Genetically modified non-human animal and uses thereof

Abstract

Provided are genetically modified animals and cells with humanized NKC and / or Ly49 locus. In one aspect, the genetically-modified, non-human animal comprises at an endogenous NKC locus, one or more human NKC genes, and / or at an endogenous Ly49 locus, one or more human KIR genes. In some embodiments, the animal comprises an endogenous Clec1b gene. In one aspect, the animal comprises at a safe harbor locus (e.g., an endogenous Hipp11 orRosa26 gene locus), one or more human KIR genes.

Description

GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL AND USES THEREOF

[0001] CLAIM OF PRIORITY

[0002] This application claims the benefit of PCT Application No. PCT / CN2024 / 102229, filed on June 28, 2024. The entire contents of the foregoing are incorporated herein by reference.TECHNICAL FIELD

[0003] This disclosure relates to genetically modified animals and cells expressing one or more human NK cell receptors.BACKGROUND

[0004] Natural killer (NK) cells perform diverse functions: they not only eradicate virus-infected, malignantly transformed, or stressed cells by virtue of their cytotoxic capabilities, but also produce chemokines and cytokines such as IFNγ, thereby modulating immune responses and contributing to tissue homeostasis. To serve this variety of purposes, NK cells express a plethora of germline-encoded activating and inhibitory receptors that, in concert, regulate their activities.

[0005] There are two main structural classes of NK receptors with the respective genes clustered at two distinct sites in the mammalian genome: NK cell receptors of the C-type lectin-like superfamily, are encoded in the natural killer gene complex (NKC; human chromosome 12) , whereas the leukocyte receptor complex (LRC; human chromosome 19) codes for killer cell immunoglobulin (Ig) -like receptors (KIR) . Inhibitory NK receptors ligating classical major histocompatibility complex (MHC) class I molecules are either LRC-encoded or NKC-encoded depending on the respective mammalian order. These molecular MHC class I sensors allow the release of NK cell cytotoxicity toward MHC class I-deficient cells typically arising upon viral infection or during tumor formation, and, hence, represent the molecular substrates of the “missing-self” recognition mode.

[0006] There is a need for non-human animals expressing human NK receptors, e.g., human NKC proteins and / or human KIR proteins. These non-human animals can respond to an MHC class I-presented antigen and mimic the immune response in human.SUMMARY

[0007] The present disclosure relates to genetically modified animals and cells with humanized NKC and / or Ly49 locus, and expressing one or more human NKC or KIR proteins.

[0008] In one aspect, the disclosure is related to a genetically-modified, non-human animal comprising at an endogenous natural killer gene complex (NKC) locus, one or more of human NKC genes. In some embodiments, the animal comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 36, at least 37, or at least 38 human NKC genes selected from Table 1. In some embodiments, the animal comprises, at the endogenous NKC gene locus, all or a majority of human NKC genes on human chromosome 12 of a human subject. In some embodiments, the animal comprises, at the endogenous NKC gene locus, all or a majority of human NKC genes on human chromosome 12 of a human cell. In some embodiments, the animal comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, or at least 23 human NKC genes selected from KLRB1, CLEC2D, CLECL1P, CD69, KLRF1, CLEC2B, KLRF2, CLEC2A, CLEC12A, CLEC1B, CLEC12B, CLEC9A, CLEC1A, CLEC7A, OLR1, TMEM52B, GABARAPL1, KLRD1, KLRK1, KLRC4, KLRC3, KLRC2, and KLRC1. In some embodiments, the animal comprises a disruption in the animal’s endogenous NKC locus. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of one or more mouse NKC genes. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50, at least 55, or at least 60 mouse NKC genes selected from Table 2. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least 28, at least 29, or at least 30 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, Clec1b, Clec9a, Clec1a, Clec7a, Olr1, Tmem52b, Gabarapl1, Klre1, Klrd1, Klrk1, Klrc3, Klrc2, and Klrc1. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of a contiguous sequence starting from mouse Klrb1a to mouse Klrc1. In some embodiments, the animal comprises one or more of endogenous Clrg1, Ly49q, and Ly49e genes. In some embodiments, the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of a contiguous sequence starting from mouse Clec9a to mouse Klrc1. In some embodiments, the animal comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, or at least 18 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, and Clec1b. In some embodiments, the animal comprises a contiguous sequence starting from mouse Klrb1a to mouse Clec1b. In some embodiments, the animal comprises an unmodified human sequence derived from a human NKC locus starting from human KLRB1 to KLRC1. In some embodiments, the animal comprises an unmodified human sequence derived from a human NKC locus starting from human KLRB1 to CLEC12A. In some embodiments, the animal comprises an unmodified human sequence derived from a human NKC locus starting from human CLEC12B to KLRC1. In some embodiments, the animal is homozygous or heterozygous with respect to the NKC locus.

[0009] In some embodiments, the animal further comprises an endogenous Clec1b gene at an endogenous safe harbour locus (e.g., Rosa26 gene locus or an endogenous Hipp11 gene locus) . In some embodiments, the animal is a mouse, and the mouse Clec1b gene is inserted between exon 1 and exon 2 of mouse Rosa26 gene locus.

[0010] In one aspect, the disclosure is related to a genetically-modified animal comprising at an endogenous NKC locus, a) a first sequence comprising one or more of human NKC genes selected from KLRB1 to CLEC12A genes on human chromosome 12; b) a second sequence comprising endogenous Clec1b; and c) a third sequence comprising one or more of human NKC genes selected from CLEC12B to KLRC1 genes on human chromosome 12, in some embodiments, the first sequence, the second sequence, and the third sequence are operably linked. In some embodiments, the first sequence comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 human NKC genes selected from the group consisting of KLRB1, CLEC2D, CLECL1P, CD69, KLRF1, CLEC2B, KLRF2, CLEC2A and CLEC12A genes. In some embodiments, the first sequence is an unmodified sequence derived from a human NKC locus starting from human KLRB1 to CLEC12A. In some embodiments, the third sequence comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, or at least 13 human NKC genes selected from the group consisting of CLEC12B, CLEC9A, CLEC1A, CLEC7A, OLR1, TMEM52B, GABARAPL1, KLRD1, KLRK1, KLRC4, KLRC3, KLRC2, and KLRC1. In some embodiments, the third sequence is an unmodified sequence derived from a human NKC locus starting from human CLEC12B to KLRC1. In some embodiments, the animal comprises a disruption in the animal’s endogenous NKC locus. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of one or more mouse NKC genes. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50, at least 55, or at least 60 mouse NKC genes selected from Table 2. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least 28, at least 29, or at least 30 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, Clec1b, Clec9a, Clec1a, Clec7a, Olr1, Tmem52b, Gabarapl1, Klre1, Klrd1, Klrk1, Klrc3, Klrc2, and Klrc1. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of a contiguous sequence starting from mouse Klrb1a to mouse Klrc1. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of a contiguous sequence starting from mouse Klrb1a to mouse Clec12b. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of a contiguous sequence starting from mouse Clec9a to mouse Klrc1. In some embodiments, the animal is homozygous or heterozygous with respect to the NKC locus.

[0011] In some embodiments, the animal further comprises at least one chromosome comprising one or more of human killer-cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes. In some embodiments, the animal is a mammal, e.g., a monkey, a rodent, a mouse, or a rat. In some embodiments, the animal does not express endogenous NKC proteins, or expresses a decreased level of endogenous NKC proteins as compared to the NKC protein expression level in a wildtype animal. In some embodiments, the animal has one or more cells (e.g., NK cells, platelets, DC cells, monocytes, and / or macrophages) expressing human NKC proteins. In some embodiments, the animal has one or more cells expressing human NKC proteins, and the expressed NKC proteins can induce or inhibit NK cell-mediated cytotoxicity.

[0012] In one aspect, the disclosure is related to a genetically-modified, non-human animal whose genome comprises at least one chromosome comprising one or more of human killer-cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes. In some embodiments, the animal comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, or at least 16 human KIR genes selected from Table 3. In some embodiments, the animal comprises, at an endogenous gene locus, all or a majority of human KIR genes (e.g., human haplotype A KIR genes) on human chromosome 19 of a human subject. In some embodiments, the animal comprises, at an endogenous gene locus, all or a majority of human KIR genes (e.g., human haplotype A KIR genes) on human chromosome 19 of a human cell.

[0013] In some embodiments, the animal comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 human KIR genes selected from KIR3DL3, KIR2DL3, KIR2DP1, KIR2DL1, KIR3DP1, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR2DS4, and KIR3DL2, at an endogenous gene locus of the animal’s genome. In some embodiments, the one or more human KIR genes are inserted at an endogenous safe harbour locus (e.g., Hipp11 gene locus or an endogenous Rosa26 gene locus) . In some embodiments, the animal is a mouse, and the one or more human KIR genes are inserted at an endogenous mouse Hipp11 gene locus. In some embodiments, the animal is homozygous or heterozygous with respect to the endogenous gene locus.

[0014] In some embodiments, the animal comprises at an endogenous Ly49 locus, at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 human KIR genes selected from KIR3DL3, KIR2DL3, KIR2DP1, KIR2DL1, KIR3DP1, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR2DS4, and KIR3DL2. In some embodiments, the animal comprises a disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus comprises a deletion of one or more mouse Ly49 genes. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus comprises a deletion of at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50, at least 51, or at least 52 mouse Ly49 genes selected from Table 4. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus comprises a deletion of at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, or at least 14 mouse Ly49 genes selected from the group consisting of Ly49q, Ly49e, Ly49f, Ly49d, Ly49k, Ly49h, Ly49n, Ly49i, Ly49g, Ly49j, Ly49m, Ly49c, Ly49a, and Ly49b. In some embodiments, the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus comprises a deletion of a contiguous sequence starting from mouse Ly49q to mouse Ly49b. In some embodiments, the animal comprises one or more of endogenous Klrc1 and Csda genes. In some embodiments, the animal comprises an unmodified human sequence derived from a human KIR locus starting from human KIR3DL3 to KIR3DL2. In some embodiments, the animal is homozygous or heterozygous with respect to the Ly49 locus.

[0015] In some embodiments, the animal further comprises at least one chromosome comprising one or more of human NKC genes. In some embodiments, the animal is a mammal, e.g., amonkey, a rodent, a mouse, or a rat. In some embodiments, the animal does not express endogenous Ly49 proteins, or expresses a decreased level of endogenous Ly49 proteins as compared to the Ly49 protein expression level in a wildtype animal. In some embodiments, the animal has one or more cells (e.g., NK cells, T cells, DC cells, monocytes, and / or macrophages) expressing human KIR proteins. In some embodiments, the animal has one or more cells expressing human KIR proteins, and the expressed KIR proteins can induce or inhibit NK cell-mediated cytotoxicity.

[0016] In one aspect, the disclosure is related to a genetically-modified, non-human animal whose genome comprises at an endogenous NKC locus of one chromosome comprising: areplacement of one or more endogenous NKC genes with one or more human NKC genes. In some embodiments, the animal is a mouse, and at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50, at least 55, or at least 60 mouse NKC genes selected from Table 2 are replaced. In some embodiments, the animal is a mouse, and at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least 28, at least 29, or at least 30 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, Clec1b, Clec9a, Clec1a, Clec7a, Olr1, Tmem52b, Gabarapl1, Klre1, Klrd1, Klrk1, Klrc3, Klrc2, and Klrc1 are replaced. In some embodiments, the one or more endogenous NKC genes are replaced by at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 36, at least 37, or at least 38 human NKC genes selected from Table 1. In some embodiments, the one or more endogenous NKC genes are replaced by at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, or at least 23 human NKC genes selected from KLRB1, CLEC2D, CLECL1P, CD69, KLRF1, CLEC2B, KLRF2, CLEC2A, CLEC12A, CLEC1B, CLEC12B, CLEC9A, CLEC1A, CLEC7A, OLR1, TMEM52B, GABARAPL1, KLRD1, KLRK1, KLRC4, KLRC3, KLRC2, and KLRC1. In some embodiments, the animal further comprises a disrupted endogenous NKC locus of the other chromosome (e.g., by deleting a contiguous sequence from mouse Clec9a to mouse Klrc1) .

[0017] In one aspect, the disclosure is related to a genetically-modified, non-human animal whose genome comprises at an endogenous Hipp11 gene locus comprising: an insertion of one or more human KIR genes. In some embodiments, a sequence comprising at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, or at least 16 human KIR genes selected from Table 3 is inserted at the endogenous Hipp11 gene locus. In some embodiments, a sequence comprising at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 human KIR genes selected from KIR3DL3, KIR2DL3, KIR2DP1, KIR2DL1, KIR3DP1, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR2DS4, and KIR3DL2 is inserted at the endogenous Hipp11 gene locus.

[0018] In one aspect, the disclosure is related to a genetically-modified, non-human animal whose genome comprises at an endogenous Ly49 locus comprising: a replacement of one or more endogenous Ly49 genes with one or more human KIR genes. In some embodiments, the animal is a mouse, and at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least45, at least 50, at least 51, or at least 52 mouse Ly49 genes selected from Table 4 are replaced. In some embodiments, the animal is a mouse, and at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, or at least 14 mouse Ly49 genes selected from the group consisting of Ly49q, Ly49e, Ly49f, Ly49d, Ly49k, Ly49h, Ly49n, Ly49i, Ly49g, Ly49j, Ly49m, Ly49c, Ly49a, and Ly49b are replaced. In some embodiments, the one or more endogenous Ly49 genes are replaced by at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, or at least 16 human KIR genes selected from Table 3. In some embodiments, the one or more endogenous Ly49 genes are replaced by at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 human KIR genes selected from KIR3DL3, KIR2DL3, KIR2DP1, KIR2DL1, KIR3DP1, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR2DS4, and KIR3DL2.

[0019] In one aspect, the disclosure is related to a method of making a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human NKC proteins, comprising: a) replacing at an endogenous NKC locus, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more endogenous NKC proteins with an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins, in some embodiments, the one or more endogenous NKC proteins comprise endogenous Clec1b; and b) inserting at an endogenous Rosa26 gene locus, a nucleotide sequence encoding endogenous Clec1b.

[0020] In one aspect, the disclosure is related to a method of making a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human NKC proteins, comprising: a) replacing at an endogenous NKC locus, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more endogenous NKC proteins with an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins, in some embodiments, the one or more endogenous NKC proteins comprise endogenous Clec1b; and b) replacing at the endogenous NKC locus, a nucleotide sequence encoding human CLEC1B with a sequence encoding endogenous Clec1b, in some embodiments, the sequence encoding human CLEC1B is part of the unmodified nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins.

[0021] In one aspect, the disclosure is related to a method of making a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human NKC proteins, comprising: a) replacing at an endogenous NKC locus, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more endogenous NKC proteins with an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins, in some embodiments, the one or more endogenous NKC proteins comprise endogenous Clec1b; and b) inserting on either sides of the unmodified nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins, a nucleotide sequence encoding endogenous Clec1b.

[0022] In one aspect, the disclosure is related to a method of making a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human NKC proteins, comprising: a) replacing at the human NKC locus, a nucleotide sequence encoding human CLEC1B with a sequence encoding mouse endogenous Clec1b; and b) replacing at an endogenous NKC locus, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more endogenous NKC proteins with the nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins.

[0023] In one aspect, the disclosure is related to a method of making a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human NKC proteins, comprising: a) replacing at an endogenous NKC locus of one chromosome, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more endogenous NKC proteins with an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins, in some embodiments, the one or more endogenous NKC proteins comprise endogenous Clec1b; and b) disrupting at an endogenous NKC locus of the other chromosome by deleting one or more genes immediately following endogenous Clec1b, in some embodiments, the animal is a mouse, and step (b) comprises deleting a contiguous sequence starting from mouse Clec9a to mouse Klrc1.

[0024] In one aspect, the disclosure is related to a method of making a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human KIR proteins, comprising: inserting at an endogenous Hipp11 gene locus, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human KIR proteins.

[0025] In one aspect, the disclosure is related to a method of making a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human KIR proteins, comprising: replacing at an endogenous Ly49 gene locus, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more endogenous Ly49 proteins with an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human KIR proteins.

[0026] In one aspect, the disclosure is related to a method of determining effectiveness of a therapeutic agent for treating cancer, comprising: a) administering the therapeutic agent to the animal described herein, in some embodiments, the animal has a tumor; and b) determining inhibitory effects of the therapeutic agent to the tumor. In some embodiments, the therapeutic agent is an antibody that specifically binds to one or more NKC proteins. In some embodiments, the therapeutic agent is an antibody that specifically binds to one or more KIR proteins (e.g., an anti-KIR2DL1 antibody, an anti-KIR2DL2 antibody, or an anti-KIR2DL3 antibody) . In some embodiments, the tumor comprises one or more cancer cells that are injected into the animal. In some embodiments, determining inhibitory effects of the therapeutic agent to the tumor involves measuring the tumor volume in the animal. In some embodiments, the cancer is a solid tumor, head and neck tumor, bladder cancer, breast cancer, esophageal cancer, non-small cell lung cancer, squamous cell carcinoma, lymphoma, multiple myeloma, colorectal cancer, melanoma cancer, prostate cancer, kidney cancer, pancreas cancer, endocrine cancer, or B-cell chronic lymphocytic leukemia.

[0027] In one aspect, the disclosure is related to a method of determining effectiveness of a therapeutic agent for treating an immune disorder (e.g., an autoimmune disease) , comprising: a) administering the therapeutic agent to the animal described herein, in some embodiments, the animal has the immune disorder; and b) determining effects of the therapeutic agent to the immune disorder. In some embodiments, the immune disorder is myelodysplastic syndrome, psoriasis, allergy, multiple sclerosis, transplant rejection, or graft versus host disease (GVHD) .

[0028] In one aspect, the disclosure is related to a method of determining effectiveness of a therapeutic agent for reducing an inflammation, comprising: a) administering the therapeutic agent to the animal described herein, in some embodiments, the animal has the inflammation; and b) determining effects of the therapeutic agent to the inflammation. In some embodiments, the inflammation is rheumatic arthritis or inflammatory bowel disease.

[0029] In one aspect, the disclosure is related to a method of determining effectiveness of a therapeutic agent for treating a cardiovascular disease (e.g., thrombus) , comprising: a) administering the therapeutic agent to the animal described herein, in some embodiments, the animal has the cardiovascular disease; and b) determining effects of the therapeutic agent to the cardiovascular disease.

[0030] In one aspect, the disclosure is related to a method of determining toxicity of a therapeutic agent comprising: a) administering the therapeutic agent to the animal described herein; and b) determining effects of the therapeutic agent to the animal. In some embodiments, determining effects of the therapeutic agent to the animal involves measuring the body weight, red blood cell count, hematocrit, and / or hemoglobin of the animal.

[0031] In some embodiments, the therapeutic agent described herein is an antibody that specifically binds to one or more NKC proteins, or an antibody that specifically binds to one or more KIR proteins.

[0032] The disclosure also relates to an offspring of the non-human mammal.

[0033] In some embodiments, the non-human mammal is a rodent. In some embodiments, the non-human mammal is a mouse.

[0034] The disclosure also provides to a cell including the targeting vector as described herein.

[0035] The disclosure also relates to a cell (e.g., a stem cell, an embryonic stem cell, an immune cell, a B cell, a T cell, or a hybridoma) or a cell line, or a primary cell culture thereof derived from the non-human mammal or an offspring thereof. The disclosure further relates to the tissue, organ or a culture thereof derived from the non-human mammal or an offspring thereof.

[0036] The disclosure further relates to the use of the non-human mammal or an offspring thereof, the animal model generated through the method as described herein in the development of a product related to an immunization processes, the manufacture of a human antibody, or the model system for a research in pharmacology, immunology, microbiology and medicine.

[0037] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Methods and materials are described herein for use in the present invention; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0038] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0039] FIGS. 1A-1C is schematic diagram showing human NKC region on chromosome 12 (FIG. 1A) , mouse NKC region on chromosome 6 (FIG. 1B) , and humanized NKC region on modified mouse chromosome 6 (mChr6-mut) (FIG. 1C) .

[0040] FIG. 2 is a schematic diagram of the modified mouse chromosome 6 (mCH6-mut1) .

[0041] FIG. 3 shows a targeting strategy at the mouse NKC cluster locus on mouse chromosome 6 with a targeting vector V01.

[0042] FIG. 4 is a schematic diagram of the modified human chromosome 12 (hChr12-mut) .

[0043] FIG. 5 shows a targeting strategy at the human NKC cluster locus on human chromosome 12 with targeting vectors V02 and V03.

[0044] FIG. 6 is a schematic diagram showing Cre-mediated recombination, in which the NKC cluster region on modified human chromosome (hChr12-mut) was used to replace the corresponding NKC cluster region on modified mouse chromosome 6 (mChr6-mut1) .

[0045] FIGS. 7A-7C show PCR results of recombinant cells. M is a marker. PC is a positive control. H2O is a water control. WT is a wildtype control.

[0046] FIG. 8 is a fluorescence in situ hybridization (FISH) image. Arrows are used to indicate the integrated human NKC cluster fragments.

[0047] FIGS. 9A-9B show PCR results of F1 generation mice. M is a marker. H2O is a water control. WT is a wildtype control.

[0048] FIG. 10 shows a targeting strategy at the mouse Rosa26 gene locus with a targeting vector V04. The inserted sequence includes, from the 5’ end to 3’ end, a CAG promotor, anucleotide sequence encoding Clec1b, WPRE, and polyA.

[0049] FIG. 11 shows a targeting strategy of replacing the human CLEC1B gene locus of the NKC humanized mouse genome (mChr6-mut2) with the mouse Clec1b gene sequence. The replacement was carried out via homologous recombination with a targeting vector V05, to obtain mChr6-mut3.

[0050] FIG. 12 is a schematic diagram of the modified human chromosome 12 (hCH12-mut1) .

[0051] FIG. 13 is a schematic diagram showing Cre-mediated recombination, in which the NKC cluster region on modified human chromosome 12 (hChr12-mut1) was used to replace the corresponding NKC cluster region on modified mouse chromosome 6 (mChr6-mut1) , to obtain mChr6-mut3.

[0052] FIGS. 14A-14B are schematic diagrams showing human KIR region on human chromosome 19 (FIG. 14A) and mouse Ly49 family region on mouse chromosome 6 (FIG. 14B) .

[0053] FIG. 15 is a schematic diagram showing KIR humanized mouse Hipp11 locus.

[0054] FIG. 16 shows a targeting strategy at the mouse Hipp11 gene locus with a targeting vector V06.

[0055] FIGS. 17A-17C show PCR results of recombinant cells. M is a marker.

[0056] FIG. 18A shows FISH images. Arrows are used to indicate the integrated human KIR cluster fragments.

[0057] FIG. 18B shows FISH images. Arrows are used to indicate the integrated human KIR cluster fragments.

[0058] FIGS. 19A-19B show PCR results of F1 generation mice. M is a marker. H2O is a water control. WT is a wildtype control.

[0059] FIG. 20 shows Southern Blot results of F1 generation mice using KIR-5’ Probe, KIR-3’Probe, or KIR-Neo Probe.

[0060] FIG. 21 shows PCR results of F2 generation mice. M is a marker. H2O is a water control.

[0061] FIG. 22 is a schematic diagram showing a humanized mouse Ly49 cluster region.

[0062] FIG. 23 shows a targeting strategy in which the human KIR cluster region on the targeting vector V07 was used to replace the Ly49 cluster region on mouse chromosome 6.

[0063] FIG. 24 shows leukocyte subtypes in lymphoid tissues of C57BL / 6 wildtype mice and KIRH / H mice.

[0064] FIG. 25 shows T cell subtypes in lymphoid tissues of C57BL / 6 wildtype mice and KIRH / H mice.

[0065] FIGS. 26A-26C show PCR results of F1 generation mice. M is a marker.

[0066] FIG. 27 is a schematic diagram of the heterozygous NKC-humanized mice with modified chromosome 6.

[0067] FIGS. 28A-28B show PCR results of F0 generation mice. M is a marker. H2O is a water control. WT is a wildtype control.

[0068] FIG. 29 shows the flow cytometry results of NK cell development in C57BL / 6 mice and KIRH / H mice. Each dot or square represent one mouse. Data are displayed as the median of measurements from six donors (n=6) .

[0069] FIGS. 30A-30C show PCR results of F1 generation mice. M is a marker. H2O is a water control. WT is a wildtype control.

[0070] FIGS. 31A-31B show RT-PCR results of C57BL / 6 wild-type mouse and NKCH / +KIRH / H mice.

[0071] FIG. 32 shows the flow cytometry results of NK cell development in C57BL / 6 mice and NKCH / +KIRH / H mice. Each dot or square represent one mouse. Data are displayed as the median of measurements from four to six donors (n=4～6) .

[0072] FIG. 33 shows Southern Blot results of F1 generation mice using 5’ Probe, 3’ Probe, or A Probe. WT is a wildtype control.DETAILED DESCRIPTION

[0073] Natural killer (NK) cells are a diverse population of circulating lymphoid cells with cytotoxic and cytokine-secreting functions, particularly in response to intracellular pathogen infections and neoplasms. Although rare, primary NK cell immunodeficiency leads to complications and / or death from severe herpesviral infections, virus-associated tumor growth, leukemia, and mycobacterial infections. Dysregulated MHC class I expression on nucleated cells, such as during viral infection, is recognized by a diverse repertoire of NK cell surface receptors which mediate their immune functions through direct recognition of equally diverse MHC class I molecules. In mammals, NK cell receptors for MHC class I are encoded within two unrelated and independently segregating gene complexes, the leukocyte receptor complex (LRC) containing genes encoding the killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR) and the natural killer complex (NKC) containing multiple members of killer cell lectin-like receptor genes (KLR) . Both gene complexes evolve rapidly, vary in gene content within and between species, and can encode both activating and inhibitory polymorphic receptors. Thus, a highly diverse NK cell repertoire containing multiple highly similar receptors allows for a finely-tuned ability to discriminate MHC class I expression between healthy and damaged cells.

[0074] The number of KIR and KLR genes is highly variable between mammalian species, with primate and rodent species the best studied. Humans and other higher primates have an expanded, highly polymorphic and gene variable KIR locus, and possess four functional KLRC genes (NKG2A, C, E, and F) and a single KLRA (Ly49) gene or pseudogene. In contrast, rats (Rattus norvegicus) possess a single KIR in their LRC, whereas mice (Mus musculus) possess two KIR genes on chromosome X and which are thought to have alternative functions. However, rodents have a highly expanded and diverse repertoire of Ly49 genes and a unique, yet related KLRH gene. The primate KIR and the rodent Ly49 and KLRH bind classical MHC class I molecules to control NK cell function, a rare example of convergent evolution that illustrates the fundamental importance of this receptor-ligand system.

[0075] Natural killer cell stimulation and effector function depend upon the integration of signals derived from two distinct types of receptors-activating and inhibitory receptors. Normal healthy cells express MHC class I molecules on their surface which act as ligands for inhibitory receptors and contribute to the self-tolerance of NK cells. However, virus-infected cells or tumor cells lose surface MHC class I expression, leading to lower inhibitory signal in NK cells. Simultaneously, cellular stress associated with viral infection or tumor development such as DNA damage response, senescence program or tumor suppressor genes upregulate ligands for activating receptors in these cells. As a result, the signal from activating receptors in NK cell shifts the balance toward NK cell activation and elimination of target cells directly through NK cell-mediated cytotoxicity or indirectly through secretion of pro-inflammatory cytokines.

[0076] Genes for inhibitory receptors are clustered on two chromosomes. The C-type lectin genes, such as CD94 and NKG2, are grouped in a～2 Mbp region of human chromosome 12, the natural killer complex, or NKC. The Ig superfamily genes, on the other hand, are clustered in the leukocyte receptor complex (LRC) on human chromosome 19q13.4. Activating versions of the receptors belonging to the same molecular superfamilies are interleaved with their inhibitory counterparts. Additional genes encoding activating or inhibitory receptors on NK cells have been identified, and most of these also fit into the two extended superfamilies. Sequences with varying degrees of relatedness are present on a variety of different tissues, particularly in the haemopoietic lineages. The products of some of these genes, such as the Ig-like transcripts (ILTs or leukocyte Ig-like receptors, LIR or CD85) are expressed on an extended range of cell types.

[0077] The present disclosure relates to genetically modified animals and / or cells having, inter alia, humanized NKC and / or Ly49 loci. In some embodiments, the animals can express one or more human NKC proteins and / or one or more human KIR proteins.

[0078] As used herein, the term “antibody” refers to an immunoglobulin molecule comprising four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds. Each heavy chain comprises a heavy chain variable (VH) domain and a heavy chain constant region (CH) . Each light chain comprises a light chain variable (VL) domain and a light chain constant region (CL) . The VH and VLdomains can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDR) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR) . Each VH and VLcomprises three CDRs and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (heavy chain CDRs may be abbreviated as HCDR1, HCDR2 and HCDR3; light chain CDRs may be abbreviated as LCDR1, LCDR2 and LCDR3) . The term “high affinity” antibody refers to an antibody that has a KD with respect to its target epitope about of 10-9M or lower (e.g., about or lower than 1×10-9M, 1×10-10M, 1×10-11M, or 1×10-12M) . In some embodiments, KD can be measured by surface plasmon resonance, e.g., BIACORETM or ELISA.

[0079] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated by the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0080] As used herein, when referring to an antibody, the phrases “specifically binding” and “specifically binds” mean that the antibody interacts with its target molecule preferably to other molecules, because the interaction is dependent upon the presence of a particular structure (i.e., the antigenic determinant or epitope) on the target molecule; in other words, the reagent is recognizing and binding to molecules that include a specific structure rather than to all molecules in general. An antibody that specifically binds to the target molecule may be referred to as a target-specific antibody.

[0081] As used herein, the terms “polypeptide, ” “peptide, ” and “protein” are used interchangeably to refer to polymers of amino acids of any length of at least two amino acids.

[0082] As used herein, the terms “polynucleotide, ” “nucleic acid molecule, ” and “nucleic acid sequence” are used interchangeably herein to refer to polymers of nucleotides of any length of at least two nucleotides, and include, without limitation, DNA, RNA, DNA / RNA hybrids, and modifications thereof.

[0083] As used herein, the term “an unmodified human sequence” refers to a sequence that is derived from a human subject, a human cell, a cultured human cell or a human cell line, wherein the sequence is identical to the genetic sequence of a human subject, a human cell, a cultured human cell or a human cell line.

[0084] As used herein, the term “a majority of” refers to more than half of the total number of items in a group. In some embodiments, a majority of human NKC genes refers to more than half of all genes (including pseudogenes) in Table 1. In some embodiments, a majority of human KIR genes refers to more than half of all genes in Table 3.

[0085] NK cell receptors

[0086] Natural killer complex (NKC)

[0087] The natural killer complex (NKC; also known as natural killer gene complex) on chromosome 12p13 encodes over 15 type II transmembrane C-type lectin-like proteins. As well as NK cells, some NKC genes are found on a wider range of haemopoietic cell types. Multiple duplications must have given rise to this extensive cluster of related loci, which extends over>1.5 Mbp. There is evidence for recent duplication, as some of the genes, such as the NKG2 (KLRC1) loci, are over 90%identical. There are obvious NKC orthologs in different species, such as CD69 and CD94, as well as species-specific loci. For example, three NKRP1 genes have been identified in mouse and two in rat, whereas humans probably have only one functional gene. Mice have the NKR-P1A ortholog as well as the related NKR-P1C gene in addition to an ITIM-containing inhibitory molecule, NKR-P1B.

[0088] The mammalian NKC encodes for several dozens of C-type lectin-like receptor (CTLR) expressed by various types of hematopoietic cells including NK cells. The immune-related CTLR of the NKC have been classified as CTLR of the subgroup V within the realm of multiform C-type lectins. This subgroup comprises atypical C-type lectins that have lost the ability to bind carbohydrates via Ca2+complexation and instead interact with proteins as their natural ligands. They are type II transmembrane glycoproteins with an N-terminal cytoplasmic domain, a single transmembrane domain followed by a stalk region and a single extracellular C-type lectin-like domain (CTLD) at the C-terminus. This name-giving CTLD basically is built up by twoα-helices and two antiparallelβ-sheets creating a compact structure that is stabilized by two or (mostly) three conserved intramolecular disulfide bonds. Another typical feature is the “WIGL” motif, a stretch of four hydrophobic amino acids that forms the core of the CTLD. Functional NKC-encoded CTLR usually form homo-or heterodimers disulfide-linked via paired cysteines of the stalk region that–like the cytoplasmic domain–exhibits considerable length variations among NKC-encoded CTLR.

[0089] Natural killer cell-encoded CTLR have been classified based on the expressing cell type either as killer cell lectin-like receptors (KLR) for NK cell-associated CTLR or C-type lectin receptors (CLEC) expressed by non-NK cells.

[0090] Most NK cell-associated CTLR (KLR) are known to bind glycoproteins with an MHC class I-like fold: these include classical and non-classical MHC class I molecules, and MHC class I-like molecules. A prominent member of this group is NKG2D (KLRK1) , an activating receptor that binds to several MHC class I-like molecules induced by various forms of cellular stress such as viral infection, tumor formation, tissue damage, and heat shock. These NK receptors share their MHC class I ligands with T cell receptors (TCR) of cytotoxic T cells. According to current belief, this molecular partner-sharing between TCR of CD8+T cells and MHC class I-specific inhibitory receptors of NK cells primarily evolved owing to the evolutionary imperative to bail the adaptive immune system out of its MHC-centric single-mindedness, i.e., establishing “missing-self” recognition of NK cells as a safeguard for CD8+T cell-blinding in case of abrogated MHC class I expression.

[0091] Ly49 receptors

[0092] Major histocompatibility complex (MHC) recognition is central to both innate and adaptive immune recognition. The function of both the innate immune effectors, such as natural killer (NK) cells, and the adaptive immune effectors, such as T cells, depend upon the recognition of MHC-I molecules expressed on aberrant cells; however, the mode of recognition varies between the two lymphocyte subsets. T cell receptors (TCR) have specificity to the antigenic peptide bound to MHC-I and form contacts to the peptide as well as to the MHC molecule. NK cell receptors, such as the Ly49 in mice, bind MHC-I molecules in a peptide-dependent but not peptide-specific manner. An exception is the Ly49C, a member of the Ly49 receptor family, whose binding to H-2Kb haplotype appears to be peptide-specific. The binding interface between Ly49 and MHC-I, revealed from crystal structures of Ly49A and H-2Db molecules, is distinct and away from the peptide binding groove on MHC-I. While signals downstream of TCR engagement specifically activate T cell functions, the Ly49 receptors can be activating or inhibitory in nature, and their expression is not limited to NK cells. In addition to NK cells, other leukocytes have also been shown to express inhibitory Ly49 receptors, such as the CD8+T cells, CD3+cells, intestinal epithelial lymphocytes (IELs) , NKT cells, uterine NK cells (uNK) cells, and cells of the myeloid lineage.

[0093] The innate MHC-I receptors include the human killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) , NKG2 / CD94, and mouse Ly49 families of receptors. The genes that encode the mouse MHC-I receptors are clustered together in the natural killer gene complex (NKC) on mouse chromosome 6. The Ly49 receptors are homodimeric type II glycoproteins of the C-type lectin-like superfamily. They are structurally distinct but functionally similar to human KIR in terms of MHC-I recognition, and therefore provide a useful model system to study the role of this class of receptors in immune regulation. MHC-I receptors generally inhibit NK cell function when they are engaged by self-MHC ligands. Therefore, inhibitory Ly49 receptors are generally agreed to be important for the prevention of autoimmunity by suppressing NK cell activation. The acquisition of inhibitory Ly49 for self-MHC-I is also a key step in the “licensing” of developing NK cells to avoid a hyporesponsive state. In contrast, the activating Ly49 receptors recognize ligands that are expressed on abnormal or infected cells, and activate cytokine production and cellular cytotoxicity by NK cells. The integration of signals from the activating and inhibitory Ly49 receptors ultimately determines the functionality of NK cells.

[0094] The inhibitory and activating members of Ly49 and KIR families are characterized by the presence or absence of immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) domains in their cytoplasmic tail. NK cell stimulation results in differential phosphorylation of Ly49 receptors.

[0095] One of the striking features of Ly49 receptors is the polymorphic and polygenic nature of the Ly49 gene cluster among the inbred mouse strains. This results in heterogeneity in both the type and level of Ly49 molecules expressed in different mouse strains. Among the four inbred mouse strains whose Ly49 gene haplotypes have been extensively characterized, the BALB / c mouse strain possess the smallest haplotype with 8 genes, and the NOD / ShiLtJ strain possess the largest haplotype with 21 discernable genes. The C57BL / 6 haplotype, which was the first to be characterized, and the 129 mouse strain haplotype possess 15 and 19 genes, respectively. In all the characterized Ly49 haplotypes, there appears to be a limited degree of conservation in the form of “framework” genes which delineate the regions of variable numbers of strain-specific genes. The framework gene pairs in mice are Ly49q-e, Ly49i-g, and Ly49c-a. Ly49 haplotype diversity has evolved as a result of multiple duplication and deletion events. Examples of strain-specific Ly49 gene inactivation are evident in different strain of mice mostly mediated by stop codons within the coding region. Such diversity is possibly driven by selective pressure due to pathogenic challenge, since NK cells appear to be critical for the control of viral infections. In mice, the activating Ly49H receptor directly interacts with the murine cytomegalovirus (MCMV) m157 gene product on NK cells and confers resistance to MCMV in the C57BL / 6 mouse strain which possesses the Ly49h gene. Conversely, 129 and BALB / c strains lack the gene for activating Ly49H and hence are highly susceptible to MCMV infection.

[0096] Killer cell immunoglobulin-like receptors

[0097] Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are members of a group of regulatory molecules found on subsets of lymphoid cells. They were first identified by their ability to impart some specificity on natural killer (NK) cytolysis. The KIR locus, containing a family of polymorphic and highly homologous genes, maps to chromosome 19q13.4 within the 1 Mb leukocyte receptor complex (LRC) . The LRC also encodes the leukocyte Ig-like receptor family (LILR) , the leukocyte-associated inhibitory receptor (LAIR) family, and the Fcαreceptor. KIR genes are tandemly arrayed over about 150 kb, with the remarkable feature that gene content varies between haplotypes. The discovery of KIR has also imparted an additional function on the human leukocyte antigen (HLA) class I molecules, which are encoded by genes within the major histocompatibility complex (MHC; chromosome 6) . Through their interaction with KIR isotypes that inhibit natural killer (NK) cell activity, certain HLA class I molecules are now known to protect healthy cells from spontaneous destruction by NK-cell-mediated cytolysis. Other KIR isotypes stimulate the activity of NK cells. Thus, KIR are likely to play a significant role in the control of the immune response, which would explain the associations observed between certain KIR genes in rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis and control of HIV disease progression. The degree of HLA / KIR compatibility may also determine the success rate of hematopoietic cell replacement therapy for certain leukemias.

[0098] The KIRs are situated within a segment of DNA that has undergone expansion and contraction over time, and inspection of KIR haplotypes suggests a history of gene duplication and unequal crossing over in the region. The order of the KIR genes along the chromosome has been determined for two distinct haplotypes, providing a framework for their genomic order. The genes are organized in a head-to-tail fashion, and each gene is roughly 10-16 kb in length with a sequence of about 2 kb separating each pair of genes, except for a 14 kb stretch of unique sequence upstream of 2DL4. Variation at the KIR gene complex is a function of both allelic polymorphism at several KIR genes and variability in the number and types of genes present on any given haplotype.

[0099] Although KIR haplotypes vary in the number and type of genes present, the genes 2DL4, 3DP1, 3DL2, and 3DL3 are present on virtually all haplotypes and have therefore been termed framework loci. All others exist on only a fraction of the total haplotypic pool. The number of putatively expressed KIR genes present on a single haplotype ranges from about 7-12, depending primarily on the presence or absence of activating KIR loci. Based on gene content, the haplotypes have been divided into two primary sets, termed A and B, which were originally differentiated by the presence of a 24 kb HindIII fragment on Southern blot analysis. Haplotype A has seven loci; 2DL1, 2DL3, 2DL4, 2DS4, 3DL1, 3DL2 and 3DL3. Perhaps the most functionally relevant distinction between haplotypes A and B is the number of stimulatory receptors present. Haplotype A contains only a single stimulatory KIR gene, 2DS4, whereas haplotype B contains various combinations of 2DS1, 2DS2, 2DS3, 2DS5, 3DS1, and 2DS4. Furthermore, the 2DS4 gene has a null allele with a population frequency of about 84% (allele frequency of 60%) . Thus, some individuals are homozygous for an A haplotype from which no activating KIR is expressed. The phenomenon of framework genes supporting areas of variable polygeny is analogous to that seen for HLA-DR, in which the DRA genes are always present, whereas the DRB gene number is variable.

[0100] The frequencies of haplotypes A and B are roughly equal in Caucasian populations, but on the basis of gene content, haplotype B displays a much greater variety of subtypes. Patterns of linkage disequilibrium (LD) between KIR loci (as opposed to LD between alleles of two genes that are both present on all haplotypes) are fixed for the A haplotypes (i.e., A haplotypes differ at the allelic level, but not in gene content) . Much of what we know about LD patterns among the B haplotypes is based on studies of KIR profiles (presence or absence of each gene in a given individual) in groups of unrelated individuals, and they indicate that LD is quite strong between many pairs of genes represented in the group of B haplotypes. Over 100 different KIR profiles have been identified among unrelated individuals, and many distinct gene-content haplotypes have been identified from segregation analysis. The numbers will undoubtedly continue to grow as more individuals and families are screened.

[0101] Expansion and contraction of the KIR region appears to have occurred due in part to unequal crossing over. One consequence of such molecular genetic events is the possible generation of KIR haplotypes that have two (or more) copies of a gene on a single haplotype and the rearrangement of gene order. 2DL5 is the most recently identified KIR gene and segregation analysis has indicated that what were once considered alleles of a single 2DL5 locus are actually two different loci, both of which can be present on a single haplotype. Interestingly, these genes, termed 2DL5A and 2DL5B, are not tandemly located on haplotypes containing both genes, suggesting that they may have arisen due to a mechanism involving nonreciprocal crossing over. The two genes share>99%sequence similarity in both their exons and introns, and would not have been identified as separate loci if family studies of 2DL5 inheritance had not been performed. There is at least one haplotype with several KIR deleted, including 2DL4 and 3DL1. Since most KIR typing methods are designed to determine presence or absence of genes and subtyping of individual KIR genes in families has been performed in only a limited number of studies, haplotypes containing multiple copies of the same gene would remain undisclosed, further underestimating KIR haplotypic diversity.

[0102] Frequencies of specific KIR haplotypes and the two major haplotypic groups, A and B, vary across ethnically defined populations. The A haplotype has an allele frequency of 75%in Japanese but only 15%in Australian Aborigines. The greatest intra-population haplotype diversity would appear to be in South Asians and the least in Japanese. It is possible that significant differences in KIR haplotypes across populations might account for variation in disease susceptibility among these groups.

[0103] A detailed description of NK cell receptors, e.g., NKC, Ly49, KIR, and their functions can be found, e.g., in Trowsdale, J. "Genetic and functional relationships between MHC and NK receptor genes. " Immunity 15.3 (2001) : 363-374; Paul, S., et al. "The molecular mechanism of natural killer cells function and its importance in cancer immunotherapy. Front Immunol 8: 1124. " (2017) ; Rahim, M.M.A., et al. "Ly49 receptors: innate and adaptive immune paradigms. "Frontiers in Immunology 5 (2014) : 145; Carrington, M., et al. "The KIR gene cluster. " (2003) ; and Bartel, Y., et al. "Modulation of NK cell function by genetically coupled C-type lectin-like receptor / ligand pairs encoded in the human natural killer gene complex. " Frontiers in Immunology 4 (2013) : 362; each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0104] Genetically modified NKC locus

[0105] Natural killer (NK) cells are a diverse population of lymphocytes with a range of biological roles including essential immune functions. NK cell diversity is in part created by the differential expression of cell surface receptors which modulate activation and function, including multiple subfamilies of C-type lectin receptors encoded within the NK complex (NKC) .

[0106] Human NKC locus is located on chromosome 12. Table 1 lists human NKC gene names, gene IDs, starting and ending positions in this locus, and their encoded protein names. Selected genes and the order of these genes are also shown in FIG. 1A.

[0107] Table 1. List of human NKC genes on human chromosome 12

[0108] Mouse NKC locus is located on chromosome 6. Table 2 lists mouse NKC gene names, gene IDs, starting and ending positions in this locus, and their encoded protein names. Selected genes and the order of these genes are also shown in FIG. 1B.

[0109] Table 2. List of mouse NKC genes on mouse chromosome 6

[0110] The present disclosure provides genetically-modified, non-human animals comprising one or more human NKC genes. In some embodiments, the human NKC genes are operably linked together. In some embodiments, the animal can express one or more human NKC proteins encoded by the one or more human NKC genes. In some embodiments, the human NKC genes are at endogenous NKC locus.

[0111] In some embodiments, the animal comprises about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, or 38 human NKC genes (e.g., genes as shown in Table 1) . In some embodiments, the human NKC genes described herein include pseudogenes. In some embodiments, the human NKC genes described herein do not include pseudogenes.

[0112] In some embodiments, the animal comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, or 23 genes selected from KLRB1, CLEC2D, CLECL1P, CD69, KLRF1, CLEC2B, KLRF2, CLEC2A, CLEC12A, CLEC1B, CLEC12B, CLEC9A, CLEC1A, CLEC7A, OLR1, TMEM52B, GABARAPL1, KLRD1, KLRK1, KLRC4, KLRC3, KLRC2, and KLRC1.

[0113] In some embodiments, the animal comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 genes selected from KLRB1, CLEC2D, CLECL1P, CD69, KLRF1, CLEC2B, KLRF2, CLEC2A and CLEC12A. In some embodiments, the animal comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13 genes selected from CLEC12B, CLEC9A, CLEC1A, CLEC7A, OLR1, TMEM52B, GABARAPL1, KLRD1, KLRK1, KLRC4, KLRC3, KLRC2, and KLRC1.

[0114] In some embodiments, the animal comprises an unmodified human sequence comprising a sequence starting from a gene selected from KLRB1, CLEC2D, CLECL1P, and CD69, and ending at a gene selected from KLRC3, KLRC2, and KLRC1. In some embodiments, the animal comprises an unmodified human sequence comprising a sequence starting from a gene selected from KLRB1, CLEC2D, CLECL1P, and CD69, and ending at a gene selected from KLRF2, CLEC2A, and CLEC12A. In some embodiments, the animal comprises an unmodified human sequence comprising a sequence starting from a gene selected from CLEC12B, CLEC9A, and CLEC1A, and ending at a gene selected from KLRC3, KLRC2, and KLRC1.

[0115] In some embodiments, the animal does not comprise human KLRG1 gene. In some embodiments, the animal does not comprise human KLRA1P gene.

[0116] In some embodiments, the unmodified human sequence derived from a human NKC locus starting from human KLRB1 to human KLRC1. In some embodiments, the unmodified human sequence derived from a human NKC locus starting from human KLRB1 to human CLEC12A. In some embodiments, the unmodified human sequence derived from a human NKC locus starting from human CLEC12B to human KLRC1. In some embodiments, the unmodified human sequence comprises all or part of the regulatory elements (e.g., 5’ UTR) of human KLRB1 gene. In some embodiments, the unmodified human sequence comprises all or part of the downstream regulatory elements (e.g., 3’ UTR) of human KLRC1 gene.

[0117] In some embodiments, the animal can have one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, or ten unmodified human sequences derived from a human NKC locus. In some embodiments, the unmodified human sequence has a length of about or at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 920, 930, 950, 960, 970, 980, 990, or 1000 kb.

[0118] In some embodiments, the human NKC genes are operably linked together. In some embodiments, human KLRB1 gene is operably linked with endogenous Clrg1 gene (e.g., mouse Clrg1 gene) . In some embodiments, human KLRC1 gene is operably linked with endogenous Ly49q and Ly49e genes (e.g., mouse Ly49q and Ly49e genes) . In some embodiments, human CLEC12A, endogenous Clec1b (e.g., mouse Clec1b) , and human CLEC12B are operably linked. In some embodiments, these genes are arranged in an order that is similar to the order in endogenous NKC locus. In some embodiments, the arrangement described herein does not affect transcription and / or translation of the human NKC genes.

[0119] In some embodiments, all or a majority of human NKC genes are used to replace all or a majority of endogenous NKC genes (e.g., mouse NKC genes) at the endogenous NKC locus. In some embodiments, all or a majority of human NKC genes are inserted upstream or downstream of endogenous NKC locus. In some embodiments, all or a majority of human NKC genes are inserted into one of the mouse “safe harbor” loci (e.g., Hipp11 locus or Rosa26 locus) . In some embodiments, all or a majority of human NKC genes are inserted between endogenous Clrg1 gene (e.g., mouse Clrg1 gene) and endogenous Klrb1a gene (e.g., mouse Klrb1a gene) .

[0120] In some embodiments, the animal comprises a disruption in the animal’s endogenous NKC locus. In some embodiments, the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of one or more endogenous NKC genes.

[0121] In some embodiments, the animal is a mouse. The disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of at least or about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, or 60 mouse NKC genes (e.g., genes as shown in Table 2) . In some embodiments, the endogenous NKC genes described herein include pseudogenes. In some embodiments, the endogenous NKC genes described herein do not include pseudogenes. In some embodiments, the disruption comprises a deletion of about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, Clec1b, Clec9a, Clec1a, Clec7a, Olr1, Tmem52b, Gabarapl1, Klre1, Klrd1, Klrk1, Klrc3, Klrc2, and Klrc1. In some embodiments, the mouse still comprises about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, Clec1b, Clec9a, Clec1a, Clec7a, Olr1, Tmem52b, Gabarapl1, Klre1, Klrd1, Klrk1, Klrc3, Klrc2, and Klrc1.

[0122] In some embodiments, the disruption comprises a deletion of about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, or 17 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, and Clec12b. In some embodiments, the disruption still comprises about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, or 17 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, and Clec12b.

[0123] In some embodiments, the disruption comprises a deletion of about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 mouse NKC genes selected from Clec9a, Clec1a, Clec7a, Olr1, Tmem52b, Gabarapl1, Klre1, Klrd1, Klrk1, Klrc3, Klrc2, and Klrc1. In some embodiments, the disruption still comprises about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 mouse NKC genes selected from Clec9a, Clec1a, Clec7a, Olr1, Tmem52b, Gabarapl1, Klre1, Klrd1, Klrk1, Klrc3, Klrc2, and Klrc1.

[0124] In some embodiments, the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of about or at least 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 150 kb, 160 kb, 170 kb, 180 kb, 190 kb, 200 kb, 210 kb, 220 kb, 230 kb, 240 kb, 250 kb, 260 kb, 270 kb, 280 kb, 290 kb, 300 kb, 350 kb, 400 kb, 450 kb, 500 kb, 1000 kb, 1010 kb, 1020 kb, 1030 kb, 1040 kb, 1050 kb, 1060 kb, 1061 kb, 1062 kb, 1063 kb, 1064 kb, 1065 kb, 1066 kb, 1067 kb, 1068 kb, 1069 kb, 1070 kb, 1080 kb, 1090 kb or 2000 kb of nucleotides. In some embodiments, there is no disruption in the animal’s endogenous NKC locus.

[0125] In some embodiments, the deleted sequence starts from mouse Klrb1a and ends at mouse Klrc1. In some embodiments, the deleted sequence starts from mouse Klrb1a and ends at mouse Clec12b. In some embodiments, the deleted sequence starts from mouse Clec9a and ends at mouse Klrc1.

[0126] In some embodiments, the modified mouse has complete human NKC gene repertoires (e.g., including all non-pseudo human NKC genes) , or a majority thereof. Thus, the modified mouse can produce a complete repertoire of human NKC proteins, or a majority thereof. Furthermore, in some cases, the entire mouse NKC genes (e.g., including all none-pseudo mouse NKC genes) , or a majority thereof, are knocked out. In some embodiments, the mouse does not express any endogenous NKC proteins. In some embodiments, the mouse expresses a decreased level (e.g., less than 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%or 30%) of endogenous NKC proteins as compared to the NKC protein expression level in a wildtype mouse.

[0127] In some embodiments, the animal described herein comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, or at least 18 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, and Clec1b. In some embodiments, the animal comprises a continuous sequence that starts from mouse Klrb1a and ends at mouse Clec1b.

[0128] In some embodiments, described herein is a genetically modified non-human animal that comprises a) a replacement at an endogenous NKC locus of one chromosome, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more endogenous NKC proteins (e.g., any of the combinations of endogenous NKC genes described herein) with an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins (e.g., any of the combinations of human NKC genes described herein) , wherein the one or more endogenous NKC proteins comprise endogenous Clec1b, and b) a disrupted endogenous NKC locus of the other chromosome. In some embodiments, the endogenous NKC locus of the other chromosome is disrupted by deleting one or more genes immediately following endogenous Clec1b. In some embodiments, the endogenous NKC locus of the other chromosome is disrupted by deleting a continuous sequence starting from mouse Clec9a to mouse Klrc1. In some embodiments, the disrupted endogenous NKC locus of the other chromosome comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, or at least 18 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, and Clec1b. In some embodiments, the disrupted endogenous NKC locus of the other chromosome comprises a contiguous sequence starting from mouse Klrb1a to mouse Clec1b.

[0129] Genetically modified Ly49 locus with human KIR genes

[0130] Human KIR locus is located on chromosome 19. Table 3 lists human KIR gene names and gene synonyms. Selected genes and the order of these genes are also shown in FIG. 14A.

[0131] Table 3. List of human KIR genes on human chromosome 19

[0132] Mouse Ly49 locus is located on chromosome 6. Table 4 lists mouse Ly49 gene names, gene synonyms, and their relative orders at this locus. Selected genes and the order of these genes are also shown in FIG. 14B.

[0133] Table 4. List of mouse Ly49 genes on mouse chromosome 6

[0134] The present disclosure provides genetically-modified, non-human animals comprising one or more human KIR genes. In some embodiments, the human KIR genes are operably linked together. In some embodiments, the animal can express one or more human KIR proteins encoded by the one or more human KIR genes. In some embodiments, the human KIR genes are at endogenous Ly49 locus.

[0135] In some embodiments, the animal comprises about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, or 16 human KIR genes (e.g., genes as shown in Table 3) . In some embodiments, the human KIR genes described herein include pseudogenes. In some embodiments, the human KIR genes described herein do not include pseudogenes.

[0136] In some embodiments, the animal comprises about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 human KIR genes that are categorized as haplotype A KIR genes. In some embodiments, the animal comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 genes selected from KIR3DL3, KIR2DL3, KIR2DP1, KIR2DL1, KIR3DP1, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR2DS4, and KIR3DL2.

[0137] In some embodiments, the animal comprises an unmodified human sequence comprising a sequence starting from a gene selected from KIR3DL3, KIR2DL3, KIR2DP1, and ending at a gene selected from KIR3DL1, KIR2DS4, and KIR3DL2. In some embodiments, the unmodified human sequence derived from a human KIR locus starting from human KIR3DL3 to human KIR3DL2. In some embodiments, the unmodified human sequence comprises all or part of the regulatory elements (e.g., 5’ UTR) of human KIR3DL3 gene. In some embodiments, the unmodified human sequence comprises all or part of the downstream regulatory elements (e.g., 3’UTR) of human KIR3DL2 gene.

[0138] In some embodiments, the animal can have one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, or ten unmodified human sequences derived from a human KIR locus. In some embodiments, the unmodified human sequence has a length of about or at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 141, 142, 142, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, or 1000 kb.

[0139] In some embodiments, the human KIR genes are operably linked with endogenous NKC genes. In some embodiments, human KIR3DL3 is operably linked with endogenous Klrc1 gene (e.g., mouse Klrc1 gene) . In some embodiments, human KIR3DL2 is operably linked with endogenous Csda gene (e.g., mouse Csda gene) . In some embodiments, the arrangement described herein does not affect transcription and / or translation of the human KIR genes.

[0140] In some embodiments, the animal comprises a disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus. In some embodiments, the disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus comprises a deletion of one or more endogenous Ly49 genes.

[0141] In some embodiments, the animal is a mouse. The disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus comprises a deletion of at least or about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 or 52 mouse Ly49 genes (e.g., genes as shown in Table 4) . In some embodiments, the endogenous Ly49 genes described herein include pseudogenes. In some embodiments, the endogenous Ly49 genes described herein do not include pseudogenes. In some embodiments, the disruption comprises a deletion of about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, or 14 mouse Ly49 genes selected from Ly49q, Ly49e, Ly49f, Ly49d, Ly49k, Ly49h, Ly49n, Ly49i, Ly49g, Ly49j, Ly49m, Ly49c, Ly49a, and Ly49b. In some embodiments, the mouse still comprises about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, or 14 mouse Ly49 genes selected from Ly49q, Ly49e, Ly49f, Ly49d, Ly49k, Ly49h, Ly49n, Ly49i, Ly49g, Ly49j, Ly49m, Ly49c, Ly49a, and Ly49b.

[0142] In some embodiments, the disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus comprises a deletion of about or at least 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 110 kb, 120 kb, 130 kb, 140 kb, 150 kb, 160 kb, 170 kb, 180 kb, 190 kb, 200 kb, 210 kb, 220 kb, 230 kb, 240 kb, 250 kb, 260 kb, 270 kb, 280 kb, 290 kb, 300 kb, 350 kb, 400 kb, 450 kb, 500 kb, 1000 kb, 1100 kb, 1200 kb, 1300 kb, 1400 kb, 1410 kb, 1411 kb, 1412 kb, 1413 kb, 1414 kb, 1415 kb, 1416 kb, 1417 kb, 1418 kb, 1419 kb, 1420 kb, 1500 kb, or 1600 kb of nucleotides. In some embodiments, there is no disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus.

[0143] In some embodiments, the deleted sequence starts from mouse Ly49q and ends at mouse Ly49b.

[0144] In some embodiments, the modified mouse has complete human KIR gene repertoires (e.g., including all non-pseudo human KIR genes) , or a majority thereof. Thus, the modified mouse can produce a complete repertoire of human KIR proteins, or a majority thereof. Furthermore, in some cases, the entire mouse Ly49 genes (e.g., including all none-pseudo mouse Ly49 genes) , or a majority thereof, are knocked out. In some embodiments, the mouse does not express any endogenous Ly49 proteins. In some embodiments, the mouse expresses a decreased level (e.g., less than 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, or 20%) of endogenous Ly49 proteins as compared to the Ly49 protein expression level in a wildtype mouse.

[0145] Genetically modified Hipp11 locus with human KIR genes

[0146] Human KIR locus is located on chromosome 19, as discussed herein. Table 3 lists human KIR gene names and gene synonyms. Selected genes and the order of these genes are also shown in FIG. 14A.

[0147] In mice, the Hipp11 locus occurs in an intergenic region near the chromosome 11 centromere that is positioned between the Eif4enif1 and Drg1 genes, and in vivo experiments have established that the integration of exogenous genes at the Hipp11 locus does not affect mouse viability or fertility and that biallelic expression of exogenous genes was possible. Details can be found, e.g., in Li, Y., et al. "Generation of H11-albumin-rtTA transgenic mice: a tool for inducible gene expression in the liver. " G3: Genes, Genomes, Genetics 9.2 (2019) : 591-599; which is incorporated herein by reference in its entirety. An exemplary targeting strategy is shown in FIG. 16.

[0148] The present disclosure provides genetically-modified, non-human animals comprising one or more human KIR genes. In some embodiments, the human KIR genes are at endogenous Hipp11 locus.

[0149] In some embodiments, the endogenous Ly49 locus of the animals is not modified. In some embodiments, the animals can express endogenous Ly49 proteins. In some embodiments, the expression level of the endogenous Ly49 proteins in the animals described herein is comparable to that in a wildtype animal.

[0150] In some embodiments, the endogenous Ly49 locus of the animals is modified. In some embodiments, the animals can not express endogenous Ly49 proteins. In some embodiments, the expression level of the endogenous Ly49 proteins in the animals described herein is low compared to that in a wildtype animal.

[0151] In some embodiments, the animal comprises about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, or 16 human KIR genes (e.g., genes as shown in Table 3) . In some embodiments, the human KIR genes described herein include pseudogenes. In some embodiments, the human KIR genes described herein do not include pseudogenes.

[0152] In some embodiments, the animal comprises about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 human KIR genes that are categorized as haplotype A KIR genes. In some embodiments, the animal comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 genes selected from KIR3DL3, KIR2DL3, KIR2DP1, KIR2DL1, KIR3DP1, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR2DS4, and KIR3DL2.

[0153] In some embodiments, the animal comprises an unmodified human sequence comprising a sequence starting from a gene selected from KIR3DL3, KIR2DL3, KIR2DP1, and ending at a gene selected from KIR3DL1, KIR2DS4, and KIR3DL2. In some embodiments, the unmodified human sequence derived from a human KIR locus starting from human KIR3DL3 to human KIR3DL2.

[0154] In some embodiments, the animal can have one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, or ten unmodified human sequences derived from a human KIR locus. In some embodiments, the unmodified human sequence has a length of about or at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, or 1000 kb.

[0155] In some embodiments, the human KIR genes are operably linked with genes in proximity to endogenous Hipp11 gene (e.g., mouse Hipp11 gene) . In some embodiments, human KIR3DL3 is operably linked with endogenous Eif4enif1 gene (e.g., mouse Eif4enif1 gene) . In some embodiments, In some embodiments, the human KIR genes are inserted downstream of exon 19 of endogenous Eif4enif1 gene (e.g., mouse Eif4enif1 gene) . In some embodiments, human KIR3DL2 is operably linked with endogenous Drg1 gene (e.g., mouse Drg1 gene) . In some embodiments, the human KIR genes are inserted upstream of exon 9 of endogenous Drg1 gene (e.g., mouse Drg1 gene) . In some embodiments, the arrangement described herein does not affect transcription and / or translation of the human KIR genes.

[0156] In some embodiments, the animal comprises a disruption in the animal’s endogenous Hipp11 locus. In some embodiments, the disruption in the animal’s endogenous Hipp11 locus comprises a deletion of all or part of the endogenous Hipp11 gene.

[0157] Genetically modified animals

[0158] In one aspect, the present disclosure provides genetically-modified, non-human animals comprising a humanized NKC locus, and / or a humanized Ly49 locus. In some embodiments, the animals comprise one or more human NKC genes and / or one or more human KIR genes. In some embodiments, the animals comprise an endogenous Clec1b gene at an endogenous Clec1b gene locus. In some embodiments, the animals comprise an endogenous Clec1b gene at a safe harbor locus, e.g., an endogenous Rosa26 gene locus or an endogenous Hipp11 gene locus. In some embodiments, the animals comprises at a safe harbor locus, e.g., an endogenous Rosa26 gene locus or an endogenous Hipp11 gene locus, one or more human KIR genes.

[0159] In some embodiments, the animal described herein comprises one or more human NKC genes at an endogenous NKC locus. In some embodiments, the animal comprises a disruption in the animal’s endogenous NKC locus. In some embodiments, the animal does not have a disruption in the animal’s endogenous NKC locus. In some embodiments, the animal comprises one or more human KIR genes at an endogenous Ly49 locus. In some embodiments, the animal comprises a disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus. In some embodiments, the animal does not have a disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus.

[0160] In some embodiments, the animal comprises an endogenous Clec1b gene at an endogenous safe harbor locus, e.g., an endogenous Rosa26 gene locus, an endogenous Hipp11 gene locus, or an endogenous COL1A1 gene locus. In some embodiments, the animal comprises one or more human KIR genes at an endogenous safe harbor locus, e.g., an endogenous Rosa26 gene locus, an endogenous Hipp11 gene locus, or an endogenous COL1A1 gene locus. In some embodiments, the animal comprises a disruption in the animal’s safe harbor locus. In some embodiments, the animal does not have a disruption in the animal’s safe harbor locus.

[0161] The genetically modified non-human animal can be various animals, e.g., a mouse, rat, rabbit, pig, bovine (e.g., cow, bull, buffalo) , deer, sheep, goat, chicken, cat, dog, ferret, primate (e.g., marmoset, rhesus monkey) . For the non-human animals where suitable genetically modifiable embryonic stem (ES) cells are not readily available, other methods are employed to make a non-human animal comprising the genetic modification. Such methods include, e.g., modifying a non-ES cell genome (e.g., a fibroblast or an induced pluripotent cell) and employing nuclear transfer to transfer the modified genome to a suitable cell, e.g., an oocyte, and gestating the modified cell (e.g., the modified oocyte) in a non-human animal under suitable conditions to form an embryo. These methods are known in the art, and are described, e.g., in A. Nagy, et al., “Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Third Edition) , ” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2006, which is incorporated by reference herein in its entirety.

[0162] In one aspect, the animal is a mammal, e.g., of the superfamily Dipodoidea or Muroidea. In some embodiments, the genetically modified animal is a rodent. The rodent can be selected from a mouse, a rat, and a hamster. In some embodiments, the genetically modified animal is from a family selected from Calomyscidae (e.g., mouse-like hamsters) , Cricetidae (e.g., hamster, New World rats and mice, voles) , Muridae (true mice and rats, gerbils, spiny mice, crested rats) , Nesomyidae (climbing mice, rock mice, with-tailed rats, Malagasy rats and mice) , Platacanthomyidae (e.g., spiny dormice) , and Spalacidae (e.g., mole rates, bamboo rats, and zokors) . In some embodiments, the genetically modified rodent is selected from a true mouse or rat (family Muridae) , a gerbil, a spiny mouse, and a crested rat. In some embodiments, the non-human animal is a mouse.

[0163] In some embodiments, the animal is a mouse of a C57 background (e.g., a C57BL strain selected from C57BL / A, C57BL / An, C57BL / GrFa, C57BL / KaLwN, C57BL / 6, C57BL / 6J, C57BL / 6ByJ, C57BL / 6NJ, C57BL / 10, C57BL / 10ScSn, C57BL / 10Cr, and C57BL / Ola) . In some embodiments, the mouse is a 129 strain selected from the group consisting of a strain that is 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (e.g., 129S1 / SV, 129S1 / SvIm) , 129S2, 129S4, 129S5, 129S9 / SvEvH, 129S6 (129 / SvEvTac) , 129S7, 129S8, 129T1, 129T2. These mice are described, e.g., in Festing et al., Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10: 836 (1999) ; Auerbach et al., Establishment and Chimera Analysis of 129 / SvEv-and C57BL / 6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines (2000) , both of which are incorporated herein by reference in the entirety. In some embodiments, the genetically modified mouse is a mix of the 129 strain and the C57BL / 6 strain. In some embodiments, the mouse is a mix of the 129 strains, or a mix of the BL / 6 strains. In some embodiments, the mouse is a BALB strain, e.g., BALB / c strain. In some embodiments, the mouse is a mix of a BALB strain and another strain. In some embodiments, the mouse is from a hybrid line (e.g., 50%BALB / c-50%12954 / Sv; or 50%C57BL / 6-50%129) . In some embodiments, the mice described herein have C57BL / 6 background.

[0164] In some embodiments, the animal is a rat. The rat can be selected from a Wistar rat, an LEA strain, a Sprague Dawley strain, a Fischer strain, F344, F6, and Dark Agouti. In some embodiments, the rat strain is a mix of two or more strains selected from the group consisting of Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6, and Dark Agouti.

[0165] The animal can have one or more other genetic modifications, and / or other modifications, that are suitable for the particular purpose for which the humanized animal is made.

[0166] Also provided herein are genetically modified non-human animals that comprise a modification of an endogenous non-human immunoglobulin gene locus. In some embodiments, the modification can comprise a human nucleic acid sequence encoding at least a portion of a human protein (e.g., at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to any one of human NKC and / or KIR proteins) . Although genetically modified cells are also provided that can comprise the modifications described herein (e.g., ES cells, somatic cells) , in many embodiments, the genetically modified non-human animals comprise the modification of the endogenous locus in the germline of the animal.

[0167] Genetically modified animals can express one or more human NKC proteins and / or one or more KIR proteins from endogenous mouse loci, wherein one or more endogenous mouse genes have been replaced with human genes and / or a nucleotide sequence that is at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the human NKC and / or KIR gene sequences (e.g., any of the genes listed in Table 1 and Table 3) . In various embodiments, an endogenous non-human gene locus is modified in whole or in part to comprise human nucleic acid sequence. In some embodiments, the endogenous gene locus is the endogenous NKC locus. In some embodiments, the endogenous gene locus is the endogenous LY49 locus. In some embodiments, the endogenous gene locus is a safe harbor locus (e.g., any of the safe harbor loci described herein) .

[0168] In some embodiments, the human nucleic acid sequence is connected to the endogenous NKC locus via an upstream connection site (with a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2) and a downstream connection site (with a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 3) . In some embodiments, the integration of the human nucleic acid sequence (e.g., any of the human nucleic acid sequences described herein) can be verified by sequencing, using PCR primer pair SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7; or SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9. In some embodiments, the integration of the human nucleic acid sequence (e.g., any of the human nucleic acid sequences described herein) can be verified by Southern Blot, using NKC-5’Probe1 (synthesized by primer pair SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11) , NKC-5’Probe2 (synthesized by primer pair SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13) , NKC-3’Probe1 (synthesized by primer pair SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15) , or NKC-3’Probe2 (synthesized by primer pair SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17) .

[0169] In some embodiments, the human nucleic acid sequence is connected to the endogenous Hipp11 locus via an upstream connection site (with a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 18) and a downstream connection site (with a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 19) . In some embodiments, the human nucleic acid sequence is connected to the endogenous Ly49 locus via an upstream connection site (with a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 35) and a downstream connection site (with a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 36) . In some embodiments, the integration of the human nucleic acid sequence (e.g., any of the human nucleic acid sequences described herein) can be verified by sequencing, using PCR primer pair SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25; or SEQ ID NOs: 32, 33, and 34. In some embodiments, the integration of the human nucleic acid sequence (e.g., any of the human nucleic acid sequences described herein) can be verified by Southern Blot, using KIR-5’Probe (synthesized by primer pair SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27) , KIR-3’Probe (synthesized by primer pair SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29) , or KIR-Neo Probe (synthesized by primer pair SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31) .

[0170] Genetic, molecular and behavioral analyses for the non-human mammals described above can be performed. The present disclosure also relates to the progeny produced by the non-human mammal provided by the present disclosure mated with the same or other genotypes. Non-human mammals can be any non-human animal known in the art and which can be used in the methods as described herein. Preferred non-human mammals are mammals, (e.g., rodents) . In some embodiments, the non-human mammal is a mouse.

[0171] The present disclosure also provides a cell line or primary cell culture derived from the non-human mammal or a progeny thereof. A model based on cell culture can be prepared, for example, by the following methods. Cell cultures can be obtained by way of isolation from a non-human mammal, alternatively cell can be obtained from the cell culture established using the same constructs and the standard cell transfection or transduction techniques. The integration of genetic constructs containing DNA sequences encoding human NKC and / or KIR proteins can be detected by a variety of methods.

[0172] There are many analytical methods that can be used to detect exogenous DNA or modifications on the genomic DNA, including methods at the level of nucleic acid (including the mRNA quantification approaches using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) or Southern blotting, and in situ hybridization) and methods at the protein level (including histochemistry, immunoblot analysis and in vitro binding studies) . In addition, the expression level of the gene of interest can be quantified by ELISA techniques well known to those skilled in the art. Many standard analysis methods can be used to complete quantitative measurements. For example, transcription levels can be measured using RT-PCR and hybridization methods including RNase protection, Southern blot analysis, and RNA dot analysis (RNAdot) analysis. Immunohistochemical staining, flow cytometry, and Western blot analysis can also be used to assess the presence of human or humanized proteins.

[0173] Methods of making genetically modified animals

[0174] The genetically modified animals can be made by introducing human NKC and / or KIR genes into the genome of non-human animals to produce animals that can express human NKC and / or KIR proteins.

[0175] In some embodiments, the methods first involve modifying the mouse NKC locus on mouse chromosome 6, e.g., introducing two recombination sites on both sides of the mouse NKC cluster. After recombination, all or part of the mouse NKC cluster is deleted from the mouse chromosome. Next, the human NKC locus is modified on the human chromosome 12. For example, two recombination sites can be introduced on both sides of the human NKC cluster. The modified human chromosomes are then introduced to the mouse receipt cells. The human NKC cluster is then introduced to the corresponding mouse locus by direct replacement. Then, the recipient cells are screened. In some embodiments, the cells do not contain the human chromosomes. The cells are then injected to blastocysts to prepare chimeric mice. Subsequent breeding can be performed to obtain mice containing intact humanized NKC locus.

[0176] In some embodiments, the disclosure provides replacing in at least one cell of the animal, at an endogenous Ly49 gene locus, a sequence ( “KIR cluster” in FIG. 23) encoding the human KIR proteins with a sequence ( “Ly49 cluster” in FIG. 23) encoding the endogenous Ly49 proteins. In some embodiments, the disclosure provides inserting in at least one cell of the animal, at an endogenous Hipp11 gene locus, a sequence ( “KIR cluster” in FIG. 23) encoding the human KIR proteins. In some embodiments, the replacement or insertion occurs in a germ cell, a somatic cell, a blastocyst, or a fibroblast, etc. The nucleus of a somatic cell or the fibroblast can be inserted into an enucleated oocyte.

[0177] Several other techniques may be used in making genetically modified animals, including, e.g., nonhomologous end-joining (NHEJ) , homologous recombination (HR) , zinc finger nucleases (ZFNs) , transcription activator-like effector-based nucleases (TALEN) , and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) -Cas system. In some embodiments, homologous recombination is used. In some embodiments, CRISPR-Cas9 genome editing is used to generate genetically modified animals. Many of these genome editing techniques are known in the art, and is described, e.g., in Yin et al., "Delivery technologies for genome editing, " Nature Reviews Drug Discovery 16.6 (2017) : 387-399, which is incorporated by reference in its entirety. Many other methods are also provided and can be used in genome editing, e.g., micro-injecting a genetically modified nucleus into an enucleated oocyte, and fusing an enucleated oocyte with another genetically modified cell.

[0178] The genetic modification process can involve replacing endogenous sequence with human sequence by homologous recombination. In some embodiments, the cleavage at the upstream and the downstream of the target site (e.g., by zinc finger nucleases, TALEN or CRISPR) can result in DNA double strands break, and the homologous recombination is used to replace endogenous sequence with human sequence.

[0179] In some embodiments, the methods for making a genetically modified, humanized animal, can include the step of replacing at an endogenous locus (or site) , a nucleic acid with a corresponding region of human sequence. The sequence can include one or more NKC genes (e.g., any of the NKC genes described herein) . In some embodiments, the replacement occurs at an endogenous Ly49 locus, where one or more endogenous Ly49 genes are replaced with one or more human KIR genes. In some embodiments, the replacement is mediated by homologous recombination. In some embodiments, the replacement is mediated by Cre recombinase.

[0180] The human chromosome can be obtained from human cell lines, cancer cells, primary cell culture, and / or human fibroblasts. In some embodiments, the human cell is introduced with a first vector and is then fused with a recipient cell. The modified chromosome is then separated and introduced into another appropriate recipient cell. Cells with the desired resistance are selected to obtain cells containing only one human chromosome. Then, a second vector is introduced into the cells, and the cells are selected by resistance. Then, ifneeded, a third vector, and / or a fourth vector can be introduced. The recipient cell can be a mammalian cell, a human cell, or a mouse cell. In some embodiments, the recipient cell is a CHO cell, or preferably an A9 cell. In some embodiments, the modified chromosomes are labeled by fluorescence and separated. And the modified chromosomes are injected into the recipient cells by chromosome microinjection. In some embodiments, the donor cells are induced to multinucleate their chromosomes. These nuclei are then forced through the cell membrane to create microcells, which can be fused to a recipient cell. In some embodiments, microcell-mediated chromosome transfer can also be used. The chromosome manipulation techniques are described, e.g., in CN1200014A; CN109837307A; US20120093785A1; and US2009253902; Kuroiwa et al. "Manipulation of human minichromosomes to carry greater than megabase-sized chromosome inserts. " Nature Biotechnology 18.10 (2000) : 1086-1090; Chinese patent CN1717483A; Paulis, Marianna. "Chromosome Transfer Via Cell Fusion. " Methods in Molecular Biology 738 (2011) : 57; Genes, Chromosomes&Cancer 14: 126127 (1995) ; Tomizuka et al. "Functional expression and germline atransmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice. " Nature Genetics 16.2 (1997) : 133-143; Somatic Cell and Molecular Genetics, Vol. 13, No. 3, 1987, pp. 279-284; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0181] The modification on mouse light chain immunoglobulin locus can be directly performed, as shown in FIG. 3. In some embodiments, a vector is directly used to replace the entire mouse NKC cluster. In some embodiments, the vector has from the 5’ to 3’ : a DNA homology arm sequence upstream of the insertion site, Flp recognition target (FRT) , a mammalian expression promoter (EF-1a) from human elongation factor 1 alpha, a hygromycin resistance gene (partial sequence of hygromycin phosphotransferase; “5’ HygR” ) , the LoxP recognition sequence (Rec01) for the Cre recombinase, 5’PB transposon sequence (PB5’) , a first Core insulator, a Ubiquitin C promoter (UbC) , a sequence encoding the DT receptor (DTR) , a sequence encoding the FMDV self-cleaving peptide (2A) , a neomycin resistance gene sequence (Neo) , a transcription termination / polyadenylation signal sequence (PolyA; “PA” ) , a second Core insulator, a 3’PB transposon sequence (PB3’) , a sequence encoding DTR, a sequence encoding the FMDV self-cleaving peptide (2A) , a puromycin resistance gene partial sequence (3’PuroR) , the Lox recognition sequence (Rec02) for the Cre recombinase, a DNA homology arm sequence downstream of the insertion site, and a diphtheria toxin subunit A (DTA) gene.

[0182] FIG. 5 show a similar targeting strategy at the human NKC locus. Two vectors can first be integrated to human chromosome. The first vector has a DNA homology arm sequence upstream of the insertion site, a PGK promoter, a red fluorescent protein reporter gene (tdTomato) , a transcription termination / polyadenylation signal sequence (PolyA; “PA” ) , PolyA, a Blasticidin resistance gene sequence (BSD) , a mammalian expression promoter (EF-1a) from human elongation factor 1 alpha, the LoxP recognition sequence (Rec101) for the Cre recombinase, a hygromycin resistance gene (partial sequence of hygromycin phosphotransferase; “3’HygR” ) , the Flp recognition target (FRT) , a downstream DNA homology arm sequence, aPGK promoter, a sequence encoding human gaussia luciferase (hGLuc) , and a DTA gene. The second vector has a DNA homology arm sequence upstream of the insertion site, the Lox recognition sequence (Rec102) for the Cre recombinase, a partial sequence of Puromycin resistance gene (5’PuroR) , a PGK promoter, PolyA, a neomycin resistance gene sequence (Neo) , an internal Ribosomal Entry Site (IRES) , a piggyBac transposase gene sequence (PBase) , a mammalian expression promoter (EF-1a) from human elongation factor 1 alpha, a DNA homology arm sequence downstream of insertion site, a PGK promoter, a sequence encoding human gaussia luciferase (hGLuc) , and a DTA gene.

[0183] LoxP recognition sequences can also be added to the human or mouse chromosomes. The cells can also be treated with Cre enzyme, leading to the recombination of the loxP sites, thereby removing genomic DNA sequences. In some embodiments, spontaneous chromosome breakage can be used to remove genomic DNA sequences as well.

[0184] The mouse NKC cluster can be replaced by the human NKC cluster by replacement (e.g., homologous recombination, or Cre-mediated recombination) . In some embodiments, Cre recombination can be used to mediate the replacement. In some embodiments, the vectors can add LoxP recognition sequences into the human chromosome. Similar modifications can be made to the mouse chromosome, wherein two LoxP recognition sequences can be added to the chromosome. For example, Cre recombinase can then mediate the replacement of NKC cluster on mouse chromosome with the NKC cluster on human chromosome.

[0185] The cells can be further screened for cells that do not have human chromosomes (e.g., by DT) . In some cases, cells that are not screened by DT may contain recombinant human chromosome fragments, but these fragments are small and are unstable in mouse cells (e.g., Shinohara et al. (2000) Chromosome Research, 8: 713-725) , and will naturally disappear during cell proliferation. In some embodiments, a large fragment of the modified human chromosome is deleted, e.g., by Cre-mediated deletion or by spontaneous chromosomal breakage.

[0186] FIG. 16 and FIG. 23 show humanization strategies for a mouse Hipp11 locus or Ly49 locus. The targeting strategies involve a vector comprising a 5’ homologous arm, a knock-in fragment including human KIR cluster sequences, and a 3’ homologous arm. The process can involve replacing endogenous Ly49 cluster sequences with the human KIR cluster sequences, or inserting the human KIR cluster sequences at the endogenous Hipp11 gene locus, by homologous recombination. In some embodiments, the cleavage at the upstream and the downstream of the target site (e.g., by zinc finger nucleases, TALEN or CRISPR) can result in DNA double strands break, and the homologous recombination is used to replace endogenous Ly49 cluster sequences with human KIR cluster sequences, or insert the human KIR cluster sequences.

[0187] The 5’ end homologous arm and / or the 3’ end homologous arm can have a desired length to facilitate homologous recombination. In some embodiments, the homology arm is about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, or 50 kb (e.g., about 3 kb) . In some embodiments, the homology arm is less than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, or 50 kb.

[0188] In some embodiments, the vector may also optionally include a reporter protein, e.g., aluciferase (e.g., Gluc) or a fluorescent protein (e.g., EGFP, BFP, etc. ) .

[0189] These modifications can be performed in various cells. In some embodiments, the cell is a stem cell, an embryonic stem cell, or a fertilized egg cell.

[0190] The present disclosure further provides a method for establishing a humanized animal model, involving the following steps:

[0191] (a) providing the cell (e.g. a fertilized egg cell) based on the methods described herein;

[0192] (b) culturing the cell in a liquid culture medium;

[0193] (c) transplanting the cultured cell to the fallopian tube or uterus of the recipient female non-human mammal, allowing the cell to develop in the uterus of the female non-human mammal;

[0194] (d) identifying the germline transmission in the offspring genetically modified humanized non-human mammal of the pregnant female in step (c) .

[0195] In some embodiments, the non-human mammal in the foregoing method is a mouse (e.g., a C57 mouse, a BALB / c mouse, or a C57BL / 6 mouse) .

[0196] In some embodiments, the non-human mammal in step (c) is a female with pseudo pregnancy (or false pregnancy) .

[0197] In some embodiments, the fertilized eggs for the methods described above are C57BL / 6 fertilized eggs. Other fertilized eggs that can also be used in the methods as described herein include, but are not limited to, FVB / N fertilized eggs, BALB / c fertilized eggs, DBA / 1 fertilized eggs and DBA / 2 fertilized eggs.

[0198] Fertilized eggs can come from any non-human animal, e.g., any non-human animal as described herein. In some embodiments, the fertilized egg cells are derived from rodents. The genetic construct can be introduced into a fertilized egg by microinjection of DNA. For example, by way of culturing a fertilized egg after microinjection, a cultured fertilized egg can be transferred to a false pregnant non-human animal, which then gives birth of a non-human mammal, so as to generate the non-human mammal mentioned in the methods described above.

[0199] Cells, tissues, and animals (e.g., mouse) are also provided that comprise the nucleotide sequences as described herein, as well as cells, tissues, and animals (e.g., mouse) that express humanized or chimeric antibodies from an endogenous non-human locus.

[0200] The present disclosure also provides various targeting vectors (e.g., vectors that are useful for making the genetically modified animals) . In some embodiments, the vector can comprise: a) a DNA fragment homologous to the 5’ end of a region to be altered (5’ homology arm) ; b) a sequence comprising desired genetic elements (e.g., LoxP recognition site, drug resistance genes, and / or reporter genes etc. ) ; and c) a second DNA fragment homologous to the 3’end of the region to be altered (3’ homology arm) . The disclosure also relates to a cell comprising the targeting vectors as described herein.

[0201] In some embodiments, the genes in the cell are heterozygous. In some embodiments, the genes in the cell are homozygous.

[0202] In some embodiments, the non-human mammalian cell is a mouse cell. In some embodiments, the cell is a fertilized egg cell.

[0203] The present disclosure further relates to methods for generating genetically modified animal model with two or more human or chimeric genes. The animal can comprise one or more human or humanized immunoglobulin locus and a sequence encoding an additional human or chimeric protein. In some embodiments, the additional human or chimeric protein can be programmed cell death protein 1 (PD-1) , cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) , Lymphocyte Activating 3 (LAG-3) , B And T Lymphocyte Associated (BTLA) , Programmed Cell Death 1 Ligand 1 (PD-L1) , CD27, CD28, CD47, CD137, CD154, T-Cell Immunoreceptor With Ig And ITIM Domains (TIGIT) , T-cell Immunoglobulin and Mucin-Domain Containing-3 (TIM-3) , Glucocorticoid-Induced TNFR-Related Protein (GITR) , or TNF Receptor Superfamily Member 4 (TNFRSF4 or OX40) .

[0204] The methods of generating genetically modified animal model with additional human or chimeric genes (e.g., humanized genes) can include the following steps:

[0205] (a) using the methods as described herein to obtain a genetically modified non-human animal;

[0206] (b) mating the genetically modified non-human animal with another genetically modified non-human animal, and then screening the progeny to obtain a genetically modified non-human animal with two or more human or chimeric genes.

[0207] In some embodiments, in step (b) of the method, the genetically modified animal can be mated with a genetically modified non-human animal with human or chimeric PD-1, CTLA-4, LAG-3, BTLA, PD-L1, CD27, CD28, CD47, CD137, CD154, TIGIT, TIM-3, GITR, SIRPa, or OX40. Some of these genetically modified non-human animal are described, e.g., in PCT / CN2017 / 090320, PCT / CN2017 / 099577, PCT / CN2017 / 099575, PCT / CN2017 / 099576, PCT / CN2017 / 099574, PCT / CN2017 / 106024, PCT / CN2017 / 110494, PCT / CN2017 / 110435, PCT / CN2017 / 120388, PCT / CN2018 / 081628, PCT / CN2018 / 081629; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0208] In some embodiments, the genetically modified animals can have a human Clec1b gene, an endogenous Clec1b gene or a modified Clec1b gene. Clec1b is a type II transmembrane receptor of the C-type lectin superfamily, which is characterized by one or more C-type lectin-like domains (CTLDs) . Clec1b is a platelet-related molecule that activating receptor for the snake venom toxin rhodocytin as well as endogenous ligand podoplanin, and also plays crucial roles in lymphatic / blood vessel separation, tumor cell-induced platelet aggregation and immune response. Previous studies have been reported that Clec1b have an inhibitory effect on platelet aggregation and tumor metastasis in colon carcinoma. Moreover, reports found that Clec1b suppresses metastasis of gastric cancer cells by preventing activation of AKT and GSK3B signaling. Recently, low Clec1b and high PD-L1 have been reported to be a valuable prognostic factor implying worse clinical outcomes in HCC. However, the role of Clec1b in the tumor immune microenvironment and progression of hepatocellular carcinoma has not been fully elucidated. Reports have also shown that mutation (e.g., - / -mutation) of the gene encoding the Clec1b gene can resulted in greatly reduced viability of (- / -) mutants. Details can be found, e.g., in WO2006132788A2, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0209] In mice, the Clec1b gene is located within the mouse NKC cluster, between mouse Clec12b gene and mouse Clec9a gene. In human, the CLEC1B gene is located within the NKC cluster, between human CLEC12A gene and human CLEC12B gene. Thus, in some embodiments, the genetically modified animals described herein can have an endogenous Clec1b gene, thereby maintaining the viability of the genetically modified animals. In some embodiments, the genetically modified animals do not have an endogenous Clec1b gene. In some embodiments, the genetically modified animals have a human CLEC1B gene.

[0210] In some embodiments, the genetically modified animals are mice. In some embodiments, the mice are modified to include a nucleotide sequence that encodes an endogenous Clec1b protein. In some embodiments, the sequence is placed at any suitable position. It can be placed in the intergenic region, or in any suitable position in the genome. In some embodiments, the sequence is placed at a safe harbor locus (e.g., any of the safe harbor loci described herein) . In some embodiments, the sequence is placed at an endogenous Clec1b gene locus. In some embodiments, the nucleic acid encodes a sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a mouse Clec1b protein (Gene ID: 56760) . In some embodiments, the nucleic acid additionally includes the regulatory elements for the Clec1b gene (e.g., promoters) . In some embodiments, the nucleic acid additionally includes auxiliary sequences, e.g., a CAG promotor, WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus (WHV) Posttranscriptional Regulatory Element) , and / or polyA sequences, as shown in FIG. 10.

[0211] In some embodiments, a functional mouse Clec1b locus can be placed in the midst of human NKC gene cluster. In some embodiment, the mouse Clec1b locus is between two human NKC genes. In some embodiments, the human CLEC1B gene between human CLEC12A and human CLEC12B is replaced with the mouse Clec1b locus. In some embodiments, the mouse Clec1b gene are located between human CLEC12A and human CLEC12B in the genome of the animal. In some embodiments, the location of the mouse Clec1b sequence within the human gene sequence can approximate the position of the human CLEC1B (e.g., within the NKC cluster) . In some embodiments, the genetically modified mice has a humanized NKC locus. In some embodiments, the mouse Clec1b is located between human CLEC12A and CLEC12B genes. Placing the mouse Clec1b between human CLEC12A and CLEC12B genes can have various advantages. For example, because these gene replaces the human CLEC1B gene at the same locus, it is likely that the replacement of human Clec1b gene will have limited impact on the transcription and / or translation, and the mouse Clec1b gene can also function properly (as in a location that is similar to the endogenous locus) .

[0212] Thus, in one aspect, the disclosure provides a genetically-modified animal comprising at an endogenous NKC locus, a first sequence comprising one or more human NKC genes; asecond sequence comprising a Clec1b gene; and a third sequence comprising one or more human NKC genes. In some embodiments, the first sequence, the second sequence, and the third sequence are operably linked.

[0213] In some embodiments, the first sequence comprises at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, or at least 8 human NKC genes selected from the group consisting of KLRB1, CLEC2D, CD69, KLRF1, CLEC2B, KLRF2, CLEC2A and CLEC12A genes. In some embodiments, the first sequence comprises all human NKC genes upstream of CLEC1B in Table 1 (except KLRG1 and CLEC1B) . In some embodiments, the first sequence is an unmodified sequence derived from a human NKC locus.

[0214] In some embodiments, the second sequence comprises an endogenous Clec1b gene (e.g., mouse Clec1b gene) . In some embodiments, the second sequence does not have a human CLEC1B gene. In some embodiments, the second sequence comprises a non-human Clec1b gene, e.g., a rodent Clec1b gene. In some embodiments, the second sequence comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a mouse Clec1b gene.

[0215] In some embodiments, the third sequence comprises at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, or at least 13 human NKC genes selected from the group consisting of CLEC12B, CLEC9A, CLEC1A, CLEC7A, OLR1, TMEM52B, GABARAPL1, KLRD1, KLRK1, KLRC4, KLRC3, KLRC2, and KLRC1. In some embodiments, the third sequence comprises all human NKC genes downstream of CLEC1B in Table 1 (except KLRA1P and CLEC1B) . In some embodiments, the third sequence is an unmodified sequence derived from a human NKC locus.

[0216] In some embodiments, the Clec1b is an endogenous sequence. In some embodiments, the Clec1b is not replaced, and / or located in its endogenous or native position. In some embodiments, the mouse NKC genes before mouse Clec12b (including Clec12b) gene in the NKC locus are replaced with human NKC genes. In some embodiments, the mouse NKC genes after mouse Clec9a (including Clec9a) gene in the NKC locus are replaced with one or more human NKC genes.

[0217] Thus, in some embodiments, the mouse NKC genes can be replaced with human NKC genes by more than one (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5) replacements. In the first step, a selected number of mouse NKC genes on the 5’ side of the Clec1b (e.g., all NKC genes upstream of Clec1b in Table 2) are replaced with human NKC genes. In the second step, a selected number of mouse NKC genes on the 3’ side of the Clec1b (e.g., all mouse NKC genes downstream of Clec1b in Table 2) are replaced with human NKC genes. The replacement can be performed by homologous recombination or Cre-mediated recombination.

[0218] In some embodiments, one or more mouse NKC genes (including mouse Clec1b gene) can be replaced with one or more human NKC genes (including human CLEC1B gene) by replacement first, and then a sequence including mouse Clec1b gene can be knocked back into the mouse genome. For example, after replacement of the NKC genes, a sequence including mouse Clec1b gene can be inserted to a safe harbor locus of the mouse genome. Thus, the genetically modified mice have both human CLEC1B gene and mouse Clec1b gene in the genome. As another example, after replacement of NKC genes, the human CLEC1B gene within the integrated human NKC locus can be replaced with mouse Clec1b gene, resulting in genetically modified mice having mouse Clec1b gene, but not human CLEC1B gene, in the genome of the mice.

[0219] In some embodiments, the human NKC locus can be modified first by replacing human CLEC1B gene with mouse Clec1b gene. The modified human NKC locus can then be used to replace the corresponding mouse NKC locus. Thus, the genetically modified mice have mouse Clec1b gene, but not human CLEC1B gene, in the genome of the mice.

[0220] In some embodiments, the mice do not have mouse Clec1b gene. In some embodiments, the mice have human CLEC1B gene.

[0221] In some embodiments, provided herein are methods to make a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human NKC proteins, the method comprising: replacing at an endogenous NKC locus of one chromosome, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more endogenous NKC proteins (e.g., any of the combinations of endogenous NKC genes described herein) with an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins (e.g., any of the combinations of human NKC genes described herein) , wherein the one or more endogenous NKC proteins comprise endogenous Clec1b, and b) disrupting at an endogenous NKC locus of the other chromosome. In some embodiments, the endogenous NKC locus of the other chromosome is disrupted by deleting one or more genes immediately following endogenous Clec1b. In some embodiments, the endogenous NKC locus of the other chromosome is disrupted by deleting a continuous sequence starting from mouse Clec9a to mouse Klrc1. In some embodiments, the disrupted endogenous NKC locus of the other chromosome comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, or at least 18 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, and Clec1b. In some embodiments, the disrupted endogenous NKC locus of the other chromosome comprises a contiguous sequence starting from mouse Klrb1a to mouse Clec1b. The two chromosomes of the obtained animal (e.g., mouse) are shown in FIG. 27.

[0222] Without wishing to be bound by theory, it is contemplated that expression of one or more endogenous NKC proteins in the obtained animal (e.g., mouse) is disrupted, and the animal (e.g., mouse) has a comparable viability as compared to an unmodified animal (e.g., mouse) , e.g., one having an endogenous Clec1b gene at the endogenous NKC locus of both chromosomes. In some embodiments, expression of one or more endogenous NKC proteins in the obtained animal (e.g., mouse) is less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, less than 10%, less than 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2%, or less than 1%as compared to that of an unmodified animal (e.g., mouse) . In some embodiments, the viability of the obtained animal (e.g., mouse) is at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 100%as compared to that of an unmodified animal (e.g., mouse) .

[0223] Various methods can be used to increase the viability of the mice. In some embodiments, the life span of the genetically-modified mice is at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95%of the life span of unmodified wildtype mice. Methods of increasing mouse viability are known in the art.

[0224] The disclosure also provides a nucleic acid sequence that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identical to any nucleotide sequence as described herein, and an amino acid sequence that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identical to any amino acid sequence as described herein.

[0225] In some embodiments, the disclosure relates to nucleotide sequences encoding any peptides that are described herein, or any amino acid sequences that are encoded by any nucleotide sequences as described herein. In some embodiments, the nucleic acid sequence is less than 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, or 600 nucleotides. In some embodiments, the amino acid sequence is less than 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, or 400 amino acid residues.

[0226] In some embodiments, the amino acid sequence (i) comprises an amino acid sequence; or (ii) consists of an amino acid sequence, wherein the amino acid sequence is any one of the sequences as described herein.

[0227] In some embodiments, the nucleic acid sequence (i) comprises a nucleic acid sequence; or (ii) consists of a nucleic acid sequence, wherein the nucleic acid sequence is any one of the sequences as described herein.

[0228] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position (as used herein amino acid or nucleic acid “identity” is equivalent to amino acid or nucleic acid “homology” ) . The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0229] The percentage of residues conserved with similar physicochemical properties (percent homology) , e.g. leucine and isoleucine, can also be used to measure sequence similarity. Families of amino acid residues having similar physicochemical properties have been defined in the art. These families include e.g., amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine) , nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan) , beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . The homology percentage, in many cases, is higher than the identity percentage. Thus, the present disclosure also provides an amino acid sequence that has at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%homology percentage to any amino acid sequence as described herein, or a nucleic acid encoding these amino acid sequences.

[0230] Methods of using genetic modified animals

[0231] Replacement of non-human genes with homologous or orthologous human genes or human sequences or insertion of homologous or orthologous human genes or human sequences in a non-human animal, at the endogenous non-human locus and under control of endogenous promoters and / or regulatory elements, can result in a non-human animal with qualities and characteristics that may be substantially different from a typical knockout-plus-transgene animal. In the typical knockout-plus-transgene animal, an endogenous locus is removed or damaged and a fully human transgene is inserted into the animal's genome and presumably integrates at random into the genome. Typically, the location of the integrated transgene is unknown; expression of the human protein is measured by transcription of the human gene and / or protein assay and / or functional assay. Inclusion in the human transgene of upstream and / or downstream human sequences are apparently presumed to be sufficient to provide suitable support for expression and / or regulation of the transgene.

[0232] In some cases, the transgene with human regulatory elements expresses in a manner that is unphysiological or otherwise unsatisfactory, and can be actually detrimental to the animal. The disclosure demonstrates that a replacement or insertion with human sequence at an endogenous locus under control of endogenous regulatory elements provides a physiologically appropriate expression pattern and level that results in a useful humanized animal whose physiology with respect to the replaced gene are meaningful and appropriate in the context of the humanized animal's physiology.

[0233] Genetically modified animals that express one or more human NKC proteins and / or one or more human KIR proteins, e.g., in a physiologically appropriate manner, provide a variety of uses that include, but are not limited to, developing therapeutics for human diseases and disorders, and assessing the toxicity and / or the efficacy of these human therapeutics in the animal models.

[0234] In various aspects, genetically modified animals are provided that express human NKC and / or KIR proteins, which are useful for testing therapeutic agents that can decrease or block the interaction between the interaction between NK cell receptors (e.g., any of the NKC proteins or KIR proteins described herein) and antibodies targeting one or more NK cell receptors, testing whether an therapeutic agent can increase or decrease the immune response, and / or determining whether an agent is an NK cell receptor agonist or antagonist. The genetically modified animals can be, e.g., an animal model of a human disease, e.g., the disease is induced genetically (aknock-in or knockout) . In various embodiments, the genetically modified non-human animals further comprise an impaired immune system, e.g., a non-human animal genetically modified to sustain or maintain a human xenograft, e.g., a human solid tumor or a blood cell tumor.

[0235] In some embodiments, the therapeutic agent (e.g., an antibody or drug targeting one or more NK cell receptors) described herein can bind to a NK cell receptor expressed on the surface of NK cells to release the inhibition signals when the NK cell receptor binds to its ligand.

[0236] In some embodiments, the genetically modified animals can be used for determining effectiveness of a therapeutic agent (e.g., an antibody or drug targeting one or more NK cell receptors) for the treatment of cancer. In some embodiments, the methods involve administering the therapeutic agent to the animal as described herein, wherein the animal has a cancer or tumor; and determining inhibitory effects of the therapeutic agent to the cancer or tumor. The inhibitory effects that can be determined include, e.g., a decrease of tumor size or tumor volume, a decrease of tumor growth, a reduction of the increase rate of tumor volume in a subject (e.g., as compared to the rate of increase in tumor volume in the same subject prior to treatment or in another subject without such treatment) , a decrease in the risk of developing a metastasis or the risk of developing one or more additional metastasis, an increase of survival rate, and an increase of life expectancy, etc. The tumor volume in a subject can be determined by various methods, e.g., as determined by direct measurement, MRI or CT.

[0237] In some embodiments, the tumor comprises one or more cancer cells (e.g., human or mouse cancer cells) that are injected into the animal. In some embodiments, the antibody or drug described herein can activate NK cell-mediated cytotoxicity and / or induce secretion of pro-inflammatory cytokines. In some embodiments, the antibody or drug described herein does not activate NK cell-mediated cytotoxicity or induce secretion of pro-inflammatory cytokines. In some embodiments, the antibody or drug described herein can inhibit NK cell-mediated cytotoxicity and / or reduce secretion of pro-inflammatory cytokines. In some embodiments, the antibody or drug described herein does not inhibit NK cell-mediated cytotoxicity or reduce secretion of pro-inflammatory cytokines.

[0238] In some embodiments, the genetically modified animals can be used for determining whether an antibody or drug targeting one or more NK cell receptors is an agonist or antagonist. In some embodiments, the methods as described herein are also designed to determine the effects of the therapeutic agent (e.g., an antibody or drug targeting one or more NK cell receptors) on NK cell receptors, e.g., whether the agent can upregulate the immune response or downregulate immune response, and / or whether the agent can induce complement mediated cytotoxicity (CMC) or antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) . In some embodiments, the genetically modified animals can be used for determining the effective dosage of a therapeutic agent for treating a disease in the subject, e.g., cancer.

[0239] The inhibitory effects on tumors can also be determined by methods known in the art, e.g., measuring the tumor volume in the animal, and / or determining tumor (volume) inhibition rate (TGITV) . The tumor growth inhibition rate can be calculated using the formula TGITV (%) = (1–TVt / TVc) ×100%, where TVt and TVc are the mean tumor volume (or weight) of treated and control groups.

[0240] In some embodiments, the therapeutic agent (e.g., an antibody or drug targeting one or more NK cell receptors) is designed for treating various cancers. As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for autonomous growth, i.e., an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include all types of cancerous growths or oncogenic processes, metastatic tissues or malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. The term “tumor” as used herein refers to cancerous cells, e.g., a mass of cancerous cells. Cancers that can be treated or diagnosed using the methods described herein include malignancies of the various organ systems, such as affecting lung, breast, thyroid, lymphoid, gastrointestinal, and genito-urinary tract, as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, non-small cell carcinoma of the lung, cancer of the small intestine and cancer of the esophagus. In some embodiments, the agents described herein are designed for treating or diagnosing a carcinoma in a subject. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues including respiratory system carcinomas, gastrointestinal system carcinomas, genitourinary system carcinomas, testicular carcinomas, breast carcinomas, prostatic carcinomas, endocrine system carcinomas, and melanomas. In some embodiments, the cancer is renal carcinoma or melanoma. Exemplary carcinomas include those forming from tissue of the cervix, lung, prostate, breast, head and neck, colon and ovary. The term also includes carcinosarcomas, e.g., which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation.

[0241] In some embodiments, the cancer described herein is lymphoma, non-small cell lung cancer, cervical cancer, leukemia, ovarian cancer, nasopharyngeal cancer, breast cancer, endometrial cancer, colon cancer, rectal cancer, gastric cancer, bladder cancer, glioma, lung cancer, bronchial cancer, bone cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, liver and bile duct cancer, esophageal cancer, kidney cancer, thyroid cancer, head and neck cancer, testicular cancer, glioblastoma, astrocytoma, melanoma, myeloproliferation abnormal syndromes, and sarcomas. In some embodiments, the leukemia is selected from acute lymphocytic (lymphoblastic) leukemia, acute myeloid leukemia, myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, multiple myeloma, plasma cell leukemia, and chronic myelogenous leukemia. In some embodiments, the lymphoma is selected from Hodgkin's lymphoma and non-Hodgkin's lymphoma, including B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, mantle cell lymphoma, marginal zone B-cell lymphoma, T-cell lymphoma, and Waldenstrom macroglobulinemia. In some embodiments, the sarcoma is selected from the group consisting of osteosarcoma, Ewing sarcoma, leiomyosarcoma, synovial sarcoma, soft tissue sarcoma, angiosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, and chondrosarcoma. In a specific embodiment, the cancer is breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, melanoma, kidney cancer, lung cancer, or liver cancer.

[0242] In some embodiments, the therapeutic agent (e.g., an antibody or drug targeting one or more NK cell receptors) is designed for treating various autoimmune diseases, including rheumatoid arthritis, Crohn’s disease, systemic lupus erythematosus, ankylosing spondylitis, inflammatory bowel diseases (IBD) , ulcerative colitis, or scleroderma. In some embodiments, the therapeutic agent is designed for treating various immune disorders, including allergy, asthma, and / or atopic dermatitis. Thus, the methods as described herein can be used to determine the effectiveness of an therapeutic agent in inhibiting immune response. In some embodiments, the immune disorders described herein is graft versus host disease (GVHD) , psoriasis, allergy, asthma, myocarditis, nephritis, hepatitis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, scleroderma, hyperthyroidism, idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune hemolytic anemia, ulcerative colitis, autoimmune liver disease, diabetes, pain or neurological disorders, etc. In some embodiments, the therapeutic agent is designed for treating various inflammations, e.g., viral inflammation. In some embodiments, the inflammation described herein includes both acute inflammation and chronic inflammation. Specifically, the inflammation includes but not limited to degenerative inflammation, exudative inflammation (e.g., serous inflammation, fibrinous inflammation, suppurative inflammation, hemorrhagic inflammation, necrotic inflammation, catarrhal inflammation) , proliferative inflammation, specific inflammation (e.g., tuberculosis, syphilis, leprosy, or lymphogranuloma) .

[0243] In some embodiments, the therapeutic agent (e.g., an antibody or drug targeting one or more NK cell receptors) is designed for treating various cardiovascular diseases, e.g., heart attack, stroke, heart failure, arrhythmia, or heart valve complications. In some embodiments, the cardiovascular disease described herein is thrombus.

[0244] The present disclosure also provides methods of determining toxicity of an antibody (e.g., an antibody targeting one or more NK cell receptors) . The methods involve administering the antibody to the animal as described herein. The animal is then evaluated for its weight change, red blood cell count, hematocrit, and / or hemoglobin. In some embodiments, the antibody can decrease the red blood cells (RBC) , hematocrit, or hemoglobin by more than 20%, 30%, 40%, or 50%. In some embodiments, the animals can have a weight that is at least 5%, 10%, 20%, 30%, or 40%smaller than the weight of the control group (e.g., average weight of the animals that are not treated with the antibody) .

[0245] The present disclosure also relates to the use of the animal model generated through the methods as described herein in the development of a product related to an immunization processes of human cells, the manufacturing of a human antibody, or the model system for a research in pharmacology, immunology, microbiology and medicine.

[0246] In some embodiments, the disclosure provides the use of the animal model generated through the methods as described herein in the production and utilization of an animal experimental disease model of an immunization processes involving human cells, the study on a pathogen, or the development of a new diagnostic strategy and / or a therapeutic strategy.

[0247] The disclosure also relates to the use of the animal model generated through the methods as described herein in the screening, verifying, evaluating or studying the NKC and / or KIR gene function, human NK cell receptor antibodies, drugs for human NK cell receptor targeting sites, the drugs or efficacies for human NK cell receptor targeting sites, the drugs for immune-related diseases and antitumor drugs.

[0248] In some embodiments, the disclosure provides a method to verify in vivo efficacy of TCR-T, CAR-T, and / or other immunotherapies (e.g., T-cell adoptive transfer therapies) . For example, the methods include transplanting human tumor cells into the animal described herein, and applying human CAR-T to the animal with human tumor cells. Effectiveness of the CAR-T therapy can be determined and evaluated. In some embodiments, the animal is selected from the NKC locus and / or Ly49 locus humanized non-human animal prepared by the methods described herein, the NKC locus and / or Ly49 locus humanized non-human animal described herein, the double-or multi-humanized non-human animal generated by the methods described herein (or progeny thereof) , a non-human animal expressing one or more human NKC and / or KIR proteins, or the tumor-bearing or inflammatory animal models described herein. In some embodiments, the TCR-T, CAR-T, and / or other immunotherapies can treat the NK cell-associated diseases described herein. In some embodiments, the TCR-T, CAR-T, and / or other immunotherapies provides an evaluation method for treating the NK cell-associated diseases described herein.

[0249] EXAMPLES

[0250] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0251] EXAMPLE 1: Mice with humanized NKC region

[0252] Human and mouse NKC clusters are located on chromosome 12 and chromosome 6, respectively. FIG. 1A and FIG. 1B show schematic diagrams of human NKC region and mouse NKC region, respectively.

[0253] In order to make genetically-modified (e.g., NKC region humanized) mice expressing human NKC proteins, various strategies can be used. For example, one or more, a majority of (e.g., more than half of all NKC genes) , or even all genes of the mouse NKC region can be in situ replaced by the corresponding human NKC genes through a stepwise approach. In some cases, all or part of the mouse NKC region can be introduced into the mouse endogenous NKC region by direct replacement (e.g., homologous recombination or Cre-mediated recombination) . In some cases, all or part of the mouse NKC region can be removed, and the corresponding human NKC region can be inserted into the mouse genome (e.g., in situ insertion or insertion at the “safe harbor” locus) .

[0254] STRATEGY1

[0255] Here, a direct replacement strategy of the NKC cluster was used to illustrate how to humanize the mouse NKC region. A nucleotide sequence at the mouse NKC region ( “mNKC cluster, ” from Klrb1a to Klrc1) was replaced with a nucleotide sequence of the human NKC region ( “hNKC cluster, ” from KLRB1 to KLRC1) , to obtain a humanized NKC region as shown in FIG. 1C (only selected genes are displayed) , thereby humanizing the mouse NKC region.

[0256] Specifically, the methods first involve modifying the human NKC region on human chromosome 12 (hChr12) , and the mouse NKC region on mouse chromosome 6 (mChr6) , respectively. Then, the modified human chromosomes were introduced into the mouse recipient cells containing the modified mouse chromosomes. Next, the recipient cells were screened for the correct replacement. After screening, the cells were injected to blastocysts to prepare chimeric mice. Subsequent breeding was performed to obtain mice containing a humanized NKC region.

[0257] The connection between the 5’ end of the human NKC cluster genes and the mouse sequence was designed as:  (SEQ ID NO: 1) , wherein the sequence in italic (in lowercase) at the 5’ end is the mouse sequence, the sequences in bold are the restriction site sequences or additional sequences, the sequences with double underlines are FRT sites, the sequence with a single underline is the EF-1a+HygR+PA sequence, and the sequence at the 3’ end (in lowercase) is the human sequence.

[0258] The sequence between FRT sites can be removed. After the removal, the sequence is  (SEQ ID NO: 2) .

[0259] The connection between the 3’ end of human NKC cluster genes and the mouse sequence was designed as:  (SEQ ID NO: 3) , wherein the sequence in italic at the 3’ end is t he mouse sequence, the sequences in bold are the restriction site sequences or additional sequenc es, the sequence with a single underline is a lox site, and the sequence at the 5’ end (in lowercase) is the human sequence.

[0260] Modification of the mouse chromosome 6

[0261] Two recombination sites (Rec01 and Rec02) were introduced on both sides of the mNKC cluster locus, and the resulting modified chromosome is shown in FIG. 2. One of the recombination sites is a wildtype loxP site, and the other is a heterospecific mutant lox site (lox2272) . The recombination cannot occur between the wildtype loxP site and the heterospecific mutant lox site. The modification was performed in mouse embryonic stem cells.

[0262] The detailed targeting strategy is shown in FIG. 3. The vector V01 has the following elements from the 5’ to 3’ end: a DNA homology arm sequence upstream of the insertion site, Flp recognition target (FRT) , a mammalian expression promoter (EF-1a) from human elongation factor 1 alpha, a hygromycin resistance gene (partial sequence of hygromycin phosphotransferase; “5’ HygR” ) , the LoxP recognition sequence (Rec01) for the Cre recombinase, 5’PB transposon sequence (PB5’) , a first Core insulator, a Ubiquitin C promoter (UbC) , asequence encoding the DT receptor (DTR) , a sequence encoding the FMDV self-cleaving peptide (2A) , a neomycin resistance gene sequence (Neo) , a transcription termination / polyadenylation signal sequence (PolyA; “PA” ) , a second Core insulator, a 3’PB transposon sequence (PB3’) , a sequence encoding DTR, a sequence encoding the FMDV self-cleaving peptide (2A) , a puromycin resistance gene partial sequence (3’PuroR) , the Lox recognition sequence (Rec02) for the Cre recombinase, a DNA homology arm sequence downstream of the insertion site, and a diphtheria toxin subunit A (DTA) gene. In some cases, the first and / or second Core insulators are optional.

[0263] The constructed targeting vector V01 was preliminarily confirmed by restriction enzyme digestion, and then verified by sequencing. The correct targeting vector was electroporated and transduced into embryonic stem (ES) cells of C57BL / 6 mice. The cells were screened by corresponding antibiotic resistance gene markers, or their combinations. PCR was performed to confirm the integration of vector V01 into the correct locus in mouse genomes. The positive ES cells containing mChr6-mut1 were used for the subsequent experiments.

[0264] Modification of the human chromosome 12

[0265] In this experiment, two recombination sites (Rec101 and Rec102) were introduced on both sides of the hNKC cluster locus. The recombination cannot occur between Rec101 and Rec102. The modified human chromosome 12 is shown in FIG. 4.

[0266] An overview of the targeting strategy is shown in FIG. 5. The first targeting vector V02 has the following elements from the 5’ to 3’ end: a DNA homology arm sequence upstream of the insertion site, a PGK promoter, a red fluorescent protein reporter gene (tdTomato) , a transcription termination / polyadenylation signal sequence (PolyA; “PA” ) , PolyA, a Blasticidin resistance gene sequence (BSD) , a mammalian expression promoter (EF-1a) from human elongation factor 1 alpha, the LoxP recognition sequence (Rec101) for the Cre recombinase, a hygromycin resistance gene (partial sequence of hygromycin phosphotransferase; “3’ HygR” ) , the Flp recognition target (FRT) , a downstream DNA homology arm sequence, a PGK promoter, a sequence encoding human gaussia luciferase (hGLuc) , and a DTA gene.

[0267] The second targeting vector (V03) has the following elements from the 5’ to 3’ end: a DNA homology arm sequence upstream of the insertion site, the Lox recognition sequence (Rec102) for the Cre recombinase, a partial sequence of Puromycin resistance gene (5’PuroR) , a PGK promoter, PolyA, a neomycin resistance gene sequence (Neo) , an internal Ribosomal Entry Site (IRES) , a piggyBac transposase gene sequence (PBase) , a mammalian expression promoter (EF-1a) from human elongation factor 1 alpha, a DNA homology arm sequence downstream of insertion site, a PGK promoter, a sequence encoding human gaussia luciferase (hGLuc) , and a DTA gene.

[0268] The vectors V02 and V03 were introduced into human receptor cells containing chromosome 12, and the cells were selected by appropriate drug resistance markers or a combination thereof (e.g., Blasticidin and / or G418) . The human receptor cells included: embryonic stem cells, fibroblasts, and / or human cancer cells.

[0269] In one experiment, the human embryonic stem cells H9 were selected and transduced with vector V02. After screening with resistance genes, the positive H9 cells containing modified human chromosome 12 were fused with mouse recipient cells (e.g., A9 cells) . Then, the modified human chromosome 12 was introduced into another appropriate mouse recipient cell type (e.g., CHO cells) . The cells were then selected by G418 resistance to obtain cells containing only one human chromosome 12. Then, vector V03 was introduced into the modified CHO cells, and the cells were screened by resistance gene. The positive clones containing hChr12-mut were treated with Cre recombinase. The chromosome manipulation techniques are described e.g., in Kuroiwa et al. "Manipulation of human minichromosomes to carry greater than megabase-sized chromosome inserts. " Nature Biotechnology 18.10 (2000) : 1086-1090; CN1200014A; CN109837307A; US20120093785A1; US2009253902; CN1717483A; Paulis, Marianna. "Chromosome Transfer Via Cell Fusion. " Methods in Molecular Biology 738 (2011) : 57; Genes, Chromosomes & Cancer 14: 126127 (1995) ; Tomizuka et al. "Functional expression and germline atransmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice. " Nature Genetics 16.2 (1997) : 133-143; and Somatic Cell and Molecular Genetics, Vol. 13, No. 3, 1987, pp. 279-284; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0270] In one experiment, the human fibroblasts HFF were selected and were transduced with vector V03. After screening with resistance genes, the positive HFF cells containing modified human chromosome 12 were fused with mouse recipient cells (e.g., CHO cells) . Then, the modified human chromosome 12 was introduced into another appropriate mouse recipient cell type (e.g., A9 cells) . The cells were then screened by resistance genes to obtain cells containing only one human chromosome 12. Then, vector V02 was introduced into the modified A9 cells, and the cells were screened by resistance genes. The positive clones containing hChr12-mut were treated with Cre recombinase.

[0271] Introduction of human chromosomes into mouse ES cells

[0272] The modified chromosome hChr12-mut was introduced into mouse ES cells containing mChr6-mut1 obtained by methods described herein. The cells were then screened with resistance genes. Only the ES cells containing one human chromosome hChr12-mut were selected. Cre recombinase then mediated the replacement of the NKC cluster region on mouse chromosome mChr6-mut1 with the NKC cluster region on human chromosome hChr12-mut (FIG. 6) .

[0273] Hygromycin and puromycin were used for screening positive cells containing mouse chromosome mChr6-mut2. The cells were further screened by diphtheria toxin (DT) to obtain mouse cells that did not contain human chromosomes before being injected into mouse blastocysts. In some cases, the cells were directly injected into blastocysts without DT screening.

[0274] The cells after Cre recombination were tested to confirm that the human NKC cluster sequences were integrated into the mouse genome. The PCR results are shown in FIGS. 7A-7C, in which all 8 cells numbered D01, D02, E01, H01, B03, C01, C02 and C03 had the correct recombination. The PCR primers used are shown in the table below.

[0275] Table 5

[0276] The positive clones identified by PCR were then verified by Southern Blot. The probes and the size of target fragments are shown in the table below.

[0277] Table 6

[0278] The following probes were used in Southern Blot assays:

[0279] NKC-5’Probe1:

[0280] NKC-5’Probe1-F: 5’-AAGTAGCTCATAAAATAGTAGATTTTC-3’ (SEQ ID NO: 10) ,

[0281] NKC-5’Probe1-R: 5’-CCATGTTTTGTTTTCAAACCTAAACTG-3’ (SEQ ID NO: 11) ;

[0282] NKC-3’Probe1:

[0283] NKC-3’Probe1-F: 5’-GCCTTGGAGTTGCAGTTTATGTCAT-3’ (SEQ ID NO: 12) ,

[0284] NKC-3’Probe1-R: 5’-TAAGGCTATATCCACCCAGTTAGTC-3’ (SEQ ID NO: 13) ;

[0285] NKC-5’Probe2:

[0286] NKC-5’Probe2-F: 5’-TTATAAACATATATTAGAGCACCCA-3’ (SEQ ID NO: 14) ,

[0287] NKC-5’Probe2-R: 5’-AGACTTAGGAAACAAGTCTGTCTTCT-3’ (SEQ ID NO: 15) ;

[0288] NKC-3’Probe2:

[0289] NKC-3’Probe2-F: 5’-GGTAGCTGAGTCACTGAGGTTTGCC-3’ (SEQ ID NO: 16) ,

[0290] NKC-3’Probe2-R: 5’-AGCTGACTTATGACTTAGGTGTTGT-3’ (SEQ ID NO: 17) .

[0291] Furthermore, cells without random insertions were analyzed by fluorescence in situ hybridization (FISH) using three BAC Probes: CH17-16N6, CH17-55F9, and CH17-182H4, which were all labeled with PromoFluor 555P, Conjugated Dyes (PromoKine, Cat#: PK-PF555P-8-100) and could be used to identify three different sites of the human NKC cluster. The representative FISH images are shown in FIG. 8, in which the arrows indicate the human NKC cluster fragments. The results indicated that human chromosome fragments were successfully integrated into the mouse chromosome.

[0292] Making mice containing a humanized NKC cluster locus

[0293] The positive clones that had been screened (black mice) were introduced into isolated blastocysts (white mice) , and the resulted chimeric blastocysts were transferred to a culture medium for short-term culture and then transplanted to the fallopian tubes of the recipient mother (white mice) to produce the F0 chimeric mice (black and white) . The F1 generation mice were obtained by backcrossing the F0 generation chimeric mice with wildtype mice. The positive mice were also bred with the Flp transgenic mice to remove the positive selectable marker genes.

[0294] The integration of human NKC cluster was confirmed by PCR. The primers NKC-L-F1 and NKC-R-R1 or primers NKC-L-F2 and NKC-R-R2 (Table 5) , were used for PCR amplification, and 6 clones were identified as positive clones with numbers F1-01 to F1-06 (FIGS. 9A-9B) . The results indicates that NKC humanized mice can be generated using the method described herein.

[0295] Reports have shown that mutation (e.g., - / -mutation) of the gene encoding the ortholog of human C-type lectin-like receptor 2 (Clec2, also called Clec1b) can result in reduced viability. See, e.g., WO2006132788A2. Although NKC humanized mice having a human CLEC1B gene were obtained as described herein, the mouse Clec1b gene can also be knocked back into the NKC humanized mice. Various methods can be used, e.g., replacement of the human CLEC1B gene of the NKC humanized mice with the mouse Clec1b gene sequence (DNA or cDNA sequence) ; insertion of a sequence including a mouse Clec1b gene into the NKC humanized mouse genome, e.g., insertion at one of the “safe harbor” loci (e.g., Hipp11 locus or Rosa26 locus) , or insertion on either or both sides of the hNKC gene cluster.

[0296] As shown in FIG. 10, an insertion strategy is used to illustrate how mouse Clec1b sequence can be reinserted at the Rosa26 gene locus (e.g., between exon 1 and exon 2) of the NKC humanized mouse genome.

[0297] As shown in FIG. 11, a replacement strategy is used to illustrate how the mouse Clec1b sequence can be used to replace the human CLEC1B gene locus of the NKC humanized mouse genome. The replacement of mouse Clec1b was confirmed by PCR and Southern Blot, and the exemplary results are shown in FIG. 33. The probes and the size of target fragments are shown in the table below.

[0298] Table 7

[0299] The following probes were used in Southern Blot assays:

[0300] 5’Probe:

[0301] 5’Probe-F: 5’-CCTGTTAGTAAATATTTTCCTGTAA-3’ (SEQ ID NO: 49) ,

[0302] 5’Probe-R: 5’-CAAATCATGATATTTTGAAGATCAGA-3’ (SEQ ID NO: 50) ;

[0303] 3’Probe:

[0304] 3’Probe-F: 5’-AGGAGATTTGCAGAACAGATTGATTAG-3’ (SEQ ID NO: 51) ,

[0305] 3’Probe-R: 5’-CATTTCCAATATGAGAAATTCTTCCA-3’ (SEQ ID NO: 52) ;

[0306] A Probe:

[0307] A Probe-F: 5’-GGTATACAGATCATCAAGTTTTATC-3’ (SEQ ID NO: 53) ,

[0308] A Probe-R: 5’-GAAAATGAGTAGTAGCTCATGAAGT-3’ (SEQ ID NO: 54) .

[0309] STRATEGY2

[0310] The modified chromosome hChr12-mut1 (as shown in FIG. 12) can also be obtained by replacing the CLEC1B gene on human chromosome 12 with the mouse Clec1b gene through molecular cloning methods. Afterwards, a similar method described herein can be used to introduce recombination sites on both sides of the hNKC cluster to obtain hChr12-mut2, which can then be introduced to ES cells containing mChr6-mut1. Humanized mice containing mChr6-mut3 were obtained through Cre recombinase-mediated sequence replacement between the recombination sites. An exemplary targeting strategy is shown in FIG. 13.

[0311] STRATEGY3

[0312] In another humanization modification approach, the human NKC gene cluster was introduced while retaining part of the mouse NKC cluster genes. Specifically, a further step involved the knockout of certain gene sequences within the endogenous mouse NKC region after obtaining the heterozygous NKC-humanized mice (NKCH / +, e.g., F1-01 to F1-06 in Strategy 1) .

[0313] The partial gene sequences of the endogenous NKC in the obtained heterozygous NKC-humanized mice were selectively knocked out. The selective knockout includes the complete or partial knockout of all or some of the genes listed in the following table. Gene knockout can be achieved through various methods, such as stepwise knockout of each gene or simultaneous knockout of all or some genes based on their distribution positions. The information about genes available for selective knockout is provided in the table below.

[0314] Table 8

[0315] Here, all the genes in Table 8 (from Clec9a to Klrc1) of the heterozygous NKC humanized mice were simultaneously knockout by gene editing techniques that are known in the art, to obtain a modified mouse chromosome 6 (mChr6-mut4) . The obtained heterozygous NKC-humanized mice with one modified chromosome 6 comprising hNKC cluster genes (from KLRB1 to KLRC1) (mChr6-mut) , and the other comprising partial mNKC cluster genes (excluding Clec9a to Klrc1) (mChr6-mut4) , as illustrated in FIG. 27.

[0316] The integration of human NKC cluster (NKC-WT-F, NKC-WT-R and hNKC-Mut) and the knockout of mouse partial NKC cluster (mNKC-F and mNKC-Mut) were confirmed by PCR. The primers shown in Table 9 were used for PCR amplification, and 7 clones were identified as positive clones with numbers F0-01 to F0-07 (FIGS. 28A-28B) . The results indicates that NKC humanized mice can be generated using the method described herein.

[0317] Table 9

[0318] EXAMPLE 2: Mice with humanized KIR region

[0319] In human, the single Ly49 sequence is a pseudogene, and the immunoglobulin superfamily KIR gene family is extensive, which is located on chromosome 19. Conversely, the C-type lectin-related Ly49 gene family predominates in mice, and is located on chromosome 6. In contrast to the single human Ly49 locus, the polymorphic Ly49 gene family in mice contains at least 16 genes and pseudogenes, e.g., Ly49a to Ly49q. Human KIR region and mouse Ly49 family region are shown in FIG. 14A and FIG. 14B, respectively.

[0320] In this example, a nucleotide sequence encoding human KIR proteins was introduced into the mouse genome, such that the mouse can express human KIR proteins. The method can include insertion of a sequence including human KIR cluster sequence into one of the mouse “safe harbor” loci (e.g., Hipp11 locus or Rosa26 locus) . For example, a sequence including human KIR cluster sequence was inserted into the Rosa26 locus of mouse genome. It is also possible to include one or more auxiliary sequences (e.g., a stop codon or a sequence having termination functions, etc. ) or to use other methods (e.g., flipping or knocking out) to inactivate the mouse endogenous Ly49 cluster genes. The strategy of direct replacement can also be used, e.g., a direct replacement at the mouse endogenous Ly49 cluster region with human KIR cluster sequences.

[0321] STRATEGY1

[0322] Here, human KIR cluster was inserted into the mouse Hipp11 locus by gene editing techniques that are known in the art, to obtain a KIR humanized mouse Hipp11 locus as shown in FIG. 15.

[0323] As shown in the schematic diagram of the targeting strategy in FIG. 16, the targeting vector V06 includes an upstream homologous arm, a downstream homologous arm, and a knock-in fragment including human KIR cluster sequences.

[0324] The upstream of the knock-in fragment containing the human KIR cluster sequence is directly connected to the 5’ homologous arm, and the connection sequence was designed as:  (SEQ ID NO: 18) , wherein the “T” in sequence is the last nucleotide of the mouse sequence, and the “A” of the sequence “ATTCT” is the first nucleotide of the human sequence.

[0325] The targeting vector also included an antibiotic resistance gene for positive clone screening (neomycin phosphotransferase gene, or Neo) , and two Frt recombination sites flanking the antibiotic resistance gene, that formed a Neo cassette. The connection between the 3’ end of the human KIR cluster and the mouse sequence was designed as:  (SEQ ID NO: 19) , wherein the sequence with lowercase at the 5’ end is the human sequence, the underlined sequences are the restriction site sequence, Neo cassette sequence, and additional sequences, and the sequence in italic at the 3’ end is the mouse sequence. In addition, a coding gene with a negative selectable marker (e.g., a gene encoding diphtheria toxin A subunit (DTA) ) was also inserted downstream of the 3’ homologous arm of the targeting vector.

[0326] The targeting vector used for inserting human KIR cluster into the mouse Hipp11 locus was constructed, e.g., by restriction enzyme digestion and ligation, or synthesized directly. The constructed targeting vector sequence was preliminarily confirmed by restriction enzyme digestion, and then verified by sequencing. The correct targeting vector was electroporated and transduced into embryonic stem cells of C57BL / 6 mice. The positive selectable marker gene was used to screen the cells, and the integration of exogenous genes was confirmed by PCR. The results are shown in FIGS. 17A-17C, in which 13 clones numbered A03, A04, A07, B01, C02, C05, D05, D08, E03, E07, F05, G06 and G07 were identified as positive clones. The PCR analysis included the primers described in the table below.

[0327] Table 10

[0328] The positive clones identified by PCR were then verified by Southern Blot. Specifically, genomic DNA of the positive clone cells was digested with SpeI, AseI, and ScaI, respectively, and then hybridized with corresponding probes.

[0329] Table 11

[0330] The following probes were used in Southern Blot assays:

[0331] KIR-5’Probe:

[0332] KIR-5’Probe-F: 5’-GCTTCAGTCGCGGTCGCTTCAG-3’ (SEQ ID NO: 26) ,

[0333] KIR-5’Probe-R: 5’-GGCGGTCTGACTTCCCGTGGTC-3’ (SEQ ID NO: 27) ;

[0334] KIR-3’Probe:

[0335] KIR-3’Probe1-F: 5’-ATCAATCCCTGTATCCCAATCCAG-3’ (SEQ ID NO: 28) ,

[0336] KIR-3’Probe1-R: 5’-ACTCCTGGCTCAGTTGGTTTAAACT-3’ (SEQ ID NO: 29) ;

[0337] KIR-Neo Probe:

[0338] KIR-A Probe-F: 5’-GCAAGGCTTTGATCTTTCTTC-3’ (SEQ ID NO: 30) ,

[0339] KIR-A Probe-R: 5’-TTTACTAACAGTGTGACTGGGC-3’ (SEQ ID NO: 31) .

[0340] Furthermore, cells without random insertions were analyzed by fluorescence in situ hybridization (FISH) using two BAC Probes: CH17-408P13 and CH17-87E23, which were both labeled with PromoFluor 488P, Conjugated Dye (PromoKine, Cat#: PK-PF488P-8-100) and could be used to identify two different sites of human KIR cluster. The representative FISH images are shown in FIGS. 18A-18B, in which the white arrows indicate the human KIR cluster fragments. The results also demonstrated that the tested clone in FIG. 18A was a heterozygous clone, and the tested clone in FIG. 18B was a homozygous clone. The results indicated that human KIR cluster fragments were integrated in the mouse chromosome.

[0341] The positive clones that had been screened (black mice) were introduced into isolated blastocysts (white mice) , and the resulted chimeric blastocysts were transferred to a culture medium for short-term culture and then transplanted to the fallopian tubes of the recipient mother (white mice) to produce the F0 chimeric mice (black and white) . The F2 generation homozygous mice were obtained by backcrossing the F0 generation chimeric mice with wildtype mice to obtain the F1 generation mice, and then breeding the F1 generation heterozygous mice with each other. The positive mice were also bred with the Flp transgenic mice to remove the positive selectable marker gene, and then the humanized KIR homozygous mice expressing human KIR proteins were obtained by breeding with each other.

[0342] PCR analysis was performed on the DNA obtained from the tail of the F1 generation mice using primers shown in Table 10. The identification results are shown in FIGS. 19A-19B, in which mice labeled F1-01 to F1-10 were identified as positive heterozygous mice.

[0343] 10 positive F1 generation mice were further analyzed by Southern Blot, to confirm whether random insertions were introduced. Specifically, mouse tail genomic DNA was extracted, digested with SpeI, AseI or ScaI restriction enzyme, transferred to a membrane, and then hybridized with the probes shown in Table 11. The test results are shown in FIG. 20, which indicated that none of the 10 mice that were identified as positive by PCR had any random insertions.

[0344] F2 generation homozygous mice (KIRH / H) can be obtained by breeding the F1 generation heterozygous mice (KIRH / +) . The genotypes of the offspring mouse somatic cells can be verified by PCR with primers shown in Table 12. The identification results of an exemplary F2 generation mouse (with the Neo marker gene removed) are shown in FIG. 21. The F2-01 to F2-08 mice were all identified as positive homozygous mice.

[0345] Table 12

[0346] The results indicate that the KIR humanized mice constructed using the methods described herein can be stably passaged without random insertions.

[0347] STRATEGY2

[0348] As a different strategy, the mouse endogenous Ly49 cluster sequence can be directly replaced with the human KIR cluster sequence, to obtain a humanized mouse Ly49 cluster region as shown in FIG. 22.

[0349] As shown in the schematic diagram of the targeting strategy in FIG. 23, the targeting vector V07 includes an upstream homologous arm, a downstream homologous arm, and a knock-in fragment including human KIR cluster sequence. The upstream of the knock-in fragment containing the human KIR cluster sequence is directly connected to the 5’ homologous arm, and the connection sequence was designed as:  (SEQ ID NO: 35) , wherein the last “T” in sequence is the last nucleotide of the mouse sequence, and the first “A” in sequence “AAATG” is the first nucleotide of the human sequence.

[0350] The targeting vector V07 also included a Neo cassette for positive clone screening. The connection between the 3’ end of the human KIR cluster and the mouse sequence was designed as: (SEQ ID NO: 36) , wherein the sequence in lowercase at the 5’ end is the human sequence, the underlined sequences are the restriction site sequence, Neo cassette sequence, and additional sequences, and the sequence in italic at the 3’ end is the mouse sequence. In addition, a coding gene with a negative selectable marker (e.g., DTA) was also inserted downstream of the 3’ homologous arm of the targeting vector.

[0351] The constructed targeting vector sequence was preliminarily confirmed by restriction enzyme digestion, and then verified by sequencing. The correct targeting vector was electroporated and transduced into embryonic stem cells of C57BL / 6 mice. The positive selectable marker gene was used to screen the cells, and the integration of exogenous genes was confirmed by PCR and Southern Blot. The positive clones that had been screened (black mice) were introduced into isolated blastocysts (white mice) , and the resulted chimeric blastocysts were transferred to a culture medium for short-term culture and then transplanted to the fallopian tubes of the recipient mother (white mice) to produce the F0 chimeric mice (black and white) . The F2 generation homozygous mice were obtained by backcrossing the F0 generation chimeric mice with wildtype mice to obtain the F1 generation mice, and then breeding the F1 generation heterozygous mice with each other.

[0352] Phenotypic identification

[0353] The expression of human KIR proteins in positive mice obtained using methods described in Strategy 1 can be confirmed, e.g., by flow cytometry. Specifically, three 8-week-old C57BL / 6 wildtype mice and three 8-week-old KIR humanized homozygous mice (KIRH / H) were selected. Spleen was collected after euthanasia by cervical dislocation. Cells were stained with: APC anti-human CD158b (KIR2DL2 / L3, NKAT2) Antibody (BioLegend, CAT#: 312612) , PE anti-human CD158a (KIR2DL1) Antibody (BioLegend, CAT#: 374904) , PE anti-human CD158e1 (KIR3DL1, NKB1) Antibody (BioLegend, CAT#: 312708) , Human KIR3DL2 / CD158k PE-conjugated Antibody (R&D System, CAT#: FAB2878P-100) , Human KIR3DL3 / CD158z Alexa 647-conjugatedAntibody (R&D System, CAT#: FAB8919R-100) , Brilliant Violet 510TM anti-mouse CD45 (BioLegend, CAT#: 103138) , Alexa 488 anti-mouse CD3 Antibody (BioLegend, CAT#: 100210) , Brilliant Violet 785TM anti-mouse CD4 Antibody (BioLegend, CAT#: 100453) , Alexa 700 anti-mouse CD8aAntibody (BioLegend, CAT#: 100730) , Brilliant Violet 650TM anti-mouse CD19 Antibody (BioLegend, CAT#: 115541) , Brilliant Violet 711TM anti-mouse NK-1.1 Antibody (BioLegend, CAT#: 108745) , Brilliant Violet 785TM anti-mouse / human CD11b Antibody (BioLegend, CAT#: 101243) , Brilliant Violet 711TM anti-mouse CD11c Antibody (BioLegend, CAT#: 117349) , PE / Cyanine7 anti-mouse F4 / 80 Antibody (BioLegend, CAT#: 123114) , Brilliant Violet 650TM anti-mouse Ly-6G Antibody (BioLegend, CAT#: 127641) , and then subjected to flow cytometry analysis. The results are summarized in the table below.

[0354] Table 13

[0355] Leukocyte subtypes and T cell subtypes in lymphoid tissues (e.g., spleen and blood) of 8-week-old male C57BL / 6 wildtype mice and KIRH / H mice were further detected by flow cytometry. The results are shown in FIG. 24 and FIG. 25, respectively. The results showed that in KIRH / H mice, the percentage of B cells, T cells, NK cells, CD4+T cells, CD8+T cells, macrophages and monocytes in the spleen and blood were almost identical to those of C57BL / 6 wildtype mice.

[0356] In the results, the leukocytes included: B cells (e.g., characterized by CD45+CD19+) , T cells (e.g., characterized by CD45+CD3+) , natural killer (NK) cells (e.g., characterized by CD45+CD3-NK1.1+) , macrophages (e.g., characterized by CD45+Ly-6G-CD11b+F4 / 80+) and monocytes (characterized by CD45+Ly-6G-CD11b+F4 / 80-) . CD4+T cells were characterized by CD45+CD3+CD4+. And CD8+T cells were characterized by CD45+CD3+CD8+. Only intact, single, and live leukocytes were included in the flow cytometry analysis.

[0357] The results indicated that humanization of the KIR region did not affect the differentiation, development, or distribution of leukocytes in lymphoid tissues.

[0358] Moreover, the NK cell development in homozygous KIR humanized mice was determined. The identification of developmental stages in NK cells were characterize by CD11b and CD27, which can represent the distinct stages of NK cells from different tissues. Specifically, NK cells from spleens, lungs, bone marrow and blood were collected from wild-type C57BL / 6 mice and KIRH / H mice, and were analysed by flow cytometry with species-specific anti-CD27 antibody (BioLegend, CAT#: 124212) and anti-CD11b antibody (BioLegend, CAT#: 101208) .

[0359] The results are shown in FIG. 29, in which no apparent difference was observed between C57BL / 6 mice and KIRH / H mice, indicating that the humanization of the KIR region did not affect the NK cells development of the mouse.

[0360] EXAMPLE 3: Generation of NKC / KIR double humanized mice

[0361] The NKC humanized mice generated in Example 1 and the KIR humanized mice generated in Example 2 can also be used to generate double humanized mouse model. For example, in Example 1, the embryonic stem (ES) cells used for blastocyst microinjection can be selected from the KIR humanized positive clone cells in Example 2, thereby generating NKC and KIR double humanized mice. Or, in Example 2, the embryonic stem (ES) cells used for blastocyst microinjection can be selected from the NKC humanized positive clone cells in Example 1, thereby generating NKC and KIR double humanized mice. In addition, it is also possible to breed the homozygous or heterozygous NKC humanized mice obtained in Example 1 with KIR humanized homozygous or heterozygous mice obtained in Example 2, and the offspring can be screened. According to Mendel’s law, it is possible to generate double-gene cluster modified heterozygous mice. Then the heterozygous mice can be bred with each other to obtain homozygous double humanized mice.

[0362] PCR analysis was performed to identify somatic cell genotype using mouse tail genomic DNA of the F1 generation mice. The PCR analysis results for some of the F1 mice are shown in FIGS. 26A-26C, in which 5 mice numbered F1-01, F1-04, F1-07, F1-10 and F1-12 were identified as NKCH / +KIRH / +mice, and 1 mouse numbered F1-11 was identified as NKCH / +KIRH / H mice. The F1 generation PCR analysis included the primers described in the table below.

[0363] Table 14

[0364] In another experiment, PCR analysis was performed to identify genotype of the F1 generation mice, with primes shown in Table 8 and Table 12. The results are shown in FIGS. 30A-30C, in which 2 mice numbered F1-01 and F1-02 were identified as NKCH / +KIRH / H mice with mouse genes Clec9a to Klrc1 knockout.

[0365] The expression of human NKC proteins (e.g. hNKG2A, hNKG2C, hNKG2D, hCLEC12A, hCD94, hCD69, and hCLEC8A) and mouse NKC proteins (e.g. mNKG2A, mNKG2D, mCLEC12A, mCD94, mCD69, and mCLEC8A) in NKCH / +KIRH / H mice were also confirmed by flow cytometry. Specifically, three C57BL / 6 mice and three NKCH / +KIRH / H mice were selected and divided into lipopolysaccharide (LPS) induced group (20μg / mouse LPS, 2 hours) and none induced group. Then, spleen and bone marrow tissues of the mice were collected after euthanasia by cervical dislocation. Cells were stained with: PE / Cyanine7 anti-mouse CD159a (NKG2AB6) Antibody (Biolegend, CAT#: 142810) , PE anti-human CD159c (NKG2C) Antibody (Biolegend, CAT#: 375004) , CD314 (NKG2D) Monoclonal Antibody (CX5) , PE-Cyanine7 (eBioscience, CAT#: 25-5882-82) , APC anti-human CD314 (NKG2D) Antibody (Biolegend, CAT#: 320808) , APC anti-mouse CD371 (CLEC12A) Antibody (Biolegend, CAT#: 143405) , PE anti-human CD371 (CLEC12A) Antibody (Biolegend, CAT#: 353604) , PerCP / Cyanine5.5 anti-mouse CD94 Antibody (Biolegend, CAT#: 105513) , FITC anti-human CD94Antibody (Biolegend, CAT#: 305504) , PE / Cyanine5 anti-mouse CD69Antibody (Biolegend, CAT#: 104509) , PE / Cyanine7 anti-human CD69Antibody (Biolegend, CAT#: 310912) , Mouse LOX-1 / OLR1 PE-conjugated Antibody (R&D System, CAT#: FAB1564P) , APC anti-human LOX-1 Antibody (Biolegend, CAT#: 358606) , and then subjected to flow cytometry analysis. The results are summarized in the table below.

[0366] Table 15

[0367] Furthermore, the expression of human and mouse CLEC2D mRNA in positive mice was confirmed by RT-PCR. Specifically, C57BL / 6 wild-type mice and NKCH / +KIRH / H mice were stimulated with 20μg LPS (lipopolysaccharide) for 2 hours, then spleen RNA were isolated and the cDNA libraries were synthesized by reverse transcription, followed by real-time quantitative PCR with CLEC2D primers (shown in Table 16) .

[0368] Table 16

[0369] RT-PCR detection results are shown in FIGS. 31A-31B. The mRNA levels of human and mouse CLEC2D in NKCH / +in stimulated condition have a increased trend compared to NKCH / +KIRH / H mice in unstimulated condition.

[0370] In addition, the NK cells development of NKC / KIR double humanized mice was determined. Specifically, NK cells from spleens, lungs, bone marrow and blood were collected from wild-type C57BL / 6 mice and NKCH / +KIRH / H mice, and were analysed by flow cytometry with anti-CD27 antibody and anti-CD11b antibody. The results are shown in FIG. 32, in which no apparent difference was observed between C57BL / 6 mice and NKCH / +KIRH / H mice, indicating that the humanization of the NKC region and KIR region did not affect the NK cells development of the mouse.

[0371] EXAMPLE 4: Validation of NKC / KIR humanized mice

[0372] To test whether KIR2DL3 expressed in KIR humanized mice could bind to its ligand, HLA-C0304 (pulsed with peptide YIPLVGAPL (SEQ ID NO: 40) ) tetramers conjugated with PE was used. Specifically, NK cells isolated from KIRH / H mice or C57BL / 6 wildtype mice were mixed with HLA-C0304 tetramers (final concentration: 0.5 mg / mL) respectively and incubated at 37℃in dark for 10 minutes. Then, the NK cells were collected to proceed the further marker antibodies staining and tested by flow cytometry. The percentage of NK cells that bound to HLA-C0304 in KIRH / H group or C57BL / 6 group were 51.8%and 0.09%, respectively, indicating that KIR2DL3 expressed in KIRH / H mice could bind to the ligand HLA-C0304 successfully.

[0373] OTHER EMBODIMENTS

[0374] It is to be understood that while the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.A genetically-modified, non-human animal comprising at an endogenous natural killer gene complex (NKC) locus, one or more of human NKC genes.2.The animal of claim 1, wherein the animal comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 36, at least 37, or at least 38 human NKC genes selected from Table 1.3.The animal of claim 1, wherein the animal comprises, at the endogenous NKC gene locus, all or a majority of human NKC genes on human chromosome 12 of a human subject.4.The animal of claim 1, wherein the animal comprises, at the endogenous NKC gene locus, all or a majority of human NKC genes on human chromosome 12 of a human cell.5.The animal of claim 1, wherein the animal comprises at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, or at least 23 human NKC genes selected from KLRB1, CLEC2D, CLECL1P, CD69, KLRF1, CLEC2B, KLRF2, CLEC2A, CLEC12A, CLEC1B, CLEC12B, CLEC9A, CLEC1A, CLEC7A, OLR1, TMEM52B, GABARAPL1, KLRD1, KLRK1, KLRC4, KLRC3, KLRC2, and KLRC1.6.The animal of any one of claims 1-5, wherein the animal comprises a disruption in the animal’s endogenous NKC locus.7.The animal of claim 6, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of one or more mouse NKC genes.8.The animal of claim 6, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50, at least 55, or at least 60 mouse NKC genes selected from Table 2.9.The animal of claim 6, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least 28, at least 29, or at least 30 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, Clec1b, Clec9a, Clec1a, Clec7a, Olr1, Tmem52b, Gabarapl1, Klre1, Klrd1, Klrk1, Klrc3, Klrc2, and Klrc1.10.The animal of claim 6, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of a contiguous sequence starting from mouse Klrb1a to mouse Klrc1.11.The animal of any one of claims 1-10, wherein the animal comprises one or more of endogenous Clrg1, Ly49q, and Ly49e genes.12.The animal of claim 6, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of a contiguous sequence starting from mouse Clec9a to mouse Klrc1.13.The animal of 12, wherein the animal comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, or at least 18 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, and Clec1b.14.The animal of claim 12 or 13, wherein the animal comprises a contiguous sequence starting from mouse Klrb1a to mouse Clec1b.15.The animal of any one of claims 1-14, wherein the animal comprises an unmodified human sequence derived from a human NKC locus starting from human KLRB1 to KLRC1.16.The animal of any one of claims 1-15, wherein the animal comprises an unmodified human sequence derived from a human NKC locus starting from human KLRB1 to CLEC12A.17.The animal of any one of claims 1-15, wherein the animal comprises an unmodified human sequence derived from a human NKC locus starting from human CLEC12B to KLRC1.18.The animal of any one of claims 1-17, wherein the animal is homozygous or heterozygous with respect to the NKC locus.19.The animal of any one of claims 1-18, wherein the animal further comprises an endogenous Clec1b gene at an endogenous safe harbour locus (e.g., Rosa26 gene locus or an endogenous Hipp11 gene locus) .20.The animal of claim 19, wherein the animal is a mouse, and the mouse Clec1b gene is inserted between exon 1 and exon 2 of mouse Rosa26 gene locus.21.A genetically-modified animal comprising at an endogenous NKC locus,a) a first sequence comprising one or more of human NKC genes selected from KLRB1 to CLEC12A genes on human chromosome 12;b) a second sequence comprising endogenous Clec1b; andc) a third sequence comprising one or more of human NKC genes selected from CLEC12B to KLRC1 genes on human chromosome 12,wherein the first sequence, the second sequence, and the third sequence are operably linked.22.The animal of claim 21, wherein the first sequence comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 human NKC genes selected from the group consisting of KLRB1, CLEC2D, CLECL1P, CD69, KLRF1, CLEC2B, KLRF2, CLEC2A, and CLEC12A genes.23.The animal of claim 21, wherein the first sequence is an unmodified sequence derived from a human NKC locus starting from human KLRB1 to CLEC12A.24.The animal of claim 21, wherein the third sequence comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, or at least 13 human NKC genes selected from the group consisting of CLEC12B, CLEC9A, CLEC1A, CLEC7A, OLR1, TMEM52B, GABARAPL1, KLRD1, KLRK1, KLRC4, KLRC3, KLRC2, and KLRC1.25.The animal of claim 21, wherein the third sequence is an unmodified sequence derived from a human NKC locus starting from human CLEC12B to KLRC1.26.The animal of any one of claims 21-25, wherein the animal comprises a disruption in the animal’s endogenous NKC locus.27.The animal of claim 26, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of one or more mouse NKC genes.28.The animal of claim 26, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50, at least 55, or at least 60 mouse NKC genes selected from Table 2.29.The animal of claim 26, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least 28, at least 29, or at least 30 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, Clec1b, Clec9a, Clec1a, Clec7a, Olr1, Tmem52b, Gabarapl1, Klre1, Klrd1, Klrk1, Klrc3, Klrc2, and Klrc1.30.The animal of claim 26, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of a contiguous sequence starting from mouse Klrb1a to mouse Klrc1.31.The animal of claim 26, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of a contiguous sequence starting from mouse Klrb1a to mouse Clec12b.32.The animal of claim 26, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous NKC locus comprises a deletion of a contiguous sequence starting from mouse Clec9a to mouse Klrc1.33.The animal of any one of claims 21-32, wherein the animal is homozygous or heterozygous with respect to the NKC locus.34.The animal of any one of claims 1-33, wherein the animal further comprises at least one chromosome comprising one or more of human killer-cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes.35.The animal of any one of claims 1-34, wherein the animal is a mammal, e.g., a monkey, a rodent, a mouse, or a rat.36.The animal of any one of claims 1-35, wherein the animal does not express endogenous NKC proteins, or expresses a decreased level of endogenous NKC proteins as compared to the NKC protein expression level in a wildtype animal.37.The animal of any one of claims 1-36, wherein the animal has one or more cells (e.g., NK cells, platelets, DC cells, monocytes, and / or macrophages) expressing human NKC proteins.38.The animal of any one of claims 1-37, wherein the animal has one or more cells expressing human NKC proteins, and the expressed NKC proteins can induce or inhibit NK cell-mediated cytotoxicity.39.A genetically-modified, non-human animal whose genome comprises at least one chromosome comprising one or more of human killer-cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes.40.The animal of claim 39, wherein the animal comprises at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, or at least 16 human KIR genes selected from Table 3.41.The animal of claim 39, wherein the animal comprises, at an endogenous gene locus, all or a majority of human KIR genes (e.g., human haplotype A KIR genes) on human chromosome 19 of a human subject.42.The animal of claim 39, wherein the animal comprises, at an endogenous gene locus, all or a majority of human KIR genes (e.g., human haplotype A KIR genes) on human chromosome 19 of a human cell.43.The animal of claim 39, wherein the animal comprises at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 human KIR genes selected from KIR3DL3, KIR2DL3, KIR2DP1, KIR2DL1, KIR3DP1, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR2DS4, and KIR3DL2, at an endogenous gene locus of the animal’s genome.44.The animal of any one of claims 39-43, wherein the one or more human KIR genes are inserted at an endogenous safe harbour locus (e.g., Hipp11 gene locus or an endogenous Rosa26 gene locus) .45.The animal of any one of claims 39-43, wherein the animal is a mouse, and the one or more human KIR genes are inserted at an endogenous mouse Hipp11 gene locus.46.The animal of any one of claims 41-45, wherein the animal is homozygous or heterozygous with respect to the endogenous gene locus.47.The animal of claim 39, wherein the animal comprises at an endogenous Ly49 locus, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 human KIR genes selected from KIR3DL3, KIR2DL3, KIR2DP1, KIR2DL1, KIR3DP1, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR2DS4, and KIR3DL2.48.The animal of any one of claims 39-47, wherein the animal comprises a disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus.49.The animal of claim 48, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus comprises a deletion of one or more mouse Ly49 genes.50.The animal of claim 48, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus comprises a deletion of at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50, at least 51, or at least 52 mouse Ly49 genes selected from Table 4.51.The animal of claim 48, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus comprises a deletion of at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, or at least 14 mouse Ly49 genes selected from the group consisting of Ly49q, Ly49e, Ly49f, Ly49d, Ly49k, Ly49h, Ly49n, Ly49i, Ly49g, Ly49j, Ly49m, Ly49c, Ly49a, and Ly49b.52.The animal of claim 48, wherein the animal is a mouse and the disruption in the animal’s endogenous Ly49 locus comprises a deletion of a contiguous sequence starting from mouse Ly49q to mouse Ly49b.53.The animal of any one of claims 39-52, wherein the animal comprises one or more of endogenous Klrc1 and Csda genes.54.The animal of any one of claims 39-53, wherein the animal comprises an unmodified human sequence derived from a human KIR locus starting from human KIR3DL3 to KIR3DL2.55.The animal of any one of claims 47-54, wherein the animal is homozygous or heterozygous with respect to the Ly49 locus.56.The animal of any one of claims 39-55, wherein the animal further comprises at least one chromosome comprising one or more of human NKC genes.57.The animal of any one of claims 39-56, wherein the animal is a mammal, e.g., a monkey, a rodent, a mouse, or a rat.58.The animal of any one of claims 39-57, wherein the animal does not express endogenous Ly49 proteins, or expresses a decreased level of endogenous Ly49 proteins as compared to the Ly49 protein expression level in a wildtype animal.59.The animal of any one of claims 39-58, wherein the animal has one or more cells (e.g., NK cells, T cells, DC cells, monocytes, and / or macrophages) expressing human KIR proteins.60.The animal of any one of claims 39-59, wherein the animal has one or more cells expressing human KIR proteins, and the expressed KIR proteins can induce or inhibit NK cell-mediated cytotoxicity.61.A genetically-modified, non-human animal whose genome comprises at an endogenous NKC locus of one chromosome, comprising: a replacement of one or more endogenous NKC genes with one or more human NKC genes.62.The animal of claim 61, wherein the animal is a mouse, and at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50, at least 55, or at least 60 mouse NKC genes selected from Table 2 are replaced.63.The animal of claim 61 or 62, wherein the animal is a mouse, and at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25, at least 26, at least 27, at least 28, at least 29, or at least 30 mouse NKC genes selected from Klrb1a, Clec2h, Klrb1, Klrb1c, Klrb1b, Clec2i, Clec2g, Mir7649, Clec2f, Klrb1f, Clec2e, Klrb1-ps1, Clec2d, CD69, Clec2m, Clec12a, Clec12b, Clec1b, Clec9a, Clec1a, Clec7a, Olr1, Tmem52b, Gabarapl1, Klre1, Klrd1, Klrk1, Klrc3, Klrc2, and Klrc1 are replaced.64.The animal of any one of claims 61-63, wherein the one or more endogenous NKC genes are replaced by at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 36, at least 37, or at least 38 human NKC genes selected from Table 1.65.The animal of any one of claims 61-64, wherein the one or more endogenous NKC genes are replaced by at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, or at least 23 human NKC genes selected from KLRB1, CLEC2D, CLECL1P, CD69, KLRF1, CLEC2B, KLRF2, CLEC2A, CLEC12A, CLEC1B, CLEC12B, CLEC9A, CLEC1A, CLEC7A, OLR1, TMEM52B, GABARAPL1, KLRD1, KLRK1, KLRC4, KLRC3, KLRC2, and KLRC1.66.The animal of any one of claims 61-65, wherein the animal further comprises a disrupted endogenous NKC locus of the other chromosome (e.g., by deleting a contiguous sequence from mouse Clec9a to mouse Klrc1) .67.A genetically-modified, non-human animal whose genome comprises at an endogenous Hipp11 gene locus comprising: an insertion of one or more human KIR genes.68.The animal of claim 67, wherein a sequence comprising at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, or at least 16 human KIR genes selected from Table 3 is inserted at the endogenous Hipp11 gene locus.69.The animal of claim 67 or 68, wherein a sequence comprising at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 human KIR genes selected from KIR3DL3, KIR2DL3, KIR2DP1, KIR2DL1, KIR3DP1, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR2DS4, and KIR3DL2 is inserted at the endogenous Hipp11 gene locus.70.A genetically-modified, non-human animal whose genome comprises at an endogenous Ly49 locus comprising: a replacement of one or more endogenous Ly49 genes with one or more human KIR genes.71.The animal of claim 70, wherein the animal is a mouse, and at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50, at least 51, or at least 52 mouse Ly49 genes selected from Table 4 are replaced.72.The animal of claim 70 or 71, wherein the animal is a mouse, and at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, or at least 14 mouse Ly49 genes selected from the group consisting of Ly49q, Ly49e, Ly49f, Ly49d, Ly49k, Ly49h, Ly49n, Ly49i, Ly49g, Ly49j, Ly49m, Ly49c, Ly49a, and Ly49b are replaced.73.The animal of any one of claims 70-72, wherein the one or more endogenous Ly49 genes are replaced by at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, or at least 16 human KIR genes selected from Table 3.74.The animal of any one of claims 70-73, wherein the one or more endogenous Ly49 genes are replaced by at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, or at least 9 human KIR genes selected from KIR3DL3, KIR2DL3, KIR2DP1, KIR2DL1, KIR3DP1, KIR2DL4, KIR3DL1, KIR2DS4, and KIR3DL2.75.A method of making a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human NKC proteins, comprising:a) replacing at an endogenous NKC locus, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more endogenous NKC proteins with an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins, wherein the one or more endogenous NKC proteins comprise endogenous Clec1b; andb) inserting at an endogenous Rosa26 gene locus, a nucleotide sequence encoding endogenous Clec1b.76.A method of making a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human NKC proteins, comprising:a) replacing at an endogenous NKC locus, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more endogenous NKC proteins with an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins, wherein the one or more endogenous NKC proteins comprise endogenous Clec1b; andb) replacing at the endogenous NKC locus, a nucleotide sequence encoding human CLEC1B with a sequence encoding endogenous Clec1b, wherein the sequence encoding human CLEC1B is part of the unmodified nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins.77.A method of making a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human NKC proteins, comprising:a) replacing at an endogenous NKC locus of one chromosome, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more endogenous NKC proteins with an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human NKC proteins, wherein the one or more endogenous NKC proteins comprise endogenous Clec1b; andb) disrupting at an endogenous NKC locus of the other chromosome by deleting one or more genes immediately following endogenous Clec1b.78.The method of claim 77, wherein the animal is a mouse, and step (b) comprises deleting a contiguous sequence starting from mouse Clec9a to mouse Klrc1.79.A method of making a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human KIR proteins, comprising: inserting at an endogenous Hipp11 gene locus, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human KIR proteins.80.A method of making a genetically-modified non-human animal that expresses one or more human KIR proteins, comprising: replacing at an endogenous Ly49 gene locus, an unmodified nucleotide sequence encoding one or more endogenous Ly49 proteins with an unmodified nucleotide sequence encoding one or more human KIR proteins.81.A method of determining effectiveness of a therapeutic agent for treating cancer, comprising:a) administering the therapeutic agent to the animal of any one of claims 1-74, wherein the animal has a tumor; andb) determining inhibitory effects of the therapeutic agent to the tumor.82.The method of claim 81, wherein the therapeutic agent is an antibody that specifically binds to one or more NKC proteins.83.The method of claim 81, wherein the therapeutic agent is an antibody that specifically binds to one or more KIR proteins (e.g., an anti-KIR2DL1 antibody, an anti-KIR2DL2 antibody, or an anti-KIR2DL3 antibody) .84.The method of any one of claims 81-83, wherein the tumor comprises one or more cancer cells that are injected into the animal.85.The method of any one of claims 81-84, wherein determining inhibitory effects of the therapeutic agent to the tumor involves measuring the tumor volume in the animal.86.The method of any one of claims 81-85, wherein the cancer is a solid tumor, head and neck tumor, bladder cancer, breast cancer, esophageal cancer, non-small cell lung cancer, squamous cell carcinoma, lymphoma, multiple myeloma, colorectal cancer, melanoma cancer, prostate cancer, kidney cancer, pancreas cancer, endocrine cancer, or B-cell chronic lymphocytic leukemia.87.A method of determining effectiveness of a therapeutic agent for treating an immune disorder (e.g., an autoimmune disease) , comprising:a) administering the therapeutic agent to the animal of any one of claims 1-74, wherein the animal has the immune disorder; andb) determining effects of the therapeutic agent to the immune disorder.88.The method of claim 87, wherein the immune disorder is myelodysplastic syndrome, psoriasis, allergy, multiple sclerosis, transplant rejection, or graft versus host disease (GVHD) .89.A method of determining effectiveness of a therapeutic agent for reducing an inflammation, comprising:a) administering the therapeutic agent to the animal of any one of claims 1-74, wherein the animal has the inflammation; andb) determining effects of the therapeutic agent to the inflammation.90.The method of claim 89, wherein the inflammation is rheumatic arthritis or inflammatory bowel disease.91.A method of determining effectiveness of a therapeutic agent for treating a cardiovascular disease (e.g., thrombus) , comprising:a) administering the therapeutic agent to the animal of any one of claims 1-74, wherein the animal has the cardiovascular disease; andb) determining effects of the therapeutic agent to the cardiovascular disease.92.A method of determining toxicity of a therapeutic agent comprising:a) administering the therapeutic agent to the animal of any one of claims 1-74; andb) determining effects of the therapeutic agent to the animal.93.The method of claim 92, wherein determining effects of the therapeutic agent to the animal involves measuring the body weight, red blood cell count, hematocrit, and / or hemoglobin of the animal.94.The method of any one of claims 87-93, wherein the therapeutic agent is an antibody that specifically binds to one or more NKC proteins, or an antibody that specifically binds to one or more KIR proteins.

Images