Methods and compositions for highly-specific modulation of protein levels and functions by designed polypeptides

Abstract

Disclosed are methods and pharmaceutical compositions for producing adjustable protein target-specific polypeptides, use for adjustable regulation of the level of one or more protein targets or a family of related protein targets and associated biological functions thereof, use for treating or preventing a disease and / or condition, selective detection and / or isolation of one or more protein targets, and use of studying the function of one or more protein targets using polypeptides that are analogs of gene knockdown by RNA interference or gene knockout by CRISPR / Cas9 in a subject.

Description

METHODS AND COMPOSITIONS FOR HIGHLY-SPECIFIC MODULATION OF PROTEIN LEVELS AND FUNCTIONS BY DESIGNED POLYPEPTIDESCROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0001] This application claims a priority to PCT application No. PCT / CN2024 / 104269, filed on July 8, 2024, the entire contents of which are incorporated herein by reference. FIELDS OF THE DISCLOSURE

[0002] This invention discloses novel methods and pharmaceutical compositions for creating tunable, protein target-specific polypeptides, their use for adjustable regulation of the levels of one or multiple protein targets or a family of related protein targets and associated biological functions thereof, and applications to treating or preventing a disease and / or condition, selective detection, and / or isolation of one or more protein targets, and investigating functions of one or more protein targets using polypeptides that serve as functional analogs to gene knockdown by RNA interference or gene knockout by CRISPR / Cas9 in a subject, in fields including but not limited to medicine, veterinary medicine, virology, cell biology, protein chemistry, genetics, and agriculture, in vivo, ex vivo and / or in vitro.BACKGROUND

[0003] Proteins are the workhorses for executing a wide range of biological functions within an organism. Dysfunctional proteins are at the heart of many diseases, contributing to, or directly causing a variety of health conditions and diseases. Traditionally small-molecule drugs have been widely used in medicine for many years and have proven effective in treating a multitude of diseases. However, they also come with certain limitations or weaknesses, including poor bioavailability, high toxicity, non-specific binding leading to off-target effects and unwanted side effects, as well as drug resistance particularly in the treatment of infections and cancer where the targeted organisms or cells can mutate.

[0004] Biologics are a class of new therapeutic drugs derived from living organisms, including products like monoclonal antibodies, vaccines, gene therapies, and many more. They have been particularly transformative in treating diseases that were previously challenging to manage, such as certain cancers and autoimmune disorders. The strengths of biologics include high specificity, with fewer off-target effects than small molecules, offering multiple therapeutic modalities, lower drug resistance, extended half-life, treating previously untreatable diseases, and fewer non-specific toxicities than small molecule drugs owing to their specificity. However, the challenges of currently available biologics include design challenges, delivery challenges, immunogenicity, high cost, and stability issues. The capacity to design or engineer proteins, polypeptides and peptides offers an exciting avenue for drug development, addressing the limitations of traditional small-molecule therapeutics and harnessing the immense potential of biological molecules for precise therapeutic intervention. DISCLOSURE OF THE INVENTION

[0005] This invention discloses novel methods and pharmaceutical compositions for modulating one or more protein targets and / or associated biological functions thereof in a subject in a highly specific manner by using a composition comprising an effective amount of at least one polypeptide or a polynucleotide encoding the polypeptide, wherein the polypeptide selectively modulates one or more protein targets and / or associated biological functions thereof in a subject, wherein the polypeptide corresponds to one or more secondary-structural elements of the protein target, the secondary-structural element that corresponds to the polypeptide can be fully solvent-accessible, partially solvent-accessible, or completely solvent-inaccessible in the native structure of the protein target, and the polypeptide corresponding to different secondary-structural elements of a protein target modulates the protein with varying degrees of potency. In some embodiments, the polypeptides derived from a protein target selectively modulates more than one protein targets, in some case, the entire family of protein targets. The number of proteins modulated by a polypeptide can be tuned by means known to anyone skilled in the art, including but not limited to, modifying the range of secondary-structural elements comprising the polypeptide, deriving the amino acid sequence of a polypeptide from different secondary-structural elements of the protein target, and / or introducing modifications into the amino acid sequence of a polypeptide. In some embodiments, at least one polynucleotide encoding one or more polypeptides corresponding to a protein target is administered into a subject, wherein the polypeptide and the protein target are translated in close proximity, thereby mediating highly-selective, co-translational modulation of the protein target, multiple protein targets, and / or a family of protein targets. In some cases, the modulation by the polypeptide leads to depletion of the protein targets. In addition, the polypeptides disclosed in this invention can be used as a high-specificity recognizing moiety for numerous applications, including but not limited to, target-specific post-translational regulation of the levels of protein targets in cells and organisms of any origin, diagnosing, preventing or treating a disease or condition, high-specificity detection and / or purification of protein targets, investigating functions of one or more protein targets using polypeptides that serve as functional analogs to gene knockdown by RNA interference or gene knockout by CRISPR / Cas9, as well as numerous applications traditionally performed by antibodies and small-molecule compounds, including but not limited to antibody-drug conjugate (ADC) , chimeric antigen receptor T-cell (CAR-T) therapy, proteolysis coupled chimera (PROTAC) , and small molecule drug conjugates (SMDCs) .BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0006] In FIG. 1, based on the secondary-structural information of the protein target, a series of polypeptides are designed to correspond to one or more secondary-structural elements for the protein target, wherein the secondary-structural element that corresponds to the polypeptide is fully solvent-accessible, partially solvent-accessible, or completely solvent-inaccessible in the native structure of the protein target, and the secondary-structural elements included in a polypeptide are consecutive (exemplified by the polypeptides in Cases A and B) or inconsecutive (exemplified by the polypeptides in Cases C and D) regardless of the sequence or structural directionality (normal N-terminus to C-terminus directionality is exemplified by the polypeptides in Cases A and C, while reversed C-terminus to N-terminus directionality is exemplified by the polypeptides in Cases B and D) in the native structure of the protein target. The designed polypeptides are prepared and tested for potency of modulation in vivo, ex vivo and / or in vitro.

[0007] In FIG. 2A-2C, a set of eight polypeptides were tested for their potency in reducing the cellular levels of PARP protein family. These polypeptides correspond to one or more secondary-structural elements of Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) . Each of the eight polypeptides caused 30～70%reduction of the total cellular level of PARP1 protein expressed from PARP1-coding plasmid (FIG. 2A) . Similarly, this set of eight polypeptides also resulted in a significant reduction of the total cellular level of PARP2 protein (FIG. 2B) and PARP3 protein (FIG. 2C) expressed from PARP2 or PARP3-coding plasmids, respectively. The most potent polypeptide is SEQ ID NO. 11, which reduced the cellular levels of PARP1, PARP2, and PARP3 by 70～90%relative to that of the control in the absence of any polypeptide.

[0008] In FIG. 3A-3B, a set of eight polypeptides were tested for their potency in reducing the cellular levels of the TEC protein tyrosine kinase family. Notably, each of the eight polypeptides exhibited a good activity in reducing the cellular level of the target protein Bruton's tyrosine kinase (BTK) expressed from BTK-coding plasmid (FIG. 3A) and the cellular protein level of Marrow Tyrosine Kinase Gene in Chromosome X (BMX) expressed from BMX-coding plasmid (FIG. 3B) .

[0009] In FIG. 4, a set of two polypeptides were tested for their potency in reducing the cellular level of Colony Stimulating Factor 1 Receptor (CSF1R) . Significantly, both polypeptides exhibited excellent activity in reducing the cellular level of the target CSF1R protein expressed from CSF1R-coding plasmid (FIG. 4) . At 20-folds, Sequence ID NO: 33 reduced the expression of CSF1R by 80%relative to that expressed from CSF1R-coding plasmid in the absence of any polypeptide (FIG. 4) .

[0010] In FIG. 5A-5D, a set of 16 polypeptides were tested for their potency in reducing the cellular levels of Programmed death-ligand 1 (PD-L1) and Programmed death-ligand 2 (PD-L2) proteins. Significantly, all polypeptides exhibited excellent activity in reducing the cellular level of PD-L1 protein expressed from PD-L1-coding plasmid (FIG. 5A～B) . Some of the most potent polypeptides reduced the level of PD-L1 by more than 90%relative to that expressed from PD-L1-coding plasmid in the absence of any polypeptide (FIG. 5A～B) . Similarly, all polypeptides exhibited excellent activity in reducing the cellular level of PD-L2 protein expressed from PD-L2-coding plasmid (FIG. 5C～D) . Some of the most potent polypeptides reduced the level of PD-L2 by more than 90%relative to that expressed from PD-L2-coding plasmid in the absence of any polypeptide (FIG. 5C～D) .

[0011] In FIG. 6A-6B, a set of 11 polypeptides were tested for their potency in reducing the cellular levels of Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 (ABL1) and Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 2 (ABL2) kinase family. Significantly, all polypeptides exhibited excellent activity in reducing the cellular level of ABL1 protein expressed from ABL1-coding plasmid (FIG. 6A) . Many of the most potent polypeptides reduced the level of ABL1 by more than 90%relative to that expressed from ABL1-coding plasmid in the absence of any polypeptide (FIG. 6A) . Similarly, all polypeptides exhibited excellent activity in reducing the cellular level of ABL2 protein expressed from ABL2-coding plasmid (FIG. 6B) . Some of the most potent polypeptides reduced the level of ABL2 by more than 90%relative to that expressed from ABL2-coding plasmid in the absence of any polypeptide (FIG. 6B) .

[0012] In FIG. 7, a set of three polypeptides were tested for their potency in reducing the cellular levels of B-cell lymphoma 2 (BCL2) protein family. The BCL2 family consists of both anti-apoptotic proteins (e.g., B-cell lymphoma 2 like 1 (BCL2L1, also known as (aka. ) BCL-XL) , B-cell lymphoma 2 like 2 (BCL2L2, aka. BCL-W) , B-cell lymphoma 2 like 3 (BCL2L3, aka. MCL1) , B-cell lymphoma 2 like 5 (BCL2L5, aka. BCL2A1) ) and pro-apoptotic proteins (for instance, B-cell lymphoma 2 like 4 (BCL2L4, aka. BAX) , and B-cell lymphoma 2 like 7 (BCL2L7, aka. BAK1) ) . Therefore, it is very important for the designed polypeptide inhibitors to distinguish these proteins of opposing cellular functions. Impressively, one of the designed polypeptides, Sequence ID NO: 76, preferably targeted the anti-apoptotic proteins of the BCL2 family, while exhibited minimal effects on the cellular level of the pro-apoptotic proteins of the BCL2 family such as BCL2L4 (FIG. 7) , illustrating the power of the disclosed method herein in being highly selective and finely tuned for specific targets.

[0013] FIG. 8A shows tumor growth inhibition (TGI) in a 4T1 triple-negative breast cancer (TNBC) mouse model treated with polypeptides SEQ ID NO: 12 (targeting PARP1 / 2 / 3) , SEQ ID NO: 25 (targeting BTK family) , SEQ ID NO: 33 (targeting CSF1R) , SEQ ID NO: 57 (targeting ABL1 / ABL2) , and SEQ ID NO: 76 (targeting BCL2 and family members, excluding BCL2L4 and BCL2L7) , each demonstrating statistically significant in vivo efficacy (p<0.05) . FIG. 8B presents a comparison of polypeptides SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, and SEQ ID NO: 65, all targeting ABL1 / ABL2, with SEQ ID NO: 57 showing the greatest in vivo antitumor activity despite a relatively weaker in vitro degradation potency compared to SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 65 (FIG. 6) . Similarly, FIG. 8C presents a comparison of BTK-targeting polypeptides SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 25, where SEQ ID NO: 20 exhibits stronger in vitro degradation but lower in vivo activity (comparing FIG. 3 and FIG. 8C) . These findings suggest that complete degradation of a target protein is not always required for maximal therapeutic benefit, and that polypeptides capable of tuning protein levels to a physiologically appropriate range may offer a more effective and disease-tailored therapeutic strategy.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIONI. Methods of highly-specific modulation of protein levels and functions by designed polypeptides

[0014] Disclosed herein are methods and compositions for highly specific modulation of the level of a protein target in its functional state and / or associated biological functions thereof in a subject by the use of at least one polypeptide that specifically binds to the protein target, wherein the polypeptide corresponds to one secondary-structural element of the protein target, wherein the level of the protein target in its functional state is upregulated, downregulated, or maintained at a stable expression level, and associated biological functions thereof is augmented, inhibited or kept at the standard level.

[0015] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the level of a protein target in its functional state or associated biological functions thereof in a subject by the use of at least one polypeptide that specifically bind to the protein target, wherein the polypeptide corresponds to more than one secondary-structural elements of the protein target, wherein the secondary-structural elements are consecutive or inconsecutive in the native structure / sequence of the protein target regardless of the directionality of the polypeptides.

[0016] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the level of a protein target in its functional state or associated biological functions thereof in a subject by the use of at least one polypeptide that specifically bind to the protein target, wherein the polypeptide corresponds to one or more secondary-structural elements of the protein target, wherein the secondary-structural element that corresponds to the polypeptide is fully solvent-accessible, partially solvent-accessible, or completely solvent-inaccessible in the native structure of the protein target.

[0017] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the level of a protein target in its functional state or associated biological functions thereof in a subject by the use of at least one polypeptide that specifically bind to the protein target, wherein the polypeptide corresponding to different secondary-structural elements of a protein modulates the protein target with varying degrees of potency.

[0018] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the level of a protein target in its functional state or associated biological functions thereof in a subject by the use of at least one polypeptide that specifically binds to the protein target, wherein the polypeptide contains an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of the protein target, wherein within the corresponding amino acid sequences, the amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of the protein target.

[0019] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the level of a protein target in its functional state or associated biological functions thereof in a subject by the use of at least one polypeptide that specifically binds to the protein target, wherein the typical procedure includes the following steps: 1) obtaining the information of secondary-structural elements of the protein target by utilizing three-dimensional structures determined by experimental techniques, including but not limited to, X-ray crystallography, NMR spectroscopy, cryo-electron microscopy, and circular dichroism spectroscopy, and / or predicted by computational methods, including but not limited to, AlphaFold and RoseTTAFold and / or any other three-dimensional structural prediction algorithms, and / or PSIPRED and DSSP and / or any other secondary structure prediction algorithms, based on the amino acid sequence of the protein target; 2) designing the polypeptides based on the information of secondary-structural elements of the protein target, by including one or more secondary-structural elements within a polypeptide, wherein one consideration factor is whether the chosen sequence for the polypeptide has a high probability to maintain the desired secondary structure in isolation; when more than one secondary-structural elements of the protein target are included in a polypeptide, the secondary-structural elements are consecutive or inconsecutive in the native structure of the protein target; 3) preparing the designed polypeptides; and 4) testing the efficiency of modulation by the designed polypeptides in appropriate concentrations in vitro, in vivo, and / or ex vivo, by standard techniques known to anyone skilled in the art, and selecting one or more polypeptides meeting the predefined potency of the desired effects.

[0020] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the levels of more than one protein targets in the functional state or associated biological functions thereof in a subject by the use of at least one polypeptide that specifically binds to the protein targets, wherein the polypeptide contains an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of the protein targets, wherein within the corresponding amino acid sequences, the amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of the protein targets.

[0021] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating a family of protein targets by one or more polypeptides, wherein a polypeptide shares at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with members of the protein family in the region with which the polypeptide corresponds. It is understood to anyone skilled in the art that each member of the protein family may have a different degree of amino acid sequence identity, within the range of at least 10%and at most 100%amino acid sequence identity, with a protein-interacting polypeptide. In some embodiments, the different degrees of amino acid sequence identity of a polypeptide with different members of the protein family lead to a varying level of modulation in the levels of functional proteins and / or associated biological functions thereof. In some embodiments, the different degrees of amino acid sequence identity of a polypeptide with different members of the protein family lead to the same level of modulation in the levels of functional proteins and / or associated biological functions thereof. In other embodiments, the different degrees of amino acid sequence identity of a polypeptide with different members of the protein family lead to a varying level of modulation in the levels of functional proteins and / or associated biological functions thereof for some family members, while remaining the same level of modulation in the levels of functional proteins and / or associated biological functions thereof for other family members.

[0022] In some embodiments, in order to accomplish the desired modulation of the levels of functional proteins and / or associated biological functions thereof, two or more different polypeptides are used for targeting, wherein the secondar-structural elements corresponding to each polypeptide have a similar or different location in the native structure of the protein target, either fully solvent-accessible, partially solvent-accessible, or completely solvent-inaccessible. In some embodiments, two or more polypeptides corresponding to a protein target co-exist in the composition as separate entities, wherein the ratios among different polypeptides are equal or unequal. In some embodiments, two or more polypeptides corresponding to a protein target are covalently linked without linkers between them. In some embodiments, two or more polypeptides corresponding to a protein target may be covalently linked via linkers between them, wherein non-limiting examples of linkers include chemically synthesized linkers such as polyethylene glycol linkers, or linkers composed of amino acids or amino acid analogues. The length and composition of the linker are designed and optimized via computational or experimental methods known to anyone skilled in the art.

[0023] In some embodiments, when two or more different polypeptides are used to modulate two or more protein targets, the polypeptides may correspond to the secondary-structural elements of different protein targets. In some embodiments, these polypeptides co-exist in the composition as separate entities, wherein the ratios among different polypeptides may be equal or unequal. In some embodiments, these polypeptides are covalently linked without linkers between them. In some embodiments, these polypeptides may be covalently linked via linkers between them, wherein non-limiting examples of linkers include chemically synthesized linkers such as polyethylene glycol linkers, or linkers composed of amino acids or amino acid analogues. The length and composition of the linker are designed and optimized via computational or experimental methods known to those skilled in the art.

[0024] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for tuning the number of proteins targeted by a polypeptide comprising modifying the range of secondary-structural elements included in a polypeptide corresponding to the protein target. In some embodiments, a polypeptide including a larger range of secondary-structural elements corresponding to the protein target allows effective modulation of a larger number of individual proteins. In some embodiments, a polypeptide with a smaller range of secondary-structural elements corresponding to the protein target results in effective modulation of a smaller number of individual proteins. In some embodiments, a polypeptide including a larger range of secondary-structural elements corresponding to the protein target allows effective modulation of a smaller number of individual proteins. In some embodiments, a polypeptide with a smaller range of secondary-structural elements corresponding to the protein target results in effective modulation of a larger number of individual proteins.

[0025] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for tuning the number of proteins targeted by a polypeptide comprising selecting the amino acid sequence of a polypeptide from different secondary-structural elements of the protein target. In some embodiments, a polypeptide having amino acid sequence corresponding to secondary-structural elements that are commonly shared among individual proteins, in some cases, the members of a protein family, modulates a larger number of individual proteins, and in some cases, the entire protein family. In some embodiments, a polypeptide having amino acid sequence corresponding to secondary-structural elements that are unique to a given protein, in some cases, shared among a small number of individual proteins, in some cases, among a small number of members of a protein family, targets a unique protein or a smaller number of individual proteins or a smaller number of members of a protein family. The term “commonly shared” or the like refers to the similarity of the secondary-structural elements of one protein target relative to other individual proteins, or other members of a protein family, wherein non-limiting examples of similarity include the amino acid sequence identity, or in the relative positions and / or relative angles of the secondary-structural elements within the protein target.

[0026] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for tuning the number of proteins targeted by a polypeptide comprising introducing modifications to the polypeptide’s amino acid sequence, including but not limited to point mutations, circular permutations, truncations, deletions, and / or insertions, and / or any combinations thereof at one or more sites. In some embodiments, mutations involve a hydrophobic amino acid residue to replace another hydrophobic amino acid residue. In some embodiments, mutations involve a hydrophobic amino acid residue to replace a hydrophilic amino acid residue. In some embodiments, mutations involve a hydrophilic amino acid residue to replace another hydrophilic amino acid residue. In some embodiments, mutations involve a hydrophilic amino acid residue to replace a hydrophobic amino acid residue. Mutations of amino acid sequence of the polypeptide can be designed by standard computational, experimental methods or other means known to anyone skilled in the art.

[0027] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for tuning the number of proteins targeted by a polypeptide, wherein non-limiting examples include varying the range of secondary-structural elements included in the polypeptide, varying the secondary-structural elements corresponding to the protein, and / or modifications of the amino acid sequence.

[0028] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the level of a protein target in its functional state or associated biological functions thereof in a subject by the use of at least one polynucleotide encoding one or more polypeptides corresponding to a protein target, wherein the polypeptide and the protein target are translated in close proximity within the cells of a subject, thereby mediating highly-selective, co-translational modulation of a protein target, in some cases multiple protein targets, and / or in some embodiments, a family of protein targets. In some embodiments, the polynucleotide comprises additional nucleotide sequences, including but not limited to, promoter sequences including organ-specific promoters, tissue-specific promoters, cell type-specific promoters, inducible promoters, developmental stage-specific promoters, and pathogen-specific promoters, and / or derivatives thereof.

[0029] The terms “protein target” , “target protein” , “protein targets” , “target proteins” , and the like refer to a protein or proteins for which the amount and / or biological functions thereof are to be modulated by polypeptides disclosed herein.

[0030] The term “subject” refers to where the modulation takes place, including but not limited to living and / or non-living subject. Non-limiting examples of living subjects include prokaryotic cells and organisms, eukaryotic cells and organisms including mammals and humans, protozoa, viruses, bacteria, bacteriophages, fungi, and plants. Non-limiting examples of non-living subjects include soil, rock, air and other environmental factors.

[0031] The terms “polypeptide” , and “peptide” and the like refer to a molecule comprising at least five amino acid residues. As used herein, the terms “wild type” , “native” and the like refer to the endogenous protein sequence in a subject. In some embodiments, wild-type or native sequence of a protein or polypeptide are employed. The terms described above may be used interchangeably.

[0032] The terms “modulate” , “modulation” , “modulating” , “regulate” , “regulation” , “regulating” and the like refer to the process in which the level of a protein target and / or associated biological functions thereof are controlled by one or more polypeptides disclosed herein, wherein the desired net outcome of modulation is a higher, a lower, or an unchanged expression level, and associated biological functions thereof are at a higher, a lower, or an unchanged level.

[0033] The terms “oligomer” , “oligomerization” , and the like refer to the formation of protein-protein or protein-other molecule complex in which two or more biological molecules are involved, including but not limited to 2, 3, 4, 5, 6, 7 or more proteins, nucleotides, or other molecules. In this context, the terms “homo-oligomer” , “homo-oligomerization” and the like refer to the process where the complex is formed by identical bio-molecules, e.g., two or more identical polypeptide chains. In some embodiments, the terms “hetero-oligomer” , “hetero-oligomerization” and the like refer to the process where the complex is formed by at least partially different bio-molecules, e.g., two or more different polypeptide chains, or two polypeptide A and one polypeptide B.

[0034] The terms “the level of a protein target” , “the level of a protein target in its functional state” , “the level of a functional protein target” and the like refer to the amount of a protein that is active in its native functional environment. Non-limiting examples of changes in the level of a functional protein include altered (higher or lower) rate of protein synthesis, folding, aggregation, activation, and / or degradation, altered types of protein post-translational modifications, and / or changes in cellular localization (for instance, a protein normally functioning in the nucleus is found to accumulate in the cytosol instead) required for the normal function of the protein.

[0035] Regarding “the level of a protein” , upregulation of the protein means that the level of the protein available for its normal functions are at least 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%or more compared to the regular level of the protein, downregulation of the protein means that the level of the protein available for its normal functions are at least 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%or less compared to the regular level of the protein, while maintained at a stable expression level means that the level of the protein available for its normal functions are within 100%±10%compared to the regular level of the protein.

[0036] Regarding “associated biological functions of a protein” , augmented associated biological functions of a protein mean that the level of biological functions in the presence of the composition comprising the polypeptides are at least 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%or more compared to the regular level of biological functions, inhibited associated biological functions of a protein mean that the level of biological functions in the presence of the composition comprising the polypeptides are at least 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%or less compared to the regular level of biological functions, while the “kept at the standard level” of associated biological functions of a protein means that the level of biological functions in the presence of the composition comprising the polypeptides are within 100%±10%compared to the regular level of biological functions.

[0037] The terms “segment” , “region” , “fraction” , and the like refer to a fragment with a contiguous amino acid sequence within a protein target, wherein the fragment comprises a protein, a protein domain, one or more secondary-structural elements or combinations or a fraction thereof. In some embodiments, the fragment comprises predominantly hydrophilic amino acid residues. In some embodiments, the fragment comprises predominantly hydrophobic amino acid residues. In some embodiments, the fragment comprises both hydrophilic and hydrophobic amino acid residues.

[0038] The terms “secondary-structural element” , “secondary-structural elements” , and the like refer to one or more secondary-structural elements known to anyone skilled in the art, including alpha-helices, beta-strands, turns, or loops or combinations or a fraction thereof. Secondary structures of proteins are formed by the folding of the polypeptide chain into local structures stabilized by hydrogen bonds. Alpha-helices are right-handed coils with hydrogen bonds between the carbonyl oxygen of one amino acid and the amide hydrogen four residues earlier, typically featuring 3.6 amino acids per turn and side chains extending outward. Beta-sheets consist of beta strands connected laterally by hydrogen bonds, either in parallel or antiparallel arrangements, with side chains alternating above and below the sheet plane. Beta turns and loops are short regions that link secondary structures, allowing the polypeptide to change direction and are often stabilized by hydrogen bonds. These secondary structures provide stability, facilitate specific functions, and contribute to the overall shape of the protein.

[0039] Secondary structural elements of a protein are defined using both experimental and computational methods. Experimental techniques like X-ray crystallography, NMR spectroscopy, cryo-electron microscopy, and circular dichroism spectroscopy provide detailed structural information by analyzing the protein in crystalline or solution forms. Computational methods include secondary structure prediction algorithms such as PSIPRED and DSSP, which predict alpha-helices, beta-sheets, and turns from the amino acid sequence of a protein.

[0040] Recent advancements in computational methods, particularly AlphaFold and RoseTTAFold, have revolutionized the field of protein structure prediction. AlphaFold employs deep learning techniques to predict protein structures by analyzing the relationships between amino acid sequences and their three-dimensional conformations, effectively capturing long-range interactions within the protein. Similarly, RoseTTAFold integrates deep learning with traditional energy-based modeling approaches, leveraging a three-track neural network to simultaneously consider sequence, distance, and coordinate information. AlphaFold's predictions have been shown to closely match experimental results, making it a powerful tool for understanding protein folding, guiding experimental work, and providing insights into protein function and interactions, particularly when experimental determination is challenging or infeasible.

[0041] The terms “consecutive” , “contiguous” and the like refer to the continuity of amino acid sequence and / or secondary structure within the native sequence and / or structure of the protein target regardless of the directionality of the polypeptides. Under this definition, if within a protein, the order of secondary-structural elements from the N-terminus to the C-terminus is Helix A-Helix B-Helix C-Strand 1-Strand 2-Strand 3-Helix D, polypeptides corresponding to Helix B-Helix C, or Helix C-Helix B, or Helix C-Strand 1, or Strand 1-Helix C are considered as comprising consecutive secondary-structural elements regardless of the directionality of the polypeptides, wherein polypeptides corresponding to Helix B-Strand 1, or Strand 1-Helix B, or Helix B-Strand 1-Strand 2, or Strand 2-Strand 1-Helix B, or Strand 2-Helix B-Strand 1 or the like are considered as comprising inconsecutive secondary-structural elements regardless of the directionality of the polypeptides. In this context, the term “directionality” refers to the regular direction of a protein sequence that runs from the N-terminus to the C-terminus, while “regardless of the directionality” refers to that the sequence of a polypeptide is of the same direction, or of a reverse direction, from the sequence / structure of the protein target. As an example, from the N-terminus to the C-terminus, if amino acid sequence in the normal directionality is NABCDEFGHC, the amino acid sequence in the reverse direction becomes NHGFEDCBAC, wherein the subscripts N and C indicate the N-terminus and the C-terminus of the polypeptides, respectively.

[0042] The terms “tunable” , “adjustable” , “tuned” , and the like refer to the probability to adjust the selectivity and binding affinity of a polypeptide to a particular protein target, or a group of protein targets. The term “selectivity” refers to whether or not a polypeptide binds to a particular protein target or a group of protein targets, while the term “binding affinity” refers to how strong a polypeptide binds to a particular protein target or a group of protein targets.

[0043] The terms “bind to” , “target” , “targeting” , “interacting” , “interact” , “interaction” “contacting” , “direct” , “directed” and the like refer to the process that a polypeptide interacts, in a selective manner, with the protein target and modulates the level and associated biological functions thereof. In some embodiments, the venue for the interaction between a polypeptide and its protein target is in test tubes, in cells or in organisms in a lab setting such as an isolated cell in cell culture, or in cells or in organisms in a living animal, including a mammal, such as a human. In some embodiments, the protein target is endogenous to the subject. In other embodiments, the protein target is exogenous to the subject, non-limiting examples including a viral protein in a human cell due to a viral infection, or a yeast protein over-expressed in a human cell line by introducing a polynucleotide encoding the protein.

[0044] The terms “amino acid sequence identity” and the like refer to the percentage of amino acids that are identical among two or more proteins, polypeptides and / or peptides taking into account of possible insertions, and deletions. The calculation of amino acid sequence identity using conventional sequence alignment or multiple sequence alignment is well known to anyone skilled in the art, non-limiting tools including the BLAST package (https:  / / blast. ncbi. nim. nih. gov) and the Clustal package (http:  / / www. clustal. org) , among others.

[0045] The terms “correspond” , “corresponding” , and the like refer to a polypeptide having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of one or more secondary-structural elements of the protein target. In some embodiments, the amino acid sequence of a polypeptide is first derived from the corresponding secondary-structural elements of a protein target, which is then modified to share a lower amino acid sequence identity with the protein target. Non-limiting examples of modifications include one or more occurrences of point mutation, circular permutation, truncation, deletion, and / or insertion, and / or combinations thereof. The modifications are assisted by conventional computational, experimental methods or other means known to anyone skilled in the art. In some embodiments, the amino acid sequence of a polypeptide is derived from one or more secondary-structural elements of a protein target’s homologues (e.g. paralogues and / or orthologues) , which has at least 10%amino acid sequence identity with the corresponding region of the protein target. In some embodiments, the amino acid sequence of a polypeptide is derived from a multi-sequence alignment of a protein’s homologues (e.g. paralogues and / or orthologues) and has at least 10%amino acid sequence identity with the corresponding region of the protein target. In some embodiments, the amino acid sequence of a polypeptide is derived from a multi-sequence alignment of a protein family and has at least 10%amino acid sequence identity with the corresponding region of one or more members of the protein family. The involved techniques are standard in the field and known to anyone skilled in the art.

[0046] The term “spectrum” refers to the number of proteins that are modulated by a polypeptide. The term “individual protein” refers to a protein in its entirety including the N-terminal start codon all the way to the C-terminal amino acid residue right before the stop codon. The opposite term to “individual proteins” is “identical proteins” , which refers to proteins having 100%amino acid sequence identity in its entirety. Under this definition, a wild-type protein and its splicing variants or protein mutants due to point mutations, circular permutations, truncations, deletions, and / or insertions, and / or combinations thereof at one or more sites are different, individual proteins.

[0047] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for modulating a protein target and / or associated biological functions thereof in a subject, wherein the protein target may be a protein of any origin, including but not limited to human proteins, bacterial proteins, viral proteins, fungal proteins, or designed artificial proteins.

[0048] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for modulating a protein in a subject no matter whether the protein target is a single-domain or multi-domain protein. The terms “single-domain protein” and the like refer to a protein that consists of one continuous polypeptide chain that folds into a single, functional three-dimensional structure. This domain independently performs a specific biological function. The terms “multi-domain protein” and the like refer to a protein that contains two or more distinct regions or domains, each of which folds independently into a stable structure and often has a specific function. These domains interact with each other to perform complex biological processes.

[0049] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for modulating a protein in a subject no matter whether the protein target is a monomeric protein or oligomeric proteins (e.g., homo-oligomeric or hetero-oligomeric proteins) . In some embodiments, a “protein” , or “protein target” is a monomeric protein. In some embodiments, a “protein” , or “protein target” is a homo-oligomeric protein. In some embodiments, a “protein” , or “protein target” is a hetero-oligomeric protein.

[0050] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for modulating a protein in a subject no matter whether the protein is endogenous or exogenous to the subject. Herein the term “endogenous” is used to refer to a protein that is an intrinsic part of the subject’s genome and encoded by the subject, while “exogenous” is used to refer to a protein that is introduced in the subject, such as a viral protein that is introduced in the host via a viral infection, or a protein that is introduced into a plant via genetic approaches.

[0051] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for modulating a protein target and / or associated biological functions thereof in a subject, wherein the protein can be of any native localization, extracellular or intracellular. In this context, extracellular proteins include but are not limited to, membrane proteins anchored in plasma membrane with one or more portions exposed to the extracellular space, secreted proteins or proteins in the extracellular matrix. Non-limiting secreted proteins include antibodies, cytokines, growth factors, digestive enzymes, and insulins. Non-limiting extracellular matrix proteins include collagens, integrins, fibronectins, transmembrane proteins and cell-surface receptors. Intracellular proteins are proteins that reside inside cells, including but not limited to proteins localized in nucleus, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, lysosomes, peroxisomes, centrosomes and centrioles, vacuoles, vesicles, and plasma membrane.

[0052] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for tuning the level of one or more protein targets in a subject by one or more polypeptides, wherein the desired level of a protein is reached and maintained via tuning the amino acid sequence and / or the amount of each polypeptide included in a composition. In some embodiments, the dose of the composition and the administration route and frequency are also tuned to achieve the desired level of a protein.

[0053] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for tuning the level of biological functions associated with one or more protein targets in a subject by one or more polypeptides, wherein the desired level of biological functions is reached and maintained via tuning the amino acid sequence and / or the amount of each polypeptide included in a composition. In some embodiments, the dose of the composition and the administration route and frequency are also tuned to achieve the desired level of biological functions.

[0054] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for modulating at least one protein and / or the associated biological functions thereof wherein a disease or condition in the subject is prevented.

[0055] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for modulating at least one protein and / or the associated biological functions thereof wherein a disease or condition in the subject is treated.

[0056] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for modulating at least one protein and / or the associated biological functions thereof wherein a disease or condition in the subject is reduced in severity.

[0057] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for modulating at least one protein and / or the associated biological functions thereof wherein the onset of a disease or condition in the subject is postponed.

[0058] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for modulating a protein target and / or associated biological functions thereof in a subject, wherein the polypeptide contains extra amino acid sequences for a particular function. Non-limiting examples include signal peptides, or subcellular-localization signals for targeted localization, sequences for enhanced or reduced immunogenicity, sequences for enhanced or reduced membrane permeability, sequences for enhanced or reduced cellular degradability, and / or affinity tags such as FLAG tag for purification purposes.

[0059] In a further aspect, disclosed herein is a method for preparing a pharmaceutical composition for modulating one or more protein targets, wherein the pharmaceutical composition comprises at least one polypeptide or a polynucleotide encoding at least one polypeptide, wherein the polypeptide corresponds to one or more secondary-structural elements of a protein target and modulates the protein target regardless of the directionality of the amino acid sequence or the order of the secondary-structural elements, comprises the steps of: identifying secondary-structural elements of the protein target by utilizing three-dimensional structures of the protein target; designing the polypeptide based on the secondary-structural elements of the protein target, by including one or more secondary-structural elements within the polypeptide, wherein the secondary-structural elements are selected according to their probability of maintaining the three-dimensional secondary structures in isolation, wherein said designing optionally including: varying the number or continuity of secondary-structural elements incorporated in the polypeptide, and / or introducing sequence modifications chosen from point mutation, circular permutation, truncation, deletion, insertion, and / or any combination thereof; preparing the designed polypeptide or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the designed polypeptide; testing the efficiency of modulation of the protein target by the designed polypeptide or a polynucleotide encoding the polypeptide in vivo, ex vivo and / or in cell-based systems for the ability to modulate the protein target or a family of related protein targets; selecting at least one polypeptide that meets a predefined potency and selectivity threshold; and specifying a pharmaceutical composition that comprises at least one selected polypeptide or a polynucleotide encoding at least one polypeptide together with at least one pharmaceutically acceptable carrier, thereby completing the design of the pharmaceutical composition.

[0060] As disclosed herein, any embodiment described can be combined in the design of the pharmaceutical composition.

[0061] As disclosed herein, the polypeptide comprises an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of a protein, wherein within the corresponding amino acid sequences, the amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of the protein target.

[0062] As disclosed herein, the polypeptide contains amino acid residues that are effective to form one or more secondary-structural elements. In some embodiments, the size of the polypeptide comprises, but is not limited to, 5, 10, 15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, or 4000 amino acid residues or greater, and any range derivable therein.

[0063] In some embodiments, the binding of the polypeptide to its protein target leads to degradation or depletion of the protein target in the subject.

[0064] In some embodiments, modulation of a protein target, including but not limited to a human protein such as PARP1, PARP2, PARP3, BTK, BMX, TEC, Resting Lymphocyte Kinase (TXK or RLK) , Interleukin-2 Inducible T-cell Kinase (ITK) , CSF1R, KIT (CD117) , Platelet-derived growth factor receptors alpha and beta (PDGFRa / b) , Fms-like tyrosine kinase 3 (FLM3) , PD-L1, PD-L2, ABL1, ABL2, BCL2, or B-cell lymphoma 2 like proteins including but not limited to, BCL2L1, BCL2L2, BCL2L3, and / or BCL2L5, or their biological functions in a subject comprises inhibition of the protein or their biological functions in a subject. In some embodiments, inhibition of the protein target, including but not limited to a human protein such as PARP1, PARP2, PARP3, BTK, BMX, TEC, TXK, ITK, CSF1R, KIT, PDGFRa / b, FLM3, PD-L1, PD-L2, ABL1, ABL2, and / or BCL2, or B-cell lymphoma 2 like proteins including but not limited to, BCL2L1, BCL2L2, BCL2L3, and / or BCL2L5, or their biological functions in a subject comprises impairment of the biological activity of the protein upon the polypeptide contacting the protein.

[0065] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for modulating a protein target in a subject by using a composition that contains an effective amount of at least one polypeptide, wherein the polypeptide corresponds to one or more secondary-structural elements of the protein target with at least 10%identity within the corresponding amino acid sequence.

[0066] In some embodiments, the polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of a protein target, wherein the amino acid sequence has at least 5, 10, 15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, or 4000 amino acid residues or greater, and any range derivable therein, and has at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of the protein target or fragments or functional derivatives thereof.

[0067] In some embodiments, the polypeptide that modulates a protein target, for example, human PARP family of enzymes or homologues thereof or fragments or functional derivatives thereof, comprises an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 1～3, or homologues thereof, or fragments or functional derivatives thereof.

[0068] In some embodiments, the polypeptide that modulates a protein target, for example, the TEC family of the human non-receptor tyrosine kinase family or homologues thereof or fragments or functional derivatives thereof, comprises an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 13～17, or homologues thereof, or fragments or functional derivatives thereof.

[0069] In some embodiments, the polypeptide that modulates a protein target, for example, human receptor tyrosine kinase (RTK) family members or homologues thereof or fragments or functional derivatives thereof, comprises an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 27～31, or homologues thereof, or fragments or functional derivatives thereof.

[0070] In some embodiments, the polypeptide that modulates a protein target, for example, human B7 family members or homologues thereof or fragments or functional derivatives thereof, comprises an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 34～35, or homologues thereof, or fragments or functional derivatives thereof.

[0071] In some embodiments, the polypeptide that modulates a protein target, for example, human non-receptor tyrosine kinase family or homologues thereof or fragments or functional derivatives thereof, comprises an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 54～55, or homologues thereof, or fragments or functional derivatives thereof.

[0072] In some embodiments, the polypeptide that modulates a protein target, for example, human BCL2 family or homologues thereof or fragments or functional derivatives thereof, comprises an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 67～73, or homologues thereof, or fragments or functional derivatives thereof.

[0073] In some embodiments, the polypeptide modulating a protein target additionally comprises a signal peptide sequence. A signal peptide is a short peptide chain, typically located at the N-terminus of a newly synthesized protein, that directs the protein to the secretory pathway. These peptides are about 15～30 amino acids long and have a distinct structure comprising a positively charged region, a central hydrophobic core, and a polar C-terminal region. The signal peptide targets the protein to the endoplasmic reticulum (ER) in eukaryotic cells or the plasma membrane in prokaryotic cells, where it is recognized by the signal recognition particle (SRP) and guides the ribosome-protein complex to the membrane. Once the protein is translocated across the membrane, the signal peptide is usually cleaved off by signal peptidase, enabling the mature protein to be released into the ER lumen or extracellular space, ensuring proper localization and function. In certain embodiments, the signal peptide comprises an amino acid sequence of at least 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 77～83, or homologues thereof, or fragments or functional derivatives thereof.

[0074] In some embodiments, the polypeptide that modulates a protein target, for example, human RTK family members or homologues thereof or fragments or functional derivatives thereof, comprising an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 27～31, or homologues thereof, or fragments or functional derivatives thereof, further comprises a signal peptide comprising an amino acid sequence of at least 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 77～81, or homologues thereof, or fragments or functional derivatives thereof.

[0075] In some embodiments, the polypeptide that modulates a protein target, for example, human B7 family members or homologues thereof or fragments or functional derivatives thereof, comprising an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 34～35, or homologues thereof, or fragments or functional derivatives thereof, further comprising a signal peptide comprising an amino acid sequence of at least 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 82～83, or homologues thereof, or fragments or functional derivatives thereof.

[0076] In some embodiments, the terms “homologues” or “homologous proteins” or similar terms refer to genes or proteins that share at least 10%amino acid sequence identity. In some embodiments, homologous proteins share common ancestries, originating from a single ancestral gene. In some embodiments, homologous proteins don’ t share common ancestries. In some embodiments, “homologous proteins” refer to orthologues that are proteins in different species having evolved from a common ancestral gene through speciation wherein orthologues retain the same function in the course of evolution. In some embodiments, “homologous proteins” refer to paralogues that are within the same species that have evolved by duplication and subsequently diverged from each other, wherein the divergence may result in the new gene having a different, albeit often related, function. In some embodiments, “homologous proteins” refer to both orthologues and paralogues provided significant homology (at least 10%amino acid sequence identity) exists among them.

[0077] In some embodiments, “regulation” , “regulating” , “modulation” , “modulating” of a protein and / or its biological function comprises a measurable change, in some cases, a statistically significant change, in occurrence or activity, comparing to a “control” . In one example, the control is a sample or subject that is not subjected to a treatment. In another example, the control is a sample or subject that is subjected to a treatment different from a method of this disclosure. A. Polypeptides

[0078] In some embodiments, a modified or variant polypeptide or peptide is used. As used herein, the term “modified” , or “variant” , or “mutant” refers to a polypeptide or a peptide wherein the chemical structure, particularly the amino acid sequence, is altered in relation to the wild-type or native protein or polypeptide. The terms described above may be used interchangeably. In some embodiments, a polypeptide or a peptide is modified with respect to one or more aspects or functions while maintaining a wild-type activity or function in other aspects. Non-limiting examples include modifying the amino acid sequence to alter (reduce or augment) immunogenicity, or to tune the targeting spectrum by a polypeptide.

[0079] As used herein, the term "proteinaceous molecule, " "proteinaceous composition, " "proteinaceous compound, " "proteinaceous chain, " or "proteinaceous material" typically denotes, but is not limited to, a polypeptide, or a peptide comprising one or more secondary-structural elements or corresponding to the full-length sequence translated from a gene, or fragments or functional derivatives thereof. The terms described above may be used interchangeably in this context.

[0080] Proteinaceous compositions can be formulated using various methods by anyone skilled in the art. These methods include but are not limited to, expressing polypeptides, or peptides using established molecular biology techniques, extracting proteinaceous compounds from natural origins, or employing chemical synthesis to produce proteinaceous materials.

[0081] In some embodiments, the polypeptide is produced directly from an organism of which it is native, by recombinant DNA / exogenous expression methods in vitro (including but not limited to microalgae, bacterial, yeast, insect cell, mammalian cell expression systems, and cell-free protein synthesis) , by in vivo expression systems including but not limited to, transgenic animal method and plant-based expression system, or other in vivo or in vitro methods. In some embodiments, nucleic acid segments encoding a polypeptide, including but not limited to RNA or DNA or modified derivatives thereof, are used to produce the polypeptide in a subject, including but not limited to cells, or organisms.

[0082] In some embodiments, the polypeptide is synthesized without using cells or organisms through various chemical methods. Solid-phase peptide synthesis is a widely used technique that involves sequentially adding amino acids to a growing peptide chain anchored to an insoluble resin. Liquid-phase peptide synthesis is a traditional method where amino acids and coupling reagents are dissolved in a liquid medium to build the peptide chain. Additionally, chemical ligation techniques can be employed to chemically link shorter peptide fragments to form longer peptides or proteins. These methods allow for precise control over peptide sequence and structure, facilitating the synthesis of complex peptides for research and therapeutic purposes.

[0083] In some embodiments, the size of a polypeptide or a peptide may comprise, but is not limited to, 5, 10, 15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, or 4000 amino acid residues or greater, and any range derivable therein, or derivatives of a corresponding amino acid sequence described or referenced herein. In some embodiments, the polypeptide may be modified by, including but not limited to, point mutations, circular permutations, truncations, deletions, insertions, additions of extra amino acid residues, or fusion or conjugation with another protein or polypeptides sequence for a particular function.

[0084] In some embodiments, the proteinaceous composition may comprise one or more polypeptides, or peptides. It is expected that any polypeptide, or peptide component described herein can be utilized in the compositions and methods disclosed in the invention. In some embodiments, the proteinaceous composition includes a biocompatible polypeptide, or peptide. The term "biocompatible, " as defined herein, denotes a substance that does not elicit significant adverse reactions when introduced to an organism, based on the methods and quantities outlined. Such adverse reactions encompass pronounced toxicity or detrimental immunological responses. Preferably, biocompatible compositions containing polypeptides, or peptides are predominantly mammalian or synthetic derivatives that are substantially devoid of toxins, pathogens, and harmful immunogens.

[0085] Polynucleotide sequences, alongside their corresponding protein, polypeptide, and peptide sequences for various genes, are readily available in well-established databases. Two primary resources include the National Center for Biotechnology Information’s Genbank and GenPept databases (ncbi. nlm. nih. gov / ) and The Universal Protein Resource (UniProt, uniprot. org) . The coding regions for these proteins can be amplified, chemically synthesized and / or expressed employing the methodologies detailed in this document or known to those skilled in the art.

[0086] In some embodiments, a proteinaceous compound may be purified, wherein “purified” generally refers to a process by which other constituents are removed while the desired protein, polypeptide, or peptide is retained, and the composition largely preserves or even augments its activity. The purity and functionality of the compound can be evaluated using standard protein assays familiar to those skilled in the art for the specific protein, polypeptide, or peptide.

[0087] In some embodiments, proteins, polypeptides and peptides suitable for this invention can include endogenous proteins, polypeptides or peptides. However, the scope of this invention isn't confined solely to endogenous proteins. In this context, the term “endogenous protein, polypeptide, or peptide” denotes a molecule sourced or derived from an organism. Potential organisms encompass, but aren't restricted to, humans, bovines, reptiles, amphibians, fishes, rodents, birds, canines, felines, fungi, plants, prokaryotic organisms, viruses, and bacteriophages. The derived “endogenous protein, polypeptide, or peptide” can subsequently be incorporated into a composition intended for application to the chosen subject, including but not limited to animal or human. The terms “endogenous” and “autologous” are used interchangeably in this context.

[0088] In some embodiments, proteins, polypeptides and peptides suitable for this invention can include exogenous proteins, polypeptides or peptides. In this context, the term “exogenous protein, polypeptide, or peptide” denotes a molecule that is produced in a host organism different from the organism in which it is naturally found. One example of exogenous protein is a viral protein that is expressed in a human cell during a viral infection. Potential organisms encompass, but aren't restricted to, humans, bovines, reptiles, amphibians, fishes, rodents, birds, canines, felines, fungi, plants, prokaryotic organisms, viruses, and bacteriophages. The terms “exogenous” and “heterologous” are used interchangeably in this context.

[0089] In some embodiments, the terms "proteins" , "polypeptides" , and "peptides" denote the proteinaceous composition of this invention. Those skilled in the art will recognize that these terms cover a broad spectrum of proteinaceous materials. An amino acid sequence of a polypeptide may consist of a continuous stretch of amino acid residues covering the entire polypeptide or a part thereof, or may comprise amino acid residues interspersed with other amino acid residues or atoms unrelated to amino acid residues. It is also acknowledged that different amino acid sequences that may vary in composition can adopt identical or nearly identical secondary-structural elements as in a protein target. It is further acknowledged that different directionalities of amino acid sequences including circular permutations can result in identical or nearly identical secondary-structural elements as in a protein target. These variations reflect the robustness of secondary-structural elements and are considered within the inclusive definition of this invention.

[0090] The compositions described herein may contain concentrations ranging from approximately 0.0001 mg to 1000 mg of the total polypeptide, peptide, and / or protein per mL. Potential concentrations can be approximately, or at least, or even up to values such as 0.001, 0.010, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0, 100.0, 200.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 700.0, 800.0, 900.0, 1000.0 mg / mL or more, or any values derivable therein. B. Polynucleotides Encoding Polypeptides

[0091] In some embodiments, the composition may comprise one or more polynucleotide sequences encoding polypeptides as isolated fragments, or recombinant vectors containing inserted polynucleotide sequences, including but not limited to derivatives, or variants of the polypeptides disclosed herein. These polynucleotide sequences can serve as effective tools for various biological applications, including but not limited to, modulating the level of a protein target in its functional state or associated biological functions thereof in a subject by the interaction of the polypeptide expressed from the polynucleotide sequences, specific targeting of a protein target, hybridization probes, PCR primers, or sequencing primers essential for the detection, analysis, mutation, or amplification of genes encoding a specific polypeptide, anti-sense nucleic acids for modulating the expression of a polypeptide, or complementary sequences related to the ones mentioned herein.

[0092] In some embodiments, disclosed are nucleic acid sequences that encode for the polypeptides for effective modulation of the level of a protein target, or that encode for the polypeptides for effective targeting of a protein target, or that encode for the epitope targeted by certain antibodies, or that encode fusion proteins incorporating the polypeptides presented herein. These nucleic acids are versatile, including but not limited to single-stranded and double-stranded, linear, circular, and supercoiled configurations, and may consist of RNA, DNA, or synthetic variants such as modified RNA, and / or peptide nucleic acids (PNAs) .

[0093] The term "polynucleotide" encompasses a broad range of nucleic acid molecules, including but not limited to, synthetic or derived from a genomic library, with or without non-coding (for example, introns) nucleic acid sequences, short nucleic acid chains known as oligonucleotides, typically less than 100 nucleotide residues in length, as well as larger constructs like recombinant vectors, non-limiting examples including plasmids, cosmids, phages, bacterial artificial chromosomes, yeast artificial chromosomes, viral vectors, shuttle vectors, episomal vectors, minivectors , minicircles and similar entities. In some embodiments, polynucleotides may comprise regulatory sequences that have been deliberately separated from their native genes or sequences encoding proteins. These polynucleotides can exist as single strands, which may serve as coding or antisense sequences, or as double strands. They can be composed of RNA or DNA, which might be genomic DNA, complementary DNA (cDNA) , synthetic variations, or their analogs, or combinations thereof.

[0094] The terms "gene" , "polynucleotide" , and "nucleic acid" denote a nucleic acid sequence that is responsible for encoding a protein, polypeptide, or peptide. This definition includes the necessary sequences for proper transcription, any post-translational modifications, and the localization of the encoded product. Those skilled in the field will recognize that these terms cover a broad spectrum of genetic materials, including but not limited to, genomic sequences, expression cassettes for protein production, cDNA sequences, and specialized shorter nucleic acid fragments engineered to produce or be modified to produce proteins, polypeptides, specific functional domains, peptides, fusion proteins, and various mutants thereof. A nucleic acid sequence that codes for all or a segment of a polypeptide may consist of a continuous stretch of nucleotides that translates into the entire polypeptide or a part thereof, or may comprise nucleotide sequences interspersed with non-coding regions such as introns. It is also acknowledged that different nucleic acid sequences that may vary in composition can encode identical or nearly identical proteins. These variations reflect the redundancy and versatility of the genetic code and are considered within the inclusive definition of these terms.

[0095] In some embodiments, disclosed herein are polynucleotide variants, which nevertheless encode a polypeptide having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with an amino acid sequence presented herein or fragments or functional derivatives thereof, or a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide coding a polypeptide having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with an amino acid sequence presented herein or fragments or functional derivatives thereof.

[0096] In some embodiments, the polynucleotides can vary significantly in length, and may comprise additional various nucleic acid sequences, including but not limited to enhancer sequences, promoter sequences, operator sequences, ribosome binding sites, Kozak sequence for eukaryotes, polyadenylation signals, extra restriction enzyme recognition sites, multiple cloning sites, terminator sequences, origin of replication sequences, epitope tag sequences, protein stabilization sequences, protein localization sequences, or other coding sequences, thus influencing their total length. The size of these polynucleotides is not constrained and can span a broad range, with possible lengths including but not limited to 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 700, 8000, 9000, 10000 nucleotides, or even longer. They may also encompass one or more additional sequences, such as regulatory elements, or be incorporated into larger genetic constructs like vectors. The length of a nucleic acid fragment used is generally dictated by the practicalities of its synthesis and its application in a given recombinant DNA technology process. In certain instances, a nucleic acid is designed to encode a polypeptide linked to different heterologous coding sequences, which is advantageous for purposes such as the polypeptide's purification, translocation, secretion, post-translational modification, or for enhancing therapeutic properties, including targeting and treating effectiveness. As mentioned previously, a tag or dissimilar heterologous polypeptide sequence may be fused to the sequence encoding the polypeptide of interest. The term "heterologous" in this context refers to a polypeptide sequence that differs from the primary polypeptide being modified.

[0097] In some embodiments, the polynucleotides harbor additional various nucleic acid sequences to direct expression of the polypeptides at a desired location. Non-limiting examples include organ-specific promoters, tissue-specific promoters, cell type-specific promoters, inducible promoters, developmental stage-specific promoters, and pathogen-specific promoters, among others. These highly specific promoters are invaluable to endorse even higher specificity to the polypeptide-based therapy as disclosed herein, allowing for targeted therapeutic polypeptide expression. They minimize off-target effects and potential side effects by restricting the therapeutic activity to the desired sites, improving the safety and efficacy of treatments.

[0098] Organ-specific promoters are specialized DNA sequences to control protein expression exclusively in certain tissues or organs. These promoters are essential for ensuring that specific polypeptides are expressed only in target tissues. Non-limiting examples include the insulin promoter, which drives gene expression in pancreatic beta cells, the albumin promoter for liver-specific expression, and the myosin promoter in muscle tissues.

[0099] Tissue-specific promoters are DNA sequences that direct gene expression to specific tissues. Non-limiting examples include the albumin promoter that is active in liver cells, the α-myosin heavy chain (α-MHC) promoter that is specific to cardiac muscle cells, the keratin promoters that drive expression in skin cells, the lipoprotein lipase (LPL) promoter that targets adipose tissue and muscle, and the surfactant protein C (SP-C) promoter that is specific to lung alveolar cells. Tissue-specific promoters are essential for targeted gene therapy, transgenic animal creation, and detailed study of gene function in specific tissues.

[0100] Cell type-specific promoters are DNA sequences that regulate gene expression in particular cell types, ensuring that specific genes are activated only in targeted cells. These promoters are crucial for precise gene regulation and allow for targeted studies and therapeutic interventions. Non-limiting examples include the neuron-specific enolase (NSE) promoter that is used to drive gene expression in neurons, enabling research and therapies targeting neurological functions and disorders; the glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter that is specific to astrocytes, facilitating studies on glial cell functions and their role in diseases like gliomas; the surfactant protein C (SP-C) promoter that is specific to alveolar type II cells in the lungs, useful for research and therapies related to pulmonary conditions.

[0101] In some embodiments, the polynucleotides harbor additional various nucleic acid sequences to direct expression of the polypeptides at a desired location. Non-limiting examples further include gene elements that play crucial roles beyond promoters, such as enhancers that are DNA sequences to increase the transcription of associated genes, often working from a distance; silencers that are regulatory elements that repress gene expression; insulators that are boundary elements to prevent the interaction between enhancers and promoters of different genes, maintaining proper gene regulation; and locus control regions (LCRs) that are complex regulatory elements to ensure high-level, tissue-specific expression of linked genes. These elements collectively contribute to the precise spatial and temporal regulation of gene expression in cells.

[0102] In some embodiments, alterations in the amino acid sequence of a polypeptide are brought about by introducing mutations into the corresponding polynucleotide sequence. These modifications are carried out using a variety of established techniques known to anyone skilled in the art. In one approach, specific amino acid residues are targeted and altered via site-directed mutagenesis. In another strategy, mutations are introduced at random positions within the sequence using random mutagenesis techniques. Regardless of the method, the resulting mutant polypeptide is produced and then assessed for particular characteristics or functions.

[0103] In some embodiments, alterations in the nucleic acid sequence encoding a polypeptide do not significantly impacting the polypeptide’s inherent biological function. For instance, nucleotide changes are designed to cause amino acid replacements at residues not critical for the polypeptide's function. On the other hand, strategic mutations can be engineered to modify the biological activity of the polypeptide in a controlled manner. Non-limiting examples include a mutation that could adjust the level of activity of a polypeptide, either increasing or decreasing it, or even completely abolishing it. In terms of qualitative changes, a mutation alters specific properties, such as changing the antigen-binding specificity of an antibody. In some embodiments, strategic mutations known in the art, including but not limited to, point mutations, circular permutations, deletions, or insertions, are introduced to modulate the spectrum of proteins in a subject that can be targeted by a polypeptide. C. Variant Polypeptides

[0104] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for introducing alterations in the polypeptides or peptides or the polynucleotides that encode them as described in this invention, yielding polypeptides with similar or enhanced properties and biological functions. In some embodiments, a polynucleotide is deliberately redesigned to incorporate different sequences while preserving its ability to encode the original ( “wild-type” ) or a variant form of a polypeptide or peptide, made possible by the redundancy of the genetic code-where different codons can specify the same amino acid.

[0105] In some embodiments, mutations including but not limited to, point mutations, circular permutations, deletions, or insertions, are strategically introduced to modulate the spectrum of proteins in a subject that are targeted by a polypeptide. In some embodiments, changes in the length, the corresponding secondary-structural elements, the amino acid sequence, and / or mutations of a polypeptide are introduced to finely modulate the spectrum of proteins in a subject that are targeted by a polypeptide. The term “spectrum” defines whether a polypeptide specifically modulates an individual protein, more than one individual protein, or a family of proteins.

[0106] In general, the fewer the amino acids in a polypeptide, the less room there is for changes without affecting its function. Mid-sized polypeptides permit a moderate degree of alteration. Full-length proteins, in contrast, are often more accommodating of a greater number of changes. It is well-known to anyone skilled in the art that some molecules or domains are more tolerant to amino acid changes than others. Therefore, a polypeptide, and / or a polynucleotide (and its encoded polypeptide) are considered as having the same or similar biological functions, even with considerable variations, provided these do not significantly impact the polypeptide’s ability to interact with specific protein targets, protein families, and similar entities.

[0107] In some embodiments, the polypeptides described herein may be modified to improve their pharmacokinetic, pharmacodynamic, or biophysical properties. Such modifications may include PEGylation, in which one or more polyethylene glycol (PEG) moieties (e.g., linear or branched PEG, ranging from 2 kDa to 40 kDa) are covalently attached to the polypeptide to increase solubility, reduce immunogenicity, and prolong circulating half-life. The PEG moiety may be conjugated via reactive groups (e.g., maleimide, NHS ester) to specific residues such as cysteine or lysine, or to the N-or C-terminus of the polypeptide. Additional modifications may include lipidation (e.g., palmitoylation, stearoylation) , glycosylation, or fusion to half-life extension domains such as Fc fragments, albumin-binding peptides, XTEN sequences, or PAS sequences. Chemical stabilization strategies may also be employed, such as backbone cyclization, stapled helices, non-natural amino acid incorporation (e.g., D-amino acids, N-methylated residues) , or replacement of labile peptide bonds with peptidomimetics. These modifications may be used alone or in combination to enhance stability, membrane permeability, or target selectivity, and are considered within the scope of the invention.

[0108] The genetic code is comprised of a series of codons, which are sequences of three nucleotides that correspond to specific amino acids-the building blocks of proteins. Due to the redundancy of the genetic code, most amino acids are encoded by more than one codon. This redundancy allows for a phenomenon known as codon degeneracy, where multiple codons can lead to the inclusion of the same amino acid in the growing polypeptide chain during protein synthesis. "Functionally equivalent codons" are different triplets of nucleotides that encode the same amino acid. For example, leucine is encoded by six different codons: CTT, CTC, CTA, CTG, TTA, and TTG. Despite the sequence differences, each of these codons directs the incorporation of a leucine residue into a protein. In a broader sense, these functionally equivalent codons can be used interchangeably in the genetic code without altering the sequence of the amino acids in the resulting polypeptide, thus maintaining its structure and function.

[0109] "Neutral substitutions, " also known as "silent mutations" or "synonymous mutations, " are changes in the DNA sequence that do not affect the amino acid sequence of the protein due to codon degeneracy. These substitutions occur at the third position of the codon, which is often subject to a higher rate of variation and can tolerate changes without altering the protein's amino acid composition. For example, a change in the DNA sequence from GAA to GAG still encodes the amino acid glutamate, and thus the substitution is considered neutral with respect to the protein's sequence and function. By employing functionally equivalent codons or making neutral substitutions, one skilled in the art can alter the nucleotide sequence of genes to improve their stability, expression levels, or to adapt them to the codon usage preferences of different organisms without changing the final protein and / or polypeptide product. Each organism has a unique codon usage bias, meaning that it uses certain codons more frequently than others to encode each amino acid. This bias can be due to various factors, including the abundance of tRNAs corresponding to those codons, evolutionary pressures, or GC content of the organism's genome. In some embodiments, one skilled in the art employs optimal codons, in a process termed “codon optimization” , to increase the efficiency and level of expression of a gene in a particular host organism, wherein the nucleotide sequence of a gene is altered so that it better aligns with the preferred codon usage of the target organism without altering the amino acid sequence of the expressed protein or polypeptide.

[0110] In some embodiments, the amino acid sequence of a protein or polypeptide is altered, resulting in protein or polypeptide variants. Protein or polypeptide variants typically fall into three main categories: substitution, insertion, and deletion variants. Each of these alterations may impact the protein’s structure and function in different ways, or may not alter the protein or polypeptide’s structure and / or biological function.

[0111] In some embodiments, the amino acid sequence of a protein or polypeptide is altered due to substitution variants that include but are not limited to conservative or non-conservative substitutions. In conservative substitutions, amino acids with similar properties are substituted for each other, which may affect the protein minimally and can sometimes be tolerated without significant loss of function. In non-conservative substitutions, amino acids with different properties are swapped (e.g., lysine for phenylalanine) , which can lead to more dramatic changes in the structure and function of a protein or a polypeptide.

[0112] As known to anyone skilled in the art, non-limiting examples for conservative substitutions include the exchanges between leucine and isoleucine; valine and alanine; phenylalanine and tyrosine and tryptophan; serine and threonine; asparagine and glutamine; aspartate and glutamate; lysine and arginine; cysteine and serine; methionine and leucine; glycine and alanine. While conservative substitutions are generally expected to have less impact on the folding, stability, or function of a protein or polypeptide than non-conservative substitutions, the actual effect of a substitution depends on the specific context within the protein or polypeptide. In some embodiments, "conservative amino acid substitutions" include non-natural amino acid residues. These residues are often introduced synthetically, rather than being produced by living organisms, and may include peptidomimetics or stereochemically altered forms of standard amino acids. Such conservative substitutions are deemed “conservative” because the structural variations they introduce do not critically alter the function of the protein or polypeptide, and are within the scope of this invention.

[0113] In some embodiments, the amino acid sequence of a protein or polypeptide is altered due to insertion variants. Non-limiting examples include insertions wherein one or more amino acids are added to the amino acid sequence, which can result in a longer, potentially more flexible or differently folded protein or polypeptide, and / or extension wherein the N-terminus or C-terminus of the protein or polypeptide is extended, adding additional amino acids to one or both ends of the protein or polypeptide. In some embodiments, insertion variants include, but are not limited to, fusion proteins composed of one or more of polypeptides disclosed in this invention, fusion of one or more polypeptides disclosed herein with affinity tags for purification purposes, with solubilization sequences for enhanced solubility, and / or with signal peptide or nucleus localization signal sequences for targeting or localization, wherein the sequences are connected with or without linkers.

[0114] In some embodiments, the amino acid sequence of a protein or polypeptide is altered as a result of deletion variants. Non-limiting examples include deletions wherein one or more amino acids are removed from the amino acid sequence, which can lead to a shorter protein or polypeptide that may have a compromised function or a completely different fold, and / or truncation wherein either the N-terminus or C-terminus or both termini of the protein or polypeptide is shortened, which may or may not remove important functional or structural elements of the protein or polypeptide. In some embodiments, a premature stop codon can be incorporated into a protein or polynucleotide sequence through substitution or insertion, thereby producing a variant that is shorter than the wild-type version.

[0115] Each of these variant types can affect the secondary, tertiary, or quaternary structure of a protein or polypeptide, thereby impacting its function. For instance, changes on the protein surface may affect interaction with other molecules, whereas changes in the core might impact stability. Moreover, variants can be designed to enhance stability, alter specificity or activity, improve expression yields, or reduce immunogenicity, depending on the desired application.

[0116] The amino acid sequence variants described may comprise substitutional, insertional, and / or deletional modifications, affecting 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 or more amino acid residues, consecutive or dispersed throughout the protein or polypeptide, in comparison to the original or "wild-type" sequence. These variants may retain an amino acid sequence identity ranging from at least 10%to 90%or more, encompassing all intermediate percentages and ranges, with any sequence disclosed or referenced in this invention. Furthermore, variants may incorporate 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, or more amino acids at each modification.

[0117] In addition, amino acid and nucleic acid sequences may encompass additional components, such as extra amino acids at the N-or C-terminus or additional 5′ or 3′ nucleotide sequences, while preserving the biological function of the protein or polypeptide. For nucleic acid sequences various additional sequences include non-coding sequences adjacent to the 5′ or 3′ ends and / or in the middle of the coding region.

[0118] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for making amino acid sequence variants of the sequences referenced in this invention, wherein a polypeptide or a region or fragment thereof has an amino acid sequence that has at least, or has at most 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, or more amino acid substitutions, or any range derivable therein, contiguous amino acid additions, or contiguous amino acid deletions compared to any of SEQ ID NOS: 1～102. Alternatively, a polypeptide or a region or fragment thereof has an amino acid sequence that is, is at least, or is at most 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any range derivable therein, identical to any of SEQ ID NOS: 1～102.

[0119] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for making amino acid sequence variants of the sequences referenced in this invention, wherein a polypeptide or a region or fragment thereof comprises an amino acid region of 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 400, 500, or more contiguous amino acids, or any range derivable therein, starting at position 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 400, 500, or more, or any range derivable therein, in any of SEQ ID NOS: 1～102 (where the N-terminus of the SEQ ID NO. is Position 1) . The polypeptides of this invention may include 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 or more, or any range derivable therein, variant amino acids or be at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any range derivable therein, similar, identical, or homologous with at least, or at most, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, or more contiguous amino acids, or any range derivable therein, of any of SEQ ID NOS: 1～102.

[0120] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for making amino acid sequence variants of the sequences referenced in this invention, wherein a polypeptide or a region or fragment thereof may include at least, at most, or exactly 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, or more substitutions, or any range derivable therein, of any of SEQ ID NOS: 1～102, wherein the substitution may be at amino acid position 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 400, 500, or more, or any range derivable therein, in any of SEQ ID NOS: 1～102 (where the N-terminus of the SEQ ID NO. is Position 1) .

[0121] To make variant polypeptides, anyone skilled in the art may determine suitable variants based on the understanding of the function of a protein target, such as enzymatic activity, structural support, signaling, or transport through studying the literature, examining protein databases, and possibly conducting preliminary experiments to assess the protein's activity and interaction.

[0122] In some embodiments, high-resolution structural data may allow anyone in the art to identify the backbone conformation, the side-chain interactions, and the positioning of secondary-structural elements within tertiary structures. The structural information may be obtained from, for example, Protein Data Bank (wwpdb. org) , or by ALPHAFOLD2 (Jumper, Evans et al. 2021) or ALPHAFOLD3 (Abramson, Adler et al. 2024) (alphafold. ebi. ac. uk) .

[0123] In some embodiments, anyone skilled in the art may determine suitable variants based on the understanding of sequence conservation. By comparing the protein sequence with orthologue homologous sequences from different organisms and / or paralogue homologous sequences from the same organisms via a process called multiple sequence alignment, conserved and non-conversed residues can be identified. In some embodiments, wherein all the members of a protein family are to be modulated, the polypeptide can be chosen to have an amino acid sequence corresponding to a highly conserved region shared among the protein family, and / or specific variants may be further made to enhance the binding. In some embodiments, wherein only one or a few members of a protein family are to be modulated, the polypeptide may be chosen and / or specific variants may be introduced to have an amino acid sequence with the highest affinity for one or a few members of a protein family, but may not interact with the rest of members of the protein family. In some embodiments, effects of mutations may be predicted using computational tools like the Sorting Intolerant From Tolerant (SIFT) or Polymorphism Phenotyping (PolyPhen) algorithms. Molecular dynamics simulations can further predict how a mutation might alter the protein's dynamics and stability over time. Advanced computational methods can integrate vast amounts of data to predict outcomes of mutations more accurately. Machine learning algorithms can learn from known protein structures and functions to suggest which mutations are most likely to be successful.

[0124] In some embodiments, anyone skilled in the art may obtain suitable variants using screening techniques, including but not limited to, phage display or yeast two-hybrid screening that allow researchers to test a large number of mutations in parallel. This method can be particularly useful when the precise effect of a mutation is difficult to predict or when a range of potential activities is acceptable. In such embodiments, a library containing a large number of mutations may be generated by randomized libraries wherein random sequences are introduced at specific positions within a gene, by directed libraries wherein mutagenesis of a specific sequence or set of sequences are based on known structure-function relationships, or by combinatorial libraries wherein a set of different sequences at multiple positions within a gene are combined.

[0125] In some embodiments, anyone skilled in the art may determine suitable variants based on the hydropathy index. Hydropathy index, as introduced by Kyte and Doolittle (Kyte and Doolittle 1982) , provides a numerical value indicating the hydrophobic or hydrophilic nature of amino acid residues. This index is used in predicting the potential for regions within a protein to form transmembrane segments or to facilitate protein folding and structure based on the hydrophobicity of the amino acid side chains. The Kyte-Doolittle hydropathy values for the 20 standard amino acids are: Arginine (R) : -4.5; Histidine (H) : -3.2; Lysine (K) : -3.9; Aspartic Acid (D) : -3.5; Glutamic Acid (E) : -3.5; Serine (S) : -0.8; Threonine (T) : -0.7; Asparagine (N) : -3.5; Glutamine (Q) : -3.5; Glycine (G) : -0.4; Proline (P) : -1.6; Alanine (A) : +1.8; Cysteine (C) : +2.5; Methionine (M) : +1.9; Valine (V) : +4.2; Leucine (L) : +3.8; Isoleucine (I) : +4.5; Tyrosine (Y) : -1.3; Phenylalanine (F) : +2.8; and Tryptophan (W) : -0.9. In some embodiments, anyone skilled in the art may determine suitable variants based on the hydrophilicity of amino acid residues, as included in U.S. Patent 4,554,101.

[0126] Once desired variants are designed, anyone skilled in the art may use techniques such as site-directed mutagenesis or CRISPR / Cas9 genome editing for specific changes to be made to DNA sequences, which then translate into protein mutations. These techniques are precise and have a high chance of not affecting unintended parts of the protein.

[0127] In some embodiments, disclosed herein are methods for strategic amino acid substitutions to achieve various objectives, including but not limited to: fine-tuning the spectrum of protein targeting, modulating immunogenicity for therapeutic treatment, improving solubility, fine-tuning structural stability, modulating temperature tolerance and / or pH resilience, increasing resistance to enzymatic degradation, modulating affinity for protein complex formation, fine-tuning the binding of ligands or antigens, imparting or altering additional physicochemical and / or functional characteristics of the polypeptides, and many others. For instance, selective amino acid changes, which may include conservative substitutions, are introduced into the existing amino acid sequence. In some embodiments, amino acid substitutions may be designed to increase the stability of the polypeptide, while in other embodiments, amino acid substitutions may be designed to decrease the stability of the polypeptide.

[0128] The term "amino molecule" as utilized herein encompasses any form of amino acid, its derivatives, or mimetics as recognized by anyone with skills in the field. In some embodiments, the amino residues of the polypeptide are contiguous, forming an unbroken chain of amino acid residues. In other embodiments, the amino sequence may be interspersed with one or several non-amino molecular elements. In some embodiments, polypeptides may exhibit interruptions in their amino acid sequences by non-amino molecular entities. The peptides and polypeptides described herein are composed not only of the twenty standard amino acids but also include their post-translational modifications, amino acid derivatives and / or mimetics. Moreover, the synthesis of polypeptides in vitro allows the incorporation of modified and unnatural amino acids, expanding the diversity of the molecular structure and function.

[0129] In some embodiments, disclosed herein are “proteinaceous composition” wherein modified and unnatural amino acids are present alongside the standard twenty amino acids that are commonly found in proteins and are encoded directly by the genetic code. These modified and unnatural amino acids can be created through post-translational modifications of standard amino acids in proteins or polypeptides or can be incorporated into proteins or polypeptides during translation by specialized mechanisms. They can also be synthesized chemically and incorporated into polypeptides through laboratory techniques. A partial list of modified and unnatural amino acids can be found in the table below.

[0130] In some embodiments, structurally analogous compounds that replicate critical sections of the peptides or polypeptides disclosed herein may be designed. Termed "peptidomimetics, " these synthetic molecules are crafted to function equivalently to the polypeptides characterized in this invention. They can potentially be used interchangeably with the native polypeptides for similar biological applications, therefore are within the scope of this disclosure.

[0131] Peptidomimetics are small protein-like chains designed to mimic a polypeptide or protein of interest. They typically arise from modifications of the amino acid sequence of the polypeptide to alter the molecule's properties, making it more suitable for therapeutic use. Peptidomimetics aim to imitate the secondary and tertiary structural elements of proteins. The fundamental concept is that the polypeptide backbone's primary role is to position the amino acid side chains strategically, enabling molecular interactions like those between antibodies and antigens. A peptidomimetic, therefore, is engineered to allow these critical molecular interactions to occur in a manner comparable to the natural polypeptide it emulates, while improving the limitations of natural polypeptides or proteins, such as their stability, bioavailability, or the ability to selectively bind to a particular protein or a group of proteins.

[0132] The modifications in peptidomimetics can involve changes to the peptide backbone or side chains, including but not-limited to, backbone modifications wherein changes to the amide bond (–CO–NH–) lead to more resistant to proteolytic enzymes; side-chain modifications to modulate binding affinity, specificity, or to confer resistance to metabolic degradation; incorporation of non-natural amino acids to modulate the drug-like properties of the polypeptide; cyclization to enhance stability and binding affinity of the polypeptide; hydrocarbon stapling to lock a polypeptide into a particular conformation and modulate its specificity and affinity for the protein, as well as the overall stability.

[0133] Some notable successes in peptidomimetic development include mimicking β-turn structures for enhanced immunogenicity; design of disulfide-bonded small, stable proteins to mirror the interaction sites of more complex proteins; mimicking the structure of β II turns with cyclic L-peptides and D-amino acids; and alpha-helix mimetics for enhanced stability and resistance to degradation, as disclosed in patents including U.S. Patents 5,446,128; 5,710,245; 5,840,833; and 5,859,184; as well as other types of mimetic turns as disclosed in U.S. Patents 5,440,013; 5,618,914; and 5,670,155; 5,475,085 and 5,929,237, 5,672,681 and 5,674,976. These structural analogs serve to expand the repertoire of tools available for peptide and protein engineering. II. Therapeutic compositions of highly-specific modulation of protein levels and  functions by designed polypeptides

[0134] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide, wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of a protein, wherein within the corresponding amino acid sequences, the amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of a protein target.

[0135] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of a protein, wherein within the corresponding amino acid sequences, the amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of a protein target.

[0136] In some embodiments, the polypeptide is expressed from a vector containing a polynucleotide sequence coding for the polypeptide, wherein the vector is a viral vector including but not limited to, adenoviruses, retroviruses, lentiviruses and / or adeno-associated viruses, or a non-viral vector including but not limited to, plasmid, minicircle DNA, minivector, liposomes, polymer-based vector and / or nanoparticles. In some embodiments, the polypeptide is expressed from an isolated polynucleotide sequence coding for the polypeptide, wherein the methods for delivering the polynucleotide into the subject include but are not limited to physical methods, chemical methods, and / or biological methods, wherein the polynucleotide sequence is of RNA or DNA or derivatives or modified formats thereof.

[0137] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides and one or more other active molecules, wherein the polypeptides specifically bind to one or more protein targets involved in the biological functions to be modulated and serves one or more functions. The polypeptides herein may act as a high-specificity recognizing moiety, applicable to numerous applications including but not limited to, antibody-drug conjugate (ADC) , immunotherapy including chimeric antigen receptor T-cell (CAR-T) therapy, proteolysis coupled chimera (PROTAC) (Yang, Kong et al. 2023) , and small molecule drug conjugates (SMDCs) . In these applications, the polypeptides disclosed in the invention replace the targeting role provided by, including but not limited to, antibodies and / or small molecules.

[0138] In some of these embodiments, the polypeptides confer high-specific targeting for efficient delivery of the active molecules to the subject. In other embodiments, the polypeptides confer both high-specific modulation of the protein target and high-specific targeting for efficient delivery of the active molecules to the subject. The effectiveness of the treatment is enhanced by both the modulation of the protein targets upon selective binding of the polypeptides and the selective delivery of the active molecules by the polypeptides while potentially reducing side effects on healthy cells. In some embodiments, the polypeptides and the active molecules to be delivered coexist without a covalent connection between them. In some embodiments, the polypeptides and the active molecules are connected via covalent bonds with or without the use of linkers.

[0139] In some embodiments, when a pharmaceutical composition comprises one or more polypeptides, the polypeptides may correspond to the secondary-structural elements of different protein targets. For instance, in an application analogous to antibody-drug conjugate (ADC) , one polypeptide capable of recognizing a protein uniquely enriched on the surface of a cancer cell is used for target-specific delivery of the pharmaceutical composition, while another polypeptide capable of potently degrading a cytosolic protein critical to cancer cell’s survival is in the cargo to be delivered. In some embodiments, these polypeptides co-exist in the composition as separate entities, or are covalently linked without linkers between them, or are covalently linked via linkers between them, wherein non-limiting examples of linkers include chemically synthesized linkers such as polyethylene glycol linkers, or linkers composed of amino acids or amino acid analogues. The length and composition of the linker are designed and optimized via computational or experimental methods known to those skilled in the art.

[0140] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides and one or more active molecules and / or cells, wherein the polypeptides act as the targeting molecules that are normally provided by antibodies, non-limiting examples of immunotherapy applications including antibody-drug conjugate (ADC) , chimeric antigen receptor T-cell (CAR-T) therapy, bispecific T-cell engagers (BiTEs) , and / or radioimmunotherapy. In some embodiments, the polypeptides disclosed herein guide the selective delivery of drugs as polypeptide-drug conjugates, analogous to ADC. In some embodiments, the polypeptides disclosed herein guide the selective delivery of a T cell to a target cell, e.g., a tumor cell, analogous to CAR-T therapy. In some embodiments, the polypeptides disclosed herein guide the selective engagement of a T-cell and a target cell, e.g., a tumor cell, analogous to BiTEs. In some embodiments, the polypeptides disclosed herein guide the selective delivery of a radioactive isotope to a target cell, e.g., a tumor cell, analogous to radioimmunotherapy mediated by antibodies.

[0141] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides and one or more active molecules and / or cells, wherein the polypeptides act as the targeting molecules that are normally provided by small molecules, non-limiting examples of therapeutic applications including proteolysis coupled chimera () , and small molecule drug conjugates (SMDCs) . In some embodiments, the polypeptides disclosed herein guide the selective delivery of E3 ligase binder to a protein target, analogous to PROTAC. In some embodiments, the polypeptides disclosed herein guide the selective delivery of a cytotoxic drug to a target cell, e.g., a tumor cell, analogous to SMDCs mediated by small molecules. Non-limiting examples of cytotoxic drugs are maytansine or derivatives thereof, auristatins or derivatives thereof, or calicheamicins or derivatives thereof.

[0142] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides and one or more small molecule drugs, wherein the small molecule drugs include but are not limited to, inhibitors, agonists, antagonists, antibiotics, antivirals, chemotherapeutic agents, stains, antifungals, antipsychotics, antidepressants, antihypertensives, diuretics, non-steroidal anti-inflammatory drugs, oral hypoglycemics, and / or proton pump inhibitors, regardless of their protein targets.

[0143] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides and one or more degradation-promoting moieties, wherein the degradation-promoting moieties (degron) include but are not limited to, sequences in chaperone-mediated autophagy (CMA) , ubiquitin-proteasome system (UPS) degron sequences, PEST sequences (proline (P) , glutamic acid (E) , serine (S) , and threonine (T) ) , degron sequences in E3 ligase substrates, endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) signals, mitochondrial targeting signal-associated degron (MitoTAD) , and / or sequences in N-degrons and C-degrons.

[0144] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides and exosomes decorated by polypeptides, wherein the polypeptides act as the targeting molecules to enhance the selective delivery of the exosome cargos, wherein the cargos include but are not limited to modulating polypeptides or polynucleotides encoding polypeptides as disclosed herein, drugs, genetic materials for gene therapy such as RNAi or CRISPR / Cas9 gene editing molecules.

[0145] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides and one or more other organic or biological molecules, wherein the polypeptides act as the targeting molecules, and non-limiting examples of therapeutic applications include epigenetic therapies, immunotherapies, RNA-based therapies including RNA-based therapies including mRNA therapies (such as mRNA-based COVID-19 vaccines) , siRNA and RNAi therapies, antisense oligonucleotides (ASOs) , gene editing including CRISPR-Cas9, and / or molecular glue degraders.

[0146] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for diagnosing the subject with a disease or condition.

[0147] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for diagnosing the subject as having symptoms of a disease or condition.

[0148] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for diagnosing the subject as being at risk of having a disease or condition.

[0149] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for monitoring the progression of a disease or condition in the subject.

[0150] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for evaluating the effectiveness of a treatment regimen for a disease or condition in the subject.

[0151] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for predicting the subject's response to a specific therapeutic intervention for a disease or condition.

[0152] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for identifying potential therapeutic targets for the treatment of a disease or condition.

[0153] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for stratifying subjects based on the severity or subtype of a disease or condition.

[0154] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for determining the genetic predisposition of the subject to a disease or condition.

[0155] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for assessing the likelihood of disease recurrence or relapse in the subject.

[0156] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for identifying biomarkers associated with the onset, progression, or resolution of a disease or condition in the subject.

[0157] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for comparing the efficacy of multiple treatment modalities for a disease or condition in the subject.

[0158] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for ascertaining whether the subject is at high risk for having a disease or condition, does not have a disease or condition, has tested negative for a disease or condition, and / or was diagnosed as having a disease or condition.

[0159] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the pharmaceutical composition comprises one or more pharmaceutically acceptable carriers. Non-limiting pharmaceutically acceptable carriers include liposomes, nanoparticles, solid lipid nanoparticles, polymeric micelles, hydrogels, microspheres, dendrimers, and / or wearable drug delivery devices.

[0160] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the pharmaceutical composition further comprises carriers for targeted delivery. Non-limiting examples include decorated nanoparticles that are engineered to enhance targeted drug delivery by functionalizing their surfaces with molecules such as polypeptides as disclosed herein, antibodies, peptides, or ligands that bind to specific receptors on target cells, improving therapeutic efficacy and reducing side effects; liposomes that encapsulate drugs in a lipid bilayer for targeted tissue delivery; polymeric micelles that solubilize hydrophobic drugs; dendrimers that carry drugs to specific cells through surface modifications; exosomes that naturally target specific cells for drug delivery; and functionalized carbon nanotubes that deliver drugs directly to intracellular targets. These methods collectively improve the specificity and effectiveness of drug delivery while minimizing adverse effects.

[0161] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide, wherein a dose of between 0.1 to 1000 mg / kg or 0.1 to 1000 μg / kg body weight of the subject of a polypeptide is administered to the subject.

[0162] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide, wherein the polypeptide is encoded by an isolated polynucleotide, or in a vector comprising the polynucleotide, including but not limited to a viral vector, a non-viral vector, a minivector, or a minicircle DNA vector, wherein a dose of between 1 x 103 to 1 x 1018 vector copies / kg body weight of the subject is administered to the subject, wherein the cells of the subject express the polypeptide under the guidance of the polynucleotide.

[0163] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition can be given as a single dose.

[0164] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition can be given as multiple doses.

[0165] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the subject might receive the composition daily.

[0166] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the subject might receive the composition several times a day.

[0167] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the subject might receive the composition multiple times a week.

[0168] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the subject might receive the composition multiple times a month.

[0169] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the subject might receive the composition multiple times a year.

[0170] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered system-wide.

[0171] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered via the nose (intranasally) .

[0172] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered through the veins (intravenously) .

[0173] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered into the peritoneal cavity (intraperitoneally) .

[0174] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered into the trachea (intratracheally) .

[0175] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered into muscles (intramuscularly) .

[0176] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered using endoscopy.

[0177] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered through the skin (percutaneously) .

[0178] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered beneath the skin (subcutaneously) .

[0179] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered to a specific region (regionally) .

[0180] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered into the brain (intracranially) .

[0181] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered through inhalation, injection, infusion, or perfusion.

[0182] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered via inhalation.

[0183] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered through injection.

[0184] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered through infusion.

[0185] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the composition is administered through perfusion. A. Application Examples

[0186] Tumor is the results of abnormal growths of cells within the body. They can arise in virtually any type of tissue or organ. Tumors can be benign (non-cancerous) or malignant (cancerous) . Benign tumors are localized and don't spread to other parts of the body; their growth is typically slow. Malignant tumors, on the other hand, have the potential to invade surrounding tissues and spread (metastasize) to distant parts of the body through the blood or lymphatic system.

[0187] The precise causes of tumor occurrence are complex and multifaceted, involving a combination of genetic, environmental, and lifestyle factors. Mutations in DNA can cause cells to grow and divide uncontrollably, leading to tumor formation. These mutations can be inherited or acquired due to various reasons such as exposure to carcinogens (cancer-causing agents like tobacco smoke or certain chemicals) , radiation, certain viruses, chronic inflammation, or hormonal imbalances. Lifestyle factors, such as diet, physical activity, and exposure to sunlight, can also influence tumor risk. Some tumors may have no identifiable cause.

[0188] Currently, breast cancer is the most frequently diagnosed cancer worldwide, predominantly among women. Lung cancer, closely linked to smoking and environmental factors, is another leading cancer globally. Colorectal cancer, which affects both the colon and rectum, is also widespread, as is prostate cancer, commonly diagnosed among older men. Stomach or gastric cancer remains prevalent, especially in certain regions, despite a declining incidence in some areas. While these cancers are prevalent in terms of new cases, their outcomes, survival rates, and associated mortalities vary, with factors like region playing a significant role.

[0189] PARP1 and PARP2 are enzymes involved in the repair of single-strand DNA breaks through the base excision repair pathway. Their role in cancer is intricately linked to their DNA repair functions. When cells sustain DNA damage, PARP1 and PARP2 facilitate the repair process, thus preventing the accumulation of mutations that could lead to cancer. However, in cancer cells, especially those with existing deficiencies in other DNA repair mechanisms like homologous recombination due to BRCA1 or BRCA2 mutations, PARP1 and PARP2 become crucial for cell survival.

[0190] The therapeutic concept of synthetic lethality is exploited by using PARP inhibitors in such cancers. By inhibiting PARP1 and PARP2, the repair of single-strand breaks is hampered, leading to double-strand breaks that cancer cells cannot repair, ultimately causing cell death. This strategy has been effective in selectively targeting cancer cells while sparing normal cells, which can still repair DNA using their intact homologous recombination machinery.

[0191] Furthermore, PARP1, in particular, has roles beyond DNA repair that impact cancer biology. It regulates gene transcription, including genes involved in cell cycle control and apoptosis. Overactivation of PARP1, often due to excessive DNA damage, can deplete cellular NAD+ and ATP, leading to a type of cell death known as parthanatos. In the context of cancer, however, cells may develop mechanisms to avoid this fate, contributing to drug resistance and tumor cell survival. In addition, inflammation mediated by PARP1 can also influence tumorigenesis and the tumor microenvironment, providing additional targets for cancer therapy. Finally, PARP1’s involvement in maintaining chromosome stability and telomere length further ties it to processes that, when dysregulated, can contribute to the genomic instability characteristic of cancer cells.

[0192] PARP1 and PARP2 play significant roles in various diseases beyond cancer due to their central functions in DNA repair and cellular stress responses. In neurodegenerative diseases such as Parkinson's , Alzheimer's , and amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , overactivation of PARP1 has been implicated in neuronal death. This is because PARP1, when excessively activated, can induce parthanatos, which can contribute to the loss of neuronal cells.

[0193] In cardiovascular diseases, excessive activation of PARP1, particularly during ischemic conditions such as myocardial infarction and stroke, can lead to cellular energy depletion and tissue damage. PARP1's role in responding to oxidative stress is a double-edged sword: while it is essential for repairing oxidative DNA damage, overactivation can exacerbate tissue injury under pathological conditions.

[0194] Chronic inflammation is another area where PARP1 is a key player, with its overactivity being linked to inflammatory diseases such as arthritis. By modulating the expression of inflammatory genes, PARP1 can impact the inflammatory milieu and contribute to disease pathology. In metabolic disorders like diabetes, PARP1 activity is associated with the development of complications. It is thought that PARP1 may influence the function of endothelial cells in the vasculature, which can have implications for diabetic retinopathy and nephropathy.

[0195] Furthermore, the involvement of PARP1 in the aging process has also been explored. Chronic low-level activation of PARP1 has been suggested to affect cellular senescence and longevity, potentially linking it to age-related pathologies.

[0196] PARP2 is also critical in various cellular processes, particularly DNA repair, and plays significant roles in cancer. PARP2 participates in the base excision repair (BER) pathway, which is essential for fixing single-strand DNA breaks. When DNA damage occurs, PARP2 detects these breaks and adds poly (ADP-ribose) chains to itself and other proteins, thereby recruiting DNA repair machinery to the damage site. This activity is crucial for maintaining genomic stability, and its inhibition can lead to the accumulation of DNA damage, promoting cell death.

[0197] In cancer therapy, PARP inhibitors (PARPi) exploit the concept of synthetic lethality, particularly targeting tumors with deficiencies in homologous recombination repair (HRR) , such as those with BRCA1 or BRCA2 mutations. PARP2, along with PARP1, is targeted by these inhibitors, leading to unrepaired DNA damage, genomic instability, and ultimately cancer cell death. By repairing DNA damage that occurs during rapid cell division, PARP2 helps cancer cells survive and proliferate, making it a valuable target for therapeutic intervention. Inhibiting PARP2 can disrupt these processes, leading to reduced tumor growth and increased sensitivity to chemotherapy and radiation.

[0198] Moreover, PARP2 is involved in regulating gene expression by modifying chromatin structure and interacting with various transcription factors and co-regulators. This influences the expression of genes related to cell cycle regulation, apoptosis, and DNA repair, affecting cancer progression and response to therapy. Emerging evidence also suggests that PARP2 may modulate the immune response within the tumor microenvironment by influencing immune-related gene expression and interacting with immune cells, thereby impacting immune surveillance of tumors and the effectiveness of immunotherapies.

[0199] PARP3 is a member of the PARP family of enzymes involved in various cellular processes, with significant roles in DNA repair, genome stability, and cancer. Unlike PARP1 and PARP2, PARP3 is specifically implicated in the repair of double-strand DNA breaks, particularly through the non-homologous end joining (NHEJ) pathway. PARP3 detects and binds to DNA breaks, facilitating the recruitment and stabilization of DNA repair proteins at the damage site. This activity is crucial for maintaining genomic integrity, and its dysregulation can contribute to cancer development and progression.

[0200] In the context of cancer, PARP3 has been found to influence several key processes. It plays a role in cell cycle regulation by modulating the activity of proteins involved in checkpoint control and DNA damage response. By doing so, PARP3 helps cancer cells to survive and proliferate under conditions of genomic stress. Additionally, PARP3 has been shown to interact with and regulate various transcription factors, influencing the expression of genes involved in apoptosis, DNA repair, and cell survival.

[0201] PARP3's involvement in DNA repair makes it a potential target for cancer therapy. While PARP inhibitors (PARPi) primarily target PARP1 and PARP2, there is growing interest in understanding the specific roles of PARP3 and developing inhibitors that can selectively target this enzyme. Targeting PARP3, particularly in combination with other DNA repair inhibitors or chemotherapy, could enhance the effectiveness of cancer treatments by increasing DNA damage in cancer cells and promoting cell death.

[0202] In some embodiments, targeting two or more proteins among PARP1, PARP2, and PARP3 may provide a comprehensive approach to disrupting DNA repair mechanisms in cancer cells, thereby enhancing the effectiveness of cancer therapies. This approach could be particularly effective in tumors that rely heavily on PARP-mediated DNA repair pathways due to deficiencies in other repair mechanisms. By inhibiting multiple PARP family members, the redundancy in DNA repair pathways can be minimized, leading to greater genomic instability and increased cancer cell death. On the other hand, the development of selective inhibitors that target a specific member of PARP family proteins or combination therapies that include PARPi with other DNA repair inhibitors or conventional treatments could provide a more tailored and effective approach to cancer therapy.

[0203] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the protein levels of PARP1 and / or PARP2 and / or PARP3 and / or homologues and / or associated biological functions thereof in a subject by using a pharmaceutical composition that contains an effective amount of at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of PARP1 (SEQ ID NO: 1) , wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%and at most 100%. The polypeptides interact with one or more members of the PARP family of enzymes or homologues including PARP1 and / or PARP2 and / or PARP3 in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0204] Optionally, the composition of the invention is not SEQ ID No: 1 as such, in unmodified form.

[0205] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the protein levels of PARP1 and / or PARP2 and / or PARP3 and / or homologues and / or associated biological functions thereof in a subject by using a pharmaceutical composition that contains an effective amount of at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of PARP2 (SEQ ID NO: 2) , wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%and at most 100%. The polypeptides interact with one or more members of the PARP family of enzymes or homologues including PARP1 and / or PARP2 and / or PARP3 in the subject and modulate their protein and / or associated biological functions thereof.

[0206] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the protein levels of PARP1 and / or PARP2 and / or PARP3 and / or homologues and / or associated biological functions thereof in a subject by using a pharmaceutical composition that contains an effective amount of at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of PARP3 (SEQ ID NO: 3) , wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%and at most 100%. The polypeptides interact with one or more members of the PARP family of enzymes or homologues including PARP1 and / or PARP2 and / or PARP3 in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0207] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the protein levels of PARP1 and / or PARP2 and / or PARP3 and / or homologues and / or associated biological functions thereof in a subject by using a pharmaceutical composition that contains an effective amount of at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of PARP1, PARP2, and / or PARP3 (SEQ ID NOS: 1～3) , wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%and at most 100%. The polypeptides interact with one or more members of the PARP family of enzymes or homologues including PARP1 and / or PARP2 and / or PARP3 in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0208] In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 4～12, or a fragment or functional derivatives thereof. The polypeptides interact with one or more members of the PARP family of enzymes or homologues including PARP1 and / or PARP2 and / or PARP3 in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0209] The TEC family of non-receptor tyrosine kinases encompasses a group of intracellular enzymes essential for various cellular processes, including signal transduction, cell growth, differentiation, survival, and immune response. This family includes five members: TEC, BTK, ITK, BMX, and TXK.

[0210] TEC, the founding member of the TEC family, is expressed in multiple tissues such as hematopoietic cells, liver, and kidney, and is critical for signaling pathways that regulate cell proliferation, survival, and differentiation. TEC is involved in signaling through several receptors, including the B cell receptor (BCR) , T cell receptor (TCR) , and cytokine receptors. Its kinase activity is essential for normal immune function and has implications in immune disorders and cancer.

[0211] BTK is predominantly expressed in B cells and is vital for B cell development, activation, and differentiation. Mutations in the BTK gene cause X-linked agammaglobulinemia (XLA) , characterized by an absence of mature B cells and immunoglobulins. BTK is a key component of BCR signaling and is targeted by inhibitors such as ibrutinib, used to treat B cell malignancies like chronic lymphocytic leukemia (CLL) and mantle cell lymphoma (MCL) .

[0212] ITK is mainly expressed in T cells and plays a crucial role in TCR signaling, T cell activation, differentiation, and cytokine production. ITK is important for the development of T helper cell subsets and is involved in immune responses to infections and autoimmune diseases. Targeting ITK has potential therapeutic implications for modulating immune responses in conditions like autoimmune diseases and allergies.

[0213] BMX is expressed in endothelial cells, hematopoietic cells, and epithelial cells, playing roles in angiogenesis, inflammation, and cellular responses to stress. BMX signaling regulates cell survival, migration, and proliferation, and has been implicated in cancer progression, particularly in solid tumors such as prostate and breast cancer, where it promotes tumor growth and metastasis.

[0214] TXK (RLK) is mainly found in T cells and natural killer (NK) cells and is involved in TCR signaling, T cell activation, and differentiation. TXK is crucial for the function of Th1 cells, a subset of T helper cells involved in cell-mediated immune responses. TXK has potential roles in autoimmune diseases and inflammatory responses.

[0215] The TEC family kinases share common structural domains, including the Pleckstrin Homology (PH) domain for membrane localization, the Tec Homology (TH) domain with a BTK motif and SH3 domain, the Src Homology 2 (SH2) domain for binding phosphorylated tyrosines, the Src Homology 3 (SH3) domain for binding proline-rich sequences, and the kinase domain responsible for their catalytic activity.

[0216] Given their roles in immune cell signaling and function, TEC family kinases are promising therapeutic targets for various diseases, including cancers, autoimmune disorders, and inflammatory conditions. Inhibitors targeting BTK, like ibrutinib, are already in clinical use. Ongoing research aims to develop selective inhibitors for other TEC family members and explore their therapeutic potential in different diseases. Understanding the mechanisms and interactions of TEC family kinases can provide valuable insights into their contributions to health and disease, offering opportunities for developing targeted therapies.

[0217] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the protein levels of one or more members of the TEC family kinases including BTK, BMX, TEC, TXK, and / or ITK, and / or homologues and / or associated biological functions thereof in a subject by using a pharmaceutical composition that contains an effective amount of at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of BTK, BMX, TEC, TXK, and / or ITK (SEQ ID NOS: 13～17) , wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%and at most 100%. The polypeptides interact with one or more members of the TEC family kinases including BTK, BMX, TEC, TXK, and / or ITK, and / or homologues in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0218] In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 18～26, or a fragment or functional derivatives thereof. The polypeptides interact with one or more members of the TEC family kinases including BTK, BMX, TEC, TXK, and / or ITK, and / or homologues in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0219] CSF1R is a key member of the RTK family, primarily involved in the regulation of cell growth, differentiation, and survival within the hematopoietic system. CSF1R is predominantly expressed on monocytes, macrophages, and their progenitors. When it binds to its ligands, colony-stimulating factor 1 (CSF1) and interleukin-34 (IL-34) , it undergoes dimerization and autophosphorylation of its intracellular tyrosine residues. This activation triggers downstream signaling pathways such as PI3K / AKT, MAPK / ERK, and JAK / STAT, which regulate various cellular functions including survival, proliferation, differentiation, and motility. CSF1R signaling is crucial for the development and function of the mononuclear phagocyte system, encompassing monocytes, macrophages, and dendritic cells.

[0220] Aberrant CSF1R signaling is associated with several diseases, including cancers, inflammatory disorders, and neurodegenerative diseases. In cancer, overexpression or mutations in CSF1R can promote tumor growth, survival, and metastasis by enhancing a tumor-supportive microenvironment. Targeting CSF1R with inhibitors or monoclonal antibodies is being explored as a therapeutic strategy for various cancers such as glioblastoma, breast cancer, and ovarian cancer. In inflammatory and autoimmune diseases, dysregulated CSF1R signaling can lead to chronic inflammation and tissue damage. Thus, CSF1R inhibitors are being investigated for their potential to modulate immune responses in conditions like rheumatoid arthritis and multiple sclerosis.

[0221] Several homologues of CSF1R exist within the RTK family, sharing structural similarities and functional roles in hematopoietic and immune cell regulation. One notable homologue is the platelet-derived growth factor receptors (PDGFRs) . PDGFR-α and PDGFR-βare receptors for platelet-derived growth factors (PDGFs) and are involved in cell proliferation, survival, migration, and differentiation. PDGFR signaling is vital for the development of connective tissues, blood vessels, and the central nervous system. Dysregulation of PDGFR signaling has been implicated in various diseases, including cancers and fibrotic disorders.

[0222] Together, CSF1R and its homologues within the RTK family are critical regulators of cell growth, differentiation, and survival. Their roles in health and disease, particularly in cancer and inflammatory conditions, make them important targets for therapeutic intervention. Understanding their signaling pathways and interactions continues to be a focus of research aimed at developing effective treatments for related diseases.

[0223] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the protein levels of one or more members of the RTK family including CSF1R, KIT, PDGFRa / b, and / or FLT3, and / or homologues and / or associated biological functions thereof in a subject by using a pharmaceutical composition that contains an effective amount of at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of CSF1R, KIT, PDGFRa / b, and / or FLT3 (SEQ ID NOS: 27～31) , wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%and at most 100%. The polypeptides interact with one or more members of the RTK family members including CSF1R, KIT, PDGFRa / b, and / or FLT3, and / or homologues in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0224] In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 32～33, or a fragment or functional derivatives thereof. The polypeptides interact with one or more members of the RTK family members including CSF1R, KIT, PDGFRa / b, and / or FLT3, and / or homologues in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0225] PD-L1 and PD-L2 are proteins that play crucial roles in the immune system's regulation, particularly in maintaining self-tolerance and preventing autoimmunity. These ligands interact with the programmed death-1 (PD-1) receptor on T cells, leading to the inhibition of T cell activity. This interaction is a natural mechanism to prevent overactivation of the immune system and minimize damage to normal tissues during immune responses.

[0226] In the context of cancer, PD-L1 and PD-L2 can be expressed by tumor cells and tumor-associated immune cells as a means of evading immune surveillance. By engaging PD-1 on T cells, these ligands effectively turn off the immune attack against the tumor, allowing cancer cells to proliferate unchecked. This immune evasion mechanism is particularly prominent in several cancers, including melanoma, breast cancer, lung cancer, renal cell carcinoma, and certain types of lymphoma.

[0227] The expression of PD-L1 and PD-L2 in tumors has significant implications for cancer therapy. Targeting the PD-1 / PD-L1 / PD-L2 pathway with immune checkpoint inhibitors has emerged as a revolutionary approach in oncology. Drugs such as pembrolizumab, nivolumab (anti-PD-1 antibodies) , and atezolizumab, durvalumab (anti-PD-L1 antibodies) block the interaction between PD-1 and its ligands, thereby reactivating T cells to recognize and kill cancer cells. These therapies have shown remarkable success in improving survival rates and inducing durable responses in patients with various types of cancer.

[0228] The role of PD-L2 in cancer is less well understood but is gaining attention. PD-L2 also binds to PD-1, although it has a more restricted expression pattern compared to PD-L1. It is primarily expressed by dendritic cells and certain tumor cells. The therapeutic targeting of PD-L2 is an area of active investigation, with the potential to provide additional avenues for enhancing anti-tumor immunity.

[0229] Overall, PD-L1 and PD-L2 are pivotal in the regulation of immune responses in cancer. Their expression by tumor cells represents a significant mechanism of immune evasion. The development and use of immune checkpoint inhibitors targeting these pathways have transformed the landscape of cancer treatment, offering new hope to patients with previously untreatable or resistant cancers. Ongoing research aims to optimize these therapies and extend their benefits to a broader range of patients.

[0230] A dual inhibitor targeting both PD-L1 and PD-L2 offers several advantages in cancer therapy. By inhibiting both ligands, such a treatment can more comprehensively block the PD-1 pathway, which is crucial for immune evasion by cancer cells. This comprehensive blockade can potentially overcome the limitations of therapies that target only PD-L1, thus enhancing the reactivation of T cells and improving their ability to recognize and destroy cancer cells.

[0231] The simultaneous inhibition of PD-L1 and PD-L2 can also address the variability in ligand expression among different tumors and within the same tumor. Some cancers may predominantly express PD-L1, while others may express PD-L2 or both. A dual inhibitor can be effective across a wider range of tumor types, increasing the likelihood of therapeutic success in diverse patient populations.

[0232] Additionally, targeting both ligands may reduce the potential for tumor cells to develop resistance by upregulating the ligand not being targeted. By blocking both PD-L1 and PD-L2, the dual inhibitor minimizes the tumor’s ability to use alternative pathways to evade immune detection and destruction. Furthermore, a dual inhibitor can simplify the therapeutic regimen by combining the effects of two drugs into one, potentially improving patient compliance and reducing treatment complexity. This can also lead to more consistent and predictable therapeutic outcomes.

[0233] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the protein levels of one or more members of the human B7 family members or homologues including PD-L1, and / or PD-L2, and / or associated biological functions thereof in a subject by using a pharmaceutical composition that contains an effective amount of at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of PD-L1, and / or PD-L2 (SEQ ID NOS: 34～35) , wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%and at most 100%. The polypeptides interact with one or more members of the human B7 family members or homologues including PD-L1 and / or PD-L2 in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0234] In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 36～53, or a fragment or functional derivatives thereof. The polypeptides interact with one or more members of the human B7 family members or homologues including PD-L1 and / or PD-L2 in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0235] ABL1 and ABL2, also known as c-Abl and Arg, respectively, belong to the human ABL family of non-receptor tyrosine kinases involved in various cellular processes, including differentiation, division, adhesion, and stress response. Both have significant roles in oncogenesis, tumor progression, and metastasis. ABL1 is notably implicated in CML, characterized by the presence of the Philadelphia chromosome, a result of a translocation between chromosomes 9 and 22. This translocation creates the BCR-ABL fusion gene, encoding a constitutively active tyrosine kinase that drives uncontrolled cell proliferation and survival, leading to leukemia. The advent of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) like imatinib (Gleevec) has revolutionized CML treatment by specifically targeting the BCR-ABL fusion protein, preventing its activity and effectively controlling the disease. Resistance to first-generation TKIs, often due to mutations in the BCR-ABL gene, has led to the development of second-and third-generation inhibitors such as dasatinib and ponatinib.

[0236] ABL1’s role extends beyond CML to other cancers, including acute lymphoblastic leukemia (ALL) and solid tumors, where it influences cell migration, invasion, and metastasis by interacting with cytoskeletal components and signaling pathways. ABL2 shares structural similarities with ABL1 and also plays critical roles in cancer. While less studied than ABL1, ABL2 contributes to tumor cell migration, invasion, and metastasis through its interactions with the cytoskeleton and signaling pathways that regulate these processes. It is involved in the response to oxidative stress and DNA damage, and dysregulation of ABL2 can promote cancer progression and metastasis.

[0237] Both ABL1 and ABL2 are targets for cancer therapy, with ongoing research focused on developing inhibitors that can effectively target these kinases in various cancers. Understanding the distinct and overlapping functions of ABL1 and ABL2 in cancer can lead to more effective therapeutic strategies and improve outcomes for patients with cancers involving these kinases.

[0238] The potential for a dual inhibitor against ABL1 and ABL2 in cancer therapy is significant, given the overlapping and complementary roles these kinases play in oncogenesis, tumor progression, and metastasis. A dual inhibitor would simultaneously target both kinases, which could lead to a more comprehensive blockade of their oncogenic signaling pathways. This could be particularly beneficial in cancers where both ABL1 and ABL2 contribute to disease progression, such as certain leukemias and solid tumors.

[0239] A dual inhibitor could enhance treatment efficacy by preventing compensatory mechanisms where inhibition of one kinase might lead to upregulation or increased activity of the other. This approach could reduce the likelihood of resistance development, a common issue with single-target therapies, particularly in the case of TKIs used in treating CML and other malignancies. Moreover, targeting both ABL1 and ABL2 could provide broader therapeutic benefits by affecting multiple pathways involved in cell migration, invasion, and survival. This could be particularly important in treating metastatic cancers, where these processes are critical. Dual inhibitors might also simplify treatment regimens by combining the effects of two drugs into one, potentially improving patient compliance and reducing the complexity of therapy.

[0240] Current research is focused on developing and optimizing such dual inhibitors, with the aim of achieving potent and selective inhibition of both ABL1 and ABL2 while minimizing off-target effects. If successful, these dual inhibitors could represent a significant advancement in cancer therapy, providing a more robust and durable response in patients with cancers driven by these kinases.

[0241] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the protein levels of one or more members of the human ABL family of non-receptor tyrosine kinase and / or homologues including ABL1 and / or ABL2 and / or associated biological functions thereof in a subject by using a pharmaceutical composition that contains an effective amount of at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of ABL1, and / or ABL2 (SEQ ID NOS: 54～55) , wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%and at most 100%. The polypeptides interact with one or more members of the human ABL family of non-receptor tyrosine kinase and / or homologues including ABL1 and / or ABL2 in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0242] In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 56～66, or a fragment or functional derivatives thereof. The polypeptides interact with one or more members of the human ABL family of non-receptor tyrosine kinase and / or homologues including ABL1 and / or ABL2 in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0243] BCL2 and BCL2-like proteins are crucial regulators of apoptosis, playing a significant role in cancer development and progression. BCL2 is the prototypical member of this family, known for its ability to inhibit apoptosis and promote cell survival. Overexpression of BCL2 is commonly observed in various cancers, including lymphomas, leukemias, and solid tumors, leading to resistance to apoptosis and contributing to tumor growth and survival. BCL2 achieves this by binding to and neutralizing pro-apoptotic proteins, thereby preventing the release of cytochrome c from mitochondria and blocking the apoptotic cascade.

[0244] BCL2-like proteins include several members with similar functions, such as BCL2L1, BCL2L2, BCL2L3, and BCL2L5, like BCL2, inhibits apoptosis by binding to pro-apoptotic proteins and is often overexpressed in cancers such as colorectal, breast, and lung cancers. The balance between pro-apoptotic and anti-apoptotic members of the BCL2 family determines the cell's fate, with the dysregulation of this balance favoring cancer cell survival.

[0245] Targeting BCL2 and its homologues has become a therapeutic strategy in cancer treatment. BH3 mimetics, such as venetoclax, have been developed to specifically inhibit BCL2, restoring the apoptotic pathway and leading to cancer cell death. Venetoclax has shown significant efficacy in treating CLL and acute myeloid leukemia (AML) . Researchers are also developing inhibitors against other BCL2-like proteins, aiming to overcome resistance mechanisms and improve treatment outcomes.

[0246] Targeting multiple BCL2-like proteins with a single inhibitor offers a comprehensive approach to overcoming cancer cell resistance to apoptosis. Cancer cells often exploit the redundancy and functional overlap among BCL2 family proteins to evade cell death. By simultaneously inhibiting multiple anti-apoptotic proteins, a multi-targeted inhibitor can effectively disrupt the survival mechanisms of cancer cells, leading to enhanced therapeutic efficacy. Inhibitors that target multiple BCL2-like proteins can prevent the compensatory upregulation of one protein when another is inhibited. A multi-targeted inhibitor can block these escape routes, ensuring a more complete induction of apoptosis.

[0247] Navitoclax (ABT-263) is an example of a drug that targets both BCL2 and BCL2L1. It has shown promise in preclinical and clinical studies by inducing apoptosis in various cancer cells. Another approach involves the development of inhibitors that target BCL2, BCL2L1, and BCL2L3, given the frequent involvement of these proteins in cancer cell survival. Such inhibitors would need to be carefully designed to minimize off-target effects and maximize therapeutic windows.

[0248] The potential benefits of multi-targeted BCL2-like protein inhibitors include more robust anti-cancer effects, reduced likelihood of resistance development, and improved outcomes in cancers that rely on multiple anti-apoptotic pathways for survival. These inhibitors could be particularly effective in hematologic malignancies, such as CLL and AML, as well as in solid tumors that exhibit high levels of apoptosis resistance. Ongoing research aims to identify and develop novel inhibitors that can target multiple BCL2 family proteins with high specificity and low toxicity. The success of these efforts could lead to new treatment options that improve survival and quality of life for cancer patients.

[0249] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the protein levels of one or more members of the human BCL2 family including BCL2, BCL2L1, BCL2L2, BCL2L3, and / or BCL2L5, and / or homologues and / or associated biological functions thereof, but not BCL2L4, or BCL2L7, and / or homologues with pro-apoptosis activities in a subject by using a pharmaceutical composition that contains an effective amount of at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of the human BCL2 family members and / or homologues including BCL2, BCL2L1, BCL2L2, BCL2L3, and / or BCL2L5 (SEQ ID NOS: 67～73) , wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%and at most 100%. The polypeptides interact with one or more members of the human BCL2 family members and / or homologues including BCL2, BCL2L1, BCL2L2, BCL2L3, and / or BCL2L5, in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0250] In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 74～76, or a fragment or functional derivatives thereof. The polypeptides interact with one or more members of the human BCL2 family and / or homologues including BCL2, BCL2L1, BCL2L2, BCL2L3, and / or BCL2L5, in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0251] The beta-2 adrenergic receptor (β2AR, encoded by ADRB2) is a G protein–coupled receptor involved in smooth muscle relaxation and metabolic regulation. The phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit alpha (PIK3R1 p85α) modulates PI3Kα activity and mediates insulin and growth factor signaling. BCL2-like 8 (BCL2L8, also known as BAD) is a pro-apoptotic member of the BCL2 family that promotes cell death by antagonizing anti-apoptotic proteins. The epidermal growth factor receptor (EGFR) is a receptor tyrosine kinase that regulates cell proliferation, survival, and differentiation. Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, p65 subunit (NF-κB p65, RELA) , is a transcription factor central to inflammatory and immune responses. Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) mediates cytokine and growth factor signaling, promoting cell survival and immune regulation. B-Raf proto-oncogene, serine / threonine kinase (BRAF) , mitogen-activated protein kinase kinase 1 (MEK1, MAP2K1) , and extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2, MAPK1) are sequential components of the MAPK signaling cascade that transmits extracellular signals to control cell growth, differentiation, and survival.

[0252] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for modulating the protein levels of one or more proteins of β2AR, PIK3R1 p85α, BCL2L8, EGFR, NF-κB p65, STAT3, and MAPK pathway components (BRAF, MEK1, ERK2) with SEQ ID NOS: 84～92, and / or homologues and / or associated biological functions thereof, by using a pharmaceutical composition that contains an effective amount of at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of β2AR, PIK3R1 p85α, BCL2L8, EGFR, NF-κB p65, STAT3, and MAPK pathway components (BRAF, MEK1, ERK2) with SEQ ID NOS: 84～92, wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%and at most 100%. The polypeptides interact with one or more proteins of β2AR, PIK3R1 p85α, BCL2L8, EGFR, NF-κB p65, STAT3, and MAPK pathway components (BRAF, MEK1, ERK2) with SEQ ID NOS: 84～92 and / or homologues thereof, in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof.

[0253] In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 93～102, or a fragment or functional derivatives thereof. The polypeptides interact with one or more proteins of β2AR, PIK3R1 p85α, BCL2L8, EGFR, NF-κB p65, STAT3, and MAPK pathway components (BRAF, MEK1, ERK2) with SEQ ID NOS: 84～92 and / or homologues thereof, in the subject and modulate their protein levels and / or associated biological functions thereof. B. Pharmaceutical Compositions

[0254] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for modulating the aberrant expression levels of one or more protein targets and / or biological functions thereof in vivo in a subject comprising interacting one or more protein targets or a fraction thereof with an effective amount of one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more protein targets or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of one or more protein targets and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with one or more protein targets or a fragment or functional derivatives thereof.

[0255] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for treating or preventing a disease or condition caused by aberrant expression or dysfunction of one or more protein targets and / or biological functions thereof in vivo in a subject comprising interacting one or more protein targets or a fraction thereof with an effective amount of one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more protein targets or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of one or more protein targets and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with one or more protein targets or a fragment or functional derivatives thereof.

[0256] The terms “protein target” and the like refer to a protein that may be endogenous or exogenous to the subject. Herein the terms “endogenous” and “autologous” and the like are used to refer to a protein that is an intrinsic part of the subject and is encoded by the subject, while “exogenous” and “heterologous” and the like are used to refer to a protein that is introduced in the subject, such as a viral protein that is introduced in the host via a viral infection, or a protein that is introduced into a plant via genetic approaches.

[0257] The terms “aberrant expression” and the like refer to abnormal expression of a protein in a subject. Non-limiting examples of aberrant expression include the level of a functional protein altered due to abnormal (higher or lower) rate of protein synthesis, folding, aggregation, activation, and / or degradation, changes in protein post-translational modifications, abnormal splice variants, expression of a mutant protein, changes in cellular localization (for instance, a protein normally functioning in the nucleus is found to accumulate in the cytosol instead) , and / or expression of a heterologous protein such as a viral protein in a viral infection.

[0258] In some embodiments, aberrant expression refers to a higher-than-normal expression. Non-limiting examples include, the overexpression of oncogenic proteins in cancer, or the expression of a viral protein in an infection, or a new splice variant of a protein. In other embodiments, aberrant expression refers to a lower-than-normal expression, for instance, the diminished expression of tumor repressor proteins in cancer, or the diminished expression of a protein due to a destabilizing mutation in the sequence.

[0259] In some embodiments, aberrant expression of proteins in a subject is associated with diseases or conditions, including but not limited to, inflammatory diseases, cancer, autoimmune diseases, bacterial infection, viral infection, chronic pain, developmental disorders, among many others. The methods and compositions disclosed herein provide an effective means to specifically modulate the levels of one or more functional proteins in a subject, thereby treating or preventing a disease or condition caused by aberrant expression of one or more proteins, wherein the levels of one or more proteins are upregulated, downregulated, or maintained at a stable expression level, and the associated biological functions of the protein are augmented, inhibited or kept at the standard level.

[0260] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for modulating the levels of human PARP family of enzymes, and / or homologues and / or fragments thereof, and / or biological functions thereof in vivo in a subject with an effective amount of one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more members of the human PARP family of enzymes, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 4～12, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0261] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for treating or preventing a disease or condition caused by aberrant expression or dysfunction of one or more members of the human PARP family of enzymes, and / or homologues in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a composition that contains one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. The disease or condition includes but is not limited to, cancer, cardiovascular diseases, neurodegenerative diseases, chronic inflammation, metabolic disorders, ageing-related diseases, developmental disorders, and / or other related diseases. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more members of the human PARP family of enzymes, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NO: 4～12, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0262] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for modulating the levels of one or more members of the TEC family of human non-receptor tyrosine kinase, and / or homologues and / or fragments thereof, and / or biological functions thereof in vivo in a subject with an effective amount of one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more members of the TEC family of human non-receptor tyrosine kinase, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 18～26, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0263] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for treating or preventing a disease or condition caused by aberrant expression or dysfunction of one or more members of the TEC family of human non-receptor tyrosine kinase, and / or homologues in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a composition that contains one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. The disease or condition includes but is not limited to, cancer, immunodeficiencies, inflammation, autoimmune diseases, developmental disorders, and / or other related diseases. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more members of the TEC family of human non-receptor tyrosine kinase, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NO: 18～26, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0264] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for modulating the levels of one or more members of the human RTK family, and / or homologues and / or fragments thereof, and / or biological functions thereof in vivo in a subject with an effective amount of one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more members of the human RTK family, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 32～33, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0265] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for treating or preventing a disease or condition caused by aberrant expression or dysfunction of one or more members of the human RTK family, and / or homologues in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a composition that contains one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. The disease or condition includes but is not limited to, cancer including brain tumors, immune disorders, leukemias and lymphomas, inflammatory diseases, developmental disorders, and / or related diseases. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more members of the human RTK family, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NO: 32～33, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0266] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for modulating the levels of one or more members of the human B7 family, and / or homologues and / or fragments thereof, and / or biological functions thereof in vivo in a subject with an effective amount of one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more members of the human B7 family, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 36～53, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0267] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for treating or preventing a disease or condition caused by aberrant expression or dysfunction of one or more members of the human B7 family, and / or homologues in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a composition that contains one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. The disease or condition includes but is not limited to, cancer including brain tumors, immune disorders, leukemias and lymphomas, inflammatory diseases, and developmental disorders, and / or other related diseases. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more members of the human B7 family, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NO: 36～53, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0268] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for modulating the levels of one or more members of the ABL family of human non-receptor tyrosine kinase, and / or homologues and / or fragments thereof, and / or biological functions thereof in vivo in a subject with an effective amount of one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more members of the ABL family of human non-receptor tyrosine kinase, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 56～66, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0269] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for treating or preventing a disease or condition caused by aberrant expression or dysfunction of one or more members of the ABL family of human non-receptor tyrosine kinase, and / or homologues in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a composition that contains one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. The disease or condition includes but is not limited to, cancer, leukemias and lymphomas, and developmental disorders, and / or other related diseases. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more members of the ABL family of human non-receptor tyrosine kinase, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NO: 56～66, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0270] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for modulating the levels of one or more members of the human BCL2 family, and / or homologues and / or fragments thereof, and / or biological functions thereof in vivo in a subject with an effective amount of one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more members of the human BCL2 family, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 74～76, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0271] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for treating or preventing a disease or condition caused by aberrant expression or dysfunction of one or more members of the human BCL2 family, and / or homologues in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a composition that contains one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. The disease or condition includes but is not limited to, cancer, autoimmune diseases, leukemias and lymphomas, inflammatory diseases, developmental disorders, and neurodegenerative disease, and / or other related diseases. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more members of the human BCL2 family, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NO: 74～76, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0272] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for modulating the levels of one or more proteins of β2AR, PIK3R1 p85α, BCL2L8, EGFR, NF-κB p65, STAT3, and MAPK pathway components (BRAF, MEK1, ERK2) with SEQ ID NOS: 84～92, and / or homologues and / or fragments thereof, and / or biological functions thereof in vivo in a subject with an effective amount of one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more proteins of β2AR, PIK3R1 p85α, BCL2L8, EGFR, NF-κB p65, STAT3, and MAPK pathway components (BRAF, MEK1, ERK2) with SEQ ID NOS: 84～92, In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NOS: 93～102, or a fragment or functional derivatives thereof.

[0273] In some embodiments, disclosed herein are methods and pharmaceutical compositions for treating or preventing a disease or condition caused by aberrant expression or dysfunction of one or more proteins of β2AR, PIK3R1 p85α, BCL2L8, EGFR, NF-κB p65, STAT3, and MAPK pathway components (BRAF, MEK1, ERK2) with SEQ ID NOS: 84～92, and / or homologues in a subject comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a composition that contains one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. The disease or condition includes but is not limited to, cancer, autoimmune diseases, and / or other related diseases. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more proteins of β2AR, PIK3R1 p85α, BCL2L8, EGFR, NF-κB p65, STAT3, and MAPK pathway components (BRAF, MEK1, ERK2) with SEQ ID NOS: 84～92, and / or homologues or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of these proteins and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with SEQ ID NO: 93～102, or a fragment or functional derivatives thereof. 1. Exogenous Delivery of Polypeptides

[0274] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for producing proteins or polypeptides of this invention. As known to anyone of skill in the art, a polypeptide may be made in various ways. Non-limiting examples include chemical synthesis, or recombinant protein expression in cultured cells including but not limited to mammalian cells, yeast cells, plant cells, bacterial cells and / or in cell-free lysates, or combinations of these and other ways. Each of these methods has its own set of advantages and challenges. The choice of production method is dictated by factors such as the size of the polypeptide, the complexity of its structure, the required modifications, the desired yield, cost considerations, and the intended use of the polypeptide.

[0275] In some embodiments, polypeptides may be chemically synthesized using methods like solid-phase peptide synthesis, wherein amino acids are sequentially added to a growing peptide chain anchored to an insoluble resin, which is particularly useful for small to medium-sized polypeptides and may incorporate non-natural amino acids or other modifications.

[0276] In some embodiments, polypeptides may be produced by expression of recombinant protein in mammalian cells such as CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, HEK293 (human embryonic kidney) cells, or other specialized lines, which is especially favorable for complex proteins requiring proper folding, post-translational modifications, and glycosylation.

[0277] In some embodiments, polypeptides may be produced by expression of recombinant protein in yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris, which offer a cost-effective and scalable option with certain post-translational modifications, with relatively fast growth rates and easy genetic manipulation.

[0278] In some embodiments, polypeptides may be produced by expression of recombinant protein in plant cells, also known as “molecular farming” , which is especially favorable for complex proteins requiring proper folding, post-translational modifications, and glycosylation, together with excellent safety profiles and environmental benefits.

[0279] In some embodiments, polypeptides may be produced by expression of recombinant protein in bacterial cells such as Escherichia coli for producing non-glycosylated peptides and proteins.

[0280] In some embodiments, polypeptides may be produced by expression of recombinant protein in cell-free expression system wherein cell lysates containing all the necessary machinery for protein synthesis allows for protein production in a controlled environment without the need for a living cell, especially for producing toxic proteins that would otherwise kill the host cell.

[0281] In other embodiments, polypeptides may be produced using combinatorial approaches, for example, a peptide is first synthesized chemically and then using recombinant techniques to add modifications or to incorporate the peptide into a larger protein. In yet other embodiments, polypeptides may be isolated from natural sources, or obtained using semi-synthetic methods, which involve the chemical synthesis of a portion of the protein and the biological synthesis of the rest.

[0282] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for delivering proteins or polypeptides of this invention into a subject. The term “subject” in this disclosure refers to where the modulation takes place, including but not limited to living and / or non-living subject. Non-limiting examples of living subjects include prokaryotic cells, eukaryotic cells and organisms including mammals and humans, protozoa, viruses, bacteria, bacteriophages, fungi, and plants. Non-limiting examples of non-living subjects include soil, rock, and air. The methods for protein or polypeptide delivery include but are not limited to, physical methods, chemical methods, and / or biological methods.

[0283] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for delivering proteins or polypeptides of this invention into a subject by using physical methods such as microinjection wherein a glass micropipette physically penetrates a cell membrane to inject polypeptides directly into the cytoplasm, particular suitable for large cells; electroporation wherein an electric pulse induces a transient increase in the permeability of cell membranes to allow peptides to enter the cells; and / or sonoporation wherein ultrasound waves transiently disrupt the cell membrane and facilitate the uptake of peptides into the cells; among other physical methods.

[0284] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for delivering proteins or polypeptides of this invention into a subject by using chemical methods such as cell-penetrating peptides wherein short peptides that can translocate across cell membranes may be conjugated to polypeptides to facilitate their entry into cells; lipofection wherein liposomes encapsulate peptides and merge with cell membranes, releasing their contents into the cytoplasm, wherein examples include lipofectamine obtainable from Thermo Fisher Scientific; polymeric carriers wherein polymers are used to encapsulate peptides and facilitate their endocytosis by cells, wherein examples include in vivo-jetPEI (poly (ethyleneimine) ) from Polyplus; and / or dendrimers wherein highly branched, synthetic dendrimers bind to peptides and enhance their solubility and cellular uptake.

[0285] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for delivering proteins or polypeptides of this invention into a subject by using biological methods such as VLPs that are derived from the structure of viruses but lack viral genetic material to allow delivery of polypeptides without replicating or causing infection; and / or exosomes that are biocompatible, with low immunogenicity, the ability to cross biological barriers including the blood-brain barrier, and may target specific cells.

[0286] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for delivering proteins or polypeptides of this invention into a subject wherein one or more therapeutic polypeptides are genetically or chemically linked to another protein or peptide with specific properties that facilitate its delivery into cells. Non-limiting protein / peptide fusion examples include fusion with the TAT protein from HIV for delivering cargoes into cells due to its cell-penetrating abilities (Schwarze, Ho et al. 1999) ; fusion with the Fc region of antibodies for its prolonged half-life in circulation due to its interaction with the neonatal Fc receptor (FcRn) , thereby increasing their stability and persistence in the body (Strohl 2015) ; fusion with albumin to enhance the peptides’ half-life and facilitate their uptake into cells; fusion with glutathione S-transferase (GST) to facilitate the solubility and stability of peptides wherein the GST tag can be removed enzymatically after the peptide is successfully delivered inside the cell; fusion with antibody wherein antibody targets specific cell surface markers, and bring the peptide along when internalized by the cell; among other fusion protein approaches. These methods are particularly useful for delivering peptides that are otherwise poorly taken up by cells, are rapidly degraded in the bloodstream, or are unable to cross cellular membranes. By exploiting the natural properties of various proteins and peptides, these fusion techniques enhance the therapeutic potential of polypeptide-based therapeutics. 2. Exogenous Delivery of Polynucleotides

[0287] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for delivering polynucleotide molecules encoding polypeptides of this invention into a subject using methods known to anyone skilled in the art. The term “subject” in this disclosure refers to where the modulation takes place, including but not limited to living and / or non-living subject. Non-limiting examples of living subjects include prokaryotic cells, eukaryotic cells and organisms including mammals and humans, protozoa, viruses, bacteria, bacteriophages, fungi, and plants. Non-limiting examples of non-living subjects include soil, rock, and air.

[0288] In some embodiments, the polypeptide is encoded by an isolated polynucleotide, or in a vector comprising the polynucleotide. Polynucleotide molecules or vectors comprising exogenous polynucleotide sequences encoding polypeptides typically comprise enhancer sequences, promoter sequences, ribosome binding sites, polyadenylation signals, multiple cloning sites, origin of replication sequences. Vectors for expressing polypeptides may be classified into broad categories of viral vectors, non-viral vectors or their hybrids, and may be delivered to the subject either in vivo or ex vivo.

[0289] When polynucleotide molecules are delivered as isolated polynucleotide or in recombinant vectors ex vivo, such as tissues or cells derived from a donor or a patient, including but not limited to blood cells, skin cells, bone marrow cells, the cells confirmed to comprise the desired polynucleotide molecules may be sent back to the patient to perform the intended function, including but not limited to diagnosis, treatment, and / or prevention.

[0290] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for delivering polynucleotide molecules encoding polypeptides of this invention into a subject, wherein viral vector comprising exogenous polynucleotide sequences allows a subject to express the proteinaceous compositions and polypeptides in this disclosure. Viral vector-based delivery systems are known to anyone of skill in the art. Typical viral vector delivery systems may be DNA viruses including but not limited to adenoviruses, adeno-associated viruses (AAVs) , and herpes simplex viruses (commonly used in research for diseases like Parkinson's and Alzheimer's ) , or RNA viruses such as retroviruses, and lentiviruses.

[0291] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for delivering polynucleotide molecules encoding polypeptides of this invention into a subject, wherein non-viral vector comprising exogenous polynucleotide sequences allows a subject to express the proteinaceous compositions and polypeptides in this disclosure. Non-viral vector-based delivery systems are known to anyone of skill in the art. Typical non-viral vector delivery systems include but are not limited to, plasmids, phagemids, cosmids, minicircle DNAs, minivectors, liposomes, polymer-based vectors, peptide-based vectors, naked DNA or RNA vectors, oligonucleotide vectors, and / or cell-penetrating peptides. In some embodiments, elements of both viral and non-viral delivery systems are combined to maximize the advantages and minimize the disadvantages of each system.

[0292] In some embodiments, mini-sized non-viral vectors such as minicircle DNA vectors and minivectors are used to allow expression of polypeptides of this invention into a subject. These mini-sized DNA vectors are a type of plasmid vector that has been engineered to be devoid of bacterial backbone sequences such as antibiotic resistance genes and origin of replication for bacteria. They are circular DNA molecules that only contain the eukaryotic expression cassette, which includes the gene of interest under the control of a eukaryotic promoter, and other necessary elements for expression in the target cell or organism, such as a polyadenylation signal. Key characteristics and advantages of these vectors include but are not limited to a reduced size that facilitates easier and more efficient transfer into cells, increased safety wherein they are less likely to cause unwanted immune responses in the host organism, and prolonged expression of the gene products.

[0293] In some embodiments, vectors may include additional elements to enhance their gene delivery capabilities or regulate gene expression, offering further benefits to the recipient cells. These elements may fine-tune the vector's binding to specific cell types or tissues; facilitate the vector's nucleic acid uptake by cells; direct the delivered genetic material to particular intracellular compartments, like the nucleus; and / or modulate the expression levels of polypeptides. Furthermore, vectors may include detectable or selectable markers, allowing for the identification or isolation of cells that have successfully incorporated and are expressing the transferred genetic material. These features could be inherent to the vector's origin, or the vectors can be engineered to include such properties. The repertoire of such vectors is vast and known to anyone of skill in the art. Once inside a host cell, the vector may replicate independently during cell division as a separate entity, integrate into the host's genome, or exist transiently within the nucleus or cytoplasm.

[0294] Introduction of polynucleotides into a subject for expression of a polypeptide typically involves standard techniques for gene therapy and gene delivery known to those of skill in the art. Typical delivery methods include but are not limited to, physical, chemical, and / or biological means. These techniques establish either stable or transient transformation of the organelles, cells, tissues, or organisms.

[0295] Physical methods of introducing polynucleotides into host organelles, cells, tissues or organisms include but are not limited to, electroporation (Potter, Weir et al. 1984) , injection (U.S. Patent Nos. 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 and 5,580,859, among others) , microinjection (Harland and Weintraub 1985) (U.S. Patent No. 5,789,215) , microprojectile bombardment also known as gene gun (PCT Application Nos. WO 94 / 09699 and 95 / 06128; U.S. Patent Nos. 5,610,042; 5,322,783, among others) , sonoporation (Miller, Pislaru et al. 2002, Newman and Bettinger 2007) , hydrodynamic delivery (Liu, Song et al. 1999) and laser irradiation (Tirlapur and Konig 2002) .

[0296] Chemical methods of introducing polynucleotides into host organelles, cells, tissues or organisms include but are not limited to, calcium phosphate precipitation (Chen and Okayama 1987) , lipofection or liposome-mediated transfection (Nicolau and Sene 1982) , polymeric carriers wherein examples include in vivo-jetPEI (poly (ethyleneimine) ) from Polyplus; and DEAE-dextran methods. The protocols for generating cells that harbor exogenous polynucleotide sequences are well-documented and established in the field.

[0297] Biological methods of introducing polynucleotides into host organelles, cells, tissues or organisms often utilize DNA and RNA vectors. Among these, viral vectors are particularly efficacious for gene delivery into mammalian cells, including human cells. Vectors may be based on a variety of viruses such as retroviruses, lentiviruses, poxviruses, herpes simplex virus, adenoviruses, vaccinia viruses and adeno-associated viruses (referenced in U.S. Pat. Nos. 5,350,674; 5,585,362) . Typical non-viral vector delivery systems include but are not limited to, plasmids, phagemids, cosmids, minicircle DNAs, and minivectors. In addition, exosome-based delivery systems utilize biocompatible exosomes for target-specific delivery of cargos; cell-based delivery systems utilize for example ex vivo transfection wherein stem cells or immune cells act as carriers; bacterially-derived delivery systems utilize bacterial ghosts or attenuated bacteria; while peptide-based delivery systems employ cell-penetrating peptides or protein transduction domains. C. Administration of Pharmaceutical Compositions

[0298] In some embodiments, disclosed herein are pharmaceutical compositions for modulating the aberrant expression levels of one or more protein targets and / or biological functions thereof in vivo in a subject comprising interacting one or more protein targets or a fraction thereof with an effective amount of one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more protein targets or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of one or more protein targets and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with one or more protein targets or a fragment or functional derivatives thereof.

[0299] In some embodiments, disclosed herein are pharmaceutical compositions for treating or preventing a disease and / or condition in a subject by modulating the aberrant expression levels of one or more protein targets and / or biological functions thereof in vivo in a subject comprising interacting one or more protein targets or a fraction thereof with an effective amount of one or more polypeptides or polynucleotides encoding the polypeptides. Once in the subject, the polypeptides interact with one or more protein targets or a fraction thereof in vivo in the subject, modulating the level of one or more protein targets and associated biological functions thereof. In some embodiments, the polypeptides of the disclosure have an amino acid sequence having at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity, or any value derivable therein, with one or more protein targets or a fragment or functional derivatives thereof.

[0300] In some embodiments, disclosed are pharmaceutical compositions comprising polypeptides or polynucleotides encoding polypeptides interacting with one or more members of human PARP family of enzymes and / or homologues. In some embodiments, disclosed are pharmaceutical compositions comprising polypeptides or polynucleotides encoding polypeptides interacting with one or more members of the TEC family of human non-receptor tyrosine kinase family and / or homologues. In some embodiments, disclosed are pharmaceutical compositions comprising polypeptides or polynucleotides encoding polypeptides interacting with one or more members of the human RTK family and / or homologues. In some embodiments, disclosed are pharmaceutical compositions comprising polypeptides or polynucleotides encoding polypeptides interacting with one or more members of the human B7 family and / or homologues. In some embodiments, disclosed are pharmaceutical compositions comprising polypeptides or polynucleotides encoding polypeptides interacting with one or more members of the ABL family of human non-receptor tyrosine kinase family and / or homologues. In some embodiments, disclosed are pharmaceutical compositions comprising polypeptides or polynucleotides encoding polypeptides interacting with one or more members of the human BCL2 family and / or homologues. In some embodiments, disclosed are pharmaceutical compositions comprising polypeptides or polynucleotides encoding polypeptides interacting with one or more of the following: β2AR, PIK3R1 p85α, BCL2L8, EGFR, NF-κB p65, STAT3, and MAPK pathway components including BRAF, MEK1, and ERK2, and / or homologues. In some embodiments, the pharmaceutical compositions may comprise one or more additional therapeutics, for instance, agents for treating viral infections, including but not limited to the agents disclosed in this invention. The compositions of the disclosure may be used for any administration, in vivo, in vitro, or ex vivo.

[0301] In some embodiments, disclosed are pharmaceutical compositions comprising a polypeptide-based therapy, such as protein-interacting polypeptide-based therapy.

[0302] In some embodiments, the therapy comprises an PARP1-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises an PARP2-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises an PARP3-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a BTK-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a BMX-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a TEC-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a TXK-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises an ITK-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a CSF1R-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a KIT-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a PDGFRa-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a PDGFRb-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a FLT3-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a PD-L1-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a PD-L2-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises an ABL1-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises an ABL2-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a BCL2-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a BCL2L1-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a BCL2L2-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a BCL2L3-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a BCL2L5-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a β2AR-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a PIK3R1 p85α–interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a BCL2L8-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises an EGFR-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a NF-κB p65–interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a STAT3-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a BRAF-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a MEK1-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises an ERK2-interacting polypeptide therapy. In some embodiments, the therapy comprises a polypeptide-based therapy comprising one or more polypeptides or a fragment or functional derivative thereof disclosed in this invention.

[0303] In some embodiments, disclosed are pharmaceutical compositions comprising a polynucleotide-based therapy, such as a therapy comprising a polynucleotide encoding a protein-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof.

[0304] In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a PARP1-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a PARP2-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a PARP3-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a BTK-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a BMX-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a TEC-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a TXK-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding an ITK-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a CSF1R-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a KIT-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a PDGFRa-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a PDGFRb-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a FLT3-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a PD-L1-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a PD-L2-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding an ABL1-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding an ABL2-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a BCL2-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a BCL2L1-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a BCL2L2-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a BCL2L3-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a BCL2L5-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a β2AR-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a PIK3R1 p85α–interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a BCL2L8-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding an EGFR-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a NF-κB p65–interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a STAT3-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a BRAF-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding a MEK1-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising a polynucleotide encoding an ERK2-interacting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof. In some embodiments, the therapy comprises a polynucleotide-based therapy comprising one or more polynucleotides encoding one or more polypeptides or a fragment or functional derivative thereof disclosed in this invention.

[0305] In some embodiments, the therapy disclosed herein comprises a combination of therapeutic compositions of one or more protein-targeting polypeptides, and / or one or more polynucleotides encoding a polypeptide, or a fragment or functional derivative thereof, and / or one or more additional therapies for a given condition, for example, anti-tumor therapies, and / or anti-viral therapies. The therapies are administered sequentially, simultaneously, or any other suitable manners known in the art. In some embodiments, the therapeutic compositions are combined. In some embodiments, the therapeutic compositions are administered separately, or any other suitable manners known in the art.

[0306] In some embodiments, the pharmaceutical composition comprising a protein-targeting polypeptide-based therapy, and / or a polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide, or a fragment or functional derivative thereof, is administered to the subject a single time. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprising a protein-targeting polypeptide-based therapy, and / or a polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide, or a fragment or functional derivative thereof, is administered to the subject multiple times. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprising a protein-targeting polypeptide-based therapy, and / or a polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide, or a fragment or functional derivative thereof, is administered to the subject daily, several times a day, multiple times a week, multiple times a month, or multiple times a year, potentially with differing formulations or via different routes each time.

[0307] In some embodiments, the pharmaceutical composition comprising a protein-targeting polypeptide-based therapy, and / or a polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide, or a fragment or functional derivative thereof, is administered to the subject before the onset of a disease or condition. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprising a protein-targeting polypeptide-based therapy, and / or a polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof, is administered to the subject after the onset of a disease or condition.

[0308] In some embodiments, the pharmaceutical composition comprising a protein-targeting polypeptide-based therapy, and / or a polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide, or a fragment or functional derivative thereof, comprises a carrier deemed acceptable for pharmaceutical use. In some embodiments, the pharmaceutical-grade carrier consists of liposomes, nanoparticles, solid lipid nanoparticles, polymeric micelles, hydrogels, microspheres, dendrimers, and / or wearable drug delivery devices. The term "pharmaceutical-grade" refers to a carrier that meets pharmaceutical standards, ensuring suitability for medical use, are safe for administration to a living organism, such as a human, without causing harmful or unwanted reactions when used in accordance with the therapeutic approaches outlined in this disclosure. The preparation of pharmaceutical compositions is known to anyone of skill in the art and is guided by comprehensive references such as "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, " published by Lippincott Williams &Wilkins in 2005, a resource herein incorporated by reference. Furthermore, when administering these compositions to a subject, the preparations must adhere to the highest standards of sterility, pyrogenicity, safety, and purity as mandated by the FDA's Office of Biological Standards.

[0309] The term "pharmaceutically-acceptable carrier" encompasses any solvents, preservatives, antioxidants, surfactants, isotonic agents, absorption enhancers, binders, disintegrants, lubricants, fillers, stabilizers, emulsifiers, gelling agents, sweetening agents, flavoring agents, coloring agents, coatings, vehicles for injections, and any other standard pharmaceutical adjuncts and combinations thereof. These carriers are known to those skilled in the art and are exemplified in detailed sources such as "Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition" by Mack Publishing Company, 1990, pages 1289-1329, a reference which is hereby fully incorporated by reference. The carriers mentioned can be utilized unless they are specifically incompatible with the active ingredients in the pharmaceutical composition comprising a protein-targeting polypeptide-based therapy, and / or a polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide, or a fragment or functional derivative thereof. Depending on the form of administration, such as solid, liquid, or aerosol, and the required sterility level for routes like injections, the compositions comprising a protein-interacting polypeptide-based therapy or polynucleotide encoding such a polypeptide may include various carrier types.

[0310] As disclosed herein, the compositions suitable for administration may be delivered using a pharmaceutically acceptable carrier, which may be optionally combined with inert diluents. Inert diluents are substances used in pharmaceutical compositions to fill out the volume of a tablet or capsule to a size that is manageable for patients to swallow. This is especially necessary when the dose of the active ingredient is too small to handle practically. Further, inert diluents may also contribute to the physical properties of the tablet or capsule, such as its hardness, disintegration, dissolution rate, and stability, without affecting its biological activity or the pharmacokinetics of the active drug.

[0311] As disclosed herein, the pharmaceutical composition may be prepared with the carrier through various means known to those skilled in the art, including but not limited to, emulsification, suspension, solution, lyophilization, granulation, encapsulation, adsorption, coacervation, complexation and any other standard methods, known to anyone of skill in the art. The pharmaceutical composition comprising a protein-targeting polypeptide-based therapy, and / or a polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide, or a fragment or functional derivative thereof, may be lyophilized or aerosolized. 1. Routes of Administrations

[0312] The pharmaceutical compositions disclosed herein can be delivered through identical or diverse routes of administration. The administration of a pharmaceutical composition can be tailored to deliver systemic or targeted effects depending on the nature of the treatment and the condition being treated. In some embodiments, the pharmaceutical compositions comprising a protein-targeting polypeptide-based therapy, and / or a polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide, or a fragment or functional derivative thereof, may be administered system-wide (systemically) or directly to a specific area (locally) .

[0313] In some embodiments, the route of administration of the pharmaceutical compositions include but are not limited to, by orally, sublingually, buccally, rectally, topically, transdermally, intravaginally, intrathecally, epidurally, intraocularly, intra-arterially, intracardially, intradermally, intraosseously, submucosally, transmucosally, subcutaneously, intraperitoneally, intravitreally, intraarticularly, implantable devices, oropharyngeally, enterally, intranasally or by inhalation, injection, infusion, localized perfusion, in creams or in lipid compositions such as liposomes, or any other methods or combinations thereof. 2. Dosing

[0314] For a particular subject, the precise dosage of the pharmaceutical compositions from the current disclosure to be administered may be established based on physical and physiological aspects, including but not limited to, the subject's body weight, the severity and progression of the disease or condition, the particular disease being treated, the subject's medical status, any prior or ongoing treatments, their medical history and reaction to the treatment, any idiopathic factors, the route of administration, and the attending physician's judgment. The frequency and amount of a preferred dose, or an efficacious quantity, may be adjusted according to the patient's response, contingent on the dosage and administration route. The medical professional in charge will decide the concentration of the active ingredients in the composition and the suitable dosage for a particular subject.

[0315] In some embodiments, the pharmaceutical compositions as disclosed herein may comprise varying amounts of active ingredients, such as protein-targeting polypeptides, and / or polynucleotides encoding protein-targeting polypeptides or a fragment or functional derivative thereof, ranging from at least or at most approximately 0.000001%up to at least or at most around 10%by weight of the active ingredients. In some embodiments, the active ingredients may comprise between at least or at most about 0.001%to at least or at most about 1%by weight, or between at least or at most about 0.01%to at least or at most about 0.1%by weight, or any range derivable therein.

[0316] Typically, the concentration of active ingredients in each therapeutic composition is adjusted to ensure that an effective dosage is achieved with each unit dose. Critical factors, including solubility, bioavailability, biological half-life, administration route, product stability, and other relevant pharmacological properties, are carefully considered by one of skill in the art in preparing pharmaceutical compositions. In some embodiments, unit doses of varying dosage strengths and treatment schedules may be prepared to meet diverse therapeutic needs.

[0317] The term “unit dose” refers to pre-packaged doses of medications in which each dose comprises a fixed-quantity of the therapeutically active ingredients. The appropriate dosage amount, as well as the specific route and formulation for administration, may be determined by anyone in the clinical art. In some embodiments, one treatment comprises one unit dose. In some embodiments, one treatment comprises two or more “unit doses” . In some embodiments, the same “unit doses” are administered to the same subject, e.g., a patient. In some embodiments, varying “unit doses” are administered to the same subject, e.g., a patient.

[0318] In some embodiments, the pharmaceutical compositions as disclosed herein comprising a protein-targeting polypeptide-based therapy may be administered at a single dose. In some embodiments, the pharmaceutical compositions as disclosed herein comprising a protein-targeting polypeptide-based therapy may be administered at multiple doses. In some embodiments, the pharmaceutical compositions as disclosed herein comprising a protein-targeting polypeptide-based therapy may be administered at a dose of at least, at most, or about 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 300, 400, 500, 1000 μg / kg, mg / kg, μg / day, or mg / day or any range or value derivable therein.

[0319] In some embodiments, the pharmaceutical compositions as disclosed herein comprising a polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof may be administered at a single dose. In some embodiments, the pharmaceutical compositions as disclosed herein comprising a polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof may be administered at multiple doses. In some embodiments, the pharmaceutical compositions as disclosed herein comprising a polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof may be administered at a dose of at least, at most, or about 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, 1 x 1014, 1 x 1015, 1 x 1016, 1 x 1017, or 1 x 1018 polynucleotide copies / kg body weight of the subject, or any range or value derivable therein.

[0320] In some embodiments, the polynucleotide that encodes a protein-targeting polypeptide, or the polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof, may be comprised in a vector. In some embodiments, an effective dose of the vector comprising the polynucleotide that encodes a protein-targeting polypeptide, or the polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof, is administered. In some embodiments, the vector is administered at a dose of at least, at most, or about 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, 1 x 1014, 1 x 1015, 1 x 1016, 1 x 1017, or 1 x 1018 vector copies / kg body weight of the subject, or any range or value derivable therein.

[0321] In some embodiments, the polynucleotide that encodes a protein-targeting polypeptide, or the polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof, is not comprised in a vector, for example, as isolated mRNA (e.g., PCT Application No. WO201460243A1) . In some embodiments, an effective dose of the polynucleotide comprising the polynucleotide that encodes a protein-targeting polypeptide, or the polynucleotide-based therapy wherein a polynucleotide encoding a protein-targeting polypeptide or a fragment or functional derivative thereof, is administered. In some embodiments, the polynucleotide is administered at a dose of at least, at most, or about 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, 1 x 1014, 1 x 1015, 1 x 1016, 1 x 1017, or 1 x 1018 polynucleotide copies / kg body weight of the subject, or any range or value derivable therein. III. Detection and / or isolation of proteins using polypeptides or polynucleotides

[0322] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for detecting and / or isolating a protein target in a subject with an effective amount of a composition comprising at least one polypeptide, wherein the polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of a protein target, wherein within the corresponding amino acid sequences, the amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of a protein target.

[0323] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for detecting and / or isolating a protein target in a subject with an effective amount of a composition comprising at least one polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of a protein target, wherein within the corresponding amino acid sequences, the amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of a protein target.

[0324] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for detecting and / or isolating a protein target in a subject with an effective amount of a composition comprising at least one polypeptide and / or at least one polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein the polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of a protein target, wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of a protein target.

[0325] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for detecting and / or isolating a protein target in a subject with an effective amount of a composition comprising at least one polypeptide and / or at least one polynucleotide encoding one or more polypeptides, a fluorescent tag, an affinity tag, an agarose bead, or a magnetic bead, among others.

[0326] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for detecting and / or isolating two or more protein targets in a subject with an effective amount of a composition comprising at least one polypeptide, wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of a protein target, wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of a protein target. In some cases, the polypeptides correspond to the amino acid sequences of one or more secondary-structural elements of one or more protein targets.

[0327] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for detecting and / or isolating two or more protein targets in a subject with an effective amount of a composition comprising at least one polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of a protein target, wherein within the corresponding amino acid sequences, the amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of a protein target. In some cases, the polypeptides correspond to the amino acid sequences of one or more secondary-structural elements of one or more protein targets.

[0328] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for detecting and / or isolating two or more protein targets in a subject with an effective amount of a composition comprising at least one polypeptide and / or at least one polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of a protein target, wherein within the corresponding amino acid sequences, the amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of a protein target. In some cases, a polypeptides correspond to the amino acid sequences of one or more secondary-structural elements of one or more protein targets.

[0329] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for detecting and / or isolating two or more protein targets in a subject with an effective amount of a composition comprising at least one polypeptide and / or at least one polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein non-limiting examples of detection and / or isolation include a fluorescent tag, an affinity tag, an agarose bead, or a magnetic bead, or others or combinations thereof.

[0330] In some embodiments, the polypeptides as disclosed herein may be used to detect one or more protein targets in a subject. In some embodiments, just analogous to the use of multiple antibodies in multiplex detection, a set of polypeptides recognizing different protein targets and coupled with different tags or fluorophores may be used to detect multiple protein targets simultaneously in a sample.

[0331] In some embodiments, the polypeptides as disclosed herein may be used to separate one or more protein targets in a subject. In these embodiments, the polypeptides may be linked to a fluorescent tag, an affinity tag, an agarose bead, or a magnetic bead or the like or combinations thereof, and the polypeptide-protein target complex may be purified from the sample. In some embodiments, the polypeptide-protein target complexes may be first depleted from the sample, allowing the detection of other protein targets in trace amounts using other polypeptides as disclosed herein.

[0332] In some embodiments, the “subject” refers to where the modulation takes place, including but not limited to living and / or non-living subject. Non-limiting examples of living subjects include prokaryotic cells and organisms, eukaryotic cells and organisms including mammals and humans, protozoa, viruses, bacteria, bacteriophages, fungi, and plants. Non-limiting examples of non-living subjects include soil, rock, air and other environmental factors. IV. Investigating functions of protein targets using polypeptides or polynucleotides

[0333] RNAi is a naturally occurring biological process that regulates gene expression by targeting specific messenger RNA (mRNA) transcripts for degradation or translational repression. This process is mediated by small non-coding RNA molecules, such as siRNAs or short hairpin RNAs (shRNAs) , which guide RNA-induced silencing complexes (RISCs) to complementary sequences on target mRNAs. The result is a reduction in protein synthesis from the targeted transcript, a phenomenon widely referred to as gene knockdown.

[0334] RNAi-based gene knockdown provides a powerful method for the transient and reversible suppression of gene expression. Unlike permanent gene disruption methods, RNAi does not alter the underlying genomic DNA sequence, making it suitable for contexts in which temporary modulation of gene function is preferred. This characteristic is particularly useful for studying essential genes, whose complete loss may be lethal to the cell or organism.

[0335] The RNAi pathway has been harnessed in research and therapeutic applications through the design of synthetic siRNAs or vector-expressed shRNAs. Synthetic siRNAs are typically delivered into cells using transfection reagents or lipid-based carriers, where they are incorporated into RISC complexes to target endogenous mRNAs. shRNAs are encoded in plasmids or viral vectors, allowing for stable or inducible knockdown in vitro and in vivo.

[0336] Due to its sequence-specific mechanism, RNAi offers high target selectivity, although off-target effects can occur due to partial complementarity with unintended transcripts. Advanced design algorithms and chemical modifications to siRNAs have been employed to minimize such effects and enhance knockdown efficiency and stability. Furthermore, delivery systems have been optimized to improve the pharmacokinetics and tissue specificity of RNAi agents in clinical settings.

[0337] The CRISPR / Cas9 system is a genome editing technology derived from the adaptive immune systems of bacteria and archaea. It utilizes a programmable guide RNA (gRNA) to direct the Cas9 endonuclease to specific DNA sequences, where it introduces a double-strand break (DSB) . This targeted cleavage event activates the cell's endogenous DNA repair pathways, primarily NHEJ or homology-directed repair (HDR) , enabling precise genetic modifications.

[0338] CRISPR / Cas9 has become a widely adopted tool for generating gene knockouts. In the absence of a repair template, DSBs are typically resolved by NHEJ, which often introduces small insertions or deletions (indels) at the break site. These indels can result in frameshift mutations or premature stop codons, effectively disrupting gene expression. This approach allows for permanent and heritable inactivation of genes in a broad range of organisms and cell types.

[0339] In addition to gene disruption, the CRISPR / Cas9 system facilitates gene knock-in by supplying a donor DNA template with homology arms flanking the cut site. During HDR, the cell incorporates sequences from the donor template into the genome, enabling precise insertion, replacement, or correction of specific DNA segments. This mechanism allows for the introduction of reporter tags, point mutations, or therapeutic transgenes at defined genomic loci.

[0340] CRISPR / Cas9 offers several advantages over earlier genome editing tools such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) , including ease of design, higher throughput, and broader target compatibility. However, challenges remain, including the potential for off-target cleavage and variability in HDR efficiency. Strategies such as high-fidelity Cas9 variants, paired nickases, and chemical modulation of repair pathways have been developed to improve editing specificity and outcomes.

[0341] As a platform for functional genomics, disease modeling, and gene therapy, CRISPR / Cas9 enables both loss-of-function and gain-of-function studies with high precision. Its ability to create stable genetic changes expands the range of experimental designs beyond transient approaches like RNAi, offering a complementary and often more definitive method for interrogating gene function and therapeutic potential.

[0342] While both RNAi and CRISPR / Cas9 technologies have revolutionized gene function studies, they each have notable limitations. RNAi knockdown is often incomplete and transient, which may not fully reveal gene function and can result in variable phenotypic outcomes. Off-target effects due to partial sequence complementarity can further confound interpretation. In contrast, CRISPR / Cas9 enables stable genetic modifications but poses challenges such as unintended off-target mutations, mosaicism in edited organisms, and lower efficiency of HDR for precise knock-in. Additionally, generating and validating CRISPR-based animal models, especially for knock-in or conditional alleles, can be time-consuming and labor-intensive, often requiring several months to over a year for breeding and characterization.

[0343] In some embodiments, disclosed herein are methods and compositions for tunable, protein target-specific polypeptides that can function as analogs to gene knockdown by RNA interference (RNAi) or gene knockout by CRISPR / Cas9. By selectively binding to and modulating the abundance or activity of specific protein targets, these polypeptides enable precise, adjustable regulation of protein function without altering the underlying genetic sequence. This allows for temporal and reversible interrogation of protein roles in cellular and organismal contexts, offering a complementary approach to RNAi or CRISPR / Cas9 for studying gene function. Unlike genomic editing, the polypeptide-based strategy bypasses the need for DNA modification, reduces the time required for in vivo model development, enables reversible manipulation, and avoids issues such as mosaicism or incomplete penetrance often encountered with genetic approaches. Thus, these polypeptides provide a rapid, scalable, and potentially safer tool for probing biological pathways, validating therapeutic targets, and modeling disease mechanisms in both research and clinical applications.

[0344] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for protein-target-specific modulation of one or more protein targets without genetic modifications in a subject, wherein one or more polypeptides or polynucleotides encoding polypeptides specifically bind to the protein targets and modulate the level and / or associated biological functions thereof.

[0345] In some embodiments, disclosed are methods and compositions for investigating the function of one or more protein targets in a cell or an organism. Non-limiting examples include cells and / or organism of eukaryotic origin, or an established cell line of mammalian origin (e.g., human origin) , plant origin, or prokaryotic cells, or pathogen-infected cells, impacting fields including but not limited to, medicine, veterinary medicine, virology, cell biology, protein chemistry, genetics, and agricultural field.

[0346] In some embodiments, the protein targets to be modulated by one or more polypeptides as disclosed herein are autologous to a cell, an organism, or a subject. In some embodiments, the protein targets to be modulated by one or more polypeptides disclosed are heterologous to a cell, an organism, or a subject, for example, a viral protein in a human host during a viral infection.

[0347] The effects of modulation on the level of a functional protein can be determined by conventional methods known in the art. One example for monitoring protein level is by Western blot utilizing antibodies specifically recognizing the protein target in the functional state, for example specific post-translational modifications required for the function. In some embodiments, the level of a functional protein can be completely diminished by tuning the amino acid sequences and the amounts of polypeptides, or the amounts of polynucleotides encoding the polypeptides.

[0348] In one example, the normal function of an autologous protein may be probed using primary cells or an established cell line, wherein one or more polypeptides or at least a polynucleotide encoding one or more polypeptides are used to modulate the level of the protein available for its normal cellular function. The phenotypical changes caused by the modulation in the level of a functional protein can provide critical information on the function of the protein target, for example, by comparing the changes in transcriptome by RNA sequencing or proteome by mass spectrometry between the cells treated with or without the polypeptides.

[0349] In some embodiments, the normal function of a heterologous protein may be probed using primary cells or an established cell line, wherein the heterologous protein may be expressed in the primary cells or the cell line, for example, from an isolated polynucleotide encoding the heterologous protein, or in a vector comprising the polynucleotide encoding the heterologous protein, that is introduced into the cells by, for example, transfection, wherein one or more polypeptides are used to modulate the level of the heterologous protein in the cells. The phenotypical changes caused by the modulation in the level of a functional protein can provide critical information on the function of the heterologous protein, for example, by comparing the changes in transcriptome by RNA sequencing or proteome by mass spectrometry between the cells treated with or without the polypeptides.

[0350] In some embodiments, to investigate the host factors critical for a viral infection, cells capable of being infected by the virus may be subjected to post-translational modulations by one or more polypeptides recognizing one or more protein targets with probable roles in the viral infection. The cells treated by various polypeptides and / or their combinations may be compared for the infection efficiency by the virus to provide valuable insights in key host factors in the viral infection.

[0351] In some embodiments, the modulation of the level of a protein in its functional state or associated biological functions thereof in a subject can be reversed by providing an exogenous protein or a polynucleotide encoding an exogenous protein or a fragment or functional derivatives thereof, provided that the polypeptide has an amino acid sequence with limited or no binding to the exogenous protein. In some embodiments, the non-binding with the exogenous protein can be achieved by fine tuning the amino acid sequence of the polypeptide. In other embodiments, the non-binding with the exogenous protein can be achieved by using a splicing variant, or a truncated but functional exogenous protein, wherein the segment recognized by the polypeptide is absent in the splicing variant or the truncated exogenous protein.

[0352] In certain embodiments, the modulation of the target protein by the polypeptide is reversible. For example, the polypeptide may be delivered transiently, such that removal or degradation of the polypeptide over time restores the endogenous function of the target protein. Alternatively, the polypeptide may be expressed under the control of an inducible promoter system (e.g., tetracycline-or doxycycline-responsive promoters) , enabling temporal regulation of expression. Upon withdrawal of the inducer, expression of the polypeptide ceases, allowing endogenous signaling pathways to recover. This reversibility provides a distinct advantage over irreversible genomic editing approaches by enabling dynamic control of protein activity, facilitating time-resolved studies and minimizing long-term off-target effects.

[0353] In some embodiments, disclosed herein are cells comprising one or more polypeptides, wherein the polypeptides are delivered to the cells as polypeptides, or as polynucleotides encoding the polypeptides. The encoding polynucleotides may be integrated into the genome for stable expression or maintained episomally. In either case, expression can be regulated using an inducible promoter system, allowing conditional and reversible modulation of the target protein’s function in vitro, in vivo, or ex vivo.

[0354] In some embodiments, disclosed herein are organisms comprising one or more polypeptides, for instance, a plant, wherein the polypeptides are delivered to the organisms as polypeptides, or as polynucleotides encoding the polypeptides. In some embodiments, polynucleotides encoding the polypeptides can be integrated into the genome of an organism, allowing stable expression of the polypeptides in the organism, e.g., a transgenic plant. In some embodiments, polynucleotides encoding the polypeptides can be integrated into the genome of a fraction of cells of an organism, allowing stable expression of the polypeptides in part of the organism, e.g., a plant with transgenic root.

[0355] As disclosed herein, any embodiment described in this patent can be combined to investigate functions of one or more protein targets in a subject, wherein the subject is given an effective amount of a composition comprising at least one polypeptide and / or at least one polynucleotide encoding one or more polypeptides, wherein a polypeptide has an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of a protein target, wherein within the corresponding amino acid sequences, the amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of a protein target, wherein the methods for delivering the polypeptides and / or polynucleotides into the subject include but are not limited to physical methods, chemical methods, and / or biological methods, in vivo, in vitro, or ex vivo.

[0356] As an example, in animal models, the tunable, protein target-specific polypeptides described herein can be employed to modulate the levels or activity of one or more endogenous or exogenous protein targets in a spatially and temporally controlled manner. This approach enables the investigation of protein functions in vivo without the need for generating genetically modified animals through traditional gene knockdown or knockout strategies, which are time-consuming and resource-intensive. By administering the polypeptides systemically or locally, via routes such as intravenous injection, intraperitoneal delivery, or tissue-specific infusion, protein function can be selectively suppressed, enhanced, or modulated in target tissues or cell types. This allows for reversible and dose-dependent interrogation of protein roles in physiological and pathological processes, including development, metabolism, neurobiology, and disease progression. Furthermore, the method supports multiplexed regulation of protein families or interacting protein networks, offering a powerful tool for dissecting complex biological systems in animal models while significantly reducing the timeline and complexity associated with conventional transgenic or genome-editing approaches. EXAMPLES

[0357] Examples 1～8 are included to demonstrate the embodiments of the disclosure. Furthermore, an additional set of illustrative examples (Examples 9～15) is provided to showcase the broader applicability of the disclosed design strategy. These include polypeptides targeting β2AR, the p85α subunit of PI3Kα, BCL2L8, EGFR, NF-κB p65, STAT3, and MAPK pathway components (BRAF, MEK1, ERK2) , each serving as a conceptual embodiment to exemplify potential research and therapeutic applications. EXAMPLE 1 EXEMPLARY METHODS

[0358] Plasmids, constructs and antibodies. The pVAX1 vector (Cat. No. V26020, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) and pEZB-TM vector (Cat. No. 74099, Addgene) were used for cloning and expressing protein targets with a C9-tag (TETSQVAPA) , derived from the C-terminal 9 amino acid sequence of rhodopsin. The minicircle DNA expression vector pMC. CMV-MCS-SV40polyA (Cat. No. MN501A-1, System Biosciences, Palo Alto, CA, USA) was used for cloning and expressing designed polypeptides with a C-terminal FLAG-tag (DYKDDDDK) . All genes optimized for expression in HEK293T cells were synthesized by Sangon Biotech (Shanghai, China) . C9-rhodopsin antibody 1D4-HRP (Cat. No. sc57432 HRP) , actin antibody (Cat. No. sc58673) , and rabbit anti-mouse IgG-HRP (Cat. No. sc358914) were purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA) . Lipofectamine 3000 (Cat. No. L3000015) , Cell Lysis Buffer II (Cat. No. FNN0021) , and DPBS (Cat. No. 14190144) were obtained from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) . HEK293T cells (Cat. No. CRL-11268) and 4T1 cells (Cat. No. CRL-2539) were purchased from American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA) and maintained in DMEM or RPMI-1640 medium, respectively, supplemented with 10%fetal bovine serum at 37℃ in a humidified incubator with 5%CO2.

[0359] Transfection and detection of protein levels. HEK293T cells at approximately 80%confluence in 6-well or 12-well plates were transfected with a fixed amount of plasmid DNA (e.g., 0.2 μg) encoding the protein target either alone (Control) or together with a variable amount of pMC. CMV-MCS-SV40polyA plasmid encoding a designed polypeptide, using Lipofectamine 3000 according to the manufacturer’s instructions. The amount of pMC. CMV-MCS-SV40polyA plasmid was calculated to achieve a molar ratio of 10: 1 or 20: 1 relative to the pVAX1 or pEZB-TM plasmid. Throughout the study, a 10: 1 ratio was used unless otherwise specified. At 48 hours post-transfection, cells were washed three times with DPBS, pelleted by centrifugation at 1,000 × g for 10 minutes, and lysed in Cell Lysis Buffer II containing protease inhibitors, according to the manufacturer’s instructions. After centrifugation at 16,000 × g for 10 minutes at 4℃, supernatants were transferred to clean Eppendorf tubes and protein concentrations were determined by OD280 measurement. Equal OD280 amounts of cleared lysates were separated by 10%SDS-PAGE, and protein target levels were detected using the 1D4-HRP antibody. Endogenous actin, detected by anti-actin antibody, served as an internal control. To enable direct comparison between Control and experimental conditions, Control samples were run adjacent to those transfected with various pMC. CMV-MCS-SV40polyA plasmids encoding different designed polypeptides.

[0360] 4T1 Wild-Type Cells. 4T1 wild-type cells were taken from liquid nitrogen and thawed in a 37 ℃ water bath. Once thawed, the cells were quickly transferred into a 50 mL centrifuge tube containing PBS. The cells were gently pipetted a few times to resuspend, then centrifuged at 200～300 × g for 5 minutes at room temperature. The supernatant was discarded, and an appropriate amount of complete culture medium was added. The cell suspension was gently mixed and transferred to a culture flask, and incubated in a 5%CO2, 37 ℃ incubator. When the cells reached 70～80%confluency, they were passaged at a ratio of 1: 3 to 1: 5. After 2～3 passages in vitro, log-phase cells were collected and digested using 0.25%trypsin. The cells were then washed with PBS, resuspended in PBS, and counted.

[0361] Preparation of minicircle DNA. The genes coding polypeptides under CMV promoter were cloned into the parental vector pMC. CMV-MCS-SV40polyA (MN501A) , which was transformed into the ZYCY10P3S2T E. coli minicircle producer strain, following the manufacturer’s instructions. Minicircle DNA production was induced by adding Arabinose Induction Solution. The resulting minicircle DNA was purified using the ZYMOPURETM II Plasmid Gigaprep Kit (Cat. No. D4204, Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA) , as per the manufacturer’s protocol. The minicircle DNA was quantified by measuring OD260 and verified by agarose gel electrophoresis and restriction enzyme digestion.

[0362] Tumor Inoculation and Dosing. Balb / c mice were orthotopically implanted with 4T1 wild-type cells into the mammary fat pad. Mice were monitored every other day post-implantation. When the average tumor volume reached approximately 50～100 mm3, mice with comparable tumor sizes and body weights were selected and randomly assigned into experimental groups (5 mice per group) . The day of grouping was designated as Day 0, and the first dose was administered. Peritumoral dosing was carried out once weekly for 3 weeks using minicircle DNA harboring a polypeptide-coding gene in nanoparticles formed by in vivo-jetPEI (Cat. No. 201-50G, Polyplus, Illkirch, France) , at a dose of 5 μg minicircle DNA per mouse. Tumor volume and body weight were recorded twice per week. EXAMPLE 2 POTENT INHIBITORS FOR THE PARP FAMILY

[0363] The inventor demonstrated the design of a series of potent PARP inhibitors against PARP1 and its homologues (Sequence ID NOS: 1～3) . A total of nine polypeptides of different amino acid sequences (Sequence ID NOS: 4～12) were designed and the polynucleotides encoding for these polypeptides were synthesized and inserted into pMC. CMV-MCS-SV40polyA plasmid. The polypeptide-coding pMC. CMV-MCS-SV40polyA plasmid were co-transfected at 10: 1 molar ratio with PARP1-coding plasmid (Sequence ID NO: 1) into 293T cells and the cellular levels of PARP1 expressed from the PARP1-coding plasmid was detected under each condition. Remarkably, each of the eight polypeptides exhibited potent activity in reducing the cellular level of PARP1 expressed from the PARP1-coding plasmid (FIG. 2A) . Furthermore, these polypeptides were tested for their effects on the cellular level of PARP2 (Sequence ID NO: 2) and PARP3 (Sequence ID NO: 3) , two other main members of the PARP family (FIG. 2B～C) . Among the designed polypeptides, Sequence ID. NO. 11 exhibited the strongest inhibitory effects on PARP1, PARP2 and PARP3 at the same time. EXAMPLE 3 POTENT INHIBITORS FOR THE TEC FAMILY OF  HUMAN NON-RECEPTOR TYROSINE KINASE FAMILY

[0364] The inventor additionally demonstrated the design of a series of potent inhibitors against BTK and its homologues in the TEC family of the human non-receptor tyrosine kinase family (Sequence ID NOS: 13～17) . A total of nine polypeptides of different amino acid sequences (Sequence ID NOS: 18～26) were designed and the polypeptide-coding pMC. CMV-MCS-SV40polyA plasmid were co-transfected at 10: 1 ratio with BTK-coding plasmid (Sequence ID NO: 13) into 293T cells and the cellular levels of BTK expressed from BTK-coding plasmid was detected under each condition. Notably, all polypeptides exhibited a good activity in reducing the cellular level of BTK protein expressed from BTK-coding plasmid (FIG. 3A) . Furthermore, these polypeptides were tested for their effects on the cellular level of BMX expressed from BMX-coding plasmid (Sequence ID NO: 14) , another member of the family. Similarly, all polypeptides at 10: 1 ratio substantially reduced the cellular protein level of BMX protein expressed from BMX-coding plasmid (FIG. 3B) . Among these polypeptides, Sequence ID NO: 19 exhibited the most potent inhibitory effect on both BTK and BMX (FIG. 3) . EXAMPLE 4 POTENT INHIBITORS FOR CSF1R

[0365] For CSF1R (Sequence ID NOS: 27) , the inventor designed two potent polypeptide inhibitors (Sequence ID NOS: 32～33) . The polypeptide-coding pMC. CMV-MCS-SV40polyA plasmid were co-transfected at 10: 1 or 20: 1 molar ratio with CSF1R-coding plasmid (Sequence ID NO: 27) into 293T cells and the cellular levels of CSF1R expressed from CSF1R-coding plasmid was compared. Significantly, both polypeptides exhibited excellent activity in reducing the cellular level of CSF1R protein expressed from CSF1R-coding plasmid (FIG. 4) . At 20-folds, Sequence ID NO: 33 reduced the expression of CSF1R by more than 80%relative to that expressed from CSF1R-coding plasmid in the absence of any inhibitory polypeptide (FIG. 4) . EXAMPLE 5 POTENT INHIBITORS FOR PD-L1 and PD-L2 FAMILY

[0366] For PD-L1 and its homologue PD-L2 (Sequence ID NOS: 34～35) , the inventor developed a series of potent polypeptide inhibitors derived from PD-L1 (Sequence ID NO: 36～44) , or from PD-L2 (Sequence ID NOS: 45～53) . The polypeptide-coding pMC. CMV-MCS-SV40polyA plasmid were co-transfected at 10: 1 molar ratio with PD-L1-coding plasmid (Sequence ID NO: 34) into 293T cells and the cellular levels of PD-L1 expressed from PD-L1-coding plasmid was compared. Significantly, all polypeptides exhibited excellent activity in reducing the cellular level of PD-L1 protein expressed from PD-L1-coding plasmid (FIG. 5A～B) . The polypeptide-coding pMC. CMV-MCS-SV40polyA plasmid were also co-transfected at 10: 1 molar ratio with PD-L2-coding plasmid (Sequence ID NO: 35) into 293T cells. All polypeptides exhibited excellent activity in reducing the cellular level of PD-L2 protein expressed from PD-L2-coding plasmid (FIG. 5C～D) . EXAMPLE 6 POTENT INHIBITORS FOR ABL1 FAMILY OF  HUMAN NON-RECEPTOR TYROSINE KINASE FAMILY

[0367] For ABL1 and its homologue ABL2 (Sequence ID NOS: 54～55) , the inventor developed a series of potent polypeptide inhibitors (Sequence ID NO: 56～66) . The polypeptide-coding pMC. CMV-MCS-SV40polyA plasmid were co-transfected at 10: 1 molar ratio with ABL1-coding plasmid (Sequence ID NO: 54) into 293T cells and the cellular levels of ABL1 expressed from ABL1-coding plasmid was compared. Significantly, all polypeptides exhibited excellent activity in reducing the cellular level of ABL1 protein expressed from ABL1-coding plasmid (FIG. 6A) . The polynucleotides encoding for these polypeptides were also co-transfected at 10: 1 molar ratio with ABL2-coding plasmid (Sequence ID NO: 55) into 293T cells. All polypeptides exhibited excellent activity in reducing the cellular level of ABL2 protein expressed from ABL2-coding plasmid (FIG. 6B) . EXAMPLE 7 POTENT INHIBITORS FOR BCL2 FAMILY

[0368] For the BCL2 family (Sequence ID NOS: 67～73) , the inventor further designed a series of potent polypeptide inhibitors (Sequence ID NOS: 74～76) . The BCL2 family consists of both anti-apoptotic proteins (e.g., BCL2, BCL2L1) and pro-apoptotic proteins (for instance, BCL2L4, BCL2L7) . Therefore, it is very important for the designed polypeptide inhibitors to distinguish these different proteins. The polynucleotides coding for all designed inhibitory polypeptides were co-transfected at 10: 1 or 20: 1 molar ratio with BCL2 (or BCL2 homologues) -coding plasmids into 293T cells and the cellular levels of BCL2 or its homologues expressed from the plasmids was compared. Impressively, Sequence ID NO: 74 carries ubiquitous inhibitory activity against all members of BCL2 family that we tested (FIG. 7A～F) . On the other hand, Sequence ID NO: 76 preferably targets the anti-apoptotic proteins of the BCL2 family, while exhibited minimal effects on the cellular level of the pro-apoptotic proteins of the BCL2 family such as BCL2L4 (FIG. 7F) . Therefore, Sequence ID NO: 76 has the most preferable selectivity among the BCL2 family. EXAMPLE 8 IN VIVO EFFICACY OF INTRACELLULARLY ACTIVE POLYPEPTIDES  IN A TNBC MODEL

[0369] Triple-negative breast cancer (TNBC) is a subtype of breast cancer characterized by the absence of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 amplification. Due to its aggressive nature and limited targeted treatment options, TNBC remains an area of significant unmet clinical need.

[0370] To evaluate the therapeutic potential of selected intracellularly active polypeptides, an orthotopic 4T1 mouse model was employed. BALB / c mice were inoculated with wild-type 4T1 cells into the mammary fat pad. Upon tumor establishment (50～100 mm3) , animals were randomized into treatment groups and administered the indicated polypeptides via peritumoral injection once weekly for three weeks. Tumor growth was monitored over the treatment period (FIG. 8, tumor size shown as mean ± SEM, n = 5) .

[0371] Five tested polypeptides resulted in statistically significant tumor growth inhibition (TGI) compared to untreated controls (p < 0.05) . Among them, SEQ ID NO: 33 (targeting CSF1R) showed the most substantial suppression of tumor growth with approximately 40%TGI. In addition, SEQ ID NO: 12 (targeting the PARP family) , SEQ ID NO: 25 (targeting the TEC family of the human non-receptor tyrosine kinase family) , and SEQ ID NO: 57 (targeting ABL1 and its homologue ABL2) each achieved approximately 40%TGI, while SEQ ID NO: 76 (targeting BCL2 and its family members, excluding BCL2L4 and BCL2L7) led to a 30%reduction in tumor volume.

[0372] Interestingly, in vivo antitumor activity did not always correlate with in vitro degradation potency. As illustrated in FIG. 8B, three polypeptides targeting ABL1 / ABL2 (SEQ ID NOs: 59, 65, and 57) demonstrated descending in vitro degradation potency in the order of SEQ ID NO: 59 > SEQ ID NO: 65 > SEQ ID NO: 57, yet SEQ ID NO: 57 conferred the greatest tumor inhibition in vivo. Similarly, FIG. 8C shows that although SEQ ID NO: 20 exhibited stronger in vitro degradation of BTK family members, SEQ ID NO: 25 produced greater TGI in vivo.

[0373] These findings indicate that maximal degradation of a target protein does not necessarily corresponding to optimal therapeutic outcome. It is possible that restoration of target protein levels to a physiological range, rather than complete ablation, may provide superior therapeutic benefit. The ability of the present disclosure to identify polypeptides with varying degrees of modulation potency offers a valuable strategy for tailoring therapeutic modulation to disease-specific contexts. EXAMPLE 9 MEMBRANE PROTEIN TARGETING - GPCR DEGRADATION

[0374] A polypeptide (SEQ ID NO: 84) targeting the β2-adrenergic receptor (β2AR) , a prototypical Class A G protein-coupled receptor (GPCR) , is designed based on its high-resolution crystal structure (PDB ID: 2RH1,  ) . The sequence corresponds to residues 1～101, encompassing the first and second transmembrane helices (TM1 and TM2) and adjacent regions that contribute to receptor folding, trafficking, and membrane integration, and are accessible for polypeptide-mediated modulation or degradation.

[0375] HEK293 cells stably expressing a human β2AR-GFP fusion protein (～5 × 105 receptors per cell, as quantified by flow cytometry) are either transfected with a plasmid (pMC. CMV-MCS-SV40polyA) encoding SEQ ID NO: 84 using Lipofectamine 3000, or treated with a TAT (with an amino acid sequence of YGRKKRRQRRR) -conjugated synthetic version of the polypeptide (10 μM) . β2AR activity is assessed by measuring intracellular cAMP levels using a BRET-based biosensor (CAMYEL) after stimulation with 1 μM isoproterenol.

[0376] The polypeptide reduces β2AR-mediated cAMP production by 75.3 ± 2.7% (mean ± SEM, n = 6) , with an IC50 of 3.2 ± 0.4 μM. Confocal microscopy using anti-GFP antibodies under non-permeabilizing condition shows a marked reduction in receptor surface fluorescence. Western blot analysis of total cell lysates reveals decreased β2AR protein levels, consistent with receptor degradation. Whole-cell patch-clamp recordings of β2AR-activated GIRK channels further confirms the functional silencing of β2AR signaling. These results support a mechanism wherein the polypeptide mediates degradation of β2AR, leading to suppression of receptor activity. EXAMPLE 10 INTRACELLULAR DELIVERY AND ISOFORM-SPECIFIC MODULATION

[0377] A polypeptide (SEQ ID NO: 94) targeting the PI3Kα isoform is derived from the p85αregulatory subunit (residues 517～597) , based on the co-crystal structure of the p110α–p85αcomplex (PDB ID: 4OVV,  resolution) . The sequence corresponds to a conserved helical region near the C-terminus of the inter-SH2 (iSH2) domain, which is critical for complex stability and isoform selectivity.

[0378] The polypeptide is conjugated to a TAT sequence via a GGGGS linker and synthesized by solid-phase peptide synthesis (SPPS) , followed by HPLC purification to >95%purity. MCF-7 cells, which are dependent on PI3Kα signaling, are treated with 0～50 μM of the TAT-conjugated polypeptide for 24 hours.

[0379] Intracellular delivery is confirmed by confocal microscopy using a fluorescently labeled version of the polypeptide (conjugated to Alexa Fluor 488) . Quantitative proteomics using stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) followed by LC-MS / MS analysis shows a 60.5 ± 3.2%reduction in phosphorylated AKT levels (pSer473) , a downstream marker of PI3K activity, specifically in the PI3Kα isoform pathway. Phosphorylation levels of substrates specific to other PI3K isoforms (e.g., PKCζ for PI3Kγ) remain unaffected.

[0380] In vitro kinase assays using recombinant PI3K isoforms show that the polypeptide inhibits PI3Kα with an IC50 of 2.1 ± 0.3 μM, while having no significant effect on PI3Kβ, PI3Kγ, or PI3Kδ at concentrations up to 100 μM. Surface plasmon resonance (SPR) measurements reveal that the polypeptide binds to PI3Kα with a dissociation constant KD of 0.45 ± 0.05 μM. Western blot analysis further shows a marked decrease in total PI3Kα protein levels, consistent with targeted degradation by SEQ ID NO: 94. EXAMPLE 11 PROTEIN-PROTEIN INTERACTION DISRUPTION

[0381] A polypeptide (SEQ ID NO: 95) is designed to mimic the BH3 domain of the pro-apoptotic protein BCL2L8 (also known as BAD) , which interacts with the anti-apoptotic protein BCL2. The polypeptide sequence corresponding to amino acid residues 103～126 of BCL2L8 is based on the crystal structure of the BCL2L8 BH3 peptide bound to BCL2L1 (BCL-XL) (PDB ID: 1G5J) that is often used to model BCL2 interaction due to structural conservation.

[0382] The polypeptide is expressed in HeLa cells using a doxycycline-inducible piggyBac transposon system. The expression construct includes a C-terminal FLAG tag for detection and an IRES-mCherry cassette for monitoring transfection efficiency. Cells are treated with doxycycline (1 μg / mL) for 24 hours to induce polypeptide expression.

[0383] Co-immunoprecipitation experiments using anti-FLAG magnetic beads show that induction of the polypeptide expression disrupts the interaction between endogenous BCL2L8 and BCL2. Quantitative analysis of Western blots reveals a 78.6 ± 4.2%reduction in BCL2L8-BCL2 complex formation. This may reflect competitive binding and / or possible destabilization of the anti-apoptotic complex. Proximity ligation assays (PLA) using anti-BCL2L8 and anti-BCL2 antibodies further confirm the disruption of this interaction in situ, with a 68.3 ± 5.7%decrease in PLA signal foci per cell.

[0384] This disruption leads to increased apoptosis in the HeLa cells as measured by Annexin V-FITC / PI staining and flow cytometry. After 48 hours of polypeptide induction, the percentage of early apoptotic (Annexin V+ / PI-) cells increases from 2.3 ± 0.5%to 37.6 ± 3.1%. Caspase-3 / 7 activity, measured using a fluorogenic substrate (Ac-DEVD-AMC) , shows a 5.2-fold increase in induced cells compared to uninduced controls.

[0385] Mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) is assessed using a tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) assay, which shows a 62.4 ± 4.8%decrease in mitochondrial membrane potential. Cytochrome c release from mitochondria is quantified by subcellular fractionation followed by ELISA, revealing a 3.7-fold increase in cytosolic cytochrome c levels in polypeptide-expressing cells. EXAMPLE 12 COMBINATION THERAPY

[0386] Two polypeptides (SEQ ID NO: 96 and SEQ ID NO: 97) targeting the epidermal growth factor receptor (EGFR) are designed based on two different regions of its tyrosine kinase domain, residues 711～733 and 808～832, respectively. These regions are chosen based on the three-dimensional structural information of EGFR and are selected to promote destabilization and degradation of the receptor.

[0387] The polypeptides are tested in combination with the small molecule EGFR inhibitor erlotinib in the EGFR-mutant (L858R / T790M) non-small cell lung cancer cell line H1975, which is resistant to erlotinib alone. Cells are treated with the TAT-conjugated polypeptides, erlotinib, or their combination for 72 hours.

[0388] Cell viability is assessed using a real-time cell analysis (RTCA) system (xCELLigence) , which measures electrical impedance as a proxy for cell number and adherence. While the polypeptides or erlotinib alone shows modest growth inhibition (20.3 ± 2.1%and 29.7 ± 2.8%respectively at 72 hours) , the combination results in a synergistic effect, reducing cell viability by 75.6 ± 3.2%. The combination index (CI) calculated using the Chou-Talalay method is 0.41, indicating strong synergy (CI < 1 indicates synergism) .

[0389] Total and phospho-EGFR levels are quantified by in-cell Western blotting using infrared fluorescent secondary antibodies and an Odyssey imaging system. The combination treatment significantly reduces both total EGFR and phospho-EGFR (pY1068) levels by 86.7 ± 4.1%and 89.3 ± 3.7%, respectively, compared to 31.2 ± 2.9% (phospho only) for erlotinib alone and 25.6 ± 2.4%for the polypeptides alone, consistent with enhanced degradation of EGFR.

[0390] Downstream signaling is assessed by multiplex phosphoprotein analysis using a Luminex bead-based assay, showing significant reductions in phospho-AKT (78.5 ± 4.1%) , phospho-ERK (82.3 ± 3.8%) , and phospho-STAT3 (71.2 ± 4.5%) levels with the combination treatment.

[0391] RNA sequencing (RNA-seq) analysis reveals that the combination treatment alters the expression of 1, 247 genes (fold change > 2, adjusted p-value < 0.05) compared to 412 genes for erlotinib alone and 378 genes for the polypeptides alone. Gene set enrichment analysis (GSEA) shows significant downregulation of cell cycle and DNA repair pathways in the combination-treated cells. EXAMPLE 13 REVERSIBILITY DEMONSTRATION

[0392] A polypeptide (SEQ ID NO: 98) targeting the transcription factor NF-κB p65 subunit is designed based on its DNA-binding domain. The polypeptide sequence corresponds to residues 59～78 of the p65 subunit, which are selected because they contribute directly to the DNA-binding interface of the Rel Homology Domain and are essential for stable NF-κB–DNA complex formation, making them a strategic target for modulation.

[0393] HEK293 cells are transfected with a NF-κB-responsive luciferase reporter plasmid (pNF-κB-Luc) and the polypeptide-encoding plasmid under a doxycycline-inducible promoter (pTRE3G-IRES-mCherry) . A constitutively expressed Renilla luciferase plasmid (pRL-TK) is co-transfected for normalization.

[0394] Upon doxycycline addition (1 μg / mL) , NF-κB activity (as measured by firefly / Renilla luciferase activity ratio) decreases by 80.3 ± 3.2%within 24 hours. Time-course analysis using real-time luminescence measurements (EnduRen live-cell substrate) shows that inhibition begins within 2 hours of doxycycline addition and reaches maximum effect by 18 hours.

[0395] When doxycycline is removed by washing and media replacement, NF-κB activity returns to baseline levels within 48 hours. Quantitative RT-PCR analysis of NF-κB target genes (IL8, NFKBIA, TNFAIP3) confirms the reversible nature of the inhibition at the transcriptional level.

[0396] Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays using anti-p65 antibodies show that the polypeptide reduces p65 binding to the promoters of target genes (80.7 ± 4.1%reduction at the IL8 promoter, 75.3 ± 3.8%reduction at the NFKBIA promoter) . ChIP-seq analysis reveals genome-wide reduction in p65 binding at known NF-κB target sites.

[0397] Western blot analysis reveals that expression of the polypeptide leads to a significant reduction in total NF-κB p65 protein levels (72.6 ± 3.9%decrease relative to control) , suggesting that the polypeptide may promote degradation of p65. The specific pathway responsible for this reduction remains to be determined.

[0398] Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments using GFP-tagged p65 show a reduced steady-state nuclear signal and increased mobile fraction, consistent with reduced protein levels and diminished chromatin engagement.

[0399] In contrast, CRISPR / Cas9-mediated knockout of p65 in the same cell system using a lentiviral sgRNA delivery leads to a permanent loss of NF-κB activity. TIDE (Tracking of Indels by Decomposition) analysis shows 94.3 ± 2.1%editing efficiency at the RELA (p65) locus.

[0400] Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) comparing polypeptide-treated, CRISPR-knockout, and control cells reveals distinct transcriptional profiles. While both approaches reduce expression of NF-κB target genes, the polypeptide-treated cells show a more dynamic and heterogeneous response, consistent with the reversible nature of the inhibition. EXAMPLE 14 MULTIPLEXED TARGETING

[0401] A set of three polypeptides (SEQ ID NOs: 99～101) are designed to simultaneously target key proteins in the MAPK pathway: RAF (SEQ ID NO: 99) , MEK (SEQ ID NO: 100) , and ERK (SEQ ID NO: 101) . The polypeptide sequences are derived from structural information of the target proteins and incorporate key protein interaction motifs potentially involved in stability regulation.

[0402] The polypeptides are co-expressed in A375 melanoma cells (harboring the BRAF V600E mutation) using a tricistronic vector (pVAX1-IRES2-IRES2) , in which each polypeptide sequence is separated by an IRES2 (internal ribosome entry site) element to ensure coordinated but independent translation. An empty pVAX1 vector is used as a negative control.

[0403] Co-expression of the three polypeptides results in a profound inhibition of cell proliferation (85.3 ± 3.7%reduction in cell number after 72 hours, as measured by real-time cell analysis) compared to targeting each protein individually (RAF: 32.1 ± 2.8%, MEK: 41.5 ± 3.2%, ERK: 37.8 ± 3.0%reduction) . Cell cycle analysis by flow cytometry shows G1 arrest in the multiplexed targeting group (78.3 ± 4.1%of cells in G1 phase compared to 43.2 ± 3.5%in control) , suggesting functional suppression of MAPK signaling..

[0404] Phosphoproteomic analysis using titanium dioxide (TiO2) enrichment followed by LC-MS / MS confirms the simultaneous downregulation of multiple MAPK pathway components and downstream targets. Key phosphorylation sites showing significant reduction (>75%, p < 0.001) include RAF1 (S338) , MEK1 / 2 (S217 / S221) , ERK1 / 2 (T202 / Y204) , and downstream substrates such as p90RSK (S380) and MSK1 (S360) .

[0405] Immunoblotting further reveals reduced total protein levels of RAF, MEK, and ERK in the multiplexed group, raising the possibility that polypeptide binding promotes degradation of target proteins via yet-undefined cellular pathways (e.g., proteasomal or lysosomal mechanisms) . MG132 co-treatment partially rescues target protein levels, supporting a role for proteasome-mediated degradation.

[0406] Transcriptomic profiling (RNA-seq) reveals downregulation of MAPK target genes, with 1,247 genes showing significant changes (fold change > 2, adjusted p-value < 0.05) in the multiplexed targeting group compared to 412, 378, and 523 genes in the RAF, MEK, and ERK single-targeting groups, respectively.

[0407] Reverse-phase protein array (RPPA) confirms that key signaling intermediates are reduced at both the phosphorylation and total protein levels, including cross-talk pathways such as PI3K / AKT and JAK / STAT. Reduction in target protein abundance may result from degradation triggered by direct polypeptide binding.

[0408] In vivo studies using A375 xenografts in nude mice (n = 10 per group) show that systemic delivery of the tricistronic construct using lipid nanoparticles results in significant tumor growth inhibition (78.3 ± 5.2%reduction in tumor volume after 21 days, p < 0.001) compared to individual targeting (RAF: 31.2 ± 3.7%, MEK: 35.6 ± 4.1%, ERK: 33.9 ± 3.8%reduction) . Tumor lysates reveal reduced MAPK protein levels, consistent with potential in vivo degradation. This strategy provides a multiplexed, post-translational approach to suppress oncogenic signaling, potentially overcoming feedback reactivation and resistance seen with single-target therapies. EXAMPLE 15 POST-TRANSLATIONAL MODIFICATION TARGETING

[0409] A polypeptide (SEQ ID NO: 102) is designed to specifically recognize and potentially degradate the phosphorylated form of the transcription factor STAT3 at tyrosine 705 (pSTAT3, pY705) . The polypeptide sequence is based on the SH2 domain of STAT3 (residues 586～688) , which binds to phosphorylated tyrosine residues, with additional flanking regions to enhance stability and specificity.

[0410] The polypeptide is expressed as a fusion protein with a cell-penetrating TAT peptide and a nuclear localization signal (NLS) from SV40 large T antigen (PKKKRKV) . The fusion protein is produced in Escherichia coli using a pET expression system and purified by affinity chromatography followed by size exclusion chromatography.

[0411] In IL-6 stimulated HepG2 cells (treated with 20 ng / mL IL-6 for 30 minutes) , the polypeptide selectively interacts with phosphorylated STAT3, as shown by co-immunoprecipitation and Western blot analysis. Quantitative analysis reveals that the polypeptide reduces pSTAT3 (pY705) levels by 78.3 ± 3.7%, potentially through interference with phosphorylation or promotion of degradation, while having no significant effect on total STAT3 levels under these conditions. Further studies are required to determine whether the observed reduction in pSTAT3 levels results from altered phosphorylation dynamics, enhanced degradation, or both.

[0412] Microscale thermophoresis (MST) measurements show that the polypeptide binds to pSTAT3 with a KD of 27 ± 3 nM, while its affinity for unphosphorylated STAT3 is >10 μM. Surface plasmon resonance (SPR) analysis confirms these binding kinetics and demonstrates the specificity of the polypeptide for pSTAT3 over other phosphorylated STAT proteins.

[0413] Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) analysis reveals that the polypeptide reduces pSTAT3 binding to its genomic targets by 73.2 ± 4.1%across all identified binding sites. This results in a 70.5 ± 3.8%reduction in the expression of STAT3 target genes as measured by quantitative RT-PCR, with key genes such as SOCS3, BCL2, and CCND1 showing >80%reduction in expression.

[0414] Cellular thermal shift assay (CETSA) demonstrates that the polypeptide specifically stabilizes the phosphorylated form of STAT3, increasing its melting temperature by 5.3 ± 0.4℃, while having no effect on the thermal stability of unphosphorylated STAT3.

[0415] In situ proximity ligation assay (PLA) using antibodies against the polypeptide and pSTAT3 shows a significant increase in PLA signal in the nucleus of IL-6 stimulated cells, confirming the interaction between the polypeptide and pSTAT3 in its native cellular context.

[0416] Time-course analysis using real-time quantitative PCR with TaqMan probes shows that inhibition of STAT3 target gene expression begins within 30 minutes of polypeptide treatment and reaches maximum effect by 4 hours. Washout experiments demonstrate that the inhibitory effect is reversible, with gene expression returning to baseline levels within 12 hours of polypeptide removal.

[0417] In vivo studies using a xenograft model of IL-6-dependent multiple myeloma (MM. 1S cells in NOD / SCID mice) show that systemic administration of the polypeptide (10 mg / kg, intravenous, every other day) results in significant tumor growth inhibition (68.3 ± 5.2%reduction in tumor volume after 21 days, p < 0.001) compared to vehicle control. Immunohistochemical analysis of tumor sections reveals decreased nuclear pSTAT3 levels and reduced expression of STAT3 target genes, consistent with effective suppression or clearance of the active transcription factor in tumor tissue. ***

[0418] The methods described herein can be performed without excessive experimentation, based on the present disclosure. Variations in steps or sequences can be made without departing from the scope. Chemically and physiologically related agents can achieve similar results when substituted. Such modifications are within the scope defined by the appended claims.

[0419] Therapeutic regimens may involve one or more pharmacological treatments for a disease, used individually or in combination, with flexibility to adapt to patient needs.

[0420] Treatments may include proteinaceous modalities, such as polypeptides interacting with specific proteins, or polynucleotide approaches involving polynucleotides carrying genetic codes for polypeptides or their functional analogs.

[0421] This disclosure covers methods for modulating target proteins, preventing or postponing disease, reducing disease severity, assessing disease risk, diagnosing, determining disease presence, and providing alternative therapies. References Abramson, J., J. Adler, J. Dunger, R. Evans, T. Green, A. Pritzel, O. Ronneberger, L. Willmore,  A.J. Ballard, J. Bambrick, S.W. Bodenstein, D.A. Evans, C.C. Hung, M. O'Neill, D. Reiman, K. Tunyasuvunakool, Z. Wu, A. Zemgulyte, E. Arvaniti, C. Beattie, O. Bertolli, A. Bridgland, A. Cherepanov, M. Congreve, A.I. Cowen-Rivers, A. Cowie, M. Figurnov, F.B. Fuchs, H. Gladman, R. Jain, Y.A. Khan, C.M.R. Low, K. Perlin, A. Potapenko, P. Savy, S. Singh, A. Stecula, A. Thillaisundaram, C. Tong, S. Yakneen, E.D. Zhong, M. Zielinski, A. Zidek, V. Bapst, P. Kohli, M. Jaderberg, D. Hassabis and J.M. Jumper (2024) . "Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. " Nature 630 (8016) : 493-500. Chen, C. and H. Okayama (1987) . "High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid  DNA. " Mol Cell Biol 7 (8) : 2745-2752. Harland, R. and H. Weintraub (1985) . "Translation of mRNA injected into Xenopus oocytes is  specifically inhibited by antisense RNA. " J Cell Biol 101 (3) : 1094-1099. Jumper, J., R. Evans, A. Pritzel, T. Green, M. Figurnov, O. Ronneberger, K. Tunyasuvunakool, R.  Bates, A. Zidek, A. Potapenko, A. Bridgland, C. Meyer, S.A.A. Kohl, A.J. Ballard, A. Cowie, B. Romera-Paredes, S. Nikolov, R. Jain, J. Adler, T. Back, S. Petersen, D. Reiman, E. Clancy, M. Zielinski, M. Steinegger, M. Pacholska, T. Berghammer, S. Bodenstein, D. Silver, O. Vinyals, A.W. Senior, K. Kavukcuoglu, P. Kohli and D. Hassabis (2021) . "Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. " Nature 596 (7873) : 583-589. Kyte, J. and R.F. Doolittle (1982) . "A simple method for displaying the hydropathic character of  a protein. " J Mol Biol 157 (1) : 105-132. Liu, F., Y. Song and D. Liu (1999) . "Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic  administration of plasmid DNA. " Gene Ther 6 (7) : 1258-1266. Miller, D.L., S.V. Pislaru and J. E. Greenleaf (2002) . "Sonoporation: mechanical DNA delivery  by ultrasonic cavitation. " Somat Cell Mol Genet 27 (1-6) : 115-134. Newman, C.M. and T. Bettinger (2007) . "Gene therapy progress and prospects: ultrasound for  gene transfer. " Gene Ther 14 (6) : 465-475. Nicolau, C. and C. Sene (1982) . "Liposome-mediated DNA transfer in eukaryotic cells.  Dependence of the transfer efficiency upon the type of liposomes used and the host cell cycle stage. " Biochim Biophys Acta 721 (2) : 185-190. Potter, H., L. Weir and P. Leder (1984) . "Enhancer-dependent expression of human kappa  immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. " Proc Natl Acad Sci U S A 81 (22) : 7161-7165. Schwarze, S.R., A. Ho, A. Vocero-Akbani and S.F. Dowdy (1999) . "In vivo protein transduction:  delivery of a biologically active protein into the mouse. " Science 285 (5433) : 1569-1572. Strohl, W.R. (2015) . "Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make  Biobetters. " BioDrugs 29 (4) : 215-239. Tirlapur, U.K. and K. Konig (2002) . "Targeted transfection by femtosecond laser. " Nature  418 (6895) : 290-291. Yang, N., B. Kong, Z. Zhu, F. Huang, L. Zhang, T. Lu, Y. Chen, Y. Zhang and Y. Jiang (2023) .  "Recent advances in targeted protein degraders as potential therapeutic agents." Mol Divers:1-25.

Claims

A method for modulating a protein target and / or associated biological functions thereof in a subject in a specific manner by using a composition comprising an effective amount of at least one polypeptide, wherein:the polypeptide corresponds to one secondary-structural element of the protein target; orthe polypeptide corresponds to more than one secondary-structural elements of the protein target;and wherein:the polypeptide modulates the protein target regardless of the directionality of the amino acid sequence or the order of the secondary-structural elements;and wherein the method further comprises:a) obtaining the information of secondary-structural elements of the protein target by utilizing three-dimensional structural information;b) designing the polypeptides based on the information of secondary-structural elements of the protein target, by including one or more secondary-structural elements within a polypeptide, wherein one consideration factor is whether the chosen polypeptide sequence exhibits a high likelihood of maintaining the desired secondary structure in isolation;c) preparing the designed polypeptides; andd) testing the efficiency of modulation by the designed polypeptides, and selecting one or more polypeptides with desired properties.The method of claim 1, wherein one or more polypeptides corresponding to a protein target can selectively modulate one or more members of a family of related protein targets, wherein the number of protein family members to be modulated can be increased or decreased by:modifying the range of secondary-structural elements included in a polypeptide corresponding to the protein target; and / orderiving the amino acid sequence of a polypeptide from different secondary-structural elements of the protein target; and / orintroducing modifications into the amino acid sequence of a polypeptide, including but not limited to point mutations, circular permutations, truncations, deletions, and / or insertions, and / or any combinations thereof.The method of any one of claims 1-2, wherein at least one polynucleotide encoding one or more polypeptides corresponding to a protein target is administered into a subject, wherein the polypeptide and the protein target are translated in close proximity, thereby mediating highly-selective, high-potency, co-translational modulation of a protein target, multiple protein targets, and / or a family of related protein targets, wherein in certain embodiments, the polynucleotide comprises additional nucleotide sequences for organ-and / or subcellular-specific expression of the polypeptide.The method of any one of claims 1-3, wherein the polypeptides are used as high-specificity recognizing moiety for numerous applications, including but not limited to applications traditionally performed by antibodies and small-molecule compounds, wherein the composition comprises at least one polypeptide and one or more other active molecules; in some embodiments, the polypeptides and the active molecules to be delivered are not covalently connected, while in other embodiments, the polypeptides and the active molecules are connected via covalent bonds with or without the use of linkers, and wherein:the polypeptides confer high-specific targeting for efficient delivery of the active molecules to the subject; and / orthe polypeptides confer both high-specific modulation of the protein target and high-specific targeting for efficient delivery of the active molecules to the subject, wherein the effectiveness of the composition is enhanced through both the selective binding of the polypeptides to modulate the protein targets, and the targeted delivery of the active molecules, reducing off-target effects on healthy cells; andoptionally, wherein:the polypeptides function as targeting agents, analogous to an antibody; and / orthe polypeptides function as targeting agents, analogous to small molecules; and / orthe active molecules comprise one or more drugs; and / orthe active molecules comprise degradation-promoting moieties; and / orthe active molecules comprise other organic or biological materials.The method of any one of claims 1-4, wherein:the protein target is a protein of any origin, including but not limited to human proteins, bacterial proteins, viral proteins, or man-made artificial proteins; and / orthe protein target is a single-domain or multi-domain protein; and / orthe protein target is a monomeric protein or oligomeric proteins (e.g., homo-oligomeric or hetero-oligomeric) ; and / orthe protein target is endogenous or exogenous to the subject; and / orthe protein target is of any native localization, intracellular or extracellular, membrane-bound or soluble; and / orthe native function of the protein target is dependent or independent of post-translational modifications.The method of any one of claims 1-5, wherein the modulation of a functional protein target is upregulated, downregulated, or maintained at a stable expression level, and the associated biological functions thereof is augmented, inhibited or kept at the standard level.The method of any one of claims 1-6, wherein modulating a protein target and / or associated biological functions thereof comprises preventing, treating, reducing the severity of, or postponing the onset of a condition or a disease in the subject, including but not limited to cancer, inflammation, autoimmune diseases, immunodeficiencies, and / or infections.The method of any one of claims 1-7, wherein additional amino acid sequences are included in the polypeptide sequence, non-limiting examples including: signal peptides and / or nucleus-localization signal and / or other subcellular-localization signals for targeted localization, sequences for enhanced or reduced immunogenicity, sequences for enhanced or reduced membrane permeability, sequences for enhanced or reduced cellular degradability, affinity tags such as FLAG tag for detection and / or purification purposes, and / or fluorescent tags for any purposes.A method for preparing a pharmaceutical composition for modulating one or more protein targets, wherein the pharmaceutical composition comprises at least one polypeptide or a polynucleotide encoding at least one polypeptide, wherein the polypeptide corresponds to one or more secondary-structural elements of the protein target and modulates the protein target regardless of the directionality of the amino acid sequence or the order of the secondary-structural elements, comprises the steps of:a) identifying secondary-structural elements of the protein target by utilizing three-dimensional structures of the protein target;b) designing the polypeptide based on the secondary-structural elements of the protein target, by including one or more secondary-structural elements within the polypeptide, wherein the secondary-structural elements are selected according to their probability of maintaining the three-dimensional secondary structures in isolation; said designing optionally including:i. varying the number or continuity of secondary-structural elements incorporated in the polypeptide, and / orii. introducing sequence modifications chosen from point mutation, circular permutation, truncation, deletion, insertion, and / or any combination thereof;c) preparing the designed polypeptide or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the designed polypeptide;d) testing the efficiency of modulation of the protein target by the designed polypeptide or a polynucleotide encoding the polypeptide in vivo, ex vivo and / or in cell-based systems for the ability to modulate the protein target or a family of related protein targets;e) selecting at least one polypeptide that meets a predefined potency and selectivity threshold; andf) specifying a pharmaceutical composition that comprises at least one selected polypeptide or a polynucleotide encoding at least one polypeptide together with at least one pharmaceutically acceptable carrier, thereby completing the design of the pharmaceutical composition.A method according to claim 9, wherein the polypeptide is a polypeptide according to any one of claims 2 to 8.The method of any one of claims 1-10, wherein the polypeptide contains an amino acid sequence corresponding to one or more secondary-structural elements of a protein target, wherein within the corresponding amino acid sequences, the shared amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequence of the protein target.A method for treating or preventing a disease and / or condition in a subject with a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising at least one polypeptide or at least a polynucleotide encoding at least one polypeptide, wherein the polypeptide corresponds to one or more secondary-structural elements of the protein target, wherein the amino acid identity of a selected polypeptide is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%or any value derivable therein, with the amino acid sequence of the protein target, .The method of claim 12, wherein the amino acid identity of a selected polypeptide with SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 13, 14, 15, 16, 17, 27, 28, 29, 30, 31, 34, 35, 54, 55, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, or 92 is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%or any value derivable therein, and wherein:the disease or condition is cancer, cardiovascular diseases, neurodegenerative diseases, chronic inflammation, metabolic disorders, ageing-related diseases, developmental disorders, and / or other related diseases, and wherein:the protein comprises Poly (ADP-ribose) polymerase 1; and / orthe protein comprises Poly (ADP-ribose) polymerase 1 homologues; and / orthe protein comprises Poly (ADP-ribose) polymerase 2; and / orthe protein comprises Poly (ADP-ribose) polymerase 3;the disease or condition is cancer, immunodeficiencies, inflammation, autoimmune diseases, developmental disorders, and / or other related diseases, and wherein:the protein comprises Bruton's tyrosine kinase; and / orthe protein comprises Bone Marrow Tyrosine Kinase Gene in Chromosome X; and / orthe protein comprises Tyrosine-protein kinase TEC; and / orthe protein comprises Tyrosine Kinase, also known as RLK -Resting Lymphocyte Kinase; and / orthe protein comprises Interleukin-2 Inducible T-cell Kinase;the disease or condition is cancer including brain tumors, immune disorders, leukemias and lymphomas, inflammatory diseases, developmental disorders, and / or related diseases, and wherein:the protein comprises Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor; and / orthe protein comprises KIT (CD117) ; and / orthe protein comprises Platelet-derived growth factor receptors alpha and beta; and / orthe protein comprises Fms-like tyrosine kinase 3;the disease or condition is cancer including brain tumors, immune disorders, leukemias and lymphomas, inflammatory diseases, and developmental disorders, and / or other related diseases, and wherein:the protein comprises Programmed death-ligand 1; and / orthe protein comprises Programmed death-ligand 2;the disease or condition is cancer, leukemias and lymphomas, and developmental disorders, and / or other related diseases, and wherein:the protein comprises Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1; and / orthe protein comprises Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 2;the disease or condition is cancer, autoimmune diseases, leukemias and lymphomas, inflammatory diseases, developmental disorders, and neurodegenerative disease, and / or other related diseases, and wherein:the protein comprises B-cell lymphoma 2; and / orthe protein comprises B-cell lymphoma 2 like proteins; and / orthe protein comprises B-cell lymphoma 2 like 1 (BCL-XL) ; and / orthe protein comprises B-cell lymphoma 2 like 2 (BCL-W) ; and / orthe protein comprises B-cell lymphoma 2 like 3 (MCL1) ; and / orthe protein comprises B-cell lymphoma 2 like 4 (BAX) ; and / orthe protein comprises B-cell lymphoma 2 like 5 (BCL2A1) ; and / orthe protein comprises B-cell lymphoma 2 like 7 (BAK1) ;the disease or condition is cancer, and / or other related diseases, and wherein:the protein comprises Beta-2 adrenergic receptor; and / orthe protein comprises Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit alpha; and / orthe protein comprises B-cell lymphoma 2 like 8 (BAD) ; and / orthe protein comprises Epidermal growth factor receptor; and / orthe protein comprises Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, p65 subunit; and / orthe protein comprises Signal transducer and activator of transcription 3; and / orthe protein comprises B-Raf proto-oncogene, serine / threonine kinase; and / orthe protein comprises Mitogen-activated protein kinase kinase 1; and / orthe protein comprises Extracellular signal-regulated kinase 2.The method of any one of claims 12-13, wherein:the disease or condition is cancer, cardiovascular diseases, neurodegenerative diseases, chronic inflammation, metabolic disorders, ageing-related diseases, developmental disorders, and / or other related diseases, and the polypeptide has an amino acid sequence identity of at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1～12, or a fragment or functional derivative thereof;the disease or condition is cancer, immunodeficiencies, inflammation, autoimmune diseases, developmental disorders, and / or other related diseases, and the polypeptide has an amino acid sequence identity of at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 13～26, or a fragment or functional derivative thereof;the disease or condition is cancer including brain tumors, immune disorders, leukemias and lymphomas, inflammatory diseases, developmental disorders, and / or related diseases, and the polypeptide has an amino acid sequence identity of at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 27～33, or a fragment or functional derivative thereof;the disease or condition is cancer including brain tumors, immune disorders, leukemias and lymphomas, inflammatory diseases, and developmental disorders, and / or other related diseases, and the polypeptide has an amino acid sequence identity of at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 34～53, or a fragment or functional derivative thereof;the disease or condition is cancer, leukemias and lymphomas, and developmental disorders, and / or other related diseases, and the polypeptide has an amino acid sequence identity of at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 54～66, or a fragment or functional derivative thereof;the disease or condition is cancer, autoimmune diseases, leukemias and lymphomas, inflammatory diseases, developmental disorders, and neurodegenerative disease, and / or other related diseases, and the polypeptide has an amino acid sequence identity of at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 67～76, or a fragment or functional derivative thereof;the disease or condition is cancer, autoimmune diseases, and / or other diseases, and the polypeptide has an amino acid sequence identity of at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, or any value derivable therein, with the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 84～102, or a fragment or functional derivative thereof.The method of any one of claims 1-14, further comprising:diagnosing the subject with the disease or condition; and / ordiagnosing the subject as having symptoms of the disease or condition; and / ordiagnosing the subject as being at risk of having the disease or condition; and / ormonitoring the progression of the disease or condition in the subject; and / orevaluating the effectiveness of a treatment regimen for the disease or condition in the subject; and / orpredicting the subject's response to a specific therapeutic intervention for the disease or condition; and / oridentifying potential therapeutic targets for the treatment of the disease or condition; and / orstratifying subjects based on the severity or subtype of the disease or condition; and / ordetermining the genetic predisposition of the subject to the disease or condition; and / orassessing the likelihood of disease recurrence or relapse in the subject; and / oridentifying biomarkers associated with the onset, progression, or resolution of the disease or condition in the subject; and / orcomparing the efficacy of multiple treatment modalities for the disease or condition in the subject.The method of any one of claims 1-15, wherein the subject is at high risk for having a disease or condition, does not have a disease or condition, has tested negative for a disease or condition, and / or was diagnosed as having a disease or condition, and optionally, wherein a disease or condition is prevented, reduced in severity, and / or delayed in onset upon administration of therapeutically effective amounts of a pharmaceutical composition.The method of any one of claims 1-16, wherein:a dose of between 0.1 to 1000 mg / kg or 0.1 to 1000 μg / kg body weight of the subject of the polypeptide is administered to the subject; and / orthe polypeptide is encoded in a polynucleotide, without or with a vector including but not limited to a viral vector, a non-viral vector, or a minicircle DNA vector, wherein a dose of between 1 x 103 to 1 x 1018 polynucleotide copies / kg body weight of the subject is administered to the subject, wherein the cells of the subject express the polypeptide under the guidance of the polynucleotide.The method of claim 17, wherein the polynucleotide comprises additional nucleic acid sequences to direct expression of the polypeptides at a desired location, include organ-specific promoters, tissue-specific promoters, cell type-specific promoters, inducible promoters, developmental stage-specific promoters, and pathogen-specific promoters.The method of any one of claims 1-18, wherein the composition further comprises one or more pharmaceutically acceptable carriers.The method of any one of claims 1-19, wherein:the composition is given as a single dose or in multiple doses; and / orthe subject receives the composition daily, several times a day, multiple times a week, multiple times a month, or multiple times a year; and / orthe composition is administered system-wide or directly to a specific area, including but not limited to, via the nose (intranasally) , through the veins (intravenously) , into the peritoneal cavity (intraperitoneally) , into the trachea (intratracheally) , into muscles (intramuscularly) , using endoscopy, through the skin (percutaneously) , beneath the skin (subcutaneously) , to a specific region (regionally) , into the brain (intracranially) , or through inhalation, injection, infusion, or perfusion.A method for detecting and / or isolating one or more proteins and / or protein families in a subject with an effective amount of a composition comprising at least one polypeptide or at least one polynucleotide encoding at least one polypeptide, wherein the polypeptide corresponds to one or more secondary-structural elements of one or more protein targets, wherein within the corresponding amino acid sequences, the amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, or 100%or any value derivable therein, with the amino acid sequences of one or more protein targets, wherein the polypeptide binds to one or more protein targets for highly selective detection or isolation.A method for investigating functions of one or more protein targets in a subject with an effective amount of a composition comprising at least one polypeptide or at least one polynucleotide encoding at least one polypeptide, wherein the polypeptide corresponds to one or more secondary-structural elements of one or more protein targets, wherein within the corresponding amino acid sequences, the amino acid identity is at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, or 100%or any value derivable therein, with the amino acid sequences of one or more protein targets, wherein these tunable, protein target-specific polypeptides may function as analogs to gene knockdown by RNA interference (RNAi) or gene knockout by CRISPR / Cas9 in vivo, in vitro, or ex vivo; wherein unlike genomic editing, the polypeptide-based strategy bypasses the need for DNA modification, reduces the time required for in vivo model development, enables reversible modulation, and avoids issues such as mosaicism or incomplete penetrance often encountered with genetic approaches.The method of any one of claims 1-22, wherein the “subject” refers to where the modulation by at least one polypeptide as disclosed herein takes place, including but not limited to living and / or non-living subjects, such as prokaryotic cells, eukaryotic cells and organisms including mammals and humans, protozoa, viruses, bacteria, bacteriophages, fungi, and plants;soil, rock, air and other environmental factors.

Images