Multispecific fusion proteins targeting angiogenic and inflammatory factors

Abstract

A fusion protein or an antigen-binding fragment or domain thereof comprises a pair of heavy chain and light chain of a VEGF antibody, a pair of heavy chain and light chain of an IL-6 or IL-6R antibody, and a single domain antibody or a binding polypeptide directed against Ang-2 that is linked to each of the VEGF antibody and the IL-6 or IL-6R antibody.

Description

MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS TARGETING ANGIOGENIC AND INFLAMMATORY FACTORSBACKGROUND OF THE INVENTION

[0001] The present invention relates to multispecific fusion proteins targeting angiogenic and inflammatory factors. In particular, the present invention relates to multispecific fusion proteins targeting signaling transduction by certain members of the family of vascular endothelial growth factors ( “VEGF” ) , interleukin-6 ( “IL-6” ) , and angiopoietin-2 ( “Ang-2” ) . More specifically, the present invention relates to multispecific antibody fusion proteins targeting VEGF-A, IL-6 or IL-6 receptor ( “IL-6R”) , and Ang-2. The present invention also relates to such fusion proteins, their uses, and processes for their production.

[0002] The major cellular components of the mammalian vascular system are the endothelium, smooth muscle cells, and pericytes. Endothelial cells form the lining of the inner surface of all blood vessels in the mammal and constitute a non-thrombogenic interface between blood and tissue. Therefore, the proliferation of endothelial cells is an important component for the development of new capillaries and blood vessels which, in turn, is a necessary process for the growth and / or regeneration of mammalian tissues.

[0003] In recent decades, a variety of signaling molecules have been identified as playing important roles in angiogenesis and increased vascular permeability (vascular leakage) . These signaling molecules include members of the VEGF family ( “VEGF family members” ) , angiopoietins, ephrin, Delta-like 4 ligand, and certain members of the interleukin family (such as IL-3, IL-6, IL-8, and IL-17) . VEGF family members of secreted polypeptides have been shown to play an extremely important role in promoting endothelial cell proliferation and angiogenesis. A pathological feature of uncontrolled angiogenesis caused by VEGF over-expression is increased vascular permeability, which results in fluid leakage into, and swelling of, the surrounding tissues. In mammals, this family consists of five related growth factors having highly conserved receptor-binding structure: vascular endothelial growth factors A-D ( “VEGF-A, ” “VEGF-B, ” “VEGF-C, ” and “VEGF-D” ) and placental growth factor ( “PlGF” ) . In this disclosure, this family of growth factors is also referred to as the VEGF family.

[0004] The cytokine interleukin-6 ( “IL-6” ) plays an important role in host defense against environmental stress such as infection and injury. Under physiological conditions, IL-6 is barely detectable, but its levels can increase more than 100, 000-fold during early phase of inflammation. However, not all occurrences of IL-6 stimulation are beneficial. Dysregulated, persistent production of IL-6 has been implicated in the development of various autoimmune and chronic inflammatory diseases. There has been evidence that unchecked production of IL-6 in inflamed tissues induces excess production of VEGF-A and VEGF-C. The levels of circulating IL-6 have been shown to be elevated in diseases such as rheumatoid arthritis, Castleman’s disease, Juvenile idiopathic arthritis, and Crohn’s Disease. Furthermore, a variety of tumor types have been shown to be stimulated by IL-6 (Keller et al., Front. Biosci., 1: 340-57 (1996) ) , including melanoma, renal cell carcinoma, Kaposi’s sarcoma, ovarian carcinoma, lymphoma, leukemia, multiple myeloma, and prostate carcinoma. In addition, increased circulating levels of IL-6 have been reported in several types of cancers.

[0005] The IL-6 signaling cascade is initiated by IL-6 binding to IL-6R and a second transmembrane protein, gp130, which serves as a signal transducer of IL-6 (Kang et al., Immunity, 50: 1007-1023 (2019) ; Kishimoto, Ann. Rev. Immunol., 23: 1-21 (2005) ) . Although IL-6R expressions are restricted to cells such as hepatocytes, monocytes, and lymphocytes, gp130 is ubiquitously expressed, potentially explaining the pleiotropic functions of IL-6. IL-6R exists in an 80 kDa transmembrane form and a 50–55 kDa soluble form (sIL-6R) . After formation of a complex between IL-6 and the membrane or soluble form of IL-6R, several modes of gp130 activation are initiated, including classic IL-6R signaling, trans-signaling and trans-presentation. Classic IL-6R signaling is mediated by membrane-bound IL-6R (mIL-6R) and gp130. IL-6 can also bind to soluble IL-6Rs (sIL-6Rs) that are generated via cleavage of mIL-6R by the proteases ADAM10 (a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10) and ADAM17 or by translation from an alternatively spliced IL6R mRNA. The IL-6-sIL-6R complex then binds to membrane-bound gp130 on cells that do not express IL-6R on the surface, a process known as trans-signaling. A third mode of gp130 activation termed IL-6 trans-presentation involves specialized dendritic cells. This process, whereby the bound form of IL-6 and mIL-6R on dendritic cells is presented to gp130-expressing T cells and is required for priming of pathogenic T helper 17 (Th17) cells. Neutralization of IL-6 inhibits both classic and trans-signaling of IL-6. Anti-IL-6R antibodies such as tocilizumab block all three modes of IL-6 signaling, whereas soluble gp130 (sgp130) blocks IL-6 trans-signaling by binding to the IL-6-sIL-6R complex.

[0006] IL-6 plays a role in immunogenicity and inflammation in both systemic and ocular immune-mediated diseases, including juvenile idiopathic arthritis and non-infectious uveitis (NIU) . Elevated IL-6 levels have been found in ocular fluids including aqueous fluid or vitreous in patients with NIU and multiple ocular diseases such as diabetic macular edema (DME) , diabetic retinopathy (DR) , ischemic central or branch retinal vein occlusion (CRVO or BRVO) and neovascular age-related macular degeneration (nAMD) (Yang et al., Int. J. Mol. Sci., 24 (5) : 4676 (2023) ) . In addition to its role in inflammation, IL-6 also plays a role in the production of VEGF, resulting in angiogenesis and vascular permeability.

[0007] The bloodretinal barrier breakdown is a key part of pathogenesis in retinal diseases such as DME and macular edema secondary to retinal vein occlusion and NIU, leading to progressive vision loss. IL-6 has been shown to play a role in damaging the barrier function of retinal endothelial cells, allowing vascular leakage by downregulating tight junction proteins. IL-6 normally mediates the recruitment of leukocytes by increasing intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) to promote adhesion of inflammatory cells to the vascular endothelium. In patients with diabetic retinopathy, elevated levels of ICAM-1 and VCAM-1 have been detected, likely due to increased IL-6 activation. In addition, elevated IL-6 and other cytokines have been demonstrated in proliferative diabetic retinopathy. In nAMD, the role of IL-6 is closely tied to the dysfunction of endothelium, oxidative damage and increased expression of VEGF, leading to abnormal vessel growth and macular edema due to increased vascular permeability.

[0008] The angiopoietin / Tie ligand / receptor system has a key regulatory role in regulating vascular integrity and quiescence. Besides its role in angiogenesis, it is an important regulator in numerous diseases including inflammation. The most important members of the angiopoietin family are Ang-1 and Ang-2. Ang-1-mediated Tie-2 activation is required to maintain the quiescent resting state of the endothelium. Agonistic Ang-1 functions are antagonized by Ang-2, which is believed to inhibit Ang-1 / Tie-2 signaling. Ang-2 destabilizes the quiescent endothelium and primes it to respond to exogenous stimuli, thereby facilitating the activities of inflammatory and angiogenic cytokines. It has been shown that Ang-2 promotes the proangiogenic action of VEGF and that VEGF up-regulates Ang-2 expression in endothelial cells.

[0009] The VEGF-family growth factors act through a family of cognate receptor tyrosine kinases, which exist only on the surface of vascular endothelial cells, to stimulate formation of blood vessels: VEGF receptor-1 ( “VEGFR-1, ” also known as “flt-1” ) , VEGF receptor-2 ( “VEGFR-2, ” also known as “KDR” in humans and “flk-1” in mice) , VEGF receptor-3 ( “VEGFR-3, ” also known as “flt-4” ) .

[0010] VEGF-A (also sometimes simply referred to as VEGF) has emerged as the most important member of this family of growth factors. Human VEGF-A is expressed in a variety of tissues as multiple homodimeric forms (121, 145, 165, 183, 189 and 206 amino acids per monomer) , wherein each form arises because of alternative splicing of a single RNA transcript.

[0011] Since VEGFs promote vascular endothelial cell proliferation and angiogenesis, they may be useful for the therapeutic treatment of numerous conditions in which a growth-promoting activity on the vascular endothelial cells is beneficially important, for example, in treatment of ulcers, vascular injuries, and myocardial infarction.

[0012] In contrast, however, while vascular endothelial proliferation is desirable under certain circumstances, vascular endothelial proliferation and angiogenesis are also undesirable components of a variety of diseases and disorders including tumor growth and metastasis, rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic retinopathy, retrolental fibroplasia, neovascular glaucoma, neovascular age-related macular degeneration, hemangiomas, immune rejection of transplanted corneal tissue and other tissues, and chronic inflammation. In individuals suffering from any of these disorders, one would want to inhibit, or at least substantially reduce, the endothelial proliferating activity of the aforementioned angiogenic factors.

[0013] Each of flt-1, KDR, and flt-4 tyrosine kinase receptors has seven extracellular immunoglobulin-like ( “Ig-like” ) domains that are available for ligand binding, a transmembrane domain that serves to anchor the receptor on the surface of cells in which it is expressed, and an intracellular catalytic tyrosine kinase domain. Flt-1 binds VEGF-A, VEGF-B, and PlGF. KDR binds VEGF-A, VEGF-C, and VEGF-D. Flt-4 binds VEGF-C and VEGF-D.

[0014] In view of the role of the growth factors of the VEGF family in vascular endothelial proliferation and angiogenesis, and the role that these processes play in many different diseases and disorders, treatments have been devised that target the control of these growth factors. However, anti-VEGF therapy alone has not been able to block completely the progression of angiogenic diseases.

[0015] Therefore, it is desirable to have a pharmacological means for more completely reducing or inhibiting one or more biological activities of the growth factors as described above in patients whose pathological conditions are rooted in aberrant angiogenesis, excessive angiogenesis, increased vascular permeability, and / or inflammation. It is also desirable to have a pharmacological means for improved treatment or control of pathological conditions that are rooted in aberrant angiogenesis, excessive angiogenesis, increased vascular permeability, and / or inflammation.SUMMARY OF THE INVENTION

[0016] As used herein, the term “control” also includes reduction, alleviation, amelioration, or prevention.

[0017] In general, the present invention provides multispecific fusion or chimeric proteins, methods of producing and compositions comprising the same, and methods for treating or controlling at least a pathological condition in a subject, which condition has etiology in at least one of aberrant angiogenesis (including excessive angiogenesis) , increased vascular permeability (vascular leakage) , and / or inflammation. In this disclosure, a “fusion protein” may be referred to as a “chimeric protein” for its inclusion of components from different origins.

[0018] In one aspect, a multispecific fusion protein of the present invention comprises components targeting signaling transduction by selected members of the VEGF family, IL-6, and Ang-2.

[0019] In another aspect, a multispecific fusion protein of the present invention comprises a VEGF-binding unit, an IL-6-or IL-6R-binding unit, and an Ang-2-binding unit. A VEGF-binding unit is a polypeptide or protein that is capable of binding, or substantially binding, to one or more VEGF family members. An IL-6-binding unit is a polypeptide or protein that is capable of binding, or substantially binding, to IL-6. An IL-6R-binding unit is a polypeptide or protein that is capable of binding, or substantially binding, to IL-6R. An Ang-2-binding unit is a polypeptide or protein that is capable of binding, or substantially binding, to Ang-2.

[0020] In another aspect, such multispecific fusion protein is a multispecific antibody fusion protein.

[0021] In another aspect, such multispecific antibody fusion protein is a trispecific fusion protein.

[0022] In still another aspect, the present invention provides a multispecific fusion or chimeric proteins, or antigen-binding fragments or antigen-binding domains thereof that are capable of binding substantially to one or more VEGF family members, IL-6 or IL-6R, and Ang-2; thereby, concurrently reducing or inhibiting signaling transduction by said one or more VEGF family members, IL-6 or IL-6R, and Ang-2.

[0023] In yet another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises VEGF-, IL-6-or IL-6R-, and Ang-2-binding units that are linked together. The term “linked” (or derivatives thereof) as used herein means connected by covalent bonds, ionic bonds, or otherwise associated by physical or chemical interactions. Such binding units comprise, consist of, or consist essentially of antigen-binding domains or moieties that target one or more VEGF family members, IL-6 or IL-6R, and Ang-2.

[0024] In yet another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises VEGF-A-, IL-6-or IL-6R-, and Ang-2-binding units that are linked together. Such binding units comprise, consist of, or consist essentially of antigen-binding domains or moieties that target VEGF-A, IL-6 or IL-6R, and Ang-2. As used herein, the terms “VEGF-A” includes all isoforms of VEGF-A.

[0025] In still another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises a heterodimer formed from a VEGF-A-binding unit and an IL-6-or IL-6R-binding unit, and two Ang-2-binding units, each of the VEGF-A-binding unit and the IL-6 or IL-6R-binding unit being linked to an Ang-2-binding unit. The Ang-2-binding units may be the same or different.

[0026] The present invention also provides an antigen-binding fragment or domain of such fusion proteins.

[0027] In one aspect, each of the VEGF-A-binding unit and the IL-6-or IL-6R-binding unit comprises a variable domain and a constant domain of a heavy chain and a light chain (comprising a variable domain and a constant domain) of an antibody against VEGF-A ( “VEGF-A antibody” ) and IL-6 or IL-6R ( “IL-6 or IL-6R antibody” ) , respectively.

[0028] In another aspect, the constant domain of the heavy chain of said antibody comprises a modified CH3 domain of human IgG1, wherein certain amino acid residues are replaced according to the “knobs-into-holes” technology to increase, enhance, improve, or favor the heterodimerization of the VEGF-A-and the IL-6-or IL-6R-binding units. Such technology is disclosed in, for example, US Patents 5,731,168; 5,821,333; 7,642,228; 7,695,936; 8,216,805; and 8,679,785, which are incorporated herein by reference in their entireties (also in Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621 (1996) disclosed therein) .

[0029] In still another aspect, the CH3 domain of an antibody (e.g., against VEGF-A) is modified as follows: Y349C and T366W. The CH3 domain of the other antibody (e.g., against IL-6 or IL-6R) is modified as follows: S354C, T366S, L368A, and Y407V. The foregoing amino acid positions are numbered according to the EU numbering system (see; e.g., https:  / / www. imgt. org / IMGTScientificChart / Numbering / Hu_IGHGnber. html) .

[0030] In some embodiments, the CH1 domain of the heavy chain and the CL domain of the light chain of the IL-6 or IL-6R antibody are interchanged. Thus, in these embodiments, the heavy chain of the IL-6-or IL-6R-binding unit comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the domains VH, CL, hinge, CH2, and CH3. The light chain of the IL-6-or IL-6R-binding unit comprises, from the N-terminus to the C terminus, the domains VL and CH1.

[0031] In yet another aspect, an Ang-2-binding unit comprises an antibody or a biologically active polypeptide that is capable of binding, or binding substantially, to Ang-2. In the present disclosure, the term “antibody” encompasses, without limitation, full-length antibodies, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, single-chain FV antibodies (scFV) , Fab antibodies, Fab’a ntibodies, (Fab’ ) 2 antibodies, single-domain antibodies (sdAbs, also known as nanobodies) , minibodies, maxibodies, diabodies, and peptibodies.

[0032] In still another aspect, an Ang-2-binding unit comprises a single-domain antibody against Ang-2 ( “Ang-2 sdAb” ) or a biologically active polypeptide that is capable of binding, or binding substantially, to Ang-2 ( “Ang-2-binding peptide” ) . Single-domain antibody is also known as nanobody or referred to as VHH.

[0033] In some embodiments, each of the C-terminuses of the heavy chains of the VEGF-A-and IL-6-or IL-6R-binding units is linked to the N-terminus of an Ang-2-binding unit. In some other embodiments, each of the N-terminuses of the light chains of the VEGF-A-and IL-6-or IL-6R-binding units is linked to the C-terminus of an Ang-2-binding unit. In one aspect, each of the N-terminuses of the light chains of the VEGF-A-and IL-6-or IL-6R-binding units is linked to the C-terminus of an Ang-2 sdAb.

[0034] In yet another aspect, an sdAb against Ang-2 or an antigen-binding fragment or domain thereof, comprises the heavy-chain variable region of a heavy-chain antibody against Ang-2. Such an sdAb can bind specifically to Ang-2 without requiring a complementary variable region as in a conventional four-chain immunoglobulin molecule.

[0035] In still another aspect, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding an antibody fusion or chimeric protein.

[0036] In still another aspect, the present invention provides a vector that comprises said nucleic acid molecule, including an expression vector comprising said nucleic molecule operatively linked to an expression control sequence. As used herein, the phrase “operatively linked” refers to components of a construct being placed in a functional relationship with each other and each component retaining its function. A nucleic acid is “operatively linked” when it is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, DNA for a pre-sequence or secretory leader is “operatively linked” to DNA encoding a polypeptide if it is expressed as a pre-protein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operatively linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operatively linked to a coding sequence if it is positioned so as to facilitate translation.

[0037] In still another aspect, the present invention provides a host-vector system for the production of said antibody fusion or chimeric protein that comprises the expression vector in a suitable host cell.

[0038] In another aspect, the present invention provides a method of producing an antibody fusion or chimeric protein, which method comprises: (a) growing cells of the host-vector system under conditions permitting production of the antibody fusion or chimeric protein; and (b) recovering the antibody fusion or chimeric protein so produced. Such method can further comprise purifying the antibody fusion or chimeric protein.

[0039] In still another aspect, the present invention provides a method for treating or controlling, or a composition for use to treat or control, at least a disease, condition, or disorder, in a subject, which has etiology in a condition selected from the group consisting of aberrant angiogenesis (including excessive angiogenesis) , increased vascular leakage, inflammation, and combinations thereof. In yet another aspect, said at least a disease, condition, or disorder has etiology in a condition selected from the group consisting of excessive angiogenesis, increased vascular leakage, inflammation, and combinations thereof.

[0040] In certain embodiments, such disease, condition, or disorder is an ocular disease, condition, or disorder. In certain other embodiments, such disease, condition, or disorder involves tumor growth and metastasis. In other embodiments, such disease, condition, or disorder is rheumatoid arthritis, psoriasis, or atherosclerosis.

[0041] Other features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description and claims.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0042] Figure 1 shows a schematic diagram of the first embodiment of the present invention.

[0043] Figure 2 shows a schematic diagram of the second embodiment of the present invention.

[0044] Figure 3 shows a schematic diagram of the third embodiment of the present invention.

[0045] Figure 4 shows a schematic diagram of the fourth embodiment of the present invention.

[0046] Figure 5 shows a schematic diagram of the fifth embodiment of the present invention.

[0047] Figure 6 shows a schematic diagram of the sixth embodiment of the present invention.

[0048] Figure 7 shows a schematic diagram of the seventh embodiment of the present invention.

[0049] Figure 8 shows a schematic diagram of the eighth embodiment of the present invention.

[0050] Figure 9 shows a schematic diagram of the ninth embodiment of the present invention.

[0051] Figure 10 shows a schematic diagram of the tenth embodiment of the present invention.

[0052] Figures 11A and B show the purities of a representative antibody fusion protein that was expressed in Chinese hamster ovarian ( “CHO” ) cells. With one round of purification using AmMagTM Protein A magnetic beads, a purity of 66.4%was achieved. With the second round of purification by size exclusion chromatography using HiLoad 16 / 600 Superdex 200pg preparative SEC columns, a purity of 96.5%was achieved.

[0053] Figures 12 and 13 show ELISA binding affinities of some antibody fusion proteins of the present invention for human VEGF-A165, wherein aflibercept and faricimab were used as comparators. Aflibercept is an Fc fusion protein containing the binding domain 2 of VEGFR-1 and the binding domain 3 of VEGFR-2 for inhibition of VEGF-A, VEGF-B and PlGF. Faricimab is a bispecific antibody that inhibits VEGF-A and Ang-2. Aflibercept and faricimab have been approved for intravitreal injections to treat retinal vascular diseases including neovascular age-related macular degeneration (nAMD) , diabetic macular edema (DME) , and macular edema due to retinal vein occlusion (RVO) .

[0054] Figures 14 and 15 show ELISA binding affinities of some antibody fusion proteins of the present invention for human IL-6, wherein vamikibart, a preclinical stage monoclonal antibody against IL-6, was used as a comparator.

[0055] Figures 16 and 17 show ELISA binding affinities of some antibody fusion proteins of the present invention for human IL-6R, wherein tocilizumab, a monoclonal antibody against IL-6R, was used as a comparator. Tocilizumab has been approved for the treatment of inflammatory diseases including moderate and severe rheumatoid arthritis, active polyarticular or systemic juvenile idiopathic arthritis, giant cell arteritis, scleroderma with interstitial lung disease, coronavirus disease 2019 (COVID-19) , and cytokine release syndrome.

[0056] Figures 18 and 19 shows ELISA binding affinities of some antibody fusion proteins of the present invention for human Ang-2, wherein faricimab, a bispecific antibody that inhibits VEGF-A and Ang-2, was used as a comparator. Faricimab has been approved for the treatment of retinal vascular diseases including nAMD, DME, and macular edema due to RVO.

[0057] Figure 20 shows ELISA binding affinities of some antibody fusion proteins of the present invention for human Ang-1, wherein a recombinant human Tie-2 receptor that can bind to both Ang-1 and Ang-2, was used as a positive control. All test antibody fusion proteins did not bind to Ang-1.

[0058] Figure 21 shows the effects of some antibody fusion proteins of the present invention on inhibiting VEGF-A165-mediated VEGFR-2 signaling, wherein aflibercept and faricimab were used as two comparators. Aflibercept is an Fc fusion protein containing the binding domain 2 of VEGFR-1 and the binding domain 3 of VEGFR-2 for inhibition of VEGF-A, VEGF-B and PlGF. Faricimab is a bispecific antibody that inhibits VEGF-A and Ang-2. Aflibercept and faricimab have been approved for intravitreal injections to treat retinal vascular diseases including nAMD, DME, and macular edema due to RVO.

[0059] Figure 22 shows the effects of some antibody fusion proteins of the present invention on inhibiting IL-6 mediated TF-1 cell proliferation, wherein vamikibart, a preclinical stage monoclonal antibody against IL-6, was used as a comparator.

[0060] Figure 23 shows the effects of some antibody fusion proteins of the present invention on inhibiting IL-6 mediated TF-1 cell proliferation, wherein tocilizumab, a monoclonal antibody against IL-6R, was used as a comparator. Tocilizumab has been approved for the treatment of inflammatory diseases including moderate and severe rheumatoid arthritis, active polyarticular or systemic juvenile idiopathic arthritis, giant cell arteritis, scleroderma with interstitial lung disease, COVID-19, and cytokine release syndrome.

[0061] Figure 24 shows the effects of some antibody fusion proteins of the present invention on inhibiting Ang-2 / Tie-2 interaction, wherein faricimab and nesvacumab were used as two comparators. Faricimab is a bispecific antibody that inhibits VEGF-A and Ang-2 and has been approved for intravitreal injections to treat retinal vascular diseases including nAMD, DME, and macular edema due to RVO. Nesvacumab is a preclinical stage monoclonal antibody against Ang-2.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0062] The terms “protein, ” “polypeptide, ” and “peptide” are used interchangeably herein to refer to a polymer of amino acid residues.

[0063] In general, the present invention provides a multispecific fusion or chimeric protein or an antigen-binding fragment or domain thereof that is capable of binding, or binding substantially, to one or more VEGF family members, IL-6 or IL-6R, and Ang-2; thereby, concurrently reducing or inhibiting signaling transduction by said one or more VEGF family members, IL-6 or IL-6R, and Ang-2.

[0064] In one aspect, the multispecific fusion or chimeric protein is an antibody fusion or chimeric protein.

[0065] In this disclosure, the term “antibody fusion protein” may be used in place of “antibody fusion or chimeric protein. ”

[0066] In one aspect, a fusion protein or an antigen-binding fragment thereof is a trispecific fusion protein capable of binding, or substantially binding, to one or more VEGF family members, IL-6 or IL-6R, and Ang-2; thereby, concurrently reducing or inhibiting signaling transduction by such VEGF family members, IL-6 or IL-6R, and Ang-2.

[0067] In another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises binding units that target one or more VEGF family members, IL-6 or IL-6R, and Ang-2 and are linked together. Such binding units comprise, consist of, or consist essentially of antigen-binding domains or moieties that target one or more VEGF family members, IL-6 or IL-6R, and Ang-2. In yet another aspect, such a multispecific fusion or chimeric protein is a trispecific fusion or chimeric protein.

[0068] In still another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises a VEGF-A-, IL-6-or IL-6R-, and Ang-2-binding units that are linked together.

[0069] In still another aspect, a multispecific fusion protein of the present invention does not bind to Ang-1. In another aspect, a multispecific fusion protein of the present invention has an affinity to Ang-1 that is less than about 10-3 times the affinity to Ang-2.

[0070] In another aspect, a multispecific fusion protein of the present invention comprises a heterodimer comprising a VEGF-A-binding unit linked to an IL-6 or IL-6R-binding unit, and two Ang-2-binding units, wherein one of the Ang-2-binding units is linked to the VEGF-A-binding unit, and the other Ang-2-binding unit to the IL-6 or IL-6R-binding unit. The two Ang-2-binding units may be the same or different.

[0071] In still another aspect, an Ang-2-binding unit is linked to the VEGF-A-or the IL-6-or IL-6R-binding unit directly or through a flexible linker. Flexible linkers are typically peptides having various lengths (e.g., 50 or fewer amino acid residues) that may be used. Non-limiting examples of peptide linkers may be those comprising or consisting of a motif of (GGGGS) x (x=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10) . Specific examples of such flexible linkers include GGGGSGGGGSGGGGS, GGGGSGGGGS, and GGGGSGGGS. Other non-limiting examples of peptide linkers may be those comprising or consisting of a motif of (GxS) nGm (x=3, n=8, 9, or 10 and m=0, 1, 2, or 3) or (x=4, n=6, 7, or 8 and m=0, 1, 2, or 3) .

[0072] In one aspect, each of the VEGF-A-binding unit and the IL-6-or IL-6R-binding unit comprises a variable domain and a constant domain of a heavy chain and a light chain of an antibody against the respective ligand. In another aspect, said binding unit comprises a full-length heavy chain and a full-length light chain of the respective antibody. In still another aspect, said full-length heavy chain comprises a heavy-chain variable domain ( “VH” ) directed against the respective ligand and a heavy-chain constant domain CH of human IgG1, which comprises CH1, CH2, and CH3 domains, or a modified thereof, and said full-length light chain comprises a light-chain variable domain ( “VL” ) directed against the respective ligand and a light-chain constant domain CL of human IgG1. The amino acid sequence of the CH1 domain, Fc domain of human IgG1 (comprising the CH2 and CH3 domains) , and CL domain of human IgG1 are shown in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively.

[0073] A non-limiting example of VEGF-A antibodies is bevacizumab, disclosed in US Patent 7,169,901, which is incorporated herein by reference in its entirety. The amino acid sequences of the heavy chain and light chain of bevacizumab are shown in SEQ ID NOs: 4 and 5, respectively. In some embodiments of the multispecific fusion proteins of the present invention, a pair of the heavy chain and light chain of bevacizumab comprises the VEGF-A-binding unit. In some other embodiments, the VH domain of bevacizumab may be replaced by that of ranibizumab to form the heavy chain of VEGF-A-binding unit. The VH and VL domains of ranibizumab are disclosed in US Patents 6,884,879 and 7,060,269 (see SEQ ID NOs: 111 and 112 therein, respectively) , which are incorporated herein by reference in their entireties. Additional non-limiting examples of heavy-chain and light-chain variable domains of other VEGF-A antibodies are disclosed in US Patent 7,667,004, which is incorporated herein by reference in its entirety. Any of such VHs and VLs may be linked to the CH domain of human IgG1 and the CL domain of human IgG1, respectively to form a VEGF-A-binding unit of a multispecific fusion protein of the present invention.

[0074] In one aspect, a VEGF-A-binding unit of a multispecific fusion protein of the present invention comprises heavy-chain complementarity-determining regions ( “CDRs” ) (HCCDR1, HCCDR2, and HCCDR3) and light-chain CDRs (LCCDR1, LCCDR2, and LCCDR3) of bevacizumab, shown in SEQ ID NOs: 6-11, respectively. Other VEGF-A-binding units of multispecific fusion proteins of the present invention can comprise HCCDR1, HCCDR2, HCCDR3, LCCDR1, LCCDR2, and LCCDR3 of ranibizumab or those disclosed in US Patent 7,667,004.

[0075] In another aspect, an IL-6 or IL-6R-binding unit of a multispecific fusion protein of the present invention comprises a pair of heavy chain and light chain of a full-length IL-6 or IL-6R antibody. Non-limiting examples of IL-6 antibodies that can be used to construct a multispecific fusion protein of the present invention include vamikibart (also known as RG6179) , olokizumab, siltuximab, sirukumab, clazakizumab (also known as ALD-518 or BMS-945429) , ziltivekimab (also known as MEDI 5117) , Medarex, and those disclosed in US Patents 8,992,920 and 10,858,424 and US Patent Application Publications 20190270806 and 20240209076.

[0076] The amino acid sequences of the heavy chains and light chains of some exemplary IL-6 antibodies are as follows.

[0077] The amino acid sequences of the heavy chain and light chain variable domains of clazakizumab (also known as ALD-518) are shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively (see WO2011 / 066371 at paragraph 0029) .

[0078] Non-limiting examples of IL-6R antibodies that can be used to construct a multispecific fusion protein of the present invention include tocilizumab (described in; e.g, US Patents 10,323,095; 7,479,543; and 5,795,965) , sarilumab (described in; e.g., US Patent 7,582,298) , and satralizumab (described in; e.g., US Patent 8,562,991) . Additional non-limiting examples of IL-6R antibodies are disclosed in US Patents 8,753,634 (to Apexigen, Inc. ) and 8,748,581 (to Ablynx N.V. ) . The foregoing patents are incorporated herein by reference in their entireties. The amino acid sequences of the heavy and light chains of tocilizumab, sarilumab, and satralizumab are as follows.

[0079] In still another aspect, an Ang-2-binding unit comprises an Ang-2 sdAb or an Ang-2-binding peptide.

[0080] Non-limiting examples of Ang-2-binding peptides include those having SEQ ID NOs: 32-37, disclosed herein below. Other non-limiting examples of Ang-2-binding peptides include those disclosed in US Patents 7,138,370 and 7,205,275 and US Patent Application Publication 20130142799, which are incorporated herein by reference in their entireties.

[0081] In some embodiments, each of the C-terminuses of the heavy chains of the VEGF-A-and IL-6-or IL-6R-binding units is linked to the N-terminus of an Ang-2-binding unit. In some other embodiments, each of the N-terminuses of the light chains of the VEGF-A-and IL-6-or IL-6R-binding units is linked to the C-terminus of an Ang-2-binding unit. In one aspect, each of the N-terminuses of the light chains of the VEGF-A-and IL-6-or IL-6R-binding units is linked to the C-terminus of an Ang-2 sdAb.

[0082] In another aspect, an Ang-2 sdAb or an antigen-binding fragment or domain thereof, comprises the heavy-chain variable region of a heavy-chain antibody (VHH) against Ang-2. Such an sdAb can bind specifically to Ang-2 without requiring a complementary variable region as in a conventional four-chain immunoglobulin molecule.

[0083] As disclosed herein, an “antigen-binding fragment or domain” of an antibody refers to a fragment or portion of such antibody, which fragment or portion is capable of binding, or binding substantially, to the antigen. In one embodiment, an antigen-binding fragment or domain of such antibody comprises, consists essentially of, or consists of a variable domain of the heavy chain (VH) of such antibody.

[0084] An Ang-2 sdAb included in some embodiments of the present invention consists of three CDRs of an antibody heavy chain, each CDR being flanked by framework domains. Such sdAb lacks the CH1 domain of the antibody heavy chain. Despite possessing only three CDRs, sdAbs show equivalent antigen-binding affinity and other effector functions compared to conventional antibodies comprising six CDRs (three CDRs of the heavy chain and three CDRs of the light chain) . Single-domain antibodies are described, for example, in Bathula et al., Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, Vol. 36, No. 2, 109-122 (2021) , Tang et al., Int. J. Mol. Sci., Vol. 24, 4176-4194 (2023) .

[0085] The present inventors generated Ang-2 sdAbs in a discovery program, the amino acid sequences of eight of which are shown in SEQ ID NO: 38 through SEQ ID NO: 45. Other Ang-2 sdAbs that may be used to construct a fusion protein of the present invention are disclosed, for example, in US Patent 9,527,925 (to Boehringer Ingelheim GmbH) , which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0086] An Ang-2 sdAb included in embodiments of the present invention is capable of binding to Ang-2 with an equilibrium dissociation constant (KD) in the range from about 1x10-6 M to 1x10-12 M. In some embodiments, the Ang-2 sdAb is capable of binding to its Ang-2 with KD in the range from about 1x10-7 M to about 1x10-12 M. In some other embodiments, the Ang-2 sdAb is capable of binding to Ang-2 with KD in the range from about 1x10-8 M to about 1x10-12 M. In still some embodiments, the Ang-2 sdAb is capable of binding to Ang-2 with KD in the range from about 1x10-9 M to about 1x10-12 M. Modification of the VEGF-A-and IL-6 or IL-6R-binding Units

[0087] In one aspect, each of the VEGF-A-binding unit and the IL-6-or IL-6R-binding unit comprises a variable domain and a constant domain of a heavy chain and a light chain of an antibody against the respective ligand. In another aspect, said binding unit comprises a full-length heavy chain and a full-length light chain of the respective antibody. In still another aspect, said full-length heavy chain comprises a heavy-chain variable domain (VH) directed against the respective ligand and a heavy-chain constant domain CH of human IgG1, which comprises CH1, CH2, and CH3 domains, or a modified domain thereof, and said full-length light chain comprises a light-chain variable domain (VL) directed against the respective ligand and a light-chain constant domain CL of human IgG1.

[0088] In another aspect, the constant domain of the heavy chain of said antibody comprises a modified CH3 domain of human IgG1, wherein certain amino acid residues are replaced according to the “knobs-into-holes” technology to increase, enhance, improve, or favor the heterodimerization of the VEGF-A-and the IL-6-or IL-6R-binding units.

[0089] In still another aspect, the CH3 domain of either antibody heavy chain can be modified by mutating certain amino acid residues to form a “knob” (the “knob CH3 domain” ) , and the CH3 domain of the other antibody to form a “hole” (the “hole CH3 domain” ) . In addition, an amino acid residue in the CH3 domain is changed to a cysteine residue so to result in a disulfide bridge between the two CH3 domains for stabilization of the heterodimer comprising the VEGF-A-and the IL-6 or IL-6R-binding units, and for increased yield of the heterodimer.

[0090] In one aspect, an amino acid residue in a first CH3 domain is replaced with another amino acid having a larger side chain volume, thereby generating a protuberance (a knob) within the interface of the CH3 domain (the knob CH3 domain) that is positionable or receivable in a cavity (a hole) of a second CH3 domain (the hole CH3 domain) . An amino acid residue in the second CH3 domain is replaced with an amino acid having a smaller side chain volume, thereby generating said cavity within the interface of the hole CH3 domain, within which the knob of the knob CH3 domain is positionable or receivable.

[0091] Said amino acid having a larger side chain volume is selected from the group consisting of arginine (R) , phenylalanine (F) , tyrosine (Y) , and tryptophan (W) . Said amino acid having a smaller side chain volume is selected from the group consisting of alanine (A) , serine (S) , theonine (T) , and valine (V) .

[0092] In addition, both CH3 domains are modified by the introduction of cysteine (C) in the corresponding positions such that a disulfide bridge between both CH3 domains can be formed.

[0093] In one aspect, the first CH3 domain (e.g., of an antibody against VEGF-A) is modified to form the knob CH3 domain as follows: Y349C and T366W. The second CH3 domain (e.g., of an antibody against IL-6 or IL-6R) is modified to form the CH3 hole domain as follows: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V. The foregoing amino acid positions are numbered according to the EU numbering system (see; e.g., https:  / / www. imgt. org / IMGTScientificChart / Numbering / Hu_IGHGnber. html) . Other mutations can be made, such as K / R409D, K370E, and / or K439E for the knob CH3 domain, and D399K, E357K, and / or E356K for the hole CH3 domain, as described in US Patents 10,011,858 and 11,1168,344, which are incorporated herein by reference in their entireties. Similarly, the first CH3 domain can be the CH3 domain of an antibody against IL-6 or IL-6R, and the second CH3 domain can be the CH3 domain of an antibody against VEGF-A.

[0094] In some embodiments, the CH1 domain of the heavy chain and the CL domain of the light chain of the IL-6 or IL-6R antibody are interchanged. Thus, in these embodiments, the heavy chain of the IL-6-or IL-6R-binding unit comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the domains VH, CL, hinge, CH2, and CH3. The light chain of the IL-6-or IL-6R-binding unit comprises, from the N-terminus to the C terminus, the domains VL and CH1.

[0095] In some other embodiments, the CH1 domain of the heavy chain and the CL domain of the light chain of the VEGF-A antibody are interchanged. Thus, in these embodiments, the heavy chain of the VEGF-A-binding unit comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the domains VH, CL, hinge, CH2, and CH3. The light chain of the VEGF-A-binding unit comprises, from the N-terminus to the C terminus, the domains VL and CH1.

[0096] In one aspect, a multispecific fusion protein of the present invention comprises: (1) a first binding unit that comprises a heavy chain and a light chain of a first antibody specifically binding to a first antigen; (2) a second binding unit that comprises a heavy chain and a light chain of a second antibody specifically binding to second antigen; and (3) two third binding units specifically binding to a third antigen; wherein a CH3 domain of the first antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the second antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and each of the third binding units is linked to the first and the second antibody, respectively; and wherein amino acid residues in an antibody heavy chain are numbered according to the EU numbering system (disclosed herein above) . In other words, one of the third binding units is linked to the first binding unit, and the other third binding unit is linked to the second binding unit. The first and second binding units form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains.

[0097] In another aspect, a multispecific fusion protein of the present invention comprises: (1) a first binding unit that comprises a heavy chain and a light chain of a first antibody specifically binding to a first antigen; (2) a second binding unit that comprises a heavy chain and a light chain of a second antibody specifically binding to a second antigen; and (3) two third binding units specifically binding to a third antigen; wherein a CH3 domain of the first antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the second antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; each of the third binding units is linked to first and the second antibody, respectively; and a CH1 domain of the heavy chain and a CL domain of the light chain of the second antibody are interchanged; and wherein amino acid residues in an antibody heavy chain are numbered according to the EU numbering system (disclosed herein above) . In other words, one of the third binding units is linked to the first binding unit, and the other third binding unit is linked to the second binding unit. The first and second binding units form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains.

[0098] In one aspect, a multispecific fusion protein of the present invention comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a heavy chain and a light chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A; (2) an IL-6-or IL-6R-binding unit that comprises a heavy chain and a light chain of an IL-6 or IL-6R antibody specifically binding to IL-6 or IL-6R; and (3) two Ang-2-binding units specifically binding to Ang-2, each of said Ang-2 binding units being linked to the VEGF-A and the IL-6 or IL-6R antibody, respectively; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6 or IL-6R antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and the Ang-2-binding unit comprises an Ang-2-binding peptide or an Ang-2 sdAb; and wherein amino acid residues in an antibody heavy chain are numbered according to the EU numbering system. In other words, one Ang-2-binding unit is linked to the VEGF-A-binding unit, and the other Ang-2-binding unit is linked to the IL-6-or IL-6R-binding unit. The VEGF-A-and IL-6-or IL-6R-binding units form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains.

[0099] In another aspect, a multispecific fusion protein of the present invention comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a heavy chain and a light chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A; (2) an IL-6-or IL-6R-binding unit that comprises a heavy chain and a light chain of an IL-6 or IL-6R antibody specifically binding to IL-6 or IL-6R; and (3) two Ang-2-binding units specifically binding to Ang-2, each of said Ang-2-binding units being linked to the VEGF-A and IL-6 or IL-6R antibody, respectively; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6 or IL-6R antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; the Ang-2-binding unit comprises an Ang-2-binding peptide or an Ang-2 sdAb; and a CH1 domain of the heavy chain and a CL domain of the light chain of the IL-6 or IL-6R antibody are interchanged; and wherein amino acid residues in an antibody heavy chain are numbered according to the EU numbering system. In other words, one Ang-2-binding unit is linked to the VEGF-A-binding unit, and the other Ang-2-binding unit is linked to the IL-6-or IL-6R-binding unit. The VEGF-A-and IL-6-or IL-6R-binding units form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains.

[0100] In one aspect, a multispecific fusion protein of the present invention comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A; (2) an IL-6-or IL-6R-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of an IL-6 or IL-6R antibody specifically binding to IL-6 or IL-6R; and (3) two Ang-2-binding units specifically binding to Ang-2, each of said Ang-2-binding units being linked to the VEGF-A and IL-6 or IL-6R antibody, respectively (i.e., one Ang-2-binding unit being linked to the VEGF-A-binding unit, and the other Ang-2-binding unit to the IL-6-or IL-6R-binding unit) ; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6 or IL-6R antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; the Ang-2-binding unit comprises an Ang-2-binding peptide or an Ang-2 sdAb; wherein the heavy chain of the IL-6-or IL-6R-binding unit comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the domains VH, CL, hinge, CH2, and CH3. The light chain of the IL-6-or IL-6R-binding unit comprises, from the N-terminus to the C terminus, the domains VL and CH1; and wherein amino acid residues in an antibody heavy chain are numbered according to the EU numbering system. The VEGF-A-and IL-6-or IL-6R-binding units form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains.

[0101] In still another aspect, a multispecific fusion protein of the present invention comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a heavy chain and a light chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A; and (2) an IL-6-or IL-6R-binding unit that comprises a heavy chain and a light chain of an IL-6 or IL-6R antibody specifically binding to IL-6 or IL-6R; and (b) two Ang-2-binding units specifically binding to Ang-2, each of said Ang-2 binding units being linked to the VEGF-A and the IL-6 or IL-6R antibody, respectively (i.e., one Ang-2-binding unit being linked to the VEGF-A-binding unit, and the other Ang-2-binding unit to the IL-6-or IL-6R-binding unit) ; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6 or IL-6R antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and the Ang-2-binding unit comprises an Ang-2-binding peptide or an Ang-2 sdAb; and wherein amino acid residues in an antibody heavy chain are numbered according to the EU numbering system. The VEGF-A-and IL-6-or IL-6R-binding units form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains.

[0102] In yet another aspect, a multispecific fusion protein of the present invention comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a heavy chain and a light chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A; and (2) an IL-6-or IL-6R-binding unit that comprises a heavy chain and a light chain of an IL-6 or IL-6R antibody specifically binding to IL-6 or IL-6R; and (b) two Ang-2-binding units specifically binding to Ang-2, each of said Ang-2-binding units being linked to the VEGF-A and IL-6 or IL-6R antibody, respectively (i.e., one Ang-2-binding unit being linked to the VEGF-A-binding unit, and the other Ang-2-binding unit to the IL-6-or IL-6R-binding unit) ; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6 or IL-6R antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; the Ang-2-binding unit comprises an Ang-2-binding peptide or an Ang-2 sdAb; and a CH1 domain of the heavy chain and a CL domain of the light chain of the IL-6 or IL-6R antibody are interchanged; and wherein amino acid residues in an antibody heavy chain are numbered according to the EU numbering system. The VEGF-A-and IL-6-or IL-6R-binding units form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains. FIRST EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE  PRESENT INVENTION

[0103] In one aspect, a first embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A; and (2) an IL-6-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of an IL-6 antibody specifically binding to IL-6; and (b) two Ang-2-binding units comprising Ang-2-binding peptides and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A and the IL-6 antibody is linked to an N-terminus of an Ang-2-binding peptide; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; and the CH3 domain of the IL-6 antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V. The VEGF-A-and IL-6-binding units form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains. See Figure ( “Fig. ” ) 1.

[0104] Non-limiting examples of Ang-2-binding peptides include those having SEQ ID NOs: 32-37, disclosed herein above. Other non-limiting examples of Ang-2-binding peptides include those disclosed in US Patents 7,138,370 and 7,205,275 and US Patent Application Publication 20130142799, which are incorporated herein by reference in their entireties.

[0105] In another aspect, the C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A and the IL-6 antibody is linked to the N-terminus of the Ang-2-binding peptide through a short flexible linker, such as one disclosed herein or known by people having ordinary skill in the art.

[0106] Non-limiting examples of VEGF-A and IL-6 antibodies that can be used to construct a multispecific fusion protein of the present invention are disclosed herein above.

[0107] In another aspect, the IL-6-binding unit of an embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention can comprise: (1) the CDR1, CDR2, and CDR3 of a heavy chain of an IL-6 antibody linked to a CH constant domain of IgG1; and (2) the CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain of the IL-6 antibody linked to a CL constant domain of IgG1. Non-limiting examples of such CDRs are those of vamikibart, which are shown in SEQ ID NOs: 46-51, and those of olokizumab, which are shown in SEQ ID NOs: 52-57.

[0108] Similarly, the VEGF-A-binding unit of an embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention can comprise: (1) the CDR1, CDR2, and CDR3 of a heavy chain of an VEGF-A antibody linked to a CH constant domain of IgG1; and (2) the CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain of the VEGF-A antibody linked to a CL constant domain of IgG1. Non-limiting examples of such CDRs are those of bevacizumab, which are shown in SEQ ID NOs: 6-11. Other non-limiting examples of such CDRs include those disclosed in US Patent 7,667,004.

[0109] In still another aspect, the IL-6-binding unit of an embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention can comprise: (1) the heavy-chain variable domain of an IL-6 antibody linked to a CH constant domain of IgG1; and (2) the light-chain variable domain of the IL-6 antibody linked to a CL constant domain of IgG1. Non-limiting examples of such variable domains are those of clazakizumab, which are shown in SEQ ID NOs: 24 and 25. Heavy-and light-chain variable domains of other IL-6 antibodies disclosed herein are readily ascertainable from their amino acid sequences disclosed herein.

[0110] Similarly, the VEGF-A-binding unit of an embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention can comprise: (1) the heavy-chain variable domain of an VEGF-A antibody linked to a CH constant domain of IgG1; and (2) the light-chain variable domain of the VEGF-A antibody linked to a CL constant domain of IgG1. Non-limiting examples of such variable domains include those disclosed in US Patent 7,667,004.

[0111] The amino acid sequences disclosed or claimed herein also encompass conservative amino acid substitutions in these sequences, which do not generally alter the biological activity of the proteins or peptides. The most commonly occurring substitutions are Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly, in both directions.

[0112] A representative trispecific fusion protein of the first embodiment is constructed (denoted as EB-108BId4) . The fusion protein comprises: comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises (A) a heavy-chain variable domain of ranibizumab (a VEGF-A antibody Fab fragment specifically binding to VEGF-A, disclosed herein above) linked directly to a modified Fc domain of bevacizumab, and (B) a light chain of ranibizumab; and (2) an IL-6-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of vamikibart (an IL-6 antibody specifically binding to IL-6, disclosed herein above) ; and (b) two Ang-2-binding units comprising Ang-2-binding Peptide 1 (SEQ ID NO: 32) and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of each of the heavy chains of bevacizumab and vamikibart is linked to an N-terminus of an Ang-2-binding Peptide 1; and wherein the CH3 domain of the bevacizumab includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of vamikibart includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V.

[0113] Complete sequences of the heavy chains of the IL-6-and VEGF-A-binding units (A and B chains) and the light chains of the VEGF-A-and IL-6-binding units (C and D chains) of EB-108BId4 are disclosed as SEQ ID NOs: 58-61, respectively.

[0114] Other trispecific fusion proteins may be constructed, comprising (1) a modified heavy chain and a light chain of one of the other VEGF-A antibodies disclosed herein; (2) a modified heavy chain and a light chain of one of the other IL-6 antibodies disclosed herein; and / or (3) one of the other Ang-2-binding peptides disclosed above, wherein the C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A and IL-6 antibodies is linked to the N-terminus of an Ang-2-binding peptide. SECOND EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE  PRESENT INVENTION

[0115] In one aspect, a second embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A; and (2) an IL-6-binding unit that comprises a modified heavy chain and a modified light chain of an IL-6 antibody specifically binding to IL-6; and (b) two Ang-2-binding units comprising Ang-2-binding peptides and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A and the IL-6 antibody is linked to an N-terminus of an Ang-2-binding peptide; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6 antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and a CH1 domain of the heavy chain and a CL domain of the light chain of the IL-6 antibody are interchanged. Thus, in the second embodiment, the heavy chain of the IL-6 antibody comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the domains VH, CL, hinge, CH2, and modified CH3. The light chain of the IL-6 antibody comprises, from the N-terminus to the C terminus, the domains VL and CH1. The VEGF-A and IL-6-binding units form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains. See Fig. 2.

[0116] Non-limiting examples of VEGF-A and IL-6 antibodies that can be used to construct a multispecific fusion protein of the present invention are disclosed herein above.

[0117] A representative trispecific fusion protein of the second embodiment is constructed (denoted as EB-108PBd5) . The fusion protein comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises (A) a heavy-chain variable domain of ranibizumab linked directly to a modified heavy chain Fc domain of bevacizumab, and (B) a light chain of ranibizumab; and (2) an IL-6-binding unit that comprises a modified heavy chain and a modified light chain of vamikibart; and (b) two Ang-2-binding units, each comprising Ang-2-binding Peptide 1 (SEQ ID NO: 32) and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of each of the heavy chains of bevacizumab and vamikibart is linked to an N-terminus of an Ang-2-binding Peptide 1; wherein the CH3 domain of the bevacizumab includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of vamikibart includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and the CH1 domain of the heavy chain and the CL domain of the light chain of vamikibart are interchanged.

[0118] Complete sequences of the heavy chains of the IL-6-and VEGF-A-binding units (A and B chains) and the light chains of the VEGF-A-and IL-6-binding units (C and D chains) of EB-108PBd5 are disclosed as SEQ ID NOs: 62-65, respectively.

[0119] Other trispecific fusion proteins may be constructed, comprising (1) a modified heavy chain and a light chain of one of the other VEGF-A antibodies disclosed herein; (2) a modified heavy chain and a light chain of one of the other IL-6 antibodies disclosed herein; and / or (3) one of the other Ang-2-binding peptides disclosed above, wherein the C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A and IL-6 antibodies is linked to the N-terminus of an Ang-2-binding peptide. THIRD EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE  PRESENT INVENTION

[0120] In one aspect, a third embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A; and (2) an IL-6-binding unit that comprises a modified heavy chain and a modified light chain of an IL-6 antibody specifically binding to IL-6; and (b) two Ang-2-binding units comprising an Ang-2 sdAb and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A and the IL-6 antibody is linked to an N-terminus of an Ang-2 sdAb; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6 antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and a CH1 domain of the heavy chain and a CL domain of the light chain of the IL-6 antibody are interchanged. Thus, in the third embodiment, the heavy chain of the IL-6 antibody comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the domains VH, CL, hinge, CH2, and modified CH3. The light chain of the IL-6 antibody comprises, from the N-terminus to the C terminus, the domains VL and CH1. The VEGF-A and IL-6 antibodies form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains. See Fig. 3.

[0121] Non-limiting examples of VEGF-A and IL-6 antibodies that can be used to construct a multispecific fusion protein of the present invention are disclosed herein above.

[0122] A representative trispecific fusion protein of the third embodiment is constructed (denoted as EB-108PBd6) . The fusion protein comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a heavy-chain variable domain of ranibizumab linked directly to a modified heavy chain Fc domain of bevacizumab and a light chain of ranibizumab; and (2) an IL-6-binding unit that comprises a modified heavy chain and a modified light chain of vamikibart; and (b) two Ang-2-binding units, each comprising Ang-2 sdAb A41-089 (SEQ ID NO: 40) and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A-binding unit and vamikibart is linked to an N-terminus of the Ang-2 sdAb; wherein the CH3 domain of the bevacizumab includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of vamikibart includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and the CH1 domain of the heavy chain and the CL domain of the light chain of vamikibart are interchanged.

[0123] Complete sequences of the heavy chains of the IL-6-and VEGF-A-binding units (A and B chains) and the light chains of the VEGF-A-and IL-6-binding units (C and D chains) of EB-108PBd6 are disclosed as SEQ ID NOs: 66-69, respectively.

[0124] Other trispecific fusion proteins may be constructed, comprising (1) a modified heavy chain and a light chain of one of the other VEGF-A antibodies disclosed herein; (2) a modified heavy chain and a light chain of one of the other IL-6 antibodies disclosed herein; and / or (3) one of the other Ang-2 sdAbs disclosed above, wherein the C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A and IL-6 antibodies is linked to the N-terminus of an Ang-2 sdAb. FOURTH EMBODIMENT OF THE MULTIISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE  PRESENT INVENTION

[0125] In one aspect, a fourth embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of a VEGF-Aantibody specifically binding to VEGF-A; and (2) an IL-6-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of an IL-6 antibody specifically binding to IL-6; and (b) two Ang-2-binding units, each comprising an Ang-2 sdAb and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of an Ang-2 sdAb is linked to a N-terminus of each of the light chains of the VEGF-A and the IL-6 antibody; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; and the CH3 domain of the IL-6 antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V. The VEGF-A and IL-6 antibodies form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains. See Fig. 4.

[0126] Non-limiting examples of VEGF-A and IL-6 antibodies that can be used to construct a multispecific fusion protein of the present invention are disclosed herein above.

[0127] A representative trispecific fusion protein of the fourth embodiment is constructed (denoted as EB-108BId7) . The fusion protein comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises (A) a heavy-chain variable domain of ranibizumab linked directly to a modified Fc domain of bevacizumab, and (B) a light chain of ranibizumab; and (2) an IL-6-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of vamikibart; and (b) two Ang-2-binding units, each comprising Ang-2 sdAb A41-089 (SEQ ID NO: 40) and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of the Ang-2 sdAb is linked to an N-terminus of each of the light chains of the VEGF-A-binding unit and vamikibart, respectively; wherein the CH3 domain of bevacizumab includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; and the CH3 domain of vamikibart includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V.

[0128] Complete sequences of the heavy chains of the IL-6-and VEGF-A-binding units (A and B chains) and the light chains of the VEGF-A-and IL-6-binding units (C and D chains) of EB-108BId7 are disclosed as SEQ ID NOs: 70-73, respectively.

[0129] Other trispecific fusion proteins may be constructed, comprising (1) a modified heavy chain and a light chain of one of the other VEGF-A antibodies; (2) a modified heavy chain and a light chain of one of the other IL-6 antibodies; and / or (3) one of the other Ang-2 sdAbs disclosed above, wherein the N-terminus of each of the light chains of the VEGF-A and IL-6 antibodies is linked to the C-terminus of an Ang-2 sdAb. FIFTH EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE PRESENT INVENTION

[0130] In one aspect, a fifth embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A; and (2) an IL-6-binding unit that comprises a modified heavy chain and a modified light chain of an IL-6 antibody specifically binding to IL-6; and (b) two Ang-2-binding units comprising an Ang-2 sdAb and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of an Ang-2 sdAb is linked to an N-terminus of each of the light chains of the VEGF-A and the IL-6 antibody; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6 antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and a CH1 domain of the heavy chain and a CL domain of the light chain of the IL-6 antibody are interchanged. Thus, in the fifth embodiment, the heavy chain of the IL-6 antibody comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the domains VH, CL, hinge, CH2, and modified CH3. The light chain of the IL-6 antibody comprises, from the N-terminus to the C terminus, the domains VL and CH1. The VEGF-A and IL-6 antibodies form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains. See Fig. 5.

[0131] Non-limiting examples of VEGF-A and IL-6 antibodies that can be used to construct a multispecific fusion protein of the present invention are disclosed herein above.

[0132] A representative trispecific fusion protein of the fifth embodiment is constructed (denoted as EB-108PBd8) . The fusion protein comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises (A) a heavy-chain variable domain of ranibizumab linked directly to a modified Fc domain of bevacizumab, and (B) a light chain of ranibizumab; and (2) an IL-6-binding unit that comprises a modified heavy chain and a modified light chain of vamikibart; and (b) two Ang-2-binding units, each comprising Ang-2 sdAb A41-089 (SEQ ID NO: 40) and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of the Ang-2 sdAb is linked to an N-terminus of each of the light chains of the VEGF-A-binding unit and vamikibart; wherein the CH3 domain of the bevacizumab includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of vamikibart includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and the CH1 domain of the heavy chain and the CL domain of the light chain of vamikibart are interchanged.

[0133] Complete sequences of the heavy chains of the IL-6-and VEGF-A-binding units (A and B chains) and the light chains of the VEGF-A-and IL-6-binding units (C and D chains) of EB-108PBd8 are disclosed as SEQ ID NOs: 74-77, respectively.

[0134] Other trispecific fusion proteins may be constructed, comprising (1) a modified heavy chain and a light chain of one of the other VEGF-A antibodies; (2) a modified heavy chain and a modified light chain of one of the other IL-6 antibodies; and / or (3) one of the other Ang-2 sdAbs disclosed above, wherein the N-terminus of each of the light chains of the VEGF-A and IL-6 antibodies is linked to the C-terminus of an Ang-2 sdAb. SIXTH EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE  PRESENT INVENTION

[0135] In one aspect, a sixth embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a modified heavy chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A and a common light chain; (2) an IL-6-binding unit that comprises a modified heavy chain of an IL-6 antibody specifically binding to IL-6 and the common light chain that is included to avoid mispairing between the light chains and the two asymmetric heavy chains; and (b) two Ang-2-binding units comprising an Ang-2 sdAb or an Ang-2-binding peptide, and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus (or N-terminus) of each of the heavy chains of the VEGF-A and the IL-6 antibody is linked to an N-terminus (or C-terminus) of an Ang-2-binding sdAb or peptide; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6 antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and a CH1 domain of the heavy chain. The VEGF-A and IL-6 antibodies form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains. See Fig. 6.

[0136] Non-limiting examples of VEGF-A and IL-6 antibodies that can be used to construct a multispecific fusion protein of the present invention are disclosed herein above.

[0137] Three representative trispecific fusion proteins of the sixth embodiment were constructed (denoted as EB-108BId6b, EB-108BId6c, and EB-108BId6d) . Each of the fusion proteins comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises: (A) a heavy-chain variable domain of ranibizumab linked directly to a modified heavy chain Fc domain of bevacizumab, and (B) a common light chain (from emicizumab, navicixizumab, and Revopsis RO-101 antibody, respectively) ; (2) an IL-6-binding unit that comprises: (A) a modified heavy chain of vamikibart, and (B) the common light chain, wherein the common light chains pair with the above asymmetric heavy chains; and (b) two Ang-2-binding units, each comprising Ang-2 sdAb A41-089 (SEQ ID NO: 40) and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A-binding unit and vamikibart is linked to an N-terminus of the Ang-2 sdAb; wherein the CH3 domain of the bevacizumab includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of vamikibart includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V. The modified CH3 domains of the two heavy chains form a knob-in-hole structure.

[0138] Complete sequences of the heavy chains of the IL-6-and VEGF-A-binding units of EB-108BId6b, EB-108BId6c, and EB-108BId6d are disclosed as SEQ ID NO: 78 (A chain) and SEQ ID NO: 79 (B chain) . Complete sequences of the common light chains (C chains) of the IL-6-and VEGF-A-binding units of EB-108BId6b, EB-108BId6c, and EB-108BId6d are disclosed as SEQ ID NO: 80, 81, and 82, respectively.

[0139] Other trispecific fusion proteins may be constructed, comprising (1) a modified heavy chain of the other VEGF-A antibodies and a common light chain; (2) a modified heavy chain of the other IL-6 antibodies and the common light chain for pairing with the asymmetric heavy chains; and (3) one of the other Ang-2 sdAbs or Ang-2 binding peptides as disclosed above, wherein the Ang-2-binding sdAb or peptide is linked to the C-terminus or N-terminus of each of the heavy chains of VEGF-A and IL-6 antibodies. SEVENTH EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE  PRESENT INVENTION

[0140] In one aspect, a seventh embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A; and (2) an IL-6R-binding unit that comprises a modified heavy chain and a modified light chain of an IL-6R antibody specifically binding to IL-6R; and (b) two Ang-2-binding units comprising Ang-2-binding peptide and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A and the IL-6R antibody is linked to an N-terminus of an Ang-2-binding peptide; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6R antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and a CH1 domain of the heavy chain and a CL domain of the light chain of the IL-6R antibody are interchanged. Thus, in the seventh embodiment, the heavy chain of the IL-6R antibody comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the domains VH, CL, hinge, CH2, and modified CH3. The light chain of the IL-6R antibody comprises, from the N-terminus to the C terminus, the domains VL and CH1. The VEGF-A-and IL-6R-binding units form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains. See Fig. 7.

[0141] Non-limiting examples of VEGF-A and IL-6R antibodies that can be used to construct a multispecific fusion protein of the present invention are disclosed herein above.

[0142] A representative trispecific fusion protein of the seventh embodiment is constructed (denoted as EB-108PBe1) . The fusion protein comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises (A) a heavy-chain variable domain of ranibizumab linked directly to a modified Fc domain of bevacizumab, and (B) a light chain of ranibizumab; and (2) an IL-6R-binding unit that comprises a modified heavy chain and a modified light chain of tocilizumab; and (b) two Ang-2-binding units comprising Ang-2-binding Peptide 1 (SEQ ID NO: 32) and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of each of the heavy chains of bevacizumab and tocilizumab is linked to an N-terminus of the Ang-2-binding Peptide 1; wherein the CH3 domain of the bevacizumab includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of tocilizumab includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and the CH1 domain of the heavy chain and the CL domain of the light chain of tocilizumab are interchanged.

[0143] Complete sequences of the heavy chains of the IL-6R-and VEGF-A-binding units (A and B chains) and the light chains of the VEGF-A-and IL-6R-binding units (C and D chains) of EB-108PBe1 are disclosed as SEQ ID NOs: 83-86, respectively.

[0144] Other trispecific fusion proteins may be constructed, comprising (1) a modified heavy chain and a light chain of one of the other VEGF-A antibodies; (2) a modified heavy chain and a light chain of one of the other IL-6R antibodies; and / or (3) one of the other Ang-2-binding peptides disclosed above, wherein the C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A and IL-6R antibodies is linked to the N-terminus of an Ang-2-binding peptide. EIGHTH EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE  PRESENT INVENTION

[0145] In one aspect, an eighth embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A; and (2) an IL-6R-binding unit that comprises a modified heavy chain and a modified light chain of an IL-6R antibody specifically binding to IL-6R; and (b) two Ang-2-binding units comprising an Ang-2 sdAb and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A and the IL-6R antibody is linked to an N-terminus of an Ang-2 sdAb; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6R antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and a CH1 domain of the heavy chain and a CL domain of the light chain of the IL-6R antibody are interchanged. Thus, in the eighth embodiment, the heavy chain of the IL-6R antibody comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the domains VH, CL, hinge, CH2, and modified CH3. The light chain of the IL-6R antibody comprises, from the N-terminus to the C terminus, the domains VL and CH1. The VEGF-A and IL-6R antibodies form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains. See Fig. 8.

[0146] Non-limiting examples of VEGF-A and IL-6R antibodies that can be used to construct a multispecific fusion protein of the present invention are disclosed herein above.

[0147] A representative trispecific fusion protein of the eighth embodiment is constructed (denoted as EB-108BIe2) . The fusion protein comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a heavy-chain variable domain of ranibizumab linked directly to a modified heavy chain Fc domain of bevacizumab and a light chain of ranibizumab; and (2) an IL-6R-binding unit that comprises a modified heavy chain and a modified light chain of tocilizumab; and (b) two Ang-2-binding units, each comprising Ang-2 sdAb A41-089 (SEQ ID NO: 40) and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A-binding unit and tocilizumab is linked to an N-terminus of the Ang-2 sdAb; wherein the CH3 domain of the bevacizumab includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of vamikibart includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and the CH1 domain of the heavy chain and the CL domain of the light chain of tocilizumab are interchanged.

[0148] Complete sequences of the heavy chains of the IL-6R-and VEGF-A-binding units (A and B chains) and the light chains of the VEGF-A-and IL-6R-binding units (C and D chains) of EB-108BIe2 are disclosed as SEQ ID NOs: 87-90, respectively.

[0149] Other trispecific fusion proteins may be constructed, comprising (1) a modified heavy chain and a light chain of one of the other VEGF-A antibodies; (2) a modified heavy chain and a light chain of one of the other IL-6R antibodies; and / or (3) one of the other Ang-2 sdAbs disclosed above, wherein the C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A and IL-6R antibodies is linked to the N-terminus of an Ang-2 sdAb. NINTH EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE  PRESENT INVENTION

[0150] In one aspect, a ninth embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a modified heavy chain and a light chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A; and (2) an IL-6R-binding unit that comprises a modified heavy chain and a modified light chain of an IL-6R antibody specifically binding to IL-6R; and (b) two Ang-2-binding units comprising an Ang-2 sdAb and specifically binding to Ang-2, wherein an N-terminus of each of the light chains of the VEGF-A and the IL-6R antibody is linked to a C-terminus of an Ang-2 sdAb; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6R antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and a CH1 domain of the heavy chain and a CL domain of the light chain of the IL-6R antibody are interchanged. Thus, in the ninth embodiment, the heavy chain of the IL-6R antibody comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the domains VH, CL, hinge, CH2, and modified CH3. The light chain of the IL-6R antibody comprises, from the N-terminus to the C terminus, the domains VL and CH1. The VEGF-A and IL-6 antibodies form a heterodimer at least through an interaction between their respective modified CH3 domains. See Fig. 9.

[0151] Non-limiting examples of VEGF-A and IL-6R antibodies that can be used to construct a multispecific fusion protein of the present invention are disclosed herein above.

[0152] A representative trispecific fusion protein of the ninth embodiment is constructed (denoted as EB-108BIe3) . The fusion protein comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises (A) a heavy-chain variable domain of ranibizumab linked directly to a modified heavy chain Fc domain of bevacizumab, and (B) a light chain of ranibizumab; and (2) an IL-6R-binding unit that comprises a modified heavy chain and a modified light chain of tocilizumab; and (b) two Ang-2-binding units, each comprising Ang-2 sdAb A41-089 (SEQ ID NO: 40) and specifically binding to Ang-2, wherein an N-terminus of each of the light chains of the VEGF-A-binding unit and tocilizumab is linked to a C-terminus of the Ang-2 sdAb; wherein the CH3 domain of the bevacizumab includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of tocilizumab includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and the CH1 domain of the heavy chain and the CL domain of the light chain of tocilizumab are interchanged.

[0153] Complete sequences of the heavy chains of the IL-6R-and VEGF-A-binding units (A and B chains) and the light chains of the VEGF-A-and IL-6R-binding units (C and D chains) of EB-108BIe3 are disclosed as SEQ ID NOs: 91-94, respectively. TENTH EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE  PRESENT INVENTION

[0154] In one aspect, a tenth embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises a modified heavy chain of a VEGF-A antibody specifically binding to VEGF-A and a common light chain; (2) an IL-6R-binding unit that comprises a modified heavy chain of an IL-6R antibody specifically binding to IL-6R, and the common light chain; wherein the common light chains are included to avoid mispairing between the light chains and the two asymmetric heavy chains; and (b) two Ang-2-binding units comprising an Ang-2 sdAb or an Ang-2-binding peptide, and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus or N-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A and the IL-6R antibody is linked to an N-terminus or C-terminus of an Ang-2 binding sdAb or peptide; wherein the CH3 domain of the VEGF-A antibody includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of the IL-6R antibody includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V. See Fig. 10 wherein the N-terminus of an Ang-2-binding peptide is linked to the C-terminus of each of the heavy chains.

[0155] Non-limiting examples of VEGF-A and IL-6R antibodies that can be used to construct a multispecific fusion protein of the present invention are disclosed herein above.

[0156] Three representative trispecific fusion proteins of the tenth embodiment are constructed (denoted as EB-108BIe1b, EB-108BIe1c, and EB-108BIe1d) . Each of the fusion proteins comprises: (a) a heterodimer that comprises: (1) a VEGF-A-binding unit that comprises: (A) a heavy-chain variable domain of ranibizumab linked directly to a modified heavy chain Fc domain of bevacizumab, and (B) a common light chain; (2) an IL-6R-binding unit that comprises: (A) a modified heavy chain of tocilizumab, and (B) the common light chain; and (b) two Ang-2-binding units, each comprising Ang-2-binding Peptide 1 (SEQ ID NO: 32) and specifically binding to Ang-2, wherein a C-terminus of each of the heavy chains of the VEGF-A-binding unit and tocilizumab is linked to an N-terminus of Ang-2-binding Peptide 1; wherein the CH3 domain of the bevacizumab includes the following amino acid modifications: Y349C and T366W; the CH3 domain of tocilizumab includes the following amino acid modifications: S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V.

[0157] Complete sequences of the heavy chains of the IL-6R-and VEGF-A-binding units of EB-108BIe1b, EB-108BIe1c, and EB-108BIe1d are disclosed as SEQ ID NO: 95 (A chain) and SEQ ID NO: 96 (B chain) . Complete sequences of the common light chains (C chains) of the IL-6R-and VEGF-A-binding units of EB-108BIe1b, EB-108BIe1c, and EB-108BIe1d are disclosed as SEQ ID NOs: 80, 81, and 82, respectively.

[0158] Other trispecific fusion proteins may be constructed, comprising (1) a modified heavy chain of the other VEGF-A antibodies and a common light chain; (2) a modified heavy chain of the other IL-6R antibodies and the common light chain, wherein the two common light chains pair with the asymmetric heavy chains; and (3) one of the other Ang-2 sdAbs or Ang-2 binding peptides as disclosed above, wherein the Ang-2 binding sdAb or peptide is linked to the C-terminus or N-terminus of each of the heavy chains of VEGF-A and IL-6R antibodies.

[0159] Non-limiting examples of common light chains include those disclosed in US Patents 7,033,590 (emicizumab) , 9,376,488 (navicixizumab) , 11,396,557, and 10,214,580; US Patent Application Publications 20230279101, 20190071519, and 20250250330, which are incorporated herein by reference in their entireties.

[0160] Other trispecific fusion proteins may be constructed, comprising (1) a modified heavy chain and a light chain of one of the other VEGF-A antibodies; (2) a modified heavy chain and a modified light chain of one of the other IL-6R antibodies; and / or (3) one of the other Ang-2 sdAbs or Ang-2-binding peptides disclosed above, wherein the N-terminus of each of the light chains of the VEGF-A and IL-6R antibodies is linked to the C-terminus of an Ang-2 sdAb or Ang-2-binding peptide.

[0161] In another aspect, when a multispecific fusion proteins of the present invention includes an IL-6R-binding unit, said IL-6R-binding unit can comprise: (1) the CDR1, CDR2, and CDR3 of a heavy chain of an IL-6R antibody linked to a CH constant domain of IgG1; and (2) the CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain of the IL-6R antibody linked to a CL constant domain of IgG1. Non-limiting examples of IL-6R antibodies are tolicizumab and sarilumab. The amino acid sequences of tocilizumab heavy-chain CDR1, CDR2, and CDR3 and light-chain CDR1, CDR2, and CDR3 are shown in SEQ ID NOs: 97-102, respectively. The amino acid sequences of sarilumab heavy-chain CDR1, CDR2, and CDR3 and light-chain CDR1, CDR2, and CDR3 are shown in SEQ ID NOs: 103-108, respectively.

[0162] An IL-6-or IL-6R-binding unit included in a trispecific fusion protein of the present invention is capable of binding IL-6 or IL-6R, respectively, with KD in the range from about 1x10-6 M to about 1x10-12 M. In some embodiments, said KD is in the range from about 1x10-7 M to about 1x10-12 M. In some other embodiments, said KD in the range from about 1x10-8 M to about 1x10-12 M. In still some embodiments, said KD is in the range from about 1x10-9 M to about 1x10-12 M. As a result, said antibody fusion protein substantially inhibits biological activity of IL-6 or IL-6R in promoting angiogenesis and inflammation; thereby, controlling a pathological condition having etiology in aberrant angiogenesis (including excessive angiogenesis) , vascular leakage, and / or inflammation. In one aspect, the pathological condition has etiology in excessive angiogenesis, vascular leakage, and / or inflammation.

[0163] An Ang-2-binding unit included in a trispecific fusion protein of the present invention is capable of binding Ang-2 with KD in the range from about 1x10-6 M to about 1x10-12 M. In some embodiments, said KD is in the range from about 1x10-7 M to about 1x10-12 M. In some other embodiments, said KD in the range from about 1x10-8 M to about 1x10-12 M. In still some embodiments, said KD is in the range from about 1x10-9 M to about 1x10-12 M. As a result, said antibody fusion protein substantially inhibits biological activity of Ang-2 in promoting angiogenesis and increased vascular permeability; thereby, controlling a pathological condition having etiology in aberrant angiogenesis (including excessive angiogenesis) , vascular leakage, and / or inflammation. In one aspect, the pathological condition has etiology in excessive angiogenesis, vascular leakage, and / or inflammation.

[0164] A VEGF-A-binding unit included in a trispecific fusion protein of the present invention is capable of binding at least a VEGF-A isoform with KD in the range from about 1x10-6 M to about 1x10-12 M. In some embodiments, said KD is in the range from about 1x10-7 M to about 1x10-12 M. In some other embodiments, said KD in the range from about 1x10-8 M to about 1x10-12 M. In still some other embodiments, said KD is in the range from about 1x10-9 M to about 1x10-12 M. As a result, said antibody fusion protein substantially inhibits biological activity of VEGF-A in promoting angiogenesis; thereby, controlling a pathological condition having etiology in aberrant angiogenesis (including excessive angiogenesis) , vascular leakage, and / or inflammation. In one aspect, the pathological condition has etiology in excessive angiogenesis, vascular leakage, and / or inflammation.

[0165] In some embodiments, the present invention also provides a binding construct that comprises, consists of, or consists essentially of a plurality of trispecific fusion or chimeric proteins, herein described, that are linked to or associated with each other by covalent bonds or other forms of attachment; wherein the trispecific fusion proteins of such a binding construct may be the same or different. Such a binding construct of the present invention is capable of binding VEGF-A, IL-6 or IL-6R, and Ang-2 with high affinity. In the case where the trispecific fusion proteins are different, each can comprise a different binding unit against VEGF-A, IL-6 or IL-6R, or Ang-2, selected from the binding units disclosed herein.

[0166] A trispecific fusion protein or a binding construct may further include a heterologous peptide or other chemical moieties. Such additions can modify its properties such as additional therapeutic properties, diagnostic properties, stability, solubility, toxicity, serum half-life, immunogenicity, detectability, or other properties.

[0167] The term “high affinity” is used in a physiological context pertaining to the relative affinity of the trispecific fusion protein for VEGF-A, IL-6 or IL-6R, and Ang-2 in vivo in a mammal, such as a laboratory test animal, a domesticated farm or pet animal, or a human. Trispecific fusion proteins binding VEGF-A, IL-6 or IL-6R, and Ang-2 in the present invention can have characteristic affinities for their ligands in vivo, typically measured in terms of sub-nanomolar values of equilibrium dissociation constants (KD) . For the purposes of this invention, a trispecific fusion protein of the present invention can bind to its targeted ligand with a KD less than or equal to about 1, or about 5, or about 10, or about 50, or about 100, or about 500, or about 1000 times the KD of the natural ligand / receptor pair.

[0168] A trispecific fusion proteins of the present invention is capable of binding to VEGF-A, IL-6 or IL-6R, and Ang-2 with an equilibrium dissociation constant (KD) in the range from about 1x10-6 M to 1x10-12 M. In some embodiments, the KD value is in the range from about 1x10-7 M to about 1x10-12 M, or from about 1x10-8 M to about 1x10-12 M, or from about 1x10-9 M to about 1x10-12 M.

[0169] In another aspect, a trispecific fusion protein may comprise more than one of each of the VEGF-binding unit, and the IL-6-or IL-6R-binding unit, and Ang-2-binding unit.

[0170] In one aspect, the amino acid and nucleic acid sequences of the non-limiting various portions or embodiments of a multispecific fusion protein of the present invention are listed in Table 1. Table 1 Amino Acid and Nucleic Acid Sequences

[0171] In yet another aspect, a trispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to any one of SEQ ID NO: 1 through SEQ ID NO: 96.

[0172] In still another aspect, a trispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises an amino acid sequence that is at least 95%identical to any one of SEQ ID NO: 1 through SEQ ID NO: 96.

[0173] In still another aspect, a trispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises an amino acid sequence that is at least 97%identical to any one of SEQ ID NO: 1 through SEQ ID NO: 96.

[0174] In still another aspect, a trispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises an amino acid sequence that is at least 98%identical to any one of SEQ ID NO: 1 through SEQ ID NO: 96.

[0175] In still another aspect, a trispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises an amino acid sequence that is at least 99%identical to any one of SEQ ID NO: 1 through SEQ ID NO: 96.

[0176] In still another aspect, the present invention provides a multispecific fusion protein comprising polypeptides having A-, B-, C-, and D-chain amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 58-61, 62-65, 66-69, 70-73, 74-77, 83-86, 87-90, and 91-94, or polypeptides having A-, B-, and C-chain amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 78-82 and 95-96. In still another aspect, the present invention provides a mutispecific fusion protein comprising four polypeptides having amino acid sequences at least 95%identical to amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 58-61, 62-65, 66-69, 70-73, 74-77, 83-86, 87-90, and 91-94, or polypeptides having A-, B-, and C-chain amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 78-82 and 95-96.

[0177] In still another aspect, the present invention provides a trispecific fusion protein comprising four polypeptides having amino acid sequences at least 98%identical to amino acid sequences from the group consisting of SEQ ID NOs: 58-61, 62-65, 66-69, 70-73, 74-77, 83-86, 87-90, and 91-94, or polypeptides having A-, B-, and C-chain amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 78-82 and 95-96.

[0178] In still another aspect, the present invention provides a trispecific fusion protein comprising four polypeptides having amino acid sequences at least 99%identical to amino acid sequences from the group consisting of SEQ ID NOs: 58-61, 62-65, 66-69, 70-73, 74-77, 83-86, 87-90, and 91-94, or polypeptides having A-, B-, and C-chain amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 78-82 and 95-96.

[0179] In still another aspect, one or more amino acid substitutions can be made in any one of the above-described amino acid sequences. Preferably, such substitution is a conservative substitution, wherein an amino acid in one of the following groups is substituted with another in the same group: (1) A, G; (2) D, E; (3) N, Q; (4) R, K; (5) I, L, M, V; (6) F, Y, W; (7) S, T; and (8) C, M; and such substitution is selected so as to preserve substantially the binding activity of the fusion protein. In one embodiment, a trispecific fusion protein of the present invention having a conservative substitution has a KD value for Ang-2, IL-6, or VEGF-A ligand less than about 120%of that before such substitution. Preferably, the KD value is less than about 110%of that before such substitution. More preferably, the KD value is less than about 105%of that before such substitution. Still more preferably, the KD value is less than about 100%of that before such substitution.

[0180] In addition, the amino acid sequences disclosed or claimed herein also encompass their “conservatively modified variants, ” which are the results of a substitution, deletion, or addition of a single amino acid or a small percentage of amino acids (such as ≤ 5, ≤ 4, ≤ 3, ≤ 2, or ≤ 1%) in the original sequence of a peptide, polypeptide, or protein sequence that does not substantially alter the biological activity of the original peptide, polypeptide, or protein. For example, such conservatively modified variants can retain about ≥ 95, ≥ 96, ≥ 97, ≥ 98, ≥ 99, or 100%of the biological activity of the original peptide, polypeptide, or protein.

[0181] Most conservative substitutions are not expected to produce radical changes in the characteristics of a domain of the fusion polypeptide. However, when it is difficult to predict the exact effect of the substitution in advance of doing so, one skilled in the art will appreciate that the effect can be evaluated by routine screening assays. For example, a domain typically is made by site-specific mutagenesis of the nucleic acid encoding the intact fusion polypeptide, expression of the variant nucleic acid in recombinant cell culture, purification of the variant fusion polypeptide from the cell culture, and detecting the ability of the variant fusion polypeptide to specifically bind to VEGF-A, IL-6 or IL-6R, or Ang-2. An exemplary binding assay which can be employed to determine if a particular substitution or substitutions in a domain or other domains affect the capability of the fusion polypeptide to bind to and inhibit the activity of VEGF-A, IL-6 or IL-6R, or Ang-2 is described in the article by Park et al., J. Biol. Chem., 269: 25646-25654 (1994) .

[0182] The VEGF-A-binding units are capable of inhibiting the VEGF-A / VEGFR-2 (VEGF receptor 2 or KDR receptor) signaling pathway. The Ang-2-binding units are capable of inhibiting the activation of Tie-2 by Ang-2. The IL-6-or IL-6R-binding units are capable of inhibiting the IL-6 signaling pathway by blocking the formation of the IL-6 / IL-6R complex. Thus, a fusion protein of the present invention is capable of substantially inhibiting the angiogenic activity of these growth factors on endothelial cells at the site of the disease. Nucleic Acid and Protein Production

[0183] In still another aspect, the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding said trispecific fusion proteins.

[0184] In yet another aspect, the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding a trispecific fusion protein; wherein said isolated nucleic acid molecules comprise: (a) a nucleic acid sequence encoding a VEGF-binding unit comprising a VEGF-A antibody with modifications described herein above; (b) a nucleic acid sequence encoding an IL-6-or IL-6R-binding unit comprising an IL-6 or IL-6R antibody, with modifications described herein above; and (c) nucleic acid sequences encoding an Ang-2-binding polypeptide or an Ang-2 sdAb operatively linked to said nucleic acid sequence encoding said VEGF-A-and IL-6-or IL-6R-binding units.

[0185] In yet another aspect, the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding a trispecific fusion protein of any of the embodiments disclosed herein above.

[0186] In still another aspect, the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding said trispecific fusion protein; wherein said isolated nucleic acid molecules comprise: (a) a nucleic acid sequences encoding the heavy chain and light chain of a VEGF-A antibody having modifications described herein above; (b) nucleic acid sequences encoding the heavy chain and light chain of an IL-6 or IL-6R antibody having modifications described herein above; and (c) two nucleic acid sequences encoding an Ang-2-binding peptide or an Ang-2 sdAb, for example, selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32-45, which is operatively linked to (1) the 3’ end of the nucleic acid sequences encoding the heavy chains of said VEGF-A and IL-6 or IL-6R antibodies, or (2) the 5’ end of the nucleic acid sequences encoding the light chains of said VEGF-A and IL-6 or IL-6R antibodies.

[0187] In another aspect, the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding a trispecific fusion or chimeric protein of the present invention; wherein said isolated nucleic acid molecules comprise a nucleic acid sequence that, as a result of the degeneracy of the genetic code, differs in one or more codons from a nucleic acid sequence listed in this disclosure. Such a different nucleic acid sequence is within the scope of the present invention.

[0188] Nucleic acids may be produced using various standard cloning and chemical synthesis techniques, which include, but are not limited to, nucleic acid amplication; e.g., polymerase chain reaction (PCR) , with genomic DNA or cDNA targets using primers capable of annealing to another sequence. Nucleic acids can also be produced by chemical synthesis (e.g., solid-phase phosphoramidite synthesis) or transcription from a gene. The sequences produced can then be translated in vitro or cloned into a plasmid (an expression vector) and propagated and then expressed in a host cell (e.g., eukaryote or mammalian cell, yeast or bacteria, in an animal or a plant) .

[0189] In still another aspect, the present invention provides a vector that comprises any of the nucleic acid molecules herein disclosed, including an expression vector comprising any of said nucleic molecules operatively linked to an expression control sequence.

[0190] In yet another aspect, a vector comprises a nucleic acid sequence encoding a multispecific fusion protein or portion thereof, as listed in any sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 109-216 and combinations thereof.

[0191] In still another aspect, the present invention provides a host-vector system for the production of any of said trispecific fusion or chimeric proteins, which host-vector system comprises the expression vector in a suitable host cell.

[0192] In one aspect, the present invention provides for the construction of a nucleic acid molecule encoding a trispecific fusion protein disclosed herein, which nucleic acid molecule is inserted into a vector that is able to express the antibody fusion protein when introduced into an appropriate host cell. Appropriate host cells include, but are not limited to, bacterial cells, yeast cells, insect cells, and mammalian cells. Any of the methods known to one skilled in the art for the insertion of DNA fragments into a vector may be used to construct expression vectors encoding chimeric polypeptide molecules under control of transcriptional / translational control signals. These methods may include in vitro recombinant DNA and synthetic techniques and in vivo recombination (genetic recombination) (See; e.g., Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) .

[0193] Expression of nucleic acid molecules encoding a fusion protein of the present invention may be regulated by a second nucleic acid sequence (a promoter) so that the fusion protein is expressed in a host transformed with the nucleic acid molecules. For example, expression of a fusion protein described herein may be controlled by any promoter / enhancer element known in the art.

[0194] In general, plasmid vectors containing replicon and control sequences that are derived from species compatible with the host cell are used in connection with these hosts. The vector ordinarily carries a replication site, as well as marking sequences that are capable of providing phenotypic selection in transformed cells. For example, E. coli is typically transformed using pBR322, a plasmid derived from an E. coli species (see; e.g., Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977) ) . The plasmid pBR322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance and thus provides easy means for identifying transformed cells. The pBR322 plasmid, or other microbial plasmid or phage, must also contain, or be modified to contain, promoters that can be used by the microbial organism for expression of proteins.

[0195] Those promoters most commonly used in recombinant DNA construction include the β-lactamase (penicillinase) and lactose promoter systems or a tryptophan (trp) promoter system (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) ) . While these are the most commonly used, other microbial promoters have been discovered and utilized. For example, the tac promoter is a synthetically produced DNA promoter produced from the combination of promoters from the trp and lac operons (de Boer et al., PNAS, (1983-01-80 (1) : 21–25 (1983) ) . It is commonly used for protein production in Escherichia coli. (Amann et al., Gene, 25: 167-178 (1983) ) . Any of these promoters may be used in connection with a method of producing a fusion protein of the present invention.

[0196] In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes, such as yeast cultures, may also be used. Saccharomyces cerevisiae, or common baker's yeast, is the most commonly used among eukaryotic microorganisms, although a number of other strains are commonly available. For expression in Saccharomyces, the plasmid YRp7, for example (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979) ) is commonly used. Other exemplary plasmids are disclosed in US Patent 4,615,974; Struhl et al., PNAS, 76 (3) : 1035 (1979) . The plasmid YRp7 contains the trp1 gene that provides a selection marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow without tryptophan, for example, ATCC No. 44, 076 or RH218 (Jones, Genetics, 85: 23 (1977) ) . The presence of the trp1 lesion as a characteristic of the yeast host cell genome then provides an effective environment for detecting transformation by growth in the absence of tryptophan.

[0197] Suitable promoting sequences in yeast vectors include the promoters for 3-phosphoglycerate kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980) ) or other glycolytic enzymes, such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylas, and glucokinase (Romanos et al., Yeast, 8: 423 (1992) ; Weinhandl et al., Microb. Cell Factories, 13: 5 (2014) ) . In constructing suitable expression plasmids, the termination sequences associated with these genes are also ligated into the expression vector 3'of the sequence desired to be expressed to provide polyadenylation of the mRNA and termination. Other promoters, which have the additional advantage of transcription controlled by growth conditions, such as the promoter region for alcohol dehydrogenase 2, and enzymes responsible for maltose and galactose utilization (Romanos et al., Weinhandl et al., supra) , may be used for the vector construction. Any plasmid vector containing yeast-compatible promoter, origin of replication and termination sequences is suitable.

[0198] In addition to microorganisms, cultures of cells derived from multicellular organisms may also be used as hosts. In principle, any such cell culture is workable, whether from vertebrate or invertebrate culture. However, much interest has been in vertebrate cells, and propagation of vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a routine procedure in recent years. Examples of such useful host cell lines are VERO and HeLa cells, Chinese hamster ovary (CHO) cell lines, and W138, BHK, COS-7, HEK293, and MDCK cell lines. Expression vectors for such cells ordinarily include (if necessary) an origin of replication, a promoter located in front of the gene to be expressed, along with any necessary ribosome binding sites, RNA splice sites, polyadenylation sites, and transcriptional terminator sequences.

[0199] For use in mammalian cells, the control functions on the expression vectors are often provided by viral material. For example, commonly used promoters are derived from polyoma, Adenovirus 2, and most frequently Simian Virus 40 (SV40) . The early and late promoters of SV40 virus are particularly useful because both are obtained easily from the virus as a fragment that also contains the SV40 viral origin of replication (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978) ) . Smaller or larger SV40 fragments may also be used, provided there is included the approximately 250-bp sequence extending from the HindIII site toward the BglI site located in the viral origin of replication. Further, it is also possible, and often desirable, to utilize promoter or control sequences normally associated with the desired gene sequence, provided such control sequences are compatible with the host cell systems.

[0200] Thus, according to the present invention, expression vectors capable of being replicated in a bacterial, a yeast cell, an insect cell, or a mammalian cell host, comprising a fusion protein-encoding nucleic acid as described herein, are used to transfect the host and thereby direct expression of such nucleic acids to produce the fusion polypeptide, which may then be recovered in a biologically active form. As used herein, a biologically active form includes a form capable of binding to at least a VEGF family member.

[0201] In some embodiments, the host cell can be E. coli, a COS cell, a HEK 293 cell (also known simply as 293 cells) , or a Chinese hamster ovary ( “CHO” ) cell. Preferably, the host cell is a HEK 293 or CHO cell.

[0202] A non-limiting example is the plasmid pcDNA3.4, which is suitable to be used in a mammalian host cell, such as the CHO cell. The plasmid pcDNA3.4 contains genes for ampicillin resistance and genes for SV40 and CMV promoters. Vector Construction

[0203] Construction of suitable vectors containing the desired coding and control sequences employ standard ligation techniques. Isolated plasmids or DNA fragments are cleaved, tailored, and ligated in the form desired to form the plasmids required. The methods employed are not dependent on the DNA source or intended host. Cleavage is performed by treating with a restriction enzyme (or enzymes) in a suitable buffer.

[0204] Methods for construction of expression vectors are known in the art. The vector components generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. A non-limiting example of such methods is described in US Patent 5,534,615, which is incorporated by reference in its entirety. Some recent developments in vector engineering are described in Nora, L.C., et al., Microb. Biotech., 12 (1) : 125-147 (2019) .

[0205] In general, the nucleic acid sequence encoding each of the A-, B-, C-, and D-chain can be inserted into a separate. Alternatively, the nucleic acid sequences encoding the A-and C-chains can be inserted into one vector, and those encoding the B-and D-chain into another vector.

[0206] As a non-limiting example, in a first embodiment, a nucleic acid sequence substantially encoding an Ang-2-binding unit is ligated to the 3’ end of a nucleic acid substantially encoding a VEGF-A antibody heavy chain having the modifications as described herein above. A nucleic acid sequence substantially encoding an Ang-2-binding unit is ligated to the 3’ end of a nucleic acid sequence substantially encoding an IL-6 antibody heavy chain having the modifications as described herein above.

[0207] These nucleic acid sequences and the nucleic acid sequences substantially encoding the light chains of the VEGF-A and IL-6 antibodies are then positioned in a vector which contains a promoter in the reading frame with the gene and compatible with the proposed host cell. A number of plasmids, such as those described in U.S. Patents 4,456,748; 5,460,811; 5,888,808; and 6,333,147 may be used in a production of a fusion protein of the present invention. The foregoing patents are incorporated herein by reference in their entireties.

[0208] In one aspect, the vector system pcDNA3.4 is suitable to express a fusion protein of the present invention in a mammalian cell.

[0209] In one embodiment, a fusion protein of the present invention may be produced according to the method described in U.S. Patent 7,070,959, which is incorporated herein by reference in its entirety. For example, the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 166-169 are inserted into the expression vector pcDNA3.4 having the CMV promoter.

[0210] In one embodiment, CHO cells are transfected with pcDNA3.4 / SEQ ID NOs: 166-169. The antibody fusion protein obtained from the CHO cells may be purified and characterized by binding assay, as described in U.S. Patent 7,070,959.

[0211] Similarly, a nucleic acid molecule encoding another trispecific fusion protein described herein above may be produced by ligating nucleic acid sequences encoding the various desired ligand-binding units in a desired order and then inserting into the expression vector pcDNA3.4. CHO cells are transfected with such vector and grown. Antibody fusion proteins obtained from these CHO cells may be similarly purified and characterized.

[0212] In one embodiment, a fusion protein of the present invention can bind to human VEGF-A ( “hVEGF-A” ) , human IL-6 ( “hIL-6” ) or IL-6R ( “hIL-6R” ) , and Ang-2 ( “hAng-2” ) with KD ≤ 10-9 M. In another embodiment, a fusion protein of the present invention can bind to hVEGF-A, hIL-6 or hIL-6R, and hAng-2 with KD ≤ 5x10-10 M. In still another embodiment, a fusion protein of the present invention can bind to hVEGF-A, hIL-6 or hIL-6R, and hAng-2 hVEGF-A, hIL-6 or hIL-6R, and hAng-2 with KD ≤ 10-10 M.

[0213] In one aspect, the present invention provides compounds, compositions, and methods for treating or controlling a disease, condition, or disorder having etiology in at least one of aberrant angiogenesis (including excessive angiogenesis) , increased vascular leakage, and inflammation. In another aspect, said disease, condition, or disorder has etiology in at least one of excessive angiogenesis, increased vascular leakage, and inflammation.

[0214] In another aspect, the present invention provides a method for treating or controlling at least an ocular or systemic disease, condition, or disorder, in a subject, which has etiology selected from the group consisting of aberrant angiogenesis (including excessive angiogenesis) , increased vascular leakage, inflammation, and combinations thereof. In still another aspect, said at least an ocular or systemic disease, condition, or disorder has etiology selected from the group consisting of excessive angiogenesis, increased vascular leakage, inflammation, and combinations thereof. The method comprises administering to a subject in need of such treating or controlling a composition comprising a trispecific fusion protein herein disclosed. Non-limiting embodiments of such a fusion protein have amino acid sequences listed in SEQ ID NOs: 58-61, 62-65, 66-69, 70-73, 74-77, 83-86, 87-90, and 91-94, or 78-82 and 95-96.

[0215] In still another aspect, the present invention provides a composition for use to treat or control at least an ocular or systemic disease, condition, or disorder, in a subject, which has etiology in excessive angiogenesis and inflammation, wherein composition comprises a trispecific fusion protein herein disclosed. Non-limiting embodiments of such a fusion protein have amino acid sequences listed in SEQ ID NOs: 58-61, 62-65, 66-69, 70-73, 74-77, 83-86, 87-90, and 91-94, or 78-82 and 95-96.

[0216] In still another aspect, the present invention provides a use of a trispecific fusion protein herein disclosed for the preparation of a pharmaceutical composition or a medicament for the treatment or control of at least an ocular or systemic disease, condition, or disorder, in a subject, which has etiology in excessive angiogenesis and inflammation. Non-limiting embodiments of such a fusion protein have amino acid sequences listed in SEQ ID NOs: 58-61, 62-65, 66-69, 70-73, 74-77, 83-86, 87-90, and 91-94, or 78-82 and 95-96.

[0217] In still another aspect, said ocular disease, condition, or disorder is selected from the group consisting of: macular edema resulting from diabetes, uveitis, central and branch retinal vein occlusion, choroidal neovascularization, neovascular age-related macular degeneration (wet age-related macular degeneration) , polypoidal choroidal vasculopathy ( “PCV” ) , myopic choroidal neovascularization, vascular leak, non-proliferative and proliferative diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, corneal neovascularization, corneal inflammation, and neovascular glaucoma.

[0218] In one embodiment, the subject is administered with a dose sufficient to treat or control a disease, condition, or disorder disclosed herein, such as about 25-8000 micrograms of the fusion protein. In another embodiment, the subject is administered with a dose of about 50-8000, about 100-8000, about 500-8000, about 1000-8000, about 2000-8000, about 50-6000, about 50-5000, about 50-4000, about 50-3000, about 50-2000, or about 50-1000 micrograms of the fusion protein.

[0219] In still another aspect, the composition comprising the fusion protein is in the form of an eye drop or an ocular injection (such as intravitreal, intracameral, peri-orbital, subtenon’s, subretinal, or suprachoroidal injection) . Such a composition comprises an ophthalmic composition. A fusion protein of the present invention may also be incorporated into a medical device that is implantable into or near a diseased tissue.

[0220] In one embodiment, the present invention provides a method for treating or controlling, or a composition for use to treat or control, an anterior-segment disease, condition, or disorder; such as corneal neovascularization, corneal inflammation, or neovascular glaucoma. The composition comprising the fusion protein may be in the form of an eye drop or intracameral or subconjunctival injection. In another embodiment, the present invention provides a method or composition for treating or controlling a posterior-segment disease, condition, or disorder; such as choroidal neovascularization, neovascular age-related macular degeneration (wet age-related macular degeneration) , polypoidal choroidal vasculopathy ( “PCV” ) , myopic choroidal neovascularization, vascular leak, macular edema resulting from diabetes, uveitis, central and branch retinal vein occlusion, non-proliferative and proliferative diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity. In this case, the composition comprising the fusion protein may be administered in the form of an intravitreal injection.

[0221] In another embodiment, the present invention provides a use of a fusion protein disclosed herein for the preparation of a medicament for treating or controlling an aforementioned disease or condition.

[0222] In yet another aspect, an eye drop is administered to the subject at least once per day, at least once per week, at least twice per month, or at least once per month until the disease, condition, or disorder is substantially treated or controlled.

[0223] In yet another aspect, the composition is administered via sustained drug release to the subject for a period of at least one month, at least two months, at least three months, or at least six months.

[0224] In still another aspect, an intravitreal injection or an injection into, or near, a diseased tissue is administered to the subject according to a regimen recommended by a medical practitioner for a particular patient. For example, an injection may be administered at least once per month, at least once every two months, at least once every three months, at least once every four months or at least once every six months until the disease, condition, or disorder is substantially treated or controlled. In one embodiment, treatment may be administered more frequently at the beginning, and then less frequently after a period of time. Such period of time may be determined by a medical practitioner.

[0225] The concentration of a fusion protein of the present invention in such an ophthalmic composition can be in the range from about 0.1 to about 200 mg / ml (or, alternatively, from about 0.25 to about 200 mg / ml, or from about 0.25 to about 160 mg / ml, or from about 0.5 to about 100 mg / ml, or from about 0.25 to about 80 mg / ml, or from about 0.5 to about 200 mg / ml, or from about 0.5 to about 160 mg / ml, or from about 0.5 to about 100 mg / ml, or from about 0.5 to about 80 mg / ml, or from about 1 to about 200 mg / ml, or from 1 to about 160 mg / ml, or from about 0.5 to about 100 mg / ml, or from about 1 to about 80 mg / ml) .

[0226] In still another aspect, a method for preparing a composition of the present invention comprises combining: (a) the amount of a trispecific fusion protein of the present invention; and (b) a physiologically acceptable carrier.

[0227] In one embodiment, such a physiologically acceptable carrier can be a sterile saline solution or a physiologically acceptable buffer. In another embodiment, such a carrier comprises a hydrophobic medium, such as a pharmaceutically acceptable oil. In still another embodiment, such a carrier comprises an emulsion of hydrophobic material and water. In yet another embodiment, a fusion protein of the present invention may be associated or linked with a high-molecular weight material to provide a long circulation time.

[0228] Physiologically acceptable buffers include, but are not limited to, a phosphate buffer or a Tris-HCl buffer (comprising tris (hydroxymethyl) aminomethane and HCl) . For example, a Tris-HCl buffer having pH of 7.4 comprises 3 g / l of tris (hydroxymethyl) aminomethane and 0.76 g / l of HCl. In yet another aspect, the buffer is 10X phosphate buffer saline ( “PBS” ) or 5X PBS solution. Non-limiting examples of buffers used for injectable compositions comprising biologics include phosphate, citric acid, acetic acid, tromethamine, histidine, arginine, gluconic acid, lactic acid, tartaric acid, aspartic acid, and glutamic acid.

[0229] Other buffers also may be found suitable or desirable in some circumstances, such as buffers based on HEPES (N- {2-hydroxyethyl} peperazine-N’ - {2-ethanesulfonic acid} ) having pKa of 7.5 at 25 ℃ and pH in the range of 6.8-8.2; BES (N, N-bis {2-hydroxyethyl} 2-aminoethanesulfonic acid) having pKa of 7.1 at 25℃ and pH in the range of 6.4-7.8; MOPS (3- {N-morpholino} propanesulfonic acid) having pKa of 7.2 at 25℃ and pH in the range from of 6.5-7.9; TES (N-tris {hydroxymethyl} -methyl-2-aminoethanesulfonic acid) having pKa of 7.4 at 25℃ and pH in the range of 6.8-8.2; MOBS (4- {N-morpholino} butanesulfonic acid) having pKa of 7.6 at 25℃ and pH in the range of 6.9-8.3; DIPSO (3- (N, N-bis {2-hydroxyethyl} amino) -2-hydroxypropane) ) having pKa of 7.52 at 25℃ and pH in the range of 7-8.2; TAPSO (2-hydroxy-3 {tris (hydroxymethyl) methylamino} -1-propanesulfonic acid) ) having pKa of 7.61 at 25℃ and pH in the range of 7-8.2.

[0230] In certain embodiments, a composition of the present invention is formulated in a buffer having an acidic pH, such as from about 4 to about 6.8, or alternatively, from about 5 to about 6.8. In such embodiments, the buffer capacity of the composition desirably allows the composition to come rapidly to a physiological pH after being administered into the patient.

[0231] In addition to a buffer, a composition of the present invention can comprise a material selected from the group consisting of surfactants, stabilizers, preservatives, co-solvent, humectants, emollients, chelating agents, tonicity-adjusting agents, and antioxidants.

[0232] In one aspect, any of these materials that may be used in a composition of the present invention is a physiologically acceptable material. In certain embodiments, any of these materials that may be used in the composition of the present invention is an ophthalmically or systemically acceptable material.

[0233] Water-soluble preservatives that may be employed include quaternary ammonium compounds such as benzalkonium chloride and various polyquaternium compounds. These agents may be present in individual amounts of from about 0.001 to about 2%by weight (preferably, about 0.01%to about 0.05%by weight) .

[0234] Non-limiting examples of surfactants include, but are not limited to, non-ionic surfactants, for example, polysorbates (such as polysorbate 20, polysorbate 80) , 4- (1, 1, 3, 3-tetramethylbutyl) phenol / poly (oxyethylene) polymers (such as the polymer sold under the trademark Tyloxapol) , poly (oxyethylene) -poly (oxypropylene) block copolymers, glycolic esters of fatty acids and the like, and mixtures thereof.

[0235] In one aspect, the pH of the composition is in the range from about 4 to about 8. Alternatively, the pH of the composition is in the range from about 6 to about 8, or from about 6.5 to about 8, or from about 6.5 to about 7.5.

[0236] In another aspect, the composition has a pH of about 7. Alternatively, the composition has a pH in a range from about 7 to about 7.5.

[0237] In still another aspect, the composition has a pH of about 7.4.

[0238] In yet another aspect, a composition also can comprise a viscosity-modifying compound designed to facilitate the administration of the composition into the subject or to promote the bioavailability in the subject. In still another aspect, the viscosity-modifying compound may be chosen so that the composition is not readily dispersed after being administered into an environment of an eye. Such compounds may enhance the viscosity of the composition, and include, but are not limited to: monomeric polyols, such as, glycerol, propylene glycol, ethylene glycol; polymeric polyols, such as, polyethylene glycol; various polymers of the cellulose family, such as hydroxypropylmethyl cellulose ( “HPMC” ) , carboxymethyl cellulose ( “CMC” ) sodium, hydroxypropyl cellulose ( “HPC” ) ; polysaccharides, such as hyaluronic acid and its salts, chondroitin sulfate and its salts, dextrans, such as, dextran 70; water soluble proteins, such as gelatin; vinyl polymers, such as, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, povidone; carbomers, such as carbomer 934P, carbomer 941, carbomer 940, or carbomer 974P; and acrylic acid polymers. In general, a desired viscosity can be in the range from about 1 to about 400 centipoises ( “cps” ) or mPa. s.

[0239] Non-limiting examples of chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid ( “EDTA” ) , diethylenetriaminepentakis (methylphosphonic acid) , etidronic acid, tetrasodium salt of etidronic acid (also known as “HAP” ) .

[0240] While the buffer itself is a “tonicity-adjusting agent” and a “pH-adjusting agent” that broadly maintains the ophthalmic solution at a particular ion concentration and pH, additional “tonicity-adjusting agents” can be added to adjust the final tonicity of the solution. Such tonicity-adjusting agents are well known to those of skill in the art and include, but are not limited to, mannitol, sorbitol, dextrose, sucrose, urea, propylene glycol, and glycerin. Also, various salts, including halide salts of a monovalent cation (e.g., NaCl or KCl) can be utilized. Typically, the tonicity of a formulation of the present invention is in the range from about 200 to 400 mOsm / kg. Alternatively, the tonicity of a formulation of the present invention is in the range from about 220 to 400 mOsm / kg, or from about 220 to 350 mOsm / kg, or from about 220 to 300 mOsm / kg, or from about 250 to 350 mOsm / kg.

[0241] Non-limiting examples of anti-oxidants include ascorbic acid (vitamin C) and its salts and esters; tocopherols (such as α-tocopherol) and tocotrienols (vitamin E) , and their salts and esters (such as vitamin E TGPS (D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate) ) ; glutathione; lipoic acid; uric acid; butylated hydroxyanisole ( “BHA” ) ; butylated hydroxytoluene ( “BHT” ) ; tertiary butylhydroquinone ( “TBHQ” ) ; and polyphenolic anti-oxidants (such as gallic acid, cinnanmic acid, flavonoids, and their salts, esters, and derivatives) .

[0242] Non-limiting examples of stabilizers includes sucrose, mannitol, sorbitol, and trehalose.

[0243] It should be understood that the proportions of the various components or mixtures may be adjusted for the appropriate circumstances.

[0244] In another aspect, a fusion protein of the present invention and appropriate amounts of one or more desired excipients are incorporated into a formulation for topical administration or injection to a portion of the eye, such as the anterior or posterior segment, or the vitreous humor. An injectable formulation can desirably comprise a carrier that provides a sustained release of the active ingredients, such as for a period longer than about 1 week (or longer than about 1, 2, 3, 4, 5, or 6 months) . In certain embodiments, a fusion protein of the present invention is included in a delivery device for sustained release of the active ingredients over a long period of time, such as 4, 5, 6 months or longer. An example of such delivery device is described in U.S. Patents 8,399,006 and 9,417,238.

[0245] In still another aspect, a composition comprising a fusion protein of the present invention and desired excipients is lyophilized and is reconstituted with a physiologically acceptable liquid carrier substantially immediately before administration to a subject.

[0246] In one embodiment, a compound or composition of the present invention can be injected with a fine-gauge needle, such as 25-35 gauge. Typically, an amount from about 25 μl to about 100 μl of a composition comprising about 25-8000 μg of a fusion protein of the present invention is administered into a patient. In one aspect, the antibody fusion protein has A-, B-, C-, and D-chain comprising amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 58-61, 62-65, 66-69, 70-73, 74-77, 83-86, 87-90, and 91-94, or A-, B-, C-chain comprising amino acid sequences selected from the group consisting of 78-82 and 95-96, and conservatively modified variants thereof. A concentration of such antibody fusion protein is selected from the ranges disclosed above. Other antibody fusion proteins comprising various VEGF-A-, IL-6-or IL-6R-, and Ang-2-binding units as disclosed herein can also be incorporated into compositions disclosed herein.

[0247] In still another aspect, a fusion protein of the present invention is incorporated into an ophthalmic device that comprises a biodegradable material, and the device is implanted into a posterior-segment tissue of a subject to provide a long-term (e.g., longer than about 1 week, or longer than about 1, 2, 3, 4, 5, 6 months, or one year) treatment or control of an angiogenic disease, condition, or disorder. Such a device may be implanted by a skilled physician in the subject’s ocular or periocular tissue. Non-limiting examples of ophthalmic implant systems or devices for the sustained-release of an active ingredient are disclosed in U.S. Patents 5,378,475; 5,773,019; 5,902,598; 6,001,386; 6,051,576; and 6,726,918, which are incorporated herein by reference in their entireties.

[0248] In still another aspect, a method for treating or controlling an ophthalmic angiogenic disease, condition, or disorder comprises administering a composition comprising a fusion protein of the present invention to a subject in need thereof.

[0249] In still another aspect, a method for treating or controlling an ophthalmic angiogenic disease, condition, or disorder comprises administering a composition comprising a fusion protein having A-, B-, C-, and D-chain comprising amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 58-61, 62-65, 66-69, 70-73, 74-77, 83-86, 87-90, and 91-94, or a fusion protein having A-, B-, and C-chain comprising amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 78-82 and 95-96, and conservatively modified variants thereof to a subject in need of such treatment or control. Other antibody fusion proteins comprising various VEGF-A-, IL-6-or IL-6R-, and Ang-2-binding units as disclosed herein can also be used in such method.

[0250] In still another aspect, a method for treating or controlling an ophthalmic angiogenic disease, condition, or disorder having an etiology in excessive angiogenesis of in the posterior segment of an eye comprises intravitreally injecting a composition comprising a fusion protein having A-, B-, C-, and D-chain comprising amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 58-61, 62-65, 66-69, 70-73, 74-77, 83-86, 87-90, and 91-94, or a fusion protein having A-, B-, and C-chain comprising amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 78-82 and 95-96, and conservatively modified variants thereof.

[0251] In another embodiment, such disease, condition, or disorder is selected from the group consisting of: macular edema resulting from diabetes, uveitis, central and branch retinal vein occlusion, choroidal neovascularization including neovascular age-related macular degeneration (wet age-related macular degeneration) , polypoidal choroidal vasculopathy (PCV) and myopic choroidal neovascular degeneration, vascular leak, non-proliferative and proliferative diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, corneal neovascularization, corneal inflammation, and neovascular glaucoma.

[0252] In yet another aspect, a composition of the present invention is administered once a week, once a month, twice a month, once a year, twice a year, three times a year, four times a year, or at a suitable frequency that is determined to be appropriate for treating or controlling an anterior-segment inflammatory disease, condition, or disorder.

[0253] In still another aspect, a fusion protein of the present invention can also be used for the treatment or control of tumors, systemic inflammatory diseases or conditions, or autoimmune diseases such as arthritis. Such treatment or control may be effected by, for example, systemic administration. Dosages and regimen for treating such diseases or conditions may be determined or recommended for the particular disease or condition by medical practitioners. Exemplary dosages for treating systemic diseases are in the range of 1-20 mg, 2-20 mg, 5-20 mg, 10-20 mg, 2-15 mg, 5-15 mg, or 10-15 mg of a fusion protein per kg of body weight. Such dosage may be administered once a week, once a month, twice a month, once a year, twice a year, three times a year, four times a year, or at a suitable frequency that is determined to be appropriate for treating or controlling such a disease. EXAMPLE 1: Expression and Purification of Antibody Fusion Proteins of the Present  Invention

[0254] Antibody fusion proteins of the present invention can be successfully expressed in Chinese hamster ovarian ( “CHO” ) cells. With one round of purification using AmMagTM Protein A magnetic beads, purities between 66.4%and 89.2%may be achieved for the proteins produced. With the second round of purification by size exclusion chromatography using HiLoad 16 / 600 Superdex 200pg preparative SEC columns, purities of > 95%could be achieved for most proteins.

[0255] cDNAs encoding the amino acid sequences of antibody fusion proteins disclosed herein were synthetized, and expressing vectors based on the circular pcDNA3.4 vector system were constructed for each cDNA. The expression vectors were used to transiently transfect CHO cells with chemically defined culture media. The produced proteins were initially purified by AmMagTM Protein A magnetic beads followed by size exclusion chromatography using HiLoad 16 / 600 Superdex 200pg preparative SEC columns and then subjected to 0.2μm sterile filtration to get the bulk of high purity. See Figs. 11A and B. EXAMPLE 2: ELISA Binding Affinities for Human VEGF-A165, IL-6, IL-6R and Ang-2.

[0256] ELISA assays were performed using 96-well plates coated with target recombinant human proteins including VEGF-A165, IL-6, IL-6R and Ang-2 (4 μg / ml, 50μl / well) at +4℃ for 16 hours. After non-specific blocking using 1%BSA at 25℃ for 1 hour, a series of dilutions of test antibodies ( “Abs” ) were added into the coated wells and incubated at 25℃ for 1 hour. The bound Abs were detected using a secondary Ab (goat anti-human IgG1-Fc) conjugated with horseradish peroxidase (HRP) followed by OD450 reading. The binding affinities of EB-108 series of molecules for VEGF-A165, IL-6, IL-6R, and Ang-2 are at sub-nanomolar scales and comparable to their corresponding comparators including aflibercept, faricimab, nesvacumab, vamikibart, and tocilizumab. Aflibercept is a human Fc fusion protein that binds to VEGF-A, VEGF-B and PlGF. Faricimab is a bispecific antibody that inhibits VEGF-A and Ang-2. Aflibercept and faricimab have been approved for intravitreal injections to treat retinal vascular diseases including nAMD, DME, and macular edema due to RVO. Nesvacumab is preclinical stage monoclonal antibody against Ang-2. Vamikibart is a preclinical stage monoclonal antibody against IL-6. Tocilizumab is a monoclonal antibody against IL-6R and has been approved for the treatment of inflammatory diseases including moderate and severe rheumatoid arthritis, active polyarticular or systemic juvenile idiopathic arthritis, giant cell arteritis, scleroderma with interstitial lung disease, COVID-19, and cytokine release syndrome. See Figs. 12-19. EXAMPLE 3: ELISA Binding Affinities for Human Ang-1

[0257] The same ELISA procedure was performed with recombinant humanAng-1. The EB-108 series of antibody fusion proteins do not bind human Ang-1. See Fig. 20. EXAMPLE 4: Inhibition of VEGF-A165-Mediated VEGFR-2 Signaling

[0258] The effects of EB-108 antibody fusion proteins on inhibition of VEGF-A165-mediated VEGFR-2 signaling were studied using an engineered HEK-293 cell line, in which the firefly luciferase gene is expressed under the control of nuclear factor activated T cell response elements (VEGFR-2-NF-AT) . Aflibercept and faricimab were used as two comparators. Aflibercept is a human Fc fusion protein containing the binding domain 2 of VEGFR-1 and the binding domain 3 of VEGFR-2 for inhibition of VEGF-A, VEGF-B and PlGF. Faricimab is a bispecific antibody that inhibits VEGF-A and Ang-2. Aflibercept and faricimab have been approved for intravitreal injections to treat retinal vascular diseases including nAMD, DME, and macular edema due to RVO. Briefly, serial dilutions of EB-108 antibody fusion proteins, aflibercept and faricimab were incubated with 60 ng / ml of human VEGF-A165 at room temperature for 30 minutes, then VEGFR-2 luciferase reporter cells were added into each well to study the effects of test antibodies on inhibiting VEGF-A165 mediated VEGFR-2 signaling. The results indicate that EB-108 antibody fusion proteins are comparable to aflibercept and faricimab in inhibiting VEGF-A165-stimulated VEGFR-2 signaling in a dose-dependent response as indicated by their IC50 values. See Fig. 21. EXAMPLE 5: Inhibiting IL-6 mediated TF-1 cell proliferation

[0259] The effects of EB-108 antibody fusion proteins containing a functional unit targeting IL-6 or IL-6R on inhibiting IL-6 / IL-6R signaling were studied by TF-1 cell proliferation assays, wherein vamikibart, a preclinical stage monoclonal antibody against IL-6, and tocilizumab, a clinical stage monoclonal antibody against IL-6R, were used as comparators. Briefly, IL-6 mediated TF-1 cell proliferation was conducted using cell viability assay with a kit obtained from Promega according to the manufacturer’s instructions. Activation of IL-6 / IL-6R signaling in TF-1 cells stimuated by recombinant human IL-6 results in TF-1 cell proliferation which is reflected by increased OD492 readings, whereas inhibition of IL-6 / IL-6R signaling will demonstrate the opposite effect. EB-108 antibody fusion proteins, vamikibart, and tocilizumab showed concentration-dependent inhibition of TF-1 cell proliferation stimulated by recombinant human IL-6 ligand. See Figs. 22 and 23. EXAMPLE 6: Inhibition of Ang-2 / Tie-2 Interaction

[0260] The effects of EB-108 antibody fusion proteins on inhibiting Ang-2 / Tie-2 interaction were studied by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis using engineered HEK-293 cells that overexpress the human Tie-2 receptor, wherein faricimab and nesvacumab were used as two comparators. Faricimab is a bispecific antibody that inhibits VEGF-A and Ang-2 and has been approved for intravitreal injections to treat retinal vascular diseases including nAMD, DME, and macular edema due to RVO. Nesvacumab is a preclinical stage monoclonal antibody against Ang-2. Briefly, serial dilutions of EB-108 antibody fusion proteins, faricimab, and nesvacumab were incubated with 100 ng / ml of human Ang-2 at 4℃ for 60 minutes, then Tie-2-expressing cells were added into each well to study the effects of test antibodies on blocking Ang-2 binding to Tie-2 receptor via FACS analysis. The results indicate that EB-108 antibody fusion proteins, in a dose response manner, showed a similar or better effect than faricimab and nesvacumab in blocking Ang-2 binding to Tie-2 receptor. See Fig. 24. AMINO ACID AND NUCLEIC ACID SEQUENCE LISTING

[0261]

[0262]

[0263]

[0264]

[0265]

[0266]

[0267]

[0268]

[0269]

[0270]

[0271]

[0272]

[0273]

[0274]

[0275]

[0276]

[0277]

[0278]

[0279]

[0280]

[0281]

[0282]

[0283]

[0284]

[0285]

[0286]

[0287]

[0288]

[0289]

[0290]

[0291]

[0292]

[0293]

[0294]

[0295]

[0296]

[0297]

[0298]

[0299]

[0300]

[0301]

[0302]

[0303]

[0304]

[0305]

[0306]

[0307]

[0308]

[0309]

[0310]

[0311]

[0312]

[0313]

[0314]

[0315]

[0316]

[0317]

[0318]

[0319]

[0320]

[0321]

[0322]

[0323]

[0324]

[0325]

[0326]

[0327]

[0328]

[0329]

[0330]

[0331]

[0332]

[0333]

[0334]

[0335]

[0336]

[0337]

[0338]

[0339]

[0340]

[0341]

[0342]

[0343]

[0344]

[0345]

[0346]

[0347]

[0348]

[0349]

[0350]

[0351]

[0352]

[0353]

[0354]

[0355]

[0356]

[0357]

[0358]

[0359]

[0360]

[0361]

[0362]

[0363]

[0364]

[0365]

[0366]

[0367]

[0368]

[0369]

[0370]

[0371]

[0372]

[0373]

[0374]

[0375]

[0376]

[0377]

[0378]

[0379]

[0380]

[0381]

[0382]

[0383]

[0384]

[0385]

[0386]

[0387]

[0388]

[0389]

[0390]

[0391]

[0392]

[0393]

[0394]

[0395]

[0396]

[0397]

[0398]

[0399]

[0400]

[0401]

[0402]

[0403]

[0404]

[0405]

[0406]

[0407]

[0408]

[0409]

[0410]

[0411]

[0412]

[0413]

[0414]

[0415]

[0416]

[0417]

[0418]

[0419]

[0420]

[0421]

[0422]

[0423]

[0424]

[0425]

[0426]

[0427]

[0428]

[0429]

[0430]

[0431]

[0432]

[0433]

[0434]

[0435]

[0436]

[0437]

[0438]

[0439]

[0440]

[0441]

[0442]

[0443]

[0444]

[0445]

[0446]

[0447]

[0448]

[0449]

[0450]

[0451]

[0452]

[0453]

[0454]

[0455]

[0456]

[0457]

[0458]

[0459]

[0460]

[0461]

[0462]

[0463]

[0464]

[0465]

[0466]

[0467]

[0468]

[0469]

[0470]

[0471]

[0472]

[0473]

[0474]

[0475]

[0476]

[0477] The contents of the electronic sequence listing (EB-108-Part_2_Sequence_Listing. xml; Size: 351 KB; and Date of Creation: September 1, 2025) are herein incorporated by reference in their entirety.

[0478] While specific embodiments of the present invention have been described in the foregoing, it will be appreciated by those skilled in the art that many equivalents, modifications, substitutions, and variations may be made thereto without departing from the spirit and scope of the invention as defined in the appended claims.

Claims

1.A fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof, comprising a VEGF-binding unit, an IL-6-or IL-6R-binding unit, and an Ang-2-binding unit; wherein the fusion protein is capable of binding substantially to at least one VEGF family member, IL-6 or IL-6R, and Ang-2; and wherein the VEGF-binding unit, the IL-6-or IL-6R-binding unit, and the Ang-2-binding unit are linked together.2.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1; wherein each of the VEGF-A-binding unit and the IL-6-or IL-6R-binding unit comprises an antibody against VEGF-A and IL-6 or IL-6R, respectively; wherein said antibody comprises a heavy chain comprising a variable domain and a constant domain, and a light chain comprising a variable domain and a constant domain.3.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 2; wherein the constant domain of the heavy chain of the VEGF-A antibody and the IL-6 or IL-6R antibody comprises a modified CH3 domain of human IgG1.4.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 3; wherein selected amino acid residues of the CH3 domain of one antibody are substituted with other amino acid residues having larger side chain volumes, and selected amino acid residues of the CH3 domain of the other antibody are substituted with other amino acid residues having smaller side chain volumes.5.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 3; wherein the modified CH3 domain of one antibody comprises a protuberance and the modified CH3 domain of the other antibody comprises a cavity for accepting the protuberance therein.6.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 3; wherein the modified CH3 domain of one antibody comprises the modifications Y349C and T366W, and the modified CH3 domain of the other antibody comprises the modifications S354C (or E356C) , T366S, L368A, and Y407V; and wherein amino acid positions are numbered according to the EU numbering system.7.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 6; wherein the CH1 domain of the heavy chain and the CL domain of the light chain of the IL-6 or IL-6R antibody are interchanged.8.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 7; wherein the heavy chain comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the domains VH, CL, hinge, CH2, and CH3; and the light chain comprises, from the N-terminus to the C-terminus, the domains VL and CH1.9.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 6; wherein the Ang-2-binding unit comprises two Ang-2-binding polypeptides or Ang-2 sdAbs, one of the Ang-2-binding polypeptides or Ang-2 sdAbs is linked to the C-terminus or the N-terminus of the heavy chain of the VEGF-A antibody, and the other Ang-2-binding polypeptides or Ang-2 sdAbs is linked to the C-terminus or the N-terminus of the IL-6 or IL-6R antibody.10.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 8; wherein the Ang-2-binding unit comprises two Ang-2-binding polypeptides or Ang-2 sdAbs, one of the Ang-2-binding polypeptides or Ang-2 sdAbs is linked to the C-terminus or the N-terminus of the heavy chain of the VEGF-A antibody, and the other Ang-2-binding polypeptides or Ang-2 sdAbs is linked to the C-terminus or the N-terminus of the IL-6 or IL-6R antibody.11.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1, comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs:58 through 96.12.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1, comprising amino acid sequences of SEQ ID NOs: 58-61.13.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1, comprising amino acid sequences of SEQ ID NOs: 62-65.14.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1, comprising amino acid sequences of SEQ ID NOs: 66-69.15.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1, comprising amino acid sequences of SEQ ID NOs: 70-73.16.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1, comprising amino acid sequences of SEQ ID NOs: 74-77.17.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1, comprising amino acid sequences of SEQ ID NOs: 83-86.18.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1, comprising amino acid sequences of SEQ ID NOs: 87-90.19.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1, comprising amino acid sequences of SEQ ID NOs: 91-94.20.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1, comprising a first amino acid sequence having SEQ ID NO: 78 or 95, a second amino acid sequence having SEQ ID NO: 79 or 96, and a third amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 80, 81, and 82.21.The antibody fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-20, wherein said antibody fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof is capable of binding at least a VEGF family member, IL-6 or IL-6R, and Ang-2 with an equilibrium dissociation constant (KD) in the range from about 1x10-6 M to about 1x10-12 M or from about 1x10-8 M to about 1x10-12 M.22.An isolated nucleic acid molecule encoding a fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any of claims 1-21.23.The isolated nucleic acid molecule of claim 22, wherein said nucleic acid molecule comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 166-204.24.An expression vector comprising the nucleic acid molecule of claim 22 or 23.25.The expression vector of claim 22, comprising said nucleic acid molecule operatively linked to an expression control sequence.26.A host-vector system comprising the expression vector of claim 24 or 25 in a host cell.27.A method of producing a substantially purified antibody fusion protein, said method comprising: (a) growing cells of the host-vector system of claim 23 under conditions permitting production of the antibody fusion protein; and (b) recovering the antibody fusion protein to produce a recovered antibody fusion protein; and (c) purifying said recovered antibody fusion protein to produce the substantially purified antibody fusion protein.28.A method for treating or controlling at least a disease, condition, or disorder, in a subject in need thereof, which has etiology selected from the group consisting of aberrant angiogenesis, excessive angiogenesis, vascular leak, inflammation, and combinations thereof; wherein said method comprises administering to said subject an amount of a composition of a fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-20.29.The method of claim 28; wherein said disease, condition, or disorder is selected from the group consisting of: macular edema resulting from diabetes, uveitis, central and branch retinal vein occlusion, choroidal neovascularization, neovascular age-related macular degeneration, polypoidal choroidal vasculopathy, myopic choroidal neovascularization, vascular leak, non-proliferative and proliferative diabetic retinopathy, corneal neovascularization, corneal inflammation, myopic neovascularization, and neovascular glaucoma.30.The method of claim 29; wherein the subject is administered with a dose of about 25-8000 micrograms of the fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof.31.The method of claim 30; wherein the composition is administered to the subject as an eye drop, a punctal plug, intracameral, retrobulbar, subconjunctival, peribulbar, subtenon, juxta-scleral, trans-scleral, intravitreal, subretinal, or suprachoroidal injection.32.The method of claim 30; wherein the composition is administered to the subject for a period of at least one month if intraocularly administered.33.The method of claim 30; wherein the composition is administered to the subject at a frequency of at least once per month if intraocularly administered.34.A method for treating or controlling at least a systemic disease, condition, or disorder, in a subject in need thereof, which has etiology in a condition selected from the group consisting of aberrant angiogenesis, excessive angiogenesis, vascular leak, inflammation, and combinations thereof; wherein said method comprises administering to said subject an amount of a composition of a fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-21.35.The method of claim 34; wherein said systemic disease, condition, or disorder involves tumor growth, tumor metastasis, a combination of tumor growth and metastasis, atherosclerosis, and psoriasis.36.A pharmaceutical composition for use to treat or control at least a disease, condition, or disorder, which has etiology in a condition selected from the group consisting of aberrant angiogenesis, excessive angiogenesis, vascular leak, inflammation, and combinations thereof; wherein said composition comprises a fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-21.37.The pharmaceutical composition of claim 36, wherein the disease, condition, or disorder is selected from the group consisting of macular edema resulting from diabetes, uveitis, central and branch retinal vein occlusion, choroidal neovascularization, neovascular age-related macular degeneration, polypoidal choroidal vasculopathy, myopic choroidal neovascularization, vascular leak, non-proliferative and proliferative diabetic retinopathy, corneal neovascularization, corneal inflammation, myopic neovascularization, neovascular glaucoma, tumor growth, tumor metastasis, a combination of tumor growth and metastasis, atherosclerosis, and psoriasis.38.A pharmaceutical composition comprising a fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claim 1-21, and a pharmaceutically acceptable carrier.39.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-10; wherein the IL-6-binding unit is selected from the group consisting of olokizumab, siltixumab, vamikibart, sirukumab, ziltivekimab, Medarex, clazakizumab, and IL-6-binding fragments or domains thereof.40.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-10; wherein the IL-6R-binding unit is selected from the group consisting of tocilizumab, sarilumab, and satralizumab.41.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-10; wherein the VEGF-binding unit is selected from the group consisting of bevacizumab and ranibizumab.42.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-10; wherein the Ang-2-binding unit comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs:32-45.

Images