Engineered exosomes for treatment of metabolic disorders

Abstract

Disclosed is an engineered exosome, comprising (a) an FGF21 polypeptide, fused to a first anchoring polypeptide, (b) an IL-27 polypeptide, fused to a second anchoring polypeptide, and (c) an activin receptor type II polypeptide, fused to a third anchoring polypeptide, wherein (a), (b) and (c) are anchored on a membrane of the exosome via the first, second and third anchoring polypeptide, respectively, and wherein the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide are exposed on an outer surface of the membrane of the exosome. Also disclosed are compositions, nucleic acid constructs, and uses of the exosome in treating metabolic disorders.

Description

ENGINEERED EXOSOMES FOR TREATMENT OF METABOLIC DISORDERSField of the Invention

[0001] The present disclosure relates to engineered exosomes, in particular to an exosome carrying a plurality of polypeptides anchored external to the membrane of the exosome. The present disclosure also relates to a composition comprising the engineered exosome, a nucleic acid construct comprising the polynucleotide encoding the fusion proteins and uses of the engineered exosome in preventing or treating metabolic disorders including obesity and overweight.Background

[0002] Treatment of metabolic disorders such as obesity remains elusive as the regulation of metabolism and fat storage involves complex biological feedback systems. To date, drugs effective in regulating metabolic dysfunction often exhibit several side effects, which limit their usefulness in patient populations, and in particular, in obese patient populations, who may require long term treatment. Overweight and obesity are defined as abnormal or excessive fat accumulation that presents a risk to health. Body mass index (BMI) is calculated based on body weight and height. A BMI over 25 is considered as overweight, and over 30 as obese. Both overweight and obesity are systemic diseases which are associated with the leading causes of morbidity and death in the United States, including type 2 diabetes, heart disease, stroke, and some types of cancer. Obesity is thus a serious condition because it is also associated with poorer mental health outcomes, reduced quality of life, and contributes to a decline in life expectancy.

[0003] Several medicaments have been approved for the treatment of obesity. One example is Semaglutide sold under the trade name Wegovy. Semaglutide is a glucagon-like peptide-1 (GLP-1) agonist which was originally developed and approved for the treatment of type 2 diabetes. The most noteworthy effects of GLP-1 agonists are their ability to promote insulin secretion in a glucose-dependent manner by binding to GLP-1 receptors expressed on the pancreatic beta cells. Almost as importantly, GLP-1 agonists have been shown to inhibit glucagon secretion at glucose levels above fasting levels. Critically, this does not affect the glucagon response to hypoglycemia, making GLP-1 agonists a safe anti-diabetic drug with very low incidence of hypoglycemia compared to insulin.

[0004] In June 2021, Semaglutide was approved by the FDA for chronic weight management in adults with obesity or overweight with at least one weight-related condition (such as high blood pressure, type 2 diabetes, or high cholesterol) . As an anti-obesity drug, GLP-1 agonists work by binding to GLP-1 receptors in hypothalamus thereby suppressing appetite. Furthermore, GLP-1 agonists bind to GLP-1 receptors in the stomach, inhibiting gastric emptying, acid secretion, and motility, which collectively promote satiety. Consequently, diabetic subjects treated with GLP-1 receptor agonists often also experience a beneficial weight loss in addition to controlling their blood sugar levels. However, there is a need for additional compositions and methods to treat metabolic disorders including obesity.Summary of the Invention

[0005] In one aspect of the invention, provided is an engineered exosome, comprising (a) an FGF21 polypeptide, fused to a first anchoring polypeptide, (b) an IL-27 polypeptide, fused to a second anchoring polypeptide, and (c) an activin receptor type II polypeptide, fused to a third anchoring polypeptide, wherein (a) , (b) and (c) are anchored on a membrane of the exosome via the first, second and third anchoring polypeptide, respectively, and wherein the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide are exposed on an outer surface of the membrane of the exosome.

[0006] Another aspect of the disclosure relates to a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (a) an FGF21 polypeptide fused to a first anchoring polypeptide, (b) an IL-27 polypeptide fused to a second anchoring polypeptide, and (c) an activin receptor type II polypeptide, fused to a third anchoring polypeptide.

[0007] A further aspect of the disclosure relates to a vector comprising the nucleic acid construct described herein.

[0008] A further aspect of the disclosure relates to a cell transduced with the vector as described herein, wherein the polynucleotide is integrated into the genome of the cell.

[0009] A further aspect of the disclosure relates to a method of producing an engineered exosome as disclosed herein, comprising (a) transducing the cell as described above with the vector as described above; (b) culturing the cell in a condition allowing secretion of an exosome from the cell; and (c) collecting and purifying the exosome.

[0010] A further aspect of the disclosure relates to use of the engineered exosomes, or the composition as disclosed herein in manufacturing a medicament for treatment of a metabolic disorder such as obesity, overweight, type II diabetes, and / or hyperlipidemia and / or for enhancement of fat metabolism, downregulation of blood glucose, and / or downregulation of blood LDL-C; and / or for reduction of abdominal volume or waist circumference.

[0011] A further aspect of the disclosure relates to a method for treating a metabolic disorder such as obesity, overweight, type II diabetes, and / or hyperlipidemia and / or for enhancement of fat metabolism, downregulation of blood glucose, and / or downregulation of blood LDL-C; and / or for reduction of abdominal volume or waist circumference, comprising administering to a subject an effective amount of the engineered exosomes, or the composition as disclosed herein.

[0012] A further aspect of the disclosure relates to the engineered exosomes, or the composition as disclosed herein for use in treatment of a metabolic disorder such as obesity, overweight, type II diabetes, and / or hyperlipidemia and / or in enhancement of fat metabolism, downregulation of blood glucose, and / or downregulation of blood LDL-C; and / or in reduction of abdominal volume or waist circumference.

[0013] These and other aspects and advantages of the disclosure will be apparent from the detailed description provided in the following. Brief Description of the Figures

[0014] Figure 1. Scheme of construction of engineered exosomes derived from stable cell lines. Mammalian cells, e.g. HEK293 or CHO-K1 cells were cultured and infected with lentiviruses, which contain functional genes FGF21, IL-27, and ActRIIB. Then antibiotics were used for stable cell line selection. After three passages selection, the expression of the functional genes was identified in both cell pellet and exosomes. After confirmation of the expression, an adaptation of stable cell line to a serum-free condition was performed. Finally, the cultured supernatant was collected from the serum-free stable cell line and the exosomes were purified via ultracentrifuging.

[0015] Figure 2. Characterization of engineered exosomes derived from stable cell lines. (A) The particle diameter and particle concentration of Exo-NO. 1 derived from the stable cell lines were analyzed by NanoFCM. (B) Exo-NO. 1 from stable cell lines were further inspected by transmission electron microscopy (TEM) . (C) Immunoblotting analysis of Exo-NO. 1 with antibodies against CD63, the fused exosomes scaffold protein. (D) The concentrations of functional proteins within Exo-NO. 1 were measured via ELISA kit.

[0016] Figure 3. Engineered exosomes promoted lipolysis on zebrafish model. Zebrafishes on 2 days after fertilization (2 dpf) were soaked with mock (A) or Exo-NO. 1 (B) at the concentration of 1.6E6 particles / ml for 24h, then stained with Nile red dye and the images were captured. The fluorescence intensity of yolk sac was analyzed via NIS-ElementsD3.20 (C) . The student’s T test was used for statistical analysis. **, P < 0.01.

[0017] Figure 4. Engineered exosomes regulated fat metabolism in diet-induced obesity (DIO) mouse model. The DIO (diet-induced obesity) mouse model was used for the evaluation of fat metabolism when treated with engineered exosomes (Exo-NO. 1) . The abdomen of DIO mice was topically applied with Exo-NO. 1 or PBS (Mock) twice a week for four weeks (A) . The body weight (B) , abdominal circumference (C) and food Intake (D) were measured every 5 days for a month. At the end of the study, the fat content (E) and muscle content (G) in mice were analyzed via a small animal body composition analyzer. The abdominal adipose tissues were analyzed via HE staining (F) . The student’s T test was used for statistical analysis. **, P < 0.01.

[0018] Figure 5. Engineered exosomes (Exo-NO. 1) downregulated blood glucose and Low-Density Lipoprotein Cholesterol (LDL-C) content in DIO mouse model. The DIO mouse model was used for the evaluation of fat metabolism when treated with Exo-NO. 1. The abdomen of DIO mice was topically applied with Exo-NO. 1 or PBS (Mock) twice a week for four weeks. At the end of the study, blood glucose (A) was measured via Glucometer Strip Method. The LDL-C content (B) was detected with automatic biochemical analyzer. The student’s T test was used for statistical analysis. *, P < 0.05, ***, P < 0.001.

[0019] Figure 6. Four cases (A-D) showed that Exo-NO. 1 can effectively reduce abdominal volume and waistline. For evaluation of abdominal volume and waistline, the images were captured and analyzed via VECTRA H2 3D Stereo image camera on Day 7 and Day 28, which can show a 360-degree presentation of the contours of various parts of the body and do a visual analysis of the condition of the bottom of the skin as well as the decreased / increased volume. The application method of Exo-NO. 1 is smearing use every three days for 4 weeks.Detailed Description of the Invention

[0020] Definition

[0021] The words “a” and “an” when used in the present specification in concert with the word comprising, including the claims, denote “one or more. ”

[0022] As used herein, the terms “or” and “and / or” are utilized to describe multiple components in combination or exclusive of one another. For example, “x, y, and / or z” can refer to “x” alone, “y” alone, “z” alone, “x, y, and z, ” “ (x and y) or z, ” “x or (y and z) , ” or “x or y or z. ” It is specifically contemplated that x, y, or z may be specifically excluded from an embodiment.

[0023] Throughout this application, the term “about” is used according to its plain and ordinary meaning in the area of cell and molecular biology to indicate that a value includes the standard deviation of error for the device or method being employed to determine the value.

[0024] “Homology” or “identity” or “similarity” refers to sequence similarity between two peptides or between two nucleic acid molecules. Homology can be determined by comparing a position in each sequence which may be aligned for purposes of comparison. When a position in the compared sequence is occupied by the same base or amino acid, then the molecules are homologous at that position. A degree of homology between sequences is a function of the number of matching or homologous positions shared by the sequences. An “unrelated” or “non-homologous” sequence shares less than 40%identity, though preferably less than 25%identity, with one of the sequences of the present disclosure.

[0025] A polynucleotide or polynucleotide region (or a polypeptide or polypeptide region) has a certain percentage (for example, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%or 99%) of “sequence identity” to another sequence means that, when aligned, that percentage of bases (or amino acids) are the same in comparing the two sequences. This alignment and the percent homology or sequence identity can be determined using software programs known in the art.

[0026] The term “linker” as used herein refers to a short fragment of amino acid (AA) or nucleotide sequence containing two or more amino acids or nucleotides which may be same or different.

[0027] The terms “reduce, ” “inhibit, ” “diminish, ” “suppress, ” “decrease, ” “prevent” and grammatical equivalents (including “lower, ” “smaller, ” etc. ) when in reference to the expression of any symptom in an untreated subject relative to a treated subject, mean that the quantity and / or magnitude of the symptoms in the treated subject is lower than in the untreated subject by any amount that is recognized as clinically relevant by any medically trained personnel. In one embodiment, the quantity and / or magnitude of the symptoms in the treated subject is at least 10%lower than, at least 25%lower than, at least 50%lower than, at least 75%lower than, and / or at least 90%lower than the quantity and / or magnitude of the symptoms in the untreated subject.

[0028] As used herein, the term “therapeutically effective amount” is synonymous with “effective amount” , “therapeutically effective dose” , and / or “effective dose” and refers to the amount of exosome that will elicit the biological, pharmaceutical, or clinical response being sought by the practitioner in an individual in need thereof. As one example, an effective amount is the amount sufficient to improve overweight. The appropriate effective amount to be administered for a particular application of the disclosed methods can be determined by those skilled in the art, using the guidance provided herein. For example, an effective amount can be extrapolated from in vitro and in vivo assays as described in the present specification. One skilled in the art will recognize that the condition of the individual can be monitored throughout the course of therapy and that the effective amount of an exosome or composition disclosed herein that is administered can be adjusted accordingly.

[0029] As used herein, the terms “treatment, ” “treat, ” or “treating” refers to intervention in an attempt to alter the natural course of the individual or cell being treated and may be performed either for prophylaxis or during the course of pathology of a disease or condition. Treatment may serve to accomplish one or more of various desired outcomes, including, for example, preventing occurrence or recurrence of disease, alleviation of symptoms, and diminishment of any direct or indirect pathological consequences of the disease, lowering the rate of disease progression, amelioration or palliation of the disease state, and remission or improved prognosis.

[0030] The term “subject, ” as used herein, may be used interchangeably with the term “individual” or “patient” and generally refers to an individual in need of a therapy. The subject can be a mammal, such as a human, dog, cat, horse, pig, or rodent. The subject can be a patient, e.g., having or being suspected of having or at risk for having a disease or medical condition related to metabolic disorders such as obesity, overweight, or type II diabetes (T2D) . For subjects having or suspected of having a medical condition directly or indirectly associated with metabolic disorders, the medical condition may be of one or more types.

[0031] “Carrier” , as used herein, refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic agent is administered. Such pharmaceutical carriers can be sterile liquids, such as saline solutions in water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. A saline solution is a preferred carrier when the composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene glycol, water, ethanol, and the like. The composition, if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained-release formulations, and the like. Such compositions will contain a therapeutically effective amount of the compound, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier so as to provide the form for proper administration to the patient. The formulation should suit the mode of administration.

[0032] The term “N-terminal amino acid residue” or “N terminus” refers to the first amino acid residue (amino acid number 1) of a polypeptide or peptide in the direction of amino-to carboxyl-terminus. The term “C-terminal amino acid residue” or “C terminus” refers to the last amino acid residue (amino acid number n, wherein n = the total number of residues in the peptide or polypeptide) of a polypeptide or peptide, in the direction of amino-to carboxyl-terminus.

[0033] As used herein, the term “FGF21” refers to a member of the fibroblast growth factor (FGF) protein family and has the GenBank Accession No. NP_061986.1 (the corresponding polynucleotide sequence of which has NCBI reference sequence number NM_019113.2) , and can be found in such issued patents as, e.g., U.S. Pat. No. 6,716,626B1, assigned to Chiron Corporation.

[0034] The term “fibroblast growth factor 21 polypeptide” or “FGF21 polypeptide” , as used herein, refers to any FGF21 protein known in the art. For purposes of this disclosure, the term “FGF21 polypeptide” can be used interchangeably to refer to any full-length FGF21 polypeptide, which consists of 209 amino acid residues; any mature form of the polypeptide, which consists of 181 amino acid residues (SEQ ID NO: 1) , and in which the 28 amino acid residues at the amino-terminal end of the full-length FGF21 polypeptide (i.e., which constitute the signal peptide) have been removed; and variants thereof.

[0035] The terms “FGF21 protein variant, ” “human FGF21 variant, ” “FGF21 polypeptide or protein variant” , “FGF21 mutant, ” or any like terms, are defined as comprising human FGF21 in which a naturally occurring (i.e., wild-type) FGF21 amino acid sequence has been modified, e.g., in which at least one amino acid of the wild-type protein has been substituted by another amino acid, and / or removed. Additionally, the variants may include N-and / or C-terminal truncations relative to the wild-type FGF21 protein. Generally speaking, a variant possesses some modified property, structural or functional, of the wild-type protein. For example, the variant may have enhanced or improved physical stability in concentrated solutions (e.g., less hydrophobic mediated aggregation) , enhanced or improved plasma stability when incubated with blood plasma or enhanced or improved bioactivity while maintaining a favorable bioactivity profile.

[0036] Acceptable amino acid substitutions and modifications which constitute differences between the FGF21 polypeptide and protein variants and mutants of the methods of the invention and wild-type FGF21 include, but are not limited to, one or more amino acid substitutions, including substitutions with non-naturally occurring amino acid analogs, and truncations. Thus, FGF21 protein variants include, but are not limited to, site-directed FGF21 mutants, truncated FGF21 polypeptides, proteolysis-resistant FGF21 mutants, aggregation-reducing FGF21 mutants, FGF21 combination mutants, and FGF21 fusion proteins, as described herein.

[0037] The variant may possess increased compatibility with pharmaceutical preservatives (e.g., m-cresol, phenol, benzyl alcohol) , thus enabling the preparation of a preserved pharmaceutical formulation that maintains the physiochemical properties and biological activity of the protein during storage. Accordingly, variants with enhanced pharmaceutical stability relative to wild-type FGF21, have improved physical stability in concentrated solutions under both physiological and preserved pharmaceutical formulation conditions, while maintaining biological potency. By way of non-limiting example, the variants of the invention may be more resistant to proteolysis and enzymatic degradation; may have improved stability; and may be less likely to aggregate, than their wild-type counterparts. As used herein, these terms are not mutually exclusive or limiting, it being entirely possible that a given variant has one or more modified properties of the wild-type protein.

[0038] As used herein, the term “truncated FGF21 polypeptide” refers to an FGF21 polypeptide in which amino acid residues have been removed from the amino-terminal (or N-terminal) end of the FGF21 polypeptide, amino acid residues have been removed from the carboxyl-terminal (or C-terminal) end of the FGF21 polypeptide, or amino acid residues have been removed from both the amino-terminal and carboxyl-terminal ends of the FGF21 polypeptide. Some embodiments comprise N-terminal truncations with 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 amino acid residues from the N-terminal end of the mature FGF21 polypeptide. Truncated FGF21 polypeptides having N-terminal truncations of fewer than 9 amino acid residues retain the ability of the mature FGF21 polypeptide to lower blood glucose in an individual. Accordingly, in particular embodiments, the present invention encompasses truncated forms of the mature FGF21 polypeptide or FGF21 protein variants having N-terminal truncations of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 amino acid residues. Some embodiments comprise C-terminal truncations with 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 amino acid residues from the C-terminal end of the mature FGF21 polypeptide. Truncated FGF21 polypeptides having C-terminal truncations of fewer than 13 amino acid residues exhibited an efficacy of at least 50%of the efficacy of wild-type FGF21 in an in vitro ELK-luciferase assay (Yie J. et al. FEBS Letts 583: 19-24 (2009) ) , indicating that these FGF21 mutants retain the ability of the mature FGF21 polypeptide to lower blood glucose in an individual. Accordingly, in particular embodiments, the present invention encompasses truncated forms of the mature FGF21 polypeptide or FGF21 protein variants having C-terminal truncations of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 amino acid residues. Some embodiments comprise truncated FGF21 polypeptides with a combination of N-terminal and C-terminal truncations. Truncated FGF21 polypeptides having a combination of N-terminal and C-terminal truncations share the activity of corresponding truncated FGF21 polypeptides having either the N-terminal or C-terminal truncations alone. In other words, truncated FGF21 polypeptides having both N-terminal truncations of fewer than 9 amino acid residues and C-terminal truncations of fewer than 13 amino acid residues possess similar or greater blood glucose-lowering activity as truncated FGF21 polypeptides having N-terminal truncations of fewer than 9 amino acid residues or truncated FGF21 polypeptides having C-terminal truncations of fewer than 13 amino acid residues. Accordingly, in particular embodiments, the present invention encompasses truncated forms of the mature FGF21 polypeptide or FGF21 protein variants having both N-terminal truncations of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 amino acid residues and C-terminal truncations of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 amino acid residues. See for example US 11963999 B2, which is incorporated herein by reference.

[0039] As used herein, the term “IL-27” or “interleukin 27” refers to the IL-27 cytokine. IL-27 is related to the IL-6 / IL-12 cytokine families and is a heterodimeric cytokine that comprises a first subunit known as Epstein-Barr Virus Induced Gene 3 (EBI3; also known as IL-27 subunit β and IL-27B) and a second subunit known as IL-27p28 (also known as IL30, IL-27 subunit αand IL-27A) . IL-27 is predominantly synthesized by activated antigen-presenting cells including monocytes, endothelial cells and dendritic cells. Although IL-27 can have proinflammatory effects, many studies suggest an important role of IL-27 as an immunosuppressive agent. Although it was initially described as a factor promoting the initiation of Th1 responses, IL-27 was later found to play a major T-cell suppressive function by limiting Th1 responses, inhibiting Th2 and Th17 cell differentiation, and regulating the development of Tr1 and other T regulatory cell populations. In addition to its role as an immunoregulator, IL-27 also regulates angiogenesis, hematopoiesis, and osteocalstogenesis.

[0040] IL-27 signals through a heterodimeric type I cytokine receptor (the IL-27 receptor or IL-27R) that comprises a first subunit known as WSX1 (also known as IL-27 receptor subunit a, IL-27RA, T-Cell Cytokine Receptor Type 1 (TCCR) , and Cytokine Receptor-Like 1 (CRL1) ) and a second subunit known as gp130 (also known as Interleukin-6 Signal Transducer (IL6ST) , Interleukin-6 Receptor Subunit β (IL-6RB) , and Oncostatin M Receptor) . gp130 is also a receptor subunit for the IL-6 family cytokines. IL-27 signaling through IL-27R activates multiple signaling cascades, including the JAK-STAT and p38 MAPK pathways.

[0041] EBI3 is also believed to have biological functions independent of p28 or the IL-27 heterodimer. For example, EBI3 also interacts with p35 to form the heterodimeric cytokine IL-35 and has been shown to be selectively overexpressed in certain cell types without a corresponding increase in p28 or IL-27.

[0042] An amino acid sequence of an exemplary human p28 protein is provided in SEQ ID NO: 6. An amino acid sequence of an exemplary human EBI3 protein is provided in SEQ ID NO: 7.

[0043] As used herein, the term “ActRII” refers to the family of type II activin receptors. This family includes activin receptor type IIA (ActRIIA) and activin receptor type IIB (ActRIIB) . As used herein, the term “ActRII” refers to a family of activin receptor type IIA (ActRIIA) proteins, a family of activin receptor type IIB (ActRIIB) proteins, or combinations and / or variants thereof. The term ActRII polypeptide includes polypeptides comprising any naturally occurring polypeptide of an ActRII family member as well as any variants thereof (including mutants, fragments, fusions, and peptidomimetic forms) that retain a useful activity. Examples of such variant ActRII polypeptides are provided throughout the present disclosure as well as in WO 2006 / 012627, WO 2007 / 062188, WO 2008 / 097541, WO 2010 / 151426, and WO 2011 / 020045, which are incorporated herein by reference in their entirety. Preferably, ActRII polypeptides are soluble (e.g., an extracellular domain of ActRII) . In some embodiments, ActRII polypeptides inhibit (e.g., Smad signaling) of one or more GDF / BMP ligands [e.g., GDF11, GDF8, activin A, activin B, GDF3, BMP4, BMP6, BMP10, and / or BMP15] . In some embodiments, ActRII polypeptides bind to one or more GDF / BMP ligands [e.g., GDF11, GDF8, activin A, activin B, GDF3, BMP4, BMP6, BMP10, and / or BMP15] .

[0044] Activin receptor II B (ActRIIB) is a receptor for myostatin, activin, and bone morphogenetic proteins (BMPs) . The interaction between myostatin and this receptor regulates the inhibition of skeletal muscle differentiation via the Smad-dependent pathway. It is thought that by inhibiting or preventing myostatin from binding to ActRIIB, e.g., via an ActRII antibody, the formation of skeletal muscle can be induced. Regulation of the activin receptor II A (ActRIIA) also plays a role in the regulation of muscle growth. An amino acid sequence of an exemplary human ActRIIA extracellular domain is provided in SEQ ID NO: 10. An amino acid sequence of an exemplary human ActRIIB extracellular domain is provided in SEQ ID NO: 2.

[0045] A metabolic disorder as used herein refers to a disorder affecting dysregulation of mammalian metabolism, including but not limited to overweight, obesity, diabetes (Type I and II) , metabolic syndrome, anti-psychotic drug-associated obesity, glucocorticoid-induced obesity, hypothalamic obesity associated with craniopharyngioma, obesity related co-morbidity, and complex and monogenetic disorders associated with obesity. The monogenetic disorders associated with obesity in humans, may include but are not limited to Bardet-Biedl syndrome, and a disorder arising from a mutation in one or more of the following genes ADCY3, ALMS1, ARL6, BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS9, BBS10, BBS12, BDNF, CCDC28B, CEP290, CREBBP, EP300, GNAS, IER3IP1, MKKS, MKS1, MRAP2, NTRK2, PCSK1, PHF6, POMC, SH2B1, SIM1, TMEM67, TRIM32, TTC8 and VPS13B, or combinations thereof. A metabolic disorder may also be associated with a complex genetic disorder, e.g., Prader-Willi syndrome.

[0046] As used herein, Body Mass Index or “BMI” is calculated as weight in kilograms (kg) divided by height in meters squared (m2) , rounded to one decimal place. As used herein, “obesity” in adult humans is defined as a BMI greater than or equal to 30 kg / m2. “Obesity” in human youth is defined as a BMI greater than or equal to the age-and sex-specific 95th percentile of the 2000 CDC growth charts. The term “overweight” is defined as a BMI of greater than or equal to 25 and less than 30.

[0047] The terms “obesity related co-morbidity” and “obesity related condition” may be used interchangeably and refer to a health condition depending from the obesity of the subject. In some embodiments, an obesity related co-morbidity or condition increases the mortality risk of the subject. Obesity related co-morbidities include but are not limited to: high blood pressure (hypertension) , high LDL cholesterol, low HDL cholesterol, high levels of triglycerides (dyslipidemia) , Type 2 diabetes, coronary heart disease, cardiometabolic disease, cardiometabolic syndrome, non-alcoholic fatty liver disease, stroke, gallbladder disease, osteoarthritis, sleep apnea, breathing problems, cancer, lower quality of life, mental illness such as clinical depression, anxiety, and other mental disorders, and body pain and difficulty with physical functioning. Obesity related cancers include but are not limited to: gastrointestinal cancers including but not limited to adenocarcinoma of the esophagus, stomach cancer, colon, and rectal cancers; breast cancer in post-menopausal women, uterine cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, liver cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, thyroid cancer, meningioma, and multiple myeloma.

[0048] The tetraspanin protein family members, such as CD63, CD81, and CD9, ubiquitously expressed on exosomes and extensively used as exosome biomarkers, are involved in physiological processes, for instance cell adhesion, cell motility, and signal transduction. CD63, the first characterized tetraspanin, has two extracellular loops of unequal sizes and two short cytoplasmic domains, is involved in the signal transduction processes of various types of immune cells. Sequential domain deletion has identified the transmembrane helix 3 (TM3) being necessary and sufficient for membrane anchoring and exosome targeting. An amino acid sequence of TM3 is illustrated in SEQ ID NO: 13.

[0049] The term “anchoring polypeptide” is a polypeptide that is anchored on the exosome membrane when the exosome is generated by a cell. A transmembrane protein is a typical anchoring polypeptide in the context of the present disclosure. By “anchoring” or its grammatical variants, it means that at least a fragment of the polypeptide is embedded in the exosome membrane. The anchoring polypeptide may be fully or partly embedded in the exosome membrane. In this disclosure, the anchoring polypeptide is fused with a polypeptide heterologous to the exosome naturally produced by the same cell, such as the FGF21 polypeptide. Exemplary anchoring polypeptides are membrane proteins of exosome, membrane-targeting sequences, or an anchoring functional fragment thereof. Exemplary membrane proteins of exosome include but are not limited to lamp2b, tetraspanins such as CD63, CD9 and CD81, platelet-derived growth factor receptors (PDGFRs) , lactadherin (C1C2 domain) , vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) , prostaglandin F2 receptor negative regulator (PTGFRN) and any combination thereof. Exemplary membrane-targeting sequences include but are not limited to glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors and lipid-anchored proteins.. A detailed review regarding GPI anchors in exosome is available from, e.g., Michel Vidal, Exosomes and GPI-anchored proteins: Judicious pairs for investigating biomarkers from body fluids, Advanced Drug Delivery Reviews, Volumes 161–162, 2020 (incorporated herein by reference in its entirety) . In a preferable embodiment of the present disclosure, the anchoring polypeptide comprises or consists of the transmembrane helix 3 (TM3) of CD63 protein.

[0050] Engineered Exosomes

[0051] One aspect of the present disclosure relates to an engineered exosome.

[0052] In some embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) an FGF21 polypeptide, fused to a first anchoring polypeptide, (b) an IL-27 polypeptide, fused to a second anchoring polypeptide, and (c) an activin receptor type II polypeptide, fused to a third anchoring polypeptide, wherein (a) , (b) and (c) are anchored on a membrane of the exosome via the first, second and third anchoring polypeptide, respectively, and wherein the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide are exposed on an outer surface of the membrane of the exosome.

[0053] In some embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) an FGF21 polypeptide, fused to a first anchoring polypeptide, (b) an IL-27 polypeptide, fused to a second anchoring polypeptide, and (c) an activin receptor type II polypeptide, fused to a third anchoring polypeptide, wherein (a) , (b) and (c) are anchored on a membrane of the exosome via the first, second and third anchoring polypeptide, respectively, and wherein the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide are exposed on an outer surface of the membrane of the exosome, and one or two or all of the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide is further fused to a Fc domain, preferably, each of the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide is further fused to a Fc domain.

[0054] Fusing a polypeptide of interest to a Fc domain was found, among others, to enhance the loading of the polypeptide of interest in the exosome compared to the polypeptide of interest without fusing to a Fc domain. See co-pending PCT Application No. PCT / CN2024 / 075683, titled Engineered Exosomes with Increased Loading of Protein Cargo and Methods Thereof, filed 4 February 2024, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0055] In some embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) an FGF21 polypeptide, fused to a first anchoring polypeptide and a Fc domain, (b) an IL-27 polypeptide, fused to a second anchoring polypeptide and a Fc domain, and (c) an activin receptor type II polypeptide, fused to a third anchoring polypeptide and a Fc domain.

[0056] In some embodiments, the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide is fused to the C-terminus of the first, second, and third anchoring polypeptides, respectively, optionally through a peptide linker, preferably, the peptide linker consists of glycine and serine, e.g., (G4S) n, in which n is an integer from 1 to 3.

[0057] In some embodiments, each of the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide is fused to the N-terminus of an Fc domain, directly or through a peptide linker, preferably, the peptide linker consists of glycine and serine, e.g., (G4S) n, in which n is an integer from 1 to 3.

[0058] In some embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) from N to C terminus, a first anchoring polypeptide, an FGF21 polypeptide, and a Fc domain, (b) from N to C terminus, a second anchoring polypeptide, an IL-27 polypeptide, and a Fc domain, and (c) from N to C terminus, a third anchoring polypeptide, an activin receptor type II polypeptide, and a Fc domain.

[0059] In some embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) from N to C terminus, an FGF21 polypeptide, a first anchoring polypeptide, and a Fc domain, (b) from N to C terminus, an IL-27 polypeptide, a second anchoring polypeptide, and a Fc domain, and (c) from N to C terminus, an activin receptor type II polypeptide, a third anchoring polypeptide, and a Fc domain.

[0060] In some embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) from N to C terminus, a first anchoring polypeptide, a peptide linker, an FGF21 polypeptide, a peptide linker, and a Fc domain, (b) from N to C terminus, a second anchoring polypeptide, a peptide linker, an IL-27 polypeptide, a peptide linker, and a Fc domain, and (c) from N to C terminus, a third anchoring polypeptide, a peptide linker, an activin receptor type II polypeptide, a peptide linker, and a Fc domain.

[0061] In some embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) from N to C terminus, an FGF21 polypeptide, a peptide linker, a first anchoring polypeptide, a peptide linker, and a Fc domain, (b) from N to C terminus, an IL-27 polypeptide, a peptide linker, a second anchoring polypeptide, a peptide linker, and a Fc domain, and (c) from N to C terminus, an activin receptor type II polypeptide, a peptide linker, a third anchoring polypeptide, a peptide linker, and a Fc domain.

[0062] In any of the embodiments described above, preferably, the first, second, and third anchoring polypeptides are independently membrane proteins of exosome, membrane-targeting sequences, or an anchoring functional fragment thereof. Exemplary membrane proteins of exosome include but are not limited to lamp2b, tetraspanins such as CD63, CD9 and CD81, platelet-derived growth factor receptors (PDGFRs) , lactadherin (C1C2 domain) , vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) , prostaglandin F2 receptor negative regulator (PTGFRN) and any combination thereof. Exemplary membrane-targeting sequences include but are not limited to glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors and lipid-anchored proteins. In preferable embodiments, the first, second, and third anchoring polypeptides comprise a TM3 domain of CD63. In preferable embodiments, each of the first, second, and third anchoring polypeptides comprises a TM3 domain of CD63. In some embodiments, the anchoring polypeptides are full-length CD63 proteins, e.g., full-length human CD63 (see e.g., UniProtKB / Swiss-Prot: F8VZE2, P08962, Q5TZP3, Q8N6Z9, or Q9UCG6) . In some embodiments, the anchoring polypeptides are truncated CD63 proteins that comprise a TM3 domain and at least one of TM1, TM2, and TM4 domains. For example, the anchoring polypeptide may consist of TM2 and TM3 of CD63; TM3 and TM4 of CD63; or TM1, TM2, and TM3 of CD63. In some embodiments, the anchoring polypeptides consist of TM3 domain of CD63. In the present disclosure, the first, second, and third anchoring polypeptides can be different or same. In preferable embodiments, the first, second, and third anchoring polypeptides are same and consist of TM3 domain of CD63. In preferable embodiments, the first, second, and third anchoring polypeptides are same and consist of TM3 domain of CD63 consisting of an amino acid sequence provided in SEQ ID NO: 13.

[0063] In any of the embodiments described above, the peptide linker preferably consists of glycine and serine, e.g., (G4S) n, in which n is an integer from 1, 2 or 3. An exemplary peptide linker has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15,

[0064] In any of the embodiments described above, the FGF21 polypeptide is preferably a human FGF21 polypeptide. In any of the embodiments described above, the FGF21 polypeptide is preferably a human FGF21 protein lacking signal peptide. In any of the embodiments described above, the FGF21 polypeptide preferably has an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 1.

[0065] In any of the embodiments described above, the IL-27 polypeptide is preferably a human IL-27 polypeptide comprising a subunit p28 covalently linked to subunit EBI3. Preferably, the subunits p28 and EBI3 have amino acid sequences that are at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively. In any of the embodiments described above, the IL-27 polypeptide is a human IL-27 polypeptide having an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 9.

[0066] In any of the embodiments described above, the activin receptor type II polypeptide is preferably an activin receptor type IIA (ActRIIA) polypeptide, preferably human ActRIIA polypeptide, more preferably an extracellular domain of ActRIIA polypeptide, and even more preferably having an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 10.

[0067] In any of the embodiments described above, the activin receptor type II polypeptide is preferably an activin receptor type IIB (ActRIIB) polypeptide, preferably human ActRIIB polypeptide, more preferably an extracellular domain of ActRIIB polypeptide, and even more preferably having an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 2.

[0068] In any of the embodiments described above, the Fc domain is preferably a human Fc. In any of the embodiments described above, the Fc domain is preferably a Fc domain derived from human IgG, IgA, IgE, or IgM. In any of the embodiments described above, the Fc domain preferably has an amino acid sequence that is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 3.

[0069] In preferable embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) an FGF21 polypeptide, fused to a first anchoring polypeptide at N-terminus of the FGF21 polypeptide and to a first Fc domain at C-terminus of the FGF21 polypeptide, (b) an IL-27 polypeptide, fused to a second anchoring polypeptide at N-terminus of the IL-27 polypeptide and to a second Fc domain at C-terminus of the IL-27 polypeptide, and (c) an activin receptor type II polypeptide, fused to a third anchoring polypeptide at N-terminus of the activin receptor type II polypeptide and a third Fc domain at C-terminus of the activin receptor type II polypeptide.

[0070] In preferable embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) from N to C terminus, CD63-TM3 and a human FGF21 polypeptide, (b) from N to C terminus, CD63-TM3 and a human IL-27 polypeptide, and (c) from N to C terminus, CD63-TM3 and a human activin receptor type II polypeptide.

[0071] In preferable embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) from N to C terminus, CD63-TM3, a peptide linker, and a human FGF21 polypeptide, (b) from N to C terminus, CD63-TM3, a peptide linker, and a human IL-27 polypeptide, and (c) from N to C terminus, CD63-TM3, a peptide linker, and a human activin receptor type II polypeptide.

[0072] In preferable embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) from N to C terminus, CD63-TM3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 and an FGF21 polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (b) from N to C terminus, CD63-TM3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 and an IL-27 polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and (c) from N to C terminus, CD63-TM3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 and an activin receptor type II polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 10.

[0073] In preferable embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) from N to C terminus, CD63-TM3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, a peptide linker having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and an FGF21 polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (b) from N to C terminus, CD63-TM3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, a peptide linker having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and an IL-27 polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and (c) from N to C terminus, CD63-TM3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, a peptide linker having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and an activin receptor type II polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 10.

[0074] In preferable embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) from N to C terminus, CD63-TM3, a human FGF21 polypeptide, and a Fc domain, (b) from N to C terminus, CD63-TM3, a human IL-27 polypeptide, and a Fc domain, and (c) from N to C terminus, CD63-TM3, a human activin receptor type II polypeptide, and a Fc domain.

[0075] In preferable embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) from N to C terminus, CD63-TM3, a peptide linker, a human FGF21 polypeptide, a peptide linker, and a Fc domain, (b) from N to C terminus, CD63-TM3, a peptide linker, a human IL-27 polypeptide, a peptide linker, and a Fc domain, and (c) from N to C terminus, CD63-TM3, a peptide linker, a human activin receptor type II polypeptide, a peptide linker, and a Fc domain.

[0076] In preferable embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) from N to C terminus, CD63-TM3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, an FGF21 polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a Fc domain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, (b) from N to C terminus, CD63-TM3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, an IL-27 polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and a Fc domain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, , and (c) from N to C terminus, CD63-TM3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, an activin receptor type II polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 10, and a Fc domain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.

[0077] In preferable embodiments, provided is an engineered exosome comprising (a) from N to C terminus, CD63-TM3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, a peptide linker having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, an FGF21 polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a peptide linker having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and a Fc domain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, (b) from N to C terminus, CD63-TM3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, a peptide linker having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, an IL-27 polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, a peptide linker having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and a Fc domain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and (c) from N to C terminus, CD63-TM3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, a peptide linker having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, an activin receptor type II polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 10, a peptide linker having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, and a Fc domain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.

[0078] Uses and Methods of Treatment of Metabolic Disorders

[0079] Aspects of the present disclosure are directed to methods and compositions for treatment or prevention of metabolic disorders.

[0080] In some embodiments, provided is a pharmaceutical composition comprising the engineered exosome described herein and a pharmaceutically acceptable carrier. In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated for topical administration. In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated for smearing on skin. In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated for smearing on abdomina.

[0081] In some embodiments, provided is a method for treatment of overweight, obesity, diabetes (Type I and II) , metabolic syndrome, anti-psychotic drug-associated obesity, glucocorticoid-induced obesity, hypothalamic obesity associated with craniopharyngioma, obesity related co-morbidity, or complex and monogenetic disorders associated with obesity, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the engineered exosome or the pharmaceutical composition described herein.

[0082] In some embodiments, provided is a method for enhancement of fat metabolism, downregulation of blood glucose, and / or downregulation of blood LDL-C, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the engineered exosome or the pharmaceutical composition described herein.

[0083] In some embodiments, provided is a method for reduction of abdominal volume or waist circumference, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the engineered exosome or the pharmaceutical composition described herein.

[0084] In some embodiments, provided is use of the engineered exosome or the pharmaceutical composition described herein in the manufacturing of a medicament for treatment of overweight, obesity, diabetes (Type I and II) , metabolic syndrome, anti-psychotic drug-associated obesity, glucocorticoid-induced obesity, hypothalamic obesity associated with craniopharyngioma, obesity related co-morbidity, or complex and monogenetic disorders associated with obesity.

[0085] In some embodiments, provided is use of the engineered exosome or the pharmaceutical composition described herein in the manufacturing of a medicament for enhancement of fat metabolism, downregulation of blood glucose, and / or downregulation of blood LDL-C.

[0086] In some embodiments, provided is use of the engineered exosome or the pharmaceutical composition described herein in the manufacturing of a medicament for reduction of abdominal volume or waist circumference.

[0087] In some embodiments, provided is the engineered exosome or the pharmaceutical composition described herein for use in treatment of overweight, obesity, diabetes (Type I and II) , metabolic syndrome, anti-psychotic drug-associated obesity, glucocorticoid-induced obesity, hypothalamic obesity associated with craniopharyngioma, obesity related co-morbidity, or complex and monogenetic disorders associated with obesity.

[0088] In some embodiments, provided is the engineered exosome or the pharmaceutical composition described herein for use in enhancement of fat metabolism, downregulation of blood glucose, and / or downregulation of blood LDL-C.

[0089] In some embodiments, provided is the engineered exosome or the pharmaceutical composition described herein for use in reduction of abdominal volume or waist circumference.

[0090] Nucleic Acid Constructs, Vectors, Cells, and Methods of Production

[0091] Aspects of the present disclosure relate also to nucleic acid constructs that encode the polypeptides anchored on the exosomes.

[0092] In some embodiments, provided is a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (a) an FGF21 polypeptide fused to a first anchoring polypeptide, (b) an IL-27 polypeptide fused to a second anchoring polypeptide, and (c) an activin receptor type II polypeptide, fused to a third anchoring polypeptide.

[0093] In some embodiments, provided is a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (a) an FGF21 polypeptide fused to a first anchoring polypeptide and a Fc domain, (b) an IL-27 polypeptide fused to a second anchoring polypeptide and a Fc domain, and (c) an activin receptor type II polypeptide, fused to a third anchoring polypeptide and a Fc domain.

[0094] In some embodiments, provided is a nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (a) from N to C terminus, a first anchoring polypeptide, an FGF21 polypeptide, and a Fc domain, (b) a second anchoring polypeptide, an IL-27 polypeptide, and a Fc domain, and (c) a third anchoring polypeptide, an activin receptor type II polypeptide, and a Fc domain.

[0095] In some embodiments, provided are a set of three nucleic acid constructs, with a first nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (a) , a second nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (b) , and a third nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (c) , wherein (a) , (b) , and (c) are defined as above.

[0096] In some embodiments, provided are a set of two nucleic acid constructs, with one nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (a) and (b) , and the other nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (c) , wherein (a) , (b) , and (c) are defined as above.

[0097] In some embodiments, provided are a set of two nucleic acid constructs, with one nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (a) and (c) , and the other nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (b) , wherein (a) , (b) , and (c) are defined as above.

[0098] In some embodiments, provided are a set of two nucleic acid constructs, with one nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (b) and (c) , and the other nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (a) , wherein (a) , (b) , and (c) are defined as above.

[0099] In preferable embodiments, provided is a single nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (a) , (b) , and (c) , wherein (a) , (b) , and (c) are defined as above.

[0100] The anchoring polypeptides and preferable embodiments thereof, the FGF21 polypeptide and preferable embodiments thereof, the IL-27 polypeptide and preferable embodiments thereof, the activin receptor type II polypeptide and preferable embodiments thereof, the Fc domain and preferable embodiments thereof, the peptide linker and preferable embodiments thereof, are same as those defined in the Engineered Exosomes section.

[0101] In the preferable embodiments, the polynucleotide may comprise, from 5’ to 3’ , a fragment of nucleotides encoding:

[0102] (i) [1st anchoring polypeptide] - [FGF21] - [self-cleavage peptide] - [2nd anchoring polypeptide] - [IL-27] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] - [ActRIIA or ActRIIB] ,

[0103] (ii) [1st anchoring polypeptide] - [FGF21] - [self-cleavage peptide] - [2nd anchoring polypeptide] - [ActRIIA or ActRIIB] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] - [IL-27] ,

[0104] (iii) [1st anchoring polypeptide] - [IL-27] - [self-cleavage peptide] - [2nd anchoring polypeptide] - [FGF21] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] - [ActRIIA or ActRIIB] ,

[0105] (iv) [1st anchoring polypeptide] - [IL-27] - [self-cleavage peptide] - [2nd anchoring polypeptide] - [ActRIIA or ActRIIB] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] -[FGF21] ,

[0106] (v) [1st anchoring polypeptide] - [ActRIIA or ActRIIB] - [self-cleavage peptide] - [2nd anchoring polypeptide] - [FGF21] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] - [IL-27] , or

[0107] (vi) [1st anchoring polypeptide] - [ActRIIA or ActRIIB] - [self-cleavage peptide] - [2nd anchoring polypeptide] - [IL-27] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] - [FGF21] ,

[0108] wherein, [] represents a separate polypeptide, and ] - [represents a peptide linker or a bond; and wherein, each of the polypeptide is arranged from N to C termini.

[0109] In preferable embodiments, the self-cleavage peptide is a 2A peptide, e.g., T2A, E2A, P2A or any combination thereof. For example, the self-cleavage peptide is a T2A peptide. the self-cleavage peptide is cleaved after the polynucleotide is translated, resulting in three independent fusion proteins, each comprising a single polypeptide to be presented onto the surface of the exosome and a single anchoring polypeptide. An exemplary amino acid sequence of T2A is shown in SEQ ID NO: 17.

[0110] In other embodiments, the single polynucleotide comprising a fragment of nucleotides encoding (a) , (b) , and (c) comprises, from 5’ to 3’ , a fragment of nucleotides encoding: [1st anchoring polypeptide] - [ActRIIA or ActRIIB] - [self-cleavage peptide] - [IL-27] - [2nd anchoring polypeptide] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] - [FGF21] , in which the second anchoring polypeptide is located at the C terminus of IL-27 polypeptide. This change is also applicable to any of the polynucleotides listed in (i) to (vi) as above. In some embodiments, each of the first, second, and third anchoring polypeptides are different and thus the anchoring polypeptides may locate at N or C terminus of the polypeptides ActRIIA or ActRIIB, FGF21 and IL-27.

[0111] In preferable embodiments, provided is a single nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding (a) , (b) , and (c) , wherein (a) , (b) , and (c) are defined as above, and wherein each of the first, second, and third anchoring polypeptides comprises a TM3 domain of CD63. In some embodiments, the polynucleotide may comprise, from 5’ to 3’ , a fragment of nucleotides encoding one of

[0112] (i) [TM3] - [FGF21] - [T2A] - [TM3] - [IL-27] - [T2A] - [TM3] - [ActRIIA or ActRIIB] ,

[0113] (ii) [TM3] - [FGF21] - [T2A] - [TM3] - [ActRIIA or ActRIIB] - [T2A] - [TM3] - [IL-27] ,

[0114] (iii) [TM3] - [IL-27] - [T2A] - [TM3] - [FGF21] - [T2A] - [TM3] - [ActRIIA or ActRIIB] ,

[0115] (iv) [TM3] - [IL-27] - [T2A] - [TM3] - [ActRIIA or ActRIIB] - [T2A] - [TM3] - [FGF21] ,

[0116] (v) [TM3] - [ActRIIA or ActRIIB] - [T2A] - [TM3] - [FGF21] - [T2A] - [TM3] - [IL-27] , and

[0117] (vi) [TM3] - [ActRIIA or ActRIIB] - [T2A] - [TM3] - [IL-27] - [T2A] - [TM3] - [FGF21] ,

[0118] wherein, [] represents a separate polypeptide, and ] - [represents a linker or a bond; wherein, each of the polypeptide is arranged from N to C termini; TM3 represents TM3 domain of CD63; and T2A represents self-cleavage peptide T2A.

[0119] In some embodiments, a polynucleotide encoding the FGF21 polypeptide has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO. 5 or a degenerate sequence thereof.

[0120] In some embodiments, a polynucleotide encoding the IL-27 polypeptide has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO. 11 or a degenerate sequence thereof.

[0121] In some embodiments, a polynucleotide encoding the activin receptor type II polypeptide has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO. 12 or a degenerate sequence thereof.

[0122] In some embodiments, a polynucleotide encoding the TM3 domain of CD63 has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO. 14 or a degenerate sequence thereof.

[0123] Also provided are vectors that comprise the nucleic acid construct (s) described above. In some embodiments, the vector is a viral vector. In preferable embodiments, the vector is a lentiviral vector or an adeno-associated viral vector.

[0124] The vectors provided herein facilitate integration of the polynucleotides encoding the polypeptides anchored on the membrane of the engineered exosomes into the genome of the cells producing the exosomes.

[0125] Also provided are cells transduced with the vectors. In preferable embodiments, the cell is not a mesenchymal stem cell. In preferable embodiments, the cell is not a stem cell. In preferable embodiments, the cell is a non-stem cell, such as a HEK293 or CHO cell.

[0126] The present disclosure also provides a process of producing the engineered exosome provided herein, comprising transducing the cell described above, such as HEK293 cell, with the vector described above; culturing the cell in a condition allowing secretion of the engineered exosome from the cell; and collecting and purifying the engineered exosome.

[0127] In some embodiments, the process comprises an adaption of the cell from serum-containing condition to a serum-free condition during culturing. The adaption may comprise a sequential adaptation with decreasing full medium and increasing serum-free medium.

[0128] Sequences Listings Examples

[0129] Example 1. Construction of engineered exosomes derived from stable cell lines.

[0130] The HEK293 cell line (human embryonic kidney 293 cells, CRL-1573TM) was purchased from ATCC, which were maintained in DMEM (high-glucose) containing 10% (vol / vol) FBS, supplemented with 100 U / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin. CHO-K1 cell (Chinese hamster cells, CCL-61TM) was purchased from BNCC (Beijing, China) , which were maintained in F12K containing 10% (vol / vol) FBS, supplemented with 100 U / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin. Cells were incubated in a humidified atmosphere containing 5%CO2 at 37 ℃. Antibody used in this study was anti-CD63 antibodies (Cat. No. MA5-32085, Invitrogen) .

[0131] Plasmid construction

[0132] The amino acid sequences of all the genes mentioned, including human FGF-21, IL-27, ActRIIB and Fc were derived from Uniprot and the corresponding DNA sequences were synthesized by General Biotechnology (Chuzhou, China) with plasmid pCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP+BSD (System Biosciences) . The target proteins FGF-21, IL-27 and ActRIIB were fused with Fc fragment, respectively. The T2A peptide was used for dissociating all the target proteins into individual protein upon translation. The 4 plasmids of 3rd-generation system were used for lentivirus production, with pCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP+BSD as lentivirus packaging plasmid. The lentiviruses were packaged by WZ Biotechnology (Jinan, China) .

[0133] The lentiviruses contained a fragment of polynucleotide as shown below for generating a stable cell line producing an exosome named Exo-NO. 1:

[0134] 5’-3’: CD63-TM3-Linker-FGF21-Linker-Fc-T2A-CD63-TM3-Linker-IL27-Linker-Fc-T2A-CD63-TM3-Linker-ActRIIB-Linker-Fc, in which

[0135] CD63-TM3 represents DNA sequence (SEQ ID NO: 14) encoding the TM3 domain of CD63 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13;

[0136] Each Linker represents DNA sequence (SEQ ID NO: 16) encoding the peptide linker having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15;

[0137] Each Fc represents DNA sequence (SEQ ID NO: 4) encoding the human Fc domain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;

[0138] Each T2A represents DNA sequence (SEQ ID NO: 18) encoding the T2A polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17;

[0139] FGF21 represents DNA sequence (SEQ ID NO: 5) encoding the human mature FGF21 polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;

[0140] IL27 represents DNA sequence (SEQ ID NO: 11) encoding the human IL-27 polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9; and

[0141] ActRIIB represents DNA sequence (SEQ ID NO: 12) encoding the human IL-27 polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

[0142] Generation of stable cell lines

[0143] The stable cell line, e.g. based on HEK293 cell line, expressing target proteins, including FGF-21, IL-27 and ActRIIB (Exo-NO. 1 derived stable cell line, or stable cell lines NO. 1, hereinafter) , was generated by transfection with the plasmids or infection with the corresponding lentiviruses. Forty-eight hours after transfection or infection, cells were selected by the addition of blasticidin (Solarbio Life Sciences) to a final concentration of 6 μg / ml. A single cell colony with green fluorescent protein (GFP) expression was selected and cultured in FM (full medium) with 6 μg / ml blasticidin. The stable cell line was monitored for the expression of GFP and the corresponding targeted proteins.

[0144] Adaptation of cell culture to a SFM (serum-free medium)

[0145] After three initial passages in FM from Exo-NO. 1 derived stable cell lines, adaptation for serum-free culture was started from the 4th passage. Cells were subcultured with medium composition in table 4. To establish the fully adapted serum-free culture, cells should be subcultured in a SFM (HyCloneTM peak expression, SH31193.02, Cytiva Life Sciences) for at least three times.

[0146] Table 1. Each step for adaptation procedures of Exo-NO. 1 derived stable cells to adapt in serum-free medium

[0147] Note: FM: Full medium; SFM: Serum-free medium.

[0148] Example 2. Characterization of Exosomes

[0149] Exosomes isolation

[0150] The stable cell line was seeded in T150 flasks for 24h, rinsed extensively with PBS and incubated in SFM for another 48h. The cultured cell-free extracellular medium containing exosomes was harvested by centrifugation at 300×g for 10 min to remove the cells. Then centrifuge at 10,000×g for 30 min to remove dead cells and cell debris. Finally, the clear supernatant was centrifuged for 70 min at 100,000×g to pellet the exosomes for twice. And the exosome pellet was resuspended. All centrifugation steps were carried out at 4 ℃. Exosomes were named Exo-No. 1. Mock exosomes were derived from unengineered HEK293 cells with the same preparation method as for Exo-NO. 1.

[0151] Analysis of the particle concentration and size distribution of exosomes

[0152] The particle concentration and size distribution of exosomes from stable cell line NO. 1 were analyzed by the NanoFCM (NanoFCM Inc., Xiamen, China) . The NanoFCM analysis used two single photon counting avalanche photodiodes (APDs) to detect individual particle side scatter (SSC) and fluorescence simultaneously. Firstly, the exosomes pellet was prepared in PBS. Then, 200nm PE and AF488 fluorophore-conjugated polystyrene beads were used for particle concentration and Silica Nanosphere Cocktail (NanoFCM Inc., Xiamen, China) for particle size distribution. The detector recorded particles passing by during a 1-min interval in each test. Each sample was diluted to reach a particle count within the optimal range of 3000-9,000 particles per minute. NanoFCM software (NanoFCM Profession V2.0) was used to convert flow rate and side scattering intensity to vesicle concentration and size.

[0153] Figure 2A shows the particle diameter and particle concentration of exosomes derived from the stable cell lines NO. 1 were analyzed by NanoFCM. The exosomes (Exo-N0.1) have a mean particle diameter of 73.8 nm.

[0154] Transmission electron microscopy (TEM) analysis of exosomes

[0155] TEM was used to confirm the presence of exosomes. Approximately, 20 μl of exosomes were added separately to copper grids. All excess fluids were removed using filter paper, and the samples were negatively stained with 2%uranyl acetate for 30 s. The grids were rinsed in deionized water and allowed to dry overnight. The samples were then air-dried using an electric incandescent lamp and viewed using an electron microscope (Hitachi, S-3000N) .

[0156] Figure 2B shows the transmission electron microscopy (TEM) image of the exosomes produced from stable cell lines NO. 1.

[0157] Identification of target proteins on exosomes via Western blotting (WB) or ELISA

[0158] For the identification of target proteins expressed on exosomes, the purified exosomes were lysed with RIPA lysis buffer (Beyotime) supplemented with 1 mM protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF; Beyotime) and phosphatase inhibitor (Beyotime) , then heat denatured, separated by SDS-PAGE, and transferred onto PVDF membrane (Millipore, USA) . The proteins were detected by incubation with primary antibody against CD63, the fused scaffold protein of exosomes, followed by incubation with an HRP-conjugated secondary antibody (Invitrogen) . Enhanced chemiluminescence reagent (Millipore, MA, USA) was then used for the visualization of the membranes.

[0159] Figure 2C showed the immunoblotting analysis of exosomes from cell line No. 1 with antibody against CD63-TM3, the exosome fused scaffold proteins. As expected, the engineered exosome-associated target proteins, IL-27, FGF-21 and ActRIIB were present in purified Exo-NO. 1.

[0160] For detection of target proteins concentration, the purified exosomes were prepared and the target proteins on exosomes were analyzed via an appropriate ELISA kit (BioLegend, 434607; Solarbio, SEKH-0176; Creative Diagnostics, DEIA6918) according to manufacturer’s instructions.

[0161] The concentration of functional proteins within Exo-NO. 1 were measured via ELISA kit. Figure 2D showed the concentrations of different proteins, including IL-27, FGF-21 and ActRIIB of Exo-NO. 1.

[0162] Example 3. Zebrafish model

[0163] Zebrafishes on 2 days after fertilization (2 dpf) were prepared to soak with mock or Exo-NO. 1 at the concentration of 1.6E6 particles / ml in 6-well plate (30 zebrafishes in 3ml / well) . Twenty-four hours after incubation, the zebrafishes were stained with Nile red dye and the images were captured. The fluorescence intensity of yolk sac was analyzed via NIS-ElementsD3.20.

[0164] Figure 3 A-C showed that Exo-NO. 1 can promote lipolysis significantly on zebrafishes model when soaked with Exo-NO. 1 at the concentration of 1.6E6 particles / ml.

[0165] Example 4. DIO mice model

[0166] All animal experiments were performed under protocols approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Novopathway Biotechnology (Shanghai, China) . The experiment was designed following animal welfare guidelines and the three Rs principles. The diet-induced obesity (DIO) mice were purchased from BioMice (Nantong, China) and housed under specific pathogen-free (SPF) conditions as animal models for fat metabolism research. All the mice had free access to water and standard laboratory chow.

[0167] For the subcutaneous fat metabolism, the mice were randomly divided into two groups: (1) Mock, treated with PBS; (2) Exo-NO. 1, treated with exosomes Exo-NO. 1. The abdomen of DIO mice was topically applied with PBS or 1E9 particles / dose in 155 μl PBS for twice a week, eight times in total. The body weight, abdominal circumference and food Intake were measured every 5 days for a month. At the end of the study, the fat content and muscle content in mice were analyzed via a small animal body composition analyzer. The blood glucose was measured via Glucometer Strip Method and the LDL-C content was detected with automatic biochemical analyzer. In addition, the mice from each group were sacrificed to obtain abdominal fat tissue, which was then fixed, dehydrated, embedded, sectioned, deparaffinized, and rehydrated for H&E staining. Afterwards, the samples were examined under a microscope, and the captured images were analyzed.

[0168] Figure 4 showed that engineered exosomes Exo-NO. 1 can remarkably reduce the body weight and abdominal circumference of DIO mice without influencing on the food intake (A-D) . At the end of the study, the fat content (E) has a 4.5%reduction and the HE staining showed that adipocyte volume becomes smaller (F) . In addition, the muscle content (G) has a 4 %increase in DIO mice.

[0169] Figure 5 showed that engineered exosomes Exo-NO. 1 can significantly downregulate both blood glucose (A) and LDL-C content (B) in DIO mouse model. Moreover, after treatment with Exo-NO. 1 for 28 days, the blood glucose reduced to 4 mmol / L, similar to the normal glucose group.

[0170] Example 5. Human efficacy evaluation

[0171] The main evaluation criterion in this human efficacy evaluation was to test the localized fat reduction effect of Exo-NO. 1 by Inger Testing Technology Service (Shanghai) Co., Ltd. In this study, the tested items included waistline, weight, BMI index, abdominal volume and body contour value. A total of 36 subjects, 18 males and 18 females were included and 36 were finalized. The age ranged from 23 to 54 years, with an average age of 40.75±7.89 years. The Exo-NO. 1 was topically applied every three days for 4 weeks. The tested items were recorded and analysis via VECTRA H2 3D Stereo image camera on Day 7 and Day 28, which can show a 360-degree presentation of the contours of various parts of the body and do a visual analysis of the condition of the bottom of the skin as well as the decreased / increased volume.

[0172] Four effective case demonstrations are presented in Figure 6, which were topically applied with Exo-NO. 1 for four weeks. Cases A and B showed a significant reduction on abdominal volume. The decreases of waistline in cases C and D were 5.1 cm and 3.9 cm, respectively.

[0173] A summary of the human efficacy evaluation on day 28 when topically applied with Exo-NO. 1 was shown in table 2.

[0174] Table 2. Engineered exosomes can effectively reduce abdominal volume and waist circumference in human efficacy evaluation

[0175] Note. Age range 23-54 years old, half male and half female; The reduction in abdominal circumference ranges from 0.2 to 8.7 cm.

Claims

1.An engineered exosome, comprising(a) an FGF21 polypeptide, fused to a first anchoring polypeptide,(b) an IL-27 polypeptide, fused to a second anchoring polypeptide, and(c) an activin receptor type II polypeptide, fused to a third anchoring polypeptide,wherein (a) , (b) and (c) are anchored on a membrane of the exosome via the first, second and third anchoring polypeptide, respectively, andwherein the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide are exposed on an outer surface of the membrane of the exosome.2.The engineered exosome of claim 1, wherein one or two or all of the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide is further fused to a Fc domain, preferably, each of the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide is further fused to a Fc domain.3.The engineered exosome of claim 1 or 2, wherein the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide is fused to the C-terminus of the first, second, and third anchoring polypeptides, respectively, optionally through a peptide linker, preferably, the peptide linker consists of glycine and serine, e.g., (G4S) n, in which n is an integer from 1 to 3.4.The engineered exosome of any one of claims 1 to 3, wherein each of the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide is fused to the N-terminus of an Fc domain, directly or through a peptide linker, preferably, the peptide linker consists of glycine and serine, e.g., (G4S) n, in which n is an integer from 1 to 3.5.The engineered exosome of any one of claims 1 to 4, wherein the first, second and third anchoring polypeptides are independently selected from a group consisting of membrane proteins of exosome, membrane-targeting sequences, and anchoring functional fragments thereof; preferably, the membrane proteins of exosome include lamp2b, tetraspanins such as CD63, CD9 and CD81, platelet-derived growth factor receptors (PDGFRs) , lactadherin (C1C2 domain) , vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) , prostaglandin F2 receptor negative regulator (PTGFRN) and any combination thereof; preferably the membrane-targeting sequences include glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors and lipid-anchored proteins; preferably, the first, second, and third anchoring polypeptides comprise a full-length CD63 or a truncated CD63 that retains TM3 domain; more preferably, each of the first, second, and third anchoring polypeptides comprises a TM3 domain of CD63; more preferably, each of the first, second, and third anchoring polypeptides is a TM3 domain of CD63; more preferably, the TM3 domain of CD63 comprises an amino acid sequence having at least 80%identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 13.6.The engineered exosome of any one of claims 1 to 5, wherein the FGF21 polypeptide:(i) is a human FGF21 polypeptide; and / or(ii) is a human FGF21 protein lacking signal peptide; and / or(ii) has an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 1.7.The engineered exosome of any one of claims 1 to 6, wherein the IL-27 polypeptide:(i) is a human IL-27 polypeptide comprising a subunit p28 covalently linked to subunit EBI3, preferably the subunits p28 and EBI3 have amino acid sequences that are at least 80%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively; and / or(ii) is a human IL-27 polypeptide having an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 9.8.The engineered exosome of any one of claims 1 to 7, wherein the activin receptor type II polypeptide:(i) is an activin receptor type IIA (ActRIIA) polypeptide, preferably human ActRIIA polypeptide, more preferably an extracellular domain of ActRIIA polypeptide, and even more preferably having an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 10; or(ii) is an activin receptor type IIB (ActRIIB) polypeptide, preferably human ActRIIB polypeptide, more preferably an extracellular domain of ActRIIB polypeptide, and even more preferably having an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 2.9.The engineered exosome of any one of claims 1 to 8, wherein the Fc domain:(i) is a human Fc; and / or(ii) is a Fc domain derived from human IgG, IgA, IgE, or IgM; and / or(iii) has an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 3.10.The engineered exosome of any one of claims 1 to 9, comprising:(a) an FGF21 polypeptide, fused to a first anchoring polypeptide at N-terminus of the FGF21 polypeptide and to a first Fc domain at C-terminus of the FGF21 polypeptide,(b) an IL-27 polypeptide, fused to a second anchoring polypeptide at N-terminus of the IL-27 polypeptide and to a second Fc domain at C-terminus of the IL-27 polypeptide, and(c) an activin receptor type II polypeptide, fused to a third anchoring polypeptide at N-terminus of the activin receptor type II polypeptide and a third Fc domain at C-terminus of the activin receptor type II polypeptide.11.A pharmaceutical composition comprising the engineered exosome of any one of claims 1 to 10, and a carrier; preferably, the pharmaceutical composition is a topical formulation.12.A nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding(a) an FGF21 polypeptide fused to a first anchoring polypeptide,(b) an IL-27 polypeptide fused to a second anchoring polypeptide, and(c) an activin receptor type II polypeptide, fused to a third anchoring polypeptide.13.The nucleic acid construct of claim 12, wherein:(i) one or two or all of the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide is further fused to a Fc domain; and / or(ii) the first, second and third anchoring polypeptides are independently selected from a group consisting of membrane proteins of exosome, membrane-targeting sequences, and anchoring functional fragments thereof; preferably, the membrane proteins of exosome include lamp2b, tetraspanins such as CD63, CD9 and CD81, platelet-derived growth factor receptors (PDGFRs) , lactadherin (C1C2 domain) , vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) , prostaglandin F2 receptor negative regulator (PTGFRN) and any combination thereof; preferably the membrane-targeting sequences include glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors and lipid-anchored proteins; preferably, the first, second, and third anchoring polypeptides comprise a full-length CD63 or a truncated CD63 that retains TM3 domain; more preferably, each of the first, second, and third anchoring polypeptides comprises a TM3 domain of CD63; more preferably, each of the first, second, and third anchoring polypeptides is a TM3 domain of CD63; more preferably, the TM3 domain of CD63 comprises an amino acid sequence having at least 80%identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 13; and / or(iii) the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide is fused to the C-terminus of the first, second, and third anchoring polypeptides, respectively, optionally through a peptide linker, preferably, the peptide linker consists of glycine and serine, e.g., (G4S) n, in which n is an integer from 1 to 3; and / or(iv) each of the FGF21 polypeptide, the IL-27 polypeptide and the activin receptor type II polypeptide is fused to the N-terminus of an Fc domain, directly or through a peptide linker; and / or(v) the FGF21 polypeptide is a human FGF21 polypeptide, preferably a human FGF21 protein lacking signal peptide; and more preferably, has an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 1; and / or(vi) the IL-27 polypeptide is a human IL-27 polypeptide comprising a subunit p28 covalently linked to subunit EBI3, preferably the subunits p28 and EBI3 have amino acid sequences that are at least 80%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively; and / or is a human IL-27 polypeptide having an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 9; and / or(vii) the activin receptor type II polypeptide is an activin receptor type IIA (ActRIIA) polypeptide, preferably human ActRIIA polypeptide, more preferably an extracellular domain of ActRIIA polypeptide, and even more preferably having an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 10; or is an activin receptor type IIB (ActRIIB) polypeptide, preferably human ActRIIB polypeptide, more preferably an extracellular domain of ActRIIB polypeptide, and even more preferably having an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 2; and / or(viii) the Fc domain is a human Fc, preferably, a Fc domain derived from human IgG, IgA, IgE, or IgM; and / or has an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 100%, identical to that shown in SEQ ID NO: 3; and / or(ix) a polynucleotide encoding the FGF21 polypeptide has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO. 5 or a degenerate sequence thereof; and / or(x) a polynucleotide encoding the IL-27 polypeptide has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO. 11 or a degenerate sequence thereof; and / or(xi) a polynucleotide encoding the activin receptor type II polypeptide has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO. 12 or a degenerate sequence thereof; and / or(xii) a polynucleotide encoding the TM3 domain of CD63 has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO. 14 or a degenerate sequence thereof; and / or(xiii) a polynucleotide encoding the Fc domain has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO. 4 or a degenerate sequence thereof.14.The nucleic acid construct of claim 12 or 13, wherein the polynucleotide is a single polynucleotide comprising a fragment of nucleotides encoding (a) , (b) , and (c) ; preferably the polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ , a fragment of nucleotides encoding:(i) [1st anchoring polypeptide] - [FGF21] - [Fc] - [self-cleavage peptide] - [2nd anchoring polypeptide] - [IL-27] - [Fc] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] - [ActRIIB] - [Fc] ,(ii) [1st anchoring polypeptide] - [FGF21] - [Fc] - [self-cleavage peptide] - [2nd anchoring polypeptide] - [ActRIIB] - [Fc] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] - [IL-27] - [Fc] ,(iii) [1st anchoring polypeptide] - [IL-27] - [Fc] - [self-cleavage peptide] - [2nd anchoring polypeptide] - [FGF21] - [Fc] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] - [ActRIIB] - [Fc] ,(iv) [1st anchoring polypeptide] - [IL-27] - [Fc] - [self-cleavage peptide] - [2nd anchoring polypeptide] - [ActRIIB] - [Fc] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] - [FGF21] - [Fc] ,(v) [1st anchoring polypeptide] - [ActRIIB] - [Fc] - [self-cleavage peptide] - [2nd anchoring polypeptide] - [FGF21] - [Fc] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] - [IL-27] - [Fc] , or(vi) [1st anchoring polypeptide] - [ActRIIB] - [Fc] - [self-cleavage peptide] - [2nd anchoring polypeptide] - [IL-27] - [Fc] - [self-cleavage peptide] - [3rd anchoring polypeptide] - [FGF21] - [Fc] ,wherein, [] represents a polypeptide, and ] - [represents a peptide linker or a bond, preferably, the peptide linker consists of glycine and serine, e.g., (G4S) n, in which n is an integer from 1 to 3;optionally, the self-cleavage peptide is a 2A peptide, e.g., T2A, E2A, P2A or any combination thereof.15.A vector comprising the nucleic acid construct of any of claims 12 to 14; preferably, the vector is a viral vector; more preferably the vector is a lentiviral vector or an adeno-associated viral vector.16.A cell transduced with the vector of claim 15, wherein the polynucleotide is integrated into the genome of the cell; preferably, the cell is not a mesenchymal stem cell; preferably, the cell is not a stem cell; preferably, the cell is a mammalian cell; or more preferably, the cell is a HEK293 or CHO cell.17.A method of producing an engineered exosome of any of claims 1 to 10, comprising(a) transducing the cell of claim 16 with the vector of claim 15;(b) culturing the cell in a condition allowing secretion of an exosome from the cell; and(c) collecting and purifying the exosome.18.The method of claim 17, further comprising adapting the cell to a serum-free condition during step (b) .19.Use of the engineered exosome of any of claims 1 to 10 or the composition of claim 11 in manufacturing a medicament for(i) treatment of a metabolic disorder such as obesity, overweight, type II diabetes, and / or hyperlipidemia; and / or(ii) enhancement of fat metabolism, downregulation of blood glucose, and / or downregulation of blood LDL-C; and / or(iii) reduction of abdominal volume or waist circumference.

Images