Virus-like particle (VLP) compositions and methods for delivering cargo to a target cell

Abstract

Viral-like particles (VLPs), methods of making thereof, and methods of making engineered cells using such VLPs are provided.

Description

VIRUS-LIKE PARTICLE (VLP) COMPOSITIONS AND METHODS FOR DELIVERING CARGO TO A TARGET CELLCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATION

[0001] This application claims benefit of priority of International Patent Application No. PCT / CN2024 / 135226 filed on November 28, 2024, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety. SEQUENCE STATEMENT

[0002] This application contains a Sequence Listing that has been submitted electronically as an XML file named “IEC250428PCT SEQUENCE LISTING. XML. ” The XML file, created on November 24 2025, is 59, 391 bytes in size. The material in the XML file is hereby incorporated by reference in its entirety.TECHNICAL FIELD

[0003] The disclosure relates to virus-like particles and methods for delivering cargo to a target cell.BACKGROUND

[0004] VLPs are natural or artificial nanostructures mimicking viruses but without enough viral genetic materials to support replication. Proteins, nucleic acids or chemical compounds may be carried by the VLP and delivered into different types of cells. For example, retroviral VLPs have been modified for delivering Cas RNPs. More specifically, the Cas protein was fused to the C-terminus or N-terminus of the viral gag proteins, and sgRNA could bind and package together with the Cas protein simultaneously. As another example, MS2 VLPs have been used to deliver cargo RNAs that contain an aptamer sequence in the form of a short RNA step-loop structure (19 nucleotides: pac site) .

[0005] However, for purposes of delivering nucleic acids, such methods are limited to delivering nucleic acids that contain a specific aptamer sequence that can bind to a corresponding aptamer-binding protein (ABP) . Also, the introduction of the aptamer sequence and the ABP may complicate the manufacturing process and may cause unintended biological effects. Thus, there is a need for improved VLPs for delivering nucleic acids.SUMMARY

[0006] This disclosure relates to VLPs that can be used to deliver a cargo (e.g., RNA) into a target cell. Also disclosed are methods of making such VLPs. Also disclosed are methods of using such VLPs to deliver a cargo. Also disclosed are methods of preparing engineered cells (e.g., CAR-T cells) using such VLPs.

[0007] The VLPs described herein are also referred to as “LetS-VLPs. ” LetS-VLPs can effectively deliver a cargo (e.g., RNA) into a target cell without the help of common VLP elements including MS2, MS2 coat protein. In some cases, LetS-VLPs can effectively deliver a cargo (e.g., RNA) into a target cell without the help of the elements including MS2, MS2 coat protein, PP7, PP7 coat protein, BoxB, P22N, λN, Pepper, tDeg, PUM-HD, dCas13, COM, COM protein, Arc1, Asprv1, a PNMA protein, CCDC8, PEG10 and an retrotransposon gag-like (RTL) protein (e.g., RTL-1) . In some cases, the LetS-VLPs can effectively deliver a cargo (e.g., RNA) into a target cell without the help of the functional fragment of any one of the elements, provided that the fragment is capable of capturing and packaging a cargo within VLP. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not rely on functional fragment of any one of the elements to package a cargo within VLP. For example, the LetS-VLPs described herein do not have to rely on the aptamer sequence or the associated aptamer binding protein to incorporate the nucleic acid into the LetS-VLPs. In some cases, LetS-VLPs can effectively deliver a cargo (e.g., RNA) into a target cell without the help of (i) the elements including MS2, MS2 coat protein, PP7, PP7 coat protein, BoxB, P22N, λN, Pepper, tDeg, PUM-HD, dCas13, COM, COM protein, Arc1, Asprv1, a PNMA protein, CCDC8, PEG10 and an RTL protein; and (ii) the functional fragment of any one of the elements, provided that the fragment is capable of capturing and packaging a cargo within VLP. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise common VLP elements including MS2, MS2 coat protein. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise the elements including MS2, MS2 coat protein, PP7, PP7 coat protein, BoxB, P22N, λN, Pepper, tDeg, PUM-HD, dCas13, COM, COM protein, Arc1, Asprv1, a PNMA protein, CCDC8, PEG10 and an RTL protein. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise the elements including the functional fragment of any one of the elements, provided that the fragment is capable of capturing and packaging a cargo within VLP. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise the elements including (i) the elements including MS2, MS2 coat protein, PP7, PP7 coat protein, BoxB, P22N, λN, Pepper, tDeg, PUM-HD, dCas13, COM, COM protein, Arc1, Asprv1, a PNMA protein, CCDC8, PEG10 and an RTL protein; and (ii) the functional fragment of any one of the elements, provided that the fragment is capable of capturing and packaging a cargo within VLP. In some cases, the PNMA protein is selected from the group consisting of PNMA1, PNMA2, PNMA3, PNMA4 (MOAP1) , PNMA5, PNMA6A, PNMA6E, PNMA6F, PNMA7A (ZCCHC12) , PNMA7B (ZCCHC18) , PNMA8A, PNMA8B, and PNMA8C. In some cases, the RTL protein is selected from the group consisting of RTL1, RTL3, RTL4, RTL5, RTL 6, RTL7, RTL8, RTL9, and RTL10. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise an exogenous aptamer sequence. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise an exogenous RNA aptamer sequence. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise an exogenous aptamer binding protein (ABP) . In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise mammalian retrovirus-like protein and / or any capture moiety for packaging a cargo. In some cases, the LetS-VLPs do not comprise a retroviral or lentiviral long terminal repeat (LTR) . In some cases, the LetS-VLPs do not comprise an RNA packaging signal sequence (e.g., psi) . In some cases, the LetS-VLPs do not comprise a central polypurine tract (cPPT)  / central termination sequence (CTS) . In some cases, the LetS-VLPs do not comprise reverse transcription and integration-related sequences including 5’ LTR, 3’ LTR, an RNA packaging signal sequence (psi) , partial Gag, partial Env, a primer binding site (pbs) and a central polypurine tract (cPPT)  / central termination sequence (CTS) .

[0008] The data in the present disclosure showed that the LetS-VLPs described herein can effectively deliver a cargo (e.g., RNA) into a target cell without the help of common VLP elements including MS2, MS2 coat protein, and other elements including PP7, PP7 coat protein, BoxB, P22N, λN, Pepper, tDeg, PUM-HD, dCas13, COM, COM protein, Arc1, Asprv1, a PNMA protein, CCDC8, PEG10 and an RTL protein.

[0009] The LetS-VLPs described herein are advantageous in that the cargo (e.g., RNA) sequence does not integrate into the genome of the target cell (e.g., no residual DNA) . The LetS-VLPs are also advantageous in that they eliminated the need for aptamer sequences and corresponding ABPs, making them easy to prepare. By eliminating the need for aptamer sequences and corresponding ABPs, the LetS-VLPs also have less safety concerns. The LetS-VLPs are also advantageous because they have high transduction efficiency. The LetS-VLPs are also advantageous because they can be used to make engineered cells that can express cargo sequences for extended periods of time. The LetS-VLPs are also advantageous because they do not negatively impact the expansion and viability of the target cells. In some cases, the LetS-VLPs described herein consists essentially of (a) a nucleic acid comprising a cargo sequence; (b) a viral structural protein; (c) a viral envelope protein; (d) a regulatory protein, and (e) a polyprotein and (f) optionally a rev response element. In some cases, the LetS-VLPs described herein consists essentially (a) a nucleic acid comprising a cargo sequence; (b) a viral structural protein which is selected from gag, matrix protein MA, and capsid proteins CA, NC, p4, p7, p9, p12, p17, p24, p30, SP1, and SP2; preferably the viral structural protein is gag; (c) a viral envelope protein which is selected from vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) , cocal virus glycoprotein (COV-G) protein, RD114-gp70 (SU+TM) , GALV-gp70 (SU+TM) , BaEV-gp70 (SU+TM) , measles, Nipah, MSCV, Cocal, MuLV-gp70 (SU+TM) , Ampho-gp70 (SU+TM) , 10A1-gp70 (SU+TM) , Eco-gp70 (SU+TM) , GP64, LCMV-G (GP1&GP2) , MV-G, HCV-G, CNV-G, PRV-G, Gp160 (gp120 / gp41) , and SYNA; preferably the viral envelope protein is VSV-G or COV-G; (d) a regulatory protein which is selected from Rev, Tat, Nef, Vpr, Vif, and Vpu Rev protein, preferably the regulatory protein is Rev, and (e) a polyprotein gag-pol and (f) optionally a rev response element (RRE) . In some cases, the LetS-VLPs described herein consists essentially (a) a nucleic acid comprising a cargo sequence; (b) a gag protein; (c) a VSV-G or COV-G protein; (d) a Rev protein; (e) a Pol protein; and (f) an RRE. In one aspect, the disclosure is related to a virus-like particle (VLP) comprising (a) a nucleic acid comprising a cargo sequence, (b) a viral structural protein, and (c) a viral envelope protein, wherein the VLP does not comprise MS2 and MS2 coat protein.

[0010] In some embodiments, the VLP does not comprise (1) PP7 coat protein, PP7 RNA, (2) P22N, BoxB RNA, (3) λN, λ BoxB RNA, (4) tDeg, Pepper RNA, (5) Pumilio homology domain ( “PUM-HD” ) , PUM-HD response elements, (6) catalytically deactivated Cas13 ( “dCas13” ) , (7) COM RNA, COM protein, (8) Arc1, (9) Asprv1, (10) Paraneoplastic Ma antigen ( “PNMA” ) protein, (11) coiled-coil domain containing 8 ( “CCDC8” ) , (12) PEG10, or (13) retrotransposon gag like (RTL) protein.

[0011] In some embodiments, the PNMA protein is selected from the group consisting of PNMA1, PNMA2, PNMA3, PNMA4 (MOAP1) , PNMA5, PNMA6A, PNMA6E, PNMA6F, PNMA7A (ZCCHC12) , PNMA7B (ZCCHC18) , PNMA8A, PNMA8B, and PNMA8C; wherein the RTL protein is selected from the group consisting of RTL1, RTL3, RTL4, RTL5, RTL6, RTL7, RTL8, RTL9, and RTL10.

[0012] In some embodiments, the VLP does not comprise an exogenous aptamer sequence, an exogenous aptamer binding protein (ABP) , mammalian retrovirus-like protein and / or any capture moiety for packaging a cargo. In some embodiments, the aptamer is an RNA aptamer.

[0013] In some embodiments, the VLP does not comprise a retroviral long terminal repeat (LTR) .

[0014] In some embodiments, the VLP does not comprise an RNA packaging signal sequence (e.g., psi) .

[0015] In some embodiments, the VLP does not comprise a central polypurine tract (cPPT)  / central termination sequence (CTS) .

[0016] In some embodiments, the VLP does not comprise reverse transcription and integration-related sequences including 5’ LTR, 3’ LTR, an RNA packaging signal sequence (psi) , partial Gag, partial Env, a primer binding site (pbs) and a central polypurine tract (cPPT)  / central termination sequence (CTS) .

[0017] In some embodiments, the cargo sequence does not integrate into the genome of the target cell when the nucleic acid is introduced into a target cell.

[0018] In some embodiments, the viral structural protein is selected from gag, matrix protein MA, and capsid proteins CA, NC, p4, p7, p9, p12, p17, p24, p30, SP1, and SP2.

[0019] In some embodiments, the viral structural protein comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 6.

[0020] In some embodiments, the viral envelope protein is selected from vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) , cocal virus glycoprotein (COV-G) protein, RD114-gp70 (SU+TM) , GALV-gp70 (SU+TM) , BaEV-gp70 (SU+TM) , measles, Nipah, MSCV, Cocal, MuLV-gp70 (SU+TM) , Ampho-gp70 (SU+TM) , 10A1-gp70 (SU+TM) , Eco-gp70 (SU+TM) , GP64, LCMV-G (GP1&GP2) , MV-G, HCV-G, CNV-G, PRV-G, Gp160 (gp120 / gp41) , and Syncytin-A (SYNA) .

[0021] In some embodiments, the viral envelope protein comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 2.

[0022] In some embodiments, the viral envelope protein comprises one or more mutations and has reduced binding to low-density lipoprotein receptor (LDL-R) . In some embodiments, the viral envelope protein retains fusogenic activity compared to a reference viral glycoprotein.

[0023] In some embodiments, the VLP further comprises an envelope surface-bound targeting molecule that specifically recognizes a cell surface protein on a target cell (e.g., an antibody fragment, a receptor, a ligand to a target cell marker) .

[0024] In some embodiments, the target cell is an immune cell.

[0025] In some embodiments, the immune cell is selected from the group consisting of a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a T cell, a natural killer (NK) cell, or a combination thereof.

[0026] In some embodiments, the immune cell is a T cell.

[0027] In some embodiments, the cell surface protein is selected from the group consisting of CD3, CD5, CD2, CD3, CD4, CD8 and CD7.

[0028] In some embodiments, the envelope surface-bound targeting molecule comprises an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes the cell surface protein on the target cell, and optionally wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of a full-length antibody, a Fab, a Fab’ , a (Fab’ ) 2, an Fv, an scFv, and an sdAb.

[0029] In some embodiments, the cargo sequence encodes an engineered receptor (e.g., CAR, TCR, TAC) , a vaccine, or an enzyme, wherein the CAR comprises an extracellular binding domain specifically recognizing a cancer-associated antigen, a cancer-specific antigen, or an autoimmune disease-associated antigen.

[0030] In some embodiments, the nucleic acid is an RNA. In some embodiments, the RNA comprises a short hairpin RNA (shRNA) , a small interfering ribonucleic acid (siRNA) , a single guide ribonucleic acid (sgRNA) , a long non-coding RNA (lncRNA) , a micro-ribonucleic acid (miRNA) , a primary micro-ribonucleic acid (pri-miRNA) , a messenger ribonucleic acid (mRNA) , a CRISPR-RNA (crRNA) , a single guide ribonucleic acid (sgRNA) , a trans-activating CRISPR ribonucleic acid (tracrRNA) , a single stranded ribonucleic acid (ssRNA) , a double stranded ribonucleic acid (dsRNA) , or a combination thereof.

[0031] In some embodiments, the nucleic acid is single stranded or double stranded.

[0032] In some embodiments, the VLP further comprises a regulatory protein (e.g., Rev) .

[0033] In some embodiments, the regulatory protein is selected from Rev, Tat, Nef, Vpr, Vif, and Vpu.

[0034] In some embodiments, the regulatory protein comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 10.

[0035] In some embodiments, the regulatory protein is a Rev protein.

[0036] In some embodiments, the viral structural protein is a group-specific antigen (gag) protein.

[0037] In some embodiments, the nucleic acid does not specifically bind to the viral structural protein (e.g., via an RNA aptamer / ABP pair) .

[0038] In some embodiments, the cargo sequence is GOI.

[0039] In some embodiments, the VLP is capable of delivering the cargo sequence into a target cell.

[0040] In some embodiments, the VLP is derived from a retrovirus, preferably from a lentivirus or a γ-retrovirus.

[0041] In some embodiments, the VLP consists essentially of: the nucleic acid comprising the cargo sequence, the viral structural protein, the viral envelope protein, a regulatory protein, and a polyprotein, and optionally a rev response element (RRE) .

[0042] In some embodiments, the viral structural protein is selected from gag, matrix protein MA, and capsid proteins CA, NC, p4, p7, p9, p12, p17, p24, p30, SP1, and SP2; preferably the viral structural protein is gag. In some embodiments, the viral envelope protein is selected from vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) , cocal virus glycoprotein (COV-G) protein, RD114-gp70 (SU+TM) , GALV-gp70 (SU+TM) , BaEV-gp70 (SU+TM) , measles, Nipah, MSCV, Cocal, MuLV-gp70 (SU+TM) , Ampho-gp70 (SU+TM) , 10A1-gp70 (SU+TM) , Eco-gp70 (SU+TM) , GP64, LCMV-G (GP1&GP2) , MV-G, HCV-G, CNV-G, PRV-G, Gp160 (gp120 / gp41) , and SYNA; preferably the viral envelope protein is VSV-G or COV-G. In some embodiments, the regulatory protein is selected from Rev, Tat, Nef, Vpr, Vif, and Vpu Rev protein; preferably the regulatory protein is Rev. In some embodiments, the polyprotein is gag-pol.

[0043] In some embodiments, the VLP consists of the nucleic acid comprising the cargo sequence, a gag protein, a VSV-G or COV-G protein, a Rev protein, a Pol protein, and an RRE.

[0044] In one aspect, the disclosure is related to a method of preparing the VLP described herein in a cell, comprising: (a) introducing into the cell a cargo vector carrying a cargo sequence; (b) expressing a viral structural protein; and (c) expressing a viral envelope protein, wherein step (b) comprises introducing into the cell a first vector encoding a viral structural protein and a second vector encoding a rev protein; and step (c) comprises introducing into the cell a third vector encoding a viral envelope protein.

[0045] In some embodiments, the first vector further encodes a pol protein, optionally the first vector comprises a rev response element (RRE) . In some embodiments, the method relies on non-specific interaction between the cargo sequence and the viral structural protein to incorporate the cargo sequence into the VLP.

[0046] In some embodiments, the wt / wt ratio between the cargo vector and the first vector is higher than 10: 1. In some embodiments, the wt / wt ratio between the cargo vector and the second vector is higher than 10: 1. In some embodiments, the wt / wt ratio between the cargo vector and the third vector is higher than 10: 1.

[0047] In some embodiments, the wt / wt ratio between the cargo vector and the first vector is higher than 16: 1. In some embodiments, the wt / wt ratio between the cargo vector and the second vector is higher than 16: 1. In some embodiments, the wt / wt ratio between the cargo vector and the third vector is higher than 16: 1.

[0048] In one aspect, the disclosure is related to a VLP prepared by the method described herein.

[0049] In one aspect, the disclosure is related to a method of modifying a target cell comprising introducing the VLP described herein into the target cell.

[0050] In some embodiments, the method is performed in vitro and comprises introducing the VLP into the target cell in vitro.

[0051] In some embodiments, the method is performed in vivo and comprises introducing the VLP into the target cell in vivo.

[0052] In some embodiments, the cargo sequence encodes an immunogen.

[0053] In some embodiments, the cargo sequence encodes an engineered receptor (e.g., CAR) .

[0054] In some embodiments, the engineered receptor comprises an extracellular antigen binding domain or ligand binding domain, and optionally an intracellular signaling domain.

[0055] In some embodiments, the engineered receptor is selected from the group consisting of an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , a T cell antigen coupler (TAC) or a portion thereof.

[0056] In some embodiments, the target cell is an immune cell (e.g., T cell) .

[0057] In some embodiments, the target cell is a T cell.

[0058] In some embodiments, the genome of the target cell remains intact after the modification.

[0059] In some embodiments, the cargo sequence is expressed for more than 7 days, 10 days, or 13 days. In some embodiments, the cargo sequence is expressed for more than 7 days, 10 days, or 13 days and less than 90 days, 60 days, or 30 days.

[0060] In some embodiments, the cargo sequence encodes a genome-editing enzyme (e.g., CRISPR) .

[0061] In one aspect, the disclosure is related to a modified cell prepared by the method described herein.

[0062] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition, comprising (a) the VLP described herein, or the modified cell described herein, and (b) a pharmaceutically acceptable carrier.

[0063] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering to the subject in need thereof a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition described herein.

[0064] In some embodiments, the disease is cancer or an auto-immune disease. Examples of auto-immune diseases include, but are not limited to, Addison's disease, alopecia areata, ankylosing spondylitis, autoimmune hepatitis, autoimmune mumps, Crohn's disease, diabetes (type I) , bullous epidermal detachment, epididymitis, glomerulonephritis, Graves'disease, Guillain-Guillain-Barr syndrome, hypodermic disease, hemolytic anemia, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, myasthenia gravis, pemphigus vulgaris, psoriasis, rheumatism fever, rheumatoid arthritis, sarcoidosis, scleroderma, Sjogren syndrome (Sjogren's syndrome) , spinal arthritis, thyroiditis, vasculitis, vitiligo, myxedema, pernicious anemia, ulcerative colitis, acute idiopathic thrombocytopenic purpura, chronic idiopathic thrombocytopenic purpura, dermatomyositis, Sydenham's chorea, lupus nephritis, rheumatic fever, polyglandular syndromes, bullous pemphigoid, diabetes mellitus, Henoch-Schonlein purpura, post-streptococcal nephritis, erythema nodosum, Takayasu's arteritis, ANCA-associated vasculitides, erythema multiforme, IgA nephropathy, polyarteritis nodosa, Goodpasture's syndrome, thromboangitis obliterans, primary biliary cirrhosis, Hashimoto's thyroiditis, thyrotoxicosis, chronic active hepatitis, polymyositis / dermatomyositis, polychondritis, Wegener's granulomatosis, membranous nephropathy, amyotrophic lateral sclerosis, tabes dorsalis, giant cell arteritis / polymyalgia, rapidly progressive glomerulonephritis, psoriasis and fibrosing alveolitis.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0065] FIG. 1A shows CAR1 expression on primary T cells as measured by flow cytometry on days 3, 6, 10, 13, and 17 after transduction by LetS-VLP (Batches 1-2) .

[0066] FIG. 1B shows T cell expansion fold on days 3, 6, 10, 13 after transduction by LetS-VLP (Batches 1-2) .

[0067] FIG. 2A shows CAR2 expression on primary T cells as measured by flow cytometry on days 3, 6, 10, 13 after transduction by LetS-VLP (Batch 1) .

[0068] FIG. 2B shows T cell expansion fold on days 3, 6, 10, 13 after transduction by LetS-VLP (Batch 1) .

[0069] FIG. 3A shows CAR2 expression on primary T cells as measured by flow cytometry on days 3, 6, 10, 13, 17, and 20 after transduction by LetS-VLP (Batch 2) .

[0070] FIG. 3B shows T cell expansion fold on days 3, 6, 10, 13 after transduction by LetS-VLP (Batch 2) .

[0071] FIG. 4 shows CAR2 expression on primary T cells as measured by flow cytometry on days 3, 6, 10, 13, and 16 after transduction by LetS-VLP (Batches 6-7) .

[0072] FIG. 5 shows an exemplary structure of a LetS-VLP.

[0073] FIG. 6A shows an exemplary structure of GOI (CAR1) .

[0074] FIG. 6B shows an exemplary structure of GOI (CAR2) .

[0075] FIG. 6C shows an exemplary structure of pMD2. G.

[0076] FIG. 6D shows an exemplary structure of pMDLg / pRRE.

[0077] FIG. 6E shows an exemplary structure of pRSV-Rev.

[0078] FIG. 7 shows relevant amino acid sequences.DETAILED DESCRIPTION

[0079] The present disclosure provides LetS-VLPs comprising a cargo and methods of making thereof. Such LetS-VLPs can be used to efficiently deliver cargo into target cells. Also disclosed are methods of making LetS-VLPs and methods of making engineered cells (e.g., CAR-T cells) using LetS-VLPs.

[0080] VLPs are virus-derived structures made up of one or more different molecules with the ability to self-assemble, mimicking the form and size of a virus particle but lacking the genetic material so they are not capable of infecting the host cell. Expression and self-assembly of the viral structural proteins can take place in various living or cell-free expression systems after which the viral structures can be assembled and reconstructed. Structural proteins from viruses, such as human immunodeficiency virus (HIV) , adeno-associated virus, Hepatitis B virus (HBV) , Hepatitis C virus (HCV) and bacteriophages have been used to produce VLPs. These particles are of different sizes, with most ranging from 20–200 nm. Based on the presence or absence of lipid envelopes, VLPs are classified into two main types: enveloped and non-enveloped VLPs and the presence of proteins organized into single-layered, two-layered or multi-layered. VLPs are being used for different purposes. Since they contain an internal cavity, they can be used as efficient delivery vehicles and they have been exploited for the delivery of different biological material, including genes, peptides, proteins and small drugs.

[0081] A detailed review of VLPs and methods of making thereof can be found in, e.g., Zeltins, Andris. "Construction and characterization of virus-like particles: a review. " Molecular biotechnology 53.1 (2013) : 92-107; Dai, Shiyu, Hualin Wang, and Fei Deng. "Advances and challenges in enveloped virus-like particle (VLP) -based vaccines. " Journal of Immunological Sciences 2.2 (2018) , each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0082] For purposes of delivering nucleic acids, various RNA aptamers and aptamer-binding proteins (ABPs) can be used to package cargo sequences containing the aptamer sequence into VLPs. A description of these aptamer / ABP pairs and their application in VLPs can be found in, e.g., Lyu, Pin, and Baisong Lu. "New advances in using virus-like particles and related technologies for eukaryotic genome editing delivery. " International Journal of Molecular Sciences 23.15 (2022) : 8750; Braselmann, Esther, et al. "Illuminating RNA biology: tools for imaging RNA in live mammalian cells. " Cell chemical biology 27.8 (2020) : 891-903, each of which is incorporated by reference in its entirety. For example, at least four pairs of RNA aptamers / ABPs-MS2 / MS2 coat protein (MCP) , PP7 / PP7 coat protein (PCP) , com / Com, and BoxB / λ N22 peptide-have been used in VLP-mediated RNA or RNP delivery. Each aptamer specifically binds to its ABP with high affinity. The table below summarizes common aptamer / ABP pairs. Table 1: Exemplary aptamer / ABP pairs

[0083] As another example, PEG10 can be used as a ABP that specifically recognizes an aptamer sequence in the Peg10 mRNA (e.g., Peg10 5’ and 3’ UTRs) . See Segel, Michael, et al. "Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery. " Science 373.6557 (2021) : 882-889. Other elements including PNMA1, PNMA2, PNMA3, PNMA4 (MOAP1) , PNMA5, PNMA6A, PNMA6E, PNMA6F, PNMA7A (ZCCHC12) , PNMA7B (ZCCHC18) , PNMA8A, PNMA8B, PNMA8C, RTL1, RTL3, RTL4, RTL5, RTL6, RTL7, RTL8, RTL9, and RTL10 are also can be used as ABPs. See Sibarov et al. "Arc protein, a remnant of ancient retrovirus, forms virus-like particles, which are abundantly generated by neurons during epileptic seizures, and affects epileptic susceptibility in rodent models" , Front Neurol. 14 (2023) : 1-12. Junjie Xu et al. "PNMA2 forms immunogenic non-enveloped virus-like capsids associated with paraneoplastic neurological syndrome" , Cell 187.4 (2024) : 831-845. e19.

[0084] Paraneoplastic Ma antigen ( “PNMA” ) proteins include PNMA1, PNMA2, PNMA3, PNMA4 (MOAP1) , PNMA5, PNMA6A, PNMA6E, PNMA6F, PNMA7A (ZCCHC12) , PNMA7B (ZCCHC18) , PNMA8A, PNMA8B, and PNMA8C. Retrotransposon gag like ( “RTL” ) proteins are including RTL1, RTL3, RTL4, RTL5, RTL6, RTL7, RTL8, RTL9, and RTL10.

[0085] Other examples of aptamers include dye-binding aptamers such as Spinach, Broccoli, Corn, Mangoes, Peppers. See Braselmann, Esther, et al. “Illuminating RNA biology: tools for imaging RNA in live mammalian cells. ” Cell chemical biology 27.8 (2020) : 891-903.

[0086] Other examples of ABPs include tDeg. See Wu, Jiahui, et al. "Live imaging of mRNA using RNA-stabilized fluorogenic proteins. " Nature methods 16.9 (2019) : 862-865. Other examples of ABPs include catalytically deactivated Cas13 (dCas13) , which can be fused to a range of effector domains to target specific RNA sequences. See Tang, Heng, et al. "Live-cell RNA imaging using the CRISPR-dCas13 system with modified sgRNAs appended with fluorescent RNA aptamers. " Chemical Science 13.47 (2022) : 14032-14040. Other examples of ABPs include the bacteriophage Mu Com ( “Com” ) , which is a small zinc finger protein that binds to its cognate mom mRNA and activates its translation. See Nowacka, Martyna, et al. "Specific interaction of zinc finger protein Com with RNA and the crystal structure of a self-complementary RNA duplex recognized by Com. " Plos one 14.4 (2019) : e0214481. Other examples of ABPs include YBX1, SYNCRIP, Arc1, AGO2, ALIX, MVP, hnRNPU, and ANXA2. See Julia, et al. "Exploiting the biogenesis of extracellular vesicles for bioengineering and therapeutic cargo loading. " Molecular Therapy 31.5 (2023) : 1231-1250. Other examples of ABPs include aspartic peptidase retroviral like 1 ( “ASPRV1” ) . See Golda,  et al. "Biochemical characterization of human retroviral-like aspartic protease 1 (ASPRV1) . " Biomolecules 10.7 (2020) : 1004. Other examples of ABPs include coiled-coil domain containing 8 ( “CCDC8” ) . See WO2021055855A1.

[0087] The aptamer can be produced by the systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) . SELEX methodology has been described previously, for example in U.S. Patent Nos. 5,270,163; 5,817,785; 5,595,887; 5,496,938; 5,475,096; 5,861,254; 5,958,691; 5,962,219; 6,013,443; 6,030,776; 6,083,696; 6,110,900; 6,127,119; and 6,147,204; U.S. Application Nos. 20030175703 and 20030083294, Potti et al., Expert Opin. Biol. Ther. 4: 1641-1647 (2004) , and Nimjee et al., Annu. Rev. Med. 56: 555-83 (2005) . The technique of SELEX has been used to evolve aptamers to have extremely high binding affinity to a variety of target proteins. See, for example, Trujillo U. H., et al., “DNA and RNA aptamers: from tools for basic research towards therapeutic applications” . Comb Chem High Throughput Screen 9 (8) : 619-32 (2006) for its disclosure of using SELEX to design aptamers that bind vascular endothelial growth factor (VEGF) .

[0088] LetS-VLPs are characterized in that they do not comprise common VLP elements including MS2, MS2 coat protein. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise the elements including MS2, MS2 coat protein, PP7, PP7 coat protein, BoxB, P22N, λN, Pepper, tDeg, PUM-HD, dCas13, COM, COM protein, Arc1, Asprv1, a PNMA protein, CCDC8, PEG10 and an RTL protein. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise the elements including the functional fragment of any one of the elements, provided that the fragment is capable of capturing and packaging a cargo within VLP. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise the elements including (i) the elements including MS2, MS2 coat protein, PP7, PP7 coat protein, BoxB, P22N, λN, Pepper, tDeg, PUM-HD, dCas13, COM, COM protein, Arc1, Asprv1, a PNMA protein, CCDC8, PEG10 and an RTL protein; and (ii) the functional fragment of any one of the elements, provided that the fragment is capable of capturing and packaging a cargo within VLP. In some cases, the PNMA protein is selected from the group consisting of PNMA1, PNMA2, PNMA3, PNMA4 (MOAP1) , PNMA5, PNMA6A, PNMA6E, PNMA6F, PNMA7A (ZCCHC12) , PNMA7B (ZCCHC18) , PNMA8A, PNMA8B, and PNMA8C. In some cases, the RTL protein is selected from the group consisting of RTL1, RTL3, RTL4, RTL5, RTL 6, RTL7, RTL8, RTL9, and RTL10. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise an exogenous aptamer sequence. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise an exogenous RNA aptamer sequence or an exogenous aptamer binding protein (ABP) . In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise mammalian retrovirus-like protein and / or any capture moiety for packaging a cargo.

[0089] Without wishing to be bound by theory, the methods disclosed herein can efficiently package the cargo into the LetS-VLPs described herein without using known aptamer / ABP pairs. In some cases, the methods disclosed herein relies on non-specific interactions between the cargo and the structural protein to incorporate the cargo into the LetS-VLPs. LetS-VLPs are advantageous in that the cargo (e.g., RNA) sequence does not integrate into the genome of the target cell. LetS-VLPs are also advantageous in that they are easy to prepare.

[0090] As used herein, an “RNA aptamer” or “RNA aptamer sequence” is defined as RNA oligonucleotides that bind to a specific target with high affinity and specificity.

[0091] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more polynucleotides of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more polynucleotides of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-Atail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector. The vector delivers one or more polynucleotides of interest to a host cell by a directed integration method (including site-specific integration, and gene-targeted integration) and / or a random integration method.

[0092] The term “introducing” or “introduced” means “transfecting” or “transfected” or “transforming” or “transformed” or “transducing” or “transduced” , which refers to a process by which exogenous nucleic acid is transferred into the host cell. A “transfected” or “transformed” or “transduced” cell is one which has been transfected, transformed or transduced with exogenous nucleic acid.

[0093] “Derived from” as that term is used herein, indicates a relationship between a first and a second molecule. It generally refers to structural similarity between the first molecule and a second molecule and does not connotate or include a process or source limitation on a first molecule that is derived from a second molecule. For example, in the case of an intracellular signaling domain that is derived from a CD3zeta molecule, the intracellular signaling domain retains sufficient CD3zeta sequence / structure such that is has the required function, namely, the ability to generate a signal under the appropriate conditions. It does not connotate or include a limitation to a particular process of producing the intracellular signaling domain, for example, it does not mean that, to provide the intracellular signaling domain, one must start with a CD3zeta sequence and delete unwanted sequence, or impose mutations, to arrive at the intracellular signaling domain.

[0094] As used herein, the term “about” when referring to a measurable value such as an amount, a temporal duration, and the like, is meant to encompass variations of ± 20%or in some instances ± 10%, or in some instances ± 5%, or in some instances ± 1%, or in some instances ± 0.1%from the specified value, as such variations are appropriate to perform the disclosed methods.

[0095] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. Methods and materials are described herein for use in the present disclosure; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0096] The term “retrovirus” as used herein is defined as an RNA virus of the Retroviridae family. Examples of retroviruses include, but are not limited to, members of the Lentivirus, Alpha-retrovirus, Beta-retrovirus, Gamma-retrovirus, Delta-retrovirus, Spumavirus and Epsilonretrovirus. LetS-VLPs

[0097] The LetS-VLPs described herein may contain (1) a cargo (e.g., RNA) , (2) a viral structural protein (e.g., HIV-1 gag protein) , and (3) a viral envelope protein (e.g., VSV-G) . LetS-VLPs can be used to deliver the cargo into a target cell. The LetS-VLPs may be derived from a retrovirus (RVV) . The LetS-VLPs may be derived from a lentivirus (LVV) .

[0098] LetS-VLPs are characterized in that they do not comprise certain common VLP elements. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise common VLP elements including MS2, and MS2 coat protein. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise the elements including MS2, MS2 coat protein, PP7, PP7 coat protein, BoxB, P22N, λN, Pepper, tDeg, PUM-HD, dCas13, COM, COM protein, Arc1, Asprv1, a PNMA protein, CCDC8, PEG10 and an RTL protein. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise the elements including the functional fragment of any one of the elements, provided that the fragment is capable of capturing and packaging a cargo within VLP. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise the elements including (i) the elements including MS2, MS2 coat protein, PP7, PP7 coat protein, BoxB, P22N, λN, Pepper, tDeg, PUM-HD, dCas13, COM, COM protein, Arc1, Asprv1, a PNMA protein, CCDC8, PEG10 and an RTL protein; and (ii) the functional fragment of any one of the elements, provided that the fragment is capable of capturing and packaging a cargo within VLP. In some cases, the PNMA protein is selected from the group consisting of PNMA1, PNMA2, PNMA3, PNMA4 (MOAP1) , PNMA5, PNMA6A, PNMA6E, PNMA6F, PNMA7A (ZCCHC12) , PNMA7B (ZCCHC18) , PNMA8A, PNMA8B, and PNMA8C. In some cases, the RTL protein is selected from the group consisting of RTL1, RTL3, RTL4, RTL5, RTL 6, RTL7, RTL8, RTL9, and RTL10. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise an exogenous aptamer sequence. In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise an exogenous RNA aptamer sequence or an exogenous aptamer binding protein (ABP) . In some cases, the LetS-VLPs described herein do not comprise mammalian retrovirus-like protein and / or any capture moiety for packaging a cargo. In some cases, the LetS-VLPs do not comprise a retroviral or lentiviral long terminal repeat (LTR) . In some cases, the LetS-VLPs do not comprise an RNA packaging signal sequence (e.g., psi) . In some cases, the LetS-VLPs do not comprise a central polypurine tract (cPPT)  / central termination sequence (CTS) . In some cases, the LetS-VLPs do not comprise reverse transcription and integration-related sequences including 5’ LTR, 3’ LTR, an RNA packaging signal sequence (psi) , partial Gag, partial Env, a primer binding site (pbs) and a central polypurine tract (cPPT)  / central termination sequence (CTS) .

[0099] Without wishing to be bound by theory, the methods disclosed herein can efficiently package the cargo into the LetS-VLPs described herein without using known aptamer / ABP pairs. In some cases, the methods disclosed herein relies on non-specific interactions between the cargo and the structural protein to incorporate the cargo into the LetS-VLPs. LetS-VLPs are advantageous in that the cargo (e.g., RNA) sequence does not integrate into the genome of the target cell. LetS-VLPs are also advantageous in that they are easy to prepare.

[0100] The cargo may be a nucleic acid (e.g., RNA) comprising a cargo sequence. The nucleic acid may be an RNA. The nucleic acid may be single stranded or double-stranded. The cargo sequence may encode a therapeutic protein (e.g., high density-lipoprotein, an antibody) . The cargo sequence may encode an engineered receptor (e.g., CAR) , a vaccine, a cytokine or an enzyme. The cargo sequence may encode a chimeric antigen receptor (CAR) . For example, the cargo sequence may encode CAR1 (see Example 1) or CAR2 (see Example 2) . CAR1 may comprise or consist of an amino acid sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 13. CAR1 may be encoded by a CAR1 DNA sequence in a vector. The CAR1 DNA sequence that transcribes RNA may comprise or consist of an DNA sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. CAR2 (CD19 / CD20 Dual CAR, 2,400 bp) may be encoded by a CAR2 RNA sequence in a vector. In some cases, the cargo does not comprise reverse transcription and integration-related sequences including 5’ LTR, 3’ LTR, an RNA packaging signal sequence (psi) , partial Gag, partial Env, a primer binding site (pbs) and a central polypurine tract (cPPT)  / central termination sequence (CTS) . In some cases, the cargo does not specifically bind to the viral structural protein (e.g., via an RNA aptamer / ABP pair) .

[0101] LetS-VLPs may contain a viral structural protein that is selected from gag, matrix protein MA, and capsid proteins CA, NC, p4, p7, p9, p12, p17, p24, p30, SP1, and SP2. The viral structural protein may be a HIV-1 gag protein. The HIV-1 gag protein sequence may comprise or consist of an amino acid sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 6. The HIV-1 gag protein may be encoded by a HIV-1 gag DNA sequence in a vector. The HIV-1 gag DNA sequence may comprise or consist of a DNA sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 5. The viral structural protein may comprise one or more mutations.

[0102] LetS-VLPs may contain a viral envelope protein that is selected from vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) protein, cocal virus glycoprotein (COV-G) protein, RD114-gp70 (SU+TM) , GALV-gp70 (SU+TM) , BaEV-gp70 (SU+TM) , measles, Nipah, MSCV, Cocal, MuLV-gp70 (SU+TM) , Ampho-gp70 (SU+TM) , 10A1-gp70 (SU+TM) , Eco-gp70 (SU+TM) , GP64, LCMV-G (GP1&GP2) , MV-G, HCV-G, CNV-G, PRV-G, Gp160 (gp120 / gp41) , and SYNA. The viral envelope protein may be a VSV-G protein. The VSV-G protein sequence may comprise or consist of an amino acid sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 2. The VSV-G protein may be encoded by a VSV-G DNA sequence in a vector. The VSV-G DNA sequence may comprise or consist of a DNA sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1. The viral envelope protein may comprise one or more mutations and has reduced binding to low-density lipoprotein receptor (LDL-R) and optionally retains fusogenic activity compared to the reference viral glycoprotein. The VSV-G protein may comprise an I182E or I182D mutation as compared to SEQ ID NO: 2. The mutated VSV-G envelope protein may include a mutation at amino acid position H8, N9, Q10, K47, K50, A51, S183, S179, N180, I182, M184, Y209, I347, T350, T352, E353, R354, an insertion of TT between N9 and Q10, an insertion of GGS between H8 and N9, an insertion of GGS between N9 and Q10, an insertion of TT between N208 and Y209, an insertion of GGS between P46 and K47, an insertion of GGS between N208 and Y209, and / or a deletion of residues 1-8. The viral envelope protein may be a COV-G protein. The viral envelope protein may be engineered to lack LDLR binding affinity, e.g., by mutation at positions 47 (e.g., K47Q) and / or 354 (e.g., R354A) . The COV-G protein may comprise an R354Q mutation (see WO2024213153A1) .

[0103] LetS-VLPs may contain an envelope surface-bound targeting molecule that specifically recognizes a cell surface protein on a target cell (e.g., an antibody fragment, a receptor, a ligand to a target cell marker) . The target cell can be an immune cell. The immune cell can be selected from a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a T cell, and a natural killer (NK) cell. The immune cell can be a T cell. The cell surface protein can be selected from CD3, CD5, CD2, CD3, CD4, CD8 and CD7. The envelope surface-bound targeting protein may specifically bind to (a) a T cell marker selected from CD3, CD28, CD80, 4-1BB, AhR, CD3, CD2, CD7, CD4, CD8, CD25, CD44, CD45RA, CD47, CD62L, CD69, CD94, CD95, CD127, CD 161, CD 183 (CXCR3) , CD 184 (CXCR4) , CD 185 (CXCR5) , CD 193 (CCR3) , CD 194 (CCR4) , CD 195 (CCR5) , CD 196 (CCR6) , CD 197 (CCR7) , CCR10, PD-1, TCRa / b, CD5, CD27, CD45RO, CD45RB, CD57, CD103, CD122, P2RX7, TIGIT, LAG-3, TIM-3, and IL6ST, or any combination thereof; (b) a gd T cell marker selected from gd TCR, Vdeltal, Vdelta2, and NKG2D (KLRK1, CD314) ; (c) an NK T cell marker selected from Invariant TCR (Va24-Jal8) , CD 185 (CXCR5) , CXCR6, and IL-21R, or any combination thereof; or (d) a MAIT cell marker selected from Va7.2, Ja33, CXCR6, IL-18R, KLRB1 (CD161) , and VLA4 (alpha4betal integrin) , or any combination thereof.

[0104] The envelope surface-bound targeting molecule may comprise an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes the cell surface protein on the target cell. The antibody or antigen-binding fragment thereof may be selected from a full-length antibody, a Fab, a Fab’ , a (Fab’ ) 2, an Fv, an scFv, and an sdAb. The targeting molecule may be an antibody, a scFv antibody, an antigen binding domain, an ankyrin repeat (e.g., DARPIN) , a VHH domain antibody, a nanobody, single domain antibody, a FN3 domain, or any combination thereof. The targeting moiety may comprise an engineered fusogen. The engineered fusogen may enable pH-dependent fusion. LetS-VLPs may contain an anti-CD3 single-chain variable fragment. The LetS-VLPs may include multiple targeting proteins or a single targeting protein having multiple different lymphocyte targeting domains.

[0105] LetS-VLPs may contain a HIV-1 gag-pol protein. The HIV-1 gag-pol protein sequence may comprise or consist of an amino acid sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 7. The HIV-1 gag-pol protein may be encoded by a HIV-1 gag-pol DNA sequence in a vector. The HIV-1 gag-pol DNA sequence may comprise or consist of a DNA sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 4 .

[0106] LetS-VLPs may contain a regulatory protein. The regulatory protein may be selected from Rev, Tat, Nef, Vpr, Vif, and Vpu. The regulatory protein may be a rev protein. The rev protein sequence may comprise or consist of an amino acid sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 10. The rev protein may be encoded by a rev DNA sequence in a vector. The rev DNA sequence may comprise or consist of a DNA sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 9.

[0107] LetS-VLPs may be encoded by one or more packaging vectors. One such packaging vector may be pMD2. G (see Example 1) . pMD2. G may comprise or consist of a DNA sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 15. pMD2. G may comprise the VSV-G DNA sequence described herein.

[0108] One such vector may be pMDLg / pRRE (see Example 1) . pMDLg / pRRE may comprise or consist of a sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 8. pMDLg / pRRE may comprise the HIV-1 gag DNA sequence described herein. pMDLg / pRRE may comprise the HIV-1 gag-pol DNA sequence described herein.

[0109] One such vector may be pRSV-Rev (see Example 1) . pRSV-Rev may comprise or consist of a sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. pRSV-Rev may comprise the rev DNA sequence described herein.

[0110] One such vector may be GOI (see Example 1) . GOI may comprise or consist of a sequence that is at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. GOI may comprise the CAR1 DNA sequence or CAR2 DNA described herein. Making LetS-VLPs

[0111] One aspect of the present disclosure provides cells methods of preparing the LetS-VLPs described herein. The method of preparing LetS-VLPs in a cell may include (a) introducing into the cell a cargo vector carrying a cargo sequence; (b) expressing a viral structural protein (e.g., gag) ; and (c) expressing a viral envelope protein (e.g., VSV-G) . Step (b) may comprise introducing into the cell a first vector encoding a viral structural protein (e.g., gag) . Step (b) may comprise introducing into the cell a second vector encoding a regulatory protein (e.g., rev) . Step (c) may comprise introducing into the cell a third vector encoding a viral envelope protein (e.g., VSV-G) . The first vector may further encode a pol. The fist vector may further comprise a HIV-1 Rev response element (RRE) .

[0112] For example, LetS-VLPs can be prepared by introducing (e.g., via transduction) the GOI and packaging vectors (e.g., pMD2. G, pMDLg / pRRE, pRSV-Rev) into packaging cells (e.g., Lenti-X 293T cells) . The GOI and packaging vector can be introduced using a PEI-based DNA transfection reagent (e.g., PEIpro-HQ) . The packaging cells may be in an adherent cell culture or a suspension cell culture (see Example 1) . In adherent cell culture, cells are grown while attached to a substrate as monolayers. In suspension cell culture, cells are free floating in the culture medium. The LetS-VLPs produced by the packaging cells can be harvested by ultracentrifugation.

[0113] For adherent cell culture, the packaging cells can be seeded in at more than 2.5×103 cells / cm2, 5×103 cells / cm2, 1×104 cells / cm2, 2×104 cells / cm2, 4×104 cells / cm2, 8×104 cells / cm2, 1.6×105 cells / cm2, or 3.2×105 cells / cm2. The packaging cells can be seeded in at less than 2.5×103 cells / cm2, 5×103 cells / cm2, 1×104 cells / cm2, 2×104 cells / cm2, 4×104 cells / cm2, 8×104 cells / cm2, 1.6×105 cells / cm2, or 3.2×105 cells / cm2.

[0114] For suspension cell culture, the packaging cells can be seeded in at more than 1×105 cells / cm2, 2×105 cells / cm2, 3.75×105 cells / cm2, 7.5×105 cells / cm2, 1.5×106 cells / cm2, 3×106 cells / cm2, 6×106 cells / cm2, or 1.2×107 cells / cm2. The packaging cells can be seeded in at more than 1×105 cells / cm2, 2×105 cells / cm2, 3.75×105 cells / cm2, 7.5×105 cells / cm2, 1.5×106 cells / cm2, 3×106 cells / cm2, 6×106 cells / cm2, or 1.2×107 cells / cm2.

[0115] The GOI and packaging vectors can be introduced to the packaging cells at certain weight ratios. The weight ratio among the packaging vectors (e.g., pMD2. G, pMDLg / pRRE, pRSV-Rev) can be about 1: 1: 1.

[0116] The weight ratio between GOI and the first vector can be more than about 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1, or 100: 1. The weight ratio between GOI and the first vector can be less than about 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 60: 1, 70:1, 80: 1, 90: 1, or 100: 1. The weight ratio between GOI and the first vector can be more than about 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, or 16: 1. In some cases, the weight ratio between GOI and the first vector is about 16: 1. In some cases, the weight ratio between GOI and the first vector is between 10: 1 and 50: 1, between 8: 1 and 40: 1, or between 6: 1 and 30: 1.

[0117] The weight ratio between GOI and the second vector can be more than about 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1, or 100: 1. The weight ratio between GOI and the second vector can be less than about 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1, or 100: 1. The weight ratio between GOI and the second vector can be more than about 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, or 16: 1. In some cases, the weight ratio between GOI and the second vector is about 16: 1. In some cases, the weight ratio between GOI and the second vector is between 10: 1 and 50: 1, between 8: 1 and 40: 1, or between 6: 1 and 30: 1.

[0118] The weight ratio between GOI and the third vector can be more than about 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1, or 100: 1. The weight ratio between GOI and the third vector can be less than about 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1, or 100: 1. The weight ratio between GOI and the third vector can be more than about 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, or 16: 1. In some cases, the weight ratio between GOI and the third vector is about 16: 1. In some cases, the weight ratio between GOI and the third vector is between 10: 1 and 50: 1, between 8: 1 and 40: 1, or between 6: 1 and 30: 1.

[0119] The molar ratio between GOI and the first vector can be more than about 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1, or 100: 1. The molar ratio between GOI and the first vector can be less than about 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1, or 100: 1. The molar ratio between GOI and the first vector can be more than about 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, or 16: 1. In some cases, the molar ratio between GOI and the first vector is about 16: 1. In some cases, the molar ratio between GOI and the first vector is between 10: 1 and 50: 1, between 8: 1 and 40: 1, or between 6: 1 and 30: 1.

[0120] The molar ratio between GOI and the second vector can be more than about 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1, or 100: 1. The molar ratio between GOI and the second vector can be less than about 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1, or 100: 1. The molar ratio between GOI and the second vector can be more than about 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, or 16: 1. In some cases, the molar ratio between GOI and the second vector is about 16: 1. In some cases, the molar ratio between GOI and the second vector is between 10: 1 and 50: 1, between 8: 1 and 40: 1, or between 6: 1 and 30: 1.

[0121] The molar ratio between GOI and the third vector can be more than about 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1, or 100: 1. The molar ratio between GOI and the third vector can be less than about 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1, or 100: 1. The molar ratio between GOI and the third vector can be more than about 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, or 16: 1. In some cases, the molar ratio between GOI and the third vector is about 16: 1. In some cases, the molar ratio between GOI and the third vector is between 10: 1 and 50: 1, between 8: 1 and 40: 1, or between 6: 1 and 30: 1.

[0122] Without being bound by theory, introducing the GOI in excess amounts comparing to the packaging vectors (e.g., pMD2. G, pMDLg / pRRE, pRSV-Rev) can facilitate the incorporation of the GOI into the LetS-VLPs.

[0123] In some cases, the GOI does not include reverse transcription and integration-related sequences including 5’ LTR, 3’ LTR, RNA packaging signal sequence (psi) , and central polypurine tract (cPPT)  / central termination sequence (CTS) .

[0124] Without being bound by theory, the absence of such reverse transcription and integration-related sequences may facilitate the incorporation of the GOI into the LetS-VLPs. Making engineered cells using LetS-VLPs

[0125] One aspect of the present disclosure provides methods for making engineered cells (e.g., immune effector cells, for example, T cells or NK cells) using the LetS-VLPs herein. The methods of making engineered cells may be performed in vitro and may comprise introducing the LetS-VLPs into the target cells in vitro. The methods of making engineered cells may be performed in vivo and may comprise introducing the LetS-VLPs into the target cells in vivo. The genome of the engineered cells may stay intact exposure to the LetS-VLPs.

[0126] The engineered cells may express a protein encoded by the cargo sequence. The cargo sequence may be expressed for more than 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days, 35 days, 40 days, 45 days, 50 days, 55 days, or 60 days.

[0127] The cargo sequence may encode an engineered receptor (e.g., CAR) , a vaccine, or an enzyme. The cargo sequence may encode a genome-editing enzyme (e.g., CRISPR) . The cargo sequence may encode an engineered receptor. The engineered receptor may comprise an extracellular antigen binding domain or ligand binding domain, and optionally an intracellular signaling domain. The engineered receptor may be selected from an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , a T cell antigen coupler (TAC) or a portion thereof. The target cell may be an immune cell (e.g., T cell) . The target cell may be a T cell. The engineered receptor (e.g., CAR) may redirect the specificity of the engineered cells through the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) or TCR on these cells. The engineered cells may have improved potency homing, cytokine production, recycle killing, and / or improved engraftment.

[0128] The engineered cells may be engineered immune effector cells (e.g., T cells or NK cells) made by the methods described herein. The engineered immune effector cells may be engineered to express a CAR, wherein the engineered immune effector cells exhibit antitumor properties. The CAR may comprise an antigen binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.

[0129] The population of starting cells may be collected from a sample from a subject. The population of cells may be collected from the peripheral blood of a subject. The population of cells may be collected from the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) . T cells (e.g., CD4+ T cells and / or CD8+ T cells) may be purified from the PBMC, for example, using a cell sorting machine, optionally, using an automatic cell sorting machine. The purified T cells may then be seeded for CAR-T manufacturing using the methods described herein. The purified T cells may be seeded at a density of 1 × 106, 2 × 106, 3 × 106, 4 × 106, 5 × 106, or 10 × 106.

[0130] The method may also include activating the cells by contacting a population of cells with an activation medium. The cells can be exposed to one or more cytokines. The activation medium may comprise at least one cytokine selected from the group consisting of IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, and IL-21. The activation medium may contain one or more of the below cytokines: IL-2, IL-7, IL-15 (e.g., hetIL-15 (IL15 / sIL-15Ra) ) , IL-21, and IL-6 (e.g., IL-6 / sIL-6R) ) . The cytokine may be selected from IL-2, IL-7 or IL-15. The cytokine may be a recombinant cytokine. The concentration of the cytokine in the activation medium may be from 1 IU / mL to 1500 IU / mL, such as from 1 IU / mL to 100 IU / mL, 2 IU / mL to 50 IU / mL, 5 IU / mL to 10 IU / mL, 10 IU / mL to 500 IU / mL, 50 IU / mL to 250 IU / mL, 100 IU / mL to 200 IU / mL, 50 IU / mL to 1500 IU / mL, 100 IU / mL to 1000 IU / mL or 200 IU / mL to 600 IU / mL. The concentration of the cytokine in the activation medium, may be at least 1 IU / mL, 5 IU / mL, 10 IU / mL, 50 IU / mL, 100 IU / mL, 200 IU / mL, 300 IU / mL, 400 IU / mL, 500 IU / mL, 1000 IU / mL or 1500 IU / mL. The activation medium may also include an agent capable of activating an intracellular signaling domain of a TCR complex, such as an anti-CD3 and / or anti-CD28 antibody.

[0131] The activation medium may be free and / or substantially free of serum. The activation medium may contain a serum-free media. The serum free media may be a defined and / or well-defined cell culture media. The serum free media may be a controlled culture media that has been processed, e.g., filtered to remove inhibitors and / or growth factors. The serum-free media may contain serum albumin, hydrolysates, growth factors, hormones, carrier proteins, and / or attachment factors. The serum-free media may contain albumin, such as bovine serum albumin, human serum albumin, and / or recombinant albumin. The serum free media may contain a basal media, e.g., AIM-V, DMEM or RPMI 1640, containing amino acids, vitamins, inorganic salts, buffers, antioxidants and energy sources. The serum free media may be supplemented, such as with, but not limited to, albumin, chemically defined lipids, growth factors, insulin, cytokines, and / or antioxidants. The serum free media may be formulated to support growth, proliferation, health, homeostasis of cells of a certain cell type, such as immune cells, T cells, and / or CD4+ and CD8+ T cells.

[0132] The activation medium may contain cytokines that can activate the cells. The activation medium may contain cytokines that can make the cells more receptive to transduction. The activation medium may help prepare the cells for more efficient transduction LetS-VLPs. The activation medium may stimulate the expression of low-density lipid receptor (LDL-R) in the cells. The cells may contain greater than 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%or more of low-density lipid receptor (LDL-R) positive cells. The activation medium may be an AIM-V medium supplemented with FBS and IL-2 (see Example 1) .

[0133] During transduction, the cells may be contacted with an appropriate amount of LetS-VLP. The LetS-VLPs may be provided at a certain ratio of copies of the LetS-VLPs or infectious units (IU) thereof, per total number of cells (IU / cell) in the input composition or total number of cells to be transduced. For example, the LetS-VLPs may be present at 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, or 1000 IU of the LetS-VLPs per one of the cells. The titer of LetS-VLPs may be between 1 × 106 TU / mL and 1 × 1010 TU / mL, such as between or between about 1 × 108 TU / mL and 5 × 109 TU / mL, such as at least 2 × 108 TU / mL, 3 × 108 TU / mL, 4 × 108 TU / mL, 5 × 108 TU / mL, 6 × 108 TU / mL, 7 × 108 TU / mL, 8 × 108 TU / mL, 9 × 108 TU / mL, 1 ×109 TU / mL, 2 ×109 TU / mL, 3 ×109 TU / mL, 4 ×109 TU / mL, or 5 ×109 TU / mL. Transduction can be performed at a multiplicity of infection (MOI) of less than 500, such as less than 400, 300, 200, 100, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 or less. The MOI may be about 18, 6, or 2. The transduction may be performed for 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 7 hours or 8 hours. The transduction may be performed for 1 hour.

[0134] An adjuvant or a transduction enhancement reagent may be added to enhance transduction efficiency. The adjuvant or transduction enhancement reagent may comprise a cationic polymer. The adjuvant or transduction enhancement reagent may be chosen from: LentiBOOSTTM (Sirion Biotech) , vectofusin-1, F108 (Poloxamer 338 or F-38) , protamine sulfate, hexadimethrine bromide (Polybrene) , PEA, Pluronic F68, Pluronic F127, Synperonic or LentiTransTM. The transduction enhancement reagent may be LentiBOOSTTM (Sirion Biotech) . The transduction enhancement reagent may be F108 (Poloxamer 338 or  F-38) .

[0135] The method may comprise transducing the population of cells (for example, T cells) with LetS-VLP, by subjecting the population of cells and LetS-VLP to a centrifugal force under conditions such that transduction efficiency is enhanced. The cells may be transduced by spinoculation. For example, transduction can be performed using centrifugation at 1000g for 60 minutes (see Example 1) .

[0136] The cells may be immune cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , hematopoietic stem cells, pluripotent stem cells, or embryonic stem cells. The cells may be immune cells. The cells may be selected from a group consisting of T cells, αβT cells, γδT cells, NK cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , hematopoietic stem cells, pluripotent stem cells, embryonic stem cells, and a combination thereof. The cells may be T cells. The cells may be NK cells. The cells may be αβ T cells. The cells may be γδ T cells. The cells may be Vδ1 T cells.

[0137] The engineered cells may be an autologous cells, syngeneic cells, allogeneic cells, or xenogeneic cells with respect to the individual receiving them. The engineered cells may be modified by changing the major histocompatibility complex (MHC) profile, by inactivating β2-microglobulin to prevent the formation of functional Class I MHC molecules, or by inactivating Class II MHC molecules. The engineered cells may be autologous cells obtained from the human subject receiving them. The engineered cells may be autologous T cells obtained from the human subject receiving them.

[0138] The engineered cells described herein may include eukaryotic cells, e.g., mammalian cells. The engineered cells may be human cells. The engineered cells may be equine, bovine, murine, ovine, canine, or feline cells. The engineered cell may be human primary T cells.

[0139] To evaluate the CAR positive rate (CAR+%) of the engineered cells, the engineered cells may be subjected to a flow cytometry analysis (e.g., following the methods described in Example 1) . The engineered cells may have a CAR positive rate of more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days, 35 days, 40 days, 45 days, 50 days, 55 days, or 60 days after transduction. For example, the engineered cells may have a CAR positive rate of more than 90%3 days after transduction. The engineered cells may have a CAR positive rate of more than 80%6 days after transduction. The engineered cells may have a CAR positive rate of more than 60%10 days after transduction. The engineered cells may have a CAR positive rate of more than 30%13 days after transduction. The engineered cells may have a CAR positive rate of more than 10%17 days after transduction.

[0140] The expansion fold (growth rate) of the engineered cells can be determined by cell counting (e.g., following the methods in Example 1) . The engineered cells may have an expansion fold that is comparable to untreated cells. Comparing to untreated cells, the cells prepared by the methods described herein may have an expansion fold that is lower by no more than 5%, no more than 10%, no more than 15%, no more than 20%, no more than 30%, no more than 40%, no more than 50%, no more than 60%, no more than 70%, no more than 80%, no more than 90%, or no more than 100%, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days, 35 days, 40 days, 45 days, 50 days, 55 days, or 60 days after transduction. Comparing to untreated cells, the engineered cells prepared by the methods described herein may have an expansion fold that is higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 10,00%, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days, 35 days, 40 days, 45 days, 50 days, 55 days, or 60 days after transduction.

[0141] Comparing to cells prepared by an electroporation-based method, the engineered cells prepared by the methods described herein may have a higher expansion fold. Comparing to cells prepared by an electroporation-based method, the engineered cells prepared by the methods described herein may have an expansion fold that is higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 10,00%, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days, 35 days, 40 days, 45 days, 50 days, 55 days, or 60 days after transduction.

[0142] The viability of the engineered cells can be determined. The engineered cells may have a viability rate that is comparable to untreated cells. Comparing to cells prepared by an electroporation-based method, the engineered cells prepared by the methods described herein may have a higher viability rate. Comparing to cells prepared by an electroporation-based method, the engineered cells prepared by the methods described herein may have a viability rate that is higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 10,00%, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days, 35 days, 40 days, 45 days, 50 days, 55 days, or 60 days after transduction. Samples and sources of cells for making engineered cells

[0143] The cells that are used in the methods described herein generally are eukaryotic cells, such as mammalian cells, and typically are human cells. The cells may be derived from the blood, bone marrow, lymph, or lymphoid organs, are cells of the immune system, such as cells of the innate or adaptive immunity, e.g., myeloid or lymphoid cells, including lymphocytes, typically T cells and / or NK cells. Other exemplary cells include stem cells, such as multipotent and pluripotent stem cells, including induced pluripotent stem cells (iPSCs) .

[0144] The cells typically are primary cells, such as those isolated directly from a subject and / or isolated from a subject and frozen. The cells may include one or more subsets of T cells or other cell types, such as whole T cell populations, CD4+ cells, CD8+ cells, and subpopulations thereof, such as those defined by function, activation state, maturity, potential for differentiation, expansion, recirculation, localization, and / or persistence capacities, antigen-specificity, type of antigen receptor, presence in a particular organ or compartment, marker or cytokine secretion profile, and / or degree of differentiation. With reference to the subject to be treated, the cells may be allogeneic and / or autologous. The cells may be pluripotent and / or multipotent, such as stem cells, such as induced pluripotent stem cells (iPSCs) . The methods may include isolating cells from the subject, preparing, processing, culturing, and / or engineering them, and re-introducing them into the same subject, before or after cryopreservation.

[0145] Among the sub-types and subpopulations of T cells and / or of CD4+ and / or of CD8+T cells are T (TN) cells, effector T cells (TEFF) , memory T cells and sub-types thereof, such as stem cell memory T (TSCM) , central memory T (TCM) , effector memory T (TEM) , or terminally differentiated effector memory T cells, tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) , immature T cells, mature T cells, helper T cells, cytotoxic T cells, mucosa-associated invariant T (MAIT) cells, naturally occurring and adaptive regulatory T (Treg) cells, helper T cells, such as TH1 cells, TH2 cells, TH3 cells, TH17 cells, TH9 cells, TH22 cells, follicular helper T cells, alpha / beta T cells (αβ T cells) , and delta / gamma T cells (γδ T cells) .

[0146] The cells may be natural killer (NK) cells. The cells may be monocytes or granulocytes, e.g., myeloid cells, macrophages, neutrophils, dendritic cells, mast cells, eosinophils, and / or basophils.

[0147] The cells may be derived from cell lines, e.g., T cell lines. The cells may be obtained from a xenogeneic source, for example, from mouse, rat, non-human primate, and pig.

[0148] The cells may be isolated from a sample, such as a biological sample, e.g., one obtained from or derived from a subject. The subject from which the cell is isolated may be one having the disease or condition or in need of a cell therapy or to which cell therapy will be administered. The subject may be a human in need of a particular therapeutic intervention, such as the adoptive cell therapy for which cells are being isolated, processed, and / or engineered.

[0149] The cells may be primary cells, e.g., primary human cells. The samples include tissue, fluid, and other samples taken directly from the subject, as well as samples resulting from one or more processing steps, such as separation, centrifugation, genetic engineering (e.g. transduction with viral vector) , washing, and / or incubation. The biological sample can be a sample obtained directly from a biological source or a sample that is processed. Biological samples include, but are not limited to, body fluids, such as blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, synovial fluid, urine and sweat, tissue and organ samples, including processed samples derived therefrom.

[0150] The sample from which the cells are derived or isolated may be blood or a blood-derived sample or is derived from an apheresis or leukapheresis product. Exemplary samples include whole blood, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) , leukocytes, bone marrow, thymus, tissue biopsy, tumor, leukemia, lymphoma, lymph node, gut associated lymphoid tissue, mucosa associated lymphoid tissue, spleen, other lymphoid tissues, liver, lung, stomach, intestine, colon, kidney, pancreas, breast, bone, prostate, cervix, testes, ovaries, tonsil, or other organ, and / or cells derived therefrom. Samples include, in the context of cell therapy, e.g., adoptive cell therapy, samples from autologous and allogeneic sources.

[0151] Cells from the circulating blood of a subject may be obtained by apheresis or leukapheresis. The samples may contain lymphocytes, including T cells, monocytes, granulocytes, B cells, other nucleated white blood cells, red blood cells, and / or platelets, and may contain cells other than red blood cells and platelets.

[0152] The blood cells collected from the subject may be washed, e.g., to remove the plasma fraction and to place the cells in an appropriate buffer or media for subsequent processing steps. The cells may be washed with phosphate buffered saline (PBS) . The wash solution may lack calcium and / or magnesium and / or many or all divalent cations. A washing step may be accomplished a semi-automated “flow-through” centrifuge. A washing step may be accomplished by tangential flow filtration (TFF) . The cells may be resuspended in a variety of biocompatible buffers after washing, such as, for example, calcium / magnesium free PBS. Components of a blood cell sample may be removed, and the cells may be resuspended in culture media.

[0153] Prior to the enriching and / or selecting of cells, the cells may be contacted with serum or plasma, such as human serum or plasma. The serum or plasma may be autologous to the subject from which the cells were obtained. The serum or plasma may be present in the sample at a concentration of at least or at least about 10% (v / v) , at least or at least about 15%(v / v) , at least or at least about 20% (v / v) , at least or at least about 25% (v / v) , at least or at least about 30% (v / v) , at least or at least about 35% (v / v) , or at least or at least about 40% (v / v) . Prior to the selection and / or transduction of cells, the cells may be contacted with an anticoagulant. The anti-coagulant may be or contains free citrate ion, e.g. anticoagulant citrate dextrose solution, Solution A (ACD-A) .

[0154] Prior to the enriching and / or selecting cells, cells from a sample may be transferred or suspended in a serum-free media. The serum free media may be a defined and / or well-defined cell culture media. The serum free media may be a controlled culture media that has been processed, e.g., filtered to remove inhibitors and / or growth factors. The serum free media may contain proteins. The serum-free media may contain serum albumin, hydrolysates, growth factors, hormones, carrier proteins, and / or attachment factors. The serum-free media may contain proteins, e.g., albumin, such as bovine serum albumin, human serum albumin, and / or recombinant albumin. The serum free media may contain a basal media, e.g., DMEM or RPMI 1640, containing amino acids, vitamins, inorganic salts, buffers, antioxidants and energy sources. The serum free media may be supplemented, such as with, but not limited to, albumin, chemically defined lipids, growth factors, insulin, cytokines, and / or antioxidants. The serum free media may be formulated to support growth, proliferation, health, homeostasis of cells of a certain cell type, such as immune cells, T cells, and / or CD4+ and CD8+ T cells.

[0155] Prior to the selection and / or enrichment of cells, the sample or the cells in the sample can be rested or held prior to further processing steps. The sample may be maintained at or held at a temperature of from or from about 2 ℃ to 8 ℃ for up to 48 hours, such as for up to 12 hours, 24 hours or 36 hours.

[0156] The methods described herein may include steps for freezing, e.g., cryopreserving, the cells, either before or after isolation, selection and / or enrichment and / or incubation for transduction and engineering. The freeze and subsequent thaw step may remove granulocytes and, to some extent, monocytes in the cell population. The cells may be suspended in a freezing solution, e.g., following a washing step to remove plasma and platelets. An exemplary freezing solution may be PBS containing 20%DMSO and 8%human serum albumin (HSA) . The freezing solution may be then diluted 1: 1 with media so that the final concentration of DMSO and HSA are 10%and 4%, respectively. The cells may be generally then frozen to -80 ℃ at a rate of 1℃ per minute and stored in the vapor phase of a liquid nitrogen storage tank.

[0157] Isolation of the cells may include one or more preparation and / or non-affinity-based cell separation steps. Cells may be washed, centrifuged, and / or incubated in the presence of one or more reagents, for example, to remove unwanted components, enrich for desired components, lyse or remove cells sensitive to particular reagents. Cells may be separated based on one or more properties, such as density, adherent properties, size, sensitivity and / or resistance to particular components.

[0158] The isolation methods may include the separation of different cell types based on the expression or presence in the cell of one or more specific molecules, such as surface markers, e.g., surface proteins, intracellular markers, or nucleic acid. The separation may be affinity-or immunoaffinity-based separation. For example, the isolation may include separation of cells and cell populations based on the cells’ expression or expression level of one or more markers, typically cell surface markers, for example, by incubation with an antibody or binding partner that specifically binds to such markers, followed generally by washing steps and separation of cells having bound the antibody or binding partner, from those cells having not bound to the antibody or binding partner.

[0159] Such separation steps can be based on positive selection, in which the cells having bound the reagents are retained for further use, and / or negative selection, in which the cells having not bound to the antibody or binding partner are retained. Both fractions may be retained for further use. Negative selection can be particularly useful where no antibody is available that specifically identifies a cell type in a heterogeneous population, such that separation is best carried out based on markers expressed by cells other than the desired population.

[0160] For example, specific subpopulations of T cells, such as cells positive or expressing high levels of one or more surface markers, e.g., CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, and / or CD45RO+ T cells, are isolated by positive or negative selection techniques. For example, CD3+, CD28+ T cells can be positively selected using anti-CD3 / anti-CD28 conjugated magnetic beads (e.g.,  M-450 CD3 / CD28 T Cell Expander) .

[0161] T cells may be separated from a PBMC sample by negative selection of markers expressed on non-T cells, such as B cells, monocytes, or other white blood cells, such as CD14. A CD4+ or CD8+ selection step may be used to separate CD4+ helper and CD8+ cytotoxic T cells. Such CD4+ and CD8+ populations can be further sorted into sub-populations by positive or negative selection for markers expressed or expressed to a relatively higher degree on one or more memory, and / or effector T cell subpopulations.

[0162] CD8+ cells may be further enriched for or depleted of central memory, effector memory, and / or central memory stem cells, such as by positive or negative selection based on surface antigens associated with the respective subpopulation. Enrichment for central memory T (TCM) cells may be carried out to increase efficacy, such as to improve long-term survival, expansion, and / or engraftment following administration, which is particularly robust in such sub-populations.

[0163] The sample or composition of cells to be separated may be incubated with small, magnetizable or magnetically responsive material, such as magnetically responsive particles or microparticles, such as paramagnetic beads (e.g., such as CytoSinct Dynabeads or MACS beads) . The magnetically responsive material, e.g., particle, generally is directly or indirectly attached to a binding partner, e.g., an antibody, that specifically binds to a molecule, e.g., surface marker, present on the cell, cells, or population of cells that it is desired to separate, e.g., that it is desired to negative or positive selection. The magnetic particle or bead may comprise a magnetically responsive material bound to a specific binding member, such as an antibody or other binding partner. The sample may be placed in a magnetic field, and those cells having magnetically responsive or magnetizable particles attached thereto will be attracted to the magnet and separated from the unlabeled cells. For positive selection, cells that are attracted to the magnet may be retained; for negative selection, cells that are not attracted (unlabeled cells) may be retained. A combination of positive and negative selection may be performed during the same selection step, where the positive and negative fractions are retained and further processed or subject to further separation steps.

[0164] The magnetically responsive particles may be coated in primary antibodies or other binding partners, secondary antibodies, lectins, enzymes, or streptavidin. The magnetic particles may be attached to cells via a coating of primary antibodies specific for one or more markers. The cells, rather than the beads, may be labeled with a primary antibody or binding partner, and then cell-type specific secondary antibody-or other binding partner (e.g., streptavidin) -coated magnetic particles, may be added. Streptavidin-coated magnetic particles may be used in conjunction with biotinylated primary or secondary antibodies.

[0165] The affinity-based selection may be performed via magnetic-activated cell sorting (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) or flow cytometry (FACS) .

[0166] Cells for transduction by the provided LetS-VLPs may include, for example, monocytes, monocyte-derived macrophages, monocyte-derived dendritic cells or resting T cells. The provided LetS-VLPs can transduce resting T cells. The input composition may comprise a plurality of cells, such as immune cells, e.g. T cells, that are non-cycling and / or quiescent and / or resting and / or in which a majority of cells, e.g. greater than 50%, 60%, 70%, 80%, 80%or more cells, in a population so transduced are non-cycling and / or quiescent and / or resting. The input composition may comprise a population of T cells in which at least 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%or more of the T cells in the population are resting T cells. The methods described herein may involve transduction of T cells in which no more than 5%, 10%, 20%, 30%, or 40%of the T cells express a T cell activation marker (e.g., HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L (CD154) , and 4-1BB (CD137) ) . Cell culture medium

[0167] The methods of the application can utilize culture media conditions comprising serum-free medium. The serum free medium may be AIM-VTM (Thermo Fischer) , OpTmizerTMCTSTM (LifeTech) , ImmunocultTMXF (Stemcell technologies) , CellGroTM (CellGenix) , TexMacsTM (Miltenyi) , StemlineTM (Sigma) , Xvivo15TM (Lonza) ,  (Irvine Scientific) , or  (RandD systems) . The serum-free medium can be supplemented with a serum substitute such as ICSR (immune cell serum replacement) from LifeTech. The level of serum substitute (for example, ICSR) can be, for example, up to 5%, for example, about 1%, 2%, 3%, 4%, or 5%. The serum-free medium can be supplemented with serum, e.g., FBS. Engineered receptor (e.g., CAR)

[0168] One aspect of the present disclosure provides cells (e.g., immune cells) that express an engineered receptor. The engineered receptor can comprise an extracellular ligand binding domain or an extracellular antigen binding domain, and optionally an intracellular signaling domain. Exemplary engineered receptors include, but are not limited to, chimeric antigen receptor (CAR) , engineered T-cell receptor (TCR) , and T-cell antigen coupler (TAC) receptor. The engineered receptor can comprise an extracellular antigen binding domain that specifically binds to an antigen (e.g., a tumor antigen) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain and / or a co-stimulatory signaling domain. The intracellular signaling domain can comprise an intracellular signaling domain of a TCR co-receptor. The engineered receptor can be encoded by a heterologous polynucleotide operably linked to a promoter (such as a constitutive promoter or an inducible promoter) .

[0169] The engineered receptor can comprise one or more specific binding domains that target at least one tumor antigen, and one or more intracellular effector domains, such as one or more primary intracellular signaling domains and / or co-stimulatory signaling domains.

[0170] The engineered receptor can be a chimeric antigen receptor (CAR) . Many chimeric antigen receptors are known in the art and can be suitable for the engineered cells described herein. CARs can also be constructed with a specificity for any cell surface marker by utilizing antigen binding fragments or antibody variable domains of, for example, antibody molecules.

[0171] CARs of the present disclosure may comprise an extracellular domain comprising at least one antigen binding domain that specifically binds at least one tumor antigen, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.

[0172] The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes an immune effector function of the CAR-containing cell, e.g., a CAR-T cell. Immune effector function or immune effector response refers to function or response, e.g., of an immune effector cell, that enhances or promotes an immune attack of a target cell. For example, an immune effector function or response can refer to a property of a T or NK cell that promotes killing or the inhibition of growth or proliferation, of a target cell. Examples of immune effector function, e.g., in a CAR-T cell, include cytolytic activity (such as antibody-dependent cellular toxicity, or ADCC) and helper activity (such as the secretion of cytokines) . The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes proliferation and / or survival of the CAR containing cell. The CAR may comprise one or more intracellular signaling domains selected from the signaling domains of CD28, CD137, CD3, CD27, CD40, ICOS, GITR, and OX40. The signaling domain of a naturally occurring molecule can comprise the entire intracellular or cytoplasmic portion, or the entire native intracellular signaling domain, of the molecule, or a fragment or derivative thereof.

[0173] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise a primary intracellular signaling domain. “Primary intracellular signaling domain” refers to cytoplasmic signaling sequence that acts in a stimulatory manner to induce immune effector functions. The primary intracellular signaling domain may contain a signaling motif known as Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif, or ITAM. The primary intracellular signaling domain may comprise a functional signaling domain of a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon RIb) , CD79a, CD79b, Fcgamma R IIa, DAP10, and DAP12. The primary intracellular signaling domain may comprise a nonfunctional or attenuated signaling domain of a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon RIb) , CD79a, CD79b, Fcgamma R IIa, DAP10, and DAP12. The nonfunctional or attenuated signaling domain can be a mutant signaling domain having a point mutation, insertion or deletion that attenuates or abolishes one or more immune effector functions, such as cytolytic activity or helper activity, including antibody-dependent cellular toxicity (ADCC) . The CAR may comprise a nonfunctional or attenuated CD3 zeta (i.e. CD3ζ or CD3z) signaling domain. The intracellular signaling domain may not comprise a primary intracellular signaling domain. An attenuated primary intracellular signaling domain may induce no more than about any of 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%or less of an immune effector function (such as cytolytic function against target cells) compared to CARs having the same construct, but with the wild-type primary intracellular signaling domain.

[0174] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise one or more (such as any of 1, 2, 3, or more) co-stimulatory signaling domains. “Co-stimulatory signaling domain” can be the intracellular portion of a co-stimulatory molecule. The term “co-stimulatory molecule” refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as T cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival. Co-stimulatory molecules are cell surface molecules other than antigen receptors or their ligands that contribute to an efficient immune response. A co-stimulatory molecule can be represented in the following protein families: TNF receptor proteins, Immunoglobulin-like proteins, cytokine receptors, integrins, signaling lymphocytic activation molecules (SLAM proteins) , and activating NK cell receptors. Co-stimulatory molecules include but are not limited to an MHC class I molecule, BTLA and a Toll ligand receptor, as well as OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a / CD18) , ICOS (CD278) , and 4-1BB (CD137) . Further examples of such co-stimulatory molecules include CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49d, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE / RANKL, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CD100 (SEMA4D) , CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG / Cbp, CD19, and a ligand that specifically binds with CD83.

[0175] The CAR can comprise a single co-stimulatory signaling domain. The CAR can comprise two or more co-stimulatory signaling domains. The intracellular signaling domain can comprise a functional primary intracellular signaling domain and one or more co-stimulatory signaling domains. The CAR may not comprise a functional primary intracellular signaling domain (such as CD3ζ) . The CAR can comprise an intracellular signaling domain consisting of or consisting essentially of one or more co-stimulatory signaling domains. The CAR can comprise an intracellular signaling domain consisting of or consisting essentially of a nonfunctional or attenuated primary intracellular signaling domain (such as a mutant CD3ζ) and one or more co-stimulatory signaling domains. Upon binding of the antigen binding domain to tumor antigen, the co-stimulatory signaling domains of the CAR can transduce signals for enhanced proliferation, survival and differentiation of the modified immune cells having the CAR (such as T cells) , and inhibit activation induced cell death. The one or more co-stimulatory signaling domains can be derived from one or more molecules selected from the group consisting of CD27, CD28, 4-1BB (i.e., CD137) , OX40, CD30, CD40, CD3, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 and ligands that specially bind to CD83.

[0176] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise a co-stimulatory signaling domain derived from CD28. The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of CD28. The intracellular signaling domain in the chimeric receptor of the present application can comprise a co-stimulatory signaling domain derived from 4-1BB (i.e., CD137) . The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζand a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain can comprise a polypeptide comprising from the N-terminus to the C-terminus: a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB and a primary intracellular signaling domain of CD3ζ.

[0177] The intracellular signaling domain of the CAR can comprise a co-stimulatory signaling domain of CD28 and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ, a co-stimulatory signaling domain of CD28, and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain can comprise a polypeptide comprising from the N-terminus to the C-terminus: a co-stimulatory signaling domain of CD28, a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB, and a primary intracellular signaling domain of CD3ζ.

[0178] The antigen binding domain of a CAR may comprise one or more (such as any one of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more) antibodies or antibody fragments, which can be selected from an scFv, a Fv, a Fab, a (Fab′) 2, a minibody, a diabody, a single domain antibody (sdAb) , or a VHH domain. The antigen binding domain of a CAR can comprise a ligand or an extracellular portion of a receptor that specifically binds to a tumor antigen. The CAR can be a monospecific, bispecific or multispecific CAR. The antigen binding domain of a CAR can specifically bind to a single tumor antigen. The antigen binding domain of a CAR can bind to two or more tumor antigens. The engineered receptor (e.g., CAR) may redirect the specificity of the engineered cells through the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) or TCR on these cells.

[0179] The antigen may be a tumor antigen selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, hTERT, IL-13Rα2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, PD-L2, and other tumor antigens with clinical significance, and combinations thereof. The antigen may be GPC3. The antigen may be DLL3. The antigen may be BCMA.

[0180] The tumor antigen can be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen can be expressed on the surface of tumor cells. Many TCRs specific for tumor antigens (including tumor-associated antigens) have been described, including, for example, NY-ESO-1 cancer-testis antigen, the p53 tumor suppressor antigens, TCRs for tumor antigens in melanoma (e.g., MARTI, gp 100) , leukemia (e.g., WT1, minor histocompatibility antigens) , and breast cancer (e.g., HER2, NY-BR1) .

[0181] The transmembrane domain of a CAR can be selected from the transmembrane domain of an alpha, beta or zeta chain of a T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , CD160, CD19, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CD100 (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, and / or NKG2C. The transmembrane domain of the CAR can be a CD4, CD3, CD8α, or CD28 transmembrane domain. The transmembrane domain of the CAR can comprise a CD8αtransmembrane domain. The transmembrane domain can be derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD1.

[0182] The extracellular domain can be connected to the transmembrane domain by a hinge domain. The hinge domain can be a hinge domain of CD8α.

[0183] The CAR can also comprise a signal peptide (SP) , such as a CD8α signal peptide.

[0184] Many CARs targeting different tumor antigens have been widely disclosed in the field, such as CD19 CARs or BCMA CARs. The extracellular antigen binding domain of CD19 CARs can be or include the CD19 binding fragment (e.g., FMC63, SJ25C1, or those disclosed in different patents such as WO 2022 / 012683, etc. ) . BCMA CARs also have been well described, related patents include but not limited to WO 2016 / 014789, WO 2016 / 014565, WO 2013 / 154760, and WO 2018 / 028647, etc. The extracellular antigen binding domain of BCMA CARs may be or include BCMA binding fragment. The BCMA binding fragment may bind to one or more epitopes on BCMA. The BCMA CARs may be bivalent CARs comprising two anti-BCMA sdAbs targeting same or different BCMA epitopes.

[0185] The engineered receptor can be a modified T-cell receptor or engineered T-cell receptor. The engineered TCR can be specific for a tumor antigen. The tumor antigen can be selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, PD-L2, and other tumor antigens with clinical significance, and combinations thereof. The tumor antigen can be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen can be expressed on the surface of tumor cells. Many TCRs specific for tumor antigens (including tumor-associated antigens) have been described, including, for example, NY-ESO-1 cancer-testis antigen, the p53 tumor suppressor antigens, TCRs for tumor antigens in melanoma (e.g., MARTI, gp 100) , leukemia (e.g., WT1, minor histocompatibility antigens) , and breast cancer (e.g., HER2, NY-BR1) . Any of the TCRs known in the art can be used. The TCR can have an enhanced affinity to the tumor antigen. Exemplary TCRs and methods for introducing the TCRs to immune cells have been described, for example, in U.S. Pat. No. 5,830,755, and Kessels et al. Immunotherapy through TCR gene transfer. Nat. Immunol. 2, 957-961 (2001) , which are incorporated herein by reference in the entirety.

[0186] The TCR receptor complex is an octomeric complex formed by variable TCR receptor α and β chains (or γ and δ chains on case of γδ T cells) with three dimeric signaling modules CD3δ / ε, CD3γ / ε and CD247 (T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain) ζ / ζ or ζ / η. Ionizable residues in the transmembrane domain of each subunit form a polar network of interactions that hold the complex together. TCR complex has the function of activating signaling cascades in T cells.

[0187] The engineered receptor can be an engineered TCR comprising one or more T-cell receptor (TCR) fusion proteins (TFPs) . Exemplary TFPs have been described, for example, in US20170166622A1, which is incorporated herein by reference in its entirety. The TFP can comprise an extracellular domain of a TCR subunit that comprises an extracellular domain or portion thereof of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications. The TFP can comprise a transmembrane domain that comprises a transmembrane domain of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications. The TFP can comprise a transmembrane domain that comprises a transmembrane domain of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a TCR zeta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications.

[0188] The TFP can comprise a TCR subunit comprising at least a portion of a TCR extracellular domain, and a TCR intracellular domain comprising a stimulatory domain from an intracellular signaling domain of CD3 epsilon; and an antigen binding domain, wherein the TCR subunit and the antigen binding domain are operatively linked, and wherein the TFP incorporates into a TCR when expressed in a T cell.

[0189] The engineered receptor can be a T-cell antigen coupler (TAC) receptor. Exemplary TAC receptors have been described, for example, in US20160368964A1, which is incorporated herein by reference. The TAC can comprise an antigen binding domain, a TCR-binding domain that specifically binds a protein associated with the TCR complex, and a T-cell receptor signaling domain. The antigen binding domain can be an antibody fragment, such as scFv or VHH, which specifically binds to a tumor antigen. The antigen binding domain can be a designed Ankyrin repeat (DARPin) polypeptide. The tumor antigen can be selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, PD-L2, and other tumor antigens with clinical significance, and combinations thereof. The tumor antigen can be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen can be expressed on the surface of tumor cells. The protein associated with the TCR complex can be CD3, such as CD3 epsilon. The TCR-binding domain can be a single chain antibody, such as scFv, or VHH. The TCR-binding domain can be derived from UCHT1. The TAC receptor can comprise a cytosolic domain and a transmembrane domain. The T-cell receptor signaling domain can comprise a cytosolic domain derived from a TCR co-receptor. Exemplary TCR co-receptors include, but are not limited to, CD4, CD8, CD28, CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 and CD154. The TAC receptor can comprise a transmembrane domain and a cytosolic domain derived from CD4. The TAC receptor can comprise a transmembrane domain and a cytosolic domain derived from CD8 (such as CD8α) .

[0190] T cell co-receptors are expressed as membrane proteins on T cells. They can provide stabilization of the TCR: peptide: MHC complex and facilitate signal transduction. The two subtypes of T cell co-receptor, CD4 and CD8, display strong specificity for particular MHC classes. The CD4 co-receptor can only stabilize TCR: MHC II complexes while the CD8 co-receptor can only stabilize the TCR: MHC I complex. The differential expression of CD4 and CD8 on different T cell types results in distinct T cell functional subpopulations. CD8+ T cells are cytotoxic T cells.

[0191] The engineered receptor (such as CAR, TCR, or TAC) can target one or more tumor antigens. Tumor antigens are proteins that are produced by tumor cells that can elicit an immune response, particularly T-cell mediated immune responses. The selection of the targeted antigen will depend on the particular type of cancer to be treated. Exemplary tumor antigens include, for example, a glioma-associated antigen, carcinoembryonic antigen (CEA) , β-human chorionic gonadotropin, alpha-fetoprotein (AFP) , lectin-reactive AFP, thyroglobulin, RAGE-1, MN-CAIX, human telomerase reverse transcriptase, RU1, RU2 (AS) , intestinal carboxyl esterase, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, prostate-specific antigen (PSA) , PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prostein, PSMA, HER2 / neu, survivin, telomerase, prostate-carcinoma tumor antigen-1 (PCTA-1) , MAGE, ELF2M, neutrophil elastase, ephrinB2, CD22, insulin growth factor (IGF) -I, IGF-II, IGF-I receptor and mesothelin.

[0192] The tumor antigen can comprise one or more antigenic cancer epitopes associated with a malignant tumor. Malignant tumors express a number of proteins that can serve as target antigens for an immune attack. These molecules include but are not limited to tissue-specific antigens such as MART-1, tyrosinase and gp100 in melanoma and prostatic acid phosphatase (PAP) and prostate-specific antigen (PSA) in prostate cancer. Other target molecules belong to the group of transformation-related molecules such as the oncogene HER2 / Neu / ErbB-2. Yet another group of target antigens are onco-fetal antigens such as carcinoembryonic antigen (CEA) . In B-cell lymphoma the tumor-specific idiotype immunoglobulin constitutes a truly tumor-specific immunoglobulin antigen that is unique to the individual tumor. B cell differentiation antigens such as CD19, CD20 and CD37 are other candidates for target antigens in B-cell lymphoma.

[0193] The tumor antigen can be a tumor-specific antigen (TSA) or a tumor-associated antigen (TAA) . A TSA is unique to tumor cells and does not occur on other cells in the body. A TAA associated antigen is not unique to a tumor cell, and instead is also expressed on a normal cell under conditions that fail to induce a state of immunologic tolerance to the antigen. The expression of the antigen on the tumor can occur under conditions that enable the immune system to respond to the antigen. TAAs can be antigens that are expressed on normal cells during fetal development, when the immune system is immature, and unable to respond or they can be antigens that are normally present at extremely low levels on normal cells, but which are expressed at much higher levels on tumor cells.

[0194] Non-limiting examples of TSA or TAA antigens include the following: Differentiation antigens such as MART-1 / MelanA, gp 100 (Pmel 17) , tyrosinase, TRP-1, TRP-2 and tumor-specific multilineage antigens such as MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; overexpressed embryonic antigens such as CEA; overexpressed oncogenes and mutated tumor-suppressor genes such as p53, Ras, HER2 / neu; unique tumor antigens resulting from chromosomal translocations; such as BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; and viral antigens, such as the Epstein Barr virus antigens EBVA and the human papillomavirus (HPV) antigens E6 and E7. Other large, protein-based antigens include TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB3, c-Met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenin, CDK4, Mum-1, p15, p16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alpha-fetoprotein, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOv18, NB / 70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, 90K\Mac-2 binding protein\cyclophilin C-associated protein, TAAL6, TAG72, TLP, and TPS. Nucleic acids encoding the engineered receptor (e.g., CAR)

[0195] The present disclosure provides nucleic acids encoding the engineered receptor (e.g., CAR, TCR) described herein. The nucleic acids described herein can be used to transfect or transduce cells to make the cells express the engineered receptor described herein.

[0196] A nucleic acid of the present disclosure can be operably linked to a transcriptional control element, e.g., a promoter, and enhancer, etc.

[0197] The promoter may be a CD8 cell-specific promoter, a CD4 cell-specific promoter, a neutrophil-specific promoter, or an NK-specific promoter. For example, a CD4 gene promoter can be used; see, e.g., Salmon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 7739; and Marodon et al. (2003) Blood 101: 3416. As another example, a CD8 gene promoter can be used. NK cell-specific expression can be achieved by use of an NcrI (p46) promoter; see, e.g., Eckelhart et al. Blood (2011) 117: 1565.

[0198] Other examples of suitable promoters include the immediate early cytomegalovirus (CMV) promoter sequence. This promoter sequence is a strong constitutive promoter sequence capable of driving high levels of expression of any nucleic acid sequence operatively linked thereto. Other constitutive promoter sequences can also be used, including, but not limited to a simian virus 40 (SV40) early promoter, a mouse mammary tumor virus (MMTV) or human immunodeficiency virus (HIV) long terminal repeat (LTR) promoter, a MoMuLV promoter, an avian leukemia virus promoter, an Epstein-Barr virus immediate early promoter, a Rous sarcoma virus promoter, the EF-1 alpha promoter, as well as human gene promoters such as, but not limited to, an actin promoter, a myosin promoter, a hemoglobin promoter, and a creatine kinase promoter. Further, the disclosure should not be limited to the use of constitutive promoters. Inducible promoters are also contemplated as part of the disclosure. The use of an inducible promoter provides a molecular switch capable of turning on expression of the nucleic acid sequence which it is operatively linked when such expression is desired, or turning off the expression when expression is not desired. Examples of inducible promoters include, but are not limited to a metallothionine promoter, a glucocorticoid promoter, a progesterone promoter, and a tetracycline promoter.

[0199] The nucleic acid of the present disclosure may be provided for the production of a CAR or a TCR described herein (e.g., in a mammalian cell) . The nucleic acid of the present disclosure may also provide for amplification of the nucleic acid.

[0200] A vector, for example an expression vector (e.g., a lentiviral vector) can be used to introduce the nucleic acid described herein into an immune cell (e.g., a T cell) or precursor thereof. The vector (e.g., a lentiviral vector) of the present disclosure may comprise one or more nucleic acids encoding for the engineered receptor described herein. The vector (e.g., lentiviral vector) may comprise additional elements that will aid in the functional expression of the CAR described herein. The expression vector may comprise a mammalian promoter. The vector may comprise an elongation-factor-1-alpha promoter (EF-1α promoter) . The use of an EF-1α promoter may increase the efficiency in expression of downstream transgenes (e.g., a CAR encoding nucleic acid) . Physiologic promoters (e.g., an EF-1α promoter) may be less likely to induce integration mediated genotoxicity and may abrogate the ability of the retroviral vector to transform stem cells. Other physiological promoters suitable for use in a vector (e.g., lentiviral vector) can be incorporated into a vector of the present disclosure. The vector (e.g., lentiviral vector) may comprise a non-requisite cis acting sequence that can improve titers and gene expression.

[0201] The nucleic acid can encode a naked CAR. The nucleic acid can comprise from the 5’ end to the 3’ end, a CD8α signal peptide, an extracellular antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a CD137 co-stimulatory signaling domain, a CD3ζ primary intracellular signaling domain. Methods of treatment

[0202] The LetS-VLPs, methods for making engineered cells described herein, and the resulting engineered cells described herein can be used in a variety of experimental, therapeutic and commercial applications.

[0203] In one aspect, the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the LetS-VLPs described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0204] In one aspect, the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the engineered cells made by the methods described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0205] In one aspect, the disclosure provides a method of treating a disease or disorder in a subject (e.g., human subject) , the method comprising administering to the subject, an effective amount of the LetS-VLPs described herein, the engineered cell described herein, or the pharmaceutical composition described herein. The disease or disorder may be cancer, an autoimmune disease, a tumor, or an infection.

[0206] The disease or disorder may be solid tumor. “Solid tumor” refers to an abnormal mass of tissue that usually does not contain cysts or liquid areas. Solid tumors may be benign (not cancer) , or malignant (cancer) . Different types of solid tumors are named for the type of cells that form them. Examples of solid tumors are sarcomas, carcinomas, and lymphomas. Leukemias (cancers of the blood) generally do not form solid tumors.

[0207] In one aspect, the disclosure provides a method of modulating an immune response comprising administering an effective amount of the LetS-VLPs described herein or the engineered cells described herein to a subject in need thereof.

[0208] The term “effective amount” as used herein means an amount effective, at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired results.

[0209] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating a disease or disorder by administering an effective amount of the LetS-VLPs described herein or the engineered cells described herein to a subject in need thereof. The disease or disorder may be infectious disease, autoimmune disease, or tumor. The cancer may be hematological cancer or solid tumor. Examples of cancer that can be treated include, but are not limited to, acute myeloid leukemia (AML) , B-cell acute lymphoid leukemia (BALL) , T-cell acute lymphoid leukemia (TALL) , acute lymphoid leukemia (ALL) , chronic myelogenous leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , multiple myeloma (MM) , myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative neoplasms (MPNs) , chronic myeloid leukemia (CML) , and blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) , breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, melanoma, oral cancer, mesothelioma, ovarian cancer, colorectal cancer, gastric cancer, cervical cancer, brain cancer, skin cancer, lymphoma, epithelial neoplasms, soft tissue sarcoma, esophageal cancers, or CNS tumors.

[0210] The disclosure further includes the use of the LetS-VLPs described herein or the engineered cells described herein in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition to modulate an immune response, to treat an infection or to treat cancer as described hereinabove.

[0211] The LetS-VLPs described herein and / or the engineered cells can also be used in experimental models, for example, to further study and elucidate the function of the cells.

[0212] The LetS-VLPs described herein and / or the engineered cells described herein can be administered to a subject in a single, unified form, such as an intravenous injection, or in multiple forms, for example, as multiple intravenous infusions or injections, or subcutaneous injections. The engineered cells may expand within a subject’s body, in vivo, after administration to a subject. The engineered cells can be frozen to provide cells for multiple treatments with the same cell preparation. The LetS-VLPs described herein, the engineered cells of the disclosure, and pharmaceutical compositions comprising the same, can be packaged as a kit. A kit can include instructions (e.g., written instructions) on the use of the LetS-VLPs described herein, the engineered cells and compositions comprising the same.

[0213] A method of treatment can comprise administering to a subject a therapeutically effective amount of the LetS-VLPs and / or the engineered cells. The therapeutically effective amount of the engineered cells may be administered for at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, or 1 year. The therapeutically effective amount of the LetS-VLPs and / or the engineered cells may be administered for at least one week. The therapeutically effective amount of the LetS-VLPs and / or the engineered cells may be administered for at least two weeks.

[0214] The LetS-VLPs and / or the engineered cells described herein can be administered before, during, or after the occurrence of a disease or condition, and the timing of administering the engineered cells can vary. For example, the LetS-VLPs and / or the engineered cells can be used as a prophylactic and can be administered continuously to subjects with a propensity to conditions or diseases in order to lessen a likelihood of the occurrence of the disease or condition. The LetS-VLPs and / or the engineered cells can be administered to a subject during or as soon as possible after the onset of the symptoms. The administration of the LetS-VLPs and / or the engineered cells can be initiated immediately within the onset of symptoms, within the first 3 hours of the onset of the symptoms, within the first 6 hours of the onset of the symptoms, within the first 24 hours of the onset of the symptoms, within 48 hours of the onset of the symptoms, or within any period of time from the onset of symptoms. The initial administration can be via any route practical (e.g., intravenous infusions or injections) , such as by any route described herein using any formulation described herein. The administration of the LetS-VLPs and / or the engineered cells of the disclosure may be an intravenous administration. One or multiple dosages of the LetS-VLPs and / or the engineered cells can be administered as soon as is practicable after the onset of a cancer or an infectious disease, and for a length of time necessary for the treatment of the disease, such as, for example, from about 24 hours to about 48 hours, from about 48 hours to about 1 week, from about 1 week to about 2 weeks, from about 2 weeks to about 1 month, from about 1 month to about 3 months. For the treatment of cancer, one or multiple dosages of the LetS-VLPs and / or the engineered cells can be administered years after onset of the cancer and before or after other treatments. The LetS-VLPs and / or the engineered cells can be administered for at least about 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, at least 48 hours, at least 72 hours, at least 96 hours, at least 1 week, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, at least 1 month, at least 2 months, at least 3 months, at least 4 months, at least 5 months, at least 6 months, at least 7 months, at least 8 months, at least 9 months, at least 10 months, at least 11 months, at least 12 months, at least 1 year, at least 2 years at least 3 years, at least 4 years, or at least 5 years. The length of treatment can vary for each subject.

[0215] Methods for administration of engineered cells for adoptive cell therapy are known and can be used in connection with the provided methods and compositions. For example, adoptive T cell therapy methods are described, e.g., in US Patent Application Publication No. 2003 / 0170238 to Gruenberg et al; US Patent No. 4,690,915 to Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10) : 577-85) . See, e.g., Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10) : 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1) : 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4) : e61338. The cell therapy, e.g., adoptive T cell therapy can be carried out by autologous transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from the subject who is to receive the cell therapy, or from a sample derived from such a subject. Thus, the cells may be derived from a subject, e.g., patient, in need of a treatment and the cells, following isolation and processing are administered to the same subject.

[0216] The subject (e.g., human subject) may have been treated with a therapeutic agent targeting the disease or condition, e.g., the tumor, prior to administration of the LetS-VLPs described herein and / or the engineered cells described herein. The subject may be refractory or non-responsive to the other therapeutic agent. The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogenic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0217] The subject may be responsive to the other therapeutic agent, and treatment with the therapeutic agent reduces disease burden. The subject may be initially responsive to the therapeutic agent but exhibits a relapse of the disease or condition over time. The subject may have not relapsed. The subject may be determined to be at risk for relapse, such as at a high risk of relapse, and thus the cells are administered prophylactically, e.g., to reduce the likelihood of or prevent relapse. The subject may has not received prior treatment with another therapeutic agent.

[0218] The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogenic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0219] The LetS-VLPs and / or the engineered cells described herein can be administered to an animal, such as a mammal, even more a human, to treat a cancer. In addition, the LetS-VLPs and / or the engineered cells can be used for the treatment of any condition related to a cancer, especially a cell-mediated immune response against a tumor cell (s) , where it is desirable to treat or alleviate the disease.

[0220] The LetS-VLPs and / or the engineered cells (e.g., immune cells, T cells, or NK cells) described herein can be included in a composition for immunotherapy. The composition can include a pharmaceutical composition and further include a pharmaceutically acceptable carrier. A therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition comprising the LetS-VLPs and / or the engineered cells can be administered.

[0221] The LetS-VLPs and / or the engineered cells disclosed herein can be formulated in unit dosage forms suitable for single administration of precise dosages. In unit dosage form, the formulation is divided into unit doses containing appropriate quantities of one or more compounds. The unit dosage can be in the form of a package containing discrete quantities of the formulation. Aqueous suspension compositions can be packaged in single-dose non-reclosable containers. Multiple-dose reclosable containers can be used, for example, in combination with a preservative or without a preservative. The pharmaceutical composition may not comprise a preservative. Formulations for parenteral injection can be presented in unit dosage form, for example, in ampoules, or in multi-dose containers with a preservative. EXAMPLES

[0222] The disclosure is further described in the following examples, which do not limit the scope of the disclosure described in the claims.

[0223] Materials used in the below examples are listed in the below table: Table 2: Materials used Table 3: Equipment used Example 1. Making engineered cells with CAR1 (Batches 1-2)LetS-VLP Batch 1 (CAR1) :

[0224] For Batch 1, Lenti-X 293T cells were seeded in a T75 flask. 24 hours after inoculation, CAR1 (1, 461 bp) delivery plasmid (GOI, SEQ ID NO: 14) and the packaging plasmids (pMD2. G, pMDLg / pRRE, pRSV-Rev) were used to transfect the cells (with PEIpro-HQ) . After 48 hours, the supernatant culture medium containing VLP was harvested, ultracentrifuged at 37,000 rpm for 35 minutes, and concentrated 200 times to obtain LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) .LetS-VLP Batch 2 (CAR1) :

[0225] For Batch 2, Lenti-X 293T cells were inoculated into a 1 L shake flask. CAR1 delivery plasmid (GOI) and the packaging plasmids (pMD2. G, pMDLg / pRRE, pRSV-Rev) were used to transfect the cells (with PEIpro-HQ) . After 48 hours, the supernatant medium containing VLP was harvested, ultracentrifuged at 37,000 rpm for 35 minutes, and concentrated 200 times to obtain LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) .

[0226] As shown in the below table, the GOI and packaging vectors were introduced to the packaging cells at certain weight ratios. The weight ratio among the packaging vectors (e.g., pMD2. G, pMDLg / pRRE, pRSV-Rev) was about 1: 1: 1. The weight ratio between the GOI and each of the packaging vectors was 16: 1. Table 4: Weight and molar ratios between GOI and packaging vectors Activation and Transduction:

[0227] PBMC cells were resuspended in an activation medium (AIM-V + FBS + IL-2) . An appropriate amount of EnceedTM T cell activation reagent was added. The cells were incubated for 3 days at 37 ℃ and 5%CO2. Cells in the logarithmic growth phase were collected into a centrifuge tube and centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatant was discarded, the cells were resuspended in transduction medium (AIM-V + FBS) . The cells were sampled and counted, and the density and viability of viable cells were recorded. The cell density was adjusted to 1×106 cells / mL. The cells were mixed and inoculated into a 96-well flat-bottom plate. 6.6 μL LetS-VLP suspension was added and mixed well. The cells were centrifuged at 1,000g for incubation. After centrifugation, the cells were placed in a 37 ℃, 5%CO2 incubator. During the culture process, as the number of cells increases, passage is performed, that is, based on the cell counting results, some cells were transferred to other wells, and additional culture medium was added.

[0228] Flow cytometric detection of CAR1 protein expression was performed on days 3, 6, 10, 13, and 17 after transduction by LetS-VLP. The cells were sampled and counted, transfered to a 96-well V-bottom plate, and centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatant was discarded. FC Buffer (HBSS + BSA) was used to resuspend the cells. Antibodies were added, and the cells were incubated in a refrigerator at 2-8 ℃ in the dark for 15-20 minutes. The cells were centrifuged at 400 g for 5 minutes and the supernatant was discarded. The cells were washed twice with FC Buffer and centrifuged to remove supernatant. The cells were resuspended in FC Buffer and subjected to flow cytometry analysis to detect the proportion and expression intensity of CAR1+ cells. Flowjo10.8.1 was used for data processing and analysis. The titer test was performed using a method similar to the lentivirus titer test-the LetS-VLP suspension was serially diluted and the transduction efficiency of 6 samples after gradient dilution was tested. Titers were calculated based on the below formula: Titer (TU / mL) = Number of cells plated × Positive rate (%)  / Virus dosage (mL) .

[0229] As shown by the flow cytometry testing, the titers of LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) and LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) were 4.68e+08 TU / mL and 9.90e+08 TU / mL, respectively. After calculation according to the added volume, the MOIs of LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) group and LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) group were 61.7 and 130.7 respectively. As shown in FIG. 1A, on the 3rd day after LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) transduction, T cells had significant CAR1 expression. The CAR+%of the LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) group was 98.2%, and the CAR+%of LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) group was 85.7%. On the 6th day after transduction, the CAR+%of the LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) group was 93.5%, and the CAR+%of the LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) group was 88.7%. On the 10th day after transduction, the CAR+%of the LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) group was 30.1%, and the CAR+%of the LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) group was 71.9%. On day 13 after transduction, the CAR+%of the LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) group was 27.0%, and the CAR+%of the LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) group was 41.8%. On day 17 after transduction, the CAR+%of the LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) group was 3.1%, and the CAR+%of the LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) group was 6.2%.

[0230] As shown in FIG. 1B, on the 3rd day after transduction of LetS-VLP-CAR1, the cell proliferation folds of the UnT cell group, LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) group and LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) group were 2.9, 4.2 and 4.2, respectively. On the 6th day after transduction, the cell proliferation folds of the UnT cell group, LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) group, and LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) group were 9.3, 33.0, and 14.7, respectively. On the 10th day after transduction, the cell proliferation folds of the UnT cell group, LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) group and LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) group were 63.7, 206.6 and 50.5 respectively. On the 13th day after transduction, the cell proliferation folds of the UnT cell group, LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) group, and LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) group were 105.1, 312.0, and 78.7, respectively.

[0231] The results suggest LetS-VLP-CAR1 is suitable for adherent and suspension packaging systems. With the same amounts of GOI and packaging vectors, suspension packing systems can produce a higher titer. The produced LetS-VLP can effectively deliver CAR1 mRNA and express CAR1 it in T cells. Throughout the entire testing cycle, LetS-VLP did not weaken the proliferation ability of T cells and did not show obvious cytotoxicity. Example 2. Making engineered cells with CAR2 (Batches 1-2)LetS-VLP Batch 1 (CAR2) :

[0232] For LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) , Lenti-X 293T cells were seeded in T75 flask for an adherent cell culture. 24 hours after inoculation, CAR2 (2, 400 bp) delivery plasmid and the remaining packaging plasmids were used to transfect the cells (with PEIpro-HQ) . After 48 hours, the supernatant culture medium containing VLP was harvested, ultracentrifuged at 37,000 rpm for 35 minutes, and concentrated 200 times to obtain LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) . The weight ratio between the GOI and each of the packaging vectors was 16: 1.

[0233] LetS-VLP Batch 2 (CAR2) :

[0234] For LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) , 293T cells were inoculated into 1L shake flask for a suspension cell culture. CAR2 delivery plasmid and the remaining packaging plasmids were used to transfect the cells (with PEIpro-HQ) . After 48 hours, the supernatant medium containing VLP was harvested, ultracentrifuged at 37,000 rpm for 35 minutes, and concentrated 200 times to obtain LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) . The weight ratio between the GOI and each of the packaging vectors was 16: 1.

[0235] Activation and Transduction:

[0236] PBMC cells were resuspended in activation medium (AIM-V + FBS + IL-2) . An appropriate amount of EnceedTM T cell activation reagent was added. The cells were incubated for 3 days at 37 ℃ and 5%CO2. Cells in the logarithmic growth phase were collected into a centrifuge tube and centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatant was discarded. The cells were resuspended in transduction medium (AIM-V + FBS) . The cells were sampled and counted, and the density and viability of viable cells were recorded. The cells were mixed and inoculated into a 96-well flat-bottom plate. LetS-VLP suspension was added at different volumes and mixed well. The cells were placed in a centrifuge and centrifuged at 1,000 g for incubation. After centrifugation, the cells were placed in a 37 ℃, 5%CO2 incubator. During the culture process, as the number of cells increases, passage was performed-based on the cell counting results, some cells were transferred to other wells, and additional culture medium was added.

[0237] Flow cytometric detection of CAR2 protein expression was performed on days 3, 6, 10, 13, 17, and 20 after cell transduction. The cells were counted and transfered to a 96-well V-bottom plate, centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatant was discarded. FC Buffer (HBSS + BSA) was used to resuspend the cells. Antibodies were added. The cells were incubated in a refrigerator at 2-8 ℃ in the dark for 15-20 minutes, centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatent was discarded. The cells were washed twice with FC Buffer and centrifuged to remove supernatant. The cells were resuspended in FC Buffer and subjected to flow cytometry analysis to detect the proportion and expression intensity of CAR2+ cells. Flowjo10.8.1 was used for data processing and analysis. The titer test was performed using a method similar to the lentivirus titer test-the LetS-VLP suspension was serially diluted and the transduction efficiency of 6 samples after gradient dilution was tested. Titers were calculated based on the below formula: Titer (TU / mL) = Number of cells plated × Positive rate (%)  / Virus dosage (mL) .

[0238] Flow cytometry testing indicates the titer of LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) was 1.35e+08 TU / mL. After calculation according to the added volume, the MOIs of LetS-VLP-CAR1 (Batch 1) groups were 17.8, 5.9, and 2.0, respectively. As shown in FIG. 2A, on the 3rd day after transduction of LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) , T cells had significant CAR2 expression. The CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) groups were 98.9%, 94.9%and 79.4%. On day 6 after transduction, the CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) groups were 80.6%, 71.0%and 42.8%respectively. On day 10 after transduction, the CAR+%LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) groups were 4.5%, 10.9%and 15.1%respectively. On day 13 after transduction, the CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) groups were 3.9%, 2.6%and 1.4%respectively.

[0239] As shown in FIG. 2B, on the 3rd day after transduction of LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) , the cell proliferation folds of the UnT cell group and LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) groups were 3.0, 5.6, 4.6 and 3.5, respectively. On the 6th day after transduction, the cell proliferation folds of the UnT cell group and LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) groups were 7.2, 38.2, 17.3 and 10.2, respectively. On the 10th day after transduction, the cell proliferation folds of the UnT cell group and LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) groups were 55.8, 209.6, 94.9 and 33.6, respectively. On the 13th day after transduction, the cell proliferation folds of the UnT cell group and LetS-VLP-CAR2 (Batch 1) groups were 173.0, 236.1, 136.0 and 73.2, respectively.

[0240] Flow cytometry testing indicates the titer of LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) was 1.54e+09 TU / mL. After calculation according to the added volume, the MOIs of LetS-VLP-CAR1 (Batch 2) groups were 203.4, 67.8 and 22.6, respectively. As shown in FIG. 3A, on the third day after transduction of LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) , the cells had significant CAR2 expression. The CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) groups were 99.2%, 98.6%and 96.5%, respectively. On day 6 after transduction, the CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) groups were 97.0%, 92.4%and 80.0%, respectively. On day 10 after transduction, the CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) groups were 78.7%, 74.1%and 57.5%, respectively. On day 13 after transduction, the CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) groups were 37.4%, 27.5%and 23.9%, respectively. On day 17 after transduction, the CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) groups were 12.3%, 13.3%and 8.7%respectively. On day 20 after transduction, the CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) groups were 6.8%, 6.7%and 2.9%, respectively.

[0241] As shown in FIG. 3B, on the 3rd day after transduction of LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) , the cell proliferation folds of the UnT cell group and LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) groups were 3.0, 4.7, 3.5 and 3.6, respectively. On the 6th day after transduction, the cell proliferation folds of the UnT cell group and LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) groups were 7.2, 22.0, 10.7 and 9.0, respectively. On the 10th day after transduction, the cell proliferation folds of the UnT cell group and LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) groups were 55.8, 100.4, 52.8 and 22.5, respectively. On the 13th day after transduction, the cell proliferation folds of the UnT cell group and LetS-VLP-CAR2 (Batch 2) groups were 173.0, 193.0, 52.5 and 40.2, respectively.

[0242] The data suggest that when the target sequence is longer, LetS-VLP can still effectively package and deliver CAR2 mRNA, and stably express CAR2 in T cells. During this process, the transduction efficiencies of respective batches of LetS-VLP showed a certain dose-dependence. In addition, high-dose LetS-VLP also did not weaken the proliferation ability of T cells and did not show significant cytotoxicity. Example 3. Making engineered cells with CAR2 (Batches 3-5) and determination of RNA and DNA copy numbersLetS-VLP Batches 3-5 (CAR2) :

[0243] Lenti-X 293T cells were seeded in a T75 flask for an adherent cell culture. 24 hours after inoculation, CAR2 delivery plasmid and packaging plasmids were used to transfect the cells with PEIpro-HQ. After 48 hours, the supernatant culture medium containing VLP was harvested, ultracentrifuged at 37,000 rpm for 35 minutes, and concentrated 200 times to obtain LetS-VLP-CAR2 (Batch 3) , LetS-VLP-CAR2 (Batch 4) and LetS-VLP-CAR2 (Batch 5) . The weight ratio between the GOI and each of the packaging vectors was 16: 1.

[0244] Determination of mRNA copy number:

[0245] The Purlink Viral RNA / DNA Mini Kit was used to extract the RNA in LetS-VLP-CAR2 according to the standard procedure. After the RNA concentration was measured with Nanodrop One., the obtained sample was divided into two parts. One part was reverse transcribed using the 1st Strand cDNA Synthesis Kit and the Oligo dT primer to complete cDNA synthesis. The other part was left as is. The two samples were separately diluted to an appropriate concentration and quantified by ddPCR with target sequence-specific primers. In order to remove the interference caused by DNA residues, the mRNA copy number was determined using the below formula: mRNA copy number = the sample copy number after reverse transcription -the copy number of the non-reverse transcribed sample.Determination of DNA copy number:

[0246] the sample to be tested was treated with DNase at 37℃ for 30 minutes to digest the residual DNA outside LetS-VLP-CAR2.0.5 M EDTA was added, mixed by a vortex mixer, and incubated at 65 ℃ for 10 minutes. The obtained sample was diluted to an appropriate concentration, and ddPCR detection was performed using target sequence-specific primers. Table 5: RNA and DNA copies in LetS-VLP (Batches 3-5)

[0247] As shown in the above table, the titers of the three batches of LetS-VLP-CAR2 were 1.12E+08 TU / mL, 1.09E+08 TU / mL, and 1.07E+08 TU / mL, respectively. Based on ddPCR detection, each titer unit (TU) contained 1, 176.3±395.7 copies of RNA (95%confidence interval, 193.2 to 2, 159.0) , and 9.4±2.2 copies of DNA (95%confidence interval, 4.0 to 14.7) . It can be seen that the sequences packaged and delivered in LetS-VLP are basically RNA, and the DNA copy number itself is extremely low. Example 4. Making engineered cells with CAR2 (Batches 6-7) and determination of RNA copy numberLetS-VLP Batch 6 (CAR2) :

[0248] Lenti-X 293T cells were seeded in a T75 flask for an adherent cell culture. 24 hours after inoculation, CAR2 delivery plasmid and packaging plasmids were used to transfect the cells with PEIpro-HQ. After 48 hours, the supernatant culture medium containing VLP was harvested, ultracentrifuged at 37,000 rpm for 35 minutes, and concentrated 200 times to obtain LetS-VLP-CAR2 (Batch 6) . The weight ratio between the GOI and each of the packaging vectors was 16: 1.

[0249] LetS-VLP Batch 7 (CAR2) :

[0250] 293T cells were inoculated into 1 L shake flask for a suspension cell culture. CAR2 delivery plasmid and packaging plasmids were used to transfect the cells with PEIpro-HQ. After 48 hours, the supernatant medium containing VLP was harvested, ultracentrifuged at 37,000 rpm for 35 minutes, and concentrated 200 times to obtain LetS-VLP-CAR2 (Batch 7) . The weight ratio between the GOI and each of the packaging vectors was 16: 1.

[0251] Activation and Transduction:

[0252] PBMC cells were resuspended in activation medium (AIM-V+FBS+IL-2) . An appropriate amount of EnceedTM T cell activation reagent was added. The cells were incubated for 3 days at 37 ℃ and 5%CO2. Cells in the logarithmic growth phase were collected into a centrifuge tube, centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatant was discarded, and the cells were resuspended in transduction medium (AIM-V+FBS) . After sampling, the cells were counted, and the density and viability of viable cells were recorded. The cells were mixed and inoculated into a 96-well flat-bottom plate. 6.6 μL LetS-VLP suspension was added, mixed well, and centrifuged at 1,000 g for incubation. After centrifugation, the cells were placed in a 37 ℃, 5%CO2 incubator. During the culture process, as the number of cells increases, passage is performed, that is, based on the cell counting results, some cells were transferred to other wells, and additional culture medium was added.

[0253] Flow cytometric detection of CAR2 protein expression was performed on days 3, 6, 10, 13, and 17 after cell transduction. The cells were sampled for counting, transferred to a 96-well V-bottom plate, and centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatant was discarded. FC Buffer (HBSS + BSA) was added to resuspend the cells. Antibodies were added. The cells were incubated in a refrigerator at 2-8 ℃ in the dark for 15-20 minutes and centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatant was discarded. The cells were washed twice with FC Buffer and centrifuged to remove supernatant. The cells were resuspended inFC Buffer and subjected to flow cytometry analysis to detect the proportion and expression intensity of CAR2+ cells. Flowjo10.8.1 was used for data processing and analysis.

[0254] T cells were collected on day 20 after transduction. A DNA extraction kit was used to extract DNA from cells. sample was taken to measure the DNA concentration with Nanodrop One and diluted to an appropriate concentration. Then ddPCR detection was performed using target sequence-specific primers. Table 6: RNA copies in LetS-VLP (Batches 6-7)

[0255] The flow cytometry results showed that the titers of LetS-VLP-CAR2 (Batch 6) and LetS-VLP-CAR2 (Batch 7) were 1.45E+08 TU / mL and 1.71E+09 TU / mL, respectively. After calculation according to the added volume, the MOIs of LetS-VLP-CAR2 (Batch 6) group and LetS-VLP-CAR2 (Batch 7) group were 19.2 and 225.3 respectively. As shown in FIG. 4, on the 3rd day after transduction of LetS-VLP-CAR2, T cells showed significant CAR2 expression, and the CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 6) and LetS-VLP-CAR2 (Batch 7) groups 98.0%and 98.0%respectively. On day 6 after transduction, the CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 6) group and LetS-VLP-CAR2 (Batch 7) group were 60.5%and 93.6%respectively. On day 10 after transduction, the CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 6) and LetS-VLP-CAR2 (Batch 7) groups were 6.9%and 24.8%, respectively. On day 13 after transduction, the CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 6) and LetS-VLP-CAR2 (Batch 7) groups were 3.2%and 26.2%, respectively. On day 17 after transduction, the CAR+%of LetS-VLP-CAR2 (Batch 7) group was 6.0%.

[0256] As shown in the above table, in the T cells harvested on Day 20, the ddPCR results showed that no residual DNA copy number was detected. ALB was used as an internal control gene.

[0257] In summary, the use of suspension system packaging can greatly improve the titer performance of LetS-VLP. The extremely low copy number DNA contained in LetS-VLP under the two packaging methods does not exist in T cells for a long time, nor does random integration time occur, and the safety performance is good. OTHER EMBODIMENTS

[0258] It is to be understood that while the disclosure has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the disclosure, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

A virus-like particle (VLP) comprising(a) a nucleic acid comprising a cargo sequence,(b) a viral structural protein, and(c) a viral envelope protein,wherein the VLP does not comprise MS2 and MS2 coat protein.The VLP of claim 1, wherein the VLP does not comprise (1) PP7 coat protein, PP7 RNA, (2) P22N, BoxB RNA, (3) λN, λ BoxB RNA, (4) tDeg, Pepper RNA, (5) Pumilio homology domain ( “PUM-HD” ) , PUM-HD response elements, (6) catalytically deactivated Cas13 ( “dCas13” ) , (7) COM RNA, COM protein, (8) Arc1, (9) Asprv1, (10) Paraneoplastic Ma antigen ( “PNMA” ) protein, (11) coiled-coil domain containing 8 ( “CCDC8” ) , (12) PEG10, or (13) retrotransposon gag like (RTL) protein.The VLP of claim 2, wherein the PNMA protein is selected from the group consisting of PNMA1, PNMA2, PNMA3, PNMA4 (MOAP1) , PNMA5, PNMA6A, PNMA6E, PNMA6F, PNMA7A (ZCCHC12) , PNMA7B (ZCCHC18) , PNMA8A, PNMA8B, and PNMA8C; wherein the RTL protein is selected from the group consisting of RTL1, RTL3, RTL4, RTL5, RTL6, RTL7, RTL8, RTL9, and RTL10.The VLP of any one of claims 1-3, wherein the VLP does not comprise an exogenous aptamer sequence, an exogenous aptamer binding protein (ABP) , mammalian retrovirus-like protein and / or any capture moiety for packaging a cargo, optionally, the aptamer is an RNA aptamer.The VLP of any one of claims 1-4, wherein the VLP does not comprise a retroviral long terminal repeat (LTR) .The VLP of any one of claims 1-4, wherein the VLP does not comprise an RNA packaging signal sequence (e.g., psi) .The VLP of any one of claims 1-4, wherein the VLP does not comprise a central polypurine tract (cPPT)  / central termination sequence (CTS) .The VLP of any one of claims 1-4, wherein the VLP does not comprise reverse transcription and integration-related sequences including 5’ LTR, 3’ LTR, an RNA packaging signal sequence (psi) , partial Gag, partial Env, a primer binding site (pbs) and a central polypurine tract (cPPT)  / central termination sequence (CTS) .The VLP of any one of claims 1-8, wherein the cargo sequence does not integrate into the genome of the target cell when the nucleic acid is introduced into a target cell.The VLP of any one of claims 1-9, wherein the viral structural protein is selected from gag, matrix protein (MA) , and capsid proteins (CA) , NC, p4, p7, p9, p12, p17, p24, p30, SP1, and SP2.The VLP of any one of claims 1-10, wherein the viral structural protein comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 6.The VLP of any one of claims 1-11, wherein the viral envelope protein is selected from vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) , cocal virus glycoprotein (COV-G) protein, RD114-gp70 (SU+TM) , GALV-gp70 (SU+TM) , BaEV-gp70 (SU+TM) , measles, Nipah, MSCV, Cocal, MuLV-gp70 (SU+TM) , Ampho-gp70 (SU+TM) , 10A1-gp70 (SU+TM) , Eco-gp70 (SU+TM) , GP64, LCMV-G (GP1&GP2) , MV-G, HCV-G, CNV-G, PRV-G, Gp160 (gp120 / gp41) , and Syncytin-A (SYNA) .The VLP of any one of claims 1-12, wherein the viral envelope protein comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 2.The VLP of any one of claims 1-13, wherein the viral envelope protein comprises one or more mutations and has reduced binding to low-density lipoprotein receptor (LDL-R) and optionally retains fusogenic activity compared to a reference viral glycoprotein.The VLP of any one of claims 1-14, wherein the VLP further comprises an envelope surface-bound targeting molecule that specifically recognizes a cell surface protein on a target cell (e.g., an antibody fragment, a receptor, a ligand to a target cell marker) .The VLP of claim 15, wherein the target cell is an immune cell.The VLP of claim 16, wherein the immune cell is selected from the group consisting of a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a T cell, a natural killer (NK) cell, or a combination thereof.The VLP of claim 16 or claim 17, wherein the immune cell is a T cell.The VLP of any one of claims 15-18, wherein the cell surface protein is selected from the group consisting of CD3, CD5, CD2, CD3, CD4, CD8 and CD7.The VLP of any one of claims 15-19, wherein the envelope surface-bound targeting molecule comprises an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes the cell surface protein on the target cell, and optionally wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of a full-length antibody, a Fab, a Fab’ , a (Fab’ ) 2, an Fv, an scFv, and an sdAb.The VLP of any one of claims 1-20, wherein the cargo sequence encodes an engineered receptor (e.g., CAR, TCR, TAC) , a vaccine, or an enzyme, wherein the CAR comprises an extracellular binding domain specifically recognizing a cancer-associated antigen, a cancer-specific antigen, or an autoimmune disease-associated antigen.The VLP of any one of claims 1-21, wherein the nucleic acid is an RNA, optionally the RNA comprises a short hairpin RNA (shRNA) , a small interfering ribonucleic acid (siRNA) , a single guide ribonucleic acid (sgRNA) , a long non-coding RNA (lncRNA) , a micro-ribonucleic acid (miRNA) , a primary micro-ribonucleic acid (pri-miRNA) , a messenger ribonucleic acid (mRNA) , a CRISPR-RNA (crRNA) , a single guide ribonucleic acid (sgRNA) , a trans-activating CRISPR ribonucleic acid (tracrRNA) , a single stranded ribonucleic acid (ssRNA) , a double stranded ribonucleic acid (dsRNA) , or a combination thereof.The VLP of any one of claims 1-22, wherein the nucleic acid is single stranded or double stranded.The VLP of any one of claims 1-23, where the VLP further comprises a regulatory protein (e.g., Rev) .The VLP of claim 24, wherein the regulatory protein is selected from Rev, Tat, Nef, Vpr, Vif, and Vpu.The VLP of claim 24 or claim 25, where the regulatory protein comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 10.The VLP of any one of claims 24 -26, wherein the regulatory protein is a Rev protein.The VLP of any one of claims 1-27, wherein the viral structural protein is a group-specific antigen (gag) protein.The VLP of any one of claims 1-28, wherein the nucleic acid does not specifically bind to the viral structural protein (e.g., via an RNA aptamer / ABP pair) .The VLP of any one of claims 1-29, wherein the cargo sequence is GOI.The VLP of any one of claims 1-30, wherein the VLP is capable of delivering the cargo sequence into a target cell.The VLP of any one of claims 1-31, wherein the VLP is derived from a retrovirus, preferably from a lentivirus or a γ-retrovirus.The VLP of any one of claims 1-32, wherein the VLP consists essentially of:(a) the nucleic acid comprising the cargo sequence,(b) the viral structural protein,(c) the viral envelope protein,(d) a regulatory protein, and(e) a polyprotein,and (f) optionally a rev response element (RRE) .The VLP of claim 33, wherein (1) the viral structural protein is selected from gag, matrix protein MA, and capsid proteins CA, NC, p4, p7, p9, p12, p17, p24, p30, SP1, and SP2; preferably the viral structural protein is gag; (2) the viral envelope protein is selected from vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) , cocal virus glycoprotein (COV-G) protein, RD114-gp70 (SU+TM) , GALV-gp70 (SU+TM) , BaEV-gp70 (SU+TM) , measles, Nipah, MSCV, Cocal, MuLV-gp70 (SU+TM) , Ampho-gp70 (SU+TM) , 10A1-gp70 (SU+TM) , Eco-gp70 (SU+TM) , GP64, LCMV-G (GP1&GP2) , MV-G, HCV-G, CNV-G, PRV-G, Gp160 (gp120 / gp41) , and SYNA; preferably the viral envelope protein is VSV-G or COV-G; (3) the regulatory protein is selected from Rev, Tat, Nef, Vpr, Vif, and Vpu Rev protein; preferably the regulatory protein is Rev; and / or (4) the polyprotein is gag-pol.The VLP of claim 33 or claim 34, wherein the VLP consists of:(a) the nucleic acid comprising the cargo sequence,(b) a gag protein,(c) a VSV-G or COV-G protein,(d) a Rev protein,(e) a Pol protein, and(f) an RRE.A method of preparing the VLP of any one of claims 1-35 in a cell, comprising:(a) introducing into the cell a cargo vector carrying a cargo sequence;(b) expressing a viral structural protein; and(c) expressing a viral envelope protein,wherein step (b) comprises introducing into the cell a first vector encoding a viral structural protein and a second vector encoding a rev protein; and step (c) comprises introducing into the cell a third vector encoding a viral envelope protein.The method of claim 36, wherein the first vector further encodes a pol protein; optionally the first vector comprises a rev response element (RRE) ; optionally the method relies on non-specific interaction between the cargo sequence and the viral structural protein to incorporate the cargo sequence into the VLP.The method of claim 36 or claim 37, wherein (1) the wt / wt ratio between the cargo vector and the first vector is higher than 10: 1, (2) the wt / wt ratio between the cargo vector and the second vector is higher than 10: 1, and / or (3) the wt / wt ratio between the cargo vector and the third vector is higher than 10: 1.The method of claim 38, wherein (1) the wt / wt ratio between the cargo vector and the first vector is higher than 16: 1, (2) the wt / wt ratio between the cargo vector and the second vector is higher than 16: 1, and / or (3) the wt / wt ratio between the cargo vector and the third vector is higher than 16: 1.A VLP prepared by the method of any one of claims 36-39.A method of modifying a target cell comprising introducing the VLP of any one of claims 1-35 and 40 into the target cell.The method of claim 41, wherein the method is performed in vitro and comprises introducing the VLP into the target cell in vitro.The method of claim 41, wherein the method is performed in vivo and comprises introducing the VLP into the target cell in vivo.The method of any one of claims 41-43, wherein the cargo sequence encodes an immunogen.The method of any one of claims 41-43, wherein the cargo sequence encodes an engineered receptor (e.g., CAR) .The method of claim 45, wherein the engineered receptor comprises an extracellular antigen binding domain or ligand binding domain, and optionally an intracellular signaling domain.The method of claim 45, wherein the engineered receptor is selected from the group consisting of an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , a T cell antigen coupler (TAC) or a portion thereof.The method of any one of claims 41-47, wherein the target cell is an immune cell (e.g., T cell) .The method of claim 48, wherein the target cell is a T cell.The method of any one of claims 41-49, wherein the genome of the target cell remains intact after the modification.The method of any one of claims 41-50, wherein the cargo sequence is expressed for more than 7 days, 10 days, or 13 days.The method of any one of claims 41-43, wherein the cargo sequence encodes a genome-editing enzyme (e.g., CRISPR) .A modified cell prepared by the method of any one of claims 41-52.A pharmaceutical composition, comprising (a) the VLP of any one of claims 1-35 and 40, or the modified cell of claim 53, and (b) a pharmaceutically acceptable carrier.A method of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering to the subject in need thereof a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 54.The method of claim 55, wherein the disease is cancer or an auto-immune disease.

Images