Anti-DLL3 / sez6 antibodies and uses thereof

Abstract

This disclosure provides anti-DLL3 antibodies or antigen binding fragments thereof, antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies or antigen-binding fragments thereof) that specifically bind to two different antigens (e.g., DLL3 and SEZ6), and antibody drug conjugates.

Description

ANTI-DLL3 / SEZ6 ANTIBODIES AND USES THEREOF

[0001] CLAIM OF PRIORITY

[0002] This application claims the benefit of PCT Application No. PCT / CN2024 / 139506, filed on December 16, 2024, PCT / CN2025 / 078014, filed on February 19, 2025, PCT / CN2025 / 086884, filed on April 2, 2025, and PCT / CN2025 / 128458, filed on October 17, 2025. The entire contents of the foregoing are incorporated herein by reference.TECHNICAL FIELD

[0003] This disclosure relates to antibodies or antigen-binding fragments thereof, antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) , and antibody drug conjugates.BACKGROUND

[0004] Small cell lung cancer (SCLC) accounts for approximately 15%of all lung cancers. Despite high rates of response to first-line chemotherapy and radiotherapy, patients with extensive-stage disease eventually relapse, and very few patients survive more than 5 years from diagnosis. Treatment options for recurrent or refractory disease are limited, and the treatments that do exist are associated with significant treatment-related toxicities. Delta-like ligand 3 (DLL3) is an inhibitory Notch ligand that is highly expressed in SCLC and other neuroendocrine tumors but minimally expressed in normal tissues. Seizure protein 6 (SEZ6) is a cell surface protein that was recently found to be highly expressed specifically in neuroendocrine tumors, including SCLC and certain neuronal tissue, but minimally expressed in most normal tissues. The expression profile positions them as promising targets for the development of pharmacological agents in the treatment of SCLC.SUMMARY

[0005] This disclosure relates to anti-DLL3 antibodies or antigen binding fragments thereof, anti-SEZ6 antibodies or antigen binding fragments thereof, antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies or antigen-binding fragments thereof) that specifically bind to two different antigens (e.g., DLL3 and SEZ6) , and antibody drug conjugates involving these antibodies or antigen binding fragments thereof.

[0006] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to DLL3 (Delta-Like Ligand 3) comprising:

[0007] a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, wherein the VH CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH CDR1 amino acid sequence, the VH CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH CDR2 amino acid sequence, and the VH CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH CDR3 amino acid sequence; and

[0008] a light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL CDR1 amino acid sequence, the VL CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL CDR2 amino acid sequence, and the VL CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL CDR3 amino acid sequence,

[0009] wherein the selected VH CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences and the selected VL CDRs, 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:

[0010] (1) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0011] (2) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0012] (3) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0013] (4) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0014] (5) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively; and

[0015] (6) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively.

[0016] In some embodiments, the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, according to the Kabat numbering scheme.

[0017] In some embodiments, the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, according to the Chothia numbering scheme.

[0018] In some embodiments, the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, according to the Kabat numbering scheme.

[0019] In some embodiments, the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, according to the Chothia numbering scheme.

[0020] In some embodiments, the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, according to the Kabat numbering scheme.

[0021] In some embodiments, the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, according to the Chothia numbering scheme.

[0022] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to human, mouse, monkey, or canine DLL3.

[0023] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a human or humanized antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., a human IgG1 antibody or a fragment thereof) .

[0024] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a single-chain variable fragment (scFv) .

[0025] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to DLL3 comprising a heavy chain variable region (VH) comprising an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) comprising an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL sequence, wherein the selected VH sequence and the selected VL sequence are one of the following:

[0026] (1) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 44, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 43;

[0027] (2) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 45, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 43; and

[0028] (3) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 47, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 46.

[0029] In some embodiments, the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 44 and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 43.

[0030] In some embodiments, the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 45 and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 43.

[0031] In some embodiments, the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 47 and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 46.

[0032] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to human, monkey, mouse, or canine DLL3.

[0033] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a human or humanized antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., a human IgG1 antibody or a fragment thereof) .

[0034] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a single-chain variable fragment (scFv) .

[0035] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein.

[0036] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to DLL3 comprising

[0037] a heavy chain variable region (VH) comprising VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 that are identical to VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 of a selected VH sequence; and

[0038] a light chain variable region (VL) comprising VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 that are identical to VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 of a selected VL sequence,

[0039] wherein the selected VH sequence and the selected VL sequence are one of the following:

[0040] (1) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 44, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 43;

[0041] (2) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 45, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 43;

[0042] (3) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 47, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 46.

[0043] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a bispecific or a multispecific antibody or an antigen-binding fragment thereof.

[0044] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof further specifically binds to SEZ6.

[0045] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising:

[0046] (1) an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and wherein the VH, when paired with a light chain variable region (VL) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43, binds to DLL3;

[0047] (2) an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof comprising a VH comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and wherein the VH, when paired with a VL comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43, binds to DLL3;

[0048] (3) an immunoglobulin light chain or a fragment thereof comprising a VL comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and wherein the VL, when paired with a VH comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44, binds to DLL3;

[0049] (4) an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof comprising a VH comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and wherein the VH, when paired with a VL comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43, binds to DLL3;

[0050] (5) an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof comprising a VH comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and wherein the VH, when paired with a VL comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43, binds to DLL3;

[0051] (6) an immunoglobulin light chain or a fragment thereof comprising a VL comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and wherein the VL, when paired with a VH comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 45, binds to DLL3;

[0052] (7) an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof comprising a VH comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and wherein the VH, when paired with a VL comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46 binds to DLL3;

[0053] (8) an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof comprising a VH comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, and wherein the VH, when paired with a VL comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46, binds to DLL3;

[0054] (9) an immunoglobulin light chain or a fragment thereof comprising a light chain variable region VL CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, and wherein the VL, when paired with a VH comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 47, binds to DLL3.

[0055] In some embodiments, the VH when paired with a VL specifically binds to human, monkey, mouse, or canine DLL3.

[0056] In some embodiments, the immunoglobulin heavy chain or the fragment thereof is a human or humanized immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof.

[0057] In some embodiments, the nucleic acid encodes a single-chain variable fragment (scFv) .

[0058] In some embodiments, the nucleic acid is cDNA.

[0059] In one aspect, the disclosure is related to an antigen-binding protein construct, comprising: a first antigen-binding domain that specifically binds to DLL3; and a second antigen-binding domain that specifically binds to SEZ6.

[0060] In some embodiments, the first antigen-binding domain comprises a first heavy chain variable region (VH1) and a first light chain variable region (VL1) ; and the second antigen-binding domain comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .

[0061] In some embodiments, the VH1 comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the VH1 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH1 CDR1 amino acid sequence, the VH1 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH1 CDR2 amino acid sequence, and the VH1 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH1 CDR3 amino acid sequence; and the VL1 comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL1 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL1 CDR1 amino acid sequence, the VL1 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL1 CDR2 amino acid sequence, and the VL1 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL1 CDR3 amino acid sequence, wherein the selected VH1 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences, the selected VL1 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:

[0062] (1) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0063] (2) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0064] (3) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0065] (4) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0066] (5) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively; and

[0067] (6) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively.

[0068] In some embodiments, the VH2 comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the VH2 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH2 CDR1 amino acid sequence, the VH2 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH2 CDR2 amino acid sequence, and the VH2 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH2 CDR3 amino acid sequence; and the VL2 comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL2 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL2 CDR1 amino acid sequence, the VL2 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL2 CDR2 amino acid sequence, and the VL2 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL2 CDR3 amino acid sequence, wherein the selected VH2 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences, and the selected VL2 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:

[0069] (1) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0070] (2) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0071] (3) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0072] (4) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0073] (5) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively; and

[0074] (6) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively.

[0075] In some embodiments,

[0076] (1) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0077] (2) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0078] (3) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0079] (4) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0080] (5) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0081] (6) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0082] (7) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0083] (8) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0084] (9) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0085] (10) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0086] (11) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0087] (12) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0088] (13) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0089] (14) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0090] (15) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0091] (16) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0092] (17) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively; or

[0093] (18) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively.

[0094] In some embodiments, the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 44, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 48, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43.

[0095] In some embodiments, the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 44, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 49, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43.

[0096] In some embodiments, the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 44, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 50, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43.

[0097] In some embodiments, the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 45, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 48, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43.

[0098] In some embodiments, the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 45, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 49, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43.

[0099] In some embodiments, the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 45, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 50, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43.

[0100] In some embodiments, the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 47, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 46, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 48, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43.

[0101] In some embodiments, the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 47, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 46, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 49, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43.

[0102] In some embodiments, the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 47, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 46, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 50, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to SEQ ID NO: 43.

[0103] In some embodiments, the antigen-binding protein construct is a bispecific antibody.

[0104] In some embodiments, the first light chain variable region and the second light chain variable region are identical.

[0105] In some embodiments, the first light chain variable region and the second light chain variable region are not identical.

[0106] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising one or more of the nucleic acids described herein, or a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, or a nucleic acid encoding the antigen-binding protein construct described herein.

[0107] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising the vector described herein.

[0108] In some embodiments, the cell is a CHO cell.

[0109] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising one or more of the nucleic acids described herein, or a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, or a nucleic acid encoding the antigen-binding protein construct described herein.

[0110] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing an antibody or an antigen-binding fragment thereof, or an antigen-binding protein construct, the method comprising

[0111] (a) culturing the cell described herein under conditions sufficient for the cell to produce the antibody or the antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct; and

[0112] (b) collecting the antibody or the antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct produced by the cell.

[0113] In one aspect, the disclosure is related to an antibody-drug conjugate comprising a therapeutic agent covalently bound to:

[0114] (a) the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein; or

[0115] (b) the antigen-binding protein construct described herein.

[0116] In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.

[0117] In some embodiments, the therapeutic agent is MMAE or MMAF.

[0118] In some embodiments, the therapeutic agent is selected from

[0119] In some embodiments, the therapeutic agent is linked to the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct via a linker. In some embodiments, the linker has a structure of:

[0120] In some embodiments, the antibody-drug conjugate has a structure of:

[0121] in some embodiments, n=1-8; in some embodiments, “Ab” represents the antibody or antigen-binding fragment thereof.

[0122] In some embodiments, the drug-to-antibody ratio (DAR) is about 4 or 8.

[0123] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, the antigen-binding protein construct described herein, or the antibody-drug conjugate described herein, to the subject.

[0124] In some embodiments, the subject has a solid tumor.

[0125] In some embodiments, the cancer is lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer (NSCLC) , small cell lung cancer (SCLC) ) , thyroid cancer, urothelial cancer, breast cancer, colorectal cancer, renal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, skin cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, liver cancer, head and neck cancer, carcinoid, lymphoma, or glioma.

[0126] In some embodiments, the subject is a human.

[0127] In some embodiments, the subject is a non-human animal.

[0128] In one aspect, the disclosure is related to a method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, the antigen-binding protein construct described herein, or the antibody-drug conjugate described herein.

[0129] In one aspect, the disclosure is related to a method of killing a tumor cell, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, the antigen-binding protein construct described herein, or the antibody-drug conjugate described herein.

[0130] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and

[0131] (a) the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein,

[0132] (b) the antigen-binding protein construct described herein, or

[0133] (c) the antibody-drug conjugate described herein.

[0134] In one aspect, the disclosure is related to an anti-DLL3 / SEZ6 antibody-drug conjugate (ADC) comprising a therapeutic agent covalently bound to a bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a first antigen-binding domain that specifically binds to DLL3; and a second antigen-binding domain that specifically binds to SEZ6.

[0135] As used herein, the term “antibody” refers to any antigen-binding molecule that contains at least one (e.g., one, two, three, four, five, or six) complementary determining region (CDR) (e.g., any of the three CDRs from an immunoglobulin light chain or any of the three CDRs from an immunoglobulin heavy chain) and is capable of specifically binding to an epitope. Non-limiting examples of antibodies include: monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multi-specific antibodies (e.g., bi-specific antibodies) , single-chain antibodies, chimeric antibodies, human antibodies, and humanized antibodies. In some embodiments, an antibody can contain an Fc region of a human antibody. The term antibody also includes derivatives, e.g., bi-specific antibodies, single-chain antibodies, diabodies, linear antibodies, and multi-specific antibodies formed from antibody fragments.

[0136] As used herein, the term “human antibody” refers to an antibody that is encoded by an endogenous nucleic acid (e.g., rearranged human immunoglobulin heavy or light chain locus) derived from a human. In some embodiments, a human antibody is collected from a human or produced in a human cell culture (e.g., human hybridoma cells) . In some embodiments, a human antibody is produced in a non-human cell (e.g., a mouse or hamster cell line) . In some embodiments, a human antibody is produced in a bacterial or yeast cell. In some embodiments, a human antibody is produced in a transgenic non-human animal (e.g., a bovine) containing an unrearranged or rearranged human immunoglobulin locus (e.g., heavy or light chain human immunoglobulin locus) .

[0137] As used herein, the term “chimeric antibody” refers to an antibody that contains a sequence present in at least two different species (e.g., antibodies from two different mammalian species such as a human and a mouse antibody) . A non-limiting example of a chimeric antibody is an antibody containing the variable domain sequences (e.g., all or part of a light chain and / or heavy chain variable domain sequence) of a non-human (e.g., mouse) antibody and the constant domains of a human antibody. Additional examples of chimeric antibodies are described herein and are known in the art.

[0138] As used herein, the term “humanized antibody” refers to a non-human antibody which contains minimal sequence derived from a non-human (e.g., mouse) immunoglobulin and contains sequences derived from a human immunoglobulin. In non-limiting examples, humanized antibodies are human antibodies (recipient antibody) in which hypervariable (e.g., CDR) region residues of the recipient antibody are replaced by hypervariable (e.g., CDR) region residues from a non-human antibody (e.g., a donor antibody) , e.g., a mouse, rat, or rabbit antibody, having the desired specificity, affinity, and capacity. In some embodiments, the Fv framework residues of the human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human (e.g., mouse) immunoglobulin residues. In some embodiments, humanized antibodies may contain residues which are not found in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications can be made to further refine antibody performance. In some embodiments, the humanized antibody contains substantially all of at least one, and typically two, variable domains, in which all or substantially all of the hypervariable loops (CDRs) correspond to those of a non-human (e.g., mouse) immunoglobulin and all or substantially all of the framework regions are those of a human immunoglobulin. The humanized antibody can also contain at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc) , typically, that of a human immunoglobulin. Humanized antibodies can be produced using molecular biology methods known in the art. Non-limiting examples of methods for generating humanized antibodies are described herein.

[0139] As used herein, the term “antigen-binding protein construct” is (i) a single polypeptide that includes at least one antigen-binding domain or (ii) a complex of two or more polypeptides (e.g., the same or different polypeptides) ) that together form at least one or more different antigen-binding domains. Non-limiting examples and aspects of antigen-binding protein constructs are described herein. Additional examples and aspects of antigen-binding protein constructs are known in the art. In some embodiments, the antigen-binding protein construct has 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or more than 8 antigen-binding domains.

[0140] As used herein, the term “antigen-binding domain” refers to one or more protein domain (s) (e.g., formed from amino acids from a single polypeptide or formed from amino acids from two or more polypeptides (e.g., the same or different polypeptides) that is capable of specifically binding to one or more different antigen (s) . In some examples, an antigen-binding domain can bind to an antigen or epitope with specificity and affinity similar to that of naturally-occurring antibodies. In some embodiments, the antigen-binding domain can be an antibody or a fragment thereof. One example of an antigen-binding domain is an antigen-binding domain formed by a VH-VL dimer. In some embodiments, the antigen-binding domain is a VHH. Non-limiting examples of antigen-binding domains are described herein. Additional examples of antigen-binding domains are known in the art. In some examples, an antigen-binding domain can bind to a single antigen.

[0141] As used herein, the term “bispecific antibody” refers to an antibody that binds to two different epitopes. The epitopes can be on the same antigen or on different antigens.

[0142] As used herein, the term “multispecific antibody” refers to an antibody that binds to two or more different epitopes. The epitopes can be on the same antigen or on different antigens.

[0143] As used herein, a “VHH” refers to the variable domain of a heavy chain antibody. In some embodiments, the VHH is a humanized VHH.

[0144] As used herein, the term “common light chain” refers to a light chain that can interact with two or more different heavy chains, forming different antigen-binding domains, wherein these different antigen-binding domains can specifically bind to different antigens or epitopes. Similarly, the term “common light chain variable region” refers to a light chain variable region that can interact with two or more different heavy chain variable regions, forming different antigen-binding domains, wherein these different antigen-binding domains can specifically bind to different antigens or epitopes. In some embodiments, the antigen-binding construct can have a common light chain. In some embodiments, the antigen-binding construct can have a common light chain variable region.

[0145] As used herein, when referring to an antibody, the phrases “specifically binding” and “specifically binds” mean that the antibody interacts with its target molecule (e.g., DLL3) preferably to other molecules, because the interaction is dependent upon the presence of a particular structure (i.e., the antigenic determinant or epitope) on the target molecule; in other words, the reagent is recognizing and binding to molecules that include a specific structure rather than to all molecules in general. An antibody that specifically binds to the target molecule may be referred to as a target-specific antibody. For example, an antibody that specifically binds to a DLL3 molecule may be referred to as a DLL3-specific antibody or an anti-DLL3 antibody.

[0146] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Methods and materials are described herein for use in the present invention; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0147] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0148] FIG. 1 lists CDR sequences of anti-DLL3 antibodies 2A2, 2BL2, and 2984 as defined by Kabat numbering.

[0149] FIG. 2 lists CDR sequences of anti-DLL3 antibodies 2A2, 2BL2, and 2984 as defined by Chothia numbering.

[0150] FIG. 3 lists CDR sequences of anti-SEZ6 antibodies 1E1, 2E3, and 2F6 as defined by Kabat numbering.

[0151] FIG. 4 lists CDR sequences of anti-SEZ6 antibodies 1E1, 2E3, and 2F6 as defined by Chothia numbering.

[0152] FIG. 5 lists amino acid sequences as described in the present disclosure.

[0153] FIG. 6 is a schematic diagram showing the structure of an exemplary anti-DLL3 / SEZ6 bispecific antibody.

[0154] FIG. 7 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with lung cancer cells NCI-H69, and were treated with PBS or anti-DLL3 ADCs.

[0155] FIG. 8 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with lung cancer cells SHP77, and were treated with PBS or anti-DLL3 ADCs.

[0156] FIG. 9 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with lung cancer cells SHP77, and were treated with PBS or anti-DLL3 / SEZ6 ADCs.

[0157] FIG. 10 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with lung cancer cells NCI-H524, and were treated with PBS or anti-DLL3 / SEZ6 ADCs.

[0158] FIG. 11 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with lung cancer cells NCI-H69, and were treated with PBS or ADCs.

[0159] FIG. 12 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with lung cancer cells NCI-H69, and were treated with PBS or anti-DLL3 / SEZ6 ADCs.

[0160] FIG. 13 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with lung cancer cells NCI-H69, and were treated with PBS or anti-DLL3 / SEZ6 ADCs.

[0161] FIG. 14 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with lung cancer cells DMS79, and were treated with PBS or anti-DLL3 / SEZ6 ADCs.

[0162] FIG. 15 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were engrafted with patient-derived lung tumor fragments (2 mm×2 mm×2 mm) , and were treated with PBS or ADCs.DETAILED DESCRIPTION

[0163] A bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof is an artificial protein that can simultaneously bind to two different epitopes (e.g., on two different antigens) . In some embodiments, a bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof can have two arms. Each arm has one heavy chain variable region and one light chain variable region, forming an antigen-binding domain (or an antigen-binding region) . In some embodiments, the bispecific antibody has a common light chain.

[0164] The present disclosure relates to anti-DLL3 antibodies or antigen binding fragments thereof, antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies or antigen-binding fragments thereof) that specifically bind to two different antigens (e.g., DLL3 and SEZ6) , and antibody-drug conjugates.

[0165] DLL3 and SEZ6

[0166] Lung cancer is the most common cause of cancer death, and small cell lung cancer (SCLC) represents approximately 15%of all cases. Despite remarkable progress in the treatment of non-small cell lung cancer in the last decade, patients with SCLC continue to have a poor prognosis and limited treatment options.

[0167] The Notch pathway is a highly conserved cell-cell signaling pathway involved in a variety of development processes, including the development of pulmonary neuroendocrine cells. Delta-like ligand 3 (DLL3) is an inhibitory Notch pathway ligand that is highly upregulated and aberrantly expressed on the cell surface in SCLC and other high-grade neuroendocrine tumors. Notch signaling is downregulated during neuroendocrine tumor growth and is inhibited by DLL3 expression. DLL3 expression is regulated by achaete-scute homolog 1 (ASCL1) , a transcription factor that is required for proper development of pulmonary neuroendocrine cells and is an oncogenic driver in SCLC.

[0168] DLL3 is specifically expressed on the surface of SCLC tumor cells. Recent studies have reported that DLL3 is also expressed in other tumor types of neuroendocrine origin, including melanoma, glioblastoma multiforme, small cell bladder cancer, metastatic castration-resistant prostate cancer, and neuroendocrine lung tumors. The DLL3 expression profile--high, homogeneous cell surface expression in tumors, versus low, cytoplasmic expression in a subset of normal tissues--has enabled the development of therapeutics that use DLL3 to specifically target SCLC cells.

[0169] A detailed review of DLL3 and its functions can be found in Owen DH, Giffin MJ, Bailis JM, Smit MD, Carbone DP, He K, “DLL3: an emerging target in small cell lung cancer” , J Hematol Oncol. 2019 Jun 18; 12 (1) : 61, which is incorporated by reference in its entirety.

[0170] Proteins of the Seizure protein 6 (SEZ6) family are abundant in neurons and are localized to the somatodendritic compartment of these highly polarised cells. The three members of the Sez6 family proteins, which include SEZ6, SEZ6L and SEZ6L2, are single transmembrane domain proteins with large extracellular regions. The Sez6 family proteinshave been identified as potential susceptibility genes for multiple neurodevelopmental and psychiatric disorders including: autism, schizophrenia, intellectual disability, epilepsy, and bipolar disorder.

[0171] Outside the nervous system, SEZ6 is identified to expressed in a variety of tumor cell lines, e.g. K562 cells (human chronic myelogenous leukemia) , A2780 cells (human ovarian cancer) , SHP-77 cells (human lung cancer) , H1299 cells (human NSCLC) , SGC996 cells (human gallbladder carcinoma) , A549 cells (human NSCLC) , H2122 cells (human lung cancer) , SPCA cells (human lung cancer) , MHCC-97H cells (human liver cancer) , SW480 cells (human colon cancer) , and MDA-MB-435 cells (human breast cancer) . In addition, SEZ6 is highly expressed in highly metastatic tumor cell lines, e.g. SHP-77, H1299, MHCC-97H, SW480, and MDA-MB-435. Furthermore, SEZ6 family members have been implicated as markers of poor prognosis in cancer. By mRNA expression analysis and IHC, SEZ6 is a highly expressed surface marker in SCLC with limited expression in normal tissue, and is a potential target for developing cancer therapeutics.

[0172] Anti-DLL3 Antibodies and Antigen-Binding Fragments

[0173] The disclosure provides several antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind to DLL3. In some embodiments, the anti-DLL3 / SEZ6 antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) can include an antigen binding region that is derived from these antibodies.

[0174] The antibodies and antigen-binding fragments described herein are capable of binding to DLL3. The disclosure provides e.g., anti-DLL3 antibodies 2A2, 2BL2, 2984, and the antibodies derived therefrom.

[0175] The CDR sequences for 2A2, and 2A2 derived antibodies (e.g., human antibodies) include CDRs of the heavy chain variable domain, SEQ ID NOs: 4-6, and CDRs of the light chain variable domain, SEQ ID NOs: 1-3 as defined by Kabat numbering. The CDRs can also be defined by Chothia system. Under the Chothia numbering, the CDR sequences of the heavy chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, and CDR sequences of the light chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 1-3.

[0176] Similarly, the CDR sequences for 2BL2, and 2BL2 derived antibodies include CDRs of the heavy chain variable domain, SEQ ID NOs: 10-12, and CDRs of the light chain variable domain, SEQ ID NOs: 1-3, as defined by Kabat numbering. Under Chothia numbering, the CDR sequences of the heavy chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, and CDRs of the light chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 1-3.

[0177] The CDR sequences for 2984, and 2984 derived antibodies include CDRs of the heavy chain variable domain, SEQ ID NOs: 19-21, and CDRs of the light chain variable domain, SEQ ID NOs: 16-18, as defined by Kabat numbering. Under Chothia numbering, the CDR sequences of the heavy chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, and CDRs of the light chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 16-18.

[0178] Furthermore, in some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can also contain one, two, or three heavy chain variable region CDRs selected from the group of SEQ ID NOs: 4-6, SEQ ID NOs: 7-9, SEQ ID NOs: 10-12, SEQ ID NOs: 13-15, SEQ ID NOs: 19-21, and SEQ ID NOs: 22-24; and / or one, two, or three light chain variable region CDRs selected from the group of SEQ ID NOs: 1-3 and SEQ ID NOs: 16-18.

[0179] In some embodiments, the antibodies can have a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR3 amino acid sequence, and a light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR3 amino acid sequence. The selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences and the selected VL CDRs, 1, 2, 3 amino acid sequences are shown in FIG. 1 (Kabat CDR) and FIG. 2 (Chothia CDR) .

[0180] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 4 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 5 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 6 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0181] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 7 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 8 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 9 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0182] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 10 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 11 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 12 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0183] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 13 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 14 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 15 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0184] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 19 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 20 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 21 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0185] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 22 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 23 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 24 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0186] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a light chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0187] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a light chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 16 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 17 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 18 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0188] The insertions, deletions, and substitutions can be within the CDR sequence, or at one or both terminal ends of the CDR sequence.

[0189] The disclosure also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to DLL3. The antibodies or antigen-binding fragments thereof contain a heavy chain variable region (VH) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL sequence. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NOs: 44, 45, or 47, and the selected VL sequence is SEQ ID NOs: 43 or 46.

[0190] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof can have 3 VH CDRs that are identical to the CDRs of any VH sequences as described herein. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof can have 3 VL CDRs that are identical to the CDRs of any VL sequences as described herein.

[0191] The disclosure also provides nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy chain or an immunoglobulin heavy chain. The immunoglobulin heavy chain or immunoglobulin light chain comprises CDRs as shown in FIG. 1 or FIG. 2, or have sequences as shown in FIG. 5. When the polypeptides are paired with corresponding polypeptide (e.g., a corresponding heavy chain variable region or a corresponding light chain variable region) , the paired polypeptides bind to DLL3 (e.g., human DLL3) .

[0192] The anti-DLL3 antibodies and antigen-binding fragments can also be antibody variants (including derivatives and conjugates) of antibodies or antibody fragments and multi-specific (e.g., bispecific) antibodies or antibody fragments. Additional antibodies provided herein are polyclonal, monoclonal, multi-specific (multimeric, e.g., bispecific) , human antibodies, chimeric antibodies (e.g., human-mouse chimera) , single-chain antibodies, intracellularly-made antibodies (i.e., intrabodies) , and antigen-binding fragments thereof. The antibodies or antigen-binding fragments thereof can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) , or subclass. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is an IgG antibody or antigen-binding fragment thereof.

[0193] Fragments of antibodies are suitable for use in the methods provided so long as they retain the desired affinity and specificity of the full-length antibody. Thus, a fragment of an antibody that binds to DLL3 will retain an ability to bind to DLL3. An Fv fragment is an antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy and one light chain variable domain in tight association, which can be covalent in nature, for example in scFv. It is in this configuration that the three CDRs of each variable domain interact to define an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer. Collectively, the six CDRs or a subset thereof confer antigen binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for an antigen) can have the ability to recognize and bind antigen, although usually at a lower affinity than the entire binding site.

[0194] Antibodies, Antigen Binding Fragments and Antigen Binding Protein Constructs

[0195] The present disclosure provides antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) . The antigen-binding protein construct (e.g., bispecific antibody) can comprise an anti-DLL3 antibody or antigen-binding fragment thereof, and anti-SEZ6 antibody or antigen-binding fragment thereof. These antigen-binding protein constructs (e.g., anti-DLL3 / SEZ6 bispecific antibody) , anti-DLL3 antibodies, anti-SEZ6 antibodies, and antigen-binding fragments thereof can have various forms.

[0196] In general, antibodies (also called immunoglobulins) can be made up of two classes of polypeptide chains, light chains and heavy chains. A non-limiting antibody of the present disclosure can be an intact, four immunoglobulin chain antibody comprising two heavy chains and two light chains. The heavy chain of the antibody can be of any isotype including IgM, IgG, IgE, IgA, or IgD or sub-isotype including IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2, etc. The light chain can be a kappa light chain or a lambda light chain. An antibody can comprise two identical copies of a light chain and / or two identical copies of a heavy chain. The heavy chains, which each contain one variable domain (or variable region, VH) and multiple constant domains (or constant regions) , bind to one another via disulfide bonding within their constant domains to form the “stem” of the antibody. The light chains, which each contain one variable domain (or variable region, VL) and one constant domain (or constant region) , each bind to one heavy chain via disulfide binding. The variable region of each light chain is aligned with the variable region of the heavy chain to which it is bound. The variable regions of both the light chains and heavy chains contain three hypervariable regions sandwiched between more conserved framework regions (FR) .

[0197] These hypervariable regions, known as the complementary determining regions (CDRs) , form loops that comprise the principle antigen binding surface of the antibody. The four framework regions largely adopt a beta-sheet conformation and the CDRs form loops connecting, and in some cases forming part of, the beta-sheet structure. The CDRs in each chain are held in close proximity by the framework regions and, with the CDRs from the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding region.

[0198] Methods for identifying the CDR regions of an antibody by analyzing the amino acid sequence of the antibody are well known, and a number of definitions of the CDRs are commonly used. The Kabat definition is based on sequence variability, and the Chothia definition is based on the location of the structural loop regions. These methods and definitions are described in, e.g., Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains, " Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al., "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains, " Molecular immunology 45.14 (2008) : 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203: 121-53 (1991) ; Morea et al., Biophys Chem. 68 (1-3) : 9-16 (Oct. 1997) ; Morea et al., J Mol Biol. 275 (2) : 269-94 (Jan. 1998) ; Chothia et al., Nature 342 (6252) : 877-83 (Dec. 1989) ; Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7: 64 (2007) ; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0199] The CDRs are important for recognizing an epitope of an antigen. As used herein, an “epitope” is the smallest portion of a target molecule capable of being specifically bound by the antigen binding domain of an antibody. The minimal size of an epitope may be about three, four, five, six, or seven amino acids, but these amino acids need not be in a consecutive linear sequence of the antigen’s primary structure, as the epitope may depend on an antigen’s three-dimensional configuration based on the antigen’s secondary and tertiary structure.

[0200] In some embodiments, the antibody is an intact immunoglobulin molecule (e.g., IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA) . The IgG subclasses (IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) are highly conserved, differ in their constant region, particularly in their hinges and upper CH2 domains. The sequences and differences of the IgG subclasses are known in the art, and are described, e.g., in Vidarsson, et al, "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. " Frontiers in immunology 5 (2014) ; Irani, et al., "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases. " Molecular immunology 67.2 (2015) : 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0201] The antibody can also be an immunoglobulin molecule that is derived from any species (e.g., human, rodent, mouse, rat, camelid) . Antibodies disclosed herein also include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, monospecific, polyspecific antibodies, and chimeric antibodies that include an immunoglobulin binding domain fused to another polypeptide. The antigen binding domain or antigen binding fragment is a portion of an antibody that retains specific binding activity of the intact antibody, i.e., any portion of an antibody that is capable of specific binding to an epitope on the intact antibody’s target molecule. It includes, e.g., Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, and variants of these fragments. Thus, in some embodiments, an antibody or an antigen binding fragment thereof can be, e.g., a scFv, a Fv, a Fd, a dAb, a bispecific antibody, a bispecific scFv, a diabody, a linear antibody, a single-chain antibody molecule, a multi-specific antibody formed from antibody fragments, and any polypeptide that includes a binding domain which is, or is homologous to, an antibody binding domain. Non-limiting examples of antigen binding domains include, e.g., the heavy chain and / or light chain CDRs of an intact antibody, the heavy and / or light chain variable regions of an intact antibody, full length heavy or light chains of an intact antibody, or an individual CDR from either the heavy chain or the light chain of an intact antibody.

[0202] In some embodiments, the scFv has two heavy chain variable domains, and two light chain variable domains. In some embodiments, the scFv has two antigen binding regions, and the two antigen binding regions can bind to the respective target antigens with different affinities.

[0203] In some embodiments, the antigen binding fragment can form a part of a chimeric antigen receptor (CAR) . In some embodiments, the chimeric antigen receptor are fusions of single-chain variable fragments (scFv) as described herein, fused to CD3-zeta transmembrane-and endodomain. In some embodiments, the chimeric antigen receptor also comprises intracellular signaling domains from various costimulatory protein receptors (e.g., CD28, 41BB, ICOS) . In some embodiments, the chimeric antigen receptor comprises multiple signaling domains, e.g., CD3z-CD28-41BB or CD3z-CD28-OX40, to increase potency. Thus, in one aspect, the disclosure further provides cells (e.g., T cells) that express the chimeric antigen receptors as described herein.

[0204] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) can bind to two different antigens or two different epitopes.

[0205] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) can comprises one, two, or three heavy chain variable region CDRs selected from FIGs. 1, 2, 3, and 4. In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) can comprises one, two, or three light chain variable region CDRs selected from FIGs. 1, 2, 3, and 4.

[0206] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) described herein can be conjugated to a therapeutic agent. The antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof can covalently or non-covalently bind to a therapeutic agent. In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent (e.g., monomethyl auristatin E, monomethyl auristatin F, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxy anthracin, maytansinoids such as DM-1 and DM-4, dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, epirubicin, camptothecin, cyclophosphamide and analogs) .

[0207] Multimerization of antibodies may be accomplished through natural aggregation of antibodies or through chemical or recombinant linking techniques known in the art. For example, some percentage of purified antibody preparations (e.g., purified IgG1 molecules) spontaneously form protein aggregates containing antibody homodimers and other higher-order antibody multimers.

[0208] In some embodiments, the multi-specific antibody is a bispecific antibody. Bispecific antibodies can be made by engineering the interface between a pair of antibody molecules to maximize the percentage of heterodimers that are recovered from recombinant cell culture. For example, the interface can contain at least a part of the CH3 domain of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (e.g., tyrosine or tryptophan) . Compensatory “cavities” of identical or similar size to the large side chain (s) are created on the interface of the second antibody molecule by replacing large amino acid side chains with smaller ones (e.g., alanine or threonine) . This provides a mechanism for increasing the yield of the heterodimer over other unwanted end-products such as homodimers. This method is described, e.g., in WO 96 / 27011, which is incorporated by reference in its entirety.

[0209] Any of the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) described herein may be conjugated to a stabilizing molecule (e.g., a molecule that increases the half-life of the antibody or antigen-binding fragment thereof in a subject or in solution) . Non-limiting examples of stabilizing molecules include: a polymer (e.g., a polyethylene glycol) or a protein (e.g., serum albumin, such as human serum albumin) . The conjugation of a stabilizing molecule can increase the half-life or extend the biological activity of an antibody or an antigen-binding fragment in vitro (e.g., in tissue culture or when stored as a pharmaceutical composition) or in vivo (e.g., in a human) .

[0210] The antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) can also have various forms. Many different formats of antigen binding constructs are known in the art, and are described e.g., in Suurs, et al., "A review of bispecific antibodies and antibody constructs in oncology and clinical challenges, " Pharmacology&therapeutics (2019) , which is incorporated herein by reference in the entirety.

[0211] In some embodiments, the antigen-binding protein construct is a BiTe, a (scFv) 2, a nanobody, a nanobody-HSA, a DART, a TandAb, a scDiabody, a scDiabody-CH3, scFv-CH-CL-scFv, a HSAbody, scDiabody-HAS, or a tandem-scFv. In some embodiments, the antigen-binding protein construct is a VHH-scAb, a VHH-Fab, a Dual scFab, a F (ab’ ) 2, a diabody, a crossMab, a DAF (two-in-one) , a DAF (four-in-one) , a DutaMab, a DT-IgG, a knobs-in-holes common light chain, a knobs-in-holes assembly, a charge pair, a Fab-arm exchange, a SEEDbody, a LUZ-Y, a Fcab, aκλ-body, an orthogonal Fab, a DVD-IgG, a IgG (H) -scFv, a scFv- (H) IgG, IgG (L) -scFv, scFv- (L) IgG, IgG (L, H) -Fv, IgG (H) -V, V (H) -IgG, IgG (L) -V, V (L) -IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody, DVI-IgG, Diabody-CH3, a triple body, a miniantibody, a minibody, a TriBi minibody, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, a F (ab’ ) 2-scFv2, a scFv-KIH, a Fab-scFv-Fc, a tetravalent HCAb, a scDiabody-Fc, a Diabody-Fc, a tandem scFv-Fc, an Intrabody, a dock and lock, a lmmTAC, an IgG-IgG conjugate, a Cov-X-Body, or a scFv1-PEG-scFv2.

[0212] In some embodiments, the antigen-binding protein construct can be a TrioMab. In a TrioMab, the two heavy chains are from different species, wherein different sequences restrict the heavy-light chain pairing.

[0213] In some embodiments, the antigen-binding protein construct has two different heavy chains and one common light chain. Heterodimerization of heavy chains can be based on the knob-in-holes or some other heavy chain pairing technique.

[0214] In some embodiments, the antigen-binding protein construct has two different heavy chains and two different light chain. Heterodimerization of heavy chains can be based on the knob-in-holes or some other heavy chain pairing technique.

[0215] In some embodiments, CrossMAb technique can be used produce bispecific antibodies. CrossMAb technique can be used enforce correct light chain association in bispecific heterodimeric IgG antibodies, this technique allows the generation of various bispecific antibody formats, including bi- (1+1) , tri- (2+1) and tetra- (2+2) valent bispecific antibodies, as well as non-Fc tandem antigen-binding fragment (Fab) -based antibodies. These formats can be derived from any existing antibody pair using domain crossover, without the need for the identification of common light chains, post-translational processing / in vitro chemical assembly or the introduction of a set of mutations enforcing correct light chain association. The method is described in Klein et al., "The use of CrossMAb technology for the generation of bi-and multispecific antibodies. " MAbs. Vol. 8. No. 6. Taylor&Francis, 2016, which is incorporated by reference in its entirety. In some embodiments, the CH1 in the heavy chain and the CL domain in the light chain are swapped.

[0216] The antigen-binding protein construct can be a Duobody. The Fab-exchange mechanism naturally occurring in IgG4 antibodies is mimicked in a controlled matter in IgG1 antibodies, a mechanism called controlled Fab exchange. This format can ensure specific pairing between the heavy-light chains.

[0217] In Dual-variable-domain antibody (DVD-Ig) , additional VH and variable light chain (VL) domain are added to each N-terminus for bispecific targeting. This format resembles the IgG-scFv, but the added binding domains are bound individually to their respective N-termini instead of a scFv to each heavy chain N-terminus.

[0218] In scFv-IgG, the two scFv are connected to the C-terminus of the heavy chain (CH3) . The scFv-IgG format has two different bivalent binding sites and is consequently also called tetravalent. There are no heavy-chain and light-chain pairing problem in the scFv-IgG.

[0219] In some embodiments, the antigen-binding protein construct can be have a IgG-IgG format. Two intact IgG antibodies are conjugated by chemically linking the C-terminals of the heavy chains.

[0220] The antigen-binding protein construct can also have a Fab-scFv-Fc format. In Fab-scFv-Fc format, a light chain, heavy chain and a third chain containing the Fc region and the scFv are assembled. It can ensure efficient manufacturing and purification.

[0221] In some embodiments, antigen-binding protein construct can be a TF. Three Fab fragments are linked by disulfide bridges. Two fragments target the tumor associated antigen (TAA) and one fragment targets a hapten. The TF format does not have an Fc region.

[0222] ADAPTIR has two scFvs bound to each sides of an Fc region. It abandons the intact IgG as a basis for its construct, but conserves the Fc region to extend the half-life and facilitate purification.

[0223] Bispecific T cell Engager ( “BiTE” ) consists of two scFvs, VLA VHA and VHB VLB on one peptide chain. It has only binding domains, no Fc region.

[0224] In BiTE-Fc, an Fc region is fused to the BiTE construct. The addition of Fc region enhances half-life leading to longer effective concentrations, avoiding continuous IV.

[0225] Dual affinity retargeting (DART) has two peptide chains connecting the opposite fragments, thus VLA with VHB and VLB with VHA, and a sulfur bond at their C-termini fusing them together. In DART, the sulfur bond can improve stability over BiTEs.

[0226] In DART-Fc, an Fc region is attached to the DART structure. It can be generated by assembling three chains, two via a disulfide bond, as with the DART. One chain contains half of the Fc region which will dimerize with the third chain, only expressing the Fc region. The addition of Fc region enhances half-life leading to longer effective concentrations, avoiding continuous IV.

[0227] In tetravalent DART, four peptide chains are assembled. Basically, two DART molecules are created with half an Fc region and will dimerize. This format has bivalent binding to both targets, thus it is a tetravalent molecule.

[0228] Tandem diabody (TandAb) comprises two diabodies. Each diabody consists of an VHA and VLB fragment and a VHA and VLB fragment that are covalently associated. The two diabodies are linked with a peptide chain. It can improve stability over the diabody consisting of two scFvs. It has two bivalent binding sites.

[0229] The ScFv-scFv-toxin includes toxin and two scFv with a stabilizing linker. It can be used for specific delivery of payload.

[0230] In modular scFv-scFv-scFv, one scFv directed against the TAA is tagged with a short recognizable peptide is assembled to a bsAb consisting of two scFvs, one directed against CD3 and one against the recognizable peptide.

[0231] In ImmTAC, a stabilized and soluble T cell receptor is fused to a scFv recognizing CD3. By using a TCR, the ImmTAC is suitable to target processed, e.g. intracellular, proteins.

[0232] Tri-specific nanobody has two single variable domains (nanobodies) with an additional module for half-life extension. The extra module is added to enhance half-life.

[0233] In Trispecific Killer Engager (TriKE) , two scFvs are connected via polypeptide linkers incorporating human IL-15. The linker to IL-15 is added to increase survival and proliferation of NKs.

[0234] In some embodiments, the antigen-binding protein construct is a bispecific antibody. In some embodiments, the bispecific antibody in present disclosure is designed to be 1+1 (monovalent for each target) and has an IgG1 subtype structure. This can reduce the avidity to cells with low expression levels of DLL3 and SEZ6, and increase the avidity to cells that co-express DLL3 and SEZ6, to achieve enhanced targeting function. Mutations S239D and / or I332E (SI mutations) can also be introduced in antibody heavy chains to enhance the antibody affinity to FcγRIIIA.

[0235] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., the anti-DLL3 antibody, the anti-SEZ6 antibody, or the bispecific antibody) , or the related antibody drug conjugates (ADC) , have a light chain constant region that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 55, and a heavy chain constant region that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NOs: 56, 57, or 58.

[0236] In some embodiments, the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof described herein has a common light chain.

[0237] Antibody Drug Conjugates (ADC)

[0238] The antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) described herein can be conjugated to a therapeutic agent (a drug) . The therapeutic agent can be covalently or non-covalently bind to the antibody or antigen-binding fragment or the antigen binding protein construct (e.g., a bispecific antibody) . In some embodiments, the bispecific antibody is an anti-DLL3 / SEZ6 bispecific antibody. In some embodiments, the bispecific antibody has a common light chain.

[0239] In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent (e.g., monomethyl auristatin E, monomethyl auristatin F, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxy anthracin, maytansinoids such as DM-1 and DM-4, dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, epirubicin, camptothecin, and cyclophosphamide and analogs) . Useful classes of cytotoxic, cytostatic, or immunomodulatory agents include, for example, antitubulin agents, DNA minor groove binders, DNA replication inhibitors, and alkylating agents.

[0240] In some embodiments, the therapeutic agent can include, but not limited to, cytotoxic reagents, such as chemo-therapeutic agents, immunotherapeutic agents and the like, antiviral agents or antimicrobial agents. In some embodiments, the therapeutic agent to be conjugated can be selected from, but not limited to, MMAE (monomethyl auristatin E) , MMAD (monomethyl auristatin D) , or MMAF (monomethyl auristatin F) .

[0241] Definitions of specific functional groups and chemical terms are described in more detail below. For purpose of this invention, the chemical elements are identified in accordance with the Periodic Table of the Elements, CAS version, Hand book of Chemistry and Physics, 75th Edition, inside cover, and specific functional groups are generally defined as described therein. Additionally, general principles of organic chemistry, as well as specific functional moieties and reactivity, are described in Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March’s Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley&Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; Carruthers, Some Modem Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987.

[0242] All ranges cited herein are inclusive, unless expressly stated to the contrary. When a range of values is listed, it is intended to encompass each value and sub-range within the range. For example, “C1-6” is intended to encompass, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5, and C5-6.

[0243] The compounds or any formula depicting and describing the compounds of the present disclosure may have one or more chiral (asymmetric) centers. The present invention encompasses all stereoisomeric forms of the compounds or any formula depicting and describing the compounds of the present invention. Centers of asymmetry that are present in the compounds or any formula depicting and describing the compounds of the present invention can all independently of one another have (R) or (S) configuration. When bonds to a chiral carbon are depicted as straight lines in the structural formulas, or when a compound name is recited without an (R) or (S) chiral designation for a chiral carbon, it is understood that both the (R) and (S) configurations of each such chiral carbon, and hence each enantiomer or diastereomer and mixtures thereof, are embraced within the formula or by the name.

[0244] The disclosure includes all possible enantiomers and diastereomers and mixtures of two or more stereoisomers, for example mixtures of enantiomers and / or diastereomers, in all ratios. Thus, enantiomers are a subject of the disclosure in enantiomerically pure form, both as levorotatory and as dextrorotatory antipodes, in the form of racemates and in the form of mixtures of the two enantiomers in all ratios. In the case of a cis / trans isomerism the disclosure includes both the cis form and the trans form as well as mixtures of these forms in all ratios. The preparation of individual stereoisomers can be carried out, if desired, by separation of a mixture by customary methods, for example by chromatography or crystallization, by the use of stereochemically uniform starting materials for the synthesis or by stereoselective synthesis. Optionally a derivatization can be carried out before a separation of stereoisomers. The separation of a mixture of stereoisomers can be carried out at an intermediate step during the synthesis of a compound or it can be done on a final racemic product. Absolute stereochemistry may be determined by X-ray crystallography of crystalline products or crystalline intermediates which are derivatized, if necessary, with a reagent containing a stereogenic center of known configuration. Alternatively, absolute stereochemistry may be determined by Vibrational Circular Dichroism (VCD) spectroscopy analysis.

[0245] Unless otherwise stated, the structures depicted herein are also meant to include the compounds that differ only in the presence of one or more isotopically enriched atoms, in other words, the compounds wherein one or more atoms are replaced by atoms having the same atomic number, but an atomic mass or mass number different from the atomic mass or mass number which predominates in nature. Such compounds are referred to as a “isotopic variant” . The present disclosure is intended to include all pharmaceutically acceptable isotopic variants of the compounds or any formula depicting and describing the compounds of the present invention. Examples of isotopes suitable for inclusion in the compounds of the present invention include, but not limited to, isotopes of hydrogen, such as 2H (i.e., D) and 3H; carbon, such as 11C, 13C, and 14C; chlorine, such as 36Cl; fluorine, such as 18F; iodine, such as 123I and 125I; nitrogen, such as 13N and 15N; oxygen, such as 15O, 17O, and 18O; phosphorus, such as 32P; and sulfur, such as 35S. Certain isotopic variants of the compounds or any formula depicting and describing the compounds of the present disclosure, for example those incorporating a radioactive isotope, may be useful in drug and / or substrate tissue distribution studies. Particularly, compounds having the depicted structures that differ only in the replacement with heavier isotopes, such as the replacement of hydrogen by deuterium (2H, or D) , can afford certain therapeutic advantages, for example, resulting from greater metabolic stability, increased in vivo half-life, or reduced dosage requirements and, hence, may be utilized in some particular circumstances. Isotopic variants of compounds or any formula depicting and describing the compounds of the present disclosure can generally be prepared by techniques known to those skilled in the art or by processes analogous to those described in the accompanying examples and synthesis using an appropriate isotopically-labeled reagent in place of the non-labeled reagent previously employed.

[0246] The compounds as provided herein are described with reference to both generic formulas and specific compounds. In addition, the compounds of the present disclosure may exist in a number of different forms or derivatives, all within the scope of the disclosure. These include, for example, pharmaceutically acceptable salts, tautomers, stereoisomers, racemic mixtures, regioisomers, prodrugs, solvated forms, different crystal forms or polymorphs, and active metabolites, etc.

[0247] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable salt” , unless otherwise stated, includes salts that retain the biological effectiveness of the free acid / base form of the specified compound and that are not biologically or otherwise undesirable. Pharmaceutically acceptable salts may include salts formed with inorganic bases or acids and organic bases or acids. In cases where the compounds of the present disclosure contain one or more acidic or basic groups, the disclosure also comprises their corresponding pharmaceutically acceptable salts. Thus, the compounds of the present invention which contain acidic groups, such as carboxyl groups, can be present in salt form, and can be used according to the invention, for example, as alkali metal salts, alkaline earth metal salts, aluminum salts or as ammonium salts. More non-limiting examples of such salts include lithium salts, sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts, barium salts, or salts with ammonia or organic amines such as ethylamine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, piperidine, N-methylglutamine, or amino acids. These salts are readily available, for instance, by reacting the compound having an acidic group with a suitable base, e.g., lithium hydroxide, sodium hydroxide, sodium propoxide, potassium hydroxide, potassium ethoxide, magnesium hydroxide, calcium hydroxide, or barium hydroxide. Other base salts of compounds of the present disclosure include but are not limited to copper (I) , copper (II) , iron (II) , iron (III) , manganese (II) , and zinc salts. Compounds of the present disclosure which contain one or more basic groups, e.g., groups which can be protonated, can be present in salt form, and can be used according to the disclosure in the form of their addition salts with inorganic or organic acids. Examples of suitable acids include hydrogen chloride, hydrogen bromide, hydrogen iodide, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid, sulfoacetic acid, trifluoroacetic acid, oxalic acid, acetic acid, tartaric acid, lactic acid, salicylic acid, benzoic acid, carbonic acid, formic acid, propionic acid, pivalic acid, diethylacetic acid, malonic acid, succinic acid, pimelic acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, embonic acid, mandelic acid, sulfaminic acid, phenylpropionic acid, gluconic acid, ascorbic acid, isonicotinic acid, citric acid, adipic acid, taurocholic acid, glutaric acid, stearic acid, glutamic acid, or aspartic acid, and other acids known to those skilled in the art. The salts which are formed are, inter alia, hydrochlorides, chlorides, hydrobromides, bromides, iodides, sulfates, phosphates, methanesulfonates (mesylates) , tosylates, carbonates, bicarbonates, formates, acetates, sulfoacetates, triflates, oxalates, malonates, maleates, succinates, tartrates, malates, embonates, mandelates, fumarates, lactates, citrates, glutarates, stearates, aspartates, and glutamates. The stoichiometry of the salts formed from the compounds of the disclosure may moreover be an integral or non-integral multiple of one.

[0248] Compounds of the present disclosure which contain basic nitrogen-containing groups can be quaternized using agents such as C1-4alkyl halides, for example, methyl, ethyl, isopropyl, and tert-butyl chloride, bromide, and iodide; diC1-4alkyl sulfates, for example, dimethyl, diethyl, and diamyl sulfate; C10-18alkyl halides, for example, decyl, dodecyl, lauryl, myristyl, and stearyl chloride, bromide, and iodide; and arylC1-4alkyl halides, for example, benzyl chloride and phenethyl bromide.

[0249] If the compounds of the present disclosure simultaneously contain acidic and basic groups in the molecule, the disclosure also includes, in addition to the salt forms mentioned, inner salts or betaines (zwitterions) . The respective salts can be obtained by customary methods which are known to those skilled in the art, for example by contacting these with an organic or inorganic acid or base in a solvent or dispersant, or by anion exchange or cation exchange with other salts. The present disclosure also includes all salts of the compounds of the present disclosure which, owing to low physiological compatibility, are not directly suitable for use in pharmaceuticals but which can be used, for example, as intermediates for chemical reactions or for the preparation of pharmaceutically acceptable salts. For a review on more suitable salts, see Stahl and Wermuth, Hand book of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Wiley-VCH, 2002) .

[0250] The compound or any formula depicting and describing the compounds of the present disclosure and pharmaceutically acceptable salts thereof may exist in unsolvated and solvated forms. As used herein, the term “solvate” refers to a molecular complex comprising the compound of Formula (I) , or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and one or more pharmaceutically acceptable solvent molecules. For example, the term “hydrate” is employed when the solvent is water.

[0251] Pharmaceutically acceptable solvates in accordance with the present disclosure may include those wherein the solvent of crystallization may be isotopically substituted, e.g., D2O, d6-acetone, d6-DMSO.

[0252] Linker (linking agent compound)

[0253] In some embodiments, the therapeutic agent is conjugated via a linker (or a linking agent compound) . As used herein, the term “linker” or “linking agent compound” refers to a compound that can connect a ligand (e.g., the antibodies or the antigen-binding fragments thereof described herein) and a therapeutic agent (e.g., any of the therapeutic agents described herein) together to form a ligand-drug conjugate by reacting with a group of the ligand compound and the therapeutic agent compound respectively by, for example, a coupling reaction.

[0254] In some embodiments, the linker described herein is a compound having the following formula:

[0255] Q-L

[0256] Formula (I) ,

[0257] or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof, wherein Q denotes to ajunction moiety capable of being coupled to a ligand via a bond selected from the group consisting of carbonyl, thioether, amide, disulfide and hydrazone bond; L denotes to a linker moiety capable of connecting Q to a therapeutic agent.

[0258] In some embodiments, the junction moiety (Q in Formula (I) ) has the following structure:

[0259] In some embodiments, the linker moiety (L in Formula (I) ) has the following formula:

[0260] where L1 is a polypeptide residue consisting of three to eight amino acid residues which comprises at least one amino acid residue with a side chain carboxyl group, for example, glutamic acid residue or aspartic acid residue, where “-COOH” denotes carboxyl group of an amino acid residue at C-terminal of the polypeptide residue;

[0261] L2 is absent or a monodentate, bidentate or tridentate hydrophilic group attached to the side chain carboxyl group on the amino acid residue of the polypeptide residue L1, and L2 has a structure of-NHC(RL2a) (RL2b) (RL2c) , where RL2a, RL2b, and RL2c are each independently selected from the group consisting of H, - (CH2O) (CH2CH2O) m (CH2) pC (O) OH, and - (CH2O) (CH2CH2O) m (CH2) pC (O) NHRL2d, RL2d is H or C1-6 alkyl optionally substituted with 1 to 6 hydroxy groups, each m is independently an integer from 0 to 10, preferably 0 to 4, for example 0, 1, 2, 3, or 4, especially preferably m is 0, and each p is independent an integer from 1 to 4, for example, 1, 2, 3, or 4; and

[0262] denotes to the N-terminal side of the polypeptide residue covalently attached to the junction moiety Q.

[0263] In some embodiments, the polypeptide residue L1 is NH-Glu-Val-Ala-COOH. In some embodiments, the hydrophilic group L2 has the following structure:

[0264] wherein “*” denotes the site covalently attached to polypeptide residue L1, e.g., side chain of the Glu residue in NH-Glu-Val-Ala-COOH.

[0265] In some embodiments, the linker described herein is a compound having the following structure:

[0266] In some embodiments, the linker is a VC linker. Details of the linkers used for ADCs can be found, e.g., in Su, Z. et al., "Antibody–drug conjugates: Recent advances in linker chemistry. " Acta Pharmaceutica Sinica B (2021) , which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0267] Therapeutic agent

[0268] In some embodiments, the therapeutic agent that is conjugated to the antibodies or the antigen-binding fragments thereof described herein is discussed as follows.

[0269] In some embodiments, the therapeutic agent described herein is a cytotoxic agent. In some embodiments, the cytotoxic agent is a camptothecin compound, an analogue or a derivative thereof. In some preferred embodiments, the camptothecin compound is a compound having the following structure:

[0270] wherein X is selected from the group consisting of-CH2-, O and S; Y is selected from the group consisting of H, D, and F.

[0271] In some embodiments, the therapeutic agent is (S) -4-amino-9-ethyl-9-hydroxy-1, 9, 12, 15-tetrahydro-13H-pyrano [3' , 4' : 6, 7] indolizino [1, 2-b] thiopyrano [4, 3, 2-de] quinoline-10, 13 (2H) -dione) (CPT-1) . The structure of CPT-1 is shown below:

[0272] In some embodiments, the therapeutic agent is (S) -4-amino-9-ethyl-9-hydroxy-1, 9, 12, 15-tetrahydro-13H-pyrano [4, 3, 2-de] pyrano [3' , 4' : 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13 (2H) -dione (CPT-2) .The structure of CPT-2 is shown below:

[0273] In some embodiments, the therapeutic agent is CPT3. The structure of CPT-3 is shown below:

[0274] In some embodiments, the therapeutic agent is (S) -4-amino-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-1, 9, 12, 15-tetrahydro-13H-pyrano [4, 3, 2-de] pyrano [3' , 4' : 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13 (2H) -dione (CPT-4) . The structure of CPT-4 is shown below:

[0275] In some embodiments, the therapeutic agent is an auristatin, such as auristatin E (also known in the art as a derivative of dolastatin-10) or a derivative thereof. The auristatin can be, for example, an ester formed between auristatin E and a keto acid. For example, auristatin E can be reacted with paraacetyl benzoic acid or benzoylvaleric acid to produce AEB and AEVB, respectively. Other typical auristatins include AFP, MMAF, and MMAE. The synthesis and structure of exemplary auristatins are described in U.S. Patent Application Publication No. 2003-0083263; International Patent Publication No. WO 04 / 010957, International Patent Publication No. WO 02 / 088172, and U.S. Pat. Nos. 7,498,298, 6,884,869, 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; and 4,486,414, each of which is incorporated by reference herein in its entirety and for all purposes.

[0276] Auristatins have been shown to interfere with microtubule dynamics and nuclear and cellular division and have anticancer activity. Auristatins bind tubulin and can exert a cytotoxic or cytostatic effect on cancer cell. There are a number of different assays, known in the art, which can be used for determining whether an auristatin or resultant antibody-drug conjugate exerts a cytostatic or cytotoxic effect on a desired cell.

[0277] In some embodiments, the therapeutic agent is a chemotherapeutic agent. Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclosphosphamide (CYTOXANTM) ; alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan and piposulfan; aziridines such as benzodopa, carboquone, meturedopa, and uredopa; ethylenimines and methylamelamines including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphaoramide and trimethylolomelamine; nitrogen mustards such as chlorambucil, chlornaphazine, cholophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembichin, phenesterine, prednimustine, trofosfamide, uracil mustard; nitrosureas such as carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, ranimustine; antibiotics such as aclacinomysins, actinomycin, authramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, calicheamicin, carabicin, carminomycin, carzinophilin, chromomycins, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, doxorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycins, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; anti-metabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU) ; folic acid analogues such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; purine analogs such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine; pyrimidine analogs such as ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, floxuridine, 5-FU; androgens such as calusterone, dromostanolone propionate, epitiostanol, mepitiostane, testolactone; anti-adrenals such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane; folic acid replenisher such as frolinic acid; aceglatone; aldophosphamide glycoside; aminolevulinic acid; amsacrine; bestrabucil; bisantrene; edatraxate; defofamine; demecolcine; diaziquone; elfornithine; elliptinium acetate; etoglucid; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidamine; mitoguazone; mitoxantrone; mopidamol; nitracrine; pentostatin; phenamet; pirarubicin; podophyllinic acid; 2-ethylhydrazide; procarbazine; PSK7; razoxane; sizofiran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquone; 2’ , 2’ , 2’ -trichlorotriethylamine; urethan; vindesine; dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosine; arabinoside (“Ara-C” ) ; cyclophosphamide; taxanes, e.g. paclitaxel (  Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J. ) and doxetaxel (  Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France) ; chlorambucil; gemcitabine; 6-thioguanine; platinum analogs such as cisplatin and carboplatin; vinblastine; platinum; etoposide (VP-16) ; ifosfamide; mitomycin C; mitoxantrone; vincristine; vinorelbine; navelbine;novantrone; teniposide; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronate; CPT-11; topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluoromethylornithine (DMFO) ; retinoic acid; esperamicins; capecitabine; and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above. Also included in this definition are anti-hormonal agents that act to regulate or inhibit hormone action on tumors such as anti-estrogens including for example tamoxifen, raloxifene, aromatase inhibiting 4 (5) -imidazoles, 4-hydroxytamoxifen, trioxifene, keoxifene, LY117018, onapristone, and toremifene (Fareston) ; and anti-androgens such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide, and goserelin; and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above. A detailed description of the chemotherapeutic agents can be found in, e.g., US20180193477A1, which is incorporated by reference in its entirety.

[0278] In some embodiments, the antigen-binding construct is coupled to the drug via a cleavable linker e.g. a SPBD linker or a maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl (VC) linker. In some embodiments, the antigen-binding construct is coupled to the drug via a non-cleavable linker e.g. a MCC linker formed using SMCC or sulfo-SMCC. Selection of an appropriate linker for a given ADC can be readily made by the skilled person having knowledge of the art and taking into account relevant factors, such as the site of attachment to the antigen binding construct, any structural constraints of the drug and the hydrophobicity of the drug (see, for example, review in Nolting, Chapter 5, Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed. ) , Springer) . A number of specific linker-toxin combinations have been described and may be used with the antigen binding constructs described herein to prepare ADCs in certain embodiments. Examples include, but are not limited to, cleavable peptide-based linkers with auristatins such as MMAE and MMAF, camptothecins such as SN-38, duocarmycins and PBD dimers; non-cleavable MC-based linkers with auristatins MMAF and MMAE; acid-labile hydrazone-based linkers with calicheamicins and doxorubicin; disulfide-based linkers with maytansinoids such as DM1 and DM4, and bis-maleimido-trioxyethylene glycol (BMPEO) -based linkers with maytansinoid DM1. Some these therapeutic agents and linkers are described, e.g., in Peters&Brown, (2015) Biosci. Rep. e00225; Dosio et al., (2014) Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery 9: 35-65; US Patent Publication No. US 2015 / 0374847, and US20180193477A1; which are incorporated herein by reference in the entirety.

[0279] Linker-Therapeutic agent compound

[0280] In some embodiments, a linker (e.g., any of the linkers described herein) and a therapeutic agent (e.g., any of the therapeutic agents described herein) can be linked to form a “linker-therapeutic agent” compound.

[0281] In some embodiments, the linker-therapeutic agent compound has the following structure:

[0282] In some embodiments, the linker-therapeutic agent compound has the following structure:

[0283] In some embodiments, an antibody ( “Ab” ) , e.g., any of the antibodies or the antigen-binding fragments thereof described herein, can be linked to a linker-therapeutic agent compound (e.g., any of the linker-therapeutic agent compounds described herein) to generate an antibody-drug conjugate. In some embodiments, the antibody-drug conjugate has the following structure:

[0284] wherein n=1-8. In some embodiments, n=1-8. In some embodiments, n is about 1, about 2, about 3, about 4, about 5, about 6, about 7, about 8. In some embodiments, n is about 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-8, 5-7, 5-6, 6-8, 6-7, or 7-8. In some embodiments, n is an integral or non-integral multiple of one.

[0285] In some embodiments, the anti-DLL3 / SEZ6 antibody is coupled to the drug via a cleavable linker e.g. a SPBD linker or a maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl (VC) linker. In some embodiments, the anti-DLL3 / SEZ6 antibody is coupled to the drug via a non-cleavable linker e.g. a MCC linker formed using SMCC or sulfo-SMCC. Selection of an appropriate linker for a given ADC can be readily made by the skilled person having knowledge of the art and taking into account relevant factors, such as the site of attachment to the anti-DLL3 / SEZ6 antibody, any structural constraints of the drug and the hydrophobicity of the drug (see, for example, review in Nolting, Chapter 5, Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed. ) , Springer) . A number of specific linker-toxin combinations have been described and may be used with the anti-DLL3 / SEZ6 antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein to prepare ADCs in certain embodiments. Examples include, but are not limited to, cleavable peptide-based linkers with auristatins such as MMAE and MMAF, camptothecins such as SN-38, duocarmycins and PBD dimers; non-cleavable MC-based linkers with auristatins MMAF and MMAE; acid-labile hydrazone-based linkers with calicheamicins and doxorubicin; disulfide-based linkers with maytansinoids such as DM1 and DM4, and bis-maleimido-trioxyethylene glycol (BMPEO) -based linkers with maytansinoid DM1. Some these therapeutic agents and linkers are described, e.g., in Peters&Brown, (2015) Biosci. Rep. e00225; Dosio et al., (2014) Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery 9: 35-65; US Patent Publication No. US 2015 / 0374847, and US20180193477A1; which are incorporated herein by reference in the entirety.

[0286] Depending on the desired drug and selected linker, those skilled in the art can select suitable method for coupling them together. For example, some conventional coupling methods, such as amine coupling methods, can be used to form the desired drug-linker complex which still contains reactive groups for conjugating to the antibodies through covalent linkage. In some embodiments, a drug-maleimide complex (i.e., maleimide linking drug) can be used for the payload bearing reactive group in the present disclosure. Most common reactive group capable of bonding to thiol group in ADC preparation is maleimide. Additionally, organic bromides, iodides also are frequently used.

[0287] The ADC can be prepared by one of several routes known in the art, employing organic chemistry reactions, conditions, and reagents known to those skilled in the art (see, for example, Bioconjugate Techniques (G. T. Hermanson, 2013, Academic Press) . For example, conjugation can be achieved by (1) reaction of a nucleophilic group or an electrophilic group of an antibody with a bivalent linker reagent, to form antibody-linker intermediate Ab-L, via a covalent bond, followed by reaction with an activated drug moiety D; or (2) reaction of a nucleophilic group or an electrophilic group of a drug moiety with a linker reagent, to form drug-linker intermediate D-L, via a covalent bond, followed by reaction with the nucleophilic group or an electrophilic group of an antibody. Conjugation methods (1) and (2) can be employed with a variety of antibodies, drug moieties, and linkers to prepare the ADCs described here. Various prepared linkers, linker components and toxins are commercially available or may be prepared using standard synthetic organic chemistry techniques. These methods are described e.g., in March’s Advanced Organic Chemistry (Smith&March, 2006, Sixth Ed., Wiley) ; Toki et al., (2002) J. Org. Chem. 67: 1866-1872; Frisch et al., (1997) Bioconj. Chem. 7: 180-186; Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press) ; US20210379193A1, and US20180193477A1, which are incorporated herein by reference in the entirety. In addition, a number of pre-formed drug-linkers suitable for reaction with a selected antigen binding construct are also available commercially, for example, linker-toxins comprising DM1, DM4, MMAE, MMAF or Duocarmycin SA are available from Creative BioLabs (Shirley, N.Y. ) .

[0288] Several specific examples of methods of preparing ADCs are known in the art and are described in U.S. Pat. No. 8,624,003 (pot method) , U.S. Pat. No. 8,163,888 (one-step) , and U.S. Pat. No. 5,208,020 (two-step method) , and US20180193477A1, which are incorporated herein by reference in the entirety. Other methods are known in the art and include those described in Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed. ) , Springer.

[0289] Drug loading is represented by the number of drug moieties per antibody in a molecule of ADC. For some antibody-drug conjugates, the drug loading may be limited by the number of attachment sites on the antibody. For example, where the attachment is a cysteine thiol, as in certain exemplary embodiments described herein, the drug loading may range from 0 to 8 drug moieties per antibody. In certain embodiments, higher drug loading, e.g. p≥5, may cause aggregation, insolubility, toxicity, or loss of cellular permeability of certain antibody-drug conjugates. In certain embodiments, the average drug loading for an antibody-drug conjugate ranges from 1 to about 8; from about 2 to about 6; or from about 3 to about 5. Indeed, it has been shown that for certain antibody-drug conjugates, the optimal ratio of drug moieties per antibody can be around 4. In some embodiments, the DAR is about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8. In some embodiments, the average DAR in the composition is about 1～about 2, about 2～about 3, about 3～about 4, about 4～about 5, about 5～about 6, about 6～about 7, or about 7～about 8.

[0290] Antibody and ADC Characteristics

[0291] The anti-DLL3 antigen-binding protein construct (e.g., antibodies, bispecific antibodies, or antibody fragments thereof) or ADC derived therefrom can include an antigen-binding region that is derived from any anti-DLL3 antibody or any antigen-binding fragment thereof as described herein.

[0292] General techniques can be used to measure the affinity of an antibody for an antigen include, e.g., ELISA, RIA, and surface plasmon resonance (SPR) . Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some implementations, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein construct (e.g., bispecific antibody) , can bind to DLL3 (e.g., human DLL3, dog DLL3, monkey DLL3, and / or mouse DLL3) with a dissociation rate (koff) of less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.0001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.0001 s-1, or greater than 0.00001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is less than 7 x 10-4 s-1.

[0293] In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 x 102 / Ms, greater than 1 x 103 / Ms, greater than 1 x 104 / Ms, greater than 1 x 105 / Ms, or greater than 1 x 106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 x 105 / Ms, less than 1 x 106 / Ms, or less than 1 x 107 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1.3 x 105 / Ms.

[0294] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein construct (e.g., bispecific antibody) can bind to DLL3 (e.g., human DLL3, dog DLL3, monkey DLL3, and / or mouse DLL3) with a KD ofless than 1 x 10-6M, less than 1 x 10-7M, less than 1 x 10-8 M, less than 1 x 10-9 M, or less than 1 x 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, KD is greater than 1 x 10-7M, greater than 1 x 10-8M, greater than 1 x 10-9 M, or greater than 1 x 10-10 M.

[0295] In some implementations, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibody) can bind to SEZ6 (e.g., human SEZ6, dog SEZ6, monkey SEZ6, and / or mouse SEZ6) with a dissociation rate (koff) ofless than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.0001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.0001 s-1, or greater than 0.00001 s-1.

[0296] In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 x 102 / Ms, greater than 1 x 103 / Ms, greater than 1 x 104 / Ms, greater than 1 x 105 / Ms, or greater than 1 x 106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 x 105 / Ms, less than 1 x 106 / Ms, or less than 1 x 107 / Ms.

[0297] Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 x 10-6M, less than 1 x 10-7M, less than 1 x 10-8 M, less than 1 x 10-9 M, or less than 1 x 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, KD is greater than 1 x 10-7 M, greater than 1 x 10-8M, greater than 1 x 10-9 M, greater than 1 x 10-10 M, greater than 1 x 10-11 M, or greater than 1 x 10-12 M. In some embodiments, the antibody binds to human SEZ6 with KD less than or equal to about 15 nM or 10 nM.

[0298] Because the antigen-binding protein construct (e.g., bispecific antibody) binds to both DLL3 and SEZ6, for cells that express both DLL3 and SEZ6, the antigen-binding protein construct has a higher binding affinity to these cells. Avidity can be used to measure the binding affinity of an antigen-binding protein construct to these cells. Avidity is the accumulated strength of multiple affinities of individual non-covalent binding interactions.

[0299] Thermal stabilities can also be determined. The antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibody) , or the ADC derived therefrom as described herein can have a Tm greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95℃. As IgG can be described as a multi-domain protein, the melting curve sometimes shows two transitions, with a first denaturation temperature, Tm D1, and a second denaturation temperature Tm D2. The presence of these two peaks often indicate the denaturation of the Fc domains (Tm D1) and Fab domains (Tm D2) , respectively. When there are two peaks, Tm usually refers to Tm D2. Thus, in some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments as described herein has a Tm D1 greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95℃. In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments as described herein has a Tm D2 greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95℃. In some embodiments, Tm, Tm D1, Tm D2 are less than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95℃.

[0300] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., the anti-DLL3 antibody, the anti-SEZ6 antibody, or the bispecific antibody) , or the ADC derived therefrom, have an endocytosis rate in cells that is at least 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. In some embodiments, the endocytosis rate that is less than 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%.

[0301] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibody) , or the ADC derived therefrom, can bind to dog DLL3, monkey DLL3, or mouse DLL3. In some embodiments, the binding is measured by the percentage of positive cells as determined by FACS. In some embodiments, the percentage of positive cells is greater than 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. In some embodiments, the percentage of positive cells is less than 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibody) , or the ADC derived therefrom, cannot bind to dog DLL3, monkey DLL3, or mouse DLL3.

[0302] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibody) , or the ADC derived therefrom, can bind to dog SEZ6, monkey SEZ6, or mouse SEZ6. In some embodiments, the binding is measured by the percentage of positive cells as determined by FACS. In some embodiments, the percentage of positive cells is greater than 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. In some embodiments, the percentage of positive cells is less than 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibody) , or the ADC derived therefrom, cannot bind to dog SEZ6, monkey SEZ6, or mouse SEZ6.

[0303] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., the anti-DLL3 antibody, the anti-SEZ6 antibody, or the bispecific antibody) , or the ADC derived therefrom, has a purity that is greater than 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by HPLC. In some embodiments, the antibodies, the purity is less than 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by HPLC.

[0304] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., the anti-DLL3 antibody, the anti-SEZ6 antibody, or the bispecific antibody) , or or the ADC derived therefrom, has a yield that is greater than 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, or 700 (μg / mL) . In some embodiments, the yield is less than 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, or 700 (μg / mL) .

[0305] In some embodiments, the stability of the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., the anti-DLL3 antibody, the anti-SEZ6 antibody, or the bispecific antibody) , or the ADC derived therefrom, is measured by the Capillary Isoelectric Focusing (cIEF) method (indicated as the percentages of the main component, acidic component, and alkaline component) . In some embodiments, the percentage of the main component is greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, after being subject to various conditions e.g., as measured by cIEF.

[0306] In some embodiments, the condition is storing at 4℃ for at least or about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 days, storing at 25℃ for at least or about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 days, or storing at 40℃ for at least or about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 days. In some embodiments, the condition is freeze-thaw for at least or about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, or 50 times. In some embodiments, the condition is storing the composition at pH3.5 for about or at least 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 hours. In some embodiments, after the treatment, the percentage of the acidic component is greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by cIEF. In some embodiments, after the treatment, the percentage of the alkaline component is greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by cIEF. In some embodiments, after the treatment, the percentage of the main component is less than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by cIEF. In some embodiments, the percentage of the acidic component is less than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by cIEF. In some embodiments, the percentage of the alkaline component is less than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by cIEF.

[0307] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., the anti-DLL3 antibody, the anti-SEZ6 antibody, or the bispecific antibody) , or the ADC derived therefrom, has a tumor growth inhibition percentage (TGI%) that is greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200%. In some embodiments, the antibody has a tumor growth inhibition percentage that is less than 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200%. The TGI%can be determined, e.g., at 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 days after the treatment starts, or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 months after the treatment starts. As used herein, the tumor growth inhibition percentage (TGI%) is calculated using the following formula:

[0308] TGI (%) = [1- (Ti-T0)  /  (Vi-V0) ] ×100

[0309] Ti is the average tumor volume in the treatment group on day i. T0 is the average tumor volume in the treatment group on day zero. Vi is the average tumor volume in the control group on day i. V0 is the average tumor volume in the control group on day zero.

[0310] In some embodiments, the antibody, the antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct (e.g., bispecific antibody) has a functional Fc region. In some embodiments, effector function of a functional Fc region is antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) . In some embodiments, effector function of a functional Fc region is phagocytosis. In some embodiments, effector function of a functional Fc region is ADCC and phagocytosis. In some embodiments, the Fc region is human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4. In some embodiments, one or both mutations S239D and / or I332E (SI mutations) are introduced in antibody Fc region to enhance the antibody affinity to FcγRIIIA, thereby increasing ADCC effects. A detailed description of SI mutations can be found in US7662925, which is incorporated by reference in their entirety.

[0311] In some embodiments, the antibody, the antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct (e.g., bispecific antibody) does not have a functional Fc region. For example, the antibodies or antigen binding fragments are Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, and Fv fragments.

[0312] In some embodiments, the antibody, the antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct (e.g., bispecific antibody) is incorporated in an antibody drug conjugate.

[0313] Recombinant Vectors

[0314] The present disclosure also provides recombinant vectors (e.g., expression vectors) that include an isolated polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) , host cells into which are introduced the recombinant vectors (i.e., such that the host cells contain the polynucleotide and / or a vector comprising the polynucleotide) , and the production of recombinant antibody polypeptides or fragments thereof by recombinant techniques.

[0315] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more polynucleotide (s) of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more polynucleotide (s) of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-A tail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector.

[0316] A vector can be introduced into the host cell by methods known in the art, e.g., electroporation, chemical transfection (e.g., DEAE-dextran) , transformation, transfection, and infection and / or transduction (e.g., with recombinant virus) . Thus, non-limiting examples of vectors include viral vectors (which can be used to generate recombinant virus) , naked DNA or RNA, plasmids, cosmids, phage vectors, and DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents.

[0317] In some implementations, a polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) is introduced using a viral expression system (e.g., vaccinia or other pox virus, retrovirus, or adenovirus) , which may involve the use of a non-pathogenic (defective) , replication competent virus, or may use a replication defective virus. In the latter case, viral propagation generally will occur only in complementing virus packaging cells. Suitable systems are disclosed, for example, in Fisher-Hoch et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N. Y. Acad Sci. 569: 86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine, 8: 17-21; U.S. Pat. Nos. 4,603,112, 4,769,330, and 5,017,487; WO 89 / 01973; U.S. Pat. No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91 / 02805; Berkner-Biotechniques, 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252: 431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88: 2838-2848; and Guzman et al., 1993, Cir. Res., 73: 1202-1207. Techniques for incorporating DNA into such expression systems are well known to those of ordinary skill in the art. The DNA may also be “naked, ” as described, for example, in Ulmer et al., 1993, Science, 259: 1745-1749, and Cohen, 1993, Science, 259: 1691-1692. The uptake of naked DNA may be increased by coating the DNA onto biodegradable beads that are efficiently transported into the cells.

[0318] For expression, the DNA insert comprising an antibody-encoding or polypeptide-encoding polynucleotide disclosed herein can be operatively linked to an appropriate promoter (e.g., a heterologous promoter) , such as the phage lambda PL promoter, the E. coli lac, trp and tac promoters, the SV40 early and late promoters and promoters of retroviral LTRs, to name a few. Other suitable promoters are known to the skilled artisan. The expression constructs can further contain sites for transcription initiation, termination and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the mature transcripts expressed by the constructs may include a translation initiating at the beginning and a termination codon (UAA, UGA, or UAG) appropriately positioned at the end of the polypeptide to be translated.

[0319] As indicated, the expression vectors can include at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture and tetracycline or ampicillin resistance genes for culturing in E. coli and other bacteria. Representative examples of appropriate hosts include, but are not limited to, bacterial cells, such as E. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium cells; fungal cells, such as yeast cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells such as CHO, COS, Bowes melanoma, and HK 293 cells; and plant cells. Appropriate culture mediums and conditions for the host cells described herein are known in the art.

[0320] Non-limiting vectors for use in bacteria include pQE70, pQE60 and pQE-9, available from Qiagen; pBS vectors, Phagescript vectors, Bluescript vectors, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, available from Stratagene; and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 available from Pharmacia. Non-limiting eukaryotic vectors include pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG available from Stratagene; and pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL available from Pharmacia. Other suitable vectors will be readily apparent to the skilled artisan.

[0321] Non-limiting bacterial promoters suitable for use include the E. coli lacI and lacZ promoters, the T3 and T7 promoters, the gpt promoter, the lambda PR and PL promoters and the trp promoter. Suitable eukaryotic promoters include the CMV immediate early promoter, the HSV thymidine kinase promoter, the early and late SV40 promoters, the promoters of retroviral LTRs, such as those of the Rous sarcoma virus (RSV) , and metallothionein promoters, such as the mouse metallothionein-I promoter.

[0322] In the yeast Saccharomyces cerevisiae, a number of vectors containing constitutive or inducible promoters such as alpha factor, alcohol oxidase, and PGH may be used. For reviews, see Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, N. Y, and Grant et al., Methods Enzymol., 153: 516-544 (1997) .

[0323] Introduction of the construct into the host cell can be effected by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals, such as Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) , which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0324] Transcription of DNA encoding an antibody of the present disclosure by higher eukaryotes may be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about from 10 to 300 bp that act to increase transcriptional activity of a promoter in a given host cell-type. Examples of enhancers include the SV40 enhancer, which is located on the late side of the replication origin at base pairs 100 to 270, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers.

[0325] For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space or into the extracellular environment, appropriate secretion signals may be incorporated into the expressed polypeptide. The signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous signals.

[0326] The polypeptide (e.g., antibody) can be expressed in a modified form, such as a fusion protein (e.g., a GST-fusion) or with a histidine-tag, and may include not only secretion signals, but also additional heterologous functional regions. For instance, a region of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be added to the N-terminus of the polypeptide to improve stability and persistence in the host cell, during purification, or during subsequent handling and storage. Also, peptide moieties can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. The addition of peptide moieties to polypeptides to engender secretion or excretion, to improve stability and to facilitate purification, among others, are familiar and routine techniques in the art.

[0327] The disclosure also provides a nucleic acid sequence that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identical to any nucleotide sequence as described herein, and an amino acid sequence that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identical to any amino acid sequence as described herein.

[0328] The disclosure also provides a nucleic acid sequence that has a homology of at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%to any nucleotide sequence as described herein, and an amino acid sequence that has a homology of at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%to any amino acid sequence as described herein.

[0329] In some embodiments, the disclosure relates to nucleotide sequences encoding any peptides that are described herein, or any amino acid sequences that are encoded by any nucleotide sequences as described herein. In some embodiments, the nucleic acid sequence is less than 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, or 600 nucleotides. In some embodiments, the amino acid sequence is less than 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, or 400 amino acid residues.

[0330] In some embodiments, the amino acid sequence (i) comprises an amino acid sequence; or (ii) consists of an amino acid sequence, wherein the amino acid sequence is any one of the sequences as described herein.

[0331] In some embodiments, the nucleic acid sequence (i) comprises a nucleic acid sequence; or (ii) consists of a nucleic acid sequence, wherein the nucleic acid sequence is any one of the sequences as described herein.

[0332] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position (as used herein amino acid or nucleic acid “identity” is equivalent to amino acid or nucleic acid “homology” ) . The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0333] The percentage of sequence homology (e.g., amino acid sequence homology or nucleic acid homology) can also be determined. How to determine percentage of sequence homology is known in the art. In some embodiments, amino acid residues conserved with similar physicochemical properties (percent homology) , e.g. leucine and isoleucine, can be used to measure sequence similarity. Families of amino acid residues having similar physicochemical properties have been defined in the art. These families include e.g., amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine) , nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan) , beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . The homology percentage, in many cases, is higher than the identity percentage.

[0334] The disclosure provides one or more nucleic acid encoding any of the polypeptides as described herein. In some embodiments, the nucleic acid (e.g., cDNA) includes a polynucleotide encoding a polypeptide of a heavy chain as described herein. In some embodiments, the nucleic acid includes a polynucleotide encoding a polypeptide of a light chain as described herein. In some embodiments, the nucleic acid includes a polynucleotide encoding a scFv polypeptide as described herein.

[0335] In some embodiments, the vector can have two of the nucleic acids as described herein, wherein the vector encodes the VL region and the VH region that together bind to DLL3. In some embodiments, apair of vectors is provided, wherein each vector comprises one of the nucleic acids as described herein, wherein together the pair of vectors encodes the VL region and the VH region that together bind to DLL3. In some embodiments, the vector includes two of the nucleic acids as described herein, wherein the vector encodes the VL region and the VH region that together bind to SEZ6. In some embodiments, a pair of vectors is provided, wherein each vector comprises one of the nucleic acids as described herein, wherein together the pair of vectors encodes the VL region and the VH region that together bind to SEZ6. In some embodiments, the VL regions are identical. In some embodiments, the VL regions are not identical.

[0336] Vectors can also be constructed to express specific antibodies or polypeptides. In some embodiments, a vector can be constructed to co-express anti-DLL3 antibody light chain (DLL3-K) and heavy chain (DLL3-H) . In some embodiments, a vector can contain sequences of, from 5’ end to 3’ end, cytomegalovirus promotor (CMV) , DLL3-K, polyadenylation (PolyA) , CMV, DLL3-H, PolyA, simian vacuolating virus 40 terminator (SV40) and glutamine synthetase marker (GS) . In some embodiments, a vector can be constructed to co-express anti-SEZ6 antibody light chain (SEZ6-K) and anti-SEZ6 antibody heavy chain (SEZ6-H) . In some embodiments, a vector can contain sequences of, from 5’ end to 3’ end, CMV, SEZ6-K, PolyA, CMV, SEZ6-H, SV40 and GS. In some embodiments, a vector can be constructed to express anti-SEZ6 antibody scFv polypeptide chain.

[0337] Methods of Making Antibodies, Antigen Binding Fragments And Antigen Binding Protein Constructs

[0338] An isolated fragment of human protein can be used as an immunogen to generate antibodies using standard techniques for polyclonal and monoclonal antibody preparation. Polyclonal antibodies can be raised in animals by multiple injections (e.g., subcutaneous or intraperitoneal injections) of an antigenic peptide or protein. In some embodiments, the antigenic peptide or protein is injected with at least one adjuvant. In some embodiments, the antigenic peptide or protein can be conjugated to an agent that is immunogenic in the species to be immunized. Animals can be injected with the antigenic peptide or protein more than one time (e.g., twice, three times, or four times) .

[0339] The full-length polypeptide or protein can be used or, alternatively, antigenic peptide fragments thereof can be used as immunogens. The antigenic peptide of a protein comprises at least 8 (e.g., at least 10, 15, 20, or 30) amino acid residues of the amino acid sequence of the protein and encompasses an epitope of the protein such that an antibody raised against the peptide forms a specific immune complex with the protein.

[0340] An immunogen typically is used to prepare antibodies by immunizing a suitable subject (e.g., human or transgenic animal expressing at least one human immunoglobulin locus) . An appropriate immunogenic preparation can contain, for example, a recombinantly-expressed or a chemically-synthesized polypeptide. The preparation can further include an adjuvant, such as Freund’s complete or incomplete adjuvant, or a similar immunostimulatory agent.

[0341] Polyclonal antibodies can be prepared as described above by immunizing a suitable subject with a polypeptide, or an antigenic peptide thereof (e.g., part of the protein) as an immunogen. The antibody titer in the immunized subject can be monitored over time by standard techniques, such as with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the immobilized polypeptide or peptide. If desired, the antibody molecules can be isolated from the mammal (e.g., from the blood) and further purified by well-known techniques, such as protein A or protein G chromatography to obtain the IgG fraction. At an appropriate time after immunization, e.g., when the specific antibody titers are highest, antibody-producing cells can be obtained from the subject and used to prepare monoclonal antibodies by standard techniques, such as the hybridoma technique originally described by Kohler et al. (Nature 256: 495-497, 1975) , the human B cell hybridoma technique (Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72, 1983) , the EBV-hybridoma technique (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985) , or trioma techniques. The technology for producing hybridomas is well known (see, generally, Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds. ) , John Wiley&Sons, Inc., New York, NY) . Hybridoma cells producing a monoclonal antibody are detected by screening the hybridoma culture supernatants for antibodies that bind the polypeptide or epitope of interest, e.g., using a standard ELISA assay.

[0342] Variants of the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the DNA encoding a human, humanized, or chimeric antibody, or antigen-binding fragment thereof described herein, or by peptide synthesis. Such variants include, for example, deletions, insertions, or substitutions of residues within the amino acids sequences that make-up the antigen-binding site of the antibody or an antigen-binding domain. In a population of such variants, some antibodies or antigen-binding fragments will have increased affinity for the target protein. Any combination of deletions, insertions, and / or combinations can be made to arrive at an antibody or antigen-binding fragment thereof that has increased binding affinity for the target. The amino acid changes introduced into the antibody or antigen-binding fragment can also alter or introduce new post-translational modifications into the antibody or antigen-binding fragment, such as changing (e.g., increasing or decreasing) the number of glycosylation sites, changing the type of glycosylation site (e.g., changing the amino acid sequence such that a different sugar is attached by enzymes present in a cell) , or introducing new glycosylation sites.

[0343] Antibodies disclosed herein can be derived from any species of animal, including mammals. Non-limiting examples of native antibodies include antibodies derived from humans, primates, e.g., monkeys and apes, cows, pigs, horses, sheep, camelids (e.g., camels and llamas) , chicken, goats, and rodents (e.g., rats, mice, hamsters and rabbits) , including transgenic rodents genetically engineered to produce human antibodies.

[0344] Phage display (panning) can be used to optimize antibody sequences with desired binding affinities. In this technique, a gene encoding single chain Fv (comprising VH or VL) can be inserted into a phage coat protein gene, causing the phage to "display" the scFv on its outside while containing the gene for the protein on its inside, resulting in a connection between genotype and phenotype. These displaying phages can then be screened against target antigens, in order to detect interaction between the displayed antigen binding sites and the target antigen. Thus, large libraries of proteins can be screened and amplified in a process called in vitro selection, and antibodies sequences with desired binding affinities can be obtained.

[0345] Human and humanized antibodies include antibodies having variable and constant regions derived from (or having the same amino acid sequence as those derived from) human germline immunoglobulin sequences. Human antibodies may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo) , for example in the CDRs.

[0346] In some embodiments, a covalent modification can be made to the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) . These covalent modifications can be made by chemical or enzymatic synthesis, or by enzymatic or chemical cleavage. Other types of covalent modifications of the antibody or antibody fragment are introduced into the molecule by reacting targeted amino acid residues of the antibody or fragment with an organic derivatization agent that is capable of reacting with selected side chains or the N-or C-terminal residues.

[0347] In some embodiments, antibody variants are provided having a carbohydrate structure that lacks fucose attached (directly or indirectly) to an Fc region. For example, the amount of fucose in such antibody may be from 1%to 80%, from 1%to 65%, from 5%to 65%or from 20%to 40%. The amount of fucose is determined by calculating the average amount of fucose within the sugar chain at Asn297, relative to the sum of all glycostructures attached to Asn 297 (e.g. complex, hybrid and high mannose structures) as measured by MALDI-TOF mass spectrometry, as described in WO 2008 / 077546, for example. Asn297 refers to the asparagine residue located at about position 297 in the Fc region (Eu numbering of Fc region residues; or position 314 in Kabat numbering) ; however, Asn297 may also be located about±3 amino acids upstream or downstream of position 297, i.e., between positions 294 and 300, due to minor sequence variations in antibodies. Such fucosylation variants may have improved ADCC function. In some embodiments, to reduce glycan heterogeneity, the Fc region of the antibody can be further engineered to replace the Asparagine at position 297 with Alanine (N297A) .

[0348] In some embodiments, to facilitate production efficiency by avoiding Fab-arm exchange, the Fc region of the antibodies was further engineered to replace the serine at position 228 (EU numbering) of IgG4 with proline (S228P) . A detailed description regarding S228 mutation is described, e.g., in Silva et al., "The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation. " Journal of Biological Chemistry 290.9 (2015) : 5462-5469, which is incorporated by reference in its entirety.

[0349] In some embodiments, the methods described here are designed to make a bispecific antibody. Bispecific antibodies can be made by engineering the interface between a pair of antibody molecules to maximize the percentage of heterodimers that are recovered from recombinant cell culture. For example, the interface can contain at least a part of the CH3 domain of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (e.g., tyrosine or tryptophan) . Compensatory “cavities” of identical or similar size to the large side chain (s) are created on the interface of the second antibody molecule by replacing large amino acid side chains with smaller ones (e.g., alanine or threonine) . This provides a mechanism for increasing the yield of the heterodimer over other unwanted end-products such as homodimers. This method is described, e.g., in WO 96 / 27011, which is incorporated by reference in its entirety.

[0350] In some embodiments, knob-into-hole (KIH) technology can be used, which involves engineering CH3 domains to create either a “knob” or a “hole” in each heavy chain to promote heterodimerization. The KIH technique is described e.g., in Xu, Yiren, et al., "Production of bispecific antibodies in ‘knobs-into-holes’ using a cell-free expression system. " MAbs. Vol. 7. No. 1. Taylor&Francis, 2015, which is incorporated by reference in its entirety. In some embodiments, one heavy chain has a T366W, and / or S354C (knob) substitution (EU numbering) , and the other heavy chain has an Y349C, T366S, L368A, and / or Y407V (hole) substitution (EU numbering) . In some embodiments, one heavy chain has one or more of the following substitutions Y349C and T366W (EU numbering) . The other heavy chain can have one or more the following substitutions E356C, T366S, L368A, and Y407V (EU numbering) . Furthermore, a substitution (-ppcpScp->-ppcpPcp-) can also be introduced at the hinge regions of both substituted IgG.

[0351] Furthermore, an anion-exchange chromatography can be used to purify bispecific antibodies. Anion-exchange chromatography is a process that separates substances based on their charges using an ion-exchange resin containing positively charged groups, such as diethyl-aminoethyl groups (DEAE) . In solution, the resin is coated with positively charged counter-ions (cations) . Anion exchange resins will bind to negatively charged molecules, displacing the counter-ion. Anion exchange chromatography can be used to purify proteins based on their isoelectric point (pI) . The isoelectric point is defined as the pH at which a protein has no net charge. When the pH>pI, a protein has a net negative charge and when the pH<pI, a protein has a net positive charge. Thus, in some embodiments, different amino acid substitution can be introduced into two heavy chains, so that the pI for the homodimer comprising two Arm DLL3 and the pI for the homodimer comprising two Arm SEZ6 is different. The pI for the bispecific antibody having Arm DLL3 and Arm SEZ6 will be somewhere between the two pIs of the homodimers. Thus, the two homodimers and the bispecific antibody can be released at different pH conditions. The present disclosure shows that a few amino acid residue substitutions can be introduced to the heavy chains to adjust pI.

[0352] Bispecific antibodies can also include e.g., cross-linked or “heteroconjugate” antibodies. For example, one of the antibodies in the heteroconjugate can be coupled to avidin and the other to biotin. Heteroconjugate antibodies can also be made using any convenient cross-linking methods. Suitable cross-linking agents and cross-linking techniques are well known in the art and are disclosed in U.S. Patent No. 4,676,980, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0353] Methods of Treatment

[0354] The methods described herein include methods for the treatment of disorders associated with cancer. Generally, the methods include administering a therapeutically effective amount of engineered antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) , or the antibody drug conjugates as described herein, to a subject who is in need of, or who has been determined to be in need of, such treatment.

[0355] As used in this context, to “treat” means to ameliorate at least one symptom of the disorder associated with cancer. Often, cancer results in death; thus, a treatment can result in an increased life expectancy (e.g., by at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 months, or by at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 years) . Administration of a therapeutically effective amount of an agent described herein for the treatment of a condition associated with cancer will result in decreased number of cancer cells and / or alleviated symptoms.

[0356] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for autonomous growth, i.e., an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include all types of cancerous growths or oncogenic processes, metastatic tissues or malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. The term “tumor” as used herein refers to cancerous cells, e.g., a mass of cancerous cells. Cancers that can be treated or diagnosed using the methods described herein include malignancies of the various organ systems, such as affecting lung, breast, thyroid, lymphoid, gastrointestinal, and genito-urinary tract, as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, non-small cell carcinoma of the lung, cancer of the small intestine and cancer of the esophagus. In some embodiments, the agents described herein are designed for treating or diagnosing a carcinoma in a subject. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues including respiratory system carcinomas, gastrointestinal system carcinomas, genitourinary system carcinomas, testicular carcinomas, breast carcinomas, prostatic carcinomas, endocrine system carcinomas, and melanomas. In some embodiments, the cancer is renal carcinoma or melanoma. Exemplary carcinomas include those forming from tissue of the esophageal, cervix, lung, prostate, breast, head and neck, colon and ovary. The term also includes carcinosarcomas, e.g., which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation. In some embodiments, the cancer is a chemotherapy resistant cancer.

[0357] In one aspect, the disclosure also provides methods for treating a cancer in a subject, methods of reducing the rate of the increase of volume of a tumor in a subject over time, methods of reducing the risk of developing a metastasis, or methods of reducing the risk of developing an additional metastasis in a subject. In some embodiments, the treatment can halt, slow, retard, or inhibit progression of a cancer. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of in the number, severity, and / or duration of one or more symptoms of the cancer in a subject.

[0358] In one aspect, the disclosure features methods that include administering a therapeutically effective amount of antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies) , or an antibody drug conjugate described herein to a subject in need thereof, e.g., a subject having, or identified or diagnosed as having, a cancer, e.g., breast cancer, carcinoid, cervical cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, renal cancer, skin cancer, stomach cancer, esophageal carcinoma, testis cancer, thyroid cancer, or urothelial cancer.

[0359] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present invention is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated by the present invention. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals. In some embodiments, the subject is a human. In some embodiments, the subject is a dog.

[0360] In some embodiments, the cancer is lung cancer (e.g., NSCLC, SCLC) , thyroid cancer, urothelial cancer, breast cancer, colorectal cancer, renal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, skin cancer, stomach cancer, esophageal carcinoma, pancreatic cancer, prostate cancer, liver cancer, lymphoma, or glioma.

[0361] In some embodiments, the compositions and methods disclosed herein can be used for treatment of patients at risk for a cancer. Patients with cancer can be identified with various methods known in the art.

[0362] As used herein, by an “effective amount” is meant an amount or dosage sufficient to effect beneficial or desired results including halting, slowing, retarding, or inhibiting progression of a disease, e.g., a cancer. An effective amount will vary depending upon, e.g., an age and a body weight of a subject to which the antibody, antigen binding fragment, antibody-drug conjugates, antibody-encoding polynucleotide, vector comprising the polynucleotide, and / or compositions thereof is to be administered, a severity of symptoms and a route of administration, and thus administration can be determined on an individual basis.

[0363] An effective amount can be administered in one or more administrations. By way of example, an effective amount of an antibody, an antigen binding fragment, or an antibody-drug conjugate is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, inhibit, slow and / or delay progression of an autoimmune disease or a cancer in a patient or is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, slow and / or delay proliferation of a cell (e.g., a biopsied cell, any of the cancer cells described herein, or cell line (e.g., a cancer cell line) ) in vitro. As is understood in the art, an effective amount of an antibody, antigen binding fragment, or antibody-drug conjugate may vary, depending on, inter alia, patient history as well as other factors such as the type (and / or dosage) of the composition used.

[0364] Effective amounts and schedules for administering the antibodies, antibody-encoding polynucleotides, antibody-drug conjugates, and / or compositions disclosed herein may be determined empirically, and making such determinations is within the skill in the art. Those skilled in the art will understand that the dosage that must be administered will vary depending on, for example, the mammal that will receive the antibodies, antibody-encoding polynucleotides, antibody-drug conjugates, and / or compositions disclosed herein, the route of administration, the particular type of antibodies, antibody-encoding polynucleotides, antigen binding fragments, antibody-drug conjugates, and / or compositions disclosed herein used and other drugs being administered to the mammal.

[0365] A typical daily dosage of an effective amount of an antibody, the antigen-binding fragment thereof, the antigen-binding protein construct (e.g., a bispecific antibody) or the antibody drug conjugate is 0.01 mg / kg to 100 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be less than 100 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be greater than 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, 0.1 mg / kg, 0.05 mg / kg, or 0.01 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about or at least 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.9 mg / kg, 0.8 mg / kg, 0.7 mg / kg, 0.6 mg / kg, 0.5 mg / kg, 0.4 mg / kg, 0.3 mg / kg, 0.2 mg / kg, or 0.1 mg / kg.

[0366] In any of the methods described herein, the at least one antibody, the antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct (e.g., a bispecific antibody) , antibody-drug conjugates, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding fragments, antibody-drug conjugates, or pharmaceutical compositions described herein) and, optionally, at least one additional therapeutic agent can be administered to the subject at least once a week (e.g., once a week, twice a week, three times a week, four times a week, once a day, twice a day, or three times a day) . In some embodiments, at least two different antibodies and / or antigen-binding fragments are administered in the same composition (e.g., a liquid composition) . In some embodiments, at least one antibody, the antigen-binding fragment thereof, the antigen-binding protein construct (e.g., a bispecific antibody) , or antibody-drug conjugate, and at least one additional therapeutic agent are administered in the same composition (e.g., a liquid composition) . In some embodiments, the at least one antibody or antigen-binding fragment and the at least one additional therapeutic agent are administered in two different compositions (e.g., a liquid composition containing at least one antibody or antigen-binding fragment and a solid oral composition containing at least one additional therapeutic agent) . In some embodiments, the at least one additional therapeutic agent is administered as a pill, tablet, or capsule. In some embodiments, the at least one additional therapeutic agent is administered in a sustained-release oral formulation.

[0367] In some embodiments, the one or more additional therapeutic agents can be administered to the subject prior to, or after administering the at least one antibody, antigen-binding antibody fragment, antibody-drug conjugate, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding antibody fragments, or pharmaceutical compositions described herein) . In some embodiments, the one or more additional therapeutic agents and the at least one antibody, antigen-binding antibody fragment, antibody-drug conjugate, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding antibody fragments, antibody-drug conjugate, or pharmaceutical compositions described herein) are administered to the subject such that there is an overlap in the bioactive period of the one or more additional therapeutic agents and the at least one antibody or antigen-binding fragment (e.g., any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein) or antibody-drug conjugate in the subject.

[0368] In some embodiments, the subject can be administered the at least one antibody, antigen-binding antibody fragment, antibody-drug conjugate, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding antibody fragments, or pharmaceutical compositions described herein) over an extended period of time (e.g., over a period of at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, 12 months, 1 year, 2 years, 3 years, 4 years, or 5 years) . A skilled medical professional may determine the length of the treatment period using any of the methods described herein for diagnosing or following the effectiveness of treatment (e.g., the observation of at least one symptom of cancer) . As described herein, a skilled medical professional can also change the identity and number (e.g., increase or decrease) of antibodies or antigen-binding antibody fragments, antibody-drug conjugates (and / or one or more additional therapeutic agents) administered to the subject and can also adjust (e.g., increase or decrease) the dosage or frequency of administration of at least one antibody or antigen-binding antibody fragment (and / or one or more additional therapeutic agents) to the subject based on an assessment of the effectiveness of the treatment (e.g., using any of the methods described herein and known in the art) .

[0369] In some embodiments, one or more additional therapeutic agents can be administered to the subject. The additional therapeutic agent can comprise one or more inhibitors selected from the group consisting of an inhibitor of B-Raf, an EGFR inhibitor, an inhibitor of a MEK, an inhibitor of ERK, an inhibitor ofK-Ras, an inhibitor of c-Met, an inhibitor of anaplastic lymphoma kinase (ALK) , an inhibitor of a phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) , an inhibitor of an Akt, an inhibitor of mTOR, a dual PI3K / mTOR inhibitor, an inhibitor of Bruton’s tyrosine kinase (BTK) , and an inhibitor of Isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) and / or Isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) . In some embodiments, the additional therapeutic agent is an inhibitor of indoleamine 2, 3-dioxygenase-1 (IDO1) (e.g., epacadostat) .

[0370] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more inhibitors selected from the group consisting of an inhibitor of HER3, an inhibitor of LSD1, an inhibitor of MDM2, an inhibitor of BCL2, an inhibitor of CHK1, an inhibitor of activated hedgehog signaling pathway, and an agent that selectively degrades the estrogen receptor.

[0371] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more therapeutic agents selected from the group consisting of Trabectedin, nab-paclitaxel, Trebananib, Pazopanib, Cediranib, Palbociclib, everolimus, fluoropyrimidine, IFL, regorafenib, Reolysin, Alimta, Zykadia, Sutent, temsirolimus, axitinib, sorafenib, Votrient, IMA-901, AGS-003, cabozantinib, Vinflunine, an Hsp90 inhibitor, Ad-GM-CSF, Temazolomide, IL-2, IFNa, vinblastine, Thalomid, dacarbazine, cyclophosphamide, lenalidomide, azacytidine, bortezomid, amrubicine, carfilzomib, pralatrexate, and enzastaurin.

[0372] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more therapeutic agents selected from the group consisting of an adjuvant, a TLR agonist, tumor necrosis factor (TNF) alpha, IL-1, HMGB1, an IL-10 antagonist, an IL-4 antagonist, an IL-13 antagonist, an IL-17 antagonist, an HVEM antagonist, an ICOS agonist, a CX3CL1 agonist, a CXCL9 agonist, a CXCL10 agonist, aCCL5 agonist, an LFA-1 agonist, an ICAM1 agonist, and a Selectin agonist.

[0373] In some embodiments, carboplatin, nab-paclitaxel, paclitaxel, cisplatin, pemetrexed, gemcitabine, FOLFOX, or FOLFIRI are administered to the subject.

[0374] In some embodiments, the additional therapeutic agent is an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-CD40 antibody, an anti-OX40 antibody, an anti-CTLA4 antibody, or an anti-41BB antibody.

[0375] Pharmaceutical Compositions and Routes of Administration

[0376] Also provided herein are pharmaceutical compositions that contain at least one (e.g., one, two, three, or four) of the antibodies (e.g., bispecific antibodies) , antigen-binding fragments, antigen-binding protein constructs, or antibody-drug conjugates described herein. Two or more (e.g., two, three, or four) of any of the antibodies, antigen-binding fragments, antigen-binding protein constructs, or antibody-drug conjugates described herein can be present in a pharmaceutical composition in any combination. The pharmaceutical compositions may be formulated in any manner known in the art.

[0377] Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) . The compositions can include a sterile diluent (e.g., sterile water or saline) , a fixed oil, polyethylene glycol, glycerine, propylene glycol or other synthetic solvents, antibacterial or antifungal agents, such as benzyl alcohol or methyl parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like, antioxidants, such as ascorbic acid or sodium bisulfite, chelating agents, such as ethylenediaminetetraacetic acid, buffers, such as acetates, citrates, or phosphates, and isotonic agents, such as sugars (e.g., dextrose) , polyalcohols (e.g., mannitol or sorbitol) , or salts (e.g., sodium chloride) , or any combination thereof. Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers (see, e.g., U.S. Patent No. 4,522,811) . Preparations of the compositions can be formulated and enclosed in ampules, disposable syringes, or multiple dose vials. Where required (as in, for example, injectable formulations) , proper fluidity can be maintained by, for example, the use of a coating, such as lecithin, or a surfactant. Absorption of the antibody or antigen-binding fragment thereof can be prolonged by including an agent that delays absorption (e.g., aluminum monostearate and gelatin) . Alternatively, controlled release can be achieved by implants and microencapsulated delivery systems, which can include biodegradable, biocompatible polymers (e.g., ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid; Alza Corporation and Nova Pharmaceutical, Inc. ) .

[0378] Compositions containing one or more of any of the antigen-binding protein constructs, antibodies, antigen-binding fragments, antibody-drug conjugates described herein can be formulated for parenteral (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in dosage unit form (i.e., physically discrete units containing a predetermined quantity of active compound for ease of administration and uniformity of dosage) .

[0379] Toxicity and therapeutic efficacy of compositions can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals (e.g., monkeys) . One can determine the LD50 (the dose lethal to 50%of the population) and the ED50 (the dose therapeutically effective in 50%of the population) : the therapeutic index being the ratio of LD50: ED50. Agents that exhibit high therapeutic indices are preferred. Where an agent exhibits an undesirable side effect, care should be taken to minimize potential damage (i.e., reduce unwanted side effects) . Toxicity and therapeutic efficacy can be determined by other standard pharmaceutical procedures.

[0380] Exemplary doses include milligram or microgram amounts of any of the antigen-binding protein constructs, antibodies or antigen-binding fragments, or antibody-drug conjugates described herein per kilogram of the subject’s weight (e.g., about 1μg / kg to about 500 mg / kg; about 100μg / kg to about 500 mg / kg; about 100μg / kg to about 50 mg / kg; about 10μg / kg to about 5 mg / kg; about 10μg / kg to about 0.5 mg / kg; or about 0.1 mg / kg to about 0.5 mg / kg) .

[0381] The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration. The disclosure also provides methods of manufacturing the antibodies or antigen binding fragments thereof, or antibody-drug conjugates for various uses as described herein.

[0382] EXAMPLES

[0383] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0384] Example 1. Generating anti-DLL3 antibodies

[0385] Human DLL3 protein (ACRO Biosystems Inc., Cat#: DL3-H52H4) or DNA encoding the protein was emulsified with adjuvants, and was used to immunize mice (e.g., a mice with a humanized heavy chain immunoglobulin locus and a humanized kappa chain immunoglobulin locus, or a mice with complete human heavy chain variable domain combined with a common light chain substitution in situ. The mice are described e.g., in PCT / CN2020 / 075698 or PCT / CN2021 / 097652, which are incoproated herein by reference in its entirety) .

[0386] The antibody immune response was monitored by an antigen-specific immunoassay. When a desired immune response was achieved, antigen-specific immune cells were isolated from the immunized mice to further obtain anti-DLL3 antibodies or to obtain the light chain and heavy chain variable region sequences of the anti-DLL3 antibodies. For example, single cell technology (for example, using  Optofluidic System, Berkeley Lights Inc. ) was used to screen and find plasma cells that secrete antigen-specific monoclonal antibodies, and reverse transcription and PCR sequencing were used to obtain antibody variable region sequences. The obtained sequences were cloned into a vector containing a sequence that encodes the human IgG1 constant region for antibody expression. The binding affinity of the expressed antibodies to DLL3 was verified using FACS.

[0387] Exemplary antibodies obtained by this method included: 2A2, 2BL2 and 2984. The VH and VL CDR 1-3 sequences of these antibodies are shown in FIG. 1 and FIG. 2. The VH and VL regions are shown in FIG. 5.

[0388] One reference antibody with specificity for DLL3, synthesized from published amino acid sequence information, was used in the following experiments (designated Ref1) . Specifically, The VL and VH sequences set forth in SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 52 were linked to the human IgG1 constant region (SEQ ID NO: 56) to form Ref1.

[0389] Example 2. Cross-species binding analyses of anti-DLL3 antibodies

[0390] CHO-hDLL3 cells, CHO-mDLL3 cells, CHO-fasDLL3 cells, or CHO-dDLL3 cells were transferred to a 96-well plate at a density of 1×105 cells / well. 2μg / mL anti-DLL3 antibodies were added to the 96-well plate, and incubated at 4℃ for 30 min. Then, the cells were incubated with the secondary antibody Anti-hIgG-Fc-Alex Flour 647 (RL1-H) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., 109-606-170) at 4℃ in the dark for 15 minutes before flow cytometry analysis.

[0391] CHO-hDLL3 cells, CHO-mDLL3 cells, CHO-fasDLL3 cells, and CHO-d DLL3 cells were obtained by transfecting CHO-S cells with vectors expressing human DLL3 (SEQ ID NO: 59) , mouse DLL3 (SEQ ID NO: 60) , monkey DLL3 (SEQ ID NO: 61) and dog DLL3 (SEQ ID NO: 62) , respectively.

[0392] The test results are shown in the table below. All the three anti-DLL3 antibodies can bind to human DLL3, monkey DLL3 and dog DLL3. In addition, 2A2 can also bind to mouse DLL3.

[0393] Table 1

[0394] Example 3. Binding affinity test of anti-DLL3 antibodies

[0395] The binding affinities of the anti-DLL3 antibodies to His-tagged human DLL3 (hDLL3-His, ACRO Biosystems Inc., Cat#: DL3-H52H4) and monkey DLL3 (fasDLL3-His, ACRO Biosystems Inc., Cat#: DL3-C52H3) were measured by Biolayer Interferometry (BLI) using ForteBio Octet system.

[0396] Purified anti-DLL3 antibodies were diluted to 10μg / mL and then injected into the AHC biosensor at 10μL / min. Kinetic measurements were performed at the concentration of 200 nM of the recombinant His-tagged DLL3 protein. The association phase lasted for 180 s and the dissociation phase lasted 400 s followed by a regeneration step with 10 mM Glycine-HCl, pH1.7. For isotype control (ISO) , an antibody targeting an irrelevant target protein was used.

[0397] Kinetic association rates (kon) and dissociation rates (koff) were obtained simultaneously by fitting the data globally to a 1: 1 Langmuir binding model (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6.99-110) using Octet data analysis program. Affinities were deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . As a person of ordinary skill in the art would understand, the same method with appropriate adjustments for parameters (e.g., antibody concentration) was performed for each tested anti-DLL3 antibody.

[0398] The results for the tested antibodies are summarized in the table below, which shows that 2A2, 2BL2, and 2984 exhibited better binding affinity to human and monkey DLL3 compared to Ref1.

[0399] Table 2

[0400] Example 4. Binding activity of anti-DLL3 antibodies to tumor cells

[0401] The binding activity of anti-DLL3 antibodies to tumor cell lines were verified by flow cytometry. Briefly, lung cancer cells NCI-H524, DMS79, and SHP-77 were plated in a 96-well plate at a density of 1 ×105 cells / well, respectively. Purified anti-DLL3 antibody with a concentration of 1.5μg / mL was added to each well and was incubated at 4℃ for 30 minutes. Then, after one wash with PBS, the cells were incubated with the secondary antibody Alexa 647 anti-human IgG Fcγ (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Cat#: 109-606-170) at 4℃ for 15 minutes. The cells were collected and tested by flow cytometry analysis. Human IgG1 was used as an ISO control.

[0402] The results are shown in the table below. Antibodies 2A2, 2BL2, and 2984 exhibited good binding activities to various cancer cell lines.

[0403] Table 3

[0404] Example 5. Internalization detection of anti-DLL3 antibodies

[0405] Anti-DLL3 antibodies (2.5μg / mL) and pHAb-Goat Anti-Human IgG Secondary Antibody (Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd., Cat#: G9845) were added to small cell lung cancer cells NCI-H524, DMS79, or SHP-77. After incubating for 6 hour, the cells were centrifuged and washed with FACS buffer. The MFI values were measured with a flow cytometer, and the endocytosis rates of the anti-DLL3 antibodies were calculated. The results are shown in the table below. Human IgG1 was used as an ISO control. The data showed that 2A2, 2BL2, and 2984 had good cell endocytosis rates.

[0406] Table 4

[0407] Example 6. Physicochemical properties of anti-DLL3 antibodies

[0408] The anti-DLL3 antibodies were diluted to 1 mg / mL using PBS buffer, and the following tests were performed: (1) detecting the purity changes of antibodies by Size-Exclusion Ultra Performance Liquid Chromatography (SEC-UPLC) (indicated as the percentage of the main peak area to the sum of all peak areas (Purity, %) ) ; (2) detecting the specificity of the antibodies using the Cross-Interaction Chromatography (CIC) method (indicated as the retention time (CIC, min) ) ; (3) detecting the colloidal stabilities of the antibodies by the stand-up monolayer chromatography (SMAC) method (indicated as the retention time (SMAC, % / min) ) ; (4) detecting thermodynamic stability of the antibodies by the high throughput multifunctional protein stability analyzer (UNcle, Unchained Labs) (indicated as the melting temperature (Tm) and aggregation temperature (Tagg 266) ) . Detailed results are summarized in the table below.

[0409] In the CIC assay, a CIC column was prepared by coupling human polyclonal IgGs (Sigma, Cat#: I4506) onto a HiTrap NHS-activated resin (GE Healthcare, Cat#: 17-0716-01) followed by passivation with ethanolamine according to published procedures. The column was then connected to Agilent 1260 chromatograph system and run at 0.1 mL / min using 1×PBS as the mobile phase until a flat baseline was reached. 10μg of antibodies at 1 mg / mL in PBS were then injected. Peak retention times on the column were monitored at 280 nm; running time: 50 minutes.

[0410] In the SMAC assay, Zenix column (4.6 mm×30 cm, Sepax, Cat#: 213300-4630) was connected to the column compartment, and place the appropriate line in the mobile phase. Equilibrate column for 60 min at 0.350 mL / min flow rate with mobile phase buffer. Load antibodies into the injection sequence. Mobile Phase A: 150 mM Sodium Phosphate pH 7.0; flow rate: 0.35 mL / min; running time: 25 min; column temperature: 30℃; detection wavelength: 280 nm, 220 nm.

[0411] In the UNcle experiments, 8μL protein sample was loaded into the Uni tube, and the system operated at a thermal temperature from 25℃to 95℃at a heating rate of 1℃ / min. The particle size and polydispersity were detected by dynamic light scattering (DLS) before heating. The protein stability was characterized by differential scanning full spectrum fluorescence (DSF) , static light scattering (SLS) and dynamic light scattering (DLS) .

[0412] Table 5

[0413] Example 7. Preparation of anti-DLL3 / SEZ6 Bispecific Antibodies

[0414] Anti-DLL3 antibodies (2A2, 2BL2, and 2984) and anti-SEZ6 antibodies (e.g., 1E1, 2E3, or 2F6) can be paired to form various bispecific antibodies. The anti-SEZ6 antibodies 1E1, 2E3, and 2F6 contained the same common light chain, and their VH and VL CDR 1-3 sequences are shown in FIG. 3 and FIG. 4. The VH and VL regions of 1E1, 2E3, and 2F6 are shown in FIG. 5.

[0415] Vectors for the light chain and heavy chain of the antibodies were made. Three or four vectors were co-transfected into CHO-S cells. After 14 days of culture, the cell supernatant was collected and purified by Protein A affinity chromatography.

[0416] Various methods can be used to reduce the chance of wrong pairing between the two heavy chains. In the Fc region, knobs-into-holes mutations were introduced to the anti-DLL3 arm heavy chain and the anti-SEZ6 arm heavy chain. Exemplary bispecific antibodies obtained included: 2A2-1E1, 2A2-2E3, 2A2-2F6, 2BL2-1E1, 2BL2-2E3, 2BL2-2F6, 2984-1E1, 2984-2E3, and 2984-2F6. In 2A2-1E1, the heavy chain constant region of 2A2 has knob mutations, and the constant region of 1E1 has hole mutations. In 2984-2F6, the heavy chain constant regions of 2984 has knob mutations, and the heavy chain constant regions of 2F6 has hole mutations. An exemplary antibody structure is shown in FIG. 6.

[0417] The sequences of the light chain constant regions, the heavy chain constant region carrying the knob mutations, and the heavy chain constant region carrying the hole mutations are set forth in SEQ ID NOs: 55, 57, and 58 respectively.

[0418] For compare purpose, one reference antibody with specificity for human SEZ6, synthesized from published amino acid sequence information, was used in the following experiments (designated Ref2) . Specifically, The VL and VH sequences set forth in SEQ ID NOs: 53-54 were linked to the human IgG1 constant region to form Ref2.

[0419] Example 8. Binding affinity of anti-DLL3 / SEZ6 antibodies

[0420] The binding affinities of the anti-DLL3 / SEZ6 antibodies to His-tagged human DLL3 (hDLL3-His, ACRO Biosystems Inc., Cat#: DL3-H52H4) and human SEZ6 (hSEZ6-His, Kactus Biosystems, Cat#: SEZ-HM106) were measured by Biolayer Interferometry (BLI) using ForteBio Octet system at 30℃. Specifically, anti-DLL3 / SEZ6 antibodies were loaded onto Protein A sensor at 10 ug / mL to yield a response of 1.0 nm. Kinetic measurements were performed at a concentration of 200 nM of the recombinant His-tagged protein. The association phase lasted for 180 s and the dissociation phase lasted 600 s followed by a regeneration step with 10 mM Glycine-HCl, pH1.7. Data analysis was performed using the Octec Analysis Studio (12.2.2.26) using a standard 1: 1 binding model.

[0421] Affinity values were deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . The results for the tested antibodies are summarized in the table below, which showed that all anti-DLL3 / SEZ6 antibodies showed good binding affinity to human DLL3 and human SEZ6.

[0422] Table 6

[0423] In another experiment, the binding affinity of anti-DLL3 / SEZ6 bispecific antibody to His-tagged monkey DLL3 protein (fasDLL3-His, ACRO Biosystems, Cat#: DL3-C52H3) and monkey SEZ6 protein (fasSEZ6-His, Kactus Biosystems, Cat#: SEZ-CM106) was measured by BLI using ForteBio Octet system. Specifically, the antibody samples were loaded onto Protein A sensor at 10 ug / mL. Serially diluted recombinant His-tagged proteins (highest concentration at 200 nM, 2-fold dilution) were then injected for 180 seconds, respectively. Dissociation was monitored for 400 seconds. The chip was regenerated after the last injection of each titration with10 mM Glycine-HCl, pH1.7. Data analysis was performed using the Octec Analysis Studio (12.2.2.26) using a standard 1: 1 binding model.

[0424] The results for the tested antibodies are summarized in the table below, which showed that 2A2-2F6 showed good binding affinity to monkey DLL3 and monkey SEZ6.

[0425] Table 7

[0426] Example 9. Binding activity of anti-DLL3 / SEZ6 antibodies to tumor cells

[0427] The binding activity of anti-DLL3 / SEZ6 antibodies to tumor cell lines were verified by flow cytometry. Briefly, NCI-H524 cells, DMS79 cells, SHP-77 cells, and NCI-H69 cells were plated in a 96-well plate at a density of 1×105 cells / well, respectively. Purified anti-DLL3 / SEZ6 antibody with a concentration of 10μg / mL was added to each well and was incubated at 4℃ for 30 minutes. Then, after one wash with PBS, the cells were incubated with the secondary antibody Alexa 647 anti-human IgG Fcγ (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Cat#: 109-606-170) at4℃ for 15 minutes. The cells were collected and tested by flow cytometry analysis. Human IgG1 was used as an ISO control.

[0428] The results are shown in the table below. The anti-DLL3 / SEZ6 antibodies exhibited good binding activities to various cancer cell lines.

[0429] Table 8

[0430] Example 10. Internalization detection of anti-DLL3 / SEZ6 antibodies

[0431] Anti-DLL3 / SEZ6 antibodies (2.5μg / mL) and pHAb-Goat Anti-Human IgG Secondary Antibody (Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd., Cat#: G9845) were added to NCI-H69 cells, DMS79 cells, SHP-77 cells, or NCI-H524 cells. After incubating for 6 hour, the cells were centrifuged and washed with FACS buffer. The MFI values were measured with a flow cytometer, and the endocytosis rates of the anti-DLL3 / SEZ6 antibodies were calculated. The results are shown in the table below. Human IgG1 was used as an ISO control.

[0432] Table 9

[0433] “ / ” means not detect

[0434] The data showed that the anti-DLL3 / SEZ6 antibodies had better cell endocytosis rates compared with the positive controls Ref1 and Ref2.

[0435] Example 11. Physicochemical properties of anti-DLL3 / SEZ6 antibodies

[0436] The physicochemical properties anti-DLL3 / SEZ6 antibodies were tested: (1) detecting the purity changes of the antibodies using the Hydrophobic Interaction Chromatography-High Performance Liquid Chromatography (HIC-HPLC) method (indicated as the retention time of the main peak (HIC, min) ) ; (2) detecting thermodynamic stability of the antibodies by the high throughput multifunctional protein stability analyzer (UNcle, Unchained Labs) (indicated as the melting temperature (Tm) and aggregation temperature (Tagg 266) ) ; (3) detecting the specificity of the antibodies using the Cross-Interaction Chromatography (CIC) method (indicated as the retention time (CIC, min) ) ; (4) detecting the colloidal stabilities of the antibodies by the stand-up monolayer chromatography (SMAC) method (indicated as the retention time (SMAC, % / min) ) ; (5) detecting thermodynamic stability of the antibodies by the high throughput multifunctional protein stability analyzer (UNcle, Unchained Labs) (indicated as the melting temperature (Tm) and aggregation temperature (Tagg 266) ) .

[0437] In the HIC-HPLC experiments, an Agilent 1260 chromatograph system (connected with ProPac HIC-10 column (4.6×100 mm, Thermo Scientific) ) was used, and samples were diluted using water. The following parameters were used: mobile phase A: 0.9 M ammonium sulfate, 0.1 M phosphate buffer (PB) , 10%acetonitrile pH 6.5; mobile phase B: 0.1 M phosphate buffer (PB) , 10%acetonitrile pH 6.5; flow rate: 0.8 mL / min; gradient: 0 min 100%A, 2 min 100%A, 32 min 100%B, 34 min 100%B, 35 min 100%A, and 45 min 100%A; column temperature: 30℃; detection wavelength: 280 nm, 220 nm; injection volume: 20μg; sample tray temperature: about 10℃; and running time: 50 minutes.

[0438] Detailed results are shown in the table below. The results showed that the anti-DLL3 / SEZ6 antibody 2A2-2F6 have good stability and physical and chemical properties.

[0439] Table 10

[0440] In another experiment, the stability of the anti-DLL3 / SEZ6 antibody 2A2-2F6 was tested under different treatment conditions: (1) the antibody was buffer exchanged into pH 6.0 (3 mg / mL histidine, 80 mg / mL sucrose, and 0.2 mg / mL Tween 80) and kept in sealed Eppendorf tubes at 40±2℃, for 7 days; (2) the antibody was loaded into protein A column and eluted with a buffer (0.1mol / L HAc) at pH 3.5. Half of the antibodies were added 2M Tris buffer to make the pH into 7.5 immediately. The remain half were kept at pH 3.5 for 6 hours and then adjust the pH into 7.5. The diluted antibodies were kept in sealed Eppendorf tubes at pH 3.5±0.1, 25±2℃ (hereinafter referred to as pH 3.5) for 6 hours; (3) the antibody was buffer exchanged into 50 mM Tris-HCl (pH 8.5) and kept in sealed Eppendorf tubes at 40±3℃for 6 hours or 24 hours; (4) the antibody was buffer exchanged into pH 6.0 (3 mg / mL histidine, 80 mg / mL sucrose, and 0.2 mg / mL 80) and H2O2 was then added into buffer to achieve final concentrations of 0.05%. The antibody was kept in sealed Eppendorf tubes at 40±3℃for 30 minutes.

[0441] After the above treatments, the following tests were performed: (1) the purity of samples were measured by Size-Exclusion High Performance Liquid Chromatography (SEC-HPLC) (indicated as the percentage of the main peak area to the sum of all peak areas (Purity, %) ) ; (2) the pI (isoelectric point) and charge variants of the antibodies were measured by the Capillary Isoelectric Focusing (cIEF) method (indicated as the percentages of the main component, acidic component, and alkaline component) ; (4) the purity changes of antibodies by capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulphate (CE-SDS) under non-reducing (CE-SDS (NR) ) conditions (indicated as the percentage of the main peak area to the sum of all peak areas (Purity, %) ) .

[0442] In the SEC-HPLC experiments, the antibody samples were diluted to 1 mg / mL with purified water and an Agilent 1290 chromatograph system (connected with XBridge Protein BEH SEC column ( Waters Corporation) ) was used. The following parameters were used: mobile phase: 25mM phosphate buffer (PB) +300mM NaCl, pH6.8; flow rate: 1.8 ml / min; column temperature: 25℃; detection wavelength: 280 nm, 220nm; injection volume: 10μL; sample tray temperature: about 8℃; and running time: 7 minutes.

[0443] In the cIEF experiments, a Maurice cIEF Method Development Kit (Protein Simple, Cat#: PS-MDK01-C) was used for sample preparation. Specifically, 40μg protein sample was mixed with the following reagents in the kit: 1μL Maurice cIEF pI Marker-4.05, 1μL Maurice cIEF pI Marker-9.99, 35 μL 1%Methyl Cellulose Solution, 2μL Maurice cIEF 500 mM Arginine, 4μL Ampholytes (Pharmalyte pH ranges 3-10) and water (added to make a final volume of 100μL) . On the Maurice analyzer (Protein Simple, Santa Clara, CA) , Maurice cIEF Cartridges (PS-MC02-C) were used to generate imaging capillary isoelectric focusing spectra. The sample was focused for a total of 10 minutes. The analysis sof tware installed on the instrument was used to integrate the absorbance of the 280 nm-focused protein.

[0444] In the CE-SDS (NR) experiments, Maurice (Protein simple, MauriceTM) and Maurice CE-SDS Size Application Kit (Protein simple, Cat#: PS-MAK02-S) were used. 66.7μL Sample Buffer, 66.7μg antibody sample, 2.5μL 25x internal standard, 5μL 250 mMβ-ME / NR+250mM IAM were add to a microcentrifuge tube, followed by centrifugation at 3000 rpm for 1 min and heating in a 70℃water bath for 10 min. The samples were then cooled to room temperature followed by centrifugation at 10000 rpm for 3 minutes. Supernatant sample preparations were then transferred to a 96 well plate and tested in Maurice. The following parameters were used: injection voltage 4.6 kV, injection time 20 sec, separation voltage 5.75 kV, and separation time 40 min.

[0445] Detailed results are shown in the table below. The results showed that the anti-DLL3 / SEZ6 antibody 2A2-2F6 exhibited good stability as well as physical and chemical properties.

[0446] Table 11

[0447] Example 12. Antibody Drug Conjugate

[0448] Each purified antibody (2A2, 2BL2, 2984, 1E1, 2E3, 2F6, 2A2-1E1, 2A2-2E3, 2A2-2F6, 2BL2-1E1, 2BL2-2E3, 2BL2-2F6, 2984-1E1, 2984-2E3 or 2984-2F6) was coupled with CPT-1, CPT-2, CPT-3, or CPT-4, through CPT-L linker. For the names of the ADCs, CPTx is added directly after the antibody name. For example, if 2A2 is coupled to CPT-1, it is named as 2A2-CPT1. For another example, if 2A2-1E1 is coupled to CPT-2, it is named as 2A2-1E1-CPT2. Antibody-drug conjugates produced by similar methods also included Ref1-CPT2 and Ref2-CPT2. For isotype control, human IgG1 was coupled to CPT-2 to form ISO-CPT2. MS (Mass Spectrometry) was used to detect the coupling of antibodies with drug molecules. The MS detection results showed that the DAR of the ADCs was about 8.

[0449] Example 13. Anti-Tumor Activity in NCI-H69 xenograft model

[0450] The ADCs were tested for their effects on tumor growth in vivo in a model of lung cancer. About 2×106 human small cell lung cancer cells NCI-H69 were injected subcutaneously in B-NDG mice (Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd., Cat#B-CM-002) . When the tumor volume reached about 200-300 mm3, the mice were randomly placed into different groups based on the tumor volume (5 mice per group) on Day 0 (the day of grouping) . The mice were then injected with phosphate buffer saline (PBS) (G1) , 2A2-CPT2 (G2) , or 2BL2-CPT2 (G3) by intravenosus (i.v. ) administration. The frequency of administration was once a week, and 2 administrations in total (Day 0 and Day 7) .

[0451] The injected volume was calculated based on the weight of the mouse and desired dosage of3 mg / kg. The length of the long axis and the short axis of the tumor were measured and the volume of the tumor was calculated as 0.5× (long axis) × (short axis) 2. The weight of the mice was also measured twice a week.

[0452] The tumor growth inhibition percentage (TGI%) was calculated using the following formula: TGI (%)= [1- (Ti-T0)  /  (Vi-V0) ] ×100. Ti is the average tumor volume in the treatment group on day i. T0 is the average tumor volume in the treatment group on day zero. Vi is the average tumor volume in the control group on day i. V0 is the average tumor volume in the control group on day zero. T-test was performed for statistical analysis. A TGI%higher than 60%indicates clear suppression of tumor growth. P<0.05 is a threshold to indicate significant difference.

[0453] The tumor size in groups treated with the ADC are shown in FIG. 7, in which the tumor volumes in the treatment groups (G2 and G3) were smaller than that of the control group (G1) . 2A2-CPT2 and 2BL2-CPT2 treatment groups exhibited significant tumor suppression effects with TGI%of 92.3%and 80.3%on Day 21, respectively.

[0454] In another experiment, about 2×106 NCI-H69 cells were injected subcutaneously in B-NDG mice, and when the tumor volume grew to about200 mm3, the mice were divided to different groups based on tumor size (5 mice per group) . The treatment group mice were randomly selected for intravenosus (i.v. ) administration of PBS (G1) , ISO-CPT2 (G2) , 2A2-1E1-CPT2 (G3) , 2984-1E1-CPT2 (G4) , 2984-2E3-CPT2 (G5) , 2A2-2F6-CPT2 (G6) , 2BL2-2F6-CPT2 (G7) , or 2A2-CPT2 (G8) . The tumor volume was measured twice a week and the results are shown in FIG. 11. Compared with the control groups (G1 and G2) , the treatment groups (G3 to G8) demonstrated better tumor inhibitory effects with TGI%of 82.7%, 75.8%, 82.3%, 90.9%, 86.9%, and 88.6%on Day 24, respectively. Notably, 2A2-2F6-CPT2 (G6) exhibited the most substantial tumor inhibitory effect, indicating its superior therapeutic potential.

[0455] In another experiment, about 2×106 NCI-H69 cells were injected subcutaneously in B-NDG mice, and when the tumor volume grew to about 200 mm3, the mice were divided to different groups based on tumor size (5 mice per group) . The treatment group mice were randomly selected for i.v. administration of PBS (G1) , ISO-CPT2 (G2) , 2A2-2F6-CPT2 (G3) , or 2BL2-2F6-CPT2 (G4) . The tumor volume was measured twice a week and the results are shown in FIG. 12. Compared with the control groups PBS (G1) and ISO-CPT2 (G2) , the treatment groups 2A2-2F6-CPT2 (G3) and 2BL2-2F6-CPT2 (G4) demonstrated better tumor inhibitory effects.

[0456] In another similar experiment, about 2×106 NCI-H69 cells were injected subcutaneously in B-NDG mice, and when the tumor volume grew to about 200-300 mm3, the mice were divided to different groups based on tumor size (5 mice per group) . The treatment group mice were randomly selected for i.v. administration of PBS (G1) , 2A2-1E1-CPT2 (G2) , 2A2-2E3-CPT2 (G3) , 2984-1E1-CPT2 (G4) , or 2984-2E3-CPT2 (G5) . The tumor volume was measured twice a week and the results are shown in FIG. 13. Compared with the control groups PBS (G1) , the four anti-DLL3 / SEZ6ADCs (G2 to G5) demonstrated better tumor inhibitory effects.

[0457] Example 14. Anti-Tumor Activity in SHP77 xenograft model

[0458] About 1×106 human small cell lung cancer cells SHP77 were injected subcutaneously in B-NDG mice. When the tumor volume reached about 200-300 mm3, the mice were randomly placed into different groups (Day 0) . The mice were then injected with PBS (G1) , 2A2-CPT2 (G2) , or 2BL2-CPT2 (G3) at a dose level of3 mg / kg by i.v. administration. The frequency of administration was once a week (2 administrations in total) . The tumor volume of mice in different groups treated with the ADCs or PBS are shown in FIG. 8. Compared with the control group (G1) , 2A2-CPT2 (G2) and 2BL2-CPT2 (G3) both exhibited better tumor inhibitory effect, with a TGI%of 106.5%and 95.4%on Day 23, respectively.

[0459] In another experiment, about 1×106 SHP77 cells were injected subcutaneously in B-NDG mice, and when the tumor volume grew to about 200 mm3, the mice were divided to different groups based on tumor size (5 mice per group) . The treatment group mice were randomly selected for i.v. administration of PBS or ADCs. Details are shown in the table below.

[0460] Table 12

[0461] The tumor volume was measured twice a week and the results are shown in FIG. 9, in which all the six anti-DLL3 / SEZ6 ADCs exhibited significant tumor inhibition activities.

[0462] Example 15. Anti-Tumor Activity in NCI-H524 xenograft model

[0463] About 1×106 human small cell lung cancer cells NCI-H524 were injected subcutaneously in B-NDG mice. When the tumor volume in the mice reached about 200 mm3, the mice were randomly placed into different groups based on tumor size (5 mice per group) . The mice were then injected with PBS (G1) , 2 mg / kg ISO-CPT2 (G2) , 2A2-1E1-CPT2 (G3) , 2A2-2E3-CPT2 (G4) , 2984-1E1-CPT2 (G5) , 2984-2E3-CPT2 (G6) , 2A2-2F6-CPT2 (G7) , or 2BL2-2F6-CPT2 (G8) by i.v. administration. The frequency of administration was once a week (2 administrations in total) .

[0464] The tumor volume was measured twice a week and the tumor volume of mice in different groups treated with the ADCs or PBS are shown in FIG. 10. Compared with the control groups (G1 and G2) , the six anti-DLL3 / SEZ6 ADC treatment groups (G3 to G8) demonstrated better tumor inhibitory effects. Notably, 2A2-2F6-CPT2 (G7) exhibited the most substantial tumor inhibitory effect, indicating its superior therapeutic potential.

[0465] In another similar experiment, about 1×106 NCI-H524 cells were injected subcutaneously in B-NDG mice, and when the tumor volume grew to about 200 mm3, the mice were divided to different groups based on tumor size (5 mice per group) . The treatment group mice were randomly selected for i.v. administration of PBS (G1) , 2 mg / kg ISO-CPT2 (G2) , Ref2-CPT2 (G3) , or 2A2-2F6-CPT2 (G4) . The frequency of administration was once a week (2 administrations in total) . The tumor volume was measured twice a week and the results showed that 2A2-2F6-CPT2 (G4) had the best tumor inhibitory effect compared to the control groups G1-G3. Specifically, the TGI% (e.g., on Day 21) of G2-G4 was 27.4%, 106.6%, and 107.4%, respectively.

[0466] Example 16. Anti-Tumor Activity in DMS79 xenograft model

[0467] About 5×106 human small cell lung cancer cells DMS79 were injected subcutaneously in B-NDG mice. When the tumor volume in the mice reached about 200-250 mm3, the mice were randomly placed into different groups based on tumor size (5 mice per group) . The mice were then injected with PBS (G1) , ISO-CPT2 (G2) , 2A2-1E1-CPT2 (G3) , 2984-1E1-CPT2 (G4) , 2984-2E3-CPT2 (G5) , 2A2-2F6-CPT2 (G6) , or 2BL2-2F6-CPT2 (G7) by i.v. administration. The frequency of administration was once a week (2 administrations in total) .

[0468] The tumor volume was measured twice a week. As shown in FIG. 14, all of the anti-DLL3 / SEZ6 ADC treatment groups (G3 to G7) demonstrated better tumor inhibitory effects than that of the control groups (G1 and G2) .

[0469] Example 17. Anti-Tumor Activity in lung cancer PDX model

[0470] The anti-tumor activity of ADCs was tested in vivo in a lung cancer PDX model. Specifically, lung tumor fragments (2 mm×2 mm×2 mm) were engrafted in the right flank of B-NDG mice. When the tumor volume reached about 200-300 mm3, the mice were randomly placed into different groups based on tumor volumes (5 mice per group) . The mice were then injected with PBS (G1) , ISO-CPT2 (G2) , or 2A2-2F6-CPT2 (G3) by i.v. administration. The frequency of administration was once a week (2 administrations in total) .

[0471] The tumor volumes were measured twice a week. As shown in FIG. 15, 2A2-2F6-CPT2 (G3) exhibited good anti-tumor activity in lung cancer.

[0472] OTHER EMBODIMENTS

[0473] It is to be understood that while the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to DLL3 (Delta-Like Ligand 3) comprising:a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, wherein the VH CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VH CDR1 amino acid sequence, the VH CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VH CDR2 amino acid sequence, and the VH CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VH CDR3 amino acid sequence; anda light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VL CDR1 amino acid sequence, the VL CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VL CDR2 amino acid sequence, and the VL CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VL CDR3 amino acid sequence,wherein the selected VH CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences and the selected VL CDRs 1, 2,and 3 amino acid sequences are one of the following:(1) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(2) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(3) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(4) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(5) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively; and(6) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively.2.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, according to the Kabat numbering scheme.3.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, according to the Chothia numbering scheme.4.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, according to the Kabat numbering scheme.5.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, according to the Chothia numbering scheme.6.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 19-21 respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, according to the Kabat numbering scheme.7.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, according to the Chothia numbering scheme.8.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-7, wherein the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to human, monkey, mouse, or canine DLL3.9.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-8, wherein the antibody or antigen-binding fragment is a human or humanized antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., a human IgG1 antibody or a fragment thereof) .10.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-9, wherein the antibody or antigen-binding fragment is a single-chain variable fragment (scFv) .11.An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to DLL3 comprisinga heavy chain variable region (VH) comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to a selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) comprising an amino acid sequence that is at least 90%identical to a selected VL sequence, wherein the selected VH sequence and the selected VL sequence are one of the following:(1) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 44, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 43;(2) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 45, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 43; and(3)the selected VH sequence is SEQ ID NO: 47, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 46.12.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 11, wherein the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 44 and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 43.13.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 11, wherein the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 45 and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 43.14.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 11, wherein the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 47 and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 46.15.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 11-14, wherein the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to human, monkey, mouse, or canine DLL3.16.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 11-15, wherein the antibody or antigen-binding fragment is a human or humanized antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., a human IgG1 antibody or a fragment thereof) .17.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 11-16, wherein the antibody or antigen-binding fragment is a single-chain variable fragment (scFv) .18.An antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-17.19.An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to DLL3 comprisinga heavy chain variable region (VH) comprising VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 that are identical to VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 of a selected VH sequence; and a light chain variable region (VL) comprising VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 that are identical to VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 of a selected VL sequence, wherein the selected VH sequence and the selected VL sequence are one of the following:(1) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 44, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 43;(2) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 45, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 43; and(3)the selected VH sequence is SEQ ID NO: 47, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 46.20.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-19, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof is a bispecific or a multispecific antibody or an antigen-binding fragment thereof.21.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 20, wherein the antibody or antigen- binding fragment thereof further specifically binds to SEZ6.22.A nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising:(1) an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and wherein the VH, when paired with a light chain variable region (VL) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43, binds to DLL3;(2) an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof comprising a VH comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and wherein the VH, when paired with a VL comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43, binds to DLL3;(3) an immunoglobulin light chain or a fragment thereof comprising a VL comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and wherein the VL, when paired with a VH comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44, binds to DLL3;(4) an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof comprising a VH comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and wherein the VH, when paired with a VL comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43, binds to DLL3;(5) an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof comprising a VH comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and wherein the VH, when paired with a VL comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43, binds to DLL3;(6) an immunoglobulin light chain or a fragment thereof comprising a VL comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and wherein the VL, when paired with a VH comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 45, binds to DLL3;(7) an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof comprising a VH comprising CDRs 1, 2,and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and wherein the VH, when paired with a VL comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46, binds to DLL3;(8) an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof comprising a VH comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, and wherein the VH, when paired with a VL comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46, binds to DLL3; or(9) an immunoglobulin light chain or a fragment thereof comprising a VL comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, and wherein the VL, when paired with a VH comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 47, binds to DLL3.23.The nucleic acid of claim 22, wherein the VH when paired with a VL specifically binds to human, monkey, mouse, or canine DLL3.24.The nucleic acid of any one of claim 22 or 23, wherein the immunoglobulin heavy chain or the fragment thereof is a human or humanized immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof.25.The nucleic acid of any one of claims 22-24, wherein the nucleic acid encodes a single-chain variable fragment (scFv) .26.The nucleic acid of any one of claims 22-25, wherein the nucleic acid is cDNA.27.An antigen-binding protein construct, comprising: a first antigen-binding domain that specifically binds to DLL3; and a second antigen-binding domain that specifically binds to SEZ6.28.The antigen-binding protein construct of claim 27, wherein the first antigen-binding domain comprises a first heavy chain variable region (VH1) and a first light chain variable region (VL1) ; and the second antigen-binding domain comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .29.The antigen-binding protein construct of claim 28, whereinthe VH1 comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, wherein the VH1 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VH1 CDR1 amino acid sequence, the VH1 region comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VH1 CDR2 amino acid sequence, and the VH1 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VH1 CDR3 amino acid sequence; andthe VL1 comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL1 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VL1 CDR1 amino acid sequence, the VL1 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VL1 CDR2 amino acid sequence, and the VL1 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VL1 CDR3 amino acid sequence,wherein the selected VH1 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences, the selected VL1 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:(1) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(2) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(3) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(4) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(5) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively; and(6) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively.30.The antigen-binding protein construct of claim 28 or claim 29, whereinthe VH2 comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the VH2 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VH2 CDR1 amino acid sequence, the VH2 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VH2 CDR2 amino acid sequence, and the VH2 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VH2 CDR3 amino acid sequence; andthe VL2 comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL2 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VL2 CDR1 amino acid sequence, the VL2 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VL2 CDR2 amino acid sequence, and the VL2 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VL2 CDR3 amino acid sequence,wherein the selected VH2 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences, and the selected VL2 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:(1) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(2) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(3) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(4) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(5) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively; and(6) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively.31.The antigen-binding protein construct of any one of claims 28-30, wherein(1) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(2) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(3) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(4) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(5) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(6) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(7) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(8) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively; or(9) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively, and the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively.32.The antigen-binding protein construct of claim 31, wherein the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 44, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 48, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43.33.The antigen-binding protein construct of claim 31, wherein the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 44, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 49, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43.34.The antigen-binding protein construct of claim 31, wherein the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 44, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 50, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43.35.The antigen-binding protein construct of claim 31, wherein the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 45, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 48, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43.36.The antigen-binding protein construct of claim 31, wherein the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 45, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 49, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43.37.The antigen-binding protein construct of claim 31, wherein the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 45, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 50, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43.38.The antigen-binding protein construct of claim 31, wherein the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 47, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 46, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 48, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43.39.The antigen-binding protein construct of claim 31, wherein the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 47, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 46, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 49, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43.40.The antigen-binding protein construct of claim 31, wherein the first heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 47, the first light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 46, the second heavy chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 50, and the second light chain variable region comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 43.41.The antigen-binding protein construct of any one of claims 27-40, wherein the antigen-binding protein construct is a bispecific antibody.42.The antigen-binding protein construct of any one of claims 28-41, wherein the first light chain variable region and the second light chain variable region are identical.43.The antigen-binding protein construct of any one of claims 28-41, wherein the first light chain variable region and the second light chain variable region are not identical.44.A vector comprising one or more of the nucleic acids of any one of claims 22-26, or a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-21, or a nucleic acid encoding the antigen-binding protein construct of any one of claims 27-43.45.A cell comprising the vector of claim 44.46.The cell of claim 45, wherein the cell is a CHO cell.47.A cell comprising one or more of the nucleic acids of any one of claims 22-26, or a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-21, or a nucleic acid encoding the antigen-binding protein construct of any one of claims 27-43.48.A method of producing an antibody or an antigen-binding fragment thereof, or an antigen-binding protein construct, the method comprising(a) culturing the cell of any one of claims 45-47 under conditions sufficient for the cell to produce the antibody or the antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct; and(b) collecting the antibody or the antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct produced by the cell.49.An antibody-drug conjugate comprising a therapeutic agent covalently bound to:(a) the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-21; or(b) the antigen-binding protein construct of any one of claims 27-43.50.The antibody-drug conjugate of claim 49, wherein the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.51.The antibody-drug conjugate of claim 49 or 50, wherein the therapeutic agent is selected from 52.The antibody-drug conjugate of any one of claims 49-51, wherein the therapeutic agent is linked to the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct via a linker.53.The antibody-drug conjugate of claim 52, wherein the linker has a structure of: 54.The antibody-drug conjugate of any one of claims 49-53, wherein the antibody-drug conjugate has a structure of: wherein n=1-8; wherein “Ab” represents the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct.55.A method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-21, the antigen-binding protein construct of any one of claims 27-43, or the antibody-drug conjugate of any one of claims 49-54, to the subject.56.The method of claim 55, wherein the subject has a solid tumor.57.The method of claim 56, wherein the cancer is lung cancer (e.g., NSCLC, SCLC) , urothelial cancer, breast cancer, colorectal cancer, renal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, skin cancer, stomach cancer, esophageal carcinoma, pancreatic cancer, prostate cancer, liver cancer, lymphoma, or glioma.58.The method of any one of claims 55-57, wherein the subject is a human.59.The method of any one of claims 55-57, wherein the subject is a non-human animal.60.A method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprisingcontacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-21, the antigen-binding protein construct of any one of claims 27-43, or the antibody-drug conjugate of any one of claims 49-54.61.A method of killing a tumor cell, the method comprisingcontacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-21, the antigen-binding protein construct of any one of claims 27-43, or the antibody-drug conjugate of any one of claims 49-54.62.A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and(a) the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-21,(b) the antigen-binding protein construct of any one of claims 27-43, or(c)the antibody-drug conjugate of any one of claims 49-54.

Images