Compositions comprising parabacteroides goldsteinii cells and uses thereof

Abstract

A composition comprising cells of a Parabacteroides goldsteinii strain (e.g., RV-01) and a carrier, wherein the cells comprise a population of hypo-acylated lipopolysaccharides (LPS). Also provided herein are methods for alleviating conditions such as conditions associated with aging or inflammation with the composition comprising the Parabacteroides goldsteinii cells.

Description

COMPOSITIONS COMPRISING PARABACTEROIDES GOLDSTEINII CELLS AND USES THEREOFBACKGROUND

[0001] Gut commensals play important roles in maintaining the homeostasis of human health. Among these, the bacterium Parabacteroides goldsteinii has recently been identified as a key component of intestinal microbiota. The human gut commensal P. goldsteinii is a Gram-negative, rod-shaped, strictly anaerobic, and non-spore forming bacterium belonging to the Bacteroidota phylum. P. goldsteinii has great potentiality to be developed as a next generation probiotic (NGP) , and it has been negatively correlated with obesity-related indexes and positively correlated with the serum levels of HDL-C and IL-10. Cai et al., Food Res Int, 2020, 130: 108939, Cui et al., FEMS Microbiology Letters, 2022, 369 (1) : fnac072. Despite there being no P. goldsteinii-related adverse effects reported in previous studies, there is no data available nor any documented history of P. goldsteinii’s use as a food ingredient. The appropriate safety and toxicological evaluations are warranted.

[0002] Potential risks of live NGPs comprise of (i) translocation across the intestine and causing systemic infection, especially in vulnerable patients and pediatric populations; (ii) acquiring antibiotic resistance and virulence genes, followed by spreading thereafter; and (iii) interfering with colonization of gut commensals in neonates. To avoid the potential occurrence of these risks, increasing interests in development of non-viable microorganisms (paraprobiotics) are considered to functionally replace the live bacteria as the killed probiotic bacteria are unable to replicate or colonize the human gut. The postbiotics form of probiotic bacteria can be obtained by applying optimal heat (tyndallization) , autoclaving, ultraviolet (UV) light, and sonication. Ali et al., Pathogens, 223, 12 (7) : 874, Pique et al., Int J Mol Sci, 20 (10) : 2534.SUMMARY

[0003] The present disclosure is based, at least in part, on the observation that cells of a P. goldsteinii strain, RV-01, either live or inactivated, exhibited various therapeutic benefits in various medical conditions, including inflammation (e.g., neuron inflammation) , age-related conditions (e.g., sarcopenia, intestinal aging, age-related aberrant circadian rhythm, skin aging, age-related cognition problems) , cancer, metabolic syndrome, and chronic kidney disease. Accordingly, provided herein are compositions comprising P. goldsteinii cells and uses thereof for alleviating medical conditions as described herein.

[0004] In some aspects, the present disclosure provides a composition comprising cells of a Parabacteroides goldsteinii strain and a carrier. The P. goldsteinii cells comprise a population of hypo-acylated lipopolysaccharides (LPS) . In some embodiments, the P. goldsteinii strain is RV-01, which is deposited with National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary, located at #122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba 292-0818, Japan, under Accession number NITE BP-04231, on November 28, 2024. In some embodiments, the carrier in the composition may comprise a polysaccharide, for example, maltodextrin, isomaltodextrin, or resistant maltodextrin (e.g.,  ) , or a combination thereof. In some embodiments, the cells of the P. goldsteinii are inactivated cells. For example, the P. goldsteinii cells can be inactivated by autoclave.

[0005] The composition provided herein may be in a form of liquid, semi-solid, or solid. In some embodiments, the composition provided herein can be an oral formulation. For example, the composition may be in the form of a tablet, a capsule, or an oral liquid. Alternatively, the composition can be a topical formulation.

[0006] In other aspects, the present disclosure provides a method for alleviating a condition associated with aging, the method comprising administering to a subject in need thereof (e.g., a human patient) an effective amount of any of the compositions disclosed herein. Exemplary conditions associated with aging include, e.g., sarcopenia, skin-aging, intestinal-aging, age-related aberrant circadian rhythm, or age-related decline in cognition.

[0007] In yet other aspects, the present disclosure provides a method for alleviating a condition, the method comprising administering to a subject in need thereof (e.g., a human patient) an effective amount of any of the compositions disclosed herein. The condition can be cancer (e.g., colon cancer) , inflammation, a metabolic syndrome, and a chronic kidney disease. In some examples, the method is for treating colon cancer in a subject such as a human patient, who may be on a treatment comprising a checkpoint inhibitor, for example, an anti-PD1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.

[0008] In any of the treatment methods provided herein, the composition is administered to the subject orally. Alternatively, the composition may be administered topically.

[0009] Also within the scope of the present disclosure are compositions for use in alleviating a medical condition (e.g., an age-associated condition such as those disclosed herein, cancer, inflammation, a metabolic syndrome, or a chronic kidney disease) , as well as use of the composition for manufacturing a medicament for alleviating any of the target medical conditions as disclosed herein.

[0010] The details of one or more embodiments of the invention are set forth in the description below. Other features or advantages of the present invention will be apparent from the following drawings and detailed description of several embodiments, and also from the appended claims.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0011] The following drawings form part of the present specification and are included to further demonstrate certain aspects of the present disclosure, which can be better understood by reference to the drawing in combination with the detailed description of specific embodiments presented herein.

[0012] FIGs. 1A-1D include diagrams showing comparative features of live and autoclaved P. goldsteinii RV-01 strain. FIG. 1A: transmission electron micrograph of live P. goldsteinii RV-01 cells. FIG. 1B: transmission electron micrograph of autoclaved P. goldsteinii RV-01 cells. FIG. 1C: a chart showing growth curves (OD600) of live and autoclaved P. goldsteinii RV-01 cells in culture broth under anaerobic condition at 37° Celsius for 24 hours. FIG. 1D: a diagram showing functional annotation results of the COG database based on the genome of P. goldsteinii RV-01.

[0013] FIGs. 2A-2B include diagrams showing levels of various short-chain fatty acids in the culture medium of P. goldsteinii RV-01 analyzed by using MS spectrometry (FIG. 2A) and the carbohydrate utilization enzymes of P. goldsteinii RV-01 analyzed against Carbohydrate-Active Enzyme (CAZy) database (FIG. 2B) .

[0014] FIGs. 3A-3C include diagrams showing comparison of lipids of P. goldsteinii RV-01 versus lipids of mouse P. goldsteinii MTS01. FIG. 3A: structural analysis of Lipid A from mouse P. goldsteinii MTS01 by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) . FIG. 3B: structural analysis of Lipid A from P. goldsteinii RV-01 by NMR. FIG. 3C: three major species of lipid A identified in P. goldsteinii LPS.

[0015] FIG. 4 is a diagram showing the anti-inflammatory potency between autoclaved P. goldsteinii RV-01 and autoclaved P. goldsteinii MTS01 strains. NF-κB activation of HCT116-Dual cells treated with autoclaved E. coli, autoclaved P. goldsteinii RV-01 or autoclaved P. goldsteinii MTS01 alone, as well as treated with autoclaved E. coli after pretreatment of autoclaved P. goldsteinii RV-01 or autoclaved P. goldsteinii MTS01 are shown. *indicates P<0.05; **indicate P<0.01; ****indicate P<0.0001.

[0016] FIGs. 5A-5D include diagrams showing the ameliorative effects of autoclaved P. goldsteinii RV-01 relative to P. goldsteinii MTS01 strains on ageing-related sarcopenia. FIG. 5A: photos of representative gastrocnemius muscle after 32 days treatment. FIG. 5B: a chart showing the weight of gastrocnemius muscle of aged mice (normalized with body weight) treated with autoclaved P. goldsteinii MTS01 or autoclaved P. goldsteinii RV-01. FIG. 5C: a chart showing forelimb grip strength of aged mice (normalized with body weight) treated with autoclaved P. goldsteinii MTS01 or autoclaved P. goldsteinii RV-01. FIG. 5D: a graph showing the exhaustive swimming time in aged mice treated with autoclaved P. goldsteinii MTS01 or autoclaved P. goldsteinii RV-01. NMN, Nicotinamide mononucleotide, was used as the positive control. *indicates P<0.05; **indicates P<0.01; ***indicates P<0.001; ns, not significant.

[0017] FIGs. 6A-6C include diagrams showing the effect of oral administration of P. goldsteinii RV-01 in GF mice. GF mice (n=3 in GF group; n=4 in GF+RV-01 group) were orally administrated with P. goldsteinii RV-01, then the sera and colon tissues were collected after 2 weeks. FIG. 6A: levels of alanine aminotransferase (ALT) . FIG. 6B: levels of blood urea nitrogen (BUN) . FIG. 6C: levels of creatinine (CREA) .

[0018] FIGs. 7A-7C include diagrams showing the ameliorative effects of P. goldsteinii RV-01 on intestinal ageing. FIG. 7A: levels of endotoxin in stools of aged mice treated with vehicle or P. goldsteinii RV-01. FIG. 7B: concentrations of IgA in stool of aged mice treated with vehicle or P. goldsteinii RV-01. FIG. 7C: mucosal thickness of ileum in aged mice treated with vehicle or P. goldsteinii RV-01. *indicates P<0.05. n=5-9 / group.

[0019] FIGs. 8A-8F include diagrams showing regulation of circadian rhythm in aged mice by P. goldsteinii RV-01. FIG. 8A: the top 10 enriched GO terms in the biological process (BP) category in gastrocnemius muscle of aged mice upregulated by P. goldsteinii RV-01. FIG. 8B: the top 10 enriched GO terms in the cellular component (CC) category in gastrocnemius muscle of aged mice upregulated by P. goldsteinii RV-01. FIG. 8C: the top 10 enriched GO terms in the molecule function (MF) category in gastrocnemius muscle of aged mice upregulated by P. goldsteinii RV-01. FIG. 8D: the top 10 enriched GO terms in the biological process (BP) category in in ileum of aged mice upregulated by P. goldsteinii RV-01. FIG. 8E: the top 10 enriched GO terms in the cellular component (CC) category in in ileum of aged mice upregulated by P. goldsteinii RV-01. FIG. 8F: the top 10 enriched GO terms in the molecule function (MF) category in in ileum of aged mice upregulated by P. goldsteinii RV-01. +: P < 0.1. *: P < 0.05. **: P < 0.01. ***: P < 0.001.

[0020] FIGs. 9A-9B include diagrams showing the ameliorative effect of P. goldsteinii RV-01 on skin ageing. The dorsal skin tissues of aged mice treated with vehicle or P. goldsteinii RV-01 were collected and subjected to transcriptomic analysis (n=3) . The activated and suppressed pathways were identified by using GSEA analysis. FIG. 9A: expression levels of genes associated with establishment of skin barrier (filaggrin and keratin) in dorsal skin of aged mice treated with vehicle or P. goldsteinii RV-01. FIG. 9B: expression levels of genes associated with strength and elasticity of skin (elastin and collagen) in dorsal skin of aged mice treated with vehicle or P. goldsteinii RV-01.

[0021] FIGs. 10A-10C include diagrams showing the ameliorative effect of P. goldsteinii RV-01 on neuron inflammation. HMC3 (human microglial cells) were treated with E. coli LPS without or with 2 hours pretreatment of P. goldsteinii RV-01 (PG RV-01) with different concentrations for 22 hours. The RNAs were extracted and subjected for quantitative RT-PCR. The RNA expression levels of IL-6 (FIG. 10A) , IL-1β (FIG. 10B) and TNF-α (FIG. 10C) were normalized with those of untreated control. *indicates P<0.05; **indicates P<0.01; ***indicates P<0.001.

[0022] FIGs. 11A-11H include diagrams showing improvement of anti-PD1 treatment efficacy in colon cancer by P. goldsteinii RV-01. CT26 tumor-bearing BALB / c mice (n=10 / group) were randomly grouped (isotype antibody treatment, anti-PD1 treatment and anti-PD1 treatment coupled with administration of P. goldsteinii RV-01) at day 5 (the average volumes of tumors were approximately 50 mm3) . Anti-PD1 (5 mg / kg) were intra-peritoneally injected at day 8, 11 and 14, as well as P. goldsteinii RV-01 (5×109 TFU / mice) were administrated daily after grouping. FIG. 11A: tumor volume for 28 days. FIG. 11B: photos of tumor tissues after animals being sacrificed at day 28. FIG. 11C: tumor volumes at day 28. FIG. 11D: tumor weights at day 28. FIG. 11E: percentages of CD8+ T cells in tumor tissues. FIG. 11F: percentages of cytotoxic CD8+ T cells in tumor tissues. FIG. 11G: percentages of CD8+ T cells in spleen. FIG. 11H: percentages of cytotoxic CD8+ T cells in spleen.

[0023] FIGs. 12A-12I include diagrams showing ameliorative effect of P. goldsteinii RV-01 on metabolic syndrome. HFD-fed mice were treated daily with P. goldsteinii RV-01 by oral gavage for 10 weeks (n=7-10 / group) . FIG. 12A: body weight change (%) for ten weeks. FIG. 12B: body weight gain after 10 weeks. FIG. 12C: amount of food intake. FIG. 12D: fasting blood glucose level after 10 weeks. FIG. 12E: blood glucose levels in OGTT test. FIG. 12F: areas under curve of blood glucose level in OGTT test. FIG. 12G: blood glucose levels in ITT test. FIG. 12H: area under curve of blood glucose level in ITT test. FIG. 12I: ALT levels in serum. *indicates P<0.05; **indicates P<0.01; ****indicates P<0.0001; ns, not significant.

[0024] FIGs. 13A-13H include diagrams showing that P. goldsteinii RV-01 improves spatial memory impairments in aged rats, as assessed by the Morris Water Maze. FIG. 13A: mean escape latency per day: Pg-treated aged rats showed a significant decrease in escape latency across the hidden task trials (P < 0.01) . FIG. 13B: total distance to target (mm) : P. goldsteinii RV-01-treated aged rats significantly reduced the total distance to the target (P < 0.05) . FIG. 13C: Quadrant 2 (Q2) latency (s) . P. goldsteinii RV-01-treatment significantly improved Q2 latency in aged rats (P < 0.05) . FIG. 13D: Quadrant 3 (Q3) latency (s) . P. goldsteinii RV-01-treated aged rats demonstrated reduced Q3 latency (P < 0.05) . FIG. 13E: Quadrant 4 (Q4) latency (s) . P. goldsteinii RV-01-treatment significantly enhanced Q4 latency performance (P < 0.01) . FIG. 13F: swimming speed. P. goldsteinii RV-01-treated aged rats exhibited improved swimming performance compared to the aged control group (P < 0.05) . FIG. 13G: Q4 checking counts. P. goldsteinii RV-01-treated aged rats showed fewer checking counts to locate the target in Q4 (P < 0.05) . FIG. 13H: Q4 checking duration (s) . P. goldsteinii RV-01-treatment significantly reduced Q4 checking duration in aged rats (P < 0.05) . (Statistics probe trial: unpaired t-test) . Data represent mean+SEM; n=5; *p < 0.05, **p < 0.01 as indicated.

[0025] FIGs. 14A-14H include diagrams showing increased locomotor activity and improved anxiety-like behavior in Pg-treated older rats. FIG. 14A: open field test: total activity distance (mm) . FIG. 14B: total activity time (s) . FIG. 13C: movement speed (mm / s) . FIG. 14D: vertical entry frequency. FIG. 14E: vertical checking counts. FIG. 14F: vertical checking duration. FIG. 14G: central checking counts. FIG. 14H: central checking duration during the entire 120-minute test period. (Statistics probe trial: unpaired t-test) . Data represent mean+SEM; n=5; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 as indicated.

[0026] FIG. 15 is a diagram illustrating induction of chronic kidney disease (CKD) in Sprague-Dawley (SD) rats.

[0027] FIGs. 16A-16D include diagrams showing that P. goldsteinii improves kidney function in adenine-induced CKD rats. FIG. 16A: serum creatinine. FIG. 16B: serum BUN. FIG. 16C: urine creatinine. FIG. 16D: urine BUN. BUN: blood urea nitrogen. Data represent mean ± SEM. ****P<0.001 vs. CTL or CKD group (n = 5 per group) .

[0028] FIGs. 17A-17C include diagrams showing that P. goldsteinii reduced pro-inflammatory cytokine production in CKD rats. FIG. 17A: IL-1β. FIG. 17B: TNF-α. FIG. 17C: IL-6. Data represent mean ± SEM. ****P<0.001 vs. CTL or CKD group (n = 5 per group) .DETAILED DESCRIPTION

[0029] Parabacteroides goldsteinii (P. goldsteinii) is a gram-negative, non-spore-forming bacterium. It is a gut commensal bacterium constituting the gut microbiota in various species, including human and mouse. It is reported herein that P. goldsteinii strain RV-01, isolated from human feces, exhibited therapeutic benefits for various medical conditions, for example, inflammation, aging, cancer, metabolic syndrome, and chronic kidney disease. Accordingly, provided herein are compositions (e.g., pharmaceutical compositions) and uses thereof for alleviating medical conditions as disclosed herein.

[0030] I. Compositions Comprising P. goldsteinii Cells

[0031] In some aspects, the present disclosure provides compositions comprising P. goldsteinii cells, e.g., P. goldsteinii RV-01 cells and a carrier (e.g., a pharmaceutically acceptable carrier) . In some embodiments, the P. goldsteinii cells, e.g., P. goldsteinii RV-01 cells, are inactivated (e.g., autoclaved) . In other embodiments, the P. goldsteinii cells, e.g., P. goldsteinii RV-01 cells, are live cells. In some embodiments, the carrier may comprise a polysaccharide, which may not be native to the P. goldsteinii cells, e.g., P. goldsteinii RV-01 cells. “Not native” refers to a component such as a polysaccharide not produced by the P. goldsteinii cells, e.g., P. goldsteinii RV-01 cells.

[0032] (a) P. goldsteinii RV-01 Cells

[0033] P. goldsteinii RV-01 is isolated from human feces and deposited with National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary, located at #122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba 292-0818, Japan, under Accession Number NITE BP-04231, on November 28, 2024. The morphology of P. goldsteinii RV-01, including live cells and inactivated cells by autoclave, is provided in FIG. 1A and FIG. 1B. As reported herein, the genome of P. goldsteinii RV-01 shares homology with other P. goldsteinii strains such as P. goldsteinii MTS01 (a P. goldsteinii strain isolated from mice) but is not identical to the genomic sequences of the tested P. goldsteinii stains, indicating that P. goldsteinii RV-01 is a distinct strain. See Table 2 below. See also Example 1 for characterization of P. goldsteinii RV-01.

[0034] Lipopolysaccharides (LPS) are glycolipids constituting a key component of the outer membrane of Gram-negative bacterial, such as P. goldsteinii. P. goldsteinii RV-01 was found to have a population of LPSs enriched with hypoacylated LPSs, which can result in reduced immune responses in humans. As such, P. goldsteinii RV-01 cells are expected to exhibit anti-inflammation effects. As shown in FIGs. 3A and 3B, P. goldsteinii RV-01 exhibits a different LPS profile as compared with that of P. goldsteinii MTS01. For example, the LPS profile of P. goldsteinii RV-01 include little or no Species C, the structure of which is provided in FIG. 3C.

[0035] In some embodiments, live P. goldsteinii RV-01 cells can be used in any of the compositions provided herein.

[0036] In other embodiments, inactivated P. goldsteinii RV-01 cells can be used in any of the compositions provided herein. “Inactivated” refers to non-viable or dead cells, which are unable to growth and proliferate under suitable conditions for growth and proliferation of the live counterparts. The inactivated P. goldsteinii cells may be intact. Alternatively, the inactivated P. goldsteinii cells may be broken. In some examples, the inactivated P. goldsteinii cells include cell membrane or cell wall components, for example, portion or all of the LPS components. Inactivation can be confirmed by viability testing. See, e.g., Example 1 below.

[0037] The inactivated P. goldsteinii cells can be prepared through chemical or physical means, e.g., via a conventional method. Examples include sonication, which uses ultrasound to disrupt intermolecular interactions, treatment with a chemical agent such as ethanol, formalin, NaOH, or β-propiolactone (BPL) , and treatment with ultraviolet radiation such as UV-C. In some example, the inactivated P. goldsteinii cells can be prepared by autoclave. Autoclaving is a process using pressurized steam to kill bacteria and other microorganisms. In some instances, the autoclaving process for producing the inactivated P. goldsteinii cells may be carried out at about 121 ℃. If needed, a higher temperature can be used. The autoclaving duration may depend on the item (e.g., whether it is wrapped) and / or the type of autoclave being used.

[0038] (b) Compositions Comprising P. goldsteinii Cells

[0039] Any of the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells provided herein may be mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers to form a composition such as a pharmaceutical composition, which can be used to achieve the therapeutic benefits disclosed herein.

[0040] The carrier in the composition (e.g., pharmaceutical composition) must be “acceptable” in the sense that it is compatible with the active ingredient of the composition (and preferably, capable of stabilizing the active ingredient) and not deleterious to the subject to be treated. Pharmaceutical excipients useful in the present disclosure include, but are not limited to, binders, fillers, disintegrants, lubricants, coatings, sweeteners, flavors and colors. One of skill in the art will recognize that other pharmaceutical excipients are useful in the present disclosure.

[0041] Acceptable carriers (e.g., excipients, or stabilizers) are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations used, and may comprise buffers such as phosphate, citrate, and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as octadecyl dimethyl benzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; benzoates, sorbate and m-cresol) ; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, serine, alanine or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates including glucose, mannose, or dextrans; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counter-ions such as sodium; metal complexes (e.g., Zn-protein complexes) ; and / or non-ionic surfactants such as TWEENTM (polysorbate) , PLURONICSTM (nonionic surfactants) , or polyethylene glycol (PEG) .

[0042] Composition Format

[0043] In some embodiments, the composition provided herein can be a pharmaceutical composition comprising pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or stabilizers in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover. Such carriers, excipients or stabilizers may enhance one or more properties of the active ingredients in the compositions described herein, e.g., bioactivity, stability, bioavailability, and other pharmacokinetics and / or bioactivities. Pharmaceutically acceptable carriers include diluents, fillers, salts, buffers, stabilizers, solubilizers and other material, which are well-known in the art. Such pharmaceutical compositions may routinely contain salt, buffering agents, preservatives, compatible carriers, and optionally other therapeutic agents.

[0044] In some embodiments, the compositions described herein can be a health food or a health food product, which can be any kinds of liquid and solid / semi-solid materials that are used for improving medical conditions such as those disclosed herein. The health food product may be a food product (e.g., tea-based beverages, juice, soft drinks, coffee, milk, jelly, cookies, cereals, chocolates, snack bars, herbal extracts, dairy products (e.g., ice cream, and yogurt) ) , a food / dietary supplement, or a nutraceutical formulation. The health food product described herein, containing the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells as disclosed herein may comprise one or more edible carriers. Examples of edible carriers include starch, cyclodextrin, maltodextrin, methylcellulose, carbonmethoxy cellulose, xanthan gum, and aqueous solutions thereof.

[0045] In certain embodiments, the composition disclosed herein can be a medical food, which may be a food product formulated to be consumed or administered enterally. Such a food product is usually used under the supervision of a physician for the specific dietary management of a target disease, such as those described herein. In some instances, such a medical food composition is specially formulated and processed (as opposed to a naturally occurring foodstuff used in a natural state) for a patient in need of the treatment (e.g., human patients who suffer from illness or who requires use of the product as a major active agent for alleviating a disease or condition via specific dietary management) . In some examples, a medical food composition described herein is not one of those that would be simply recommended by a physician as part of an overall diet to manage the symptoms or reduce the risk of a disease or condition.

[0046] In some embodiments, the compositions provided herein such as pharmaceutical compositions used for in vivo administration are sterile. This is readily accomplished by, for example, filtration through sterile filtration membranes. Therapeutic compositions are generally placed into a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle.

[0047] The compositions described herein can be in unit dosage forms such as tablets, pills, capsules, powders, granules, solutions or suspensions, or suppositories, for a suitable administration route, for example, oral, parenteral or topical administration.

[0048] For preparing solid compositions such as tablets, the principal active ingredient (the P. goldsteinii cells) can be mixed with a pharmaceutical carrier, e.g., conventional tableting ingredients such as corn starch, lactose, sucrose, sorbitol, talc, stearic acid, magnesium stearate, dicalcium phosphate or gums, and other pharmaceutical diluents, e.g., water, to form a solid preformulation composition containing a homogeneous mixture of a compound of the present invention, or a non-toxic pharmaceutically acceptable salt thereof. When referring to these preformulation compositions as homogeneous, it is meant that the active ingredient is dispersed evenly throughout the composition so that the composition may be readily subdivided into equally effective unit dosage forms such as tablets, pills and capsules. This solid preformulation composition is then subdivided into unit dosage forms of the type described above containing from 0.1 to about 1000 mg of the active ingredient of the present invention. The tablets or pills of the composition can be coated or otherwise compounded to provide a dosage form affording the advantage of prolonged action. For example, the tablet or pill can comprise an inner dosage and an outer dosage component, the latter being in the form of an envelope over the former. The two components can be separated by an enteric layer that serves to resist disintegration in the stomach and permits the inner component to pass intact into the duodenum or to be delayed in release. A variety of materials can be used for such enteric layers or coatings, such materials including a number of polymeric acids and mixtures of polymeric acids with such materials as shellac, cetyl alcohol, and cellulose acetate.

[0049] The pH of a composition such as a pharmaceutical composition or dosage form, or of the tissue to which the pharmaceutical composition or dosage form is applied, may also be adjusted to improve delivery of one or more active ingredients. Similarly, the polarity of a solvent carrier, its ionic strength, or tonicity can be adjusted to improve delivery. Compounds such as stearates can also be added to pharmaceutical compositions or dosage forms to advantageously alter the hydrophilicity or lipophilicity of one or more active ingredients so as to improve delivery. In this regard, stearates can serve as a lipid vehicle for the formulation, as an emulsifying agent or surfactant, and as a delivery enhancing or penetration enhancing agent. Different salts, hydrates or solvates of the active ingredients can be used to further adjust the properties of the resulting composition.

[0050] Oral Formulations

[0051] In yet other embodiments, the compositions provided herein (e.g., a pharmaceutical composition as disclosed herein) can be formulated as an oral formulation. Compositions that are suitable for oral administration can be presented as discrete dosage forms, such as, but are not limited to, tablets (e.g., chewable tablets) , caplets, capsules, and liquids (e.g., flavored syrups) . Such dosage forms contain predetermined amounts of active ingredients, and may be prepared by methods of pharmacy well known to those skilled in the art. See generally, Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press; 22 edition (September 15, 2012) . In certain embodiments, the oral dosage forms are solid and prepared under anhydrous conditions with anhydrous ingredients, as described in detail herein. However, the scope of the compositions provided herein extends beyond anhydrous, solid oral dosage forms. As such, further forms are described herein.

[0052] Typical oral dosage forms are prepared by combining P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells in an intimate admixture with at least one excipient according to conventional pharmaceutical compounding techniques. Excipients can take a wide variety of forms depending on the form of preparation desired for administration. In certain embodiments, excipients suitable for use in oral liquid or aerosol dosage forms include, but are not limited to, water, glycols, oils, alcohols, flavoring agents, preservatives, and coloring agents. In certain embodiments, excipients suitable for use in solid oral dosage forms (e.g., powders, tablets, capsules, and caplets) include, but are not limited to, starches, sugars, micro crystalline cellulose, diluents, granulating agents, lubricants, binders, and disintegrating agents.

[0053] In some instances, excipients that can be used in oral dosage forms include, but are not limited to, binders, fillers, disintegrants, and lubricants. Binders suitable for use in pharmaceutical compositions and dosage forms include, but are not limited to, corn starch, potato starch, or other starches, gelatin, natural and synthetic gums such as acacia, sodium alginate, alginic acid, other alginates, powdered tragacanth, guar gum, cellulose and its derivatives (e.g., ethyl cellulose, cellulose acetate, carboxymethyl cellulose calcium, sodium carboxymethyl cellulose) , polyvinyl pyrrolidone, methyl cellulose, pre gelatinized starch, hydroxypropyl methyl cellulose, (e.g., Nos. 2208, 2906, 2910) , microcrystalline cellulose, and mixtures thereof.

[0054] Topical Formulations

[0055] In some embodiments, the composition provided herein such as pharmaceutical compositions can be transdermal and topical dosage forms. Transdermal and topical dosage forms include, but are not limited to, sprays, aerosols, creams, lotions, ointments, gels, solutions, emulsions, suspensions, or other forms known to one of skill in the art. See, e.g., Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press; 22 edition (September 15, 2012) ; and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985) . Further, transdermal dosage forms include “reservoir type” or “matrix type” patches, which can be applied to the skin and worn for a specific period of time to permit the penetration of a desired amount of active ingredients.

[0056] Suitable carriers (e.g., excipients and diluents) and other materials that can be used to provide transdermal and topical dosage forms encompassed herein include the ones known to those skilled in the pharmaceutical arts. Typical carriers include, but are not limited to, water, acetone, ethanol, ethylene glycol, propylene glycol, butane 1, 3 diol, isopropyl myristate, isopropyl palmitate, mineral oil, and mixtures thereof to form lotions, tinctures, creams, emulsions, gels or ointments, which are nontoxic and pharmaceutically acceptable. In some embodiments, materials which may serve as pharmaceutically acceptable carriers include: (1) sugars, such as lactose, glucose and sucrose; (2) starches, such as corn starch and potato starch; (3) cellulose, and its derivatives, such as sodium carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose and cellulose acetate; (4) powdered tragacanth; (5) malt; (6) gelatin; (7) talc; (8) excipients, such as cocoa butter and suppository waxes; (9) oils, such as peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil and soybean oil; (10) glycols, such as propylene glycol; (11) polyols, such as glycerin, sorbitol, mannitol and polyethylene glycol; (12) esters, such as ethyl oleate and ethyl laurate; (13) agar; (14) buffering agents, such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide; (15) alginic acid; (16) pyrogen-free water; (17) isotonic saline; (18) Ringer’s solution; (19) ethyl alcohol; (20) phosphate buffer solutions; and (21) other non-toxic compatible substances employed in pharmaceutical formulations. Moisturizers or humectants can also be added to pharmaceutical compositions and dosage forms if desired. Examples of such additional ingredients are well known in the art. See, e.g., Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press; 22 edition (September 15, 2012) .

[0057] Depending on the specific tissue to be treated, additional components may be used prior to, in conjunction with, or subsequent to treatment with active ingredients provided. In certain embodiments, penetration enhancers can be used to assist in delivering the active ingredients to the tissue. Suitable penetration enhancers include, but are not limited to: acetone; various alcohols such as ethanol, oleyl, and tetrahydrofuryl; alkyl sulfoxides such as dimethyl sulfoxide; dimethyl acetamide; dimethyl formamide; polyethylene glycol; pyrrolidones such as polyvinylpyrrolidone; Kollidon grades (Povidone, Polyvidone) ; urea; and various water soluble or insoluble sugar esters such as Tween 80 (polysorbate 80) and Span 60 (sorbitan monostearate) .

[0058] Parenteral Formulation

[0059] In yet other embodiments, the compositions such as pharmaceutical compositions provided herein may be in parenteral dosage form, which can be administered to subjects by various routes including, but not limited to, subcutaneous, intravenous (including bolus injection) , intramuscular, and intra-arterial. In certain embodiments, parenteral dosage forms can be administered to subjects by various routes including, but not limited to, topical, intradermal, or intralesional. Because their administration typically bypasses subjects’ natural defenses against contaminants, parenteral dosage forms are typically, sterile or capable of being sterilized prior to administration to a subject. In certain embodiments, parenteral dosage forms include, but are not limited to, solutions ready for injection, dry products ready to be dissolved or suspended in a pharmaceutically acceptable vehicle for injection, suspensions ready for injection, and emulsions.

[0060] Suitable vehicles that can be used to provide parenteral dosage forms are well known to those skilled in the art. In certain embodiments, suitable vehicles include, but are not limited to: Water for Injection USP; aqueous vehicles such as, but not limited to, Sodium Chloride Injection, Ringer’s Injection, Dextrose Injection, Dextrose and Sodium Chloride Injection, and Lactated Ringer’s Injection; water miscible vehicles such as, but not limited to, ethyl alcohol, polyethylene glycol, and polypropylene glycol; and non-aqueous vehicles such as, but not limited to, corn oil, cottonseed oil, peanut oil, sesame oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzyl benzoate. Compounds that increase the solubility of one or more of the active ingredients disclosed herein can also be incorporated into the parenteral dosage forms.

[0061] In other instances, the compositions provided herein (e.g., a pharmaceutical composition as disclosed herein) can be formulated as an injectable formulation (e.g., for intradermal injection) . A sterile injectable composition, e.g., a sterile injectable aqueous or oleaginous suspension, can be formulated according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents (such as Polysorbate 80) and suspending agents. The sterile injectable preparation can also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent, for example, as a solution in 1, 3-butanediol. Among the acceptable vehicles and solvents that can be employed are mannitol, water, Ringer’s solution and isotonic sodium chloride solution. In addition, sterile, fixed oils are conventionally employed as a solvent or suspending medium (e.g., synthetic mono-or diglycerides) . Fatty acids, such as oleic acid and its glyceride derivatives are useful in the preparation of injectables, as are natural pharmaceutically-acceptable oils, such as olive oil or castor oil, especially in their polyoxyethylated versions. These oil solutions or suspensions can also contain a long-chain alcohol diluent or dispersant, or carboxymethyl cellulose or similar dispersing agents. Other commonly used surfactants such as Tweens or Spans or other similar emulsifying agents or bioavailability enhancers which are commonly used in the manufacture of pharmaceutically acceptable solid, liquid, or other dosage forms can also be used for the purposes of formulation.

[0062] Sustained Release Formulation

[0063] In some instances, the compositions provided herein such as pharmaceutical compositions can be formulated in a sustained-release format. Suitable examples of sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells described herein, which matrices are in the form of shaped articles, e.g., films, or microcapsules. Examples of sustained-release matrices include, but are not limited to, polyesters, hydrogels (for example, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) , or poly (vinylalcohol) ) , polylactides (U.S. Pat. No. 3,773,919) , copolymers of L-glutamic acid and 7 ethyl-L-glutamate, non-degradable ethylene-vinyl acetate, degradable lactic acid-glycolic acid copolymers such as the LUPRON DEPOTTM (injectable microspheres composed of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate) , sucrose acetate isobutyrate, and poly-D- (-) -3-hydroxybutyric acid.

[0064] II. Methods of Alleviating Medical Conditions with Compositions Comprising P. goldsteinii Cells

[0065] Any of the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells disclosed herein, live or inactivated, as well as compositions comprising such as also disclosed herein can be used to alleviate a target medical condition as also disclosed herein. Accordingly, provided herein, in some aspects, are methods for alleviating a medical condition comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells or a composition comprising such via a suitable administration route. In some examples, the subject for the treatment is a human patient.

[0066] In some embodiments, provided herein is a method for alleviating a condition associated with aging comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells or a composition comprising such via a suitable administration route. Aging is a process of becoming older and it is associated with a person’s physical, psychological, and social life. It is caused by a buildup of cellular and molecular damage in the body over time.

[0067] In some examples, the age-related condition is sarcopenia, which is a condition characterized by a progressive loss of muscle mass, strength, and function. The main symptom of sarcopenia is muscle weakness. Sarcopenia is a type of muscle atrophy primarily caused by the natural aging process. In some instances, the subject for a treatment of sarcopenia as disclosed herein can be a human patient diagnosed with sarcopenia. In other instances, the subject can be a human patient who exhibits one or more symptoms associated with sarcopenia. Alternatively, the subject may be a human patient at risk for development of sarcopenia.

[0068] In some examples, the age-related condition is skin-aging, which is a natural process involving a number of changes to the skin. Examples include thinning, wrinkling, age spots, dryness, slower healing, or a combination thereof. The subject for a treatment of skin-aging as disclosed herein can be a human patient who exhibits one or more skin-aging signs such as those exemplified herein. In other instances, the subject may be a human patient at risk for skin-aging.

[0069] In some examples, the age-related condition is intestinal aging, which refers to a number of changes that can lead to digestive issues and increased risks of age-related diseases. Exemplary changes associated with intestinal aging include deficiency in motor control, which can result in constipation, reduced regenerative capacity of intestinal epithelium cells, changes in intestinal microbiota, changed immune system, altered epithelial function, and / or altered enteric nervous system. Typical symptoms associated with intestinal aging include bloating and gas, and / or acid reflux. The subject for a treatment of intestinal aging as disclosed herein can be a human patient who exhibits one or more of the symptoms associated with intestinal aging. In other instances, the subject matter may be a human patient at risk for intestinal aging.

[0070] In some examples, the age-related condition is aberrant circadian rhythm. Aging can cause disruption in circadian rhythm, leading to changes in sleep patterns and other behaviors. For example, aging can result in sleep changes, such as changes in sleep duration, timing, and fragmented sleep patterns. Sleep disruption can be linked to worse cognitive performance. Increased fragmentation of the rest-activity rhythm is associated with cognitive decline. Circadian rhythm disruption can also promote brain changes that lead to inflammation, oxidative stress, and metabolic dysfunction. The subject for a treatment of age-related aberrant circadian rhythm as disclosed herein can be a human patient who experiences one or more changes as those disclosed herein that may result from age-related aberrant circadian rhythm. In other examples, the subject may be a human patient at risk for age-related aberrant circadian rhythm.

[0071] In some examples, the age-related condition is declined cognition. Cognitive aging is the gradual change in cognitive function associated with aging, including subtle declines in thinking speed and attention. The subject for a treatment of age-related cognition deficiency as disclosed herein can be a human patient who experiences decline of cognition associated with aging. In some instances, the subject may be a human patient who is at risk for age-related decline of cognition.

[0072] In some embodiments, provided herein is a method for alleviating inflammation comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells or a composition comprising such via a suitable administration route. Inflammation is a bodily response to harmful stimuli, such as pathogens, damaged cells, or irritants. Typically signs associated with inflammation include pain, redness, loss of function, swelling, and / or heat. The subject for a treatment of inflammation as disclosed herein can be a human patient who exhibit one or more symptoms associated with inflammation.

[0073] In some embodiments, provided herein is a method for treating a cancer (e.g., colon cancer) comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells or a composition comprising such via a suitable administration route. The subject for a treatment of inflammation as disclosed herein can be a human patient who is diagnosed as having the target cancer. In other instances, the subject may be a human patient who exhibits one or more symptoms associated with the cancer. In yet other instances, the subject may be a human patient at risk for developing the target cancer. In some examples, the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells or a composition comprising such may be used as an adjunct therapy in combination with another anti-cancer therapy applied to the subject. For example, the subject may be on a cancer treatment comprising a checkpoint inhibitor, such as a PD-1 inhibitor, e.g., an anti-PD-1 or anti-PD-L1 antibody. Examples include anti-PD1 antibodies such as nivolumab, pembrolizumab, cemiplimab, dostarlimab, retifanlimab, toripalimab, or tislelizumab, and anti-PD-L1 antibodies such as atezolizumab, avelumab, and durvalumab.

[0074] In some embodiments, provided herein is a method for alleviating a metabolic syndrome comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells or a composition comprising such via a suitable administration route. Metabolic syndrome is a chronic condition that often occurs when a person has one of more of the following risk factors: abdominal obesity, high blood pressure, high blood sugar, high triglycerides, and low high-density lipoprotein cholesterol. The subject for a treatment of a metabolic syndrome as disclosed herein can be a human patient who exhibit one or more related symptoms. In some instances, the subject can be a human patient at risk for developing a metabolic syndrome.

[0075] In some embodiments, provided herein is a method for alleviating chronic kidney disease (CKD) comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells or a composition comprising such via a suitable administration route. CKD is a condition where the kidneys are damaged and cannot filter blood properly. Conventional symptoms associated with CKD include weight loss and poor appetite, swollen ankles, feet, or hands, shortness of breath, tiredness, blood in urine, an increased need to pee, difficulty in sleeping, and / or itchy skin. The subject for a treatment of CKD as disclosed herein can be a human patient who exhibit one or more related symptoms. In some instances, the subject can be a human patient at risk for developing CKD.

[0076] As used herein, the term “treating” refers to the application or administration of a composition including one or more active agents to a subject, who has a target disease or disorder, a symptom of the disease / disorder, or a predisposition toward the disease / disorder, with the purpose to cure, heal, alleviate, relieve, alter, remedy, ameliorate, improve, or affect the disorder, the symptom of the disease, or the predisposition toward the disease or disorder.

[0077] Alleviating a target disease / disorder includes delaying the development or progression of the disease or reducing disease severity or prolonging survival. Alleviating the disease or prolonging survival does not necessarily require curative results. As used therein, "delaying" the development of a target disease or disorder means to defer, hinder, slow, retard, stabilize, and / or postpone progression of the disease. This delay can be of varying lengths of time, depending on the history of the disease and / or individuals being treated. A method that delays or alleviates the development of a disease, or delays the onset of the disease, is a method that reduces probability of developing one or more symptoms of the disease in a given time frame and / or reduces extent of the symptoms in a given time frame, when compared to not using the method. Such comparisons are typically based on clinical studies, using a number of subjects sufficient to give a statistically significant result.

[0078] “Development” or “progression” of a disease means initial manifestations and / or ensuing progression of the disease. Development of the disease can be detectable and assessed using standard clinical techniques as well known in the art. However, development also refers to progression that may be undetectable. For purpose of this disclosure, development or progression refers to the biological course of the symptoms. “Development” includes occurrence, recurrence, and onset. As used herein “onset” or “occurrence” of a target disease or disorder includes initial onset and / or recurrence.

[0079] To practice the method disclosed herein, an effective amount of the composition described herein (e.g., a pharmaceutical composition) can be administered to a subject (e.g., a human) in need of the treatment via a suitable route, for example, orally, parenterally, by inhalation spray, topically, rectally, nasally, buccally, vaginally or via an implanted reservoir. The term “parenteral” as used herein includes subcutaneous, intracutaneous, intravenous, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.

[0080] In some embodiments, the composition comprising the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells can be administered to the subject via a systemic route. In some embodiments, the systemic route includes the administration of the composition orally or parenterally.

[0081] Alternatively, the composition can be administered to the subject via a local route, for example, topically. In some embodiments, the composition such as the pharmaceutical composition comprising the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells can be administered to a body site of the subject where treatment is needed. In some embodiments, the composition is administered to a subject such as a human subject by topical administration. In some instances, the composition comprising such may be applied to a skin site where treatment is needed.

[0082] As used herein, “an effective amount” refers to the amount of each active agent required to confer therapeutic effect on the subject, either alone or in combination with one or more other active agents. Determination of whether an amount of the antibody achieved the therapeutic effect would be evident to one of skill in the art. Effective amounts vary, as recognized by those skilled in the art, depending on the particular condition being treated, the severity of the condition, the individual patient parameters including age, physical condition, size, gender and weight, the duration of the treatment, the nature of concurrent therapy (if any) , the specific route of administration and like factors within the knowledge and expertise of the health practitioner. These factors are well known to those of ordinary skill in the art and can be addressed with no more than routine experimentation. It is generally preferred that a maximum dose of the individual components or combinations thereof be used, that is, the highest safe dose according to sound medical judgment.

[0083] Empirical considerations, such as the half-life, generally will contribute to the determination of the dosage. Frequency of administration may be determined and adjusted over the course of therapy, and is generally, but not necessarily, based on treatment and / or suppression and / or amelioration and / or delay of the target medical condition as disclosed herein. Alternatively, sustained continuous release formulations of the P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells may be appropriate. Various formulations and devices for achieving sustained release are known in the art.

[0084] For the purpose of the present disclosure, the appropriate dosage of the pharmaceutical composition as described herein will depend on the specific active agents and optionally hydrophilic agents employed, the type and severity of the disease / disorder, whether the composition is administered for preventive or therapeutic purposes, previous therapy, the patient's clinical history and response to the active agents, and the discretion of the attending physician. Typically, the clinician will administer a pharmaceutical composition disclosed herein, until a dosage is reached that achieves the desired result.

[0085] Any of the therapeutic benefits by a method disclosed herein can be evaluated via routine practice.

[0086] III. Kits for Alleviating Medical Conditions

[0087] In one aspect, the present disclosure provides a kit for alleviating an age-related condition, or a medical condition of cancer, inflammation, metabolic syndrome, or CKD in a subject. The kit may comprise a composition (e.g., a pharmaceutical composition) comprising P. goldsteinii cells such as P. goldsteinii RV-01 cells as described herein with an instruction for effective administration. Such kits can include one or more containers comprising the pharmaceutical composition disclosed herein. In some embodiments, the composition is for co-use with a second agent that is effective for the target condition (e.g., a checkpoint inhibitor for cancer treatment) .

[0088] In some embodiments, the instruction for use is in accordance with any of the methods described herein for achieving a therapeutic benefit as disclosed herein. The included instructions can comprise a description of administration of the pharmaceutical composition, and optionally the second agent, to treat, delay the onset, or alleviate the medical condition in a subject. The kit may further comprise a description of selecting an individual suitable for the treatment based on identifying whether that individual needs to achieve the desired therapeutic benefit, e.g., following a routine procedure.

[0089] The instructions relating to the use of the pharmaceutical composition disclosed herein generally include information as to dosage, dosing schedule, and route of administration for the intended treatment. The containers may be unit doses, bulk packages (e.g., multi-dose packages) or sub-unit doses. Instructions supplied in the kits are typically written instructions on a label or package insert (e.g., a paper sheet included in the kit) , but machine-readable instructions (e.g., instructions carried on a magnetic or optical storage disk) are also acceptable.

[0090] The label or package insert indicates that the composition is used for treating, delaying the onset and / or alleviating a target medical condition. Instructions may be provided for practicing any of the methods described herein.

[0091] The kits are in suitable packaging. Suitable packaging includes, but is not limited to, vials, bottles, jars, flexible packaging (e.g., sealed Mylar or plastic bags) , and the like. Also contemplated are packages for use in combination with a specific device, such as an inhaler, nasal administration device (e.g., an atomizer) or an infusion device such as a minipump. A kit may have a sterile access port (for example the container may be an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle) . The container may also have a sterile access port (for example the container may be an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle) .

[0092] Kits may optionally provide additional components such as buffers and interpretive information. Normally, the kit comprises a container and a label or package insert (s) on or associated with the container.

[0093] General techniques

[0094] The practice of the present disclosure will employ, unless otherwise indicated, conventional techniques of molecular biology (including recombinant techniques) , microbiology, cell biology, biochemistry, and immunology, which are within the skill of the art. Such techniques are explained fully in the literature, such as Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed. 1984) ; Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. 1987) ; Introuction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc. ) ; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds. ) : Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987) ; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds. 1987) ; PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994) ; Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991) ; Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) ; Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997) ; Antibodies (P. Finch, 1997) ; Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989) ; Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000) ; Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) ; The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995) ; DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985) ; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985>>; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984>>; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986>>; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986>>; and B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; F.M. Ausubel et al. (eds. ) .

[0095] Without further elaboration, it is believed that one skilled in the art can, based on the above description, utilize the present invention to its fullest extent. The following specific embodiments are, therefore, to be construed as merely illustrative, and not limitative of the remainder of the disclosure in any way whatsoever. All publications cited herein are incorporated by reference for the purposes or subject matter referenced herein.

[0096] EXAMPLES

[0097] While the present disclosure has been described with reference to the specific embodiments thereof, it should be understood by those skilled in the art that various changes may be made, and equivalents may be substituted without departing from the true spirit and scope of the disclosure. In addition, many modifications may be made to adapt a particular situation, material, composition of matter, process, process step or steps, to the objective, spirit, and scope of the present disclosure. All such modifications are intended to be within the scope of the disclosure.

[0098] Example 1: Isolation, Characterization, and Safety Evaluation of Autoclaved Gut Commensal P. goldsteinii Strain RV-01

[0099] This example explores isolation, genomic and functional characterization, and safety evaluations of inactivated P. goldsteinii strain RV-01 by autoclaving. P. goldsteinii RV-01 was isolated from feces of a healthy adult by streaking on anaerobic blood agar plates, Bacteroides Bile Esculin agar plate and Laked blood with kanamycin and vancomycin agar plate and grown at 37 ℃ in a Whitley A35 anaerobic chamber with mixed anaerobic gas (5%carbon dioxide, 5%hydrogen, 90%nitrogen) . Colonies were picked and screened by PCR using P. goldsteinii-specific 16S rRNA primers as described in Wu et al., Gut, 2019, 68 (2) : 248-262, and confirmed for full-length 16S rRNA via Sanger’s method. On CDC anaerobic blood agar plates, P. goldsteinii RV-01 colonies are smooth circular with 1–2 mm in diameter, grey to off-white–grey, and slightly convex. 16S rRNA sequencing-validated Working Cell Bank was maintained to store inoculum for culture initiation. A seed culture P. goldsteinii RV-01 was used to inoculate production culture at 37℃ for 24 hours in the fermentation vessel. Fermentation was conducted in accordance with Good Manufacturing Practice and Hazard Analysis and Critical Control Point conditions. Following production, bacteria was pelleted by centrifugation, and subjected to autoclaving at 121℃ for 15 minutes. Transmission Electron Microscope images showed no significant differences in morphology between live and autoclaved P. goldsteinii RV-01 strain (FIGs. 1A and 1B) . FIG. 1C shows complete growth inhibition of the autoclaved P. goldsteinii RV-01 compared to live cultures. Autoclaved bacteria were mixed 1: 6 (w / w) with maltodextrin, the mixture was lyophilized, and the cake was grounded to a powder.

[0100] The enumeration of autoclaved P. goldsteinii RV-01 in the powder was conducted via flow cytometry using BacLightTM Bacterial Viability and Counting Kit. P. goldsteinii RV-01 ingredient for toxicologic studies was determined as 5.406×1010 TFU / g, which stands for as total fluorescent units and represents the sum of dead cells. Table 1 enumerates proximate analysis showing averaged results from five batches of autoclaved P. goldsteinii RV-01 powder.

[0101] Table 1: Proximate Composition of the Autoclaved P. goldsteinii RV-01 Ingredient.

[0102] The genomic DNA of P. goldsteinii RV-01 was extracted using Easy Pure Genomic DNA Spin Kit. The long fragment sequences were generated by the third-generation Oxford Nanopore sequencing platform. The whole genome of P. goldsteinii RV-01 was sequenced by Nanopore genome sequence analysis. The genome sequence with a total length of 6,631,096 bps and annotation of P. goldsteinii RV-01 strain has been deposited at NCBI BioProject number PRJNA1153404. Analysis shows The GC content of genome is 43%, and no plasmid DNA was detected. Annotation of the sequences of P. goldsteinii RV-01 revealed the genome consists of 5, 241 coding DNA sequences, 79 tRNA genes, and 18 rRNA genes. The functional annotation results of the Clusters of Orthologous Genes (COG) database divided into 22 categories. Among these, the most abundant category is the signal transduction mechanisms, followed by general function, and cell wall / membrane / envelop biogenesis. Table 2 shows Average Nucleotide Identity (ANI) between P. goldsteinii RV-01 and similar species and strains as calculated using the tool available at ANI Calculator (https:  / / www. ezbiocloud. net / tools / ani) using the OrthoANIu algorithm.

[0103] Table 2: Average Nucleotide Identity (ANI) Analysis

[0104] Genomic Characteristics

[0105] The whole genome of P. goldsteinii RV-01 was sequenced by Nanopore genome sequence analysis. The completed circular chromosomal map with a total length of 6,631,096 bps. P. goldsteinii RV-01 do not harbor any plasmid DNA. The GC content of genome is 43%. Annotation of the sequences revealed the genome consists of 5, 241 coding DNA sequences, 79 tRNA genes, and 18 rRNA genes. The functional annotation results of the COG database are shown in FIG. 1D, which are divided into 22 categories. The most abundant category is signal transduction mechanisms, followed by general function, and cell wall / membrane / envelop biogenesis.

[0106] Genome comparisons were performed between P. goldsteinii RV-01 genome and those of two P. goldsteinii strains (MTS01 and JCM13446) . The genome sequences of P. goldsteinii JCM13446 strain had been deposited in GenBank (RefSeq assembly: GCF_000969835.1) . The genome assembly of 7 contigs of JCM13446 strain was 6,486,757 bps. The full-genome sequences of P. goldsteinii MTS01 strain had been deposited in GenBank (RefSeq assembly: GCA_017873595.1) and were with a total length of 6,881,351 bps.

[0107] The predicted translated amino-acid sequence-based comparison between P. goldsteinii RV-01 and MTS01 revealed that RV-01 strain has 1058 genes / open reading frames (ORFs) with protein sequence identity <70%. Surprisingly, a total of 566 genes were NOT mapped to those of MTS01, indicating these 566 genes were unique in RV-01 strain. Concordantly, amino-acid sequence-based comparison between P. goldsteinii RV-01 and JCM13446 also showed that RV-01 strain has 1009 genes / ORFs with protein sequence identity <70%, and there were 600 genes / ORFs not mapped to those of JCM13446. In brief, these results indicated that the composition of genes differed between P. goldsteinii RV-01 and the other two P. goldsteinii strains.

[0108] From the genome-wide view based on the chromosomal organization, the circular map showed the comparison of similarity of the translated amino-acid between the P. goldsteinii RV-01 and the other two P. goldsteinii strains. It was observed that some regions / genes clusters of the strain P. goldsteinii RV-01 have lower identity or were even unmapped with the genomes of strains MTS01 and JCM13446. These results implied that these genes clusters might be acquired by these strains via horizontal gene transfer. In conclusion, a large degree of genomic diversity among P. goldsteinii strains was revealed.

[0109] Phenotypic Characteristics

[0110] The short chain fatty acids SCFAs acetate, propionate, and butyrate are the main metabolites produced in the colon by bacterial fermentation of dietary fibers and resistant starch and have been shown to provide various health benefits. Pascale et al., Endocrine 2018, 61 (3) : 357-371. The productions of SCFA in P. goldsteinii RV-01 were determined by Mass (MS) analysis of bacterial culture supernatant. The major SCFAs are acetic and propionic acids; minor amounts of isobutyric acid, 3-Methylbutyric acid, 2-Methylbutyric acid and formic acid are produced (FIG. 2A) . A total of 413 genes (7.9%of genome) encoding CAZy including glycoside hydrolase (GH) , glycosyl transferase (GT) , carbohydrate binding module (CBM) , carbohydrate esterase (CE) , and polysaccharide lyase (PL) were identified (FIG. 2B) . The major CAZy (atotal of 239) was GH which are a class of enzymes which catalyze the hydrolysis of glycosidic bonds in complex sugars. These results indicated that P. goldsteinii RV-01 is a complex carbohydrate-degrading and SCFA-producing bacterium.

[0111] Unlike the LPS of most Gram-negative bacteria (for example E. coli) eliciting proinflammatory responses, P. goldsteinii has been reported to produce the anti-inflammatory LPS (Pg-LPS) that antagonized the TLR4 activity. Lai et al., Gut 2022, 71 (2) : 309-321. E. coli normally produced a lipid A molecule with six acyl chains. Raetz et al., Annu Rev Biochem, 2007, 76: 295-329. A BLAST analysis of whole genome sequence of P. goldsteinii RV-01 highlighted genes involved in lipid A synthesis lacked LpxM, one ortholog of the acyltransferases genes which was responsible for addition the sixth-acyl chain of LPS and was expected to produce hypo-acylated lipid A. The Nuclear Magnetic Resonance structural analysis of LPS (lipid A) structures between the two strains, P. goldsteinii MTS01 and P. goldsteinii RV-01 revealed that the lipid A species in mouse P. goldsteinii (MTS-01) and human P. goldsteinii (RV-01) are different. Specifically, P. goldsteinii RV-01 lacked the species “c” (FIGs. 3A-3C and 5C) .

[0112] Safety Evaluations of autoclaved P. goldsteinii RV-01

[0113] Analysis of the P. goldsteinii RV-01 genome was conducted to screen for potential antibiotic resistance and virulence factor genes using the homology search tools by comparison with Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) and Virulence Factor DataBase (VFDB) . Although one gene tetQ met the threshold qualifications of >60%coverage and >70%identity, the results of minimal inhibitory concentration (MIC) assay showed that P. goldsteinii RV-01 was susceptible to tetracycline and PCR followed by agarose gel electrophoresis showed that the tetQ gene was not detected in the autoclaved P. goldsteinii RV-01 ingredient, excluding the potential for horizontal spreading of the tetQ gene. Further in silico analysis showed no genes in the P. goldsteinii RV-01 genome showing identity to known virulence factors were revealed. Together, the analyses indicated P. goldsteinii RV-01 is a non-pathogenic bacterium.

[0114] An in vitro cytotoxicity test on human embryonic kidney cells 293 (HEK293) was performed to see whether the autoclaved P. goldsteinii RV-01 show any cytotoxicity potential. Different numbers of autoclaved P. goldsteinii RV-01 were used to treat HEK293 with the multiplicity of infection (MOI) of 1, 10, 50, 100, 500, 1000 and 2000, respectively. Then the cytotoxicity was determined by measuring the level of extracellular LDH released from damaged cells. The results indicate that no cytotoxicity was observed even in the MOI up to 2000.

[0115] Other GLP OECD toxicological tests, such as the Bacterial Reverse Mutation Test / Ames test, In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test, Rodent Micronucleus Test in Peripheral Blood, 28-day repeated dose oral toxicity, 90-day repeated dose oral toxicity as listed in Table 3 shows that the autoclaved P. goldsteinii RV-01 product is non-toxicogenic.

[0116] Table 3. Toxicological Studies with Autoclaved P. goldsteinii RV-01.

[0117] Example 2: Anti-Inflammation Effect of P. goldsteinii RV-01

[0118] Unlike the LPS of most Gram-negative bacteria (for example E. coli) eliciting proinflammatory responses, P. goldsteinii was previously reported to produce the anti-inflammatory LPS (Pg-LPS) that antagonized the TLR4 activity. E. coli normally produced a lipid A molecule with six acyl chains. A previous study using the whole-genome-sequence BLAST analysis approach highlighted the LpxM was absent in P. goldsteinii MTS01. LpxM is an ortholog of one acyltransferase gene responsible for adding the sixth-acyl chain in LPS lipid A. Analysis of P. goldstenii RV-01 genome indicates the lack of LpxM. Therefore, P. goldstenii RV-01 was expected to produce the hypo-acylated lipid A and was therefore anti-inflammatory.

[0119] The anti-inflammatory potency of P. goldsteinii RV-01 and P. goldsteinii MTS01 was examined as described below. In the human colon epithelial HCT116 NF-κB & IRF reporter cell (HCT116 DualTM Cells) , autoclaved E. coli induced profound inflammation indicated by NF-κB activation after 20h. In comparison, autoclaved P. goldsteinii RV-01 or MTS01 strains did not show significant activation activity. However, pretreatment with P. autoclaved goldsteinii RV-01 for 2h significantly decreased the inflammation induced by autoclaved E. coli after 20h (FIG. 4) . This decrease in autoclaved E. Coli-induced inflammation was statistically lower than pretreatment with autoclaved P. goldsteinii MTS01 at the same MOI and duration (FIG. 4) . These results suggested that autoclaved P. goldsteinii RV-01 reduced the TLR4 related inflammation, where its LPS might be responsible for the TLR4 antagonization activity.

[0120] Example 3: Effects of Autoclaved P. goldsteinii RV-01 Strain on Ageing-Related Sarcopenia

[0121] This example evaluates the effects of inactivated P. goldsteinii RV-01 produced by autoclaving on ageing-related sarcopenia using an in vivo mouse model. Sarcopenia is the accelerated loss of skeletal muscle mass and function commonly, but not exclusively, associated with advancing age. Sayer et al, Nat Rev Dis Primers, 2024, 10 (68) . It is defined by loss of muscle mass and loss of muscle function or strength. Walston, Curr Opin Rheumatol, 2012, 24 (6) : 623-627.

[0122] Male 8-week-old (referred to as ‘young’ ) and 80-82-week-old (referred to as ‘aged’ ) C57BL / 6JNarl male mice were initially housed for 1 week under a 12 h light / dark cycle at 20–24℃ and 44–52%humidity to permit adaptation. After adaptation, the aged mice were randomly allocated to four groups (n =10 per group) and fed for 32 days with chow diet. Over the same period, PBS, Nicotinamide mononucleotide (NMN) (300 mg / kg / day) , autoclaved P. goldsteinii MTS-01 (2x108 TFU / kg / day) and P. goldsteinii RV-01 (2x108 TFU / kg / day) in an equal volume of vehicle was orally administered daily to the mice. The body weight, food intake, and water consumption of the mice were checked weekly. The tissues were collected for analysis and the organs were weighed. Aged vehicle mice had a significantly lower gastrocnemius / body weight compared to young vehicle mice (FIGs. 5A and 5B) . Only the aged mice administered with autoclaved P. goldsteinii RV-01 showed a significant increase in gastrocnemius / body weight compared to vehicle (FIGs. 5A and 5B) . Mice treated with NMN or autoclaved P. goldsteinii MTS01 did not show such effects.

[0123] The maximal muscle strength of the mice was determined by measuring grip strength at 32 days using a grip strength meter. At the end of the oral administration period, mice were placed with their forelimbs or all limbs on a grid and the grip strength was measured immediately before mice fell from the bar. While the aged mice had a significantly lower forelimb grip strength compared to young mice, all aged mice administered with NMN, autoclaved P. goldsteinii MTS-01, and autoclaved P. goldsteinii RV-01 showed a significant improvement in forelimb grip strength / body weight compared to vehicle (FIG. 5C) .

[0124] Next, a weight equivalent to 0%, 5%, and 7.5%body weight was attached to the root of the mouse tail by lead fish sinkers. The tank was maintained at 28℃ during the swimming process and the endurance for each mouse was measured as swimming time recorded from the beginning of the time to exhaustion, defined by observing uncoordinated movements and failure to return to the surface within 7s. The time of floating, struggling and making necessary movements was assessed until possible drowning and exhaustion. Aged mice showed a significant decrease in exhaustive swimming time compared to the young mice. Only the aged mice administered with autoclaved P. goldsteinii RV-01 showed a significant increase in exhaustive swimming time compared to control (FIG. 5D) .

[0125] Example 4: Effects of P. goldsteinii RV-01 on Intestinal immunity in Germ Free (GF) Mice

[0126] In this example, effects of live P. goldsteinii RV-01 on intestinal immunity were evaluated in Germ Free (GF) mice. GF mice were orally administrated with live P. goldsteinii RV-01 (5×108 CFU) once at 8 weeks old (n=3 in GF group; n=4 in GF+RV-01 group) . After 2 weeks of mono-colonization, mice were sacrificed, and their serum and colon tissues were collected for biochemical analysis and bulk RNA transcriptomic analysis, respectively.

[0127] Sera examination for liver and renal functions indicated that no adverse effects were identified (FIGs. 6A-6C) . Bulk transcriptomics analysis showed that P. goldsteinii RV-01 influenced multiple gene expressions, with 255 up-regulated genes and 557 down-regulated genes identified in the colon tissue. The pathways influenced by P. goldsteinii RV-01 were subsequently identified by using GSEA analysis. Among these, the expression of genes related to defense response to bacteria, antigen processing and presentation, T-cell differentiation, as well as B-cell homeostasis was upregulated. By contrast, decreased expression of genes related to neuronal cell body and cell junction was also observed. Previous results revealed that a normal immune development and a delayed neuronal response are elicited only after the microbiota accommodating homeostasis has been established in GF mice. In this study, the administration of P. goldsteinii RV-01 significantly enhanced the immunity and significantly decreased the neuronal response in the colon, implying the involvement of P. goldsteinii in the development of the immunity and the neuronal signaling.

[0128] Example 5: P. goldsteinii RV-01 Ameliorates Intestinal Aging

[0129] Aged mice (80–82-week-old) were treated daily with P. goldsteinii RV-01 for four weeks as described in Example 4 above. After four weeks, the intestinal health was examined by measuring microbiota endotoxin level in stool, IgA concentration in stool and mucosal thickness in ileum. Administration of P. goldsteinii RV-01 significantly decreased the endotoxin level in stool (FIG. 7A) , increased the IgA concentration in stool (FIG. 7B) and increased the mucosal thickness of ileum (FIG. 7C) in aged mice. These results demonstrated that P. goldsteinii ameliorated intestinal ageing.

[0130] Example 6: P. goldsteinii RV-01 Restores Aberrant Circadian Rhythm in Aging

[0131] The gastrocnemius muscle and ileum tissues of aged mice treated with vehicle or P. goldsteinii RV-01 for 4 weeks as disclosed in Example 4 above were collected and subjected to transcriptomic analysis. Then, the differential expressed genes and their enriched GO pathways were identified. The top 30 enriched GO terms in gastrocnemius muscle and ileum of aged mice upregulated by P. goldsteinii RV-01 are provided in FIGs. 8A-8F. The results revealed that the most significantly enriched pathway in both tissues was associated with circadian rhythm. Previous reports have demonstrated that circadian rhythms change with age and disruption of circadian clock function can exacerbate a wide range of age-related pathologies. Therefore, P. goldsteinii RV-01 may ameliorate a wide-range of aged-related diseases through regulation of circadian rhythm.

[0132] Example 7: P. goldsteinii RV-01 Ameliorates Skin Ageing

[0133] The dorsal skin tissues of aged mice treated with vehicle or P. goldsteinii RV-01 for 4 weeks as disclosed in Example 4 above were collected and subjected to transcriptomic analysis. Then, the top 30 activated and suppressed gene sets were revealed by using GSEA analysis.

[0134] Gene sets associated with establishment of skin barrier and keratinization were significantly activated by treatment of P. goldsteinii RV-01. Especially, analysis of the expression levels of gene sets associated with establishment of skin barrier and keratinization in dorsal skin of aged mice revealed genes encoding filaggrin and keratin were significantly induced by P. goldsteinii RV-01 (FIG. 9A) . Moreover, the expression levels of genes associated with strength and elasticity of skin (elastin and collagen) were also analyzed (FIG. 9B) . Treatment of P. goldsteinii RV-01 also significantly upregulated genes encoding elastin and collagen. Taken together, P. goldsteinii RV-01 ameliorates skin ageing.

[0135] Example 8: P. goldsteinii RV-01 Ameliorates Neuron Inflammation

[0136] The efficacy of P. goldsteinii RV-01 on neuron inflammation was evaluated by using HMC3 cells (human microglial cells) . HMC3 cells were treated with E. coli LPS with or without 2 hours earlier pretreatment of P. goldsteinii RV-01 of different concentrations for 22 hours. The RNAs were extracted and subjected for quantitative RT-PCR. The RNA expression levels of IL-6 (FIG. 10A) , IL-1β (FIG. 10B) and TNF-α (FIG. 10C) were significantly upregulated by treatment of E. coli LPS. Pretreatment of P. goldsteinii RV-01 significantly reduced the expression of these pro-inflammatory cytokines. These results indicated P. goldsteinii RV-01 reduces neuron inflammation.

[0137] Example 9: P. goldsteinii RV-01 Improves Efficacy of Anti-PD1 Treatment in Colon Cancer

[0138] The efficacy of P. goldsteinii RV-01 on anti-PD1 treatment in colon cancer was evaluated in CT26 tumor-bearing BALB / c mice. CT26 tumor-bearing mice were randomly grouped into three groups (isotype antibody treatment, anti-PD1 treatment and anti-PD1 treatment combined with autoclaved P. goldsteinii RV-01) at day 5 (when the average volumes of tumors were approximately 50 mm3) . Anti-PD1 (5 mg / kg) were intra-peritoneally injected at days 8, 11 and 14. P. goldsteinii RV-01 (5×109 TFU / mice) were administrated daily from day 1. The mice were sacrificed at day 28. Results from this study indicated that the combination of P. goldsteinii RV-01 and anti-PD1 significantly reduced the tumor volume and weight (FIGs. 11A-11D) . Further, the combination of P. goldsteinii RV-01 and the anti-PD1 antibody also significantly increased the amounts of CD8+ T cells and cytotoxic CD8+ T cells in tumor environments (FIGs. 11E-11F) . A similar outcome was observed in spleen (FIGs. 10G-10H) .

[0139] Taken together, P. goldsteinii RV-01 improves the efficacy of anti-PD1 treatment in colon cancer.

[0140] Example 10: P. goldsteinii RV-01 Ameliorates Metabolic Syndrome

[0141] The efficacy of P. goldsteinii RV-01 on amelioration of metabolic syndrome was examined in high fat diet (HFD) -fed mice. HFD-fed mice were treated daily with P. goldsteinii RV-01 for ten weeks (FIG. 12A) . After ten weeks, the body weight changes in HFD-fed mice were significantly higher than those with treatment of P. goldsteinii RV-01 (FIG. 12B) . By contrast, the amount of food intake was not significantly different between two groups (FIG. 12C) . Moreover, the fasting glucose level and the area under the curve (AUC) of oral glucose tolerance test (OGTT) and insulin tolerance test (ITT) test in HFD-fed mice with P. goldsteinii RV-01 treatment were significantly lower than those of HFD-fed mice (FIGs. 12D-12H) . Also, the measurement of serum level of alanine Transaminase (ALT) indicated that P. goldsteinii RV-01 significantly decreased the liver inflammation induced by HFD treatment (FIG. 12I) .

[0142] Taken together, these results demonstrated that P. goldsteinii RV-01 ameliorates metabolic syndrome.

[0143] Example 11: P. goldsteinii RV-01 Improves Learning, Memory and Cognition Abilities in Aged Rats

[0144] This example explores the effects of P. goldsteinii RV-01 in improving learning, memory, and cognition abilities in aged rats.

[0145] (a) Morris Water Maze

[0146] A Morris water maze test was performed to analyze long-term memory in an apparatus with a size of 120 cm in diameter. Aged rats treated or untreated with autoclaved P. goldsteinii RV-01 were examined for latency, path efficiency, mean distance to the platform and the corrected integrated path length during the probe trial. Track plot of each individual animal from the probe trial are recorded.

[0147] Aged rats showed a significant decline in long-term memory performance. P. goldsteinii RV-01 treated rescued the age-related decline in memory significantly. FIGs. 13A-13H. For example, the average latency (time taken to find the platform) is significantly reduced in the treatment group as compared with the non-treatment group. FIG. 13A. Further, animals of the treatment group showed increased swim speed and less average time to reach the target platform relative to those of the non-treatment group. FIG. 13F. The average distance to the target platform observed in the treatment group is also reduced relative to that observed in the non-treatment group. FIG. 13B. Further, P. goldsteinii RV-01 treatment significantly improved latency. FIGs. 13C-13E. Also, the treated rats showed fewer checking counts to locate the target (FIG. 13G) and reduced duration (FIG. 13H) relative to the untreated rats.

[0148] In summary, P. goldsteinii RV-01 effectively enhanced spatial learning and memory cognitive functions.

[0149] (b) Open Field Test

[0150] Aged rats treated or untreated with P. goldsteinii RV-01 were subject to the Open Field Test, which is commonly used to measure locomotor activity and anxiety-like behavior.

[0151] The results obtained from this study show that the P. goldsteinii RV-01 treatment (a) increased the total distance that the animal traveled (FIG. 14A) ; increased the activity time of the animals (FIG. 14B) ; (c) increases movement speed (FIG. 14C) ; (d) increases vertical activity (FIGs. 14D-14F) ; (e) increases central zone activity (FIGs. 14G-14H) .

[0152] In sum, the aged rats treated with P. goldsteinii RV-01 exhibited enhanced locomotor activity and speed in the novel environment, as well as subsequent increases in locomotor activity and time spent in the vertical and center areas compared to the untreated aged rats. P. goldsteinii RV-01 effectively improved the impaired walking ability caused by aging and enhanced animal’s exploratory behavior.

[0153] Example 12: P. goldsteinii RV-01 Ameliorates Chronic Kidney Disease Pathogenesis

[0154] Chronic kidney disease (CKD) , which has high morbidity and mortality rates worldwide, is characterized by decreased kidney function. This condition can result from various risk factors, including diabetes, hypertension, and obesity.

[0155] In this study, SD rats were used as an animal model of CKD, which is induced by an adenine (0.25%w / w) diet. FIG. 15. The CKD rats were treated with autoclaved P. goldsteinii RV-01 orally at 1x109 cells per animal for 7 days. The control rats were treated a normal diet.

[0156] Levels of serum and urine creatine and blood urea nitrogen (BUN) , indicating kidney function, were measured in the CKD rats and control rats. As shown in FIGs. 16A-16D, P. goldsteinii RV-01 treatment improved kidney function in the CKD rats.

[0157] Further, levels of pro-inflammatory cytokines such as IL-1β, TNF-α, and IL-6 were measured in the CKD rats treated with P. goldsteinii RV-01 and in the control rats. As shown in FIGs. 17A-17C, P. goldsteinii RV-01 significantly reduced the levels of the pro-inflammatory cytokines.

[0158] In addition, kidney sections obtained from the CKD rats treated with P. goldsteinii RV-01 and in the control rats were analyzed by hematoxylin-eosin (HE) staining to examine glomerular histopathology. Relative to non-CKD control rats, glomerular thickening, intestitial fibrosis and hyaline changes, epithelial cellular vacuolar degeneration, hyaline casts and arteriolopathy were observed in the kidney sections of the CKD rats (not treated with P. goldsteinii) . Milder histological alterations of glomeruli and arterioles were observed in the kidney sections of CKD rats treated with P. goldsteinii. Further, alpha-Masson staining showed more tubulointerstitial fibrosis and tubular atrophy in the kidneys of CKD rats than in the non-CKD control rats. The renal level of alpha-SMA was significantly reduced in CKD rats treated with P. goldsteinii RV-01 as compared with the untreated CKD rats. Alpha-Masson staining also showed severe glomerular and tubulointerstitial fibrosis in the kidneys of adenine-induced CKD rats as evidenced by collagen accumulation. P. goldsteinii RV-01 treatment significantly reduced the level and area of fibrosis in the CKD rats. Moreover, Picro-Sirius Red staining (PAS) revealed a normal glomerulus surrounded by Bowman’s capsule and proximal and distal convoluted tubules without any inflammatory changes in non-CKD rats, while renal tubule atrophy, thickening of the basement membrane and degenerated glomeruli infiltrated by inflammatory cells were observed in CKD rats. The P. goldsteinii RV-01-treated CKD rats showed significantly fewer inflammatory cells, reduced thickening of the basement membrane and capillaries compared with untreated CKD rats.

[0159] OTHER EMBODIMENTS

[0160] All of the features disclosed in this specification may be combined in any combination. Each feature disclosed in this specification may be replaced by an alternative feature serving the same, equivalent, or similar purpose. Thus, unless expressly stated otherwise, each feature disclosed is only an example of a generic series of equivalent or similar features.

[0161] From the above description, one skilled in the art can easily ascertain the essential characteristics of the present invention, and without departing from the spirit and scope thereof, can make various changes and modifications of the invention to adapt it to various usages and conditions. Thus, other embodiments are also within the claims.

[0162] EQUIVALENTS

[0163] While several inventive embodiments have been described and illustrated herein, those of ordinary skill in the art will readily envision a variety of other means and / or structures for performing the function and / or obtaining the results and / or one or more of the advantages described herein, and each of such variations and / or modifications is deemed to be within the scope of the inventive embodiments described herein. More generally, those skilled in the art will readily appreciate that all parameters, dimensions, materials, and configurations described herein are meant to be exemplary and that the actual parameters, dimensions, materials, and / or configurations will depend upon the specific application or applications for which the inventive teachings is / are used. Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific inventive embodiments described herein. It is, therefore, to be understood that the foregoing embodiments are presented by way of example only and that, within the scope of the appended claims and equivalents thereto, inventive embodiments may be practiced otherwise than as specifically described and claimed. Inventive embodiments of the present disclosure are directed to each individual feature, system, article, material, kit, and / or method described herein. In addition, any combination of two or more such features, systems, articles, materials, kits, and / or methods, if such features, systems, articles, materials, kits, and / or methods are not mutually inconsistent, is included within the inventive scope of the present disclosure.

[0164] All definitions, as defined and used herein, should be understood to control over dictionary definitions, definitions in documents incorporated by reference, and / or ordinary meanings of the defined terms.

[0165] All references, patents and patent applications disclosed herein are incorporated by reference with respect to the subject matter for which each is cited, which in some cases may encompass the entirety of the document.

[0166] The indefinite articles “a” and “an, ” as used herein in the specification and in the claims, unless clearly indicated to the contrary, should be understood to mean “at least one. ”

[0167] The phrase “and / or, ” as used herein in the specification and in the claims, should be understood to mean “either or both” of the elements so conjoined, i.e., elements that are conjunctively present in some cases and disjunctively present in other cases. Multiple elements listed with “and / or” should be construed in the same fashion, i.e., “one or more” of the elements so conjoined. Other elements may optionally be present other than the elements specifically identified by the “and / or” clause, whether related or unrelated to those elements specifically identified. Thus, as a non-limiting example, a reference to “A and / or B” , when used in conjunction with open-ended language such as “comprising” can refer, in one embodiment, to A only (optionally including elements other than B) ; in another embodiment, to B only (optionally including elements other than A) ; in yet another embodiment, to both A and B (optionally including other elements) ; etc.

[0168] As used herein in the specification and in the claims, “or” should be understood to have the same meaning as “and / or” as defined above. For example, when separating items in a list, “or” or “and / or” shall be interpreted as being inclusive, i.e., the inclusion of at least one, but also including more than one, of a number or list of elements, and, optionally, additional unlisted items. Only terms clearly indicated to the contrary, such as “only one of” or “exactly one of, ” or, when used in the claims, “consisting of, ” will refer to the inclusion of exactly one element of a number or list of elements. In general, the term “or” as used herein shall only be interpreted as indicating exclusive alternatives (i.e. “one or the other but not both” ) when preceded by terms of exclusivity, such as “either, ” “one of, ” “only one of, ” or “exactly one of. ” “Consisting essentially of, ” when used in the claims, shall have its ordinary meaning as used in the field of patent law.

[0169] The term “about” or “approximately” means within an acceptable error range for the particular value as determined by one of ordinary skill in the art, which will depend in part on how the value is measured or determined, i.e., the limitations of the measurement system. For example, “about” can mean within an acceptable standard deviation, per the practice in the art. Alternatively, “about” can mean a range of up to ± 20 %, preferably up to ± 10 %, more preferably up to ± 5 %, and more preferably still up to ± 1 %of a given value. Alternatively, particularly with respect to biological systems or processes, the term can mean within an order of magnitude, preferably within 2-fold, of a value. Where particular values are described in the application and claims, unless otherwise stated, the term “about” is implicit and in this context means within an acceptable error range for the particular value. In some embodiments, the hinge domain is a hinge domain of a naturally occurring protein.

[0170] As used herein in the specification and in the claims, the phrase “at least one, ” in reference to a list of one or more elements, should be understood to mean at least one element selected from any one or more of the elements in the list of elements, but not necessarily including at least one of each and every element specifically listed within the list of elements and not excluding any combinations of elements in the list of elements. This definition also allows that elements may optionally be present other than the elements specifically identified within the list of elements to which the phrase “at least one” refers, whether related or unrelated to those elements specifically identified. Thus, as a non-limiting example, “at least one of A and B” (or, equivalently, “at least one of A or B, ” or, equivalently “at least one of A and / or B” ) can refer, in one embodiment, to at least one, optionally including more than one, A, with no B present (and optionally including elements other than B) ; in another embodiment, to at least one, optionally including more than one, B, with no A present (and optionally including elements other than A) ; in yet another embodiment, to at least one, optionally including more than one, A, and at least one, optionally including more than one, B (and optionally including other elements) ; etc.

[0171] It should also be understood that, unless clearly indicated to the contrary, in any methods claimed herein that include more than one step or act, the order of the steps or acts of the method is not necessarily limited to the order in which the steps or acts of the method are recited.

Claims

1.A composition comprising cells of a Parabacteroides goldsteinii strain and a carrier, wherein the cells comprise a population of hypo-acylated lipopolysaccharides (LPS) .2.The composition of claim 1, wherein the Parabacteroides goldsteinii strain is RV-01, which is deposited with NITE Patent Microorganisms Depositary under Accession Number NITE BP-04231.3.The composition of claim 1 or claim 2, wherein the carrier comprises a polysaccharide, which optionally is altodextrin, isomaltodextrin, or resistant maltodextrin.4.The composition of any one of claims 1-3, wherein the cells of the Parabacteroides goldsteinii are inactivated cells.5.The composition of claim 4, wherein the inactivated cells are inactivated by autoclave.6.The composition of any one of claims 1-5, which is an oral formulation or a topical formulation.7.The composition of any one of claims 1-6, wherein the composition is in a form of liquid, semi-solid, or solid.8.The composition of claim 7, wherein the composition is in a form of tablet, capsule, or oral liquids.9.A method for alleviating a condition associated with aging, the method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition set forth in any one of claims 1-8.10.The method of claim 9, wherein the condition associated with aging is sarcopenia, skin-aging, intestinal-aging, age-related aberrant circadian rhythm, or age-related decline in cognition.11.A method for alleviating a condition, the method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition set forth in any one of claims 1-8, wherein the condition is selected from the group consisting of cancer, inflammation, a metabolic syndrome, and a chronic kidney disease.12.The method of any one of claims 9-11, wherein the composition is administered to the subject orally or topically.13.The method of claim 12, wherein the subject is a human patient.14.The method of claim 13, wherein the human patient has colon cancer.15.The method of claim 14, wherein the human patient is on a treatment comprising a checkpoint inhibitor, which optionally is an anti-PD1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.

Images