Dual-AAV delivery of ABCA4

Abstract

Provided herein is a composition or a method for expression of a human ABCA4 protein. Also provided herein is a method of treating Stargardt disease.

Description

DUAL-AAV DELIVERY OF ABCA4

[0001] REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] The instant application claims the priority to and the benefit of the filing date of PCT / CN2024 / 144193, filed on December 31, 2024, the entire contents of which, including any drawings and sequence listing, are incorporated herein by reference.

[0003] REFERENCE TO AN ELECTRONIC SEQUENCE LISTING

[0004] The disclosure contains a Sequence Listing XML file which has been submitted electronically in XML format and is hereby incorporated by reference in its entirety. Said XML copy, created on December 30, 2025, by software “WIPO Sequence” according to WIPO Standard ST. 26, is named HGP045PCT. xml, and is 91,828 bytes in size.

[0005] According to WIPO Standard ST. 26, symbol “t” is used to denote both T in DNA and U in RNA. Thus, in the instant sequence listing prepared according to ST. 26, wherever a sequence is an RNA, the T in the sequence shall be deemed as U.BACKGROUND

[0006] Stargardt disease (STGD) , as an autosomal recessive inherited disease, is a type of retinal dystrophy, which usually occurs in children or young people and is one of the most common youth eye diseases. It is believed that this disease is caused by a mutation in ABCA4 gene (ATP-binding cassette transporter A4) , which is located on chromosome 1. The mutation in this gene may lead to degeneration of retinal pigment cells, which in turn affects the perception and transmission of light by the retina and ultimately leads to vision loss. The main clinical manifestations of STGD include decreased visual acuity, central visual field deformation, and loss of color perception. The rate of deterioration of vision varies among patients, but in general, STGD has a long-term, progressively worsening course that may lead to blindness. Currently, there is no cure for this disease. It would be desired to develop pharmaceuticals and methods for treating STGD to meet the unmet clinical needs.

[0007] Citation or identification of any document in the disclosure is not an admission that such a document is available as prior art to the disclosure. Each of the references mentioned or cited in the disclosure is incorporated by reference in its entirety.SUMMARY

[0008] In an aspect, the disclosure provides a composition comprising:

[0009] (1) a first recombinant AAV (rAAV) particle comprising a capsid and a first polynucleotide encapsulated within the capsid, the first polynucleotide comprising:

[0010] (i) a first ABCA4 polynucleotide encoding a N-terminal portion of human ABCA4 protein, and

[0011] (ii) a first intein polynucleotide encoding an N-terminal portion of an intein, wherein the first intein polynucleotide is linked 3’ to the first ABCA4 polynucleotide; and

[0012] (2) a second rAAV particle comprising a capsid and a second polynucleotide encapsulated within the capsid, the second polynucleotide comprising:

[0013] (i) a second ABCA4 polynucleotide encoding a C-terminal portion of the human ABCA4 protein, and

[0014] (ii) a second intein polynucleotide encoding a C-terminal portion of the intein, wherein the second intein polynucleotide is linked 5’ to the second ABCA4 polynucleotide;

[0015] wherein co-delivery of the first rAAV particle and the second rAAV particle into a cell results in the production of the human ABCA4 protein in the cell.

[0016] In another aspect, the disclosure provides a method for expression of human ABCA4 protein, comprising delivering the composition of the disclosure into a cell.

[0017] In yet another aspect, the disclosure provides a method of treating an eye disease caused by a reduction in expression of human ABCA4 protein in a subject in need thereof, comprising administrating to the subject the composition of the disclosure.

[0018] In yet another aspect, the disclosure provides a method of treating Stargardt disease in a subject in need thereof, comprising administrating to the subject the composition of the disclosure.

[0019] In yet another aspect, the disclosure provides a DNA plasmid comprising the first polynucleotide as defined in the disclosure or the second polynucleotide as defined in the disclosure.

[0020] In yet another aspect, the disclosure provides a method of manufacturing a rAAV particle, comprising introducing the DNA plasmid of the disclosure into a cell, wherein said rAAV particle is produced.

[0021] The details of one or more embodiments of the disclosure are set forth in the description below. Other features or advantages of the disclosure will be apparent from the following drawings and detailed description of several embodiments, and also from the appended claims. It is understood that any aspect or embodiment of the disclosure can be combined with any other aspect or embodiment of the disclosure to constitute another embodiment explicitly or implicitly disclosed herein unless otherwise indicated.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0022] An understanding of the features and advantages of the disclosure will be obtained by reference to the following detailed description that sets forth illustrative embodiments, in which the principles of the disclosure may be utilized, and the accompanying drawings of which:

[0023] Fig. 1 illustrates the constructs of the two expression plasmids for use to express human ABCA4 protein and evaluate the expression efficiency and expression purity of human ABCA4 protein with various split sites and various split inteins in the disclosure.

[0024] Fig. 2 shows the expression efficiency of full length hABCA4 for each of the combinations of the split sites and the split inteins in the disclosure.

[0025] Fig. 3 shows the expression purity of full length hABCA4 for each of the combinations of the split sites and the split inteins in the disclosure.

[0026] Fig. 4 shows the expression efficiency of full length hABCA4 for the combination of split site S1099 and various split intein in the disclosure.

[0027] Fig. 5 shows hABCA4 expression by HG rAAV particles of the disclosure at various doses vs. JWK rAAV particles (control) .

[0028] Fig. 6 shows A2E level in treated and untreated eyes of Abca4- / -mouse models after administration of ABCA4 rAAV8 particles.

[0029] Fig. 7 shows the strategy to establish an acute light-induced injury Abca4- / -Rdh8- / -mouse model, and the photoreceptor ultrastructure of the eye of C57BL / 6J mouse, the treated eye of Abca4- / -Rdh8- / -mouse, and the untreated eye of Abca4- / -Rdh8- / -mouse.

[0030] The figures herein are for illustrative purposes only and are not necessarily drawn to scale.DETAILED DESCRIPTION

[0031] I. Overview

[0032] Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector may be a suitable delivery vector for retinal diseases due to its low immunogenicity and long-term transgenic expression characteristics. However, ABCA4 gene is too large to be packaged into a single rAAV vector because of 4.7 k packaging capacity limitation. Splitting a large protein into two parts and recombining them back into the large protein, split inteins have been used to deliver large proteins with dual AAV vectors. References, such as WO2020 / 079034, CN115074369A, and “An expanded library of orthogonal split inteins enables modular multi-peptide assemblies” (Filipe Pinto et al., Nature Communication, 2020) , discloses inteins and uses thereof, the disclosure of which are incorporated herein by reference in their entireties.

[0033] In this disclosure, overexpression of ABCA4 gene by split inteins and rAAV vectors is applied as a promising treatment strategy for STGD1. As used herein, split site refers to the amino acid residue of human ABCA4 protein where the protein is split into a N-terminal portion and a C-terminal portion. The split site and any amino acid residue in the disclosure are numbered according to the full length of wild type human ABCA4 of SEQ ID NO: 1. The split occurs at immediately N-terminal of the split site, leaving the amino acid residue of the split site to the C-terminal portion of the ABCA4 protein. For example, by using the split site S1063, the human ABCA4 protein was divided at immediately N-terminal (also the immediately “left” side when hABCA4 is conventionally read in N-to-C orientation) of the amino acid S1063 of human ABCA4 protein, generating hABCA4-N-S1063 fragment, which ranges from position 1 (N-terminal starting Methionine (Met; M) ; residue M1; corresponding to start codon ATG of ABCA4 gene) to position 1062 (residue L1062) of hABCA4, and hABCA4-C-S1063 fragment, which ranges from position 1063 (residue S1063) to position 2273 (residue D2273) of hABCA4. The amino acid sequence of hABCA4-N-S1063 fragment (with N-terminal starting Met) is set forth in SEQ ID NO: 8. The amino acid sequence of hABCA4-C-S1063 fragment is set forth in SEQ ID NO: 10.

[0034] II. Composition comprising recombinant AAV (rAAV) particles

[0035] In an aspect, the disclosure provides a composition comprising:

[0036] (1) a first recombinant AAV (rAAV) particle comprising a capsid and a first polynucleotide encapsulated within the capsid, the first polynucleotide comprising:

[0037] (i) a first ABCA4 polynucleotide encoding a N-terminal portion of human ABCA4 protein, and

[0038] (ii) a first intein polynucleotide encoding an N-terminal portion of an intein, wherein the first intein polynucleotide is linked 3’ to the first ABCA4 polynucleotide; and

[0039] (2) a second rAAV particle comprising a capsid and a second polynucleotide encapsulated within the capsid, the second polynucleotide comprising:

[0040] (i) a second ABCA4 polynucleotide encoding a C-terminal portion of the human ABCA4 protein, and

[0041] (ii) a second intein polynucleotide encoding a C-terminal portion of the intein, wherein the second intein polynucleotide is linked 5’ to the second ABCA4 polynucleotide;

[0042] wherein co-delivery of the first rAAV particle and the second rAAV particle into a cell results in the production of the human ABCA4 protein in the cell.

[0043] In another aspect, the disclosure provides the first rAAV particle as defined in the disclosure.

[0044] In yet another aspect, the disclosure provides the second rAAV particle as defined in the disclosure.

[0045] In yet another aspect, the disclosure provides a rAAV particle comprising a capsid and a first polynucleotide encapsulated within the capsid, the first polynucleotide comprising:

[0046] (i) a first ABCA4 polynucleotide encoding a N-terminal portion of human ABCA4 protein, and

[0047] (ii) a first intein polynucleotide encoding an N-terminal portion of an intein, wherein the first intein polynucleotide is linked 3’ to the first ABCA4 polynucleotide.

[0048] In yet another aspect, the disclosure provides a rAAV particle comprising a capsid and a second polynucleotide encapsulated within the capsid, the second polynucleotide comprising:

[0049] (i) a second ABCA4 polynucleotide encoding a C-terminal portion of the human ABCA4 protein, and

[0050] (ii) a second intein polynucleotide encoding a C-terminal portion of the intein, wherein the second intein polynucleotide is linked 5’ to the second ABCA4 polynucleotide.

[0051] In yet another aspect, the disclosure provides the first polynucleotide as defined in the disclosure.

[0052] In yet another aspect, the disclosure provides the second polynucleotide as defined in the disclosure.

[0053] In yet another aspect, the disclosure provides a rAAV particle comprising a capsid and the first polynucleotide encapsulated within the capsid.

[0054] In yet another aspect, the disclosure provides a rAAV particle comprising a capsid and the second polynucleotide encapsulated within the capsid.

[0055] In yet another aspect, the disclosure provides a rAAV particle comprising a capsid and the polynucleotide of the disclosure encapsulated within the capsid. In some embodiments, the polynucleotide is the first polynucleotide of the disclosure. In some embodiments, the polynucleotide is the second polynucleotide of the disclosure.

[0056] In some embodiments, the N-terminal portion of the human ABCA4 protein and the C-terminal portion of the human ABCA4 protein are split at a split site selected from the group consisting of S1109, S1063, S1071, T1089, S1096, S1099, T1112, S1116, T1117, C1140, S1141, T1143, T1153, T1158, C1150, S1090, and S1168 of the human ABCA4 protein.

[0057] In some embodiments, the human ABCA4 protein is human wild type ABCA4 protein (NCBI Accession No.: NP_000341) of SEQ ID NO: 1 or a naturally occurring, functional, non-pathogenic mutant thereof. In some embodiments, the human ABCA4 protein comprises a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 1.

[0058] In some embodiments, the split site is S1109 or S1063.

[0059] In some embodiments, the split site is S1109, the N-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 2 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 2; and the C-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 6 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 6.

[0060] In some embodiments, the split site is S1109, the first ABCA4 polynucleotide comprises SEQ ID NO: 3 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 3; and the second ABCA4 polynucleotide comprises SEQ ID NO: 7 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 7.

[0061] In some embodiments, the split site is S1063, the N-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 8 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 8; and the C-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 10 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 10.

[0062] In some embodiments, the first intein polynucleotide is linked immediately 3’ to the first ABCA4 polynucleotide.

[0063] In some embodiments, the second intein polynucleotide is linked immediately 5’ to the second ABCA4 polynucleotide.

[0064] In some embodiments, the intein is selected from the group consisting of DnaE intein and DnaB intein.

[0065] In some embodiments, the intein is selected from the group consisting of Gp41-1 intein, Npu intein, Rma intein, Cfa intein, and Cat intein.

[0066] In some embodiments, the intein is Gp41-1 intein.

[0067] In some embodiments, the intein is Npu intein, the N-terminal portion of the intein (Npu-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 11, and the C-terminal portion of the intein (Npu-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 13.

[0068] In some embodiments, the intein is Rma intein, the N-terminal portion of the intein (Rma-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 15, and the C-terminal portion of the intein (Rma-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 17.

[0069] In some embodiments, the intein is Cfa intein, the N-terminal portion of the intein (Cfa-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 19, and the C-terminal portion of the intein (Cfa-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 21.

[0070] In some embodiments, the intein is Gp41-1 intein, the N-terminal portion of the intein (Gp41-1-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 23, and the C-terminal portion of the intein (Gp41-1-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 25.

[0071] In some embodiments, the intein is Cat, intein the N-terminal portion of the intein (Cat-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 27, and the C-terminal portion of the intein (Cat-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 29.

[0072] In some embodiments, the intein is Npu intein, the first intein polynucleotide (Npu-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 12, and the second intein polynucleotide (Npu-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 14.

[0073] In some embodiments, the intein is Rma intein, the first intein polynucleotide (Rma-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 16, and the second intein polynucleotide (Rma-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 18.

[0074] In some embodiments, the intein is Cfa intein, the first intein polynucleotide (Cfa-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 20, and the second intein polynucleotide (Cfa-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 22.

[0075] In some embodiments, the intein is Gp41-1 intein, the first intein polynucleotide (Gp41-1-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 24, and the C second intein polynucleotide (Gp41-1-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 26.

[0076] In some embodiments, the intein is Cat intein, the first intein polynucleotide (Cat-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 28, and the second intein polynucleotide (Cat-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 30.

[0077] In some embodiments, the first polynucleotide comprises a promoter that regulates the transcription of the first ABCA4 polynucleotide.

[0078] In some embodiments, the second polynucleotide comprises a promoter that regulates the transcription of the second ABCA4 polynucleotide.

[0079] In some embodiments, the promoter is a GRK1 promoter, such as, SEQ ID NO: 46.

[0080] In some embodiments, the first polynucleotide comprises an intron.

[0081] In some embodiments, the second polynucleotide comprises an intron.

[0082] In some embodiments, the promoter is a MVM intron, such as, SEQ ID NO: 47.

[0083] In some embodiments, the first polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ :

[0084] (a) 5’ ITR, e.g., AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;

[0085] (b) a promoter, e.g., GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;

[0086] (c) an optional intron, e.g., MVM intron of SEQ ID NO: 47;

[0087] (d) an optional Kozak sequence (GCCACC) ;

[0088] (e) the first ABCA4 polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 3) encoding the N-terminal portion of the human ABCA4 protein (e.g., hABCA4-N-S1109, such as, SEQ ID NO: 2) ;

[0089] (f) the first intein polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 24) encoding the N-terminal portion of the intein (e.g., Gp41-1-N, such as, SEQ ID NO: 23) , wherein the first intein polynucleotide is linked (e.g., linked immediately) 3’ to the first ABCA4 polynucleotide;

[0090] (g) an optional WPRE3 (such as, SEQ ID NO: 34) ;

[0091] (h) a polyA coding sequence (such as, SEQ ID NO: 35) ; and

[0092] (i) 3’ ITR, e.g., AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45; and

[0093] the second polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ :

[0094] (a) 5’ ITR, e.g., AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;

[0095] (b) a promoter, e.g., GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;

[0096] (c) an optional intron, e.g., MVM intron of SEQ ID NO: 47;

[0097] (d) an optional Kozak sequence (GCCACC) ;

[0098] (e) the second intein polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 26) encoding the C-terminal portion of the intein (e.g., Gp41-1-C, such as, SEQ ID NO: 25) , wherein the second intein polynucleotide is linked (e.g., linked immediately) 5’ to the second ABCA4 polynucleotide;

[0099] (f) the second ABCA4 polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 7) encoding the C-terminal portion of the human ABCA4 protein (e.g., hABCA4-C-S1109, such as, SEQ ID NO: 6) ;

[0100] (g) an optional WPRE3 (such as, SEQ ID NO: 34) ; and

[0101] (h) a polyA coding sequence (such as, SEQ ID NO: 35) ; and

[0102] (i) 3’ ITR, e.g., AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45.

[0103] In some embodiments, the first polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ :

[0104] (a) AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;

[0105] (b) GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;

[0106] (c) MVM intron of SEQ ID NO: 47;

[0107] (d) Kozak sequence (GCCACC) ;

[0108] (e) the first ABCA4 polynucleotide of SEQ ID NO: 3;

[0109] (f) the first intein polynucleotide of SEQ ID NO: 24) , wherein the first intein polynucleotide is linked immediately 3’ to the first ABCA4 polynucleotide;

[0110] (g) WPRE3 of SEQ ID NO: 34;

[0111] (h) a polyA coding sequence of SEQ ID NO: 35; and

[0112] (i) AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45; and

[0113] the second polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ :

[0114] (a) AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;

[0115] (b) GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;

[0116] (c) MVM intron of SEQ ID NO: 47;

[0117] (d) Kozak sequence (GCCACC) ;

[0118] (e) the second intein polynucleotide of SEQ ID NO: 26) , wherein the second intein polynucleotide is linked (e.g., linked immediately) 5’ to the second ABCA4 polynucleotide;

[0119] (f) the second ABCA4 polynucleotide of SEQ ID NO: 7) ;

[0120] (g) WPRE3 of SEQ ID NO: 34; and

[0121] (h) a polyA coding sequence of SEQ ID NO: 35; and

[0122] (i) AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45.

[0123] In some embodiments, the first polynucleotide comprises a sequence having a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 49.

[0124] In some embodiments, the second polynucleotide comprises a sequence having a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 50.

[0125] In some embodiments, the capsid is selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV-DJ, AAV. PHP. eB, a member of the Clade to which any of the AAV1-AAV13 belong, a functional truncation thereof, or a functional mutant thereof. Unless otherwise indicated, AAV1 to AAV13 refer to wild type.

[0126] In some embodiments, the capsid is the capsid of AAV8 (AAV8 capsid) . As used herein, AAV8 refers to wild type AAV8.

[0127] In some embodiments, the composition is suitable for subretinal injection.

[0128] III. Method of Treating

[0129] In yet another aspect, the disclosure provides a method for expression of human ABCA4 protein, comprising delivering the composition of the disclosure into a cell.

[0130] In yet another aspect, the disclosure provides a method of treating an eye disease caused by a reduction in expression of human ABCA4 protein in a subject in need thereof, comprising administrating to the subject the composition of the disclosure.

[0131] In some embodiments, the eye disease is Stargardt disease.

[0132] In yet another aspect, the disclosure provides a method of treating Stargardt disease in a subject in need thereof, comprising administrating to the subject the composition of the disclosure.

[0133] In some embodiments, said administrating is by subretinal injection.

[0134] IV. Polynucleotide

[0135] In yet another aspect, the disclosure provides a polynucleotide comprising:

[0136] (i) a first ABCA4 polynucleotide encoding a N-terminal portion of human ABCA4 protein, and

[0137] (ii) a first intein polynucleotide encoding an N-terminal portion of an intein, wherein the first intein polynucleotide is linked 3’ to the first ABCA4 polynucleotide.

[0138] In yet another aspect, the disclosure provides a polynucleotide comprising:

[0139] (i) a second ABCA4 polynucleotide encoding a C-terminal portion of the human ABCA4 protein, and

[0140] (ii) a second intein polynucleotide encoding a C-terminal portion of the intein, wherein the second intein polynucleotide is linked 5’ to the second ABCA4 polynucleotide.

[0141] In some embodiments, the N-terminal portion of the human ABCA4 protein and the C-terminal portion of the human ABCA4 protein are split at a split site selected from the group consisting of S1109, S1063, S1071, T1089, S1096, S1099, T1112, S1116, T1117, C1140, S1141, T1143, T1153, T1158, C1150, S1090, and S1168 of the human ABCA4 protein.

[0142] In some embodiments, the human ABCA4 protein is human wild type ABCA4 protein (NCBI Accession No.: NP_000341) of SEQ ID NO: 1 or a naturally occurring, functional, non-pathogenic mutant thereof.

[0143] In some embodiments, the split site is S1109 or S1063.

[0144] In some embodiments, the split site is S1109, the N-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 2 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 2; and the C-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 6 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 6.

[0145] In some embodiments, the split site is S1109, the first ABCA4 polynucleotide comprises SEQ ID NO: 3 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 3; and the second ABCA4 polynucleotide comprises SEQ ID NO: 7 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 7.

[0146] In some embodiments, the split site is S1063, the N-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 8 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 8; and the C-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 10 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 10.

[0147] In some embodiments, the first intein polynucleotide is linked immediately 3’ to the first ABCA4 polynucleotide.

[0148] In some embodiments, the second intein polynucleotide is linked immediately 5’ to the second ABCA4 polynucleotide.

[0149] In some embodiments, the intein is selected from the group consisting of DnaE intein and DnaB intein.

[0150] In some embodiments, the intein is selected from the group consisting of Gp41-1 intein, Npu intein, Rma intein, Cfa intein, and Cat intein.

[0151] In some embodiments, the intein is Gp41-1 intein.

[0152] In some embodiments, the intein is Npu intein, the N-terminal portion of the intein (Npu-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 11, and the C-terminal portion of the intein (Npu-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 13.

[0153] In some embodiments, the intein is Rma intein, the N-terminal portion of the intein (Rma-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 15, and the C-terminal portion of the intein (Rma-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 17.

[0154] In some embodiments, the intein is Cfa intein, the N-terminal portion of the intein (Cfa-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 19, and the C-terminal portion of the intein (Cfa-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 21.

[0155] In some embodiments, the intein is Gp41-1 intein, the N-terminal portion of the intein (Gp41-1-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 23, and the C-terminal portion of the intein (Gp41-1-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 25.

[0156] In some embodiments, the intein is Cat, intein the N-terminal portion of the intein (Cat-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 27, and the C-terminal portion of the intein (Cat-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 29.

[0157] In some embodiments, the intein is Npu intein, the first intein polynucleotide (Npu-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 12, and the second intein polynucleotide (Npu-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 14.

[0158] In some embodiments, the intein is Rma intein, the first intein polynucleotide (Rma-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 16, and the second intein polynucleotide (Rma-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 18.

[0159] In some embodiments, the intein is Cfa intein, the first intein polynucleotide (Cfa-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 20, and the second intein polynucleotide (Cfa-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 22.

[0160] In some embodiments, the intein is Gp41-1 intein, the first intein polynucleotide (Gp41-1-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 24, and the C second intein polynucleotide (Gp41-1-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 26.

[0161] In some embodiments, the intein is Cat intein, the first intein polynucleotide (Cat-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 28, and the second intein polynucleotide (Cat-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 30.

[0162] In some embodiments, the polynucleotide comprises a promoter that regulates the transcription of the first ABCA4 polynucleotide.

[0163] In some embodiments, the polynucleotide comprises a promoter that regulates the transcription of the second ABCA4 polynucleotide.

[0164] In some embodiments, the promoter is a GRK1 promoter, such as, SEQ ID NO: 46.

[0165] In some embodiments, the polynucleotide comprises an intron.

[0166] In some embodiments, the promoter is a MVM intron, such as, SEQ ID NO: 47.

[0167] In some embodiments, the polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ :

[0168] (a) 5’ ITR, e.g., AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;

[0169] (b) a promoter, e.g., GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;

[0170] (c) an optional intron, e.g., MVM intron of SEQ ID NO: 47;

[0171] (d) an optional Kozak sequence (GCCACC) ;

[0172] (e) the first ABCA4 polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 3) encoding the N-terminal portion of the human ABCA4 protein (e.g., hABCA4-N-S1109, such as, SEQ ID NO: 2) ;

[0173] (f) the first intein polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 24) encoding the N-terminal portion of the intein (e.g., Gp41-1-N, such as, SEQ ID NO: 23) , wherein the first intein polynucleotide is linked (e.g., linked immediately) 3’ to the first ABCA4 polynucleotide;

[0174] (g) an optional WPRE3 (such as, SEQ ID NO: 34) ;

[0175] (h) a polyA coding sequence (such as, SEQ ID NO: 35) ; and

[0176] (i) 3’ ITR, e.g., AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45.

[0177] In some embodiments, the polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ :

[0178] (a) 5’ ITR, e.g., AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;

[0179] (b) a promoter, e.g., GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;

[0180] (c) an optional intron, e.g., MVM intron of SEQ ID NO: 47;

[0181] (d) an optional Kozak sequence (GCCACC) ;

[0182] (e) the second intein polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 26) encoding the C-terminal portion of the intein (e.g., Gp41-1-C, such as, SEQ ID NO: 25) , wherein the second intein polynucleotide is linked (e.g., linked immediately) 5’ to the second ABCA4 polynucleotide;

[0183] (f) the second ABCA4 polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 7) encoding the C-terminal portion of the human ABCA4 protein (e.g., hABCA4-C-S1109, such as, SEQ ID NO: 6) ;

[0184] (g) an optional WPRE3 (such as, SEQ ID NO: 34) ; and

[0185] (h) a polyA coding sequence (such as, SEQ ID NO: 35) ; and

[0186] (i) 3’ ITR, e.g., AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45.

[0187] In some embodiments, the polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ :

[0188] (a) AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;

[0189] (b) GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;

[0190] (c) MVM intron of SEQ ID NO: 47;

[0191] (d) Kozak sequence (GCCACC) ;

[0192] (e) the first ABCA4 polynucleotide of SEQ ID NO: 3;

[0193] (f) the first intein polynucleotide of SEQ ID NO: 24) , wherein the first intein polynucleotide is linked immediately 3’ to the first ABCA4 polynucleotide;

[0194] (g) WPRE3 of SEQ ID NO: 34;

[0195] (h) a polyA coding sequence of SEQ ID NO: 35; and

[0196] (i) AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45.

[0197] In some embodiments, the second polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ :

[0198] (a) AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;

[0199] (b) GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;

[0200] (c) MVM intron of SEQ ID NO: 47;

[0201] (d) Kozak sequence (GCCACC) ;

[0202] (e) the second intein polynucleotide of SEQ ID NO: 26) , wherein the second intein polynucleotide is linked (e.g., linked immediately) 5’ to the second ABCA4 polynucleotide;

[0203] (f) the second ABCA4 polynucleotide of SEQ ID NO: 7) ;

[0204] (g) WPRE3 of SEQ ID NO: 34; and

[0205] (h) a polyA coding sequence of SEQ ID NO: 35; and

[0206] (i) AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45.

[0207] In some embodiments, the polynucleotide comprises a sequence having a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 49.

[0208] In some embodiments, the polynucleotide comprises a sequence having a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 50.

[0209] V. Method of Manufacturing

[0210] In yet another aspect, the disclosure provides a DNA plasmid comprising the polynucleotide of the disclosure. In some embodiments, the polynucleotide is the first polynucleotide of the disclosure. In some embodiments, the polynucleotide is the second polynucleotide of the disclosure.

[0211] In yet another aspect, the disclosure provides a cell comprising the DNA plasmid of the disclosure.

[0212] In yet another aspect, the disclosure provides a method of manufacturing a rAAV particle, comprising introducing the DNA plasmid of the disclosure into a cell, wherein said rAAV particle is produced. In some embodiments, the rAAV particle comprises a capsid of AAV8.

[0213] In some embodiments, wherein the cell is a HeLa cell, a HEK293T cell, an MRC-5 cell, a WI-38 cell, a Vero cell, or a FRhL-2 cell.

[0214] VI. Additional embodiments

[0215] The disclosure also provides the following aspects and embodiments.

[0216] In an aspect, the disclosure provides a vector system for expression of a human ABCA4 protein, said vector system comprising:

[0217] (1) a first vector comprising:

[0218] (i) a first ABCA4 polynucleotide encoding a N-terminal portion of the human ABCA4 protein, and

[0219] (ii) a first intein polynucleotide encoding an N-terminal portion of an intein, wherein the first intein polynucleotide is linked 3’ to the first ABCA4 polynucleotide; and

[0220] (2) a second vector comprising:

[0221] (i) a second ABCA4 polynucleotide encoding a C-terminal portion of the human ABCA4 protein, and

[0222] (ii) a second intein polynucleotide encoding a C-terminal portion of the intein, wherein the second intein polynucleotide is linked 5’ to the second ABCA4 polynucleotide;

[0223] wherein co-delivery of the first vector and the second vector into a cell results in the production of the human ABCA4 protein in the cell.

[0224] In some embodiments, the N-terminal portion of the human ABCA4 protein and the C-terminal portion of the human ABCA4 protein are split at a split site selected from the group consisting of S1109, S1063, S1071, T1089, S1096, S1099, T1112, S1116, T1117, C1140, S1141, T1143, T1153, T1158, C1150, S1090, and S1168 of the human ABCA4 protein.

[0225] In some embodiments, the human ABCA4 protein is human wild type ABCA4 protein (NCBI Accession No.: NP_000341) of SEQ ID NO: 1 or a naturally occurring, functional, non-pathogenic mutant thereof.

[0226] In some embodiments, the split site is S1109 or S1063.

[0227] In some embodiments, the split site is S1109, the N-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 2 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 2; and the C-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 6 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 6.

[0228] In some embodiments, the split site is S1109, the first ABCA4 polynucleotide comprises SEQ ID NO: 3 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 3; and the second ABCA4 polynucleotide comprises SEQ ID NO: 7 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 7.

[0229] In some embodiments, the split site is S1063, the N-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 8 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 8; and the C-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 10 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 10.

[0230] In some embodiments, the first intein polynucleotide is linked immediately 3’ to the first ABCA4 polynucleotide.

[0231] In some embodiments, the second intein polynucleotide is linked immediately 5’ to the second ABCA4 polynucleotide.

[0232] In some embodiments, the intein is selected from the group consisting of DnaE intein and DnaB intein.

[0233] In some embodiments, the intein is selected from the group consisting of Gp41-1 intein, Npu intein, Rma intein, Cfa intein, and Cat intein.

[0234] In some embodiments, the intein is Gp41-1 intein.

[0235] In some embodiments, the intein is Npu intein, the N-terminal portion of the intein (Npu-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 11, and the C-terminal portion of the intein (Npu-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 13.

[0236] In some embodiments, the intein is Rma intein, the N-terminal portion of the intein (Rma-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 15, and the C-terminal portion of the intein (Rma-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 17.

[0237] In some embodiments, the intein is Cfa intein, the N-terminal portion of the intein (Cfa-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 19, and the C-terminal portion of the intein (Cfa-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 21.

[0238] In some embodiments, the intein is Gp41-1 intein, the N-terminal portion of the intein (Gp41-1-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 23, and the C-terminal portion of the intein (Gp41-1-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 25.

[0239] In some embodiments, the intein is Cat, intein the N-terminal portion of the intein (Cat-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 27, and the C-terminal portion of the intein (Cat-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 29.

[0240] In some embodiments, the intein is Npu intein, the first intein polynucleotide (Npu-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 12, and the second intein polynucleotide (Npu-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 14.

[0241] In some embodiments, the intein is Rma intein, the first intein polynucleotide (Rma-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 16, and the second intein polynucleotide (Rma-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 18.

[0242] In some embodiments, the intein is Cfa intein, the first intein polynucleotide (Cfa-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 20, and the second intein polynucleotide (Cfa-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 22.

[0243] In some embodiments, the intein is Gp41-1 intein, the first intein polynucleotide (Gp41-1-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 24, and the C second intein polynucleotide (Gp41-1-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 26.

[0244] In some embodiments, the intein is Cat intein, the first intein polynucleotide (Cat-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 28, and the second intein polynucleotide (Cat-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 30.

[0245] In some embodiments:

[0246] (1) the first vector comprises, from 5’ to 3’ :

[0247] (a) 5’ ITR, e.g., AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;

[0248] (b) a promoter, e.g., GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;

[0249] (c) an optional intron, e.g., MVM intron of SEQ ID NO: 47;

[0250] (d) an optional Kozak sequence (GCCACC) ;

[0251] (e) the first ABCA4 polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 3) encoding the N-terminal portion of the human ABCA4 protein (e.g., hABCA4-N-S1109, such as, SEQ ID NO: 2) ;

[0252] (f) the first intein polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 24) encoding the N-terminal portion of the intein (e.g., Gp41-1-N, such as, SEQ ID NO: 23) , wherein the first intein polynucleotide is linked (e.g., linked immediately) 3’ to the first ABCA4 polynucleotide;

[0253] (g) an optional WPRE3 (such as, SEQ ID NO: 34) ;

[0254] (h) a polyA coding sequence (such as, SEQ ID NO: 35) ; and

[0255] (i) 3’ ITR, e.g., AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45; and

[0256] (2) the second vector comprises, from 5’ to 3’ :

[0257] (a) 5’ ITR, e.g., AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;

[0258] (b) a promoter, e.g., GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;

[0259] (c) an optional intron, e.g., MVM intron of SEQ ID NO: 47;

[0260] (d) an optional Kozak sequence (GCCACC) ;

[0261] (e) the second intein polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 26) encoding the C-terminal portion of the intein (e.g., Gp41-1-C, such as, SEQ ID NO: 25) , wherein the second intein polynucleotide is linked (e.g., linked immediately) 5’ to the second ABCA4 polynucleotide;

[0262] (f) the second ABCA4 polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 7) encoding the C-terminal portion of the human ABCA4 protein (e.g., hABCA4-C-S1109, such as, SEQ ID NO: 6) ;

[0263] (g) an optional WPRE3 (such as, SEQ ID NO: 34) ; and

[0264] (h) a polyA coding sequence (such as, SEQ ID NO: 35) ; and

[0265] (i) 3’ ITR, e.g., AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45.

[0266] In some embodiments:

[0267] (1) the first vector comprises, from 5’ to 3’ :

[0268] (a) AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;

[0269] (b) GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;

[0270] (c) MVM intron of SEQ ID NO: 47;

[0271] (d) Kozak sequence (GCCACC) ;

[0272] (e) the first ABCA4 polynucleotide of SEQ ID NO: 3;

[0273] (f) the first intein polynucleotide of SEQ ID NO: 24) , wherein the first intein polynucleotide is linked immediately 3’ to the first ABCA4 polynucleotide;

[0274] (g) WPRE3 of SEQ ID NO: 34;

[0275] (h) a polyA coding sequence of SEQ ID NO: 35; and

[0276] (i) AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45; and

[0277] (2) the second vector comprises, from 5’ to 3’ :

[0278] (a) AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;

[0279] (b) GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;

[0280] (c) MVM intron of SEQ ID NO: 47;

[0281] (d) Kozak sequence (GCCACC) ;

[0282] (e) the second intein polynucleotide of SEQ ID NO: 26) , wherein the second intein polynucleotide is linked (e.g., linked immediately) 5’ to the second ABCA4 polynucleotide;

[0283] (f) the second ABCA4 polynucleotide of SEQ ID NO: 7) ;

[0284] (g) WPRE3 of SEQ ID NO: 34; and

[0285] (h) a polyA coding sequence of SEQ ID NO: 35; and

[0286] (i) AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45.

[0287] In some embodiments, the first vector comprises a sequence having a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 49.

[0288] In some embodiments, the second vector comprises a sequence having a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 50.

[0289] In some embodiments, the first vector is a recombinant AAV vector.

[0290] In some embodiments, the second vector is a recombinant AAV vector.

[0291] In yet another aspect, the disclosure provides the first vector as defined in the vector system of the disclosure.

[0292] In yet another aspect, the disclosure provides the second vector as defined in the vector system of the disclosure.

[0293] In yet another aspect, the disclosure provides a rAAV particle comprising the first vector or the second vector of the disclosure.

[0294] In yet another aspect, the disclosure provides a composition comprising a rAAV particle comprising the first vector of the disclosure and a rAAV particle comprising the second vector of the disclosure.

[0295] In some embodiments, the rAAV particle comprises a AAV capsid selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV-DJ, AAV. PHP. eB, a member of the Clade to which any of the AAV1-AAV13 belong, a functional truncation thereof, or a functional mutant thereof. Unless otherwise indicated, AAV1 to AAV13 refer to wild type.

[0296] In some embodiments, the rAAV particle comprises an AAV capsid of AAV8.

[0297] In yet another aspect, the disclosure provides a method for expression of a human ABCA4 protein, comprising delivering the vector system of the disclosure into a cell.

[0298] In yet another aspect, the disclosure provides use of the vector system, the first vector, or the second vector of the disclosure in the manufacture of a medicament for expression of a human ABCA4 protein.

[0299] Further embodiments are illustrated in the following Examples which are given for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the disclosure.

[0300] EXAMPLES

[0301] The following examples are provided to further illustrate some embodiments of the disclosure but are not intended to limit the scope of the invention; it will be understood by their exemplary nature that other procedures, methodologies, or techniques known to those skilled in the art may alternatively be used.

[0302] Example 1: Evaluation of expression efficiency and expression purity of human ABCA4 protein by dual-vector delivery using various ABCA4 split sites and various split inteins

[0303] Design and Construction:

[0304] Two ABCA4 split sites, S1063 and S1109, were selected to divide human ABCA4 protein (hABCA4; SEQ ID NO: 1) into two parts, i.e., N-terminal human ABCA4 fragment (hABCA4-N) and C-terminal human ABCA4 fragment (hABCA4-C) .

[0305] By using the split site S1063, the human ABCA4 protein was split at immediately N-terminal (also the immediately “left” side when hABCA4 is conventionally read in N-to-C orientation) of the amino acid S1063 of human ABCA4 protein, generating hABCA4-N-S1063 fragment, which ranges from position 1 (N-terminal starting Methionine (Met; M) ; residue M1; corresponding to start codon ATG of ABCA4 gene) to position 1062 (residue L1062) of hABCA4 (or positions 2-1062 if N-terminal starting Met is not taken into account, for example, when a flag protein is inserted between the Met and the remaining residues) , and hABCA4-C-S1063 fragment, which ranges from position 1063 (residue S1063) to position 2273 (residue D2273) of hABCA4. The amino acid sequence of hABCA4-N-S1063 fragment (with N-terminal starting Met) is set forth in SEQ ID NO: 8. The amino acid sequence of hABCA4-N-S1063 fragment without N-terminal starting Met is set forth in SEQ ID NO: 9. The amino acid sequence of hABCA4-C-S1063 fragment is set forth in SEQ ID NO: 10.

[0306] By using the split site S1109, the human ABCA4 protein was split at immediately N-terminal (also the immediately “left” side when hABCA4 is conventionally read in N-to-C orientation) of the amino acid S1109 of human ABCA4 protein, generating hABCA4-N, which ranges from position 1 (N-terminal starting Methionine (Met; M) ; residue M1) to position 1108 of hABCA4 (residue R1108) (or positions 2-1108 if N-terminal starting Met is not taken into account, for example, when a flag protein is inserted between the Met and the remaining residues) , and hABCA4-C, which ranges from position 1109 (residue S1109) to position 2273 (residue D2273) of hABCA4. The amino acid sequence of hABCA4-N-S1109 fragment (with N-terminal starting Met) is set forth in SEQ ID NO: 2, and its coding sequence is set forth in SEQ ID NO: 3. The amino acid sequence of hABCA4-N-S1109 fragment without N-terminal starting Met is set forth in SEQ ID NO: 4, and its coding sequence is set forth in SEQ ID NO: 5. The amino acid sequence of hABCA4-C-S1109 fragment is set forth in SEQ ID NO: 6, and its coding sequence is set forth in SEQ ID NO: 7.

[0307] Five types of split inteins, (1) Npu, (2) Rma, (3) Cfa, (4) Gp41-1, and (5) Cat, were used individually in combination with each of the two split sites, leading to ten (10) combinations of spit site and split intein in Table 2. The N-terminal section and C-terminal section of each of the spilt inteins are set forth in 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, and 29, respectively, and their coding sequences thereof are set forth in SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, and 30, respectively, as shown in Table 1. The split inteins were used in form of two parts in pair: N-terminal section (Intein-N; SEQ ID NO: 11, 15, 19, 23, or 27) and C-terminal section (Intein-C; SEQ ID NO: 13, 17, 21, 25, or 29) .

[0308] Table 1. Split inteins and their coding sequences

[0309] Table 2. Combinations of split Inteins and split sites

[0310] As illustrated in Fig. 1, two expression plasmids, named ABCA4-N and ABCA4-C, were constructed to express hABCA4-N with Intein-N and hABCA4-C with Intein C, respectively.

[0311] Taking Combination No. 8 (combination of split intein Gp41-1 and split site S1109) as an illustrative and non-limiting example, the expression plasmid ABCA4-N comprised, from N-terminal to C-terminal, Cbh promoter (SEQ ID NO: 31) , start codon ATG (also corresponding to position 1 (residue M1) of the human ABCA4 protein, SEQ ID NO: 1) , a coding sequence (SEQ ID NO: 37) encoding an Flag tag (SEQ ID NO: 36) , a coding sequence (SEQ ID NO: 5; without start codon ATG) encoding hABCA4-N-S1109 (SEQ ID NO: 4; without N-terminal starting Methionine (M) ) , a coding sequence (SEQ ID NO: 24 encoding Gp41-1-N (SEQ ID NO: 23) , WPRE3 (SEQ ID NO: 34) , polyA coding sequence (SEQ ID NO: 35) , CMV enhancer (SEQ ID NO: 32) , CMV promoter (SEQ ID NO: 33) , a coding sequence (SEQ ID NO: 41) encoding mCherry (SEQ ID NO: 40) ; and the expression plasmid ABCA4-C comprised, from N-terminal to C-terminal, Cbh promoter (SEQ ID NO: 31) , start codon ATG, a coding sequence (SEQ ID NO: 26) encoding Gp41-1-C (SEQ ID NO: 25) , a coding sequence (SEQ ID NO: 7) encoding hABCA4-C-S1109 (SEQ ID NO: 6) , three repeats of a coding sequence (SEQ ID NO: 39) encoding HA tag (SEQ ID NO: 38) , WPRE3 (SEQ ID NO: 34) , polyA coding sequence (SEQ ID NO: 35) , CMV enhancer (SEQ ID NO: 32) , CMV promoter (SEQ ID NO: 33) , a coding sequence (SEQ ID NO: 43) encoding EGFP (SEQ ID NO: 42) .

[0312] For the other combinations of split inteins and split sites, the two expression plasmids remained the same except for the replacement with the corresponding sequences encoding the N-terminal and C-terminal fragments of hABCA4 divided at the indicated split site and the corresponding sequences encoding the N-terminal and C-terminal sections of the indicated split inteins.

[0313] It should be noted that the Flag tag in this Example was inserted as an indicator between the N-terminal starting Methionine (M) (corresponding to position 1 of SEQ ID NO: 1) (aa1) of hABCA4-N and the remaining part of hABCA4-N (corresponding to positions 2 to 1108 of SEQ ID NO: 1; aa2 to aa1108) and should not be considered as a part of the hABCA4-N. The Flag tag may not be present in case that the indicator function is not required or not desired, e.g., in the manufacture of medicaments. The start codon ATG and the coding sequence without ATG (SEQ ID NO: 5) together constitute the complete coding sequence (SEQ ID NO: 3) for hABCA4-N-S1109 (aa1 to aa1108) .

[0314] Transfection and Detection:

[0315] According to standard cell culture methods, HEK293T cells were grown in 6-well tissue culture plates to a suitable density before the cells were transfected with PEI reagents and 1.5 μg of each of the two expression plasmids. The transfected cells were then cultured at 37℃ in an incubator under 5%CO2 for about 72 hours, and after that, samples were taken from the cultures and lysed in RIPA buffer (Beyotime Biotechnology, P0013B; supplemented with protease inhibitors and 1 mM phenylmethylsulfonyl (PMSF) (Beyotime Biotechnology, ST506) ) to extract recombinant human ABCA4 protein. After the lysis, the samples were denatured at 0℃ for 15 minutes in 1xSDS-PAGE sample loading buffer and then the lysates were separated by 6%SDS polyacrylamide gel electrophoresis for Western Blot to detect the expression of the recombinant human ABCA4 protein with the following antibodies: Monoclonal   M2 antibody (1: 2000, F1804, Sigma-Aldrich) ; HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb (1: 2000, #3724, Cell Signaling Technology) ; Tubulin β polyclonal antibody (1: 2000, AP0064, Bioworld) to detect Tubulin as a loading control.

[0316] The expression of hABCA4-N and the recombination of hABCA4-N and hABCA4-C into full length hABCA4 generated bands indicating hABCA4-N and full length hABCA4 by using the anti-Flag antibody in the Western Blot. The bands can be easily distinguished by their molecular weight characteristic.

[0317] The expression of hABCA4-C and the recombination of hABCA4-N and hABCA4-C into full length hABCA4 generated bands indicating hABCA4-C and full length hABCA4 by using the anti-HA antibody in the Western Blot. The bands can be easily distinguished by their molecular weight characteristics.

[0318] The hABCA4-assocaited bands and the band of the loading control Tubulin were quantified by using Image software.

[0319] The ratio of the quantified band intensity of full length hABCA4 to the quantified band intensity of Tubulin was defined as Expression Efficiency of full length hABCA4. The higher the expression efficiency, the more desired the selection of the split site and / or the split intein is.

[0320] The ratio of the quantified band intensity of full length hABCA4 to the quantified band intensity of hABCA4-N or hABCA4-C (both are undesired by-products) was defined as Expression Purity of full length hABCA4. The higher the expression purity, the more desired the selection of the split site and / or the split intein is.

[0321] Results and Conclusion:

[0322] The Western Blot results in Table 3 and Fig. 2 show that for both split sites S1063 and S1109 and all five types of split inteins, the expression of full length hABCA4 was noted.

[0323] In view of the selection of the split site, higher expression efficiency was achieved with split site S1109 compared to split site S1063 for all the five types of split inteins.

[0324] In view of the selection of the split intein, higher expression efficiency was achieved with split intein Gp41-1 compared to the other four types of split inteins for both split sites S1063 and S1109.

[0325] The highest expression efficiency was achieved with the combination of split site S1109 and split intein Gp41-1.

[0326] Table 3. Expression efficiency of full length hABCA4 for each of the combinations of the split sites and the split inteins

[0327] Similar trends were noted for the expression purity (Table 4 and Fig. 3) of full length hABCA4.

[0328] In view of the selection of the split site, higher expression purity was achieved with split site S1109 compared to split site S1063 for the four types of split inteins other than Rma.

[0329] In view of the selection of the split intein, higher expression purity was achieved with split intein Gp41-1 compared to the other four types of split inteins for both split sites S1063 and S1109.

[0330] The highest expression purity was achieved with the combination of split site S1109 and split intein Gp41-1.

[0331] Table 4. Expression purity of full length hABCA4 for each of the combinations of the split sites and the split inteins

[0332] The above results demonstrate that the split intein Gp41-1 was optimal for both split sites S1063 and S1109. To further verify whether Gp41-1 is optimal for additional split sites, split site S1099 was tested in combination with Gp41-1 according to the same experimental procedure above.

[0333] The Western Blot results in Table 5 and Fig. 4 show that Gp41-1 also achieved the highest expression efficiency of full length hABCA4 for this additional split site S1099, suggesting that Gp41-1 could be used in combination with various split sites to achieve desired expression efficiency.

[0334] Table 5. Expression efficiency of full length hABCA4 for the combination of split site S1099 and various split intein

[0335] Example 2: Dual-rAAV8 delivery of human ABCA4 protein

[0336] This Example demonstrates the in vivo expression of dual-rAAV8-delivered hABCA4 with split site S1109 and split intein Gp41-1 as demonstrated to be the best candidate in Example 1 (designated as “HG” hereinafter) . AAV8 capsid refers to the capsid of wild type AAV8 virus. rAAV8 or rAAV8 particles refers to recombinant AAV particles with AAV8 capsid, encapsulating engineered vector genomes.

[0337] Transgene Plasmid Construction:

[0338] A hABCA4-N-S1109 rAAV transgene plasmid for packaging into AAV8 capsid to prepare hABCA4-N-S1109 rAAV8 particles for expressing hABCA4-N-S1109 was designed to comprise the full length of the 5’ ITR-to-3’ ITR sequence as set forth in SEQ ID NO: 49, which comprises, from 5’ to 3’ , the elements in Table 6 below. Upon AAV packaging, the 5’ ITR-to-3’ ITR sequence (SEQ ID NO: 49) was encapsulated by the AAV8 capsid to form the vector genome of the resulting hABCA4-N-S1109 rAAV8 particles.

[0339] Table 6. Elements of the hABCA4-N-S1109 rAAV transgene plasmid

[0340] A hABCA4-C-S1109 rAAV transgene plasmid for packaging into AAV8 capsid to prepare hABCA4-C-S1109 rAAV8 particles for expressing hABCA4-C-S1109 was designed to comprise the full length of the 5’ ITR-to-3’ ITR sequence as set forth in SEQ ID NO: 50, which comprises, from 5’ to 3’ , the elements in Table 7 below. Upon AAV packaging, the 5’ ITR-to-3’ ITR sequence (SEQ ID NO: 50) was encapsulated by the AAV8 capsid to form the vector genome of the resulting hABCA4-C-S1109 rAAV8 particles. The resulting hABCA4-N-S1109 and hABCA4-C-S1109rAAV8 particles are collectively designated as HG particles.

[0341] Table 7. Elements of the hABCA4-C-S1109 rAAV transgene plasmid

[0342] As a control, two rAAV transgene plasmids based on CN115074369A ( “JWK” ) were constituted and packaged into AAV8 capsid to prepare rAAV8 particles for expressing control hABCA4-N-C1150 and control hABCA4-C-C1150, respectively, with split site C1150 and split intein Rma. The full length of the 5’ ITR-to-3’ ITR sequence comprised in the JWK hABCA4-N transgene plasmid is set forth in SEQ ID NO: 51. The full length of the 5’ ITR-to-3’ ITR sequence comprised in the JWK hABCA4-C transgene plasmid is set forth in SEQ ID NO: 52. The resulting hABCA4-N-C1150 and hABCA4-C-C1150 rAAV8 particles are collectively designated as JWK particles.

[0343] rAAV Particle Preparation:

[0344] The rAAV particles were produced using conventional triple-plasmid transfection system mutatis mutandis, by co-transfecting the rAAV transgene plasmid, packaging plasmid, and helper plasmid in a weight ratio of 1: 1: 2 into HEK293T cells. The rAAV transgene plasmid was packaged by AAV8 capsid to form the vector genome inside the capsid, and together the genome and the AAV8 capsid constituted rAAV8 particles.

[0345] Specifically, the HEK293T cells were cultured in competent DMEM medium, and the cells were plated 24 hours before transfection of the plasmids. Shortly before transfection, the culture medium was replaced with fresh DMEM containing 2%FBS. PEI-MAX was used as the transfection reagent. The transfected HEK293T cells were harvested from the media at 72 hours post translation. The rAAV particles were purified from the cells by using iodixanol density gradient ultracentrifugation.

[0346] Administration

[0347] C57BL / 6J (wild type) mice was used as control to show normal expression level of mouse ABCA4 protein in vivo. On the other hand, a mouse model in which mouse ABCA4 gene was knock out was established based on C57BL / 6J mice, resulting in an ABCA4 deficient C57BL / 6J mouse model (Abca4- / -) .

[0348] rAAV8 particles (HG or JWK) were administrated to the mouse model at 4-week age via subretinal injection at various doses (Dose 1: 3.00E+08; Dose 2: 5.56E+08; Dose 3: 1.67E+09; Dose 4: 3.00E+09; Dose 5: 5.00E+09) for expression and recombination of hABCA4 protein in the mice model. After 8 weeks, whole eyes were extracted from C57 WT mice (12-week age) and Abca4- / -mouse models administrated with rAAV particles (12-week age) for cell lysis and detection of hABCA4 protein by Western Blot with anti-ABCA4 antibody as a primary antibody and an antibody having affinity to the primary antibody as a secondary antibody. The mABCA4-and hABCA4-assocaited bands were quantified by using Image software. The qualified band intensity of hABCA4 was normalized to the qualified band intensity of mABCA4.

[0349] Results:

[0350] As shown in Table 8 and Fig. 5, HG rAAV8 particles achieved about half of the normal ABCA4 expression level of WT C57 mouse at Dose 2, achieved about 83%at Dose 3, and achieved about 150%at Dose 4 and Dose 5. For comparison purpose, the ABCA4 expression level achieved by HG rAAV8 particles was about 7 folds of that by JWK rAAV8 particles at the same Dose 5, indicating the advantage of the HG rAAV8 particles.

[0351] Table 8

[0352] Example 3: Reduced A2E accumulation

[0353] Loss of ABCA4 function leads to toxic accumulation of bisretinoids, specifically N-retinylidene-N-retinylethanolamine (A2E) , a condensation product of all-trans-retinal with N-ret-PE in the outer segments. The HG particles and Abca4- / -mouse model in Example 2 were used to detect accumulation of lipofuscin / N-retinylidene-N-retinylethanolamine (A2E) .

[0354] Six to nine weeks old Abca4- / -mice received subretinal injection of HG particles. One eye of each mouse was treated with HG particles, and the other contralateral eye of the same mouse was untreated and left as a negative control. Thirteen weeks after subretinal injection, mice were euthanized followed by exsanguination. Eyecups were dissected and placed on crushed ice immediately. Each specimen was spiked with 100 μL of an internal-standard solution (0.5 ng / μL) and subjected to chloroform–methanol extraction. The organic phase was transferred to a vacuum concentrator and dried in two steps: V-HV mode for 40 min, followed by V-AL mode for 15 min. Dried extracts were stored at -80 ℃ until analysis. Immediately before LC-MS, samples were reconstituted in 100 μL methanol containing 0.1 %trifluoroacetic acid; calibration standards were reconstituted in 100 μL neat methanol. Analyses were performed on an Acquity UPLC H-Class coupled to a Xevo G2-XS Q-TOF mass spectrometer operating in multiple-reaction-monitoring (MRM) mode. Injection volume was 2 μL per sample. A2E was quantified using the transition m / z 418.31, and its deuterated internal standard (A2E-d4) using m / z 422.33.

[0355] Referring to Fig. 6, the experimental results show that reduced accumulation of A2E was achieved in the treated eye for all four dosages (1×109, 3×109, 5×109, 7×109 vg / eye / 1 μL) of HG particles compared to the contralateral eye, suggesting that the expression of ABCA4 protein by HG particles in the treated eye of Abca4- / -mouse models reduced undesired A2E accumulation. A2E accumulation was reduced by 19.4%at the dosage of 1×109 vg / eye / 1 μL, reduced by 38.2%at the dosage of 3×109 vg / eye / 1 μL, reduced by 30.0%at the dosage of 5×109 vg / eye / 1 μL, and reduced by 51.9%at the dosage of 7×109 vg / eye / 1 μL.

[0356] Example 4: Protection of photoreceptor structure

[0357] It was reported that genetic ablation of Rdh8 and Abca4, two important enzymes responsible for all-trans-retinal clearance from photoreceptors, caused severe retinal degeneration in mice. A mouse model in which both mouse ABCA4 gene and RDH gene were knock out was established based on C57BL / 6J mice, resulting in an ABCA4 and RDH deficient C57BL / 6J mouse model (Abca4- / -Rdh8- / -) .

[0358] Five to six weeks old Abca4- / -Rdh8- / -mice received subretinal injection of HG particles. One eye of each mouse was treated with HG particles, and the other contralateral eye of the same mouse was untreated and left as a negative control. Eight weeks after subretinal injection, mice were placed in a complete dark room for overnight dark adaptation. On the following morning, full pupillary dilation was achieved in both eyes, after which the mice were exposed to 10,000 lux white light for 1 hour. Immediately following light exposure, mice were returned to the dark room for continued dark adaptation. One week later, optical coherence tomography (OCT) imaging was performed, and both eyes were harvested for hematoxylin and eosin (H&E) staining.

[0359] Referring to Fig. 7, the experimental results show that the subretinal injection of HG particles preserved photoreceptor structure and prevented light-induced cell death, while untreated fellow eyes showed severe outer-segment disarray and extensive apoptosis. These results demonstrate that the HG particles successfully protected retinas from light-induced damage.

[0360] ***

[0361] Various modifications and variations of the described products, methods, and uses of the disclosure will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the disclosure. Although the disclosure has been described in connection with specific embodiments, it will be understood that it is capable of further modifications and that the disclosure as claimed should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the disclosure that are obvious to those skilled in the art are intended to be within the scope of the disclosure. This application is intended to cover any variations, uses, or adaptations of the disclosure following, in general, the principles of the disclosure and including such departures from the present disclosure come within known customary practice within the art to which the disclosure pertains and may be applied to the essential features herein before set forth.

[0362] DESCRIPTION OF EXAMPLARY SEQUENCES

[0363] SEQ ID NO: 1, human ABCA4 protein amino acid sequence, 2273 aa, retinal-specific phospholipid-transporting ATPase ABCA4 [Homo sapiens] , GenBank NP_000341.2

[0364] SEQ ID NO: 2, hABCA4-N-S1109 amino acid sequence with N-terminal starting Methionine (M) , 1108 aa

[0365] SEQ ID NO: 3, hABCA4-N-S1109 coding sequence with start codon ATG, 3324 nt

[0366] SEQ ID NO: 4, hABCA4-N-S1109 amino acid sequence without N-terminal starting Methionine (M) , 1107 aa

[0367] SEQ ID NO: 5, hABCA4-N-S1109 coding sequence without start codon ATG, 3321 nt

[0368] SEQ ID NO: 6, hABCA4-C-S1109 amino acid sequence, 1165 aa

[0369] SEQ ID NO: 7, hABCA4-C-S1109 coding sequence, 3495 aa

[0370] SEQ ID NO: 8, hABCA4-N-S1063 amino acid sequence with N-terminal starting Methionine (M) , 1062 aa

[0371] SEQ ID NO: 9, hABCA4-N-S1063 amino acid sequence without N-terminal starting Methionine (M) , 1061 aa

[0372] SEQ ID NO: 10, hABCA4-C-S1063 amino acid sequence, 1211 aa

[0373] SEQ ID NO: 11, Npu-N amino acid sequence, 102 aa

[0374] SEQ ID NO: 12, Npu-N coding sequence, 306 nt

[0375] SEQ ID NO: 13, Npu-C amino acid sequence, 35 aa

[0376] SEQ ID NO: 14, Npu-C coding sequence, 105 nt

[0377] SEQ ID NO: 15, Rma-N amino acid sequence, 102 aa

[0378] SEQ ID NO: 16, Rma-N coding sequence, 306 nt

[0379] SEQ ID NO: 17, Rma-C amino acid sequence, 51 aa

[0380] SEQ ID NO: 18, Rma-C coding sequence, 153 nt

[0381] SEQ ID NO: 19, Cfa-N amino acid sequence, 101 aa

[0382] SEQ ID NO: 20, Cfa-N coding sequence, 303 nt

[0383] SEQ ID NO: 21, Cfa-C amino acid sequence, 35 aa

[0384] SEQ ID NO: 22, Cfa-C coding sequence, 105 nt

[0385] SEQ ID NO: 23, Gp41-1-N amino acid sequence, 88 aa

[0386] SEQ ID NO: 24, Gp41-1-N coding sequence, 264 nt

[0387] SEQ ID NO: 25, Gp41-1-C amino acid sequence, 36 aa

[0388] SEQ ID NO: 26, Gp41-1-C coding sequence, 108 nt

[0389] SEQ ID NO: 27, Cat-N amino acid sequence, 30 aa

[0390] SEQ ID NO: 28, Cat-N coding sequence, 90 nt

[0391] SEQ ID NO: 29, Cat-C amino acid sequence, 104 aa

[0392] SEQ ID NO: 30, Cat-C coding sequence, 312 nt

[0393] SEQ ID NO: 31, CBH promoter, 799 nt

[0394] SEQ ID NO: 32, CMV enhancer, 304 nt

[0395] SEQ ID NO: 33, CMV promoter, 204 nt

[0396] SEQ ID NO: 34, WPRE3, 248 nt

[0397] SEQ ID NO: 35, polyA signal coding sequence (polyA signal: SV40 late polyadenylation signal upstream element + SV40 late polyadenylation signal) , 181 nt

[0398] SEQ ID NO: 36, Flag tag amino acid sequence, 22 aa

[0399] SEQ ID NO: 37, Flag tag coding sequence, 66 nt

[0400] SEQ ID NO: 38, HA tag amino acid sequence, 9 aa

[0401] SEQ ID NO: 39, HA tag coding sequence, 27 nt

[0402] SEQ ID NO: 40, mCherry amino acid sequence, 236 aa

[0403] SEQ ID NO: 41, mCherry coding sequence, 708 nt

[0404] SEQ ID NO: 42, EGFP amino acid sequence, 239 aa

[0405] SEQ ID NO: 43, EGFP coding sequence, 717 nt

[0406] SEQ ID NO: 44, AAV2 5’ ITR, 141 nt

[0407] SEQ ID NO: 45, AAV2 3’ ITR, 141 nt

[0408] SEQ ID NO: 46, GRK1 promoter, 292 nt

[0409] SEQ ID NO: 47, MVM intron, 92 nt

[0410] SEQ ID NO: 48, W3SL, 429 nt

[0411] SEQ ID NO: 49, ITR-to-ITR sequence of HG ABCA4-N transgene plasmid, 4761 nt

[0412] SEQ ID NO: 50, ITR-to-ITR sequence of HG ABCA4-C transgene plasmid, 4779 nt

[0413] SEQ ID NO: 51, ITR-to-ITR, 5001 nt

[0414] SEQ ID NO: 52, ITR-to-ITR, 4798 nt

Claims

1.A composition comprising:(1) a first recombinant AAV (rAAV) particle comprising a capsid and a first polynucleotide encapsulated within the capsid, the first polynucleotide comprising:(i) a first ABCA4 polynucleotide encoding a N-terminal portion of human ABCA4 protein, and(ii) a first intein polynucleotide encoding an N-terminal portion of an intein, wherein the first intein polynucleotide is linked 3’ to the first ABCA4 polynucleotide; and(2) a second rAAV particle comprising a capsid and a second polynucleotide encapsulated within the capsid, the second polynucleotide comprising:(i) a second ABCA4 polynucleotide encoding a C-terminal portion of the human ABCA4 protein, and(ii) a second intein polynucleotide encoding a C-terminal portion of the intein, wherein the second intein polynucleotide is linked 5’ to the second ABCA4 polynucleotide;wherein co-delivery of the first rAAV particle and the second rAAV particle into a cell results in the production of the human ABCA4 protein in the cell.2.The composition of claim 1, wherein the N-terminal portion of the human ABCA4 protein and the C-terminal portion of the human ABCA4 protein are split at a split site selected from the group consisting of S1109, S1063, S1071, T1089, S1096, S1099, T1112, S1116, T1117, C1140, S1141, T1143, T1153, T1158, C1150, S1090, and S1168 of the human ABCA4 protein.3.The composition of claim 1 or 2, wherein the human ABCA4 protein is human wild type ABCA4 protein (NCBI Accession No. : NP_000341) of SEQ ID NO: 1 or a naturally occurring, functional, non-pathogenic mutant thereof; optionally, wherein the human ABCA4 protein comprises a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 1.4.The composition of any of claims 1-3, wherein the split site is S1109, the N-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 2 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 2; and the C-terminal portion of the human ABCA4 protein comprises SEQ ID NO: 6 or a sequence having sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 6.5.The composition of any of claims 1-4, wherein the intein is selected from the group consisting of Gp41-1 intein, Npu intein, Rma intein, Cfa intein, and Cat intein.6.The composition of any of claims 1-5, wherein the intein is Gp41-1 intein, the N-terminal portion of the intein (Gp41-1-N) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 23, and the C-terminal portion of the intein (Gp41-1-C) has a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO:25.7.The composition of any of claims 1-6, wherein the first polynucleotide comprises a promoter that regulates the transcription of the first ABCA4 polynucleotide; and / or wherein the second polynucleotide comprises a promoter that regulates the transcription of the second ABCA4 polynucleotide; optionally, wherein the promoter is a GRK1 promoter, such as, SEQ ID NO: 46.8.The composition of any of claims 1-7, wherein the first polynucleotide comprises an intron; and / or wherein the second polynucleotide comprises an intron; optionally, wherein the promoter is a MVM intron, such as, SEQ ID NO: 47.9.The composition of any of claims 1-8, wherein the first polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ :(a) 5’ ITR, e.g., AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;(b) a promoter, e.g., GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;(c) an optional intron, e.g., MVM intron of SEQ ID NO: 47;(d) an optional Kozak sequence (GCCACC) ;(e) the first ABCA4 polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 3) encoding the N-terminal portion of the human ABCA4 protein (e.g., hABCA4-N-S1109, such as, SEQ ID NO: 2) ;(f) the first intein polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 24) encoding the N-terminal portion of the intein (e.g., Gp41-1-N, such as, SEQ ID NO: 23) , wherein the first intein polynucleotide is linked (e.g., linked immediately) 3’ to the first ABCA4 polynucleotide;(g) an optional WPRE3 (such as, SEQ ID NO: 34) ;(h) a polyA coding sequence (such as, SEQ ID NO: 35) ; and(i) 3’ ITR, e.g., AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45; andthe second polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ :(a) 5’ ITR, e.g., AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;(b) a promoter, e.g., GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;(c) an optional intron, e.g., MVM intron of SEQ ID NO: 47;(d) an optional Kozak sequence (GCCACC) ;(e) the second intein polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 26) encoding the C-terminal portion of the intein (e.g., Gp41-1-C, such as, SEQ ID NO: 25) , wherein the second intein polynucleotide is linked (e.g., linked immediately) 5’ to the second ABCA4 polynucleotide;(f) the second ABCA4 polynucleotide (such as, SEQ ID NO: 7) encoding the C-terminal portion of the human ABCA4 protein (e.g., hABCA4-C-S1109, such as, SEQ ID NO: 6) ;(g) an optional WPRE3 (such as, SEQ ID NO: 34) ; and(h) a polyA coding sequence (such as, SEQ ID NO: 35) ; and(i) 3’ ITR, e.g., AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45.10.The composition of any of claims 1-9, wherein the first polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ :(a) AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;(b) GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;(c) MVM intron of SEQ ID NO: 47;(d) Kozak sequence (GCCACC) ;(e) the first ABCA4 polynucleotide of SEQ ID NO: 3;(f) the first intein polynucleotide of SEQ ID NO: 24) , wherein the first intein polynucleotide is linked immediately 3’ to the first ABCA4 polynucleotide;(g) WPRE3 of SEQ ID NO: 34;(h) a polyA coding sequence of SEQ ID NO: 35; and(i) AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45; andthe second polynucleotide comprises, from 5’ to 3’ :(a) AAV2 5’ ITR of SEQ ID NO: 44;(b) GRK1 promoter of SEQ ID NO: 46;(c) MVM intron of SEQ ID NO: 47;(d) Kozak sequence (GCCACC) ;(e) the second intein polynucleotide of SEQ ID NO: 26) , wherein the second intein polynucleotide is linked (e.g., linked immediately) 5’ to the second ABCA4 polynucleotide;(f) the second ABCA4 polynucleotide of SEQ ID NO: 7) ;(g) WPRE3 of SEQ ID NO: 34; and(h) a polyA coding sequence of SEQ ID NO: 35; and(i) AAV2 3’ ITR of SEQ ID NO: 45.11.The composition of any of claims 1-10, wherein the first polynucleotide comprises a sequence having a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 49; and / or wherein the second polynucleotide comprises a sequence having a sequence identity of at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 50.12.The composition of any of claims 1-11, wherein the capsid is selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAVrh74, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV-DJ, AAV. PHP. eB, a member of the Clade to which any of the AAV1-AAV13 belong, a functional truncation thereof, or a functional mutant thereof. Unless otherwise indicated, AAV1 to AAV13 refer to wild type; optionally, wherein the capsid is the capsid of AAV813.A method for expression of human ABCA4 protein, comprising delivering the composition of any of claims 1-12 into a cell.14.A method of treating an eye disease caused by a reduction in expression of human ABCA4 protein in a subject in need thereof, comprising administrating to the subject the composition of any of claims 1-12;optionally, wherein the eye disease is Stargardt disease; optionally, wherein said administrating is by subretinal injection.15.A method of treating Stargardt disease in a subject in need thereof, comprising administrating to the subject the composition of any of claims 1-12; optionally, wherein said administrating is by subretinal injection.16.A DNA plasmid comprising the first polynucleotide as defined in any of claims 1-12 or the second polynucleotide as defined in any of claims 1-12.17.A method of manufacturing a rAAV particle, comprising introducing the DNA plasmid of claim 16 into a cell, wherein said rAAV particle is produced; optionally, wherein the rAAV particle comprises a capsid of AAV8.

Images