Antibodies, antigen-binding protein constructs, and uses thereof

Abstract

Provided are anti-4-1BBantibodies or antigen binding fragments thereof, anti-DLL3antibodies or antigen binding fragments thereof, anti-CD3antibodies or antigen binding fragments thereof, and antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies or antigen-binding fragments thereof) thatspecifically bind to three different antigens (e.g., 4-1BB, DLL3, and CD3).

Description

ANTIBODIES, ANTIGEN-BINDING PROTEIN CONSTRUCTS, AND USES THEREOF

[0001] CLAIM OF PRIORITY

[0002] This application claims the benefit of PCT Application No. PCT / CN2025 / 078009, filed on February 19, 2025. The entire content of the foregoing is incorporated herein by reference.TECHNICAL FIELD

[0003] This disclosure relates to antibodies or antigen-binding fragments thereof, and antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) .BACKGROUND

[0004] A multi-specific antibody is an artificial protein that can simultaneously bind to multiple different types of antigens or multiple different epitopes. Despite the clinical success of the first bispecific antibody approved by the FDA against B cell malignancies (blinatumomab) , many obstacles remain such as treatment resistance, and modest efficacy in solid tumors. To overcome these limitations, considerable efforts have been dedicated to the development of multi-specific antibodies, opening up new avenues to address both the complex biology of cancer and the onset of anti-tumoral immune responses. Simultaneous targeting of two tumor-associated antigens is presumed to enhance cancer cell selectivity and reduce immune escape. Co-engagement of CD3, along with agonists of co-stimulatory molecules or antagonists of co-inhibitory immune checkpoint receptors in a single molecule, may revert T cell exhaustion. Similarly, targeting of two activating receptors in NK cells may improve their cytotoxic potency. From the perspective of health care costs, multi-specific antibodies are appealing, since a similar (or superior) therapeutic effect could be obtained with a single therapeutic agent as with a combination of different monoclonal antibodies.

[0005] As multi-specific antibodies have various applications, there is a need to continue to develop various therapeutics based on multi-specific antibodies.SUMMARY

[0006] This disclosure relates to anti-4-1BB antibodies, antigen-binding fragments thereof, and antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies or antigen-binding fragments thereof) that specifically bind to three different antigens (e.g., 4-1BB, CD3, and DLL3) , and the uses thereof.

[0007] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to 4-1BB (CD137, tumor necrosis factor receptor superfamily 9) , comprising: a heavy chain single variable domain (VHH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, wherein the VHH CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR1 amino acid sequence, the VHH CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR2 amino acid sequence, and the VHH CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR3 amino acid sequence, wherein the selected VHH CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:

[0008] (1) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0009] (2) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively;

[0010] (3) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively;

[0011] (4) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively;

[0012] (5) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively; and

[0013] (6) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively.

[0014] In some embodiments, the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively.

[0015] In some embodiments, the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively.

[0016] In some embodiments, the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively.

[0017] In some embodiments, the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively.

[0018] In some embodiments, the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively.

[0019] In some embodiments, the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively.

[0020] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to 4-1BB comprising a heavy chain single variable region (VHH) comprising an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH sequence, wherein the selected VHH sequence is one of the following:

[0021] (1) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 43;

[0022] (2) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 44; and

[0023] (3) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 45.

[0024] In some embodiments, the VHH comprises the sequence of SEQ ID NO: 43.

[0025] In some embodiments, the VHH comprises the sequence of SEQ ID NO: 44.

[0026] In some embodiments, the VHH comprises the sequence of SEQ ID NO: 45.

[0027] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to 4-1BB comprising a heavy chain single variable region (VHH) comprising VHH CDR1, VHH CDR2, and VHH CDR3 that are identical to VHH CDR1, VHH CDR2, and VHH CDR3 of a selected VHH sequence, wherein the selected VHH sequence is one of the following:

[0028] (1) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 43;

[0029] (2) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 44; and

[0030] (3) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 45.

[0031] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to human 4-1BB and / or monkey 4-1BB.

[0032] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to DLL3, comprising:

[0033] a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, wherein the VH CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VH CDR1 amino acid sequence, the VH CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VH CDR2 amino acid sequence, and the VH CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VH CDR3 amino acid sequence; and

[0034] a light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VL CDR1 amino acid sequence, the VL CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VL CDR2 amino acid sequence, and the VL CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VL CDR3 amino acid sequence,

[0035] wherein the selected VH CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences and the selected VL CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:

[0036] (1) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively;

[0037] (2) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively;

[0038] (3) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 83-85, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively;

[0039] (4) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 89-91, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively;

[0040] (5) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 86-88, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively; and

[0041] (6) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 92-94, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively.

[0042] In some embodiments, the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, according to Kabat definition.

[0043] In some embodiments, the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 83-85, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, according to Kabat definition.

[0044] In some embodiments, the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 86-88, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, according to Kabat definition.

[0045] In some embodiments, the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, according to Chothia definition.

[0046] In some embodiments, the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 89-91, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, according to Chothia definition.

[0047] In some embodiments, the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 92-94, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, according to Chothia definition.

[0048] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to DLL3 comprising a heavy chain variable region (VH) comprising an amino acid sequence that is at least 90%identical to a selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) comprising an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VL sequence, wherein the selected VH sequence and the selected VL sequence are one of the following:

[0049] (1) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 46, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47;

[0050] (2) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 95, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47; and

[0051] (3) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 96, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47.

[0052] In some embodiments, the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 46 and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 47.

[0053] In some embodiments, the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 95 and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 47.

[0054] In some embodiments, the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 96 and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 47.

[0055] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to DLL3 comprising a heavy chain variable region (VH) comprising VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 that are identical to VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 of a selected VH sequence; and a light chain variable region (VL) comprising VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 that are identical to VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 of a selected VL sequence, wherein the selected VH sequence and the selected VL sequence are one of the following:

[0056] (1) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 46, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47;

[0057] (2) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 95, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47; and

[0058] (3) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 96, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47.

[0059] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to human DLL3, monkey DLL3, mouse DLL3, and / or canine DLL3.

[0060] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a human or humanized antibody or antigen-binding fragment thereof.

[0061] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a multi-specific antibody (e.g., a trispecific antibody) .

[0062] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment comprises a human IgG Fc (e.g., a human IgG1 Fc) .

[0063] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment comprises two or more heavy chain single variable domains.

[0064] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment described herein.

[0065] In some embodiments, the nucleic acid is cDNA.

[0066] In one aspect, the disclosure is related to an antigen-binding protein construct, comprising: a first antigen-binding domain that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) , a second antigen-binding domain that specifically binds to DLL3, and a third antigen-binding domain that specifically binds to CD3.

[0067] In some embodiments, the first antigen-binding domain comprises a single-domain antibody variable domain (VHH) ; the second antigen-binding domain comprises a first heavy chain variable region (VH1) and a first light chain variable region (VL1) ; and the third antigen-binding domain comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .

[0068] In one aspect, the disclosure is related to an antigen-binding protein construct, comprising

[0069] (a) a Fc;

[0070] (b) a Fab fragment (Fab) that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) ;

[0071] (c) a single-chain variable fragment (scFv) that specifically binds to CD3; and

[0072] (d) a single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to 4-1BB, wherein the Fab is linked to the N-terminus of the scFv, which is in turn linked to the N-terminus of the Fc, and the VHH is linked to the C-terminus of the Fc, wherein the Fab comprises a first heavy chain variable region (VH1) and a first light chain variable region (VL1) , and the scFv comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .

[0073] In some embodiments, the Fc comprises a first part and a second part, and antigen-binding protein construct comprises:

[0074] (1) the VHH and a first part of the Fc are arranged in tandem, and the Fab, the scFv, and a second part of the Fc are arranged in tandem from N-terminus to C-terminus; or

[0075] (2) the Fab, the scFv, the Fc, and the VHH are arranged in tandem from N-terminus to C-terminus.

[0076] In some embodiments, the Fc comprises a first part and a second part, and the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, and a third chain, wherein:

[0077] (1) the first chain comprises, from N-terminus to C-terminus, a first part of the Fc, the VHH;

[0078] (2) the second chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, VH2, VL2, a second part of the Fc; and

[0079] (3) the third chain comprises VL1.

[0080] In some embodiments, the Fc comprises a first part and a second part, and the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, and a third chain, wherein:

[0081] (1) the first chain comprises a first part of the Fc;

[0082] (2) the second chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, VH2, VL2, a second part of the Fc, the VHH; and

[0083] (3) the third chain comprises VL1.

[0084] In one aspect, the disclosure is related to an antigen-binding protein construct, comprising

[0085] (a) a Fc;

[0086] (b) a first Fab fragment (Fab) and a second Fab that specifically bind to a TAA;

[0087] (c) a single-chain variable fragment (scFv) that specifically binds to CD3; and

[0088] (d) a single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to 4-1BB,

[0089] wherein the first Fab is linked to the N-terminus of the Fc, and the second Fab is linked to the N-terminus of the scFv, which is in turn linked to the N-terminus of the Fc, and the VHH is linked to the C-terminus of the Fc, wherein each of the first Fab and the second Fab comprises a first heavy chain variable region (VH1) and a first light chain variable region (VL1) , and the scFv comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .

[0090] In some embodiments, the Fc comprises a first part and a second part, and antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, a third chain and a fourth chain, wherein:

[0091] (1) the first chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, a first part of the Fc, the VHH;

[0092] (2) the second chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, VH2, VL2, a second part of the Fc;

[0093] (3) the third chain comprises VL1; and

[0094] (4) the fourth chain comprises VL1.

[0095] In some embodiments, the first part of the Fc and the second part of the Fc comprise the same amino acid sequence or different amino acid sequences.

[0096] In some embodiments, the first part of the Fc and the second part of the Fc comprise the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 69-71.

[0097] In one aspect, the disclosure is related to an antigen-binding protein construct, comprising:

[0098] (a) a first polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first CH2 domain, a first CH3 domain, and a single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to 4-1BB;

[0099] (b) a second polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first heavy chain variable region (VH1) , a single-chain variable fragment (scFv) that specifically binds to CD3, a second CH2 domain, and a second CH3 domain; and

[0100] (c) a third polypeptide comprising a first light chain variable region (VL1) ,

[0101] wherein the VH1 and the VL1 associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) , and the scFv comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .

[0102] In one aspect, the disclosure is related to an antigen-binding protein construct, comprising:

[0103] (a) a first polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first CH2 domain, a first CH3 domain;

[0104] (b) a second polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first heavy chain variable region (VH1) , a single-chain variable fragment (scFv) that specifically binds to CD3, a second CH2 domain, a second CH3 domain, and a single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to 4-1BB; and

[0105] (c) a third polypeptide comprising a first light chain variable region (VL1) ,

[0106] wherein the VH1 and the VL1 associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) , and the scFv comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .

[0107] In one aspect, the disclosure is related to an antigen-binding protein construct, comprising:

[0108] (a) a first polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first heavy chain variable region (VH1) , a first CH2 domain, a first CH3 domain, and a single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to 4-1BB;

[0109] (b) a second polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first heavy chain variable region (VH1) , a single-chain variable fragment (scFv) that specifically binds to CD3, a second CH2 domain, and a second CH3 domain; and

[0110] (c) a third polypeptide comprising a first light chain variable region (VL1) ; and

[0111] (d) a fourth polypeptide comprising a first light chain variable region (VL1) ,

[0112] wherein the VH1 of the first polypeptide and the VL1 of the fourth polypeptide associate with each other, forming an antigen binding site of a first Fab, and VH1 of the second polypeptide and the VL1 of the third polypeptide associate with each other, forming an antigen binding site of a second Fab , each of which specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) , and the scFv comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .

[0113] In some embodiments,

[0114] (1) the first chain is VHH-L3-Fc, the second chain is VH1-CH1-L1-VH2-L2-VL2-Fc, and the third chain is VL1-CL;

[0115] (2) the first chain is Fc-L4-VHH, the second chain is VH1-CH1-L1-VH2-L2-VL2-Fc, and the third chain is VL1-CL;

[0116] (3) the first chain is Fc, the second chain is VH1-CH1-L1-VH2-L2-VL2-Fc-L5-VHH, and the third chain is VL1-CL; or

[0117] (4) the first chain is VH1-CH1-Fc-L4-VHH, the second chain is VH1-CH1-L1-VH2-L2-VL2-Fc, the third chain is VL1-CL, and the fourth chain is VL1-CL.

[0118] wherein LI, L2, L3, and L4 are empty or peptide linkers, respectively; CL is a light chain constant region; CH1 is a first heavy chain constant domain.

[0119] In some embodiments, provided is the antigen-binding protein construct according to any one as described herein, wherein the L1, L2, L3, L4, and L5 are empty or peptide linkers known in the art, as long as the antigen-binding protein construct is capable of exhibiting the desired antigen binding activity. For example, the peptide linkers may be flexible peptides having 1-50 or 3-20 amino acid residues. In some embodiments, the peptide linkers are 3-15 amino acid residues in length. In some embodiments, wherein L1, L2, L3, L4, and L5 are same or different, respectively. In some embodiments, L1 amino acid sequence is SEQ ID NO: 72. In some embodiments, L2, L4 and L5 amino acid sequences are SEQ ID NO: 73. In some embodiments, L3 is empty. The linker can consist of neutral polar or nonpolar amino acids. A linker can be, for example, 2 to 100 amino acids in length, such as between 2 and 50 amino acids in length, for example, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50 amino acids in length. A linker can be a cleavable linker, for example, by auto-cleavage, or enzymatic or chemical cleavage.

[0120] In some specific embodiments, the structures of the antigen-binding protein construct are shown in FIGs. 10A-10D.

[0121] In some embodiments, the VHH comprises complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, wherein the VHH CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR1 amino acid sequence, the VHH CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR2 amino acid sequence, and the VHH CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR3 amino acid sequence, wherein the selected VHH CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:

[0122] (1) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;

[0123] (2) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively;

[0124] (3) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively;

[0125] (4) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively;

[0126] (5) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively; and

[0127] (6) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively.

[0128] In some embodiments, the TAA is selected from the group consisting of DLL3, Claudin18.2, CDH17, cluster of differentiate 20 (CD20) , carcinoembryonic antigen (CEA) , prostate-specific antigen (PSA) , prostate stem cell antigen (PSCA) , programmed death-ligand 1 (PD-L1) , human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) , human epidermal growth factor receptor 3 (Her3) , human epidermal growth factor receptor (Her1) , β-Catenin, cluster of differentiate 19 (CD19) , epidermal growth factor receptor (EGFR) , tyrosine-protein kinase Met (c-Met) , epithelial cell adhesion molecule (EPCAM) , prostate-specific membrane antigen (PSMA) , cluster of differentiate 40 (CD40) , Mucin 1, Cell Surface Associated (MUC1) , insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) , and carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 6 (CEA-CAM6) .

[0129] In some embodiments, the TAA is selected from the group consisting of DLL3, Claudin18.2, and CDH17.

[0130] In some embodiments, the VH1 comprises CDRs 1, 2, and 3, wherein the VH1 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH1 CDR1 amino acid sequence, the VH1 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH1 CDR2 amino acid sequence, and the VH1 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH1 CDR3 amino acid sequence; and the VL1 comprises CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL1 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL1 CDR1 amino acid sequence, the VL1 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL1 CDR2 amino acid sequence, and the VL1 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL1 CDR3 amino acid sequence, wherein the selected VH1 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences, the selected VL1 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:

[0131] (1) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively; chain

[0132] (2) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively;

[0133] (3) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 83-85, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively;

[0134] (4) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 89-91, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively;

[0135] (5) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 86-88, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively; and

[0136] (6) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 92-94, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively.

[0137] In some embodiments, the VH2 comprises CDRs 1, 2, and 3, wherein the VH2 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH2 CDR1 amino acid sequence, the VH2 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH2 CDR2 amino acid sequence, and the VH2 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH2 CDR3 amino acid sequence; and the VL2 comprises CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL2 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL2 CDR1 amino acid sequence, the VL2 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL2 CDR2 amino acid sequence, and the VL2 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL2 CDR3 amino acid sequence, wherein the selected VH2 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences, and the selected VL2 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:

[0138] (1) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively; and

[0139] (2) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively.

[0140] In some embodiments, (1) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;

[0141] (2) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;

[0142] (3) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;

[0143] (4) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;

[0144] (5) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;

[0145] (6) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;

[0146] (7) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 83-85, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;

[0147] (8) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 89-91, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;

[0148] (9) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 83-85, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;

[0149] (10) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 89-91, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;

[0150] (11) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 83-85, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;

[0151] (12) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 89-91, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;

[0152] (13) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 86-88, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;

[0153] (14) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 92-94, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;

[0154] (15) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 86-88, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;

[0155] (16) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 92-94, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;

[0156] (17) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 86-88, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively; or

[0157] (18) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 92-94, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively.

[0158] In some embodiments, the VHH comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH sequence, wherein the selected VHH sequence is one of the following:

[0159] (1) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 43;

[0160] (2) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 44; and

[0161] (3) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 45.

[0162] In some embodiments, the VH1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 46, 95, and 96; and the VL1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 47.

[0163] In some embodiments, the VH2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 48; and the VL2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 49.

[0164] In some embodiments, the VHH comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 43; the VH1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 46, 95, and 96; the VL1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 47; the VH2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 48; and the VL2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 49.

[0165] In some embodiments, the VHH comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 44; the VH1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 46, 95, and 96; the VL1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 47; the VH2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 48; and the VL2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 49.

[0166] In some embodiments, the VHH comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 45; the VH1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 46, 95, and 96; the VL1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 47; the VH2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 48; and the VL2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 49.

[0167] In some embodiments, the VHH comprises VHH CDR1, VHH CDR2, and VHH CDR3 that are identical to VHH CDR1, VHH CDR2, and VHH CDR3 of a selected VHH sequence, wherein the selected VHH sequence is one of the following:

[0168] (1) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 43;

[0169] (2) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 44; and

[0170] (3) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 45.

[0171] In some embodiments, the VH1 comprises VH1 CDR1, VH1 CDR2, and VH1 CDR3 that are identical to VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 of any one of SEQ ID NOs: 46, 95, and 96; and the VL1 comprising VL1 CDR1, VL1 CDR2, and VL1 CDR3 that are identical to VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3of SEQ ID NO: 47.

[0172] In some embodiments, the VH2 comprises VH2 CDR1, VH2 CDR2, and VH2 CDR3 that are identical to VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 of SEQ ID NO: 48; and the VL2 comprising VL2 CDR1, VL2 CDR2, and VL2 CDR3 that are identical to VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 of SEQ ID NO: 49.

[0173] In some embodiments, the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, and a third chain, wherein the first chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected first chain, the second chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected second chain, and the third chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected third chain, wherein the selected first chain, second chain and third chain amino acid sequences are one of the following:

[0174] (1) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 50, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0175] (2) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 53, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0176] (3) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 54, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 55, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0177] (4) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 56, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0178] (5) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 57, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0179] (6) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 54, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 58, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0180] (7) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 59, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0181] (8) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 60, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52; and

[0182] (9) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 54, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 61, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52.

[0183] In some embodiments, the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, a third chain and a fourth chain, wherein the first chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 116, the second chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 51, and the third chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 52, and the fourth chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 52.

[0184] In some embodiments, the antigen-binding protein construct is a trispecific antibody.

[0185] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising one or more of the nucleic acids described herein, or a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, or a nucleic acid encoding the antigen-binding protein construct described herein.

[0186] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising the vector described herein.

[0187] In some embodiments, the cell is a CHO cell.

[0188] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising one or more of the nucleic acids described herein, or a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, or a nucleic acid encoding the antigen-binding protein construct described herein.

[0189] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing an antibody or an antigen-binding fragment thereof, or an antigen-binding protein construct, the method comprising

[0190] (a) culturing the cell described herein under conditions sufficient for the cell to produce the antibody or the antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct; and

[0191] (b) collecting the antibody or the antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct produced by the cell.

[0192] In one aspect, the disclosure is related to an antibody-drug conjugate (ADC) comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, or the antigen-binding protein construct described herein, covalently bound to a therapeutic agent.

[0193] In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.

[0194] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and

[0195] (a) the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein,

[0196] (b) the antigen-binding protein construct described herein, or

[0197] (c) the ADC described herein.

[0198] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, the antigen-binding protein construct described herein, the ADC described herein, or the pharmaceutical composition described herein, to the subject.

[0199] In some embodiments, the subject has a solid tumor.

[0200] In some embodiments, the cancer is breast cancer, oropharyngeal cancer, ovarian cancer, bladder cancer, colorectal cancer, pancreas cancer, B cell lymphoma, hepatocellular carcinoma, lung cancer, prostate cancer, melanoma, renal cancer, or Non-Hodgkin's lymphoma.

[0201] In some embodiments, the cancer is pancreatic neuroendocrine tumor (PNET) , small-cell type neuroendocrine carcinoma (SCNEC) , large-cell type neuroendocrine carcinoma (LCNEC) , small cell lung cancer (SCLC) , large cell-neuroendocrine lung cancer, neuroendocrine prostate cancer (NEPC) , Merkel cell carcinoma, small cell urinary bladder cancer, GI neuroendocrine carcinoma, medullary thyroid carcinoma (MTC) , gastroenteropancreatic neuroendocrine carcinoma (GEP NEC) , neuroblastoma, glioma or glioblastoma (GBM) , melanoma, or medullary thyroid cancer.

[0202] In some embodiments, the subject is a human.

[0203] In some embodiments, the subject is a non-human animal.

[0204] In one aspect, the disclosure is related to a method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, the antigen-binding protein construct described herein, the ADC described herein, or the pharmaceutical composition described herein.

[0205] In one aspect, the disclosure is related to a method of killing a tumor cell, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, the antigen-binding protein construct described herein, the ADC described herein, or the pharmaceutical composition described herein.

[0206] In one aspect, the disclosure is related to a method of increasing immune response in a subject, the method comprising administering to the subject an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein, the antigen-binding protein construct described herein, the ADC described herein, or the pharmaceutical composition described herein.

[0207] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Methods and materials are described herein for use in the present invention; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0208] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0209] FIG. 1 lists CDR sequences of anti-4-1BB antibodies as defined by Kabat numbering.

[0210] FIG. 2 lists CDR sequences of anti-4-1BB antibodies as defined by Chothia numbering.

[0211] FIG. 3 lists CDR sequences of anti-DLL3 antibodies and an anti-CD3 antibody as defined by Kabat numbering.

[0212] FIG. 4 lists CDR sequences of anti-DLL3 antibodies and an anti-CD3 antibody as defined by Chothia numbering.

[0213] FIG. 5 lists amino acid sequences as described in the present disclosure.

[0214] FIG. 6A-6B show the activation effect of anti-4-1BB antibodies in reporter cell line.

[0215] FIG. 7A shows the pharmacokinetic profile of anti-4-1BB antibodies in humanized 4-1BB mice.

[0216] FIG. 7B shows the pharmacokinetic profile of anti-4-1BB antibodies in C57BL / 6 mice.

[0217] FIG. 8A-BC are schematic diagrams showing the structure of reference antibody.

[0218] FIGs. 8D-8E are schematic diagrams showing the different structure of bispecific antibody.

[0219] FIG. 9 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with MC38-hB7H4 cells, and were treated with PBS or bispecific antibodies.

[0220] FIGs. 10A-10D are schematic diagrams showing the structure of exemplary anti-4-1BB / DLL3 / CD3 trispecific antibodies.

[0221] FIG. 11A show the activation effect of different structure of anti-Claudin18.2 / CD3 bispecific antibodies in reporter cell line.

[0222] FIG. 11B show the activation effect of different structure of anti-4-1BB / Claudin18.2 / CD3 trispecific antibodies in reporter cell line.

[0223] FIGs. 12A-12C show the binding activity of anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies.

[0224] FIG. 13A is a graph showing the anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies promote cytokine release at E:T ratio of 5: 1.

[0225] FIGs. 13B-13E are graphs showing the anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies promote cytokine release at E: T ratio of 3: 1.

[0226] FIG. 14 is a graph showing the anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies promote the expression of anti-apoptotic protein on T cells surface.

[0227] FIG. 15A is a graph showing the anti-4-1BB / Claudin18.2 / CD3 antibodies promote cytokine release.

[0228] FIGs. 15B-15C are graphs showing the anti-4-1BB / CDH17 / CD3 antibodies promote cytokine release.

[0229] FIG. 16 is a graph showing average tumor volumes on Day 20 in different groups of mice that were injected with SHP-77 cells, and were treated with ISO or anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies.

[0230] FIG. 17 is a graph showing the number of CD3+ cells of per microliter blood in different groups of mice that were injected with SHP-77 cells, and were treated with ISO or anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies.

[0231] FIG. 18 is a graph showing the CXCL10 cytokine release in different groups of mice that were injected with SHP-77 cells, and were treated with ISO or anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies.

[0232] FIG. 19 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with SHP-77 cells, and were treated with ISO or different concentrations of Tri-Format-B-5F5.

[0233] FIGs. 20A-20B are graphs showing Tri-Format-Astructure could induce non-specific cytokine release in the absence of DLL3 positive cells.

[0234] FIG. 20C is a graph showing Tri-Format-Astructure could induce non-specific cytokine release in the absence of Claudin18.2 positive cells.

[0235] FIGs. 20D-20E are graphs showing Tri-Format-Astructure could induce non-specific cytokine release in the absence of CDH17 positive cells.

[0236] FIG. 21 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with lung cancer cells NCI-H69, and were treated with PBS or anti-DLL3 ADCs.

[0237] FIG. 22 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with lung cancer cells SHP77, and were treated with PBS or anti-DLL3 ADCs.

[0238] FIG. 23A is a graph showing the number of CD4+ T cells of per microliter blood in different groups of mice that were injected with SHP-77 cells, and were treated with ISO or the antibodies.

[0239] FIG. 23B is a graph showing the number of CD8+ T cells of per microliter blood in different groups of mice that were injected with SHP-77 cells, and were treated with ISO or the antibodies.

[0240] FIG. 24A is a graph showing the number of CD4+ T cells of per microliter blood in different groups of mice that were injected with SHP-77 cells, and were treated with PBS or the antibodies.

[0241] FIG. 24B is a graph showing the number of CD8+ T cells of per microliter blood in different groups of mice that were injected with SHP-77 cells, and were treated with PBS or the antibodies.

[0242] FIG. 24C is a graph showing the number of CD4+ T cells of per gram of tumor in different groups of mice that were injected with SHP-77 cells, and were treated with PBS or the antibodies.

[0243] FIG. 24D is a graph showing the number of CD8+ T cells of per gram of tumor in different groups of mice that were injected with SHP-77 cells, and were treated with PBS or the antibodies.

[0244] FIG. 25 is a graph showing average tumor volumes in different groups of mice that were injected with lung cancer cells NCI‐H889, and were treated with PBS or with the antibodies.

[0245] FIG. 26 is a graph showing the viability of PBMCs stimulated with the antibodies; Stim2: the second round of stimulation, Stim3: the third round of stimulation, Stim4: the fourth round of stimulation.

[0246] FIG. 27 is a graph showing the cytotoxicity of the PBMCs after the fourth round of stimulation.

[0247] FIG. 28 is a graph showing the body weight of the mice that were treated with PBS or different concentrations of Tri-Format-B-5F5.

[0248] FIG. 29A is a graph showing the IL-2 release in different groups of mice that were treated with PBS or different concentrations of Tri-Format-B-5F5.

[0249] FIG. 29B is a graph showing the IFN-γ release in different groups of mice that were treated with PBS or different concentrations of Tri-Format-B-5F5.

[0250] FIG. 29C is a graph showing the IL-6 release in different groups of mice that were treated with PBS or different concentrations of Tri-Format-B-5F5.

[0251] FIG. 30 is a graph showing the pharmacokinetic characteristics of Tri-Format-B-5F5.DETAILED DESCRIPTION

[0252] In one aspect, the present disclosure provides anti-4-1BB antibodies (e.g., multispecific antibodies) and antigen-binding fragments thereof (e.g., heavy chain antibodies, humanized heavy chain antibodies) , and the uses thereof.

[0253] In one aspect, the present disclosure provides anti-DLL3 antibodies (e.g., multispecific antibodies) and antigen-binding fragments thereof (e.g., heavy chain antibodies, humanized heavy chain antibodies) , and the uses thereof.

[0254] In one aspect, the disclosure provides multispecific antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) that specifically bind to different antigens (e.g., 4-1BB, CD3, and DLL3) . Among the purposes of multispecific antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) , one class of molecules, T cell engagers (TCE) , has gained more attention. A TCE is a multispecific antibody (e.g., trispecific antibodies) which binds to an antigen on a T cell and an antigen on another cell simultaneously. CD3 is usually selected as the antigen on the T cell. A cancer or tumor cell is usually selected as the other cell type as discussed above. Through binding to CD3 on T cells and a tumor associated antigen (TAA) on cancer cells, the TCE can induce activation of T cells upon binding to cancer cells and cause the killing of the latter. The present disclosure provides multispecific antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies or trispecific antibodies) that bind to both a T cell antigen (e.g., CD3) and a tumor associated antigen. The multispecific antigen-binding protein constructs can be used to treat tumor associated antigen positive cancers in a subject (e.g., a human patient) . In some embodiments, the tumor associated antigen positive cancer is DLL3-positive.

[0255] The multispecific antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibodies or trispecific antibodies) can be designed to include one or more antigen-binding sites that target T cell antigens (e.g., CD3, CD4, and CD8) , and include one or more antigen-binding sites that target a tumor-associated antigen (e.g., DLL3, Claudin18.2, CDH17, CEA, CEA-CAM6, HER2, EGFR) . The antigen-binding site can comprise e.g., a Fab, a scFv, a VHH. In some embodiments, the one or more antigen-binding sites that target a T cell antigen (e.g., CD3) can comprise a scFv. In some embodiments, the one or more antigen-binding sites that target the tumor-associated antigen can comprise a Fab. The tumor-associated antigen refers to an antigen that is specifically expressed on tumor cell surfaces. These antigens can be used to identify tumor cells. Normal cells rarely express these tumor associated antigens. Some exemplary tumor-associated antigens include, e.g., DLL3, Claudin18.2, CDH17, CEA, CD20, PSA, PSCA, PD-L1, HER2, Her3, Her1, β-Catenin, CD19, CEA-CAM6, EGFR, c-Met, EPCAM, PSMA, CD40, MUC1, and IGF1R, etc.

[0256] A trispecific antibody or antigen-binding fragment thereof is an artificial protein that can simultaneously bind to three different epitopes (e.g., on three different antigens) . In some embodiments, a trispecific antibody or antigen-binding fragment thereof can have three arms. Each arm forms an antigen-binding domain (or an antigen-binding region) . The present disclosure provides examples of antigen-binding protein constructs that specifically bind to a TAA (e.g., 4-1BB, Claudin18.2, CDH17) , CD3, and DLL3. For example, anti-4-1BB antibodies (e.g., 5F5, 5B2, 9A8) , anti-CD3 antibodies (e.g., humanized SP34 (hSP34) ) , and anti-DLL3 antibodies (e.g., 2A2, 2BL2, 2984) , or antigen-binding fragments thereof can be paired to form various antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) . In some embodiments, the anti-4-1BB / DLL3 / CD3 trispecific antibodies have a heavy chain single variable domain targeting 4-1BB (e.g., any one of the VHH targeting 4-1BB described herein) , a pair of heavy chain variable region and light chain variable region targeting DLL3 (e.g., any one of the VH and VL pairs targeting DLL3 described herein) , and a pair of heavy chain variable region and light chain variable region targeting CD3 (e.g., any one of the VH and VL pairs targeting CD3 described herein) .

[0257] In some embodiments, the multispecific antigen-binding protein constructs includes a Fab that specifically binds to a TAA (e.g., DLL3, Claudin18.2, CDH17) , a scfV that specifically binds to CD3, and a VHH that specifically binds to 4-1BB. In some specific embodiments, the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) have the structures shown in FIGs. 10A-10D. In some embodiments, the antigen-binding protein constructs simultaneously targeting CD3 and 4-1BB may help revert T cell exhaustion.

[0258] In some embodiments, the antigen-binding protein construct comprises:

[0259] (a) a Fc;

[0260] (b) a Fab fragment (Fab) that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) ;

[0261] (c) a single-chain variable fragment (scFv) that specifically binds to CD3; and

[0262] (d) a single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to 4-1BB.

[0263] In some embodiments, the Fab is linked to the N-terminus of the scFv, which is in turn linked to the N-terminus of the Fc, and the VHH is linked to the C-terminus of the Fc. Without wishing to be bound by theory, linking the VHH to the C-terminus of the Fc can help avoid undesirable cytokine secretion.

[0264] In some embodiments, the Fab comprises a first heavy chain variable region (VH1) and a first light chain variable region (VL1) , and the scFv comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .

[0265] In some embodiments, the Fc comprises a first part (e.g., an optional hinge region, CH2 domain and CH3 domain) and a second part (e.g., an optional hinge region, CH2 domain and CH3 domain) , and the antigen-binding protein construct comprises the VHH and a first part of the Fc are arranged in tandem, and the Fab, the scFv, and a second part of the Fc are arranged in tandem from N-terminus to C-terminus; or the Fab, the scFv, the Fc, and the VHH are arranged in tandem from N-terminus to C-terminus.

[0266] In some embodiments, the Fc comprises a first part (e.g., an optional hinge region, CH2 domain and CH3 domain) and a second part (e.g., an optional hinge region, CH2 domain and CH3 domain) , and the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, and a third chain, wherein:

[0267] (1) the first chain comprises, from N-terminus to C-terminus, a first part of the Fc, the VHH;

[0268] (2) the second chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, VH2, VL2, a second part of the Fc; and

[0269] (3) the third chain comprises VL1.

[0270] In some embodiments, the Fc comprises a first part (e.g., an optional hinge region, CH2 domain and CH3 domain) and a second part (e.g., an optional hinge region, CH2 domain and CH3 domain) , and the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, and a third chain, wherein:

[0271] (1) the first chain comprises a first part of the Fc;

[0272] (2) the second chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, VH2, VL2, a second part of the Fc, the VHH; and

[0273] (3) The third chain comprises VL1.

[0274] In some embodiments, the Fc comprises a first part and a second part, and antigen-binding protein construct comprises, a first chain, a second chain, a third chain and a fourth chain, wherein:

[0275] (1) the first chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, a first part of the Fc, the VHH;

[0276] (2) the second chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, VH2, VL2, a second part of the Fc;

[0277] (3) the third chain comprises VL1; and

[0278] (4) the fourth chain comprises VL1.

[0279] In some embodiments, the first part of the Fc and the second part of the Fc comprise the same amino acid sequence. In some embodiments, the first part of the Fc and the second part of the Fc comprise the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 69.

[0280] In some embodiments, the first part of the Fc and the second part of the Fc comprise different amino acid sequences. In some embodiments, the first part of the Fc and the second part of the Fc are separate peptide chains. In some embodiments, knobs-into-holes (KIH) mutations can be introduced into Fc region to promote heterodimerization. In some embodiments, the first part of the Fc can comprise a knob mutation and the second part of the Fc can comprise a hole mutation. In some embodiments, the first part of the Fc can comprise a hole mutation and the second part of the Fc can comprise a knob mutation. In some embodiments, the knob mutations comprise a S345C and / or T366W mutation according to EU numbering, and / or the hole mutations comprise a Y349C, T366S, L368A and / or Y407V mutation according to EU numbering. In addition, LALA-GA (L234A, L235A, and G237A mutations according to EU numbering) can be introduced into the Fc region to reduce ADCC activity. In some embodiments, the first part of the Fc comprise the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 70, and the second part of the Fc comprise the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 71. In some embodiments, the first part of the Fc comprise the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 71, and the second part of the Fc comprise the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 70. In some embodiments, the first part of the Fc comprises the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 69-71. In some embodiments, the second part of the Fc comprises the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 69-71.

[0281] In some embodiments, the antigen-binding protein construct comprises:

[0282] (a) a first polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: an optional hinge region, a first CH2 domain, a first CH3 domain, and a single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to 4-1BB;

[0283] (b) a second polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first heavy chain variable region (VH1) , a single-chain variable fragment (scFv) that specifically binds to CD3, an optional hinge region, a second CH2 domain, and a second CH3 domain; and

[0284] (c) a third polypeptide comprising a first light chain variable region (VL1) ,

[0285] In some embodiments, the VH1 and the VL1 associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) , and the scFv comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .

[0286] In some embodiments, the antigen-binding protein construct comprises:

[0287] (a) a first polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: an optional hinge region, a first CH2 domain, a first CH3 domain;

[0288] (b) a second polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first heavy chain variable region (VH1) , a single-chain variable fragment (scFv) that specifically binds to CD3, an optional hinge region, a second CH2 domain, a second CH3 domain, and a single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to 4-1BB; and

[0289] (c) a third polypeptide comprising a first light chain variable region (VL1) ,

[0290] In some embodiments, the VH1 and the VL1 associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) , and the scFv comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .

[0291] In some embodiments, the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, and a third chain, wherein the first chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected first chain, the second chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected second chain, and the third chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected third chain, wherein the selected first chain, second chain and third chain amino acid sequences are one of the following:

[0292] (1) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 50, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0293] (2) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 53, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0294] (3) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 54, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 55, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0295] (4) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 56, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0296] (5) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 57, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0297] (6) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 54, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 58, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0298] (7) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 59, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;

[0299] (8) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 60, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52; and

[0300] (9) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 54, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 61, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52.

[0301] In some embodiments, the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, a third chain and a fourth chain, wherein the first chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 116, the second chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 51, and the third chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 52, and the fourth chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 52.

[0302] Anti-4-1BB Antibodies and Antigen-Binding Fragments

[0303] 4-1BB (CD137, tumor necrosis factor receptor superfamily 9) is an inducible costimulatory receptor expressed on activated T and natural killer (NK) cells. 4-1BB ligation on T cells triggers a signaling cascade that results in upregulation of antiapoptotic molecules, cytokine secretion, and enhanced effector function. In dysfunctional T cells that have a decreased cytotoxic capacity, 4-1BB ligation demonstrates a potent ability to restore effector functions. On NK cells, 4-1BB signaling can increase antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. Agonistic monoclonal antibodies targeting 4-1BB have been developed to harness 4-1BB signaling for cancer immunotherapy. Preclinical results in a variety of induced and spontaneous tumor models suggest that targeting 4-1BB with agonist antibodies can lead to tumor clearance and durable antitumor immunity.

[0304] 4-1BB is transiently expressed on activated T cells that have encountered cognate antigen, activated NK cells or mature dendritic cells (DCs) . A unique functional ligand has been identified for 4-1BB, 4-1BBL (CD137L, TNFSF9) , expressed on the surface of professional antigen-presenting cells such as DCs, macrophages and B cells. Structurally, no enzymatic activity has been described for the intracellular domain of 4-1BB which is believed to function by recruiting TRAF1, TRAF2 and maybe TRAF3 adaptor proteins that mediate K63 polyubiquitination reactions in the 4-1BB signalosome. 4-1BBL trimerisation leads to 4-1BB receptor clustering and TRAFs-mediated activation of NF-κB and MAPK intracellular signalling cascades, ultimately leading to cell activation, proliferation and survival. Bcl-XL, Bfl-1 induction and downregulation of BIM have been identified as antiapoptotic mechanisms, that seems to involve a role for interference with activation-induced cell death.

[0305] The roles of 4-1BB in cancer are described, e.g., Etxeberria,  et al. “New emerging targets in cancer immunotherapy: CD137 / 4-1BB costimulatory axis. ” ESMO open 4 (2019) : e000733; Etxeberria,  et al. “New emerging targets in cancer immunotherapy: CD137 / 4-1BB costimulatory axis. ” ESMO open 4 (2019) : e000733; Chester, Cariad, et al. “Immunotherapy targeting 4-1BB: mechanistic rationale, clinical results, and future strategies. ” Blood, The Journal of the American Society of Hematology 131.1 (2018) : 49-57, which are incorporated herein by reference in the entirety.

[0306] The disclosure provides, e.g., anti-4-1BB antibodies, modified antibodies thereof, chimeric antibodies thereof, humanized antibodies thereof, and antigen-binding fragments thereof. The disclosure provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind to 4-1BB. In some embodiments, the antibodies and antigen-binding fragments described herein are capable of binding to 4-1BB (e.g., human 4-1BB) . The disclosure provides, e.g., anti-4-1BB antibodies 5F5, 5B5, 9A8, and antibodies and antigen-binding fragments derived therefrom. In some embodiments, the anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can include an antigen binding region that is derived from these antibodies.

[0307] The CDR sequences for 5F5, and 5F5 derived antibodies (e.g., humanized antibodies) include CDR sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively, as defined by Kabat numbering. The CDRs can also be defined by Chothia system. Under the Chothia numbering, the CDR sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, respectively.

[0308] The CDR sequences for 5B2, and 5B2 derived antibodies (e.g., humanized antibodies) include CDR sequences set forth in SEQ ID NOs: 31, 32, and 33, respectively, as defined by Kabat numbering. The CDRs can also be defined by Chothia system. Under the Chothia numbering, the CDR sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34, 35, and 36, respectively.

[0309] The CDR sequences for 9A8, and 9A8 derived antibodies (e.g., humanized antibodies) include CDR sequences set forth in SEQ ID NOs: 37, 38, and 39, respectively, as defined by Kabat numbering. The CDRs can also be defined by Chothia system. Under the Chothia numbering, the CDR sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40, 41, and 42, respectively.

[0310] The amino acid sequence for the VHH domain of 5F5 is set forth in SEQ ID NO: 43.

[0311] The amino acid sequence for the VHH domain of 5B2 is set forth in SEQ ID NO: 44.

[0312] The amino acid sequence for the VHH domain of 9A8 is set forth in SEQ ID NO: 45.

[0313] The amino acid sequences for various modified or humanized VHH are also provided. As there are different ways to modify or humanize a heavy-chain antibody (e.g., a sequence can be modified with different amino acid substitutions) , the VHH domain of a heavy-chain antibody can have different humanized sequences. In some embodiments, the humanized VHH domain is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to sequence of SEQ ID NOs: 43-45.

[0314] Furthermore, in some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can also contain one, two, or three VHH domain CDR sequences selected from the group of SEQ ID NOs: 1-3 (Kabat) , 4-6 (Chothia) , 31-33 (Kabat) , 34-36 (Chothia) , 37-39 (Kabat) , and 40-42 (Chothia) .

[0315] In some embodiments, the antibodies can have a heavy chain single variable domain (VHH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, wherein the CDR1 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VHH CDR1 amino acid sequence, the CDR2 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VHH CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VHH CDR3 amino acid sequence. The selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are shown in FIG. 1 (Kabat) and FIG. 2 (Chothia) .

[0316] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain single variable domain (VHH) containing one, two, or three of VHH CDR1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VHH CDR2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VHH CDR3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions, wherein VHH CDR1, VHH CDR2, and VHH CDR3 are selected from the CDRs in FIG. 1 and FIG. 2.

[0317] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain single variable domain (VHH) containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0318] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain single variable domain (VHH) containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 4 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 5 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 6 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0319] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain single variable domain (VHH) containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 31 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 32 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 33 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0320] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain single variable domain (VHH) containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 34 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 35 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 36 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0321] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain single variable domain (VHH) containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 37 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 38 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 39 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0322] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain single variable domain (VHH) containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 40 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 41 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 42 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0323] The insertions, deletions, and substitutions can be within the CDR sequence, or at one or both terminal ends of the CDR sequence. In some embodiments, the CDR is determined based on Kabat numbering scheme. In some embodiments, the CDR is determined based on Chothia numbering scheme. In some embodiments, the CDR is determined based on a combination numbering scheme. In some embodiments, the CDR is determined based on IMGT numbering scheme.

[0324] The disclosure also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to 4-1BB (e.g., human 4-1BB) . The antibodies or antigen-binding fragments thereof contain a heavy chain single variable region (VHH) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VHH sequence. In some embodiments, the selected VHH sequence is SEQ ID NO: 43, 44 or 45.

[0325] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For purposes of illustration, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished, e.g., using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0326] The disclosure also provides nucleic acids comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy chain single variable domain (VHH) . The VHH comprises CDRs as shown in FIG. 1 and FIG. 2, or has sequences as shown in FIG. 5.

[0327] The antibodies and antigen-binding fragments can also be antibody variants (including derivatives and conjugates) of antibodies or antibody fragments and multi-specific (e.g., bi-specific, tri-specific) antibodies or antibody fragments. Additional antibodies provided herein are polyclonal, monoclonal, multi-specific (multimeric, e.g., bi-specific, tri-specific) , human antibodies, chimeric antibodies (e.g., human-mouse chimera) , single-chain antibodies, intracellularly-made antibodies (i.e., intrabodies) , and antigen-binding fragments thereof.

[0328] In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof comprises an Fc region that can be originated from various types (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) , or subclass. In some embodiments, the Fc region is originated from an IgG antibody or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the Fc region comprises one, two, three, four, or more heavy chain constant regions.

[0329] The present disclosure also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with any antibody or antigen-binding fragment as described herein. The cross-competing assay is known in the art, and is described e.g., in Moore et al., "Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein. " Journal of virology 70.3 (1996) : 1863-1872, which is incorporated herein reference in its entirety. In one aspect, the present disclosure also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the same epitope or region as any antibody or antigen-binding fragment as described herein. The epitope binning assay is known in the art, and is described e.g., in Estep et al. "High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. " MAbs. Vol. 5. No. 2. Taylor &Francis, 2013, which is incorporated herein reference in its entirety.

[0330] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain single variable domain (VHH) CDR1 selected from SEQ ID NOs: 1, 4, 31, 34, 37, and 40.

[0331] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain single variable domain (VHH) CDR2 selected from SEQ ID NOs: 2, 5, 32, 35, 38, and 41.

[0332] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain single variable domain (VHH) CDR3 selected from SEQ ID NOs: 3, 6, 33, 36, 39, and 42.

[0333] In some embodiments, the anti-4-1BB antibodies or antigen-binding fragments thereof comprise a pair of heavy chains. In some embodiments, the heavy chain pair is linked by one or more disulfide bonds. In some embodiments, the heavy chain pair comprises knob-in-hole modifications. In some embodiments, the heavy chain comprises a human IgG Fc domain. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises in each heavy chain at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 VHH domains. In some embodiments, the VHH domains in each heavy chain specifically bind to the same epitope. In some embodiments, the VHH domains in each heavy chain specifically bind to different epitopes. In some embodiments, the VHH domains in each heavy chain bind to at least 1, 2, 3, 4, or 5 different epitopes.

[0334] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a bi-specific antibody, or tri-specific antibody. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof can specifically bind to at least 4, 5, or 6 antigens.

[0335] In some embodiments, the Fc region is human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4.

[0336] In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments thereof have a functional Fc region. In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments thereof comprise a human IgG1 Fc region. In some embodiments, the human IgG1 Fc region comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 69.

[0337] In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments do not have an Fc region. For example, the antibody (or antigen-binding fragment thereof) is a polypeptide comprising one or more VHH domains that are interconnected by linker peptides. In some embodiments, the antibody comprises at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 VHH domain. In some embodiments, the VHH domains specifically bind to the same epitope. In some embodiments, the VHH domains bind to different epitopes. In some embodiments, the VHH domains bind to at least 1, 2, 3, 4, or 5 different epitopes.

[0338] A heavy-chain antibody (or heavy chain-only antibody) is an antibody which has only heavy chains (generally two heavy chains) and lacks the two light chains usually found in antibodies. Naturally occurring heavy-chain antibodies have been discovered in cartilaginous fishes (e.g., shark) and camelids (e.g., llama) . For example, in cartilaginous fishes, the immunoglobulin new antigen receptor (IgNAR) is a heavy-chain antibody. IgNAR shows significant structural differences to other antibodies. It has five constant domains (CH) per chain instead of the usual three, several disulfide bonds in unusual positions, and the complementarity-determining region 3 (CDR3) forms an extended loop covering the site which binds to a light chain in other antibodies. These differences, in combination with the phylogenetic age of the cartilaginous fishes, have led to the hypothesis that IgNAR could be more closely related to a primordial antigen-binding protein than the mammalian immunoglobulins.

[0339] The only mammals with heavy-chain (IgG-like) antibodies are camelids such as dromedaries, camels, llamas and alpacas. Like all mammals, camelids (e.g., llamas) can produce conventional antibodies made of two heavy chains and two light chains bound together with disulfide bonds in a Y shape (e.g., IgG1) . However, they also produce two unique subclasses of IgG: IgG2 and IgG3, also known as heavy chain IgG. These antibodies are made of only two heavy chains, which lack the CH1 region but still bear an antigen-binding domain at their N-terminus called VHH (or nanobody) . Conventional Ig require the association of variable regions from both heavy and light chains to allow a high diversity of antigen-antibody interactions. Although isolated heavy and light chains still show this capacity, they exhibit very low affinity when compared to paired heavy and light chains. The unique feature of heavy chain IgG is the capacity of their monomeric antigen binding regions to bind antigens with specificity, affinity and especially diversity that are comparable to conventional antibodies without the need of pairing with another region. This feature is mainly due to a couple of major variations within the amino acid sequence of the variable region of the two heavy chains, which induce deep conformational changes when compared to conventional Ig. Major substitutions in the variable regions prevent the light chains from binding to the heavy chains, but also prevent unbound heavy chains from being recycled by the immunoglobulin binding proteins.

[0340] The single variable domain of these antibodies (designated VHH, sdAb, or nanobody) is the smallest antigen-binding domain generated by adaptive immune systems. The third Complementarity Determining Region (CDR3) of the variable region of these antibodies has been found to be twice as long as the conventional ones. This results in an increased interaction surface with the antigen as well as an increased diversity of antigen-antibody interactions, which compensates the absence of the light chains. With a long complementarity-determining region 3 (CDR3) , VHHs can extend into crevices on proteins that are not accessible to conventional antibodies, including functionally interesting sites such as the active site of an enzyme or the receptor-binding canyon on a virus surface.

[0341] VHHs offer numerous other advantages compared to conventional antibodies carrying variable domains (VH and VL) of conventional antibodies, including higher stability, solubility, expression yields, and refolding capacity, as well as better in vivo tissue penetration and internalization. Moreover, in contrast to the VH domains of conventional antibodies, VHH do not display an intrinsic tendency to bind to light chains. Since VHH do not bind to VL domains, it is much easier to reformat VHHs into multi-specific (e.g., trispecific) constructs than constructs containing conventional VH-VL pairs or single domains based on VH domains.

[0342] A notable difference between the camelid VHH and the human VH domain is the length and orientation of the CDR3 loop. The CDR3 corresponds to the unique region of the antibody molecule that is encoded by a DNA element newly generated during B-cell development. Genetic recombination results in the fusion of a D-element with flanking V-and J-elements. During recombination further genetic diversity is generated by addition and / or deletion of nucleotides at the junctions. Thereby, the CDR3 loop provides the major contribution to antibody diversity and specificity. A limited number of variable region genes (IGHV, IGHD, and IGHJ) in some early transgenic heavy chain antibody animals, results in some antigens not being recognized by these animals, despite potent antigen response by wildtype animals (Janssens, Rick, et al. "Generation of heavy-chain-only antibodies in mice. " Proceedings of the National Academy of Sciences 103.41 (2006) : 15130-15135) . The present disclosure provides fully humanized heavy chain antibodies generated by genetically modified animals that have complete human heavy chain antibody repertoires.

[0343] As used herein, the term “single-chain antibody” refers to a single polypeptide that contains at least two immunoglobulin variable domains (e.g., a variable domain of a mammalian immunoglobulin heavy chain or light chain) that is capable of specifically binding to an antigen.

[0344] As used herein, the term “heavy-chain antibody” refers to an antibody molecule which is composed only of heavy chains (generally two) and does not have any light chains.

[0345] As used herein, the term “VHH, ” “single-domain antibody variable domain, ” or “heavy chain single variable domain, ” refers to the variable domain derived from a heavy-chain antibody. The VHH can specifically recognize an antigen without the need to be paired with a VL. In some embodiments, the VHH (also known as sdAb or nanobody) described herein is derived from any of the humanized heavy-chain antibody described herein. In some embodiments, the VHH, sdAb, or nanobody described herein is derived from the heavy chain antibody produced by any of the genetically modified non-human animal.

[0346] Anti-DLL3 Antibodies and Antigen-Binding Fragments

[0347] The disclosure provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind to DLL3. In some embodiments, the anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can include an antigen binding region that is derived from these antibodies.

[0348] The Notch pathway is a highly conserved cell signaling pathway that is implicated in malignant transformation, cell proliferation, cycle arrest, and apoptosis, epithelial to mesenchymal transition, and suppression of neuroendocrine differentiation. The Notch signaling pathway is initiated by the binding of one of five ligands (Jagged 1 (Jag 1) , Jag 2, DLL1, DLL3, DLL4) with one of four receptors (Notch 1-4) . The DLL family of proteins interact with EGF repeats on Notch receptors on cell membranes, triggering Notch signaling. In canonical Notch signaling, ligand binding results in the intracellular cleavage of the receptor by metalloproteases, and the Notch intracellular domain then translocates into the nucleus and modulates transcription of Notch-responsive genes. Notch signaling can be oncogenic or tumor suppressive depending on the cellular context. DLL1 has a tumor-suppressive role in lung cancer and is poorly expressed in the bone marrow of patients with lung cancer. In contrast, DLL1 has an oncogenic role in breast cancer, and its overexpression is associated with a poorer prognosis. DLL4 has an oncogenic role in a range of cancers. DLL3 is a noncanonical inhibitory ligand of the Notch receptor that is involved in poorly differentiated neuroendocrine carcinomas (NEC) and well-differentiated neuroendocrine tumors (NET) tumorigenesis. DLL3 is thought to inhibit Notch signaling in cis; it does not bind or activate Notch receptors when presented in trans. In normal tissues, DLL3 is generally expressed at low levels (if at all) and confined to the cytoplasm. It regulates Notch signaling by preventing the localization of Notch receptors to the cell surface and redirecting them to the endosomes for degradation.

[0349] DLL3 expression is regulated by achaete-scute complex homolog 1 (ASCL1) , a transcription factor that dictates neuroendocrine cell fate and whose expression correlates with tumor-initiating cell capacity. Upregulation of ASCL1 in RB1-mutated high-grade pulmonary NEC (SCLC and LCNEC (large-cell NEC) ) is associated with DLL3 overexpression compared with normal tissues. ASCL1 expression in SCLC is associated with DLL3 but negatively associated with Notch expression. DLL3 is expressed on the surface of tumor cells, in addition to having cytoplasmic localization. By modulating Notch1, DLL3 promotes migration and invasion in SCLC. Conversely, Notch pathway activation is associated with low neuroendocrine differentiation and increased intrinsic tumor immunity in SCLC cells. Both ASCL1 and DLL3 are highly expressed in NEPC. These are among the most differentially expressed Notch signaling genes in neuroendocrine prostate cancers (NEPC) cells compared with adenocarcinoma, localized prostate adenocarcinoma, or benign cells. Additionally, upregulated DLL3 expression in patients with gastrointestinal or bladder / urinary tract NECs is strongly associated with ASCL1 expression. Notch2 and DLL3 are upregulated in patients with invasive versus non-invasive growth hormone–producing pituitary adenoma.

[0350] A detailed description of DLL3 and its functions can be found, e.g., in Yao J, Bergsland E, Aggarwal R, Aparicio A, Beltran H, Crabtree JS, Hann CL, Ibrahim T, Byers LA, Sasano H, Umejiego J, Pavel M. DLL3 as an Emerging Target for the Treatment of Neuroendocrine Neoplasms. Oncologist. 2022 Nov 3; 27 (11) : 940-951. ; and Cortinovis DL, Colonese F, Abbate MI, Sala L, Meazza Prina M, Cordani N, Sala E, Canova S. Harnessing DLL3 inhibition: From old promises to new therapeutic horizons. Front Med. 2022 Dec 1; 9: 989405. ; each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0351] In some embodiments, the antibodies and antigen-binding fragments described herein are capable of binding to DLL3 (e.g., human DLL3) . The disclosure provides, e.g., anti-DLL3 antibodies 2A2, 2BL2, 2984, and antibodies and antigen-binding fragments derived therefrom.

[0352] The CDR sequences for 2A2, and 2A2 derived antibodies (e.g., human antibodies) include CDRs of a heavy chain variable domain, comprising the CDR sequences set forth in SEQ ID NOs: 7-9, and CDRs of a light chain variable domain, comprising the CDR sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12 as defined by Kabat numbering. The CDRs can also be defined by Chothia system. Under the Chothia numbering, the CDR sequences of the heavy chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, and CDR sequences of the light chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 22-24.

[0353] The CDR sequences for 2BL2, and 2BL2 derived antibodies (e.g., human antibodies) include CDRs of a heavy chain variable domain, comprising the CDR sequences set forth in SEQ ID NOs: 83-85, and CDRs of a light chain variable domain, comprising the CDR sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12 as defined by Kabat numbering. The CDRs can also be defined by Chothia system. Under the Chothia numbering, the CDR sequences of the heavy chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 89-91, and CDR sequences of the light chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 22-24.

[0354] The CDR sequences for 2984, and 2984 derived antibodies (e.g., human antibodies) include CDRs of a heavy chain variable domain, comprising the CDR sequences set forth in SEQ ID NOs: 86-88, and CDRs of a light chain variable domain, comprising the CDR sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12 as defined by Kabat numbering. The CDRs can also be defined by Chothia system. Under the Chothia numbering, the CDR sequences of the heavy chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 92-94, and CDR sequences of the light chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 22-24.

[0355] Furthermore, in some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can also contain one, two, or three heavy chain variable region CDRs selected from the group of SEQ ID NOs: 7-9 (Kabat) , SEQ ID NOs: 19-21 (Chothia) , SEQ ID NOs: 83-85 (Kabat) , SEQ ID NOs: 86-88 (Kabat) , SEQ ID NOs: 89-91 (Chothia) , and SEQ ID NOs: 92-94 (Chothia) ; and / or one, two, or three light chain variable region CDRs selected from the group of SEQ ID NOs: 10-12 (Kabat) and SEQ ID NOs: 22-24 (Chothia) .

[0356] In some embodiments, the antibodies can have a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, wherein the CDR1 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR1 amino acid sequence, the CDR2 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR3 amino acid sequence, and a light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, 3, wherein the CDR1 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR1 amino acid sequence, the CDR2 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR3 amino acid sequence. The selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences and the selected VL CDRs, 1, 2, 3 amino acid sequences are shown in FIG. 3 (Kabat CDR) and FIG. 4 (Chothia CDR) .

[0357] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 7 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 8 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 9 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0358] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 19 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 20 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 21 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0359] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 83 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 84 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 85 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0360] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 86 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 87 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 88 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0361] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 89 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 90 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 91 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0362] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 92 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 93 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 94 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0363] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a light chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 10 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 11 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 12 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0364] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a light chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 22 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 23 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 24 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0365] The insertions, deletions, and substitutions can be within the CDR sequence, or at one or both terminal ends of the CDR sequence.

[0366] The disclosure also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to DLL3. The antibodies or antigen-binding fragments thereof contain a heavy chain variable region (VH) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL sequence. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NO: 46, 95, or 96, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47.

[0367] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof can have 3 VH CDRs that are identical to the CDRs of any VH sequences as described herein. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof can have 3 VL CDRs that are identical to the CDRs of any VL sequences as described herein.

[0368] The disclosure also provides nucleic acids comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy chain or an immunoglobulin heavy chain. The immunoglobulin heavy chain or immunoglobulin light chain comprises CDRs as shown in FIG. 3 or FIG. 4, or have sequences as shown in FIG. 5. When the polypeptides are paired with corresponding polypeptide (e.g., a corresponding heavy chain variable region or a corresponding light chain variable region) , the paired polypeptides bind to DLL3 (e.g., human DLL3) .

[0369] The anti-DLL3 antibodies and antigen-binding fragments can also be antibody variants (including derivatives and conjugates) of antibodies or antibody fragments and multi-specific (e.g., trispecific) antibodies or antibody fragments. Additional antibodies provided herein are polyclonal, monoclonal, multi-specific (multimeric, e.g., trispecific) , human antibodies, chimeric antibodies (e.g., human-mouse chimera) , single-chain antibodies, intracellularly-made antibodies (i.e., intrabodies) , and antigen-binding fragments thereof. The antibodies or antigen-binding fragments thereof can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) , or subclass. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is an IgG antibody or antigen-binding fragment thereof.

[0370] Fragments of antibodies are suitable for use in the methods provided so long as they retain the desired affinity and specificity of the full-length antibody. Thus, a fragment of an antibody that specifically binds to DLL3 will retain an ability to specifically bind to DLL3. An Fv fragment is an antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy and one light chain variable domain in tight association, which can be covalent in nature, for example in scFv. It is in this configuration that the three CDRs of each variable domain interact to define an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer. Collectively, the six CDRs or a subset thereof confer antigen binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for an antigen) can have the ability to recognize and bind antigen, although usually at a lower affinity than the entire binding site.

[0371] Anti-CD3 Antibodies and Antigen-Binding Fragments

[0372] The disclosure provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind to CD3. In some embodiments, the anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can include an antigen binding region that is derived from these antibodies.

[0373] Cluster of differentiation 3 (CD3) is a multimeric protein complex, known historically as the T3 complex, and is composed of four distinct polypeptide chains; epsilon (ε) , gamma (γ) , delta (δ) and zeta (ζ) , that assemble and function as three pairs of dimers (εγ, εδ, ζζ) . The CD3 complex serves as a T cell co-receptor that associates noncovalently with the T cell receptor (TCR) . The CD3 protein complex is a defining feature of the T cell lineage, therefore anti-CD3 antibodies can be used effectively as T cell markers.

[0374] Several strategies have been developed over the years to rescue and boost T cell effector function in the immunotherapeutic treatment of cancerous diseases. The CD3 protein complex is the signaling subunit of the T cell, and thus, special attention has been paid to developing strategies that could rescue T cell function via targeting the axis where the first signal of T cell activation takes place through the CD3 / TCR engagement. These interventions modify function and / or provide stimulatory signals directly to the T cells to rescue their activation potential, effector function, as well as memory formation ability.

[0375] The CD3 subunits are highly desirable targets for cancer immunotherapy due to several advantages that it may afford. The CD3 complex is a favorable target because of its nature as the signaling-machinery-orchestrating subunit of the T cell receptor. Its function, thus, makes it a target accessible for signal modulation and redirection. The CD3 subunits are the nonvariant subunits of the T cell receptor complex and are present on all T cells-both CD4+ and CD8+ T cells and α-β and γ-δ T cells-making them an easily accessible, pan-T cell, off the shelf, universal target. The multimeric nature of the CD3 complex-6 chains of 3 different types of CD3 proteins, 10 ITAMs of 6 different types as well as their modular arrangement as hetero and homodimers-provides a high degree of modularity and several foci of therapeutic intervention where the CD3 agonistic signal can be fine-tuned and customized to exhibit a wide range and scope of regulatory and modulatory effects on the T cell activation axis. Furthermore, targeting the CD3 subunits may provide the advantage of activating the T cell without depending on the context of MHC restriction.

[0376] T-cell-engaging multispecific antibodies simultaneously bind to antigens on tumour cells and CD3 subunits on T cells. This simultaneous binding results in the recruitment of T cells to the tumour, followed by T-cell activation and degranulation, and tumour cell elimination. T-cell-engaging BsAbs have shown substantial activity in several haematological malignancies by targeting CD19 in acute lymphoblastic leukaemia, CD20 in B-cell non-Hodgkin lymphoma, and BCMA and GPRC5D in multiple myeloma.

[0377] A detailed description of CD3 and its functions can be found, e.g., in Menon, Ashwathi Puravankara et al., “Modulating T Cell Responses by Targeting CD3. ” Cancers vol. 15, 4 1189.13 Feb. 2023; which is incorporated by reference in its entirety.

[0378] In some embodiments, the antibodies and antigen-binding fragments described herein are capable of binding to CD3 (e.g., human CD3) . The disclosure provides, e.g., anti-CD3 antibody hSP34, and antibodies and antigen-binding fragments derived therefrom.

[0379] The CDR sequences for hSP34, and hSP34 derived antibodies (e.g., human antibodies) include CDRs of a heavy chain variable domain, comprising the CDR sequences set forth in SEQ ID NOs: 13-15, and CDRs of a light chain variable domain, comprising the CDR sequences set forth in SEQ ID NOs: 16-18 as defined by Kabat numbering. The CDRs can also be defined by Chothia system. Under the Chothia numbering, the CDR sequences of the heavy chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, and CDR sequences of the light chain variable domain are set forth in SEQ ID NOs: 28-30.

[0380] Furthermore, in some embodiments, the antibody or antigen-binding fragments thereof described herein can also contain one, two, or three heavy chain variable region CDRs selected from the group of SEQ ID NOs: 13-15 (Kabat) and SEQ ID NOs: 25-27 (Chothia) ; and / or one, two, or three light chain variable region CDRs selected from the group of SEQ ID NOs: 16-18 (Kabat) and SEQ ID NOs: 28-30 (Chothia) .

[0381] In some embodiments, the antibodies can have a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, wherein the CDR1 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR1 amino acid sequence, the CDR2 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR3 amino acid sequence, and a light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, 3, wherein the CDR1 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR1 amino acid sequence, the CDR2 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR3 amino acid sequence. The selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences and the selected VL CDRs, 1, 2, 3 amino acid sequences are shown in FIG. 3 (Kabat CDR) and FIG. 4 (Chothia CDR) .

[0382] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 13 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 14 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 15 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0383] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 25 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 26 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 27 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0384] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a light chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 16 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 17 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 18 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0385] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a light chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 28 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 29 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 30 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions.

[0386] The insertions, deletions, and substitutions can be within the CDR sequence, or at one or both terminal ends of the CDR sequence.

[0387] The disclosure also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to CD3. The antibodies or antigen-binding fragments thereof contain a heavy chain variable region (VH) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL sequence. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NO: 48, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 49.

[0388] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof can have 3 VH CDRs that are identical to the CDRs of any VH sequences as described herein. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof can have 3 VL CDRs that are identical to the CDRs of any VL sequences as described herein.

[0389] The disclosure also provides nucleic acids comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy chain or an immunoglobulin heavy chain. The immunoglobulin heavy chain or immunoglobulin light chain comprises CDRs as shown in FIG. 3 or FIG. 4, or have sequences as shown in FIG. 5. When the polypeptides are paired with corresponding polypeptide (e.g., a corresponding heavy chain variable region or a corresponding light chain variable region) , the paired polypeptides bind to CD3 (e.g., human CD3) .

[0390] The anti-CD3 antibodies and antigen-binding fragments can also be antibody variants (including derivatives and conjugates) of antibodies or antibody fragments and multi-specific (e.g., trispecific) antibodies or antibody fragments. Additional antibodies provided herein are polyclonal, monoclonal, multi-specific (multimeric, e.g., trispecific) , human antibodies, chimeric antibodies (e.g., human-mouse chimera) , single-chain antibodies, intracellularly-made antibodies (i.e., intrabodies) , and antigen-binding fragments thereof. The antibodies or antigen-binding fragments thereof can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) , or subclass. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is an IgG antibody or antigen-binding fragment thereof.

[0391] Fragments of antibodies are suitable for use in the methods provided so long as they retain the desired affinity and specificity of the full-length antibody. Thus, a fragment of an antibody that specifically binds to CD3 will retain an ability to specifically bind to CD3. An Fv fragment is an antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy and one light chain variable domain in tight association, which can be covalent in nature, for example in scFv. It is in this configuration that the three CDRs of each variable domain interact to define an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer. Collectively, the six CDRs or a subset thereof confer antigen binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for an antigen) can have the ability to recognize and bind antigen, although usually at a lower affinity than the entire binding site.

[0392] Anti-Claudin18.2 Antibodies and Antigen-Binding Fragments

[0393] The tight junction molecule claudin 18 isotype 2 (Claudin 18.2, also known as CLDN18.2) is a cancer-associated splice variant of Claudin 18. Claudin 18.2 is a 27.8 kDa transmembrane protein comprising four membrane spanning domains with two small extracellular loops (loopl embraced by hydrophobic region 1 and hydrophobic region 2; loop2 embraced by hydrophobic regions 3 and 4) . Claudin 18.2 is a highly selective gastric lineage antigen, exclusively expressed on short-lived differentiated gastric epithelial cells and not detectable in any other normal human tissue. The antigen is ectopically expressed at significant levels in a diversity of human cancers including gastroesophageal and pancreatic cancer. The Claudin 18.2 protein is also frequently detected in lymph node metastases of gastric cancer and in distant metastases. Claudin 18.2 seems to be involved in proliferation of Claudin 18.2 positive tumor cells, since down regulation of the target by siRNA technology results in inhibition of proliferation of gastric cancer cells.

[0394] A detailed description of Claudin 18.2 and its functions can be found, e.g., in Nakayama, Izuma et al. “Claudin 18.2 as a novel therapeutic target. ” Nature reviews. Clinical oncology vol. 21, 5 (2024) : 354-369. ; Kyuno, Daisuke et al. “Claudin-18.2 as a therapeutic target in cancers: cumulative findings from basic research and clinical trials. ” Tissue barriers vol. 10, 1 (2022) : 1967080. ; each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0395] The disclosure provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind to Claudin 18.2. The disclosure also provides anti-4-1BB / Claudin 18.2 / CD3 antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) . In some embodiments, the anti-4-1BB / Claudin 18.2 / CD3 antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can include an antigen binding region that is derived from these antibodies.

[0396] In some embodiments, the antibodies and antigen-binding fragments described herein are capable of binding to Claudin 18.2 (e.g., human Claudin 18.2) . In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof contain a heavy chain variable region (VH) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to a selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to a selected VL sequence. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NO: 104, 106, or 108, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 105, 107, or 109. Additional antibody sequences are described in US11541127, US12129296, US2022 / 0119517, each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0397] Anti-CDH17 Antibodies and Antigen-Binding Fragments

[0398] Cadherins are calcium dependent cell adhesion molecules. They preferentially interact with themselves in a homophilic manner in connecting cells; cadherins may thus contribute to the sorting of heterogeneous cell types. The cadherin molecule Cadherin-17 (CDH17 henceforward) is also known as liver-intestine cadherin or intestinal peptide-associated transporter HPT-1. CDH17 may have a role in the morphological organization of liver and intestine. It is also involved in intestinal peptide transport. The CDH17 structure is characterized as having an extracellular domain with 7 cadherin domains, a single hydrophobic transmembrane domain and a short C-terminal cytoplasmic tail.

[0399] CDH 17 is expressed in the gastrointestinal tract and pancreatic duct. It is not detected in kidney, lung, liver, brain, adrenal gland or skin. CDH 17 expression has been reported in gastric cancer and in epithelial and neuroendocrine colorectal neoplasms.

[0400] A detailed description of CDH17 and its functions can be found, e.g., in Jacobsen, Frank et al. “Cadherin-17 (CDH17) expression in human cancer: A tissue microarray study on 18, 131 tumors. ” Pathology, research and practice vol. 256 (2024) : 155175., which is incorporated by reference in its entirety.

[0401] The disclosure provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind to CDH17. The disclosure also provides anti-4-1BB / CDH17 / CD3 antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) . In some embodiments, the anti-4-1BB / CDH17 / CD3 antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can include an antigen binding region that is derived from these antibodies.

[0402] In some embodiments, the antibodies and antigen-binding fragments described herein are capable of binding to CDH17 (e.g., human CDH17) . In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof contain a heavy chain variable region (VH) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to a selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to a selected VL sequence. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NO: 110, 112, or 114, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 111, 113, or 115. Additional antibody sequences are described in US2025 / 0034273, US10858438, US2013 / 0259878, each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0403] Antibodies, Antigen Binding Fragments and Antigen Binding Protein Constructs

[0404] The present disclosure provides antibodies, antigen-binding fragments thereof, or antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) . The antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can comprise an anti-4-1BB antibody or antigen-binding fragment thereof, an anti-DLL3 antibody or antigen-binding fragment thereof, and an anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof. These antigen-binding protein constructs (e.g., anti-4-1BB / DLL3 / CD3 trispecific antibodies) , anti-4-1BB antibodies, anti-DLL3 antibodies, anti-CD3 antibodies, and antigen-binding fragments thereof can have various forms (e.g., FIGs. 10A-10D) .

[0405] In general, conventional antibodies (also called immunoglobulins) can be made up of two classes of polypeptide chains, light chains and heavy chains. A non-limiting antibody of the present disclosure can be an intact, four immunoglobulin chain antibody comprising two heavy chains and two light chains. The heavy chain of the antibody can be of any isotype including IgM, IgG, IgE, IgA, or IgD or sub-isotype including IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2, etc. The light chain can be a kappa light chain or a lambda light chain. An antibody can comprise two identical copies of a light chain and / or two identical copies of a heavy chain. The heavy chains, which each contain one variable domain (or variable region, VH) and multiple constant domains (or constant regions) , bind to one another via disulfide bonding within their constant domains to form the “stem” of the antibody. The light chains, which each contain one variable domain (or variable region, VL) and one constant domain (or constant region) , each bind to one heavy chain via disulfide binding. The variable region of each light chain is aligned with the variable region of the heavy chain to which it is bound. The variable regions of both the light chains and heavy chains contain three hypervariable regions sandwiched between more conserved framework regions (FR) .

[0406] These hypervariable regions, known as the complementary determining regions (CDRs) , form loops that comprise the principle antigen binding surface of the antibody. The four framework regions largely adopt a beta-sheet conformation and the CDRs form loops connecting, and in some cases forming part of, the beta-sheet structure. The CDRs in each chain are held in close proximity by the framework regions and, with the CDRs from the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding region.

[0407] Methods for identifying the CDR regions of an antibody by analyzing the amino acid sequence of the antibody are well known, and a number of definitions of the CDRs are commonly used. The Kabat definition is based on sequence variability, and the Chothia definition is based on the location of the structural loop regions. These methods and definitions are described in, e.g., Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains, " Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains, " Molecular immunology 45.14 (2008) : 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203: 121-53 (1991) ; Morea et al., Biophys Chem. 68 (1-3) : 9-16 (Oct. 1997) ; Morea et al., J Mol Biol. 275 (2) : 269-94 (Jan . 1998) ; Chothia et al., Nature 342 (6252) : 877-83 (Dec. 1989) ; Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7: 64 (2007) ; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0408] The CDRs are important for recognizing an epitope of an antigen. As used herein, an “epitope” is the smallest portion of a target molecule capable of being specifically bound by the antigen binding domain of an antibody. The minimal size of an epitope may be about three, four, five, six, or seven amino acids, but these amino acids need not be in a consecutive linear sequence of the antigen’s primary structure, as the epitope may depend on an antigen’s three-dimensional configuration based on the antigen’s secondary and tertiary structure.

[0409] In some embodiments, the antibody is an intact immunoglobulin molecule (e.g., IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA) . The IgG subclasses (IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) are highly conserved, differ in their constant region, particularly in their hinges and upper CH2 domains. The sequences and differences of the IgG subclasses are known in the art, and are described, e.g., in Vidarsson, et al, "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. " Frontiers in immunology 5 (2014) ; Irani, et al. "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases. " Molecular immunology 67.2 (2015) : 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0410] The antibody can also be an immunoglobulin molecule that is derived from any species (e.g., human, rodent, mouse, rat, camelid) . Antibodies disclosed herein also include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, monospecific, polyspecific antibodies, and chimeric antibodies that include an immunoglobulin binding domain fused to another polypeptide. The antigen binding domain or antigen binding fragment is a portion of an antibody that retains specific binding activity of the intact antibody, i.e., any portion of an antibody that is capable of specific binding to an epitope on the intact antibody’s target molecule. It includes, e.g., Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, and variants of these fragments. Thus, in some embodiments, an antibody or an antigen binding fragment thereof can be, e.g., a scFv, a Fv, a Fd, a dAb, a bispecific antibody, a bispecific scFv, a diabody, a linear antibody, a single-chain antibody molecule, a multi-specific antibody formed from antibody fragments, and any polypeptide that includes a binding domain which is, or is homologous to, an antibody binding domain. Non-limiting examples of antigen binding domains include, e.g., the heavy chain and / or light chain CDRs of an intact antibody, the heavy and / or light chain variable regions of an intact antibody, full length heavy or light chains of an intact antibody, or an individual CDR from either the heavy chain or the light chain of an intact antibody.

[0411] In some embodiments, the scFV has one heavy chain variable domain, and one light chain variable domain. In some embodiments, the scFV has two heavy chain variable domains, and two light chain variable domains.

[0412] Single-chain Fv (scFv) or antibody fragments comprise the VH and VL domains (or regions) of antibody, wherein these domains are present in a single polypeptide chain. Generally, the scFv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains, which enables the scFv to form the desired structure for antigen binding.

[0413] The Fab fragment contains a variable and constant domain of the light chain and a variable domain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. F (ab') 2 antibody fragments comprise a pair of Fab fragments which are generally covalently linked near their carboxy termini by hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known in the art.

[0414] Diabodies are small antibody fragments with two antigen-binding sites, which fragments comprise a VH connected to a VL in the same polypeptide chain (VH and VL) . By using a linker that is too short to allow pairing between the two domains on the same chain, the domains are forced to pair with the complementary domains of another chain and create two antigen-binding sites.

[0415] Linear antibodies comprise a pair of tandem Fd segments (VH-CH1-VH-CH1) which, together with complementary light chain polypeptides, form a pair of antigen binding regions. Linear antibodies can be bispecific or monospecific.

[0416] One-armed antibodies can have a heavy chain and a light chain, and a heavy chain fragment comprising CH2 and CH3 domains of IgG. In some embodiments, a one-armed antibody is an antibody that only has one of the two antigen binding arms in a typical antibody. In some embodiments, a one-armed antibody comprises an antigen binding arm (e.g., VH+ CH1 and VL+CL) , and a Fc.

[0417] Antibodies and antibody fragments of the present disclosure can be modified in the Fc region to provide desired effector functions or serum half-life. In some embodiments, the Fc region can be modified to silence or decrease complement-dependent cytotoxicity (CDC) or antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) . In some embodiments, the Fc region can be modified to increase CDCor ADCC.

[0418] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can bind to three different antigens or three different epitopes.

[0419] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can comprises one, two, or three heavy chain variable region CDRs selected from FIGs. 1, 2, 3, and 4. In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can comprises one, two, or three light chain variable region CDRs selected from FIGs. 1, 2, 3, and 4.

[0420] Multimerization of antibodies may be accomplished through natural aggregation of antibodies or through chemical or recombinant linking techniques known in the art. For example, some percentage of purified antibody preparations (e.g., purified IgG1 molecules) spontaneously form protein aggregates containing antibody homodimers and other higher-order antibody multimers.

[0421] In some embodiments, the multi-specific antibody is a trispecific antibody. Trispecific antibodies can be made by engineering the interface between the first and second polypeptideto maximize the percentage of heterodimers that are recovered from recombinant cell culture. For example, the interface can contain at least a part of the CH3 domain of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first polypeptide are replaced with larger side chains (e.g., tyrosine or tryptophan) . Compensatory “cavities” of identical or similar size to the large side chain (s) are created on the interface of the second polypeptide by replacing large amino acid side chains with smaller ones (e.g., alanine or threonine) . This provides a mechanism for increasing the yield of the heterodimer over other unwanted end-products such as homodimers. This method is described, e.g., in WO 96 / 27011, which is incorporated by reference in its entirety.

[0422] Any of the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) described herein may be conjugated to a stabilizing molecule (e.g., a molecule that increases the half-life of the antibody or antigen-binding fragment thereof in a subject or in solution) . Non-limiting examples of stabilizing molecules include: a polymer (e.g., a polyethylene glycol) or a protein (e.g., serum albumin, such as human serum albumin) . The conjugation of a stabilizing molecule can increase the half-life or extend the biological activity of an antibody or an antigen-binding fragment in vitro (e.g., in tissue culture or when stored as a pharmaceutical composition) or in vivo (e.g., in a human) .

[0423] The antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can also have various forms. Many different formats of antigen binding constructs are known in the art, and are described e.g., in Tapia-Galisteo, Antonio et al. “When three is not a crowd: trispecific antibodies for enhanced cancer immunotherapy. ” Theranostics vol. 13, 3 1028-1041.22 Jan. 2023, which is incorporated herein by reference in the entirety.

[0424] In some embodiments, the antigen-binding protein construct is a trispecific antibody. In some embodiments, the trispecific antibody in the present disclosure is designed to be 1+1+1 (monovalent for each target) and has an IgG1 subtype structure. In some embodiments, the first antigen-binding domain that specifically binds to 4-1BB is VHH, the second antigen-binding domain that specifically binds to DLL3 is a Fab, and the third antigen-binding domain that specifically binds to CD3 is a scFv, and

[0425] (1) the VHH and the Fc are arranged in tandem, and the Fab, the scFv, and the Fc are arranged in tandem from N-terminus to C-terminus; or

[0426] (2) the Fab, the scFv, the Fc region, and the VHH are arranged in tandem from N-terminus to C-terminus.

[0427] In some embodiments, the Fc comprises a first part and a second part, and the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, and a third chain, wherein:

[0428] (1) the first chain comprises, from N-terminus to C-terminus, a first part of the Fc, the VHH;

[0429] (2) the second chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, VH2, VL2, a second part of the Fc; and

[0430] (3) the third chain comprises VL1.

[0431] In some embodiments, the Fc comprises a first part and a second part, and the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, and a third chain, wherein:

[0432] (1) the first chain comprises a first part of the Fc;

[0433] (2) the second chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, VH2, VL2, a second part of the Fc, the VHH; and

[0434] (3) the third chain comprises VL1.

[0435] In some embodiments, the antigen-binding protein construct is a trispecific antibody. In some embodiments, the trispecific antibody in the present disclosure is designed to be 2+1+1 (bivalent for TAA target, monovalent for the other target) and has an IgG1 subtype structure. In some embodiments, the first antigen-binding domain that specifically binds to 4-1BB is VHH, the second antigen-binding domain that specifically binds to DLL3 is (Fab') 2, and the third antigen-binding domain that specifically binds to CD3 is a scFv.

[0436] In some embodiments, the Fc comprises a first part and a second part, and antigen-binding protein construct comprises, a first chain, a second chain, a third chain and a fourth chain, wherein:

[0437] (1) the first chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, a first part of the Fc, the VHH;

[0438] (2) the second chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, VH2, VL2, a second part of the Fc;

[0439] (3) the third chain comprises VL1; and

[0440] (4) the fourth chain comprises VL1.

[0441] Various methods can be used to reduce homodimerization of the Fc region. For example, knobs-into-holes mutations can be introduced in the Fc regions. The Fc region, effector function can be minimized through the introduction of or LALA-GA mutations ( (L234A, L235A, and G237A mutations according to EU numbering) . The combination can bring an effector cell (T-cell) into the proximity of the tumor cell to enhance antitumor effect.

[0442] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., anti-4-1BB antibodies, anti-DLL3 antibodies, anti-CD3 antibodies, or trispecific antibodies) , have a light chain constant region that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 67, and a heavy chain constant region (e.g., the hinge region, CH2 domain and CH3 domain) that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 69-71.

[0443] Antibody Drug Conjugates (ADC)

[0444] The antibodies and the antigen-binding fragments thereof that specifically bind to DLL3 described herein can be conjugated to a therapeutic agent (a drug) . The therapeutic agent can be covalently or non-covalently bind to the antibody or antigen-binding fragment.

[0445] In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent (e.g., monomethyl auristatin E, monomethyl auristatin F, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxy anthracin, maytansinoids such as DM-1 and DM-4, dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, epirubicin, camptothecin, and cyclophosphamide and analogs) . Useful classes of cytotoxic, cytostatic, or immunomodulatory agents include, for example, antitubulin agents, DNA minor groove binders, DNA replication inhibitors, and alkylating agents.

[0446] In some embodiments, the therapeutic agent can include, but not limited to, cytotoxic reagents, such as chemo-therapeutic agents, immunotherapeutic agents and the like, antiviral agents or antimicrobial agents. In some embodiments, the therapeutic agent to be conjugated can be selected from, but not limited to, MMAE (monomethyl auristatin E) , MMAD (monomethyl auristatin D) , or MMAF (monomethyl auristatin F) .

[0447] Definitions of specific functional groups and chemical terms are described in more detail below. For purpose of this invention, the chemical elements are identified in accordance with the Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Edition, inside cover, and specific functional groups are generally defined as described therein. Additionally, general principles of organic chemistry, as well as specific functional moieties and reactivity, are described in Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March’s Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley &Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; Carruthers, Some Modem Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987.

[0448] All ranges cited herein are inclusive, unless expressly stated to the contrary. When a range of values is listed, it is intended to encompass each value and sub-range within the range. For example, “C1-6” is intended to encompass, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5, and C5-6.

[0449] The compounds or any formula depicting and describing the compounds of the present disclosure may have one or more chiral (asymmetric) centers. The present invention encompasses all stereoisomeric forms of the compounds or any formula depicting and describing the compounds of the present invention. Centers of asymmetry that are present in the compounds or any formula depicting and describing the compounds of the present invention can all independently of one another have (R) or (S) configuration. When bonds to a chiral carbon are depicted as straight lines in the structural formulas, or when a compound name is recited without an (R) or (S) chiral designation for a chiral carbon, it is understood that both the (R) and (S) configurations of each such chiral carbon, and hence each enantiomer or diastereomer and mixtures thereof, are embraced within the formula or by the name.

[0450] The disclosure includes all possible enantiomers and diastereomers and mixtures of two or more stereoisomers, for example mixtures of enantiomers and / or diastereomers, in all ratios. Thus, enantiomers are a subject of the disclosure in enantiomerically pure form, both as levorotatory and as dextrorotatory antipodes, in the form of racemates and in the form of mixtures of the two enantiomers in all ratios. In the case of a cis / trans isomerism the disclosure includes both the cis form and the trans form as well as mixtures of these forms in all ratios. The preparation of individual stereoisomers can be carried out, if desired, by separation of a mixture by customary methods, for example by chromatography or crystallization, by the use of stereochemically uniform starting materials for the synthesis or by stereoselective synthesis. Optionally a derivatization can be carried out before a separation of stereoisomers. The separation of a mixture of stereoisomers can be carried out at an intermediate step during the synthesis of a compound or it can be done on a final racemic product. Absolute stereochemistry may be determined by X-ray crystallography of crystalline products or crystalline intermediates which are derivatized, if necessary, with a reagent containing a stereogenic center of known configuration. Alternatively, absolute stereochemistry may be determined by Vibrational Circular Dichroism (VCD) spectroscopy analysis.

[0451] Unless otherwise stated, the structures depicted herein are also meant to include the compounds that differ only in the presence of one or more isotopically enriched atoms, in other words, the compounds wherein one or more atoms are replaced by atoms having the same atomic number, but an atomic mass or mass number different from the atomic mass or mass number which predominates in nature. Such compounds are referred to as a “isotopic variant” . The present disclosure is intended to include all pharmaceutically acceptable isotopic variants of the compounds or any formula depicting and describing the compounds of the present invention. Examples of isotopes suitable for inclusion in the compounds of the present invention include, but not limited to, isotopes of hydrogen, such as 2H (i.e., D) and 3H; carbon, such as 11C, 13C, and 14C; chlorine, such as 36Cl; fluorine, such as 18F; iodine, such as 123I and 125I; nitrogen, such as 13N and 15N; oxygen, such as 15O, 17O, and 18O; phosphorus, such as 32P; and sulfur, such as 35S. Certain isotopic variants of the compounds or any formula depicting and describing the compounds of the present disclosure, for example those incorporating a radioactive isotope, may be useful in drug and / or substrate tissue distribution studies. Particularly, compounds having the depicted structures that differ only in the replacement with heavier isotopes, such as the replacement of hydrogen by deuterium (2H, or D) , can afford certain therapeutic advantages, for example, resulting from greater metabolic stability, increased in vivo half-life, or reduced dosage requirements and, hence, may be utilized in some particular circumstances. Isotopic variants of compounds or any formula depicting and describing the compounds of the present disclosure can generally be prepared by techniques known to those skilled in the art or by processes analogous to those described in the accompanying examples and synthesis using an appropriate isotopically-labeled reagent in place of the non-labeled reagent previously employed.

[0452] The compounds as provided herein are described with reference to both generic formulas and specific compounds. In addition, the compounds of the present disclosure may exist in a number of different forms or derivatives, all within the scope of the disclosure. These include, for example, pharmaceutically acceptable salts, tautomers, stereoisomers, racemic mixtures, regioisomers, prodrugs, solvated forms, different crystal forms or polymorphs, and active metabolites, etc.

[0453] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable salt” , unless otherwise stated, includes salts that retain the biological effectiveness of the free acid / base form of the specified compound and that are not biologically or otherwise undesirable. Pharmaceutically acceptable salts may include salts formed with inorganic bases or acids and organic bases or acids. In cases where the compounds of the present disclosure contain one or more acidic or basic groups, the disclosure also comprises their corresponding pharmaceutically acceptable salts. Thus, the compounds of the present invention which contain acidic groups, such as carboxyl groups, can be present in salt form, and can be used according to the invention, for example, as alkali metal salts, alkaline earth metal salts, aluminum salts or as ammonium salts. More non-limiting examples of such salts include lithium salts, sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts, barium salts, or salts with ammonia or organic amines such as ethylamine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, piperidine, N-methylglutamine, or amino acids. These salts are readily available, for instance, by reacting the compound having an acidic group with a suitable base, e.g., lithium hydroxide, sodium hydroxide, sodium propoxide, potassium hydroxide, potassium ethoxide, magnesium hydroxide, calcium hydroxide, or barium hydroxide. Other base salts of compounds of the present disclosure include but are not limited to copper (I) , copper (II) , iron (II) , iron (III) , manganese (II) , and zinc salts. Compounds of the present disclosure which contain one or more basic groups, e.g., groups which can be protonated, can be present in salt form, and can be used according to the disclosure in the form of their addition salts with inorganic or organic acids. Examples of suitable acids include hydrogen chloride, hydrogen bromide, hydrogen iodide, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid, sulfoacetic acid, trifluoroacetic acid, oxalic acid, acetic acid, tartaric acid, lactic acid, salicylic acid, benzoic acid, carbonic acid, formic acid, propionic acid, pivalic acid, diethylacetic acid, malonic acid, succinic acid, pimelic acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, embonic acid, mandelic acid, sulfaminic acid, phenylpropionic acid, gluconic acid, ascorbic acid, isonicotinic acid, citric acid, adipic acid, taurocholic acid, glutaric acid, stearic acid, glutamic acid, or aspartic acid, and other acids known to those skilled in the art. The salts which are formed are, inter alia, hydrochlorides, chlorides, hydrobromides, bromides, iodides, sulfates, phosphates, methanesulfonates (mesylates) , tosylates, carbonates, bicarbonates, formates, acetates, sulfoacetates, triflates, oxalates, malonates, maleates, succinates, tartrates, malates, embonates, mandelates, fumarates, lactates, citrates, glutarates, stearates, aspartates, and glutamates. The stoichiometry of the salts formed from the compounds of the disclosure may moreover be an integral or non-integral multiple of one.

[0454] Compounds of the present disclosure which contain basic nitrogen-containing groups can be quaternized using agents such as C1-4alkyl halides, for example, methyl, ethyl, isopropyl, and tert-butyl chloride, bromide, and iodide; diC1-4alkyl sulfates, for example, dimethyl, diethyl, and diamyl sulfate; C10-18alkyl halides, for example, decyl, dodecyl, lauryl, myristyl, and stearyl chloride, bromide, and iodide; and arylC1-4alkyl halides, for example, benzyl chloride and phenethyl bromide.

[0455] If the compounds of the present disclosure simultaneously contain acidic and basic groups in the molecule, the disclosure also includes, in addition to the salt forms mentioned, inner salts or betaines (zwitterions) . The respective salts can be obtained by customary methods which are known to those skilled in the art, for example by contacting these with an organic or inorganic acid or base in a solvent or dispersant, or by anion exchange or cation exchange with other salts. The present disclosure also includes all salts of the compounds of the present disclosure which, owing to low physiological compatibility, are not directly suitable for use in pharmaceuticals but which can be used, for example, as intermediates for chemical reactions or for the preparation of pharmaceutically acceptable salts. For a review on more suitable salts, see Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Wiley-VCH, 2002) .

[0456] The compound or any formula depicting and describing the compounds of the present disclosure and pharmaceutically acceptable salts thereof may exist in unsolvated and solvated forms. As used herein, the term “solvate” refers to a molecular complex comprising the compound of Formula (I) , or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and one or more pharmaceutically acceptable solvent molecules. For example, the term “hydrate” is employed when the solvent is water.

[0457] Pharmaceutically acceptable solvates in accordance with the present disclosure may include those wherein the solvent of crystallization may be isotopically substituted, e.g., D2O, d6-acetone, d6-DMSO.

[0458] Linker (linking agent compound)

[0459] In some embodiments, the therapeutic agent is conjugated via a linker (or a linking agent compound) .

[0460] In some embodiments, the linker described herein is a compound having the following formula:

[0461] Q-L

[0462] Formula (I) ,

[0463] or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, stereoisomer, or isotopic variant thereof, wherein Q denotes to a junction moiety capable of being coupled to a ligand via a bond selected from the group consisting of carbonyl, thioether, amide, disulfide and hydrazone bond; L denotes to a linker moiety capable of connecting Q to a therapeutic agent.

[0464] In some embodiments, the junction moiety (Q in Formula (I) ) has the following structure:

[0465] In some embodiments, the linker moiety (L in Formula (I) ) has the following formula:

[0466] where L1 is a polypeptide residue consisting of three to eight amino acid residues which comprises at least one amino acid residue with a side chain carboxyl group, for example, glutamic acid residue or aspartic acid residue, where “-COOH” denotes carboxyl group of an amino acid residue at C-terminal of the polypeptide residue;

[0467] L2 is absent or a monodentate, bidentate or tridentate hydrophilic group attached to the side chain carboxyl group on the amino acid residue of the polypeptide residue L1, and L2 has a structure of -NHC (RL2a) (RL2b) (RL2c) , where RL2a, RL2b, and RL2c are each independently selected from the group consisting of H, - (CH2O) (CH2CH2O) m (CH2) pC (O) OH, and - (CH2O) (CH2CH2O) m (CH2) pC (O) NHRL2d, RL2d is H or C1-6 alkyl optionally substituted with 1 to 6 hydroxy groups, each m is independently an integer from 0 to 10, preferably 0 to 4, for example 0, 1, 2, 3, or 4, especially preferably m is 0, and each p is independent an integer from 1 to 4, for example, 1, 2, 3, or 4; and

[0468] denotes to the N-terminal side of the polypeptide residue covalently attached to the junction moiety Q.

[0469] In some embodiments, the polypeptide residue L1 is NH-Glu-Val-Ala-COOH. In some embodiments, the hydrophilic group L2 has the following structure:

[0470] wherein “*” denotes the site covalently attached to polypeptide residue L1, e.g., side chain of the Glu residue in NH-Glu-Val-Ala-COOH.

[0471] In some embodiments, the linker described herein is a compound having the following structure:

[0472] In some embodiments, the linker is a VC linker. Details of the linkers used for ADCs can be found, e.g., in Su, Z. et al., "Antibody–drug conjugates: Recent advances in linker chemistry. " Acta Pharmaceutica Sinica B (2021) , which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0473] Therapeutic agent

[0474] In some embodiments, the therapeutic agent that is conjugated to the antibodies or the antigen-binding fragments thereof described herein is discussed as follows.

[0475] In some embodiments, the therapeutic agent described herein is a cytotoxic agent. In some embodiments, the cytotoxic agent is a camptothecin compound, an analogue or a derivative thereof. In some preferred embodiments, the camptothecin compound is a compound having the following structure:

[0476] wherein X is selected from the group consisting of -CH2-, O and S; Y is selected from the group consisting of H, D, and F.

[0477] In some embodiments, the therapeutic agent is (S) -4-amino-9-ethyl-9-hydroxy-1, 9, 12, 15-tetrahydro-13H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] thiopyrano [4, 3, 2-de] quinoline-10, 13 (2H) -dione) (CPT-1) . The structure of CPT-1 is shown below:

[0478] In some embodiments, the therapeutic agent is (S) -4-amino-9-ethyl-9-hydroxy-1, 9, 12, 15-tetrahydro-13H-pyrano [4, 3, 2-de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13 (2H) -dione (CPT-2) . The structure of CPT-2 is shown below:

[0479] In some embodiments, the therapeutic agent is CPT3. The structure of CPT-3 is shown below:

[0480] In some embodiments, the therapeutic agent is (S) -4-amino-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-1, 9, 12, 15-tetrahydro-13H-pyrano [4, 3, 2-de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinoline-10, 13 (2H) -dione (CPT-4) . The structure of CPT-4 is shown below:

[0481] In some embodiments, the therapeutic agent is an auristatin, such as auristatin E (also known in the art as a derivative of dolastatin-10) or a derivative thereof. The auristatin can be, for example, an ester formed between auristatin E and a keto acid. For example, auristatin E can be reacted with paraacetyl benzoic acid or benzoylvaleric acid to produce AEB and AEVB, respectively. Other typical auristatins include AFP, MMAF, and MMAE. The synthesis and structure of exemplary auristatins are described in U.S. Patent Application Publication No. 2003-0083263; International Patent Publication No. WO 04 / 010957, International Patent Publication No. WO 02 / 088172, and U.S. Pat. Nos. 7,498,298, 6,884,869, 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; and 4,486,414, each of which is incorporated by reference herein in its entirety and for all purposes.

[0482] Auristatins have been shown to interfere with microtubule dynamics and nuclear and cellular division and have anticancer activity. Auristatins bind tubulin and can exert a cytotoxic or cytostatic effect on cancer cell. There are a number of different assays, known in the art, which can be used for determining whether an auristatin or resultant antibody-drug conjugate exerts a cytostatic or cytotoxic effect on a desired cell.

[0483] In some embodiments, the therapeutic agent is a chemotherapeutic agent. Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclosphosphamide (CYTOXANTM) ; alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan and piposulfan; aziridines such as benzodopa, carboquone, meturedopa, and uredopa; ethylenimines and methylamelamines including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphaoramide and trimethylolomelamine; nitrogen mustards such as chlorambucil, chlornaphazine, cholophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembichin, phenesterine, prednimustine, trofosfamide, uracil mustard; nitrosureas such as carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, ranimustine; antibiotics such as aclacinomysins, actinomycin, authramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, calicheamicin, carabicin, carminomycin, carzinophilin, chromomycins, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, doxorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycins, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; anti-metabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU) ; folic acid analogues such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; purine analogs such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine; pyrimidine analogs such as ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, floxuridine, 5-FU; androgens such as calusterone, dromostanolone propionate, epitiostanol, mepitiostane, testolactone; anti-adrenals such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane; folic acid replenisher such as frolinic acid; aceglatone; aldophosphamide glycoside; aminolevulinic acid; amsacrine; bestrabucil; bisantrene; edatraxate; defofamine; demecolcine; diaziquone; elfornithine; elliptinium acetate; etoglucid; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidamine; mitoguazone; mitoxantrone; mopidamol; nitracrine; pentostatin; phenamet; pirarubicin; podophyllinic acid; 2-ethylhydrazide; procarbazine; PSK7; razoxane; sizofiran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquone; 2’, 2’ , 2’ -trichlorotriethylamine; urethan; vindesine; dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosine; arabinoside ( “Ara-C” ) ; cyclophosphamide; taxanes, e.g. paclitaxel ( Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J. ) and doxetaxel ( Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France) ; chlorambucil; gemcitabine; 6-thioguanine; platinum analogs such as cisplatin and carboplatin; vinblastine; platinum; etoposide (VP-16) ; ifosfamide; mitomycin C; mitoxantrone; vincristine; vinorelbine; navelbine; novantrone; teniposide; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronate; CPT-11; topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluoromethylornithine (DMFO) ; retinoic acid; esperamicins; capecitabine; and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above. Also included in this definition are anti-hormonal agents that act to regulate or inhibit hormone action on tumors such as anti-estrogens including for example tamoxifen, raloxifene, aromatase inhibiting 4 (5) -imidazoles, 4-hydroxytamoxifen, trioxifene, keoxifene, LY117018, onapristone, and toremifene (Fareston) ; and anti-androgens such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide, and goserelin; and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above. A detailed description of the chemotherapeutic agents can be found in, e.g., US20180193477A1, which is incorporated by reference in its entirety.

[0484] In some embodiments, the antibodies and the antigen-binding fragments thereof that specifically bind to DLL3 is coupled to the drug via a cleavable linker e.g. a SPBD linker or a maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl (VC) linker. In some embodiments, the antibodies and the antigen-binding fragments thereof that specifically bind to DLL3 is coupled to the drug via a non-cleavable linker e.g. a MCC linker formed using SMCC or sulfo-SMCC. Selection of an appropriate linker for a given ADC can be readily made by the skilled person having knowledge of the art and taking into account relevant factors, such as the site of attachment to the antibodies and the antigen-binding fragments thereof that specifically bind to DLL3, any structural constraints of the drug and the hydrophobicity of the drug (see, for example, review in Nolting, Chapter 5, Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed. ) , Springer) . A number of specific linker-toxin combinations have been described and may be used with the antibodies and the antigen-binding fragments thereof that specifically bind to DLL3 described herein to prepare ADCs in certain embodiments. Examples include, but are not limited to, cleavable peptide-based linkers with auristatins such as MMAE and MMAF, camptothecins such as SN-38, duocarmycins and PBD dimers; non-cleavable MC-based linkers with auristatins MMAF and MMAE; acid-labile hydrazone-based linkers with calicheamicins and doxorubicin; disulfide-based linkers with maytansinoids such as DM1 and DM4, and bis-maleimido-trioxyethylene glycol (BMPEO) -based linkers with maytansinoid DM1. Some these therapeutic agents and linkers are described, e.g., in Peters &Brown, (2015) Biosci. Rep. e00225; Dosio et al., (2014) Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery 9: 35-65; US Patent Publication No. US 2015 / 0374847, and US20180193477A1; which are incorporated herein by reference in the entirety.

[0485] Linker-Therapeutic agent compound

[0486] In some embodiments, a linker (e.g., any of the linkers described herein) and a therapeutic agent (e.g., any of the therapeutic agents described herein) can be linked to form a “linker-therapeutic agent” compound.

[0487] In some embodiments, the linker-therapeutic agent compound has the following structure:

[0488] In some embodiments, the linker-therapeutic agent compound has the following structure:

[0489] In some embodiments, an antibody ( “Ab” ) , e.g., any of the antibodies or the antigen-binding fragments thereof described herein, can be linked to a linker-therapeutic agent compound (e.g., any of the linker-therapeutic agent compounds described herein) to generate an antibody-drug conjugate. In some embodiments, the antibody-drug conjugate has the following structure:

[0490] wherein n = 1-8. In some embodiments, n = 1-8. In some embodiments, n is about 1, about 2, about 3, about 4, about 5, about 6, about 7, about 8. In some embodiments, n is about 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-8, 5-7, 5-6, 6-8, 6-7, or 7-8. In some embodiments, n is an integral or non-integral multiple of one.

[0491] In some embodiments, the anti-DLL3 antibody is coupled to the drug via a cleavable linker e.g. a SPBD linker or a maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl (VC) linker. In some embodiments, the anti-DLL3 antibody is coupled to the drug via a non-cleavable linker e.g. a MCC linker formed using SMCC or sulfo-SMCC. Selection of an appropriate linker for a given ADC can be readily made by the skilled person having knowledge of the art and taking into account relevant factors, such as the site of attachment to the anti-DLL3 antibody, any structural constraints of the drug and the hydrophobicity of the drug (see, for example, review in Nolting, Chapter 5, Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed. ) , Springer) . A number of specific linker-toxin combinations have been described and may be used with the anti-DLL3 antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein to prepare ADCs in certain embodiments. Examples include, but are not limited to, cleavable peptide-based linkers with auristatins such as MMAE and MMAF, camptothecins such as SN-38, duocarmycins and PBD dimers; non-cleavable MC-based linkers with auristatins MMAF and MMAE; acid-labile hydrazone-based linkers with calicheamicins and doxorubicin; disulfide-based linkers with maytansinoids such as DM1 and DM4, and bis-maleimido-trioxyethylene glycol (BMPEO) -based linkers with maytansinoid DM1. Some these therapeutic agents and linkers are described, e.g., in Peters &Brown, (2015) Biosci. Rep. e00225; Dosio et al., (2014) Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery 9: 35-65; US Patent Publication No. US 2015 / 0374847, and US20180193477A1; which are incorporated herein by reference in the entirety.

[0492] Depending on the desired drug and selected linker, those skilled in the art can select suitable method for coupling them together. For example, some conventional coupling methods, such as amine coupling methods, can be used to form the desired drug-linker complex which still contains reactive groups for conjugating to the antibodies through covalent linkage. In some embodiments, a drug-maleimide complex (i.e., maleimide linking drug) can be used for the payload bearing reactive group in the present disclosure. Most common reactive group capable of bonding to thiol group in ADC preparation is maleimide. Additionally, organic bromides, iodides also are frequently used.

[0493] The ADC can be prepared by one of several routes known in the art, employing organic chemistry reactions, conditions, and reagents known to those skilled in the art (see, for example, Bioconjugate Techniques (G. T. Hermanson, 2013, Academic Press) . For example, conjugation can be achieved by (1) reaction of a nucleophilic group or an electrophilic group of an antibody with a bivalent linker reagent, to form antibody-linker intermediate Ab-L, via a covalent bond, followed by reaction with an activated drug moiety D; or (2) reaction of a nucleophilic group or an electrophilic group of a drug moiety with a linker reagent, to form drug-linker intermediate D-L, via a covalent bond, followed by reaction with the nucleophilic group or an electrophilic group of an antibody. Conjugation methods (1) and (2) can be employed with a variety of antibodies, drug moieties, and linkers to prepare the ADCs described here. Various prepared linkers, linker components and toxins are commercially available or may be prepared using standard synthetic organic chemistry techniques. These methods are described e.g., in March’s Advanced Organic Chemistry (Smith &March, 2006, Sixth Ed., Wiley) ; Toki et al., (2002) J. Org. Chem. 67: 1866-1872; Frisch et al., (1997) Bioconj. Chem. 7: 180-186; Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press) ; US20210379193A1, and US20180193477A1, which are incorporated herein by reference in the entirety. In addition, a number of pre-formed drug-linkers suitable for reaction with a selected antigen binding construct are also available commercially, for example, linker-toxins comprising DM1, DM4, MMAE, MMAF or Duocarmycin SA are available from Creative BioLabs (Shirley, N.Y. ) .

[0494] Several specific examples of methods of preparing ADCs are known in the art and are described in U.S. Pat. No. 8,624,003 (pot method) , U.S. Pat. No. 8,163,888 (one-step) , and U.S. Pat. No. 5,208,020 (two-step method) , and US20180193477A1, which are incorporated herein by reference in the entirety. Other methods are known in the art and include those described in Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed. ) , Springer.

[0495] Drug loading is represented by the number of drug moieties per antibody in a molecule of ADC. For some antibody-drug conjugates, the drug loading may be limited by the number of attachment sites on the antibody. For example, where the attachment is a cysteine thiol, as in certain exemplary embodiments described herein, the drug loading may range from 0 to 8 drug moieties per antibody. In certain embodiments, higher drug loading, e.g. p≥5, may cause aggregation, insolubility, toxicity, or loss of cellular permeability of certain antibody-drug conjugates. In certain embodiments, the average drug loading for an antibody-drug conjugate ranges from 1 to about 8; from about 2 to about 6; or from about 3 to about 5. Indeed, it has been shown that for certain antibody-drug conjugates, the optimal ratio of drug moieties per antibody can be around 4. In some embodiments, the DAR is about or at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8. In some embodiments, the average DAR in the composition is about 1～ about 2, about 2～ about 3, about 3～ about 4, about 4～ about 5, about 5～ about 6, about 6～ about 7, or about 7～ about 8.

[0496] Antibody and ADC Characteristics

[0497] The anti-4-1BB antigen-binding protein construct (e.g., antibodies, trispecific antibodies, or antibody fragments thereof) can include an antigen-binding region that is derived from any anti-4-1BB antibody or any antigen-binding fragment thereof as described herein.

[0498] General techniques can be used to measure the affinity of an antibody for an antigen include, e.g., ELISA, RIA, and surface plasmon resonance (SPR) . Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some implementations, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) , can bind to 4-1BB (e.g., human 4-1BB and / or monkey 4-1BB) with a dissociation rate (koff) of less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.0001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.0001 s-1, or greater than 0.00001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is less than 7 x 10-4 s-1.

[0499] In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 x 102 / Ms, greater than 1 x 103 / Ms, greater than 1 x 104 / Ms, greater than 1 x 105 / Ms, or greater than 1 x 106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 x 105 / Ms, less than 1 x 106 / Ms, or less than 1 x 107 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 x 105 / Ms.

[0500] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can bind to 4-1BB (e.g., human 4-1BB and / or monkey 4-1BB) with a KD of less than 1 x 10-6 M, less than 1 x 10-7 M, less than 1 x 10-8 M, less than 1 x 10-9 M, or less than 1 x 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, KD is greater than 1 x 10-7 M, greater than 1 x 10-8 M, greater than 1 x 10-9 M, or greater than 1 x 10-10 M.

[0501] In some implementations, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can bind to DLL3 (e.g., human DLL3) with a dissociation rate (koff) of less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.0001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.0001 s-1, or greater than 0.00001 s-1.

[0502] In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 x 102 / Ms, greater than 1 x 103 / Ms, greater than 1 x 104 / Ms, greater than 1 x 105 / Ms, or greater than 1 x 106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 x 105 / Ms, less than 1 x 106 / Ms, or less than 1 x 107 / Ms.

[0503] Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 x 10-6 M, less than 1 x 10-7 M, less than 1 x 10-8 M, less than 1 x 10-9 M, or less than 1 x 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, KD is greater than 1 x 10-7 M, greater than 1 x 10-8 M, greater than 1 x 10-9 M, greater than 1 x 10-10 M, greater than 1 x 10-11 M, or greater than 1 x 10-12 M. In some embodiments, the antibody binds to human DLL3 with KD less than or equal to about 15 nM or 10 nM.

[0504] In some implementations, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can bind to CD3 (e.g., human CD3) with a dissociation rate (koff) of less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.0001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.0001 s-1, or greater than 0.00001 s-1.

[0505] In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 x 102 / Ms, greater than 1 x 103 / Ms, greater than 1 x 104 / Ms, greater than 1 x 105 / Ms, or greater than 1 x 106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 x 105 / Ms, less than 1 x 106 / Ms, or less than 1 x 107 / Ms.

[0506] Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 x 10-6 M, less than 1 x 10-7 M, less than 1 x 10-8 M, less than 1 x 10-9 M, or less than 1 x 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, KD is greater than 1 x 10-7 M, greater than 1 x 10-8 M, greater than 1 x 10-9 M, greater than 1 x 10-10 M, greater than 1 x 10-11 M, or greater than 1 x 10-12 M. In some embodiments, the antibody binds to human CD3 with KD less than or equal to about 15 nM or 10 nM.

[0507] In some implementations, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can bind to Claudin18.2 (e.g., human Claudin18.2) with a dissociation rate (koff) of less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.0001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.0001 s-1, or greater than 0.00001 s-1.

[0508] In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 x 102 / Ms, greater than 1 x 103 / Ms, greater than 1 x 104 / Ms, greater than 1 x 105 / Ms, or greater than 1 x 106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 x 105 / Ms, less than 1 x 106 / Ms, or less than 1 x 107 / Ms.

[0509] Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 x 10-6 M, less than 1 x 10-7 M, less than 1 x 10-8 M, less than 1 x 10-9 M, or less than 1 x 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, KD is greater than 1 x 10-7 M, greater than 1 x 10-8 M, greater than 1 x 10-9 M, greater than 1 x 10-10 M, greater than 1 x 10-11 M, or greater than 1 x 10-12 M. In some embodiments, the antibody binds to human Claudin18.2 with KD less than or equal to about 15 nM or 10 nM.

[0510] In some implementations, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can bind to CDH17 (e.g., human CDH17) with a dissociation rate (koff) of less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.0001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.0001 s-1, or greater than 0.00001 s-1.

[0511] In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 x 102 / Ms, greater than 1 x 103 / Ms, greater than 1 x 104 / Ms, greater than 1 x 105 / Ms, or greater than 1 x 106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 x 105 / Ms, less than 1 x 106 / Ms, or less than 1 x 107 / Ms.

[0512] Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 x 10-6 M, less than 1 x 10-7 M, less than 1 x 10-8 M, less than 1 x 10-9 M, or less than 1 x 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, KD is greater than 1 x 10-7 M, greater than 1 x 10-8 M, greater than 1 x 10-9 M, greater than 1 x 10-10 M, greater than 1 x 10-11 M, or greater than 1 x 10-12 M. In some embodiments, the antibody binds to human CDH17 with KD less than or equal to about 15 nM or 10 nM.

[0513] In some embodiments, thermal stabilities are determined. The antibodies or antigen-binding fragments as described herein can have a Tm (melting temperature) greater than 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, Tm is less than 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. The antibodies or antigen-binding fragments as described herein can have a Tagg (aggregation temperature, e.g., Tagg at 266 nm (Tagg266) or Tagg at 473 nm (Tagg473) ) great than 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, Tagg is less than 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃.

[0514] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., anti-4-1BB antibodies, anti-DLL3 antibodies, anti-CD3 antibodies, anti-Claudin18.2 antibodies, anti-CDH17 antibodies, or trispecific antibodies) , has a purity that is greater than 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by HPLC. In some embodiments, the antibodies, the purity is less than 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by HPLC.

[0515] In some embodiments, the antibodies, the activation effect of the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., anti-4-1BB antibodies, anti-DLL3 antibodies, anti-CD3 antibodies, anti-Claudin18.2 antibodies, anti-CDH17 antibodies, or trispecific antibodies) , is measured by EC50 (ng / mL) . In some embodiments, the EC50 is greater than 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000, 200000, or 500000 ng / mL. In some embodiments, the IC50 is less than 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000, 200000, or 500000 ng / mL. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof can activate 4-1BB signaling. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof as described herein can activate 4-1BB signaling by more than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200%.

[0516] The antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can have a Tm greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. As IgG can be described as a multi-domain protein, the melting curve sometimes shows two or more transitions, with a first denaturation temperature, Tm D1, a second denaturation temperature Tm D2, and / or a third denaturation temperature, Tm D3. In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments as described herein has a Tm D1 greater than 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments as described herein has a Tm D2 greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, Tm, Tm D1, Tm D2 are less than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments as described herein has a Tm D3 greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, Tm, Tm D1, Tm D2 are less than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃.

[0517] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs have an endocytosis rate in cells (e.g., small cell lung cancer cells NCI-H524, DMS79, or SHP-77) that is at least 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. In some embodiments, the endocytosis rate that is less than 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%.

[0518] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can bind to dog 4-1BB, monkey 4-1BB, or mouse 4-1BB. In some embodiments, the binding is measured by the percentage of positive cells as determined by FACS. In some embodiments, the percentage of positive cells is greater than 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. In some embodiments, the percentage of positive cells is less than 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs cannot bind to dog 4-1BB, monkey 4-1BB, or mouse 4-1BB.

[0519] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) can bind to dog DLL3, monkey DLL3, or mouse DLL3. In some embodiments, the binding is measured by the percentage of positive cells as determined by FACS. In some embodiments, the percentage of positive cells is greater than 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. In some embodiments, the percentage of positive cells is less than 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs cannot bind to dog DLL3, monkey DLL3, or mouse DLL3.

[0520] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs have a purity that is greater than 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by HPLC. In some embodiments, the antibodies, the purity is less than 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by SEC. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof as described herein have a purity of above 90%, above 91%, above 92%, above 93%, above 94%, above 95%, above 96%, above 97%, above 98%, or above 99%as determined by size exclusion chromatography (SEC) . In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof as described herein have a hydrophobic interaction chromatography (HIC) retention time that is higher than 2 minutes, higher than 3 minutes, higher than 4 minutes, higher than 5 minutes, higher than 6 minutes, higher than 7 minutes, higher than 8 minutes, higher than 9 minutes, higher than 10 minutes, higher than 11 minutes, higher than 12 minutes, higher than 13 minutes, higher than 14 minutes, higher than 15 minutes, higher than 16 minutes, higher than 17 minutes, higher than 18 minutes, higher than 19 minutes, higher than 20 minutes, higher than 21 minutes or higher than 22 minutes.

[0521] In some embodiments, the stability of the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs can be measured by the Capillary Isoelectric Focusing (cIEF) method (indicated as the percentages of the main component, acidic component, and alkaline component) . In some embodiments, the percentage of the main component is greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, after being subject to various conditions e.g., as measured by cIEF. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof as described herein have a main peak that constitutes more than 40%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, more than 85%, or more than 90%, as determined by capillary isoelectric focusing (cIEF) . In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof as described herein have an acidic peak that constitutes less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, less than 85%, or less than 90%, as determined by capillary isoelectric focusing (cIEF) . In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof as described herein have a isoelectric point (PI) that is higher than 7.5, higher than 7.75, higher than 8, higher than 8.25, higher than 8.5, higher than 8.65, higher than 8.75, or higher than 8.85, as determined by capillary isoelectric focusing (cIEF) . In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof as described herein have a half maximal effective concentration (EC50) that is lower than 2.5, lower than 2, lower than 1.5, lower than 1, lower than 0.75, lower than 0.5, lower than 0.25, lower than 0.15 μg / mL.

[0522] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein can bind to CD3 and a target tumor associated antigen (e.g., DLL3) , thereby bridging T cells and target cells; activating T cells; and inducing directly killing the cancer cells by the T cells.

[0523] In some embodiments, in vitro cell killing effects can be measured by the methods described in Example 16. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein have a cell killing EC50 of less than 5 pM, less than 10 pM, less than 50 pM, less than 0.1 nM, less than 0.2 nM, less than 0.5 nM, less than 0.8 nM, less than 1 nM, less than 2 nM, less than 5 nM, less than 8 nM, less than 10 nM, less than 20 nM, less than 50 nM, less than 100 nM, less than 200 nM, less than 500 nM, or less than 800 nM, as determined using the method described herein. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein have a cell killing EC50 of more than 5 pM, more than 10 pM, more than 50 pM, more than 0.1 nM, more than 0.2 nM, more than 0.5 nM, more than 0.8 nM, more than 1 nM, more than 2 nM, more than 5 nM, more than 8 nM, more than 10 nM, more than 20 nM, more than 50 nM, more than 100 nM, more than 200 nM, more than 500 nM, or more than 800 nM, as determined using the method described herein. In some embodiments, the antibodies, antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein have a cell killing EC50 value that is 1 pM-50 pM, 0.1-1 nM, 0.2-2 nM, 0.5-5 nM, 0.8-8 nM, 1-10 nM, 2-20 nM, 5-50 nM, 8-80 nM, 10-100 nM, 20-200 nM, 50-500 nM, or 80-800 nM. In some embodiments, the antibodies, antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein have a cell killing EC50 value that is 1pM-800nM. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein have a cell killing EC50 value that is less than or about 50%, less than or about 30%, less than or about 20%, less than or about 10%, less than or about 5%, less than or about 1%as compared to that of an isotype control antibody.

[0524] In some embodiments, in vitro cytokine secretion can be measured by the methods described in Example 16. In some embodiments, the in vitro cytokine release stimulation can be measured by incubating human immune cells (e.g., PBMC) with target tumor cells (e.g., SHP-77 cells) and the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein can stimulate TNFα release by PBMC cells. In some embodiments, the TNF-α cytokine release is above 10 pg / mL, above 25 pg / mL, above 50 pg / mL, above 100 pg / mL, above 250 pg / mL, above 500 pg / mL, above 1000 pg / mL, above 2500 pg / mL, above 5000 pg / mL, or above 7000 pg / mL. In some embodiments, the TNF-α cytokine release is below 10 pg / mL, below 25 pg / mL, below 50 pg / mL, below 100 pg / mL, below 250 pg / mL, below 500 pg / mL, below 1000 pg / mL, below 2500 pg / mL, below 5000 pg / mL, or below 7000 pg / mL. In some embodiments, the TNF-α cytokine release is about 10-500 pg / mL, 50-250 pg / mL, or 50-150 pg / mL.

[0525] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein can stimulate IFNγ release by human immune cells. In some embodiments, the IFNγ cytokine release is above 10 pg / mL, above 25 pg / mL, above 50 pg / mL, above 100 pg / mL, above 250 pg / mL, above 500 pg / mL, above 1000 pg / mL, above 2500 pg / mL, above 5000 pg / mL, or above 7000 pg / mL. In some embodiments, the IFNγ cytokine release is below 10 pg / mL, below 25 pg / mL, below 50 pg / mL, below 100 pg / mL, below 250 pg / mL, below 500 pg / mL, below 1000 pg / mL, below 2500 pg / mL, below 5000 pg / mL, or below 7000 pg / mL. In some embodiments, the IFNγ cytokine release is about 100-7000 pg / mL, 500-5000 pg / mL, 500-2500 pg / mL or 500-1500 pg / mL.

[0526] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein can stimulate IL-2 release by human immune cells. In some embodiments, the IL-2 cytokine release is above 10 pg / mL, above 25 pg / mL, above 50 pg / mL, above 100 pg / mL, above 250 pg / mL, above 500 pg / mL, above 1000 pg / mL, above 2500 pg / mL, above 5000 pg / mL, or above 7000 pg / mL. In some embodiments, the IL-2 cytokine release is below 10 pg / mL, below 25 pg / mL, below 50 pg / mL, below 100 pg / mL, below 250 pg / mL, below 500 pg / mL, below 1000 pg / mL, below 2500 pg / mL, below 5000 pg / mL, or below 7000 pg / mL. In some embodiments, the IL-2 cytokine release is about 10-100 pg / mL, or 10-50 pg / mL.

[0527] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein can stimulate IL-6 release by human immune cells. In some embodiments, the IL-6 cytokine release is above 10 pg / mL, above 25 pg / mL, above 50 pg / mL, above 100 pg / mL, above 250 pg / mL, above 500 pg / mL, above 1000 pg / mL, above 2500 pg / mL, above 5000 pg / mL, or above 7000 pg / mL. In some embodiments, the IL-6 cytokine release is below 10 pg / mL, below 25 pg / mL, below 50 pg / mL, below 100 pg / mL, below 250 pg / mL, below 500 pg / mL, below 1000 pg / mL, below 2500 pg / mL, below 5000 pg / mL, or below 7000 pg / mL. In some embodiments, the IL-6 cytokine release is about 10-300 pg / mL, or 50-300 pg / mL.

[0528] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein can stimulate IL-10 release by human immune cells. In some embodiments, the IL-10 cytokine release is above 10 pg / mL, above 25 pg / mL, above 50 pg / mL, above 100 pg / mL, above 250 pg / mL, above 500 pg / mL, above 1000 pg / mL, above 2500 pg / mL, above 5000 pg / mL, or above 7000 pg / mL. In some embodiments, the IL-10 cytokine release is below 10 pg / mL, below 25 pg / mL, below 50 pg / mL, below 100 pg / mL, below 250 pg / mL, below 500 pg / mL, below 1000 pg / mL, below 2500 pg / mL, below 5000 pg / mL, or below 7000 pg / mL. In some embodiments, the IL-10 cytokine release is about 10-400 pg / mL, or 50-400 pg / mL.

[0529] In some embodiments, the pharmacokinetic profile of the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein can be determined in 4-1BB humanized mice or C57BL / 6 mice. In some embodiments, the half-life of the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is at least 1 day, at least 2 days, at least 3 days, at least 4 days, or at least 5 days, at least 6 days, at least 7 days, at least 8 days, at least 9 days, at least 10 days, at least 11 days, at least 12 days, at least 13 days, at least 14 days, at least 15 days, at least 16 days, at least 17 days, or at least 18 days. In some embodiments, the max concentration (Cmax) of the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is at least 50 μg / ml, at least 75 μg / ml, at least 100 μg / ml, at least 125 μg / ml, at least 150 μg / ml, at least 175 μg / ml, or at least 200 μg / ml. In some embodiments, the serum clearance rate (CL) of the antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is at least 7.5 ml / day / kg, at least 10 ml / day / kg, at least 12.5 ml / day / kg, at least 15 ml / day / kg, at least 17.5 ml / day / kg, at least 20 ml / day / kg, at least 25 ml / day / kg, at least 30 ml / day / kg, at least 35 ml / day / kg, or at least 40 ml / day / kg.

[0530] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs (e.g., anti-4-1BB antibodies, anti-DLL3 antibodies, anti-CD3 antibodies, anti-Claudin18.2 antibodies, anti-CDH17 antibodies, or trispecific antibodies) , or the ADC derived therefrom, have a tumor growth inhibition percentage (TGI%) that is greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200%. In some embodiments, the antibody has a tumor growth inhibition percentage that is less than 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200%. The TGI%can be determined, e.g., at 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 days after the treatment starts, or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 months after the treatment starts. As used herein, the tumor growth inhibition percentage (TGI%) is calculated using the following formula: TGI (%) = [1- (Ti-T0)  /  (Vi-V0) ] ×100

[0531] Ti is the average tumor volume in the treatment group on day i. T0 is the average tumor volume in the treatment group on day zero. Vi is the average tumor volume in the control group on day i. V0 is the average tumor volume in the control group on day zero.

[0532] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) have a functional Fc region. In some embodiments, effector function of a functional Fc region is antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) . In some embodiments, effector function of a functional Fc region is phagocytosis. In some embodiments, effector function of a functional Fc region is ADCC and phagocytosis. In some embodiments, the Fc region is human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4. In some embodiments, one or both mutations S239D and / or I332E (SI mutations) are introduced in antibody Fc region to enhance the antibody affinity to FcγRIIIA, thereby increasing ADCC effects. A detailed description of SI mutations can be found in US7662925, which is incorporated by reference in their entirety.

[0533] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) have an Fc region with decreased effector function. In some embodiments, the Fc region is human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4. In some embodiments, LALA-GA mutations ( (L234A, L235A, and G237A mutations according to EU numbering) are introduced in antibody Fc region to reduce the antibody affinity to FcγR.

[0534] In some embodiments, the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) do not have a functional Fc region. For example, the antibodies or antigen binding fragments are Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, and Fv fragments.

[0535] Recombinant Vectors

[0536] The present disclosure also provides recombinant vectors (e.g., expression vectors) that include an isolated polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) , host cells into which are introduced the recombinant vectors (i.e., such that the host cells contain the polynucleotide and / or a vector comprising the polynucleotide) , and the production of recombinant antibody polypeptides or fragments thereof by recombinant techniques.

[0537] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more polynucleotide (s) of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more polynucleotide (s) of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-Atail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector.

[0538] A vector can be introduced into the host cell by methods known in the art, e.g., electroporation, chemical transfection (e.g., DEAE-dextran) , transformation, transfection, and infection and / or transduction (e.g., with recombinant virus) . Thus, non-limiting examples of vectors include viral vectors (which can be used to generate recombinant virus) , naked DNA or RNA, plasmids, cosmids, phage vectors, and DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents.

[0539] In some implementations, a polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) is introduced using a viral expression system (e.g., vaccinia or other pox virus, retrovirus, or adenovirus) , which may involve the use of a non-pathogenic (defective) , replication competent virus, or may use a replication defective virus. In the latter case, viral propagation generally will occur only in complementing virus packaging cells. Suitable systems are disclosed, for example, in Fisher-Hoch et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N.Y. Acad Sci. 569: 86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine, 8: 17-21; U.S. Pat. Nos. 4,603,112, 4,769,330, and 5,017,487; WO 89 / 01973; U.S. Pat. No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91 / 02805; Berkner-Biotechniques, 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252: 431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88: 2838-2848; and Guzman et al., 1993, Cir. Res., 73: 1202-1207. Techniques for incorporating DNA into such expression systems are well known to those of ordinary skill in the art. The DNA may also be “naked, ” as described, for example, in Ulmer et al., 1993, Science, 259: 1745-1749, and Cohen, 1993, Science, 259: 1691-1692. The uptake of naked DNA may be increased by coating the DNA onto biodegradable beads that are efficiently transported into the cells.

[0540] For expression, the DNA insert comprising an antibody-encoding or polypeptide-encoding polynucleotide disclosed herein can be operatively linked to an appropriate promoter (e.g., a heterologous promoter) , such as the phage lambda PL promoter, the E. coli lac, trp and tac promoters, the SV40 early and late promoters and promoters of retroviral LTRs, to name a few. Other suitable promoters are known to the skilled artisan. The expression constructs can further contain sites for transcription initiation, termination and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the mature transcripts expressed by the constructs may include a translation initiating at the beginning and a termination codon (UAA, UGA, or UAG) appropriately positioned at the end of the polypeptide to be translated.

[0541] As indicated, the expression vectors can include at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture and tetracycline or ampicillin resistance genes for culturing in E. coli and other bacteria. Representative examples of appropriate hosts include, but are not limited to, bacterial cells, such as E. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium cells; fungal cells, such as yeast cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells such as CHO, COS, Bowes melanoma, and HK 293 cells; and plant cells. Appropriate culture mediums and conditions for the host cells described herein are known in the art.

[0542] Non-limiting vectors for use in bacteria include pQE70, pQE60 and pQE-9, available from Qiagen; pBS vectors, Phagescript vectors, Bluescript vectors, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, available from Stratagene; and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 available from Pharmacia. Non-limiting eukaryotic vectors include pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG available from Stratagene; and pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL available from Pharmacia. Other suitable vectors will be readily apparent to the skilled artisan.

[0543] Non-limiting bacterial promoters suitable for use include the E. coli lacI and lacZ promoters, the T3 and T7 promoters, the gpt promoter, the lambda PR and PL promoters and the trp promoter. Suitable eukaryotic promoters include the CMV immediate early promoter, the HSV thymidine kinase promoter, the early and late SV40 promoters, the promoters of retroviral LTRs, such as those of the Rous sarcoma virus (RSV) , and metallothionein promoters, such as the mouse metallothionein-I promoter.

[0544] In the yeast Saccharomyces cerevisiae, a number of vectors containing constitutive or inducible promoters such as alpha factor, alcohol oxidase, and PGH may be used. For reviews, see Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, New York, N.Y, and Grant et al., Methods Enzymol., 153: 516-544 (1997) .

[0545] Introduction of the construct into the host cell can be effected by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals, such as Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) , which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0546] Transcription of DNA encoding an antibody of the present disclosure by higher eukaryotes may be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about from 10 to 300 bp that act to increase transcriptional activity of a promoter in a given host cell-type. Examples of enhancers include the SV40 enhancer, which is located on the late side of the replication origin at base pairs 100 to 270, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers.

[0547] For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space or into the extracellular environment, appropriate secretion signals may be incorporated into the expressed polypeptide. The signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous signals.

[0548] The polypeptide (e.g., antibody) can be expressed in a modified form, such as a fusion protein (e.g., a GST-fusion) or with a histidine-tag, and may include not only secretion signals, but also additional heterologous functional regions. For instance, a region of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be added to the N-terminus of the polypeptide to improve stability and persistence in the host cell, during purification, or during subsequent handling and storage. Also, peptide moieties can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. The addition of peptide moieties to polypeptides to engender secretion or excretion, to improve stability and to facilitate purification, among others, are familiar and routine techniques in the art.

[0549] The disclosure also provides a nucleic acid sequence that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identical to any nucleotide sequence as described herein, and an amino acid sequence that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identical to any amino acid sequence as described herein.

[0550] The disclosure also provides a nucleic acid sequence that has a homology of at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%to any nucleotide sequence as described herein, and an amino acid sequence that has a homology of at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%to any amino acid sequence as described herein.

[0551] In some embodiments, the disclosure relates to nucleotide sequences encoding any peptides that are described herein, or any amino acid sequences that are encoded by any nucleotide sequences as described herein. In some embodiments, the nucleic acid sequence is less than 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, or 600 nucleotides. In some embodiments, the amino acid sequence is less than 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, or 400 amino acid residues.

[0552] In some embodiments, the amino acid sequence (i) comprises an amino acid sequence; or (ii) consists of an amino acid sequence, wherein the amino acid sequence is any one of the sequences as described herein.

[0553] In some embodiments, the nucleic acid sequence (i) comprises a nucleic acid sequence; or (ii) consists of a nucleic acid sequence, wherein the nucleic acid sequence is any one of the sequences as described herein.

[0554] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position (as used herein amino acid or nucleic acid “identity” is equivalent to amino acid or nucleic acid “homology” ) . The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0555] The percentage of sequence homology (e.g., amino acid sequence homology or nucleic acid homology) can also be determined. How to determine percentage of sequence homology is known in the art. In some embodiments, amino acid residues conserved with similar physicochemical properties (percent homology) , e.g. leucine and isoleucine, can be used to measure sequence similarity. Families of amino acid residues having similar physicochemical properties have been defined in the art. These families include e.g., amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine) , nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan) , beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . The homology percentage, in many cases, is higher than the identity percentage.

[0556] The disclosure provides one or more nucleic acid encoding any of the polypeptides as described herein. In some embodiments, the nucleic acid (e.g., cDNA) includes a polynucleotide encoding a polypeptide of a heavy chain as described herein. In some embodiments, the nucleic acid includes a polynucleotide encoding a polypeptide of a light chain as described herein. In some embodiments, the nucleic acid includes a polynucleotide encoding a scFv polypeptide as described herein.

[0557] In some embodiments, the vector can have one of the nucleic acids as described herein, wherein the vector encodes the VHH region that specifically bind to 4-1BB. In some embodiments, a pair of vectors is provided, wherein each vector comprises one of the nucleic acids as described herein, wherein the vectors encodes the VHH region that specifically bind to 4-1BB.

[0558] In some embodiments, the vector can have two of the nucleic acids as described herein, wherein the vector encodes the VL region and the VH region that together bind to DLL3. In some embodiments, a pair of vectors is provided, wherein each vector comprises one of the nucleic acids as described herein, wherein together the pair of vectors encodes the VL region and the VH region that together bind to DLL3. In some embodiments, the vector includes two of the nucleic acids as described herein, wherein the vector encodes the VL region and the VH region that together bind to CD3. In some embodiments, a pair of vectors is provided, wherein each vector comprises one of the nucleic acids as described herein, wherein together the pair of vectors encodes the VL region and the VH region that together bind to CD3.

[0559] Vectors can also be constructed to express specific antibodies or polypeptides. In some embodiments, a vector can be constructed to express anti-4-1BB antibody heavy chain single variable domain (4-1BB-VHH) . In some embodiments, a vector can contain sequences of, from 5’ end to 3’ end, cytomegalovirus promotor (CMV) , 4-1BB-VHH, polyadenylation (PolyA) , simian vacuolating virus 40 terminator (SV40) and glutamine synthetase marker (GS) .

[0560] In some embodiments, a vector can be constructed to co-express an anti-DLL3 antibody heavy chain variable domain (DLL3-VH) and an anti-CD3 antibody scFv polypeptide chain. In some embodiments, a vector can be constructed to co-express an anti-DLL3 antibody heavy chain variable domain (DLL3-VH) , an anti-CD3 antibody scFv polypeptide chain, and an anti-4-1BB antibody heavy chain single variable domain (4-1BB-VHH) . In some embodiments, a vector can be constructed to express an anti-DLL3 antibody light chain variable domain (DLL3-VL) .

[0561] Methods of Making Antibodies, Antigen Binding Fragments And Antigen Binding Protein Constructs

[0562] An isolated fragment of human protein can be used as an immunogen to generate antibodies using standard techniques for polyclonal and monoclonal antibody preparation. Polyclonal antibodies can be raised in animals by multiple injections (e.g., subcutaneous or intraperitoneal injections) of an antigenic peptide or protein. In some embodiments, the antigenic peptide or protein is injected with at least one adjuvant. In some embodiments, the antigenic peptide or protein can be conjugated to an agent that is immunogenic in the species to be immunized. Animals can be injected with the antigenic peptide or protein more than one time (e.g., twice, three times, or four times) .

[0563] The full-length polypeptide or protein can be used or, alternatively, antigenic peptide fragments thereof can be used as immunogens. The antigenic peptide of a protein comprises at least 8 (e.g., at least 10, 15, 20, or 30) amino acid residues of the amino acid sequence of the protein and encompasses an epitope of the protein such that an antibody raised against the peptide forms a specific immune complex with the protein.

[0564] An immunogen typically is used to prepare antibodies by immunizing a suitable subject (e.g., human or transgenic animal expressing at least one human immunoglobulin locus) . An appropriate immunogenic preparation can contain, for example, a recombinantly-expressed or a chemically-synthesized polypeptide. The preparation can further include an adjuvant, such as Freund’s complete or incomplete adjuvant, or a similar immunostimulatory agent.

[0565] Polyclonal antibodies can be prepared as described above by immunizing a suitable subject with a polypeptide, or an antigenic peptide thereof (e.g., part of the protein) as an immunogen. The antibody titer in the immunized subject can be monitored over time by standard techniques, such as with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the immobilized polypeptide or peptide. If desired, the antibody molecules can be isolated from the mammal (e.g., from the blood) and further purified by well-known techniques, such as protein A or protein G chromatography to obtain the IgG fraction. At an appropriate time after immunization, e.g., when the specific antibody titers are highest, antibody-producing cells can be obtained from the subject and used to prepare monoclonal antibodies by standard techniques, such as the hybridoma technique originally described by Kohler et al. (Nature 256: 495-497, 1975) , the human B cell hybridoma technique (Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72, 1983) , the EBV-hybridoma technique (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985) , or trioma techniques. The technology for producing hybridomas is well known (see, generally, Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds. ) , John Wiley &Sons, Inc., New York, NY) . Hybridoma cells producing a monoclonal antibody are detected by screening the hybridoma culture supernatants for antibodies that bind the polypeptide or epitope of interest, e.g., using a standard ELISA assay.

[0566] Variants of the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the DNA encoding a human, humanized, or chimeric antibody, or antigen-binding fragment thereof described herein, or by peptide synthesis. Such variants include, for example, deletions, insertions, or substitutions of residues within the amino acids sequences that make-up the antigen-binding site of the antibody or an antigen-binding domain. In a population of such variants, some antibodies or antigen-binding fragments will have increased affinity for the target protein. Any combination of deletions, insertions, and / or combinations can be made to arrive at an antibody or antigen-binding fragment thereof that has increased binding affinity for the target. The amino acid changes introduced into the antibody or antigen-binding fragment can also alter or introduce new post-translational modifications into the antibody or antigen-binding fragment, such as changing (e.g., increasing or decreasing) the number of glycosylation sites, changing the type of glycosylation site (e.g., changing the amino acid sequence such that a different sugar is attached by enzymes present in a cell) , or introducing new glycosylation sites. In some embodiments, the heavy-chain antibody or antigen-binding fragment thereof described herein is obtained by immunizing any of the genetically modified animals (e.g., mice with complete human heavy chain variable domain substitution in situ, combined with a modified constant region) described e.g., in PCT / CN2022 / 119188.

[0567] Antibodies disclosed herein can be derived from any species of animal, including mammals. Non-limiting examples of native antibodies include antibodies derived from humans, primates, e.g., monkeys and apes, cows, pigs, horses, sheep, camelids (e.g., camels and llamas) , chicken, goats, and rodents (e.g., rats, mice, hamsters and rabbits) , including transgenic rodents genetically engineered to produce human antibodies.

[0568] Phage display (panning) can be used to optimize antibody sequences with desired binding affinities. In this technique, a gene encoding single chain Fv (comprising VH or VL) can be inserted into a phage coat protein gene, causing the phage to "display" the scFv on its outside while containing the gene for the protein on its inside, resulting in a connection between genotype and phenotype. These displaying phages can then be screened against target antigens, in order to detect interaction between the displayed antigen binding sites and the target antigen. Thus, large libraries of proteins can be screened and amplified in a process called in vitro selection, and antibodies sequences with desired binding affinities can be obtained.

[0569] Human and humanized antibodies include antibodies having variable and constant regions derived from (or having the same amino acid sequence as those derived from) human germline immunoglobulin sequences. Humanized antibodies may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo) , for example in the CDRs. Accordingly, “humanized” antibodies are chimeric antibodies wherein sequences from a non-human species are substituted by the corresponding human sequences.

[0570] Ordinarily, amino acid sequence variants of the human, humanized, or chimeric anti-4-1BB antibody will contain an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%percent identity with a sequence present in the VHH domain of the original antibody.

[0571] In some embodiments, a covalent modification can be made to the antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) . These covalent modifications can be made by chemical or enzymatic synthesis, or by enzymatic or chemical cleavage. Other types of covalent modifications of the antibody or antibody fragment are introduced into the molecule by reacting targeted amino acid residues of the antibody or fragment with an organic derivatization agent that is capable of reacting with selected side chains or the N-or C-terminal residues.

[0572] In some embodiments, antibody variants are provided having a carbohydrate structure that lacks fucose attached (directly or indirectly) to an Fc region. For example, the amount of fucose in such antibody may be from 1%to 80%, from 1%to 65%, from 5%to 65%or from 20%to 40%. The amount of fucose is determined by calculating the average amount of fucose within the sugar chain at Asn297, relative to the sum of all glycostructures attached to Asn 297 (e.g. complex, hybrid and high mannose structures) as measured by MALDI-TOF mass spectrometry, as described in WO 2008 / 077546, for example. Asn297 refers to the asparagine residue located at about position 297 in the Fc region (Eu numbering of Fc region residues; or position 314 in Kabat numbering) ; however, Asn297 may also be located about ±3 amino acids upstream or downstream of position 297, i.e., between positions 294 and 300, due to minor sequence variations in antibodies. Such fucosylation variants may have improved ADCC function. In some embodiments, to reduce glycan heterogeneity, the Fc region of the antibody can be further engineered to replace the Asparagine at position 297 with Alanine (N297A) .

[0573] In some embodiments, to facilitate production efficiency by avoiding Fab-arm exchange, the Fc region of the antibodies can be further engineered to replace the serine at position 228 (EU numbering) of IgG4 with proline (S228P) . A detailed description regarding S228 mutation is described, e.g., in Silva et al., "The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation. " Journal of Biological Chemistry 290.9 (2015) : 5462-5469, which is incorporated by reference in its entirety.

[0574] In some embodiments, the methods described here are designed to make a trispecific antibody. trispecific antibodies can be made by engineering the interface between the first and second polypeptide to maximize the percentage of heterodimers that are recovered from recombinant cell culture. For example, the interface can contain at least a part of the CH3 domain of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first polypeptide are replaced with larger side chains (e.g., tyrosine or tryptophan) . Compensatory “cavities” of identical or similar size to the large side chain (s) are created on the interface of the second polypeptide by replacing large amino acid side chains with smaller ones (e.g., alanine or threonine) . This provides a mechanism for increasing the yield of the heterodimer over other unwanted end-products such as homodimers. This method is described, e.g., in WO 96 / 27011, which is incorporated by reference in its entirety.

[0575] In some embodiments, knob-into-hole (KIH) technology can be used, which involves engineering CH3 domains to create either a “knob” or a “hole” in each heavy chain to promote heterodimerization. The KIH technique is described e.g., in Xu, Yiren, et al. "Production of trispecific antibodies in ‘knobs-into-holes’ using a cell-free expression system. " MAbs. Vol. 7. No. 1. Taylor &Francis, 2015, which is incorporated by reference in its entirety. In some embodiments, one heavy chain has a T366W, and / or S354C (knob) substitution (EU numbering) , and the other heavy chain has an Y349C, T366S, L368A, and / or Y407V (hole) substitution (EU numbering) . In some embodiments, one heavy chain has one or more of the following substitutions Y349C and T366W (EU numbering) . The other heavy chain can have one or more the following substitutions E356C, T366S, L368A, and Y407V (EU numbering) . Furthermore, a substitution (-ppcpScp->-ppcpPcp-) can also be introduced at the hinge regions of both substituted IgG.

[0576] Furthermore, an anion-exchange chromatography can be used to purify trispecific antibodies. Anion-exchange chromatography is a process that separates substances based on their charges using an ion-exchange resin containing positively charged groups, such as diethyl-aminoethyl groups (DEAE) . In solution, the resin is coated with positively charged counter-ions (cations) . Anion exchange resins will bind to negatively charged molecules, displacing the counter-ion. Anion exchange chromatography can be used to purify proteins based on their isoelectric point (pI) . The isoelectric point is defined as the pH at which a protein has no net charge. When the pH > pI, a protein has a net negative charge and when the pH < pI, a protein has a net positive charge. Thus, in some embodiments, different amino acid substitution can be introduced into two heavy chains, so that the pI for the homodimer comprising two first Fc and the pI for the homodimer comprising two second Fc is different. The pI for the trispecific antibody having one first Fc and one second Fc will be somewhere between the two pIs of the homodimers. Thus, the two homodimers and the trispecific antibody can be released at different pH conditions. The present disclosure shows that a few amino acid residue substitutions can be introduced to the heavy chains to adjust pI.

[0577] Multispecific antibodies can also include e.g., cross-linked or “heteroconjugate” antibodies. For example, one of the antibodies in the heteroconjugate can be coupled to avidin and the other to biotin. Heteroconjugate antibodies can also be made using any convenient cross-linking methods. Suitable cross-linking agents and cross-linking techniques are well known in the art and are disclosed in U.S. Patent No. 4,676,980, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0578] Methods of Treatment

[0579] The methods described herein include methods for the treatment of disorders associated with cancer. Generally, the methods include administering a therapeutically effective amount of engineered antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) as described herein, to a subject who is in need of, or who has been determined to be in need of, such treatment.

[0580] As used in this context, to “treat” means to ameliorate at least one symptom of the disorder associated with cancer. Often, cancer results in death; thus, a treatment can result in an increased life expectancy (e.g., by at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 months, or by at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 years) . Administration of a therapeutically effective amount of an agent described herein for the treatment of a condition associated with cancer will result in decreased number of cancer cells and / or alleviated symptoms.

[0581] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for autonomous growth, i.e., an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include all types of cancerous growths or oncogenic processes, metastatic tissues or malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. The term “tumor” as used herein refers to cancerous cells, e.g., a mass of cancerous cells. Cancers that can be treated or diagnosed using the methods described herein include malignancies of the various organ systems, such as affecting lung, breast, thyroid, lymphoid, gastrointestinal, and genito-urinary tract, as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, non-small cell carcinoma of the lung, cancer of the small intestine and cancer of the esophagus. In some embodiments, the agents described herein are designed for treating or diagnosing a carcinoma in a subject. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues including respiratory system carcinomas, gastrointestinal system carcinomas, genitourinary system carcinomas, testicular carcinomas, breast carcinomas, prostatic carcinomas, endocrine system carcinomas, and melanomas. In some embodiments, the cancer is renal carcinoma or melanoma. Exemplary carcinomas include those forming from tissue of the esophageal, cervix, lung, prostate, breast, head and neck, colon and ovary. The term also includes carcinosarcomas, e.g., which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation. In some embodiments, the cancer is a chemotherapy resistant cancer.

[0582] In one aspect, the disclosure also provides methods for treating a cancer in a subject, methods of reducing the rate of the increase of volume of a tumor in a subject over time, methods of reducing the risk of developing a metastasis, or methods of reducing the risk of developing an additional metastasis in a subject. In some embodiments, the treatment can halt, slow, retard, or inhibit progression of a cancer. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of in the number, severity, and / or duration of one or more symptoms of the cancer in a subject.

[0583] In one aspect, the disclosure features methods that include administering a therapeutically effective amount of antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) described herein to a subject in need thereof, e.g., a subject having, or identified or diagnosed as having, a cancer, e.g., breast cancer, carcinoid, cervical cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, renal cancer, skin cancer, stomach cancer, esophageal carcinoma, testis cancer, thyroid cancer, or urothelial cancer.

[0584] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present invention is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated by the present invention. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals. In some embodiments, the subject is a human. In some embodiments, the subject is a dog.

[0585] In some embodiments, the cancer is thyroid cancer, urothelial cancer, breast cancer, colorectal cancer, renal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, lung cancer, endometrial cancer, skin cancer, stomach cancer, esophageal carcinoma, pancreatic cancer, prostate cancer, liver cancer, lymphoma, or glioma.

[0586] In some embodiments, the cancer is cervical cancer, prostate cancer, thyroid cancer, urothelial cancer, head and neck cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, lung cancer, breast cancer, carcinoid, skin cancer, liver cancer, or testis cancer.

[0587] In some embodiments, the cancer is pancreas cancer, lung cancer, stomach cancer, prostate cancer, breast cancer, ovary cancer, colon cancer, skin cancer, or brain cancer.

[0588] In some embodiments, the cancer is pancreatic neuroendocrine tumor (PNET) , small-cell type neuroendocrine carcinoma (SCNEC) , large-cell type neuroendocrine carcinoma (LCNEC) , small cell lung cancer (SCLC) , large cell-neuroendocrine lung cancer, neuroendocrine prostate cancer (NEPC) , Merkel cell carcinoma, small cell urinary bladder cancer, GI neuroendocrine carcinoma, medullary thyroid carcinoma (MTC) , gastroenteropancreatic neuroendocrine carcinoma (GEP NEC) , neuroblastoma, glioma or glioblastoma (GBM) , melanoma, or medullary thyroid cancer.

[0589] In some embodiments, the compositions and methods disclosed herein can be used for treatment of patients at risk for a cancer. Patients with cancer can be identified with various methods known in the art.

[0590] As used herein, by an “effective amount” is meant an amount or dosage sufficient to effect beneficial or desired results including halting, slowing, retarding, or inhibiting progression of a disease, e.g., a cancer. An effective amount will vary depending upon, e.g., an age and a body weight of a subject to which the antibody, antigen binding fragment, antibody binding protein constructs, antibody-encoding polynucleotide, vector comprising the polynucleotide, and / or compositions thereof is to be administered, a severity of symptoms and a route of administration, and thus administration can be determined on an individual basis.

[0591] An effective amount can be administered in one or more administrations. By way of example, an effective amount of an antibody, an antigen binding fragment, or an antibody binding protein constructs is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, inhibit, slow and / or delay progression of an autoimmune disease or a cancer in a patient or is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, slow and / or delay proliferation of a cell (e.g., a biopsied cell, any of the cancer cells described herein, or cell line (e.g., a cancer cell line) ) in vitro. As is understood in the art, an effective amount of an antibody, antigen binding fragment, or antibody binding protein constructs may vary, depending on, inter alia, patient history as well as other factors such as the type (and / or dosage) of the composition used.

[0592] Effective amounts and schedules for administering the antibodies, antigen binding fragments, antibody-encoding polynucleotides, antibody binding protein constructs, and / or compositions disclosed herein may be determined empirically, and making such determinations is within the skill in the art. Those skilled in the art will understand that the dosage that must be administered will vary depending on, for example, the mammal that will receive the antibodies, antigen binding fragments, antibody-encoding polynucleotides, binding protein constructs, and / or compositions disclosed herein, the route of administration, the particular type of antibodies, antibody-encoding polynucleotides, antigen binding fragments, antibody binding protein constructs, and / or compositions disclosed herein used and other drugs being administered to the mammal.

[0593] A typical daily dosage of an effective amount of an antibody, antigen-binding fragment thereof, or antigen-binding protein construct (e.g., a trispecific antibody) is 0.01 mg / kg to 100 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be less than 100 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be greater than 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, 0.1 mg / kg, 0.05 mg / kg, or 0.01 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about or at least 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.9 mg / kg, 0.8 mg / kg, 0.7 mg / kg, 0.6 mg / kg, 0.5 mg / kg, 0.4 mg / kg, 0.3 mg / kg, 0.2 mg / kg, or 0.1 mg / kg.

[0594] In any of the methods described herein, the at least one antibody, antigen-binding fragment thereof, antigen-binding protein construct (e.g., a trispecific antibody) , or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding fragments, or pharmaceutical compositions described herein) , with or without at least one additional therapeutic agent, can be administered to the subject at least once a week (e.g., once a week, twice a week, three times a week, four times a week, once a day, twice a day, or three times a day) . In some embodiments, at least two different antibodies and / or antigen-binding fragments are administered in the same composition (e.g., a liquid composition) . In some embodiments, at least one antibody, antigen-binding fragment thereof, antigen-binding protein construct (e.g., a trispecific antibody) , and at least one additional therapeutic agent are administered in the same composition (e.g., a liquid composition) . In some embodiments, the at least one antibody or antigen-binding fragment and the at least one additional therapeutic agent are administered in two different compositions (e.g., a liquid composition containing at least one antibody or antigen-binding fragment and a solid oral composition containing at least one additional therapeutic agent) . In some embodiments, the at least one additional therapeutic agent is administered as a pill, tablet, or capsule. In some embodiments, the at least one additional therapeutic agent is administered in a sustained-release oral formulation.

[0595] In some embodiments, the one or more additional therapeutic agents can be administered to the subject prior to, or after administering the at least one antibody, antigen-binding fragment thereof, antigen-binding protein construct (e.g., a trispecific antibody) , or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding fragments, or pharmaceutical compositions described herein) . In some embodiments, the one or more additional therapeutic agents and the at least one antibody, antigen-binding fragment thereof, antigen-binding protein construct (e.g., a trispecific antibody) , or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding fragments, or pharmaceutical compositions described herein) are administered to the subject such that there is an overlap in the bioactive period of the one or more additional therapeutic agents and the at least one antibody or antigen-binding fragment (e.g., any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein) , or the antigen-binding protein construct (e.g., a trispecific antibody) in the subject.

[0596] In some embodiments, the subject can be administered with the at least one antibody, antigen-binding fragment, antigen-binding protein construct (e.g., a trispecific antibody) , or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding fragments, or pharmaceutical compositions described herein) over an extended period of time (e.g., over a period of at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, 12 months, 1 year, 2 years, 3 years, 4 years, or 5 years) . A skilled medical professional may determine the length of the treatment period using any of the methods described herein for diagnosing or following the effectiveness of treatment (e.g., the observation of at least one symptom of cancer) . As described herein, a skilled medical professional can also change the identity and number (e.g., increase or decrease) of antibodies or antigen-binding fragments, or the antigen-binding protein construct (e.g., a trispecific antibody) administered to the subject and can also adjust (e.g., increase or decrease) the dosage or frequency of administration of at least one antibody or antigen-binding fragment, or antigen-binding protein construct (e.g., a trispecific antibody) to the subject based on an assessment of the effectiveness of the treatment (e.g., using any of the methods described herein and known in the art) .

[0597] In some embodiments, one or more additional therapeutic agents can be administered to the subject. The additional therapeutic agent can comprise one or more inhibitors selected from the group consisting of an inhibitor of B-Raf, an EGFR inhibitor, an inhibitor of a MEK, an inhibitor of ERK, an inhibitor of K-Ras, an inhibitor of c-Met, an inhibitor of anaplastic lymphoma kinase (ALK) , an inhibitor of a phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) , an inhibitor of an Akt, an inhibitor of mTOR, a dual PI3K / mTOR inhibitor, an inhibitor of Bruton’s tyrosine kinase (BTK) , and an inhibitor of Isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) and / or Isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) . In some embodiments, the additional therapeutic agent is an inhibitor of indoleamine 2, 3-dioxygenase-1 (IDO1) (e.g., epacadostat) .

[0598] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more inhibitors selected from the group consisting of an inhibitor of HER3, an inhibitor of LSD1, an inhibitor of MDM2, an inhibitor of BCL2, an inhibitor of CHK1, an inhibitor of activated hedgehog signaling pathway, and an agent that selectively degrades the estrogen receptor.

[0599] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more therapeutic agents selected from the group consisting of Trabectedin, nab-paclitaxel, Trebananib, Pazopanib, Cediranib, Palbociclib, everolimus, fluoropyrimidine, IFL, regorafenib, Reolysin, Alimta, Zykadia, Sutent, temsirolimus, axitinib, sorafenib, Votrient, IMA-901, AGS-003, cabozantinib, Vinflunine, an Hsp90 inhibitor, Ad-GM-CSF, Temazolomide, IL-2, IFNa, vinblastine, Thalomid, dacarbazine, cyclophosphamide, lenalidomide, azacytidine, bortezomid, amrubicine, carfilzomib, pralatrexate, and enzastaurin.

[0600] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more therapeutic agents selected from the group consisting of an adjuvant, a TLR agonist, tumor necrosis factor (TNF) alpha, IL-1, HMGB1, an IL-10 antagonist, an IL-4 antagonist, an IL-13 antagonist, an IL-17 antagonist, an HVEM antagonist, an ICOS agonist, a CX3CL1 agonist, a CXCL9 agonist, a CXCL10 agonist, a CCL5 agonist, an LFA-1 agonist, an ICAM1 agonist, and a Selectin agonist.

[0601] In some embodiments, carboplatin, nab-paclitaxel, paclitaxel, cisplatin, pemetrexed, gemcitabine, FOLFOX, or FOLFIRI are administered to the subject.

[0602] In some embodiments, the additional therapeutic agent is an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-CD40 antibody, an anti-OX40 antibody, or an anti-CTLA4 antibody.

[0603] Pharmaceutical Compositions and Routes of Administration

[0604] Also provided herein are pharmaceutical compositions that contain at least one (e.g., one, two, three, or four) of the antibodies, antigen-binding fragments, or antigen-binding protein constructs (e.g., trispecific antibodies) described herein. Two or more (e.g., two, three, or four) of any of the antibodies, antigen-binding fragments, or antigen-binding protein constructs described herein can be present in a pharmaceutical composition in any combination. The pharmaceutical compositions may be formulated in any manner known in the art.

[0605] Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) . The compositions can include a sterile diluent (e.g., sterile water or saline) , a fixed oil, polyethylene glycol, glycerine, propylene glycol or other synthetic solvents, antibacterial or antifungal agents, such as benzyl alcohol or methyl parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like, antioxidants, such as ascorbic acid or sodium bisulfite, chelating agents, such as ethylenediaminetetraacetic acid, buffers, such as acetates, citrates, or phosphates, and isotonic agents, such as sugars (e.g., dextrose) , polyalcohols (e.g., mannitol or sorbitol) , or salts (e.g., sodium chloride) , or any combination thereof. Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers (see, e.g., U.S. Patent No. 4,522,811) . Preparations of the compositions can be formulated and enclosed in ampules, disposable syringes, or multiple dose vials. Where required (as in, for example, injectable formulations) , proper fluidity can be maintained by, for example, the use of a coating, such as lecithin, or a surfactant. Absorption of the antibody or antigen-binding fragment thereof can be prolonged by including an agent that delays absorption (e.g., aluminum monostearate and gelatin) . Alternatively, controlled release can be achieved by implants and microencapsulated delivery systems, which can include biodegradable, biocompatible polymers (e.g., ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid; Alza Corporation and Nova Pharmaceutical, Inc. ) .

[0606] Compositions containing one or more of any of the antigen-binding protein constructs, antibodies, antigen-binding fragments described herein can be formulated for parenteral (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in dosage unit form (i.e., physically discrete units containing a predetermined quantity of active compound for ease of administration and uniformity of dosage) .

[0607] Toxicity and therapeutic efficacy of compositions can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals (e.g., monkeys) . One can determine the LD50 (the dose lethal to 50%of the population) and the ED50 (the dose therapeutically effective in 50%of the population) : the therapeutic index being the ratio of LD50: ED50. Agents that exhibit high therapeutic indices are preferred. Where an agent exhibits an undesirable side effect, care should be taken to minimize potential damage (i.e., reduce unwanted side effects) . Toxicity and therapeutic efficacy can be determined by other standard pharmaceutical procedures.

[0608] Exemplary doses include milligram or microgram amounts of any of the antigen-binding protein constructs, antibodies or antigen-binding fragments described herein per kilogram of the subject’s weight (e.g., about 1 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 50 mg / kg; about 10 μg / kg to about 5 mg / kg; about 10 μg / kg to about 0.5 mg / kg; or about 0.1 mg / kg to about 0.5 mg / kg) .

[0609] The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration. The disclosure also provides methods of manufacturing the antibodies or antigen binding fragments thereof for various uses as described herein.

[0610] EXAMPLES

[0611] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0612] Example 1. Generating anti-4-1BB antibodies

[0613] Human 4-1BB protein (ACRO Biosystems Inc., Cat#: 41B-H5258) or DNA encoding the protein was emulsified with adjuvants, and was used to immunize mice (e.g., the mice with complete human heavy chain variable domain substitution in situ, combined with a modified constant region. The mice are described e.g., in PCT / CN2022 / 119188, which is incorporated herein by reference in its entirety) .

[0614] The antibody immune response was monitored by an antigen-specific immunoassay. When a desired immune response was achieved, antigen-specific immune cells were isolated from the immunized mice to further obtain anti-4-1BB antibodies or to obtain the heavy chain variable region sequences of the anti-4-1BB antibodies. For example, single cell technology (for example, using  Optofluidic System, Berkeley Lights Inc. ) was used to screen and find plasma cells that secrete antigen-specific monoclonal antibodies, and reverse transcription and PCR sequencing were used to obtain antibody variable region sequences. The obtained variable region sequences were used for antibody expression to verify the binding activity to 4-1BB using FACS. Because the lack of the CH1 domain, the heavy chain variable region (VH) of the obtained antibodies is also referred to as a heavy chain single variable domain (VHH) .

[0615] The obtained VHH sequences were each connected to a human IgG1 Fc region. 5F5, 5B2, and 9A8 are exemplary antibodies obtained by this method. The heavy chain CDRs 1-3 sequences are shown in FIG. 1 and FIG. 2. The VHH region sequence of 5F5, 5B2, and 9A8 are shown in FIG. 5.

[0616] Two reference antibodies with specificity for 4-1BB, synthesized from published amino acid sequence information, were used in the following experiments (designated Ref1 and Ref2) . Specifically, The VHH sequence set forth in SEQ ID NO: 62 was linked to the human IgG1 Fc region set forth in SEQ ID NO: 69 to form Ref1. The VL and VH sequences set forth in SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 63 were linked to the human IgG4 constant region set forth in SEQ ID NO: 67 and SEQ ID NO: 68 to form Ref2.

[0617] Example 2. Binding affinity test of anti-4-1BB antibodies

[0618] The binding affinity of the anti-4-1BB antibodies to His-tagged human 4-1BB protein ( (h41BB-His, ACRO biosystems, Cat#: 41B-H52Hc) or His-tagged monkey 4-1BB protein (cyno41BB-His, ACRO biosystems, Cat#: 41B-C52H4) was verified by Biolayer Interferometry (BLI) using ForteBio Octet system.

[0619] Purified anti-4-1BB antibodies were captured on the Protein A chip (Series S Sensor Chip Protein A) for the detection. 2 μg / mL antibody was loaded at 10 μL / min to bind to the recombinant h41BB-His or cyno41BB-His with the concentration of 400 nM. The flow rate was 30 μL / min, the binding and dissociation time were set to 180s and 400s, respectively. The chip was regenerated after the last injection of each titration with a glycine solution (pH2.0) at 30 μL / min for 30 seconds.

[0620] Kinetic association rates (kon) and dissociation rates (koff) were obtained simultaneously by fitting the data globally to a 1: 1 Langmuir binding model (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110) using BiacoreTM 8K Evaluation Software 3.0. Affinities were deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) .

[0621] As a person of ordinary skill in the art would understand, the same method with appropriate adjustments for parameters (e.g., antibody concentration) was performed for each tested antibody. The results are summarized in the table below. The results show that 5F5, 5B2, and 9A8 can bind to human and monkey 4-1BB with high affinity.

[0622] Table 1

[0623] Example 3. Activation effect of anti-4-1BB antibodies in a reporter cell line

[0624] The experiment was performed to test the agonist activity of anti-4-1BB antibodies. Jurkat-luc-h41BB cells (expressing human 4-1BB, along with an NF-κB-inducible luciferase reporter gene) and CHO-K1-hFcγRIIB cells (expressing human hFcγRIIB) were seeded in a 96-well plate, or only Jurkat-luc-h41BB cells were seeded in a 96-well plate. Serially diluted anti-4-1BB antibodies were added to corresponding wells. The above 96-well plate was incubated in a 37 ℃ incubator for 6 hours. After the incubation, Bio-GloTM Luciferase Assay system (vazyme, cat#: DD1201-02) was added to incubate at room temperature for 5-10 minutes. The plate was then placed in a luminescence detector to detect the fluorescence signal.

[0625] The relative light unit (RLU) values were used to generate a fitting curve with respect to the antibody concentrations. More specifically, logarithm of antibody concentrations was calculated and was used as the X-axis variable, while the corresponding RLU value was used as the Y-axis variable. The test results are shown in FIGs. 6A-6B. The results indicated that 5F5, 5B2, and 9A8 had agonist activity that was dependent on FcγRIIB mediated crosslinking and 5F5, 5B2, and 9A8 had lower agonist activity as compared to the control antibody Ref2.

[0626] Example 4. Physicochemical properties of anti-4-1BB antibodies

[0627] The anti-4-1BB antibodies were diluted to 1 mg / mL using PBS buffer, and the following tests were performed: (1) detecting changes in the apparent hydrophobicity of the antibodies using the Hydrophobic Interaction Chromatography-High Performance Liquid Chromatography (HIC-HPLC) method (indicated as the retention time of the main peak (HIC, min) ; (2) detecting the specificity of the antibodies using the Cross-Interaction Chromatography (CIC) method (indicated as the retention time (CIC, min) ) ; (3) detecting the colloidal stabilities of the antibodies by the stand-up monolayer chromatography (SMAC) method (indicated as the retention time (SMAC, % / min) ) ; (4) detecting thermodynamic stability of the antibodies by the high throughput multifunctional protein stability analyzer (UNcle, Unchained Labs) (indicated as the melting temperature (Tm) and aggregation temperature (Tagg 266) ) ; and (5) detecting isoelectric point of the antibodies by the Capillary Isoelectric Focusing (cIEF) method (indicated as the isoelectric point (pI) ) . Detailed results are summarized in the table below.

[0628] In the HIC-HPLC experiments, the Agilent 1260 chromatograph system (connected with ProPacTM HIC-10 column (4.6 × 100 mm, Thermo Scientific) ) was used, and the antibodies were diluted using mobile phase A to 0.5 mg / mL. The following parameters were used: mobile phase A: 0.9 M ammonium sulfate, 0.1 M PB, 10%acetonitrile pH 6.5; mobile phase B: 0.1 M PB, 10%acetonitrile pH 6.5; flow rate: 0.8 mL / min; gradient: 0 min 100%A, 2 min 100%A, 32 min 100%B, 34 min 100%B, 35 min 100%A, and 45 min 100%A; column temperature: 30 ℃; detection wavelength: 280 nm; injection volume: 10 μg; sample tray temperature: about 6 ℃; and running time: 45 minutes.

[0629] In the CIC assay, a CIC column was prepared by coupling human polyclonal IgGs (Sigma, Cat#: I4506) onto a HiTrap NHS-activated resin (GE Healthcare, Cat#: 17-0716-01) followed by passivation with ethanolamine according to published procedures. The column was then connected to Agilent 1260 chromatograph system and run at 0.1 mL / min using 1× PBS as the mobile phase until a flat baseline was reached. 10 μg of antibody at 1 mg / mL in PBS were then injected. Peak retention times on the column were monitored at 280 nm; running time: 50 minutes.

[0630] In the SMAC assay, Zenix column (4.6 mm × 30 cm, Sepax, Cat#: 213300-4630) was connected to the column compartment, and the appropriate line was placed in the mobile phase. Column was equilibrated for 60 min at 0.350 mL / min flow rate with mobile phase buffer. Antibodies were loaded into the injection sequence. Mobile Phase A: 150 mM Sodium Phosphate pH 7.0; flow rate: 0.35 mL / min; running time: 25 min; column temperature: 30℃; detection wavelength: 280 nm, 220 nm.

[0631] In the UNcle experiments, 8 μL protein sample was loaded into the Uni tube, and the system operated at a thermal temperature from 25℃ to 95℃ at a heating rate of 1℃ / min. The particle size and polydispersity were detected by dynamic light scattering (DLS) before heating. The protein stability was characterized by differential scanning full spectrum fluorescence (DSF) , static light scattering (SLS) and dynamic light scattering (DLS) .

[0632] In the cIEF experiments, a Maurice cIEF Method Development Kit (Protein Simple, Cat#: PS-MDK01-C) was used for sample preparation. Specifically, 40 μg protein sample was mixed with the following reagents in the kit: 1 μL Maurice cIEF pI Marker-4.05, 1 μL Maurice cIEF pI Marker-9.99, 35 μL 1%Methyl Cellulose Solution, 2 μL Maurice cIEF 500 mM Arginine, 4 μL Ampholytes (Pharmalyte pH ranges 3-10) , and water (added to make a final volume of 100 μL) . On the Maurice analyzer (Protein Simple, Santa Clara, CA) , Maurice cIEF Cartridges (PS-MC02-C) were used to generate imaging capillary isoelectric focusing spectra. The sample was focused for a total of 10 minutes. The analysis software installed on the instrument was used to integrate the absorbance of the 280 nm-focused protein.

[0633] The results shown in the table below indicate that all the anti-4-1BB antibodies have good stability.

[0634] Table 2

[0635] Example 5. Pharmacokinetic Profiles

[0636] The pharmacokinetic clearance rates of the anti-4-1BB antibodies were determined in humanized 4-1BB mice (Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd., Cat#: 110004) . Specifically, the mice were placed into three groups and administered with 3 mg / kg 5F5, 5B2, or Ref1 by intravenous injection. Blood samples were collected at different time points.

[0637] The serum levels of antibodies were determined by sandwich ELISA. Briefly, Goat Anti-Human IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Inc., Cat#: 109-005-088) was diluted to a final concentration of 2000 ng / mL, added to a 96-well plate at 100 μL / well, and then incubated overnight at 2-8 ℃. After the incubation, the plate was washed with PBS-T buffer (PBS supplemented with TweenTM 20) for 4 times. The plates were blocked with 2%BSA (bovine serum albumin) for 2 hours at 37 ℃. After washing, 100 μL of sample was added to each well. The wells were sealed and incubated at 37 ℃ for 1 hour. After washing, Peroxidase AffiniPure F (ab') 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Jackson ImmunoResearch Inc., Cat#: 109-036-098) was added at 100 μL / well to corresponding wells, and incubated at 37 ℃ for 1 hour. After washing, tetramethylbenzidine (TMB) solution was added with 100 μL / well to the 96-well plate as the substrate. After incubating at room temperature in the dark, 100 μL stop solution (Beyotime, Cat#: P0215) was added to each well. Luminescent signals of the plate were measured at 450 nm and 630 nm. The absorbance value and corresponding concentration of the calibration sample prepared by each test product was used to create a standard curve with four parameters. The standard curve was used to calculate the antibody concentration of each serum sample. A drug concentration-time curve was created using the calculated sample concentration at each time point. PhoenixTM WinNolin 8.3 was used to calculate the pharmacokinetic parameters (i.e., T1 / 2, Cmax, and AUC0-21day) .

[0638] As shown in FIG. 7A and table below, the results indicated that 5F5 and 5B2 have typical pharmacokinetic characteristics in humanized 4-1BB mice.

[0639] Table 3

[0640] In another experiment, the pharmacokinetic clearance rates of the anti-4-1BB antibodies were determined in C57BL / 6 mice. Specifically, the mice were placed into three groups and administered with 3 mg / kg 5F5, 5B2, or Ref1 by intravenous injection. Blood samples were collected at different time points. The serum levels of antibodies were determined by sandwich ELISA.

[0641] As shown in FIG. 7B and table below, similar to previous results, 5F5 and 5B2 have typical pharmacokinetic characteristics in C57BL / 6 mice.

[0642] Table 4

[0643] Example 6. Anti-Tumor Activity in MC38-hB7H4 xenograft model

[0644] Ref5 is an anti-B7H4 / 4-1BB bispecific antibody, composed of an anti-B7H4 IgG1 monoclonal antibody with an anti-4-1BB VHH fused at the C-terminus of heavy chain constant region. The structure is shown in FIG. 8A. Ref5 was synthesized from published amino acid sequence information and was used as a control in the following experiment. Specifically, the heavy chain and light chain sequence of Ref5 are set forth in SEQ ID NO: 75 and SEQ ID NO: 76, respectively, and the anti-4-1BB VHH part sequence is set forth in SEQ ID NO: 62.

[0645] The anti-4-1BB VHH part of Ref5 was replaced with 5F5, 5B2, or 9A8 to obtain anti-B7H4 / 4-1BB bispecific antibodies Ref5-5F5, Ref5-5B2, and Ref5-9A8.

[0646] The above bispecific antibodies were tested for their effects on tumor growth in vivo in a model of MC38-hB7H4 (obtained by transfecting MC38 cells with vectors expressing human B7H4 (hB7H4, SEQ ID NO: 77) ) xenograft model. Specifically, about 3 × 106 MC38-hB7H4 cells were injected subcutaneously in 4-1BB humanized mice (Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd., Cat#: 110004) . When the tumor volume of the mice reached about 100 mm3, the mice were randomly placed into different groups based on tumor volumes (6 mice per group) . The mice were then injected with phosphate buffer saline (PBS) , Ref5, Ref5-5F5, Ref5-5B2, or Ref5-9A8 by intravenous (i. v. ) administration. There were 4 administrations in total.

[0647] The lengths of the long axis and the short axis of the tumor were measured and the volume of the tumor was calculated as 0.5× (long axis) × (short axis) 2. The tumor growth inhibition (TGI) was calculated using the following formula: TGI (%) = [1- (Ti-T0)  /  (Vi-V0) ] ×100. Ti is the average tumor volume in the treatment group on day i. T0 is the average tumor volume in the treatment group on day zero. Vi is the average tumor volume in the control group on day i. V0 is the average tumor volume in the control group on day zero. T-test was performed for statistical analysis. P < 0.05 is a threshold to indicate significant difference.

[0648] As shown in FIG. 9, the treatment groups (G2-G5) showed different tumor inhibition effects compared with the control groups G1. Among the treatment groups, Ref5-5F5 (G3) showed the best tumor inhibitory effect.

[0649] Example 7. Generating anti-DLL3 antibodies

[0650] Human DLL3 protein (ACRO Biosystems Inc., Cat#: DL3-H52H4) or DNA encoding the protein was emulsified with adjuvants, and was used to immunize mice (e.g., the mice with complete human heavy chain variable domain combined with a common light chain substitution in situ. The mice are described e.g., in PCT / CN2021 / 097652, which are incorporated herein by reference in its entirety) .

[0651] The antibody immune response was monitored by an antigen-specific immunoassay. When a desired immune response was achieved, antigen-specific immune cells were isolated from the immunized mice to further obtain anti-DLL3 antibodies or to obtain the light chain and heavy chain variable region sequences of the anti-DLL3 antibodies. For example, single cell technology (for example, using  Optofluidic System, Berkeley Lights Inc. ) was used to screen and find plasma cells that secrete antigen-specific monoclonal antibodies, and reverse transcription and PCR sequencing were used to obtain antibody variable region sequences. The obtained sequences were cloned into a vector containing a sequence that encodes the human IgG1 constant region for antibody expression. The binding activity of the expressed antibodies to DLL3 was verified using FACS.

[0652] Exemplary antibodies obtained by this method included: 2A2, 2BL2 and 2984. The VH and VL CDRs 1-3 sequences of these antibodies are shown in FIG. 3 and FIG. 4. The sequences of the VH and VL regions are shown in FIG. 5.

[0653] One reference antibody with specificity for DLL3, synthesized from published amino acid sequence information, was used in the following experiments (designated Ref9) . Specifically, The VH and VL sequences set forth in SEQ ID NO: 97 and SEQ ID NO: 98 were linked to the human IgG1 constant region sequences set forth in SEQ ID NO: 99 and SEQ ID NO: 67 to form Ref9.

[0654] Example 8. Cross-species binding analyses of anti-DLL3 antibodies

[0655] CHO-hDLL3 cells, CHO-mDLL3 cells, CHO-fasDLL3 cells, or CHO-dDLL3 cells were transferred to a 96-well plate at a density of 1×105 cells / well. 2 μg / mL anti-DLL3 antibodies were added to the 96-well plate, and incubated at 4℃ for 30 min. Then, the cells were incubated with the secondary antibody Anti-hIgG-Fc-Alex Flour 647 (RL1-H) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., 109-606-170) at 4℃ in the dark for 15 minutes before flow cytometry analysis.

[0656] CHO-hDLL3 cells, CHO-mDLL3 cells, CHO-fasDLL3 cells, and CHO-dDLL3 cells were obtained by transfecting CHO-Scells with vectors expressing human DLL3 (SEQ ID NO: 100) , mouse DLL3 (SEQ ID NO: 101) , monkey DLL3 (SEQ ID NO: 102) and dog DLL3 (SEQ ID NO: 103) , respectively.

[0657] The test results are shown in the table below. All the three anti-DLL3 antibodies can bind to human DLL3, monkey DLL3, and dog DLL3. In addition, 2A2 can also bind to mouse DLL3.

[0658] Table 5

[0659] Example 9. Binding affinity test of anti-DLL3 antibodies

[0660] The binding affinities of the anti-DLL3 antibodies to His-tagged human DLL3 (hDLL3-His, ACRO Biosystems Inc., Cat#: DL3-H52H4) and monkey DLL3 (fasDLL3-His, ACRO Biosystems Inc., Cat#: DL3-C52H3) were measured by Biolayer Interferometry (BLI) using ForteBio Octet system.

[0661] Purified anti-DLL3 antibodies were diluted to 10 μg / mL and then injected into the AHC biosensor at 10 μL / min. Kinetic measurements were performed at the concentration of 200 nM of the recombinant His-tagged DLL3 protein. The association phase lasted for 180 s and the dissociation phase lasted 400 s followed by a regeneration step with 10 mM Glycine-HCl, pH1.7. For isotype control (ISO) , an antibody targeting an irrelevant target protein was used.

[0662] Kinetic association rates (kon) and dissociation rates (koff) were obtained simultaneously by fitting the data globally to a 1: 1 Langmuir binding model (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6.99-110) using Octet data analysis program. Affinities were deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . As a person of ordinary skill in the art would understand, the same method with appropriate adjustments for parameters (e.g., antibody concentration) was performed for each tested anti-DLL3 antibody.

[0663] The results for the tested antibodies are summarized in the table below, which shows that 2A2, 2BL2, and 2984 exhibited better binding affinity to human and monkey DLL3 compared to Ref9.

[0664] Table 6

[0665] Example 10. Binding activity of anti-DLL3 antibodies to tumor cells

[0666] The binding activity of anti-DLL3 antibodies to tumor cell lines were verified by flow cytometry. Briefly, lung cancer cells NCI-H524, DMS79, and SHP-77 were plated in a 96-well plate at a density of 1 × 105 cells / well, respectively. Each purified anti-DLL3 antibody (e.g., 2A2, 2BL2, 2984) was added to each well to reach a final concentration of 1.5 μg / mL and was incubated at 4℃ for 30 minutes. Then, after one wash with PBS, the cells were incubated with the secondary antibody Alexa  647 anti-human IgG Fcγ (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Cat#: 109-606-170) at 4℃ for 15 minutes. The cells were collected and tested by flow cytometry analysis. Human IgG1 was used as an ISO control.

[0667] The results are shown in the table below. Antibodies 2A2, 2BL2, and 2984 exhibited good binding activities to various cancer cell lines.

[0668] Table 7

[0669] Example 11. Internalization detection of anti-DLL3 antibodies

[0670] Anti-DLL3 antibodies (2.5 μg / mL) and pHAb-Goat Anti-Human IgG Secondary Antibody (Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd., Cat#: G9845) were added to small cell lung cancer cells NCI-H524, DMS79, or SHP-77. After incubating for 6 hours, the cells were centrifuged and washed with FACS buffer. The MFI values were measured with a flow cytometer, and the endocytosis rates of the anti-DLL3 antibodies were calculated. The results are shown in the table below. Human IgG1 was used as an ISO control. The data showed that 2A2, 2BL2, and 2984 had good cell endocytosis rates.

[0671] Table 8

[0672] Example 12. Physicochemical properties of anti-DLL3 antibodies

[0673] In another experiment, the physicochemical properties of anti-DLL3 antibodies were evaluated. The purity changes of antibodies were detected by Size-Exclusion Ultra Performance Liquid Chromatography (SEC-UPLC) (indicated as the percentage of the main peak area to the sum of all peak areas (Purity, %)) .

[0674] In the SEC-UPLC experiments, the Agilent 1290 chromatograph system (connected with XBridgeTM Protein BEH SEC column ( Waters Corporation) ) was used. The antibody samples were diluted to 1 mg / mL with purified water. The following parameters were used: mobile phase: 25 mM phosphate buffer (PB) (pH 6.8) + 0.3 M NaCl; flow rate: 1.8 mL / min; column temperature: 25 ℃; detection wavelength: 280 nm; injection volume: 10 μL; sample tray temperature: 6 ℃; and running time: 7 minutes.

[0675] The results shown in the table below indicate that all the anti-DLL3 antibodies have good stability.

[0676] Table 9

[0677] Example 13. Preparation of trispecific antibodies

[0678] Four types of anti-4-1BB / TAA / CD3 trispecific antibodies were designed as shown in the table below and FIGs. 10A-10D.

[0679] Various methods can be used to reduce homodimerization of the Fc region. For example, knobs-into-holes mutations were introduced in the Fc regions. In addition, LALA-GA (L234A, L235A, and G237A mutations according to EU numbering) were introduced into the Fc region to reduce effector function.

[0680] Table 10

[0681] Tri-Format-AStructure (FIG. 10A) from N-terminus to C-terminus includes:

[0682] First chain: VHH (targeting 4-1BB) , linker L3 (optional, preferably 0 amino acids) , first part of Fc (Hinge-CH2-CH3) ;

[0683] Second chain: VH1 (targeting TAA) , CH1, linker L1 (optional) , VH2 (targeting CD3) , linker L2 (optional) , VL2 (targeting CD3) , a second part of Fc (Hinge-CH2-CH3) ; where L1 is preferably Linker 1 (DGGGGSGGGGS (SEQ ID: 72) ) , and L2 is preferably Linker 2 (GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID: 73) ) ;

[0684] Third chain: VL1 (targeting TAA) , CL.

[0685] Tri-Format-B Structure (FIG. 10B) from N-terminus to C-terminus includes:

[0686] First chain: a first part of Fc (Hinge-CH2-CH3) , linker L4 (optional) , VHH (targeting 4-1BB) ; where L4 is preferably GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID: 73) ;

[0687] Second chain: VH1 (targeting TAA) , CH1, linker L1 (optional) , VH2 (targeting CD3) , linker L2 (optional) , VL2 (targeting CD3) , a second part of Fc (Hinge-CH2-CH3) ; where L1 is preferably Linker 1 (DGGGGSGGGGS (SEQ ID: 72) ) , and L2 is preferably Linker 2 (GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID: 73) ) ;

[0688] Third chain: VL1 (targeting TAA) , CL.

[0689] Tri-Format-C Structure (FIG. 10C) from N-terminus to C-terminus includes:

[0690] First chain: a first part of Fc (Hinge-CH2-CH3) ;

[0691] Second chain: VH1 (targeting TAA) , CH1, linker L1 (optional) , VH2 (targeting CD3) , linker L2 (optional) , VL2 (targeting CD3) , a second part of Fc (Hinge-CH2-CH3) , linker L5 (optional) , VHH (targeting 4-1BB) ; where L1 is preferably Linker 1 (DGGGGSGGGGS (SEQ ID: 72) ) , L2 is preferably Linker 2 (GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID: 73) ) , and L5 is preferably Linker 2 (GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID: 73) ) ;

[0692] Third chain: VL1 (targeting TAA) , CL.

[0693] Tri-Format-D Structure (FIG. 10D) from N-terminus to C-terminus includes:

[0694] First chain: VH1 (targeting TAA) , CH1, a first part of Fc (Hinge-CH2-CH3) , linker L4 (optional) , VHH (targeting 4-1BB) ; where L4 is preferably GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID: 73) ;

[0695] Second chain: VH1 (targeting TAA) , CH1, linker L1 (optional) , VH2 (targeting CD3) , linker L2 (optional) , VL2 (targeting CD3) , a second part of Fc (Hinge-CH2-CH3) ; where L1 is preferably Linker 1 (DGGGGSGGGGS (SEQ ID: 72) ) , and L2 is preferably Linker 2 (GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID: 73) ) ;

[0696] Third chain: VL1 (targeting TAA) , CL;

[0697] Fourth chain: VL1 (targeting TAA) , CL.

[0698] Preparation of anti-4-1BB / DLL3 / CD3 trispecific antibodies

[0699] Based on the structures described above and shown in FIGs. 10A-10D, anti-4-1BB antibodies (e.g., 5F5, 5B2, 9A8) , anti-CD3 antibodies (e.g., humanized SP34 (hSP34) ) , and anti-DLL3 antibodies (e.g., 2A2, 2BL2, 2984) were used to construct anti-4-1BB / DLL3 / CD3 trispecific antibodies.

[0700] For the names of the anti-4-1BB / DLL3 / CD3 trispecific antibodies, when 2A2, hSP34 and different anti-4-1BB antibodies were used to construct anti-4-1BB / DLL3 / CD3 trispecific antibodies, the name of anti-4-1BB antibody is added directly after the structure name. For example, if 5F5 is used in Tri-Format-A structure, it is named as Tri-Format-A-5F5. As another example, if 9A8 is used in Tri-Format-A structure, it is named as Tri-Format-A-9A8. Exemplary amino acid sequences of the first, second, third and fourth chains of anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies are shown in FIG. 5.

[0701] Vectors encoding the first, second, third and fourth chains of the trispecific antibody (e.g. Tri-Format-A-5F5, Tri-Format-B-5F5, Tri-Format-C-5F5, Tri-Format-D-5F5, Tri-Format-A-5B2, Tri-Format-B-5B2, Tri-Format-C-5B2, Tri-Format-D-5B2, Tri-Format-A-9A8, Tri-Format-B-9A8, Tri-Format-C-9A8, Tri-Format-D-9A8) were made and transfected into CHO-S cells. After culture, the cell supernatant was collected and purified by Protein A affinity chromatography.

[0702] For comparison purposes, two different reference antibodies that specifically bind to DLL3 and CD3, synthesized from published amino acid sequence information, were used in the following experiments (designated Ref3 and Ref4) . Specifically, Ref3 contains two chains, the sequences of Ref3 first chain and the second chain were set forth in SEQ ID NO: 65 and SEQ ID NO: 82. Ref4 contains three chains, the sequences of Ref4 first, second and third chains were set forth in SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 66, and SEQ ID NO: 52. The structure of Ref3 is shown in FIG. 8B, and the structure of Ref4 is shown in FIG. 8E.

[0703] Preparation of trispecific antibodies associated with other tumor-associated antigens

[0704] Based on the structures shown in FIGs. 10A-10D, an anti-Claudin18.2 antibody or an anti-CDH17 antibody was used to construct anti-4-1BB / Claudin18.2 / CD3 trispecific antibodies or 4-1BB / CDH17 / CD3 trispecific antibodies with anti-CD3 antibody SP34 (hSP34) , and anti-4-1BB antibody 5F5, respectively.

[0705] For the names of the anti-4-1BB / Claudin18.2 / CD3 antibodies and anti-4-1BB / CDH17 / CD3 antibodies, the TAA target is added directly after the structure name. For example, if the Claudin18.2 antibody is used in Tri-Format-A structure, it is named as Tri-Format-A-Claudin18.2, if the Claudin18.2 antibody is used in Tri-Format-B structure, it is named as Tri-Format-B-Claudin18.2. For another example, if the CDH17 antibody is used in Tri-Format-Astructure, it is named as Tri-Format-A-CDH17.

[0706] Structural validation of trispecific antibodies

[0707] The position of anti-CD3 antibody

[0708] FIG. 8D and FIG. 8E demonstrate two different Claudin18.2 / CD3 bispecific antibody structures, based on which two types of anti-Claudin18.2 / CD3 bispecific antibodies were prepared using anti-CD3 antibody hSP34 and the anti-Claudin18.2 antibody. These two anti-Claudin18.2 / CD3 bispecific antibodies were named as BsAb-A-1 and BsAb-B-1 respectively.

[0709] The binding activity of the two anti-Claudin18.2 / CD3 bispecific antibodies to Jurkat cells were analyzed using Jurkat-Luc-IL2 (Promega, J1631) . Specifically, Jurkat-Luc-IL2 cells were seeded in a 96-well plate. Serially diluted anti-Claudin18.2 / CD3 bispecific antibodies were added to corresponding wells. The binding of anti-Claudin18.2 / CD3 bispecific antibodies to Jurkat-Luc-IL2 was detected by FACS.

[0710] The test results are shown in FIG. 11A. The results indicated that the structure of BsAb-B could create steric hindrance, significantly reducing the binding activity of anti-CD3 antibody to CD3.

[0711] In another similar experiment, the binding activity of the anti-4-1BB / Claudin18.2 / CD3 trispecific antibodies to Jurkat cells were analyzed using Jurkat-Luc-IL2 cells. The test results are shown in FIG. 11B. Three different structures of anti-4-1BB / Claudin18.2 / CD3 trispecific antibodies significantly reduced the binding activity of anti-CD3 antibody to CD3, whereas the control antibody Ref6 demonstrates strong binding activity to CD3.

[0712] Ref6 is an anti-Claudin18.2 / CD3 bispecific antibody whose structures is shown in FIG. 8B. Specifically, the first chain sequence and second chain sequence of Ref6 are set forth in SEQ ID NO: 78 and SEQ ID NO: 79, respectively.

[0713] Example 14. Binding activity of anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies

[0714] The binding activity of anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies to different cell lines were verified by flow cytometry. Briefly, Jurkat cells (CD3+) , SHP-77 cells (DLL3+) , or CHO-h41BB (4-1BB+) cells were plated in a 96-well plate at a density of 1 × 105 cells / well, respectively. Serially diluted anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies were added to corresponding wells, and incubated at 4℃ for 30 minutes. After washing with PBS, the cells were incubated with the secondary antibody Alexa  647 anti-human IgG Fcγ (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Cat#: 109-606-170) at 4℃ for 15 minutes. The cells were collected and tested by flow cytometry analysis. CHO-h41BB cells were obtained by transfecting CHO-S cells with vectors expressing human 4-1BB (SEQ ID NO: 74) .

[0715] The results are shown in the FIGs. 12A-12C. The anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies exhibited good DLL3 and 4-1BB binding activities. The anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies exhibited lower CD3 binding activities as compared to Ref3. The lower CD3 binding activities can help avoid excessive cytokine release and / or T-cell exhaustion.

[0716] Example 15. Activation effects of anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies in reporter cell line

[0717] The experiment was performed to test the T cell activation effects of anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies. Jurkat-luc-NFAT cells (Promega, Cat#: J1601) at a density of 5 × 104 cells / well and SHP-77 cells (expressing human hFcγRIIB) at a density of 5 × 104 cells / well were seeded in a 96-well plate. Serially diluted anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies (highest concentration at 200 nM) were added to corresponding wells. The above 96-well plate was incubated in a 37℃ incubator for 6 hours. After the incubation, Bio-GloTM Luciferase Assay system (vazyme, cat#: DD1201-02) was added to incubate at room temperature in the dark for 5 minutes. The plate was then placed in a luminescence detector to detect the fluorescence signal and the EC50 value was calculated.

[0718] The test results are shown in the table below. Tri-Format-A-5F5, Tri-Format-B-5F5, and Tri-Format-C-5F5 all exhibited good T cell activation effects.

[0719] Table 11

[0720] Example 16. Anti-4-1BB / TAA / CD3 antibodies mediated killing activities and cytokine release

[0721] The anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies mediated T cell killing activities against tumor cells were evaluated at an effector-to-target ratio (E: T) of 5: 1. Specifically, 2 μM CellTraceTM Violet reagent (Invitrogen, Cat#: C34557) were added to SHP-77 cells and incubated at room temperature in the dark for 20 minutes. After washing, SHP-77 cells at a density of 1 × 104 cells / well were seeded in a 96-well plate. PBMC cells (from volunteer donation) at a density of 5 × 104 cells / well and serially diluted anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies were added to a 96-well plate respectively. After incubation for 48 h, the plate was centrifuged for 5 minutes. The culture supernatant was collected to detect cytokines (e.g. IFN-γ) release by ELISA, and 100 μL eBioscienceTM Fixable Viability Dye eFluorTM 780 (Invitrogen, Cat#: 65-0865-14) was added to the corresponding well and incubated at 2-8℃ in the dark for 30 minutes. After washing, the cells were measured by FACS. The cytotoxicity percentage were used to generate a fitting curve with respect to the antibody concentrations. The EC50 value was determined.

[0722] The IFN-γ levels are shown in FIG. 13A. All of Tri-Format-A-5F5, Tri-Format-B-5F5, and Tri-Format-C-5F5 could promote IFN-γ release in a dose-dependent manner.

[0723] The cytotoxicity results are shown in the table below. Tri-Format-A-5F5, Tri-Format-B-5F5, and Tri-Format-C-5F5 all exhibited better tumor cell killing activity than that of the positive control Ref4.

[0724] Table 12

[0725] In another similar experiments, the anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies mediated T cell killing activities against tumor cells were evaluated at an E: T of 3: 1 (SHP-77 cells at a density of 1 × 104 cells / well and PBMC cells at a density of 3 × 104 cells / well) . The culture supernatant was collected to detect cytokines (e.g. IFN-γ, IL-6, IL-10, TNF-α) release by ELISA, and the cells were measured by FACS.

[0726] The IFN-γ, IL-6, IL-10 and TNF-α levels are shown in FIGs. 13B-13E. Tri-Format-B-5F5 and Tri-Format-C-5F5 could promote IFN-γ, IL-6, IL-10 and TNF-α release in a dose-dependent manner.

[0727] The cytotoxicity results are shown in the table below. Tri-Format-B-5F5 and Tri-Format-C-5F5 still exhibited better tumor cell killing activity than that of the positive controls Ref3 and Ref4.

[0728] Table 13

[0729] In another similar experiments, the anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies mediated T cell killing activities against tumor cells were evaluated at an E: T of 1: 2 (SHP-77 cells at a density of 5 × 103 cells / well and PBMC cells at a density of 2.5 × 103 cells / well) . The cells were measured by FACS.

[0730] The test results are shown in the table below. Tri-Format-B-5F5 and Tri-Format-C-5F5 still exhibited tumor cell killing activity at an E: T of 1: 2, with the positive control didn’ t exhibit tumor cell killing activity.

[0731] Table 14 “ / ” mean negative

[0732] In another similar experiments, the anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibody Tri-Format-B-5F5 mediated T cell killing activity against tumor cells was evaluated at an E: T of 1: 1 (SHP-77 cells at a density of 5 ×103 cells / well and PBMC cells at a density of 5 × 103 cells / well) . The cells were measured by FACS.

[0733] The results showed that Tri-Format-B-5F5 exhibited better tumor cell killing activity than the positive controls Ref3 and Ref4, with EC50 of 0.5609 nM for Tri-Format-B-5F5, 0.9762 nM for Ref3, and 1.8940 nM for Ref4.

[0734] In addition, the cells also were incubated with an anti-Bcl-xL antibody (abcam, Cat#: ab208747) to detect the expression of anti-apoptotic protein on T cells surface. After incubation, the cells were measured by FACS.

[0735] The test results are shown in FIG. 14. The anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies promoted the expression of anti-apoptotic protein on T cells surface. Compared with Ref3 and Ref4, Tri-Format-B-5F5 and Tri-Format-C-5F5 had an additional anti-4-1BB domain, which can enhance the anti-apoptosis ability of the T cells.

[0736] In another experiment, the anti-4-1BB / Claudin18.2 / CD3 antibodies mediated T cell killing activities against tumor cells (NUGC-4) were evaluated at an effector-to-target ratio (E: T) of 5: 1. The cytokines (e.g. IL-2) release was detected by ELISA, and the cytotoxicity was determined by FACS.

[0737] The IL-2 levels are shown in FIG. 15A. Both Tri-Format-A-Claudin18.2 and Tri-Format-C-Claudin18.2 could promote IL-2 release in a dose-dependent manner.

[0738] The cytotoxicity results are shown in the table below. Tri-Format-A-Claudin18.2 and Tri-Format-C-Claudin18.2 exhibited better tumor cell killing activity than that of the positive controls Ref6 and BsAb-B-1.

[0739] Table 15

[0740] In another experiment, anti-4-1BB / CDH17 / CD3 antibodies mediated T cell killing activities against tumor cells (SNU-5) were evaluated at an effector-to-target ratio (E: T) of 5: 1. The cytokines (e.g. IL-2, IFN-γ) release was detected by ELISA, and the cytotoxicity was determined by FACS.

[0741] The IL-2 and IFN-γ levels were shown in FIGs. 15B-15C. All of Tri-Format-A-CDH17, Tri-Format-B-CDH17, and Tri-Format-C-CDH17 could promote IL-2 and IFN-γ release in a dose-dependent manner.

[0742] The cytotoxicity results are shown in the table below. Tri-Format-A-CDH17, Tri-Format-B-CDH17, and Tri-Format-C-CDH17 exhibited better tumor cell killing activity than that of the positive controls Ref7 and Ref8.

[0743] Table 16

[0744] Ref7 is an anti-CDH17 / CD3 bispecific antibody with structures as shown in FIG. 8C. Specifically, the heavy chain sequence and light chain sequence of Ref7 are set forth in SEQ ID NO: 80 and SEQ ID NO: 81, respectively. Based on the structures shown in FIG. 8E, Ref8 was constructed using the anti-CDH17 antibody and anti-CD3 antibody hSP34.

[0745] Example 17. Anti-tumor activity in SHP-77 xenograft model

[0746] About 5 × 106 lung cancer cells SHP-77 were injected subcutaneously in B-NDG mice (Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd., Cat#: B-CM-002) . When the tumor volume reached about 80-120 mm3, the mice were randomly placed into different groups based on tumor size. About 5 ×105 human PBMC were injected into the tumor. The mice were then injected with PBS, 1.6mg / kg Ref3, Tri-Format-B-5F5, or Tri-Format-C-5F5 by intravenous (i. v. ) administration on the day of group assignment (Day 0) .

[0747] The tumor volume of mice in different groups were measured on day 20. The tumor volume was calculated as 0.5 × (long axis) × (short axis) 2. The blood of mice in different groups were collected on Day 6 and Day 21, and the CXCL10 level in the blood on Day 6 and the number of CD3+ cells in the blood on Day 21 were measured, respectively.

[0748] The tumor volume of mice is shown in FIG. 16. The number of CD3+ cells of per microliter blood is shown in FIG. 17. The results indicated that Tri-Format-B-5F5 and Tri-Format-C-5F5 exhibited comparable tumor inhibitory effect comparing to that of the positive control Ref3, but Tri-Format-B-5F5 and Tri-Format-C-5F5 exhibited better T cell proliferation activity, whereas the positive control Ref3 showed T cell exhaustion. The CXCL10 level is shown in FIG. 18. The result indicated that Tri-Format-B-5F5 and Tri-Format-C-5F5 exhibited better ability to promote CXCL10 release, thereby facilitating T cell recruitment.

[0749] In another similar experiment, SHP-77 xenograft model mice were injected with different concentrations of Tri-Format-B-5F5 or Ref3 by intraperitoneal (i. p. ) administration. Human IgG1 was used as an isotype control (ISO) . The tumor volumes were measured twice a week, and the number of CD4+ T cells and CD8+ T cells in the blood on Day 21 were measured respectively.

[0750] As shown in FIG. 19, Tri-Format-B-5F5 exhibited dose-dependent tumor inhibition, with Ref3 demonstrating similar efficacy (data not shown) . However, regarding T cell analysis (FIGs. 23A-23B) , Tri-Format-B-5F5 promoted T cell proliferation in a dose-dependent manner without inducing apoptosis. In contrast, Ref3 did not show this proliferative trend and instead led to T cell exhaustion.

[0751] In another experiment, about 5 × 106 lung cancer cells SHP-77 were injected subcutaneously in B-NDG mice. When the tumor volume reached about 150-200 mm3, the mice were randomly placed into different groups based on tumor size. About 5 × 105 human PBMC were injected into the tumor. The mice were then injected with PBS, 0.18 mg / kg Ref4, 0.2 mg / kg Tri-Format-B-5F5 by i. v. administration on Day 0, Day 4 and Day 7.

[0752] The tumor volume of mice in different groups were measured twice a week. The results indicated that Tri-Format-B-5F5 exhibited better tumor-inhibiting effect than Ref4.

[0753] The blood of mice in different groups were collected on Day 11. The number of CD4+ T cells and CD8+ T cells in the blood and the tumor were measured respectively. As shown in FIGs. 24A-24D, Tri-Format-B-5F5 can potently induce T cell proliferation.

[0754] Example 18. Structural exploration of trispecific antibody

[0755] In experiments similar to what is described above in Example 16, PBMC cells and DLL3-tumor cells were co-incubation for 48h at an effector-to-target ratio (E: T) of 5: 1. The cytokines (e.g. IL-2, IFN-γ) release was detected by ELISA.

[0756] The IL-2 and IFN-γ levels are shown in FIGs. 20A-20B. The results showed that Tri-Format-Astructure could induce non-specific cytokine release in the absence of DLL3 positive cells.

[0757] Similar experiments were performed using different structures of anti-4-1BB / Claudin18.2 / CD3 antibodies and anti-4-1BB / CDH17 / CD3 antibodies. The results, shown in FIGs. 20C-20E, showed that the Tri-Format-Astructure could induce non-specific cytokine release in the absence of Claudin18.2 positive cells or CDH17 positive cells.

[0758] Example 19. Antibody Drug Conjugate

[0759] Each purified anti-DLL3 antibody (2A2, 2BL2, 2984) was coupled with CPT-1, CPT-2, CPT-3, or CPT-4, through CPT-L linker. For the names of the ADCs, CPTx is added directly after the antibody name. For example, if 2A2 is coupled to CPT-1, it is named as 2A2-CPT1. For another example, if 2A2 is coupled to CPT-2, it is named as 2A2-CPT2. MS (Mass Spectrometry) was used to detect the coupling of antibodies with drug molecules. The MS detection results showed that the DAR of the ADCs was about 8.

[0760] Example 20. Anti-Tumor Activity in NCI-H69 xenograft model

[0761] The ADCs were tested for their effects on tumor growth in vivo in a model of lung cancer. About 2×106 human small cell lung cancer cells NCI-H69 were injected subcutaneously in B-NDG mice (Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd., Cat#B-CM-002) . When the tumor volume reached about 200-300 mm3, the mice were randomly placed into different groups based on the tumor volume (5 mice per group) on Day 0 (the day of grouping) . The mice were then injected with PBS (G1) , 2A2-CPT2 (G2) , or 2BL2-CPT2 (G3) by intravenous (i. v. ) administration. The frequency of administration was once a week, and 2 administrations in total (Day 0 and Day 7) .

[0762] The tumor size in groups treated with the ADC are shown in FIG. 21, in which the tumor volumes in the treatment groups (G2 and G3) were smaller than that of the control group (G1) . 2A2-CPT2 and 2BL2-CPT2 treatment groups exhibited significant tumor suppression effects with TGI%of 92.3%and 80.3%on Day 21, respectively.

[0763] Example 21. Anti-Tumor Activity in SHP77 xenograft model

[0764] About 1×106 human small cell lung cancer cells SHP77 were injected subcutaneously in B-NDG mice. When the tumor volume reached about 200-300 mm3, the mice were randomly placed into different groups (Day 0) . The mice were then injected with PBS (G1) , 2A2-CPT2 (G2) , or 2BL2-CPT2 (G3) at a dose level of 3 mg / kg by i. v. administration. The frequency of administration was once a week (2 administrations in total) . The tumor volume of mice in different groups treated with the ADCs or PBS are shown in FIG. 22. Compared with the control group (G1) , 2A2-CPT2 (G2) and 2BL2-CPT2 (G3) both exhibited better tumor inhibitory effect, with a TGI%of 106.5%and 95.4%on Day 23, respectively.

[0765] Example 22. Anti-Tumor Activity in NCI‐H889 xenograft model

[0766] The antibodies were tested for their effects on tumor growth in vivo in a model of lung cancer. About 2×106 human small cell lung cancer cells NCI‐H889 were injected subcutaneously in B-NDG mice. When the tumor volume reached about 80-120 mm3, the mice were randomly placed into different groups based on tumor size. About 5 × 105 human PBMC were injected into the tumor. The mice were then injected with PBS (G1) , 4 mg / kg Tri-Format-B-5F5 (G2) , or 5.5 mg / kg Tri-Format-D-5F5 (G3) by i.p. administration. The tumor volumes were measured twice a week. As shown in FIG. 25, Tri-Format-B-5F5 and Tri-Format-D-5F5 showed significant tumor inhibitory effects, with a TGI%of 103.9%and 76.5%on Day 21, respectively.

[0767] Example 23. T cell function maintenance assay

[0768] PBMC cells were seeded into a 24-well flat plate at a density of 5 × 105 cells per well. The plate was pre-coated with DLL3 protein (ACRO Biosystems Inc., Cat#: DL3-H52H4) . Subsequently, the seeded PBMCs were co-incubated respectively with Tri-Format-B-5F5, reference antibodies Ref3 or Ref4, and cultured at 37 ℃, 5%CO2, saturated humidity.

[0769] For each subsequent round of stimulation (2-3‐day intervals) , PBMCs were harvested from the co-culture system by centrifugation, and viable cells were counted. The harvested PBMCs were re-seeded into fresh pre-coated wells, and re-stimulated with the corresponding antibodies at a final concentration of 5 nM for the next round of culture and functional assessment. The PBMCs cell viability was detected after each stimulation (Stim2, Stim3, Stim4) via a microplate reader. After the fourth round of stimulation, Ref3 and Ref4 groups had insufficient viable cells for continued stimulation (FIG. 26) . FACS analysis further confirmed that the Tri-Format-B-5F5 treatment group maintained significantly higher cytotoxicity levels (FIG. 27) , demonstrating that Tri-Format-B-5F5 preserves T cell effector function and potent anti-tumor activity even after repeated stimulation.

[0770] Example 24. In vivo toxicity testing of anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies

[0771] The in vivo toxicity of anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibodies were tested in B-hCD3E / h4-1BB mice (Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd., Cat#: 121281) . Specifically, the mice were placed into five groups (5 mice per group) , and administered with PBS (G1) , 1.5 mg / kg Tri-Format-A-5F5 (G2) , or Tri-Format-B-5F5 at doses of 1.0 mg / kg (G3) , 10 mg / kg (G4) , or 50 mg / kg (G5) by intravenous (i. v. ) injection on Day 0, Day 3, Day 7 and Day 10.

[0772] The body weight of the mice was monitored during the entire treatment period. As shown in FIG. 28, the body weight in different groups all increased at the end of the experiment, indicating that Tri-Format-5F5A and Tri-Format-B-5F5 were well tolerated by mice.

[0773] Four hours post-initial injection, the cytokines (including IL-2, IFN-γ, and IL-6) release was detected by ELISA. As shown in FIGs. 29A-29C, the Tri-Format-B-5F5 treatment groups exhibited lower level of cytokine release.

[0774] In another similar experiment, the in vivo toxicity of anti-4-1BB / DLL3 / CD3 antibody was tested in cynomolgus monkeys. Specifically, two monkeys were administered with 10 mg / kg Tri-Format-B-5F5 by i. v. injection on Day 1, Day 8, Day 15 and Day 22. No drug-related changes were observed in clinical signs, body weight, food consumption, body temperature, cardiovascular measurements, or macroscopic tissue examinations. Additionally, serum cytokine levels (including IL-6, IL-2, TNF-a, IFN-g, IL-10, IL-4 and MCP-1) were monitored at multiple time points. Throughout the study, all serum levels of cytokines remained low or below the limit of quantification (LOQ) , with only a transient increase in serum MCP-1 observed, confirming the systemic safety of Tri-Format-B-5F5.

[0775] Example 25. Pharmacokinetic Profiles

[0776] The pharmacokinetic clearance rate of Tri-Format-B-5F5 was evaluated in B-hFcRn mice (Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd., Cat#: 110001) . Specifically, the mice were placed into two groups and administered with 3 mg / kg or 10 mg / kg Tri-Format-B-5F5 by intravenous injection. Blood samples were collected at different time points.

[0777] The serum levels of antibodies were determined by sandwich ELISA. Briefly, Goat Anti-Human IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Inc., Cat#: 109-005-088) was diluted to a final concentration of 2000 ng / mL, added to a 96-well plate at 100 μL / well, and then incubated overnight at 2-8 ℃. After the incubation, the plate was washed with PBS-T buffer (PBS supplemented with TweenTM 20) for 4 times. Antibody-unbound areas were blocked with 2%BSA (bovine serum albumin) for 2 hours at 37 ℃. After washing, 100 μL of sample was added to each well. The wells were sealed and incubated at 37 ℃ for 1 hour. After washing, Peroxidase AffiniPure F (ab') 2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Jackson ImmunoResearch Inc., Cat#: 109-036-098) was added at 100 μL / well to corresponding wells, and incubated at 37 ℃ for 1 hour. After washing, tetramethylbenzidine (TMB) solution was added ...

Claims

1.An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to 4-1BB (CD137, tumor necrosis factor receptor superfamily 9) , comprising:a heavy chain single variable domain (VHH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, wherein the VHH CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR1 amino acid sequence, the VHH CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR2 amino acid sequence, and the VHH CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR3 amino acid sequence;wherein the selected VHH CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:(1) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(2) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively;(3) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively;(4) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively;(5) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively; and(6) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively.2.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively.3.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively.4.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively.5.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively.6.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively.7.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1, wherein the VHH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively.8.An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to 4-1BB comprisinga heavy chain single variable region (VHH) comprising an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH sequence, wherein the selected VHH sequence is one of the following:(1) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 43;(2) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 44; and(3) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 45.9.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 8, wherein the VHH comprises the sequence of SEQ ID NO: 43.10.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 8, wherein the VHH comprises the sequence of SEQ ID NO: 44.11.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 8, wherein the VHH comprises the sequence of SEQ ID NO: 45.12.An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to 4-1BB comprisinga heavy chain single variable region (VHH) comprising VHH CDR1, VHH CDR2, and VHH CDR3 that are identical to VHH CDR1, VHH CDR2, and VHH CDR3 of a selected VHH sequence, wherein the selected VHH sequence is one of the following:(1) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 43;(2) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 44; and(3) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 45.13.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-12, wherein the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to human 4-1BB and / or monkey 4-1BB.14.An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to DLL3, comprising:a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, wherein the VH CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VH CDR1 amino acid sequence, the VH CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VH CDR2 amino acid sequence, and the VH CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VH CDR3 amino acid sequence; anda light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VL CDR1 amino acid sequence, the VL CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to a selected VL CDR2 amino acid sequence, and the VL CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VL CDR3 amino acid sequence,wherein the selected VH CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences and the selected VL CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:(1) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively;(2) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively;(3) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 83-85, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively;(4) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 89-91, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively;(5) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 86-88, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively; and(6) the selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 92-94, respectively, and the selected VL CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively.15.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 14, wherein the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, according to Kabat definition.16.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 14, wherein the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 83-85, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, according to Kabat definition.17.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 14, wherein the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 86-88, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, according to Kabat definition.18.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 14, wherein the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, according to Chothia definition.19.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 14, wherein the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 89-91, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, according to Chothia definition.20.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 14, wherein the VH comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 92-94, respectively, and the VL comprises CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, according to Chothia definition.21.An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to DLL3 comprising a heavy chain variable region (VH) comprising an amino acid sequence that is at least 90%identical to a selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) comprising an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VL sequence, wherein the selected VH sequence and the selected VL sequence are one of the following:(1) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 46, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47;(2) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 95, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47; and(3) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 96, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47.22.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 21, wherein the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 46 and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 47.23.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 21, wherein the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 95 and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 47.24.The antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 21, wherein the VH comprises the sequence of SEQ ID NO: 96 and the VL comprises the sequence of SEQ ID NO: 47.25.An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to DLL3 comprisinga heavy chain variable region (VH) comprising VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 that are identical to VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 of a selected VH sequence; and a light chain variable region (VL) comprising VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 that are identical to VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 of a selected VL sequence, wherein the selected VH sequence and the selected VL sequence are one of the following:(1) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 46, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47;(2) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 95, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47; and(3) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 96, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 47.26.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 14-25, wherein the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to human DLL3, monkey DLL3, mouse DLL3, and / or canine DLL3.27.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-26, wherein the antibody or antigen-binding fragment is a human or humanized antibody or antigen-binding fragment thereof.28.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-27, wherein the antibody or antigen-binding fragment is a multi-specific antibody (e.g., a trispecific antibody) .29.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-28, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises a human IgG Fc (e.g., a human IgG1 Fc) .30.The antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-29, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises two or more heavy chain single variable domains.31.A nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof any one of claims 1-30.32.The nucleic acid of claim 31, wherein the nucleic acid is cDNA.33.An antigen-binding protein construct, comprising: a first antigen-binding domain that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) , a second antigen-binding domain that specifically binds to DLL3, and a third antigen-binding domain that specifically binds to CD3.34.The antigen-binding protein construct of claim 33, wherein the first antigen-binding domain comprises a single-domain antibody variable domain (VHH) ; the second antigen-binding domain comprises a first heavy chain variable region (VH1) and a first light chain variable region (VL1) ; and the third antigen-binding domain comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .35.An antigen-binding protein construct, comprising(a) a Fc;(b) a Fab fragment (Fab) that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) ;(c) a single-chain variable fragment (scFv) that specifically binds to CD3; and(d) a single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to 4-1BB, wherein the Fab is linked to the N-terminus of the scFv, which is in turn linked to the N-terminus of the Fc, and the VHH is linked to the C-terminus of the Fc, wherein the Fab comprises a first heavy chain variable region (VH1) and a first light chain variable region (VL1) , and the scFv comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .36.The antigen-binding protein construct of claim 35, wherein the Fc comprises a first part and a second part, and antigen-binding protein construct comprises(1) the VHH and a first part of the Fc are arranged in tandem, and the Fab, the scFv, and a second part of the Fc are arranged in tandem from N-terminus to C-terminus; or(2) the Fab, the scFv, the Fc, and the VHH are arranged in tandem from N-terminus to C-terminus.37.The antigen-binding protein construct of claim 35, wherein the Fc comprises a first part and a second part, and the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, and a third chain, wherein:(1) the first chain comprises, from N-terminus to C-terminus, a first part of the Fc, the VHH;(2) the second chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, VH2, VL2, a second part of the Fc; and(3) the third chain comprises VL1.38.The antigen-binding protein construct of claim 35, wherein the Fc comprises a first part and a second part, and the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, and a third chain, wherein:(1) the first chain comprises a first part of the Fc;(2) the second chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VH1, VH2, VL2, a second part of the Fc, the VHH; and(3) the third chain comprises VL1.39.The antigen-binding protein construct of any one of claims 36-38, wherein the first part of the Fc and the second part of the Fc comprise the same amino acid sequence or different amino acid sequences.40.The antigen-binding protein construct of claim 39, wherein the first part of the Fc and the second part of the Fc comprise the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 69-71.41.An antigen-binding protein construct, comprising:(a) a first polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first CH2 domain, a first CH3 domain, and a single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to 4-1BB;(b) a second polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first heavy chain variable region (VH1) , a single-chain variable fragment (scFv) that specifically binds to CD3, a second CH2 domain, and a second CH3 domain; and(c) a third polypeptide comprising a first light chain variable region (VL1) ,wherein the VH1 and the VL1 associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) , and the scFv comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .42.An antigen-binding protein construct, comprising:(a) a first polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first CH2 domain, a first CH3 domain;(b) a second polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first heavy chain variable region (VH1) , a single-chain variable fragment (scFv) that specifically binds to CD3, a second CH2 domain, a second CH3 domain, and a single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to 4-1BB; and(c) a third polypeptide comprising a first light chain variable region (VL1) ,wherein the VH1 and the VL1 associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) , and the scFv comprises a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) .43.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-42, whereinthe VHH comprises complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, wherein the VHH CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR1 amino acid sequence, the VHH CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR2 amino acid sequence, and the VHH CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH CDR3 amino acid sequence,wherein the selected VHH CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:(1) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively;(2) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively;(3) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively;(4) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively;(5) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively; and(6) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively.44.The antigen-binding protein construct of any one of claims 33-43, wherein the TAA is selected from the group consisting of DLL3, Claudin18.2, CDH17, cluster of differentiate 20 (CD20) , carcinoembryonic antigen (CEA) , prostate-specific antigen (PSA) , prostate stem cell antigen (PSCA) , programmed death-ligand 1 (PD-L1) , human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) , human epidermal growth factor receptor 3 (Her3) , human epidermal growth factor receptor (Her1) , β-Catenin, cluster of differentiate 19 (CD19) , epidermal growth factor receptor (EGFR) , tyrosine-protein kinase Met (c-Met) , epithelial cell adhesion molecule (EPCAM) , prostate-specific membrane antigen (PSMA) , cluster of differentiate 40 (CD40) , Mucin 1, Cell Surface Associated (MUC1) , insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) , and carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 6 (CEA-CAM6) .45.The antigen-binding protein construct of claim 44, wherein the TAA is selected from the group consisting of DLL3, Claudin18.2, and CDH17.46.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-45, wherein:(1) the VH1 comprises CDRs 1, 2, and 3, wherein the VH1 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH1 CDR1 amino acid sequence, the VH1 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH1 CDR2 amino acid sequence, and the VH1 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH1 CDR3 amino acid sequence; andthe VL1 comprises CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL1 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL1 CDR1 amino acid sequence, the VL1 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL1 CDR2 amino acid sequence, and the VL1 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL1 CDR3 amino acid sequence,wherein the selected VH1 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences, the selected VL1 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:(1) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively;(2) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively;(3) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 83-85, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively;(4) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 89-91, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively;(5) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 86-88, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively; and(6) the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 92-94, respectively, and the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively.47.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-46, wherein:the VH2 comprises CDRs 1, 2, and 3, wherein the VH2 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH2 CDR1 amino acid sequence, the VH2 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH2 CDR2 amino acid sequence, and the VH2 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VH2 CDR3 amino acid sequence; andthe VL2 comprises CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL2 CDR1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL2 CDR1 amino acid sequence, the VL2 CDR2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL2 CDR2 amino acid sequence, and the VL2 CDR3 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%or 100%identical to a selected VL2 CDR3 amino acid sequence,wherein the selected VH2 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences, and the selected VL2 CDRs 1, 2, and 3 amino acid sequences are one of the following:(1) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively; and(2) the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively.48.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-47, wherein(1) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;(2) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;(3) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;(4) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;(5) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 7-9, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;(6) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 19-21, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;(7) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 83-85, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;(8) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 89-91, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;(9) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 83-85, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;(10) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 89-91, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;(11) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 83-85, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;(12) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 89-91, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;(13) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 1-3, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 86-88, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;(14) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 4-6, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 92-94, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;(15) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 31-33, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 86-88, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively;(16) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 34-36, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 92-94, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively;(17) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 37-39, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 86-88, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 10-12, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 13-15, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 16-18, respectively; or(18) the selected VHH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 40-42, respectively, the selected VH1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 92-94, respectively, the selected VL1 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 22-24, respectively, the selected VH2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 25-27, respectively, and the selected VL2 CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are set forth in SEQ ID NOs: 28-30, respectively.49.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-48, wherein the VHH comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected VHH sequence, wherein the selected VHH sequence is one of the following:(1) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 43;(2) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 44; and(3) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 45.50.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-49, wherein the VH1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 46, 95, and 96; and the VL1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 47.51.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-50, wherein the VH2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 48; and the VL2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 49.52.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-51, wherein the VHH comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 43; the VH1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 46, 95, and 96; the VL1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 47; the VH2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 48; and the VL2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 49.53.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-51, wherein the VHH comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 44; the VH1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 46, 95, and 96; the VL1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 47; the VH2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 48; and the VL2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 49.54.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-51, wherein the VHH comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 45; the VH1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 46, 95, and 96; the VL1 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 47; the VH2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 48; and the VL2 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 49.55.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-54, wherein the VHH comprises VHH CDR1, VHH CDR2, and VHH CDR3 that are identical to VHH CDR1, VHH CDR2, and VHH CDR3 of a selected VHH sequence, wherein the selected VHH sequence is one of the following:(1) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 43;(2) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 44; and(3) the selected VHH sequences is SEQ ID NO: 45.56.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-55, wherein the VH1 comprises VH1 CDR1, VH1 CDR2, and VH1 CDR3 that are identical to VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 of any one of SEQ ID NOs: 46, 95, and 96; and the VL1 comprising VL1 CDR1, VL1 CDR2, and VL1 CDR3 that are identical to VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 of SEQ ID NO: 47.57.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-56, wherein the VH2 comprises VH2 CDR1, VH2 CDR2, and VH2 CDR3 that are identical to VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 of SEQ ID NO: 48; and the VL2 comprising VL2 CDR1, VL2 CDR2, and VL2 CDR3 that are identical to VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 of SEQ ID NO: 49.58.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-57, wherein the antigen-binding protein construct comprises a first chain, a second chain, and a third chain, wherein the first chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected first chain, the second chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected second chain, and the third chain comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to a selected third chain, wherein the selected first chain, second chain and third chain amino acid sequences are one of the following:(1) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 50, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;(2) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 53, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;(3) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 54, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 55, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;(4) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 56, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;(5) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 57, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;(6) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 54, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 58, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;(7) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 59, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52;(8) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 60, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 51, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52; and(9) the selected first chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 54, the selected second chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 61, and the selected third chain amino acid sequences is SEQ ID NO: 52.59.The antigen-binding protein construct of any one of claims 34-58, wherein the antigen-binding protein construct is a trispecific antibody.60.A vector comprising one or more of the nucleic acids of any one of claims 31-32, or a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-30, or a nucleic acid encoding the antigen-binding protein construct of any one of claims 33-59.61.A cell comprising the vector of claim 60.62.The cell of claim 61, wherein the cell is a CHO cell.63.A cell comprising one or more of the nucleic acids of any one of claims 31-32, or a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-30, or a nucleic acid encoding the antigen-binding protein construct of any one of claims 33-59.64.A method of producing an antibody or an antigen-binding fragment thereof, or an antigen-binding protein construct, the method comprising(a) culturing the cell of any one of claims 61-63 under conditions sufficient for the cell to produce the antibody or the antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct; and(b) collecting the antibody or the antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct produced by the cell.65.An antibody-drug conjugate (ADC) comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-30, or the antigen-binding protein construct of any one of claims 33-59, covalently bound to a therapeutic agent.66.The ADC of claim 65, wherein the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.67.A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and(a) the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-30,(b) the antigen-binding protein construct of any one of claims 33-59, or(c) the ADC of claim 65 or 66.68.A method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-30, the antigen-binding protein construct of any one of claims 33-59, the ADC of claim 65 or 66, or the pharmaceutical composition of claim 67, to the subject.69.The method of claim 68, wherein the subject has a solid tumor.70.The method of claim 68, wherein the cancer is breast cancer, oropharyngeal cancer, ovarian cancer, bladder cancer, colorectal cancer, pancreas cancer, B cell lymphoma, hepatocellular carcinoma, lung cancer, prostate cancer, melanoma, renal cancer, or Non-Hodgkin's lymphoma.71.The method of claim 68, wherein the cancer is pancreatic neuroendocrine tumor (PNET) , small-cell type neuroendocrine carcinoma (SCNEC) , large-cell type neuroendocrine carcinoma (LCNEC) , small cell lung cancer (SCLC) , large cell-neuroendocrine lung cancer, neuroendocrine prostate cancer (NEPC) , Merkel cell carcinoma, small cell urinary bladder cancer, GI neuroendocrine carcinoma, medullary thyroid carcinoma (MTC) , gastroenteropancreatic neuroendocrine carcinoma (GEP NEC) , neuroblastoma, glioma or glioblastoma (GBM) , melanoma, or medullary thyroid cancer.72.The method of any one of claims 68-71, wherein the subject is a human.73.The method of any one of claims 68-71, wherein the subject is a non-human animal.74.A method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprisingcontacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-30, the antigen-binding protein construct of any one of claims 33-59, the ADC of claim 65 or 66, or the pharmaceutical composition of claim 67.75.A method of killing a tumor cell, the method comprisingcontacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-30, the antigen-binding protein construct of any one of claims 33-59, the ADC of claim 65 or 66, or the pharmaceutical composition of claim 67.76.A method of increasing immune response in a subject, the method comprising administering to the subject an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-30, the antigen-binding protein construct of any one of claims 33-59, the ADC of claim 65 or 66, or the pharmaceutical composition of claim 67.

Images