Dihydropyrimidine-2,4(1h,3h)-dione-containing polycyclic derivatives and pharmaceutical composition thereof, preparation method thereof and use thereof

Abstract

The present disclosure relates to dihydropyrimidine-2,4(1H,3H)-dione-containing polycyclic compounds, or pharmaceutically acceptable salts thereof, and compositions thereof which are effective to reduce or modulate widely interspaced zinc finger motifs (WIZ) protein expression levels and / or induce fetal hemoglobin (HbF) expression, and also relates to methods of their preparation and their use in treatment of subjects in need.

Description

DIHYDROPYRIMIDINE-2, 4 (1H, 3H) -DIONE-CONTAINING POLYCYCLIC DERIVATIVES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION THEREOF, PREPARATION METHOD THEREOF AND USE THEREOFTECHNICAL FIELD

[0001] The present disclosure relates to medicinal chemistry, in particular, dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione-containing polycyclic compounds, or pharmaceutically acceptable salts thereof, and compositions thereof which are effective to reduce or modulate widely interspaced zinc finger motifs (WIZ) protein expression levels and / or induce fetal hemoglobin (HbF) expression, and also relates to methods of their preparation and their use in treatment of subjects in need.BACKGROUND

[0002] Sickle cell disease (SCD) is caused by the formation of a pathological sickle hemoglobin tetramer consisting of two α-globin chains and two abnormal β-globin chains (HbS) , in which the glutamic acid residue at position 6 is replaced by valine owing to a single base change, from adenine to thymine, in the β-globin gene (HBB) (Rees DC et al., Lancet 2010, 376: 2018-2031) . Polymerization of deoxygenated HbS causes abnormally shaped red blood cells, painful vaso-occlusive episodes, hemolytic anemia, end-organ damage, and early death resulting in high economic burden and poor quality of life (Martin B et al., Societal Burden of Sickle Cell Disease in the United Kingdom, 17th Annual Academy for Sickle Cell and Thalassemia (ASCAT) Conference, 2022, October 20-22) .

[0003] Increasing HbF levels in adult red blood cells provides considerable amelioration of the symptoms in SCD patients and a subset of β-Thalassemia patients (Grevet JD et al., Science 2018, 361: 285–290) . Hydroxyurea, an approved drug, is considered to achieve its benefit by enhancing the production of HbF. However, there is still limited data to support the long-term benefits of hydroxyurea for all SCD patients, particularly in preventing chronic complications of SCD (Nevitt SJ et al., Cochrane Database Syst Rev 2017, 4: CD002202) . As such, SCD patients are in urgent need of new treatment options to improve the quality of life and to reduce long-term health care costs (Piel FB et al., N Engl J Med 2017, 376: 1561-1573) .

[0004] The G9a methyltransferase is known to regulate HbF production by repressing the transcription of fetal γ-globin genes (Krivega, et al. Blood, 2015) . WIZ was reported to retain histone H3 lysine 9 methyltransferases G9a and GLP on chromatin to direct the deposition of H3K9me1 and H3K9me2, resulting in gene repression (Bian C et al., Elife 2015, 4: e05606) thereby, potentially contributing to the silencing of γ-globin genes. WIZ is a known neosubstrate of several CRBN-based molecular glue degraders including immunomodulatory (IMiD) drugs and CC-122 (Yu HH et al., bioRxiv 2019 (doi: https:  / / doi. org / 10.1101 / 595389) ; Hagner PR et al., Blood. 2015, 126: 779-789) . Recruitment of WIZ to the Cul4 / DDB1 / RBX1 / CRBN E3 ligase complex by these compounds results in ubiquitination and subsequent proteasomal degradation of WIZ via a mechanism commonly shared among IMiD substrates (Sievers, Q. L. et al. Science 2018, 362, eaat0572) . Therefore, WIZ degradation by molecular glues represents a promising therapeutic strategy in SCD and β-thalassemia by restoring γ-globin synthesis and HbF production.SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] The object of the present invention is to provide a new class of compounds which can reduce / modulate WIZ protein expression levels.

[0006] In the first aspect, it provides a compound having the structure of:

[0007] or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof.

[0008] In another preferred embodiment, the compound is selected from

[0009] In another preferred embodiment, the compound is

[0010] In another preferred embodiment, the compound is

[0011] In another preferred embodiment, the compound is

[0012] In another preferred embodiment, the compound is

[0013] In the second aspect, it provides a pharmaceutical composition comprising a compound of the first aspect of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0014] In another preferred embodiment, the pharmaceutical composition is a tablet, a capsule, a granule, a syrup, a suspension, a solution, a dispersion, a slowed release preparation for oral or non-oral administration, an intravenous injection preparation, a subcutaneous injection preparation, an inhalation preparation, a transdermal preparation, a rectal or vaginal suppository.

[0015] In another preferred embodiment, the pharmaceutical composition is an oral preparation.

[0016] In the third aspect, it provides a use of a compound of any one of the first aspect of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof in the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or disorder that is affected by the degradation of WIZ protein.

[0017] In another preferred embodiment, it provides a compound of the first aspect of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof, for use in the treatment of a disease or disorder affected by reactivating or increasing fetal hemoglobin expression in a subject in need thereof.

[0018] In the fourth aspect, it provides a method of inhibiting, reducing, or eliminating the activity of WIZ protein or WIZ protein expression in a subject in need thereof, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the compound of the first aspect of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof.

[0019] In another preferred embodiment, wherein a disease or disorder includes sickle cell anemia, and beta-thalassemia.

[0020] In the fourth aspect, it provides a method of treating a disease or disorder selected from sickle cell anemia, and beta-thalassemia in a subject in need thereof, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the compound of the first aspect of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereofDETAILED DESCRIPTION OF EMBODIMENTS

[0021] Active ingredient

[0022] As used herein, "the compound of the present invention" refers to the compound in the first aspect of the invention, and further comprises the pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof.

[0023] The salt of the compound in the present invention may be formed which is also within the scope of the present invention. Unless otherwise stated, the compound in the present invention is understood to include its salt. The term "salt" as used herein refers to a salt formed in the form of acid or base from inorganic or organic acid and base. Further, when the compound in the present invention contains a base fragment which includes, but is not limited to pyridine or imidazole, when contains an acid segment which includes, but is not limited to carboxylic acid. The zwitter-ion that may form "inner salt" is included within the range of the term "salt" . Pharmaceutically acceptable (i.e., non-toxic, physiologically acceptable) salt is preferred, although other salts are also useful and may be used, for example, in the separation or purification steps of the preparation process. The compound of the present invention may form a salt, for example, compound I is reacted with a certain amount (such as an equivalent amount) of an acid or base, and precipitated in a medium, or freeze-dried in aqueous solution.

[0024] The compounds in the present invention containing base fragments which include but are not limited to amines or pyridine or imidazole rings, may form salt with organic or inorganic acid. Typical acids that form salts include acetate (e.g., acetate or trihalogenated acetic acid, e.g., trifluoroacetic acid) , adipate, alginate, ascorbate, aspartate, benzoate, benzene sulfonate, disulfate, borate, butyrate, citrate, camphorate, camphor sulfonate, cyclopentane propionate, diethylene glycolate, lauryl sulfate, ethanesulphonate, fumarate, gluceptate, glycerophosphate, hemisulphate, enanthate, caproate, hydrochloride, hydrobromide, hydriodate, isethionate (e.g., 2-hydroxy-ethesulfonate) , lactate, maleate, mesylate, naphthalenesulfonate (e.g., 2-naphthalenesulfonate) , nicotinate, nitrate, oxalate, pectate, persulfate, phenylpropionate (e.g., 3-phenylpropionate) , phosphate, picrate, pivalate, propionate, salicylate, succinate, sulfate (e.g., formed with sulfuric acid) , sulfonate, tartrate, thiocyanate, toluenesulfonate (e.g., tosilate) , dodecanoate, etc.

[0025] Some compounds of the invention may contain acidic fragments including, but not limited to carboxylic acid may form salts with various organic or inorganic bases. Salts formed by typical bases includes ammonium salt, alkali metal salt (such as sodium, lithium and potassium salts) , alkaline earth metal salt (such as calcium and magnesium salts) , and salts formed by organic bases (e.g., organic amines) , such as benzathine, dicyclohexylamine, hydrabamine (salt formed with N, N-bis (dehydroabietyl) ethylenediamine) , N-methyl-D-glucanamine, N-methyl-D-glucoamide, tert-butyllamine, and the salts formed with amino acids such as arginine, lysine, etc. Basic nitrogen-containing groups can form quaternary ammonium salts with halides, such as small molecular alkyl halides (e.g., chlorides, bromides and iodides of methyl, ethyl, propyl and butyl) , dialkyl sulfates (such as dimethyl, diethyl, dibutyl, and dipentyl sulfates) , long chain halides (e.g., chlorides, bromides and iodides of decyl, dodecyl, tetradecyl, and tetradecyl) , aralkyl halides (such as bromides of benzyl and phenyl) , etc.

[0026] The prodrug and solvate of the compound in the present invention are also included within the scope of the present invention. The term "prodrug" herein refers to a compound resulting from the chemical transformation of a metabolic or chemical process to produce a compound, salt, or solvate in the present invention for the treatment of an associated disease. The compounds of the invention include solvates such as hydrates.

[0027] Compound, salt or solvate in the present invention, may be present in tautomeric forms such as amide and imino ether. All of these tautomers are part of the present invention.

[0028] Stereoisomers of all compounds (e.g., those asymmetric carbon atoms that may be present due to various substitutions) , including their enantiomeric forms and non-enantiomeric forms, all belong to the protection scope of the present invention. The independent stereoisomer in the present invention may not coexist with other isomers (e.g., as a pure or substantially pure optical isomer with special activity) , or may be a mixture (e.g., racemate) , or a mixture formed with all other stereoisomers or a part thereof. The chiral center of the present invention has two configurations of S or R, which is defined by International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) founded in 1974. The racemization form can be solved by physical methods, such as fractional crystallization, or separation crystallization by derivation into diastereomers, or separation by chiral column chromatography. Individual optical isomer can be obtained from racemate by appropriate methods, including but not limited to conventional methods, such as recrystallization after salting with optically active acids.

[0029] When a stereocenter is designated as “*R” or “*S” , it means that the absolute stereochemistry for such a stereocenter is undetermined (even if the bonds are drawn stereo specifically) although it is in a substantially single steric configuration. In other word, “*R” can be absolute R configuration, or absolute S configuration. Similarly, “*S” can be absolute R configuration, or absolute S configuration. “*R” or “*S” is assigned randomly for such molecules. A stereocenter designated as “*R” can be in a single steric configuration same as or different from that of another stereocenter designated as “*S” . A stereocenter designated as “*R” can be in a single steric configuration same as or different from that of another stereocenter designated as “*R” . A stereocenter designated as “*S” can be in a single steric configuration same as or different from that of another stereocenter designated as “*S” . When the absolute stereochemistry for a stereocenter is determined, *R or *Sis not designated.

[0030] For example, it will be clear that the absolute stereochemistry of Compound 1  is determined as a cis isomer and has one of the following structure formulae:  while the absolute stereochemistry of Compound 2  is determined as a trans isomer and has one of the following structure formulae:

[0031] Weight content of compound in the present invention obtained by preparation, separation and purification in turn is equal to or greater than 90%, such as equal to or greater than 95%, equal to or greater than 99% ( "very pure" compound) , and listed in the description of the text. In addition, the "very pure" compound of the present invention is also part of the present invention.

[0032] All configuration isomers of the compound of the present invention are within the scope, whether in mixture, pure or very pure form. The definition of the compound of the present invention comprises cis (Z) and trans (E) olefin isomers, and cis and trans isomers of carbocyclic and heterocyclic.

[0033] Specific functional groups and chemical term definitions are described in detail. For the purposes of the present invention, the chemical elements are consistent with Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed. The definition of a particular functional group is also described. In addition, the basic principles of Organic Chemistry as well as specific functional groups and reactivity described in “Organic Chemistry” , Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, the entire content of which is incorporated herein by reference.

[0034] Some compounds of the present invention may exist in specific geometric or stereoisomer forms. The present invention covers all compounds, including their cis and trans isomers, R and S enantiomers, diastereomers, (D) type isomers, (L) type isomers, racemic mixtures and other mixtures. In addition, asymmetric carbon atom can represent substituent, such as alkyl. All isomers and mixtures thereof are included in the present invention.

[0035] According to the invention, mixtures of isomers may contain a variety ratio of isomers. For example, mixtures with only two isomers may have the following combinations: 50: 50, 60: 40, 70: 30, 80: 20, 90: 10, 95: 5, 96: 4, 97: 3, 98: 2, 99: 1, or 100: 0, all ratios of the isomers are within the scope of the present invention. Similar ratio and the ratio of mixtures of more complex isomers, which are readily understood by general skill of the art are also within the scope of the invention.

[0036] The present invention also includes the isotope labeled compound, which is equivalent to the original compound herein. However, in fact, the substitution of one or more atoms by an atom with a different atomic weight or mass number usually occurs. Examples of compound isotopes that may be listed in the present invention include hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, fluorine, and chlorine isotopes such as 2H, 3H, 13C, 11C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F and 36Cl, respectively. Compound, or enantiomer, diastereomer, isomer, or pharmaceutically acceptable salt or solvate, the above compound containing isotopes or other isotope atoms are all within the scope of the invention. Some isotope-labeled compounds in the present invention, such as the radioactive isotopes of 3H and 14C, are also included and are useful in experiments on the tissue distribution of drugs and substrates. Tritium (3H) and Carbon-14 (14C) , which are relatively easy to prepare and detect. In addition, heavier isotope substitutions such as deuterium, i.e. 2H, have advantages in certain therapies due to their good metabolic stability, such as increased half-life or reduced dosage in vivo, and thus may be preferred in certain situations. Isotope-labeled compounds can be prepared by conventional methods through replacing readily available isotope-labeled reagents with non-isotopic reagents that can be prepared using the disclosed scheme shown in the Example.

[0037] If the synthesis of the compound of the invention is to be designed, it can be prepared by asymmetric synthesis, or derivatized with chiral auxiliary reagent, separating the resulting diastereomeric mixture and removing the chiral adjunct to obtain a pure enantiomer. In addition, if a molecule contains a basic functional group, such as an amino acid, or an acidic functional group, such as a carboxyl group, a diastereomer can be formed with a salt of suitable optically active acids or bases, which can be separated by conventional means, such as crystallization or chromatography, to obtain a pure enantiomer.

[0038] As described herein, the compound in the present invention may be substituted with any number of substituents or functional groups to extend its scope. In general, whether the term "substituted" appears before or after the term "optional" , the general formula that includes substituents in the compound of the present invention means the substitution of a specified structural substituent for a hydrogen radical. When multiple locations in a particular structure are replaced by multiple specific substituents, each location of the substituents can be the same or different. The term "stable" herein refers to a stable compound which is sufficient for maintaining the integrity of the compound structure within a sufficiently long time, preferably in a sufficiently long time, which is hereby used for the above purposes.

[0039] The metabolites of the compounds of the present application and their pharmaceutically acceptable salts, and prodrugs that can be converted into the compounds of the present application and their pharmaceutically acceptable salts in vivo, also included in the claims.

[0040] Preparation method

[0041] The preparation method of the compound of the present invention is more specifically described below, but these specific methods do not constitute any limitation of the invention. The compound of the invention may also optionally be conveniently prepared by combining the various synthetic methods described in this specification or known in the art, such a combination may be easily performed by a skilled person in the art to which the invention belongs.

[0042] Pharmaceutical composition and method of administration

[0043] The pharmaceutical compositions of the present invention are used to prevent and  / or treat a disease or disorder that is affected by the degradation of WIZ protein, such as sickle cell disease, beta-thalassemia, anemia, or related hemoglobinopathy.

[0044] The compounds of the present invention may be used in combination with other drugs known to treat or improve similar conditions. When administered in combination, the original administration for the drug can remain unchanged, while compound of the present invention may be administered simultaneously or subsequently. Pharmaceutical composition containing one or more known drugs and the compound of the present invention may be preferred when administered in combination with one or more other drugs. The drug combination also includes administering the compound of the present invention and other one or more known drugs at overlapping time. When the compound of the present invention is combined with other one or more drugs, the dose of the compound or known drug may be lower than that of their individual use.

[0045] The dosage forms of the pharmaceutical composition of the present invention include (but are not limited to) : injection, tablet, capsule, aerosol, suppository, pellicle, pill, liniment for external use, controlled release or sustained-release or nano formulation.

[0046] The pharmaceutical composition of the present invention comprises a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt and a pharmaceutically acceptable excipient or carrier with safe and effective amount. wherein "safe and effective amount" refers to the amount of compound is sufficient to significantly improve the condition, not to produce severe side effects. Typically, the pharmaceutical composition contains 1-2000 mg of the compound  / dosage of the present invention, and preferably contains 1-1000 mg of the compound  / dosage of the present invention. Preferably, "one dosage" is a capsule or a pill.

[0047] "Pharmaceutically acceptable carrier" refers to one or more compatible solid or liquid filler or gel substances, which are suitable for human use, and must be sufficiently pure and of sufficiently low toxicity. "Compatible" herein refers to the ability of each component of a composition can be mixed with the compound of the present invention and can be mixed with each other without appreciably reducing the efficacy of the compound. Examples of pharmaceutically acceptable carrier include cellulose and derivatives thereof (such as sodium carboxymethylcellulose, sodium ethylcellulose, cellulose acetate, etc. ) , gelatin, talc, solid lubricant (such as stearic acid, magnesium stearate) , calcium sulfate, vegetable oil (such as soybean oil, sesame oil, peanut oil, olive oil, etc. ) , polyol (such as propylene glycol, glycerol, mannitol, sorbitol, etc. ) , emulsifier (such as  ) , wetting agent (such as lauryl sodium sulfate) , colorant, flavoring, stabilizer, antioxidant, preservative, pyrogen-free water, etc.

[0048] There is no special limitation of administration mode for the compound or pharmaceutical compositions of the present invention, and the representative administration mode includes (but is not limited to) : oral, intratumorally, rectal, parenteral (intravenous, intramuscular or subcutaneous) , and topical administration.

[0049] Solid dosage forms for oral administration include capsules, tablets, pills, powders and granules. In these solid dosage forms, the active compounds are mixed with at least one conventional inert excipient (or carrier) , such as sodium citrate or dicalcium phosphate, or mixed with any of the following components: (a) fillers or compatibilizer, such as starch, lactose, sucrose, glucose, mannitol and silicic acid; (b) binders, such as hydroxymethyl cellulose, alginate, gelatin, polyvinylpyrrolidone, sucrose and arabic gum; (c) humectant, such as, glycerol; (d) disintegrating agent, such as agar, calcium carbonate, potato starch or tapioca starch, alginic acid, certain composite silicates, and sodium carbonate; (e) dissolution-retarding agents, such as paraffin; (f) absorption accelerators, such as quaternary ammonium compounds; (g) wetting agents, such as cetyl alcohol and glyceryl monostearate; (h) adsorbents, for example, kaolin; and (i) lubricants such as talc, stearin calcium, magnesium stearate, solid polyethylene glycol, lauryl sodium sulfate, or the mixtures thereof. In capsules, tablets and pills, the dosage forms may also contain buffering agents.

[0050] The solid dosage forms such as tablets, sugar pills, capsules, pills and granules can be prepared by using coating and shell materials, such as enteric coatings and any other materials known in the art. They can contain an opaque agent. The release of the active compounds or compounds in the compositions can be released in a delayed mode in a given portion of the digestive tract. Examples of the embedding components include polymers and waxes. If necessary, the active compounds and one or more above excipients can form microcapsules.

[0051] Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups or tinctures. In addition to the active compounds, the liquid dosage forms may contain any conventional inert diluents known in the art such as water or other solvents, solubilizers and emulsifiers, such as ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, propylene glycol, 1, 3-butanediol, dimethyl formamide, as well as oil, in particular, cottonseed oil, peanut oil, corn germ oil, olive oil, castor oil and sesame oil, or the combination thereof.

[0052] Besides these inert diluents, the composition may also contain additives such as wetting agents, emulsifiers, suspending agent, sweetener, flavoring agents and perfume.

[0053] In addition to the active compounds, the suspension may contain suspending agent, for example, ethoxylated isooctadecanol, polyoxyethylene sorbitol and sorbitan esters, microcrystalline cellulose, methanol aluminum and agar, or the combination thereof.

[0054] The compositions for parenteral injection may comprise physiologically acceptable sterile aqueous or anhydrous solutions, dispersions, suspensions or emulsions, and sterile powders which can be re-dissolved into sterile injectable solutions or dispersions. Suitable aqueous and non-aqueous carriers, diluents, solvents or excipients include water, ethanol, polyols and any suitable mixtures thereof.

[0055] The dosage forms for topical administration of compounds of the invention include ointments, powders, patches, aerosol, and inhalants. The active ingredients are mixed with physiologically acceptable carriers and any preservatives, buffers, or propellant if necessary, under sterile conditions.

[0056] Compounds of the present invention can be administrated alone, or in combination with any other pharmaceutically acceptable compounds.

[0057] When the pharmaceutical compositions are used, a safe and effective amount of compound of the present invention is administered to a mammal (such as human) in need thereof, wherein the dose of administration is a pharmaceutically effective dose. For a person weighing 60 kg, the daily dose is usually 1-2000 mg, preferably 50-1000mg. Of course, the particular dose should also depend on various factors, such as the route of administration, patient health status, which are well within the skills of an experienced physician.

[0058] The present invention also provides a preparation method of pharmaceutical composition comprising the step of mixing a pharmaceutically acceptable carrier with the compound or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof of the present invention.

[0059] The main advantages of the present invention include:

[0060] 1. The compounds described in the present invention possess novel structure.

[0061] 2. The compounds described in the present invention are effective to reduce or modulate widely interspaced zinc finger motifs (WIZ) protein expression levels and / or induce fetal hemoglobin (HbF) expression.

[0062] 3. The compounds described in the present invention possess a low clearance rate, good oral exposure, and high oral bioavailability.

[0063] The present invention is further described below in conjunction with specific examples. It is to be understood that these examples are intended to illustrate the invention only and not to limit the scope of the invention. The following embodiments do not indicate the specific conditions of the experimental method, usually according to the conventional conditions, or according to the conditions recommended by the manufacturer. Unless otherwise specified, percentages and parts are calculated by weight.

[0064] Example

[0065] Methods of Preparing a Compound of the Invention

[0066] Compounds of the present invention may be prepared using reactions and techniques known in the art and those described herein. One of the skills in the art will appreciate that methods of preparing compounds of the invention described herein are non-limiting and that steps within the methods may be interchangeable without affecting the structure of the end product.

[0067] Chemistry

[0068] Several methods for preparing the compounds of the invention are illustrated hereinbelow. Unless otherwise noted, all starting materials were obtained from commercial suppliers and used without further purification.

[0069] Hereinafter, ACN means acetonitrile, AcOH means acetic acid, Boc means tert-butyloxycarbonyl, Bn means benzyl, BINAP means 1.1'-binaphthyl-2.2'-diphemyl phosphine, calcd. means calculated, Cbz means benzyloxycarbonyl, col. means column, conc. means concentrated, DCM means dichloromethane, DIEA or DIPEA means N,N-diisopropylethyl amine, DIBAL means Diisobutylaluminium hydride, DMF means dimethylformamide, DMP means Dess-Martin periodinane, DMSO means dimethyl sulphoxide, Dppf means 1, 1'-Bis (diphenylphosphino) ferrocene, Et3N means triethylamine, EtOAc or EA means ethyl acetate, ee means enantiomeric excess, ESI means electrospray ionization, FA means formic acid, HNMR means 1H NMR, HCl means hydrochloric acid, HPLC means high performance liquid chromatography, LC-MS or LCMS means liquid chromatography-mass spectrometry, LAH means lithium aluminum hydride, NIS means N-iodosuccinimide, NBS means N-bromosuccinimide, NaBH3CN means sodium cyanoborohydride, PE means petroleum ether, Pd (dppf) Cl2 DCM, 1, 1'-Bis (diphenylphosphino) ferrocene-palladium (II) dichloride dichloromethane complex, PMB means 4-methoxybenzyl, PPTS means pyridinium p-toluenesulfonate, prep. means preparative, Prep-HPLC means preparative HPLC, PCC means pyridinium chlorochromate, Pd2 (dba) 3 means tris (dibenzylideneacetone) dipalladium (0) , Pd (OAc) 2 means Palladium acetate, tR or Rt mean retention time, (s) or (s) mean solid, sat. means saturated, SFC means supercritical fluid chromatography, TEA means triethylamine, THF means tetrahydrofuran, TFA means trifluoroacetic acid, T or Temp mean temperature, Tf2O means trifluoromethanesulfonic anhydride, TfOH means trifluoromethanesulfonic, K2CO3 means potassium carbonate, RuPhos Pd G3 means RuPhos-G3-Palladacycle, Methanesulfonato (2-dicyclohexylphosphino-2', 6'-di-isopropoxy-1, 1'-biphenyl) (2'-amino-1, 1'-bi phenyl-2-yl) palladium (II) , XPhos Pd G2 means Chloro (2-dicyclohexylphosphino-2', 4', 6'-triisopropyl-1, 1'-biphenyl) [2- (2'-amino-1, 1'-biphenyl) ] palladium (II) , W means wavelength.

[0070] Example 1:

[0071] Preparation of Compound 1:

[0072] 1- (2-fluoro-5- ( ( (S) -3-methyl-4- ( ( (1s, 4R) -4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione and Compound 2:

[0073] 1- (2-fluoro-5- ( ( (S) -3-methyl-4- ( ( (1r, 4S) -4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione

[0074] Step 1: Synthesis of methyl 4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohex-3-ene-1-carboxylate

[0075] A mixture of 5-bromo-2-methylpyrimidine (500 mg, 2.89 mmol) , methyl 4- (4, 4, 5, 5-tetramethyl-1, 3, 2-dioxaborolan-2-yl) cyclohex-3-ene-1-carboxylate (770 mg, 2.89 mmol) , Pd (dppf) Cl2·DCM (470 mg, 0.58 mmol) and K2CO3 (1.00 g, 7.23 mmol) in dioxane / H2O (8 mL / 2 mL) was heated at 100 ℃ under nitrogen atmosphere for 6 hours. Then H2O (30 mL) was added, and the aqueous mixture was extracted with EA (40 mL) . The organic layer was washed with brine, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue, which was purified by flash silica gel chromatography ( 25 g  Silica Flash Column, Eluent of 1-30%Petroleum ether / Ethyl acetate @60 ml / min) . Compound methyl 4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohex-3-ene-1-carboxylate (651 mg, 97%yield) was obtained as a white solid.

[0076] LCMS (ESI+) : m / z 233.4 [M+H] +.

[0077] Step 2: Synthesis of methyl 4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexane-1-carboxylate

[0078] To a solution of methyl 4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohex-3-ene-1-carboxylate (761 mg, 3.28 mmol) in EtOH (10 mL) was added 10%Pd / C (150 mg, wetted with 55%H2O) . The reaction mixture was stirred under hydrogen atmosphere at room temperature overnight. The mixture was filtered through celite pad. The filtrate was concentrated to give a colorless oil (756 mg, 98%) , which can be used into next step without further purification.

[0079] LCMS (ESI+) : m / z 235.3 [M+H] +.

[0080] Step 3: Synthesis of (4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methanol

[0081] To a solution of methyl 4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexane-1-carboxylate (756 mg, 3.23 mmol) in THF (4 mL) was added LiAlH4 (1.29 mL, 3.23 mmol, 2.5 N in THF) dropwise at 0 ℃under nitrogen atmosphere. Then the mixture was stirred at 0 ℃ for 30 mins. The reaction was quenched by addition of 0.2 mL H2O. Then 0.4 mL 10%NaOH aqueous solution and 0.6 mL H2O was added successively. The mixture was further stirred at room temperature for 20 mins. The mixture was dried over Na2SO4 and filtered through celite pad. The filtrate was concentrated to give a white solid (666 mg, 100%) , which can be used into next step without further purification.

[0082] LCMS (ESI+) : m / z 207.3 [M+H] +.

[0083] Step 4: Synthesis of 4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexane-1-carbaldehyde

[0084] To a solution of (4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methanol (666 mg, 3.23 mmol) in DCM (15 mL) was added Dess-Martin periodinane (1.78 g, 4.20 mmol) at 0 ℃. The mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The reaction was quenched by addition of 10%sodium thiosulfate aqueous solution. Then 20 mL saturated NaHCO3 aqueous solution and 40 mL DCM were added to do the extraction. The organic layer was washed with brine, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue, which was purified by flash silica gel chromatography ( 25 g Silica Flash Column, Eluent of 5-50%Petroleum ether / Ethyl acetate @60 ml / min) . Compound 4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexane-1-carbaldehyde (312 mg, 47%yield) was obtained as a white solid.

[0085] LCMS (ESI+) : m / z 205.3 [M+H] +.

[0086] Step 5: Synthesis of

[0087] (S) -1- (2-fluoro-5- ( (3-methyl-4- ( (4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) -3- (4-methoxybenzyl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione

[0088] To a solution of 4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexane-1-carbaldehyde (118 mg, 0.580 mmol) and Int. 7 (107 mg, 0.193 mmol; the compound of Int. 7 was synthesized according to the preparation of Intermediate INT-5 in the patent application WO2024255810A1) in MeOH (5 mL) was added DIPEA (75.0 mg, 0.580 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 10 min. A solution of 2 N ZnCl2 in 2-methyltetrahydrofuran (1.0 mL, 0.2 mmol) was added to the mixture. The mixture was stirred at 35 ℃ for overnight. Then NaBH3CN (36.0 mg, 0.580 mmol) was added to the mixture. The mixture was stirred at 35 ℃ for 2 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue, which was dissolved in EA (30 mL) . The solution was washed with brine, dried over Na2SO4, filtrated and the volatiles were removed under reduced pressure to give a crude, which was purified by flash silica gel chromatography ( 10 g Silica Flash Column, Eluent of 1-5%DCM / MeOH @35 ml / min) . Compound (S) -1- (2-fluoro-5- ( (3-methyl-4- ( (4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) -3- (4-methoxybenzyl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (79 mg, 61%yield) was obtained as a white solid.

[0089] LCMS (ESI+) : m / z 669.6 [M+H] +.

[0090] Step 6: Synthesis of

[0091] (S) -1- (2-fluoro-5- ( (3-methyl-4- ( (4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione

[0092] A mixture of

[0093] (S) -1- (2-fluoro-5- ( (3-methyl-4- ( (4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) -3- (4-methoxybenzyl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (79.0 mg, 0.118 mmol) in TFA  / TfOH (2 mL / 2 mL) was stirred at 35 ℃ for 1 hour. A saturated NaHCO3 aqueous solution was added to the reaction to adjust the pH of the mixture to 7-8. The solution was extracted with EA (30 mL) . The organic layer was washed with brine (10 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue, which was purified by prep-HPLC (0.05%FA in water and Acetonitrile as gradient eluent) . (S) -1- (2-fluoro-5- ( (3-methyl-4- ( (4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (24.0 mg, 37%yield) was obtained as a white solid.

[0094] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.52 (s, 1H) , 8.59 –8.47 (m, 3H) , 7.48 (s, 1H) , 6.96 (dd, J =7.2, 1.8 Hz, 1H) , 3.74 (t, J = 6.7 Hz, 2H) , 3.53 –3.40 (m, 2H) , 2.84 –2.72 (m, 3H) , 2.67 –2.30 (m, 7H) , 2.26 –2.12 (m, 2H) , 2.02 –1.89 (m, 3H) , 1.85 –1.70 (m, 3H) , 1.60 –1.29 (m, 4H) , 1.10 –0.82 (m, 5H) .

[0095] LCMS (ESI+) : m / z 549.6 [M+H] +.

[0096] Step 7: Compound 1:

[0097] 1- (2-fluoro-5- ( ( (S) -3-methyl-4- ( ( (1s, 4R) -4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione and Compound 2:

[0098] 1- (2-fluoro-5- ( ( (S) -3-methyl-4- ( ( (1r, 4S) -4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione

[0099] The mixture of cis and trans

[0100] (S) -1- (2-fluoro-5- ( (3-methyl-4- ( (4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (500 mg, 911 μmol) was purified by SFC (column: DAICEL CHIRALPAK AD (250 mm×30 mm, 10 μm) ; mobile phase: [CO2-EtOH: ACN = 4: 1 (0.1%NH3. H2O) ] ; B%: 55%, isocratic elution mode) to obtain: the peak 1 was assigned compound 1

[0101] 1- (2-fluoro-5- ( ( (S) -3-methyl-4- ( ( (1s, 4R) -4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (50 mg, 10%yield) as a white solid and the peak 2 was assigned compound 2

[0102] 1- (2-fluoro-5- ( ( (S) -3-methyl-4- ( ( (1r, 4S) -4- (2-methylpyrimidin-5-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (350 mg, 68%yield) as a white solid.

[0103] Compound 1:

[0104] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.55 (s, 1H) , 8.58 (s, 2H) , 8.51 (d, J = 7.2 Hz, 1H) , 7.48 (s, 1H) , 7.02 -6.88 (m, 1H) , 3.82 -3.67 (m, 2H) , 3.55 -3.39 (m, 2H) , 2.94 -2.75 (m, 4H) , 2.64 -2.54 (m, 6H) , 2.43 -2.36 (m, 1H) , 2.27 -2.10 (m, 2H) , 2.02 -1.79 (m, 3H) , 1.75 -1.41 (m, 8H) , 1.05 -0.94 (m, 3H)

[0105] 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -130.88 (br s, 1F)

[0106] LCMS (ESI+) : m / z 549.2 [M+H] +.

[0107] SFC: Rt = 1.11 min.

[0108] Compound 2:

[0109] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.55 (s, 1H) , 8.56 (s, 2H) , 8.51 (d, J = 6.8 Hz, 1H) , 7.48 (s, 1H) , 7.02 -6.89 (m, 1H) , 3.78 -3.69 (m, 2H) , 3.56 -3.40 (m, 2H) , 2.85 -2.73 (m, 3H) , 2.63 -2.53 (m, 5H) , 2.47 -2.31 (m, 3H) , 2.26 -2.07 (m, 2H) , 2.01 -1.88 (m, 3H) , 1.85 -1.70 (m, 3H) , 1.59 -1.38 (m, 3H) , 1.09 -0.84 (m, 5H)

[0110] 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -130.87 (s, 1F)

[0111] LCMS (ESI+) : m / z 549.2 [M+H] +.

[0112] SFC: Rt = 1.81 min.

[0113] Preparation of Compound 3:

[0114] 1- (2-fluoro-5- ( ( (S) -3-methyl-4- ( ( (1s, 4R) -4- (pyrimidin-2-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione and

[0115] Compound 4:

[0116] 1- (2-fluoro-5- ( ( (S) -3-methyl-4- ( ( (1r, 4S) -4- (pyrimidin-2-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione

[0117] Step 1: Synthesis of methyl 4- (pyrimidin-2-yl) cyclohex-3-ene-1-carboxylate

[0118] A mixture of methyl

[0119] 4- (4, 4, 5, 5-tetramethyl-1, 3, 2-dioxaborolan-2-yl) cyclohex-3-ene-1-carboxylate (25.0 g, 93.9 mmol) , 2-chloropyrimidine (16.1 g, 141 mmol) , K2CO3 (26.0 g, 188 mmol) ,

[0120] Pd(dppf) Cl2. CH2Cl2 (7.67 g, 9.39 mmol) in dioxane (200 mL) and H2O (10 mL) was degassed and purged with N2 for 3 times, and then the mixture was stirred at 90 ℃ for 16 hours under N2 atmosphere. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue, which was purified by column chromatography (SiO2, Commercial hexanes: Ethyl acetate=1: 0 to 3: 1) to afford methyl 4- (pyrimidin-2-yl) cyclohex-3-ene-1-carboxylate (25.4 g, crude) as a yellow oil.

[0121] LCMS (ESI+) : m / z 219.2 [M+H] +.

[0122] Step 2: Synthesis of methyl 4- (pyrimidin-2-yl) cyclohexane-1-carboxylate

[0123] To a solution of methyl 4-pyrimidin-2-ylcyclohex-3-ene-1-carboxylate (15.0 g, 68.7 mmol) in MeOH (150 mL) was added Tris (triphenylphosphine) ruthenium (II) chloride (6.36 g, 6.87 mmol) under H2 atmosphere. Then the mixture was stirred at 50 ℃ for 16 hours under H2 atmosphere (50 Psi) . The reaction mixture was filtered through celite, the filtered cake was washed with MeOH (100 mL) , and the combined filtrate was concentrated under reduced pressure to give a residue, which was purified by column chromatography (SiO2, Commercial hexanes: Ethyl acetate=1: 0 to 1: 1) to afford methyl 4- (pyrimidin-2-yl) cyclohex-3-ene-1-carboxylate (13.2 g, 75.0%yield) as a colorless oil.

[0124] LCMS (ESI+) : m / z 221.1 [M+H] +.

[0125] Step 3: Synthesis of 4- (pyrimidin-2-yl) cyclohexane-1-carbaldehyde

[0126] A mixture of methyl 4-pyrimidin-2-ylcyclohexanecarboxylate (17.0 g, 77.2 mmol) in THF (340 mL) was cooled to -60 ℃ under N2, then the mixture was added DIBAL-H (1 M in hexane, 108 mL, 108 mmol) dropwise about 40 mins, the mixture was stirred at -60 ℃ for 20 min under N2 atmosphere. Then the reaction mixture was added aq. potassium sodium 2, 3-dihydroxysuccinate tetrahydrate (500 mL) dropwise under N2 and then the mixture was extracted with DCM (300 mL×3) . The combined organic phases were concentrated to dryness under reduced pressure to give a residue, which was purified by column chromatography (SiO2, Commercial hexanes: Ethyl acetate=1: 0 to 1: 1) to afford 4- (pyrimidin-2-yl) cyclohexane-1-carbaldehyde (2.20 g, 15%yield) as a colorless oil.

[0127] LCMS (ESI+) : m / z 191.2 [M+H] +.

[0128] Step 4: Synthesis of

[0129] (S) -1- (2-fluoro-5- ( (3-methyl-4- ( (4- (pyrimidin-2-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) -3- (4-methoxybenzyl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione

[0130] To a solution of 4-pyrimidin-2-ylcyclohexanecarbaldehyde (2.20 g, 11.6 mmol) , 1- [2-fluoro-5- [ [ (3S) -3-methylpiperazin-1-yl] methyl] pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl] -3- [ (4-methox yphenyl) methyl] hexahydropyrimidine-2, 4-dione as HCl salt (4.50 g crude, 7.74 mmol) in MeOH (40 mL) was added DIEA (2.00 g, 15.5 mmol, 2.70 mL) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 0.5 hour, then the mixture was added ZnCl2 (1 M in THF, 15.5 mL) and the mixture was stirred at 25 ℃ for 16 hours. Then the mixture was added NaBH3CN (972 mg, 15.5 mmol) , and the mixture was stirred at 25 ℃ for 3 hours. The residue was diluted with H2O (50 mL) and extracted with DCM (40 mL ×4) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue, which was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH = 20: 1) to afford (S) -1- (2-fluoro-5- ( (3-methyl-4- ( (4- (pyrimidin-2-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) p yrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) -3- (4-methoxybenzyl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (4.20 g, 83%yield) as a yellow solid.

[0131] LCMS (ESI+) : m / z 655.7 [M+H] +.

[0132] Step 5: Synthesis of

[0133] (S) -1- (2-fluoro-5- ( (3-methyl-4- ( (4- (pyrimidin-2-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione

[0134] To a solution of

[0135] 1- [2-fluoro-5- [ [ (3S) -3-methyl-4- [ (4-pyrimidin-2-ylcyclohexyl) methyl] piperazin-1-yl] methyl] py razolo [1, 5-a] pyridin-3-yl] -3- [ (4-methoxyphenyl) methyl] hexahydropyrimidine-2, 4-dione (6.40 g, 9.77 mmol) in TFA (20 mL) and TfOH (20 mL) . The mixture was stirred at 60 ℃ for 1 hour. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was basified with saturated aq. K2CO3 until pH=14. Then, the mixture was extracted with DCM (100 mL×3) . The combined organic layers were dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue, which was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH =10: 1) to afford

[0136] 1- [2-fluoro-5- [ [ (3S) -3-methyl-4- [ (4-pyrimidin-2-ylcyclohexyl) methyl] piperazin-1-yl] methyl] py razolo [1, 5-a] pyridin-3-yl] hexahydropyrimidine-2, 4-dione (3.40 g, 65%yield) as a yellow solid.

[0137] LCMS (ESI+) : m / z 535.2 [M+H] +.

[0138] Step 6: Synthesis of compound 3:

[0139] 1- (2-fluoro-5- ( ( (S) -3-methyl-4- ( ( (1s, 4R) -4- (pyrimidin-2-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione and compound 4:

[0140] 1- (2-fluoro-5- ( ( (S) -3-methyl-4- ( ( (1r, 4S) -4- (pyrimidin-2-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione

[0141] The mixture of cis and trans of

[0142] 1- [2-fluoro-5- [ [ (3S) -3-methyl-4- [ (4-pyrimidin-2-ylcyclohexyl) methyl] piperazin-1-yl] methyl] pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl] hexahydropyrimidine-2, 4-dione (4.00 g, 7.48 mmol) was purified by SFC {column: DAICEL CHIRALPAK AD (250 mm×50 mm, 10 μm) ; mobile phase:

[0143] [CO2-EtOH] ; B%: 55%, isocratic elution mode} to obtain: the peak 1 was assigned compound 3 1- (2-fluoro-5- ( ( (S) -3-methyl-4- ( ( (1s, 4R) -4- (pyrimidin-2-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (404.6 mg, 10.1%yield) as a white solid and the peak 2 was assigned compound 4

[0144] 1- (2-fluoro-5- ( ( (S) -3-methyl-4- ( ( (1r, 4S) -4- (pyrimidin-2-yl) cyclohexyl) methyl) piperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (2.37 g, 59.3%yield) as a white solid.

[0145] Compound 3:

[0146] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.55 (s, 1H) , 8.73 (d, J = 4.4 Hz, 2H) , 8.51 (d, J = 7.2 Hz, 1H) , 7.55 -7.42 (m, 1H) , 7.34 -7.27 (m, 1H) , 6.95 (d, J = 7.2Hz, 1H) , 3.82 -3.66 (m, 2H) , 3.53 -3.40 (m, 2H) , 2.98 -2.88 (m, 1H) , 2.82 -2.63 (m, 4H) , 2.45 -2.09 (m, 4H) , 2.03 -1.82 (m, 4H) , 1.80 -1.59 (m, 4H) , 1.58 -1.34 (m, 4H) , 0.93 (s, 3H) .

[0147] LCMS (ESI+) : m / z 535.2 [M+H] +.

[0148] SFC: Rt = 0.832 min

[0149] Compound 4:

[0150] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.55 (s, 1H) , 8.71 (d, J = 5.2 Hz, 2H) , 8.51 (d, J = 7.2 Hz, 1H) , 7.48 (s, 1H) , 7.35 -7.26 (m, 1H) , 7.02 -6.88 (m, 1H) , 3.79 -3.67 (m, 2H) , 3.50 -3.41 (m, 2H) , 2.82 -2.72 (m, 4H) , 2.56 (d, J = 10.8 Hz, 2H) , 2.47 -2.42 (m, 1H) , 2.38 -2.29 (m, 1H) , 2.24 -2.11 (m, 2H) , 2.01 -1.88 (m, 5H) , 1.81 -1.72 (m, 1H) , 1.62 -1.45 (m, 3H) , 1.06-0.99 (m, 1H) , 0.94 (d, J = 6.0 Hz, 4H) .

[0151] LCMS (ESI+) : m / z 535.5 [M+H] +.

[0152] SFC: Rt = 1.347 min.

[0153] Example 2: Protein degradation assay (HiBiT assay)

[0154] The following is an example of an assay that can be used to determine WIZ, CK1α, GSPT1, and IKZF1 degradation activity of compounds in the HT-1080 cell line (ATCC, Cat#CCL-121) . For WIZ, and IKZF1 HiBiT assays, HT-1080 cells were engineered to stably overexpress GSPT Δ (1-138)  / G575N mutant, and HiBiT tagged WIZ, and IKZF1 respectively. For CK1α and GSPT1 HiBiT assays, HT-1080 cells were engineered to stably overexpress GSPT Δ (1-138)  / G575N mutant, CRBN and HiBiT tagged CK1α, and GSPT1 respectively. Cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10%heat-inactivated FBS, 1X sodium pyruvate, 1X non-essential amino acids, 1X glutamine, 100 U / ml penicillin, and 100 ug / mL streptomycin. For HiBiT degradation assay, about 10,000 engineered HT-1080 cells in 35 μl culture medium were seeded into 384-well plates (Cat#3764, Corning) , pre-spotted with test compounds using the Echo 650 liquid handler (Beckman) . The half-log dose-response-curve (DRC) typically has 10 points with the highest concentration at 10 μM, and the lowest concentration at 0.316 nM. Assay plates were incubated at 37 ℃ with 5%CO2 for 20 hrs. Target protein degradation was then assessed using the Nano-Glo HiBiT Lytic Detection Reagent according to the manufacturer’s instructions. Luminescence was measured on a Pherastar microplate reader (BMG Labtech) . The data was processed using Collaborative Drug Discovery Vault and DMSO control was used as the reference value to calculate degradation values for each treated sample (%compared to DMSO control) . A four-Parameter Logistic Model was used to determine the compound’s EC50 and DC50, using the following equation:

[0155] y = (A+ ( (B-A)  /  (1+ ( (C / x) AD) ) ) )

[0156] A = Ymin (lowest target protein level normalized to DMSO control in response to compound treatment, as determined by curve fit)

[0157] B = Ymax (highest value, target protein value in DMSO control)

[0158] C = EC50

[0159] D = Hill Slope

[0160] x = compound concentration

[0161] EC50 = the concentration of compound when y = (Ymax-Ymin)  / 2

[0162] DC50 = the concentration of the sample when y = 50%of DMSO control (50%target protein degradation)

[0163] y = target protein level normalized to DMSO control

[0164] Dmax = (1-Ymin / Ymax) × 100%

[0165] Dmax represented the maximum percentage of target protein degradation that could be achieved by a compound at its highest treatment concentration. The results of compounds described in the present invention are shown in Table 1 and 2.

[0166] Table 1. WIZ degradation activity

[0167] According to Table 1, the compounds of the present invention have significantly improved degradation activity towards WIZ protein compared to Reference 1.

[0168] Table 2. The degradation activity of CK1α, GSPT1, and IKZF1

[0169] As is shown in Table 2, the compounds of the present invention have lower degradation activity towards CK1α, GSPT1, and IKZF1 compared to Reference 1, demonstrating a better selectivity and lower toxicity.

[0170] Reference 1: Example 203 described in WO2022 / 195454,

[0171] (S) -1- (5- ( (4-isobutyl-3-methylpiperazin-1-yl) methyl) pyrazolo [1, 5-a] pyridin-3-yl) dihydropyrimi dine-2, 4 (1H, 3H) -dione

[0172] Example 3: Liver microsomal stability

[0173] 1.1 Empty 'Incubation' plates T60 and NCF60 were pre-warmed at 37℃ for 10 min.

[0174] 1.2 Microsome working solutions (445 μL) was transferred into pre-warmed 'Incubation' plates T60 and NCF60, followed by a 10 min incubation at 37℃.

[0175] 1.3 Microsome working solutions (54 μL) was transferred to a Blank60 plate, followed by the addition of 6 μL NADPH cofactor and 180 μL of stop solution into each well. 1.4 Compound working solution (5 μL) was added to the 'incubation' plates (T60 and NCF60) containing microsomes.

[0176] 1.5 For the 'Incubation' plate NCF60, 50 μL of PB buffer was added, the plate was incubated at 37℃ for 60 min.

[0177] 1.6 Stop solution (180 μL) and NADPH working solution (6 μL) were added to the T0 plate. Then, a mixture (54 μL) was removed from the 'Incubation' plate T60 and transferred to the T0 plate.

[0178] 1.7 For the 'Incubation' plate T60, NADPH working solution (44 μL) was added, followed by a 60 min incubation at 37℃.

[0179] 1.8 At 5, 15, 30, 45, and 60 min, 60 μL of each sample at each time point was transferred to a well containing 180 μL of stop solution, followed by mixing.

[0180] 1.9 All sampling plates were shaken for 10 min, then centrifuged at 3220 ×g for 20 min at 4℃. 2.10 The supernatant (80 μL) was transferred into 240 μL of pure water and mixed using a plate shaker for 10 min.

[0181] 2.11 Each bioanalysis plate was sealed and shaken for 10 min prior to LC-MS / MS analysis.

[0182] Table 3. Liver microsomal stability

[0183] Example 4: The pharmacokinetic study after single intravenous and oral administration in SD rat

[0184] Sample collection and preparation: After intravenous injection or oral administration of test compounds, blood samples were collected and collection time was recorded. After collection, the blood sample was immediately transferred into a labeled centrifuge tube containing K2-EDTA, followed by centrifugation and plasma collection. The plasma was then transferred into a pre-cooled centrifuge tube, quickly frozen on dry ice, and stored in an ultra-low temperature refrigerator at -70±10℃ until the LC-MS / MS analysis was performed.

[0185] Pharmacokinetic data analysis: The pharmacokinetic software was used to process the plasma drug concentration data of the compound in a non-compartmental model. The peak concentration (Cmax) , peak time (Tmax) and quantifiable end time can be directly obtained from the plasma concentration-time diagram. The log-linear trapezoidal method was used to calculate the following pharmacokinetic parameters: half-life (T1 / 2) , apparent volume of distribution (Vss) and clearance (Cl) , and the area under the time-plasma concentration curve (AUC0-last) from the 0 point to the end point.

[0186] Table 4. Rat pharmacokinetic data

Claims

A compound having the structure of:or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof.The compound according to claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof, wherein the compound is selected fromThe compound according to claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof, wherein the compound isThe compound according to claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof, wherein the compound isThe compound according to claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof, wherein the compound isThe compound according to claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof, wherein the compound isA pharmaceutical composition comprising a compound of any one of claims 1-6, or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier.The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the pharmaceutical composition is a tablet, a capsule, a granule, a syrup, a suspension, a solution, a dispersion, a slowed release preparation for oral or non-oral administration, an intravenous injection preparation, a subcutaneous injection preparation, an inhalation preparation, a transdermal preparation, a rectal or vaginal suppository.The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the pharmaceutical composition is an oral preparation.Use of a compound of any one of claims 1-6 or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof in the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or disorder that is affected by the degradation of WIZ protein.A method of inhibiting, reducing, or eliminating the activity of WIZ protein or WIZ protein expression in a subject in need thereof, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the compound of any one of claims 1-6 or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof.A method of treating a disease or disorder selected from sickle cell anemia, and beta-thalassemia in a subject in need thereof, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the compound of any one of claims 1-6 or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate, prodrug, stereoisomer, or tautomer thereof.

Images