Kits for biotin-streptavidin pulldown system and method

Abstract

The present disclosure provides a method for isolating a biotinylated molecule from a biological sample, using an affinity ligand conjugated with a first nucleotides and a solid support conjugated with a second nucleotides, wherein the affinity ligand specifically binds the biotinylated molecule to form a complex, the first nucleotides is complementary to the second nucleotides. As a result, the complex can be captured by the solid support through the hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide. The complex may subsequently be released from the solid support by applying heat equal to or above a melting temperature (Tm) sufficient to disrupt the hybridization. The present disclosure also provides a kit useful for performing the method described herein.

Description

KITS FOR BIOTIN-STREPTAVIDIN PULLDOWN SYSTEM AND METHODCROSS REFERENCE TO RELATED PATENT APPLICATION

[0001] This application claims priority to US Provisional Application Serial Number 63 / 665,474 filed on June 28, 2024, titled “KITS FOR BIOTIN-STREPTAVIDIN PULLDOWN SYSTEM AND METHOD” , which is herein incorporated by reference in its entirety.BACKGROUND

[0002] The biotin-streptavidin pulldown system is a widely utilized technique in biochemical and molecular biology research due to its high affinity and specificity. The interaction between biotin and streptavidin is one of the strongest non-covalent bonds known (KD～10-15M) , which makes this system extremely effective for isolating and studying proteins, nucleic acids, and other biomolecules. Typically, this technique involves biotinylation of a target protein, binding a biotinylated target protein to streptavidin-coated beads, washing away unbound proteins and elution of the target protein from the beads. Despite its popularity and effectiveness, the biotin-streptavidin pulldown system has several drawbacks that can limit its applications and efficacy in certain experimental contexts.

[0003] One of the primary concerns is the non-specific binding of proteins and other biomolecules. Despite their high affinity for biotin, magnetic beads coated with streptavidin not only bind biotinylated proteins, but also bind non-specifically to other components in complex biological samples, such as cell lysates. This non-specific binding can lead to background noise, making it challenging to distinguish between specific and non-specific interactions. Another drawback is elution challenges. The strong and almost irreversible binding biotin and streptavidin makes it difficult to elute bound molecules without harsh conditions (e.g. high salt, low pH, or denaturants) can potentially denature proteins or disrupt protein-protein interaction, complicating downstream analyses and affecting the integrity of the captured molecules.

[0004] An efficient method for releasing the biotinylated proteins is to enzymatically digest the entire protein-bound beads directly. However, this approach inevitably leads to the digestion of non-specific binders on the beads as well, resulting in a high amount of non-specific proteins in the pulldown products, which can affect downstream experiments such as mass spectrometry analysis. Thus, there remains a need for a kit and method that can selectively bind to biotinylated proteins, which can be used for detection, purification, and pulldown of biotinylated proteins. SUMMARY OF THE DISCLOSURE

[0005] In the present invention, a dual-phased affinity approach is provided which enables specific pulldown of biotinylated targets via both biotin–streptavidin binding and oligonucleotide hybridization. In the present invention, a biotinylated molecule of interest is first captured by an affinity ligand with an oligonucleotide, and the resulting complex is subsequently immobilized onto a solid support with a complementary oligonucleotide via sequence-specific hybridization. This approach minimizes non-specific binding to the solid support and allows for controlled release of the complex by disrupting the hybridization between the oligonucleotides, thereby enabling efficient recovery of the target molecule under mild and reversible conditions. The target molecule as recovered can be used for a subsequent analysis, such as mass spectrometry.

[0006] In particular, the present invention provides a method for analyzing a biotinylated protein via mass spectrometry, comprising (i) providing a biotin-binding molecule which is conjugated with a first oligonucleotide; (ii) contacting the biotinylated protein with the biotin-binding molecule, thereby forming a  complex of the biotinylated protein and the biotin-binding molecule conjugated with the first oligonucleotide; (iii) providing a solid support conjugated with a second oligonucleotide which is  complementary to the first oligonucleotide; (iv) contacting the complex of step (ii) with the solid support of step (iii) , thereby forming a  hybrid of the complex and the solid support through hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide; (v) eluting the complex from the hybrid under conditions that permit the dissolution  between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide; and (vi) subjecting the eluted complex to a mass spectrometry analysis.

[0007] In some embodiments, the biotin-binding molecule is selected from the group consisting of streptavidin, avidin and Neutravidin.

[0008] In some embodiments, the first oligonucleotide and the second oligonucleotide each comprises 15 to 40 nucleotides in length and have at least 10 consecutive complementary nucleotides for hybridization.

[0009] In some embodiments, the first oligonucleotide has a poly (A) sequence and the second oligonucleotide has a poly (T) sequence, or the first oligonucleotide has a poly (T) sequence and the second oligonucleotide has a poly (A) sequence.

[0010] In some embodiments, the solid support is selected from the group consisting of a magnetic bead, an agarose bead, a polystyrene bead, a micro bead, a hydrogel bead, a Sepharose bead, and a silica bead.

[0011] In some embodiments, the biotinylated protein is contained in a biological sample.

[0012] In some embodiments, the biological sample comprises a cell lysate, a serum sample, or a tissue extract.

[0013] In some embodiments, the hybrid of step (iv) is washed to remove unbound components before step (v) .

[0014] In some embodiments, the complex is eluted from the hybrid by applying heat at a melting temperature (Tm) sufficient to disrupt the hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.

[0015] In some embodiments, the melting temperature (Tm) is in the range of 30℃ to 90℃.

[0016] In some embodiments, the eluted complex is subjected to an enzymatic reaction and resultant peptides are analyzed by a mass spectrometer.

[0017] The present invention also provides a method for isolating a biotinylated molecule, comprising (i) providing a sample which comprises the biotinylated molecule and non-biotinylated  molecules; (ii) contacting the sample with a biotin-binding molecule which is conjugated with a first  oligonucleotide, thereby forming a complex of the biotinylated molecule and the biotin-binding molecule conjugated with the first oligonucleotide; (iii) providing a solid support conjugated with a second oligonucleotide which is  complementary to the first oligonucleotide; (iv) contacting the complex of step (ii) with the solid support of step (iii) , thereby forming a  hybrid of the complex of step (ii) and the solid support of step (iii) through hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide; and (v) eluting the complex from the hybrid under conditions that permit the dissolution  between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.

[0018] In some embodiments, the sample is a biological sample.

[0019] In some embodiments, the biological sample comprises a cell lysate, a serum sample, or a tissue extract.

[0020] In some embodiments, the biotinylated molecule is a protein, a nucleic acid, a lipid, a carbohydrate or a small molecule which is linked to a biotin moiety.

[0021] The present invention further provides a kit for performing a method as described herein, which comprises (a) a biotin-binding molecule conjugated with a first oligonucleotide, capable of forming a  complex of the biotinylated molecule and the biotin-binding molecule conjugated with the first oligonucleotide; and (b) a solid support conjugated with a second oligonucleotide which is complementary to the  first oligonucleotide, capable of forming a hybrid of the complex and the solid support through hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.

[0022] In some embodiments, the biotin-binding molecule is selected from the group consisting of streptavidin, avidin and Neutravidin.

[0023] In some embodiments, the first oligonucleotide and the second oligonucleotide each comprises 15 to 40 nucleotides in length and have at least 10 consecutive complementary nucleotides for hybridization.

[0024] In some embodiments, the first oligonucleotide has a poly (A) sequence and the second oligonucleotide has a poly (T) sequence, or the first oligonucleotide has a poly (T) sequence and the second oligonucleotide has a poly (A) sequence.

[0025] In some embodiments, the solid support is selected from the group consisting of a magnetic bead, an agarose bead, a polystyrene bead, a micro bead, a hydrogel bead, a Sepharose bead, and a silica bead.

[0026] In some embodiments, the kit further comprises (c) a binding buffer to facilitate interaction between the biotinylated molecule and the  biotin-binding molecule to form the complex; (d) a hybridizing buffer to facilitate interaction between the complex and the solid support  to form the hybrid through hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide; (e) a washing buffer to perform a washing step to remove unbound components; and / or (f) an eluting buffer to perform an elution step to release the complex from the hybrid via  dissolution between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.

[0027] The details of one or more embodiments of the invention are set forth in the description below. Other features or advantages of the present invention will be apparent from the following detailed description of several embodiments, and also from the appended claims.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0028] The embodiments will become more fully understood from the detailed description and accompanying drawings, which are given for illustration only, and thus are not limited to the present invention.

[0029] In the drawings:

[0030] FIG. 1A depicts a diagram of exemplary affinity ligand which comprises a biotin-binding protein conjugated with oligo (dA) in one embodiment of the invention.

[0031] FIG. 1B depicts a diagram of exemplary substrate which comprises a solid support conjugated with oligo (dT) in one embodiment of the invention.

[0032] FIG. 2 illustrates an exemplary workflow of isolating the biotinylated biomolecules and subsequent steps before performing a mass analysis.

[0033] FIG. 3 illustrates an exemplary chemical conjugation method for preparing Streptavidin conjugated with a poly (A) tail.

[0034] FIG. 4 shows a representative high-performance liquid chromatography (HPLC) profile demonstrating that streptavidin conjugated with a poly (A) tail has been successfully prepared.DETAILED DESCRIPTION

[0035] Before describing the present invention in detail, it is to be understood that this invention is not limited to particular formulations or process parameters as such may, of course, vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments of the invention only, and is not intended to be limiting.

[0036] Although a number of methods and materials similar to or equivalent to those described herein can be sued in the practice of the present invention, the preferred materials and methods are described herein.

[0037] The present invention relates to a method and kit for analyzing and / or isolating biotinylated molecules. Please refer to FIG. 1A and 1B, showing the major components of the present invention, including an affinity ligand 14 which comprises a biotin-binding molecule 141 conjugated with a first oligonucleotide 142; and a substrate 16 which comprises a solid support 161 conjugated with a second oligonucleotide 162, which is complementary to the first oligonucleotide 142.

[0038] As shown in FIG. 1A, an affinity ligand 14 comprises a biotin-binding molecule 141 conjugated with a first oligonucleotide 142.

[0039] As used herein, the term “affinity ligand” refers to a molecule capable of specifically binding to a target moiety, thereby enabling its selective isolation or detection. In certain embodiments, the affinity ligand is a biotin-binding molecule, such as streptavidin, avidin, or neutravidin, which binds biotin with high affinity. Biotin-binding proteins are among the most commonly used affinity ligands in pull-down assays due to their strong and specific interaction with biotinylated molecules. In one embodiment, the biotin-binding protein 141 is streptavidin.

[0040] In some embodiments, the streptavidin may be wild-type form or various derivatives that have been engineered or modified for specific applications, such as recombinant streptavidin, core streptavidin, monovalent streptavidin, neutral streptavidin, or mutants which may alter binding characteristics, stability or other properties. In some embodiments, the streptavidin may be substituted by avidin or modified form of avidin, such as Streptavidin, Strep- NeutrAvidin, CaptAvdin, and ExtrAvidin.

[0041] As used herein, the term “oligonucleotide (s) ” refers to a polynucleotide that comprises between about 6 to 150 nucleotides. Throughout the specification, an oligonucleotide can be represented by a sequence of letters (for example, from the four base letters; A, C, G, and T, which denote adenosine, cytidine, guanosine, and thymidine, respectively) . Unless denoted otherwise, whenever an oligonucleotide sequence is represented, it will be understood that the nucleotides are in 5’ to 3’ orientation from left to right. In some embodiments, an oligonucleotide as described herein comprises 6 to 100 nucleotides, for example, 6 to 90 nucleotides, 6 to 80 nucleotides, 6 to 70 nucleotides, 6 to 60 nucleotides, 6 to 50 nucleotides, 6 to 40 nucleotides, 6 to 30 nucleotides or 6 to 20 nucleotides. In some embodiments, an oligonucleotide as described herein comprises 10 to 100 nucleotides, for example, 10 to 90 nucleotides, 10 to 80 nucleotides, 10 to 70 nucleotides, 10 to 60 nucleotides, 10 to 50 nucleotides, 10 to 40 nucleotides, 10 to 30 nucleotides or 10 to 20 nucleotides. In some embodiments, an oligonucleotide as described herein comprises 15 to 100 nucleotides, for example, 15 to 90 nucleotides, 15 to 80 nucleotides, 15 to 70 nucleotides, 15 to 60 nucleotides, 15 to 50 nucleotides, 15 to 40 nucleotides, 15 to 30 nucleotides, 15 to 30 nucleotides or 15 to 20 nucleotides.

[0042] As shown in FIG. 1B, a substrate 16 comprising a solid support 161 conjugated with a second oligonucleotide 162, which is complementary to the first oligonucleotide 142. In one embodiment disclosed herein, the solid support may be a bead, which is selected from the group consisting of a magnetic bead, an agarose bead, a polystyrene bead, a micro bead, a hydrogel bead, a Sepharose bead, and a silica bead. In one embodiment disclosed herein, the solid support 161 is a magnetic bead. A magnetic bead is typically made from magnetic materials like iron oxide or ferrite materials. Inorganic materials like silicon can be used to coat or encapsulate these beads, enhancing their properties and making them suitable for various applications.

[0043] In some embodiments, to prepare the affinity ligand 14, the biotin-binding molecule 141 is conjugated with the first oligonucleotide 142. Conventional methods for preform the conjugation are available in the art. In some examples, a biotin-binding protein is modified with maleimide to introduce thiol-reactive functional groups; an oligonucleotide is synthesized with disulfide protected thiol groups for bioconjugation or surface attachment which is then reduced using a reducing agent e.g. Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) to selectively reduce the S-Sbond, converting the protected thiol (-S-S-R) into a free thiol (-SH) for conjugation; and the modified biotin-binding protein is conjugated with the SH (thiol) -containing oligonucleotide.

[0044] As used herein, the term “complementary” refers to the ability of two nucleic acid sequences to form a stable duplex through Watson-Crick base pairing under suitable hybridization conditions. Complementarity between two single-stranded nucleic acid molecules may be “partial, ” in which only some of the nucleotides bind, or it may be complete when total complementarity exists between the single-stranded molecules. A first nucleotide sequence can be said to be the “reverse complement” of a second sequence, if the first nucleotide sequence is complementary to a sequence that is the reverse (i.e., the order of the nucleotides is reversed) of the second sequence. It is understood from the disclosure that if a molecule can hybridize to another molecule it may be complementary, or partially complementary, to the molecule that is hybridizing. In certain embodiments, the first and second oligonucleotides are complementary to each other over a sequence length of at least 10 consecutive nucleotides, thereby allowing stable and specific hybridization under standard conditions. Typically, hybridization conditions are selected to be about 5 to 30℃ lower than the melting point (Tm) for the specified sequence at a defined ionic strength and pH. More typically, hybridization conditions are selected to be about 5 to 15℃ lower than the Tm for the specified sequence at a defined ionic strength and pH.

[0045] One of the most commonly used and straightforward examples of nucleic acid hybridization involves oligo (dA) and oligo (dT) sequences. In one embodiment disclosed herein, the first oligonucleotide 142 may be a oligo (dA) (also referred to herein as poly (A) ) sequence having a length of 15 nucleotides (SEQ ID NO: 1) , in which the case the second oligonucleotide 162 may be a complementary oligo (dT) (also referred to herein as poly (T) ) having a length of 15 nucleotides (SEQ ID NO: 2) . In another embodiment, the first oligonucleotide 142 may instead be a oligo (dT) sequence, and the second oligonucleotide may be a complementary oligo (dA) sequence. Such combinations provide a simple and effective means for sequence-specific hybridization and subsequent thermal elution.

[0046] In one embodiment, as shown in FIG. 1A and 1B, the first oligonucleotide 142 and the second oligonucleotide 162 both have the same length of 15 nucleotides. In another embodiment, the first oligonucleotide 142 and the second oligonucleotide 162 may differ in nucleotide length. For example, the first oligonucleotide may comprise 15 nucleotides and the second oligonucleotide may comprise 25 nucleotides. The first oligonucleotide and the second oligonucleotide may be designed to include consecutive complementary sequence of 10 or more nucleotides to enable hybridization.

[0047] It should be noted that apart from homopolymeric sequences such as poly (A) and poly (T) , the first and / or the second oligonucleotides may also comprise random multimer, gene-specific sequence or barcode sequence, depending on the intended application. A randomer sequence refers to an oligonucleotide comprising a randomized arrangement of nucleotides, which may be used, for example, to reduce structural bias or to facilitate non-specific binding for capture or indexing purposes. A barcode sequence, by contrast, typically consists of a predefined and unique short oligonucleotide used for sample identification, multiplexing, or molecular tracking in high-throughput workflows.

[0048] In certain embodiments, the first and / or the second oligonucleotide may include a hybrid structure combining a poly (A) or poly (T) tail with a barcode or randomer region to achieve both efficient hybridization and traceability. Such designs allow for increased versatility in downstream applications, such as sequencing-based analysis or multiplexed pulldown assays.

[0049] Pulldown Method

[0050] The streptavidin–biotin affinity system is widely used for the pulldown of molecules of interest due to its exceptionally high binding affinity (Kd ～10-15 M) . A common approach involves first labeling the molecule of interest with biotin, followed by incubation with streptavidin-coated beads to isolate the biotinylated molecules from a complex mixture. However, this method presents notable limitations. The solid support (e.g., beads) often exhibits non-specific binding to other biomolecules present in the sample, resulting in reduced specificity. Moreover, the extremely strong interaction between streptavidin and biotin renders the dissociation of the complex difficult, thereby complicating the recovery of the target molecule and potentially interfering with downstream analyses such as mass spectrometry or sequencing.

[0051] To address these issues, the present invention provides a dual-phased affinity strategy enables highly specific isolation of biotinylated targets via both biotin–streptavidin binding and oligonucleotide hybridization. In this system, the biotinylated molecule of interest is first captured by the affinity ligand, and the resulting complex is subsequently immobilized onto the solid support via sequence-specific hybridization. This approach minimizes non-specific binding to the solid support and allows for controlled release of the complex by disrupting the hybridization between the oligonucleotides, thereby enabling efficient recovery of the target molecule under mild and reversible conditions.

[0052] FIG. 2 illustrates an exemplary pulldown method according to the present disclosure. As shown in FIG. 2, in step (i) , a biological sample 1 (e.g. a cell lysate) comprises a biotinylated molecule of interest 11 and other non-target molecules 12.

[0053] In some embodiments, a biological sample as used herein is a suspension sample where biomolecules are present within a fluid or semi-fluid medium derived from biological sources. Such molecules may include, but are not limited to, nucleic acids (e.g., DNA, RNA) , proteins, peptides, lipids, carbohydrates, or complexes thereof, which are suspended or solubilized in an aqueous environment. The biological suspension may originate from a variety of sources, including cell lysates, serum, plasma, tissue extracts, whole blood, urine, or other bodily fluids or homogenized biological materials. These suspensions typically result from sample preparation procedures such as cell disruption, centrifugation, or filtration.

[0054] As used herein, the term “biotinylated” refers to a molecule that has been covalently or non-covalently modified to include one or more biotin moieties, thereby enabling its recognition and binding by a biotin-binding protein such as streptavidin, avidin, or neutravidin. The process of introducing biotin into a molecule is referred to as “biotinylation” . In the context of the present invention, a biotinylated molecule (also referred to as the “molecule of interest” or “target molecule” ) is one that has been labeled with biotin to facilitate subsequent capture or isolation via a biotin-binding affinity ligand.

[0055] Biotinylation may be carried out using any of a variety of known methods in the art, including but not limited to chemical conjugation, enzymatic labeling, or in vitro transcription / translation systems incorporating biotinylated precursors. The biotinylation can be directed toward nucleic acids, proteins, peptides, lipids, carbohydrates, or other biomolecules of interest. In some embodiments, photobiotinylation is performed where biotin is attached to a molecule of interest (like DNA, RNA, or proteins) using a light-activated process. The biotin, when conjugated to a photoactivatable group (like an arylazide) , remains inactive until exposed to strong light. Upon irradiation, the arylazide group becomes reactive and forms a bond with nearby molecules, effectively labeling them with biotin.

[0056] In some embodiments, cells are fixed using paraformaldehyde (PFA) or other crosslinking agents to maintain cellular architecture; permeabilization is performed to allow reagents to access intracellular proteins; a photoactivatable biotin reagent is introduced, and laser illumination is applied to trigger biotinylation in the targeted region; and biotin-labeled cells are treated with a lysis buffer containing detergents (e.g., NP-40, Triton X-100, or sodium dodecyl sulfate (SDS) ) to break the cells. The cell lysate is obtained for subsequent steps. Optionally, the cell lysate is pre-treated to remove endogenous poly A.

[0057] As shown in FIG. 2, in step (ii) , the biological sample comprising the biotinylated molecule 11 is mixed with an affinity ligand 14, therefore forming a complex 15 of the affinity ligand 14 and the biotinylated molecules 11. Typically, the affinity ligand is a streptavidin-poly (A) . In step (iii) , the substrate 16 is provided. In some embodiment, the substrate is an oligo (dT) bead which is particularly a magnetic bead with a sequence of oligo (dT) s (thymidine nucleotides) covalently attached to the bead’s surface. Some commercial product is available, e.g. DynabeadsTM Oligo (dT) 25. In step (iv) , the substrate 16 is added to the reaction mixture, where under appropriate hybridization conditions, the first oligonucleotide 142 and the second oligonucleotide 162 form a complementary duplex (or hybrid) 17, thereby enabling the specific capture of biotinylated molecules 11.

[0058] FIG. 2, step (v) illustrates the thermal elution step, in which the complex 15 is released from the substrate 16 by applying heat equal to or above a melting temperature (Tm) under conditions sufficient to disrupt the hybridized duplex formed between the first and the second oligonucleotides.

[0059] As used herein, the term “melting temperature” or “Tm” refers to the minimum temperature under defined conditions (e.g., ionic strength, oligonucleotide length, and sequence composition) at which the hybridized duplex between two complementary oligonucleotides is completely dissociated in single strands. In other words, it is the temperature at which substantially all (i.e., approximately 100%) of the duplex structure is disrupted, allowing for full separation of the two strands. In some embodiment disclosed herein, the melting temperature (Tm) is in the range of 30℃ to 90℃. In certain embodiments, the applied temperature for disrupting the hybridization is preferably in the range of 35℃ to 70℃, which is sufficient to achieve complete duplex dissociation while maintaining the structural integrity and biological activity of protein components.

[0060] The hybridized oligonucleotide duplex (or hybrid) can also be denatured under low salt conditions, which reduces the ionic stabilization of the duplex and thereby promotes strand separation. In another embodiment, the mild condition to separate the complex 15 with the substrate 16 is to incubate the cell lysate in low salt concentration, i.e. 0.1 –50 mM. This provides an alternative to thermal elution for disrupting hybridization between the first and second oligonucleotides.

[0061] In some embodiments, the eluted complex is subjected to further downstream analysis, such as mass spectrometry. As illustrated in FIG. 2, in step (vi) , the eluted complex 15 is treated with a proteolytic enzyme (e.g., trypsin) to digest the protein components into short peptides, which are then analyzed by mass spectrometry (MS) for identification and characterization. Examples of mass spectrometry include, but are not limited to, matrix-assisted laser desorption ionization / time of flight (MALDI-TOF) , surface-enhanced laser desorption ionization / time of flight (SELDI-TOF) , liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) , liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS-MS) , and electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) . One certain example of this approach is tandem mass spectrometry (MS / MS) , which involves multiple steps of mass selection or analysis, usually separated by some form of fragmentation.

[0062] In one embodiment disclosed herein, the eluted complexes may be detected using data-independent acquisition (DIA) mass spectrometry. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS / MS) is conducted on an UltiMate 3000 RSLCnano system (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) , linked to an Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) . The desalted and dried peptides may be reconstituted in 0.1%formic acid in water and separated on a 75 μm × 250 mm column (pore size  particle size 1.7 μm, nanoEase M / Z Peptide CSH C18, Waters) . The full MS spectra may be acquired in Orbitrap at a resolution of 120, 000, covering a scan range of 375–1500 m / z, with an automatic gain control (AGC) target of 1×106 and using a maximum injection time of 50 ms. For DIA MS / MS, utilizing 40 scan events with a 10 m / z isolation window to undergo fragmentation within the m / z range of 400–800. The MS / MS scan, operating in high-energy collision dissociation (HCD) mode at 30%normalized collision energy, employed an AGC target of 4×105 and a maximum injection time of 54 ms. Fragment ions can be scanned in Orbitrap with a resolution of 30, 000.

[0063] The present invention also provides a kit comprising components for performing the method as described herein. The components can be packaged together in the form of a kit. For example, the components can be packaged in separate containers, and the instructions (e.g., written, tape, VCR, CD-ROM, etc. ) for performing the method can also be included in the kit.

[0064] In particular, the kit comprises (a) a biotin-binding molecule conjugated with a first oligonucleotide, capable of forming a complex of a biotinylated molecule and the biotin-binding molecule conjugated with the first oligonucleotide; and (b) a solid support conjugated with a second oligonucleotide which is complementary to the first oligonucleotide, capable of forming a hybrid of the complex and the solid support through hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.

[0065] In some embodiments, the kit further comprises (c) a binding buffer to facilitate interaction between the biotinylated molecule and the biotin-binding molecule to form the complex; (d) a hybridizing buffer to facilitate interaction between the complex and the solid support to form the hybrid through hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide; (e) a washing buffer to perform a washing step to remove unbound components; and / or (f) an eluting buffer to perform an elution step to release the complex from the hybrid via dissolution between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide. In some examples, the binding buffer and the hybridization buffer can have the same conditions suitable for the binding reaction between the biotinylated molecule and the biotin-binding molecule to form the complex, and also the hybridization reaction between the complex and the solid support to form the hybrid through hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide. In one particular example, the binding buffer and the hybridization buffer comprises 100 mM Tris-HCl, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1%LiDS and 5 mM dithiothreitol (DTT) , pH 7.5-8.0.

[0066] Without further elaboration, it is believed that those skilled in the art will be able to apply the invention to its fullest extent based on the above description. The following specific examples are, therefore, intended to be illustrative, and are not intended to limit the applicable scope of the invention in any way. All documents cited herein are incorporated herein by reference.

[0067] Examples

[0068] Example 1: Preparation of streptavidin conjugated with a poly (A) tail

[0069] FIG. 3 shows a schematic method to conjugate oligo (dA) with a recombinant streptavidin. First, the streptavidin was modified with maleimide. Second, the maleimide modified streptavidin was conjugated with SH (thiol) -containing 15 adenosines (e.g. thio-modified oligonucleotide, pA-15, commercially available from custom oligo synthesis providers) . Specifically, to prepare the conjugation reagents, a stock solution of 250 mM SM (PEG) 2, a crosslinker containing both sulfhydryl (SH) and maleimide (SM) groups, with two ethylene oxide (PEG) spacer arms in between, was made by dissolving 100 mg of SM (PEG) 2 in 840 μL of anhydrous N, N-dimethylformamide (DMF) , which was aliquoted as 50 μL per vial, and unused portions were stored at –20 ℃ for up to three months. A 50 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) stock was prepared by dissolving 7 mg of TCEP in 493 μL of ddH2O. For preparing a streptavidin solution, 5 mg of streptavidin was dissolved in 2 mL phosphate buffered saline (PBS) to achieve a final concentration of 2.5 mg / mL (～48 μM, based on MW 52 kDa) , 150 μL of which was dispensed per vial and stored at 4 ℃. To reduce pA-15, 1.26 μL of 100 mM TCEP was added to 125 μL of 100 μM pA-15 stock solution (TCEP: pA-15 molar ratio of 5: 1) , and incubate at room temperature for 1 hour. Separately, 1.44 μL of 250 mM SM(PEG) 2 was added to 150 μL of the streptavidin solution (molar ratio of 50: 1) , which was incubated for 30 minutes at room temperature. Excess crosslinker was removed using a 40 kDa desalting column equilibrated with phosphate buffered saline (PBS) . Then, 126.3 μL of the reduced pA-15 was added to the desalted streptavidin at a molar ratio of 1.74: 1, which was incubated for another 30 minutes at room temperature. Finally, TCEP and unreacted pA-15 were removed using a PBS-equilibrated 40 kDa desalting column, and the resultant conjugated product, streptavidin–poly (A) , was analyzed by SEC-LC to confirm the conjugation.

[0070] To confirm the oligod (A) sequence was successfully conjugated to streptavidin, the reaction mixture was analyzed using high-performance liquid chromatography (HPLC) (Nexera series, Column: Agilent Bio SAX column (P / N 5190-2463) ) . The mobile phases consisted of: Buffer A: 20 mM Tris, pH 8.0, Buffer B: 20 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8.0. The flow rate was set at 0.5 mL / min. The following gradient program was applied: 0–14 min: linear gradient from 0%to 100%B; 14–19 min: hold at 100%B; and 19.1–27.5 min: re-equilibrate to 0%B.

[0071] FIG. 4 shows the HPLC profiles obtained for individual components and the conjugated product. The UV absorbance was monitored at 260 nm and 280 nm. Poly (A) tail displays a higher absorbance at 260 nm and a lower absorbance at 280 nm, which is characteristic of nucleic acids. In contrast, streptavidin exhibits a strong absorbance at 280 nm and relatively low absorbance at 260 nm, typical for proteins. The conjugated product, streptavidin–poly (A) tail (at a poly (A) to streptavidin molar ratio of 2.0) , demonstrates a combined absorbance at both 260 nm and 280 nm, indicating successful conjugation of the oligo (dA) sequence to streptavidin.

[0072] Example 2: Cell fixation and permeabilization

[0073] U-2OS cells (HTB-96, ATCC, VA, USA) were cultivated at 37℃ in a 5%CO2 humidified environment in Dulbecco’s Modified Eagle Medium supplemented with 10%FBS. 2×105 cells were seeded in glass bottom chambers (80287, ibidi) and incubated for approximately 16 h to 80-90%of confluency. Afterwards, cells were washed with phosphate buffered saline (PBS) then fixed with 2.4%paraformaldehyde solution (PFA, 15710, Electron Microscopy Sciences) or 100%ice-cold methanol. Fixed cells were incubated with PBS / 0.5%Triton X-100 to permeabilize the cell membrane and blocked with 3%BSA in PBS / 0.1%Triton X-100 (PBS-T) for 1 h, followed by 30 min of 0.002%streptavidin for blocking endogenous biotin and 15 min of 40 μM biotin for blocking remaining unbound streptavidin sites.

[0074] Example 3: Photo-biotinylation and cell lysis

[0075] The Microscoop system (Syncell Inc. ) in combination with the Synlight-RichTM reagent (Syncell Inc. ) were employed to perform microscopy-guided photo-biotinylation, illuminating the nuclear region of cells with a 780 nm femtosecond laser. The Synlight-RichTM operated with 1mM and photolabeling was conducted using 100 μs of exposure time and 150 mW of power. After photolabeling in the fixed cells, the cells were lysed using a lysis buffer containing 100 mM Tris-HCl, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1%LiDS and 5 mM dithiothreitol (DTT) , pH 7.5-8.0. Unlabeled parts were kept in the dark. After cell lysis and protein quantification, 200 μg of nuclear labeled / biotinylated sample (PL protein lysate sample, about 160 μL) and 200 μg of unlabeled / unbiotinylated sample (UL protein lysate sample, about 160 μL) were collected.

[0076] To remove endogenous poly (A) , the protein lysate samples (the PL protein lysate sample and the UL protein lysate sample) were treated with DynabeadsTM Oligo (dT) 25 (Thermo Fisher Scientific Inc. ) . Specifically, DynabeadsTM Oligo (dT) 25 was resuspended thoroughly before use. A volume of 100 μL (equivalent to 0.5 mg) of the bead stock was transferred to a microcentrifuge tube placed on a magnetic stand, and the supernatant was discarded. The beads were washed once with 50–100 μL of lysis / binding buffer, followed by removal of the supernatant. The tube was then removed from the magnet, and 160 μL of protein lysate samples and 840 μL of lysis / binding buffer were added to the pre-washed beads. The mixture was rotated at room temperature for 30 minutes to allow the poly (A) tails of mRNA to hybridize to the beads. After incubation, the supernatant was collected and saved as pre-cleared protein lysate.

[0077] Example 4: Pulldown assay

[0078] The pulldown assay was performed as follows. Specifically, 10 μL of streptavidin-poly (A) (0.3 μg / μL) was added to the pre-cleared protein lysate present in the lysis buffer (100 mM Tris-HCl, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1%LiDS and 5 mM dithiothreitol (DTT) , pH 7.5-8.0) and incubated for 1 hour at 4℃ on a rotator for the binding reaction, thereby forming a streptavidin-poly (A) : biotinylated protein complex. Separately, 10 μL of DynabeadsTM Oligo (dT) 25 were prepared from stock, washed with 100 μL of lysis / binding buffer, and the supernatant was discarded. The streptavidin-poly (A) : biotinylated protein complex was then added to the pre-washed beads and incubated for 30 minutes at 4℃ with gentle rotation for the hybridization reaction, thereby forming a hybrid of the streptavidin-poly (A) : biotinylated protein complex with the beads. After incubation, the beads were washed twice with 1 mL of ice-cold Washing Buffer A (10 mM Tris-HCl, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA and 0.1%LiDS, pH 7.5) , followed by two washes with ice-cold Washing Buffer B (10 mM Tris-HCl, 0.15 M LiCl and 1 mM EDTA, pH 7.5) to remove unbounded components. The streptavidin-poly (A) : biotinylated protein complex was eluted from the hybrid via dissociation between the poly A sequence of the streptavidin-poly (A) and the poly T sequence of the beads using 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) by incubation at 35℃ for 2–5 minutes.

[0079] Example 5: Analysis by mass spectrometry

[0080] Subsequently, 200 ng of trypsin was added to the eluted fraction of the streptavidin-poly (A) : biotinylated protein complex, and the mixture was incubated at 37℃ for 16 hours for proteolytic digestion. The resulting peptides were desalted using C18 Ziptips, and the final desalted peptides were analyzed using an Orbitrap FusionTM LumosTM mass spectrometer operated in data-independent acquisition (DIA) mode.

[0081] The raw DIA files from both the 200 μg of labeled (PL) and unlabeled (control, UL) samples were analyzed together using Spectronaut software (version 18.2.230802.50606) in directDIATM mode, which eliminates the need for a spectral library. Protein identification was conducted using the Pulsar search engine, and the reference database employed was UniProtKB / Swiss-Prot, specifically the human proteome database (Homo sapiens: 20, 423 entries) , with default search settings. Label-free peptide quantification was performed by measuring peak heights at the MS1 level. Protein abundance was estimated by averaging the quantities of top three most intense peptides, and missing values were imputed using the 'global imputing'strategy. A fold-change at 1.5 as the cutoff to filter the non-specific binders from the pulldown assays.

[0082] The identified peptides were mapped to corresponding proteins, and the quantification revealed successful enrichment of specific biotinylated nuclear-associated proteins. Table 1 shows the results.

[0083] Table 1

[0084] As shown in Table 1, a total of 24 proteins were identified in this experiment, wherein 21 proteins were classified as nuclear proteins, while 3 proteins were non-nuclear, resulting in a nuclear protein specificity of 87.5% (21 out of 24) . The results demonstrate a dual-phased affinity approach as describe herein is feasible for specific isolation of biotinylated targets via both biotin–streptavidin binding and oligonucleotide hybridization.

[0085] All references cited herein, including patent applications and publications, are incorporated by reference in their entirety. The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting of the disclosure. As used herein, the singular forms “a” , “an” and “the” are intended to include the plural forms as well, unless the context clearly indicates otherwise. It will be further understood that the terms “comprises” and / or “comprising” , or “includes” and / or “including” or “has” and / or “having” when used in this specification, specify the presence of stated features, regions, integers, steps, operations, elements, and / or components, but do not preclude the presence or addition of one or more other features, regions, integers, steps, operations, elements, components, and / or groups thereof.

[0086] The ranges set forth herein may be interpreted as being inclusive of their endpoints, and open-ended ranges may be interpreted to include only commercially practical values. Similarly, lists of values may be considered as inclusive of intermediate values unless the context indicates the contrary. The recitation of ranges of values herein is merely intended to serve as a shorthand method of referring individually to each separate value falling within the range.

[0087] Methods described herein can be performed in any suitable order unless otherwise indicated herein or otherwise indicated otherwise context. The use of examples, or exemplary language (e.g., “such as” ) provided with respect to certain embodiments herein is intended merely to better illuminate the invention and does not pose a limitation on the scope of the invention otherwise claimed.

Claims

1.A method for analyzing a biotinylated protein via mass spectrometry, comprising(i) providing a biotin-binding molecule which is conjugated with a first oligonucleotide;(ii) contacting the biotinylated protein with the biotin-binding molecule, thereby forming a complex of the biotinylated protein and the biotin-binding molecule conjugated with the first oligonucleotide;(iii) providing a solid support conjugated with a second oligonucleotide which is complementary to the first oligonucleotide;(iv) contacting the complex of step (ii) with the solid support of step (iii) , thereby forming a hybrid of the complex and the solid support through hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide;(v) eluting the complex from the hybrid under conditions that permit the dissolution between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide; and(vi) subjecting the eluted complex to a mass spectrometry analysis.2.The method of claim 1, wherein the biotin-binding molecule is selected from the group consisting of streptavidin, avidin and Neutravidin.3.The method of claim 1 or 2, wherein the first oligonucleotide and the second oligonucleotide are each 15 to 40 nucleotides in length and have at least 10 consecutive complementary nucleotides for hybridization.4.The method of any of claims 1 to 3, wherein the first oligonucleotide has a poly (A) sequence and the second oligonucleotide has a poly (T) sequence, or the first oligonucleotide has a poly (T) sequence and the second oligonucleotide has a poly (A) sequence.5.The method of any of claims 1 to 4, wherein the solid support is selected from the group consisting of a magnetic bead, an agarose bead, a polystyrene bead, a micro bead, a hydrogel bead, a Sepharose bead, and a silica bead.6.The method of any of claims 1 to 5, wherein the biotinylated protein is contained in a biological sample.7.The method of claim 6, wherein the biological sample comprises a cell lysate, a serum sample, or a tissue extract.8.The method of any of claims 1 to 7, wherein the hybrid of step (iv) is washed to remove unbound components before step (v) .9.The method of any of claims 1 to 8, wherein the complex is eluted from the hybrid by applying heat at a melting temperature (Tm) sufficient to disrupt the hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.10.The method of claim 9, wherein the melting temperature (Tm) is in the range of 30℃ to 90℃.11.The method of any of claims 1 to 10, wherein the eluted complex is subjected to an enzymatic reaction and resultant peptides are analyzed by a mass spectrometer.12.A method for isolating a biotinylated molecule, comprising(i) providing a sample which comprises the biotinylated molecule and non-biotinylated molecules;(ii) contacting the sample with a biotin-binding molecule which is conjugated with a first oligonucleotide, thereby forming a complex of the biotinylated molecule and the biotin-binding molecule conjugated with the first oligonucleotide;(iii) providing a solid support conjugated with a second oligonucleotide which is complementary to the first oligonucleotide;(iv) contacting the complex of step (ii) with the solid support of step (iii) , thereby forming a hybrid of the complex and the solid support through hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide; and(v) eluting the complex from the hybrid under conditions that permit the dissolution between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.13.The method of claim 12, wherein the biotin-binding molecule is selected from the group consisting of streptavidin, avidin and Neutravidin.14.The method of claim 12 or 13, wherein the first oligonucleotide and the second oligonucleotide each comprises 15 to 40 nucleotides in length and have at least 10 consecutive complementary nucleotides for hybridization.15.The method of any of claims 12 to 14, wherein the first oligonucleotide has a poly (A) sequence and the second oligonucleotide has a poly (T) sequence, or the first oligonucleotide has a poly (T) sequence and the second oligonucleotide has a poly (A) sequence.16.The method of any of claims 12 to 15, wherein the solid support is selected from the group consisting of a magnetic bead, an agarose bead, a polystyrene bead, a micro bead, a hydrogel bead, a Sepharose bead, and a silica bead.17.The method of any of claims 12 to 16, wherein the sample is a biological sample.18.The method of claim 17, wherein the biological sample comprises a cell lysate, a serum sample, or a tissue extract.19.The method of any of claims 12 to 18, wherein the hybrid of step (iv) is washed to remove unbound components before step (v) .20.The method of any of claims 12 to 19, wherein the complex is eluted from the hybrid by applying heat at a melting temperature (Tm) sufficient to disrupt the hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.21.The method of claim 20, wherein the melting temperature (Tm) is in the range of 30℃ to 90℃.22.The method of any of claims 12 to 21, wherein the biotinylated molecule is a protein, a nucleic acid, a lipid, a carbohydrate or a small molecule which is linked to a biotin moiety.23.A kit for isolating a biotinylated molecule, comprising(a) a biotin-binding molecule conjugated with a first oligonucleotide, capable of forming a complex of the biotinylated molecule and the biotin-binding molecule conjugated with the first oligonucleotide; and(b) a solid support conjugated with a second oligonucleotide which is complementary to the first oligonucleotide, capable of forming a hybrid of the complex and the solid support through hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.24.The kit of claim 23, wherein the biotin-binding molecule is selected from the group consisting of streptavidin, avidin and Neutravidin.25.The kit of claim 23 or 24, wherein the first oligonucleotide and the second oligonucleotide each comprises 15 to 40 nucleotides in length and have at least 10 consecutive complementary nucleotides for hybridization.26.The kit of any of claims 23 to 25, wherein the first oligonucleotide has a poly (A) sequence and the second oligonucleotide has a poly (T) sequence, or the first oligonucleotide has a poly (T) sequence and the second oligonucleotide has a poly (A) sequence.27.The method of any of claims 23 to 26, wherein the solid support is selected from the group consisting of a magnetic bead, an agarose bead, a polystyrene bead, a micro bead, a hydrogel bead, a Sepharose bead, and a silica bead.28.The kit of any of claims 23 to 27, further comprising(c) a binding buffer to facilitate interaction between the biotinylated molecule and the biotin-binding molecule to form the complex;(d) a hybridizing buffer to facilitate interaction between the complex and the solid support to form the hybrid through hybridization between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide;(e) a washing buffer to perform a washing step to remove unbound components; and / or(f) an eluting buffer to perform an elution step to release the complex from the hybrid via dissolution between the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.

Images