Oligonucleotide delivery agents, pharmaceutical compositions and methods using the same

Abstract

Provided is an oligonucleotide delivery agent comprising at least one lipid moiety comprising at least one linear alkyl group or linear alkylenyl group directly or indirectly conjugated to a single-stranded oligonucleotide, which can be delivered to various subjects, such as muscle, heart, liver, etc., with enhanced efficiency and thus achieving improved expression regulation of target genes. A pharmaceutical composition comprising the oligonucleotide delivery agent and a method of modulating the expression of a target gene by using the same are also provided.

Description

OLIGONUCLEOTIDE DELIVERY AGENTS, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND METHODS USING THE SAMEFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present disclosure relates to the technical field of gene expression modulation, and in particular to unique oligonucleotide delivery agents useful for efficient oligonucleotide delivery.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Oligonucleotides are an emerging class of therapeutics currently under active development for the treatment of a wide variety of diseases via a myriad of mechanisms of action (MOA) . Major categories of oligonucleotide therapeutics include single-stranded antisense oligonucleotides (ASOs) and duplex (double-stranded) RNAs (dsRNAs) such as siRNA and saRNA.

[0003] There are two main types of ASOs. One is the so-called “gapmer” ASO which suppresses gene expression by degrading target mRNA via the RNase H mechanism. Gapmer ASOs have a central DNA region required to support the RNase H activity and two ribonucleotide wings to increase the ASO’s binding affinity to the target sequence. Another category of ASOs is steric blockers, which are typically composed uniformly of ribonucleotides with phosphorothioate (PS) backbone and bind to pre-mRNA in the nucleus to alter mRNA processing (e.g., mRNA splicing, translation and nuclear export) by blocking the binding of certain proteins to the mRNA (e.g., splicing factors) . Such ASOs have found successes for the treatment of disorders amendable through correction of abnormal splicing errors and have been approved by U.S. Food and Drug Administration (FDA) , including an exon inclusion ASO drug  for the treatment of spinal muscular atrophy (SMA) and 4 exon-skipping ASO drugs for the treatment of Duchenne muscular dystrophy (DMD) .

[0004] ASOs are self-deliverable molecules with limited bioavailability in a few types of organs and tissues without an extra delivery facilitator. However, they typically require a high systemic or tissue concentration to be therapeutically effective and such high concentration is often associated with toxicity, resulting in a small therapeutic window. So far, approved PS-ASO drugs are mainly administered locally including the eye and CNS so that high local  concentration can be achieved without much concern of systemic toxicity [Vitravene Study Group. Safety of intravitreous fomivirsen for treatment of cytomegalovirus retinitis in patients with AIDS. Am J Ophthalmol (2002) ; US20180273943A1; and Stein, C. A. and D. Castanotto. FDA-Approved Oligonucleotide Therapies in 2017. Mol Thera (2017) ] . Systemic ASO drugs are mainly of morpholino based oligomers (PMOs) administrated by IV for the treatment of Duchenne muscular dystrophy (DMD) . PMOs have in general wider safety margin compared with PS-ASO due to the neutral morpholino ring in their molecular structure and can be given to patients at very high doses. Despite that, therapeutic efficacy is limited [P Duda, GA Laforet et.al, Development of Phosphorodiamidate Morpholino Oligomers (PMOs) for the Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) (S42.008) . Neurology (2017) ] . There continues to be a longstanding need for improved oligonucleotide-based delivery mechanisms which can address these challenges.

[0005] After persistent exploration, the inventors have developed a unique oligonucleotide delivery agent which can enhance in vivo activity of ASOs especially in the muscle where huge unmet medical need exists.SUMMARY OF THE INVENTION

[0006] The present disclosure provides an oligonucleotide delivery agent comprising one or more lipid moieties directly or indirectly conjugated to an oligonucleotide, wherein at least one of the lipid moieties comprises at least one C6-C22 linear alkyl and / or alkenyl group, preferably at least one C12, C14, C15, C16, C18 or C20 linear alkyl or alkenyl group, and the oligonucleotide is a single-stranded oligonucleotide, preferably an antisense oligonucleotide (ASO) . In a particular embodiment, an oligonucleotide delivery agent having a structure presented by Formula A is provided:

[0007] wherein the lipid moiety comprises at least one C6-C22 linear alkyl or alkenyl group, and M is an integer of 1 to 5, and the oligonucleotide is at least one single-stranded oligonucleotide, and N is an integer of 1, 2 or 3; and the delivery enhancing compound (DEC) moiety is a bivalent to hexavalent moiety comprising at least one nitrogen-containing  heterocyclic ring, at least one nitrogen-containing linear chain group, at least one nitrogen-containing linear chain-carbocyclic ring group, or combinations thereof, and each of the lipid moiety and the oligonucleotide is directly or indirectly conjugated to the delivery enhancing compound moiety.

[0008] Also provided herein is a pharmaceutical composition comprising the oligonucleotide delivery agent of the present disclosure, the pharmaceutical composition may optionally comprise additional ingredients, such as pharmaceutically acceptable carrier, excipient, solvent, diluent, stabilizer, dispersant, buffer, compatibilizer, preservative agent and combinations thereof.

[0009] Also provided herein is method of modulating the expression of a target gene in a subject, wherein the method comprises the step of administrating the pharmaceutical composition of the present disclosure to a subject in the case of assays or therapeutic treatment, or contacting the pharmaceutical composition with a cell in the case of assays.

[0010] It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory only and are not restrictive of the invention, as claimed.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0011] A better understanding of the features and advantages of the present invention will be obtained with reference to the following detailed description that sets forth illustrative embodiments, in which the principles of the invention are utilized, and the accompanying drawings of which:

[0012] FIGs. 1A-D compares the splicing activity of an exemplary “lipid-DEC-ASO” (LDEC-ASO) to a non-conjugate control at converting SMN2 pre-mRNA to full-length transcript (SMN2FL) over its exon 7 depleted isoform (SMN2Δ7) in skeletal muscle of type III SMA mice. LDEC-ASO (i.e., RD-14644) or the non-conjugate control (i.e., RD-10004) was administered via subcutaneous (SC) injection into female type III SMA mice (n = 3 mice / dose) on postnatal day (PND) 40-50 at the indicated doses (i.e., 10, 30 and 100 mg / kg) . Saline treatment alone (n = 4 mice / group) served as a vehicle control to establish baseline expression levels of SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA isoforms. Mice were sacrificed on 14 days post dosing in which SMN2FL and SMN2Δ7 levels were quantified via RT-qPCR using isoform- specific primer sets in tissue samples from different skeletal muscles including bicep (FIG. 1A) , semitendinosus (FIG. 1B) , platysma (FIG. 1C) , and gluteus (FIG. 1D) . Tbp was amplified as an internal reference used to normalize expression data. Data represents mean expression levels of SMN2FL or SMN2Δ7 in muscle tissue of treated animals relative to the saline control group. Statistical significance was calculated using one-way ANOVA.

[0013] FIGs. 2A-2B compares the splicing activity of LDEC-ASOs to non-conjugated ASO at converting SMN2 pre-mRNA to SMN2FL over the SMN2Δ7 mRNA isoform in peripheral tissues including liver (FIG. 2A) and heart (FIG. 2B) . In FIG. 2A, LDEC-ASOs (i.e., RD-14644, RD-14645, and RD-14646) or the non-conjugate control (i.e., RD-10004) were administered via subcutaneous (SC) injection into female type III SMA mice (n =2-3 mice / dose) on PND 40-50 at the indicated doses (i.e., 10, 30 and 100 mg / kg) . Whereas only LDEC-conjugate RD-14644 treatment was compared to RD-10004 in the heart (FIG. 2B) . Saline treatment alone (n = 4 mice / group) served as a vehicle control to establish baseline expression levels of SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA isoforms. Mice were sacrificed on 14 days post dosing and SMN2FL and SMN2Δ7 levels were quantified via RT-qPCR using isoform-specific primer sets. Tbp was amplified as an internal reference used to normalize expression data. Data represents mean expression levels of SMN2FL or SMN2Δ7 in the liver (FIG. 2A) or heart (FIG. 2B) of treated animals relative to the saline control group. Statistical significance was calculated using one-way ANOVA.

[0014] FIGs. 3A-3B compares the splicing activity of LDEC-ASOs to non-conjugated ASO at converting SMN2 pre-mRNA to SMN2FL over the SMN2Δ7 mRNA isoform in peripheral tissues and skeletal muscle in female type III SMA mice. LDEC-ASO (i.e., RD-14644) or the non-conjugate control (i.e., RD-10004) were administered via SC injection into female type III SMA mice on PND 40-50 at 30 mg / kg. aCSF treatment alone served as a vehicle control to establish baseline expression levels of SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA isoforms. Mice were sacrificed on 14 days post dosing in which SMN2FL and SMN2Δ7 levels were quantified via RT-qPCR using isoform-specific primer sets. Tbp was amplified as an internal reference used to normalize expression data. FIG. 3A-3B shows mean expression levels of SMN2FL or SMN2Δ7 in the peripheral tissues (i.e., heart, liver, fat tissues, diaphragm, thoracic aorta with vein) and skeletal muscle (i.e., bicep, semitendinosus, platysma and gluteus) of treated animals relative to the aCSF control group. Data represents mean ± SEM of 3 mice per group.

[0015] FIGs. 4A-4F compares the splicing activity of LDEC-ASOs to non-conjugated ASO at converting SMN2 pre-mRNA to SMN2FL over the SMN2Δ7 mRNA isoform in various tissues of type III SMA mice. In FIG. 4A-4C, LDEC-ASOs (i.e., RD-14644 and RD-14645) or the non-conjugate control (i.e., RD-10004) were administered via femoral vein (IV) injection into female type III SMA mice on PND 40-50 at 10 mg / kg. In FIG. 4D-4F, only LDEC-conjugate RD-14644 treatment was compared to RD-10004 in tissue from the heart, diaphragm and lung. Saline treatment alone served as a vehicle control to establish baseline expression levels of SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA isoforms. Mice were sacrificed on 14 days post dosing and SMN2FL and SMN2Δ7 levels were quantified via RT-qPCR using isoform-specific primer sets. Tbp was amplified as an internal reference used to normalize expression data. Data represents mean expression levels of SMN2FL or SMN2Δ7 in the liver, fat tissue (epididymal fat) , thoracic aorta, heart, diaphragm and lung of treated animals relative to the saline control group (mean ± SEM of 2-3 mice per group) .

[0016] FIGs. 5A-5B compares the splicing activity of LDEC-ASOs to non-conjugated ASO at converting SMN2 pre-mRNA to SMN2FL over the SMN2Δ7 mRNA isoform in GM03813 cells. The indicated LDEC-ASOs (i.e., RD-15865, RD-16070, RD-16071, RD-16072, RD-16073, RD-16074, RD-16075, RD-16076, RD-16077, RD-16078, RD-16079, RD-16080, RD-16081 and RD-16098) were transfected into GM03813 cells at 1 nM and 10 nM for 3 days. RD-10004 was transfected and served as a non-conjugate control. Mock treatments were transfected in absence of oligonucleotide. dsCon2 served as a non-specific duplex control. FIG. 5A-5B shows mRNA levels of SMN2FL and SMN2Δ7 as quantified by RT-qPCR using a gene specific primer set in each of the PCR reactions. SDHA was amplified as an internal reference used to normalize expression data. Data represents mean expression levels of SMN2FL or SMN2Δ7 relative to Mock treatment after normalized to SDHA (mean ± SEM of two replicated transfection wells) .

[0017] FIGs. 6A-6B compares the splicing modulating activity of LDEC-ASOs to non-conjugated ASO at converting SMN2 pre-mRNA to SMN2FL over the SMN2Δ7 mRNA isoform in GM09677 and GM03813 cells. The indicated LDEC-ASOs (i.e., RD-15865, RD-16070, RD-16071, RD-16072, RD-16073, RD-16074, RD-16075, RD-16076, RD-16077, RD-16078, RD-16079, RD-16080, RD-16081 and RD-16098) were transfected into GM09677 (FIG. 6A) and GM03813 (FIG. 6B) cells at 0.1 nM and 1 nM for 3 days. RD-10004 was  transfected and served as a non-conjugate control. Mock treatments were transfected in absence of oligonucleotide. dsCon2 served as a non-specific duplex control. FIG. 6A-6B shows mRNA levels of SMN2FL and SMN2Δ7 as quantified by RT-qPCR using a gene specific primer set in each of the PCR reactions. SDHA was amplified as an internal reference used to normalize expression data. Data represents mean expression levels of SMN2FL or SMN2Δ7 relative to Mock treatment after normalized to SDHA (mean ± SEM of two replicated transfection wells) .

[0018] FIGs. 7A-7B compares the splicing modulating activity of LDEC-ASOs to non-conjugated ASO at converting SMN2 pre-mRNA to SMN2FL over the SMN2Δ7 mRNA isoform in GM03813 cells. The indicated LDEC-ASOs (i.e., RD-16935, RD-16936 and RD-16937) were transfected into GM03813 cells at 1 nM and 10 nM for 3 days. RD-10004 was transfected and served as a non-conjugate control. Mock treatments were transfected in absence of oligonucleotide. FIG. 7A-7B shows mRNA levels of SMN2FL and SMN2Δ7 as quantified by RT-qPCR using a gene specific primer set in each of the PCR reactions. SDHA was amplified as an internal reference used to normalize expression data. Data represents mean expression levels of SMN2FL or SMN2Δ7 relative to Mock treatment after normalized to SDHA (mean ± SEM of four replicated transfection wells) .

[0019] FIGs. 8A-8B show changes in expression level of human SCN9A mRNA mediated by ASOs in human neuroblastoma cell line (SK-N-AS) . 119 ASOs on human SCN9A transcript were individually transfected into SK-N-AS cells at 25 and 100 nM for 24 hours. Mock treatments were transfected in the absence of an oligonucleotide (not shown) . RD-10750 served as a non-specific control (not shown) . RD-12746 was transfected as a silencing dsRNA control (not shown) . SCN9A mRNA levels were quantified by one-step RT-qPCR using a gene specific primer set in each of the PCR reactions. Geometric means of the mRNA levels of HPRT1 and HMBS were used as an internal reference. FIG. 8A shows mean expression levels of SCN9A mRNA relative to Mock treatment after normalized to HPRT1 and HMBS at 25 and 100 nM, respectively. ASOs are sorted on x-axis by their activity in knocking SCN9A mRNA expression in a descending order (mean ± SEM of two replicated transfection wells) . FIG. 8B shows Emax knockdown activity of ASOs on SCN9A mRNA between 25 and 100 nM. The top 32 performing ASOs are marked in rectangular solid box.

[0020] FIGs. 9A-9D shows dose-dependent knockdown activity on SCN9A mRNA by ASOs  in SK-N-AS cells. Based on the screening results for SCN9A knockdown activity, top 32 functional ASOs were selected and transfected into SK-N-AS cells at indicated concentration gradient (i.e., 0.02, 0.1, 0.39, 1.56, 6.25, 25, 100 and 400 nM) for 24 hours. Mock treatments were transfected in the absence of an oligonucleotide (not shown) . RD-10750 served as a non-specific control (not shown) . RD-12746 was transfected as a silencing dsRNA control (not shown) . FIGs. 9A-9D show SCN9A mRNA levels were quantified by one-step RT-qPCR using a gene specific primer set in each of the PCR reactions. Geometric means of the mRNA levels of HPRT1 and HMBS were used as an internal reference. The values (y-axis) represented SCN9A mRNA expression of dose response relative to Mock treatment after normalized to HPRT1 and HMBS (mean ± SEM of two replicated transfection wells) .

[0021] FIG. 10 shows tail flick latency of SD rats after intrathecal (IT) injection with LDEC-ASOs. The indicated LDEC-ASOs (i.e., RD-13767 and RD-15069) and non-conjugated ASO (i.e., RD-12835 and RD-15064) were administered via IT injection into adult female SD rats at 0.5 mg and 1 mg. RD-15873 was treated at 1 mg and served as a positive control. aCSF treatment alone served as a vehicle control to establish baseline of tail flick latency. Tail flick latency was tested on day 27 by hot water tail immersion test as described in materials and methods section. Data represents mean tail flick latency of treated group relative to the aCSF group (mean ± SEM of 4-5 mice per group) .

[0022] FIG. 11A to 11B compares the knockdown activity of LDEC-ASOs to non-conjugated ASO on rat Scn9a mRNA expression in SD rats. The indicated LDEC-ASOs (i.e., RD-13767 and RD-15069) and non-conjugate ASOs (i.e., RD-12835 and RD-15064) were administered via IT injection at 0.5 mg and 1 mg. RD-15873 was treated at 1 mg and served as a positive control. aCSF treatment alone served as a vehicle control to establish baseline expression of Scn9a mRNA. FIG. 11A shows the remaining Scn9a mRNA as quantified in tissues from brain (i.e., cerebrum) and spinal cord (i.e., cervical, thoracic and lumbar) via RT-qPCR. FIG. 11B shows the remaining Scn9a mRNA as quantified in dorsal root ganglion (DRG) via RT-qPCR. Rats were sacrificed on 27 days post dosing and Scn9a mRNA levels were quantified via RT-qPCR. Geometric means of the mRNA levels of Tbp and B2m were used as an internal reference to normalize expression data. Data represents mean expression of Scn9a mRNA of treated animals relative to the aCSF control group (mean ± SEM of 4-5 mice per group) .

[0023] FIG. 12 shows exon 51 skipping levels of human DMD mRNA mediated by LDEC- ASOs in human malignant embryonic rhabdomyoma cell line (RD) . 50 human LDEC-ASOs were individually transfected into RD cells at 25 nM for 48 hours. Mock treatments were transfected in the absence of an oligonucleotide. RD-16271 and RD-16272 were transfected and served as non-specific controls. RD-15946 was transfected and served as a LDEC-ASO positive control. Exon 51 skipping levels were quantified by nested PCR using two gene specific primer sets (shown in Table 21) . Data represents mean expression levels of exon 51 skipping relative to Mock treatment (mean ± SEM of two replicated transfection wells) .

[0024] FIG. 13 shows dose-dependent exon 51 skipping levels of human DMD mRNA mediated by LDEC-ASOs in RD cell line. The indicated LDEC-ASOs (i.e., RD-15905, RD-15935, RD-15936, RD-15941, RD-15942, RD-15943 and RD-15944) were individually transfected into RD cells at 10, 25 and 100 nM for 48 hours. Mock treatments were transfected in the absence of an oligonucleotide. RD-16271 served as non-specific controls. RD-15945 was transfected and served as a non-conjugate ASO positive control. RD-15946 was transfected and served as a LDEC-ASO positive control. Exon 51 skipping levels were quantified by nested PCR using two gene specific primer sets (shown in Table 21) . Data represents mean expression levels of exon 51 skipping relative to Mock treatment (mean ± SEM of two replicated transfection wells) .DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0025] The newly developed oligonucleotide delivery agent enables more efficient delivery of desired amount or higher level of the oligonucleotides to the site of action, as compared to the oligonucleotide delivery technologies of the prior art, at the above indicated target tissues, and thus may improve bioactive and pharmacological properties (e.g., biodistribution, bioavailability, pharmacokinetics, activity, potency, etc. ) . In some embodiments, the improvement of bioactive properties may be caused by improved passing-through of biological barriers, higher protein binding, better cellular uptake, less entrapment in endosome, less lysosomal degradation, higher potency, and / or longer duration / half-life. In some embodiments, the improvement of pharmacological properties may also lead to lower toxicity, lower dose, less frequent administrations, and less undesired immune responses. In some embodiments, the present oligonucleotide delivery agent involves a simpler synthesis process and thus has better processibility and scalability in manufacturing. In some embodiments, the  present oligonucleotide delivery agent possesses inherent pharmacological properties of a free benzimidazole or a benzimidazole derivative which being a proton pump or targets proton pump (as reversible and irreversible proton pump inhibitors, PPI) , dopamine receptor (e.g., DRD) , angiotensin II type 1 receptor (AT1) , histamine receptor (e.g., HRH) , dual specific mitogen activated protein kinase (e.g., MEK) and / or cyclin dependent kinase (CDK) , etc. In some embodiments, the inherent pharmacological properties enable the present oligonucleotide delivery agent to be potentially used in drugs including peptic ulcer, hypertension, schizophrenia, parasitic infection, bacterial infection, virus infection, and cancer, etc.

[0026] In some embodiments, the newly developed oligonucleotide delivery agent disclosed herein can facilitate delivery of an effective amount of oligonucleotide molecules to achieve and function at target tissues or cells, e.g., in central nervous system (e.g., brain and spinal cord) , heart, eye, ear, liver, lung, kidney, spleen, fat tissues, intestine, pancreas, cholecyst, muscles (e.g., smooth, skeletal, and cardiac) , diaphragm, thoracic aorta and bone. In some embodiments, the oligonucleotide delivery agent’s modulating activities, e.g., up-regulating or down-regulating, the expression of a target gene in the cells can be improved as compared to the technologies of the prior art. Therefore, in light of the findings provided herein, those skilled in the art will appreciate that use of the oligonucleotide delivery agent as described herein may facilitate improved bio-distribution of therapeutic oligonucleotides in various target (s) or cells as stated above for preventing, treating and / or delaying on-set of various diseases, disorders and / or conditions.

[0027] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the invention belongs. Also, all publications, patent applications, patents, and other references mentioned herein are incorporated by reference.

[0028] As disclosed herein, singular forms, such as “a” and “this” , include plural objects, unless otherwise specified clearly in the context.

[0029] As disclosed herein, the terms “approximately, ” “about, ” “substantially” , and similar terms are intended to have a broad meaning in harmony with the common and accepted usage by those of ordinary skill in the art to which the subject matter of this disclosure pertains.

[0030] As disclosed herein, “and / or” means “and, or as an alternative” . If any numerical  ranges are provided, the ranges include any numerical values in the range (including the upper and lower values) , and any sub-ranges in the range. For example, the range from 1 to 3 may include any of the numerical values 1, 2 and 3, as well as sub-ranges from 1 to 2 and from 2 to 3.

[0031] As used herein, the terms “oligonucleotide” , “polynucleotide” or “oligo” are interchangeable and refer to polymers of nucleotides, and particularly refer to single-stranded nucleic acid molecules of DNA, RNA, or DNA / RNA hybrid, oligonucleotide strands containing regularly and irregularly alternating deoxyribosyl portions and ribosyl portions, as well as modified and naturally or unnaturally existing frameworks for such oligonucleotides, such as a phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO) .

[0032] As used herein, the term “complementary” refers to the capability of forming base pairs between two oligonucleotide strands. The base pairs are generally formed through hydrogen bonds between nucleotides in the antiparallel oligonucleotide strands. The bases of the complementary oligonucleotide strands can be paired in the Watson-Crick manner (such as A to T, A to U, and C to G) or in any other manner allowing the formation of a homogenous or xenogenous duplex (such as RNA-RNA or DNA-RNA duplex by Hoogsteen or reverse Hoogsteen base pairing) .

[0033] As used herein, the term “SMN2FL mRNA” or “SMN2Δ7 mRNA” refers to a message RNA (mRNA) generated from the expression of SMN2 gene, or the transcription of SMN2 gene.

[0034] As used herein, the upper cased “SCN9A” or “SCN9A gene” refers to a human gene; whereas the first letter capitalized “Scn9a” or “Scn9a gene” refers to a mouse gene.

[0035] As used herein, the term “SCN9A mRNA” refers to a message RNA (mRNA) generated from the expression of SCN9A gene, or the transcription of SCN9A gene.

[0036] As used herein, the upper cased “DMD” or “DMD gene” refers to a human gene.

[0037] At least part of the present disclosure also relates an antisense oligonucleotide (ASO) comprising an oligonucleotide sequence having a length ranging from 12 to 30 consecutive nucleotides, wherein the oligonucleotide sequences of SMN2 gene were selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 and their oligonucleotide delivery agent SEQ ID NO: 2-21, wherein the ASO targeting the pre-mRNA of the SMN2 gene to modulate its splicing by inclusion of exon 7 into the matured mRNA, thus “converting” SMN2Δ7 (i.e., SMN2 with  deletion of exon 7) to SMN2Fi (i.e., full-length SMN2 including exon 7) mRNA in a cell, thereby boosting the level of SMN protein encoded by SMN2FL mRNA.

[0038] At least part of the present disclosure also relates an antisense oligonucleotide (ASO) comprising an oligonucleotide sequence having a length ranging from 12 to 30 consecutive nucleotides, wherein the oligonucleotide sequence comprises a nucleotide sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or 100%complementarity to an equal length portion of SEQ ID NO: 22, wherein the ASO inhibits the mRNA transcript of SCN9A gene by at least 50%as compared to the baseline of SCN9A mRNA level.

[0039] The inventors also discovered that optimal antisense oligonucleotide (ASO) sequence within SCN9A mRNA transcript included the 3’-UTR region include sequences having: (1) GC content between 40%and 70%, (2) less than 5 consecutive identical nucleotides, (3) fewer than 3 dinucleotide or trinucleotide repeats, and (4) not on 5’ UTR region of SCN9A mRNA. As a beneficial consequence, a target sequence (e.g., an isolated nucleic acid sequence comprising the target sequence) , inhibits the mRNA transcript of SCN9A gene by at least 50%as compared to the baseline of SCN9A mRNA level.

[0040] Certain embodiments of the present application relate to an ASO target sequence in the SCN9A mRNA transcript included the 3’-UTR regions, wherein the target sequence in the mRNA transcript has at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 99%, or at least 100%homology to the nucleotide sequence selected from group consisting of SEQ ID NOs: 23-141.

[0041] Certain embodiments of the present application also relate to an ASO comprising a single-stranded oligonucleotide sequence that is at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 99%homology or 100%identical to the nucleotide sequence selected from group consisting of chemically modified SEQ ID NOs: 261-379 and SEQ ID NO: 388 and SEQ ID NO: 390, and their unmodified naked sequences SEQ ID NOs: 142-260, wherein the ASO inhibits the mRNA transcript of SCN9A gene by at least 50%as compared to the baseline of SCN9A mRNA level.

[0042] Certain embodiments of the present application also relate to an ASO comprising a single-stranded oligonucleotide sequence that is at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 99%homology or 100%identical to the nucleotide sequence selected from group consisting of oligonucleotide delivery agent SEQ ID  NO: 389 and SEQ ID NO: 391, wherein the ASO inhibits the mRNA transcript of SCN9A gene by at least 50%as compared to the baseline of SCN9A mRNA level.

[0043] At least part of the present disclosure also relates an antisense oligonucleotide (ASO) comprising an oligonucleotide sequence having a length ranging from 12 to 30 consecutive nucleotides, wherein the oligonucleotide sequence comprises a nucleotide sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or 100%complementarity to an equal length portion of SEQ ID NO: 392, wherein the ASO enhances the exon 51 skipping levels of DMD gene by at least 30%as compared to the baseline of DMD exon 51 skipping level.

[0044] The inventors also discovered that optimal antisense oligonucleotide (ASO) sequence within DMD exon 51 region include sequences having: (1) GC content between 40%and 70%; (2) less than 5 consecutive identical nucleotides; (3) fewer than 3 dinucleotide or trinucleotide repeats. As a beneficial consequence, a target sequence (e.g., an isolated nucleic acid sequence comprising the target sequence) , enhances the exon 51 skipping levels of DMD gene by at least 30%as compared to the baseline of DMD exon 51 skipping level.

[0045] Certain embodiments of the present application relate to an ASO target sequence in the DMD exon 51 region, wherein the target sequence in the exon 51 region has at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 99%, or at least 100%homology to the nucleotide sequence selected from group consisting of SEQ ID NOs: 393-442.

[0046] Certain embodiments of the present application also relate to an ASO comprising a single-stranded oligonucleotide sequence that is at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 99%homology or 100%identical to the nucleotide sequence selected from group consisting of oligonucleotide delivery agent SEQ ID NOs: 493-542 and their unmodified naked sequences SEQ ID NOs: 443-492, wherein the ASO enhances the exon 51 skipping levels of DMD gene by at least 30%as compared to the baseline of DMD exon 51 skipping level.

[0047] Also provided here are vectors and cells comprising the oligonucleotide agents of the present disclosure. In some embodiments, the cell is a mammalian cell and is optionally a human cell. In some embodiments, the cell is a host cell. In some embodiments, the cell is in vitro. In some embodiments, the cell exists in a mammalian body.

[0048] In various embodiments, the oligonucleotide delivery agent comprises a single- stranded oligonucleotide having 15 to 35 nucleotides in length, such as for example, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 or 35 nucleotides in length.

[0049] In various embodiments, the oligonucleotide delivery agent comprises a lipid moiety which is a C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 or C20 linear, saturated or unsaturated hydrocarbyl group, such as linear alkyl group or linear alkenyl group. The linear alkenyl group may comprise one to four olefinically unsaturated groups, such as one or two olefinically unsaturated groups. In exemplary embodiments, the lipid moiety includes 2-dodecylenyl, 3-dodecylenyl, 4-dodecylenyl, 5-dodecylenyl, 6-dodecylenyl, 7-dodecylenyl, 8-dodecylenyl, 9-dodecylenyl, 10-dodecylenyl, 2-hexadecylenyl group, 3-hexadecylenyl group, 4-hexadecylenyl group, 5-hexadecylenyl group, 6-hexadecylenyl group, 7-hexadecylenyl group, 8-hexadecylenyl group, 9-hexadecylenyl group, 10-hexadecylenyl group, 11-hexadecylenyl group, 12-hexadecylenyl group, 2-octodecylenyl, 3-octodecylenyl, 4-octodecylenyl, 5-octodecylenyl, 6-octodecylenyl, 7-octodecylenyl, 8-octodecylenyl, 9-octodecylenyl, 10-octodecylenyl, 11-octodecylenyl, 12-octodecylenyl, 4, 7-hexadecyl-dienyl group, 5, 8-hexadecyl-dienyl group, 6, 9-hexadecyl-dienyl group, 7, 10-hexadecyl-dienyl group, 5, 8-octodecyl-dienyl, 6, 9-octodecyl-dienyl or 7, 10-octodecyl-dienyl.

[0050] In certain embodiments, the unsaturated lipid moiety comprises at least one cis-unsaturated double bond in the alkenyl group. In certain embodiments, the unsaturated lipid moiety comprises at least one trans-unsaturated double bond in the alkenyl group.

[0051] In various embodiments, the oligonucleotide delivery agent comprises one or more lipid moiety directly or indirectly conjugated to an oligonucleotide. As used herein, the term “the lipid moiety being indirectly conjugated to an oligonucleotide” refers to the embodiments in which both of the lipid and the oligonucleotide are conjugated to the same DEC moiety, wherein the linkage between the DEC moiety and the oligonucleotide can be a covalent bond or a linking moiety, such as those listed hereinafter.

[0052] On the other hand, the term “lipid moiety being directly conjugated to an oligonucleotide” refers to the embodiments in which the oligonucleotide delivery agent does not comprise the DEC moiety and thus the lipid and the oligonucleotide are linked with each other, either via a covalent bond or via a linking moiety, such as those listed hereinafter.

[0053] In some embodiments, the oligonucleotide delivery agent has a structure presented by Formula A wherein the lipid moiety is conjugated with the oligonucleotide via a DEC moiety,  wherein M, which refers to the number of the lipid moiety, is an integer of 1, 2, 3, 4 or 5, and N, which refers to the number of the DEC compound moieties conjugated to the oligonucleotide, is an integer of 1, 2 or 3. In an exemplary embodiment, the delivery enhancing compound moiety is a bivalent to hexavalent moiety comprising at least one nitrogen-containing heterocyclic ring, and each of the lipid moiety and the oligonucleotide is conjugated to the delivery enhancing compound moiety. In another embodiment, the delivery enhancing compound moiety is a bivalent, trivalent, tetravalent, pentavalent or hexavalent moiety. Preferably, the valence of the delivery enhancing compound moiety equals to M + 1. More preferably, the delivery enhancing compound moiety is a bivalent, trivalent or tetravalent moiety.

[0054] As used herein, the terms “delivery enhancing compound” and “DEC” are used interchangeably and refer to the compound from which the delivery enhancing compound moiety can be derived.

[0055] In exemplary embodiments, the nitrogen-containing heterocyclic ring contained in the DEC may have a core structure shown by any of the following formulae, with all the chemical bonds, atoms and substituents attached to the ring atoms of the core structure omitted for the sake of simplicity:

[0056] The above indicated core structures comprise different ring atoms, and the fused ring core structures may be either electrically neutral or locally charged in the form of e.g., sulphonium or quaternary ammonium. It can be seen that one or more unsaturated double bonds may shift in the fused ring core structure due to the delocalized π-electronic conjugation effect, and all the substituents, including the presence / absence of any substituents, may vary depending on the categories and valences of each ring atom to which the substituents are  attached. For example, an additional substituent may be attached to a sulphonium or quaternary ammonium ion which is present as a ring atom of the fused ring core structure. All of these variations are within the concept of the present disclosure.

[0057] In an embodiment, the attachment of the at least one lipid moiety to the DEC moiety (i.e., the combination of the lipid moiety and the delivery enhancing compound moiety, LDEC) can form a structure the represented by Formula A’ (Lipid moiety) M-Delivery enhancing compound moiety- Formula A’

[0058] wherein the lipid moiety at least one C6-C22 linear alkyl or alkenyl group, such as at least one C8-C18 linear alkyl or alkenyl group, or at least one (e.g., one, two or three) C10-C12 linear alkyl or alkenyl group, the DEC moiety and M are as defined above.

[0059] The exemplary compounds for deriving the structure represented by Formula A’ is particularly defined as follows, and the definition of the DEC moiety can be clearly and unambiguously determined by subtracting the at least one lipid moiety from the structure represented by Formula A’.

[0060] In an embodiment, the structure the represented by Formula A’ is derivable from a structure represented by Formula I or Formula II, e.g., by subtracting at least one hydrogen atom or at least one terminal group from a structure represented by Formula I or Formula II. According to the terminal group may be selected from the group consisting of a hydroxyl group, a carboxy group, an ester group, an ether group, an alkyl group, an alkoxy group, a phosphate group, a phosphonate group, a sulfate group, a sulfonate group, an amide group, an acyl group, and combinations thereof.

[0061] wherein each  independently represents a covalent single or double bond; X, on each occurrence, is an atom selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur; each of F, G, H and I is independently selected from the group consisting of carbon,  nitrogen, oxygen and sulfur.

[0062] In an embodiment, m is an integer of 1, 2 or 3, n is an integer of 1, 2 or 3, and m+n=4. In some exemplary embodiments, m=1 and n=3; or m=2 and n=2; or m=3 and n=1.

[0063] In an embodiment, C, on each occurrence, is either absent or selected from the group consisting of hydrogen; halogen atom, such as fluorine, chlorine, bromine or iodine; hydroxyl; (C1-C20) alkyl, such as - (C2-C19) alkyl, or - (C3-C18) alkyl, or - (C4-C16) alkyl, or - (C6-C12) alkyl, or - (C8-C10) alkyl; (C1-C20) alkoxy, such as - (C2-C19) alkoxy, or - (C3-C18) alkoxy, or - (C4-C16) alkoxy, or - (C6-C12) alkoxy; halogenated (C1-C20) alkyl, such as halogenated (C2-C19) alkyl, or halogenated (C3-C18) alkyl, or halogenated (C4-C16) alkyl, or halogenated (C6-C12) alkyl, or halogenated (C8-C10) alkyl; and halogenated (C1-C20) alkoxy, such as halogenated (C1-C20) alkoxy, such as halogenated (C2-C19) alkoxy, or halogenated (C3-C18) alkoxy, or halogenated (C4-C16) alkoxy, or halogenated (C6-C12) alkoxy, or halogenated (C8-C10) alkoxy; wherein “halogenated” can be fluorinated, chlorinated, brominated, iodinated, or combinations thereof. In an embodiment, in the structure represented by Formula I, each B is attached to any one of F, G, H and I, while C is attached to the rest of F, G, H and I. In an embodiment, B is attached to H and three C’s are separately attached to each of F, G and I. In another embodiment, B is attached to G and three C’s are separately attached to each of F, H and I. In another embodiment, B is attached to F and three C’s are separately attached to each of G, H and I. In another embodiment, B is attached to I and three C’s are separately attached to each of F, G and H. In another embodiment, two B’s are separately attached to G and H, and two C’s are separately attached to each of F and I.

[0064] In an embodiment, B, on each occurrence, is independently selected from the group consisting of hydroxyl; -C (O) OH; -P (O) 2-OH; -P (O) -OH; -P (O) (S) -OH; -CN; - (C1-C22) alkyl, such as - (C2-C20) alkyl, or - (C3-C16) alkyl, or - (C6-C12) alkyl; -O- (C1-C22) alkyl, such as -O- (C2-C20) alkyl, or -O- (C3-C16) alkyl, or -O- (C6-C12) alkyl; - (C1-C22) alkenyl, such as - (C2-C20) alkenyl, or - (C3-C16) alkenyl, or - (C6-C12) alkenyl; - (C1-C22) alkylene-OH, such as - (C2-C20) alkylene-OH, or - (C3-C16) alkylene-OH, or - (C6-C12) alkylene-OH; - (C3-C22) cycloalkylene-OH, such as - (C5-C16) cycloalkylene-OH, or - (C6-C12) cycloalkylene-OH, or - (C6-C10) cycloalkylene-OH; - (C6-C22) arylene-OH; - (C6-C22) heteroarylene-OH; - (C1-C22) alkylene-C (O) OH, such as - (C2-C18) alkylene-C (O) OH, or - (C3-C16) alkylene-C (O) OH, or - (C6-C12) alkylene-C (O) OH; - (C3-C22) cycloalkylene-C (O) OH; - (C6-C22) arylene-C (O) OH; - (C5-C22) heteroarylene-C (O) OH; -O- C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) NH2, such as -O-C (O) - (C2-C18) alkylene-C (O) NH2, or -O-C (O) - (C3-C16) alkylene-C (O) NH2, or -O-C (O) - (C6-C12) alkylene-C (O) NH2; - (C1-C22) alkylene-O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) NH2, such as - (C2-C18) alkylene-O-C (O) - (C2-C18) alkylene-C (O) NH2, or - (C3-C16) alkylene-O-C (O) - (C3-C16) alkylene-C (O) NH2, or - (C6-C12) alkylene-O-C (O) - (C6-C12) alkylene-C (O) NH2; -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) OH; - (C1-C22) alkylene-O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) OH; -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) NH2; - (C1-C22) alkylene-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) NH2; -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-OH; -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) OH; - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) OH; - (C1-C30) alkylene-P (O) 2-OH; - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, such as - (C2-C18) alkylene-O-P (-N (C2-C18 alkyl) 2) -O- (C2-C18) alkylene-CN, or - (C3-C16) alkylene-O-P (-N (C3-C16 alkyl) 2) -O- (C3-C16) alkylene-CN, or - (C6-C12) alkylene-O-P (-N (C6-C12 alkyl) 2) -O- (C6-C12) alkylene-CN; - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH; - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2; - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH; -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN; -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH; -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C30) alkylene-C (O) OH; -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2; - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN; - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH; - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH; - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2; - (C1-C22) alkylene -P (O) -OH; - (C1-C22) alkylene-P (O) (S) -OH and - (C1-C22) alkylene-CN. Each of the (C1-C22) alkyl or (C1-C22) alkylene included in B can be an alkyl or alkylene comprising from 1 to 22 carbon atoms, or from 2 to 20 carbon atoms, or from 3 to 16 carbon atoms, or from 4 to 12 carbon atoms, or from 6 to 12 carbon atoms, or from 8 to 10 carbon atoms.

[0065] In an embodiment, each of A1, A2 and A3 is either absent or a substituent independently selected from the group consisting of -H, -OH, -O-R1, -SH, - (C1-C22) alkyl, halogenated - (C1-C22) alkyl, - (C2-C22) alkenyl, - (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkenylene-OH, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C3-C22) cycloalkenyl, - (C1-C22) alkylene- (C3-C22) cycloalkyl, - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkenylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-R1, - (C1-C22) alkenylene-O-R1, -  (C1-C22) alkylene-COOR1, - (C1-C22) alkenylene-COOR1, -C (O) O-R1, -O- (C1-C22) alkyl, -S- (C1-C22) alkyl, -C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkyl, -O-C (O) - (C1-C22) alkyl, -O-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-O-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NR2-R1, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-OH, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, -adamantyl, - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -O-adamantly, -C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -halogenated (C1-C22) alkyl, -CH (NH-CO- (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, -CH (NH-CO-halogenated (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -halogenated (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene- (C1-C6 alkylene oxide) (1-20) -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -C (O) NH- (C1-C22) alkyl, -C (O) NH-R1, -C (O) NR2-R1, -C (O) NH- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) NH- (C1-C22) alkylene-COOH, -NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, -NH-C (O) -R1, -NR2-C (O) -R1, -O-P (O) 2-O-R1, -OP (O) (S) -O-R1, -O-P (O) -O-R1, -NH-R1, -NR2-R1, - (C1-C22) alkylene-NH-R1, - (C1-C22) alkylene-NR2-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) O-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) - NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C30) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH,  - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene -P (O) -OH, - (C1-C22) alkylene-P (O) (S) -OH, - (C1-C22) alkylene-CN, substituted or unsubstituted pyrrole, substituted or unsubstituted pyrroline, substituted or unsubstituted pyrrolidine, substituted or unsubstituted pyrazole, substituted or unsubstituted pyrazoline, substituted or unsubstituted pyrazolidine, substituted or unsubstituted imidazole, substituted or unsubstituted oxazole, substituted or unsubstituted thiazole, substituted or unsubstituted benzopyrrole, substituted or unsubstituted benzopyrroline, substituted or unsubstituted benzopyrrolidine, substituted or unsubstituted benzopyrazole, substituted or unsubstituted benzopyrazoline, substituted or unsubstituted benzopyrazolidine, substituted or unsubstituted benzoimidazole, substituted or unsubstituted benzooxazole, substituted or unsubstituted benzothiazole, wherein when the above indicated rings are substituted, the substituents may include hydroxyl, halogen atom (such as fluorine, chlorine, bromine or iodine) , (C1-C16) alkyl, (C1-C12) alkoxy; and a substituent represented by Formula III,

[0066] In an embodiment, Y is selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur; and each of P, Q, S and T is independently selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur; and the asterisk refers to the site wherein the substituent represented by Formula III is linked with the structure represented by Formula I or Formula II;

[0067] In an embodiment, each of R3, R4 and R5 is either absent or a substituent independently selected from the group consisting of -H, -OH, -O-R1, -SH, - (C1-C22) alkyl, halogenated - (C1-C22) alkyl, - (C2-C22) alkenyl, - (C1-C22) alkylene-OH, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C3-C22) cycloalkenyl, - (C1-C22) alkylene- (C3-C22) cycloalkyl, - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-R1, - (C1-C22) alkylene-COOR1, -C (O) O-R1, -O- (C1-C22) alkyl, -S- (C1-C22) alkyl, -C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkyl, -O-C (O) - (C1-C22) alkyl, -O-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-O-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NR2-R1, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-OH, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, -adamantyl, - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -O-adamantly, -C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -  (C1-C22) alkylene-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -halogenated (C1-C22) alkyl, -CH (NH-CO- (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, -CH (NH-CO-halogenated (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -halogenated (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene- (C1-C6 alkylene oxide) (1-20) -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -C (O) NH- (C1-C22) alkyl, -C (O) NH-R1, -C (O) NR2-R1, -C (O) NH- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) NH- (C1-C22) alkylene-COOH, -NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, -NH-C (O) -R1, -NR2-C (O) -R1, -O-P (O) 2-O-R1, -OP (O) (S) -O-R1, -O-P (O) -O-R1, -NH-R1, -NR2-R1, - (C1-C22) alkylene-NH-R1, - (C1-C22) alkylene-NR2-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) O-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C30) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene -P (O) -OH, - (C1-C22) alkylene-P (O) (S) -OH, - (C1-C22) alkylene-CN, substituted or unsubstituted pyrrole, substituted or unsubstituted pyrroline, substituted or unsubstituted pyrrolidine, substituted or unsubstituted pyrazole, substituted or unsubstituted pyrazoline, substituted or unsubstituted pyrazolidine, substituted or unsubstituted imidazole, substituted or unsubstituted oxazole,  substituted or unsubstituted thiazole, substituted or unsubstituted benzopyrrole, substituted or unsubstituted benzopyrroline, substituted or unsubstituted benzopyrrolidine, substituted or unsubstituted benzopyrazole, substituted or unsubstituted benzopyrazoline, substituted or unsubstituted benzopyrazolidine, substituted or unsubstituted benzoimidazole, substituted or unsubstituted benzooxazole, and substituted or unsubstituted benzothiazole, wherein when the above indicated rings are substituted, the substituents may include hydroxyl, halogen atom (such as fluorine, chlorine, bromine or iodine) , (C1-C16) alkyl, (C1-C12) alkoxy.

[0068] In an embodiment, R7, on each occurrence, is attached to any one of P, Q, S and T, and is either absent or selected from the group consisting of hydrogen, halogen atom, hydroxyl, (C1-C20) alkyl, (C1-C20) alkoxy, halogenated (C1-C20) alkyl and halogenated (C1-C20) alkoxy.

[0069] In an embodiment, p is an integer of 0, 1, 2 or 3.

[0070] In an embodiment, R6 is attached to any one of P, Q, S and T, and is selected from the group consisting of direct bond, -O-, -C (O) O-, -O-C (O) -, -P (O) 2-O-, -O-P (O) 2-O-, -P (O) (S) -O-, -O-P (O) (S) -O-, -O-P (O) -O-, - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-O-, -O- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-, -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -C (O) -O- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C30) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-C (O) -, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-, -C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-O-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH-, -C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) -, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-O-, -N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-, -N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-O-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, -N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-, -N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) -, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C22) alkylene -P (O) 2-O-, - (C1-C22) alkylene-O-P (O) 2-O-, - (C3-C22) cycloalkylene-, -  (C3-C22) cycloalkylene-O-, -O- (C3-C22) cycloalkylene-, - (C6-C22) arylene-, - (C6-C22) arylene-O-, -O- (C6-C22) arylene-, - (C6-C22) arylene-NH-, -NH- (C6-C22) arylene-, -C (O) - (C6-C22) arylene-, - (C6-C22) arylene-C (O) -, -C (O) -O- (C6-C22) arylene-, - (C6-C22) arylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C6-C22) arylene-and -C (O) -NH- (C6-C22) arylene-C (O) -O-.

[0071] In an embodiment, R1, on each occurrence, is independently selected from the group consisting of hydrogen, hydroxyl, - (C1-C22) alkyl, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C6-C22) aryl, - (C1-C22) alkoxy, - (C3-C22) cycloalkoxy, - (C6-C22) aryloxy, -C (O) - (C1-C22) alkyl, -OC (O) (C1-C22) alkyl, -C (O) -O- (C1-C22) alkyl, -C (O) - (C3-C22) cycloalkyl, -OC (O) - (C3-C22) cycloalkyl, -C (O) -O- (C3-C22) cycloalkyl, -C (O) - (C6-C22) aryloxy, -OC (O) - (C6-C22) aryloxy, -C (O) -O- (C6-C22) aryloxy, -C (O) -phosphate ester group, phosphodiester group, phosphoramidite group, saturated fatty acid group, unsaturated fatty acid group, lipid, PEG, steroid, lipophile, carbohydrate, cholesterol, adamantane, amino acid, peptide, chloroquine and alkaloid.

[0072] In an embodiment, R2, on each occurrence, is independently selected from the group consisting of a halogen atom, a (C1-C12) alkyl, a (C1-C12) alkoxy, a (C1-C12) alkoxycarbonyl, a (C6-C16) aryl or a (C6-C16) aryloxycarbonyl.

[0073] In an embodiment, one or more hydroxyl group, carboxyl group, amino group, nitrile group and phosphoric acid group contained in A1, A2, A3, B, C, R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 can be protected with a terminal protective group RP selected from the group consisting of (C1-C22) alkyl, (C1-C22) alkoxy, (C1-C22) alkylcarbonyl, (C1-C22) alkoxycarbonyl, (C6-C22) aryl, (C6-C22) aryloxy, (C6-C22) arylcarbonyl, (C6-C22) aryloxycarbonyl, tri ( (C1-C22) alkyl) silyl and tri( (C1-C22) alkoxy) silyl, wherein the (C1-C22) alkyl contained in the protection group Rp can be an alkyl comprising from 1 to 22 carbon atoms, such as from 2 to 20 carbon atoms, or from 3 to 18 carbon atoms, or from 4 to 16 carbon atoms, or from 6 to 12 carbon atoms; the (C1-C22) alkoxy contained in Rp can be an alkoxy comprising from 1 to 22 carbon atoms, such as from 2 to 20 carbon atoms, or from 3 to 18 carbon atoms, or from 4 to 16 carbon atoms, or from 6 to 12 carbon atoms; the (C6-C22) aryl contained in Rp can be an aryl comprising from 6 to 22 carbon atoms, such as from 6 to 20 carbon atoms, or from 6 to 18 carbon atoms, or from 6 to 16 carbon atoms, or from 6 to 12 carbon atoms, or from 8-10 atoms; and the (C6-C22) aryloxy contained in Rp can be an aryloxy comprising from 6 to 22 carbon atoms, such as from 6 to 20 carbon atoms, or from 6 to 18 carbon atoms, or from 6 to 16 carbon atoms, or from 6 to 12 carbon atoms, or from 8-10 atoms.

[0074] In an embodiment, A1, A2 and A3 are not simultaneously hydrogen and R3, R4 and R5 are not simultaneously hydrogen. In an exemplary embodiment, X is carbon, and all of A1, A2 and A3 are present. In another embodiment, X is nitrogen, both A1 and A2 are present and A3 is absent. In another embodiment, X is nitrogen with positive charge (i.e. quaternary ammonium) , and all of A1, A2 and A3 are present. In another embodiment, X is sulfur or oxygen, both A1 and A3 are absent and A2 is present. In another embodiment, X is sulfur with positive charge (i.e. sulfonium) , both A2 and A3 are present and A1 is absent.

[0075] In an embodiment, each of the (C1-C22) alkyl or (C1-C22) alkylene included in A1, A2, A3, R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 can be an alkyl or alkylene comprising from 1 to 22 carbon atoms, or from 2 to 20 carbon atoms, or from 3 to 16 carbon atoms, or from 4 to 12 carbon atoms, or from 6 to 12 carbon atoms, or from 8 to 10 carbon atoms.

[0076] In an embodiment, one or more hydroxyl group, carboxyl group, amino group, nitrile group and phosphoric acid group contained in A1, A2, A3, B, C, R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 can be linked with a support material selected from the group consisting of silica, silica gel, glass, ceramic, polymer, cellulose, and combinations thereof. In some embodiments, the solid material is in the form of a bead. The bead may be made of any material including, without limitation, magnetic bead, paramagnetic bead, silica bead, an agarose bead, etc.

[0077] In an embodiment, at least one of A1, A2, A3, R3, R4 and R5 corresponds to the lipid moiety as stated above. In another embodiment, one, two or three of A1, A2, A3, R3 and R4 corresponds to the lipid moiety as stated above. In another embodiment, the structure of Formula A’ does not comprise the R3, R4 and R5, and at least one of A1, A2 and A3 corresponds to the lipid moiety.

[0078] In another embodiment, the compound of the present disclosure may have a structure represented by any of Formula IV to Formula XIII,

[0079] wherein A1, A2, A3, B, C, F, G, H, I, m and n are as defined above.

[0080] In some embodiments, the oligonucleotide delivery agent is a compound comprising at least one nitrogen-containing linear chain group, at least one nitrogen-containing linear chain-carbocyclic ring group, or combinations thereof. In some exemplary embodiments, the delivery enhancing compound moiety may include a structure selected from the group consisting of - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, - (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - (C3-C12) cycloalkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene- (C3-C12) cycloalkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene- (C3-C12) cycloalkylene- (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, - (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, - (C3-C12) cycloalkylene-C (O) -NH-, - (C1-C16) alkylene- (C3-C12) cycloalkylene-C (O) -NH-, - (C1-C16) alkylene- (C3-C12) cycloalkylene- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-; such as - (C2-C12) alkylene-NH-C (O) -, - (C2-C12) alkylene-C (O) -NH-, - (C2-C12) alkylene-O- (C2-C12) alkylene-NH-C (O) -, - (C2-C12) alkylene-O- (C2-C12) alkylene-O- (C2-C12) alkylene-NH-C (O) -, - (C3-C8)cycloalkylene-NH-C (O) -, - (C1-C12) alkylene- (C3-C8) cycloalkylene-NH-C (O) -, - (C1-C12) alkylene- (C3-C8) cycloalkylene- (C1-C12) alkylene-NH-C (O) -, - (C2-C12) alkylene-O- (C2-C12) alkylene-C (O) -NH-, - (C2-C12) alkylene-O- (C1-C12) alkylene-O- (C1-C12) alkylene-C (O) -NH-, - (C3-C8) cycloalkylene-C (O) -NH-, - (C2-C12) alkylene- (C3-C8) cycloalkylene-C (O) -NH-, - (C2-C12) alkylene- (C3-C8) cycloalkylene- (C2-C12) alkylene-C (O) -NH-; or - (C1-C6) alkylene-NH- C (O) -, - (C1-C6) alkylene-C (O) -NH-, - (C1-C6) alkylene-O- (C1-C6) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C6)alkylene-O- (C1-C6) alkylene-O- (C1-C6) alkylene-NH-C (O) -, - (C3-C6) cycloalkylene-NH-C (O) -, - (C1-C6) alkylene- (C3-C6) cycloalkylene-NH-C (O) -, - (C1-C6) alkylene- (C3-C6)cycloalkylene- (C1-C6) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C6) alkylene-O- (C1-C6) alkylene-C (O) -NH-, - (C1-C6) alkylene-O- (C1-C6) alkylene-O- (C1-C6) alkylene-C (O) -NH-, - (C3-C6) cycloalkylene-C (O) -NH-, - (C1-C6) alkylene- (C3-C6) cycloalkylene-C (O) -NH-, - (C1-C6) alkylene- (C3-C6)cycloalkylene- (C1-C6) alkylene-C (O) -NH-.

[0081] In another embodiment, when any one or more of the above indicated substituents comprise at least one double bond, each of the double bond and the atoms or moieties attached to the same may be in E form or Z form.

[0082] In some embodiments, at least one hydrogen atom (i.e. H) contained in the lipid moiety and / or the delivery enhancing compound moiety is substituted with deuterium atom (i.e. D) . In an exemplary embodiment, the lipid moiety and / or the delivery enhancing compound moiety comprises one to twenty, such as one to fifteen, or one to twelve, or one to ten, or one to eight, or one to six, or one to three, or one to two deuterium atoms. In an exemplary embodiment, 1%to 100%, or 2%to 90%, or 5%to 80%, or 10%to 70%, or 20%to 60%, or 30%to 50%, or 40%to 45%by mole of the hydrogen atom contained in the lipid moiety and / or the delivery enhancing compound moiety is substituted with deuterium atom. In another exemplary embodiment, the deuterium substitution rate can be within a numerical range obtained by combining any two of the above said end point values.

[0083] In an exemplary embodiment, the combination of the lipid moiety and the delivery enhancing compound moiety represented by Formula A’ can be derived from, e.g., by subtracting at least one hydrogen atom or terminal group, from any of the following compound C1 to compound C71:

[0084] wherein  represents a support material as defined above.

[0085] In an embodiment, the oligonucleotide contained in the oligonucleotide delivery agent of the present disclosure can be selected from the group consisting of antisense oligonucleotide (ASO) , antisense RNA, short interfering RNA (siRNA) , micro-RNA (miRNA) , small activating RNA (saRNA) , dsRNA, small guide RNA (sgRNA) , and phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO) . Preferably the oligonucleotide is an antisense oligonucleotide (ASO) .

[0086] Another some embodiments of the present disclosure, the structure the represented by Formula A’ is linked with the oligonucleotide via a covalent bond or linked with the oligonucleotide via at least one linking moiety, so as to form the oligonucleotide delivery agent. Another some other embodiments of the present disclosure, the at least one lipid (i.e. said linear alkyl or alkenyl group) is linked with the oligonucleotide via a covalent bond or via at least one linking moiety, so as to form the oligonucleotide delivery agent. In an embodiment, the linking moieties, when present, can be selected from the group consisting of -O-, -S-, -C (O) -, -NH-, -N ( (C1-C12) alkyl) -, -N ( (C1-C12) alkyl) -C (O) -O-, -O-C (O) -, -C (O) -O-, -O-C (O) -O-, -C (O) -NH-, -OP (O) 2O-, -P (O) (O-) O-, -OP (O) O-, -OP (O) (S) O-, -OP (O) (S-) O-, -O-S (O) 2-O-, -S (O) 2-O-, -S (O) -O-, - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-, -NH- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C22) alkylene-C (O) -, - (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-, -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -NH- (C1-C22) alkylene-NH-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) O-, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -O- (C1-C22) alkylene-O-C (O) -, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C22) alkylene-OP (O) 2O-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) (O-) O-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) (O-) O- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) O-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) (S) O-, - (C1-C22) alkylene-O-S (O) 2-O-, - (C1-C22) alkylene-S (O) 2-O-, - (C1-C22) alkylene-S (O) -O-, -O-P (O) 2-O- (C1-C22) alkylene-OP (O) 2O-, -O-P (O) -O- (C1-C22) alkylene-OP (O) O-, -OP (O) (S) O- (C1-C22) alkylene-OP (O) (S) O-, -O-S (O) 2-O- (C1-C22) alkylene-O-S (O) 2-O-, -S (O) 2-O- (C1-C22) alkylene-S (O) 2-O-and -O-S (O) - (C1-C22) alkylene-S (O) -O-; wherein the - (C1-C22) alkylene-contained in the linking moiety can be an alkylene group comprising from 1 to 22 carbon atoms, such as from 2 to 20 carbon atoms, or from 3 to 18 carbon atoms, or from 4 to 16 carbon atoms, or from 5 to 12 carbon atoms, or from 6 to 10 carbon atoms.

[0087] In an embodiment, the oligonucleotide delivery agent may comprise one, two, or three (i.e., N=1, 2 or 3) structures of Formula A’, each of which is separately linked with the oligonucleotide via one, two or three linking moieties as stated above. For example, the oligonucleotide delivery agent may have a structure represented by any of the following formulae AI to AVII :

[0088] wherein L represents the linking moiety, ☆ represents the combination of the lipid moiety and the delivery enhancing compound moiety represented by Formula A’,  represents a single-stranded oligonucleotide, and each of a, b and c is independently an integer from 1 to 50, such as an integer from 2 to 45, or an integer from 3 to 40, or an integer from 4 to 35, or an integer from 5 to 30, or an integer from 10 to 20. Each of the linking moiety, and thus the combination of the lipid moiety and the delivery enhancing compound moiety represented by Formula A’, may be linked at 3’ end, 5’ end or any internal position, such as the nth nucleotide, of the single-stranded oligonucleotide.

[0089] In one embodiment, one or more of the substituents A1, A2, A3, B and C of the delivery enhancing compound can be linked with the linking moiety or with the oligonucleotide (when the linking moiety is a direct bond) . For example, either one of A1, A2, A3 and B, preferably A2 or B is linked with the linking moiety or the oligonucleotide. Without being limited to any theory, one or more terminal groups of the above said substituents (such as DMTrO-C1-C22 alkylene-or - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN) , may be  cleaved or hydrolyzed to decap an active site (such as a - (C1-C22) alkylene-OH group) which is then linked with the oligonucleotide via a linking moiety (such as -P (O) (O-) O-or -OP (O) (S-) O-, ) . For example, exemplary structures of the oligonucleotide delivery agents include O1 to O20, which are also referred as RD-14644, RD-14645, RD-14646, RD-15865, RD-16070, RD-16071, RD-16072, RD-16073, RD-16074, RD-16075, RD-16076, RD-16077, RD-16078, RD-16079, RD-16080, RD-16081, RD-16098, RD-16935, RD-16936 and RD-16937 respectively in the following examples and figures, as illustrated below, wherein Y represents O or S atom.

[0090] It can be seen that in the structures of the oligonucleotide delivery agents O1, O2 and O3, each of the delivery enhancing compounds is linked with single-stranded RNA (including  but not limited to ASO) at one or both of the 3’-terminus and 5’-terminus via a linking moiety, such as -OP (O) 2O-, (-P (O) (O-) -O-) or (-P (O) (S-) -O-.

[0091] Another embodiment of the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the oligonucleotide delivery agent. In another embodiment, the pharmaceutical composition may comprise one or more additional ingredients, such as pharmaceutically acceptable carrier, excipient, solvent, diluent, stabilizer, dispersant, buffer, compatibilizer, preservative agent and combinations thereof.

[0092] Another embodiment of the present disclosure provides a method of modulating the expression of a target gene in vitro or in vivo, comprising the step of administrating the pharmaceutical composition to a subject, or contacting the pharmaceutical composition with cells of the subject. For example, it is estimated that the oligonucleotide delivery agent and pharmaceutical composition can be applied in various organs, tissues and cells, such as in central nervous system (e.g., brain and spinal cord) , heart, eye, ear, liver, lung, kidney, spleen, fat tissues, intestine, pancreas, cholecyst, muscles (e.g., smooth, skeletal, and cardiac) , diaphragm, thoracic aorta and bone, and modulate the expression of one or more target genes in the cell thereof. In some embodiments, the oligonucleotide contained in the oligonucleotide delivery agent targets one or more genes selected from SMN2, SCN9A, Scn9a and DMD. In some specific embodiments, the oligonucleotide contained in the oligonucleotide delivery agent targeting SMN2 comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1. In some specific embodiments, the oligonucleotide contained in the oligonucleotide delivery agent targeting SCN9A comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 142-260, SEQ ID NO: 261-379, SEQ ID NO: 388 and SEQ ID NO: 390. In some specific embodiments, the oligonucleotide contained in the oligonucleotide delivery agent targeting DMD comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 443-492.

[0093] Another embodiment of the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the oligonucleotide delivery agent capable of treating muscular system diseases. In another embodiment, the muscular system diseases include primary muscular system diseases, e.g., polymyositis, dermatomyositis, muscular dystrophy such as Duchenne, Becker, congenital, myotonic, limb-girdle, facioscapulohumeral, Emery-Dreifuss, distal, and  oculopharyngeal muscular dystrophies, myasthenia gravis, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , spinal muscular atrophy (SMA) , rhabdomyolysis, cardiomyopathy, and sarcopenia. In another embodiment, the muscular system diseases include secondary muscular system diseases, e.g., muscular disorders caused by infectious diseases, endocrine disorders or diseases of the glands, metabolic disorders such as diabetes, immunological conditions such as HIV / AIDS, and vascular diseases.

[0094] Another embodiment of the present disclosure provides an application of the pharmaceutical composition comprising the oligonucleotide delivery agent in the manufacturing of a medicament treating muscular disorders including muscular cancer such as sarcoma, neuromuscular diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , spinal muscular atrophy (SMA) , autoimmune disorders such as myasthenia gravis (MG) , and various types of myopathies, inflammatory muscle weakness caused by polymyositis, cardiovascular disease such as coronary artery disease, chronic pain disorders such as fibromyalgia, genetic disorders such as muscular dystrophy (e.g., Duchenne, Becker, congenital, myotonic, limb-girdle, facioscapulohumeral, Emery-Dreifuss, distal, and oculopharyngeal muscular dystrophies) , infectious damage of muscle fibers such as Lyme disease, malaria and Rocky Mountain spotted fever, injury caused muscles strain and paralysis, and muscle pains caused by medications or a severe allergic reaction to a medication or a toxic substance.

[0095] Particular embodiments

[0096] A partiuclar embodiment comprises an oligonucleotide delivery agent comprising one or more lipid moiety directly or indirectly conjugated to an oligonucleotide, wherein at least one of the lipid moieties comprises at least one C6-C22 linear alkyl group, at least one C6-C22 linear alkenyl group or a combination thereof, and the oligonucleotide is a single-stranded oligonucleotide.

[0097] In another partiuclar embodiment, the lipid moieties comprise C12-C20 linear alkyl group, C12-C20 linear alkenyl group or a combination thereof, and the C12-C20 linear alkenyl group comprises one or two olefinically unsaturated groups.

[0098] In another partiuclar embodiment, the C6-C22 linear alkyl group is selected from the group consisting of linear dodecyl, linear myristyl, linear pentadecyl, linear hexadecyl group, linear  octodecyl, linear eicosyl, linear dodecylenyl, linear myristylenyl, linear pentadecylenyl, linear hexadecylenyl group, linear octodecylenyl, linear eicosylenyl, linear dodecyl-dienyl, linear myristyl-dienyl, linear pentadecyl-dienyl, linear hexadecyl-dienyl group, linear octodecyl-dienyl, linear eicosyl-dienyl.

[0099] In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide is a single-stranded oligonucleotide.

[0100] In another partiuclar embodiment, the single-stranded oligonucleotide has 15 to 35 nucleotides in length.

[0101] In another partiuclar embodiment, the lipid moiety is directly conjugated to the single-stranded oligonucleotide via a covalent bond or a linking moiety having the following structure

[0102] wherein Y1 is oxygen or sulfur, the asterisk (*) refers to the site wherein the linking moiety is attached to the single-stranded oligonucleotide, and the double asterisk (**) refers to the site wherein the linking moiety is attached to the lipid moiety.

[0103] In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide delivery agent has a structure presented by Formula A:

[0104] [(Lipid moiety)M—Delivery enhancing—compound moiety]N—oligonucleotide   Formula A

[0105] wherein the lipid moiety comprises at least one C6-C22 linear alkyl group, at least C6-C22 linear alkenyl group, or a combination thereof, and M is an integer of 1 to 5, the oligonucleotide is a single-stranded oligonucleotide, and N is an integer of 1, 2 or 3; and

[0106] the delivery enhancing compound moiety is a bivalent to hexavalent moiety comprising at least one nitrogen-containing heterocyclic ring, at least one nitrogen-containing linear chain group, at least one nitrogen-containing linear chain-carbocyclic ring group, or combinations thereof, and each of the lipid moiety and the oligonucleotide is directly or indirectly conjugated to the delivery enhancing compound moiety.

[0107] In another partiuclar embodiment, the lipid moiety is a C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 or C20 linear, saturated or unsaturated hydrocarbyl group, and M is an integer of 1,  2, 3, 4 or 5.

[0108] In another partiuclar embodiment, the unsaturated lipid moiety has at least one cis-or trans-unsaturated double bond in the hydrocarbyl group.

[0109] In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide is at least one single-stranded oligonucleotide selected from the group consisting of antisense oligonucleotide (ASO) , antisense RNA, short interfering RNA (siRNA) , microRNA (miRNA) , small activating RNA (saRNA) , small cytoplasmic RNA (scRNA) , small guide RNA (sgRNA) and phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO) .

[0110] In another partiuclar embodiment, the combination of the lipid moiety and the delivery enhancing compound moiety represented by Formula A’ has a structure obtainable by subtracting at least one hydrogen atom or terminal group from a structure represented by Formula I or Formula II, wherein the terminal group is selected from the group consisting of a hydroxyl group, a carboxy group, an ester group, an ether group, a phosphate group, a phosphonate group, a sulfate group, a sulfonate group, an amide group, an acyl group, and combinations thereof, and with the proviso that at least one of A1, A2, A3, R3, R4 and R5 is a C6-C22 linear alkyl group, and preferably a linear hexadecyl group, (Lipid moiety) M-Delivery enhancing compound moiety- Formula A’

[0111] wherein each  independently represents a covalent single or double bond; X, on each occurrence, is selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur; each of F, G, H andI is independently selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur;

[0112] wherein m is an integer of 1, 2 or 3, n is an integer of 1, 2 or 3, and m+n=4;

[0113] wherein C, on each occurrence, is either absent or selected from the group consisting of hydrogen, halogen atom, hydroxyl, (C1-C20) alkyl, (C1-C20) alkoxy, halogenated (C1-C20) alkyl  and halogenated (C1-C20) alkoxy;

[0114] wherein B, on each occurrence, is independently selected from the group consisting of hydroxyl, -C (O) OH, -P (O) 2-OH, -P (O) -OH, -P (O) (S) -OH, -CN, - (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkenyl, - (C1-C22) alkylene-OH, - (C3-C22) cycloalkylene-OH, - (C6-C22) arylene-OH, - (C6-C22) heteroarylene-OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C3-C22) cycloalkylene-C (O) OH, - (C6-C22) arylene-C (O) OH, - (C5-C22) heteroarylene-C (O) OH, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) NH2, - (C1-C22) alkylene-O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) NH2, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C22) alkylene-O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) NH2, - (C1-C22) alkylene-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) NH2, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C30) alkylene-P (O) 2-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C30) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene -P (O) -OH, - (C1-C22) alkylene-P (O) (S) -OH, - (C1-C22) alkylene-CN,

[0115] wherein each of A1, A2 and A3 is either absent or a substituent independently selected from the group consisting of -H, -OH, -O-R1, -SH, - (C1-C22) alkyl, halogenated - (C1-C22) alkyl, - (C2-C22) alkenyl, - (C1-C22) alkylene-OH, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C3-C22) cycloalkenyl, - (C1-C22) alkylene- (C3-C22) cycloalkyl, - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkenylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-R1, - (C1-C22) alkenylene-O-R1, - (C1-C22) alkylene-COOR1, - (C1-C22) alkenylene-COOR1, -C (O) O-R1, -O- (C1-C22) alkyl, -S- (C1-C22) alkyl, -C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkyl, -O-C (O) - (C1-C22) alkyl, -O-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-O-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NR2-R1, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-OH, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - adamantyl, - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -O-adamantly, -C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -halogenated (C1-C22) alkyl, -CH (NH-CO- (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, -CH (NH-CO-halogenated (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -halogenated (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene- (C1-C6 alkylene oxide) (1-20) -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -C (O) NH- (C1-C22) alkyl, -C (O) NH-R1, -C (O) NR2-R1, -C (O) NH- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) NH- (C1-C22) alkylene-COOH, -NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, -NH-C (O) -R1, -NR2-C (O) -R1, -O-P (O) 2-O-R1, -OP (O) (S) -O-R1, -O-P (O) -O-R1, -NH-R1, -NR2-R1, - (C1-C22) alkylene-NH-R1, - (C1-C22) alkylene-NR2-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) O-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C30) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene -P (O) -OH, - (C1-C22) alkylene-P (O) (S) -OH, - (C1-C22) alkylene-CN, substituted or unsubstituted pyrrole, substituted or unsubstituted pyrroline, substituted or unsubstituted pyrrolidine, substituted or unsubstituted pyrazole, substituted or unsubstituted pyrazoline, substituted or unsubstituted  pyrazolidine, substituted or unsubstituted imidazole, substituted or unsubstituted oxazole, substituted or unsubstituted thiazole, substituted or unsubstituted benzopyrrole, substituted or unsubstituted benzopyrroline, substituted or unsubstituted benzopyrrolidine, substituted or unsubstituted benzopyrazole, substituted or unsubstituted benzopyrazoline, substituted or unsubstituted benzopyrazolidine, substituted or unsubstituted benzoimidazole, substituted or unsubstituted benzooxazole, substituted or unsubstituted benzothiazole, and a substituent represented by Formula III,

[0116] wherein Y is selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur; and each of P, Q, S and T is independently selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur; and the asterisk refers to the site wherein the substituent represented by Formula III is linked with the structure represented by Formula I or Formula II;

[0117] wherein each of R3, R4 and R5 is either absent or a substituent independently selected from the group consisting of -H, -OH, -O-R1, -SH, - (C1-C22) alkyl, halogenated - (C1-C22) alkyl, - (C2-C22) alkenyl, - (C1-C22) alkylene-OH, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C3-C22) cycloalkenyl, - (C1-C22) alkylene- (C3-C22) cycloalkyl, - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkenylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-R1, - (C1-C22) alkenylene-O-R1, - (C1-C22) alkylene-COOR1, - (C1-C22) alkenylene-COOR1, -C (O) O-R1, -O- (C1-C22) alkyl, -S- (C1-C22) alkyl, -C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkyl, -O-C (O) - (C1-C22) alkyl, -O-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-O-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NR2-R1, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-OH, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, -adamantyl, - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -O-adamantly, -C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -halogenated (C1-C22) alkyl, -CH (NH-CO- (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, -CH (NH-CO-halogenated (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -halogenated (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1- C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene- (C1-C6 alkylene oxide) (1-20) -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -C (O) NH- (C1-C22) alkyl, -C (O) NH-R1, -C (O) NR2-R1, -C (O) NH- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) NH- (C1-C22) alkylene-COOH, -NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, -NH-C (O) -R1, -NR2-C (O) -R1, -O-P (O) 2-O-R1, -OP (O) (S) -O-R1, -O-P (O) -O-R1, -NH-R1, -NR2-R1, - (C1-C22) alkylene-NH-R1, - (C1-C22) alkylene-NR2-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) O-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C30) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene -P (O) -OH, - (C1-C22) alkylene-P (O) (S) -OH, - (C1-C22) alkylene-CN, substituted or unsubstituted pyrrole, substituted or unsubstituted pyrroline, substituted or unsubstituted pyrrolidine, substituted or unsubstituted pyrazole, substituted or unsubstituted pyrazoline, substituted or unsubstituted pyrazolidine, substituted or unsubstituted imidazole, substituted or unsubstituted oxazole, substituted or unsubstituted thiazole, substituted or unsubstituted benzopyrrole, substituted or unsubstituted benzopyrroline, substituted or unsubstituted benzopyrrolidine, substituted or unsubstituted benzopyrazole, substituted or unsubstituted benzopyrazoline, substituted or unsubstituted benzopyrazolidine, substituted or unsubstituted benzoimidazole, substituted or unsubstituted benzooxazole, and substituted or unsubstituted benzothiazole,

[0118] wherein R7, on each occurrence, is attached to any one of P, Q, S and T, and is either absent or selected from the group consisting of hydrogen, halogen atom, hydroxyl, (C1-C20) alkyl, (C1-C20) alkoxy, halogenated (C1-C20) alkyl and halogenated (C1-C20) alkoxy;

[0119] wherein p is an integer of 0, 1, 2 or 3;

[0120] wherein R6 is attached to any one of P, Q, S and T, and is selected from the group consisting of direct bond, -O-, -C (O) O-, -O-C (O) -, -P (O) 2-O-, -O-P (O) 2-O-, -P (O) (S) -O-, -O-P (O) (S) -O-, -O-P (O) -O-, - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-O-, -O- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-, -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -C (O) -O- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C30) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-C (O) -, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-, -C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-O-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH-, -C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) -, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-O-, -N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-, -N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-O-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, -N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-, -N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) -, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C22) alkylene -P (O) 2-O-, - (C1-C22) alkylene-O-P (O) 2-O-, - (C3-C22) cycloalkylene-, - (C3-C22) cycloalkylene-O-, -O- (C3-C22) cycloalkylene-, - (C6-C22) arylene-, - (C6-C22) arylene-O-, -O- (C6-C22) arylene-, - (C6-C22) arylene-NH-, -NH- (C6-C22) arylene-, -C (O) - (C6-C22) arylene-, - (C6-C22) arylene-C (O) -, -C (O) -O- (C6-C22) arylene-, - (C6-C22) arylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C6-C22) arylene-and -C (O) -NH- (C6-C22) arylene-C (O) -O-;

[0121] wherein R1, on each occurrence, is independently selected from the group consisting of hydrogen, hydroxyl, - (C1-C22) alkyl, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C6-C22) aryl, - (C1-C22) alkoxy, - (C3-C22) cycloalkoxy, - (C6-C22) aryloxy, -C (O) - (C1-C22) alkyl, -OC (O) (C1-C22) alkyl, -C (O) -O- (C1- C22) alkyl, -C (O) - (C3-C22) cycloalkyl, -OC (O) - (C3-C22) cycloalkyl, -C (O) -O- (C3-C22) cycloalkyl, -C (O) - (C6-C22) aryloxy, -OC (O) - (C6-C22) aryloxy, -C (O) -O- (C6-C22) aryloxy, -C (O) -phosphate ester group, phosphodiester group, phosphoramidite group, saturated fatty acid group, unsaturated fatty acid group, lipid, PEG, steroid, lipophile, carbohydrate, cholesterol, adamantane, amino acid, peptide, chloroquine and alkaloid,

[0122] wherein R2, on each occurrence, is independently selected from the group consisting of a halogen atom, a (C1-C12) alkyl, a (C1-C12) alkoxy, a (C1-C12) alkoxycarbonyl, a (C6-C16) aryl or a (C6-C16) aryloxycarbonyl; and

[0123] wherein one or more hydroxyl group, carboxyl group, amino group, nitrile group and phosphoric acid group contained in A1, A2, A3, B, C, R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 are optionally linked to a support material or protected with a terminal protective group.

[0124] In another partiuclar embodiment, one or more hydroxyl group, carboxyl group, amino group, nitrile group and phosphoric acid group contained in each of A1, A2, A3, B, C, R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 are optionally protected with a terminal protection group RP selected from the group consisting of (C1-C22) alkyl, (C1-C22) alkoxy, (C1-C22) alkylcarbonyl, (C1-C22) alkoxycarbonyl, (C6-C22) aryl, (C6-C22) aryloxy, (C6-C22) arylcarbonyl, (C6-C22) aryloxycarbonyl, tri ( (C1-C22) alkyl) silyl and tri ( (C1-C22) alkoxy) silyl; and

[0125] wherein the support material is selected from the group consisting of silica, silica gel, glass, ceramic, polymer, cellulose, and combinations thereof.

[0126] In another partiuclar embodiment, the combination of the lipid moiety and the delivery enhancing compound moiety represented by Formula A’ has a structure obtainable by subtracting at least one hydrogen atom or terminal group from a structure represented by any of Formula IV to Formula XIII,

[0127] In another partiuclar embodiment, each of F, G, H and I is carbon, m is 1 and n is 3, B is attached to G or H, each of P, Q, S and T is carbon, R6 is attached to any one of Q and S;

[0128] wherein the protection group RP is selected from the group consisting of benzyloxycarbonyl (Cbz) , tert-butyldimethylsilyl (TBS) , 4, 4’-dimethoxytrityl (DMTr) , t-butyloxy carbonyl (Boc) , benzyl (Bn) and benzyloxy (BnO) ;

[0129] wherein C, on each occurrence, is selected from the group consisting of hydrogen, halogen atom, hydroxyl, (C1-C12) alkyl, (C1-C12) alkoxy, halogenated (C1-C12) alkyl and halogenated (C1-C12) alkoxy;

[0130] wherein B, on each occurrence, is - (C1-C22) alkylene-OH, -O-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) NH2, - (C1-C16) alkylene-O-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) NH2, -O-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) OH, - (C1-C16) alkylene-O-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) OH, -C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) NH2, - (C1-C16) alkylene-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) NH2, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-OH, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) OH, - (C1-C16) alkylene-C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) OH, - (C1-C16) alkylene-O-P (-N (C1-C16 alkyl) 2) -O- (C1-C16) alkylene-CN, - (C1-C16) alkylene-O-P (-N (C1-C16 alkyl) 2) -O- (C1-C16) alkylene-OH, - (C1-C16) alkylene-O-P (-N (C1-C16 alkyl) 2) -O- (C1-C16) alkylene-NH2, - (C1-C16) alkylene-O-P (-N (C1-C16 alkyl) 2) -O- (C1-C16) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-O-P (-N (C1-C16 alkyl) 2) -O- (C1-C16) alkylene-CN,

[0131] wherein each of A1, A2 and A3 is either absent or a substituent independently selected  from the group consisting of -H, -OH, linear or branched - (C6-C22) alkyl, linear or branched - (C2-C22) alkenyl, - (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkenylene-OH, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C3-C22) cycloalkenyl, - (C1-C22) alkylene- (C3-C22) cycloalkyl, - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkenylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-R1, - (C1-C22) alkenylene-O-R1, - (C1-C22) alkylene-COOR1, - (C1-C22) alkenylene-COOR1, -O- (C1-C22) alkyl, - (C6-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene- (C1-C6 alkylene oxide) (1-20) -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -C (O) NH-R1, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, substituted or unsubstituted pyrrole, substituted or unsubstituted pyrroline, substituted or unsubstituted pyrrolidine, substituted or unsubstituted pyrazole, substituted or unsubstituted pyrazoline, substituted or unsubstituted pyrazolidine, substituted or unsubstituted imidazole, substituted or unsubstituted oxazole, substituted or unsubstituted thiazole, substituted or unsubstituted benzopyrrole, substituted or unsubstituted benzopyrroline, substituted or unsubstituted benzopyrrolidine, substituted or unsubstituted benzopyrazole, substituted or unsubstituted benzopyrazoline, substituted or unsubstituted benzopyrazolidine, substituted or unsubstituted benzoimidazole, substituted or unsubstituted benzooxazole, substituted or unsubstituted benzothiazole, and a substituent represented by Formula III,

[0132] wherein Y is selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur; and each of P, Q, S and T is carbon;

[0133] wherein each of R3, R4 and R5 is either absent or a substituent independently selected from the group consisting of -H, -OH, linear or branched - (C6-C22) alkyl, linear or branched - (C2-C22) alkenyl, - (C1-C22) alkylene-OH, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C3-C22) cycloalkenyl, - (C1-C22) alkylene- (C3-C22) cycloalkyl, - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-R1, - (C1-C22) alkylene-COOR1, -O- (C1-C22) alkyl, - (C6-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene- (C1-C6 alkylene oxide) (1-20) -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -C (O) NH-R1, - (C1-C22) alkylene-O-P (- N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, substituted or unsubstituted pyrrole, substituted or unsubstituted pyrroline, substituted or unsubstituted pyrrolidine, substituted or unsubstituted pyrazole, substituted or unsubstituted pyrazoline, substituted or unsubstituted pyrazolidine, substituted or unsubstituted imidazole, substituted or unsubstituted oxazole, substituted or unsubstituted thiazole, substituted or unsubstituted benzopyrrole, substituted or unsubstituted benzopyrroline, substituted or unsubstituted benzopyrrolidine, substituted or unsubstituted benzopyrazole, substituted or unsubstituted benzopyrazoline, substituted or unsubstituted benzopyrazolidine, substituted or unsubstituted benzoimidazole, substituted or unsubstituted benzooxazole, and substituted or unsubstituted benzothiazole,

[0134] wherein R7, on each occurrence, is attached to any one of P, Q, S and T, and is either absent or selected from the group consisting of hydrogen, halogen atom, hydroxyl, (C1-C20) alkyl, (C1-C20) alkoxy, halogenated (C1-C20) alkyl and halogenated (C1-C20) alkoxy;

[0135] wherein p is an integer of 0, 1, 2 or 3;

[0136] wherein R6 is attached to any one of P, Q, S and T, and is selected from the group consisting of - (C1-C16) alkylene-, - (C1-C16) alkylene-O-, -O- (C1-C16) alkylene-, - (C1-C16) alkylene-NH-, -NH- (C1-C16) alkylene-, -C (O) - (C1-C16) alkylene-, - (C1-C16) alkylene-C (O) -, -C (O) -O- (C1-C16) alkylene-, - (C1-C16) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-O-C (O) -, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-O-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-O-, -C (O) -N ( (C1-C16) alkyl) - (C1-C16) alkylene-, -C (O) -N ( (C1-C16) alkyl) - (C1-C16) alkylene-O-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, -C (O) -N ( (C1-C16) alkyl) - (C1-C16) alkylene-C (O) -N ( (C1-C16) alkyl) - (C1-C16) alkylene-, -C (O) -N ( (C1-C16) alkyl) - (C1-C16) alkylene-C (O) -N ( (C1-C16) alkyl) -, - (C1-C16) alkylene-C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-, - (C1-C16) alkylene-C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, -NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) -O-, -NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-O-, -N ( (C1-C16) alkyl) -C (O) - (C1-C16) alkylene-, -N ( (C1-C16) alkyl) -C (O) - (C1-C16) alkylene-O-, -NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - N ( (C1-C16) alkyl) -C (O) - (C1-C16) alkylene-N ( (C1-C16) alkyl) -C (O) - (C1-C16) alkylene-, -N ( (C1-C16) alkyl) -C (O) - (C1-C16) alkylene-N ( (C1-C16) alkyl) -C (O) -, - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-, - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -; and

[0137] with the proviso that at least one of A1, A2, A3, R3, R4 and R5 is a C6-C22 linear alkyl group, and preferably a linear hexadecyl group.

[0138] In another partiuclar embodiment, the delivery enhancing compound moiety comprises a structure selected from the group consisting of - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, - (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - (C3-C12) cycloalkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene- (C3-C12) cycloalkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene- (C3-C12) cycloalkylene- (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, - (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, - (C3-C12) cycloalkylene-C (O) -NH-, - (C1-C16) alkylene- (C3-C12) cycloalkylene-C (O) -NH-, - (C1-C16) alkylene- (C3-C12) cycloalkylene- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, and / or

[0139] wherein the delivery enhancing compound moiety is directly conjugated to the single-stranded oligonucleotide via a covalent bond or a linking moiety having the following structure

[0140] wherein Y1 is oxygen or sulfur, the asterisk (*) refers to the site wherein the linking moiety is attached to the single-stranded oligonucleotide, and the double asterisk (**) refers to the site wherein the linking moiety is attached to the delivery enhancing compound moiety.

[0141] In another partiuclar embodiment, at least one hydrogen atom contained in the lipid moiety is substituted with deuterium atom.

[0142] In another partiuclar embodiment, at least one hydrogen atom contained in the lipid moiety and / or the delivery enhancing compound moiety is substituted with deuterium atom.

[0143] In another partiuclar embodiment, the combination of the lipid moiety and the delivery enhancing compound moiety represented by Formula A’ has a structure obtainable by subtracting at least one hydrogen atom or terminal group from any of the compound C1 to  compound C71

[0144] wherein  represents a support material.

[0145] In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide is attached to the delivery enhancing compound moiety via at least one linking moiety selected from the group consisting of direct bond, -O-, -S-, -C (O) -, -NH-, -N ( (C1-C12) alkyl) -, -N ( (C1-C12) alkyl) -C (O) -O-, -O-C (O) -, -C (O) -O-, -O-C (O) -O-, -C (O) -NH-, -OP (O) 2O-, -P (O) (O-) O-, -OP (O) O-, -OP (O) (S) O-, -OP (O) (S-) O-, -O-S (O) 2-O-, -S (O) 2-O-, -S (O) -O-, - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-, -NH- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C22) alkylene-C (O) -, - (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-, -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -NH- (C1-C22) alkylene-NH-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) O-, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -O- (C1-C22) alkylene-O-C (O) -, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C22) alkylene-OP (O) 2O-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) (O-) O-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) (O-) O- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) O-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) (S) O-, - (C1-C22) alkylene-O-S (O) 2-O-, - (C1-C22) alkylene-S (O) 2-O-, - (C1-C22) alkylene-S (O) -O-, -O-P (O) 2-O- (C1-C22) alkylene-OP (O) 2O-, -O-P (O) -O- (C1-C22) alkylene-OP (O) O-, -OP (O) (S) O- (C1-C22) alkylene-OP (O) (S) O-, -O-S (O) 2-O- (C1-C22) alkylene-O-S (O) 2-O-, -S (O) 2-O- (C1-C22) alkylene-S (O) 2-O-and -O-S (O) - (C1-C22) alkylene-S (O) -O-.

[0146] In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide delivery agent has a structure represented by any of the formulae AI to AVII:

[0147] wherein L represents the linking moiety, ☆ represents the combination of the lipid moiety and the delivery enhancing compound moiety represented by Formula A’,  represents a single-stranded oligonucleotide either in a 5’ to 3’ direction or in a 3’ to 5’ direction, and each of a, b and c is independently an integer from 1 to 50.

[0148] In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide delivery agent has a structure represented by any of the formulae O1 to O20:

[0149] wherein Y represents oxygen or sulfur.

[0150] In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide targets a gene comprising at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SMN2, SCN9A,  Scn9a and DMD.

[0151] In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 142-260 and SEQ ID NO: 443-492. In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 261-379, SEQ ID NO: 388, and SEQ ID NO: 390. In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide is complementary to a consecutive target sequence comprising at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23-141 and SEQ ID NO: 393-442. In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-21, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 391, and SEQ ID NO: 493-542.

[0152] In another partiuclar embodiment, the present disclosure provides a pharmaceutical composition, comprising: a) the oligonucleotide delivery agent as indicated herein; and b) optionally, one or more ingredients selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable carrier, excipient, solvent, diluent, stabilizer, dispersant, buffer, compatibilizer, preservative agent and combinations thereof.

[0153] In another partiuclar embodiment, the present disclosure provides a method of modulating the expression of a target gene in a subject, the method comprising the step of administrating the pharmaceutical composition as indictaed herein.

[0154] In another partiuclar embodiment, the pharmaceutical composition is administrated to at least one of cardiac muscles, skeletal muscles, smooth muscles and liver of a subject.

[0155] In another partiuclar embodiment, the pharmaceutical composition increases the expression of the target gene.

[0156] In another partiuclar embodiment, the pharmaceutical composition decreases the expression of the target gene.

[0157] In another partiuclar embodiment, the subject is a mammal.

[0158] In another partiuclar embodiment, the mammal is a rodent.

[0159] In another partiuclar embodiment, the rodent is a mouse or a rat.

[0160] In another partiuclar embodiment, the mammal is a non-human primate.

[0161] In another partiuclar embodiment, the mammal is a human.

[0162] In another partiuclar embodiment, the target gene is associated with a disease or disorder.

[0163] In another partiuclar embodiment, the target gene is associated with a disease or disorder in the central nervous system, eye, spleen, muscle, heart, kidney, or liver.

[0164] In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide targets a gene comprising at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SMN2, SCN9A, Scn9a and DMD.

[0165] In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 142-260 and SEQ ID NO: 443-492. In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:261-379, SEQ ID NO: 388, and SEQ ID NO: 390. In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide is complementary to a consecutive target sequence comprising at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23-141 and SEQ ID NO: 393-442. In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-21, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 391, and SEQ ID NO: 493-542.

[0166] In another partiuclar embodiment, the method comprising contacting a cell with the pharmaceutical composition as indicated herein.

[0167] In another partiuclar embodiment, the cell is derived from skeletal muscle, cardiac muscle, smooth muscle or liver.

[0168] In another partiuclar embodiment, the pharmaceutical composition increases the expression of the target gene.

[0169] In another partiuclar embodiment, the pharmaceutical composition decreases the expression of the target gene.

[0170] In another partiuclar embodiment, the cell is a mammalian cell.

[0171] In another partiuclar embodiment, the mammalian cell is a mouse cell or a rat cell.

[0172] In another partiuclar embodiment, the mammalian cell is a non-human primate cell.

[0173] In another partiuclar embodiment, the mammalian cell is a human cell.

[0174] In another partiuclar embodiment, the target gene is associated with a disease or disorder.

[0175] In another partiuclar embodiment, the target gene is associated with a disease or disorder in the central nervous system, eye, spleen, muscle, heart, kidney, or liver.

[0176] In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide targets a gene comprising at least  part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SMN2, SCN9A, Scn9a and DMD.

[0177] In another partiuclar embodiment, wherein the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 142-260 and SEQ ID NO: 443-492. In another partiuclar embodiment, wherein the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 261-379, SEQ ID NO: 388, and SEQ ID NO: 390. In another partiuclar embodiment, wherein the oligonucleotide is complementary to a consecutive target sequence comprising at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23-141 and SEQ ID NO: 393-442. In another partiuclar embodiment, the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-21, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 391, and SEQ ID NO: 493-542.

[0178] EXAMPLES

[0179] Some embodiments of the invention will now be described in the following examples, wherein all parts and percentages are by weight unless otherwise specified. However, the scope of the present disclosure is not, of course, limited to the formulations set forth in these examples. Rather, the examples are merely inventive of the disclosure.

[0180] The following examples are set forth so as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present invention and are not intended to limit the scope of what the inventors regard as their invention nor are they intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (e.g., amounts, temperature, etc. ) but some experimental errors and deviations should be accounted for. Unless indicated otherwise, parts are parts by weight, molecular weight is weight average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or near atmospheric. Standard abbreviations may be used, e.g., bp, base pair (s) ; kb, kilobase (s) ; nM, nanomolar (s) ; s or sec, second (s) ; min, minute (s) ; h or hr, hour (s) ; aa, amino acid (s) ; nt, nucleotide (s) ; i. m., intramuscular (ly) ; i. p., intraperitoneal (ly) ; s. c., subcutaneous (ly) ; ivt or IVT, intravitreous; iv or IV, tail vein, intravenous; i. c. v. or icv or ICV, intracerebroventricular and the like.

[0181] All the starting materials, reagents and solvents used hereafter were purchased from commercial sources and used as received unless stated otherwise. Purification of reaction products was performed with a column chromatography comprising a silica gel (200-300 mesh) and eluting agents of hexane / ethyl acetate, DCM / MeOH. Thin layer chromatography (TLC) was carried out using pre-coated silica Gel GF plates and visualized using KMnO4 stains. 1H-NMR spectra were recorded at 400 or 500 MHz (Varian) using CDCl3 with TMS. High-resolution mass spectra (HRMS) were recorded on LC / MS (Agilent Technologies 1260 Infinity II / 6120 Quadrupole) and a time-of-flight mass spectrometer by ESI or matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) .

[0182] Example 1. Preparation of compound C1

[0183] Compound C1 was prepared in this example by using the following procedures.

[0184] (1) Preparation of compound 5

[0185] To a solution of methyl 2- (4-fluoro-3-nitrophenyl) acetate 4 (17.3 g, 81 mmol, 1.0 eq) and K2CO3 (11.2 g, 81 mmol) in anhydrous DMF (200 mL) , under nitrogen atmosphere, was added compound 3 (19.56 g, 81 mmol, 1.0 eq) . The reaction mixture was stirred at 55 ℃ for 6 h, then cold water (100 mL) was added. The mixture was extracted three times with ethyl acetate, then the organic phase was washed three times with saturated LiCl solution and one time with brine. Then the organic phase was dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to form compound 5 as yellow oil which was directly used in the next step without further purification.

[0186] (2) Preparation of compound 6

[0187] To a solution of compound 5 (35.18 g, 81 mmol, 1.0 eq) in THF / H2O (9: 1, 280 mL) , under ice bath, was added HCOONH4 (30.67 g, 486 mmol, 6.0 eq) and Zn powder (31.78 g, 486 mmol, 6.0 eq) . After stirred for 10 minutes, the reaction mixture was moved from the ice bath and stirred at room temperature overnight. Then the reaction mixture was filtered and concentrated under reduced pressure. After that, water (200 mL) was added into the mixture, then the mixture was extracted three times with ethyl acetate, the organic phase was washed one time with brine. After dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the product 6 formed then was directly used in the next step without further purification. The compound 6 was characterized with mass spectrometry. MW calc.: 404.34; MW.Found: 405.3 [M+H] +.

[0188] (3) Preparation of compound 8

[0189] To a solution of compound 6 (19.36 g, 48 mmol, 1.0 eq) in EtOH (200 mL) under nitrogen atmosphere, was added 3- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) propanal 7 (9.0 g, 48 mmol, 1.0 eq) and AcOH (11 mL, 192 mmol, 4.0 eq) . The reaction mixture was stirred at 80℃ overnight, and then concentrated under reduced pressure. Then a saturated NaHCO3 solution (100 mL) was added, the mixture was extracted three times with ethyl acetate, then the organic phase was combined and washed with brine, dried over Na2SO4, and concentrated. The resultant residue compound 8 was directly used in the next step without further purification.

[0190] (4) Preparation of compound 9

[0191] To a solution of compound 8 (10 g, 17.5 mmol, 1.0 eq) in anhydrous THF (50 mL) under nitrogen atmosphere, was added 1 M TBAF THF solution (26.3 mL, 26.3 mmol, 1.5 eq) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 h, and then concentrated under reduced pressure. Then water (100 mL) was added, the mixture was extracted three times with DCM, then the organic phase was combined and washed with brine, dried over Na2SO4, and  concentrated. The resultant residue was dissolved in 50 mL pyridine, and DMTrCl (7.12 g, 21 mmol, 1.2 eq) was added therein. The reaction mixture was stirred at room temperature for 6 h, after which it was concentrated under reduced pressure. The resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-3%of MeOH / DCM) to provide compound 9 (8.1 g, 61%yield) as yellow solid. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 760.48; MW. Found: 761.8 [M + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.59 -7.53 (m, 1H) , 7.38 -7.31 (m, 2H) , 7.23 -7.19 (m, 6H) , 7.18 -7.14 (m, 3H) , 6.76 (dd, J = 7.8, 5.6 Hz, 4H) , 4.17 -4.02 (m, 2H) , 3.76 (s, 6H) , 3.73 (s, 2H) , 3.67 (s, 3H) , 3.59 (t, J = 7.0 Hz, 2H) , 3.19 -3.05 (m, 2H) , 1.29 -1.25 (m, 28H) , 0.88 (t, J = 6.5 Hz, 3H) .

[0192] (5) Preparation of compound C1

[0193] To a solution of compound 9 (2.7 g, 3.55 mmol, 1.0 eq) in anhydrous THF (20 mL) under nitrogen atmosphere and ice bath, was added LiAlH4 (202 mg, 5.33 mmol, 1.5 eq) . The mixture was moved to room temperature after 10 minutes and stirred for 1 h. Then the reaction was moved to ice bath, saturated potassium sodium tartrate solution (20 mL) was added slowly into the mixture. After 30 minutes, the reaction was extracted three times with Et2O, then the organic phase was combined and washed with brine, dried over Na2SO4, and concentrated. The crude product (300 mg, 0.41 mmol, 1.0 eq) was dissolved in anhydrous DCM (5 mL) then DIPEA (204 μL, 1.23 mmol, 3.0 eq) , 3- ( (chloro (diisopropylamino) phosphanyl) oxy) propanenitrile (274 μL, 1.23 mmol, 3.0 eq. ) were added under nitrogen atmosphere at 25℃. The reaction mixture was stirred for 1 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM, 1%Et3N) to provide compound C1 (299 mg, 78%yield) as colorless oil. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.62 (s, 1H) , 7.32 (dd, J = 7.6, 4.1 Hz, 2H) , 7.27 -7.11 (m, 9H) , 6.73 (dd, J = 7.9, 5.6 Hz, 4H) , 4.34 - 4.31 (m, 2H) , 4.10 -4.06 (m, 2H) , 3.75 (s, 6H) , 3.64 -3.61 (m, 2H) , 3.58 (dd, J = 11.8, 5.1 Hz, 2H) , 3.24 -3.18 (m, 2H) , 3.09 -2.88 (m, 4H) , 2.65 -2.55 (m, 4H) , 1.37 -1.28 (m, 28H) , 1.22 (dd, J = 6.8, 3.2 Hz, 12H) , 0.88 (t, J = 6.5 Hz, 3H) .

[0194] Example 2. Preparation of compound C2

[0195] Compound C2 was prepared in this example by using the following procedures.

[0196] (1) Preparation of compound 11

[0197] To a solution of methyl 4-fluoro-3-nitrobenzoate 10 (15 g, 75.3 mmol, 1.0 eq) and K2CO3 (10.4 g, 75.3 mmol, 1.0 eq) in anhydrous DMF (240 mL) , under nitrogen atmosphere, was added compound 3 (18.18 g, 75.3 mmol, 1.0 eq) . The reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 6 h, then cold water (100 mL) was added. The mixture was extracted three times with ethyl acetate, then the organic phase was washed three times with saturated LiCl solution and one time with brine. Then dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to form compound 11 as brown oil which was directly used in the next step without further purification.

[0198] (2) Preparation of compound 12

[0199] To a solution of compound 11 (31.65 g, 75.3 mmol, 1.0 eq) in THF / H2O (9: 1, 300 mL) , under ice bath, was added HCOONH4 (28.5 g, 451.8 mmol, 6.0 eq) and Zn powder (29.5 g, 451.8 mmol, 6.0 eq) . After 10 minutes, the reaction mixture was moved to room temperature  and stirred overnight. Then the reaction mixture was filtered and concentrated under reduced pressure. After that, water (100 mL) was added into the mixture, then extracted three times with ethyl acetate, the organic phase was washed one time with brine. After dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the brown solid compound 12 formed then was directly used in the next step without further purification.

[0200] (3) Preparation of compound 14

[0201] To a solution of compound 12 (6.0 g, 15.4 mmol, 1.0 eq) in EtOH (90 mL) under nitrogen atmosphere, was added compound 13 (1.57 g, 15.4 mmol, 1.0 eq) and AcOH (3.54 mL, 61.6 mmol, 4.0 eq) . The reaction mixture was stirred at 80℃ overnight, and then concentrated under reduced pressure. Then a saturated NaHCO3 solution (80 mL) was added, the mixture was extracted three times with ethyl acetate, then the organic phase was combined and washed with brine, dried over Na2SO4, and concentrated. The resultant residue was directly used in the next step without further purification. The resultant residue was characterized with mass spectrometry. MW calc.: 472.37; MW. Found: 473.4 [M+H] +.

[0202] The resultant residue (1.0 g, 2.12 mol, 1.0 eq) was dissolved in 10 mL DCM, and Et3N (0.44 mL, 3.17 mmol, 1.5 eq) , DMTrCl (860 mg, 2.54 mmol, 1.2 eq) were added therein. The reaction mixture was stirred at room temperature for 6 h, after which it was concentrated under reduced pressure. The resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM) to provide compound 14 (1.27 g, 77%yield) as yellow solid. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 774.50; MW. Found: 303.2 [DMT] -, 473.4 [DMT off + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.42 (d, J = 0.9 Hz, 1H) , 7.97 (dd, J = 8.5, 1.4 Hz, 1H) , 7.42 (d, J = 7.4 Hz, 2H) , 7.33 -7.28 (m, 5H) , 7.25 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 7.19 (t, J = 7.3 Hz, 1H) , 6.80 (dd, J = 9.4, 2.4 Hz, 4H) , 4.05 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 3.93 (s, 3H) , 3.78 (s, 6H) , 3.12 (t, J = 6.3 Hz, 2H) , 2.92 -2.80 (m, 2H) , 2.07 -1.97 (m, 2H) , 1.82 -1.71 (m, 4H) , 1.28 -1.24 (m, 26H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0203] (4) Preparation of compound 15

[0204] To a solution of compound 14 (1.27 g, 1.64 mmol, 1.0 eq) in anhydrous THF (10 mL) under nitrogen atmosphere and ice bath, was added LiAlH4 (93 mg, 2.46 mmol, 1.5 eq) . The mixture was moved to room temperature after 10 minutes and stirred for 1 h. Then the reaction was moved to ice bath, saturated potassium sodium tartrate solution (10 mL) was added slowly into the mixture. After 30 minutes, the reaction was extracted three times with Et2O, then the organic phase was combined and washed with brine, dried over Na2SO4, and concentrated. The crude product (500 mg, 0.67 mmol, 1.0 eq) was dissolved in DCM (10 mL) , then DMAP (286 mg, 2.34 mmol, 3.5 eq) , succinic anhydride (134 mg, 1.34 mmol, 2.0 eq) were added therein under nitrogen atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature overnight then H2O (10 mL) was added into the reaction, the mixture was extracted with DCM (3*10 mL) and the organic phase was combined, dried over Na2SO4, and concentrated. The resultant residue was purified with flash chromatography. The resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-10%of MeOH / DCM) to provide compound 15 (425 mg, 62%yield) as colorless oil. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 846.52; MW. Found: 303.2 [DMT] -, 545.4 [DMT off + H]+. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.81 (s, 1H) , 7.42 (d, J = 7.5 Hz, 2H) , 7.30 (d, J = 8.8 Hz, 4H) , 7.25 (d, J = 7.6 Hz, 3H) , 7.19 (dd, J = 14.9, 7.9 Hz, 2H) , 6.80 (d, J = 8.8 Hz, 4H) , 5.26 (s, 2H) , 4.03 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 3.77 (s, 6H) , 3.11 (t, J = 6.1 Hz, 2H) , 2.90 (t, J = 7.7 Hz, 2H) , 2.73 -2.66 (m, 4H) , 1.99 (dt, J = 15.3, 7.7 Hz, 2H) , 1.74 (dd, J = 13.5, 6.9 Hz, 4H) , 1.29 -1.25 (m, 26H) , 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H) .

[0205] (5) Preparation of compound C2

[0206] To a solution of the compound 15 (114 mg, 0.134 mmol, 1.0 eq) , Controlled Pore  Glass (CPG) (2.36 g) , DIPEA (67 μL, 0.4 mmol, 3.0 eq) in acetonitrile (18 mL) was added HBTU (102 mg, 0.268 mmol, 2.0 eq) under nitrogen atmosphere. The reaction mixture was stirred at 25℃ overnight and then subsequently washed with DCM and ethyl ether to generate crude solid support. To a solution of acetic anhydride (8.04 mL) , pyridine (15.5 mL) , NEt3 (241 μL) in acetonitrile (10 mL) was added the crude solid support under nitrogen atmosphere. The reaction mixture was stirred at 25 ℃ overnight and then subsequently washed with DCM and ethyl ether to produce the Compound C2 of the present disclosure (2.2 g) .

[0207] Example 3. Preparation of compound C55 of the present disclosure

[0208] Compound C55 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0209] (1) Preparation of compound 5

[0210] To a solution of methyl 2- (4-fluoro-3-nitrophenyl) acetate 4 (9.9 g, 46.4 mmol, 1.0 eq) and K2CO3 (6.4 g, 46.4 mmol, 1.0 eq) in anhydrous DMF (80 mL) , under nitrogen atmosphere, was added compound 3 (11.2 g, 46.4 mmol, 1.0 eq) . The reaction mixture was stirred at 55 ℃ for 8 h, then cold water (100 mL) was added. The mixture was extracted three times with ethyl acetate, then the organic phase was washed three times with saturated LiCl solution and one time with brine. Then the organic phase was dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to form compound 5 as yellow oil which was directly used in the next step without further purification.

[0211] (2) Preparation of compound 16

[0212] To a solution of compound 5 (15.58 g, 35.87 mmol, 1.0 eq) in anhydrous THF (160 mL) under nitrogen atmosphere and ice bath, was added LiAlH4 (1.36 g, 35.87 mmol, 1.0 eq) slowly. The mixture was moved to room temperature after 10 minutes and stirred for 1 h. Then the reaction was moved to ice bath, saturated potassium sodium tartrate solution (30 mL) was added slowly into the mixture. After 30 minutes, the reaction was extracted three times with EtOAc, then the organic phase was combined and washed with brine, dried over Na2SO4, and concentrated. The crude residue was then dissolved in anhydrous DMF (140 mL) . Then imidazole (3.66 g, 53.8 mmol, 1.5 eq) and TBSCl (6.5 g, 43.04 mmol, 1.2 eq) were added under nitrogen atmosphere. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h, then H2O (100 mL) was added. The mixture was extracted three times by ethyl acetate, then the organic phase was washed three times by saturated LiCl solution and one time by brine and then dried by anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure. The resultant residue 16 was directly used in the next step without further purification. The product was characterized with mass spectrometry. MW calc.: 520.41; MW Found: 521.4 [M + H] +.

[0213] (3) Preparation of compound 17

[0214] To a solution of compound 16 (35.87 mmol, 1.0 eq) in THF / H2O (9: 1, 178 mL) , under ice bath, was added HCOONH4 (13.58 g, 215.2 mmol, 6.0 eq) and Zn powder (14.1 g, 215.2 mmol, 6.0 eq) . After stirred for 10 minutes, the reaction mixture was moved from the ice bath and stirred at room temperature overnight. Then the reaction mixture was filtered and concentrated under reduced pressure. After that, water (200 mL) was added into the mixture, then the mixture was extracted three times with ethyl acetate, the organic phase was washed one time with brine. After dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the product 17 formed then was directly used in the next step without further purification. The compound 17 was characterized with mass spectrometry. MW calc.: 490.43; MW Found: 491.40 [M+H] +.

[0215] (4) Preparation of compound 18

[0216] To a solution of compound 17 (5 g, 10.2 mmol, 1.0 eq) in EtOH (25 mL) under nitrogen atmosphere, was added 5-Hydroxypentanal (1.04 g, 10.2 mmol, 1.0 eq) and AcOH (2.35 mL, 40.8 mmol, 4.0 eq) . The reaction mixture was stirred at 80℃ overnight, and then concentrated under reduced pressure. Then a saturated NaHCO3 solution (25 mL) was added, the mixture was extracted three times with ethyl acetate, then the organic phase was combined and washed with brine, dried over Na2SO4, and concentrated. The resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM) to provide compound 18 (1.9 g, 33%yield) . The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 572.47; MW Found: 573.61 [M + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.53 (s, 1H) , 7.21 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 7.11 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, 1H) , 4.07 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 3.84 (dd, J = 9.3, 5.6 Hz, 2H) , 3.69 (t, J = 6.1 Hz, 2H) , 2.93 (dt, J = 19.8, 7.3 Hz, 4H) , 2.13 -2.03 (m, 2H) , 1.84 -1.70 (m, 4H) , 1.40 -1.21 (m, 26H) , 0.93 -0.85 (m, 12H) , 0.03 (s, 6H) .

[0217] (5) Preparation of compound 19

[0218] To a solution of compound 18 (1.9 g, 3.32 mmol, 1.0 eq) in DCM (10 mL) , was added Dess-Martin periodinane (DMP) (1.69 g, 3.98 mmol, 1.2 eq) under nitrogen atmosphere. The reaction mixture was stirred for 6 h. After reaction, NaHCO3 solution (20 mL) was added into the mixture and the mixture was stirred for 30 min. The mixture was extracted three times by DCM and then the organic phase was washed one time by brine. After dried by anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM) to provide compound 19 (619 mg, 33%yield) as brown oil. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 570.46; MW Found: 571.61 [M + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.98 (s, 1H) , 7.35 (d, J = 8.2 Hz, 2H) , 7.30 (s, 1H) , 4.25 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 3.89 (t, J = 6.9 Hz, 2H) , 3.18 -3.12 (m, 2H) , 3.01 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.55 -2.50 (m, 2H) , 2.32 -2.24 (m, 2H) , 1.85 (dd, J = 14.3, 7.2 Hz, 2H) , 1.36 -1.28 (m, 26H) , 0.93 -0.86 (m, 12H) , 0.03 (s, 6H) .

[0219] (6) Preparation of compound 20

[0220] To a solution of compound 8 (733 mg, 1.16 mmol, 1.2 eq) in anhydrous THF (5 mL) under nitrogen atmosphere at ice bath, was added NaH (60%dispersion in mineral oil, 77 mg, 1.93 mmol, 2.0 eq) . The reaction mixture was stirred at ice bath for 15 min, and then compound 19 (550 mg, 0.964 mmol, 1.0 eq) was added to the reaction mixture. The mixture was stirred at room temperature for 2 h and then the reaction was moved to ice bath, saturated ammonium chloride (5 mL) was added slowly into the mixture. After 5 minutes, the reaction was extracted two times with ethyl acetate, the organic phase was washed one time by brine. Then dried by anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure. The resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM) to provide compound 20 (699 mg, 81%yield) . The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 876.58; MW. Found: 877.96 [M + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.54 (s, 1H) , 7.22 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 7.15 -7.10 (m, 1H) , 6.97 -6.84 (m, 1H) , 5.73 -5.65 (m, 5H) , 4.07 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 3.85 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 2.96 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 2.88 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 2.18 -2.06 (m, 2H) , 1.85 -1.70 (m, 3H) , 1.33 -1.18 (m, 48H) , 0.90 (s, 9H) , 0.03 (s, 6H) .

[0221] (7) Preparation of compound 21

[0222] To a solution of compound 20 (690 mg, 0.77 mmol, 1.0 eq) in THF (2 mL) was added 2 M HCl (2 mL) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 h. 5 mL H2O was added into the reaction. Then the mixture was extracted two times with ethyl acetate, washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM) to provide compound 21 (488 mg, 82%yield) . The  product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 762.49; MW Found: 763.76 [M+H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.72 (s, 1H) , 7.33 (d, J = 8.3 Hz, 1H) , 7.24 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 6.87 -6.74 (m, 1H) , 5.75 -5.59 (m, 5H) , 4.14 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 3.91 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.09 -2.95 (m, 4H) , 2.46 (d, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.17 (dt, J = 14.4, 7.3 Hz, 2H) , 1.87 -1.75 (m, 3H) , 1.31 -1.17 (m, 44H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0223] (8) Preparation of compound C55

[0224] To a solution of compound 21 (480 mg, 0.62 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (212 mg, 1.24 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (5 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (374 mg, 1.24 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 4 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-3%of MeOH / DCM, 1%Et3N) to provide compound C55 (514 mg, 84%yield) as yellow oil. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 962.60; MW Found: 880.82 [M -83+ H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.53 (s, 1H) , 7.22 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 7.11 (d, J = 8.2, 1H) , 6.95 -6.82 (m, 1H) , 5.83 -5.59 (m, 5H) , 4.05 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 3.83 -3.73 (m, 2H) , 3.51 -3.46 (m, 2H) , 3.04 (t, J = 7.3 Hz, 2H) , 2.86 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 2.76 (td, J = 6.2, 1.9 Hz, 5H) , 2.10 (dd, J = 15.1, 7.6 Hz, 2H) , 1.81 -1.72 (m, 3H) , 1.26 -1.24 (m, 26H) , 1.21 (s, 18H) , 1.18 -1.34 (m, 12H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0225] Example 4. Preparation of compound C56 of the present disclosure

[0226] Compound C56 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0227] (1) Preparation of compound C56

[0228] To a solution of compound 22 (1.00 g, 5.37 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (1.83 g, 10.73 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (27 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (3.4 mL, 10.73 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 4 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-2%of ethyl acetate / petroleum ether, 1%Et3N) to provide compound C56 (1.3 g, 63%yield) as colorless oil. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 386.13; MW Found: 387.56 [M + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.90 -3.78 (m, 2H) , 3.69 -3.51 (m, 4H) , 2.64 (t, J = 6.6 Hz, 2H) , 1.65 -1.57 (m, 2H) , 1.27 -1.24 (m, 18H) , 1.22 -1.15 (m, 12H) , 0.88 (t, 3H) .

[0229] Example 5. Preparation of compound C57 of the present disclosure

[0230] Compound C57 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0231] (1) Preparation of compound C57

[0232] To a solution of compound 23 (1.0 g, 4.7 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (1.6 g, 9.4 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (10 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (2.8 g, 9.4 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 4 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 3-5%of Ethyl acetate / Petroleum ether, 1%Et3N) to provide compound C57 (1.8 g, 93%yield) . The product was characterized with 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.90 -3.76 (m, 2H) , 3.70 -3.53 (m, 4H) , 2.64 (t, J = 6.6 Hz, 2H) , 1.64 -1.57 (m, 2H) , 1.29 -1.25 (m, 22H) , 1.21 -1.16 (m, 12H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0233] Example 6. Preparation of compound C58 of the present disclosure

[0234] Compound C58 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0235] (1) Preparation of compound C58

[0236] To a solution of compound 24 (1.00 g, 4.12 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (1.41 g, 8.25 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (21 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (2.61 mL, 8.25 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 4 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic  layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-2%of ethyl acetate / petroleum ether, 1%Et3N) to provide compound C58 (1.7 g, 94%yield) as colorless oil. The product was characterized with 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.89 -3.77 (m, 2H) , 3.70 -3.52 (m, 4H) , 2.64 (t, J = 6.6 Hz, 2H) , 1.65 -1.56 (m, 2H) , 1.33 -1.23 (m, 26H) , 1.22 -1.14 (m, 12H) , 0.87 (t, 3H) .

[0237] Example 7. Preparation of compound C59 of the present disclosure

[0238] Compound C59 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0239] (1) Preparation of compound C59

[0240] To a solution of compound 25 (1.0 g, 4.2 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (1.4 g, 8.4 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (10 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (2.5 g, 8.4 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 4 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 2-5%of Ethyl acetate / Petroleum ether, 1%Et3N) to provide compound C59 (1.4 g, 77%yield) . The product was characterized with 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.37 -5.32 (m, 2H) , 3.87 -3.77 (m, 2H) , 3.67 -3.51 (m, 4H) , 2.68 -2.60 (m, 2H) , 2.06 -1.99 (m, 4H) , 1.63 -1.56 (m, 2H) , 1.30 -1.25 (m, 18H) , 1.21 -1.15 (m, 12H) , 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 3H) .

[0241] Example 8. Preparation of compound C60 of the present disclosure

[0242] Compound C60 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0243] (1) Preparation of compound C60

[0244] To a solution of compound 26 (1.00 g, 4.20 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (1.43 g, 8.40 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (18 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (2.66 mL, 8.40 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 4 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-2%of ethyl acetate / petroleum ether, 1%Et3N) to provide compound C60 (1.6 g, 88%yield) as colorless oil. The product was characterized with 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.28 -6.15 (m, 1H) , 6.13 -5.98 (m, 1H) , 3.87 -3.77 (m, 2H) , 3.69 -3.44 (m, 4H) , 2.70 -2.62 (m, 2H) , 1.65 -1.57 (m, 2H) , 1.39 -1.36 (m, 6H) , 1.26 -1.25 (m, 24H) , 1.21 -1.15 (m, 6H) , 0.89 (t, J = 6.5 Hz, 3H) .

[0245] Example 9. Preparation of compound C61 of the present disclosure

[0246] Compound C61 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0247] (1) Preparation of compound C61

[0248] To a solution of compound 25 (1.0 g, 3.7 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (1.3 g, 7.4 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (10 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (2.2 g, 7.4 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 4 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 2-5%of Ethyl acetate / Petroleum ether, 1%Et3N) to provide compound C61 (860 mg, 49%yield) . The product was characterized with 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.94 -3.73 (m, 2H) , 3.72 -3.48 (m, 4H) , 2.64 (t, J = 6.6 Hz, 2H) , 1.60 (t, J = 13.7 Hz, 3H) , 1.39 -1.22 (m, 30H) , 1.21 -1.15 (m, 12H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 1H) .

[0249] Example 10. Preparation of compound C62 of the present disclosure

[0250] Compound C62 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0251] (1) Preparation of compound C62

[0252] To a solution of compound 28 (1.00 g, 3.73 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (1.27 g, 7.45 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (19 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (2.36 mL, 7.45 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 8 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic  layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-2%of ethyl acetate / petroleum ether, 1%Et3N) to provide compound C62 (1.6 g, 91%yield) as colorless oil. The product was characterized with 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.28 -6.15 (m, 1H) , 6.13 -5.98 (m, 1H) , 3.87 -3.77 (m, 2H) , 3.69 -3.44 (m, 4H) , 2.70 -2.62 (m, 2H) , 1.65 -1.57 (m, 2H) , 1.39 -1.36 (m, 6H) , 1.26 -1.25 (m, 24H) , 1.21 -1.15 (m, 6H) , 0.89 (t, J = 6.5 Hz, 3H) .

[0253] Example 11. Preparation of compound C63 of the present disclosure

[0254] Compound C63 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0255] (1) Preparation of compound C63

[0256] To a solution of compound 29 (1.00 g, 3.35 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (1.15 g, 6.70 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (17 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (2.12 mL, 6.70 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 4 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-2%of ethyl acetate / petroleum ether, 1%Et3N) to provide compound C63 (1.3 g, 78%yield) as colorless oil. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 498.78; MW Found: 613.55 [M-diisopropyl+ H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.84 -3.74 (m, 2H) , 3.61 -3.51 (m, 4H) , 2.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H) , 1.63 -1.57 (m, 2H) , 1.38 -1.22 (m, 34H) , 1.20 -1.17 (m, 12H) , 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3H) .

[0257] Example 12. Preparation of compound C64 of the present disclosure

[0258] Compound C64 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0259] (1) Preparation of compound 31

[0260] To a solution of the compound 40 (2 g, 19.4 mmol, 1.0 eq) , compound 30 (5.97 g, 23.28 mmol, 1.2 eq) , DIPEA (4.82 mL, 29.1 mmol, 1.5 eq) in DCM (40 mL) was added HBTU (11 g, 29.1 mmol, 1.5 eq) under nitrogen atmosphere. The reaction mixture was stirred overnight. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM) to provide compound 31 (4.63 g, 70%yield) as white solid. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 341.33; MW Found: 342.39 [M + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.64 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.25 (dd, J = 13.0, 6.9 Hz, 2H) , 2.19 -2.10 (m, 2H) , 1.59 (dd, J = 14.3, 7.3 Hz, 4H) , 1.52 (dd, J = 15.0, 7.9 Hz, 2H) , 1.44 -1.38 (m, 2H) , 1.27 -1.21 (m, 26H) , 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0261] (2) Preparation of compound C64

[0262] To a solution of compound 31 (1 g, 2.9 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (745 mg, 4.35 mmol, 1.5 eq) in anhydrous DCM (10 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (1.31 g, 4.35 mmol, 1.5 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 2 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM, 1%Et3N) to  provide compound C64 (1.25 g, 79%yield) . The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 541.44; MW Found: 459.41 [M -83 + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.55 -3.51 (m, 2H) , 3.19 -3.16 (m, 2H) , 2.69 (td, J = 6.3, 1.7 Hz, 1H) , 2.65 -2.45 (m, 3H) , 2.14 -2.02 (m, 2H) , 1.54 (dt, J = 11.8, 4.8 Hz, 4H) , 1.49 -1.39 (m, 2H) , 1.38 -1.30 (m, 2H) , 1.22 -1.15 (m, 26H) , 1.12 -1.09 (m, 12H) , 0.81 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0263] Example 13. Preparation of compound C65 of the present disclosure

[0264] Compound C65 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0265] (1) Preparation of compound 33

[0266] To a solution of the compound 32 (5.85 g, 22.83 mmol, 1.2 eq) , compound 41 (2 g, 19.02 mmol, 1.0 eq) , DIPEA (4.73 mL, 28.53 mmol, 1.5 eq) in DCM (50 mL) was added HBTU (10.82 g, 28.53 mmol, 1.5 eq) under nitrogen atmosphere. The reaction mixture was stirred overnight. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-8%of MeOH / DCM) to provide compound 33 (2.3 g, 35%yield) as white solid. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 343.31; MW Found: 344.37 [M + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.85 (s, 1H) , 3.78 -3.73 (m, 2H) , 3.62 -3.54 (m, 4H) , 3.47 (dd, J = 10.5, 5.2 Hz, 2H) , 2.21 -2.15 (m, 2H) , 1.62 -1.60 (m, 2H) , 1.33 -1.21 (m, 24H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0267] (2) Preparation of compound C65

[0268] To a solution of compound 33 (1.5 g, 4.37 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (1.5 g, 8.74 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (28 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (2.63 g, 8.74 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 2 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM, 1%Et3N) to provide compound C65 (2.02 g, 85%yield) . The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 543.42; MW Found: 485.35 [M -81 + Na] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.64 (d, J = 7.1 Hz, 2H) , 3.57 -3.53 (m, 4H) , 3.50 -3.43 (m, 4H) , 2.78 -2.74 (m, 4H) , 2.66 -2.64 (d, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.19 -2.15 (m, 2H) , 1.26 -1.25 (m, 24H) , 1.20 -1.17 (m, 12H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0269] Example 14. Preparation of compound C66 of the present disclosure

[0270] Compound C66 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0271] (1) Preparation of compound 35

[0272] To a solution of the compound 34 (2.06 g, 8.04 mmol, 1.2 eq) , compound 42 (1 g, 6.7 mmol, 1.0 eq) , DIPEA (1.67 mL, 10.05 mmol, 1.5 eq) in DCM (15 mL) was added HBTU (3.81 g, 10.05 mmol, 1.5 eq) under nitrogen atmosphere. The reaction mixture was stirred overnight. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-8%of MeOH / DCM) to provide compound 35 (2.2 g, 85%yield) as white solid. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 387.33; MW Found: 388.93 [M + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.05 (s, 1H) , 3.77 -3.73 (m, 2H) , 3.70 -3.66 (m,  2H) , 3.66 -3.61 (m, 4H) , 3.59 -3.55 (m, 2H) , 3.46 (dd, J = 10.4, 5.2 Hz, 2H) , 2.21 -2.14 (m, 2H) , 1.66 -1.58 (m, 2H) , 1.27 (d, J = 11.8 Hz, 24H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0273] (2) Preparation of compound C66

[0274] To a solution of compound 35 (2.0 g, 5.17 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (1.77 g, 10.34 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (40 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (3.12 g, 10.34 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 2 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM, 1%Et3N) to provide compound C66 (2.43 g, 80%yield) . The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 587.44; MW Found: 505.32 [M -83 + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.68 -3.65 (m, 4H) , 3.64 -3.58 (m, 4H) , 3.55 (dd, J = 9.6, 3.9 Hz, 4H) , 3.44 (dd, J = 9.7, 5.3 Hz, 2H) , 2.77 (td, J = 6.3, 1.5 Hz, 2H) , 2.68 -2.63 (m, 2H) , 2.20 -2.14 (m, 2H) , 1.61 (dd, J = 14.5, 7.1 Hz, 2H) , 1.27 -1.24 (m, 24H) , 1.19 -1.15 (m, 12H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0275] Example 15. Preparation of compound C67 of the present disclosure

[0276] Compound C67 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0277] (1) Preparation of compound 37

[0278] To a solution of the compound 36 (1.07 g, 4.19 mmol, 1.2 eq) , compound 43 (500 mg, 3.49 mmol, 1.0 eq) , DIPEA (866 μL, 5.23 mmol, 1.5 eq) in DCM (10 mL) was added HBTU (1.98 g, 5.23 mmol, 1.5 eq) under nitrogen atmosphere. The reaction mixture was stirred overnight. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM) to provide compound 37 (998 mg, 75%yield) as white solid. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 381.36; MW Found: 405.10 [M + Na] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.48 (s, 1H) , 3.46 (d, J = 6.3 Hz, 2H) , 3.11 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.24 -2.09 (m, 2H) , 1.88 -1.74 (m, 4H) , 1.65 -1.57 (m, 2H) , 1.45 (dd, J = 11.3, 7.8 Hz, 2H) , 1.33 -1.20 (m, 24H) , 0.96 (t, J = 10.9 Hz, 4H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0279] (2) Preparation of compound C67

[0280] To a solution of compound 37 (900 mg, 2.36 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (606 mg, 3.54 mmol, 1.5 eq) in anhydrous DCM (10 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (1.07 g, 3.54 mmol, 1.5 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 2 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM, 1%Et3N) to provide compound C67 (1.09 g, 80%yield) . The product was characterized with 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.88 -3.76 (m, 2H) , 3.58 -3.45 (m, 4H) , 3.10 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.76 (tt, J = 6.1, 3.1 Hz, 2H) , 2.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H) , 2.19 -2.13 (m, 2H) , 1.86 -1.73 (m, 4H) , 1.69 -1.60 (m, 2H) , 1.26 -1.23 (m, 24 H) , 1.20 -1.15 (m, 12H) , 0.96 (t, J = 10.5 Hz, 4H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0281] Example 16. Preparation of compound C68 of the present disclosure

[0282] Compound C68 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0283] (1) Preparation of compound 39

[0284] To a solution of the compound 38 (2.19 g, 8.53 mmol, 1.0 eq) , compound 44 (1 g, 8.53 mmol, 1.0 eq) , DIPEA (2.12 mL, 12.8 mmol, 1.5 eq) in DCM (50 mL) was added HBTU (4.85 g, 12.8 mmol, 1.5 eq) under nitrogen atmosphere. The reaction mixture was stirred overnight. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure to provide compound 39 (2.44 g, 80%yield) as white solid. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 355.35; MW Found: 356.16 [M + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.43 (s, 1H) , 3.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H) , 3.25 (dd, J = 13.1, 7.0 Hz, 2H) , 2.18 -2.11 (m, 2H) , 1.67 -1.48 (m, 6H) , 1.46 -1.34 (m, 4H) , 1.33 -1.16 (m, 24H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0285] (2) Preparation of compound C68

[0286] To a solution of compound 39 (1 g, 2.82 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (724 mg, 4.23 mmol, 1.5 eq) in anhydrous DCM (10 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (1.27 g, 4.23 mmol, 1.5 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 2 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM, 1%Et3N) to provide compound C68 (1.29 g, 82%yield) as white solid. The product was characterized with 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.90 -3.75 (m, 2H) , 3.63 -3.57 (m, 2H) , 3.23 (dd, J = 13.1, 6.9 Hz, 2H) , 2.65 (t, J = 6.5 Hz, 2H) , 2.19 -2.10 (m, 2H) , 1.67 -1.57 (m, 4H) , 1.54 - 1.45 (m, 2H) , 1.39 -1.34 (m, 2H) , 1.33 -1.22 (m, 28H) , 1.20 -1.15 (m, 12H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0287] Example 17. Preparation of compound C69

[0288] Compound C69 was prepared in this example by using the following procedures.

[0289] (1) Preparation of compound 45

[0290] To a solution of methyl 2- (4-fluoro-3-nitrophenyl) acetate 4 (5 g, 23.5 mmol, 1.0 eq) and K2CO3 (4.9 g, 35.3 mmol, 1.5 eq) in anhydrous DMF (80 mL) , under nitrogen atmosphere, was added compound 51 (6.9 g, 25.8 mmol, 1.1 eq) . The reaction mixture was stirred at 55 ℃ for 6 h, then cold water (200 mL) was added. The mixture was extracted three times with ethyl acetate, then the organic phase was washed three times with saturated LiCl solution and one time with brine. Then the organic phase was dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to form compound 45 as yellow oil which was directly used in the next step without further purification.

[0291] (2) Preparation of compound 46

[0292] To a solution of compound 45 (10.8 g, 23.5 mmol, 1.0 eq) in THF / H2O (9: 1, 130 mL) , under ice bath, was added HCOONH4 (8.9 g, 141 mmol, 6.0 eq) and Zn powder (9.2 g, 141 mmol, 6.0 eq) . After stirred for 10 minutes, the reaction mixture was moved from the ice bath and stirred at room temperature overnight. Then the reaction mixture was filtered and concentrated under reduced pressure. After that, water (200 mL) was added into the mixture, then the mixture was extracted three times with ethyl acetate, the organic phase was washed  one time with brine. After dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the product 46 formed then was directly used in the next step without further purification.

[0293] (3) Preparation of compound 47

[0294] To a solution of compound 46 (5 g, 11.6 mmol, 1.0 eq) in EtOH (60 mL) under nitrogen atmosphere, was added 3- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) propanal 7 (3.3 g, 17.4 mmol, 1.5 eq) and AcOH (2.7 mL, 46.4 mmol, 4.0 eq) . The reaction mixture was stirred at 80℃ overnight, and then concentrated under reduced pressure. Then a saturated NaHCO3 solution (100 mL) was added, the mixture was extracted three times with ethyl acetate, then the organic phase was combined and washed with brine, dried over Na2SO4, and concentrated. The resultant residue compound was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 10-40%of ethyl acetate / petroleum ether) to provide compound 47 (1.5 g, 22%yield) as light-yellow oil. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 598.99; MW. Found: 599.72 [M + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.59 (s, 1H) , 7.24 (d, J = 8.3 Hz, 1H) , 7.16 (d, J = 8.3 Hz, 1H) , 5.40 -5.31 (m, 2H) , 4.17 -4.09 (m, 4H) , 3.74 (s, 2H) , 3.68 (s, 3H) , 3.09 (t, J = 6.9 Hz, 2H) , 2.06 -1.92 (m, 4H) , 1.81 -1.72 (m, 2H) , 1.39 -1.19 (m, 22H) , 0.88 (t, J = 6.5 Hz, 3H) , 0.86 (s, 9H) , 0.01 (s, 6H) .

[0295] (4) Preparation of compound 48

[0296] To a solution of compound 47 (1.5 g, 2.5 mmol, 1.0 eq) in THF (10 mL) under nitrogen atmosphere, was added 2 M HCl solution (10 mL) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 h. 20 mL saturated NaHCO3 solution was added into the reaction. Then the mixture was extracted two times with ethyl acetate, washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure. The resultant residue was dissolved in DCM (10 mL) , triethylamine (0.4 g, 3.8 mmol, 1.5 eq) and DMTrCl (1.1 g, 3.3 mmol, 1.3 eq) was added therein. The reaction mixture was stirred at room temperature for 6 h, after which it was concentrated under reduced pressure. The resultant  residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 20-50%of ethyl acetate / petroleum ether) to provide compound 48 (1.5 g, 76%yield) as light-yellow oil. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 787.1; MW. Found: 788.1 [M + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.56 (s, 1H) , 7.34 (d, J = 7.1 Hz, 2H) , 7.25 -7.13 (m, 9H) , 6.75 (d, J = 8.8 Hz, 4H) , 5.41 -5.30 (m, 2H) , 4.13 -4.07 (m, 2H) , 3.76 (s, 6H) , 3.73 (s, 2H) , 3.67 (s, 3H) , 3.60 (t, J = 7.0 Hz, 2H) , 3.11 (t, J = 6.9 Hz, 2H) , 1.99 (t, J = 15.9 Hz, 4H) , 1.77 -1.65 (m, 2H) , 1.33 -1.23 (m, 22H) , 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0297] (5) Preparation of compound C69

[0298] To a solution of compound 48 (1.5 g, 1.9 mmol, 1.0 eq) in anhydrous THF (20 mL) under nitrogen atmosphere and ice bath, was added LiAlH4 (73 mg, 1.9 mmol, 1.0 eq) . The mixture was moved to room temperature after 10 minutes and stirred for 1 h. Then the reaction was moved to ice bath, saturated potassium sodium tartrate solution (10 mL) was added slowly into the mixture. After 30 minutes, the reaction was extracted three times with ethyl acetate, then the organic phase was combined and washed with brine, dried over Na2SO4, and concentrated. The crude product (1.3 g, 1.7 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (587 mg, 3.4 mmol, 2 eq) were dissolved in anhydrous DCM (10 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (1.0 g, 3.4 mmol, 2 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 6 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 10-30%of ethyl acetate / petroleum ether, 1%Et3N) to provide compound C69 (1.2 g, 78%yield) as light-yellow oil. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc.: 959.31; MW Found: 876.75 [M-diisopropyl + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.50 (s, 1H) , 7.34 (d, J = 7.2 Hz, 2H) , 7.25 -7.14 (m, 8H) , 7.09 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 6.75 (d, J = 8.8 Hz, 4H) , 5.41 -5.31 (m, 2H) , 4.13 -4.05 (m, 2H) , 3.93 -3.83 (m, 1H) , 3.81 -3.70 (m, 9H) , 3.64 -3.54 (m, 4H) , 3.11 (t, J = 7.0 Hz, 2H) , 3.03 (t, J = 7.3 Hz, 2H) , 2.57 -2.47 (m, 2H) , 2.07 -1.92 (m, 4H) , 1.77 - 1.66 (m, 2H) , 1.34 -1.24 (m, 22H) , 1.18 -1.12 (m, 12H) , 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H) .

[0299] Example 18. Preparation of compound C70 of the present disclosure

[0300] Compound C70 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0301] (1) Preparation of compound C70

[0302] To a solution of compound 49 (1.00 g, 3.73 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (1.27 g, 7.45 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (19 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (2.36 mL, 7.45 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 8 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-2%of ethyl acetate / petroleum ether, 1%Et3N) to provide compound C70 (1.65 g, 94%yield) as colorless oil. The product was characterized with 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.40 -5.36 (m, 2H) , 3.86 -3.76 (m, 2H) , 3.62 -3.52 (m, 4H) , 2.65 (t, 2H) , 1.99 -1.91 (m, 4H) , 1.66 -1.59 (m, 2H) , 1.35 -1.25 (m, 22H) , 1.20 -1.18 (m, 12H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0303] Example 19. Preparation of compound C71 of the present disclosure

[0304] Compound C71 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0305] (1) Preparation of compound C71

[0306] To a solution of compound 50 (1.00 g, 3.75 mmol, 1.0 eq) and Diisoropyl ammonium tetrazolide (1.28 g, 7.51 mmol, 2.0 eq) in anhydrous DCM (20 mL) under nitrogen atmosphere was added 3- ( (Bis (diisopropylamino) phosphino) oxy) propanenitrile (2.38 mL, 7.51 mmol, 2.0 eq) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 6 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-2%of ethyl acetate / petroleum ether, 1%Et3N) to provide compound C71 (1.5 g, 90%yield) as colorless oil. The product was characterized with 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.45 -5.28 (m, 4H) , 3.85 -3.75 (m, 2H) , 3.64 -3.53 (m, 4H) , 2.65 (t, J = 6.6 Hz, 2H) , 2.09 -2.00 (m, 4H) , 1.64 -1.58 (m, 2H) , 1.41 -1.24 (m, 18H) , 1.21 -1.17 (m, 12H) , 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 3H) .

[0307] Example 20: Synthesis and design of LDEC-conjugated ASOs

[0308] RD-10004 (ASO-10-27, SEQ ID NO: 1) is an ASO targeting the pre-mRNA of the SMN2 gene to modulate its splicing by inclusion of exon 7 into the matured mRNA, thus “converting” SMN2Δ7 (i.e., SMN2 with deletion of exon 7) to SMN2FL (i.e., full-length SMN2 including exon 7) mRNA in a cell, thereby boosting the level of SMN protein encoded by SMN2FL mRNA. It was synthesized with medicinal chemistry (i.e., 2’MOE and PS modifications) without a lipid conjugation.

[0309] The sequence and chemical modifications of RD-10004 were kept unchanged when synthesizing exemplary LDEC conjugates by covalently linking LDEC to the 5’-end, 3’-end, or both 3’-and 5’-ends of RD-10004, respectively. Oligonucleotide sequences and conjugates are shown in Table 1.

[0310] Example 21: fn vivo activity of LDEC-ASO in exon 7 inclusion and induction of SMN2FL mRNA in skeletal muscle of type III SMA mice via SC administration

[0311] To compare activity of LDEC-ASO (i.e., RD-14644) to non-conjugated RD-10004 at modulating SMN2 splicing in skeletal muscle tissue, type III SMA female mice at PND 40-50 were treated at 10, 30, or 100 mg / kg doses of either RD-14644 or RD-10004 via SC injection. Saline treatment alone served as a vehicle control to establish baseline expression levels of SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA. Mice were sacrificed on day 14 after treatment in which SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA levels were quantified via RT-qPCR in bicep (FIG. 1A) , semitendinosus (FIG. 1B) , platysma (FIG. 1C) and gluteus (FIG. 1D) muscle tissue. At all doses, RD-14644 measured greater levels of SMN2FL over SMN2Δ7 mRNA in each muscle tissue comparative to RD-10004 (FIG. 1A-D) . Table 2 summarizes mean fold change in SMN2FL and SMN2Δ7 transcript levels relative to the saline control group following SC treatment. Overall, LDEC-conjugation enhanced ASO such as RD-14644 had improved potency in exon 7 inclusion and induction of SMN2FL transcript in muscle tissue in comparison to non-conjugated ASO (i.e., RD-10004) .

[0312] Table 2. SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA levels in skeletal muscles following LDEC-ASO treatment in vivo Note: ″SEM″represents Standard Error of Mean. * / #represents p ＜ 0.05, ** / ##represents p ＜ 0.01, *** / ### represents p ＜ 0.001, **** / ####represents p ＜ 0.0001, and ″ns″represents no statistical significance (compared to saline group) .

[0313] Example 22: Converting SMN2Δ7 to SMN2FL transcript in peripheral tissue (i.e., heart and liver) of type III SMA mice via SC administration of LDEC-ASOs

[0314] To compare activity of LDEC-ASOs (i.e., RD-14644, RD-14645, and RD-14646) to non-conjugated RD-10004 at modulating SMN2 splicing in the liver, SMN2FL and SMN2Δ7 expression was quantified via RT-qPCR in tissue of type III SMA female mice on 14 days post dosing via SC injection. As shown in FIG. 2A, each LDEC-ASO (i.e., RD-14644, RD-14645, and RD-14646) had a dose-dependent response at increasing SMN2FL production in comparison to RD-10004, which only measured a statistical difference in splicing activity at the highest tested dose (i.e., 100 mg / kg) .

[0315] In the heart, treatment with LDEC-ASO (i.e., RD-14644) also measured greater levels of SMN2FL over SMN2Δ7 mRNA comparative to RD-10004 (FIG. 2B) . In fact, only the LDEC-conjugate (i.e., RD-14644) demonstrated dose-dependent splicing activity, whereas RD-10004 only had subtle or no activity at the tested doses (i.e., 10, 30, and 100 mg / kg) .

[0316] Table 3 summarizes SMN2FL and SMN2Δ7 expression results in the liver and heart following treatment with the indicated LDEC-ASOs relative to the saline control group. Similar to results in muscle tissue, data indicates LDEC conjugation also enhanced delivery and subsequent splicing activity of RD-10004 in peripheral tissues (i.e., heart and liver) .

[0317] Table 3. SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA levels in the liver or heart following LDEC-ASOs treatment in vivo Note: ″SEM″represents Standard Error of Mean. * / #represents p ＜ 0.05, ** / ##represents p ＜ 0.01, *** / ### represents p ＜ 0.001, **** / ####represents p ＜ 0.0001, and ″ns″represents no statistical significance (compared to Saline group) .

[0318] Example 23: Converting SMN2Δ7 to SMN2FL transcript in peripheral tissue and skeletal muscle of type III SMA mice via SC administration of LDEC-ASOs

[0319] To further compare activity of LDEC-ASOs (i.e., RD-14644) to non-conjugated RD-10004 at modulating SMN2 splicing in peripheral tissue and skeletal muscle, LDEC-ASO (i.e., RD-14644) or the non-conjugate control (i.e., RD-10004) were administered via SC injection into female type III SMA mice on PND 40-50 at 30 mg / kg. aCSF treatment alone served as a vehicle control to establish baseline expression levels of SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA isoforms. SMN2FL and SMN2Δ7 expression was quantified via RT-qPCR in tissue of type III SMA female mice on 14 days 14 post dosing via SC injection. Mean expression levels of SMN2FL or SMN2Δ7 in the peripheral tissues (i.e., heart, liver, fat tissues, diaphragm, thoracic aorta with vein) and skeletal muscle (i.e., bicep, semitendinosus, platysma and gluteus) of treated animals are shown in FIG. 3A-3B and indicates LDEC conjugation also enhanced delivery and subsequent splicing activity of RD-10004 in peripheral tissues and skeletal muscle.

[0320] Example 24: Converting SMN2Δ7 to SMN2FL transcript in peripheral tissue of type III SMA mice via IV administration of LDEC-ASOs

[0321] To compare activity of LDEC-ASOs (i.e., RD-14644 and RD-14645) to non-conjugated RD-10004 at modulating SMN2 splicing, SMN2FL and SMN2Δ7 expression was quantified by RT-qPCR using tissues from type III SMA female mice on day 14 post femoral vein (IV) injection. Saline treatment alone served as a vehicle control to establish baseline expression levels of SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA. As shown in FIG. 4A-4F, each LDEC-ASO (i.e., RD-14644 and RD-14645) increased SMN2FL production in comparison to RD-10004 in peripheral tissues (i.e., liver, fat tissue, thoracic aorta, heart, diaphragm and lung) . SMN2FL and SMN2Δ7 expression results following treatment with the indicated LDEC-ASOs relative to the saline control group are shown in Table 4.

[0322] Table 4. SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA levels following LDEC-ASOs treatment in vivo Note: ″SEM″represents Standard Error of the Mean.

[0323] Example 25: Converting SMN2Δ7 to SMN2FL transcript via LDEC-ASO treatment in GM03813 and GM09677 cells

[0324] To test in vitro activity of various LDEC-ASOs, the indicated LDEC-ASOs (i.e., RD-15865, RD-16070, RD-16071, RD-16072, RD-16073, RD-16074, RD-16075, RD-16076, RD-16077, RD-16078, RD-16079, RD-16080, RD-16081 and RD-16098) were transfected into GM03813 and GM09677 cells at 0.1, 1 and 10 nM for 3 days, respectively. Mock treatments were transfected in absence of oligonucleotide. dsCon2 served as a non-specific duplex control. mRNA levels of SMN2FL and SMN2Δ7 were quantified by RT-qPCR. FIG. 5A-5B shows mRNA expression of SMN2FL and SMN2Δ7 at 1 and 10 nM. Table 5 summarizes SMN2FL and SMN2Δ7 expression results in GM03813 cells.

[0325] Table 5. SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA levels (fold change) following LDEC-ASOs treatment in GM03813 cells Note: ″SEM″represents Standard Error of the Mean.

[0326] Further, FIG. 6A-6B shows mRNA expression of SMN2FL and SMN2Δ7 at 0.1 and 1 nM in GM09677 and GM03813 cells and the results are summarized in Table 6.

[0327] Table 6. SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA levels (fold change) following LDEC-ASOs treatment in GM09677 and GM03813 cells Note: ″SEM″represents Standard Error of the Mean.

[0328] Example 26: Converting SMN2Δ7 to SMN2FL transcript via LDEC-ASOs treatment in GM03813 cells

[0329] To test in vitro activity of LDEC-ASOs in which the lipid contains 18 carbon atoms, the indicated LDEC-ASOs (i.e., RD-16935, RD-16936 and RD-16937) were transfected into GM03813 cells at 1 nM and 10 nM for 3 days. RD-10004 was transfected and served as a non-conjugate control. As shown in FIG, 7A, all LDEC-ASOs presented the splicing activity similar or superior to non-conjugate RD-10004 at 1 nM. As shown in FIG, 7B, when increased the concentration at 10 nM, all LDEC-ASOs presented similar splicing activity compared to non-conjugate RD-10004 suggesting the splicing activity of ASOs may reach a plateau at 10 nM.mRNA expression of SMN2FL and SMN2Δ7 relative to mock control at 1 and 10 nM in GM03813 cells are summarized in Table 7.

[0330] Table 7. SMN2FL and SMN2Δ7 mRNA levels following LDEC-ASOs treatment in GM03813 cells Note: ″SEM″represents Standard Error of the Mean.

[0331] Example 27: Design and synthesis of ASOs targeting human SCN9A transcript

[0332] Gapmer ASOs of 20 nucleotides (nt) with 10 nt DNA gap and two 5-nt wings) were designed against SCN9A mRNA sequence (ENST00000409672, SEQ ID NO: 22, see Table 8) using the PFRD program (Sciabola et al. PFRED: A computational platform for siRNA and antisense oligonucleotides design. PLoS One. 2021; 16 (1) : e0238753. Published 2021 Jan 22. doi: 10.1371 / journal. pone. 0238753) .

[0333] Table 8. Human SCN9A cDNA sequences for ASO design

[0334] The resulted ASOs were first filtered by using the following criteria: (i) GC content between 40%and 70%, (ii) less than 5 consecutive identical nucleotides, (iii) fewer than 3 dinucleotide or trinucleotide repeats, and (iv) not on 5’ UTR region of SCN9A mRNA. The remaining ASOs were then sorted by the PLSpred_optimized score of each ASO as provided by the program from largest to smallest, the top 119 ASOs were selected as candidates for in vitro screen. The ASO sequences were synthesized with chemical modification and are listed in Table 9 with their congnate target sequences.

[0335] Example 28: Screening of ASOs targeting human SCN9A transcript

[0336] To assess the knockdown activity of SCN9A ASOs, SK-N-AS cells were transfected with each of the aforementioned ASO at 25 and 100 nM for 24 hours. Mock treatments were transfected in the absence of an oligonucleotide (not shown) . RD-10750 served as a non-specific control (not shown) . RD-12746 was transfected as a silencing dsRNA control (not shown) . SCN9A mRNA levels were quantified by one-step RT-qPCR using a gene specific primer set in each of the PCR reactions.

[0337] Relative changes of SCN9A expression caused by ASO treatment are summarized in Table 8 and plotted in FIG. 8A. FIG. 8B shows Emax knockdown activity of ASOs on SCN9A mRNA between 25 and 100 nM. The top 32 performing ASOs are marked in rectangular solid box. Results show that 4 (3.4%) and 34 (28.6%) ASOs have high (≥70%) and moderate (50-70%) knockdown on SCN9A expression and are summarized in Table 10.

[0338] Table 10. Summary of ASOs knockdown activity on SCN9A mRNA screened in SK-N-AS cells

[0339] Example 29: Knockdown activity on SCN9A mRNA by ASOs in SK-N-AS cells

[0340] To confirm the screening results for SCN9A knockdown activity, 32 functional SCN9A ASOs were transfected into SK-N-AS cells at concentration gradient (i.e., 0.02, 0.1, 0.39, 1.56, 6.25, 25, 100 and 400 nM) for 24 hours to generate dose response curve via RT-qPCR shown in FIG. 9A-9D. IC50 values and Emax knockdown levels were extrapolated to define potency in context to maximal activity for each of the tested ASOs that demonstrated dose-dependent knockdown of SCN9A. Table 11 summarizes the IC50 values and Emax knockdown levels.

[0341] Table 11. IC50 values and Emax knockdown levels following ASO treatment in SK-N-AS cells

[0342] Example 30: Thermal sensitivity functional tests by LDEC-conjugated ASOs in SD rats

[0343] To test thermal sensitivity of SCN9A ASOs, the indicated LDEC-ASOs (i.e., RD-13767 and RD-15069) and non-conjugated ASO (i.e., RD-12835 and RD-15064) were administered via IT injection into adult female SD rats at 0.5 and 1 mg. RD-15873 was treated at 1 mg and served as a positive control. The aforementioned ASOs sequences are listed in Table 12. aCSF treatment alone served as a vehicle control to establish baseline of tail flick latency. FIG. 10 shows the tail flick latency was tested on day 27 by hot water tail immersion  test to assess thermal sensitivity and the mean values are summarized Table 13.

[0344] Table 12. Human SCN9A ASO sequences Note: upper case, RNA; lower case, DNA; d, DNA; *, phosphorothioate (PS) backbone modification; f, 2′-fluoro;  me, 2′-O-methoxyethyl (2’MOE) ; E, cET (constrained ethyl) ; C, 5-methyl cytosine; U, 5-methyl uracil.

[0345] Table 13. Values of tail flick latency on day 27 following IT injection in SD rats Note: “SEM” represents Standard Error of the Mean.

[0346] Example 31: Knockdown activity on rat Scn9a mRNA mediated by LDEC-conjugated ASOs in SD rats

[0347] To assess knockdown activity of LDEC-ASOs on rat Scn9a mRNA, the indicated LDEC-ASOs (i.e., RD-13767 and RD-15069) and non-conjugate ASOs (i.e., RD-12835 and RD-15064) were administered via IT injection at 0.5 and 1 mg. RD-15873 was treated at 1 mg and served as a positive control. aCSF treatment alone served as a vehicle control to establish baseline expression of Scn9a mRNA. Rats were sacrificed on 27 days post dosing and Scn9a mRNA levels were quantified via RT-qPCR. The remaining Scn9a mRNA were quantified in tissues from brain (i.e., cerebrum) , spinal cord (i.e., cervical, thoracic and lumbar) and dorsal  root ganglion (DRG) are shown in FIG. 11A-11B. Table 14 summarizes the mean knockdown activity on Scn9a mRNA on day 27 following ASO treatment in SD rats.

[0348] Table 14. Mean knockdown activity on Scn9a mRNA on day 27 following ASO treatment Note: ″ / ″means not tested.

[0349] Example 32: Design and synthesis of ASOs targeting human DMD exon 51 transcript

[0350] To assess the knockdown activity of ASOs, coding strand sequence for human DMD exon 51 transcript was retrieved from the UCSC Genome database (SEQ ID NO: 392, as shown in Table 15) .

[0351] Table 15. Human DMD cDNA sequences for ASO design

[0352] Fifty ASOs were designed with 20 nucleotides (nt) in length based on the following criteria: (i) GC content between 40%and 70%, (ii) less than 5 consecutive identical nucleotides, and (iii) fewer than 3 dinucleotide or trinucleotide repeats. ASOs were synthesized with chemical modification and their sequences including cognate target site in human DMD exon 51 transcript are listed in Table 16.

[0353] Example 33: Exon 51 skipping levels of human DMD mRNA mediated by LDEC-ASOs in RD cells

[0354] To assess the exon 51 skipping levels of human DMD mRNA mediated by LDEC-ASOs, 50 LDEC-ASOs were individually transfected into RD cells at 25 nM for 48 hours. RD-16271 and RD-16272 were transfected and served as non-specific controls. RD-15946 was transfected and served as a LDEC-ASO positive control. Exon 51 skipping levels were quantified by nested PCR using two gene specific primer sets were plotted in FIG. 12 and summarized in Table 16. As shown in FIG. 12, 7 LDEC-ASOs (i.e., RD-15905, RD-15935, RD-15936, RD-15941, RD-15942, RD-15943 and RD-15944) presented high exon 51 skipping levels compared to LDEC-ASO positive control (RD-15946) .

[0355] Example 34: Dose-dependent exon 51 skipping levels of human DMD mRNA mediated by LDEC-ASOs in RD cells

[0356] To further validate the exon 51 skipping levels, top 7 performing LDEC-ASOs (i.e., RD-15905, RD-15935, RD-15936, RD-15941, RD-15942, RD-15943 and RD-15944) were individually transfected into RD cells at 10, 25 and 100 nM for 48 hours. RD-16271 served as a non-specific control. RD-15945 was transfected and served as a non-conjugate ASO positive control. RD-15946 was transfected and served as a LDEC-ASO positive control. Exon 51 skipping levels were quantified by nested PCR using two gene specific primer sets. As shown in FIG. 13, almost all LDEC-ASOs showed a dose-dependent increase in exon 51 skipping.

[0357] Materials and Methods

[0358] General synthesis method of oligonucleotide.

[0359] Single strand synthesis method

[0360] The single strand oligonucleotide was synthesized on a K&ADNA synthesizer (K&ALaborgeraete GbR, chaafheim, Germany) by a solid phase synthesis technique.

[0361] The starting material was universal solid support or special solid support commercially available or synthesis as disclosure in previous context. In general, phosphoramidite monomers including various linkers and conjugates (0.1M in acetonitrile or dichloromethane) , were added sequentially onto a solid support in the DNA synthesizer to generate the desired full-length oligonucleotides. Each cycle of amidite addition consisted of four chemical  reactions including detritylation, coupling, oxidation / thiolation and capping. In the first step, the detritylation was performed by using 3%dichloroacetic acid (TCA) in DCM for 45 seconds. In the second step, phosphoramidite coupling was conducted for 6 minutes for all amidites by 12 eq. In the third step, oxidation was performed by using 0.02 M iodine in THF: pyridine: water (70: 20: 10, v / v / v) for 1 minute; if phosphorothioate modification needed then replace oxidation by thiolation which was carried out with 0.1 M solution of xanthane hydride in pyridine: ACN (50: 50, v / v) for 3 minutes. In the fourth step, the capping was performed by using a THF: acetic anhydride: Pyridine (80: 10: 10, v / v / v) (CAP A) and N-methylimidazole: THF (10: 90, v / v) , (CAP B) for 20 seconds. The Cycles of four chemical reactions will be depended on the length of single oligonucleotide.

[0362] Deprotection I (Nucleobase Deprotection) : After completion of the synthesis, the solid support was transferred to a screw-cap microcentrifuge tube. For a 1 μmol synthesis scale, 1 ml of a mixture of methylamine and ammonium hydroxide was added. The tube containing the solid support was then heated in an oven at 60℃ to 65℃ for 15 min and then allowed to cool to room temperature. The cleavage solution was collected and evaporated to dryness in a speedvac to provide crude single strand of oligonucleotide.

[0363] Deprotection II (Removal of 2’-TBDMS Group) : the crude RNA oligonucleotide, still carrying the 2’-TBDMS groups, was then dissolved in 0.1 ml of DMSO. After adding 1 ml of Triethylamine trihydrofluoride, the tube was capped, and the mixture was shaken vigorously to ensure complete dissolution and then heated in an oven at 65℃ for 15 minutes. The tube was removed from the oven and cooled down to room temperature. The solution containing the completely desilylated oligonucleotide was cooled on dry ice. 2 ml of ice-cold n-butanol (-20℃) were carefully added in 0.5 ml portions to precipitate the oligonucleotides. The precipitate was filtered, washed with 1 ml ice-cold n-butanol, and subsequently dissolved in 0.01 M Tris (hydroxymethyl) aminomethanol hydrochloride buffer.

[0364] (2) single strand purification

[0365] The purification of oligonucleotides was performed on an AKTA explorer 10 equipped with a Source 15Q 4.6 / 100 PE column using the following conditions: buffer A: (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) , B: (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 2M NaCl, pH 7.5) , gradient: 10%B to 60%B in 25 min, flow rate: 1 ml / min. The pure oligonucleotides were collected and desalting by a HiPrep 26 / 10 Desalting column and then were subsequently lyophilized to  powder.

[0366] Cell culture and treatment

[0367] SMA patient derived fibroblasts were obtained from Coriell Institute (Camden, NJ, USA) , including GM03813 (SMA type II with 3 copies of SMN2 gene) and GM09677 (SMA type I with 3 copies of SMN2 gene) were cultured at 5%CO2 and 37℃ in modified MEM medium (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) supplemented with 15%bovine calf serum (Sigma-Aldrich) , 1%NEAA (Gibco) and 1%penicillin / streptomycin (Gibco) . SK-N-AS (Procell, Wuhan, China, Cat#CL-0621) cells and RD cells (TCHu 45, Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Science, China) were cultured at 37℃ with 5%CO2 in modified DMEM medium (Gibco, Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10%bovine calf serum (Sigma-Aldrich) and 1%penicillin / streptomycin (Gibco) . Transfection was carried out using Lipofectamine RNAiMax (ThermoFisher, Waltham, MA, USA) in growth media without antibiotics according to the manufacturer’s protocol.

[0368] Animal procedures

[0369] All animal procedures were conducted by certified laboratory personnel using protocols consistent with local and state regulations and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee. SMA-like mice created by homozygous knock-out of mouse Smn exon 7 with transgene of human SMN2 (Smn- / -SMN2+ / -) as previously described Hsieh-Li et al.(Hsieh-Li, H. M., et al. 2000) were obtained from Jackson Laboratories. SMA type III female mice [Smn1- / -, SMN2+ / + (Genotyping see WO2022022617A1 patent) ] were generated and administered with test compounds. Sprague-Dawley (SD) female rats (A102, SPF, China) were purchased from SPF (Suzhou) Biotechnology Co., LTD. Animals were randomly allocated into study groups.

[0370] Femoral vein (IV)

[0371] Mice were anesthetized by using 5%isoflurane in a custom-made chamber. Anesthetized mice were placed on a heating pad at 37 ℃ and anesthesia was maintained by using an inspiratory isoflurane concentration of 2%via a face mask. The hindlimbs of mice were fixed with tape in slight abduction, and the inguinal area of the leg was shaved and disinfected with 70%ethanol and exposed for surgery. Through a skin incision of 3 to 4 mm parallel and inferior to the inguinal ligament, the femoral vein was exposed and then separated  from surrounding tissues. The intravenous infusion in femoral vein was performed slowly within 2 mins of 200 μL of a solution of test compounds. At the end of infusion, the injection site of femoral vein was pressed firmly with a cotton swab to prevent backflow of the administration solution and / or blood. The wound was flushed with 1 mL 0.9%saline, and the incision was closed with 6-0 silk.

[0372] Intrathecal (IT) injection

[0373] Anesthesia was administered via 3.0%isoflurane in an induction chamber continuously for 10 mins. Hair was shaved around the injection site at the base of the tail and cleaned with 75%ethanol. The space between the L5-L6 spinous processes was identified and a 30-gauge needle attached to a microliter syringe containing the appropriate drug formulations was slowly inserted into the intradural space until a tail flick was observed. The needle position was subsequently secured in which 30 μL total volume of solution was injected over the course of 1 min.

[0374] Hot water tail immersion test

[0375] The tail immersion test measures pain response (tail flank latency) to 55℃ hot water. A rat is picked up with its tail exposed. The rats are held over the water bath and dipped 1cm of the distal tail into the water bath. The time needed for the rat to respond (e.g., tail flick) is recorded. If there is no response within 10 seconds, the test is terminated. For each animal, mean response time from 3 independent measurements is calculated.

[0376] Tissues harvest

[0377] The treated animals were euthanized by carbon dioxide inhalation and placed on plate with back up. The fur of the forelimbs, hind limbs, neck and buttocks of the animal were shaved. The skin of the animal was sterilized with 75%ethanol. The skeletal muscles (i.e., bicep, semitendinosus, platysma and gluteus) were isolated according to anatomical schematics and immediately submerged in RNAlaterTM (Ro118-500 mL, Beyotime, China) . The indicated brain, spinal cord and peripheral tissues were isolated and stored in RNAlaterTM.

[0378] RNA isolation

[0379] Animal tissues were submerged and stored in RNAlaterTM prior to sample processing. Animal tissues were cut into 2-3 slices less than 0.5 cubic thick and the resulted fragments were transferred to a 2 mL Micro tube containing 1 mL RNAVzol (Biosharp, BS259A, China) and 6-8 ceramic beads (ALLSHENG Ceramic Beads, China) . The tissues were homogenized  by a Bioprep-24 homogenizer (ALLSHENG Bioprep-24, China) . 200 μL chloroform was pipetted to the homogenate, then vortexed and incubated for 5 min, followed by a centrifugation for 15 min at 12000 g. 200 μL top aqueous phase was pipetted to a new 1.5 mL tube. RNA was isolated using a MagPure Total RNA Micro LQ kit (Magen, R6621, Guangdong, China) following its instructions provided by the manufacturer in an Auto-Pure96 machine (ALLSHENG, Zhejiang, China) . RNA concentrations were determined by a microplate reader system (Infinite M2000 Pro, Tecan) .

[0380] Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)

[0381] The resultant RNA (～1 μg) was reversely transcribed into cDNA by using a PrimeScript RT kit containing gDNA Eraser (Takara, Shlga, Japan) . The resultant cDNA was amplified in a Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 384 (Roche, ref: 4729749001, US) using SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Shlga, Japan) reagents and primers specific for amplifying target genes of interest. Reaction conditions were as follows: reverse transcription reaction (stage 1) : 42℃ for 5 min, 95℃ for 10 sec; PCR reaction (stage 2) : 95℃ for 5 sec, 60℃ for 30 sec, 72℃ for 10 sec, 40 cycles of amplification; and melting curve (stage 3) . PCR reaction conditions are shown in Table 17 and Table 18. Primer sequences are listed in Table 19.

[0382] Table 17: RT reaction

[0383] Table 18: RT-qPCR reaction

[0384] Table 19. Primer sequences for RT-qPCR assay

[0385] One reference gene

[0386] To calculate the expression levels (Erel) of target mRNA in dsRNA-or ASO-treatment samples relative to control treatment, the Ct values of the target gene and the internal reference gene were substituted into Formula BI, Erel=2 (CtTm-CtTs)  / 2 (CtRm-CtRs)           (Formula BI)

[0387] wherein CtTm was the Ct value of the target gene from the control-treated sample; CtTs was the Ct value of the target gene from the dsRNA-or ASO-treated sample; CtRm was the Ct value of the internal reference gene from the control-treated sample; CtRs was the Ct value of the internal reference gene from the dsRNA-or ASO-treated sample.

[0388] Two reference genes

[0389] To calculate the expression level (Erel) of target gene mRNA in an dsRNA-treatment sample relative to control treatment, the Ct values of the target gene and the two internal reference genes were substituted into the following Formula BII, Erel=2 (CtTm-CtTs)  /  ( (2 (CtR1m-CtR1s) *2 (CtR2m-CtR2s)) (1 / 2) )          (Formula BII)

[0390] wherein CtTm was the Ct value of the target gene from the control-treated sample; CtTs was the Ct value of the target gene from the dsRNA-treated sample; CtR1m was the Ct value of the internal reference gene 1 from the control-treated sample; CtR1s was the Ct value of the internal reference gene 1 from the dsRNA-treated sample; CtR2m was the Ct value of the internal reference gene 2 from the control-treated sample; and CtR2s was the Ct value of the internal reference gene 2 from the dsRNA-treated sample.

[0391] Nested PCR and gel electrophoresis analysis

[0392] Total cellular RNA was isolated from cell culture using the RNeasy Plus Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer’s protocol. The resultant RNA (500 ng) was reverse transcribed into cDNA by using PrimeScript RT kit containing gDNA Eraser (Takara, Shiga, Japan) as shown in Table 17. Primer-specific, exon-specific, optimized nested PCR amplification was thereafter performed in Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 384 (Roche, ref: 4729749001, US) by using SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Shiga, Japan) reagents and primer pair sets as shown below in Table 20. The indicated primer pairs are shown in Table 21 as either forward or reverse (F / R) and either outer or inner primer pairs (O / I) corresponding to primary or secondary amplifications, respectively. Products from secondary amplification were thereafter added with 10 × loading buffer (Takara, Shiga, Japan) , separated by 2%agarose gel at 180 V for 30 min and visualized by  Nucleic Acid Gel Stain (Biotium, Fremont, US) . Images were captured by ChemiDoc XRS+ System (Biorad, Hercules, US) and quantified by Image J.

[0393] Table 20: nested PCR reaction

[0394] Table 21. Primer sequences for nested PCR assay

[0395] Statistical analysis

[0396] Differences between groups of continuous variables were compared using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s multiple comparisons. A P value of less than 0.05 was considered statistically significant between two groups. * / #represents p ＜ 0.05, ** / ##represents p ＜ 0.01, *** / ###represents p ＜ 0.001, **** / ####represents p ＜ 0.0001.

[0397] While the invention has been particularly shown and described with reference to a preferred embodiment and various alternate embodiments, it is understood by persons skilled in the relevant art that various changes in form and details can be made therein without departing from the spirit and scope of the invention.

[0398] References

[0399] 1. Vitravene Study Group. Safety of intravitreous fomivirsen for treatment of cytomegalovirus retinitis in patients with AIDS. Am J Ophthalmol 2002 Apr; 133 (4) : 484-98.

[0400] 2. IONIS PHARMACEUTICALS, INC. Modulation of smn expression. April 10, 2015.

[0401] 3. Stein, C.A. and D. Castanotto. FDA-Approved Oligonucleotide Therapies in 2017. Mol Thera, 2017 May 3; 25 (5) : 1069-1075.

[0402] 4. P Duda, GA Laforet, C DiJohnson, H Eliopoulos, A Narayana, DE Frank, S Ruff, JR Mendell. Development of Phosphorodiamidate Morpholino Oligomers (PMOs) for the Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) (S42.008) . Neurology, April 18, 2017; 88 (16 Supplement) .

[0403] 5. H M Hsieh-Li 1, J G Chang, Y J Jong, M H Wu, N M Wang, C H Tsai, H Li. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nature Genet, 2000 Jan; 24 (1) : 66-70.

Claims

1.An oligonucleotide delivery agent comprising one or more lipid moiety directly or indirectly conjugated to an oligonucleotide, wherein at least one of the lipid moieties comprises at least one C6-C22 linear alkyl group, at least one C6-C22 linear alkenyl group or a combination thereof, and the oligonucleotide is a single-stranded oligonucleotide.2.The oligonucleotide delivery agent according to claim 1, wherein the lipid moieties comprise C12-C20 linear alkyl group, C12-C20 linear alkenyl group or a combination thereof, and the C12-C20 linear alkenyl group comprises one or two olefinically unsaturated groups.3.The oligonucleotide delivery agent according to claim 1, wherein the C6-C22 linear alkyl group is selected from the group consisting of linear dodecyl, linear myristyl, linear pentadecyl, linear hexadecyl group, linear octodecyl, linear eicosyl, linear dodecylenyl, linear myristylenyl, linear pentadecylenyl, linear hexadecylenyl group, linear octodecylenyl, linear eicosylenyl, linear dodecyl-dienyl, linear myristyl-dienyl, linear pentadecyl-dienyl, linear hexadecyl-dienyl group, linear octodecyl-dienyl, linear eicosyl-dienyl.4.The oligonucleotide delivery agent according to any of claims 1 to 3, wherein the oligonucleotide is a single-stranded oligonucleotide.5.The oligonucleotide delivery agent according to claim 4, wherein the single-stranded oligonucleotide has 15 to 35 nucleotides in length.6.The oligonucleotide delivery agent according to claim 1, wherein the lipid moiety is directly conjugated to the single-stranded oligonucleotide via a covalent bond or a linking moiety having the following structure wherein Y1 is oxygen or sulfur, the asterisk (*) refers to the site wherein the linking moiety is attached to the single-stranded oligonucleotide, and the double asterisk (**) refers to the site wherein the linking moiety is attached to the lipid moiety.7.The oligonucleotide delivery agent according to claim 1, having a structure presented by Formula A: wherein the lipid moiety comprises at least one C6-C22 linear alkyl group, at least C6-C22 linear alkenyl group, or a combination thereof, and M is an integer of 1 to 5, the oligonucleotide is a single-stranded oligonucleotide, and N is an integer of 1, 2 or 3; andthe delivery enhancing compound moiety is a bivalent to hexavalent moiety comprising at least one nitrogen-containing heterocyclic ring, at least one nitrogen-containing linear chain group, at least one nitrogen-containing linear chain-carbocyclic ring group, or combinations thereof, and each of the lipid moiety and the oligonucleotide is directly or indirectly conjugated to the delivery enhancing compound moiety.8.The oligonucleotide delivery agent according to claim 7, wherein the lipid moiety is a C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 or C20 linear, saturated or unsaturated hydrocarbyl group, andM is an integer of 1, 2, 3, 4 or 5.9.The oligonucleotide delivery agent according to claim 8, wherein the unsaturated lipid moiety has at least one cis-or trans-unsaturated double bond in the hydrocarbyl group.10.The oligonucleotide delivery agent according to any of claims 1-3 and 7, wherein the oligonucleotide is at least one single-stranded oligonucleotide selected from the group consisting of antisense oligonucleotide (ASO) , antisense RNA, short interfering RNA (siRNA) , microRNA (miRNA) , small activating RNA (saRNA) , small cytoplasmic RNA (scRNA) , small guide RNA (sgRNA) and phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO) .11.The oligonucleotide delivery agent according to claim 7, wherein the combination of the lipid moiety and the delivery enhancing compound moiety represented by Formula A’ has a structure obtainable by subtracting at least one hydrogen atom or terminal group from a structure represented by Formula I or Formula II, wherein the terminal group is selected from the group consisting of a hydroxyl group, a carboxy group, an ester group, an ether group, a phosphate group, a phosphonate group, a sulfate group, a sulfonate group, an amide group, an acyl group, and combinations thereof, and with the proviso that at least one of A1, A2, A3, R3, R4 and R5 is a C6-C22 linear alkyl group, and preferably a linear hexadecyl group, wherein each independently represents a covalent single or double bond; X, on each occurrence, is selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur; each of F, G, H and I is independently selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur;wherein m is an integer of 1, 2 or 3, n is an integer of 1, 2 or 3, and m+n=4;wherein C, on each occurrence, is either absent or selected from the group consisting of hydrogen, halogen atom, hydroxyl, (C1-C20) alkyl, (C1-C20) alkoxy, halogenated (C1-C20) alkyl and halogenated (C1-C20) alkoxy;wherein B, on each occurrence, is independently selected from the group consisting of hydroxyl, -C (O) OH, -P (O) 2-OH, -P (O) -OH, -P (O) (S) -OH, -CN, - (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkenyl, - (C1-C22) alkylene-OH, - (C3-C22) cycloalkylene-OH, - (C6-C22) arylene-OH, - (C6-C22) heteroarylene-OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C3-C22) cycloalkylene-C (O) OH, - (C6-C22) arylene-C (O) OH, - (C5-C22) heteroarylene-C (O) OH, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) NH2, - (C1-C22) alkylene-O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) NH2, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C22) alkylene-O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) NH2, - (C1-C22) alkylene-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) NH2, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C30) alkylene-P (O) 2-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C30) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene -P (O) -OH, - (C1-C22) alkylene-P (O) (S) -OH, - (C1-C22) alkylene-CN, wherein each of A1, A2 and A3 is either absent or a substituent independently selected from the group consisting of -H, -OH, -O-R1, -SH, - (C1-C22) alkyl, halogenated - (C1-C22) alkyl, - (C2-C22) alkenyl, - (C1-C22) alkylene-OH, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C3-C22) cycloalkenyl, - (C1-C22) alkylene- (C3-C22) cycloalkyl, - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkenylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-R1, - (C1-C22) alkenylene-O-R1, - (C1-C22) alkylene-COOR1, - (C1-C22) alkenylene-COOR1, -C (O) O-R1, -O- (C1-C22) alkyl, -S- (C1-C22) alkyl, -C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkyl, -O-C (O) - (C1-C22) alkyl, -O-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-O-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NR2-R1, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-OH, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, -adamantyl, - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -O-adamantly, -C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -halogenated (C1-C22) alkyl, -CH (NH-CO- (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, -CH (NH-CO-halogenated (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -halogenated (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene- (C1-C6 alkylene oxide) (1-20) -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -C (O) NH- (C1-C22) alkyl, -C (O) NH-R1, -C (O) NR2-R1, -C (O) NH- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) NH- (C1-C22) alkylene-COOH, -NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, -NH-C (O) -R1, -NR2-C (O) -R1, -O-P (O) 2-O-R1, -OP (O) (S) -O-R1, -O-P (O) -O-R1, -NH-R1, -NR2-R1, - (C1-C22) alkylene-NH-R1, - (C1-C22) alkylene-NR2-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) O-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C30) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene -P (O) -OH, - (C1-C22) alkylene-P (O) (S) -OH, - (C1-C22) alkylene-CN, substituted or unsubstituted pyrrole, substituted or unsubstituted pyrroline, substituted or unsubstituted pyrrolidine, substituted or unsubstituted pyrazole, substituted or unsubstituted pyrazoline, substituted or unsubstituted pyrazolidine, substituted or unsubstituted imidazole, substituted or unsubstituted oxazole, substituted or unsubstituted thiazole, substituted or unsubstituted benzopyrrole, substituted or unsubstituted benzopyrroline, substituted or unsubstituted benzopyrrolidine, substituted or unsubstituted benzopyrazole, substituted or unsubstituted benzopyrazoline, substituted or unsubstituted benzopyrazolidine, substituted or unsubstituted benzoimidazole, substituted or unsubstituted benzooxazole, substituted or unsubstituted benzothiazole, and a substituent represented by Formula III,wherein Y is selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur; and each of P, Q, S and T is independently selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur; and the asterisk refers to the site wherein the substituent represented by Formula III is linked with the structure represented by Formula I or Formula II;wherein each of R3, R4 and R5 is either absent or a substituent independently selected from the group consisting of -H, -OH, -O-R1, -SH, - (C1-C22) alkyl, halogenated - (C1-C22) alkyl, - (C2-C22) alkenyl, - (C1-C22) alkylene-OH, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C3-C22) cycloalkenyl, - (C1-C22) alkylene- (C3-C22) cycloalkyl, - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkenylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-R1, - (C1-C22) alkenylene-O-R1, - (C1-C22) alkylene-COOR1, - (C1-C22) alkenylene-COOR1, -C (O) O-R1, -O- (C1-C22) alkyl, -S- (C1-C22) alkyl, -C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkyl, -O-C (O) - (C1-C22) alkyl, -O-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-O-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NR2-R1, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-OH, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, -adamantyl, - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -O-adamantly, -C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -halogenated (C1-C22) alkyl, -CH (NH-CO- (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, -CH (NH-CO-halogenated (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -halogenated (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene- (C1-C6 alkylene oxide) (1-20) -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -C (O) NH- (C1-C22) alkyl, -C (O) NH-R1, -C (O) NR2-R1, -C (O) NH- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) NH- (C1-C22) alkylene-COOH, -NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, -NH-C (O) -R1, -NR2-C (O) -R1, -O-P (O) 2-O-R1, -OP (O) (S) -O-R1, -O-P (O) -O-R1, -NH-R1, -NR2-R1, - (C1-C22) alkylene-NH-R1, - (C1-C22) alkylene-NR2-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) O-R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -R1, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C30) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene -P (O) -OH, - (C1-C22) alkylene-P (O) (S) -OH, - (C1-C22) alkylene-CN, substituted or unsubstituted pyrrole, substituted or unsubstituted pyrroline, substituted or unsubstituted pyrrolidine, substituted or unsubstituted pyrazole, substituted or unsubstituted pyrazoline, substituted or unsubstituted pyrazolidine, substituted or unsubstituted imidazole, substituted or unsubstituted oxazole, substituted or unsubstituted thiazole, substituted or unsubstituted benzopyrrole, substituted or unsubstituted benzopyrroline, substituted or unsubstituted benzopyrrolidine, substituted or unsubstituted benzopyrazole, substituted or unsubstituted benzopyrazoline, substituted or unsubstituted benzopyrazolidine, substituted or unsubstituted benzoimidazole, substituted or unsubstituted benzooxazole, and substituted or unsubstituted benzothiazole,wherein R7, on each occurrence, is attached to any one of P, Q, S and T, and is either absent or selected from the group consisting of hydrogen, halogen atom, hydroxyl, (C1-C20) alkyl, (C1-C20) alkoxy, halogenated (C1-C20) alkyl and halogenated (C1-C20) alkoxy;wherein p is an integer of 0, 1, 2 or 3;wherein R6 is attached to any one of P, Q, S and T, and is selected from the group consisting of direct bond, -O-, -C (O) O-, -O-C (O) -, -P (O) 2-O-, -O-P (O) 2-O-, -P (O) (S) -O-, -O-P (O) (S) -O-, -O-P (O) -O-, - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-O-, -O- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-, -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -C (O) -O- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C30) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-C (O) -, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-, -C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-O-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH-, -C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) - (C1-C22) alkylene-C (O) -N ( (C1-C22) alkyl) -, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -NH-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-O-, -N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-, -N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-O-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, -N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-, -N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) - (C1-C22) alkylene-N ( (C1-C22) alkyl) -C (O) -, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C22) alkylene -P (O) 2-O-, - (C1-C22) alkylene-O-P (O) 2-O-, - (C3-C22) cycloalkylene-, - (C3-C22) cycloalkylene-O-, -O- (C3-C22) cycloalkylene-, - (C6-C22) arylene-, - (C6-C22) arylene-O-, -O- (C6-C22) arylene-, - (C6-C22) arylene-NH-, -NH- (C6-C22) arylene-, -C (O) - (C6-C22) arylene-, - (C6-C22) arylene-C (O) -, -C (O) -O- (C6-C22) arylene-, - (C6-C22) arylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C6-C22) arylene-and -C (O) -NH- (C6-C22) arylene-C (O) -O-;wherein R1, on each occurrence, is independently selected from the group consisting of hydrogen, hydroxyl, - (C1-C22) alkyl, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C6-C22) aryl, - (C1-C22) alkoxy, - (C3-C22) cycloalkoxy, - (C6-C22) aryloxy, -C (O) - (C1-C22) alkyl, -OC (O) (C1-C22) alkyl, -C (O) -O- (C1-C22) alkyl, -C (O) - (C3-C22) cycloalkyl, -OC (O) - (C3-C22) cycloalkyl, -C (O) -O- (C3-C22) cycloalkyl, -C (O) - (C6-C22) aryloxy, -OC (O) - (C6-C22) aryloxy, -C (O) -O- (C6-C22) aryloxy, -C (O) -phosphate ester group, phosphodiester group, phosphoramidite group, saturated fatty acid group, unsaturated fatty acid group, lipid, PEG, steroid, lipophile, carbohydrate, cholesterol, adamantane, amino acid, peptide, chloroquine and alkaloid,wherein R2, on each occurrence, is independently selected from the group consisting of a halogen atom, a (C1-C12) alkyl, a (C1-C12) alkoxy, a (C1-C12) alkoxycarbonyl, a (C6-C16) aryl or a (C6-C16) aryloxycarbonyl; andwherein one or more hydroxyl group, carboxyl group, amino group, nitrile group and phosphoric acid group contained in A1, A2, A3, B, C, R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 are optionally linked to a support material or protected with a terminal protective group.12.The oligonucleotide delivery agent according to claim 11, wherein one or more hydroxyl group, carboxyl group, amino group, nitrile group and phosphoric acid group contained in each of A1, A2, A3, B, C, R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 are optionally protected with a terminal protection group RP selected from the group consisting of (C1-C22) alkyl, (C1-C22) alkoxy, (C1-C22) alkylcarbonyl, (C1-C22) alkoxycarbonyl, (C6-C22) aryl, (C6-C22) aryloxy, (C6-C22) arylcarbonyl, (C6-C22) aryloxycarbonyl, tri ( (C1-C22) alkyl) silyl and tri ( (C1-C22) alkoxy) silyl; andwherein the support material is selected from the group consisting of silica, silica gel, glass, ceramic, polymer, cellulose, and combinations thereof.13.The oligonucleotide delivery agent according to claim 11, wherein the combination of the lipid moiety and the delivery enhancing compound moiety represented by Formula A’ has a structure obtainable by subtracting at least one hydrogen atom or terminal group from a structure represented by any of Formula IV to Formula XIII, 14.The oligonucleotide delivery agent according to claim 11, wherein each of F, G, H and I is carbon, m is 1 and n is 3, B is attached to G or H, each of P, Q, S and T is carbon, R6 is attached to any one of Q and S;wherein the protection group RP is selected from the group consisting of benzyloxycarbonyl (Cbz) , tert-butyldimethylsilyl (TBS) , 4, 4’-dimethoxytrityl (DMTr) , t-butyloxy carbonyl (Boc) , benzyl (Bn) and benzyloxy (BnO) ;wherein C, on each occurrence, is selected from the group consisting of hydrogen, halogen atom, hydroxyl, (C1-C12) alkyl, (C1-C12) alkoxy, halogenated (C1-C12) alkyl and halogenated (C1-C12) alkoxy;wherein B, on each occurrence, is - (C1-C22) alkylene-OH, -O-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) NH2, - (C1-C16) alkylene-O-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) NH2, -O-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) OH, - (C1-C16) alkylene-O-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) OH, -C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) NH2, - (C1-C16) alkylene-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) NH2, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-OH, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) OH, - (C1-C16) alkylene-C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) OH, - (C1-C16) alkylene-O-P (-N (C1-C16 alkyl) 2) -O- (C1-C16) alkylene-CN, - (C1-C16) alkylene-O-P (-N (C1-C16 alkyl) 2) -O- (C1-C16) alkylene-OH, - (C1-C16) alkylene-O-P (-N (C1-C16 alkyl) 2) -O- (C1-C16) alkylene-NH2, - (C1-C16) alkylene-O-P (-N (C1-C16 alkyl) 2) -O- (C1-C16) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-O-P (-N (C1-C16 alkyl) 2) -O- (C1-C16) alkylene-CN,wherein each of A1, A2 and A3 is either absent or a substituent independently selected from the group consisting of -H, -OH, linear or branched - (C6-C22) alkyl, linear or branched - (C2-C22) alkenyl, - (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkenylene-OH, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C3-C22) cycloalkenyl, - (C1-C22) alkylene- (C3-C22) cycloalkyl, - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkenylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-R1, - (C1-C22) alkenylene-O-R1, - (C1-C22) alkylene-COOR1, - (C1-C22) alkenylene-COOR1, -O- (C1-C22) alkyl, - (C6-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene- (C1-C6 alkylene oxide) (1-20) -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -C (O) NH-R1, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, substituted or unsubstituted pyrrole, substituted or unsubstituted pyrroline, substituted or unsubstituted pyrrolidine, substituted or unsubstituted pyrazole, substituted or unsubstituted pyrazoline, substituted or unsubstituted pyrazolidine, substituted or unsubstituted imidazole, substituted or unsubstituted oxazole, substituted or unsubstituted thiazole, substituted or unsubstituted benzopyrrole, substituted or unsubstituted benzopyrroline, substituted or unsubstituted benzopyrrolidine, substituted or unsubstituted benzopyrazole, substituted or unsubstituted benzopyrazoline, substituted or unsubstituted benzopyrazolidine, substituted or unsubstituted benzoimidazole, substituted or unsubstituted benzooxazole, substituted or unsubstituted benzothiazole, and a substituent represented by Formula III,wherein Y is selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur; and each of P, Q, S and T is carbon;wherein each of R3, R4 and R5 is either absent or a substituent independently selected from the group consisting of -H, -OH, linear or branched - (C6-C22) alkyl, linear or branched - (C2-C22) alkenyl, - (C1-C22) alkylene-OH, - (C3-C22) cycloalkyl, - (C3-C22) cycloalkenyl, - (C1-C22) alkylene- (C3-C22) cycloalkyl, - (C1-C22) alkylene-R1, - (C1-C22) alkylene-O-R1, - (C1-C22) alkylene-COOR1, -O- (C1-C22) alkyl, - (C6-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkyl, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene-NR2-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, - (C1-C22) alkylene- (C1-C6 alkylene oxide) (1-20) -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-adamantyl, -C (O) NH-R1, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-OH, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-NH2, - (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-C (O) OH, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-O-P (-N (C1-C22 alkyl) 2) -O- (C1-C22) alkylene-CN, substituted or unsubstituted pyrrole, substituted or unsubstituted pyrroline, substituted or unsubstituted pyrrolidine, substituted or unsubstituted pyrazole, substituted or unsubstituted pyrazoline, substituted or unsubstituted pyrazolidine, substituted or unsubstituted imidazole, substituted or unsubstituted oxazole, substituted or unsubstituted thiazole, substituted or unsubstituted benzopyrrole, substituted or unsubstituted benzopyrroline, substituted or unsubstituted benzopyrrolidine, substituted or unsubstituted benzopyrazole, substituted or unsubstituted benzopyrazoline, substituted or unsubstituted benzopyrazolidine, substituted or unsubstituted benzoimidazole, substituted or unsubstituted benzooxazole, and substituted or unsubstituted benzothiazole,wherein R7, on each occurrence, is attached to any one of P, Q, S and T, and is either absent or selected from the group consisting of hydrogen, halogen atom, hydroxyl, (C1-C20) alkyl, (C1-C20) alkoxy, halogenated (C1-C20) alkyl and halogenated (C1-C20) alkoxy;wherein p is an integer of 0, 1, 2 or 3;wherein R6 is attached to any one of P, Q, S and T, and is selected from the group consisting of - (C1-C16) alkylene-, - (C1-C16) alkylene-O-, -O- (C1-C16) alkylene-, - (C1-C16) alkylene-NH-, -NH- (C1-C16) alkylene-, -C (O) - (C1-C16) alkylene-, - (C1-C16) alkylene-C (O) -, -C (O) -O- (C1-C16) alkylene-, - (C1-C16) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-O-C (O) -, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-O-C (O) -O-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-O-, -C (O) -N ( (C1-C16) alkyl) - (C1-C16) alkylene-, -C (O) -N ( (C1-C16) alkyl) - (C1-C16) alkylene-O-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, -C (O) -N ( (C1-C16) alkyl) - (C1-C16) alkylene-C (O) -N ( (C1-C16) alkyl) - (C1-C16) alkylene-, -C (O) -N ( (C1-C16) alkyl) - (C1-C16) alkylene-C (O) -N ( (C1-C16) alkyl) -, - (C1-C16) alkylene-C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-, - (C1-C16) alkylene-C (O) -NH- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, -NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) -O-, -NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-O-, -N ( (C1-C16) alkyl) -C (O) - (C1-C16) alkylene-, -N ( (C1-C16) alkyl) -C (O) - (C1-C16) alkylene-O-, -NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, -N ( (C1-C16) alkyl) -C (O) - (C1-C16) alkylene-N ( (C1-C16) alkyl) -C (O) - (C1-C16) alkylene-, -N ( (C1-C16) alkyl) -C (O) - (C1-C16) alkylene-N ( (C1-C16) alkyl) -C (O) -, - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-, - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -; andwith the proviso that at least one of A1, A2, A3, R3, R4 and R5 is a C6-C22 linear alkyl group, and preferably a linear hexadecyl group.15.The oligonucleotide delivery agent according to claim 7, wherein the delivery enhancing compound moiety comprises a structure selected from the group consisting of - (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, - (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - (C3-C12) cycloalkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene- (C3-C12) cycloalkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene- (C3-C12) cycloalkylene- (C1-C16) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, - (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-O- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, - (C3-C12) cycloalkylene-C (O) -NH-, - (C1-C16) alkylene- (C3-C12) cycloalkylene-C (O) -NH-, - (C1-C16) alkylene- (C3-C12) cycloalkylene- (C1-C16) alkylene-C (O) -NH-, and / orwherein the delivery enhancing compound moiety is directly conjugated to the single-stranded oligonucleotide via a covalent bond or a linking moiety having the following structurewherein Y1 is oxygen or sulfur, the asterisk (*) refers to the site wherein the linking moiety is attached to the single-stranded oligonucleotide, and the double asterisk (**) refers to the site wherein the linking moiety is attached to the delivery enhancing compound moiety.16.The oligonucleotide delivery agent according to any of claims 1 to 6, wherein at least one hydrogen atom contained in the lipid moiety is substituted with deuterium atom.17.The oligonucleotide delivery agent according to any of claims 7 to 15, wherein at least one hydrogen atom contained in the lipid moiety, the delivery enhancing compound moiety and / or the single-stranded oligonucleotide is substituted with deuterium atom.18.The oligonucleotide delivery agent according to claim 7, wherein the combination  of the lipid moiety and the delivery enhancing compound moiety represented by Formula A’ has a structure obtainable by subtracting at least one hydrogen atom or terminal group from any of the compound C1 to compound C71 wherein represents a support material.19.The oligonucleotide delivery agent according to claim 7, wherein the oligonucleotide is attached to the delivery enhancing compound moiety via at least one linking moiety selected from the group consisting of direct bond, -O-, -S-, -C (O) -, -NH-, -N ( (C1-C12) alkyl) -, -N ( (C1-C12) alkyl) -C (O) -O-, -O-C (O) -, -C (O) -O-, -O-C (O) -O-, -C (O) -NH-, -OP (O) 2O-, -P (O) (O-) O-, -OP (O) O-, -OP (O) (S) O-, -OP (O) (S-) O-, -O-S (O) 2-O-, -S (O) 2-O-, -S (O) -O-, - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-, -NH- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C22) alkylene-C (O) -, - (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-, -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -NH- (C1-C22) alkylene-NH-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) O-, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -O- (C1-C22) alkylene-O-C (O) -, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C22) alkylene-OP (O) 2O-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) (O-) O-, - (C1-C22) alkylene- OP (O) (O-) O- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) O-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) (S) O-, - (C1-C22) alkylene-O-S (O) 2-O-, - (C1-C22) alkylene-S (O) 2-O-, - (C1-C22) alkylene-S (O) -O-, -O-P (O) 2-O- (C1-C22) alkylene-OP (O) 2O-, -O-P (O) -O- (C1-C22) alkylene-OP (O) O-, -OP (O) (S) O- (C1-C22) alkylene-OP (O) (S) O-, -O-S (O) 2-O- (C1-C22) alkylene-O-S (O) 2-O-, -S (O) 2-O- (C1-C22) alkylene-S (O) 2-O-and -O-S (O) - (C1-C22) alkylene-S (O) -O-.20.The oligonucleotide delivery agent according to claim 19, having a structure represented by any of the formulae AI to AVII: wherein L represents the linking moiety, represents the combination of the lipid moiety and the delivery enhancing compound moiety represented by Formula A’, represents a single-stranded oligonucleotide either in a 5’ to 3’ direction or in a 3’ to 5’ direction, and each of a, b and c is independently an integer from 1 to 50.21.The oligonucleotide delivery agent according to claim 19, having a structure represented by any of the formulae O1 to O20: wherein Y represents oxygen or sulfur.22.The oligonucleotide delivery agent according to any of claims 1 to 21, wherein the oligonucleotide targets a gene comprising at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SMN2, SCN9A, Scn9a and DMD.23.The oligonucleotide delivery agent according to any of claims 1 to 22, wherein the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 142-260 and SEQ ID NO: 443-492; and / orwherein the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 261-379, SEQ ID NO: 388, and SEQ ID NO: 390; and / orwherein the oligonucleotide is complementary to a consecutive target sequence comprising at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23-141 and SEQ ID NO: 393-442.24.The oligonucleotide delivery agent according to any of claims 1 to 23, wherein the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-21, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 391, and SEQ ID NO: 493-542.25.A pharmaceutical composition, comprising:a) the oligonucleotide delivery agent according to any of claims 1 to 24; andb) optionally, one or more ingredients selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable carrier, excipient, solvent, diluent, stabilizer, dispersant, buffer, compatibilizer, preservative agent and combinations thereof.26.A method of modulating the expression of a target gene in a subject, the method comprising the step of administrating the pharmaceutical composition according to claim 25 to a subject.27.The method according to claim 26, wherein the pharmaceutical composition is administrated to at least one of cardiac muscles, skeletal muscles, smooth muscles and liver of a subject.28.The method according to claim 26, wherein the pharmaceutical composition increases the expression of the target gene.29.The method according to claim 26, wherein the pharmaceutical composition decreases the expression of the target gene.30.The method according to any of claims 26 to 29, wherein the subject is a mammal.31.The method according to claims 30, wherein the mammal is a rodent.32.The method according to claim 31, wherein the rodent is a mouse or a rat.33.The method according to claim 32, wherein the mammal is a non-human primate.34.The method according to claim 30, wherein the mammal is a human.35.The method according to any of claims 26 to 29, wherein the target gene is associated with a disease or disorder.36.The method according to claim 35, wherein the target gene is associated with a disease or disorder in the central nervous system, eye, spleen, muscle, heart, kidney, or liver.37.The method according to any of claims 26 to 36, wherein the oligonucleotide targets a gene comprising at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SMN2, SCN9A, Scn9a and DMD.38.The method according to any of claims 26 to 37, wherein the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 142-260 and SEQ ID NO: 443-492; and / orwherein the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 261-379, SEQ ID NO: 388, and SEQ ID NO: 390; and / orwherein the oligonucleotide is complementary to a consecutive target sequence comprising at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23-141 and SEQ ID NO: 393-442.39.The method according to any of claims 26 to 38, wherein the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-21, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 391, and SEQ ID NO: 493-542.40.A method of modulating the expression of a target gene, the method comprising contacting a cell with the pharmaceutical composition of claim 22.41.The method according to claim 40, wherein the cell is derived from skeletal muscle, cardiac muscle, smooth muscle or liver.42.The method according to claim 40, wherein the pharmaceutical composition  increases the expression of the target gene.43.The method according to claim 40, wherein the pharmaceutical composition decreases the expression of the target gene.44.The method according to any of claims 41, wherein the cell is a mammalian cell.45.The method according to claim 44, wherein the mammalian cell is a mouse cell or a rat cell.46.The method according to claim 44, wherein the mammalian cell is a non-human primate cell.47.The method according to claim 44, wherein the mammalian cell is a human cell.48.The method according to any of claims 40 to 47, wherein the target gene is associated with a disease or disorder.49.The method according to claim 48, wherein the target gene is associated with a disease or disorder in the central nervous system, eye, spleen, muscle, heart, kidney, or liver.50.The method according to any of claims 40 to 49, wherein the oligonucleotide targets a gene comprising at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SMN2, SCN9A, Scn9a and DMD.51.The method according to any of claims 40 to 50, wherein the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 142-260 and SEQ ID NO: 443-492; and / orwherein the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 261-379, SEQ ID NO: 388, and SEQ ID NO: 390; and / orwherein the oligonucleotide is complementary to a consecutive target sequence comprising at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23-141 and SEQ ID NO: 393-442.52.The method according to any of claims 40 to 51, wherein the oligonucleotide comprises at least part of the oligonucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-21, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 391, and SEQ ID NO: 493-542.

Images