Oligonucleotide formulation

Abstract

Provided herein are oligonucleotide formulations. In particular, it relates to formulations of oligonucleotide comprising oligonucleotide (such as ASO, siRNA, saRNA) and calcium, methods the preparation of the formulation, and use thereof. The oligonucleotide formulations have reduced in vivo acute toxicity (especially in central nervous system) and expanded in vivo safety window for the oligonucleotides especially the lipid conjugate, and thus having great application prospect.

Description

OLIGONUCLEOTIDE FORMULATIONFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present disclosure relates generally to the field of biopharmaceutics and oligonucleotide therapeutics. In particular, the present disclosure relates to formulations of oligonucleotide substance with a calcium-containing solution with specific calcium concentrations, as well as specific oligonucleotide formulations with calcium and other components.

[0002] CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0003] This application claims priority to the filing date of Provisional Patent Application Serial No. PCT / CN2023 / 100743 filed June 16, 2023, the disclosure of which application is herein incorporated by reference.

[0004] SEQUENCE LISTING

[0005] The instant application contains a Sequence Listing which has been submitted electronically in computer readable format and is hereby incorporated by reference in its entirety.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0006] Oligonucleotide-based therapeutics has emerged as a promising class of therapeutics for neurological diseases. The administration of oligonucleotides to patients, organs, tissues or cells may elicit or impact various biochemical reactions and thus achieve functions such as silencing, inhibiting, activating, and / or modulating gene expression.

[0007] Single-stranded ASOs in the form of “gapmer” can be used to suppress gene expression by degrading target mRNA via an RNase H mechanism. Another category of ASOs is steric blockers (i.e., splicing modulators) , which are typically composed uniformly of ribonucleotides and bind to pre-mRNA in the nucleus to alter mRNA splicing by blocking the binding of certain splicing factors to the mRNA.

[0008] Duplex oligonucleotide or double-stranded RNAs (dsRNA) sinclude small interfering RNA (siRNA) and small activating RNA (saRNA) , and microRNA (miRNA) , all of which are loaded to argonaute (AGO) proteins in cytoplasm as the initial step before specifically acting on their targets. siRNA binds to target mRNA mainly in the cytoplasm to down-regulate gene expression post-transcriptionally via the RNA interference (RNAi) mechanism. saRNA targets gene regulatory sequences in the nucleus such as gene promoters to upregulate gene expression at the transcriptional level via the RNA activation (RNAa) mechanism. miRNAs are also duplex RNAs that typically bind to the 3’ untranslated region (3’ UTR) of mRNAs with imperfect complementarity following loading into AGO protein and partially inhibit expression via translational repression or / and mRNA degradation.

[0009] Oligonucleotides (e.g., ASO, siRNA or saRNA) with 2’ -substituted modification (such as 2′-fluoro-2′-deoxynucleoside, 2′-O-methyl, or 2′-O- (2-methoxyethyl) modification) , backbone modification (such as phosphorothioate (PS) ) and / or conjugated to such as an hydrophilic moiety (such as a fatty acid moiety, cholesterol or lipid) are believed to have improved nuclease stability and  reduced hydrophilicity. However, the chemically modified (such as fluorinated, PS modified) and / or conjugated (such as conjugated to hydrophilic moiety) oligonucleotide / oligonucleotide substance induce dose-limiting acute toxicity resulting in narrow therapeutic windows or even failed clinical trials.

[0010] Thus, there is a need for improved formulations for the oligonucleotide substances to address the challenges.SUMMARY OF THE INVENTION

[0011] To address the aforementioned problems and challenges, the present application provides novel oligonucleotide formulations, methods for the preparation thereof and use thereof.

[0012] Aspects of the present disclosure include an oligonucleotide formulation. The formulation comprises (a) a calcium-containing solution comprising calcium in a concentration of at least 15 mM; and (b) an oligonucleotide substance in said solution.

[0013] In some embodiments, when the oligonucleotide substance is a non-conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to less than 25 mM. For example, when the oligonucleotide substance is a non-conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is in a range from 15 mM to 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 or 16 mM, or any sub-range or value in the range.

[0014] In some embodiments, when the oligonucleotide substance is a conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to 150 mM. For example, the concentration of calcium in the formulations is in a range from 15 mM to 150 mM, such as from 20 mM to 150 mM, from 20 mM to 130 mM, from 20 mM to 120 mM, from 30 mM to 110 mM or from 35 mM to 100 mM, for example the calcium concentration in the formulation is about 20, 35, 47.5, 60, 82.5, 100, 120 mM calcium. In some embodiments, when the oligonucleotide substance is a conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to less than 25 mM, such as in a range from 15 mM to 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 or 16 mM, or any sub-range or value in the range.

[0015] In some embodiments, the oligonucleotide formulation has an osmotic pressure in a range from 250 mOsmol / kg to 350 mOsmol / kg.

[0016] In some embodiments, the oligonucleotide is a single-stranded oligonucleotide (such as an antisense RNA (ASO) selected from a gapmer, a steric blocker or a mixmer) or a double-stranded oligonucleotide (such as a duplex RNA selected from a siRNA, a saRNA, or a miRNA, a combination of siRNA and saRNA, or a conjugate of siRNAs and / or saRNAs) or a combination thereof (such as a combination of a single-stranded oligonucleotide and a double-stranded oligonucleotide, e.g., an oligonucleotide agent comprising a targeting duplex and an single-stranded non-targeting accessory oligonucleotide (ACO) conjugated to each other with or without a linker) . In some embodiments, the oligonucleotide substance is an oligonucleotide conjugate comprising a duplex RNA in conjugation to an ACO. In some embodiments, the oligonucleotide is conjugated to one or more conjugation moiety, such as a lipid (e.g., fatty acid) moiety. In some embodiments, the oligonucleotide is conjugated to a moiety derived from C5x5.

[0017] In some embodiments, one or more of the nucleotides in the oligonucleotide substance are modified. In some embodiments, one or more of the internucleoside linkages in the oligonucleotide or the ACO are selected from the group consisting of phosphodiesters, phosphotriesters, methylphosphonates, phosphoramidate, and phosphorothioates.

[0018] In some aspects of the present disclosure, a method for the preparation of the oligonucleotide formulation is provided. The method comprises combining the oligonucleotide substance with calcium-containing substance in a solution to form the oligonucleotide formulation.

[0019] In some embodiments, the calcium is contained in the oligonucleotide substance by exchanging sodium in a solution comprising the oligonucleotide substance with calcium. In some embodiments, the formulation is prepared by adding 35 mM of CaCl2 in artificial cerebrospinal fluid (aCSF) solution, and dissolving the oligonucleotide substance in the CaCl2 containing aCSF solution.

[0020] In some aspects of the present disclosure, a product comprising the oligonucleotide formulation is provided. The product can be selected from a medicament, a vaccine, a diagnostic product, and an imaging product.

[0021] In some aspects of the present disclosure, use of the oligonucleotide formulation in the manufacturing of a product for treatment, prevention, or detection of a disease or disorder in a subject is provided. In some embodiments, the product acts in the central nervous system (CNS) .

[0022] In some aspects of the present disclosure, a method for treatment, prevention or detection of a disease or disorder in a subject in need thereof comprising administering the oligonucleotide formulation to the subject is provided.

[0023] In some aspects of the present disclosure, an oligonucleotide formulation of the invention for use in treatment, prevention or detection of a disease or disorder in a subject in need thereof is provided.

[0024] In some embodiments, the oligonucleotide targets genes selected from the group consisting of SOD1, FUS, C9orf72, MAPT (Tau) , APP, SMN2, SCN9A, SCN10A, HTT, p21, UTRN, DUX4, SNCA, ATXN1, ATXN2, ATXN3, SCA1, SCA7, SCA8, UCP1, VEGFA, MeCP2, PRNP, DMPK, TARDBP, and TTR.

[0025] In some embodiments, the disease or disorder is a disease or disorder in central neuron system (CNS) . In some embodiments, the action of the oligonucleotide on CNS is selected from treatment, prevention and / or diagnosis of a disease or disorder in CNS, or imaging site (s) of a disease or disorder in CNS. In some embodiments, the disease or disorder in CNS is selected from cerebral disease, myelopathy, and peripheral neuropathy, such as spinal muscular atrophy (SMA) , Duchenne muscular dystrophy (DMD) , amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , Alzheimer disease (AD) and Parkinson disease (PD) , Huntington's disease (HD) , multiple sclerosis (MS) , brain tumors, frontotemporal dementia, spinocerebellar, prion, lafora, migraine, schizophrenia, depression, pain, and apoplexy.

[0026] The oligonucleotide formulation and product comprising the same can be used to reduce acute toxicity (such as the acute toxicity in CNS) and expand safety window for the oligonucleotide, and thus having great application prospect.

[0027] Additional aspects and advantages of the present application will become readily apparent to those skilled in this art from the following detailed description, wherein only illustrative embodiments of the present application are shown and described. As will be realized, the present application is capable of other and different embodiments, and its several details are capable of modifications in various obvious respects, all without departing from the disclosure. Accordingly, the drawings and description are to be regarded as illustrative in nature, and not as restrictive.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0028] The novel features of the invention are set forth with particularity in the appended claims. A better understanding of the features and advantages of the present invention will be obtained by reference to the following detailed description that sets forth illustrative embodiments, in which the principles of the invention are employed, and the accompanying drawings (also “figure” and “FIG. ” herein) , of which:

[0029] FIG. 1 shows purification of calcium exchange oligonucleotide substance (OS) of TA2 (described in Example 1) from free CaCl2 salt solution which was desalted using size exclusion column by UV and conductivity signal. Fraction 2 was collected and lyophilized to generate calcium OS of TA2.

[0030] FIG. 2 shows purification of calcium exchange OS of TA5 (described in Example 3) from free CaCl2 salt solution which was desalted using size exclusion column by UV and conductivity signal. Fraction 2 was collected and lyophilized to generate calcium OS of TA5.

[0031] FIG. 3 shows purification of calcium exchange OS of TA15 (described in Example 4) from free CaCl2 salt solution which was desalted using size exclusion column by UV and conductivity signal. Fraction 2 was collected and lyophilized to generate calcium OS of TA15.

[0032] FIG. 4 shows purification of calcium exchange OS of TA6 (described in Example 5) from free CaCl2 salt solution which was desalted using size exclusion column by UV and conductivity signal. Fraction 2 was collected and lyophilized to generate calcium OS of TA6.

[0033] FIG. 5 shows purification of calcium exchange OS of TA16 (described in Example 6) from free CaCl2 salt solution which was desalted using size exclusion column by UV and conductivity signal. Fraction 2 was collected and lyophilized to generate calcium OS of TA16.

[0034] In the figures, "------10 Cond" represents conductivity signal curve; "--10 Fractions" represents the fraction portions denoted as number 1, 2, 3… "--10 UV1 260 nm" refers to UV measurement wavelength for oligo detection is 260 nm.DETAILED DESCRIPTION

[0035] While various embodiments of the invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, changes, and substitutions may occur to those skilled in the art without departing from the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed.

[0036] Before the present invention is described, it is to be understood that this invention is not limited to particular embodiments described, as such may, of course, vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to be limiting, since the scope of the present invention will be limited only by the appended claims.

[0037] Where a range of values is provided, it is understood that each intervening value, to the tenth of the unit of the lower limit unless the context clearly dictates otherwise, between the upper and lower limits of that range is also specifically disclosed. Each smaller range between any stated value or intervening value in a stated range and any other stated or intervening value in that stated range is encompassed within the invention. The upper and lower limits of these smaller ranges may independently be included or excluded in the range, and each range where either, neither or both limits are included in the smaller ranges is also encompassed within the invention, subject to any specifically excluded limit in the stated range. Where the stated range includes one or both of the limits, ranges excluding either or both of those included limits are also included in the invention.

[0038] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the exemplary methods and materials are now described. All publications mentioned herein are incorporated herein by reference to disclose and describe the methods and / or materials in connection with which the publications are cited. It is understood that the present disclosure supersedes any disclosure of an incorporated publication to the extent there is a contradiction.

[0039] It must be noted that as used herein and in the appended claims, the singular forms "a" , "an" , and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to "a sample" includes a plurality of such samples and reference to "the molecule" includes reference to one or more molecules and equivalents thereof known to those skilled in the art, and so forth.

[0040] The publications discussed herein are provided solely for their disclosure prior to the filing date of the present application. Nothing herein is to be construed as an admission that the present invention is not entitled to antedate such publication by virtue of prior invention. Further, the dates of publication provided may be different from the actual publication dates, which may need to be independently confirmed.

[0041] As used herein, the term "calcium" refers to calcium existing in the formulation of the oligonucleotide in any form which is capable of reducing in vivo acute toxicity (such as in central nervous system) and expanding in vivo safety window for the oligonucleotide. In some embodiments, the calcium is in a form selected from molecular calcium, ionic calcium and complex calcium or any combinations thereof. The calcium (such as in CaCl2) can be incorporated to the oligonucleotide formulation by adding the same into a solution comprising the oligonucleotide (such as in an aCSF solution) or exchanging sodium in a solution comprising the oligonucleotide (such as the synthesized oligonucleotide substance) .

[0042] As used herein, the term "calcium-containing solution" in the nucleotide formulation refers to a solution comprising calcium in defined concentration and for carrying or carrying the nucleotide of the formulation. Calcium in the formulation may be provided by a calcium source, such as one or more selected from calcium chloride, calcium gluconate, calcium lactate, calcium bicarbonate, calcium dihydrogen phosphate, calcium hydrogen phosphate and any combinations thereof.

[0043] In some embodiments, the concentration of calcium in the formulation is varied. In some embodiments, when the oligonucleotide substance is a non-conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to less than 25 mM. For example, when the oligonucleotide substance is a non-conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is in a range from 15 mM to 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 or 16 mM, or any sub-range or value in the range.

[0044] In some embodiments, when the oligonucleotide substance is a conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to 150 mM. For example, the concentration of calcium in the formulations is in a range from 15 mM to 150 mM, such as from 20 mM to 150 mM, from 20 mM to 130 mM, from 20 mM to 120 mM, from 30 mM to 110 mM or from 35 mM to 100 mM, for example the calcium concentration in the formulation is about 20, 35, 47.5, 60, 82.5, 100, 120 mM calcium. In some embodiments, when the oligonucleotide substance is a conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to less than 25 mM, such as in a range from 15 mM to 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 or 16 mM, or any sub-range or value in the range. Based on the disclosure of the present application, a person skilled in the art could make adjustment to the concentration of calcium in the oligonucleotide formulation according to the need in practice.

[0045] As used herein, the term "oligonucleotide substance (OS) " refers to a substance consists of an oligonucleotide or comprises an oligonucleotide moiety (such as an oligonucleotide moiety conjugated to other non-targeting moieties) , preferably the oligonucleotide or oligonucleotide moiety is capable of targeting a specific gene and modulating the expression and / or function of the gene.

[0046] In some embodiments, the oligonucleotide substance in the oligonucleotide formulation is one or more selected from a single-stranded oligonucleotide or a double-stranded oligonucleotide or a combination thereof. The oligonucleotide substance can be in the forms of isolated oligonucleotide or conjugated oligonucleotide. The single-stranded oligonucleotide can be an antisense RNA (ASO) selected from a gapmer, a steric blocker or a mixmer. The double-stranded oligonucleotide can be a duplex RNA selected from a siRNA, or a saRNA, a combination of siRNA and saRNA, or a conjugate of siRNAs and / or saRNAs, or a miRNA. Combinations or conjugations of single-stranded oligonucleotides, double-stranded oligonucleotides or single-stranded and double stranded oligonucleotides may also be used in the formulation of the present application. For example, the present disclosure also comprises an oligonucleotide conjugate comprising a targeting duplex and an accessory oligonucleotide (ACO) conjugated to each other with or without a linker.

[0047] As used herein, the term "gapmer" refers to a short DNA antisense oligonucleotide (ASO) structure with modified RNA segments on both sides of the central DNA structure. In some embodiments, at least one of the modified RNA segments may comprise one or more of modified nucleotides selected from locked nucleic acids (LNA) , and 2'-OMe or 2'-F modified nucleotides to increase affinity to the target, increase nuclease resistance, reduce immunogenicity, and / or decrease  toxicity. In some embodiments, a gapmer comprises at least one nucleotide modified with a phosphorothioate (PS) group. In some embodiments, the gapmer is designed to hybridize to a target fragment of RNA and silence the gene transcript through the induction of RNase H cleavage.

[0048] As used herein, the term “LNA” refers to a locked nucleic acid in which the 2'-oxygen and 4'-carbon atoms are joined by an extra bridge. As used herein, the term “BNA” refers to a 2'-O and 4'-aminoethylene bridged nucleic acid that can contain a five-membered or six-membered bridged structure with an N-O linkage. As used herein, the term “PNA” refers to a nucleic acid mimic with a pseudopeptide backbone composed of N- (2-aminoethyl) glycine units with the nucleobases attached to the glycine nitrogen via carbonyl methylene linkers.

[0049] As used herein, the term "mixmer" refers to an antisense oligonucleotide (ASO) characterized as a mixture of DNA and chemically modified nucleic acid analogs in structure. Optionally, a mixmer is composed of fully modified nucleotides or nucleic acid analogs. In some embodiments, a mixmer is designed to bind and mask complementary RNA sequence to sterically block proteins, factors, or other RNAs from interacting with targeted RNA. In some embodiments, a mixmer is designed to alter pre-mRNA splicing by displacing the spliceosome. In some embodiments, a mixmer is designed to bind and sequester microRNAs (miRNAs) , in which it is adopted yet another name called an "antagomir" or an "anti-miR" .

[0050] As used herein, the term "splicing modulator" refers to an antisense oligonucleotide (ASO) typically composes uniformly of ribonucleotides and binds to pre-mRNA in the nucleus to alter mRNA splicing, such as by blocking the binding of certain splicing factors to the mRNA (asteric blocker) .

[0051] As used herein, the terms "sense strand" of dsRNA (e.g., siRNA, saRNA) duplex refers to the strand having sequence homology or sequence identity with a fragment of the coding strand of the sequence of a target gene.

[0052] As used herein, the terms "antisense strand" of dsRNA (e.g., siRNA, saRNA) duplex refers to the strand having sequence complementary with the sense strand.

[0053] As used herein, the term "overhang" as used herein refers to non-base-paired nucleotides at the terminus (5'or 3') of an oligonucleotide strand, which is formed by one strand extending out of the other strand in a double-stranded oligonucleotide. A single-stranded region extending out of the 3'terminus and / or 5'terminus of a duplex is referred to as an overhang.

[0054] As used herein, the term “natural overhang” as used herein refers to an overhang which consists of one or more nucleotides identical to or complementary to the corresponding position on the target sequence.

[0055] As used herein, the terms "gene activation" , "activating gene expression" , “gene upregulation” and “upregulating gene expression” can be used interchangeably, and means an increase or upregulation in transcription, translation, expression or activity of a certain nucleic acid sequence as determined by measuring the transcription level, mRNA level, protein level, enzymatic activity, methylation state, chromatin state or configuration, translation level or the activity or state in a cell or biological system of a gene. These activities or states can be determined directly or indirectly. In  addition, "gene activation" or "activating gene expression" refers to an increase in activity associated with a nucleic acid sequence, regardless of the mechanism of such activation. For example, gene activation occurs at the transcriptional level to increase transcription into RNA and the RNA is translated into a protein, thereby increasing the expression of the protein.

[0056] As used herein, the terms "gene silencing" , "knockdown of gene expression" , “gene downregulation” and “downregulating gene expression” can be used interchangeably, and means a decrease or downregulation in transcription, translation, expression or activity of a certain nucleic acid sequence as determined by measuring the transcription level, mRNA level, protein level, enzymatic activity, methylation state, chromatin state or configuration, translation level or the activity or state in a cell or biological system of a gene. These activities or states can be determined directly or indirectly. In addition, "gene downregulation" or "downregulating gene expression" refers to a decrease in activity associated with a nucleic acid sequence, regardless of the mechanism of such downregulation. For example, gene downregulation occurs at the transcriptional level to decrease or silence transcription into RNA and the RNA is not translated into a protein, thereby decreasing or silencing the expression of the protein.

[0057] As used herein, the terms "short interfering RNA" , "siRNA" and “silencing RNA” can be used interchangeably and refer to a ribonucleic acid molecule that can downregulate, knockdown, or silence target gene expression. It can be a double-stranded nucleic acid molecule. It interferes with the expression of specific genes with complementary nucleotide sequences by degrading mRNA after transcription, preventing translation. siRNA binds to target mRNA mainly in the cytoplasm to down-regulate gene expression post-transcriptionally via the RNA interference (RNAi) mechanism. siRNAs may be designed to target a gene’s mRNA sequence to silence its expression via the RNAi mechanism, such as SOD1, for maximizing treatment outcomes, e.g., for ALS patients. siRNAs are molecules having endogenous RNA bases or chemically modified nucleotides. The modifications do not abolish cellular activity, but rather impart increased stability and / or increased cellular potency. Examples of chemical modifications include phosphorothioate groups, 2'-deoxynucleotide, 2'-OCH3-containing ribonucleotides, 2'-F-ribonucleotides, 2'-methoxyethyl ribonucleotides, combinations thereof and the like. The siRNA can have varying lengths (e.g., 10-200 bps) and structures (e.g., hairpins, single / double strands, bulges, nicks / gaps, mismatches) and are processed in cells to provide active gene silencing. A double-stranded siRNA can have the same number of nucleotides on each strand (blunt ends) or asymmetric ends (overhangs) . An overhang of 1-2 nucleotides, for example, can be present on the sense and / or the antisense strand, as well as present on the 5'-and / or the 3'-ends of a given strand. The length of the siRNA molecule is typically about 10 to about 60, about 10 to about 50, about 15 to about 30, about 17 to about 29, about 18 to about 28, about 19 to about 27, about 20 to about 26, about 21 to about 25, and about 22 to about 24 base pairs, and typically about 15, about 16, about 17, about 18, about 19, about 20, about 21, about 23, about 25, about 30, about 40, or about 50 base pairs. In addition, the terms "small interfering RNA" , “silencing RNA” and "siRNA" also contain nucleic acids other than the ribonucleotide, including, but not limited to, modified nucleotides or analogues.

[0058] As used herein, the terms "small activating RNA" , "saRNA" and "small activating ribonucleic acid" can be used interchangeably and refer to a ribonucleic acid molecule that can upregulate target  gene expression. It can be a double-stranded nucleic acid molecule composed of a first nucleic acid strand containing a ribonucleotide sequence with sequence homology with the non-coding nucleic acid sequence (such as a promoter and an enhancer) of a target gene and a second nucleic acid strand containing a nucleotide sequence complementary with the first strand. The saRNA can also be comprised of a synthesized or vector-expressed single-stranded RNA molecule that prone to form a hairpin structure by two complementary regions within the molecule, wherein the first region contains a ribonucleotide sequence having sequence homology with the target sequence of a promoter of a gene, and a ribonucleotide sequence contained in the second region is complementary with the first region. The length of the duplex region of the saRNA molecule is typically about 10 to about 60, about 10 to about 50, about 10 to about 40, about 12 to about 30, about 14 to about 28, about 16 to about 26, about 18 to about 24, and about 20 to about 22 base pairs, and typically about 10, about 13, about 15, about 17, about 18, about 19, about 20, about 21, about 22, about 25, about 30, about 40, about 50, or about 60 base pairs. In addition, the terms "small activating RNA" , "saRNA" and "small activating ribonucleic acid" also contain nucleic acids other than the ribonucleotide, including, but not limited to, modified nucleotides or analogues.

[0059] As used herein, the term “complementary” refers to the capability of forming base pairs between two oligonucleotide strands. The base pairs are generally formed through hydrogen bonds between nucleotides in the antiparallel oligonucleotide strands. The bases of the complementary oligonucleotide strands can be paired in the Watson-Crick manner (such as A to T, A to U, and C to G) or in any other manner allowing the formation of a duplex (such as Hoogsteen or reverse Hoogsteen base pairing) .

[0060] The term "conjugated oligonucleotide" or “oligonucleotide conjugate” can be used interchangeably and refers to a chimeric oligonucleotide molecule comprising a targeting oligonucleotide and a non-targeting moiety which, for example, capable of facilitating delivery of the targeting oligonucleotide. The targeting oligonucleotide includes, but is not limited to, double-stranded nucleic acid molecules of DNA, RNA, or DNA / RNA hybrid, oligonucleotide strands containing regularly and irregularly alternating deoxyribosyl portions and / or ribosyl portions, as well as modified and naturally or unnaturally existing frameworks for such oligonucleotides. The targeting oligonucleotide as disclosed herein may be a small inhibiting nucleic acid molecule (siRNA) , a small activating nucleic acid molecule (saRNA) or an antisense oligonucleotide molecule (ASO) . Specifically, the oligonucleotide conjugate for inhibiting mRNA transcript level of a target gene described herein is a non-targeting moiety conjugated siRNA molecule, and the oligonucleotide agent for activating transcription of a target gene described herein is a non-targeting moiety conjugated saRNA molecule.

[0061] As used herein, the term "non-targeting" means that the referenced accessory oligonucleotide (ACO) which conjugates with the targeting oligonucleotide (e.g., siRNA, saRNA, and etc. ) does not specifically complement to the target sequence which the targeting oligonucleotide functions, and / or that the referenced oligonucleotide (i.e., ACO) does not share the same target sequence which the targeting oligonucleotide (e.g., siRNA, saRNA, and etc. ) specifically attends to function to. The targeting oligonucleotide disclosed herein is a nucleic acid sequence that specifically complements to the target sequence or the region thereof. In some embodiments, the term "non-targeting  oligonucleotide" may comprise any referenced oligonucleotide except the “targeting sequence” . In some cases, the “specifically complementary” may mean that the complementarity between the targeting oligonucleotide and the target sequence or the region thereof is at least about 95%. The non-targeting oligonucleotide (i.e., accessory oligonucleotide, or “ACO” used interchangeably) is not to elicit biological activity via any known mechanism, nor intended to elicit activities indicative of ASO (i.e., “mixmer” or “gapmer” ) function onto a complementary nucleic acid sequence (i.e., mRNA) in a certain subject, an organ of the subject, a tissue of the subject, or a cell of the subject, when the oligonucleotide is administered. The non-targeting oligonucleotide (i.e., ACO) is to facilitate the introduction of the targeting oligonucleotide (e.g., siRNA, saRNA, and etc. ) it conjugates into a certain subject, an organ of the subject, a tissue of the subject, a cell of the subject, or a cell nucleus of the subject, when the oligonucleotide conjugate is administered.

[0062] The oligonucleotide may further comprise one or more conjugation moieties, such as to facilitate the entry of the oligonucleotide into cell. In certain embodiments, conjugation moieties modify one or more properties of the attached oligonucleotide, including but not limited to pharmacodynamics, pharmacokinetics, stability, binding, absorption, tissue distribution, cellular distribution, cellular uptake, charge and clearance. In certain embodiments, conjugation moieties impart a new property on the attached oligonucleotide, e.g., fluorophores or reporter groups that enable detection of the oligonucleotide.

[0063] In some embodiments, the oligonucleotide is conjugated to one or more conjugation moieties selected from: intercalators, reporter molecules, polyamines, polyamides, peptides, carbohydrates, vitamin moieties, polyethylene glycols, thioethers, polyethers, cholesterols, thiocholesterols, cholic acid moieties, folate, lipids, phospholipids, biotin, phenazine, phenanthridine, anthraquinone, adamantane, acridine, fluoresceins, rhodamines, coumarins, fluorophores, and dyes.

[0064] In some embodiments, a conjugation moiety comprises an active drug substance, for example, aspirin, warfarin, phenylbutazone, ibuprofen, suprofen, fen-bufen, ketoprofen, (S) - (+) -pranoprofen, carprofen, dansylsarcosine, 2, 3, 5-triiodobenzoic acid, fingolimod, flufenamic acid, folinic acid, a benzothiadiazide, chlorothiazide, a diazepine, indo-methicin, a barbiturate, a cephalosporin, a sulfa drug, an antidiabetic, an antibacterial or an antibiotic. In some embodiments, the oligonucleotide is conjugated to one or more conjugation moieties selected from: a lipid, a fatty acid, a fluorophore, a ligand, a saccharide, a peptide, and an antibody. For example, a lipid or fatty acid conjugation moiety may comprise a saturated or unsaturated carbon chain having from 4 to 30 carbon atoms, for example, a saturated or unsaturated C4, C6, C8, C10, C12, C14, C16, C18, C20, C22, or C24 carbon chain.

[0065] In certain embodiments, one or more conjugation moieties are derived from C5x5 as shown in the present application:

[0066] According to some embodiment, the oligonucleotide may further comprise one or more linking moieties or linkers. As used herein, the term "linking moiety" or "linker" refers to a molecule for covalently joining two molecules, e.g., a non-targeting moiety and a dsRNA (e.g., siRNA or saRNA) ,  two dsRNAs, etc. As described in more detail below, the term can include, e.g., a nucleic acid linker, a peptide linker, and the like and also, includes disulfide linkers. When present, the linking moieties or linker can be selected from the group consisting of -O-, -S-, -C (O) -, -NH-, -N ( (C1-C12) alkyl) -, -N ( (C1-C12) alkyl) -C (O) -O-, -O-C (O) -, -C (O) -O-, -O-C (O) -O-, -C (O) -NH-, -OP (O) 2O-, -P (O) (O-) O-, -OP (O) O-, -P (O) -O-, -OP (O) (S) O-, -O-S (O) 2-O-, -S (O) 2-O-, -S (O) -O-, - (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-, -NH- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C22) alkylene-C (O) -, - (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-, -NH- (C1-C22) alkylene-C (O) -, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -NH- (C1-C22) alkylene-NH-, -C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) O-, -O-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -O-, -C (O) -O- (C1-C22) alkylene-O-C (O) -, -C (O) - (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -, -NH-C (O) - (C1-C22) alkylene-C (O) -NH-, -C (O) -NH- (C1-C22) alkylene-NH-C (O) -, - (C1-C22) alkylene-OP (O) 2O-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) (O-) O-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) (O-) O- (C1-C22) alkylene-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) O-, - (C1-C22) alkylene-OP (O) (S) O-, - (C1-C22) alkylene-O-S (O) 2-O-, - (C1-C22) alkylene-S (O) 2-O-, - (C1-C22) alkylene-S (O) -O-, -O-P (O) 2-O- (C1-C22) alkylene-OP (O) 2O-, -O-P (O) -O- (C1-C22) alkylene-OP (O) O-, -OP (O) (S) O- (C1-C22) alkylene-OP (O) (S) O-, -O-S (O) 2-O- (C1-C22) alkylene-O-S (O) 2-O-, -S (O) 2-O- (C1-C22) alkylene-S (O) 2-O-and -O-S (O) - (C1-C22) alkylene-S (O) -O-; wherein the - (C1-C22) alkylene-contained in the linking moiety can be an alkylene group comprising from 1 to 22 carbon atoms, such as from 2 to 20 carbon atoms, or from 3 to 18 carbon atoms, or from 4 to 16 carbon atoms, or from 5 to 12 carbon atoms, or from 6 to 10 carbon atoms. In one embodiment, the conjugation moiety is directly linked with the oligonucleotide when the linking moiety is a direct bond. For example, a conjugation moiety derived from C5x5 may conjugate to 5'-end of a nucleotide strand via -OP (O) 2O-or -P (O) -O-.

[0067] All nucleotides of the oligonucleotides described herein may be natural, i.e., non-chemically modified nucleotides or at least one nucleotide may be chemically modified. Non-limiting examples of the chemical modification can include one or a combination of the following: modifications to phosphodiester linkages of nucleotides in the nucleotide sequence of a functional oligonucleotide; modification of the 2 '-OH of ribose in the nucleotide sequence of a functional oligonucleotide; and modifications to bases in the nucleotide sequence of a functional oligonucleotide. These modifications may increase the bioavailability of the oligonucleotides, increase affinity for the target sequence, and enhance resistance to nuclease hydrolysis in a cell.

[0068] Chemical modifications of nucleotides or oligonucleotides in the present disclosure are well known to those skilled in the art, and modifications of the phosphodiester bond may refer to modifications of oxygen in the phosphodiester bond, including phosphorothioate modifications and boronated phosphate modifications. Both modifications stabilize the oligonucleotide structure, maintaining high specificity and high affinity for base pairing. The ribose modification refers to a modification of the 2'-OH in a nucleotide pentose, i.e., introduction of certain substituents at the hydroxyl position of the ribose, e.g., 2'-fluoro modification, 2'-oxomethyl modification, 2'-oxyethylenemethoxy modification, 2, 4 '-dinitrophenol modification, locked nucleic acid (LNA) , 2'-amino modification, 2'-deoxy modification. By base modification, it is meant a modification of the base of the nucleotide, e.g., 5'-bromouracil modification, 5'-iodouracil modification, N-methyluracil modification, 2, 6-diaminopurine modification.

[0069] As used herein, the term "synthetic" refers to the manner in which oligonucleotides are synthesized, including any means capable of synthesizing or chemically modifying RNA, such as chemical synthesis, in vitro transcription, vector expression, and the like.

[0070] As used herein, the terms “subject” and “individual” are used interchangeably herein to mean any living organism that may be treated with agents of the present application. The term “patient” means a human subject or individual, including infants, children and adults.

[0071] The terms “Amyotrophic lateral sclerosis” or “ALS” include, but are not limited to, familial ALS (fALS) , sporadic ALS (sALS) , Lou Gehrig's disease, diseases associated with mutant genes Chromosome 9 Open Reading Frame 72 gene (C9orf72; 40%) , superoxide dismutase 1 (SOD1; 20%) , transactive response DNA-binding protein 43 (TDP43; 4%) and fused in sarcoma / translocated in liposarcoma (FUS / TLS; 4%) .

[0072] In certain embodiments of the present application, the target gene is SOD1. By "target sequence" is meant a sequence fragment to which the sense strand or antisense oligonucleotide of the siRNA or saRNA is homologous or complementary. For example, in certain embodiments, a SOD1 siRNA is homologous or complementary to a target select sequence within human SOD1 transcript. In certain embodiments, the sequence of the sense strand of the SOD1 siRNA is as set forth in SEQ ID NO: 1, and the sequence of the antisense strand of the SOD1 siRNA is as set forth in SEQ ID NO: 2.

[0073] In certain embodiments of the present application, the target gene is FUS. For example, in certain embodiments, a FUS siRNA is homologous or complementary to a target select sequence within human FUS transcript. In certain embodiments, the strands of the FUS siRNA are fully chemically modified. In certain embodiments, the sense strand of the FUS siRNA comprises a single-stranded accessory oligonucleotide ACO or a lipid conjugation of C5x5. In certain embodiments, the sequence of the sense strand of the FUS siRNA is as set forth in SEQ ID NO: 3, 5, 6, 8, 10, 11, 13 or 15, and the sequence of the antisense strand of the FUS siRNA is as set forth in SEQ ID NO: 4, 7, 9, 12 or 14. In some embodiments, the sequences of the sense strand and the antisense strand in a FUS siRNA is selected from (a) SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; (b) SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 4; (c) SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7; (d) SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9; (e) SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 9; (f) SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12; (g) SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; and (h) SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 14.

[0074] An effective amount refers to an amount sufficient to produce the desired effect. For example, a “therapeutically effective amount” or "an effective amount for treatment" of an agent or a composition is an amount sufficient to achieve a desired therapeutic effect, and therefore does not require cure or complete remission. In embodiments of the present application, therapeutic efficacy is an improvement in any of the disease indicators, and a therapeutically effective amount is sufficient to cause an improvement in a clinically significant condition / symptom in the treated individual.

[0075] The effective amount may vary depending on such factors as the size and weight of the subject, the type of illness, or the particular agents of the application. For example, the choice of the agent of the application could affect what constitutes an “effective amount. ” One ordinary skill in the art  would be able to study the factors contained herein and make the determination regarding the effective amount of the agents of the application without undue experimentation.

[0076] The regime of administration may affect what constitutes an effective amount. The agent of the application can be administered to the subject either prior to or after the disease diagnosis or condition. Further, several divided dosages, as well as staggered dosages, can be administered daily or sequentially, or the dose can be continuously infused, or can be a bolus injection. Further, the dosages of the agent (s) of the application could be proportionally increased or decreased as indicated by the exigencies of the therapeutic or prophylactic situation.

[0077] The terms “treat” , “treated” , “treating” , or “treatment” as used herein have the meanings commonly understood in the medical arts, and therefore do not require cure or complete remission, and include any beneficial or desired clinical results. Non-limiting examples of such beneficial or desired clinical results are prolonging survival as compared to expected survival without treatment, reduced symptoms including one or more of the followings: weakness and atrophy of proximal skeletal muscles, inability to sit or walk independently, difficulties in swallowing and / or breathing, etc. As used herein, “preventing” or “delaying” a disease refers to inhibiting the full development of a disease.

[0078] Particular embodiments

[0079] Unless otherwise defined, all the technological and scientific terms used therein have the same meanings as those generally understood by those of ordinary skill in the art covering the present application.

[0080] The present application is based on the surprising discovery that the existence of calcium in a formulation comprising oligonucleotide can attenuate acute toxicity in vivo induced by the oligonucleotide substance and thus broadening the safety window of the oligonucleotide formulation.

[0081] In the present application, we further screened calcium concentration range in the oligonucleotide formulation and found for non-conjugated oligonucleotide, a calcium concentration of from 15 mM to less than 25 mM, and for conjugated oligonucleotides, a calcium concentration from 10 mM to 210 mM (preferably 35 mM to 100 mM) in the oligonucleotide formulation, is effective in attenuating acute toxicity in vivo, especially in CNS. In addition, calcium can be incorporated into the oligonucleotide easily via conventional technical means, such as by adding CaCl2 in aCSF solution and directly dissolved oligonucleotide samples in this solution; or by exchanging sodium in the original oligonucleotide solution with calcium. In addition, it is also preferred that the oligonucleotide formulation has an osmotic pressure ranging from 250 to 350 mOsmol / kg, more preferably with an isotonic osmotic pressure ranging from 280 to 320 mOsmol / kg.

[0082] The oligonucleotide formulation is suitable for carrying various oligonucleotide substances, such as for ASO, duplex RNA (e.g., siRNA, saRNA targeting various genes or the combinations thereof) , and relevant conjugate such as lipid conjugate or ACO conjugate. Preferably, the oligonucleotides target genes (such as SOD1, SMN2, UTRN, FUS) associated with a disease or disorder in CNS, such as spinal muscular atrophy (SMA) , amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , Duchenne muscular dystrophy (DMD) .

[0083] The present application provides the following particular embodiments:

[0084] 1. An oligonucleotide formulation comprising:

[0085] (a) a calcium-containing solution with a calcium concentration of at least 15 mM in the formulation; and

[0086] (b) an oligonucleotide substance in said solution.

[0087] 2. The oligonucleotide formulation according to embodiment 1, wherein when the oligonucleotide substance is a non-conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to less than 25 mM; or

[0088] wherein when the oligonucleotide substance is a conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to 150 mM; and / or

[0089] wherein the oligonucleotide formulation has an osmotic pressure in a range from 250 mOsmol / kg to 350 mOsmol / kg.

[0090] 3. The oligonucleotide formulation according to embodiment 1, wherein the oligonucleotide substance comprises a single-stranded oligonucleotide or a double-stranded oligonucleotide or a combination thereof.

[0091] 4. The oligonucleotide formulation according to embodiment 1, wherein the single-stranded oligonucleotide is one or more antisense oligonucleotide (ASO) selected from a gapmer, a mixmer, a steric blocker, or a splicing modulator; and / or

[0092] the double-stranded oligonucleotide is one or more duplex RNA selected from a siRNA or a saRNA, or a combination of siRNA and / or saRNA, or a conjugate of siRNA and / or saRNA, or a miRNA.

[0093] 5. The oligonucleotide formulation according to any of embodiments 2-4, wherein the conjugated oligonucleotide is conjugated to one or more conjugation moieties; and / or

[0094] wherein the one or more conjugation moieties are selected from: a lipid, a luminophor, a ligand, a saccharide, a peptide, and an antibody; and / or

[0095] wherein the conjugation moiety is an accessory oligonucleotide (ACO) conjugated to the oligonucleotide; and / or

[0096] wherein the one or more conjugation moieties are conjugated to the oligonucleotide at one or more ends of the oligonucleotide strand or at an internal position of the oligonucleotide.

[0097] 6. The oligonucleotide formulation according to embodiment 5, wherein the one or more conjugation moieties is selected from: a fatty acid, a cell-penetrating peptide, a fluorophore, polyethylene glycol, an alkaloid, a tryptamine, a benzimidazole, a quinolone, an amino acid, a cholesterol, glucose and N-acetylgalactosamine; and / or

[0098] wherein the oligonucleotide substance is an oligonucleotide conjugated to an ACO or an oligonucleotide conjugated to a lipid moiety.

[0099] 7. The oligonucleotide formulation according to embodiment 5, wherein the lipid moiety is a C4-C30 fatty acid moiety.

[0100] 8. The oligonucleotide formulation according to embodiment 5, wherein the lipid moiety comprises a saturated or unsaturated C6, C8, C10, C12, C14, C16, C18, C20, C22, or C24 carbon chain.

[0101] 9. The oligonucleotide formulation according to embodiment 5, wherein the conjugation moiety is derived from C5x5:

[0102] 10. The oligonucleotide formulation according to embodiment 9, wherein C5x5 is conjugated to the 5'end of a sense strand or an antisense strand in the oligonucleotide via -OP (O) 2O-, -OP (O) (S)O-and / or-P (O) -O-.

[0103] 11. The oligonucleotide formulation according to embodiment 5, wherein the accessory oligonucleotide (ACO) is a single stranded oligonucleotide having at least 6 nucleotides in length; and / or

[0104] wherein the accessory oligonucleotide (ACO) is a non-targeting oligonucleotide; and / or

[0105] wherein the accessory oligonucleotide (ACO) comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, or at least 18 phosphorothioate modification on the backbone, or all the nucleotides in the backbone are phosphorothioate modified.

[0106] 12. The oligonucleotide formulation according to embodiment 1, wherein the calcium is in a form selected from molecular calcium, ionic calcium, complex calcium, or any combinations thereof.

[0107] 13. The oligonucleotide formulation according to embodiment 1, wherein the calcium is provided by calcium chloride, calcium gluconate, calcium lactate, calcium bicarbonate, calcium dihydrogen phosphate, calcium hydrogen phosphate and any combinations thereof.

[0108] 14. The oligonucleotide formulation according to embodiment 2, wherein when the oligonucleotide substance is a non-conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is in a range from 15 mM to 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 or 16 mM, or any sub-range or value in the range; and / or

[0109] wherein when the oligonucleotide substance is a non-conjugated oligonucleotide, the osmotic pressure of the formulation is in a range from 280 mOsmol / kg to 320 mOsmol / kg.

[0110] 15. The oligonucleotide formulation according to embodiment 2, wherein when the oligonucleotide substance is a conjugated oligonucleotide,

[0111] the calcium concentration in the formulation is in a range from 15 mM to 140 mM, 20 mM to 130 mM, from 20 mM to 120 mM, from 30 mM to 110 mM or from 35 mM to 100 mM; and / or, the calcium concentration in the formulation is about 20, 35, 47.5, 60, 82.5, 100 mM, 120 mM; and / or

[0112] wherein the calcium concentration in the formulation is about 35, 47.4, 60, 100 mM; and / or

[0113] wherein the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to less than 25 mM; and / or

[0114] wherein the calcium concentration in the formulation is in a range from 15 mM to 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 or 16 mM, or any sub-range or value in the range; and / or

[0115] wherein when the oligonucleotide substance is a conjugated oligonucleotide, the osmotic pressure of the formulation is in a range from 280 mOsmol / kg to 320 mOsmol / kg.

[0116] 16. The oligonucleotide formulation according to any of embodiments 1-15, wherein at least one nucleotide of the oligonucleotide substance is chemically modified nucleotide.

[0117] 17. The oligonucleotide formulation according to embodiment 16, wherein the chemically modified nucleotide locates in an antisense strand of the ASO, or in a sense strand, an antisense strand, or both strands of the duplex RNA, or in an ACO; and / or

[0118] wherein the chemically modified nucleotide is a nucleotide modified at the 5'end, 3'end, both ends, or in internal part of the strand (s) ; and / or

[0119] wherein at least 50%nucleotides in the oligonucleotide substance are chemically modified.

[0120] 18. The oligonucleotide formulation according to embodiment 16, wherein the chemically modified nucleotide is one or more selected from a 2’s ugar modification; base modification; a phosphorothioate (PS) backbone modification; an addition of a 5'-phosophate moiety or a 5-methyl cytosine moiety at the 5’ end of the nucleotide strand.

[0121] 19. The oligonucleotide formulation according to embodiment 18, wherein the 2’s ugar modification is one or more selected from: 2′-fluoro-2′-deoxynucleoside (2′-F) modification, 2′-O-methyl (2′-O-Me) modification, and 2′-O- (2-methoxyethyl) (2′-O-MOE) modification; and / or

[0122] wherein the addition of a 5'-phosophate moiety is one or more selected from an additional of (E)-vinylphosphonate moiety at the 5’ end of the nucleotide strand.

[0123] 20. The oligonucleotide formulation according to any of embodiments 1-19, wherein the formulation further comprises one or more other excipients selected from preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, isotonic agents and antioxidant.

[0124] 21. The oligonucleotide formulation according to embodiment 1, wherein the formulation comprises one or more selected from salt, polyol, saccharide and / or alcohol; and / or

[0125] wherein the carrier in the formulation is artificial cerebrospinal fluid (aCSF) or water; and / or

[0126] wherein the calcium-containing solution is an aCSF or aqueous solution; and / or

[0127] wherein the formulation comprises one or more ingredients selected from NaCl, KCl, MgSO4, KH2PO4, NaHCO3, glucose and sucrose.

[0128] 22. The oligonucleotide formulation according to embodiment 1, wherein the formulation comprises 50-150 mM NaCl, 0.5-5.0 mM KCl, 0.5-5.0 mM MgSO4, 0.4-3.0 mM KH2PO4, 10-50 mM NaHCO3, 1-20 mM glucose, and 1-10 mM sucrose.

[0129] 23. The oligonucleotide formulation according to embodiment 1, wherein the formulation comprises 124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.0 mM MgSO4, 1.25 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose, and 4 mM sucrose.

[0130] 24. The oligonucleotide formulation according to embodiment 1, wherein the formulation  comprises ingredients selected from the solution groups of A1, B1, A2, B2, A3, B3, A4, B4, A5 and B5, as listed in Table 17, Table 18, Table 19, Table 20 and Table 21.

[0131] 25. The oligonucleotide formulation according to embodiment 1, wherein the oligonucleotide in the oligonucleotide formulation targets SOD1 gene; and / or

[0132] wherein the oligonucleotide in the oligonucleotide formulation targets FUS gene; and / or

[0133] wherein the oligonucleotide in the oligonucleotide formulation targets genes selected from the group consisting of C9orf72, MAPT (Tau) , APP, SMN2, SCN9A, SCN10A, HTT, p21, UTRN, DUX4, SNCA, ATXN1, ATXN2, ATXN3, SCA1, SCA7, SCA8, UCP1, VEGFA, MeCP2, PRNP, DMPK, TARDBP, and TTR.

[0134] 26. The oligonucleotide formulation according to embodiment 1, wherein the oligonucleotide in the oligonucleotide formulation comprises one or more oligonucleotide strands or strand pairs in the oligonucleotide substances of Table 1 and / or Table 12; and / or

[0135] wherein the oligonucleotide in the oligonucleotide formulation comprises one or more oligonucleotide strands or strand pairs having the sequences as shown in one or more of SEQ ID NOs: 1-15.

[0136] 27. The oligonucleotide formulation according to embodiment 25, wherein the oligonucleotide formulation has a calcium concentration ranged from 20 mM to 100 mM; and / or

[0137] wherein the oligonucleotide formulation has an osmotic pressure in a range from 280 mOsmol / kg to 320 mOsmol / kg; and / or

[0138] wherein the oligonucleotide formulation is an isosmotic solution.

[0139] 28. The oligonucleotide formulation according to any of embodiment 1-27, wherein the formulation is in a form suitable for administration route selected from subcutaneous injection, intravenous injection, intraocular injection, intradermal injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intratracheal administration, intraadiposal administration, intraarticular administration, intrathecal administration, epidural administration, inhalation, intranasal administration, oral administration, sublingual administration, buccal administration, rectal administration, vaginal administration, intracisternal administration, transdermal administration and topical administration, or administration via local delivery.

[0140] 29. A method of preparing the oligonucleotide formulation of any of embodiments 1-28 comprising:

[0141] combining the oligonucleotide substance with a calcium-containing substance in a solution to form the oligonucleotide formulation.

[0142] 30. The method of embodiment 29, wherein calcium is provided by calcium salt, such as calcium chloride (CaCl2) , calcium gluconate, calcium lactate, calcium bicarbonate, calcium dihydrogen phosphate, calcium hydrogen phosphate.

[0143] 31. The method of embodiment 29, wherein calcium is contained in aCSF for dissolving the oligonucleotide substance; and / or

[0144] calcium is incorporated to the solution by exchanging sodium in a solution comprising the  oligonucleotide substance with calcium; and / or

[0145] wherein when the oligonucleotide substance is a non-conjugated oligonucleotide, and the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to less than 25 mM; or

[0146] wherein when oligonucleotide substance is a conjugated oligonucleotide, the concentration of calcium in the oligonucleotide formulation ranges from 15 mM to 150 mM.

[0147] 32. The method of embodiment 29, wherein the formulation is prepared by adding CaCl2 in aCSF solution, and dissolving oligonucleotide substance in the CaCl2 containing aCSF solution.

[0148] 33. A product comprising the oligonucleotide formulation of any of embodiments 1-28.

[0149] 34. The product of embodiment 33, wherein the product is a medicament, a vaccine, a diagnostic product, an imaging product, or a kit.

[0150] 35. Use of the oligonucleotide formulation of any of embodiments 1-28 in the manufacturing of a product for treatment, prevention, or detection of a disease or disorder in a subject.

[0151] 36. A method for treatment, prevention or detection of a disease or disorder in a subject in need thereof comprising administering the oligonucleotide formulation of any of embodiments 1-28 in a treatment, prevention, or detection effective amount to the subject.

[0152] 37. The oligonucleotide formulation of any of embodiments 1-28 for treatment, prevention, or detection of a disease or disorder in a subject.

[0153] 38. The use of embodiment 35, the method of 36, or the oligonucleotide formulation for use of embodiment 37, wherein the oligonucleotide formulation has reduced in vivo acute toxicity as compared to a reference oligonucleotide formulation without the presence of calcium in defined concentration range.

[0154] 39. The use of embodiment 35, the method of 36, or the oligonucleotide formulation for use of embodiment 37, wherein the oligonucleotide formulation has reduced in vivo acute toxicity as compared to a reference oligonucleotide formulation without the presence of calcium in defined concentration range, and wherein the in vivo acute toxicity is the toxicity to the somatic motor nervous system; and / or

[0155] wherein the oligonucleotide formulation is for acting on somatic motor nervous system; and / or

[0156] wherein the oligonucleotide formulation is for acting on central nervous system (CNS) ; and / or

[0157] the acute toxicity is a CNS acute toxicity.

[0158] 40. The use of embodiment 35, the method of 36, or the oligonucleotide formulation for use of embodiment 37, wherein the subject is in needs of a medicament for the treatment of the disease or disorder, a vaccine for prevention of the disease or disorder, a diagnostic product for diagnosis of the disease or disorder, and an imaging product for imaging site (s) of the disease or disorder.

[0159] 41. The use of embodiment 35, the method of 36, or the oligonucleotide formulation for use of embodiment 37, wherein the disease or disorder is selected from cerebral disease, myelopathy, and peripheral neuropathy.

[0160] 42. The use of embodiment 35, the method of 36, or the oligonucleotide formulation for use of  embodiment 37, wherein the oligonucleotide targets genes selected from the group consisting of SOD1, FUS, C9orf72, MAPT (Tau) , APP, SMN2, SCN9A, SCN10A, HTT, p21, UTRN, DUX4, SNCA, ATXN1, ATXN2, ATXN3, SCA1, SCA7, SCA8, UCP1, VEGFA, MeCP2, PRNP, DMPK, TARDBP, and TTR.

[0161] 43. The use of embodiment 35, the method of 36, or the oligonucleotide formulation for use of embodiment 37, wherein the disease or disorder is selected from spinal muscular atrophy (SMA) , Duchenne and Becker muscular dystrophy (DMD &BMD) , amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , Alzheimer disease (AD) , Parkinson disease (PD) , Huntington's disease (HD) , multiple sclerosis (MS) , brain tumors, frontotemporal dementia, spinocerebellar, prion, lafora, migraine, schizophrenia, depression, pain, and apoplexy.

[0162] EXAMPLES

[0163] Some embodiments of the invention will now be described in the following Examples, wherein all parts and percentages are by weight unless otherwise specified. However, the scope of the present disclosure is not, of course, limited to the formulations set forth in these examples. Rather, the Examples are merely inventive of the disclosure.

[0164] All the starting materials, reagents and solvents used hereafter were purchased from commercial sources and used as received unless stated otherwise. Purification of reaction products was performed with column chromatography using silica gel (200-300 mesh) and eluting agents of hexane / ethyl acetate, DCM / MeOH. Thin layer chromatography (TLC) was carried out using pre-coated silica Gel GF plates and visualized using KMnO4 staining. 1H-NMR spectra were recorded at 400 or 500 MHz (Varian) using CDCl3 with TMS. High-resolution mass spectra (HRMS) were recorded on LC / MS (Agilent Technologies 1260 Infinity II / 6120 Quadrupole) and a time-of-flight mass spectrometer by ESI or matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) .

[0165] Materials and Methods

[0166] Oligonucleotide synthesis

[0167] (1) Synthesis of single-stranded oligonucleotide

[0168] Single-stranded oligonucleotide was synthesized on a K&ADNA synthesizer (K&ALaborgeraete GbR, chaafheim, Germany) by a solid phase synthesis technique.

[0169] The starting material was universal solid support or special solid support commercially available or synthesis as disclosure in previous context. In general, phosphoramidite monomers including various linkers and conjugates (0.1M in acetonitrile or dichloromethane) , were added sequentially onto a solid support in the DNA synthesizer to generate the desired full-length oligonucleotides.

[0170] Amidite addition: each cycle of amidite addition consisted of four chemical reactions including detritylation, coupling, oxidation / thiolation and capping. In the first step, the detritylation was performed by using 3%dichloroacetic acid (DCA) in DCM for 45 seconds. In the second step, phosphoramidite coupling was conducted for 6 minutes for all amidites by 12 eq. In the third step,  oxidation was performed by using 0.02 M iodine in THF: pyridine: water (70: 20: 10, v / v / v) for 1 minute; if phosphorothioate modification was needed then replace oxidation by thiolation which was carried out with 0.1 M solution of xanthane hydride in pyridine: ACN (50: 50, v / v) for 3 minutes. In the fourth step, the capping was performed by using a THF: acetic anhydride: pyridine (80: 10: 10, v / v / v) (CAP A) and N-methylimidazole: THF (10: 90, v / v) , (CAP B) for 20 seconds. The cycles of four chemical reactions were depended by the length of the single stranded oligonucleotide.

[0171] Deprotection I (Nucleobase Deprotection) : after completion of the synthesis, the solid support was transferred to a screw-cap microcentrifuge tube. For a 1 μmol synthesis scale, 1 ml of a mixture of methylamine and ammonium hydroxide was added. The tube containing the solid support was then heated in an oven at 60℃ to 65℃ for 15 min and then allowed to cool to room temperature. The cleavage solution was collected and evaporated to dryness in a speed-vac to provide crude single strand of oligonucleotide.

[0172] Deprotection II (Removal of 2’ -TBDMS Group) : if the crude RNA oligonucleotide still carried the 2’ -TBDMS groups, then dissolved it in 0.1 ml of DMSO. After adding 1 ml of triethylamine trihydrofluoride, the tube was capped, and the mixture was shaken vigorously to ensure complete dissolution and then heated in an oven at 65℃ for 15 minutes. The tube was removed from the oven and cooled down to room temperature. The solution containing the completely desilylated oligonucleotide was cooled on dry ice. Two ml of ice-cold n-butanol (-20℃) were carefully added in 0.5 ml portions to precipitate the oligonucleotides. The precipitate was filtered, washed with 1 ml ice-cold n-butanol, and subsequently dissolved in 0.01 M Tris (hydroxymethyl) aminomethanol hydrochloride buffer.

[0173] (2) Single-stranded oligonucleotide purification

[0174] The purification of single-stranded oligonucleotides was performed on an AKTA explorer 10 equipped with a Source 15Q 4.6 / 100 PE column using the following conditions: buffer A: (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) , buffer B: (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 2M NaCl, pH 7.5) , gradient: 10%B to 60%B in 25 min, flow rate: 1 ml / min. The purified oligonucleotides were collected and desalting by a HiPrep 26 / 10 Desalting column.

[0175] (3) Annealing to form a duplex oligonucleotide

[0176] To form a duplex, after the generation of desalted purified single-stranded solutions, sense strand and antisense strand were mixed in equal volumes at equimolar concentration in the tube. The tube was placed in a heat block at 95℃ for 5 min and then cooled to room temperature. Then, the thus obtained duplex was subsequently lyophilized to powder.

[0177] General Method A: Oligonucleotide substance (OS) calcium exchange with sodium.

[0178] CaCl2 (Bidepharm, Lot number: BD119632-500g) was weighed and dissolved in medium [e.g., commercial artificial cerebrospinal fluid (aCSF, TOCRIS, Batch number: 57A) or water] for injection to obtain calcium solutions of 5 mM, 10 mM, 20 mM or 100 mM, respectively.

[0179] Oligonucleotide substance RD-12500 (WuXi STA, COA: P220505001-C-MC00759-5-C-Lyo-V04, 6.3%w / w sodium, no calcium) was dissolved in CaCl2 solution at the indicated concentrations to obtain 20 mg / mL oligonucleotide sample. RD-12500 is a siRNA duplex conjugated to an ACO via  a S9 spacer (Table 1) . The thus obtained sample solution was allowed to stand for 30 minutes. After that, the sample was loaded on a desalting column (AKTA, Hiprep 26 / 10) to remove free CaCl2, and oligonucleotide fraction was collected based on the conductivity signals (only collecting the fraction ahead of the valley points of conductivity signal curve which means lowest or free salt) . The collected oligonucleotide with combinational salt was lyophilized, and the sodium (oligo drug substance is sodium salt) and calcium percentage was measured by inductively coupled plasma mass spectrometry (NSF LABORTORY or Medinoah Company, China) . The calcium exchange oligonucleotide was dissolved in aCSF (TOCRIS, Batch number: 57A) to produce test article (TA) at the indicated concentration for intrathecal (IT) injection. The oligonucleotide sequences of RD-12500 are listed in Table 1.

[0180] Table 1. Oligonucleotide strand sequences and duplex compositions

[0181] Note: upper case, RNA; *, phosphorothioate (PS) backbone modification; f, 2'-fluoro; m, 2'-O-methyl (2'-OMe) ; me, 2'-O-methoxyethyl (2’ -MOE) ; Vp, 5’ - (E) -vinylphosphonate; meC, 2'-O-methoxyethyl-5-methyl cytosine; meU, 2'-O-methoxyethyl-5-methyl uracil; S9, 9 atoms long triethylene glycolyl.

[0182] General Method B: Introducing calcium into oligonucleotide formulation (OF)

[0183] CaCl2 (Bidepharm, Lot number: BD119632-500g) was weighed and dissolved in solvent medium (e.g., aCSF or water) to obtain calcium solutions of 5 mM, 10 mM, 20 mM, 35 mM, 100 mM for intrathecal (IT) injection, respectively. Oligonucleotide with designated concentration was dissolved in the Ca-containing solution to obtain the oligonucleotide formulation.

[0184] Animal study

[0185] Sprague-Dawley female rats (A102, SPF, China) were purchased from SPF Biotechnology Co., LTD (Suzhou, Jiangsu, China) . All animal procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Ractigen Therapeutics. Fresh formulations for animal treatments were prepared prior to use by dissolving aliquots of lyophilized oligonucleotide into aCSF to create stock solutions for dilution to the intended treatment concentrations. aCSF alone served as a vehicle control. Animals were randomly assigned into study groups (4-6 rats per group) based on body weight (140 g-260 g) .

[0186] Intrathecal (IT) injection

[0187] Anesthesia was introduced via administration of 3.0%isoflurane in an induction chamber for continuous 10 minutes. Hair was shaved around the injection site at the base of the tail and the injection site was then cleaned with 75%ethanol. The space between the L5-L6 spinous processes was identified and a 30-gauge needle attached to a microliter syringe containing the appropriate drug formulations was slowly inserted into the intradural space until a tail flick was observed. The needle position was subsequently secured in which 30μL total volume of solution was injected over the  course of 1 minute.

[0188] Functional observational battery (FOB)

[0189] Sprague Dawley rats were administered with test articles at a single IT dose. Within 3 hours post-injection, rats were evaluated for signs of motor deficit using the FOB, which was developed to provide unbiased assessment of the effects of drugs on central and peripheral nervous system based on movement dysfunction. FOB was assigned based on the following 7 different parts of the rat: (1) tail; (2) posterior posture; (3) hind limbs; (4) hind paws; (5) forepaws; (6) anterior posture; (7) head. Based on each of the 7 different parts, each rat was given a sub-score: 0 if no signs of motor dysfunction, 1 if the evaluated part was paralyzed. The sub-scores and mean values were calculated and summarized for each rat after evaluating each part.

[0190] Example 1. Preparation of TA2

[0191] TA2 was prepared in this Example by using the following procedures as General Method A.

[0192] Oligonucleotide substance RD-12500 (WuXi STA, COA: P220505001-C-MC00759-5-C-Lyo-V04) was dissolved in 5 mL 5 mM CaCl2 solution to obtain 20 mg / mL oligonucleotide sample. The obtained TA solution was allowed to stand for 30 minutes. After that, the sample was loaded on desalting column to remove free CaCl2, and oligonucleotide fraction was collected based on conductivity signal (FIG. 1, fraction 2) . The collected oligonucleotide with combinational salt was lyophilized, followed by characterizing sodium and calcium percentage via inductively coupled plasma mass spectrometry (NSF LABORTORY, China) . The results are summarized in Table 2. Na: 3.9 × 104 (mg / Kg) (3.9%, percentage) ; Ca: 1.3 × 104 (mg / Kg) (1.3%, percentage) .

[0193] The calcium exchange oligonucleotide was dissolved in aCSF to obtain TA2 solution at 100 mg / mL concentration.

[0194] Example 2. Preparation of TA3

[0195] TA3 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0196] Oligonucleotide substance RD-12500 (WuXi STA, COA: P220505001-C-MC00759-5-C-Lyo-V04) was dissolved in Lactated Ringer's solution (Phygene, lot. 20221129) to get TA3 at 100 mg / mL concentration for IT injection.

[0197] Example 3. Preparation of TA5

[0198] TA5 was prepared in this Example by using the following procedures as General Method A.

[0199] Oligonucleotide substance RD-12500 (WuXi STA, COA: P220505001-C-MC00655-16-C-Lyo-V01, 5.6%w / w sodium, no calcium) was dissolved in 5 mL 10 mM CaCl2 solution to obtain 20 mg / mL oligonucleotide sample. The obtained TA solution was allowed to stand for 30 minutes. After that, the sample was loaded on desalting column to remove free CaCl2, and oligonucleotide fraction was collected based on conductivity signal (FIG. 2, fraction 2) . The collected oligonucleotide with combinational salt was lyophilized, followed by characterizing sodium and calcium percentage via inductively coupled plasma mass spectrometry (Medinoah Company, China) . The results are summarized in Table 2. Na: 5.3%, Ca: 0.9%.

[0200] The calcium exchange oligonucleotide was dissolved in aCSF to get TA5 at 200 mg / mL concentration.

[0201] Example 4. Preparation of TA15

[0202] TA15 was prepared in this Example by using the following procedures as General Method A.

[0203] The oligonucleotide substance RD-12500 was dissolved in 5 mL 20 mM CaCl2 solution to obtain 50 mg / mL oligonucleotide sample. The obtained TA solution was allowed to stand for 30 minutes. After that, the sample was loaded on desalting column to remove free CaCl2, and oligonucleotide fraction was collected based on the conductivity signal (FIG. 3, fraction 2) . The collected oligonucleotide with combinational salt was lyophilized, followed by characterizing sodium and calcium percentage via inductively coupled plasma mass spectrometry (Medinoah Company, China) . The results are summarized in Table 2. Na: 4.5%, Ca: 1.6%.

[0204] The calcium exchange oligonucleotide was dissolved in aCSF to get TA15 at 200 mg / mL concentration.

[0205] Example 5. Preparation of TA6

[0206] TA6 was prepared in this Example by using the following procedures as General Method A.

[0207] The oligonucleotide substance RD-12500 was dissolved in 5 mL 100 mM CaCl2 solution to obtain 20 mg / mL oligonucleotide sample. The obtained TA solution was allowed to stand for 30 minutes. After that, the sample was loaded on desalting column to remove free CaCl2, and oligonucleotide fraction was collected based on conductivity signal (FIG. 4, fraction 2) . The collected oligonucleotide with combinational salt was lyophilized, followed by characterizing sodium and calcium percentage via inductively coupled plasma mass spectrometry (Medinoah Company, China) . The results are summarized in Table 2. Na: 1.8%, Ca: 4.0%.

[0208] The calcium exchange oligonucleotide was dissolved in aCSF to obtain TA6 at 200 mg / mL concentration.

[0209] Example 6. Preparation of TA16

[0210] TA16 was prepared in this Example by using the following procedures as General Method A.

[0211] The oligonucleotide substance RD-12500 was dissolved in water and loaded on size exclusion column. PBS (pH= 7.4) buffer solution and 2 M CaCl2 water solution were used to elute and collect oligonucleotide fraction. After that, the sample was desalted by loading the sample on desalting column to remove free CaCl2, and oligonucleotide fraction was collected based on conductivity signal (FIG. 5, fraction 2) . The collected oligonucleotide with combinational salt was lyophilized, followed by characterizing sodium and calcium percentage via inductively coupled plasma mass spectrometry (Medinoah Company, China) . The result is summarized in Table 2. Na: 0.8%, Ca: 5.3%.

[0212] The calcium exchange oligonucleotide was dissolved in aCSF to get TA16 at 200 mg / mL concentration.

[0213] Example 7. Preparation of TA7

[0214] TA7 was prepared in this Example by using the following procedures as General Method B. 3.6 mg CaCl2 was weighed and dissolved in 1 mL aCSF to obtain 35 mM calcium-containing aCSF solution.

[0215] The oligonucleotide substance sodium RD-12500 was dissolved in the 35 mM calcium-containing aCSF solution to get TA7 at 200 mg / mL concentration.

[0216] Example 8. Preparation of TA8

[0217] TA8 was prepared in this Example by using the following procedures as General Method B. 6.4 mg CaCl2 was weighed and dissolved in 1 mL aCSF to obtain 60 mM calcium-containing aCSF solution.

[0218] The oligonucleotide substance sodium RD-12500 was dissolved in the 60 mM calcium-containing aCSF solution to get TA8 at 200 mg / mL concentration.

[0219] Example 9. Preparation of TA9

[0220] TA9 was prepared in this Example by using the following procedures as General Method B. 10.8 mg CaCl2 was weighed and dissolved in 1 mL aCSF to obtain 100 mM calcium-containing aCSF solution.

[0221] The oligonucleotide substance sodium RD-12500 was dissolved in the 100 mM calcium-containing aCSF solution to get TA9 at 200 mg / mL concentration.

[0222] Example 10. Preparation of TA11

[0223] TA11 was prepared in this Example by using the following procedures as General Method B. 0.3 mg CaCl2 was weighed and dissolved in 1 mL aCSF to obtain 5 mM calcium-containing aCSF solution.

[0224] The oligonucleotide substance sodium RD-12500 was dissolved in the 5 mM calcium-containing aCSF solution to get TA8 at 200 mg / mL concentration for IT injection. The mean osmotic pressure of TA11 was 703 mOsmol / kg (WuXi AppTec, China) .

[0225] Example 11. Preparation of TA12

[0226] TA12 was prepared in this Example by using the following procedures as General Method B. 0.8 mg CaCl2 was weighed and dissolved in 1 mL solvent aCSF to obtain 10 mM calcium-containing aCSF solution.

[0227] The oligonucleotide substance sodium RD-12500 was dissolved in the 10 mM calcium-containing aCSF solution to get TA12 at 200 mg / mL concentration for IT injection. The mean osmotic pressure of TA12 was 716 mOsmol / kg (WuXi AppTec, China) .

[0228] Example 12. Preparation of TA13

[0229] TA13 was prepared in this Example by using the following procedures as General Method B.

[0230] 2.0 mg CaCl2 was weighed and dissolved in 1 mL aCSF to obtain 20 mM calcium-containing aCSF solution.

[0231] The oligonucleotide substance sodium RD-12500 was dissolved in the 20 mM calcium-containing aCSF solution to get TA13 at 200 mg / mL concentration for IT injection. The mean osmotic pressure of the TA13 was 739 mOsmol / kg (WuXi AppTec, China) .

[0232] Example 13. Preparation of TA14

[0233] TA14 was prepared in this Example by using the following procedures as General Method B.

[0234] 3.6 mg CaCl2 was weighed and dissolved in 1 mL aCSF to obtain 35 mM calcium-containing aCSF solution.

[0235] The oligonucleotide substance sodium RD-12500 was dissolved in the 35 mM calcium-containing aCSF solution to get TA14 at 200 mg / mL concentration for IT injection. The mean osmotic pressure of the TA14 was 794 mOsmol / kg (WuXi AppTec, China) .

[0236] Example 14. Introducing calcium to oligonucleotide substance by cation exchange (Method A) As summarized in Table 2, the calcium concentrations in the oligonucleotide substance TA5, TA15, TA6 and TA16 were increased from 0.9%to 4%, or calcium exchange percentage increased from 16%to 71%, by utilizing different CaCl2 concentrations in Method A or a size exclusion column in Method B. In Example 6, TA16 was subjected to the size exclusion column to remove sodium as much as possible, and then used 2 M calcium solution to dilute the oligonucleotide sample on the column, resulting 5.3%OS calcium percentage and 84%calcium exchange percentage. When dissolved TA16 OS in aCSF as oligonucleotide formulation (OF) solution at 200 mg / mL, the calculated calcium concentration reaches 267.5 mM which is extremely high.

[0237] The calcium exchange percentage with sodium was calculated by Formula I (OS RD-12500 contains 6.3%sodium) :

[0238] The calculated calcium concentration (mM) was calculated by Formula II (the aCSF comprises 2.5 mM of calcium) :

[0239] In Formula II, Oligonucleotide Conc. refers to the concentration of oligonucleotide sodium substrate dissolved in CaCl2 solution in the unit of mg / mL; OS Ca% (i.e., oligonucleotide substrate calcium %) refers to the value detected by inductively coupled plasma mass spectrometry in Table 2.

[0240] In summary, Method A is effective for preparing oligonucleotide solutions with relative low  calcium concentration, whereas Method B is more suitable for preparing oligonucleotide solutions with mediate and controllable calcium concentration.

[0241] Table 2. Summary of calcium exchange data by Method A

[0242] Note: “-” represents not available.

[0243] a: The calcium exchange percentage with sodium was calculated by Formula I.

[0244] b: The calcium exchange OS was dissolved in aCSF to form 200 mg / mL OF solution. The theoretical calcium concentration of OF solution was calculated by Formula II.

[0245] Example 15. CNS acute toxicity of oligonucleotide by calcium exchange in IT injected SD rats

[0246] To test the acute toxicity of the oligonucleotide formulations, the indicated test articles (i.e., TA1, TA2 and TA3, see Table 3) were prepared and administrated into adult female SD rats (body weigh arrange: 140 g-260 g) at 3 mg / dose (100 mg / mL, 30 μL) via IT injection. aCSF served as a vehicle control to establish baseline FOB. The cage-side clinical symptoms and FOB were recorded within 3 hours after IT injection.

[0247] Results are shown in Table 4 and Table 5. In TA1 and TA3 groups, 3 out of 4 rats showed acute neurological toxicity characterized by convulsion, abnormal vocalization, abnormal gait or hind limb weakness. All rats in TA2 group showed no abnormal behavior. The results suggest that the CNS acute toxicity of oligonucleotide was reduced by calcium exchange.

[0248] Table 3. Oligonucleotide sample information

[0249] Note: “-” represents not available.

[0250] n represents the number of rats.

[0251] a: represents oligonucleotide substance (sodium salt) directly dissolved in aCSF solution.

[0252] b: represents oligonucleotide substance by calcium exchange was dissolved in aCSF solution in Example 1.

[0253] c: Lac represents oligonucleotide substance (sodium salt) dissolved in Lactated Ringer's solution in Example 2.

[0254] d: aCSF contains 2.5 mM calcium.

[0255] e: 35 mM calcium calculated by Formula II.

[0256] Table 5. Record of functional observational battery (FOB) within 3 hours after a single IT dose of TAs

[0257] Note: n represents the number of rats, 0 represents no signs of motor dysfunction, 1 represents the evaluated part was paralyzed.

[0258] Example 16. CNS acute toxicity of oligonucleotide by different calcium exchange in IT injected SD rats

[0259] To further test acute toxicity of the oligonucleotide formulations, the indicated test articles (i.e., TA4, TA5, TA6, TA7, TA8 and TA9, see Table 6) were prepared and administered into adult female SD rats (body weigh arrange: 140 g-260 g) at 6 mg / dose (200 mg / mL, 30 μL) via IT injection. TA4 was prepared by directly dissolving RD-12500 in aCSF and served as functional observational battery (FOB) positive control. The cage-side clinical symptoms and FOB were recorded within 3 hours after the IT injection.

[0260] Results are shown in Table 7 and Table 8. In TA4 control group, 3 out of 6 rats showed acute neurological toxicity characterized by severe conclusion, abnormal vocalization, ear and limbs paleness, hind limb weakness, abnormal gait, or sensitive to touch, and 1 out of 6 rats died around 1 hour after IT dosing. In the TA5, TA7, TA8 and TA9 groups, no abnormal clinical symptoms were observed in the cage-side clinical observations and FOB record. In the TA6 group, when the calcium concentration in the oligonucleotide formulation reached 203 mM, 3 out of 6 rats showed paralysis which was not recovered within 3 hours. Table 8 shows the result of TA5, TA7 and TA9.

[0261] The study also demonstrated that both Method A and Method B are effective in preparing oligonucleotide formulations with desired calcium concentration, meanwhile Method B is more repeatable and an easier process than Method A. More than 10 mM calcium in the oligonucleotide formulation, especially 20 mM or more, e.g., 35 mM calcium is capable of eliminating most of or all acute toxicity from the oligonucleotide substrate administered into CNS by IT injection.

[0262] Table 6. Oligonucleotide sample information

[0263] Note:

[0264] “-” represents not available.

[0265] n represents the number of rats.

[0266] a: MA-10 represents TA was prepared by method A and the final calcium concentration was 10 mM.

[0267] b: MB-35 represents TA was prepared by method B and the final calcium concentration was 35 mM.

[0268] c: 47.5 mM calcium of TA5 and 203 mM calcium of TA6 was calculated by Formula II.

[0269] Example 17. CNS acute toxicity of oligonucleotide with increased calcium concentration in IT injected SD rats

[0270] To further study the optimal calcium concentration for minimizing acute toxicity of the oligonucleotide formulation and validating the protocol reproducibility, the indicated test articles (i.e., TA10, TA11, TA12, TA13, and TA14, see Table 9) were prepared and administered into adult female SD rats (body weigh arrange: 140 g-260 g) at 6 mg / dose (200 mg / mL, 30 μL) via IT injection. TA10 was prepared by directly dissolving into oligonucleotide substance RD-12500 (WuXi STA, COA: P220505001-C-MC00655-16-C-Lyo-V01, 5.6%w / w sodium, no calcium) in aCSF and served as neurotoxicity positive control. The cage-side clinical symptoms and FOB were recorded within 3 hours after IT injection. Results are shown in Table 10 and Table 11. In TA10 group, 5 out of 6 rats showed acute neurotoxicity including convulsion, abnormal vocalization, and abnormal gait. TA10 was consistent with TA4 in the same formulation except for different oligonucleotide substance batch (within 1%w / w difference of sodium content) .

[0271] In TA11 group, all rats showed abnormal clinical signs. In TA12 group, 4 out of 6 rats showed abnormal clinical signs, i.e., convulsion, abnormal vocalization and / or abnormal gait. In TA13 group, 2 out of 6 rats showed abnormal clinical signs. Surprisingly, in TA14 group, when the calcium concentration was increased to 35 mM, no abnormal clinical symptoms were observed. TA14 was consistent with TA7, both of which prepared in the same formulation by Method B) . TA14 and TA7 showed reproducibility in reducing acute toxicity in two independent experiments. As a conclusion, the results demonstrate that oligonucleotide formulations with a calcium concentration of no less than 10 mM, preferably at least 20 mM, more preferably 35 mM or higher can effectively reduce the acute toxicity of oligonucleotide substances and / or their formulations.

[0272] Example 18: Preparation of compound C5x5

[0273] Compound C5x5 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0274] (1) The preparation of compound 42

[0275] To a solution of methyl 2- (4-fluoro-3-nitrophenyl) acetate compound 41 (17.3 g, 81 mmol, 1.0 eq) and K2CO3 (11.2 g, 81 mmol) in anhydrous DMF (200 mL) , under nitrogen atmosphere, was added compound 40 (19.56 g, 81 mmol, 1.0 eq) . The reaction mixture was stirred at 55 ℃ for 6 h, and then cold water (100 mL) was added. The mixture was extracted three times by ethyl acetate, and then the organic phase was washed three times by saturated LiCl solution and one time by brine and then dried by anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure to form yellow oil compound 42 which was directly used in the next step without further purification.

[0276] (2) The preparation of compound 43

[0277] To a solution of compound 42 (35.18 g, 81 mmol, 1.0 eq) in THF / H2O (9: 1, 280 mL) , under ice bath, was added HCOONH4 (30.67 g, 486 mmol, 6.0 eq) and Zn powder (31.78 g, 486 mmol, 6.0 eq) . After 10 minutes, the reaction mixture was moved to room temperature and stirred overnight. Then the reaction mixture was filtered and concentrated under reduced pressure. After that, water (200 mL) was added into the mixture, and then extracted three times by ethyl acetate, the organic phase was washed one time by brine. After dried by anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the compound 43 was formed and then was directly used in the next step without further purification. The compound 43 was characterized with mass spectrometry. MW calc. : 404.34; MW. Found: 405.3 [M+H] +.

[0278] (3) The preparation of compound 45

[0279] To a solution of compound 43 (19.36 g, 48 mmol, 1.0 eq) in EtOH (200 mL) under nitrogen atmosphere, was added 3- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) propanal compound 44 (9.0 g, 48 mmol, 1.0 eq) and AcOH (11 mL, 192 mmol, 4.0 eq) . The reaction mixture was stirred at 80℃ overnight, and  then concentrated under reduced pressure. Then a saturated NaHCO3 solution (100 mL) was added, the mixture was extracted three times by ethyl acetate, then the organic phase was combined and washed by brine, dried over Na2SO4, and concentrated. The resultant residue compound 45 was directly used in the next step without further purification.

[0280] (4) The preparation of compound 46

[0281] To a solution of compound 45 (10 g, 17.5 mmol, 1.0 eq) in anhydrous THF (50 mL) under nitrogen atmosphere, was added 1 M TBAF THF solution (26.3 mL, 26.3 mmol, 1.5 eq) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 h, and then concentrated under reduced pressure. Then water (100 mL) was added, the mixture was extracted three times with DCM, then the organic phase was combined and washed with brine, dried over Na2SO4, and concentrated. The resultant residue was dissolved in 50 mL pyridine, and DMTrCl (7.12 g, 21 mmol, 1.2 eq) was added therein. The reaction mixture was stirred at room temperature for 6 h, after which it was concentrated under reduced pressure. The resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-3%of MeOH / DCM) to provide compound 46 (8.1 g, 61%yield) as yellow solid. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. MW calc. : 760.48; MW. Found: 761.8 [M + H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.59 –7.53 (m, 1H) , 7.38 –7.31 (m, 2H) , 7.23 -7.19 (m, 6H) , 7.18 –7.14 (m, 3H) , 6.76 (dd, J = 7.8, 5.6 Hz, 4H) , 4.17 –4.02 (m, 2H) , 3.76 (s, 6H) , 3.73 (s, 2H) , 3.67 (s, 3H) , 3.59 (t, J = 7.0 Hz, 2H) , 3.19 –3.05 (m, 2H) , 1.29 –1.25 (m, 28H) , 0.88 (t, J = 6.5 Hz, 3H) .

[0282] (5) The preparation of compound C5x5

[0283] To a solution of compound 46 (2.7 g, 3.55 mmol, 1.0 eq) in anhydrous THF (20 mL) under nitrogen atmosphere and ice bath, was added LiAlH4 (202 mg, 5.33 mmol, 1.5 eq) . The mixture was moved to room temperature after 10 minutes and stirred for 1 h. Then the reaction was moved to ice bath, saturated potassium sodium tartrate solution (20 mL) was added slowly into the mixture. After 30 minutes, the reaction was extracted three times with Et2O, then the organic phase was combined and washed by brine, dried over Na2SO4, and concentrated. The crude product (300 mg, 0.41 mmol, 1.0 eq) was dissolved in anhydrous DCM (5 mL) then DIPEA (204 μL, 1.23 mmol, 3.0 eq) , 3- ( (chloro (diisopropylamino) phosphanyl) oxy) propanenitrile compound 47 (274 μL, 1.23 mmol, 3.0 eq. ) were added under nitrogen atmosphere at 25℃. The reaction mixture was stirred for 1 h. The mixture was extracted two times with DCM, then washed with brine and dried with anhydrous Na2SO4. The organic layer was concentrated under reduced pressure and the resultant residue was purified with flash chromatography (silica gel, gradient eluent: 1-5%of MeOH / DCM, 1%Et3N) to provide compound C5x5 (299 mg, 78%yield) as colorless oil. The product was characterized with mass spectrometry and 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.62 (s, 1H) , 7.32 (dd, J = 7.6, 4.1 Hz, 2H) , 7.27 –7.11 (m, 9H) , 6.73 (dd, J = 7.9, 5.6 Hz, 4H) , 4.34 –4.31 (m, 2H) , 4.10 –4.06 (m, 2H) , 3.75 (s, 6H) , 3.64 –3.61 (m, 2H) , 3.58 (dd, J = 11.8, 5.1 Hz, 2H) , 3.24 –3.18 (m, 2H) , 3.09 – 2.88 (m, 4H) , 2.65 –2.55 (m, 4H) , 1.37 –1.28 (m, 28H) , 1.22 (dd, J = 6.8, 3.2 Hz, 12H) , 0.88 (t, J =6.5 Hz, 3H) .

[0284] Example 19: Preparation of conjugated oligonucleotide linked with the conjugation group derived from compound C5x5

[0285] Oligonucleotide conjugate with C5x5 was generated by using a conjugation group derived from the compound C5x5 by using C5x5 as terminus amidite according to the above methods of general synthesis method of oligonucleotide.

[0286] Exemplary structure of the lipid-conjugated oligonucleotide is O1 as illustrated below:

[0287] O1 (Compound C5x5 application)

[0288] It can be seen that in the structures of O1, the conjugation derived from the delivery enhancing compound C5x5 is linked with double-stranded RNA (dsRNA) duplexes (including but not limited to saRNA or siRNA) at the 5’ -end of the sense strand (S) via a linking moiety, such as –OP (O) 2O-, –OP (O) (S) O-or –P (O) -O-, wherein (S) is the sense strand and (AS) is the antisense strand.

[0289] Example 20. Design and synthesis of oligonucleotides

[0290] To further assess the toxicity of oligonucleotide formulations, the oligonucleotides listed in Table 12 were designed and synthesized with fully chemical modification (i.e., 2’ -O-methyl, 2'-O-methoxyethyl, 5’ - (E) -vinylphosphonate, or phosphorothioate (PS) backbone modification) , and conjugated with ACO or lipid (i.e., C5x5) , respectively. Oligonucleotide formulations were prepared following General Method B.

[0291] Table 12. Oligonucleotide strand sequences and duplex compositions

[0292] Note: upper case, RNA; *, phosphorothioate (PS) backbone modification; f, 2'-fluoro; m, 2'-O-methyl (2'-OMe) ; me, 2'-O-methoxyethyl (2’ MOE) ; Vp, 5’ - (E) -vinylphosphonate; meC, 2'-O-methoxyethyl-5-methyl cytosine; meU, 2'-O-methoxyethyl-5-methyl uracil; S9, 9 atoms long triethylene glycolyl.

[0293] Example 21. CNS acute toxicity of oligonucleotide dissolved in 35 mM calcium aCSF in IT injected SD rats

[0294] Lipid conjugated oligonucleotide or duplex-ACO (e.g., siRNA-ACO) compound commonly shows severe acute toxicity at medium dose within 3 hours after IT injection (such as those shown in Table 13 and Table 14) . However, in our observation, proper (preferably optimized) calcium concentration in oligonucleotide formulation can greatly mitigate acute toxicity originated from oligonucleotide substance such as oligonucleotide lipid conjugate (RD-16234 and RD-16237) or siRNA-ACOs (RD-16223, RD-16224, RD-16226, RD-16229, RD-16230 and RD-16236) .

[0295] To assess the acute toxicity of the oligonucleotide formulations, the indicated siRNA-ACOs (i.e., RD-16223, RD-16224, RD-16226, RD-16229, RD-16230 and RD-16236, see Table 12) and lipid conjugated oligonucleotides (i.e., RD-16234 and RD-16237, see Table 12) were dissolved in aCSF and 35 mM calcium aCSF, respectively. Indicated oligonucleotides were administered into adult female SD rats at 6 mg / dose (200 mg / mL, 30 μL) via IT injection, respectively. aCSF was used as a solvent and served as a negative control. The cage-side clinical signs and FOB of oligonucleotides dissolved in commercial aCSF (TOCRIS, Batch number: 57A) or 35 mM calcium aCSF were recorded within 3 hours after IT injection, as summarized in Table 13, Table 15, Table 14 and Table 16. In comparison, oligonucleotides formulations dissolved in aCSF with 35 mM calcium provided reduced CNS acute toxicity, especially for lipid-conjugated oligonucleotides (i.e., RD-16234 and RD-16237) .

[0296] Table 15. Record of FOB within 3 hours after a single IT dose of oligonucleotides in commercial aCSF

[0297] Note: n represents the number of rats; 0 represents no signs of motor dysfunction; 1 represents the evaluated part was paralyzed.

[0298] Table 16. Record of FOB within 3 hours after a single IT dose of oligonucleotides in commercial aCSF with 35 mM calcium

[0299] Note: n represents the number of rats; 0 represents no signs of motor dysfunction; 1 represents the evaluated part was paralyzed.

[0300] Example 22. Preparation of DP-10

[0301] DP-10 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0302] 1) Preparation of solution A1 and solution B1 according to the following Table 17.

[0303] Table 17. Summary of solution A1 and solution B1

[0304] 2) The prescription amount of oligonucleotide substance RD-12500 (500mg, WuXi STA, COA: P220505001-C-MC00655-16-C-Lyo-V01) was dissolved in 2.5 mL of solution A1 in a 15 mL tube, followed by the addition of 1.0 mL of solution B1. The mixed solution was transferred to a 5 mL volumetric flask and the volume was adjusted to 5ml using water for injection. The osmotic pressure was measured, yielding a result of 278 mOsmol / kg. After that, 3.21mg of sodium chloride was added to achieve a final concentration of DP-10 at 100mg / mL with an osmotic pressure of 305 mOsmol / kg.

[0305] Example 23. Preparation of DP-15

[0306] DP-15 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0307] 1) Preparation of solution A2 and solution B2 according to the following Table 18.

[0308] Table 18. Summary of solution A2 and solution B2

[0309] 2) The prescription amount of oligonucleotide substance RD-12500 (500mg, WuXi STA, COA: P220505001-C-MC00655-16-C-Lyo-V01) was dissolved in 2.5 mL of solution A2 in a 15 mL tube, followed by the addition of 1.0 mL of solution B2. The mixed solution was transferred to a 5 mL volumetric flask and the volume was adjusted to 5ml using water for injection. The osmotic pressure was measured, yielding a result of 263 mOsm / kg. After that, 5.12 mg of sodium chloride was added to achieve a final concentration of DP-15 at 100mg / mL with an osmotic pressure of 298 mOsmol / kg.

[0310] Example 24. Preparation of DP-20

[0311] DP-20 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0312] 1) Preparation of solution A3 and solution B3 according to the following Table 19.

[0313] Table 19. Summary of solution A3 and solution B3

[0314] 2) The prescription amount of oligonucleotide substance RD-12500 (500mg, WuXi STA, COA: P220505001-C-MC00655-16-C-Lyo-V01) was dissolved in 2.5 mL of solution A3 in a 15 mL tube, followed by the addition of 1.0 ml of solution B3. The mixed solution was transferred to a 5 mL volumetric flask and the volume was adjusted to 5ml using water for injection. The osmotic pressure was measured, yielding a result of 267 mOsmol / kg. After that, 4.12 mg of sodium chloride was added to achieve a final concentration of DP-20 at 100mg / mL with an osmotic pressure of 297 mOsmol / kg.

[0315] Example 25. Preparation of DP-25

[0316] DP-25 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0317] 1) Preparation of solution A4 and solution B4 according to the following Table 20.

[0318] Table 20. Summary of solution A4 and solution B4

[0319] 2) The prescription amount of oligonucleotide substance RD-12500 (500mg, WuXi STA, COA: P220505001-C-MC00655-16-C-Lyo-V01) was dissolved in 2.5 mL of solution A4 in a 15 mL tube, followed by the addition of 1.0 mL of solution B4. The mixed solution was transferred to a 5 mL volumetric flask and the volume was adjusted to 5ml using water for injection. The osmotic pressure was measured, yielding a result of 249 mOsmol / kg. After that, 6.58 mg of sodium chloride was added to achieve a final concentration of DP-25 at 100mg / mL with an osmotic pressure of 297 mOsmol / kg.

[0320] Example 26. Preparation of DP-35

[0321] DP-35 was prepared in this Example by using the following procedures.

[0322] 1) Preparation of solution A5 and solution B5 according to the following Table 21.

[0323] Table 21. Summary of solution A5 and solution B5

[0324] 2) The prescription amount of oligonucleotide substance RD-12500 (500mg, WuXi STA, COA: P220505001-C-MC00655-16-C-Lyo-V01) was dissolved in 2.5 mL of solution A5 in a 15 mL tube, followed by the addition of 1.0 mL of solution B5. The mixed solution was transferred to a 5 mL volumetric flask and the volume was adjusted to 5ml using water for injection. The osmotic pressure was measured, yielding a result of 268 mOsmol / kg. After that, 4.37 mg of sodium chloride was added to achieve a final concentration of DP-35 at 100mg / mL with an osmotic pressure of 305 mOsmol / kg.

[0325] Example 27. CNS acute toxicity of oligonucleotide by using an isotonic formulation in IT injected SD rats

[0326] To assess the acute toxicity of the oligonucleotide formulations, the indicated test articles (i.e., DP-10, DP-15, DP-20, DP-25, and DP-35, see Table 22) were prepared and administered into adult female SD rats (body weigh arrange: 140 g-260 g) at 3 mg / dose (100 mg / mL, 30 μL) via IT injection. Preparations of DP-10, DP-15, DP-20, DP-25, and DP-35 were described in Example 22, 23, 24, 25 and 26, respectively. The cage-side clinical symptoms and FOB were recorded within 3 hours after IT injection, and the results are shown in Table 22 and Table 23. All groups had no obvious acute toxicity. The results demonstrate that oligonucleotide formulations with isotonic osmotic pressure ranging from 280 to 320 mOsmol / kg can mitigate acute toxicity dramatically.

[0327] While the invention has been particularly shown and described with reference to a preferred embodiment and various alternate embodiments, it is understood by persons skilled in the relevant art that various changes in form and details can be made therein without departing from the spirit and scope of the invention.

Claims

1.An oligonucleotide formulation comprising:(a) a calcium-containing solution with a calcium concentration of at least 15 mM in the formulation; and(b) an oligonucleotide substance in said solution.2.The oligonucleotide formulation according to claim 1, wherein when the oligonucleotide substance is a non-conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to less than 25 mM; orwherein when the oligonucleotide substance is a conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to 150 mM; and / orwherein the oligonucleotide formulation has an osmotic pressure in a range from 250 mOsmol / kg to 350 mOsmol / kg.3.The oligonucleotide formulation according to claim 1, wherein the oligonucleotide substance comprises a single-stranded oligonucleotide or a double-stranded oligonucleotide or a combination thereof.4.The oligonucleotide formulation according to claim 1, wherein the single-stranded oligonucleotide is one or more antisense oligonucleotide (ASO) selected from a gapmer, a mixmer, a steric blocker, or a splicing modulator; and / orthe double-stranded oligonucleotide is one or more duplex RNA selected from a siRNA or a saRNA, or a combination of siRNA and / or saRNA, or a conjugate of siRNA and / or saRNA, or a miRNA.5.The oligonucleotide formulation according to any of claims 2-4, wherein the conjugated oligonucleotide is conjugated to one or more conjugation moieties; and / orwherein the one or more conjugation moieties are selected from: a lipid, a luminophor, a ligand, a saccharide, a peptide, and an antibody; and / orwherein the conjugation moiety is an accessory oligonucleotide (ACO) conjugated to the oligonucleotide; and / orwherein the one or more conjugation moieties are conjugated to the oligonucleotide at one or more ends of the oligonucleotide strand or at an internal position of the oligonucleotide.6.The oligonucleotide formulation according to claim 5, wherein the one or more conjugation moieties is selected from: a fatty acid, a cell-penetrating peptide, a fluorophore, polyethylene glycol, an alkaloid, a tryptamine, a benzimidazole, a quinolone, an amino acid, a cholesterol, glucose and N-acetylgalactosamine; and / orwherein the oligonucleotide substance is an oligonucleotide conjugated to an ACO or an oligonucleotide conjugated to a lipid moiety.7.The oligonucleotide formulation according to claim 5, wherein the lipid moiety is a C4-C30 fatty acid moiety.8.The oligonucleotide formulation according to claim 5, wherein the lipid moiety comprises a saturated or unsaturated C6, C8, C10, C12, C14, C16, C18, C20, C22, or C24 carbon chain.9.The oligonucleotide formulation according to claim 5, wherein the conjugation moiety is derived from C5x5: 10.The oligonucleotide formulation according to claim 9, wherein C5x5 is conjugated to the 5' end of a sense strand or an antisense strand in the oligonucleotide via -OP (O) 2O-, -OP (O) (S) O-and / or-P (O) -O-.11.The oligonucleotide formulation according to claim 5, wherein the accessory oligonucleotide (ACO) is a single stranded oligonucleotide having at least 6 nucleotides in length; and / orwherein the accessory oligonucleotide (ACO) is a non-targeting oligonucleotide; and / orwherein the accessory oligonucleotide (ACO) comprises at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, or at least 18 phosphorothioate modification on the backbone, or all the nucleotides in the backbone are phosphorothioate modified.12.The oligonucleotide formulation according to claim 1, wherein the calcium is in a form selected from molecular calcium, ionic calcium, complex calcium, or any combinations thereof.13.The oligonucleotide formulation according to claim 1, wherein the calcium is provided by calcium chloride, calcium gluconate, calcium lactate, calcium bicarbonate, calcium dihydrogen phosphate, calcium hydrogen phosphate and any combinations thereof.14.The oligonucleotide formulation according to claim 2, wherein when the oligonucleotide substance is a non-conjugated oligonucleotide, the calcium concentration in the formulation is in a range from 15 mM to 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 or 16 mM, or any sub-range or value in the range; and / orwherein when the oligonucleotide substance is a non-conjugated oligonucleotide, the osmotic pressure of the formulation is in a range from 280 mOsmol / kg to 320 mOsmol / kg.15.The oligonucleotide formulation according to claim 2, wherein when the oligonucleotide substance is a conjugated oligonucleotide,the calcium concentration in the formulation is in a range from 15 mM to 140 mM, 20 mM to 130 mM, from 20 mM to 120 mM, from 30 mM to 110 mM or from 35 mM to 100 mM;and / or, the calcium concentration in the formulation is about 20, 35, 47.5, 60, 82.5, 100 mM, 120 mM; and / orwherein the calcium concentration in the formulation is about 35, 47.4, 60, 100 mM; and / orwherein the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to less than 25 mM; and / orwherein the calcium concentration in the formulation is in a range from 15 mM to 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 or 16 mM, or any sub-range or value in the range; and / orwherein when the oligonucleotide substance is a conjugated oligonucleotide, the osmotic pressure of the formulation is in a range from 280 mOsmol / kg to 320 mOsmol / kg.16.The oligonucleotide formulation according to any of claims 1-15, wherein at least one nucleotide of the oligonucleotide substance is chemically modified nucleotide.17.The oligonucleotide formulation according to claim 16, wherein the chemically modified nucleotide locates in an antisense strand of the ASO, or in a sense strand, an antisense strand, or both strands of the duplex RNA, or in an ACO; and / orwherein the chemically modified nucleotide is a nucleotide modified at the 5' end, 3' end, both ends, or in internal part of the strand (s) ; and / orwherein at least 50%nucleotides in the oligonucleotide substance are chemically modified.18.The oligonucleotide formulation according to claim 16, wherein the chemically modified nucleotide is one or more selected from a 2’ sugar modification; base modification; a phosphorothioate (PS) backbone modification; an addition of a 5'-phosophate moiety or a 5-methyl cytosine moiety at the 5’ end of the nucleotide strand.19.The oligonucleotide formulation according to claim 18, wherein the 2’ sugar modification is one or more selected from: 2′-fluoro-2′-deoxynucleoside (2′-F) modification, 2′-O-methyl (2′-O-Me) modification, and 2′-O- (2-methoxyethyl) (2′-O-MOE) modification; and / orwherein the addition of a 5'-phosophate moiety is one or more selected from an additional of (E) -vinylphosphonate moiety at the 5’ end of the nucleotide strand.20.The oligonucleotide formulation according to any of claims 1-19, wherein the formulation further comprises one or more other excipients selected from preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, isotonic agents and antioxidant.21.The oligonucleotide formulation according to claim 1, wherein the formulation comprises one or more selected from salt, polyol, saccharide and / or alcohol; and / orwherein the carrier in the formulation is artificial cerebrospinal fluid (aCSF) or water; and / orwherein the calcium-containing solution is an aCSF or aqueous solution; and / orwherein the formulation comprises one or more ingredients selected from NaCl, KCl, MgSO4, KH2PO4, NaHCO3, glucose and sucrose.22.The oligonucleotide formulation according to claim 1, wherein the formulation comprises 50-150 mM NaCl, 0.5-5.0 mM KCl, 0.5-5.0 mM MgSO4, 0.4-3.0 mM KH2PO4, 10-50 mM NaHCO3, 1-20 mM glucose, and 1-10 mM sucrose.23.The oligonucleotide formulation according to claim 1, wherein the formulation comprises 124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.0 mM MgSO4, 1.25 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose, and 4 mM sucrose.24.The oligonucleotide formulation according to claim 1, wherein the formulation comprises ingredients selected from the solution groups of A1, B1, A2, B2, A3, B3, A4, B4, A5 and B5, as listed in Table 17, Table 18, Table 19, Table 20 and Table 21.25.The oligonucleotide formulation according to claim 1, wherein the oligonucleotide in the oligonucleotide formulation targets SOD1 gene; and / orwherein the oligonucleotide in the oligonucleotide formulation targets FUS gene; and / orwherein the oligonucleotide in the oligonucleotide formulation targets genes selected from the group consisting of C9orf72, MAPT (Tau) , APP, SMN2, SCN9A, SCN10A, HTT, p21, UTRN, DUX4, SNCA, ATXN1, ATXN2, ATXN3, SCA1, SCA7, SCA8, UCP1, VEGFA, MeCP2, PRNP, DMPK, TARDBP, and TTR.26.The oligonucleotide formulation according to claim 1, wherein the oligonucleotide in the oligonucleotide formulation comprises one or more oligonucleotide strands or strand pairs in the oligonucleotide substances of Table 1 and / or Table 12; and / orwherein the oligonucleotide in the oligonucleotide formulation comprises one or more oligonucleotide strands or strand pairs having the sequences as shown in one or more of SEQ ID NOs: 1-15.27.The oligonucleotide formulation according to claim 25, wherein the oligonucleotide formulation has a calcium concentration ranged from 20 mM to 100 mM; and / orwherein the oligonucleotide formulation has an osmotic pressure in a range from 280 mOsmol / kg to 320 mOsmol / kg; and / orwherein the oligonucleotide formulation is an isosmotic solution.28.The oligonucleotide formulation according to any of claim 1-27, wherein the formulation is in a form suitable for administration route selected from subcutaneous injection, intravenous injection, intraocular injection, intradermal injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intratracheal administration, intraadiposal administration, intraarticular administration, intrathecal administration, epidural administration, inhalation, intranasal administration, oral administration, sublingual administration, buccal administration, rectal administration, vaginal administration, intracisternal administration, transdermal administration and topical administration, or administration via local delivery.29.A method of preparing the oligonucleotide formulation of any of claims 1-28 comprising:combining the oligonucleotide substance with a calcium-containing substance in a solution to form the oligonucleotide formulation.30.The method of claim 29, wherein calcium is provided by calcium salt, such as calcium chloride (CaCl2) , calcium gluconate, calcium lactate, calcium bicarbonate, calcium dihydrogen phosphate, calcium hydrogen phosphate.31.The method of claim 29, wherein calcium is contained in aCSF for dissolving the  oligonucleotide substance; and / orcalcium is incorporated to the solution by exchanging sodium in a solution comprising the oligonucleotide substance with calcium; and / orwherein when the oligonucleotide substance is a non-conjugated oligonucleotide, and the calcium concentration in the formulation is from 15 mM to less than 25 mM; orwherein when oligonucleotide substance is a conjugated oligonucleotide, the concentration of calcium in the oligonucleotide formulation rangs from 15 mM to 150 mM.32.The method of claim 29, wherein the formulation is prepared by adding CaCl2 in aCSF solution, and dissolving oligonucleotide substance in the CaCl2 containing aCSF solution.33.A product comprising the oligonucleotide formulation of any of claims 1-28.34.The product of claim 33, wherein the product is a medicament, a vaccine, a diagnostic product, an imaging product, or a kit.35.Use of the oligonucleotide formulation of any of claims 1-28 in the manufacturing of a product for treatment, prevention, or detection of a disease or disorder in a subject.36.A method for treatment, prevention or detection of a disease or disorder in a subject in need thereof comprising administering the oligonucleotide formulation of any of claims 1-28 in a treatment, prevention, or detection effective amount to the subject.37.The oligonucleotide formulation of any of claims 1-28 for treatment, prevention, or detection of a disease or disorder in a subject.38.The use of claim 35, the method of 36, or the oligonucleotide formulation for use of claim 37, wherein the oligonucleotide formulation has reduced in vivo acute toxicity as compared to a reference oligonucleotide formulation without the presence of calcium in defined concentration range.39.The use of claim 35, the method of 36, or the oligonucleotide formulation for use of claim 37, wherein the oligonucleotide formulation has reduced in vivo acute toxicity as compared to a reference oligonucleotide formulation without the presence of calcium in defined concentration range, and wherein the in vivo acute toxicity is the toxicity to the somatic motor nervous system; and / orwherein the oligonucleotide formulation is for acting on somatic motor nervous system; and / orwherein the oligonucleotide formulation is for acting on central nervous system (CNS) ; and / orthe acute toxicity is a CNS acute toxicity.40.The use of claim 35, the method of 36, or the oligonucleotide formulation for use of claim 37, wherein the subject is in needs of a medicament for the treatment of the disease or disorder, a vaccine for prevention of the disease or disorder, a diagnostic product for diagnosis of the disease or disorder, and an imaging product for imaging site (s) of the disease or disorder.41.The use of claim 35, the method of 36, or the oligonucleotide formulation for use of claim 37, wherein the disease or disorder is selected from cerebral disease, myelopathy, and  peripheral neuropathy.42.The use of claim 35, the method of 36, or the oligonucleotide formulation for use of claim 37, wherein the oligonucleotide targets genes selected from the group consisting of SOD1, FUS, C9orf72, MAPT (Tau) , APP, SMN2, SCN9A, SCN10A, HTT, p21, UTRN, DUX4, SNCA, ATXN1, ATXN2, ATXN3, SCA1, SCA7, SCA8, UCP1, VEGFA, MeCP2, PRNP, DMPK, TARDBP, and TTR.43.The use of claim 35, the method of 36, or the oligonucleotide formulation for use of claim 37, wherein the disease or disorder is selected from spinal muscular atrophy (SMA) , Duchenne and Becker muscular dystrophy (DMD &BMD) , amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , Alzheimer disease (AD) , Parkinson disease (PD) , Huntington's disease (HD) , multiple sclerosis (MS) , brain tumors, frontotemporal dementia, spinocerebellar, prion, lafora, migraine, schizophrenia, depression, pain, and apoplexy.

Images