Proteins and uses thereof

Abstract

Provided are Nef proteins and Nef fusion proteins, and methods of use thereof. Also provided are engineered cells (e.g., CAR-T cells) with reduced endogenous TCR levels, particularly engineered cells that overexpress the Nef protein or the Nef fusion protein.

Description

PROTEINS AND USES THEREOF

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims benefit of priority of International Patent Application No. PCT / CN2023 / 106325 filed on July 7, 2023, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0003] SUBMISSION OF SEQUENCE LISTING ON XML FILE

[0004] The content of the following submission on XML file is incorporated herein by reference in its entirety: a computer readable form (CRF) of the Sequence Listing (file name: IEC240352PCT SEQUENCE LISTING. XML, date recorded: July 4, 2024, size: 38, 569 KB) .TECHNICAL FIELD

[0005] This disclosure relates to proteins for downmodulation of a target and uses thereof. The disclosure also relates to engineered cells (e.g., CAR-T cells) expressing the proteins.BACKGROUND

[0006] Chimeric antigen receptor (CAR) -T cell therapy utilizes genetically modified T cells carrying an engineered receptor specifically recognizing a target tumor antigen to direct T cells to tumor site. It has shown promising results in treating hematological cancer and multiple myeloma (MM) . Nevertheless, due to individual differences, autologous CAR-T or TCR-T therapy (using patient’s own T cells) presents significant challenges in manufacturing and standardization, with extremely expensive cost for manufacturing and treatment. Furthermore, cancer patients usually have lower immune function, with lymphocytes having reduced number, lower immune activity, and hard to expand in vitro.

[0007] Universal allogeneic CAR-T or TCR-T therapy is considered as an ideal model, with T cells derived from healthy donors. However, the key challenge is how to effectively eliminate graft-versus-host disease (GvHD) during treatment due to histoincompatibility. TCR is a cell surface receptor involved in T cell activation in response to antigen presentation. 95%of T cells  in human have TCR consisting of an alpha (α) chain and a beta (β) chain. TCRα and TCRβ chains combine to form a heterodimer and associate with CD3 subunits to form a TCR complex present on the cell surface. GvHD happens when donor’s T cells recognize non-self major histocompatibility complex (MHC) molecules via TCR and perceive host (transplant recipient) tissues as antigenically foreign and attack them. In order to eliminate endogenous TCR from donor T cells thereby preventing GvHD, people have been using gene editing technologies such as Zinc Finger Nuclease (ZFN) , transcription activator-like effector nucleases (TALEN) , and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) -CRISPR associated (Cas) (CRISPR / Cas) for endogenous TCRα or TCRβ gene knockout (KO) , then enriching TCR-negative T cells for allogeneic CAR-T or TCR-T production.

[0008] Nef (Negative Regulatory Factor) is a small 27-35 kDa myristoylated protein encoded by primate lentiviruses. Nef (e.g., SIV Nef) can mediate downmodulation of endogenous T cell receptor (TCR) and can dampen inflammation.SUMMARY

[0009] This disclosure relates to Nef proteins and Nef fusion proteins, and methods of making and use thereof. This disclosure also relates to engineered cells with reduced endogenous TCR levels, particularly engineered cells that overexpress a Nef protein (e.g., a truncated Nef protein) or a Nef fusion protein (e.g., a Nef protein fused to a TRIM21 protein) . The engineered cells may elicit no or reduced graft-versus-host disease (GvHD) response in a histoincompatible individual as compared to the GvHD response elicited by a primary T cell isolated from the donor of the precursor T cell from which the engineered cell is derived.

[0010] In one aspect, the disclosure is related to a non-naturally occurring negative regulatory factor (Nef) protein, comprising a deletion of amino acids 207-223 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof.

[0011] In some embodiments, the non-naturally occurring Nef protein comprises a deletion of amino acids 50-91 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof.

[0012] In some embodiments, the non-naturally occurring Nef protein down-regulates cell surface expression of an endogenous T cell receptor (TCR) .

[0013] In some embodiments, the non-naturally occurring Nef protein consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.

[0014] In one aspect, the disclosure is related to a fusion protein comprising (1) a non-naturally occurring Nef protein and (2) an E3 ubiquitin ligase or fragment thereof.

[0015] In some embodiments, the non-naturally occurring Nef protein comprises a deletion of amino acids 207-223 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof.

[0016] In some embodiments, the non-naturally occurring Nef protein comprises a deletion of amino acids 50-91 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof.

[0017] In some embodiments, the non-naturally occurring Nef protein consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.

[0018] In some embodiments, the E3 ubiquitin ligase or fragment thereof is derived from a Tripartite Motif Containing 21 (TRIM21) protein.

[0019] In some embodiments, the TRIM21 protein is truncated.

[0020] In some embodiments, the TRIM21 protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12.

[0021] In some embodiments, the amino acid sequence of the TRIM21 protein is set forth in SEQ ID NO: 12.

[0022] In some embodiments, the non-naturally occurring Nef protein and the E3 ubiquitin ligase or fragment thereof are connected via a linker.

[0023] In some embodiments, the linker comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

[0024] In some embodiments, the non-naturally occurring Nef protein and the E3 ubiquitin ligase or fragment thereof are directly connected to each other without a linker.

[0025] In some embodiments, the non-naturally occurring Nef protein is N-terminal to the E3 ubiquitin ligase or fragment thereof or C-terminal to the E3 ubiquitin ligase or fragment thereof.

[0026] In some embodiments, the fusion protein comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 6-10, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 6-10.

[0027] In some embodiments, the fusion protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

[0028] In some embodiments, the fusion protein downregulates and / or degrades an endogenous CD3ζ.

[0029] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid comprising a first nucleic acid sequence encoding the non-naturally occurring Nef protein described herein, or the fusion protein described herein.

[0030] In some embodiments, the nucleic acid further comprises a second nucleic acid sequence encoding an engineered receptor.

[0031] In some embodiments, the engineered receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) .

[0032] In some embodiments, the CAR comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14.

[0033] In some embodiments, the nucleic acid further comprises a nucleic acid sequence encoding a protein marker.

[0034] In some embodiments, the protein marker is a mutant dihydrofolate reductase (DHFR) polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

[0035] In some embodiments, the nucleic acid further comprises a nucleic acid sequence encoding an exogenous cytokine or a fragment thereof.

[0036] In some embodiments, the exogenous cytokine or fragment thereof is a membrane-bound subunit beta of interleukin 12 (IL12p40) polypeptide having the amino acid sequence of  SEQ ID NO: 21, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.

[0037] In some embodiments, each nucleic acid sequence is connected via a nucleic acid sequence encoding a cleavable linker.

[0038] In some embodiments, the cleavable linker is P2A or T2A.

[0039] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising the nucleic acid described herein.

[0040] In one aspect, the disclosure is related to an engineered cell comprising the non-naturally occurring Nef protein described herein, the fusion protein described herein, the nucleic acid described herein, or the vector described herein.

[0041] In some embodiments, the engineered cell further comprises an engineered receptor.

[0042] In some embodiments, the engineered receptor is selected from the group consisting of an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , and a T cell antigen coupler (TAC) .

[0043] In some embodiments, the engineered receptor comprises:

[0044] (a) an extracellular ligand binding domain,

[0045] (b) a transmembrane domain, and

[0046] (c) an intracellular signaling domain (ISD) comprising a chimeric signaling domain (CMSD) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16.

[0047] In some embodiments, the engineered receptor further comprises a signal peptide located at the N-terminus of the extracellular ligand binding domain.

[0048] In some embodiments, the extracellular ligand binding domain of the engineered receptor binds to an antigen.

[0049] In some embodiments, the antigen is selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3  (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, EGF1R, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, ADGRE2, FcRH5, NKp80, NKp30, NKG2A, CD229, and CS-1.

[0050] In some embodiments, the engineered receptor is a CAR.

[0051] In some embodiments, the intracellular signaling domain of the CAR further comprises a co-stimulatory signaling domain, and the CAR further comprises a hinge domain located between the C-terminus of the extracellular ligand binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain.

[0052] In some embodiments, the engineered cell comprises a CAR that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14.

[0053] In some embodiments, the engineered cell further comprises a protein marker; optionally the protein marker is a mutant DHFR polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

[0054] In some embodiments, the engineered cell further comprises an exogenous cytokine or a fragment thereof.

[0055] In some embodiments, the exogenous cytokine or fragment thereof is a membrane-bound IL12p40 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.

[0056] In some embodiments, the engineered cell is selected from the group consisting of a T cell, a αβT cell, a γδT cell, a NK cell, a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , a hematopoietic stem cell, a pluripotent stem cell, and an embryonic stem cell.

[0057] In some embodiments, the cell is a T cell.

[0058] In some embodiments, the engineered cell expresses a decreased level of CD3ζ as compared to that in a precursor T cell and / or a decreased level of endogenous T cell receptor (TCR) as compared to that in a precursor T cell.

[0059] In some embodiments, the engineered cell elicits no or reduced graft-versus-host disease (GvHD) response in a histoincompatible individual as compared to the GvHD response  elicited by a primary T cell isolated from the donor of the precursor T cell from which the engineered cell is derived.

[0060] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing an engineered T cell, comprising introducing into a precursor cell the nucleic acid described herein, or the vector described herein.

[0061] In some embodiments, the method further comprising introducing into the precursor cell a second nucleic acid encoding a chimeric antigen receptor (CAR) .

[0062] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition comprising the engineered cell described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0063] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering to the subject in need thereof a therapeutically effective amount of the engineered cell described herein, or the pharmaceutical composition described herein.

[0064] In one aspect, the disclosure is related to a method of downregulating and / or degrading a target protein in a T cell from a subject, comprising introducing into the T cell the nucleic acid described herein, or the vector described herein.

[0065] In some embodiments, the target protein is CD3ζ and / or TCR.

[0066] In one aspect, the disclosure is related to a chimeric antigen receptor (CAR) , comprising:

[0067] (1) an extracellular ligand binding domain that binds to CD20, comprising:

[0068] an LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, an LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, an HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; wherein the CDRs are determined according to the Kabat numbering scheme,

[0069] (2) a transmembrane domain, and

[0070] (3) an intracellular signaling domain (ISD) comprising a chimeric signaling domain (CMSD) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

[0071] In some embodiments, the intracellular signaling domain further comprising a co-stimulatory signaling domain.

[0072] In some embodiments, the extracellular ligand binding domain of the CAR comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.

[0073] In some embodiments, the CAR comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.

[0074] Other features and advantages of the disclosure will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0075] FIG. 1A and FIG. 1B show flow cytometry detection results of TCRαβ (FIG. 1A) and CD3ζ protein (FIG. 1B) expressed by Jurkat cells containing truncated SIV Nef M116. M116-Jurkat, M708-Jurkat, M2237-Jurkat, and M2729-Jurkat cells overexpressed SIV Nef M116, SIV Nef M116 Trun1, SIV Nef M116 Trun2, and SIV Nef M116 Trun3, respectively. “Mock” represents untransduced Jurkat cells, which were used as a control.

[0076] FIG. 2A and FIG. 2B show flow cytometry detection results of TCRαβ (FIG. 2A) and CD3ζ protein (FIG. 2B) expressed in CAR-positive (CAR+) Jurkat cells containing truncated SIV Nef M116-TRIM21 Trun2 fusion proteins. M2268-Jurkat, M2410-Jurkat, M2445-Jurkat, and M2444-Jurkat cells overexpressed SIV Nef M116-TRIM21 Trun2, SIV Nef M116 Trun1-TRIM21 Trun2, SIV Nef M116 Trun2-TRIM21 Trun2, and SIV Nef M116 Trun3-TRIM21 Trun2 fusion proteins, respectively. “Mock” represents untransduced Jurkat cells, which were used as a control.

[0077] FIG. 3A and FIG. 3B show flow cytometry detection results of CD20 CAR (CAR) , TCRαβ, and MB12 (IL12p40) expressed in M2664-T cells containing fusion protein of SIV Nef M116 Trun3 and TRIM21 Trun2. “UnT” represents untransduced T cells that were used as a control.

[0078] FIG. 4A and FIG. 4B show flow cytometry detection results and Western blot detection results of CD3ζ protein expressed in M2664-T, CD3ζ KO-T and UnT cells.

[0079] FIG. 5 shows the killing efficiency of M2664-T cells on CD20-positive lymphoma cell line Raji. Luc at an E: T ratio of 20: 1 or 10: 1.

[0080] FIG. 6 shows selected sequences listed in the present disclosure.DETAILED DESCRIPTION

[0081] The present disclosure relates to a non-naturally occurring Nef protein (also referred to as mutant Nef protein) . The non-naturally occurring Nef protein may be a truncated Nef protein, wherein the truncated Nef protein retains partial or entire function of the wild-type Nef protein and has a smaller size than that of the wild-type Nef protein. When co-expression with a large protein or several proteins is required, the truncated Nef is more advantageous because of its smaller size, for example, the “all-in-one” vector can be easier to transfer into T cells. The truncated Nef protein may be obtained or derived from Simian Immunodeficiency Virus (SIV) Nef isolates. The truncated Nef protein may retain partial or entire function of binding to CD3ζ, and / or downmodulating endogenous TCR. The truncated Nef protein may be obtained by deleting a fragment (e.g., the C-terminal fragment) of the wild-type SIV Nef protein.

[0082] The present disclosure also relates to a fusion protein (i.e., Nef fusion protein) comprising the non-naturally occurring Nef protein of the present disclosure and a E3 ubiquitin ligase or fragment thereof. The present disclosure found that expressing the fusion protein in a cell (e.g., a T cell) can induce a target protein (e.g., CD3ζ) in the cell being specifically degraded. Without being bound by theory, the degradation of CD3ζ triggers downmodulation of the TCR and interfering with TCR-mediated signal transduction such as T cell activation or T cell proliferation. The E3 ubiquitin ligase or fragment thereof may be obtained or derived from TRIM21.

[0083] In one aspect, the present disclosure provides engineered cells overexpressing the non-naturally occurring Nef protein or the Nef fusion protein. The engineered cells can be further engineered to express an engineered receptor, such as engineered TCR (e.g., traditional engineered TCR, chimeric TCR (cTCR) ) , TAC (T cell antigen coupler) , TAC-like chimeric receptor, or CAR (e.g., antibody-based CAR, ligand / receptor-based CAR, or ACTR (antibody-coupled T cell receptor) ) . The engineered receptor can comprise: (a) an extracellular ligand binding domain, (b) a transmembrane domain, and (c) an intracellular signaling domain (ISD) comprising a chimeric signaling domain (CMSD) , wherein the CMSD comprises one or a plurality of ITAMs ( “CMSD ITAMs” ) . At least one of the CMSD ITAMs may be not based on CD3ζ. As a result, the expression of the non-naturally occurring Nef protein or the Nef fusion protein described herein has little to  no effect on the expression of the engineered receptor. However, it is understood that the cells expressing the non-naturally occurring Nef protein or the Nef fusion protein does not need to comprise any engineered receptors, or may comprise an engineered receptor that are not ITAM-modified, e.g., a traditional CAR comprising a CD3ζ ISD.

[0084] In one aspect, the present application provides the prevention or mitigation of graft-versus-host disease (GvHD) related to cell therapies (e.g., CAR-T or CAR-NT therapies) . The present disclosure is based on, in part, the finding that engineered immune cells that overexpress the non-naturally occurring Nef protein or the Nef fusion protein have reduced endogenous TCR levels, and can be used in cell therapies. Using the non-naturally occurring Nef protein or the Nef fusion protein to down-modulate endogenous TCR level may reduce the GvHD, and sustain the anti-tumor activity of adoptive transferred cells. The non-naturally occurring Nef protein or the Nef fusion protein can be overexpressed in adoptive transferred cells, such as chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells.

[0085] In one aspect, the disclosure provides a method to down-modulate endogenous TCR level in an immune cell by overexpressing the non-naturally occurring Nef protein or the Nef fusion protein. In one aspect, the disclosure provides a method of downregulating and / or degrading a target protein (e.g. CD3ζ and / TCR) in a T cell from a subject, by overexpressing the non-naturally occurring Nef protein or the Nef fusion protein set forth herein. In one aspect, the disclosure provides nucleic acids that encode the non-naturally occurring Nef protein and / or the Nef fusion protein.

[0086] As used herein, the term “overexpress” generally refers to any amount greater than or equal to an expression level exhibited by a reference standard. The terms “overexpress, ” “overexpressing, ” “overexpressed” and “overexpression” in the present disclosure refer an expression of a gene product or a polypeptide at a level greater than the expression of the same gene product or polypeptide prior to a genetic alteration of the host cell or in a comparable host which has not been genetically altered at defined conditions. If a host cell does not comprise a given gene product, it is possible to introduce the gene product into the host cell for expression; in this case, any detectable expression is encompassed by the term “overexpression. ”

[0087] As used herein, the term “Nef protein” refers to a polypeptide derived from a wild-type Nef protein, an isoform of Nef protein, or a functional variant thereof. The Nef protein can be a wild-type Nef protein (e.g., SIV Nef, HIV1 Nef, HIV2 Nef, and Nef homologous protein) . The  Nef protein can be a mutant Nef protein (e.g., a non-naturally occurring Nef protein) having one or more mutations (e.g., insertions, deletions, and / or substitutions) . The non-naturally occurring Nef protein can be a mutant SIV Nef. The non-naturally occurring Nef protein can be a truncated Nef protein by deleting one or more fragments in wild-type Nef protein.

[0088] As used herein, the term “Nef fusion protein” refers to a polypeptide that contains a Nef protein (e.g., a non-naturally occurring Nef protein) that is fused to an additional protein. The Nef protein may be fused directly to the additional protein, or can be ligated to the additional protein via a linker. The additional protein may be an E3 ubiquitin ligase or fragment thereof (e.g., a TRIM21 protein) .

[0089] As used herein, the term “TRIM21 protein” refers to a polypeptide derived from a wild-type TRIM21 protein, an isoform of TRIM21 protein, or a functional variant thereof. TRIM21 is a member of the tripartite motif (TRIM) family of RING E3 ubiquitin ligases consisting of an N-terminal RING domain with E3 ubiquitin ligase activity, a B-box domain, a coiled-coil dimerization domain and a C-terminal PRYSPRY domain. It recognizes Fc domain and binds to immunoglobulin G, immunoglobulin A and immunoglobulin M on antibody marked non-enveloped virions which have infected the cell. Either by autoubiquitination or by ubiquitination of a cofactor, it is then responsible for directing the virions to the proteasome, see for example, Zeng, Jingwei et al. “Target-induced clustering activates Trim-Away of pathogens and proteins. ” Nature structural &molecular biology vol. 28, 3 (2021) : 278-289. The TRIM21 protein can be a wild-type TRIM21 protein (e.g., human TRIM21 protein) . The TRIM21 protein can be a mutant TRIM21 protein having one or more mutations (e.g., insertions, deletions, and / or substitutions) . The TRIM21 protein can be a truncated TRIM21 comprising the RING domain.

[0090] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more nucleic acids of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more nucleic acids of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the nucleic acid of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-Atail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the nucleic acid of interest such that the nucleic acid of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector.

[0091] The term “engineered receptor” as used herein, refers to an exogenous receptor (such as CAR (e.g., antibody-based CAR, ligand / receptor-based CAR, or ACTR (antibody-coupled T cell receptor) ) , engineered TCR (e.g., traditional engineered TCR, chimeric TCR (cTCR) ) , T cell antigen coupler (TAC) , or TAC-like chimeric receptor) that retains its biological activity after being introduced into the T cells or engineered cells described herein. The biological activity includes but are not limited to the ability of the engineered receptor in specifically binding to a molecule (e.g., cancer antigen) , properly transducing downstream signals, such as inducing cellular proliferation, cytokine production and / or performance of regulatory or cytolytic effector functions.

[0092] As used herein, the term “chimeric antigen receptor” or “CAR” as used herein refers to genetically engineered receptors, which can be used to graft one or more antigen specificity onto immune effector cells, such as T cells. Some CARs are also known as “artificial T-cell receptors, ” “chimeric T cell receptors, ” or “chimeric immune receptors. ” A CAR may comprise an extracellular ligand binding domain or an extracellular antigen binding domain specific for one or more ligands or antigens (such as tumor antigens) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain. “CAR-T cell” refers to a T cell that expresses a CAR. “CD20 CAR” refers to a CAR having an extracellular binding domain specific for CD20.

[0093] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for autonomous growth. Examples of such cells include cells having an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include cancerous growths, e.g., tumors; oncogenic processes, metastatic tissues, and malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. Also included are malignancies of the various organ systems, such as respiratory, cardiovascular, renal, reproductive, hematological, neurological, hepatic, gastrointestinal, endocrine systems and neuroendocrine tumor (NET) ; as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, small cell lung cancer (SCLC) , large cell neuroendocrine cancer (LCNC) , neuroendocrine prostate cancer (NEPC) , pancreatic neuroendocrine tumor (PNET) , gastrointestinal neuroendocrine cancers, and cancer of the small intestine. Cancer that is “naturally arising” includes any cancer that is not experimentally induced by implantation of cancer cells into a subject, and includes, for example, spontaneously arising cancer, cancer caused by exposure of a patient to a carcinogen (s) , cancer resulting from insertion  of a transgenic oncogene or knockout of a tumor suppressor gene, and cancer caused by infections, e.g., viral infections. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues. The term also includes carcinosarcomas, which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation. The term “hematopoietic neoplastic disorders” includes diseases involving hyperplastic / neoplastic cells of hematopoietic origin. A hematopoietic neoplastic disorder can arise from myeloid, lymphoid or erythroid lineages, or precursor cells thereof.

[0094] The term “down-modulation” when used in the context of a target protein (e.g., endogenous CD3ζ or TCR) in cells refers to down-regulate, reduce, or decrease expression level of the target protein. Down-modulation of a target protein can encompass degradation of the target protein, for example, through ubiquitination pathway. Down-modulation of the target receptors via e.g., internalization, stripping, capping or other forms of changing receptors rearrangements on the cell surface may also be encompassed. Endogenous TCR down-modulation described herein comprises down-regulation of cell surface expression of endogenous TCR (e.g., TCRα and / or TCRβ) , and / or interfering with TCR-mediated signal transduction such as T cell activation or T cell proliferation. Endogenous TCR down-modulation described herein can be induced by the Nef protein binding to CD3ζ. Endogenous TCR down-modulation described herein can be induced by the Nef fusion protein down-regulating the endogenous CD3ζ. The terms “down-modulate” and “down-regulate” are used interchangeably herein.

[0095] The terms “polypeptide” and “peptide” and “protein” are used interchangeably herein and refer to polymers of amino acids of any length. The polymer may be linear or branched, it may comprise modified amino acids, and it may be interrupted by non-amino acids. The terms also encompass an amino acid polymer that has been modified naturally or by intervention; for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation or modification. Also included within the definition are, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid, including but not limited to, unnatural amino acids, as well as other modifications known in the art. It is understood that, because the polypeptides of this disclosure may be based upon antibodies or other members of the  immunoglobulin superfamily, in certain embodiments, a “polypeptide” can occur as a single chain or as two or more associated chains.

[0096] “Percent (%) amino acid sequence identity” and “homology” with respect to a peptide, polypeptide or antibody sequence are defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in the specific peptide or polypeptide sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in various ways that are within the skill in the art, for instance, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or MEGALIGNTM(DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared.

[0097] As used herein, the term “autologous” is meant to refer to any material derived from the same individual to whom it is later to be re-introduced into the individual.

[0098] “Allogeneic” refers to a graft derived from a different individual of the same species.

[0099] The term “transfected” or “transformed” or “transduced” as used herein refers to a process by which exogenous nucleic acid is transferred or introduced into the host cell. A “transfected” or “transformed” or “transduced” cell is one which has been transfected, transformed or transduced with exogenous nucleic acid. The cell includes the primary subject cell and its progeny.

[0100] It is understood that embodiments of the present application described herein include “consisting” and / or “consisting essentially of” embodiments.

[0101] Reference to "about" a value or parameter herein includes (and describes) variations that are directed to that value or parameter per se. For example, description referring to "about X" includes description of "X" .

[0102] The term “about X-Y” used herein has the same meaning as “about X to about Y. ”

[0103] As used herein and in the appended claims, the singular forms "a, " "or, " and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise.

[0104] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure  belongs. Methods and materials are described herein for use in the present disclosure; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0105] Nef protein and Nef fusion protein

[0106] Nef (Negative Regulatory Factor) is a small 27-35 kDa myristoylated protein encoded by primate lentiviruses, including Human Immunodeficiency Viruses (HIV-1 and HIV-2) and Simian Immunodeficiency Virus (SIV) . Nef localizes primarily to the cytoplasm but also partially to the Plasma membrane (PM) and is one of many pathogen-expressed proteins, known as virulence factors, which function to manipulate the host's cellular machinery and thus allow infection, survival or replication of the pathogen.

[0107] T cell receptor (TCR) signaling in response to antigen recognition plays a key role in the immune response and is modulated by numerous viral pathogens. Nef proteins of most SIVs and HIV-2 efficiently prevent T cell activation by removing CD3 and the TCR complex from the cell surface. CD3 is a key component of the TCR complex and essential for intracellular signaling as well as cell surface expression of the TCR complex. Thus, primate lentiviruses capable of downmodulating CD3 prevent the formation of the immunological synapse between virally infected CD4+ T cells and antigen-presenting cells (APCs) and suppress T cell activation.

[0108] A detailed review of Nef protein and its functions can be found in Joas, Simone, et al. "Nef-mediated CD3-TCR downmodulation dampens acute inflammation and promotes SIV immune evasion. " Cell reports 30.7 (2020) : 2261-2274; Laguette, Nadine, et al. "Human immunodeficiency virus (HIV) type-1, HIV-2 and simian immunodeficiency virus Nef proteins. " Molecular aspects of medicine 31.5 (2010) : 418-433, each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0109] The Nef protein may be a wildtype SIV Nef (UniProt Accession No. Q02840) having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The Nef protein may be a mutant having one or more mutations (e.g., insertions, deletions, and / or substitutions) . The mutant Nef protein may comprise an alanine at position 178 and / or an alanine at position 179, relative to the amino acid  position of wildtype SIV Nef. The mutant Nef protein may have an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The mutant Nef protein can have little to no down-modulation effect on CD4 and CD28 expression.

[0110] In one aspect, the present disclosure provides a non-naturally occurring Nef protein. The non-naturally occurring Nef protein may be a truncated Nef protein. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion at C-terminal fragment of wildtype SIV Nef. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 207-223 relative to the amino acid position of wildtype SIV Nef. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 207-223 as numbered in SEQ ID NO: 1 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may consist of amino acids 1-206 as numbered in SEQ ID NO: 1 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion at C-terminal fragment of a mutant Nef. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 207-223 relative to the amino acid position of a mutant Nef. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 207-223 as numbered in SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may consist of amino acids 1-206 as numbered in SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may have an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 4. In some cases, the non-naturally occurring Nef protein has an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. The non-naturally occurring Nef protein can have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations. Each mutation can be a deletion, an insertion, or a substitution. The non-naturally occurring Nef protein may retain partial or entire function of wildtype SIV Nef and has a smaller size than that of wildtype SIV Nef. The non-naturally occurring Nef protein may retain partial or entire function of a mutant Nef having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and has a smaller size than that of the mutant Nef. The non-naturally occurring Nef protein may retain the function of binding to CD3ζ, and / or downmodulating endogenous TCR. The non-naturally occurring Nef protein may have little to no down-modulation effect on CD4 and CD28 expression.

[0111] In one aspect, the present disclosure provides a non-naturally occurring Nef protein. The non-naturally occurring Nef protein may be a truncated Nef protein. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 50-91 relative to the amino acid position of wildtype SIV Nef. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 50-91 as numbered in SEQ ID NO: 1 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may consist of amino acids 1-49 and 92-223 as numbered in SEQ ID NO: 1 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 50-91 relative to the amino acid position of a mutant Nef. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 50-91 as numbered in SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may consist of amino acids 1-49 and 92-223 as numbered in SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may have an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. In some cases, the non-naturally occurring Nef protein has an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. The non-naturally occurring Nef protein can have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations. Each mutation can be a deletion, an insertion, or a substitution. The non-naturally occurring Nef protein may retain partial or entire function of wildtype SIV Nef and has a smaller size than that of wildtype SIV Nef. The non-naturally occurring Nef protein may retain partial or entire function of a mutant Nef having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and has a smaller size than that of the mutant Nef. The non-naturally occurring Nef protein may retain the function of binding to CD3ζ, and / or downmodulating endogenous TCR. The non-naturally occurring Nef protein may have little to no down-modulation effect on CD4 and CD28 expression.

[0112] In one aspect, the present disclosure provides a non-naturally occurring Nef protein. The non-naturally occurring Nef protein may be a truncated Nef protein. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 50-91 and a deletion of amino acids 207-223 relative to the amino acid position of wildtype SIV Nef. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 50-91 and a deletion of amino acids 207-223 as numbered in SEQ ID NO: 1 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may consist of amino acids 1-49 and 92-206 as numbered in SEQ ID NO: 1 or  corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 50-91 and a deletion of amino acids 207-223 relative to the amino acid position of a mutant Nef. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 50-91 and a deletion of amino acids 207-223 as numbered in SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may consist of amino acids 1-49 and 92-206 as numbered in SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may have an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. In some cases, the non-naturally occurring Nef protein has an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. The non-naturally occurring Nef protein can have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations. Each mutation can be a deletion, an insertion, or a substitution. The non-naturally occurring Nef protein may retain partial or entire function of wildtype SIV Nef and has a smaller size than that of wildtype SIV Nef. The non-naturally occurring Nef protein may retain partial or entire function of a mutant Nef having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and has a smaller size than that of the mutant Nef. The non-naturally occurring Nef protein may retain the function of binding to CD3ζ, and / or downmodulating endogenous TCR. The non-naturally occurring Nef protein may have little to no down-modulation effect on CD4 and CD28 expression.

[0113] The Nef protein (e.g., the non-naturally occurring Nef protein) set forth herein may be expressed from an exogenous vector. The Nef protein may be produced in an engineered cell (e.g., a CAR-T cell) by introducing an exogenous vector via lentivirus infection. The Nef protein may be a truncated Nef protein. Comparing to the exogenous vector carrying the full-length Nef protein, that carrying the truncated Nef protein may be smaller in size and easier to transduce into cells. Comparing to the full-length Nef protein, the truncated Nef protein may increase the virus titer of the lentivirus by more than 10%, more than 50%, more than 75%, more than 100%, more than 150%, more than 175%, more than 200%, more than 225%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, or more than 800%. The Nef protein set forth herein may reduce the endogenous TCR level in the engineered cell. The Nef protein may reduce the GvHD.

[0114] In one aspect, the present disclosure provides a Nef fusion protein. The Nef fusion protein may comprise a Nef protein (e.g., the non-naturally occurring Nef protein set forth herein) and an E3 ubiquitin ligase or fragment thereof. The Nef protein and the E3 ubiquitin ligase or fragment thereof may be directly connected to each other without a linker. The Nef protein and the E3 ubiquitin ligase or fragment thereof may be connected to each other via a linker. The linker may comprise an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. The E3 ubiquitin ligase or fragment thereof may be N-terminal to the Nef protein, or C-teriminal to the Nef protein.

[0115] A non-limiting exemplary E3 ubiquitin ligase of the presently disclosed Nef fusion protein is a TRIM21 protein. The TRIM21 protein may be a truncated TRIM21. The TRIM21 protein may be wildtype (wt) or mutant (mut) . The TRIM21 protein may comprise a RING domain from TRIM21. In some cases, the TRIM21 protein has an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12. In some cases, the TRIM21 protein has an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12. The TRIM21 protein can have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations. Each mutation can be a deletion, an insertion, or a substitution.

[0116] In one aspect, the present disclosure provides a Nef fusion protein comprising a Nef protein (e.g., a mutant Nef protein) and a TRIM21 protein. The Nef protein may be a mutant having one or more mutations (e.g., insertions, deletions, and / or substitutions) . The Nef protein may comprise an alanine at position 178 and / or an alanine at position 179, relative to the amino acid position of wildtype SIV Nef. The Nef protein may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. The TRIM21 protein may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12. The Nef fusion protein may have an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some cases, the Nef fusion protein has an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. The Nef fusion protein can have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations. Each mutation can be a deletion, an insertion, or a substitution.

[0117] In one aspect, the present disclosure provides a Nef fusion protein comprising a Nef protein (e.g., a non-naturally occurring Nef protein) and a TRIM21 protein. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 207-223 relative to the amino acid position of wildtype SIV Nef or a mutant thereof. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 207-223 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may consist of amino acids 1-206 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. The TRIM21 protein may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12. The Nef fusion protein may have an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In some cases, the Nef fusion protein has an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. The Nef fusion protein can have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations. Each mutation can be a deletion, an insertion, or a substitution.

[0118] In one aspect, the present disclosure provides a Nef fusion protein comprising a Nef protein (e.g., a non-naturally occurring Nef protein) and a TRIM21 protein. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 50-91 relative to the amino acid position of wildtype SIV Nef or a mutant thereof. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 50-91 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may consist of amino acids 1-49 and 92-223 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 The TRIM21 protein may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12. The Nef fusion protein may have an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. In some cases, the Nef fusion protein has an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. The Nef fusion protein can have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations. Each mutation can be a deletion, an insertion, or a substitution.

[0119] In one aspect, the present disclosure provides a Nef fusion protein comprising a Nef protein (e.g., a non-naturally occurring Nef protein) and a TRIM21 protein. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 50-91and a deletion of amino acids 207-223 relative to the amino acid position of wildtype SIV Nef or a mutant thereof. The non-naturally occurring Nef protein may comprise a deletion of amino acids 50-91 and a deletion of amino acids 207-223 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may consist of amino acids 1-49 and 92-206 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof. The non-naturally occurring Nef protein may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5. The TRIM21 protein may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12. The Nef fusion protein may have an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10. In some cases, the Nef fusion protein has an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10. The Nef fusion protein can have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations. Each mutation can be a deletion, an insertion, or a substitution.

[0120] In some cases, the Nef fusion protein has an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 6-10. In some cases, the Nef fusion protein has an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 6-10. The Nef fusion protein can have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations. Each mutation can be a deletion, an insertion, or a substitution.

[0121] The Nef fusion protein may contain a linker between the Nef protein and the TRIM21 protein. The amino acid sequence can be at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 6-9.

[0122] The Nef fusion protein may contain a Nef protein and a TRIM21 protein that are directly jointed to each other, without a linker. The amino acid sequence can be at least 70%, 80%,  81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 10.

[0123] The Nef fusion protein set forth herein may be expressed from an exogenous vector. The Nef fusion protein may be produced in an engineered cell (e.g., a CAR-T cell) by introducing an exogenous vector via lentivirus infection. The Nef fusion protein may comprise a truncated Nef protein. Comparing to the exogenous vector carrying the full-length Nef protein, that carrying the truncated Nef protein may be smaller in size and easier to transduce into cells. Comparing to the full-length Nef protein, the truncated Nef protein may increase the virus titer of the lentivirus by more than 10%, more than 50%, more than 75%, more than 100%, more than 150%, more than 175%, more than 200%, more than 225%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, or more than 800%. The Nef fusion protein set forth herein may induce the degradation of endogenous CD3ζ and / or reduce the endogenous TCR level in the engineered cell. The Nef fusion protein may reduce the GVHD.

[0124] Also provided are nucleic acids (e.g., isolated nucleic acid) encoding any of the Nef proteins (e.g., non-occurring Nef protein, truncated Nef protein) and / or any of the Nef fusion proteins described herein. Further provided are vectors (e.g., viral vectors such as lentiviral vectors, bacteria expression vectors) comprising a nucleic acid encoding any of the Nef proteins and / or the Nef fusion proteins described herein. These vectors can be replaced with any of the vectors described herein.

[0125] Engineered cells

[0126] In one aspect, the present disclosure provides engineered cells (e.g., engineered immune cells) with down-modulated endogenous TCR levels. In one aspect, the present disclosure provides engineered cells that overexpress a Nef protein and / or a Nef fusion protein.

[0127] In one aspect, the present disclosure provides engineered cells overexpressing the Nef protein and / or the Nef fusion protein described herein. The overexpression of the Nef protein and / or the Nef fusion protein may be controlled by a non-native regulatory element. The non-native regulatory element may be an exogenous promoter. The engineered cells overexpressing the Nef protein and / or the Nef fusion protein described herein can further express an engineered receptor (e.g., CAR) . The engineered cells described herein can express more than one engineered receptor, such as any combination of CAR, TCR, or TAC receptors. The engineered cells may  further comprise a protein marker for screening purposes (e.g., DHFR L22F / F31S) . The engineered cells may further comprise a functional IL12 polypeptide (e.g., a membrane-bound IL12p40 polypeptide) .

[0128] In one aspect, the present disclosure provides an engineered T cell (e.g., allogeneic T cell) comprising the Nef protein and / or the Nef fusion protein described herein, wherein the Nef protein and / or the Nef fusion protein upon expression results in down-modulation of the endogenous TCR (e.g., TCRα and / or TCRβ) in the engineered T cell. The down-modulation comprises down-regulating cell surface expression of endogenous TCR. In some embodiments, the cell surface expression of endogenous TCR is down-regulated by at least about any of 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%or 97%. The expression of endogenous CD3ζ may be down-regulated by at least about any of 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95%. The expression of endogenous CD3ζmay be not down-regulated. The expression of endogenous CD4 and / or CD28 may be down-regulated. The expression of endogenous CD4 and / or CD28 may be not down-regulated. The Nef protein and / or the Nef fusion protein may down-regulate cell surface expression of endogenous TCR, but does not down-modulate engineered receptors (such as engineered TCR (e.g., traditional engineered TCR, chimeric TCR (cTCR) ) , TAC, TAC-like chimeric receptor, or CAR (e.g., antibody-based CAR, ligand / receptor-based CAR, or ACTR) ) . In some embodiments, the engineered receptor (such as engineered TCR (e.g., traditional engineered TCR, chimeric TCR (cTCR) ) , TAC, TAC-like chimeric receptor, or CAR (e.g., antibody-based CAR, ligand / receptor-based CAR, or ACTR) ) is down-modulated by the Nef protein and / or the Nef fusion protein by at most about any of 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, or 5%.

[0129] Examples of suitable non-native regulatory element include a cytomegalovirus (CMV) promoter, a simian virus 40 (SV40) early promoter, a mouse mammary tumor virus (MMTV) or human immunodeficiency virus (HIV) long terminal repeat (LTR) promoter, a MoMuLV promoter, an avian leukemia virus promoter, an Epstein-Barr virus immediate early promoter, a Rous sarcoma virus promoter, the EF-1 alpha promoter, as well as human gene promoters such as, but not limited to, an actin promoter, a myosin promoter, a hemoglobin promoter, and a creatine kinase promoter. Inducible promoters are also contemplated as part of the disclosure. The use of an inducible promoter provides a molecular switch capable of turning on expression of the polynucleotide sequence which it is operatively linked when such expression is desired, or turning off the expression when expression is not desired. Examples of inducible promoters include, but  are not limited to a metallothionine promoter, a glucocorticoid promoter, a progesterone promoter, and a tetracycline promoter.

[0130] The engineered cell overexpressing the Nef protein and / or the Nef fusion protein may have multiple copies of a nucleic acid sequence encoding the Nef protein and / or the Nef fusion protein. The engineered cell may comprise one, two, three, four, five or more copies of the coding sequence of the Nef protein and / or the Nef fusion protein.

[0131] The cell that is to be engineered can be obtained from e.g., humans or non-human animals. The cell that is to be engineered can be obtained from bacteria, fungi, humans, rats, mice, rabbits, monkeys, pig or any other species. For example, the cell can be obtained from humans, rats or mice. The cells may be mouse lymphocytes and engineered (e.g., transduced) to express the Nef protein and / or the Nef fusion protein described herein. The cell may be obtained from humans. The cell may be a blood cell. The cell may be a leukocyte (e.g., a T cell) , lymphocyte or any other suitable blood cell type. The cell may be a peripheral blood cell. The cell may be a tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) . The cell may be a T cell, a B cell, an NKT cell or an NK cell. The cells may be human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) . The human PBMCs may be CD3+ cells. The human PBMCs may be CD8+ cells or CD4+ cells.

[0132] The cell may be a T cell. The T cells may express one or more engineered receptors that recognize a specific antigen on the surface of a target cell. T cells can be obtained by various methods known in the art, e.g., in vitro culture of T cells (e.g., tumor infiltrating lymphocytes) isolated from subjects. Genetically engineered T cells can be obtained by transducing T cells (e.g., isolated from the peripheral blood of subjects) , with a vector, such as the vector provided herein. The T cells may be CD4+ T cells, CD8+ T cells, or regulatory T cells. The T cells may be T helper type 1 T cells and / or T helper type 2 T cells. The T cell may be an αβ-T cell. The T cell expressing this receptor may be a γδ-T cell. The T cells may be central memory T cells. The T cells may be effector memory T cells. The T cells may be T cells.

[0133] The preparation of the engineered immune cells may include one or more culture and / or preparation steps. The cells which are to be engineered can be isolated from a sample, such as a biological sample, e.g., one obtained from or derived from a subject. The subject from which the cell is isolated may have a disease or condition or need a cell therapy or to which cell therapy will be administered. The subject may be a human in need of a particular therapeutic intervention, such as an adoptive cell therapy for which the cells are being isolated, processed, and / or engineered.

[0134] The cells may be stem cells, such as hematopoietic stem cell, embryonic stem cell and pluripotent stem cell, including induced pluripotent stem cells (iPSCs) . The cells can be primary cells, such as those isolated directly from a subject and / or isolated from a subject and frozen. The stem cells may be cultured with additional differentiation factors to obtain desired cell types (e.g., T cells) .

[0135] Different cell types can be obtained via appropriate isolation methods. The isolation methods include the separation of different cell types based on the expression or presence in the cell of one or more specific molecules, such as surface markers, e.g., surface proteins, intracellular markers, or nucleic acid. Any known method for separation based on such markers can be used. The separation may be affinity-or immunoaffinity-based separation. For example, the isolation in some aspects includes separation of cells and cell populations based on the cells’ expression or expression level of one or more markers, typically cell surface markers, for example, by incubation with an antibody or binding partner that specifically binds to such markers, followed generally by washing steps and separation of cells having bound the antibody or binding partner, from those cells having not bound to the antibody or binding partner.

[0136] Such separation steps can be based on positive selection, in which the cells having bound the reagents are retained for further use, and / or negative selection, in which the cells having not bound to the antibody or binding partner are retained. Both fractions may be retained for further use. Negative selection can be particularly useful where no antibody is available that specifically identifies a cell type in a heterogeneous population, such that separation is best carried out based on markers expressed by cells other than the desired population.

[0137] Also provided are methods, nucleic acids, compositions, and kits, for expressing the Nef protein and / or the Nef fusion protein and / or the engineered receptor, and / or for producing the engineered immune cells. The genetic engineering generally involves introduction of a nucleic acid encoding the Nef protein and / or the Nef fusion protein into the cell, such as by retroviral transduction, transfection, or transformation. Gene transfer may be accomplished by first stimulating the cell, such as by combining it with a stimulus that induces a response such as proliferation, survival, and / or activation, e.g., as measured by expression of a cytokine or activation marker, followed by transduction of the activated cells, and expansion in culture to numbers sufficient for clinical application.

[0138] Recombinant nucleic acids may be transferred into cells using recombinant infectious virus particles, such as, e.g., vectors derived from simian virus 40 (SV40) , adenoviruses, adeno-associated virus (AAV) . Recombinant nucleic acids may be transferred into T cells using recombinant lentiviral vectors or retroviral vectors, such as gamma-retroviral vectors. The retroviral vector may have a long terminal repeat sequence (LTR) , e.g., a retroviral vector derived from the Moloney murine leukemia virus (MoMLV) , myeloproliferative sarcoma virus (MPSV) , murine embryonic stem cell virus (MESV) , murine stem cell virus (MSCV) , or spleen focus forming virus (SFFV) . Most retroviral vectors are derived from murine retroviruses. The retroviruses may include those derived from any avian or mammalian cell source. The retroviruses typically are amphotropic, meaning that they are capable of infecting host cells of several species, including humans. The vector may be a lentivirus vector. In certain embodiments, the vector comprises any one of the nucleic acids encoding the Nef protein and / or the Nef fusion protein and / or the engineered receptor described herein. The nucleic acid can be cloned into the vector using any known molecular cloning methods in the art, including, for example, using restriction endonuclease sites and one or more selectable markers. Recombinant nucleic acids may be transferred into T cells via electroporation. Recombinant nucleic acids may be transferred into T cells via transposition. Other methods of introducing and expressing genetic material in immune cells include calcium phosphate transfection, protoplast fusion, cationic liposome-mediated transfection; tungsten particle-facilitated microparticle bombardment and strontium phosphate DNA co-precipitation. Many of these methods are descried e.g., in WO2019195486, which is incorporated herein by reference in its entirety. A T cells may be pre-activated, e.g., using anti-CD3 / CD28 particles, for about 12 hours, about 24 hours, about 36 hours, about 48 hours, or about 60 hours prior to transduction. A transduced T cells may be harvested on day 5, day 6, day 7, day 8, day 9, day 10, day 11, or day 12 post transduction.

[0139] The engineered immune cells may be used to treat various disorder or disease as described herein (e.g., cancer) .

[0140] Comparing to cells that do not overexpress the Nef protein or the Nef fusion protein, the engineered cells overexpressing the Nef protein and / or the Nef fusion protein may have reduced endogenous TCR levels. Comparing to cells that do not overexpress the Nef protein or the Nef fusion protein described herein, the engineered cells overexpressing the Nef protein and / or the  Nef fusion protein described herein may elicit no or reduced graft-versus-host disease (GvHD) response in a histoincompatible individual.

[0141] The engineered cells described herein can be eukaryotic cells, e.g., mammalian cells. The engineered cells can be human cells. The engineered cells can be equine, bovine, murine, ovine, canine, or feline cells. The engineered cells can be modified immune cells. The engineered cells can be T cells. The engineered cells can be NK cells. The engineered cells can be αβ T cells. The engineered cells can be γδ T cells. The engineered cells can be Vδ1 T cells.

[0142] The engineered cells can be autologous cells, syngeneic cells, allogeneic cells, or xenogeneic cells with respect to the individual receiving them. The engineered cells can be modified by changing the major histocompatibility complex (MHC) profile, by inactivating β2-microglobulin to prevent the formation of functional Class I MHC molecules, or by inactivating Class II MHC molecules. The engineered cells can be autologous cells obtained from the human subject receiving them. The engineered cells can be autologous T cells obtained from the human subject receiving them.

[0143] The engineered receptor can be a CAR. The CAR can comprise a polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: a CD8α signal peptide, an extracellular antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a 4-1BB co-stimulatory signaling domain, and a primary intracellular signaling domain. In some embodiments, the CAR is a CD20 CAR. In some cases, the CAR comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14.

[0144] The Nef protein can comprise an amino acid sequence having at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3-5.

[0145] The Nef fusion protein can comprise an amino acid sequence having at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 6-10.

[0146] The engineered cells may overexpress the Nef protein and / or the Nef fusion protein and express a CAR (CAR armored with the Nef protein and / or the Nef fusion protein) . The  engineered cells can be modified CAR-T cells (the Nef protein and / or the Nef fusion protein armored CAR-T cells) .

[0147] The engineered cells may comprise a polypeptide comprising a CAR and a Nef protein. The polypeptide may comprise from the N-terminus to the C-terminus: a Nef protein, a 2A linker, a CD8α signal peptide, an extracellular antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8αtransmembrane domain, a 4-1BB co-stimulatory signaling domain, and a primary intracellular signaling domain.

[0148] The engineered cells may comprise a polypeptide comprising a CAR and a Nef fusion protein. The polypeptide may comprise from the N-terminus to the C-terminus: a Nef fusion protein, a 2A linker, a CD8α signal peptide, an extracellular antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a 4-1BB co-stimulatory signaling domain, and a primary intracellular signaling domain.

[0149] Comparing to cells that do not overexpress the Nef protein or the Nef fusion protein described herein, the engineered cell overexpressing the Nef protein and / or the Nef fusion protein described herein can have reduced endogenous TCR levels. The expression of TCRαβ by the engineered cells can be determined by flow cytometry (FACS) (e.g., following the methods described in Example 1) . The engineered cells can have a TCRαβ positive rate of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The engineered cells can have a TCRαβ positive rate of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. In some cases, the engineered cells have a TCRαβ positive rate of 10%-50%, 10%-40%, or 10%-40%.

[0150] Comparing to cells that do not overexpress the Nef protein or the Nef fusion protein described herein, the engineered cell overexpressing the Nef protein and / or the Nef fusion protein described herein can have reduced endogenous TCR levels. The expression of CD3ζ by the engineered cells can be determined by flow cytometry (FACS) (e.g., following the methods described in Example 1) . The engineered cells can have a CD3ζ positive rate of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%,  more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The engineered cells can have a CD3ζ positive rate of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. In some cases, the engineered cells have a CD3ζ positive rate of 98-100%.

[0151] Comparing to cells that do not overexpress the Nef protein or the Nef fusion protein described herein, the engineered cell overexpressing the Nef protein and / or the Nef fusion protein described herein can have reduced endogenous TCR levels. The expression of TCRαβ by the engineered cells can be determined by flow cytometry (FACS) (e.g., following the methods described in Example 2) . Among CAR-positive cells, the engineered cells may have a TCRαβpositive rate of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. Among CAR-positive cells, the engineered cells may have a TCRαβ positive rate of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. In some cases, among CAR-positive cells, the engineered cells have a TCRαβ positive rate of 1%-10%, 1%-5%, or 3%-5%.

[0152] Comparing to cells that do not overexpress the Nef protein or the Nef fusion protein described herein, the engineered cell overexpressing the Nef protein and / or the Nef fusion protein described herein can have reduced endogenous TCR levels. The expression of CD3ζ by the engineered cells can be determined by flow cytometry (FACS) (e.g., following the methods described in Example 2) . Among CAR-positive cells, the engineered cells may have a CD3ζpositive rate of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. Among CAR-positive cells, the engineered cells may have a CD3ζ positive rate of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. In some cases, among CAR-positive  cells, the engineered cells have a CD3ζ positive rate of 1%-30%, 1%-20%, 10%-20%, or 12%-17%.

[0153] The expression of CAR and the Nef protein and / or the Nef fusion protein by the engineered cells can be determined by flow cytometry (FACS) (e.g., following the methods described in Example 2) . The engineered cells can have a CAR positive rate of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The engineered cells can have a CAR positive rate of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. In some cases, the engineered cells have a CAR positive rate of 20%-50%, 20%-40%, or 25%-40%.

[0154] The Nef protein positive rate and the Nef fusion protein positive rate of the engineered cells can be determined by flow cytometry (FACS) . The engineered cells can have a Nef protein positive rate or a Nef fusion protein positive rate of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The engineered cells can have a Nef protein positive rate or a Nef fusion protein positive rate of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. In some cases, the engineered cells have a Nef protein positive rate or a Nef fusion protein positive rate of 10%-50%, 10%-40%, or 15%-40%.

[0155] The engineered cells can be enriched by cell sorting (e.g., following the methods in Example 3) . After enrichment, the percentage of TCRαβ-negative and CAR-positive cells may be more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. After enrichment, the percentage of TCRαβ-negative and CAR-positive cells may be less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%,  less than 75%, less than 80%, or less than 90%. After enrichment, the percentage of TCRαβ-negative and CAR-positive cells may be 50%-100%, 70%-100%, or 80%-100%.

[0156] The engineered cells can be enriched by cell sorting (e.g., following the methods in Example 3) . After enrichment, the percentage of MB12-positive and CAR-positive cells may be more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. After enrichment, the percentage of MB12-positive and CAR-positive cells may be less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. After enrichment, the percentage of MB12-positive and CAR-positive cells may be 50%-100%, 70%-100%, or 75%-100%.

[0157] The populations of engineered cells, compositions containing such cells and / or enriched for such cells, may make up at least 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more percent of the total cells in the composition or cells of a certain type such as T cells, CD8+ or CD4+ cells.

[0158] After enrichment, the expression of CD3ζ by the engineered cells can be determined by flow cytometry (FACS) (e.g., following the methods described in Example 3) . After enrichment, the engineered cells may have a CD3ζ positive rate of more than 0.1%, more than 1%, more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. After enrichment, the engineered cells may have a CD3ζ positive rate of less than 0.1%, less than 1%, less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. After enrichment, the engineered cells may have a CD3ζ positive rate of 0.1%-10%, 0.1%-5%, 0.1%-2%, or 0.2%-2%.

[0159] After enrichment, the expression of CD3ζ by the engineered cells can be determined by western blot (e.g., following the methods described in Example 3) . After enrichment, the engineered cells may have a CD3ζ positive rate of more than 0.1%, more than 1%, more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%,  more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. After enrichment, the engineered cells may have a CD3ζ positive rate of less than 0.1%, less than 1%, less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. After enrichment, the engineered cells may have a CD3ζ positive rate of 0.1%-10%, 0.1%-5%, 0.1%-2%, or 0.2%-2%.

[0160] The viability of the transduced T cells may be at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, or at least 95%on day 0, day 1, day 2, day 3, day 4, or day 5 post transduction. The viability of the transduced T cells may be at least or about 80%, at least or about 90%, at least or about 100%, at least or about 110%, at least or about 120%as compared to the viability of un-transduced T cells, on day 0, day 1, day 2, day 3, day 4, or day 5 (e.g., on day 5) post transduction.

[0161] The T cell expansion fold may be at least 1 fold, 2 folds, 3 folds, 4 folds, 5 folds, 10 folds, 15 folds, 20 folds, 25 folds, 30 folds, 35 folds, 40 folds, 45 folds, or 50 folds, on day 0, day 1, day 2, day 3, day 4, or day 5 post transduction. The T cell expansion fold of the transduced T cells may be at least or about 50%, at least or about 60%, at least or about 70%, at least or about 80%, at least or about 90%higher as compared to that of un-transduced T cells, on day 0, day 1, day 2, day 3, day 4, or day 5 (e.g., on day 5) post transduction.

[0162] The engineered cells (e.g., CAR-T) may kill tumor cells. The cytotoxicity of the engineered cells against tumor cells (e.g., Raji cells) can be determined by an in vitro cytotoxicity assay (e.g., following the methods described in Example 3) . The engineered cells (e.g., CAR-T cells) may be co-cultured with target cells for at least or about 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours, 16 hours, 18 hours, 1 day, 2 days, 3 days, or longer, such that the engineered cells (e.g., CAR-T cells) can be activated. The effector cell: target cell (E: T) ratio can be 0.3: 1, 0.5: 1, 1: 1, 2: 1, 2.5: 1, 5: 1, 10: 1, or 20: 1. Compared to the un-transduced T cells, the engineered cells may have a cytotoxicity of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, or more than 90%. The cytotoxicity may be specific for the target cells that express a target antigen, for example CD20. The engineered cells may induce little or background  cytotoxicity against target cells which do not express the target antigen (e.g., cells that do not express CD20) .

[0163] The engineered cells may also express a protein marker. The protein marker may be a dihydrofolate reductase (DHFR) protein (e.g., a mutant DHFR protein) . The DHFR protein may have an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. The DHFR protein may serve as a genetic marker specifying trimethoprim resistance (TmpR) .

[0164] The engineered cells may also express an exogenous cytokine or a fragment thereof. The exogenous cytokine or a fragment thereof may be a membrane-bound subunit beta of interleukin 12 (IL12p40) protein. The IL12p40 protein may have an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.

[0165] The cells for engineering can be isolated from a sample, such as a biological sample, e.g., one obtained from or derived from a subject. The subject from which the cell is isolated can be one having the disease or condition or in need of a cell therapy or to which cell therapy will be administered. The subject may be a human in need of a particular therapeutic intervention, such as the adoptive cell therapy for which cells are being isolated, processed, and / or engineered.

[0166] The cells may be primary cells, e.g., primary human cells. The samples may include tissue, fluid, and other samples taken directly from the subject, as well as samples resulting from one or more processing steps, such as separation, centrifugation, genetic engineering (e.g., transduction with viral vector) , washing, and / or incubation. The biological sample may be a sample obtained directly from a biological source or a sample that is processed. Biological samples include, but are not limited to, body fluids, such as blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, synovial fluid, urine and sweat, tissue and organ samples, including processed samples derived therefrom.

[0167] The engineered cells may express a decreased level of CD3ζ as compared to that in a precursor T cell and / or a decreased level of endogenous T cell receptor (TCR) as compared to that in a precursor T cell. The engineered cell may elicit no or reduced graft-versus-host disease (GvHD) response in a histoincompatible individual as compared to the GvHD response elicited by a  primary T cell isolated from the donor of the precursor T cell from which the engineered cell is derived.

[0168] Engineered receptor

[0169] One aspect of the present disclosure provides engineered cells (e.g., immune cells) that overexpress the Nef protein and / or Nef fusion protein described herein and express an engineered receptor. The engineered receptor can comprise an extracellular ligand binding domain or an extracellular antigen binding domain that specifically binds to an antigen (e.g., a tumor antigen) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain. The engineered receptor may comprise a signal peptide located at the N-terminus of the extracellular ligand binding domain. The engineered receptor can be encoded by a heterologous polynucleotide operably linked to a promoter (such as a constitutive promoter or an inducible promoter) . Exemplary engineered receptors include, but are not limited to, chimeric antigen receptor (CAR) , engineered T-cell receptor (TCR) , and T-cell antigen coupler (TAC) receptor.

[0170] The engineered receptor can be monovalent and monospecific. The engineered receptor can be multivalent and monospecific. The engineered receptor can be multivalent and multispecific.

[0171] The engineered receptor can comprise: (a) an extracellular ligand binding domain, (b) a transmembrane domain (e.g., derived from CD8α) , and (c) an intracellular signaling domain (ISD) comprising a chimeric signaling domain (CMSD) . The CMSD may contain one or a plurality signaling motifs known as Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs, or ITAMs. The plurality of ITAMs may be connected by one or more linkers. The plurality of ITAMs may be directly connected to each other. The ITAMs may be derived from a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon Rib) , CD79a, CD79b, Fcgamma R IIa, DAP10, and DAP 12. In some embodiments, the engineered receptor has an intracellular signaling domain derived from CD3ζ. In some embodiments, the engineered receptor does not have any sequence derived from CD3ζ (e.g., human CD3ζ) . In some embodiments, at least one of the ITAMs in the engineered receptor is not derived from CD3ζ. In some embodiments, at least one of the ITAMs in the engineered receptor is not ITAM1 or ITAM2 of CD3ζ. The CMSD may comprise ITAM010 or ITAM045. ITAM010 has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15. ITAM045 has an  amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16. ITAM010 and ITAM045 are disclosed in PCT Application Publication No. WO2021037221, which is incorporated herein in its entirety.

[0172] The antigen of the engineered receptor may be a tumor antigen selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, hTERT, IL-13Rα2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, PD-L2, ADGRE2, FcRH5, NKp80, NKp30, NKG2A, CD229 and other tumor antigens with clinical significance, and combinations thereof. The antigen may be CD20. The tumor antigen can be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen can be expressed on the surface of tumor cells. Many TCRs specific for tumor antigens (including tumor-associated antigens) have been described, including, for example, NY-ESO-1 cancer-testis antigen, the p53 tumor suppressor antigens, TCRs for tumor antigens in melanoma (e.g., MARTI, gp 100) , leukemia (e.g., WT1, minor histocompatibility antigens) , and breast cancer (e.g., HER2, NY-BR1) .

[0173] The engineered receptor described herein can be a chimeric antigen receptor (CAR) . Many chimeric antigen receptors are known in the art and can be suitable for the engineered cells described herein. CARs can also be constructed with a specificity for any cell surface marker by utilizing antigen binding fragments or antibody variable domains of, for example, antibody molecules.

[0174] CARs of the present disclosure may comprise an extracellular domain comprising at least one antigen binding domain that specifically binds at least one tumor antigen, a transmembrane region, and an intracellular signaling domain.

[0175] The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes an immune effector function of the CAR-containing cell, e.g., a CAR-T cell. Immune effector function or immune effector response refers to function or response, e.g., of an immune effector cell, that enhances or promotes an immune attack of a target cell. For example, an immune effector function or response can refer to a property of a T or NK cell that promotes killing or the inhibition of  growth or proliferation, of a target cell. Examples of immune effector function, e.g., in a CAR-T cell, include cytolytic activity (such as antibody-dependent cellular toxicity, or ADCC) and helper activity (such as the secretion of cytokines) . The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes proliferation and / or survival of the CAR containing cell. The signaling domain of a naturally occurring molecule can comprise the entire intracellular or cytoplasmic portion, or the entire native intracellular signaling domain, of the molecule, or a fragment or derivative thereof.

[0176] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise one or more (such as any of 1, 2, 3, or more) co-stimulatory signaling domains. “Co-stimulatory signaling domain” can be the intracellular portion of a co-stimulatory molecule. The term “co-stimulatory molecule” refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as T cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival. Co-stimulatory molecules are cell surface molecules other than antigen receptors or their ligands that contribute to an efficient immune response. A co-stimulatory molecule can be represented in the following protein families: TNF receptor proteins, Immunoglobulin-like proteins, cytokine receptors, integrins, signaling lymphocytic activation molecules (SLAM proteins) , and activating NK cell receptors. Co-stimulatory molecules include, but are not limited to an MHC class I molecule, BTLA and a Toll ligand receptor, as well as OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a / CD18) , ICOS (CD278) , and 4-1BB (CD137) . Further examples of such co-stimulatory molecules include CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE / RANKL, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG / Cbp, CD19a, and a ligand that specifically binds with CD83.

[0177] The CAR can comprise a single co-stimulatory signaling domain. The CAR can comprise two or more co-stimulatory signaling domains. The intracellular signaling domain can  comprise a functional primary intracellular signaling domain (e.g., a chimeric signaling domain (CMSD) set forth herein) and one or more co-stimulatory signaling domains. The CAR may not comprise a functional primary intracellular signaling domain (such as CD3ζ) . The CAR can comprise an intracellular signaling domain consisting of or consisting essentially of one or more co-stimulatory signaling domains. The CAR can comprise an intracellular signaling domain consisting of or consisting essentially of a nonfunctional or attenuated primary intracellular signaling domain (such as a mutant CD3ζ) and one or more co-stimulatory signaling domains. Upon binding of the antigen binding domain to tumor antigen, the co-stimulatory signaling domains of the CAR can transduce signals for enhanced proliferation, survival and differentiation of the modified immune cells having the CAR (such as T cells) , and inhibit activation induced cell death. The one or more co-stimulatory signaling domains can be derived from one or more molecules selected from the group consisting of CD27, CD28, 4-1BB (i.e., CD137) , OX40, CD30, CD40, CD3, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 and ligands that specially bind to CD83.

[0178] The antigen binding domain of a CAR may comprise one or more (such as any one of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more) antibodies or antibody fragments, which can be selected from an scFv, a Fv, a Fab, a (Fab′) 2, a minibody, a diabody, a single domain antibody (sdAb) , or a VHH domain. The antigen binding domain of a CAR can comprise a ligand or an extracellular portion of a receptor that specifically binds to a tumor antigen. The CAR can be a monospecific, bispecific or multispecific CAR. The antigen binding domain of a CAR can specifically bind to a single tumor antigen. The antigen binding domain of a CAR can bind to two or more tumor antigens. The engineered receptor (e.g., CAR) may redirect the specificity of the engineered cells through the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) or TCR on these cells.

[0179] The transmembrane region of a CAR comprises a transmembrane region can be selected from the transmembrane region of an alpha, beta or zeta chain of a T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , CD160, CD19, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) ,  SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, and / or NKG2C. The transmembrane domain of the CAR can be a CD4, CD3, CD8α, or CD28 transmembrane domain. The transmembrane region of the CAR can comprise a CD8αtransmembrane domain.

[0180] The extracellular domain can be connected to the transmembrane domain by a hinge domain. The hinge domain can be a hinge domain of CD8α.

[0181] The CAR can also comprise a signal peptide (SP) , such as a CD8α signal peptide.

[0182] Many CARs targeting different tumor antigens have been widely disclosed in the field, such as CD19 CARs or BCMA CARs. The extracellular antigen binding domain of CD19 CARs can be or include the CD19 binding fragment (e.g., FMC63, SJ25C1, or those disclosed in different patents such as WO 2022 / 012683, etc) . BCMA CARs also have been well described, related patents include but not limited to WO 2016 / 014789, WO 2016 / 014565, WO 2013 / 154760, and WO 2018 / 028647, etc. The extracellular antigen binding domain of BCMA CARs may be or include BCMA binding fragment. The BCMA binding fragment may bind to one or more epitopes on BCMA. The BCMA CARs may be bivalent CARs comprising two anti-BCMA sdAbs targeting same or different BCMA epitopes.

[0183] The CAR can be a CD20 CAR. The CD20 CAR may be monospecific. The CD20 CAR may be bispecific or bivalent. The extracellular antigen binding domain of CD20 CAR may be or include one or more CD20 binding moiety. The CD20 binding moiety may bind to one or more epitopes on CD20. The CD20 CAR may be bivalent CARs comprising two anti-CD20 sdAbs (e.g., VHH domains) targeting same or different CD20 epitopes. A wide variety of antigen binding domain sequences can be used as the antigen binding domain of the CD20 CAR.

[0184] The CD20 CAR can comprise from the N-terminus to the C-terminus: a CD8α signal peptide, an extracellular antigen binding domain comprising an anti-CD20 scFv, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a 4-1BB co-stimulatory signaling domain, and a primary intracellular signaling domain. The anti-CD20 scFv can comprise a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18.

[0185] The CD20 CAR may comprise an anti-CD20 scFv that comprises a HCDR1 (heavy chain CDR1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 or a variant thereof comprising up to about 3 amino acid substitutions, a HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 or a variant thereof comprising up to about 3 amino acid substitutions, and a HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or a variant thereof comprising up to about 3 amino acid substitutions, and a LCDR1 (light chain CDR1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 or a variant thereof comprising up to about 3 amino acid substitutions, a LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 or a variant thereof comprising up to about 3 amino acid substitutions, and a LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 or a variant thereof comprising up to about 3 amino acid substitutions. CDR sequences can be determined according to well-known numbering systems. In some embodiments, the CDRs are according to Kabat numbering.

[0186] The primary intracellular signaling domain (e.g., ITAM010, ITAM045) can comprise a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16.

[0187] The CD20 CAR can comprise a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14. The CD20 CAR may specifically bind to CD20-positive tumor cells (e.g., Raji cells) .

[0188] In one aspect, the disclosure provides a CAR comprising (1) an extracellular ligand binding domain that binds to CD20, comprising: an LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, an LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, an HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, (2) a transmembrane domain, and (3) an intracellular signaling domain (ISD) comprising a chimeric signaling domain (CMSD) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

[0189] The engineered receptor can be a modified T-cell receptor or engineered T-cell receptor. The engineered TCR can be specific for any tumor antigen set forth herein. Any of the TCRs  known in the art can be used. The TCR can have an enhanced affinity to the tumor antigen. Exemplary TCRs and methods for introducing the TCRs to immune cells have been described, for example, in U.S. Pat. No. 5,830,755, and Kessels et al. Immunotherapy through TCR gene transfer. Nat. Immunol. 2, 957-961 (2001) , which are incorporated herein by reference in the entirety.

[0190] The TCR receptor complex is an octomeric complex formed by variable TCR receptor α and β chains (or γ and δ chains on case of γδ T cells) with three dimeric signaling modules CD3δ / ε, CD3γ / ε and CD247 (T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain) ζ / ζ or ζ / η. Ionizable residues in the transmembrane region of each subunit form a polar network of interactions that hold the complex together. TCR complex has the function of activating signaling cascades in T cells.

[0191] The engineered receptor can be an engineered TCR comprising one or more T-cell receptor (TCR) fusion proteins (TFPs) . Exemplary TFPs have been described, for example, in US20170166622A1, which is incorporated herein by reference in its entirety. The TFP can comprise an extracellular domain of a TCR subunit that comprises an extracellular domain or portion thereof of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications. The TFP can comprise a transmembrane region that comprises a transmembrane region of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications. The TFP can comprise a transmembrane region that comprises a transmembrane region of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a TCR zeta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications.

[0192] The TFP can comprise a TCR subunit comprising at least a portion of a TCR extracellular domain, and a TCR intracellular domain comprising a stimulatory domain from an intracellular signaling domain of CD3 epsilon; and an antigen binding domain, wherein the TCR  subunit and the antigen binding domain are operatively linked, and wherein the TFP incorporates into a TCR when expressed in a T cell.

[0193] The engineered receptor can be a T-cell antigen coupler (TAC) receptor. Exemplary TAC receptors have been described, for example, in US20160368964A1, which is incorporated herein by reference. The TAC can comprise an antigen binding domain, a TCR-binding domain that specifically binds a protein associated with the TCR complex, and a T-cell receptor signaling domain. The antigen binding domain can be an antibody fragment, such as scFv or VHH, which specifically binds to a tumor antigen. The antigen binding domain can be a designed Ankyrin repeat (DARPin) polypeptide. The tumor antigen can be any of the antigens set forth herein. The protein associated with the TCR complex can be CD3, such as CD3E. The TCR-binding domain can be a single chain antibody, such as scFv, or a VHH. The TCR-binding domain can be derived from UCHT1. The TAC receptor can comprise a cytosolic domain and a transmembrane region. The T-cell receptor signaling domain can comprise a cytosolic domain derived from a TCR co-receptor. Exemplary TCR co-receptors include, but are not limited to, CD4, CD8, CD28, CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 and CD 154. The TAC receptor can comprise a transmembrane region and a cytosolic domain derived from CD4. The TAC receptor can comprise a transmembrane region and a cytosolic domain derived from CD8 (such as CD8α) .

[0194] T cell co-receptors are expressed as membrane proteins on T cells. They can provide stabilization of the TCR: peptide: MEC complex and facilitate signal transduction. The two subtypes of T cell co-receptor, CD4 and CD8, display strong specificity for particular MEC classes. The CD4 co-receptor can only stabilize TCR: MEC II complexes while the CD8 co-receptor can only stabilize the TCR: MEC I complex. The differential expression of CD4 and CD8 on different T cell types results in distinct T cell functional subpopulations. CD8+ T cells are cytotoxic T cells.

[0195] The engineered receptor (such as CAR, engineered TCR, or TAC) can target one or more tumor antigens. Tumor antigens are proteins that are produced by tumor cells that can elicit an immune response, particularly T-cell mediated immune responses. The selection of the targeted antigen will depend on the particular type of cancer to be treated. Exemplary tumor antigens include, for example, a glioma-associated antigen, carcinoembryonic antigen (CEA) , β-human chorionic gonadotropin, alphafetoprotein (AFP) , lectin-reactive AFP, thyroglobulin, RAGE-1, MN-CAIX, human telomerase reverse transcriptase, RU1, RU2 (AS) , intestinal carboxyl esterase,  mut hsp70-2, M-CSF, prostase, prostate-specific antigen (PSA) , PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, prostein, PSMA, HER2 / neu, survivin and telomerase, prostate-carcinoma tumor antigen-1 (PCTA-1) , MAGE, ELF2M, neutrophil elastase, ephrinB2, CD22, insulin growth factor (IGF) -I, IGF-II, IGF-I receptor and mesothelin.

[0196] The tumor antigen can comprise one or more antigenic cancer epitopes associated with a malignant tumor. Malignant tumors express a number of proteins that can serve as target antigens for an immune attack. These molecules include but are not limited to tissue-specific antigens such as MART-1, tyrosinase and gp100 in melanoma and prostatic acid phosphatase (PAP) and prostate-specific antigen (PSA) in prostate cancer. Other target molecules belong to the group of transformation-related molecules such as the oncogene HER2 / Neu / ErbB-2. Yet another group of target antigens are onco-fetal antigens such as carcinoembryonic antigen (CEA) . In B-cell lymphoma the tumor-specific idiotype immunoglobulin constitutes a truly tumor-specific immunoglobulin antigen that is unique to the individual tumor. B cell differentiation antigens such as CD 19, CD20 and CD37 are other candidates for target antigens in B-cell lymphoma.

[0197] The tumor antigen can be a tumor-specific antigen (TSA) or a tumor-associated antigen (TAA) . A TSA is unique to tumor cells and does not occur on other cells in the body. A TAA associated antigen is not unique to a tumor cell, and instead is also expressed on a normal cell under conditions that fail to induce a state of immunologic tolerance to the antigen. The expression of the antigen on the tumor can occur under conditions that enable the immune system to respond to the antigen. TAAs can be antigens that are expressed on normal cells during fetal development, when the immune system is immature, and unable to respond or they can be antigens that are normally present at extremely low levels on normal cells, but which are expressed at much higher levels on tumor cells.

[0198] Non-limiting examples of TSA or TAA antigens include the following: Differentiation antigens such as MART-1 / MelanA (MART-I) , gp 100 (Pmel 17) , tyrosinase, TRP-1, TRP-2 and tumor-specific multilineage antigens such as MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; overexpressed embryonic antigens such as CEA; overexpressed oncogenes and mutated tumor-suppressor genes such as p53, Ras, HER2 / neu; unique tumor antigens resulting from chromosomal translocations; such as BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; and viral antigens, such as the Epstein Barr virus antigens EBVA and the human papillomavirus (HPV) antigens E6 and E7. Other large, protein-based antigens include TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6,  RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenin, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alpha-fetoprotein, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB / 70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2 binding protein\cyclophilin C-associated protein, TAAL6, TAG72, TLP, and TPS.

[0199] Nucleic acids

[0200] The present disclosure provides (i) nucleic acids encoding the Nef protein and / or the Nef fusion protein, and (ii) nucleic acids encoding an engineered receptor (e.g., CAR, TAC or engineered TCR) . The nucleic acids of the present disclosure can comprise a nucleic acid sequence encoding any one of the Nef protein, the Nef fusion protein, and / or the engineered receptor disclosed herein. The nucleic acid can encode both (1) a Nef protein or a Nef fusion protein and (2) a CAR. The nucleic acid may comprise one, two, three, four, five or more copies of the coding sequence of the Nef protein and / or the Nef fusion protein. The expression of the Nef protein and / or the Nef fusion protein may be controlled by a non-native regulatory element.

[0201] A nucleic acid of the present disclosure may comprise a first nucleic acid sequence and a second nucleic acid sequence. The first nucleic acid may be upstream of the second nucleic acid or the first nucleic acid may be downstream of the second nucleic acid. The first and second nucleic acid sequence can be separated by a linker. A linker for use in the present disclosure allows for multiple proteins to be encoded by the same nucleic acid sequence (e.g., a multicistronic or bicistronic sequence) , which are translated as a polyprotein that is dissociated into separate protein components. The nucleic acid may comprise from 5'end to 3'end of the first nucleic acid sequence, the linker, and the second nucleic acid sequence. The nucleic acid may comprise from 5'end to 3'end the second nucleic acid sequence, the linker, and the first nucleic acid sequence. The first nucleic acid sequence may encode the Nef protein and / or the Nef fusion protein described herein and the second nucleic acid sequence may encode a CAR described herein.

[0202] The linker may comprise a nucleic acid sequence that encodes for an internal ribosome entry site (IRES) . As used herein, “an internal ribosome entry site” or “IRES” refers to an element that promotes direct internal ribosome entry to the initiation codon, such as ATG, of a protein coding region, thereby leading to cap-independent translation of the gene. Various internal  ribosome entry sites are known to those of skill in the art, including, without limitation, IRES obtainable from viral or cellular mRNA sources, e.g., immunogloublin heavy-chain binding protein (BiP) ; vascular endothelial growth factor (VEGF) ; fibroblast growth factor 2; insulin-like growth factor; translational initiation factor eIF4G; yeast transcription factors TFIID and HAP4; and IRES obtainable from, e.g., cardiovirus, rhinovirus, aphthovirus, HCV, Friend murine leukemia virus (FrMLV) , and Moloney murine leukemia virus (MoMLV) . Those of skill in the art would be able to select the appropriate IRES.

[0203] The linker may comprise a nucleic acid sequence that encodes for a self-cleaving peptide. As used herein, a “self-cleaving peptide” or “2A linker” refers to an oligopeptide that allow multiple proteins to be encoded as polyproteins, which dissociate into component proteins upon translation. Use of the term “self-cleaving” is not intended to imply a proteolytic cleavage reaction. Various self-cleaving or 2A linkers are known to those of skill in the art, including, without limitation, those found in members of the Picornaviridae virus family, e.g., foot-and-mouth disease virus (FMDV) , equine rhinitis A virus (ERAV0, Thosea asigna virus (TaV) , and porcine tescho virus-1 (PTV-1) ; and carioviruses such as Theilovirus and encephalomyocarditis viruses. 2A linkers derived from FMDV, ERAV, PTV-1, and TaV are referred to herein as “F2A, ” “E2A, ” “P2A, ” and “T2A, ” respectively.

[0204] The P2A linker may have a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. The T2A linker may have a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23.

[0205] Various linker sequences are known in the art, including, without limitation, glycine serine (GS) spacers (also known as GS linkers) such as (GS) n, (SG) n, (GSGGS) n and (GGGS) n, where n represents an integer of at least 1. Exemplary linker sequences can comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

[0206] A nucleic acid of the present disclosure may a restriction enzyme site sequence.

[0207] A nucleic acid of the present disclosure can be operably linked to a transcriptional control element, e.g., a promoter, and enhancer, etc.

[0208] The promoter may be a CD8 cell-specific promoter, a CD4 cell-specific promoter, a neutrophil-specific promoter, or an NK-specific promoter. For example, a CD4 gene promoter can be used; see, e.g., Salmon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 7739; and Marodon et al. (2003) Blood 101: 3416. As another example, a CD8 gene promoter can be used. NK cell-specific expression can be achieved by use of an NcrI (p46) promoter; see, e.g., Eckelhart et al. Blood (2011) 117: 1565.

[0209] Other examples of suitable promoters include the immediate early cytomegalovirus (CMV) promoter sequence. This promoter sequence is a strong constitutive promoter sequence capable of driving high levels of expression of any nucleic acid sequence operatively linked thereto. Other constitutive promoter sequences can also be used, including, but not limited to a simian virus 40 (SV40) early promoter, a mouse mammary tumor virus (MMTV) or human immunodeficiency virus (HIV) long terminal repeat (LTR) promoter, a MoMuLV promoter, an avian leukemia virus promoter, an Epstein-Barr virus immediate early promoter, a Rous sarcoma virus promoter, the EF-1 alpha promoter, as well as human gene promoters such as, but not limited to, an actin promoter, a myosin promoter, a hemoglobin promoter, and a creatine kinase promoter. Further, the disclosure should not be limited to the use of constitutive promoters. Inducible promoters are also contemplated as part of the disclosure. The use of an inducible promoter provides a molecular switch capable of turning on expression of the nucleic acid sequence which it is operatively linked when such expression is desired, or turning off the expression when expression is not desired. Examples of inducible promoters include, but are not limited to a metallothionine promoter, a glucocorticoid promoter, a progesterone promoter, and a tetracycline promoter.

[0210] The nucleic acid of the present disclosure may be provided for the production of (i) a Nef protein and / or a Nef fusion protein described herein, and / or (ii) a CAR described herein (e.g., in a mammalian cell) . The nucleic acid of the present disclosure may provide for amplification of the nucleic acid.

[0211] A vector, for example an expression vector (e.g., a lentiviral vector) can be used to introduce the nucleic acid described herein into an immune cell (e.g., a T cell) or precursor thereof. The vector (e.g., a lentiviral vector) of the present disclosure may comprise one or more nucleic acids encoding for the Nef protein and / or the Nef fusion protein described herein. The vector (e.g.,  lentiviral vector) may comprise additional elements that will aid in the functional expression of the Nef protein and / or the Nef fusion protein described herein, and / or the CAR described herein. The expression vector may comprise a mammalian promoter. The vector may comprise an elongation-factor-1-alpha promoter (EF-1α promoter) . The use of an EF-1α promoter may increase the efficiency in expression of downstream transgenes (e.g., a CAR encoding nucleic acid) . Physiologic promoters (e.g., an EF-1α promoter) may be less likely to induce integration mediated genotoxicity, and may abrogate the ability of the retroviral vector to transform stem cells. Other physiological promoters suitable for use in a vector (e.g., lentiviral vector) can be incorporated into a vector of the present disclosure. The vector (e.g., lentiviral vector) may comprise a non-requisite cis acting sequence that can improve titers and gene expression.

[0212] The nucleic acid can encode a naked CAR. The nucleic acid can comprise from the 5' end to the 3' end, a CD8α signal peptide, an extracellular antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a 4-1BB co-stimulatory signaling domain, a primary intracellular signaling domain. In some cases, the nucleic acid encodes an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14.

[0213] The nucleic acid can encode (1) a CAR and (2) a Nef protein or a Nef fusion protein. The nucleic acid can comprise from the 5' end to the 3' end, the coding sequences of a Nef protein or a Nef fusion protein, a 2A cleavable linker, and a CAR. The nucleic acid can comprise from the 5' end to the 3' end, the coding sequences of a CAR, a 2A cleavable linker, and a Nef protein or a Nef fusion protein.

[0214] The nucleic acid may also encode a protein marker. The protein marker may be a dihydrofolate reductase (DHFR) protein (e.g., a mutant DHFR protein) . The mutant DHFR protein may have an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

[0215] The nucleic acid may also encode an exogenous cytokine or a fragment thereof. The exogenous cytokine or a fragment thereof may be a membrane-bound subunit beta of interleukin 12 (IL12p40) protein. The IL12p40 protein may have an amino acid sequence that is at least 70%,  80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.

[0216] The nucleic acid sequences encoding the Nef protein, Nef fusion protein, engineered receptor, protein marker, and exogenous cytokine or a fragment thereof, can be connected via one or more nucleic acid sequences encoding a cleavable linker. The cleavable linker can be a P2A linker or a T2A linker.

[0217] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The length of a reference sequence aligned for comparison purposes is at least 80%of the length of the reference sequence, and may be at least 90%, 95%, or 100%. The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0218] Methods of treatment

[0219] The engineered cells (e.g., engineered immune cells) with reduced endogenous TCR levels, particularly the engineered cells overexpressing the Nef protein and / or the Nef fusion protein described herein, can be used in a variety of experimental, therapeutic and commercial applications.

[0220] In one aspect, the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the engineered cell described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0221] In one aspect, the disclosure provides a method of treating a disease or disorder in a subject (e.g., human subject) , the method comprising administering to the subject, an effective  amount of the engineered cell described herein, or the pharmaceutical composition described herein. The disease or disorder may be cancer, an autoimmune disease, or an infection.

[0222] The disease or disorder may be solid tumor. “Solid tumor” refers to an abnormal mass of tissue that usually does not contain cysts or liquid areas. Solid tumors may be benign (not cancer) , or malignant (cancer) . Different types of solid tumors are named for the type of cells that form them. Examples of solid tumors are sarcomas, carcinomas, and lymphomas. Leukemias (cancers of the blood) generally do not form solid tumors.

[0223] In one aspect, the disclosure provides a method of modulating an immune response comprising administering an effective amount of engineered cells described herein to a subject in need thereof.

[0224] The term “effective amount” as used herein means an amount effective, at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired results.

[0225] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating cancer comprising administering an effective amount of engineered cells described herein to a subject in need thereof. Examples of cancer that can be treated include, but are not limited to, small cell lung cancer (SCLC) , large cell neuroendocrine cancer (LCNC) , neuroendocrine prostate cancer (NEPC) , pancreatic neuroendocrine tumor (PNET) , gastrointestinal neuroendocrine cancers, leukemias including chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute myelogenous leukemia, acute lymphoblastic leukemia, and T cell and B cell leukemias, lymphomas (Hodgkin's and non-Hodgkins) , lymphoproliferative disorders, plasmacytomas, histiocytomas, melanomas, adenomas, sarcomas, carcinomas of solid tissues, hypoxic tumors, squamous cell carcinomas, genitourinary cancers such as cervical and bladder cancer, hematopoietic cancers, head and neck cancers, and nervous system cancers.

[0226] The disclosure further includes the use of the engineered cells described herein in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition to modulate an immune response, to treat an infection or to treat cancer as described hereinabove.

[0227] The engineered cells can also be used in experimental models, for example, to further study and elucidate the function of the cells.

[0228] One or more of the engineered cells described herein can be administered to a subject in a single, unified form, such as an intravenous injection, or in multiple forms, for example, as multiple intravenous infusions or injections, or subcutaneous injections. In some cases, the  engineered cells can expand within a subject's body, in vivo, after administration to a subject. The engineered cells can be frozen to provide cells for multiple treatments with the same cell preparation. The engineered cells of the disclosure, and pharmaceutical compositions comprising the same, can be packaged as a kit. A kit can include instructions (e.g., written instructions) on the use of the engineered cells and compositions comprising the same.

[0229] A method of treatment can comprise administering to a subject a therapeutically-effective amount of the engineered cells. The therapeutically-effective amount of the engineered cells may be administered for at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, or 1 year. The therapeutically-effective amount of the engineered cells may be administered for at least one week. The therapeutically-effective amount of the engineered cells may be administered for at least two weeks.

[0230] The engineered cells described herein can be administered before, during, or after the occurrence of a disease or condition, and the timing of administering the engineered cells can vary. For example, the engineered cells can be used as a prophylactic and can be administered continuously to subjects with a propensity to conditions or diseases in order to lessen a likelihood of the occurrence of the disease or condition. The engineered cells can be administered to a subject during or as soon as possible after the onset of the symptoms. The administration of the engineered cells can be initiated immediately within the onset of symptoms, within the first 3 hours of the onset of the symptoms, within the first 6 hours of the onset of the symptoms, within the first 24 hours of the onset of the symptoms, within 48 hours of the onset of the symptoms, or within any period of time from the onset of symptoms. The initial administration can be via any route practical (e.g., intravenous infusions or injections) , such as by any route described herein using any formulation described herein. In some examples, the administration of the engineered cells of the disclosure is an intravenous administration. One or multiple dosages of the engineered cells can be administered as soon as is practicable after the onset of a cancer or an infectious disease, and for a length of time necessary for the treatment of the disease, such as, for example, from about 24 hours to about 48 hours, from about 48 hours to about 1 week, from about 1 week to about 2 weeks, from about 2 weeks to about 1 month, from about 1 month to about 3 months. For the treatment of cancer, one or multiple dosages of the engineered cells can be administered years after onset of the cancer and before or after other treatments. In some examples, the engineered cells can be administered for at least about 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours,  6 hours, 12 hours, 24 hours, at least 48 hours, at least 72 hours, at least 96 hours, at least 1 week, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, at least 1 month, at least 2 months, at least 3 months, at least 4 months, at least 5 months, at least 6 months, at least 7 months, at least 8 months, at least 9 months, at least 10 months, at least 11 months, at least 12 months, at least 1 year, at least 2 years at least 3 years, at least 4 years, or at least 5 years. The length of treatment can vary for each subject.

[0231] Methods for administration of engineered cells for adoptive cell therapy are known and can be used in connection with the provided methods and compositions. For example, adoptive T cell therapy methods are described, e.g., in US Patent Application Publication No. 2003 / 0170238 to Gruenberg et al; US Patent No. 4,690,915 to Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10) : 577-85) . See, e.g., Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10) : 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1) : 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4) : e61338. The cell therapy, e.g., adoptive T cell therapy can be carried out by autologous transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from the subject who is to receive the cell therapy, or from a sample derived from such a subject. Thus, in some aspects, the cells are derived from a subject, e.g., patient, in need of a treatment and the cells, following isolation and processing are administered to the same subject.

[0232] The cell therapy (e.g., adoptive T cell therapy) can be carried out by allogeneic transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from a subject other than a subject who is to receive or who ultimately receives the cell therapy, e.g., a first subject. In such embodiments, the cells then are administered to a different subject, e.g., a second subject, of the same species. The first and second subjects may be genetically identical. The first and second subjects may be genetically similar. The second subject may express the same HLA class or supertype as the first subject.

[0233] The subject (e.g., human subject) may have been treated with a therapeutic agent targeting the disease or condition, e.g., the tumor, prior to administration of the cells or composition containing the cells. The subject may be refractory or non-responsive to the other therapeutic agent. The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogenic HSCT. In some cases, the administration can effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0234] The subject may be responsive to the other therapeutic agent, and treatment with the therapeutic agent reduces disease burden. The subject may be initially responsive to the therapeutic agent, but exhibits a relapse of the disease or condition over time. The subject may have not relapsed. The subject may be determined to be at risk for relapse, such as at a high risk of relapse, and thus the cells are administered prophylactically, e.g., to reduce the likelihood of or prevent relapse. The subject may has not received prior treatment with another therapeutic agent.

[0235] The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogenic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0236] The engineered cells described herein can be administered to an animal, such as a mammal, even more a human, to treat a cancer. In addition, the engineered cells can be used for the treatment of any condition related to a cancer, especially a cell-mediated immune response against a tumor cell (s) , where it is desirable to treat or alleviate the disease.

[0237] The engineered cells (e.g., immune cells, T cells, or NK cells) described herein can be included in a composition for immunotherapy. The composition can include a pharmaceutical composition and further include a pharmaceutically acceptable carrier. A therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition comprising the engineered cells can be administered.

[0238] The engineered cells can be immediately used in the above therapeutic, experimental or commercial applications or the cells can be cryopreserved for use at a later date. The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration.

[0239] The engineered cells disclosed herein can be formulated in unit dosage forms suitable for single administration of precise dosages. The unit dosage forms may comprise additional lymphocytes. In unit dosage form, the formulation is divided into unit doses containing appropriate quantities of one or more compounds. The unit dosage can be in the form of a package containing discrete quantities of the formulation. Non-limiting examples are packaged tablets or capsules, and powders in vials or ampoules. Aqueous suspension compositions can be packaged in single-dose non-reclosable containers. Multiple-dose reclosable containers can be used, for example, in combination with a preservative or without a preservative. The pharmaceutical composition may  not comprise a preservative. Formulations for parenteral injection can be presented in unit dosage form, for example, in ampoules, or in multi-dose containers with a preservative.

[0240] EXAMPLES

[0241] The disclosure is further described in the following examples, which do not limit the scope of the disclosure described in the claims.

[0242] Example 1. Regulation of TCRαβ and CD3ζ protein expression by the truncated SIV Nef M116

[0243] As an exemplary Nef protein in the present disclosure, SIV Nef M116 is a mutant SIV Nef protein with a mutant SIV Nef “di-leucine based AP recruitment domain. ” The amino acid sequence of wildtype SIV Nef protein is shown in SEQ ID NO: 1. M116 has two amino acid mutations to wildtype SIV Nef protein: L178A and M179A. SIV Nef M116 can effectively down-regulate TCR complex expression on T cell surface, while having very little down-regulation effect on CD4 and CD28 expression. Details of SIV Nef M116 (amino acids 1-223, SEQ ID NO: 2) can be found, e.g., in PCT Application Publication No. WO2020020359, which is incorporated herein by reference in its entirety. Full-length SIV Nef M116 protein was truncated to obtain SIV Nef M116 Trun1 (delete amino acids 50-91 of SIV Nef M116; SEQ ID NO: 3) , SIV Nef M116 Trun2 (delete amino acids 207-223 of SIV Nef M116; SEQ ID NO: 4) , and SIV Nef M116 Trun3 (delete amino acids 50-91 and 207-223 of SIV Nef M116; SEQ ID NO: 5) .

[0244] 1) Construction of expression plasmids encoding the truncated SIV Nef M116

[0245] The pLVX-Puro plasmid (purchased from Clontech) was digested with ClaI and EcoRI restriction enzymes to remove the CMV promoter, and the human EF1α promoter (GenBank: J04617.1) was cloned into the digested plasmid to obtain the pLVX-hEF1α plasmid.

[0246] A nucleic acid sequence encoding the truncated SIV Nef M116 was cloned downstream of the human EF1α promoter on the expression plasmid pLVX-hEF1α. The truncated SIV Nef M116 was connected with the screening marker protein (Puro; SEQ ID NO: 19) by a self-cleaving peptide T2A (SEQ ID NO: 22) . The corresponding recombinant expression plasmids PLLV-Modified116 ( “M116” for short, encodes SIV Nef M116) , PLLV-Modified708 ( “M708” for short, encodes SIV Nef M116 Trun1) , PLLV-Modified2237 ( “M2237” for short, encodes SIV Nef M116  Trun2) and PLLV-Modified2729 ( “M2729” for short, encodes SIV Nef M116 Trun3) were isolated and mixed with helper plasmids (e.g., psPAX2 and pMD2. G) , to co-transfect HEK 293T cells for lentivirus production. After 60 hours of transfection, cell culture supernatant containing the lentivirus was collected and centrifuged at 4℃, 3000 rpm for 5 minutes. Afterwards, the supernatant was filtered through a 0.45 μm filter, and a 500 KD hollow fiber membrane column tangential flow technology was used to further concentrate the supernatant to prepare the lentivirus concentrate, which was stored at -80℃ for later use.

[0247] 2) Preparation of Jurkat cell line expressing the truncated SIV Nef M116

[0248] Jurkat cells (Human T Lymphocyte Cell, clone E6‐1, ATCC, TIB‐152TM) were cultured in 90%RPMI 1640 medium (Gibco, Cat#: 22400-089) supplemented with 10%fetal bovine serum (FBS, Gibco, Cat#: 10099-141C) . 5 × 106 Jurkat cells were infected with the lentivirus prepared above, and the cell suspension was added to a 10 cm culture dish, which was placed in a 37℃, 5%CO2 incubator for 3 days. On the third day of viral transduction, the culture medium was replaced to include 1 μg / mL puromycin (Gibco, Cat#: A1113803) . The culture was continued for three days for drug resistance screening.

[0249] 3) Detection of TCRαβ and CD3ζ expression by flow cytometry

[0250] Detection of TCRαβ expression by flow cytometry was performed as follows. 3×106 cell suspension was centrifuged at room temperature at 1000 rpm for 1 minute, and supernatant was discarded. Cells were suspended in Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS; Cytiva, Cat#: SH30028.02) , and incubated with 1 μL (1: 100) APC anti-human TCRα / β antibody (Miltenyi, Cat#: 130-113-527) at 4℃ for 30 minutes. After the incubation, the cell suspension was centrifuged at room temperature at 1000 rpm for 1 minutes. The supernatant was discarded, and the cells were suspended in 1 mL DPBS. The cells were washed twice as described above, and then subject to flow cytometry detection.

[0251] Detection of CD3ζ expression by flow cytometry was performed as follows. The cell suspension was centrifuged at room temperature at 1000 rpm for 1 minute, and supernatant was discarded. 200 μL of BD CytofixTM Fixation Buffer (BD Biosciences, Cat#: 554655) was added to the cell samples above. The cells were suspended and incubated at room temperature for 10 minutes. The cell suspension was centrifuged at 300 g at room temperature for 1 minute, and  supernatant was discarded. The cells were suspended with 200 μL BD Perm / WashTM Buffer (BD Biosciences, Cat#: 51-2091KZ) , and then washed once. Afterwards, 1 μL (1: 100) PE anti-CD247 (TCRζ, CD3ζ) Antibody (BioLegend, Cat#: 644106) was added, and the cells were incubated at room temperature for 30 minutes. The cells were washed twice as described above, and then subject to flow cytometry detection.

[0252] FIG. 1A shows TCRαβ expression of mock, M116-Jurkat, M708-Jurkat, M2237-Jurkat and M2729-Jurkat cells, and the percentage of TCRαβ+ cells was 94.96%, 19.86%, 38.36%, 14.28%and 38.04%, respectively. TCRαβ expression was significantly down-regulated in Jurkat cells transduced with M116, M708, M2237 and M2729 plasmids, respectively, as compared to the blank mock group (untransduced Jurkat cells) .

[0253] FIG. 1B shows CD3ζ expression of mock, M116-Jurkat, M708-Jurkat, M2237-Jurkat and M2729-Jurkat cells, and the percentage of CD3ζ+ cells was 99.72%, 98.68%, 99.05%, 98.70%and 98.77%, respectively. CD3ζ expression was not regulated.

[0254] The results indicate that similar to SIV Nef M116, the truncated SIV Nef M116 (SIV Nef M116 Trun1, SIV Nef M116 Trun2 and SIV Nef M116 Trun3) can significantly downregulate TCRαβ on T lymphocytes without degrading CD3ζ protein.

[0255] Example 2. Regulation of TCRαβ and CD3ζ protein expression in CAR-T cells by fusion proteins of the truncated SIV Nef M116 and TRIM21 Trun2

[0256] 1) Construction of expression plasmids

[0257] To further degrade the endogenous CD3ζ protein in T lymphocytes, fusion proteins of the truncated SIV Nef and E3 ubiquitin ligase (e.g., TRIM21) were constructed and expressed in CAR-T cells. The TRIM21 protein comprising RING-Box-Coiled-Coil domains (RBCC) (amino acids 1-267 of TRIM21; SEQ ID NO: 11) was truncated to obtain TRIM21 Trun2 (amino acids 1-85 of TRIM21; SEQ ID NO: 12) . In some embodiments, there is a linker connecting the truncated SIV Nef and TRIM21 Trun2. An exemplary linker has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25.

[0258] Similar to the methods described in Example 1, the DNA fragment encoding SIV Nef M116-linker-TRIM21 Trun2-T2A-CD8α SP-CD20 scFv (Leu16) -CD8α Hinge-CD8α TM-4-1BB-ITAM010-P2A-DHFR L22F / F31S-P2A-SP-MB12 was cloned into the expression plasmid pLVX-hEF1α, to obtain the expression plasmid PLSINK-Modified2268 ( “M2268” for short) . The DNA  fragment encoding the truncated SIV Nef M116-linker-TRIM21 Trun2-T2A-CD8α SP-CD20 scFv (Leu16) -CD8α Hinge-CD8α TM-4-1BB-ITAM010-P2A-DHFR L22F / F31S-P2A-SP-MB12 was cloned into the expression plasmid pLVX-hEF1α, to obtain the expression plasmid PLSINK-Modified2410 (SIV Nef M116 Trun1, “M2410” for short) , PLSINK-Modified2445 (SIV Nef M116 Trun2, “M2445” for short) and PLSINK-Modified2444 (SIV Nef M116 Trun3, “M2444” for short) , respectively. Schematic structures and sequences of the fusion proteins are shown in Table 1.

[0259] Table 1. Exemplary fusion proteins having the truncated SIV Nef M116 and TRIM21 Trun2 in corresponding CD20 CAR expression structures

[0260] Lentivirus was produced and concentrated using methods similar to the methods described in Example 1. The recombinant expression plasmids were isolated and mixed with helper plasmids (e.g., pMDLg-pRRE, pRSV-Rev, and pMD2. G) , to co-transfect HEK 293T cells for lentivirus production. In some embodiments, compared with M2268 with full-length SIV Nef M116, M2410, M2445 and M2444 with truncated SIV Nef M116 can increase virus titers by 1.53 to 1.78 times, 2.50 to 2.59 times, and 5.82 to 8.05 times, respectively.

[0261] The ITAM010-modified CD20 CAR (CD8α SP-CD20 scFv (Leu16) -CD8α Hinge-CD8α TM-4-1BB-ITAM010) was disclosed in PCT Application Publication No. WO2021037221, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 13. ITAM010 was disclosed in PCT Application Publication No. WO2021037221, and its sequence is shown in SEQ ID NO: 15. The amino acid sequence of dihydrofolate reductase (DHFR) L22F / F31S is shown in SEQ ID NO: 20.  MB12 is an exemplary membrane-bound IL12p40 polypeptide, with a schematic structure of IL12p40-CD8αHinge-CD8α transmembrane domain-CD8α intracellular cytoplasmic domain, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 21. The amino acid sequences for self-cleaving peptides T2A, P2A, and signal peptide (SP) are shown in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, and SEQ ID NO: 24, respectively.

[0262] Jurkat cell lines were prepared according to the methods described in Example 1, to obtain M2268-Jurkat, M2410-Jurkat, M22445-Jurkat, and M2444-Jurkat cells, respectively. The culture was not screened for puromycin resistance.

[0263] 2) Detection of CAR, TCRαβ and CD3ζ expression by flow cytometry

[0264] Expressions of CAR was detected according to the flow cytometry detection methods of TCRαβ in Example 1. Specifically, 0.64 μL Alexa FlourTM 7488 LUCAR-20S ADA antibody (produced by GeneScript, Order No: LGBUADAb-1) , 1 μL (1: 100) APC anti-human TCRα / βantibody, and 1 μL (1: 100) PE anti-CD247 (TCRζ, CD3ζ) Antibody (BioLegend, Cat#: 644106) were used for cell staining.

[0265] FIG. 2A shows TCRαβ expression of mock, M2268-Jurkat, M2410-Jurkat, M2445-Jurkat and M2444-Jurkat cells, and the percentage of TCRαβ-positive (TCRαβ+) cells among CAR-positive (CAR+) cells was 97.57%, 3.85%, 3.04%, 4.17%and 3.36%, respectively.

[0266] FIG. 2B shows CD3ζ expression of mock, M2268-Jurkat, M2410-Jurkat, M2445-Jurkat and M2444-Jurkat cells, the percentage of CD3ζ+ cells among CAR+ cells was 97.87%, 16.63%, 15.46%, 16.11%and 12.51%, respectively.

[0267] TCRαβ and CD3ζ expression were both significantly down-regulated in Jurkat cells transduced with M2268, M2410, M2445 and M2444 plasmids, respectively, as compared to the blank mock group (untransduced Jurkat cells) .

[0268] The results indicate that SIV Nef M116-TRIM21 Trun2, SIV Nef M116 Trun1-TRIM21 Trun2, SIV Nef M116 Trun2-TRIM21 Trun2 and SIV Nef M116 Trun3-TRIM21 Trun2 fusion proteins can significantly downregulate TCRαβ, capture and significantly degrade CD3ζprotein on T lymphocytes.

[0269] Example 3. Cell phenotype, CD3ζ protein expression, and specific cytotoxicity of CD20 CAR-T cells containing fusion proteins of the truncated SIV Nef M116 and TRIM21 Trun2

[0270] 1) Construction of expression plasmids

[0271] Expression plasmid was constructed using the methods described in Example 2. The DNA fragment encoding SIV Nef M116 Trun3-TRIM21 Trun2-T2A-CD8α SP-CD20 scFv (3H7) -CD8α Hinge-CD8α TM-4-1BB-ITAM045-P2A-DHFR L22F / F31S-P2A-SP-MB12 was cloned into the expression plasmid pLVX-hEF1α, to obtain the expression plasmid PLSINK-Modified2664 ( “M2664” for short) . Lentivirus was produced and concentrated as described in Example 2.

[0272] The amino acid sequence of CD20 scFv (3H7) is shown in SEQ ID NO: 18. ITAM045 was disclosed in PCT Application Publication No. WO2021037221, and its sequence is shown in SEQ ID NO: 16. The amino acid sequence of ITAM045-modified CD20 CAR (CD8α SP-CD20 scFv (3H7) -CD8α Hinge-CD8α TM-4-1BB-ITAM045) is shown in SEQ ID NO: 14. The amino acid sequence of fusion protein of SIV Nef M116 Trun3 and TRIM21 Trun2 is shown in SEQ ID NO: 10.

[0273] 2) T cell isolation, transduction and preparation

[0274] 50 mL of fresh peripheral blood from volunteers was collected, and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by lymphocyte separation medium and density gradient centrifugation. The cells were labeled with magnetic beads using the Pan T Cell Isolation Kit (Miltenyi, Cat#: 130-096-535) to isolate and purify T lymphocytes. Purified T cells were treated with CD3 / CD28 magnetic beads for T lymphocyte activation and proliferation. After culturing in a 37℃, 5%CO2 incubator for 24 hours, 5 × 106 activated T lymphocytes were infected with M2664 lentivirus. The cell suspension was added to a 6-well plate, and cultured in a 37℃, 5%CO2 incubator. The CD3ζ gene (CD247) was knocked out in UnT (untransduced T cells) using CRISPR / Cas9 technology to generate CD3ζ KO-T. On the seventeenth day of viral transduction, the TCRα / β sorting kit was used to enrich and sort TCRαβ negative cells to complete the preparation of CD3ζ KO-T and M2264-T cells.

[0275] 3) Detection of CD5, CAR, TCRαβ, MB12 and CD3ζ expression by flow cytometry

[0276] Expressions of CD5, CAR, TCRαβ and MB12 were detected according to the flow cytometry detection methods of TCRαβ in Example 1. Specifically, 1 μL (1: 100) of PE / Cyanine7 anti-human CD5 antibody, 0.64 μL Alexa FlourTM 7488 LUCAR-20S ADA antibody (produced  by GeneScript, Order No: LGBUADAb-1) , 1 μL (1: 100) APC anti-human TCRα / β antibody, and 1 μL (1: 100) PE anti-human IL-12 / IL-23 p40 antibody were used for cell staining.

[0277] Expressions of CD3ζ was detected according to the methods described in Example 1.

[0278] 4) Detection of CD3ζ by Western blot

[0279] 5 ×106 UnT, CD3ζ KO-T and 2664-T cells were washed twice with cold DPBS, and then centrifuged at 2500 g for 5 minutes. After centrifugation, the cells were collected and 1 mL cell lysis buffer (Thermo Scientific, Cat#: 89900) was added. The cell lysate was shaken gently on ice for 15 minutes, and then centrifuged at 14,000 g at 4℃ for 15 minutes. Supernatant was transferred to a new centrifuge tube, and stored in a -80℃ refrigerator for later use. The expression level of CD3ζ protein was detected with a CD3ζ-specific antibody (Santa Cruz, Cat#: sc-1239) by Western blot, and β-actin was detected as a control.

[0280] 5) Specific cytotoxicity of CAR-T cells

[0281] Each T cell group was mixed with Raji. Luc (CD20-positive lymphoma cells, ATCC, Cat#: CCL-86) cells at 20: 1 and 10: 1 effect-to-target ratios, respectively, in 384-well plates (white) , and incubated for 18-24 hours. The ONE-GloTM Luciferase Assay System (TAKARA, Cat#: B6120) was used.

[0282] Specifically, 25 μL One-GloTM reagent was added to each well of the 384-well plates, and the fluorescence signal from Luciferase was detected with a microplate reader (TECAN,  10M) . The killing efficiency of each group of lymphocytes on target cells was calculated as follows: Killing efficiency (%) = (1- (RLUexperimental group-RLUblank control group)  / RLUtumor cell group) × 100%.

[0283] FIG. 3A and FIG. 3B show that after TCRαβ sorting and enrichment of M2664-T cells, the percentage of TCRαβ-CAR+ (TCRαβ-negative and CAR-positive) cells was 83.20%, and the ratio of CAR+MB12+ cells was 79.05%.

[0284] FIG. 4A shows CD3ζ expression of UnT, CD3ζ KO-T and M2664-T cells detected by flow cytometry, and the percentage of CD3ζ+ cells was 99.10%, 0.21%and 1.55%, respectively.

[0285] FIG. 4B shows CD3ζ protein expression of UnT, CD3ζ KO-T and M2664-T cells detected by Western blot. CD3ζ expression was significantly down-regulated in CD3ζ KO-T and M2664-T cells, as compared to UnT.

[0286] The results indicate that the fusion protein of SIV Nef M116 Trun3 and TRIM21 Trun2 on CAR-T cells had the function of capturing and degrading CD3ζ protein. Moreover, the specific cytotoxicity of CAR-T cells expressing the fusion protein of SIV Nef M116 Trun3 and TRIM21 Trun2 was verified in FIG. 5.

[0287] OTHER EMBODIMENTS

[0288] It is to be understood that while the disclosure has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the disclosure, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.A non-naturally occurring negative regulatory factor (Nef) protein, comprising a deletion of amino acids 207-223 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof.2.The non-naturally occurring Nef protein of claim 1, comprising a deletion of amino acids 50-91 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof.3.The non-naturally occurring Nef protein of claim 1 or claim 2, which down-regulates cell surface expression of an endogenous T cell receptor (TCR) .4.The non-naturally occurring Nef protein of any one of claims 1-3, consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.5.A fusion protein comprising (1) a non-naturally occurring Nef protein and (2) an E3 ubiquitin ligase or fragment thereof.6.The fusion protein of claim 5, wherein the non-naturally occurring Nef protein comprises a deletion of amino acids 207-223 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof.7.The fusion protein of claim 5 or claim 6, wherein the non-naturally occurring Nef protein comprises a deletion of amino acids 50-91 as numbered in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or corresponding amino acids thereof.8.The fusion protein of any one of claims 5-7, wherein the non-naturally occurring Nef protein consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.9.The fusion protein of any one of claims 5-8, wherein the E3 ubiquitin ligase or fragment thereof is derived from a Tripartite Motif Containing 21 (TRIM21) protein.10.The fusion protein of claim 9, wherein the TRIM21 protein is truncated; optionally wherein the TRIM21 protein comprises a RING domain.11.The fusion protein of claim 9 or claim 10, wherein the TRIM21 protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12; optionally wherein the amino acid sequence of the TRIM21 protein is set forth in SEQ ID NO: 12.12.The fusion protein of any one of claims 5-11, wherein the non-naturally occurring Nef protein and the E3 ubiquitin ligase or fragment thereof are connected via a linker; optionally wherein the linker comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.13.The fusion protein of any one of claims 5-11, wherein the non-naturally occurring Nef protein and the E3 ubiquitin ligase or fragment thereof are directly connected to each other without a linker.14.The fusion protein of any one of claims 5-13, wherein the non-naturally occurring Nef protein is N-terminal to the E3 ubiquitin ligase or fragment thereof or C-terminal to the E3 ubiquitin ligase or fragment thereof.15.The fusion protein of any one of claims 5-14, wherein the fusion protein comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 6-10, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 6-10.16.The fusion protein of claim 15, wherein the fusion protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.17.The fusion protein of any one of claims 5-16, which downregulates and / or degrades an endogenous CD3ζ.18.A nucleic acid comprising a first nucleic acid sequence encoding the non-naturally occurring Nef protein of any one of claims 1-4, or the fusion protein of any one of claims 5-17.19.The nucleic acid of claim 18, wherein the nucleic acid further comprises a second nucleic acid sequence encoding an engineered receptor.20.The nucleic acid of claim 19, wherein the engineered receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) ; optionally wherein the CAR comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14.21.The nucleic acid of any one of claims 18-20, further comprising a nucleic acid sequence encoding a protein marker; optionally wherein the protein marker is a mutant dihydrofolate reductase (DHFR) polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.22.The nucleic acid of any one of claims 18-21, further comprising a nucleic acid sequence encoding an exogenous cytokine or a fragment thereof; optionally wherein the exogenous cytokine or fragment thereof is a membrane-bound subunit beta of interleukin 12 (IL12p40) polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.23.The nucleic acid of any one of claims 19-22, wherein each nucleic acid sequence is connected via a nucleic acid sequence encoding a cleavable linker; optionally wherein the cleavable linker is P2A or T2A.24.A vector comprising the nucleic acid of any one of claims 18-23.25.An engineered cell comprising the non-naturally occurring Nef protein of any one of claims 1-4, the fusion protein of any one of claims 5-17, the nucleic acid of any one of claims 18-23, or the vector of claim 24.26.The engineered cell of claim 25, wherein the engineered cell further comprises an engineered receptor; optionally wherein the engineered receptor is selected from the group consisting of an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , and a T cell antigen coupler (TAC) .27.The engineered cell of claim 26, wherein the engineered receptor comprises:(a) an extracellular ligand binding domain,(b) a transmembrane domain, and(c) an intracellular signaling domain (ISD) comprising a chimeric signaling domain (CMSD) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16.28.The engineered cell of claim 27, wherein the engineered receptor further comprises a signal peptide located at the N-terminus of the extracellular ligand binding domain.29.The engineered cell of any one of claims 26-28, wherein the extracellular ligand binding domain of the engineered receptor binds to an antigen,wherein the antigen is selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, EGF1R, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, ADGRE2, FcRH5, NKp80, NKp30, NKG2A, CD229 and CS-1.30.The engineered cell of any one of claims 26-29, wherein the engineered receptor is a CAR; optionally wherein: the intracellular signaling domain of the CAR further comprises a co-stimulatory signaling domain, and the CAR further comprises a hinge domain located between the C-terminus of the extracellular ligand binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain.31.The engineered cell of any one of claims 25-30, comprising a CAR that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14.32.The engineered cell of any one of claims 25-31, further comprising a protein marker; optionally the protein marker is a mutant DHFR polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.33.The engineered cell of any one of claims 25-32, further comprising an exogenous cytokine or a fragment thereof; optionally wherein the exogenous cytokine or fragment thereof is a membrane-bound IL12p40 polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.34.The engineered cell of any one of claims 25-33, wherein the engineered cell is selected from the group consisting of a T cell, a αβT cell, a γδT cell, a NK cell, a peripheral  blood mononuclear cell (PBMC) , a hematopoietic stem cell, a pluripotent stem cell, and an embryonic stem cell.35.The engineered cell of claim 34, wherein the cell is a T cell.36.The engineered cell of claim 35, wherein the engineered cell expresses a decreased level of CD3ζ as compared to that in a precursor T cell and / or a decreased level of endogenous T cell receptor (TCR) as compared to that in a precursor T cell.37.The engineered cell of claim 35 or 36, wherein the engineered cell elicits no or reduced graft-versus-host disease (GvHD) response in a histoincompatible individual as compared to the GvHD response elicited by a primary T cell isolated from the donor of the precursor T cell from which the engineered cell is derived.38.A method of producing an engineered T cell, comprising introducing into a precursor cell the nucleic acid of any one of claims 18-23, or the vector of claim 24; optionally wherein the method further comprising introducing into the precursor cell a second nucleic acid encoding a chimeric antigen receptor (CAR) .39.A pharmaceutical composition comprising the engineered cell of any one of claims 25-38, and a pharmaceutically acceptable carrier.40.A method of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering to the subject in need thereof a therapeutically effective amount of the engineered cell of any one of claims 25-38, or the pharmaceutical composition of claim 39.41.A method of downregulating and / or degrading a target protein in a T cell from a subject, comprising introducing into the T cell the nucleic acid of any one of claims 18-23, or the vector of claim 24; optionally wherein the target protein is CD3ζ and / or TCR.42.A chimeric antigen receptor (CAR) , comprising:(1) an extracellular ligand binding domain that binds to CD20, comprising:an LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, an LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, an LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, an HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, an HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and an HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; wherein the CDRs are determined according to the Kabat numbering scheme,(2) a transmembrane domain, and(3) an intracellular signaling domain (ISD) comprising a chimeric signaling domain (CMSD) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; optionally wherein the intracellular signaling domain further comprising a co-stimulatory signaling domain.43.The CAR of claim 42, wherein the extracellular ligand binding domain of the CAR comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.44.The CAR of claim 42 or claim 43, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.

Images