Methods, reagents, and kits for tuning an immunoassay signal

Abstract

Methods, assays, systems, and kits for determining the presence, severity, and / or predisposition of heart failure (HF) in an individual are disclosed. The methods utilize a solid substrate, wherein streptavidin-coated particles are pre-incubated with biotinylated antibody to form the solid phase reagent. Because the solid phase reagent is now presented with the biotinylated antibody in a pre-complexed form, there are fewer opportunities for biotin from the sample to interfere in the assay. The methods, systems, assays, and kits of the present disclosure allow the NT-proBNP assay to demonstrate no biotin interference up to a concentration of 3510 ng / mL biotin.

Description

METHODS, REAGENTS, AND KITS FOR TUNING AN IMMUNOASSAY SIGNAL    CROSS‐REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0001] This application claims the benefit of US Provisional Application No. 63 / 514,108,  filed  July 17, 2023. The entire  contents of  the above‐referenced patent application(s) are  hereby expressly incorporated herein by reference.  FIELD

[0002] The present disclosure is in the field of immunoassays and assay formats suitable  for tuning a signal by altering the signal to noise ratio thereof. Further the present disclosure  relates  to  stabilizing  reagents  and  eliminating  interference  of  free  biotin  in  a  biological  sample. In certain non‐limiting embodiments, the present disclosure tunes the signal to noise  ratio of an NT‐proBNP sandwich immunoassay suitable for use in a high‐throughput analyzer.  BACKGROUND

[0003] Left ventricular dysfunction can occur as part of coronary heart disease, arterial  hypertension,  valvular  disease,  and  primary  myocardial  disease.  If  the  left  ventricular  dysfunction  remains  untreated  and  is  progressive,  the  potential  for mortality  is  high,  for  example, due  to sudden cardiac death. Chronic cardiac  insufficiency  is a clinical syndrome  caused by impairment of the cardiac pumping function. Based on the symptoms, the presence  and severity of cardiac insufficiency may be classified in stages I–IV such as by the New York  Heart Association  (NYHA). Clinical  tests and  imaging procedures are used  to diagnose  left  ventricular dysfunction.

[0004] Natriuretic peptides  reported  in  the  literature  include atrial natriuretic peptide  (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), and C-type natriuretic peptide (CNP). The significance  of natriuretic peptides in the control of cardiovascular system function has been established.  Brain  natriuretic  peptide  biomarkers  are  commonly  used  to  aid  in  diagnosis  and  assess  severity in patients with heart failure (HF).

[0005] ANP  and  BNP  have  natriuretic  and  diuretic  properties.  As  antagonists  of  the  renin-angiotensin-aldosterone  system,  ANP  and  BNP  influence  the  electrolyte  and  fluid  balance  in  the  body. In  subjects  with  left  ventricular  dysfunction,  serum  and  plasma  concentrations  of  BNP  increase,  as  do  the  concentrations  of  the  biologically  inactive  prohormone, proBNP. ProBNP  includes 108  amino  acids.  It  is  secreted mainly by  the  left  ventricle of the heart and, in this process, is cleaved into physiologically active BNP (Amino Acid 77–108), and the N-terminal fragment NT-proBNP (Amino Acid 1–76) (See e.g., Nadar  SK, Shaikh MM. Biomarkers in Routine Heart Failure Clinical Care. Card Fail Rev. 2019;5(1):50‐ 56. doi: 10.15420 / cfr.2018.27.2).

[0006] Biomarkers  such  as  NT-proBNP  act  as  surrogates  for  clinically  meaningful  outcomes and may or may not reflect the pathogenesis underlying a disease. Examples of  clinical  utility  include  diagnosis,  the  prediction  of  disease  progression  or  regression,  and  prognostication of mortality. A biomarker should be easily acquired, reliably measured, and  available for serial monitoring. Ideally, it would also provide an advantage of currently used  clinical measures in ease, timeframe, and / or expense.

[0007] Certain substances in a biological sample problematically interfere with an assay  format for measuring a biomarker. It is well known that biotin present in a biological sample  may  bias  assay  results  and / or  interfere  with  an  assay,  for  example,  in  assays  where  biotinylated antibody is a separate reagent from a solid phase that includes a biotin binding  molecule, such as (but not limited to) unconjugated streptavidin‐coated particles. The assay  format problematically allows time for any biotin naturally present in a biological sample to  complex  with  the  streptavidin‐coated  particles,  resulting  in  interference  in  which  the  biotinylated antibody is blocked from binding to the streptavidin‐coated particles.

[0008] Prior  art  of  interest  includes  U.S.  Patent  No.  8,252,605,  entitled Method  and  Composition For Stabilizing Liquid Reagents to Janzen et al. (herein incorporated entirely by  reference). However,  the  prior  art  is  deficient  in  that  it  does  not  show  improvement  to  reducing  biotin  interference  as  shown  and  described  herein,  especially  to  an NT‐proBNP  detecting immunoassay in accordance with the present disclosure.

[0009] Therefore,  there  is  a  continuing  need  in  the  art  for  improved  assays  such  as  NT-proBNP assays having improved performance where problematic free or natural biotin is  or may be present in a biological sample at a concentration sufficient to cause interference.  It  is  to  such  biomarker  assay  formats,  as  well  as  compositions / reagents / kits  containing  reagents  for measuring a biomarker, along with methods of using  same,  that  the present  disclosure is directed.  BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0010] Embodiments of the present disclosure, briefly summarized above and discussed  in greater detail below, can be understood by reference to the illustrative embodiments of  the  disclosure  depicted  in  the  appended  drawings.  However,  the  appended  drawings illustrate only typical embodiments of the disclosure and are therefore not to be considered  limiting of scope, for the disclosure may admit to other equally effective embodiments.

[0011] FIG.  1  depicts  a  prior  art  immunoassay  format  for  NT‐proBNP.  The  prior  art  immunoassay  utilizes  three  reagents:  a  streptavidin‐coated  particle  (Reagent  1),  a  biotinylated antibody (Reagent 2), and an acridinium ester‐labeled antibody (Reagent 3). The  two antibodies bind to non‐overlapping epitopes of NT‐proBNP so that a sandwich complex  can be formed (Product 1).

[0012] FIG. 2 depicts the effects of biotin interference on the prior art immunoassay of  FIG. 1.

[0013] FIG.  3  depicts  one  non‐limiting  embodiment  of  an  NT‐proBNP  immunoassay  constructed  in accordance with  the present disclosure.  In  this embodiment, a  solid phase  reagent  is produced  before  addition  of  the  sample by pre‐incubating  streptavidin‐coated  particles with biotinylated antibody (or binding fragment thereof). Because the solid phase  reagent  is  presented  with  the  biotinylated  antibody  in  a  pre‐complexed  form,  biotin  interference from free or natural biotin in the sample is eliminated or substantially eliminated  in the immunoassay.

[0014] FIG. 4 depicts an exemplary block diagram of a computer system 1100 suitable for  executing the methods of the present disclosure on a chemical analyzer.

[0015] FIG.  5  graphically  illustrates  a  receiver  operating  characteristic  (ROC)  curve  demonstrating  the  clinical  sensitivity  and  specificity  of  the  immunoassay  constructed  in  accordance with the present disclosure.

[0016] To facilitate understanding, identical reference numerals have been used, where  possible, to designate identical elements that are common to the figures. The figures are not  drawn to scale and may be simplified for clarity. Elements and features of one embodiment  may be beneficially incorporated in other embodiments without further recitation.    DETAILED DESCRIPTION

[0017] Before explaining at least one embodiment of the present disclosure in detail by  way of exemplary language and results, it is to be understood that the present disclosure is  not  limited  in  its  application  to  the  details  of  construction  and  the  arrangement  of  the  components set forth in the following description. The present disclosure is capable of other  embodiments or of being practiced or carried out in various ways. As such, the language used herein  is  intended  to  be  given  the  broadest  possible  scope  and  meaning;  and  the  embodiments are meant to be exemplary ‐ not exhaustive. Also, it is to be understood that  the  phraseology  and  terminology  employed  herein  is  for  the  purpose  of  description  and  should not be regarded as limiting.

[0018] Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection  with the present disclosure shall have the meanings that are commonly understood by those  of ordinary skill in the art. Further, unless otherwise required by context, singular terms shall  include pluralities and plural terms shall include the singular. The foregoing techniques and  procedures are generally performed according to conventional methods well known  in the  art  and  as  described  in  various  general  and more  specific  references  that  are  cited  and  discussed  throughout  the present  specification. The nomenclatures utilized  in  connection  with, and the laboratory procedures and techniques of, analytical chemistry, synthetic organic  chemistry,  and medicinal  and  pharmaceutical  chemistry described  herein  are  those well‐ known and commonly used in the art.

[0019] All patents, published patent applications, and non‐patent publications mentioned  in the specification are indicative of the level of skill of those skilled in the art to which the  present  disclosure  pertains.  All  patents,  published  patent  applications,  and  non‐patent  publications referenced in any portion of this application are herein expressly incorporated  by reference in their entirety to the same extent as if each individual patent or publication  was specifically and individually indicated to be incorporated by reference.

[0020] All of  the  compositions, devices,  kits,  and / or methods disclosed herein  can be  made and executed without undue experimentation in light of the present disclosure. While  the compositions, devices, kits, and / or methods have been described in terms of particular  embodiments, it will be apparent to those of skill in the art that variations may be applied to  the compositions, devices, kits, and / or methods and in the steps or in the sequence of steps  of the methods described herein without departing from the concept, spirit, and scope of the  present disclosure. All such similar substitutions and modifications apparent to those skilled  in the art are deemed to be within the spirit, scope, and concept of the present disclosure as  defined by the appended claims.  Definitions

[0021] As utilized in accordance with the present disclosure, the following terms, unless  otherwise indicated, shall be understood to have the following meanings:

[0022] The  use  of  the  term  “a”  or  “an”  when  used  in  conjunction  with  the  term  “comprising” in the claims and / or the specification may mean “one,” but it is also consistent  with the meaning of “one or more,” “at least one,” and “one or more than one.” As such, the  terms  “a,”  “an,”  and  “the”  include  plural  referents  unless  the  context  clearly  indicates  otherwise.  Thus,  for  example,  reference  to  “a  compound”  may  refer  to  one  or  more  compounds, two or more compounds, three or more compounds, four or more compounds,  or greater numbers of compounds. The term “plurality” refers to “two or more.”

[0023] The use of the term “at least one” will be understood to include one as well as any  quantity more than one, including but not limited to, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, etc.  The term “at least one” may extend up to 100 or 1000 or more, depending on the term to  which it is attached; in addition, the quantities of 100 / 1000 are not to be considered limiting,  as higher limits may also produce satisfactory results. In addition, the use of the term “at least  one of X, Y, and Z” will be understood to include X alone, Y alone, and Z alone, as well as any  combination of X, Y, and Z.

[0024] The use of ordinal number terminology (i.e., “first,” “second,” “third,” “fourth,”  etc.)  is  solely  for  the  purpose  of  differentiating  between  two  or more  items  and,  unless  explicitly stated otherwise, is not meant to imply any sequence or order or importance to one  item over another or any order of addition, for example.

[0025] The use of the term “or” in the claims is used to mean an inclusive “and / or” unless  explicitly  indicated  to  refer  to  alternatives  only  or  unless  the  alternatives  are  mutually  exclusive. For example, a condition “A or B” is satisfied by any of the following: A is true (or  present) and B is false (or not present), A is false (or not present) and B is true (or present),  and both A and B are true (or present).

[0026] As used herein, any reference to “one embodiment,” “an embodiment,” “some  embodiments,”  “one  example,”  “for  example,”  or  “an  example” means  that  a  particular  element, feature, structure, or characteristic described in connection with the embodiment  is  included  in  at  least  one  embodiment.  The  appearance  of  the  phrase  “in  some  embodiments” or “one example”  in various places  in the specification is not necessarily all  referring  to  the  same  embodiment,  for  example.  Further,  all  references  to  one  or more  embodiments or examples are to be construed as non‐limiting to the claims.

[0027] Throughout  this  application,  the  term  “about”  is used  to  indicate  that  a  value  includes  the  inherent variation of error  for a composition / apparatus /  device,  the method being employed to determine the value, or the variation that exists among the study subjects.  For example, but not by way of limitation, when the term “about” is utilized, the designated  value may vary by plus or minus twenty percent, or  fifteen percent, or twelve percent, or  eleven percent, or ten percent, or nine percent, or eight percent, or seven percent, or six  percent, or five percent, or four percent, or three percent, or two percent, or one percent  from the specified value, as such variations are appropriate to perform the disclosed methods  and as understood by persons having ordinary skill in the art.

[0028] The  term  "antibody”  is  used  herein  in  the  broadest  sense  and  refers  to,  for  example,  intact monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, multi‐specific antibodies  (e.g.,  bispecific  antibodies),  antibody  fragments  and  conjugates  thereof  that  exhibit  the  desired biological activity of analyte binding (such as, but not limited to, Fab, Fab', F(ab')2, Fv,  scFv, Fd, diabodies, single‐chain antibodies, and other antibody  fragments and conjugates  thereof that retain at least a portion of the variable region of an intact antibody), antibody  substitute  proteins  or  peptides  (i.e.,  engineered  binding  proteins / peptides),  and  combinations or derivatives thereof. The antibody can be of any type or class (e.g., IgG, IgE,  IgM, IgD, and IgA) or sub‐class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2).

[0029] The term “biomarker” or “biological marker” is used herein, consistent with its use  in the art, to refer to an entity whose presence,  level, or form correlates with a particular  biological event or state of interest, so that it is considered to be a “marker” of that event or  state. To give but a few examples, in some non‐limiting embodiments, a biomarker may be or  include a marker  for a particular disease  state, or  for  likelihood  that a particular disease,  disorder, or condition may develop, occur, or reoccur. In some non‐limiting embodiments, a  biomarker may be or  include a marker  for a particular disease or  therapeutic outcome or  likelihood thereof. Thus, in some non‐limiting embodiments, a biomarker is predictive of the  relevant biological event or state of interest; in some non‐limiting embodiments, a biomarker  is prognostic of the relevant biological event or state of  interest; and  in some non‐limiting  embodiments, a biomarker is diagnostic of the relevant biological event or state of interest.  In  some  non‐limiting  embodiments,  a  biomarker  is  a  possible  biomarker  of  the  relevant  biological event or state of interest. A biomarker may be an entity of any chemical class. For  example, in some non‐limiting embodiments, a biomarker may be or include a nucleic acid, a  polypeptide, a small molecule, or a combination thereof. In some non‐limiting embodiments,  a  biomarker  is  a  cell  surface marker.  In  some  non‐limiting  embodiments,  a  biomarker  is intracellular. In some non‐limiting embodiments, a biomarker is found in a particular tissue  (e.g., lung tissue). In some non‐limiting embodiments, a biomarker is found outside of cells  (e.g., is secreted or is otherwise generated or present outside of cells, e.g., in a body fluid such  as blood, urine, tears, saliva, cerebrospinal fluid, etc.).

[0030] As described herein,  in some non‐limiting embodiments, a biomarker  is an NT‐ proBNP Biomarker. An “NT‐proBNP Biomarker” as used herein refers to a biological marker  for  Heart  Failure  (HF).  In  some  non‐limiting  embodiments,  one  or  more  NT‐proBNP  Biomarkers include the N-terminal fragment NT-proBNP (Amino Acid 1–76) of proBNP. (See  e.g., Nadar SK, Shaikh MM. Biomarkers in Routine Heart Failure Clinical Care. Card Fail Rev.  2019;5(1):50‐56. doi: 10.15420 / cfr.2018.27.2).

[0031] The  term  “characteristic  fragment”  refers  to  a  fragment  of  a  biomarker  (e.g.,  NT-proBNP Biomarker) that is sufficient to identify the biomarker from which the fragment  was derived. For example, in some non‐limiting embodiments, a “characteristic fragment” of  a  biomarker  is  one  that  contains  an  amino  acid  sequence,  or  a  collection  of  amino  acid  sequences, that together allow for the biomarker from which the fragment was derived to be  distinguished from other possible biomarkers, proteins, or polypeptides. In some non‐limiting  embodiments, a characteristic fragment includes at least 10, at least 20, at least 30, at least  40, or at least 50 amino acids. In certain non‐limiting embodiments, a characteristic fragment  refers to a fragment of a biomarker that has at least 90%, at least 95%, at least 99% sequence  identity to the biomarker from which the characteristic fragment was derived.

[0032] The term “hybridization” refers to the physical property of single‐stranded nucleic  acid molecules  (e.g.,  DNA  or  RNA)  to  anneal  to  complementary  nucleic  acid molecules.  Hybridization can typically be assessed in a variety of contexts – including where interacting  nucleic acid molecules are studied in isolation or in the context of more complex systems (e.g.,  while covalently or otherwise associated with a carrier entity and / or in a biological system or  cell).  In some non‐limiting embodiments, hybridization can be detected by a hybridization  technique, such as a  technique selected  from  the group consisting of  in situ hybridization  (ISH),  microarray,  Northern  blot,  Southern  blot,  and  the  like.  In  some  non‐limiting  embodiments, hybridization refers to 100% annealing between the single‐stranded nucleic  acid  molecules  and  the  complementary  nucleic  acid  molecule.  In  some  non‐limiting  embodiments, annealing is less than 100% (e.g., at least 95%, at least 90%, at least 85%, at  least 80%, at least 75%, at least 70% of a single‐stranded nucleic acid molecule anneals to a complementary nucleic acid molecule). Hybridization techniques, and methods for evaluating  hybridization, are well known in the art. See, e.g., Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. Those skilled  in the art understand how to estimate and adjust the stringency of hybridization conditions  such that sequences having at least a desired level of complementarity will stably hybridize,  while those having lower complementarity will not. For examples of hybridization conditions  and parameters, see, e.g., Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,  Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.; Ausubel, F. M. et al. 1994, Current  Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Secaucus, N.J.

[0033] The  term  “detection  agent”  as  used  herein  refers  to  any  element, molecule,  functional group, compound,  fragment, or moiety  that  is detectable.  In some non‐limiting  embodiments,  a  detection  agent  is  provided  or  utilized  alone.  In  some  non‐limiting  embodiments, a detection agent is provided and / or utilized in association with (e.g., joined  to)  another  agent.  Examples  of  detection  agents  include,  but  are  not  limited  to:  various  ligands, radionuclides (e.g., 3H, 14C, 18F, 19F, 32P, 35S, 135I, 125I, 123I, 64Cu, 187Re, 111In, 90Y, 99mTc, 177Lu, 89Zr etc.), fluorescent dyes, chemiluminescent agents (such as, for example, acridinum  esters,  stabilized  dioxetanes,  and  the  like),  bioluminescent  agents,  spectrally  resolvable  inorganic fluorescent semiconductors, nanocrystals (i.e., quantum dots), metal nanoparticles  (e.g., gold, silver, copper, platinum, etc.), nanoclusters, paramagnetic metal  ions, enzymes,  colorimetric labels (such as, for example, dyes, colloidal gold, and the like), biotin, dioxigenin,  haptens, and proteins for which antisera or monoclonal antibodies are available.

[0034] As used herein, the term “diagnostic test” refers to a step or series of steps that is  or has been performed to attain information that is useful in determining whether a patient  has a disease, disorder, or condition and / or in classifying a disease, disorder, or condition into  a  phenotypic  category  or  any  category  having  significance with  regard  to  prognosis  of  a  disease, disorder, or condition, or likely response to treatment (either treatment in general  or  any  particular  treatment)  of  a  disease,  disorder,  or  condition.  Similarly,  the  term  “diagnosis” refers to providing any type of diagnostic information, including, but not limited  to, whether a  subject  is  likely  to have or develop a disease, disorder, or  condition;  state,  staging, or characteristic of a disease, disorder, or condition as manifested  in  the subject;  information related to the nature or classification of a condition such as a tumor or a heart  condition;  information  related  to  prognosis;  and / or  information  useful  in  selecting  an appropriate treatment or additional diagnostic testing. Selection of treatment may  include  the choice of a particular  therapeutic agent or other  treatment modality  such as  surgery,  radiation, etc., a choice about whether to withhold or deliver therapy, a choice relating to  dosing regimen (e.g., frequency or level of one or more doses of a particular therapeutic agent  or  combination of  therapeutic agents), etc.  Selection of additional diagnostic  testing may  include more specific testing for a given disease, disorder, or condition.

[0035] As used in this specification and claim(s), the words “comprising” (and any form of  comprising, such as “comprise” and “comprises”), “having” (and any form of having, such as  “have” and “has”), “including” (and any form of including, such as “includes” and “include”),  or “containing” (and any form of containing, such as “contains” and “contain”) are inclusive  or  open‐ended  and  do  not  exclude  additional,  unrecited  elements  or method  steps.  For  example, a process, method, article, or apparatus  that comprises a  list of elements  is not  necessarily limited to only those elements but may include other elements not expressly listed  or inherently present therein.

[0036] The term “or combinations thereof” as used herein refers to all permutations and  combinations of the listed items preceding the term. For example, “A, B, C, or combinations  thereof”  is  intended to  include at  least one of: A, B, C, AB, AC, BC, or ABC, and  if order  is  important  in a particular context, also BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, or CAB. Continuing  with this example, expressly included are combinations that contain repeats of one or more  item or term, such as BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, and so forth. The  skilled artisan will understand that typically there is no limit on the number of items or terms  in any combination, unless otherwise apparent from the context.

[0037] As used herein, the term “substantially” means that the subsequently described  event  or  circumstance  completely  occurs  or  that  the  subsequently  described  event  or  circumstance  occurs  to  a  great  extent  or  degree.  For  example, when  associated with  a  particular  event  or  circumstance,  the  term  “substantially”  means  that  the  subsequently  described event or circumstance occurs at least 80% of the time, or at least 85% of the time,  or at least 90% of the time, or at least 95% of the time. The term “substantially adjacent” may  mean that two items are 100% adjacent to one another, or that the two items are within close  proximity to one another but not 100% adjacent to one another, or that a portion of one of  the two items is not 100% adjacent to the other item but is within close proximity to the other  item.

[0038] As used herein, the phrase “associated with”  includes both direct association of  two moieties to one another as well as indirect association of two moieties to one another.  Non‐limiting  examples of  associations  include  covalent binding of one moiety  to  another  moiety either by a direct bond or through a spacer group, non‐covalent binding of one moiety  to another moiety either directly or by means of specific binding pair members bound to the  moieties, incorporation of one moiety into another moiety such as by dissolving one moiety  in another moiety or by synthesis, and coating one moiety on another moiety.

[0039] The term “biological  fluid sample” as used herein will be understood to  include  any liquid test sample that may be obtained from a patient and utilized in accordance with  the present disclosure. Examples of biological fluid samples that may be utilized include, but  are not limited to, whole blood or any portion thereof (i.e., plasma or serum), serum, EDTA  plasma, lithium heparin plasma, combinations thereof, and the like.

[0040] As used herein, the term “volume” as it relates to the liquid test samples utilized  in accordance with the present disclosure typically refers to a volume of liquid test sample in  a range of from about 0.1 µl to about 100 µl, or a range of from about 1 µl to about 75 µl, or  a range of from about 2 µl to about 60 µl, or a value less than or equal to about 50 µl, or the  like.

[0041] The term “patient” as utilized herein includes human and veterinary subjects. In  certain  non‐limiting  embodiments,  a  patient  is  a mammal.  In  certain  other  non‐limiting  embodiments,  the  patient  is  a  human.  The  term  “mammal”  for  purposes  of  diagnosis / treatment refers to any animal classified as a mammal, including human, domestic  and farm animals, nonhuman primates, and zoo, sports, or pet animals, such as dogs, horses,  cats, cows, etc.

[0042] A “health care provider” or “health care decision maker” includes any individual  authorized  to diagnose or  treat  a patient, or  to  assist  in  the diagnosis or  treatment of  a  patient. In the context of identifying useful new drugs to treat a particular disease, disorder,  or condition, a health care provider can be an individual who is not authorized to diagnose or  treat a patient, or to assist in the diagnosis or treatment of a patient.

[0043] “Point of care testing” refers to real time diagnostic testing that can be done in a  rapid time frame so that the resulting test is performed faster than comparable tests that do  not employ this system. Point of care testing can be performed rapidly and on site, such as in  a doctor's office, at a bedside, in a stat laboratory, emergency room, or other such locales, particularly where rapid and accurate results are required. The patient can be present, but  such presence is not required. Point of care includes, but is not limited to: emergency rooms,  operating rooms, hospital laboratories and other clinical laboratories, doctor's offices, in the  field, or in any situation in which a rapid and accurate result is desired.

[0044] The  term  “specific  binding  partner,”  as  used  in  particular  (but  not  by way  of  limitation) herein  in  the  terms  “target analyte‐specific binding partner” or  “biotin‐specific  binding  partner,”  will  be  understood  to  refer  to  any  molecule  capable  of  specifically  associating with the target analyte. For example, but not by way of  limitation, the binding  partner may be an antibody, a receptor, a  ligand, aptamers, molecular  imprinted polymers  (i.e., inorganic matrices), combinations or derivatives thereof, as well as any other molecules  capable of specific binding to the target analyte.

[0045] The term “immunoassay” as utilized herein refers to an assay to determine the  presence of a diagnostic biomarker  in a biological  sample by  reacting  the  sample with an  antibody  (or  fragment  thereof)  that  specifically  binds  to  the  diagnostic  biomarker  or  characteristic  fragment  thereof, wherein  the  reaction  is  carried out  for a  time and under  conditions  that  allow  for  the  formation of  an  immunocomplex between  the  antibody  (or  fragment thereof) and the diagnostic biomarker. The quantitative determination of such an  immunocomplex is then performed.

[0046] Sample: As used herein, the term “sample” refers to a biological sample obtained  or derived from a human subject, as described herein.    In some embodiments, a biological  sample  includes biological tissue or  fluid.    In some embodiments, a biological sample may  include blood; blood cells; tissue or fine needle biopsy samples; cell‐containing body fluids;  free  floating  nucleic  acids;  cerebrospinal  fluid;  lymph;  tissue  biopsy  specimens;  surgical  specimens; other body fluids, secretions, and / or excretions; and / or cells therefrom.  In some  embodiments, a biological  sample  includes  cells obtained  from an  individual, e.g.,  from a  human or animal subject.  In some embodiments, obtained cells are or include cells from an  individual from whom the sample is obtained.  In some embodiments, a sample is a “primary  sample” obtained directly from a source of interest by any appropriate means.  For example,  in some embodiments, a primary biological sample is obtained by methods selected from the  group consisting of biopsy (e.g., fine needle aspiration or tissue biopsy), surgery, collection of  body fluid (e.g., blood).  In some embodiments, a sample is cardiac tissue obtained from the  subject.  In some embodiments, as will be clear from context, the term “sample” refers to a preparation that  is obtained by processing  (e.g., by removing one or more components of  and / or by adding one or more agents to) a primary sample.   For example, filtering using a  semi‐permeable membrane.  As another example of sample processing, the sample may be a  plasma sample that  is treated with an anticoagulant selected  from the group consisting of  EDTA, heparin, and citrate.   As another example of sample processing, the sample may be  processed  to  isolate one or more proteins  (e.g., by  capturing proteins with one or more  antibodies).  A “processed sample” may include, for example, nucleic acids or polypeptides  extracted from a sample or obtained by subjecting a primary sample to techniques such as  amplification  or  reverse  transcription  of  mRNA,  isolation  and / or  purification  of  certain  components.

[0047] Subject: As used herein, the term “subject” refers to an organism, for example, a  mammal (e.g., a human).  In some embodiments a human subject is an adult, adolescent, or  pediatric subject. In some embodiments, a subject is at least 50, at  least 55, at  least 60, at  least 65, at least 70, at least 75, or at least 80 years of age.  In some embodiments, a subject  is suffering from a disease, disorder or condition, e.g., a disease, disorder or condition that  can  be  treated  as  provided  herein.    In  some  embodiments,  a  subject  is  susceptible  to  a  disease, disorder, or condition; in some embodiments, a susceptible subject is predisposed to  and / or  shows an  increased  risk  (as compared  to  the average  risk observed  in a  reference  subject  or  population)  of  developing  the  disease,  disorder  or  condition.    In  some  embodiments, a subject displays one or more symptoms of a disease, disorder or condition.   In  some  embodiments,  a  subject  does  not  display  a  particular  symptom  (e.g.,  clinical  manifestation  of  disease)  or  characteristic  of  a  disease,  disorder,  or  condition.    In  some  embodiments, a subject does not display any symptom or characteristic of a disease, disorder,  or condition such as heart  failure.    In some embodiments, a subject  is a patient.    In some  embodiments, a subject is an individual to whom diagnosis and / or therapy is and / or has been  administered.

[0048] Threshold value: As used herein, the term “threshold value” refers to a value (or  values) that are used as a reference to attain information on and / or classify the results of a  measurement, for example, the results of a measurement attained in an assay.  A threshold  value can be determined based on one or more control samples.  A threshold value can be  determined prior  to, concurrently with, or after  the measurement of  interest  is  taken.    In  some embodiments, a  threshold value can be a range of values.  In some embodiments, a threshold value can be a value (or range of values) reported in the relevant field (e.g., a value  found in a standard table).

[0049] The  term  “stratification”  refers  to  the  division  of  potential  patient  groups  or  patient groups into subgroups such as strata or blocks.  In embodiments, “strata” refers to a  particular section of a patient population.

[0050] Turning  now  to  various  non‐limiting  embodiments  of  the  present  disclosure,  improved  biomarker  assay  formats,  as  well  as  compositions / reagents / kits  containing  reagents for measuring a biomarker, along with methods of using same, are described herein.  In certain non‐limiting embodiments, the present disclosure provides improved assays, such  as  (but not  limited  to)  improved NT-proBNP assays, having  improved performance where  problematic free or natural biotin is or may be present in a biological sample and can cause  interference  in  existing  assay  formats.    In  embodiments,  biomarker  assay  formats  are  formulated to tune signal from a signal moiety.

[0051] In  certain  non‐limiting  embodiments,  the  assay  format  includes  one  or more  streptavidin‐coated solid supports (such as but not limited to one or more bead substrates or  particles) that have been pre‐incubated with one or more biotinylated antibodies (or binding  fragments  thereof)  to  form  one  or  more  solid  phase  reagents  suitable  for  use  in  an  immunoassay while eliminating or substantially eliminating  interference of  free biotin  in a  biological  sample.  In  certain  non‐limiting  embodiments,  the  present  disclosure  tunes  the  signal  to noise  ratio  of  an NT‐proBNP  sandwich  immunoassay  suitable  for use  in  a high‐ throughput analyzer. In certain non‐limiting embodiments, because the solid phase reagent  is presented with the biotinylated antibody in a pre‐complexed form, there are substantially  no opportunities for free or natural biotin from the sample to interfere in the assay. In certain  non‐limiting embodiments, such as for an NT‐proBNP analyte, “no interference to biotin” is  defined  as  a  percent  bias  of  ≤  10%.  In  certain  non‐limiting  embodiments,  the  present  disclosure allows the NT‐proBNP assay to claim no interference up to 3510 ng / mL biotin.

[0052] In certain non‐limiting embodiments, the present immunoassay may be run on a  high‐throughput chemical analyzer capable of running more than 20, 30, 40, 50, 75, 100, or  more  tests  per  hour.  In  certain  non‐limiting  embodiments,  the  present  disclosure  also  includes non‐transient computer readable media suitable for executing the methods of the  present disclosure on a chemical analyzer.

[0053] In  certain  particular  (but  non‐limiting)  embodiments,  the  immunoassays  may  detect a complex between a serum marker or characteristic fragment thereof and a serum  marker‐binding antibody using a second antibody that is labeled and also binds to the serum  marker or fragment thereof. In certain non‐limiting embodiments, sandwich immunoassays  are used where a serum marker‐binding antibody can be a capture antibody attached to an  insoluble material (such as, but not limited to, a magnetic bead), and the second antibody can  be a labeling antibody. The above‐described sandwich immunoassay procedures can be used  with the antibodies described hereinafter.

[0054] Turning now  to particular non‐limiting embodiments of  the present disclosure,  embodiments  of  the  present  disclosure  include  an  assay  format  suitable  for  detecting  individual biomarkers  such  as NT‐proBNP or  a  characteristic  fragment  thereof,  as well  as  compositions / devices / kits containing same, methods of producing and using same, kits, and  diagnostic tests related thereto. Certain non‐limiting embodiments of the present disclosure  include a preselected assay format for detecting NT‐proBNP  in serum. Certain non‐limiting  embodiments of  the present disclosure advantageously  reduce, eliminate, or substantially  eliminate  biotin  interference  in  a  reaction.  In  certain  non‐limiting  embodiments,  a  preselected assay format advantageously limits biotin from being associated with reagents of  the assay.

[0055] Certain  non‐limiting  embodiments  of  the  present  disclosure  are  directed  to  a  method of determining the presence, severity, and / or predisposition of heart  failure  in an  individual  using  a  single  biomarker.  In  certain  non‐limiting  embodiments,  the  present  disclosure includes a method having a process sequence including: (a) forming a solid phase  immunoassay reagent by contacting one or more streptavidin‐coated particles with one or  more  biotinylated  antibodies  to  form  a  complex;  and  (b)  separating  the  solid  phase  immunoassay reagent from an immunoassay lite reagent and storing or packaging the solid  phase reagent separate from the lite reagent. In certain non‐limiting embodiments, because  a solid phase reagent is presented with the biotinylated antibody in a pre‐complexed form,  there are substantially no opportunities for biotin from the biological fluid sample to interfere  in the assay. For NT‐proBNP analyte, “no interference to biotin” is defined as a percent bias  of ≤ 10%. In certain non‐limiting embodiments of the present disclosure, the term “no biotin  interference” includes no interference up to a concentration of 3510 ng / mL biotin.

[0056] The  present  disclosure  facilitates  diagnosis,  such  as  point  of  care  or  remote  diagnoses, of HF and assists health care providers in monitoring the status or progress of HF  at two or more time points. Embodiments of the present disclosure are suitable for use in an  outpatient setting, such as where a patient in need thereof provides a biological sample from  , or utilizes one or more embodiments of the present disclosure as part of an ambulatory care  strategy, such as where medical service embodiments of the present disclosure do not require  hospitalization, or wherein patients  are  free  to  leave  a medical  facility once  a  service or  procedure of the present disclosure is complete.  Non‐limiting examples of outpatient care  include home health services, annual check‐ups at a physician’s office or non‐admitting clinic  settings  such  as medical  offices,  clinics,  ambulatory  surgery  centers,  hospital  outpatient  departments  and  other  non‐hospital  centers.  In  some  embodiments,  embodiment  of  the  present disclosure are suitable for use by a user in home ambulatory care to promote patient  independence,  permit  a  transition  from  hospital  to  home  care,  or  as  part  of  a  home  monitoring  strategy  e.g.,  cardiac monitoring.  In  embodiments,  the  assays  of  the  present  disclosure  can be applied  in  a  single occurrence  in an outpatient  care  setting  such  as  an  outpatient facility where the patient does not need to be present for more than 1‐24 hours,  24 hours, or 12 hours.

[0057] In embodiments, a patient in need thereof will provide a biological sample such as  blood or  serum  from an outpatient  setting.   The biological  sample may be  shared with a  facility suitable for performing one or more assays or embodiments of the present disclosure  in  order  to  analyze  the  patient  health  information  such  as  cardiac  information.  In  embodiments,  after  sample  collection,  chemical  reactions  between  an  analyte  in  a  patient's biological  sample and  reagents  are  contacted  under  conditions  suitable  for  performing the assays of  the present disclosure and resulting  in  the generation of various  signals, or tuned signals that measured by an analyzer.

[0058] Also provided by  the present disclosure are kits  including one or more anti‐HF  Biomarker agents and instructions for use (e.g., treatment, prophylactic, or diagnostic use).  In some non‐limiting embodiments, the kit is used for an in vitro diagnostic assay to diagnose  HF.  In some non‐limiting embodiments, the one or more anti‐HF Biomarker agents  include  antibody agents. In some non‐limiting embodiments, one or more of the antibody agents are  labeled with a detectable moiety. In some non‐limiting embodiments, the kit further includes  a  detection  agent  (e.g.,  one  or  more  acridinium  ester  molecules).  In  some  non‐limiting embodiments, one or more of  the  antibody  agents  are  labeled with one or more of  the  acridinium ester molecules. In some non‐limiting embodiments, the kit further includes one  or more  secondary  antibody  agents  that  specifically  bind  to  one  or more  of  the  anti‐HF  Biomarker antibody agents. Additional kit embodiments are described in the Examples below.

[0059] In certain non‐limiting embodiments, the  instructions for use provide a method  for use suitable for an ATELLICA® CI Analyzer (Siemens Healthineers USA, Malvern, PA), e.g.,  1900 model.

[0060] In some non‐limiting embodiments, the kit further includes one or more control  samples.  In some non‐limiting embodiments,  the control samples  include one or more HF  Biomarker standards.

[0061] In  addition  to  the  above,  a  kit  can  include other  ingredients,  such  as  (but not  limited to) a solvent or buffer, a stabilizer or a preservative, and / or an agent for treating a  condition or disorder described herein. Alternatively, other ingredients can be included in a  kit, but  in different compositions or containers than the anti‐HF Biomarker agents.  In such  embodiments, a kit can include instructions for admixing the anti‐HF Biomarker agents and  the other ingredients, or for using the anti‐HF Biomarker together with the other ingredients.  In certain non‐limiting embodiments, the instructions provided eliminate time for any biotin  in  the  sample  to complex with  the  streptavidin‐coated particles and / or  interfere with  the  biotin labeled antibodies from becoming associated with the streptavidin‐coated particles. In  certain  non‐limiting  embodiments,  the  instructions  include  using  the  streptavidin‐coated  particles characterized as pre‐incubated with the biotinylated antibody and are in the form a  solid phase reagent.

[0062] In certain non‐limiting embodiments, kits for use in accordance with the present  disclosure may include a reference or control sample(s), instructions for processing samples,  instructions for performing tests on samples, and / or instructions for interpreting the results,  as well as buffers and / or other reagents necessary for performing tests.

[0063] Methods and kits provided herein detect NT‐proBNP in a sample with a sensitivity  and  a  specificity  that  renders  the  outcome  of  the  test  reliable  enough  to  be  medically  actionable. Methods  and  kits  described  herein  for  detection  and / or  diagnosis  of HF  in  a  subject detects NT‐proBNP with a sensitivity greater than 75%, greater than 80%, greater than  85%, greater than 90%, greater than 95%, greater than 96%, greater than 97%, greater than  98%, greater than 99%, or about 100%. In some non‐limiting embodiments, methods and kits provided herein can detect NT‐proBNP with a sensitivity that  is between about 70%‐100%,  between about 80%‐100%, or between about 90‐100%. In some non‐limiting embodiments,  methods and kits provided herein can detect NT‐proBNP with a sensitivity and a specificity  that  is between  about 50%‐100%, between  about 60%‐100%, between  about 70%‐100%,  between about 80%‐100%, or between about 90‐100%.

[0064] Also  provided  herein  are  compositions.  In  some  non‐limiting  embodiments,  a  composition  includes  one  or more  biotinylated  antibodies  associated with  one  or more  streptavidin‐coated solid supports (such as, but not limited to, streptavidin‐coated beads or  particles).  In  certain  non‐limiting  embodiments,  the  assay  format  includes  one  or  more  streptavidin‐coated particles such as one or more bead substrates having been pre‐incubated  with one or more biotinylated antibodies to form one or more solid phase reagents suitable  for use  in eliminating or substantially eliminating  interference of  free biotin  in a biological  fluid sample. In certain non‐limiting embodiments, the present disclosure tunes the signal to  noise ratio of an NT‐proBNP sandwich  immunoassay suitable  for use  in a high‐throughput  analyzer. In certain non‐limiting embodiments, because the solid phase reagent is presented  with  the  biotinylated  antibody  in  a  pre‐complexed  form,  there  are  substantially  no  opportunities for free or natural biotin from the sample to  interfere  in the assay when the  reagents are mixed with  sample.  In certain non‐limiting embodiments, such as  for an NT‐ proBNP analyte, “no interference to biotin” is defined as a percent bias of ≤ 10%. In certain  non‐limiting embodiments, the present disclosure allows the NT‐proBNP assay to claim no  interference up to 3510 ng / mL biotin.

[0065] In certain non‐limiting embodiments, the present immunoassay may be run on a  high‐throughput chemical analyzer capable of running more than 20, 30, 40, 50, 75, or 100  tests per hour. In certain non‐limiting embodiments, the present immunoassay may be run,  for example, on an ATELLICA® CI Analyzer (Siemens Healthineers USA, Malvern, PA), e.g., 1900  model.

[0066] In one form of a diagnostic method, an immunoassay, one or more specific binding  species  are  used.  Typical  examples  are  the  sandwich  immunoassay,  where  two  specific  binding  species  (antibody or  antigen) bind  to non‐overlapping  epitopes of  the  analyte of  interest. One of the specific binding species is commonly attached to a so‐called label or tag,  which  may  be  an  atom  (e.g.,  radioactive),  molecule  (e.g.,  an  enzyme,  fluorescent,  or luminescent compound) or particle (magnetic or latex). This label allows for detection of the  analyte of interest through a variety of detection methods corresponding to the label utilized.

[0067] The  other  specific  binding  species  is  frequently  associated  with  a  solid  or  suspendable substrate (“the solid phase”) covalently or through adsorption. Alternatively, it  may be  linked  to a  first member of a  second binding pair  (e.g., biotin), while  the  second  member of the second binding pair  (e.g., streptavidin)  is attached to the solid phase. This  allows  the  specific binding  species  to bind  to  the  solid phase via  the  second binding pair  interaction (e.g., biotin‐streptavidin).

[0068] Solid  phases  may  be  macroscopic  solid  phases,  such  as  (but  not  limited  to)  microtiter well, tube and ball in tube devices, or suspendable solid phases, such as (but not  limited  to)  beads,  latex  beads,  magnetic  latex  beads,  and  the  like,  as  well  as  other  paramagnetic materials. A secondary binding species is commonly labeled through the use of  a  tag.  The  interaction  between  the  tag  and  the  solid  phase  allows  for  detection  and  quantification  of  the  analyte  of  interest  through  a  variety  of  detection  methods  corresponding to the label utilized.

[0069] FIGS. 1‐2 demonstrate a prior art sandwich immunoassay for an analyte such as  (but not limited to) NT‐proBNP, along with the effects of biotin interference thereon. As seen  in FIG. 1, the prior art assay utilizes three reagents. Reagent 1 is a streptavidin‐coated particle  (such as, but not limited to, a streptavidin‐coated magnetic bead); Reagent 2 is a biotinylated  first antibody; and Reagent 3 is an acridinium‐labeled second antibody. The two antibodies of  Reagents 2 and 3 bind to non‐overlapping epitopes of NT‐proBNP so that both antibodies can  bind to a single molecule of NP‐proBNP. When the three reagents are mixed with a biological  sample suspected of containing NT‐proBNP (such as, but not limited to, plasma or serum), the  two antibodies bind to NP‐proBNP, and the biotinylated antibody binds to the streptavidin of  the particles to form Reaction Product 1, in which the acridinium ester is indirectly associated  with the solid phase particle via the binding of the two antibodies to NT‐proBNP. Thus, the  Reaction  Product  1  can  be  detected  via  the  signal  generated  by  the  acridinium  ester  associated with the solid phase.

[0070] However, when free biotin is present in the biological sample, as shown in FIG. 2,  the free biotin competes with the biotinylated antibody for binding to the streptavidin‐coated  particles. As such, three reaction products are produced: the detectable Reaction Product 1,  along with Reaction Product 2 that contains a NP‐proBNP molecule bound by both antibodies (and  thus contains  the acridinium ester), and a Reaction Product 3  that contains  the  free  biotin bound to the streptavidin‐coated particles. Therefore, a falsely low (or false negative)  measurement  is determined, as a portion of  the NT‐proBNP present  in  the  sample  is not  present  in  Product  1  and  therefore  is  not  detected,  because  the  acridinium  ester  label  associated with the two antibodies and NT‐proBNP analyte (Product 2) cannot associate with  the streptavidin‐coated particle (Product 3) for detection of the label.

[0071] In  contrast,  FIG.  3  illustrates  a  non‐limiting  embodiment  of  a  kit,  system,  and  method for performing an immunoassay for a target analyte (such as, but not limited to, NT‐ proBNP) in accordance with the present disclosure. In this embodiment, only two reagents  are utilized: Reagent 1 is the streptavidin‐coated particle having the biotinylated first antibody  pre‐bound thereto, and Reagent 2  is the acridinium‐labeled second antibody. Use of these  two reagents ensures that free biotin present in the sample does not interfere or substantially  interfere with  the  formation of Product 1,  in which  the binding of NT‐proBNP by  the  two  antibodies associates the acridinium ester label with the solid phase particles.

[0072] In  certain  particular  (but  non‐limiting)  embodiments,  the  use  of  streptavidin‐ coated magnetic beads provides a fast magnetic response time and is suitable for use in high  throughput and multiplexed assays. The streptavidin coating is contacted with one or more  biotinylated antibodies under conditions suitable to associate the streptavidin coating and  biotinylated antibodies. Therefore, the immunoassay of the present disclosure can be a fully  automated 2-site sandwich immunoassay using direct chemiluminescent technology, which  uses constant or  substantially  constant amounts of  two monoclonal antibodies. The Solid  Phase  contains  a  bound  biotinylated monoclonal  sheep  anti-human  antibody  specific  to  NT-proBNP and conjugated to streptavidin magnetic particles. The Lite Reagent contains an  acridinium-ester-labeled monoclonal sheep anti-human NT-proBNP F(ab')2 fragment specific  to NT-proBNP. In certain non‐limiting embodiments, a direct relationship exists between the  amount of NT-proBNP present in the patient sample and the amount of relative light units  (RLUs) detected by the system.

[0073] Methods described herein can be  implemented  in a computer system having a  processor  that executes specific  instructions  in a computer program.  In some non‐limiting  embodiments, a computer system may be arranged to output an HF Biomarker score based  on receiving an HF Biomarker profile and / or a level of NT‐proBNP Biomarkers. Particularly, a computer program may include instructions for the system to select appropriate next steps,  including additional medication, a treatment, and / or additional testing for a subject.

[0074] In  some non‐limiting embodiments,  the  computer program may be  configured  such that the computer system can  identify a subject for further testing (e.g., heart tests),  identify a subject as being at risk of having or having HF, and / or identify a subject to receive  medication based on received data (e.g., an NT‐proBNP Biomarker profile) and use the data  to calculate an NT‐proBNP Biomarker score.

[0075] FIG. 4  is  a block diagram of  a  computer  system 1100  that  can be used  in  the  operations described above, according  to one non‐limiting embodiment. The system 1100  includes a processor 1110, a memory 1120, a storage device 1130, and an input / output device  1140. Each of the components 1110, 1120, 1130, and 1140 are interconnected using a system  bus  1150.  The  system  may  optionally  further  include  analyzing  equipment  1160  for  determining a level of one or more biomarkers of the present disclosure in a sample.

[0076] In certain non‐limiting embodiments, the processor 1110 is capable of processing  instructions  for  execution within  the  system  1100.  In  one  non‐limiting  embodiment,  the  processor  1110  is  a  single‐threaded  processor.  In  another  non‐limiting  embodiment,  the  processor 1110  is a multi‐threaded processor. The processor 1110  is capable of processing  instructions stored in the memory 1120 or on the storage device 1130, including for receiving  or sending information through the input / output device 1140.

[0077] In certain non‐limiting embodiments, the memory 1120 stores information within  the system 1100. In one non‐limiting embodiment, the memory 1120 is a computer‐readable  medium.  In one non‐limiting embodiment,  the memory 1120  is a volatile memory unit.  In  another embodiment, the memory 1120 is a non‐volatile memory unit.

[0078] The storage device 1130 is capable of providing mass storage for the system 1100.  In one non‐limiting embodiment, the storage device 1130 is a computer‐readable medium.

[0079] The  input / output device 1140 provides  input / output operations  for  the system  1100.  In one non‐limiting embodiment,  the  input / output device 1140  includes a keyboard  and / or  pointing  device.  In  one  non‐limiting  embodiment,  the  input / output  device  1140  includes a display unit for displaying graphical user interfaces.

[0080] The  system  1100  can  be  used  to  build  a  database.  In  certain  non‐limiting  embodiments, a method of the present disclosure is performed in the system 1100 disposed  within  a  chemical  analyzer.  For  example,  a  computer  program  product  can  include instructions  that  cause  the  processor  1110  to  perform  the  steps  of  any  of  the methods  disclosed or otherwise contemplated herein.

[0081] Additionally,  non‐transitory  computer  readable  media  containing  executable  instructions that when executed cause a processor to perform operations including a method  as provided herein are provided. For example, a non‐transitory computer readable medium  containing  executable  instructions  that  when  executed  cause  a  processor  to  perform  operations  including  any  of  the methods disclosed  or  otherwise  contemplated  herein.  In  certain non‐limiting embodiments, a non‐transitory computer readable medium  includes a  hard drive, external hard drive, discs, CDs, DVDs, and / or the like that stores data. In certain  non‐limiting embodiments, software disposed within a physical medium  is suitable for use  herein.

[0082] In some non‐limiting embodiments, a non‐transitory computer readable media is  disclosed  that  contains  executable  instructions  that when  executed  cause  a  processor  to  perform  operations  including  a  method  of  determining  the  presence,  severity,  and / or  predisposition of heart failure (HF) in an individual, wherein the method includes the steps  of: incubating the assay components of the present disclosure with a biological sample, and  determining the amount of NT‐proBNP in a sample.    EXAMPLES

[0083] Examples are provided herein below. However,  the present disclosure  is  to be  understood to not be limited in its application to the specific experimentation, results, and  laboratory procedures disclosed hereinafter. Rather, the Examples are simply provided as one  of various embodiments and is meant to be exemplary, not exhaustive.  Example 1

[0084] The present disclosure includes in a non‐limiting embodiment an NT-proBNP assay  suitable for in vitro diagnostic use in the quantitative determination of N-terminal pro-brain  natriuretic peptide  (NT-proBNP)  in human  serum  and plasma  (EDTA  and  lithium heparin)  using a chemical analyzer, such as (but not limited to) the ADVIA Centaur® XP system. In the  Emergency Department (ED) and Outpatient (OP) populations, measurements of NT-proBNP  are used as an aid in the diagnosis of heart failure (HF) in patients with clinical suspicion of  new onset or worsening HF, and for assessment of HF severity.

[0085] In one non‐limiting embodiment, the Materials present in the kit include: ^ Lite reagent (7.5 ml / reagent pack) containing monoclonal sheep anti‐human NT‐proBNP  F(ab’)2 fragment antibody (~0.36 µg / ml) labeled with acridinium ester in buffer; bovine  serum albumin (BSA); bovine gamma globulin; and preservatives.  ^ Solid Phase reagent (20.0 ml / reagent pack) containing monoclonal sheep anti‐human NT‐ proBNP antibody (~2µg / ml) labeled with biotin bound to streptavidin magnetic particles  (~220  mg / L)  in  buffer;  BSA;  bovine  gamma  globulin;  sheep  gamma  globulin;  and  preservatives.  ^ Optional Ancillary Well Reagent  (7.5 ml / reagent  pack)  containing  Buffer; BSA;  bovine  gamma globulin; sheep gamma globulin; and preservatives.

[0086] In certain non‐limiting embodiments, the assay of the present disclosure is a fully  automated 2-site sandwich immunoassay using direct chemiluminescent technology, which  uses  constant  amounts  of  2  monoclonal  antibodies.  The  Solid  Phase  contains  a  bound  biotinylated monoclonal sheep anti-human antibody specific to NT-proBNP and conjugated  to  streptavidin magnetic  particles.  The  Lite  Reagent  contains  an  acridinium-ester-labeled  monoclonal sheep anti-human NT-proBNP F(ab')2 fragment specific to NT-proBNP. A direct  relationship exists between the amount of NT-proBNP present in the patient sample and the  amount of relative light units (RLUs) detected by the system.

[0087] Non‐limiting procedures for collecting the specimen or sample may involve one or  more  of  the  following  optional  steps:  observe  universal  precautions  when  collecting  specimens;  handle  all  specimens  as  if  they  are  capable  of  transmitting  disease;  follow  recommended  procedures  for  collection  of  diagnostic  blood  specimens  by  venipuncture;  follow the instructions provided with your specimen collection device for use and processing;  allow blood specimens to clot completely before centrifugation; and / or keep tubes capped at  all times.

[0088] Non‐limiting procedures for storing the specimen or sample may  involve one or  more of the following optional steps: after centrifugation, serum specimens stored on the clot  are stable for up to 24 hours at 2–8°C; separated samples are stable for up to 3 days at room  temperature, and for up to 4 days at 2–8°C; separated samples are stable at ≤ ‐20°C for up to  12 months; avoid more than 1 freeze-thaw cycle; do not store in a frost‐free freezer; and / or  thoroughly mix thawed samples and centrifuge them before using.

[0089] Non‐limiting procedures for transporting the specimen or sample may involve one  or  more  of  the  following  optional  steps:  package  and  label  specimens  for  shipment  in compliance with applicable  federal and  international regulations covering the transport of  clinical  specimens  and  etiological  agents;  and / or  if  during  shipment,  specimens may  be  subjected to temperatures > 25°C, then ship specimens frozen.

[0090] Non‐limiting procedures for preparing the samples may involve one or more of the  following optional steps: this assay requires 20 µL of sample for a single determination. This  volume does not  include  the unusable volume  in  the  sample  container, or  the additional  volume required when performing duplicates or other tests on the same sample; the sample  volume  required  to perform onboard dilution differs  from  the sample volume  required  to  perform a single determination on an undiluted sample; do not use samples with apparent  contamination;  before  placing  samples  on  the  system,  ensure  that  samples  are  free  of:  Bubbles  or  foam,  fibrin  or  other  particulate  matter;  and / or  remove  particulates  by  centrifugation  according  to  CLSI  guidance  and  the  collection  device  manufacturer’s  recommendations.

[0091] Non‐limiting assay procedures may involve one or more of the following optional  steps. The system (including a high throughput chemical analyzer) automatically performs the  following steps: dispenses 20 µL of sample into a cuvette; dispenses 200 µL of Solid Phase and  75 µL of Ancillary Well Reagent, then incubates for 3 minutes at 37°C; dispenses 75 µL of Lite  Reagent,  then  incubates  for 6 minutes  at 37°C; performs  a wash  sequence using  a wash  reagent (such as, but not limited to, ADVIA Centaur Wash 1); dispenses 300 µL each of acid  and base reagent (such as, but not limited to, ADVIA Centaur Acid Reagent and ADVIA Centaur  Base Reagent) into initiate the chemiluminescent reaction; and / or reports results.

[0092] Non‐limiting  instructions  for  preparing  the  reagents  for  use  on  an  automated  system  include: all reagents are  liquid and ready to use. Before loading the packs onto the  system,  reagents  require mixing.  For  information about mixing  the  reagents,  refer  to  the  system online help.

[0093] Non‐limiting  instructions  for  preparing  the  automated  system  to  perform  the  assays of the present disclosure  include: ensure that sufficient materials are  loaded on the  system. Refer to Materials Provided and Materials Required but Not Provided for guidance  about required reagents.

[0094] Non‐limiting  instructions  for  setting  Master  Curve  Definition  include:  before  initiating  calibration on each new  lot of  reagent,  enter  the  assay master  curve  values by  scanning the master curve card.

[0095] Non‐limiting instructions for performing calibration include: For calibration of one  certain non‐limiting embodiments of the assay, use the calibrators provided with each kit.  Calibrators provided in an assay kit must only be used with the reagent lot provided in the  same kit.

[0096] Non‐limiting instructions for Calibration Frequency include: Perform a calibration  if one or more of the following conditions exist: At the end of the 36-day calibration interval;  When changing  lot numbers of primary  reagent packs; When  indicated by quality control  results; and after major maintenance or service, if indicated by quality control results. Follow  government regulations or accreditation requirements for calibration frequency.  Individual  laboratory quality control programs and procedures may require more frequent calibration.

[0097] Non‐limiting instructions for preparing the calibrators include one or more of the  following optional steps: add 2.0 mL of reagent water into each vial. Replace cap. Let the vials  stand for 30 minutes at room temperature to allow the lyophilized material to dissolve. Gently  mix and invert the vials to ensure homogeneity of the material. For extended storage, aliquot  and  seal  tightly.  Store  reconstituted  material  according  to  stability  limits  specified  in  Reagents. Do  not  store  in  a  frost‐free  freezer.  Before  using  frozen  calibrators,  allow  the  material to thaw completely. Gently mix and  invert the vials to ensure homogeneity of the  material. Use  calibrators within  the  stability  limits  specified  in Reagents  and  discard  any  remaining material.

[0098] Non‐limiting  instructions  for  performing  the  calibration  procedure  include:  ensuring that the appropriate master curve and calibrator assigned values are entered on the  system. For information about defining the master curve and entering calibrator values, refer  to the system online help. Load the required reagents for the assay. Schedule the calibrators.  Label two sample containers with barcode  labels: one container for the  low calibrator and  one container for the high calibrator. Place the barcode labels on the sample containers with  the readable characters oriented vertically. Barcode labels are lot‐specific. Do not use barcode  labels from one lot of calibrators with any other lot of calibrators. Gently mix the product and  dispense a sufficient volume of each calibrator into the appropriate sample containers. Avoid  bubbles. The required sample volume for testing depends on several factors. For information  about  sample  volume  requirements,  refer  to  the  system  online  help.  Load  the  samples  according  to  the system online help. Dispose of any calibrator  that remains  in  the sample container after 6 hours. Do not refill or reuse sample containers. Do not return any calibrator  material back into the original container.

[0099] Non‐limiting instructions for performing quality xontrol include: for quality control  of  certain  non‐limiting  embodiments  of  the  assays  of  the  present  disclosure,  use  an  appropriate quality control material of known analyte concentration with a minimum of two  levels (low and high) at least once during each day that samples are analyzed. Use the quality  control material in accordance with the quality control instructions for use. Additional quality  control material  can  be used  at  the  discretion of  the  laboratory. Use  the quality  control  material  in  accordance with  the quality  control  instructions  for use.  In  addition, perform  quality  control:  following  a  valid  calibration;  with  use  of  a  new  lot  of  reagent;  when  troubleshooting  test  results  that  do  not  match  clinical  conditions  or  symptoms.  Follow  government  regulations  or  accreditation  requirements  for  quality  control  frequency.  Individual  laboratory quality control programs and procedures may require more  frequent  quality control testing. Acceptable performance is achieved when the analyte values obtained  are within the expected control interval for the system, as indicated by the manufacturer of  the  control material  or within  the  interval  determined  by  an  internal  laboratory  quality  control procedure. Follow your laboratory’s quality control procedures if the results obtained  do  not  fall  within  the  acceptable  limits.  For  information  about  entering  quality  control  definitions, refer to the system online help.

[0100] Non‐limiting instructions for Taking Corrective Action include: If the quality control  results  do  not  fall  within  the  expected  control  interval,  do  not  report  results.  Perform  corrective actions in accordance with established laboratory protocol. For suggested protocol,  refer to the system online help.   Results   Calculation of Results

[0101] The system determines the result using the calculation procedure described in the  system online help. The system reports results in pg / mL (common units) or pmol / L (SI units),  depending on the units defined when setting up the assay. Conversion formula: 1 pg / mL =  0.118 pmol / L For information about results outside the specified measuring interval, refer to  Measuring Interval.

[0102] Dilutions

[0103] The measuring interval is 35–35,000 pg / mL (4.13–4130 pmol / L). For information  about  dilution  options,  refer  to  the  system  online  help.  Dilute  and  retest  samples with  NT-proBNP levels > 35,000 pg / mL (4130 pmol / L) to obtain accurate results. For automated  dilutions, perform the following activities: Load a multi‐diluent (such as, but not limited to,  ADVIA Centaur Multi-Diluent 1). Ensure that sufficient sample volume  is available. Refer to  the  table  below.  Select  the  appropriate  dilution  factor.  For  automatic  dilutions  enter  a  Dilution Point ≤ 35,000 pg / mL (4130 pmol / L).   TABLE 1  Sample  Dilution  Sample Volume (µL)  S d l 15 40

[0104] pa e   esu s  e cee   e  easu g  e va  o   e  assay  when  using  automated dilution, or  if  laboratory protocol requires manual dilution, manually dilute the  patient sample. For manual dilutions, perform the following actions: Use a multi‐diluent (such  as but not  limited to, ADVIA Centaur Multi-Diluent 1; vial) to prepare a manual dilution. In  embodiments  one may  refer  to  an  operation manual  and  discussion  related  to  optional  materials. For  information about ordering  tests  for manually diluted samples,  refer  to  the  system online help. Ensure that results are mathematically corrected for dilution. If a dilution  factor is entered when scheduling the test, the system automatically calculates the result.  Interpretation of Results

[0105] Results  from  assays  of  the  present  disclosure  should  be  interpreted with  the  appropriate clinical guidelines and in conjunction with the patient’s medical history, clinical  presentation, and other  findings. Guidelines recommend using natriuretic peptides  in both  Emergency Department (ED) and Outpatient (OP) settings for diagnosis or exclusion of heart  failure. The performance of the assays of the present disclosure was evaluated separately in  each of these settings using published age‐independent and age‐dependent cut‐off values.   Emergency Department (ED) Population

[0106] For patients presenting to ED settings with clinical suspicion of HF, the NT‐proBNP  assay results should be interpreted as indicated in Table 2.   TABLE 2

[0107] Elevated or depressed natriuretic peptides  values  can be  caused by  conditions  which may confound the diagnosis of heart failure. In the ED, conditions such as chronic heart  failure,  acute  coronary  syndrome,  atrial  fibrillation,  pulmonary  embolism,  valvular  heart  disease, myocarditis, pulmonary hypertension, renal deficiency, stroke, and sepsis can elevate  NT‐ proBNP levels in the absence of acute heart failure. In addition, obesity, flash pulmonary  edema, pericarditis, and cardiac tamponade are associated with reduced NT‐proBNP levels.   Outpatient Population

[0108] In outpatient settings, the optimal use of natriuretic peptide assays excludes the  HF  diagnosis.  Therefore,  a  lower  rule‐out  cut‐off  value  which  increases  sensitivity  and  negative predictive value is needed, as these patients can present with limited, less acute HF  symptoms. For ambulatory patients presenting to outpatient facilities with clinical suspicion  of HF not previously diagnosed, the assay results should be interpreted as indicated in Table  3.  TABLE 3

[0109] Clinical conditions such as acute coronary syndrome, atrial fibrillation, pulmonary  embolism,  valvular  heart  disease, myocarditis,  pulmonary  hypertension,  renal  deficiency,  stroke, and sepsis can elevate NT‐proBNP levels in the absence of heart failure.   Limitations

[0110] Patient  samples  may  contain  heterophilic  antibodies  that  could  react  in  immunoassays  and  cause  falsely  elevated  or  depressed  results.  This  assay  is designed  to minimize interference from heterophilic antibodies. Additional information may be required  for diagnosis.

[0111] Expected Values in a Healthy Population (Table 4)

[0112] Expected values were established non‐parametrically using the ADVIA Centaur®  XP system  in accordance with CLSI Document EP28‐A3c on a population of 723 apparently  healthy subjects (362 females and 361 males) without HF.  TABLE 4

[0113] As with all  in vitro diagnostic assays, each  laboratory should determine  its own  reference  interval for the diagnostic evaluation of patient results. Consider these values as  guidance only.

[0114] Disease Study Group

[0115] ED Population: A total of 3128 subject who presented to the ED with signs and  symptoms of HF were enrolled. Of these, 1148 subjects (476 females and 672 males) were  diagnosed with  acute HF  and  included  in  the disease  study  group. NT‐proBNP  values  are  summarized in Tables 5‐6 for subjects with acute HF by subgroups based on age group (Table  5) and NYHA Functional Class (Table 6). The males with Acute HF are summarized in Table 7,  while the females with acute HF are summarized in Table 8.    TABLE 5: ED Population – All Subjects with Acute HF    T                   TABLE 8

[0116] ED Population ‐ all subjects with Acute HF (e.g, such as NYHA Functional Class). The NYHA classifications for the ED population with acute HF are provided in Table 9. Males with  Acute HF  (NYHA Functional Class) are shown  in Table 10, while  females with acute HF are  shown in Tables 11‐12.  TABLE 9         TABLE 10     TABLE 11   TABLE 12

[0117] Outpatient (OP) Population

[0118] A total of 1033 subjects who presented to the OP setting with signs and symptoms  of HF were enrolled. Of these, 185 subjects (102 females and 83 males) were diagnosed with  new onset HF and included in the disease study group. NT‐proBNP values are summarized for  subjects with new onset HF based on age group (Tables 13‐15) and NYHA Functional Class  (Tables 16‐18). Table 13 summarizes OP population – all subjects with new onset HF. Males  with  new  onset  HF  are  summarized  in  Table  14, while  females with  new  onset  HF  are  summarized in Table 15.

[0119] The NYHA classifications for the OP population with new onset HF are provided in  Table 16. Males with new onset HF  (NYHA Functional Class) are shown  in Table 17, while  females with new onset HF are shown in Table 18.    TABLE 13        TABLE 14        TABLE 15    T       TABLE  17

[0120] OP Population – Receiver Operating Characteristic Curve

[0121] The Receiver Operating Characteristic Curve (ROC) shown  in FIG. 5 presents the  clinical sensitivity and specificity for the enrolled 185 subjects diagnosed with new onset HF  and 848 subjects without HF. The area under the ROC curve for the NT‐proBNP assay is 0.839  with a 95% confidence interval of 0.804 to 0.868.

[0122] Performance Characteristics

[0123] Measuring Interval: 35 – 35,000 pg / mL (4.13 – 4130 pmol / L). The lower limit of the  measuring  interval  is defined by  the  limit of quantitation  (LoQ). Report  results below  the  measuring interval as < 35 pg / ml (4.13 pmol / L).

[0124] Detection Capability:    Limit of Blank (LoB), 13 pg / ml (1.53 pmol / L)    Limit of Detection (LoD), 20 pg / ml (2.36 pmol / L)    Limit of Quantitation (LoQ), 35 pg / ml (4.13 pmol / L)  LoB  and  LoD  values  are  representative  data.  The  LoB  corresponds  to  the  highest  measurement result likely to be observed for a blank sample with a probability of 95%. The  LoD  corresponds  to  the  lowest  concentration of NT‐proBNP  that  can be detected with  a  probability of 95%. The LoQ corresponds to the lowest amount of NT‐proBNP in a sample at which the within  laboratory CV  is 20%. Detection capability was determined  in accordance  with CLSI Document EP17‐A2.    Clinical Performance

[0125] A total of 3128 subjects with signs and symptoms of acute HF who presented to  the  ED, were prospectively  enrolled  in  a multi‐site  clinical  evaluation of one non‐limiting  embodiment of the NT‐proBNP assay of the present disclosure. Diagnosis and severity of HF  were  determined  by  an  independent  central  adjudication  panel  of  expert  clinicians  (cardiologists).  1148  subjects  were  adjudicated  as  acute  HF,  and  1980  subjects  were  adjudicated as without HF.

[0126] The descriptive statistics for the NT‐proBNP test results (pg / ml) were determined  for the ED Population at enrollment.

[0127] Table 19 summarizes the baseline characteristics for all of the ED population, while  Table 20 summarizes the baseline characteristics of the ED population by age group.    TABLE 19        TABLE 20

[0128] Likelihood Ratio

[0129] The NT‐proBNP  results were  stratified  into  three  determinations  based  on  an  overall  rule‐out  cut‐off  value  of  300  pg / ml  and  age‐specific  rule‐in  cut‐off  values,  and  compared to the adjudicated diagnosis for acute HF. The pre‐test risk (or prevalence) of HF  within this study was 36.7%. Relative to this pre‐test risk, the risk of HF increased to 67.2%  for  subjects with a positive NT‐proBNP determination  (post‐test  risk). The  likelihood  ratio  compares  the  probability  of  a  NT‐proBNP  test  result  given  acute  heart  failure  to  the  probability of a NT‐proBNP test result given heart failure. For a positive NT‐proBNP test result,  a likelihood ratio of 3.53 indicates a person with acute HF is 3.5 times more likely to have a  positive test result than a person with no acute HF. Subjects with an indeterminate result had  a reduction in post‐test risk of HF to 24.3% and were nearly half (LR 0.55) as likely to be in the  HF  population  than  in  the  negative  diagnosis  population.  For  a  negative NT‐proBNP  test  result, a  likelihood ratio of 0.07  indicates a person with acute HF  is 0.07  (less than 1 / 10th)  times likely to have a negative test than a person with no acute HF.

[0130] The analysis of clinical performance between the non‐limiting embodiment of the  NT‐proBNP assay of the present disclosure and the adjudicated diagnosis employs a 2‐by‐3  contingency  table  format.  Tables  21‐32  summarize  the  NT‐proBNP  results  versus  the  adjudicated diagnosis for acute HF (positive or negative) using the following determinations:     greater than the age‐specific rule‐in cut‐off value (positive)    between the rule‐in and rule‐out cut‐off values (indeterminate)    below the rule‐out cut‐off value (negative)  The LR should only be used for the ED population.

[0131] ED population – Clinical agreement between the NT‐proBNP results of the non‐ limiting embodiment of the assay of the present disclosure and Acute HF Diagnosis. Table 21  summarizes the results for all sex and age groups combined; Table 22 summarizes the results  by age group; Table 23 summarizes the male subjects by age group; and Table 24 summarizes  the female subjects by age group. Analyses were also performed for relevant ED population  clinical subgroups as shown in Tables 25‐32.  TABLE 21          TABLE 22                             TABLE 23                              TABLE 24    TED population – Clinical Agreement Between  NT‐proBNP Results and Acute HF Diagnosis in Patients with BMI <30 kg / m2.       TABLE 26  ED population – Clinical Agreement Between   NT‐proBNP Results and Acute HF Diagnosis in Patients with BMI ≤30 kg / m2.  TABLE 27  ED population – Clinical Agreement Between NT‐proBNP Results   and Acute HF Diagnosis in Patients with eGFR < 60 mL / Min / 1.73 m2.            TABLE 28  ED population – Clinical Agreement Between NT‐proBNP Results and  Acute HF Diagnosis in Patients with eGFR ≥ 60 mL / Min / 1.73 m2.             TABLE 29  ED Population – Clinical Agreement between NT‐proBNP Results and   Adjudicated Acute Heart Failure Diagnosis in Patients with History of Heart Failure        TABLE 30  ED Population – Clinical Agreement between NT‐proBNP Results and Adjudicated Acute Heart  Failure Diagnosis in Patients with No History of Heart Failure            TABLE 31  ED Population – Clinical Agreement between NT‐proBNP Results and   Adjudicated Acute Heart Failure Diagnosis in Patients with Comorbidities          TABLE 32  ED Population – Clinical Agreement between NT‐proBNP Results and   Adjudicated Acute Heart Failure Diagnosis in Patients without Comorbidities

[0132] The following statements are based on performance in the clinical study:

[0133] Patients with BMI ≥ 30 kg / m2 had a higher rate of  false negatives compared to  those patients with BMI < 30 kg / m2. Of the total false negatives (44 / 1148), 41 (93%) came  from patients with BMI ≥ 30 kg / m2, 1 (2.2%) came from a patient with a BMI < 30 kg / m2, and  2 (4.4%) were from patients with unknown BMI.

[0134] Patients with  eGFR  <  60 mL / min / 1.73 m2  had  a  higher  rate  of  false  positives  compared to those patients with eGFR ≥ 60 mL / min / 1.73 m2. Of the 492 total patients with  eGFR  <  60  mL / min / 1.73  m2  adjudicated  as  no  acute  HF,  226  (45.9%)  had  NT‐proBNP  concentrations ≥ ASC. Of the 1427 total patients with eGFR ≥ 60 mL / min / 1.73 m2 adjudicated  as no acute HF, 251  (17.6%) had NT‐proBNP concentrations ≥ ASC. Sixty‐one  (61) patients  adjudicated as no acute HF (3.1%) had unknown eGFR.

[0135] Patients with a history of HF had a higher rate of false positives compared to those  patients with no history of HF. Of the 527 total patients with a history of HF adjudicated as no  acute HF, 243 (46.1%) had NT‐proBNP concentrations ≥ ASC. Of the 1338 total patients with  no history of HF adjudicated as no HF, 216 (16.1%) had NT‐proBNP concentrations of ≥ ASC.  Of the 1980 patients adjudicated as no acute HF, 115 (5.8%) had unknown history of HF.

[0136] Variation in NT‐proBNP concentrations due to high BMI, low GFR, and history of  HF are extensively supported by literature.   Clinical Performance in the OP Population

[0137] A  total  of  1033 OP  subjects with  signs  and  symptoms  of  new  onset HF were  prospectively enrolled in a multi‐site clinical evaluation of one non‐limiting embodiment of  the NT‐proBNP assay of the present disclosure. The clinical performance was assessed using  a single cut‐off value of 125 pg / ml.

[0138] Diagnosis  and  severity  of  HF  were  determined  by  an  independent  central  adjudication panel of expert clinicians (cardiologists). One hundred eighty‐five (185) subjects  were adjudicated as new onset HF, and 848 subjects were adjudicated as without HF.  TABLE 33       Clinical Sensitivity and Specificity

[0139] Clinical  sensitivity  and  specificity were  determined  for  the OP  population  and  relevant  OP  clinical  subgroups  by  comparing  the  performance  of  the  non‐limiting  embodiment of the NT‐proBNP assay of the present disclosure to the adjudicated diagnosis.  Using a single cut‐off of 126 pg / mL, relative to the adjudicated diagnosis of new onset HF, the  analysis consisted of calculations of clinical sensitivity, clinical specificity, Positive Predictive  Value (PPV), and Negative Predictive Value (NPV). The results are summarized in Tables 34‐ 38.

[0140] Clinical  sensitivity  and  specificity  were  determined  in  accordance  with  CLSI  Document EP12‐A2.  TABLE 34     TABLE 35   TABLE 36 TABLE 37     TABLE 38

[0141] Precision

[0142] Precision was determined  in accordance with CLSI Document EP05‐A3. Samples  were  assayed  in  duplicate  in  2  runs  per  day  for  20  days.  The  results  in  Table  39  are  representative of the performance of the assay.    TABLE 39

[0143] Reproducibility

[0144] Reproducibility  was  determined  in  accordance  with  CLSI  Document  EP05‐A3.  Samples (N = 90) were assayed in triplicate in 2 runs per day for 5 days at 3 sites. The results  shown in Table 40 are representative of the performance of the assay.       TABLE 40

[0145] Specimen Equivalency

[0146] Specimen equivalency was determined with the Passing‐Bablok regression model  in accordance with CLSI Document EP09c‐ed3. Agreement of the specimen types may vary  depending on the study design and population tested.                 TABLE 41

[0147] The assay is designed to have a correlation coefficient of 0.950 – 1.000, a slope of  1.00 ± 0.05, and an intercept of ≤ 6 pg / mL (0.708 pmol / L).

[0148] Interferences

[0149] Hemolysis, Icterus, Lipemia (HIL)

[0150] Interference testing was performed in accordance with CLSI Document EP07‐ed3.  The substances listed in Table 42 do not interfere with the assay when present in serum at  the  concentrations  indicated.  Bias  due  to  these  substances  does  not  exceed  10%  at NT‐ proBNP concentrations of 123 ‐ 137 pg / mL (14.5 – 16.2 pmol / L) and 1612 ‐ 1813 pg / mL (190  ‐ 214 pmol / L).  TABLE 42

[0151] Other substances

[0152] Interference testing was performed in accordance with CLSI Document EP07‐ed3.  The substances listed in Table 43 do not interfere with the assay when present in serum at  the  concentrations  indicated.  Bias  due  to  these  substances  does  not  exceed  10%  at NT‐ proBNP concentrations of 116 – 163 pg / mL (13.7 – 19.2 pmol / L) and 1478 ‐ 2225 pg / mL (174  ‐ 263 pmol / L).     TABLE 43

[0153] Cross‐Reactivity

[0154] Cross‐reactivity was  determined  in  accordance with  CLSI Document  EP07‐ed3.  Cross‐reactants  listed  in Table 44 were tested at NT‐proBNP concentrations of 0 pg / mL  (0  pmol / L) and 126 – 158 pg / mL (14.9 – 18.6 pmol / L).                     TABLE 44

[0155] Linearity

[0156] Linearity testing was performed in accordance with CLSI Document EP06‐ed2. The  assay is linear for the measuring interval of 35 – 35,000 pg / mL (4.13 – 4130 pmol / L).

[0157] Onboard Dilution Recovery

[0158] Serum samples were diluted onboard the ADVIA Centaur XP System with Multi‐ Diluent 1. The results in Table 45 are representative of the performance of the assay.  TABLE 45

[0159] High‐Dose Hook Effect

[0160] High NT‐proBNP  concentrations  can  cause  a  paradoxical  decrease  in  the  RLUs  (high‐dose hook effect). In this assay, patient samples with NT‐proBNP concentrations above  the measuring  interval and as high as 300,000 pg / mL (35,400 pmol / L) will report > 35,000  pg / mL (4130 pmol / L).

[0161] Standardization

[0162] The assay is traceable to an internal standard manufactured using highly purified  material. Assigned values for calibrators are traceable to this standardization. Currently no  reference standard is available for this assay.     Example 2

[0163] Tables  46‐47  outline  the  characteristics  and  reagents  of  one  non‐limiting  embodiment of a kit constructed in accordance with the present disclosure. The non‐assay  related reagents listed (i.e., wash reagents, multidiluents, etc.) are available, for example but  not by way of limitation, from Siemens Healthineers (Malvern, PA).    TABLE 46 TABLE 47

[0164] Note  that  in  some  non‐limiting  embodiments,  the  lite  reagent,  solid  phase  reagent, ancillary well reagent, calibrator, multi‐diluent, and / or wash reagent can be stored  unopened at 2‐8°C.  In addition,  in some non‐limiting embodiments,  the  lite  reagent, solid  phase reagent, and / or ancillary well reagent are substantially stable for at least 36 days once  onboard.     Example 3

[0165] This Example contains a comparison of the biotin interference observed between  the prior art 3‐reagent NT‐proBNP assay and one non‐limiting embodiment of the 2‐reagent  NT‐proBNP assay of the present disclosure. As can be seen, biotin interference of ‐28% to ‐ 23% was observed at biotin concentrations of 200 ng / mL in the prior art 3‐reagent NT‐proBNP  assay. In contrast, substantially no biotin interference (defined as a percent bias of ≤10%) was  observed  in the assay of the present disclosure, even at a biotin concentration that is over  17x  higher  than  the  biotin  concentration  at  which  substantial  biotin  interference  was  observed in the prior art assay.  TABLE 48 Example 4

[0166] This Example contains a comparison of biotin interference observed between the  prior art 3‐reagent NT‐proBNP assay and one non‐limiting embodiment of the 2‐reagent NT‐proBNP assay of the present disclosure. As can be seen, the acceptable percent bias observed  for the assay of the present concentration occurs at a biotin concentration that  is at  least  about 50x higher  than  the biotin  concentration  at which  an  acceptable percent bias was  observed in the prior art assay.  TABLE 49 NON‐LIMITING ILLUSTRATIVE EMBODIMENTS

[0167] Illustrative embodiment 1. A kit for use in determining an amount of NT‐proBNP  in a biological sample, the kit comprising: (a) a solid phase reagent comprising a solid support  having  a  first  anti‐NT‐proBNP  antibody  or  binding  fragment  thereof  directly  or  indirectly  attached  thereto; and  (b) a  lite  reagent  comprising a  second anti‐NT‐proBNP antibody or  binding fragment thereof labeled with an acridinium ester; and wherein the first and second  anti‐NT‐proBNP antibodies or binding fragments thereof bind to non‐overlapping epitopes of  NT‐proBNP and thereby form an immunocomplex comprising (a), (b), and NT‐proBNP.

[0168] Illustrative embodiment 2. The kit of Illustrative embodiment 1, wherein the first  anti‐NT‐proBNP antibody or binding fragment thereof is biotinylated, and wherein at least a  portion of a surface of the solid support  is coated with a biotin‐specific binding molecule,  whereby the first anti‐NT‐proBNP antibody or binding fragment thereof is indirectly attached  to the solid support.

[0169] Illustrative  embodiment  3.  The  kit  of  Illustrative  embodiment  2,  wherein  the  biotin‐specific  binding  molecule  is  selected  from  the  group  consisting  of  streptavidin,  traptavidin, and avidin.

[0170] Illustrative  embodiment  4.  The  kit  of  Illustrative  embodiment  3,  wherein  the  biotin‐specific binding molecule is streptavidin.

[0171] Illustrative embodiment 5. The kit of any of Illustrative embodiments 1‐4, wherein  the solid support comprises magnetic and / or latex particles.

[0172] Illustrative embodiment 6. The kit of any of Illustrative embodiments 1‐5, wherein  the  solid  phase  reagent  of  (a)  comprises  a  biotinylated  monoclonal  sheep  anti-human  antibody specific to NT-proBNP conjugated to a magnetic particles having streptavidin coated  on at least a portion of a surface thereof.

[0173] Illustrative embodiment 7. The kit of any of Illustrative embodiments 1‐6, wherein  the lite reagent of (b) comprises an acridinium-ester-labeled monoclonal sheep anti-human  NT-proBNP F(ab')2 fragment specific to NT-proBNP.

[0174] Illustrative embodiment 8. The kit of any of Illustrative embodiments 1‐7, wherein  (a) is packaged separately from (b).

[0175] Illustrative  embodiment  8A.  The  kit  of  any  of  illustrative  embodiments  1‐8,  wherein the kit is configured for use in an emergency department setting.

[0176] Illustrative  embodiment  8B.  The  kit  of  any  of  illustrative  embodiments  1‐8A,  wherein the kit is configured for use in an outpatient setting.

[0177] Illustrative  embodiment  8C.  The  kit  of  any  of  illustrative  embodiments  1‐8B,  wherein the kit is configured for use in an emergency department and / or outpatient setting.

[0178] Illustrative  embodiment  9.  A  method  of  determining  the  presence,  severity,  and / or predisposition of Heart Failure (HF) in an individual, the method including the steps  of: (a) combining, either simultaneously or wholly or partially sequentially, to form a reaction  mixture:  (i) a biological  fluid  sample;  (ii) a  solid phase  reagent comprising a  solid  support  having a first anti‐NT‐proBNP antibody or binding fragment thereof attached thereto; and (iii)  a  lite  reagent  comprising  a  second  anti‐NT‐proBNP  antibody or binding  fragment  thereof  labeled with an acridinium ester, wherein the first and second anti‐NT‐proBNP antibodies or  binding fragments thereof bind to non‐overlapping epitopes of NT‐proBNP; (b) incubating the  reaction mixture under conditions that allow for binding of (ii) and (iii) to NT‐proBNP present  in the biological fluid sample to form an immunocomplex; and (c) measuring an amount of  immunocomplex formed to obtain a measured value for NT‐proBNP in the sample.

[0179] Illustrative  embodiment  10.  The method  of  Illustrative  embodiment  9,  further  comprising the step of: (d) using a mathematical algorithm to obtain an HF score based on  the measured value of NT‐proBNP in the sample.

[0180] Illustrative  embodiment  11.  The  method  of  Illustrative  embodiment  9  or  10,  wherein  the biological  fluid sample  is selected  from  the group consisting of blood, serum,  plasma, and combinations thereof.

[0181] Illustrative embodiment 12. The method of any of Illustrative embodiments 9‐11,  wherein the first anti‐NT‐proBNP antibody or binding fragment thereof  is biotinylated, and  wherein at  least a portion of a surface of the solid support  is coated with a biotin‐specific  binding molecule, whereby the first anti‐NT‐proBNP antibody or binding fragment thereof is  indirectly attached to the solid support.

[0182] Illustrative embodiment 13. The method of Illustrative embodiment 12, wherein  the biotin‐specific binding molecule  is  selected  from  the group  consisting of  streptavidin,  traptavidin, and avidin.

[0183] Illustrative embodiment 13A. The method of illustrative embodiment 13, wherein  the biotin‐specific binding molecule is streptavidin.

[0184] Illustrative embodiment 14. The method of any of Illustrative embodiments 9‐13A,  wherein the solid support comprises magnetic and / or latex particles.

[0185] Illustrative embodiment 15. The method of any of Illustrative embodiments 9‐14,  wherein the solid phase reagent of (ii) comprises a biotinylated monoclonal sheep anti-human  antibody specific to NT-proBNP conjugated to a magnetic particles having streptavidin coated  on at least a portion of a surface thereof.

[0186] Illustrative embodiment 16. The method of any of Illustrative embodiments 9‐15,  wherein  the  lite  reagent  of  (iii)  comprises  an  acridinium-ester-labeled monoclonal  sheep  anti-human NT-proBNP F(ab')2 fragment specific to NT-proBNP.

[0187] Illustrative embodiment 17. The method of any of Illustrative embodiments 9‐16,  wherein  substantially no  interference  from biotin present  in  the biological  fluid  sample  is  observed.

[0188] Illustrative embodiment 17A. The method of Illustrative embodiment 17, wherein  substantially no biotin interference is defined as a percent bias of ≤ 10%.

[0189] Illustrative embodiment 17B. The method of Illustrative embodiment 17 or 17A,  wherein  substantially  no  biotin  interference  is  observed  at  a  biotin  concentration  in  the  biological fluid sample of up to about 3510 ng / ml biotin

[0190] Illustrative embodiment 18. The method of any of Illustrative embodiments 9‐17,  wherein at least one of steps (b), (c), and (d) is performed on an automated analyzer.

[0191] Illustrative embodiment 19. The method of Illustrative embodiment 18, wherein  step (c) is further defined as measuring an amount of relative light units (RLUs), wherein the  amount of RLUs is directly proportional to an amount of NT‐proBNP in the sample.

[0192] Illustrative embodiment 19A. The method of any of  Illustrative embodiments 9‐ 19, wherein the method is performed in an emergency department setting.

[0193] Illustrative embodiment 19B. The method of any of  Illustrative embodiments 9‐ 19A, wherein  the method or a potion  thereof  is performed  in an outpatient  setting.   For  example, a sample may be obtained in the out‐patient setting or from an out‐patient strata  and shared with a facility suitable for performing the methods of the present disclosure or  using kits of the present disclosure.  In embodiments, the sharing may be done by sending  sample to the facility under conditions suitable for shipping biological materials.

[0194] Illustrative embodiment 19C. The method of any of  Illustrative embodiments 9‐ 19B, wherein the method is performed in an emergency department, point‐of‐care, and / or  outpatient setting.

[0195] Illustrative  embodiment  20.  A  non‐transitory  computer  readable  medium  containing  executable  instructions  that  when  executed  cause  a  processor  to  perform  operations including the method of any of Illustrative embodiments 9‐19C.

[0196] Illustrative embodiment 21. A kit for use in determining an amount of NT‐proBNP  in a biological sample, the kit comprising: (a) a solid phase reagent comprising a biotinylated  monoclonal  sheep  anti-human  antibody  specific  to NT-proBNP  conjugated  to  a magnetic  particle having streptavidin coated on at least a portion of a surface thereof; (b) a lite reagent  comprising  acridinium-ester-labeled  monoclonal  sheep  anti-human  NT-proBNP  F(ab')2  fragment specific to NT-proBNP; and wherein the antibody of (a) and F(ab’)2 fragment of (b)  bind  to  non‐overlapping  epitopes  of  NT‐proBNP  and  thereby  form  an  immunocomplex  comprising (a), (b), and NT‐proBNP.

[0197] Illustrative embodiment 22. The kit of Illustrative embodiment 21, wherein (a) is  packaged separately from (b).

[0198] Illustrative embodiment 22A. The kit of illustrative embodiment 21 or 22, wherein  the kit is configured for use in an emergency department setting.

[0199] Illustrative embodiment 22B. The kit of any of  illustrative embodiments 21‐22A,  wherein the kit is configured for use in an outpatient setting.

[0200] Illustrative  embodiment  23.  A method  of  determining  the  presence,  severity,  and / or predisposition of Heart Failure (HF) in an individual, the method including the steps  of: (a) combining, either simultaneously or wholly or partially sequentially, to form a reaction  mixture:  (i)  a  biological  fluid  sample;  (ii)  a  solid  phase  reagent  comprising  a  biotinylated monoclonal  sheep  anti-human  antibody  specific  to NT-proBNP  conjugated  to  a magnetic  particle having streptavidin coated on at least a portion of a surface thereof; (iii) a lite reagent  comprising  acridinium-ester-labeled  monoclonal  sheep  anti-human  NT-proBNP  F(ab')2  fragment specific to NT-proBNP, wherein the antibody of (ii) and F(ab’)2 fragment of (iii) bind  to non‐overlapping epitopes of NT‐proBNP; and  (b)  incubating  the reaction mixture under  conditions that allow for binding of (ii) and (iii) to NT‐proBNP present in the biological fluid  sample to form an immunocomplex; and (c) measuring an amount of immunocomplex formed  to obtain a measured value for NT‐proBNP in the sample.

[0201] Illustrative embodiment 24. The method of  Illustrative embodiment 23,  further  comprising the step of: (d) using a mathematical algorithm to obtain an HF score based on  the measured value of NT‐proBNP in the sample.

[0202] Illustrative  embodiment  25.  The method  of  Illustrative  embodiment  23  or  24,  wherein  the biological  fluid sample  is selected  from  the group consisting of blood, serum,  plasma, and combinations thereof.

[0203] Illustrative embodiment 26. The method of any of Illustrative embodiments 23‐25,  wherein  substantially no  interference  from biotin present  in  the biological  fluid  sample  is  observed.

[0204] Illustrative embodiment 26A. The method of Illustrative embodiment 26, wherein  substantially no biotin interference is defined as a percent bias of ≤ 10%.

[0205] Illustrative embodiment 26B. The method of Illustrative embodiment 26 or 26A,  wherein  substantially  no  biotin  interference  is  observed  at  a  biotin  concentration  in  the  biological fluid sample of up to about 3510 ng / ml biotin.

[0206] Illustrative embodiment 27. The method of any of Illustrative embodiments 23‐26,  wherein at least one of steps (b), (c), and (d) is performed on an automated analyzer.

[0207] Illustrative embodiment 28. The method of Illustrative embodiment 27, wherein  step (c) is further defined as measuring an amount of relative light units (RLUs), wherein the  amount of RLUs is directly proportional to an amount of NT‐proBNP in the sample.

[0208] Illustrative embodiment 28A. The method of any of Illustrative embodiments 23‐ 28, wherein the method is performed in an emergency department setting.

[0209] Illustrative embodiment 28B. The method of any of Illustrative embodiments 23‐ 28A, wherein the method is performed in an outpatient setting.

[0210] Illustrative embodiment 28C. The method of any of Illustrative embodiments 23‐ 28, wherein  the method  is performed  in an emergency department and / or or outpatient  setting.

[0211] Illustrative  embodiment  29.  A  non‐transitory  computer  readable  medium  containing  executable  instructions  that  when  executed  cause  a  processor  to  perform  operations including the method of any of Illustrative embodiments 23‐28C.

[0212] Illustrative  embodiment  30.  A method  of  determining  the  presence,  severity,  and / or predisposition of Heart Failure (HF) in an individual, the method including the steps  of:  (a)   combining, either simultaneously or wholly or partially sequentially, to  form a reaction mixture:   (i)   a biological fluid sample;  (ii)  a solid phase reagent comprising a solid support having a first  anti‐NT‐proBNP  antibody  or  binding  fragment  thereof  attached  thereto; and  (iii)  a lite reagent comprising a second anti‐NT‐proBNP antibody or  binding fragment thereof labeled with an acridinium ester, wherein the  first  and  second  anti‐NT‐proBNP  antibodies  or  binding  fragments  thereof bind to non‐overlapping epitopes of NT‐proBNP;  (b)  incubating the reaction mixture under conditions that allow for binding  of (ii) and (iii) to NT‐proBNP present in the biological fluid sample to form an  immunocomplex; and  (c)   measuring  an  amount  of  immunocomplex  formed  to  obtain  a  measured value for NT‐proBNP in the sample, wherein the method optionally  includes the step of:   (d)   using a mathematical algorithm  to obtain an HF  score based on  the  measured  value  of  NT‐proBNP  in  the  sample, wherein  the  biological  fluid  sample  is  selected  from  the group  consisting of blood,  serum, plasma, and  combinations thereof.

[0213] Illustrative  embodiment  31.  Embodiment  30  including wherein  the method  is  performed in an emergency department, point‐of‐care and / or outpatient setting.

[0214] Illustrative  embodiment  32,  Embodiment  30‐31,  wherein  the  biological  fluid  sample  is  obtained  in  the  outpatient  setting,  and  subsequently  provided  to  the  reaction  mixture.

[0215] Illustrative  embodiment  33,  Embodiment  30‐32,  wherein  the  individual  is  characterized as from an out‐patient strata.

[0216] Illustrative embodiment 34, Embodiment 30‐33, wherein the first anti‐NT‐proBNP  antibody or binding  fragment  thereof  is biotinylated, and wherein at  least a portion of a  surface of  the solid support  is coated with streptavidin, whereby  the  first anti‐NT‐proBNP  antibody or binding fragment thereof is indirectly attached to the solid support, wherein the  solid support comprises magnetic and / or latex particles, wherein: the solid phase reagent of  (ii) comprises a biotinylated monoclonal sheep anti-human antibody specific to NT-proBNP  conjugated to a magnetic particles having streptavidin coated on at least a portion of a surface  thereof; and the lite reagent of (iii) comprises an acridinium-ester-labeled monoclonal sheep  anti-human  NT-proBNP  F(ab')2  fragment  specific  to  NT-proBNP,  wherein  no  biotin  interference is observed at a biotin concentration in the biological fluid sample of up to about  3510 ng / ml, and wherein at least one of steps (b), (c), and (d) is performed on an automated  analyzer.

[0217] Thus,  in  accordance  with  the  present  disclosure,  there  have  been  provided  compositions, kits, systems, and / or methods which fully satisfy the objectives and advantages  set  forth hereinabove. Although  the present disclosure has been described  in conjunction  with the specific drawings, experimentation, results, and language set forth hereinabove, it is  evident that many alternatives, modifications, and variations will be apparent to those skilled  in  the art. Accordingly,  it  is  intended  to embrace all  such alternatives, modifications, and  variations that fall within the spirit and broad scope of the present disclosure.

Claims

What is claimed is:

1. A kit for use in determining an amount of NT‐proBNP in a biological sample, the  kit comprising:   (a)   a solid phase reagent comprising a solid support having a first anti‐NT‐ proBNP antibody or binding  fragment thereof directly or  indirectly attached  thereto; and  (b)  a lite reagent comprising a second anti‐NT‐proBNP antibody or binding  fragment thereof labeled with an acridinium ester; and  wherein the first and second anti‐NT‐proBNP antibodies or binding fragments  thereof bind to non‐overlapping epitopes of NT‐proBNP and thereby form an  immunocomplex comprising (a), (b), and NT‐proBNP.

2. The kit of claim 1, wherein the first anti‐NT‐proBNP antibody or binding fragment  thereof  is biotinylated, and wherein at  least a portion of a  surface of  the  solid  support  is  coated with  streptavidin, whereby  the  first anti‐NT‐proBNP antibody or binding  fragment  thereof is indirectly attached to the solid support.

3. The  kit of  claim 1, wherein  the  solid  support  comprises magnetic and / or  latex  particles.

4. The kit of claim 1, wherein:   the  solid  phase  reagent  of  (a)  comprises  a  biotinylated monoclonal  sheep  anti-human antibody specific to NT-proBNP conjugated to a magnetic particles  having streptavidin coated on at least a portion of a surface thereof; and  the  lite  reagent  of  (b)  comprises  an  acridinium-ester-labeled  monoclonal  sheep anti-human NT-proBNP F(ab')2 fragment specific to NT-proBNP.

5. The kit of claim 1, wherein (a) is packaged separately from (b).

6. The kit of claim 1, wherein the kit is configured for use in an emergency department  and / or outpatient setting.

7. A method of determining the presence, severity, and / or predisposition of Heart  Failure (HF) in an individual, the method including the steps of:  (a)   combining, either simultaneously or wholly or partially sequentially, to  form a reaction mixture:   (i)   a biological fluid sample;  (ii)  a solid phase reagent comprising a solid support having a first  anti‐NT‐proBNP  antibody  or  binding  fragment  thereof  attached  thereto; and  (iii)  a lite reagent comprising a second anti‐NT‐proBNP antibody or  binding fragment thereof labeled with an acridinium ester, wherein the  first  and  second  anti‐NT‐proBNP  antibodies  or  binding  fragments  thereof bind to non‐overlapping epitopes of NT‐proBNP;  (b)  incubating the reaction mixture under conditions that allow for binding  of (ii) and (iii) to NT‐proBNP present in the biological fluid sample to form an  immunocomplex; and  (c)   measuring  an  amount  of  immunocomplex  formed  to  obtain  a  measured value for NT‐proBNP in the sample.

8. The method of claim 7, further comprising the step of:   (d)   using a mathematical algorithm  to obtain an HF  score based on  the  measured value of NT‐proBNP in the sample.

9. The method of claim 7, wherein the biological fluid sample  is selected from the  group consisting of blood, serum, plasma, and combinations thereof.

10. The method  of  claim  7, wherein  the  first  anti‐NT‐proBNP  antibody  or  binding  fragment  thereof  is biotinylated,  and wherein  at  least a portion of  a  surface of  the  solid  support  is coated with streptavidin, whereby  the  first anti‐NT‐proBNP antibody or binding  fragment thereof is indirectly attached to the solid support.

11. The method of claim 7, wherein the solid support comprises magnetic and / or latex  particles.

12. The method of claim 7, wherein:   the  solid  phase  reagent  of  (ii)  comprises  a  biotinylated monoclonal  sheep  anti-human antibody specific to NT-proBNP conjugated to a magnetic particles  having streptavidin coated on at least a portion of a surface thereof; and  the  lite  reagent  of  (iii)  comprises  an  acridinium-ester-labeled  monoclonal  sheep anti-human NT-proBNP F(ab')2 fragment specific to NT-proBNP.

13. The method of  claim 7, wherein no biotin  interference  is observed  at  a biotin  concentration in the biological fluid sample of up to about 3510 ng / ml.

14. The method of claim 7, wherein at least one of steps (b), (c), and (d) is performed  on an automated analyzer.

15. The method  of  claim  14, wherein  step  (c)  is  further  defined  as measuring  an  amount of relative light units (RLUs), wherein the amount of RLUs is directly proportional to  an amount of NT‐proBNP in the sample.

16. The  method  of  claim  7,  wherein  the  method  is  performed  in  an  emergency  department, point‐of‐care and / or outpatient setting.

17. The  method  of  claim  7,  wherein  the  biological  fluid  sample  is  obtained  in  the  outpatient setting, and subsequently provided to the reaction mixture.

18. The method of claim 7, wherein the individual is characterized as from an outpatient  strata.

17. A  non‐transitory  computer  readable  medium  containing  executable  instructions  that when  executed  cause  a processor  to perform  operations  including the  method of claim 7.

Images