Anti-CD25 antibody and uses thereof

Abstract

Antibodies and antigen-binding fragments thereof for targeting CD25 and selectively depleting Tregs. In addition, nucleic acid molecules encoding such antibodies and antigen-binding fragments, and vectors and host cells comprising such nucleic acid molecules and methods for producing the antibodies and antigen-binding fragments thereof, and to uses thereof in the treatment of infectious, autoimmune and cancer diseases.

Description

ANTI-CD25 ANTIBODY AND USES THEREOFTechnical Field

[0001] The present invention generally relates to antibodies and antigen-binding fragments thereof for targeting CD25 and selectively depleting Tregs. In addition, the present invention relates to nucleic acid molecules encoding such antibodies and antigen-binding fragments, and vectors and host cells comprising such nucleic acid molecules. The invention further relates to methods for producing the antibodies and antigen-binding fragments thereof, and to uses thereof in the treatment of infectious, autoimmune and cancer diseases.Background Art

[0002] Regulatory T cells (Treg) are defined by their expression of CD4, persistently high expression of CD25, and intracellular expression of the transcription factor FoxP3. These cells play an important role in regulation of innate and adaptive immune responses. The suppressive activity of Tregs may account for poor immune response to cancer and be associated with uncontrolled pathogen growth and infectious disease progression.

[0003] CD25 is a component of interleukin-2 receptor. The IL-2 receptor (IL-2R) exists in two functional forms, the high-affinity trimeric IL-2R composed of IL-2Rα (CD25) , IL-2Rβ (CD122) and IL2Rγ (CD132) , and the intermediate -affinity dimeric IL-2R composed of IL-2Rβ and IL2Rγ. The high-affinity IL-2R assembles when IL-2 is captured by the IL-2Rα (CD25) subunit that in turn drives additional IL-2 binding and subsequent signaling by the IL-2Rβ (CD122) and IL-2Rγ (CD132) subunits; this IL-2R is found at high levels on Tregs but lower levels on T effector cells (Teff cells) . The intermediate-affinity IL-2R occurs when IL-2 binds directly to CD122 and CD132, where these subunits are found on many Ag-experienced CD8+ T cells and most NK cells. (See, e.g., IL-2 / CD25: A Long-Acting Fusion Protein That Promotes Immune Tolerance by Selectively Targeting the IL-2 Receptor on Regulatory T Cells, https:  / / doi. org / 10.4049 / jimmunol. 1800907) .

[0004] CD25 is constitutively expressed on Tregs and is absent on naive T effectors (Teff) . CD25 has been proposed as a promising target for inhibiting or eliminating Tregs. Clinical studies have been conducted to explore the use of daclizumab, a humanized IgG1 anti-human CD25 antibody, or LMB-2, a recombinant fusion protein combining anti-human CD25 Fv and a fragment of Pseudomonas exotoxin A (PE) , which displayed a variable impact on the number of circulating Tregs. However, there is no clear evidence that Tregs in the tumor microenvironment were effectively reduced, and antitumor activity has been disappointing, with no survival benefit.

[0005] There is still a need in the art to develop therapies that selectively interfere with and / or deplete Tregs and enhance the immune response in patients, such as those having infectious diseases and cancers.Summary of Invention

[0006] The present invention provides anti-CD25 antibodies, which are capable of specifically binding to CD25 without blocking the IL-2 binding to CD25 or the IL-2 signaling via CD25, and capable of selectively depleting Tregs over T effector cells, so as to enhance the immune response.

[0007] In a first aspect, the present invention provides an isolated anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising one to three (preferably three) selected from HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of a heavy chain variable region (VH) comprising or consisting of the amino acid sequence selected from the group  consisting of SEQ ID NOs: 1, 5-8 and 11-12, and / or one to three (preferably three) selected from LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of a light chain variable region (VL) comprising or consisting of the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos: 2, 8-10 and 13-14. Preferably, the HCDRs and the LCDRs are defined according to Kabat, Chothia, IMGT, or the combination thereof.

[0008] In some embodiments, the present invention provides an isolated CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof, which comprises three CDRs of a heavy chain variable region (VH) , i.e., HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and three CDRs of a light chain variable region (VL) , i.e., LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein:

[0009] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 1, 5, 6, 7, 11, or 12, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 2, 8, 9, 10, 13 or 14;

[0010] preferably, wherein:

[0011] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 2;

[0012] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 8;

[0013] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 9;

[0014] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 10;

[0015] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 8;

[0016] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 9;

[0017] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 10;

[0018] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 8;

[0019] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 9;

[0020] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 10;

[0021] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 14; or

[0022] - the amino acid sequence of the VH is as shown in SEQ ID NO: 12, and the amino acid sequence of the VL is as shown in SEQ ID NO: 13.

[0023] In some embodiments, the present invention provides an isolated anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof, which comprises three CDRs of a heavy chain variable region (VH) , i.e., HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and three CDRs of a light chain variable region (VL) , i.e., LCDR1, LCDR2 and LCDR3; wherein the VH and VL are selected from:

[0024] (1) a VH comprising the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1, and a VL comprising the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2;

[0025] (2) a VH comprising the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 6, and a VL comprising the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8;

[0026] (3) a VH comprising the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11, and a VL comprising the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 14; or

[0027] (4) a VH comprising the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 12 and a VL comprising the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13.

[0028] In some embodiments, the present invention provides an isolated anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising one to three (preferably three) of heavy chain complementary determining regions (HCDRs) , HCDR1, HCDR2 and HCDR3, wherein the HCDR1 comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 15, 21 or 23, the HCDR2 comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16 or 24, and the HCDR3 comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 17.

[0029] In one aspect, the present invention provides an isolated anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising one to three (preferably three) of light chain complementary determining regions (LCDRs) , LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the LCDR1 comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 18, the LCDR2 comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 19 or 22, and the LCDR3 comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20.

[0030] In some embodiments, the present invention provides an isolated anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising heavy chain complementary determining regions (HCDRs) , HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and light chain complementary determining regions (LCDRs) , LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein:

[0031] - the HCDR1 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 15, the HCDR2 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16, the HCDR3 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 17, the LCDR1 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 18, the LCDR2 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 19 and the LCDR3 comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20;

[0032] - the HCDR1 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 21, the HCDR2 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16, the HCDR3 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 17, the LCDR1 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 18, the LCDR2 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 22, and the LCDR3 comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20; or

[0033] - the HCDR1 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 23, the HCDR2 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24, the HCDR3 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 17, the LCDR1 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 18, the LCDR2 comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 19 and the LCDR3 comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20.

[0034] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises a heavy chain variable region (VH) , wherein the VH comprises the amino acid sequence identical to or having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1, 5, 6, 7, 11 or 12, especially as shown in SEQ ID NO:  11 or 12.

[0035] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises a light chain variable region (VL) , wherein the VL comprises an amino acid sequence identical to or having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2, 8, 9, 10, 13 or 14, especially as shown in SEQ ID NO: 13 or 14.

[0036] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein the VH comprises an amino acid sequence identical to or having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1, wherein the VL comprises an amino acid sequence identical to or having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2.

[0037] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein the VH comprises an amino acid sequence identical to or having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5, 6, or 7, wherein the VL comprises an amino acid sequence identical to or having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8, 9 or 10.

[0038] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein the VH comprises an amino acid sequence identical to or having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 6, wherein the VL comprises an amino acid sequence identical to or having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8.

[0039] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein the VH comprises an amino acid sequence identical to or having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11, wherein the VL comprises an amino acid sequence identical to or having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 14.

[0040] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein the VH comprises an amino acid sequence identical to or having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 12, wherein the VL comprises an amino acid sequence identical to or having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13.

[0041] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the  present invention comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein the VH comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1, and wherein the VL comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2.

[0042] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein the VH comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5, 6 or 7, and wherein the VL comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8, 9 or 10.

[0043] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein the VH comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 6, and wherein the VL comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8.

[0044] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein the VH comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11, and wherein the VL comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 14.

[0045] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein the VH comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 12, and wherein the VL comprises the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13.

[0046] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is a murine antibody, a chimeric antibody or a humanized antibody. In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is in the form of a full-length antibody, a Fab, a Fab', a Fab'-SH, a Fv, a single-chain antibody such as a scFv or scFab, a F(ab′) 2, or a linear antibody. In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is comprised in a multi-specific antibody (e.g., a bispecific antibody) or an immunoconjugate further comprising a therapeutic or diagnostic agent.

[0047] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is of IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 isotype. In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises an Fc region. In some embodiments, the amino acid sequence of the Fc region is identical to the sequence of the Fc region of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype, or is a variant thereof. In some embodiments, the Fc region has an enhanced binding to activating FcγRs and / or an enhanced ADCC activity, relative to a wild-type Fc region. In some embodiments, the Fc region comprises an amino acid mutant or a glycan modification conferring the enhanced binding to activating FcγRs and / or the enhanced ADCC activity. In some embodiments, the Fc region comprises a reduced fucose level, relative to a wild-type Fc region. In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is afucosylated or hypofucosylated, or the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention has a fucose level of less than 50%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%. In some embodiments,  the Fc region comprises a VLPYLL mutation.

[0048] In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention has one or more of the following properties:

[0049] (a) binding the extracellular domain of human CD25;

[0050] (b) having immunological cross-reactivity with monkey CD25;

[0051] (c) binding cells expressing human CD25 on their surface;

[0052] (d) not blocking the binding of Interleukin-2 (IL-2) to CD25;

[0053] (e) not blocking the IL-2 signaling via CD25;

[0054] (f) inducing ADCC activity in presence of NK or T cells; and

[0055] (g) selectively depleting Treg cells over CD8+ T cells.

[0056] In a second aspect, the present invention provides an isolated nucleic acid, which encodes any of the antibodies or fragment thereof according to the present invention, wherein preferably, the nucleic acid encodes the heavy chain and / or the light chain, or the heavy chain variable region and / or the light chain variable region of the antibody of the present invention.

[0057] In a third aspect, the present invention provides a vector (e.g., an expression vector) , comprising one or more nucleic acids according to the present invention, preferably wherein the vector is suitable for recombinant production of any antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention. In some embodiments, the vector is an expression vector.

[0058] In a fourth aspect, the present invention provides a host cell, comprising one or more nucleic acids, or vectors (e.g. expression vectors) according to the present invention. In some embodiments, the host cell is a mammalian cell, e.g., selected from CHO or CHO-based cells, HEK293 or HEK293-based cells. In some embodiments, the host cell is a genetically engineering cell having a modified (especially reduced or eliminated) fucosylation capacity, for example, commercially available cell lines such as Potelligent (Lonza) , and GlyMAXX (ProBiogen) .

[0059] In a fifth aspect, the present invention provides a method for producing the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention, wherein the said method comprises culturing a host cell of the present invention under conditions suitable for expressing a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, and preferably suitable for reducing or eliminating the fucosylation of the produced antibody or antigen-binding fragment. Methods for manipulating the manufacturing process, for example by controlling osmolarity and / or using enzyme inhibitors, to modify the host cell’s fucosylation capacity, are known in the art. See for example the methods described in EP2480671, WO2009135181 and WO2021127414. In some embodiments, the host cell is cultured in the presence of a protein fucosylation inhibitor, e.g., 2-fluorofucose (2-FF) , for example, 10-50μM or about 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50μM 2-FF, preferably, about 20-40μM 2-FF, e.g., about 30μM 2-FF.

[0060] In a sixth aspect, the present invention provides an immunoconjugate or a multi-specific antibody, comprising the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention.

[0061] In a seventh aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition, comprising the anti- CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof, the nucleic acid, the vector or the host cell according to the present invention, and optionally further comprising at least one pharmaceutically acceptable auxiliary substance, such as a pharmaceutical carrier or a pharmaceutical excipient.

[0062] In an eighth aspect, the present invention provides a method or a use of the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof, the nucleic acid, the vector, the host cell, the immunoconjugate or the multi-specific antibody according to the present invention, for preventing or treating a CD25-associated disease or disorder or in the preparation of a medicament for preventing or treating a CD25-associated disease or disorder. In some embodiments, the disease or disorder will benefit from the depletion of Tregs and / or the enhancement of the immune response. In some embodiments, the disease or disorder is an infectious disease or a cancer. In some embodiments, the disease or disorder is a cancer, e,g., a solid tumor or a hematological cancer. In some embodiments, the disease or disorder is selected from colorectal cancer, multiple sclerosis (MS) or organ transplantation rejection. In some embodiments, the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is administered in combined with other therapeutic agents or procedures, for treating or preventing a CD25-associated disease or disorder.

[0063] In a nineth aspect, the present invention provides a method for detecting CD25 in a sample by using the anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention. The method can be used to diagnose / detect a CD25-associated disease or disorder in a subject.

[0064] The present invention also encompasses any combinations of any embodiments described herein. Any embodiments or any combinations thereof described herein are applicable to any and all anti-CD25 antibodies or fragments, methods and uses thereof of the present invention described herein.

[0065] Brief Description of Figures

[0066] Figure 1 shows that hybridoma 75G1 antibody binds to recombinant human CD25, as measured by ELISA-based binding assay.

[0067] Figure 2 shows that hybridoma 75G1 antibody binds to SU-DHL-1 cell line expressing human CD25 on the cell surface, as measured by FACS-based binding assay.

[0068] Figure 3 shows that hybridoma 75G1 antibody does not block IL-2 binding to recombinant human CD25 protein, as measured by ELISA-based IL-2 neutralization assay.

[0069] Figure 4 shows that chimeric 75G1 antibody binds to recombinant human CD25, as measured by ELISA-based binding assay.

[0070] Figure 5 shows that chimeric 75G1 antibody binds to cynomolgus monkey CD25, as measured by ELISA-based binding assay.

[0071] Figure 6 shows that chimeric 75G1 antibody binds to SU-DHL-1 cells expressing human CD25 on the cell surface, as measured by FACS-based binding assay.

[0072] Figure 7 shows that chimeric 75G1 antibody binds to induced Treg cells (iTreg cells) expressing human CD25  on the cell surface, as measured by FACS-based binding assay.

[0073] Figure 8 shows that chimeric 75G1 antibody does not block IL-2 binding to recombinant human CD25 protein, as measured by ELISA-based IL-2 neutralization assay.

[0074] Figure 9 shows that chimeric 75G1 antibody does not block IL-2 binding to human CD25 protein on SU-DHL-1 cells, as measured by FACS-based IL-2 neutralization assay.

[0075] Figure 10 shows the ADCC activity of chimeric 75G1 antibody on SU-DHL-1 cells, as measured by ADCC reporter assay.

[0076] Figure 11 shows that humanized variants of chimeric 75G1 antibody bind to human CD25, as measured by ELISA-based binding assay.

[0077] Figure 12 shows that humanized 75G1 variants bind to SU-DHL-1 cells expressing human CD25, as measured by FACS-based binding assay.

[0078] Figure 13 shows the ADCC activity of humanized 75G1 variants, Hu75G1-HdLd, Hu75G1-HdLc, Hu75G1-HeLc, on SU-DHL-1 cells, as measured by ADCC reporter assay.

[0079] Figure 14 shows the ADCC activity of humanized 75G1 variant Hu75G1-HeL0, on SU-DHL-1 cells, as measured by ADCC reporter assay.

[0080] Figure 15 shows the SEC-HPLC purity of affinity-matured antibody H8L6.

[0081] Figure 16 shows the SEC-HPLC purity of affinity-matured antibody H5L0.

[0082] Figure 17 shows that the affinity-matured antibodies, H8L6 and H5L0, bind to SU-DHL-1 cells, as measured by FACS.

[0083] Figure 18 shows that the affinity-matured antibodies, H8L6 and H5L0, bind to iTreg cells, as measured by FACS.

[0084] Figure 19 shows that the affinity-matured antibodies, H8L6 and H5L0, bind to cynomolgus monkey CD25, as measured by ELISA-based binding assay.

[0085] Figure 20 shows that the affinity-matured antibodies, H8L6 and H5L0, do not block IL-2 binding to recombination human CD25 protein.

[0086] Figure 21 shows that affinity-matured antibody H5L0 does not block IL-2 signaling in Foxp3+ T cells, as measured by FACS-based assay.

[0087] Figure 22 shows that affinity-matured antibody H5L0 does not block IL-2 signaling in CD25+ T cells, as measured by FACS-based assay.

[0088] Figure 23 shows that different afucosylated antibodies, produced in presence of different concentrations of 2-FF, bind to SU-DHL-1 cells, as measured by FACS-based assay.

[0089] Figure 24 shows that different afucosylated antibodies, produced in presence of different concentrations of 2-FF, bind to iTreg cells, as measured by FACS-based assay.

[0090] Figure 25 shows the ADCC activities of different afucosylated antibodies on SU-DHL-1 cells, as measured by ADCC reporter assay.

[0091] Figure 26 shows the ADCC activities of different afucosylated antibodies on iTeg cells, as measured by ADCC reporter assay.

[0092] Figure 27 shows the ADCC activities of different afucosylated antibodies on CD8+ T cells, as measured by ADCC reporter assay.

[0093] Figure 28 shows the cytotoxicity activities of different afucosylated antibodies on iTreg cells, as measured by NK cell-based killing assay with E: T=8: 1.

[0094] Figure 29 shows the cytotoxicity activities of different afucosylated antibodies on activated CD8+ T cells, as measured by NK cell-based killing assay with effector cell: target cell (E: T) =8: 1.

[0095] Figure 30 shows in vivo efficacy of different versions of affinity-matured antibody H5L0. For Figures 30B to 30C, one asterisk indicates p value < 0.05; two asterisks indicate p value < 0.01; and three asterisks indicate p value < 0.001.Detailed Description

[0096] I. Definitions

[0097] Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present disclosure shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. In the event of any latent ambiguity between the present disclosure and any dictionary or extrinsic definition, definitions provided herein shall prevail. Further, unless otherwise required by context, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular. In this application, the use of “or” means “and / or” unless stated otherwise. Furthermore, the use of the term “including” , as well as other forms, such as “includes” and “included” , is not limiting. Also, terms such as “element” or “component” encompass both elements and components comprising one unit and elements and components that comprise more than one subunit unless specifically stated otherwise.

[0098] The term “about” used in combination with a numerical value is intended to encompass the numerical values in a range from a lower limit less than the specified numerical value by 5%to an upper limit greater than the specified numerical value by 5%.

[0099] The term “and / or” , used in conjunction with two or more options, shall be construed to mean any one of the options or a combination of any two or more of the options.

[0100] As used herein, the term “comprise” or “include” means the inclusion of a stated element (s) , integer (s) , or step (s) , but not the exclusion of any other element (s) , integer (s) , or step (s) . In the present disclosure, the term “comprise” or “include” encompasses the situations consisting of the stated element (s) , integer (s) or step (s) unless otherwise indicated. For example, when reference is made to a variable region of an antibody that “comprises” a particular sequence, it is also intended to encompass a variable region of an antibody that consists of that particular sequence.

[0101] As used herein, the term “antibody” refers to a polypeptide comprising at least a light or heavy chain immunoglobulin variable region that specifically recognizes and binds to an antigen. This term covers a variety of antibody structures, including, but not limited to, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, single-or multiple-chain antibodies, monospecific or multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies) , chimeric or humanized antibodies, full-length antibodies, and antibody fragments, as long as they exhibit the desired antigen-binding activities.

[0102] It will be understood by those skilled in the art that a “whole antibody” (used interchangeably herein with “full-length antibody” , “complete antibody” and “intact antibody” ) comprise at least two heavy chains (H) and two light chains (L) . Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region consists of 3 to 4 domains, CH1, CH2, and CH3, and optionally CH4. Each light chain consists of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region. The light chain constant region consists of one domain, CL. Variable regions are domains in the heavy or light chains of antibodies that are involved in the binding of the antibodies to their antigen. Constant regions are not directly involved in antibody-antigen binding, but they display a variety of effector functions. The light chains of antibodies can be assigned to one of two types, known as kappa (κ) and lambda (κ) , based on the amino acid sequences of light chain constant domains. The heavy chains of antibodies can be divided into five major types, IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, depending on the amino acid sequences of heavy chain constant regions, and several of these types can be further divided into subtypes, such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, IgA1, and IgA2. The heavy chain constant regions corresponding to different antibody types are called α, δ, ε, γ, and μ, respectively. The term “isotype” refers to the type of an antibody that is determined by the heavy chain constant region of the antibody. See generally, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W. Ed., 2nd ed., Raven Press, N. Y. (1989) ) (which is incorporated herein by reference in its entirety and for all purposes) . In a preferable embodiment, a full-length antibody comprising two heavy chains and two light chains, especially an antibody of IgG type, is used in the methods of the present invention.

[0103] The term "antigen-binding portion” of an antibody (used interchangeably herein with “antibody fragment” and “antigen-binding fragment” ) refers to a molecule other than an intact antibody that comprises a portion of an intact antibody that binds to the antigen to which the intact antibody binds. As understood by those skilled in the art, the antigen-binding portion of an antibody typically comprises amino acid residues from a “complementary determining region” or a “CDR” . An antigen-binding fragment can be prepared using recombinant DNA technology, or by enzymatic or chemical cleavage of an intact antibody. Antigen-binding  fragments include, but are not limited to, Fab, scFab, Fab’ , F (ab’ ) 2, Fab’ -SH, Fv, single-chain Fv, diabody, triabody, tetrabody, minibody, and single-domain antibody (sdAb) . More detailed description of antibody fragments can be found in Fundamental Immunology, edited by W. E. Paul, Raven Press, N. Y. (1993) ; Shao Rongguang, et al. (Editor) , Research and Application of Antibody-based Drugs. People’s Medical Publishing House (2013) ; Hollinger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993) ; and Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003) .

[0104] The term "chimeric antibody" refers to an antibody in which one part (e.g., the variable region sequence) is derived from one species and the other part (e.g., the constant region sequence) is derived from another species, e.g., an antibody in which the variable region sequence is derived from a mouse antibody and the constant region sequence from a human antibody.

[0105] The term “humanized antibody” refers to an antibody in which CDR sequences derived from non-human mammalian species (such as mice) are grafted into the framework region sequences of human origin. Additional modifications to framework and / or CDR regions can be made to further refine one or more properties of the humanized antibody.

[0106] An “isolated” antibody is one that has been separated from a component of its natural environment, or purified from a component of the environment producing it. In some embodiments, the antibody is purified to greater than 95%or 99%purity, as determined by, for example, electrophoresis (e.g., SDS-PAGE, isoelectric focusing (IEF) , capillary electrophoresis) or chromatography (e.g., ion exchange or reverse phase HPLC) . For a review of methods for assessing antibody purity see, e.g., Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87.

[0107] The term “epitope” refers to a region in an antigen to which an antibody binds. Epitopes can be formed by contiguous amino acids or non-contiguous amino acids juxtaposed by tertiary folding of a protein. In some embodiments, the anti-CD25 antibody according to the present invention binds to the extracellular domain of human CD25. Preferably, the antibody binds to an epitope on human CD25 that is not the same as or overlapping to that of IL-2 binding so that the antibody does not block the interaction of CD25 with IL-2.

[0108] The terms “CD25” and “IL-2Rα” are used interchangeably herein and refer to Interleukin-2 receptor subunit alpha. The expressions include variants, isoforms, homologs, and species homologs of CD25. The term “human CD25” or “hCD25” refers to CD25 of a human sequence. A specific human CD25 sequence is shown under Uniprot Accession Number P01589. In some embodiments, a human CD25 sequence has at least 95%, or even 96%, 97%, 98%, or 99%amino acid sequence identity to the human CD25 amino acid sequence under Accession Number P01589. Amino acid sequences of CD25 proteins of other species, such as mouse and monkey CD25 sequences, are available from the Uniprot protein sequence database. In the present disclosure, “CD25” encompasses fragments of CD25, such as fragments comprising extracellular domain. In the present disclosure, the term CD25, if not explicitly indicated as from a non-human species (e.g., “monkey CD25” ) , refers to CD25 from human, or a biologically active fragment thereof.

[0109] The term “specifically bind” means that an antibody selectively or preferentially binds to an antigen. If an antibody binds to human CD25 with a KD of about 5× 10-7 M or less, about 1× 10-7 M or less, about 5× 10-8 M or less, about 1× 10-8 M or less, or about 5× 10-9 M or less based on Bio-Layer Interferometry (BLI) or  Surface Plasmon Resonance, the antibody is considered as an antibody that “specifically binds to human CD25” . However, antibodies that specifically bind to human CD25 can be cross-reactive with CD25 proteins from other species. For example, in some embodiments, an antibody of the invention is specific for human CD25, and in some embodiments, the antibody is cross-reactive with CD25 protein from cynomolgus monkeys, but not with murine CD25. Methods of determining cross-reactivity include the methods described herein in the Examples and the standard assays known in the art, for example, by using an ELISA-based binding assay or a FACS-based binding assay.

[0110] The term "affinity" or "binding affinity" refers to the intrinsic binding affinity that reflects the interactions between members of a binding pair. The affinity of a molecule X for its partner Y can generally be represented by an equilibrium dissociation constant (KD) , which is the ratio of a dissociation rate constant to an association rate constant (kdis and kon, respectively) . Affinity can be measured by common methods known in the art. A specific method for measuring affinity is the ForteBio or Biacore kinetic binding assay described herein. In some embodiments, an anti-CD25 antibody of the invention binds to human CD25 with high affinity.

[0111] The term "high affinity” for an IgG antibody means that the antibody binds to a target antigen with a KD of 1× 10-7 M or less, preferably 5 × 10-8 M or less, more preferably about 1× 10-8 M or less, and even more preferably about 5x10-9 M or less. However, a "high affinity” for binding may vary with different antibody isotypes. For example, for an antibody of IgM isotype, a "high affinity” "means that the antibody has a KD of 1× 10-6 M or less, preferably 1× 10-7 M or less, more preferably about 1× 10-8 M or less.

[0112] As used herein, the term “non-IL-2 blocking” and similar terminology, with reference to an anti-CD25 antibody, means that the anti-CD25 antibody and antigen-binding fragment thereof is capable of specific binding to the CD25 subunit of the IL-2 receptor without blocking the IL-2 binding to CD25 or inhibiting the IL-2 signaling via CD25. In some embodiments, an anti-CD25 antibody of the invention is a non-IL-2 blocking antibody, and in some embodiments, the anti-CD25 antibody allows more than 90%, 80%, 70%, 60%, or 50%of IL-2 signaling in response to IL-2 binding to CD25, as compared to the level of signaling in the absence of the anti-CD25 antibody. Detection of IL-2 / CD25 binding or IL-2 signaling can be performed using the assays known in the art or described in this disclosure, such as those exemplified in the Examples. In some embodiments, IL-2 signaling can be determined by measuring by the levels of phosphorylated STATS protein in cells, using a standard Stat-5 phosphorylation assay.

[0113] As used herein, the term “depleted” or “depleting” , with respect to the depletion of T regulatory cells by an anti-CD25 antibody, means that the number, ratio or percentage of Tregs is decreased relative to when the anti-CD25 antibody is not administered. In some embodiments, an anti-CD25 antibody of the invention is capable of depleting T regulatory cells, and in some embodiments, over about 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%or 99%of T regulatory cells in tumor (i.e., tumor-infiltrating Treg cells) and / or in peripheral blood (i.e., peripheral Treg cells) of a subject are depleted by the anti-CD25 antibody. The depletion of Treg cells by an anti-CD25 antibody can be measured in methods known in the art or disclosed in the present disclosure, for example, in an in vitro NK-based assay as described in the Examples, or in an in vivo tumor-bearing animal model as described in the Examples. In some embodiments, the ratio of T effector cells / T regulatory cells in the peripheral blood and / or tumor of a subject receiving the anti-CD25 antibody can be measured to reflect the selective depletion of Treg cells over Teff cells.

[0114] The term “T regulatory cells” or “Treg cells” , as used herein, refers to a lineage of CD4+ T lymphocytes specialized in controlling autoimmunity, allergy and infection. Typically, Treg cells can be characterized by the expression of biomarkers CD4, CD25 and Foxp3. Normally, peripheral CD4+ T lymphocytes comprises about 5-10%Treg cells. However, tumor-infiltrating Treg cells within a tumor microenvironment may constitute about 20-30%of the CD4+ T lymphocyte population.

[0115] The term "Fc region” is used herein to define a C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that contains at least a portion of the constant region. The term includes native sequence Fc-regions and variant Fc-regions. In an embodiment, a human IgG heavy chain Fc region extends from Cys226 or from Pro230 to the carboxy terminus of the heavy chain. However, the C-terminal lysine (Lys447) of the Fc-region may or may not be present. Unless otherwise indicated herein, the numbering of amino acid residues in the Fc-region or constant region is according to the EU numbering system, also known as the EU Index, as described in Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) , NIH Publication 91-3242.

[0116] The term “VLPYLL mutation” , with reference to a Fc region, is used herein to refer to the mutation L235V / F243L / R292P / Y300L / P396L in a Fc region, according to the EU numbering. The presence of the VLPYLL mutation in a Fc region has been shown to increase IgG Fc binding affinity to the FcγRIIIa present on immune effector cells such as natural killer cells and lead to enhanced ADCC activity. See, for example, Futa Mimoto et al., “Novel asymmetrically engineered antibody Fc variant with superior FcγR binding affinity and specificity compared with afucosylated Fc variant” , MAbs. 2013 Mar 1; 5 (2) : 229–236, doi: 10. 4161 / mabs. 23452 (which is incorporated herein by reference in its entirety and for all purposes) .

[0117] The term “protein fucosylation inhibitor” is used herein to refer to an agent, for example small chemical molecule, capable of inhibiting antibody fucosylation. Fucose analogues, such as 2-fluorofucose and 5-alkynylfucose are examples of the inhibitors, which have been shown to generate afucosylated monoclonal antibodies. The mechanism of action of the inhibitors may involve depletion of intracellular GDP-fucose with a subsequent block of the de novo pathway or the inhibition of FUT8. See, for example, Natasha A. Pereira et al., “The “less-is-more” in therapeutic antibodies: Afucosylated anti-cancer antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity” , MAbs. 2018 Jul; 10 (5) : 693–711, doi: 10. 1080 / 19420862.2018.1466767 (which is incorporated herein by reference in its entirety and for all purposes) .

[0118] As used herein, the term “effector functions” refers to the biological activities which are attributable to the Fc region of an antibody and which vary with the antibody isotype. Examples of effector functions of antibodies include: C1q binding and complement dependent cytotoxicity (CDC) ; Fc receptor binding; antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) ; antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP) . CDC, ADCC and ADCP can be measured using assays that are known in the art (Clynes et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-6) . In some embodiments, an anti-CD25 antibody of the invention that does not inhibit the binding of IL-2 to CD25 elicits a strong CDC response and / or a strong ADCC and / or a strong ADCP response on T regulatory cells.

[0119] The term “Fc receptor” or “FcR” as used herein describes a receptor that binds to an antibody Fc region. In  some embodiments, FcR is FcγR (agamma receptor) , including receptors of FcγRI, FcγRII, and FcγRIII subclasses, and also including allelic variants and alternative splicing forms of those receptors. Human FcγRs are functionally categorized into activating or inhibitory. Activating receptors contain an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) in their cytoplasmic domains. Inhibitory receptors contain an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) in their cytoplasmic domains (see, for example, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997) ) . Engagement of activating or inhibitory FcγRs by IgG immune complexes induces immunostimulatory or immunosuppressive signals, respectively, influencing thereby the IgG-mediated effector functions. Examples of activating FcγRs include FcγRI (CD64) , FcγRIIa (CD32a) , FcγRIIc (CD32c) and FcγRIIIa (CD16a) . Examples of inhibitory FcγRs include FcγRIIb (CD16b) . For a review of FcγR, see, e.g., Stylianos Bournazos, et al., Fcγ Receptor Pathways during Active and Passive Immunization, Immunol Rev. 2015 Nov; 268 (1) : 88–103., doi: 10.1111 / imr. 12343.

[0120] The term “ADCC” , as used herein, relates to a mechanism of cell-mediated immune defense whereby an effector cell of the immune system actively lyses a target cell, whose membrane-surface antigens have been bound by specific antibodies. Classical ADCC is mediated by natural killer (NK) cells; macrophages, neutrophils and eosinophils can also mediate ADCC. The ADCC activity can be determined by methods known in the art. Such methods comprise, among others, the ADCC report assay as shown in the Examples. Other suitable assays include chromium-51 [Cr51] release assay, europium [Eu] release assay, and sulfur-35 [S35] release assay. Usually, in such a release assay, a labelled-target cell line expressing a surface-exposed CD25 antigen is incubated with antibody specific for that antigen. After washing, effector cells expressing Fc receptor CD 16 are co-incubated with the antibody-labelled target cells. Target cell lysis is subsequently measured by release of intracellular label by a scintillation counter or spectrophotometry.

[0121] The term "variant" , with reference to an antibody, is used herein to refer to an antibody comprising an antibody region of interest that has been modified in amino acids by substitution, deletion and / or insertion of at least one amino acids, e.g., 1-30 amino acids, or 1-20 amino acids or 1-10 amino acids (e.g., 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids) , as compared to a reference antibody, wherein the variant substantially retains at least one biological property (e.g., antigen-binding capacity) of the original antibody molecule without the modification. The antibody region of interest may be the full length of the antibody, or the heavy chain variable region, the light chain variable region, or the combination thereof, or the heavy chain CDR region (s) or the light chain CDR region (s) or the combination thereof.

[0122] In the present disclosure, "sequence identity" refers to the degree to which a sequence is identical to another on a nucleotide-by-nucleotide or amino acid-by-amino acid basis in a comparison window. The "percentage of sequence identity" can be calculated using the following method: comparing two optimally aligned sequences in a comparison window to determine the number of the positions where the same nucleic acid base (e.g., A, T, C, G, I) or the same amino acid residue (e.g., Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys, and Met) is present in the two sequences so as to obtain the number of matching positions, then dividing the number of matching positions by the total number of the positions in the comparison window (i.e., window size) , and multiplying the result by 100 to obtain the percentage of sequence identity. The optimal alignment for determining the percent sequence identity can be achieved in a variety of ways known in the art, for example, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DASTAR) software. One skilled in the art can determine suitable parameters for aligning sequences, including any algorithm required to achieve maximum alignment over  the full length of the sequence being compared or within a sequence region of interest.

[0123] In the present disclosure, for antibody sequences, the percentage of amino acid sequence identity is determined by optimally aligning a candidate antibody sequence with a reference antibody sequence, and in a preferred embodiment by optimally aligning according to the Kabat numberings. In the present disclosure, if not specifying a comparison window (i.e., the antibody region of interest to be compared) , the alignment is made over the full length of the reference antibody sequence. In some embodiments, sequence identity may be present along the entire heavy chain variable regions and / or the entire light chain variable regions of antibodies, or sequence identity may be limited to the framework regions only, with the sequences in corresponding CDR regions remaining 100%identical.

[0124] Similarly, for antibody sequences, a candidate antibody with an amino acid modification in an antibody region of interest, as relative to a reference antibody, can be identified based on sequence alignment.

[0125] In the present disclosure, a "conservative substitution" means an amino acid modification by which an amino acid is replaced with a chemically similar amino acid. Amino acid modifications such as substitutions can be introduced into the antibodies of the present invention using standard methods known in the art, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. A table of conservative substitutions providing functionally similar amino acids is well-known in the art. In a preferable aspect, residues for conservative substitution are from the following conservative substitution table, Table A, and preferably are the residues under preferred conservative substitutions in Table A.

[0126] Table A

[0127] In some embodiments, the antibodies of the present invention comprise antibody sequences having conservative substitutions, for example, antibody sequences that are derived from an exemplary antibody sequence of the invention (e.g., any one or combination of SEQ ID Nos: 1 to 10) by introducing one or more conservative substitutions, especially preferred conservative substitutions in Table A.

[0128] The terms "individual" and "subject" are used herein interchangeably to refer to a mammal. Mammals include, but are not limited to, domesticated animals (e.g., cows, sheep, cats, dogs, and horses) , primates (e.g., humans and non-human primates such as monkeys) , rabbits, and rodents (e.g., mice and rats) . In particular, the term "subject" refers to a human.

[0129] In the present disclosure, "treatment" includes 1) a therapeutic measure that cures, postpones, alleviates the symptoms of and / or halts the progression of a diagnosed pathological condition or a disorder; and 2) a prophylactic or preventive measure that prevents and / or postpones the development of a pathological condition or a disorder. Thus, subjects in need of treatment include individuals having already developed a disorder, individuals susceptible to a disorder, and individuals to be prevented from a disorder. The individuals will benefit from the therapeutic or prophylactic measure and exhibit a reduction or improvement in the occurrence, recurrence, or progression of a disease, disorder, condition, and / or symptom as compared to an individual not receiving the said treatment. In some embodiments, the present invention involves the treatment of a disease or a disorder. In other embodiments, the present invention involves the prevention of a disease or a disorder.

[0130] In some embodiments of the invention, "treatment" of a disease or a disorder means amelioration of the disease or the disorder (i.e., slowing or preventing or reducing the progression or at least one clinical symptom) . In some other embodiments, "treatment" means relief or improvement of at least one physical parameter, including those physiological parameters that may be indiscernible by patients. In some other embodiments, "treatment" means modulating a disease or a disorder physically (e.g., stabilizing a discernible symptom) , physiologically (e.g., stabilizing a physical parameter) , or both. Unless explicitly otherwise indicated herein, methods for assessing the therapeutic and / or prophylactic efficacy of a disease or disorder are generally known in the art.

[0131] In some embodiments of the present invention, "treatment" of a disease or a disorder means "prevention" of a disease or a disorder, including inhibition of the occurrence or progression of the disease or the disorder or a particular symptom of the disease or the disorder. In some embodiments, the subject is a candidate for a prevention regimen. Typically, the term "prevention" refers to administration of a drug prior to the appearance of any signs or symptoms of a disease or a disorder, particularly in a subject at risk of developing a disease.

[0132] As used herein, the term “CD25-associated diseases or disorders” is used to refer to a disease or a disorder associated with an CD25 activity.

[0133] The following subsections will further detail various aspects of the invention.

[0134] I. Anti-CD25 Antibodies of the Present Invention

[0135] In one aspect, the present invention provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to CD25, preferably human CD25 protein. In some embodiments, the antigen-binding  fragments of the antibodies of the present invention are an antibody fragment selected from the following antibody fragments: Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, a single-chain antibody such as scFv and scFab, (Fab’ ) 2 fragment and a linear antibody.

[0136] CDR Region of Antibody

[0137] “Complementarity determining region” or “CDR region” or “CDR” (used interchangeably herein with hypervariable region “HVR” ) is an amino acid region in the variable region of an antibody that is predominantly responsible for binding to an epitope of an antigen. The CDRs of heavy and light chains are commonly referred to as CDR1, CDR2, and CDR3, numbered sequentially from the N-terminus. The CDRs located within the variable domain of an antibody heavy chain are referred to as HCDR1, HCDR2, and HCDR3, while the CDRs located within the variable domain of an antibody light chain are referred to as LCDR1, LCDR2, and LCDR3.

[0138] The VH and VL sequence combinations of some exemplary antibodies of the Invention are given in Table B below:

[0139] Table B

[0140] In some embodiments, an antibody of the invention comprises the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences contained in the VH and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences contained in the VL, of any one of the antibody shown in Table 8.

[0141] In some preferable embodiments, an antibody of the invention comprises: (i) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences contained in the VH of SEQ ID NO: 12; and (ii) the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences contained in the VL of SEQ ID NO: 13.

[0142] Various schemes for determining the CDR sequences of a given VH or VL amino acid sequence are known in the art. For example, Kabat complementarity determining regions (CDRs) are determined based on sequence variability and are the most commonly used ones (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . Chothia scheme refers to the positions of the structural loops (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) ) . AbM HVRs are a compromise between Kabat HVRs and Chothia structural loops and are used by Oxford Molecular's AbM antibody modeling software. "Contact" HVRs are based on analysis of available complex crystal structures. Residues of each HVR / CDRs according to the different CDR determination schemes are described below.

[0143] HVRs can also be determined based on the same positions according to Kabat numbering as a reference CDR sequence (e.g., any one of the exemplary CDRs of the invention, for example, the sequences of SEQ ID NOs: 15-20) .

[0144] Unless otherwise specified, the term "CDR" or "CDR sequence" or "HVR" or "HVR sequence" used herein includes HVR or CDR sequences determined in any of the ways described above.

[0145] Unless otherwise specified, residue positions in an antibody variable region (including heavy chain variable region residues and light chain variable region residues) referred to herein are numbered according to the Kabat numbering system (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) .

[0146] Table C below gives some exemplary CDR sequence combinations of the invention:

[0147] In one embodiment, an antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the antibody comprises:

[0148] (i) six CDR sequences contained in the VH and VL sequences of any of the antibodies listed in Table B; or

[0149] (ii) six CDR sequences contained in any of the combinations listed in Table C; or

[0150] (iii) six CDR sequences, which, relative to the sequences of (i) or (ii) , collectively include at least one but not more than 10 or 5, 4, 3, 2, 1 amino acid modifications (preferably amino acid substitutions, preferably conservative substitutions) .

[0151] In a preferable embodiment, an antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention comprises:

[0152] (i) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences of the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 1, and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences of the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 2,

[0153] (ii) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences of the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 5, 6 or 7, and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences of the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 8, 9 or 10,

[0154] (iii) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences of the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 11, and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences of the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 14, or

[0155] (iv) the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 sequences of the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 12 and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences of the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 13.

[0156] In a preferable embodiment, an antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention comprises three complementarity-determining regions of a heavy chain variable region (HCDRs) , and three complementarity-determining regions of a light chain variable region (LCDRs) , wherein,

[0157] (a) HCDR1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15; HCDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16; HCDR3 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17; LCDR1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18; LCDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, and LCDR3 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20;

[0158] (b) HCDR1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, HCDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16; HCDR3 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17; LCDR1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18; LCDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, and LCDR3 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20; or

[0159] (c) HCDR1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23; HCDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24; HCDR3 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17; LCDR1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18; LCDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, and LCDR3 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.

[0160] In a preferable embodiment, an antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention comprises three complementarity-determining regions of a heavy chain variable region (HCDRs) , and three  complementarity-determining regions of a light chain variable region (LCDRs) , wherein,

[0161] - the HCDR1 comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23,

[0162] - the HCDR2 comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24,

[0163] - the HCDR3 comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17,

[0164] - the LCDR1 comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18,

[0165] - the LCDR2 comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and

[0166] - the LCDR3 comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

[0167] Antibody Variable Region

[0168] A "variable region" or "variable domain" is a domain in the heavy or light chain of an antibody that is involved in binding of the antibody to antigen thereof. A heavy chain variable region (VH) and a light chain variable (VL) region can be further subdivided into hypervariable regions (HVRs, also known as complementarity-determining regions (CDRs) ) , interspersed with more conservative regions (i.e., framework regions (FRs) ) . Each VH or VL consists of three CDRs and four FRs, arranged in the following order from amino-terminus to carboxy-terminus: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0169] As known in the art, one or more residues in one or both of the two variable regions (i.e., VH and / or VL) of an antibody can be modified. For example, a residue modification, especially a conservative residue substitution, can be made in VH or VL or both VH and / VL regions of an antibody, while substantially retaining at least one desired biological property (e.g., the binding activity to the antigen of interest) . The binding properties or other functional properties of a mutated antibody can be assessed by in vitro or in vivo assays. For example, a framework region residue of an antibody can be mutated to improve a property of the antibody via a technique such as affinity maturation.

[0170] CDR grafting is another type for antibody variable region modification known in the art. Since CDR sequences are responsible for most antibody-antigen interactions, a recombinant antibody variant can be constructed to mimic the properties of a known antibody. In such an antibody variant, CDR sequences from the known antibody are grafted onto framework regions from a different antibody with a different property. Thus, in one embodiment, the present invention relates to an anti-CD25 antibody, or antigen-binding fragment thereof, comprising CDR sequences from the heavy and light chain variable regions of one of the antibodies presented in Table B, but with different framework region sequences. The framework region sequences for such substitution can be obtained from public DNA databases, including germline antibody gene sequences, or from published anti-CD25 antibody sequences. For example, germline DNAs for human heavy and light chain variable region genes are available from the GenBank database. The sequence of the antibody protein can be compared with the protein sequences in databases using sequence similarity search tools, such as Gapped BLAST, to find suitable framework candidates. Preferably, as compared to the framework sequence of the antibody of the invention to be modified, the framework sequence for substitution has a sequence identity, e.g., a sequence identity of at least 80%, 85%or 90%, or more than 95%, 96%, 97%, 98%or 99%.

[0171] Thus, in one aspect, the present invention provides an antibody comprising a heavy chain variable region comprising or consisting of the VH sequence of any of the antibodies listed in Table B, or a variant thereof. In another aspect, the present invention provides an antibody comprising a light chain variable region comprising or consisting of the VL sequence of any of the antibodies listed in Table B, or a variant thereof.

[0172] In one embodiment, the variant VH / VL sequence has at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99%or greater identity in amino acid sequence compared to the reference VH / VL sequence. In one embodiment, the variant VH / VL sequence comprises at least one and no more than 30, 10, or 5, 4, 3, 2 amino acid modifications (preferably amino acid substitutions, preferably conservative substitutions) in amino acid sequence compared to the reference VH / VL sequence. Preferably, the sequence modification (s) does not occur in the CDR regions.

[0173] In some embodiment, an antibody of the invention comprises:

[0174] (i) a VH sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a sequence having at least 80%, 85%or 90%, or preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity thereto;

[0175] (ii) a VH sequence comprising the amino acid sequence shown in one of SEQ ID NOs: 5-7 and 11-12, or a sequence having at least 80%, 85%or 90%, or preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity thereto;

[0176] (iii) a VH sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, or a sequence having at least 80%, 85%or 90%, or preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity thereto; or

[0177] (iv) a VH sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or a sequence having at least 80%, 85%or 90%, or preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity thereto.

[0178] In some embodiment, an antibody of the invention comprises:

[0179] (i) a VL sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a sequence having at least 80%, 85%or 90%, or preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity thereto;

[0180] (ii) a VL sequence comprising the amino acid sequence shown in one of SEQ ID NOs: 8-10, or a sequence having at least 80%, 85%or 90%, or preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity thereto;

[0181] (iii) a VL sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, or a sequence having at least 80%, 85%or 90%, or preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity thereto; or

[0182] (iv) a VL sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, or a sequence having at least 80%, 85%or 90%, or preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity thereto.

[0183] In some embodiment, an antibody of the invention comprises:

[0184] (i) a VH sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a sequence having at least 80%, 85%or 90%, or preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity thereto, and / or a VL sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a sequence having at least 80%, 85%or 90%, or preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity thereto; or

[0185] (ii) a VH sequence comprising the amino acid sequence shown in one of SEQ ID NOs: 5-7 and 11-12, or a sequence having at least 80%, 85%or 90%, or preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity thereto, and / or a VL sequence comprising the amino acid sequence shown in one of SEQ ID NOs: 8-10 and 13-14, or a sequence having at least 80%, 85%or 90%, or preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity thereto.

[0186] In some preferable embodiment, an antibody of the invention comprises a VH sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a VL sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

[0187] In some preferable embodiment, an antibody of the invention comprises a VH sequence comprising the  amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 5-7, and a VL sequence comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 8-10.

[0188] In some preferable embodiment, an antibody of the invention comprises a VH sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and a VL sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.

[0189] In some preferable embodiment, an antibody of the invention comprises a VH sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and a VL sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.

[0190] Antibody heavy chains and light chains

[0191] In some embodiments, an antibody of the invention comprises a heavy chain constant region, such as an Fc region of an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype. In some embodiments, an antibody of the invention comprises a kappa or lambda light chain constant region, such as a human kappa light chain constant region.

[0192] In some preferable embodiments, an antibody of the invention comprises a Fc region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence comprising at least one, two or three, but not more than 20, 10 or 5 amino acid modifications relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or a sequence having at least 95%to 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

[0193] In some preferable embodiment of the invention, an antibody of the invention comprises a light chain constant region. In a preferable embodiment, the light chain constant region is a human kappa light chain constant region. In a further preferable embodiment, the light chain constant region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or an amino acid sequence comprising at least one, two or three, but not more than 20, 10 or 5 amino acid modifications relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or a sequence having at least 95%to 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

[0194] Fc engineered antibody

[0195] In one aspect, the present invention provides an Fc engineered antibody with modulated effector function (s) . As used herein, the term “Fc engineered antibody” is an antibody comprising a Fc region engineered to have a modification with the aim of modulating (enhancing or reducing / eliminating) effector functions. The modification may be an amino acid modification in the Fc (that is, protein-Fc engineered antibody) or a glycosylation modification on the Fc (that is, glycol-Fc engineered antibody) .

[0196] In some embodiment, an Fc engineered antibody of the invention is an antibody with enhanced ADCC activity. One class of Fc engineered antibodies with enhanced ADCC activity is an afucoslyated or hypofucosylated antibody, which is an antibody without, or with a reduced number of, fucose attached to the Fc region. The second class of Fc engineered antibodies with enhanced ADCC activity is an antibody comprising a Fc region mutated at amino acid residues involved in interactions with FcγRs.

[0197] In some embodiments, the anti-CD25 antibody of the invention is an afucosylated or hypofucosylated  antibody. Afucosylated or hypofucosylated antibodies can be generated by using expression platforms incapable of fucosylation, for example, a genetically engineering cell line with absent or reduced fucosylation capacity (such as FUT8 knock out cells and those cell lines commercially available, including Potelligent (Lonza) , GlyMAXX (ProBiogen) ) , or by manipulating the manufacturing process, for example by controlling osmolarity and / or using protein fucoslyation inhibitors, see also for example the methods described in EP2480671. As will be understood, the generated antibody preparation will be a population of antibody molecules comprising a mixture of individual normally-fucosylated, afucosylated and / or hypofucosylated antibodies, and thus may exhibit any degree of fucosylation from 0%to 100%. As a consequence, in some aspects, an anti-CD25 antibody of the present invention may refer to a population of antibody molecules in a preparation comprising one or more of the fucosylated, afucosylated and hypofucosylated forms of the antibody.

[0198] For clarity, the term “afucosylated” and the term “hypofucosylated” are used herein to refer to individual antibody molecule lacking fucose or having a reduced number of fucose attached to Fc region of the antibody. The term "level of fucose" or "level of fucosylation" is used herein to refer to a population of antibody molecules wherein the individual antibody molecules in the population have the same antibody protein sequence while possibly having the same or different fucosylation form. Correspondingly, reference to “an antibody with a stated level of fucose” means a population of antibody molecules having the stated level of the fucosylated species of the antibody. In some embodiments, the antibody according to the present invention comprises a fucose level of less than less than 50%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%. The level of fucosylation can be determined by methods according to the art. Such methods comprise, among others, digestion with Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) , to deglycosylate the antibodies, and subsequent collection of the isolated glycan. The collected glycan can be characterized using HPLC or LC / MS. See, e.g., US9856502B2, content of which is incorporated herein by reference. In some embodiments, the afucosylated antibody of the invention is produced in a mammalian host cell in a culture medium comprising a protein fucosylation inhibitor. In some embodiments, the fucosylation inhibitor is 2-FF. The fucosylation level of the antibody can be controlled by adjusting the amount of the 2-FF in the medium.

[0199] In some embodiments, the anti-CD25 antibody of the invention is an antibody comprising a Fc region having a mutation that confers enhanced ADCC activity. In vitro and / or in vivo cytotoxicity assays can be conducted to confirm the alteration of ADCC activities. For example, a Fc receptor (FcR) binding assay can be conducted to ensure that an antibody have an enhanced FcγRIIIa binding (and therefore enhanced ADCC activity) , while a reduced FcγRII binding ability. NK cells, the main cells that mediate ADCC, only express FcγRIII, while monocytes express FcγRI, FcγRII and FcγRIII. FcR expression on hematopoietic cells is summarized in Table 3 on page 464 of Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Tmmunol ·9: 457-492 (1991) . The binding sites with FcγRI, FcγRII, FcγRIII and FcRn on human IgG1 have been depicted, and variants with improved binding have been described (see Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604, 2001) . Various strategies have been used to develop more effective antibodies with desired ADCC activities. These include site-directed mutagenesis, alanine scanning, structure based computational design, directed evolution technologies, yeast display, and asymmetric engineering.

[0200] It has been demonstrated that amino acid sequence variants that exhibit increased binding to FcγRIII also possess enhanced ADCC activity (Shields et al. (2001) J. Biol. Chem., 276: 6591-6604) . For human FcγRIIIA, this subset includes, for example, the following: (1) Lys274-Arg301 and Tyr407-Arg416; (2) Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299, and Ala327-Ile332, and (3) T256, K290, S298, E333, K334, A339; see also variants disclosed in U. S. Patent Application No. 2004 / 0228856. For example, Fc variants T256A, K290A, S298A, E333A, K334A, A339T have been described as having enhanced ADCC activity as compared to native sequences (see, e.g., Shields, supra) . Furthermore, a number of amino acids can be mutated without any loss of ADCC function.

[0201] In some embodiments, the anti-CD25 antibody of the invention comprises a Fc region having one or more amino acids mutated at the following positions: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, and 439, numbered according to the EU numbering system. In some embodiments, said one or more amino acids are mutated at the following positions: L234, L235, G236, S239, F243, T256, D265, H268, D270, K290, R292, S298, Y300, V305, K326, A330, I332, E333, K334, A339 and P396, numbered according to the EU numbering system. In some embodiments, said one or more amino acids which are mutated are selected from the following substitutions: L235V, G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305I, A330L, I332E, E333A, K334A, A339T and P396L, numbered according to the EU numbering system.

[0202] In some preferable embodiments, the anti-CD25 antibody of the invention comprises a Fc region having a mutation, selected from the group consisting of S298A / E333A / K334A; S239D / A330L / I332E; G236A / S239D / A330L / I332E; and L235V / F243L / R292P / Y300L / P396L. In some preferable embodiments, the anti-CD25 antibody of the invention comprises a Fc region having a VLPYLL mutation.

[0203] Antibody variants

[0204] In one aspect, the present invention provides variants of any of the antibodies described herein, especially the exemplary antibodies listed in Table B. In one embodiment, the antibody variant retains at least 60%, 70%, 80%, 90%, or 100%of a biological activity (e.g., antigen-binding activity) of the unmodified antibody. In some embodiments, the modification in the antibody variant do not cause loss of the antigen-binding activity, but optionally conferring a property such as an improved antigen-binding affinity and a different effector function.

[0205] As will be understood, the heavy chain variable region, the light chain variable region, or each CDR / FR region, of an antibody can be modified individually or in combination. In some aspects, the present invention provides an antibody variant having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%or greater sequence identity in heavy chain variable region, as compared to a reference antibody (e.g., one of the antibodies listed in Table B) . In some aspects, the present invention provides an antibody variant having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%or greater sequence identity in light chain  variable region, as compared to a reference antibody (e.g., one of the antibodies listed in Table B) . In some aspects, the present invention provides an antibody variant having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%or greater sequence identity in heavy chain variable region and light chain variable region, as compared to a reference antibody (e.g., one of the antibodies listed in Table B) .

[0206] In addition, the Fc region of an antibody can be altered. The modification in the Fc region can be made alone or in combination with the modification to the VH / VL regions described above. The Fc region may be modified to alter one or more of the functions of the antibody, such as serum half-life, complement fixation, Fc receptor binding, and / or antigen-dependent cytotoxicity. In addition, an antibody of the invention can also be chemically modified (e.g., conjugated with PEG) , or have altered glycosylation pattern.

[0207] In some embodiments, the Fc region of an antibody of the present invention may contain one or more amino acid substitutions that increase ADCC activity, e.g., substitutions at Fc region positions 298, 333, and / or 334 (EU numbering scheme for residues) . In some embodiments, the Fc region may be modified to result in altered (i.e., increased or decreased) C1q binding and / or complement-dependent cytotoxicity (CDC) (see, for example, US6,194,551, WO99 / 51642 and Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) : 4178-4184) .

[0208] In some other embodiments, the Fc region may be modified to increase or decrease its glycosylation level and / or to alter its glycosylation pattern. Addition or deletion of glycosylation sites of the Fc region can be conveniently achieved by altering the amino acid sequence so as to create or remove one or more glycosylation sites. For example, one or more amino acid substitutions can be made to eliminate one or more glycosylation sites, thereby eliminating glycosylation at the sites. Antibodies with altered glycosylation patterns can be prepared, such as low-or non-fucosylated antibodies with reduced contents of fucosyl residues or antibodies with increased bisecting GlcNac structures. Such altered glycosylation patterns have been shown to increase ADCC activities of antibodies. The present invention also contemplates antibody variants having at least one galactose residue in an oligosaccharide attached to Fc region. These antibody variants may have an improved CDC function.

[0209] In certain embodiments, the present invention also contemplates antibody variants that have some but not all effector functions, which makes them ideal candidates for certain applications where the in vivo half-life of an antibody is important, but some effector functions, such as complement and ADCC, are unnecessary or deleterious. For example, Fc region may comprise a mutation that eliminates or attenuates an effector function, such as a human IgG1 Fc region harboring the mutations P329G and / or L234A and L235A, or a human IgG4 Fc region harboring the mutations P329G and / or S228P and L235E.

[0210] In some embodiments, mutations that may facilitate antibody production in the cross-mAb format may be introduced into the Fc region, such as knob-into-hole mutations. See, e.g., WO2016075035.

[0211] In certain embodiments, it may be desirable to produce cysteine-engineered antibodies, such as "thioMabs" , in which one or more antibody residues are substituted with a cysteine residue. For example, the number of cysteine residues in the hinge region of an antibody can be altered, e.g., to facilitate the assembly of light and heavy chains or increase or decrease the stability of the antibody. See, e.g., U.S. Patent No. 5,677,425.

[0212] In certain embodiments, the antibodies provided herein can be further modified to contain a non-protein moiety. The moieties suitable for antibody derivatization include, but are not limited to, water soluble polymers. Non-limiting examples of water-soluble polymers include, but not limited to, polyethylene glycol (PEG) , which can be used, for example, to extend the half-life (e.g., in serum) of an antibody. Methods for PEGylation of proteins are known in the art and can be applied to the antibodies of the invention. See, e.g., EP 0154 316 and EP 0401384.

[0213] Antibody properties

[0214] In some embodiments, the anti-CD25 antibody of the present invention has one or more of the following properties:

[0215] (a) binding the extracellular domain of human CD25;

[0216] (b) having immunological cross-reactivity with monkey CD25;

[0217] (c) binding cells expressing human CD25 on their surface;

[0218] (d) not blocking the binding of Interleukin-2 (IL-2) to CD25;

[0219] (e) not blocking the IL-2 signaling via CD25;

[0220] (f) inducing ADCC activity in presence of NK or T cells; and

[0221] (g) selectively depleting Treg cells over CD8+ T cells.

[0222] In some embodiments, the anti-CD25 antibody of the present invention binds to human CD25, especially to the extracellular domain of human CD25, with a high affinity, such as with a KD value of less than 100 nM, such as less than 50 nM, such as less than 30 nM, preferably less than 10 nM or 5 nM, or more preferably, less than 1 nM, wherein preferably the KD value is measured using surface plasmon resonance (SPR) assay or bio-layer interferometry (BLI) assay;

[0223] In some embodiments, the anti-CD25 antibody of the present invention binds to human CD25 expressed on the surface of cells (such as Treg cells) , with a high affinity, such as with a EC50 value of less than 50 nM, such as less than 20 nM, preferably less than 10 nM, more preferably less than 5 nM or 1 nM, wherein preferably the EC50 value is measured using FACS-based binding assay, e.g., the assay described in the Examples.

[0224] In some embodiments, the anti-CD25 antibody of the present invention does not block the binding of Interleukin-2 (IL-2) to CD25, as measured in an in vitro cell-based FACS assay, e.g., the assay described in the Examples. In some embodiments, the anti-CD25 antibody of the present invention allows more than 90%, 80%, 70%, 60%, or 50%of IL-2 binding to CD25, relative to the binding level in the absence of the anti-CD25 antibody.

[0225] Preferably, the antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention exhibit at least one, preferably at least two, more preferably at least three, four, or five of the above properties, and even more preferably all of the above properties. Preferably, the antibodies of the invention are a humanized antibody. Still preferably, the antibodies of the invention are antibodies produced and isolated from mammalian producer cells, such as CHO cells, in presence of a protein fucosylation inhibitor such as 2-FF. In one  embodiment, the inhibitor is present in a concentration of about 1-100μM, for example, about 5μM, about 10μM, about 15μM, about 20μM, about 25μM, about 30μM, about 35μM, about 40μM, about 45μM, about 50μM, about 55μM, about 60μM, about 65μM, about 70μM, about 75μM, about 80μM, preferably 10-30μM. In some embodiments, the anti-CD25 antibody recombinantly produced in the host cell comprises a fucose level of less than 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%.

[0226] 1.2 Nucleic acids of the present invention and host cells comprising the same

[0227] In one aspect, the invention provides nucleic acids encoding any of the anti-CD25 antibodies or fragments thereof above mentioned. The nucleic acids may encode an amino acid sequence comprising the light and / or heavy chain variable regions of an antibody, or an amino acid sequence comprising the light and / or heavy chains of an antibody.

[0228] In one embodiment, one or more vectors comprising the nucleic acids are provided. In one embodiment, the vector is an expression vector.

[0229] In one embodiment, a host cell comprising the vector is provided. Suitable host cells for cloning or expression of antibody-encoding vectors include prokaryotic or eukaryotic cells. For example, antibodies may be produced in bacteria, in particular when glycosylation and Fc effector function are not needed. For expression of antibody fragments and polypeptides in bacteria, see, e.g., U.S. Patent Nos. 5,648,237, 5,789,199, and 5,840,523; and also Charlton, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (Lo, B.K.C. (ed. ) , Humana Press, Totowa, N J (2003) , p. 245-254, describing expression of antibody fragments in E. coli) . After expression, the antibody may be isolated from the bacterial cell paste in a soluble fraction and can be further purified.

[0230] In one embodiment, the host cell is eukaryotic. In another embodiment, the host cell is selected from the group consisting of yeast cells, mammalian cells or other cells which are suitable for preparing the antibodies or the antigen binding fragments thereof. For example, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeasts are the suitable cloning or expression hosts for antibody-encoding vectors, including fungi and yeast strains whose glycosylation pathways have been “humanized” , resulting in the production of an antibody with a partially or fully human glycosylation pattern. See Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) , and Li, et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006) . Host cells suitable for the expressing glycosylated antibodies are also derived from multicellular organisms (invertebrates and vertebrates) . Vertebrate cells may also be used as hosts. For example, mammalian cell lines that are adapted to grow in suspension may be used. Other examples of useful mammalian host cell lines are monkey kidney CV1 lines (COS-7) transformed with SV40; human embryonic kidney lines (293 or 293T cells, such as described e.g. in Graham, et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977) ) . Examples of useful mammalian host cell lines also include Chinese hamster ovary (CHO) , including DHFR-CHO cells (Urlaub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 216 (1980) ) ; and myeloma cell lines such as Y0, NS0 and Sp2 / 0. For a review of certain mammalian host cell lines suitable for antibody production, see, e.g., Yazaki and Wu, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, (Ed. ) , Humana Press, Totowa, NJ) , p. 255-268 (2003) .

[0231] In one embodiment, a method of preparing an anti-CD25 antibody is provided, wherein the method comprises culturing a host cell comprising a nucleic acid encoding the antibody, as provided above, under conditions suitable for expression of the antibody, and optionally recovering the antibody from the host cell  (or host cell culture medium) . For recombinant production of an anti-CD25 antibody, nucleic acid encoding an antibody, e.g., the antibody described above, is isolated and inserted into one or more vectors for further cloning and / or expression in a host cell. Such nucleic acid may be readily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., by using oligonucleotide probes that are capable of binding specifically to genes encoding the heavy and light chains of the antibody) .

[0232] In some embodiment, a method of preparing an anti-CD25 antibody having reduced fucose level is provided, comprising: culturing a host cell in a culture medium comprising an effective amount of a protein fucosylation inhibitor (e.g., a fucose analog) under suitable growth conditions, wherein the host cell expresses the antibody having an Fc domain having reduced fucose level, and isolating the antibody from the cells. The fucose analog according to the present invention may be known in the art, such as those described in WO2009135181. In some embodiments, the fucose analog is 2-fluorofucose. In one embodiment, the 2-fluorofucose is added into the culture medium in a concentration of about 1-100μM, for example, about 5μM, about 10μM, about 15μM, about 20μM, about 25μM, about 30μM, about 35μM, about 40μM, about 45μM, about 50μM, about 55μM, about 60μM, about 65μM, about 70μM, about 75μM, about 80μM, preferably 10-30μM. Preferably, the antibody or antigen-binding fragment produced according to the method of the present invention has a fucose level of less than 50%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, or 5%, for example, about 15%to 30%fucose level.

[0233] 1.3 Pharmaceutical Compositions and Pharmaceutical Formulations

[0234] The present invention further provides pharmaceutical compositions comprising one or more monocolonal antibodies which binds to CD25 or immunologically active fragment thereof. It should be understood that the anti-CD25 antibody or the pharmaceutical composition provided in the present invention may be formulated into carriers, excipients and other agents suitable in a formulation for co-administration, resulting in improved transfer, delivery, tolerance, and the like.

[0235] The term "pharmaceutical composition" refers to a formulation which is present in a form so as to permit the biological activity of the active ingredient contained in the formulation to be effective, and which contains no additional components that are unacceptably toxic to a subject to which the formulation would be administered. The term "pharmaceutical carrier" refers to diluents, adjuvants (e.g. Freund's adjuvant (complete or incomplete) ) , excipients, or vehicles with which the therapeutic agent is administered.

[0236] The present invention further includes a composition comprising an anti-CD25 antibody (including a pharmaceutical compositions or pharmaceutical formulation) and a composition comprising a polynucleotide acid encoding anti-CD25 antibody. In certain embodiments, the composition comprises one or more antibodies which bind to CD25 or one or more polynucleotide acids encoding one or more antibodies which bind to CD25. These compositions may further comprise suitable pharmaceutical carriers, such as pharmaceutical excipients known in the field, including buffering agents.

[0237] The pharmaceutical compositions of the invention can comprise an antibody of the invention and pharmaceutical carriers. These pharmaceutical compositions can be contained in a kit.

[0238] Pharmaceutical carriers suitable for use in this invention may be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral  oil, sesame oil and the like. Water is the preferable carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be used as liquid carriers, especially for injectable solutions. Suitable pharmaceutical carriers include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol and the like. For the usage of excipients and use thereof, see also “Handbook of Pharmaceutical Excipients” , 5th Edition, R.C. Rowe; P.J. Seskey and S.C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicago. The compositions, if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsion, tablets, pills, capsules, powders, sustained-release formulations and the like. Oral formulation can include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, and saccharin.

[0239] Pharmaceutical formulations comprising an anti-CD25 antibody of the invention described herein can be prepared by mixing the anti-CD25 antibody of the invention having the desired degree of purity with one or more optional pharmaceutical carriers (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Osol, A. Ed. (1980) ) , preferably in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions.

[0240] Exemplary lyophilized antibody formulations are described in US Patent No. 6,267,958. Aqueous antibody formulations include those described in US Patent No. 6,171,586 and WO2006 / 044908.

[0241] The pharmaceutical compositions or formulations of the invention can further contain more than one active ingredient as necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. The active ingredients are present appropriately in combination at amounts effective to use of interest.

[0242] Sustained-release formulations may be prepared. Suitable examples of sustained-release formulations include semi-permeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the antibody, which matrices are the shaped articles, e.g., films, or microcapsules.

[0243] 1.4 Immunoconjugate and immune fusion

[0244] In some embodiments, the present invention provides an immunoconjugate, comprising any anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof provided by the present invention conjugated to a second substance. In one embodiment, the second substance is, for example, a diagnostic or therapeutic agent. In some embodiments, the present invention provides an immune fusion comprising any anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof fused to a heterogeneous polypeptide or peptide. In some embodiments, the immunoconjugate and the immune fusion are used for preventing or treating CD25-associated diseases or disorders.

[0245] 1.5 Treatment Methods and Uses

[0246] In one aspect, the present invention provides a method of preventing or treating a disease or a disorder associated with an CD25 activity, or for depleting regulatory T cells in a subject.

[0247] The terms "individual" and "subject" are used herein interchangeably and refer to a mammal. Mammals include, but are not limited to, domesticated animals (e.g., cows, sheep, cats, dogs, and horses) , primates  (e.g., humans and non-human primates such as monkeys) , rabbits, and rodents (e.g., mice and rats) . In some preferable embodiments, the subject according to the present invention is a human. In another preferable embodiments, the subject according to the present invention is a non-human mammal animal.

[0248] The term "treatment" , as used herein, refers to a clinical intervention intended to alter the natural course of a disease or a disorder in an individual being treated. The desired therapeutic effects include, but are not limited to, preventing disease onset or recurrence, alleviating symptom, minimizing any direct or indirect pathological consequences of disease or disorder, preventing metastasis, postponing disease progression, improving or relieving disease status, as well as alleviating or improving prognosis.

[0249] Accordingly, in one embodiment, the present invention relates to a method of preventing or treating a disease or disorder associated with an CD25 activity (i.e., a CD25-associated disease or disorder) . The CD25 -associated diseases or disorders includes diseases or disorders that can be ameliorated, alleviated, prevented, or treated by depleting CD25-expressing T regulatory cells or by enhancing immunity. In an aspect, the method is for treatment purpose, and the subject already has the disease or disorder. In another aspect, the method is for prevention purpose, and the subject is suspected of or at the risk of developing the disease or disorder. In some embodiments, the method comprises administering to a subject in need thereof an effective amount of an anti-CD25 antibody of the invention.

[0250] The terms “therapeutically effective amount” , “therapeutically effective dose” and “effective amount” herein refer to the amount of the anti-CD20 antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention that effectively prevents or improves the symptoms of one or more diseases or conditions or the development of the diseases or conditions when given to cells, tissues or subjects alone or in combination with other therapeutic drugs. Therapeutically effective dose also refers to the amount of the antibody or antigen-binding fragment thereof that is sufficient to result in improvement of the symptoms, such as the amount to treat, cure, prevent or improve related medical conditions or to increase the speed of treatment, cure, prevention or improvement of such conditions. When the active ingredient alone is administered to an individual, the therapeutically effective dose refers only to the ingredient. When administered in combination, the therapeutically effective dose refers to the total amount of active ingredients contributing to therapeutic effects, regardless of administration in combination, in sequence or at the same time. The effective amount of the therapeutic agent will result in an improvement in the diagnostic criteria or parameter by at least 10%, typically at least 20%, preferably at least about 30%, more preferably at least 40%, and most preferably at least 50%.

[0251] In some embodiments, the antibody of the invention is used to treat a cancer. As used herein, the term “cancer” (used interchangeably herein with “tumor” ) refers to the physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth. Examples of cancer include a solid tumor and a hematological cancer, for example, carcinoma, lymphoma, leukemia, blastoma and sarcoma.

[0252] In some embodiments, the method of the invention includes administering an effective amount of an anti-CD25 antibody of the invention to the subject having a cancer. In one embodiment, the cancer is a solid tumor, selected from the group consisting of for example, brain cancer, lung cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, renal cancer, bladder cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, ovarian cancer, melanoma. In another embodiment, the cancer is a hematological cancer,  selected from the group consisting of for example, lymphomas, such as Hodgkin lymphomas, and lymphocytic leukemias, such as chronic lymphocytic leukemia. In some embodiments, the anti-CD25 antibody depletes T regulatory cells in peripheral blood and / or in tumor of the subject. In some embodiments, the anti-CD25 antibody increases the ratio of effector T cells (e.g., CD8+ T cells) to T regulatory cells in a solid tumor and / or in peripheral blood. In one embodiment, the cancer is colorectal cancer. In one embodiment, the anti-CD25 antibody is an antibody of IgG1 isotype. In one embodiment, the anti-CD25 antibody is afucosylated or hypofucosylated. In some embodiments, the anti-CD25 antibody comprises a fucose level of less than 50%, 40%, 30%or 20%. In another embodiment, the anti-CD25 antibody comprises a Fc comprising a VLPYLL mutation. In one embodiment, the anti-CD25 antibody enhances tumor regression, impairs or reduces tumor growth, and / or enhances survival time of the subject.

[0253] In some embodiments, an antibody of the invention is used to treat solid tumors. In the treatment context, the antibody of the invention can be used alone or in combination with additional anti-tumor agent (s) .

[0254] Furthermore, it has been shown that the suppressive activity of Tregs may be associated with autoimmune diseases, infectious diseases, and organ transplantation. See, e.g., Bo-Jin Chen et al., “Immunotherapy of Cancer by Targeting Regulatory T cells” , International Immunopharmacology, Volume 104, March 2022, 108469, https:  / / doi. org / 10.1016 / j. intimp. 2021.108469; and Maíra Felonato et al., “Anti-CD25 Treatment Depletes Treg Cells and Decreases Disease Severity in Susceptible and Resistant Mice Infected with Paracoccidioides brasiliensis” , PLoS One. 2012; 7 (11) : e51071, doi: 10.1371 / journal. pone. 0051071. Therefore, in some embodiments, the present invention contemplates an antibody of the invention or antibody fragment thereof for use to treat an infectious disease, such as fungus infection. In some embodiments, the present invention contemplates an antibody of the invention or antibody fragment thereof for use to treat an autoimmune disease such as multiple sclerosis (MS) . In some embodiments, the present invention contemplates an antibody of the invention or antibody fragment thereof for use to treat organ transplantation rejection.

[0255] In the treatment methods of the invention, the antibodies of the invention can be administered alone or in combination with a second therapeutic agent, such as a second therapeutic agent suitable for treating the disease or disorder to be treated or for decreasing a side effect (s) associated with the administration of the anti-CD25 antibody of the invention. The combined administration includes concomitant administration (wherein two or more therapeutic agents are contained in the same or different formulations) and separate administration (wherein the antibodies of the invention are administered before, simultaneously with, or after the administration of additional therapeutic agent (s) ) .

[0256] The antibodies of the invention (and pharmaceutical compositions or immunoconjugates comprising the same, and any additional therapeutic agent) can be administered via any suitable administration mode, including parenteral administration, intrapulmonary administration, and intranasal administration as well as intralesional administration if local treatment is required. Parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intra-arterial, intraperitoneal or subcutaneous administration. Any suitable route, such as injection, e.g., intravenous or subcutaneous injection, can be adopted, partially depending on whether the administration is a short-time one or a long-term one. The present disclosure encompasses a variety of dosing courses, including, but not limited to, single dosing or multiple dosing at multiple time points, bolus dosing, and pulsed infusion.

[0257] For the purpose of prevention or treatment, the appropriate dosage of an antibody of the invention, when used alone or in combination with one or more additional therapeutic agents, will be selected depending on the type of disease or disorder to be treated, the type of antibody, the severity and course of the disease or disorder, whether the antibody is administered for prophylactic or therapeutic purpose, previous treatment, the patient's clinical history and response to the antibody treatment, as well as the judgment of the attending physician. The antibody is suitably administered to the patient in a single treatment or over a series of treatments.

[0258] In the foregoing methods of the invention, a composition, a multispecific antibody or an immunoconjugate of the invention may be administered in lieu of an antibody or antigen-binding portion of the invention. Alternatively, in these methods, in addition to administering the antibody or antigen-binding portion of the invention, the composition, multispecific antibody or immunoconjugate of the invention can be further administered.

[0259] In yet another aspect, the present invention provides the uses of anti-CD25 antibodies, compositions, immunoconjugates, and multispecific antibodies of the invention in the manufacture of a medicament for use in the foregoing methods (e.g., for treatment) .

[0260] 1.6 Methods and Compositions for Diagnostics and Detection

[0261] In certain embodiments, any of the anti-CD25 antibodies or antigen-binding fragments thereof provided herein is useful for detecting the presence of CD25 in a biological sample. The term "detecting" as used herein includes quantitative or qualitative detection. In certain embodiments, a biological sample is blood, serum or other liquid samples of biological sources. In certain embodiments, a biological sample comprises a cell or tissue.

[0262] In certain embodiments, labeled anti-CD25 antibodies are provided. Labels include, but are not limited to, labels or moieties that are detected directly (such as fluorescent, chromophoric, electron-dense, chemiluminescent, and radioactive labels) , as well as moieties, such as enzymes or ligands, that are detected indirectly, e.g., through an enzymatic reaction or molecular interaction. Exemplary labels include, but are not limited to, the radioisotopes 32P, 14C, 125I, 3H, and 131I, fluorophores such as rare earth chelates or fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, dansyl, umbelliferone, luceriferases, e.g., firefly luciferase and bacterial luciferase (U.S. Patent No. 4,737,456) , fluorescein, 2, 3-dihydrophthalazinediones, horseradish peroxidase (HR) , alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucoamylase, lysozyme, saccharide oxidases, e.g., glucose oxidase, galactose oxidase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase, heterocyclic oxidases such as uricase and xanthine oxidase, coupled with an enzyme that employs hydrogen peroxide to oxidize a dye precursor, such as HR, lactoperoxidase, or microperoxidase; biotin / avidin, spin labels, bacteriophage labels, stable free radicals, and the like.

[0263] The invention is further illustrated with the following examples. However, it should be understood that the invention is described with the examples in an illustrative manner other than limiting one, and various modifications may be made by the person skilled in the art.

[0264] Example 1 production of anti-CD25 monoclonal antibody

[0265] Immunization and Hybridoma Fusion

[0266] C57B / L6 mice were immunized subcutaneously and intraperitoneally using Fc-tagged human CD25 (Acro biosystem) emulsified in Complete Freund's Adjuvant (Pierce) at a 1: 1 ratio. After initial immunization, the recombinant CD25 protein was given every two weeks as a booster to the inoculated animals. After immunizations, anti-serum from the mice was collected for an ELISA experiment to determine the anti-hCD25 titer.

[0267] Four days following the last boost, the animals were killed and spleen cells were separated for hybridoma fusion. Electro-fusion was employed to fuse the spleen cells with mouse myeloma cell line SP2-0 cells. The resultant hybridoma cells were grown in hypoxanthine-aminopterin-thymidine-containing DMEM medium. Hybridoma supernatants were obtained for antigen binding screening after a 10-day culture.

[0268] Hybridoma Screening

[0269] An ELISA plate was coated with 100 μL per well of 0.5 μg / mL full-length human CD25 protein with his tag (Acro biosystem) . After blocking the plate with PBS containing 1%BSA + 1%normal goat serum + 0.05%Tween20, hybridoma supernatants were added to the plate for 1hr. The specific binding of the hybridoma antibodies to human CD25 was detected with an HRP-linked anti-mouse IgG antibody. Finally, 100 μl / well of TMB (3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidine) was added to each well. After the reaction was terminated using 0.64M H2SO4, the plate was read on a Thermo MultiskanTM FC Microplate Reader at 450nm. The clones that demonstrated positive ELISA binding were selected for further activity screening. Ab19 (a reference anti-human CD25 antibody, disclosed in the patent application US20200010554A1) was used as control in the ELISA assay. The selected clone 75G1A5C10 demonstrated a great binding activity to human CD25 protein (Figure 1) .

[0270] The positive hybridoma clone with good binding activity was selected and expanded. After centrifugation and filtration, the antibody-containing supernatant was loaded onto protein A column and purified with the GE AKTA purification system. After washing, antibodies were eluted with citric acid (pH3.5) . The antibodies were ready for further evaluation.

[0271] Characterization of Hybridoma antibody

[0272] FACS-based Cellular Binding Assay

[0273] To test the binding activity to CD25-expressing cells, SU-DHL-1 cell line with high expression of human CD25 at the cell surface was employed. In a 96-V bottom plate, 60, 000 SU-DHL-1 cells were plated per well. After a wash, anti-CD25 antibodies (serially diluted in the assay buffer, starting from the concentration of 10 μg / ml) were added into the wells of the plate and incubated for 1 hour at 4℃. After two washes, anti-mouse IgG antibody (FITC) (1: 500 dilution) was added to the wells, and then incubated at 4 ℃ for one hour. The plate was ready for detection by Beckman cytoflex FACS device after two washings. Ab 19 and PC-61 (a reference anti-mouse CD25 antibody, also depicted in US20200010554A1) were used as control in the FACS assay. In contrast to anti-mouse PC-61, the human CD25 specific antibodies, Ab 19 and clone 75G1A5C10, were capable of binding to SU-DHL-1 cells (Figure 2) .

[0274] IL-2 neutralization Assay

[0275] The CD25 protein with his tag (Acro biosystem) was diluted to 0.5 μg / mL with a coating buffer having a high pH (0.16%Na2CO3, 0.3%NaHCO3, pH9.8) , and used to coat a ELISA plate at 100 μl / well by incubation overnight at 4℃. The plate was then washed one time on an automatic plate washer using a washing buffer (PBS +0.1%Tween 20) . 200 μl per well of a blocking buffer (PBS+1%BSA+1%Goat serum+0.05%Tween 20) was added and incubated for 2 hours at room temperature. The blocking buffer was then aspirated off, and 100 μl per well of anti-CD25 antibody serially diluted in a dilution buffer (PBS+1%BSA+1%Goat serum+0.01%Tween 20) was transferred to the wells of the ELISA plate and allowed to incubate for 60 min at room temperature. After washing again, 100 μl per well of 0.1 μg / ml biotinylated IL-2 (R&D) in the dilution buffer , and then 100 μl / well of Neutravidin-HRP (Thermo) diluted in the dilution buffer were added to the wells of the plate. The ELISA plate was incubated for 20 min at room temperature and then washed 3 times with 250 μl / well washing buffer. Finally, 100 μl / well of TMB substrate was added. After the reaction was terminated using 0.64M H2SO4, the plate was read on a Thermo Multiscan FC at 450nm. Anti-human CD25 antibodies, Ab19 and Daclizumab (in-house generated based on the sequences under DrugBank Accession Number DB00111, which can block IL-2 binding to CD25) , were included as control in the assay. Hybridoma 75G1A5C10 did not block the IL-2 binding to human CD25, while daclizumab that was set as positive control showed the blocking activity (Figure 3) .

[0276] Example 2 Molecular construction, production and characterization of chimeric antibody

[0277] V-gene cloning and sequencing of hybridoma antibodies

[0278] The lead antibody 75G1A5C10 with a desired activity profile was selected for V-gene cloning. The sequences of the light chain and heavy chain variable regions of the murine anti-human CD25 antibody were obtained by the polymerase chain reaction (PCR) amplification technique. Total RNA was extracted from hybridoma cells using the MiniBest Universal RNA Extraction Kit (TaKaRa) , and the cDNA was synthesized using the 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa) with Oligo (dT) primer. The variable regions of mouse IgG genes were amplified by PCR using primers for different isotypes of heavy chains and primers for Kappa light chains. The PCR products were subcloned into a TA cloning vector. For each variable gene construct, more than 10 single colonies were used for DNA sequencing by Synbio Technologies (Suzhou, China) . The amino acid sequences of Vh and Vk were derived from the DNA sequencing results.

[0279] Construction of chimeric antibody

[0280] Murine antibody 75G1 (derived from clone 75G1A5C10) was selected as lead antibody to generate a chimeric antibody with a human IgG1 constant region. The sequences of antibody 75G1 are listed in Table 1. After sequence analysis and confirmation, cDNAs of the variable regions of heavy chain and light chain of murine 75G1 were synthesized and fused respectively to the sequence of the human IgG1 constant region and the sequence of the human kappa constant region. To improve the antibody secretion, a signal peptide sequence was added at N-terminal of heavy chain and light chain, respectively. The resulting chimeric antibody genes were cloned into an expression vector. Large-scale preparation of plasmid DNAs were performed by using Plasmid Maxi-prep System from Qiagen.

[0281] Table 1. Variable region sequences of murine or chimeric antibody

[0282] Note: CDRs defined by Kabat are marked with bold and underline

[0283] Expression and Purification of Chimeric Antibody

[0284] Using the ExpiFectamine CHO transfection kit, the plasmids containing the light chain and heavy chain of the chimeric 75G1 antibody were transfected into ExpiCHO-STM cells. The transfected ExpiCHO-Scells were cultured in the ExpiCHOTM serum-free Expression Medium (Gibco) . 14 days post transfection, the supernatants were collected. After centrifugation and filtration, the supernatants were loaded onto protein A column and then purified with the GE AKTA purification system. After washing, antibodies were eluted with citric acid (pH3.5) .

[0285] Characterization of Chimeric Antibody

[0286] Binding Assay

[0287] His-tagged full-length CD25 proteins, including human CD25-His (Acro biosystem) , cynomolgus monkey CD25-His (Sino Biological) , rat CD25-His (Sino Biological) , mouse CD25-His (Acro biosystem) , were used to detect the binding activity of the chimeric antibody. An ELISA plate was coated by adding 100 μl per well of 0.5 μg / ml a CD25-His protein into the wells. After blocking the plate with PBS containing 1%BSA + 1%normal goat serum + 0.05%Tween20, the chimeric antibody was added to the plate for 1hr. The binding activity of the chimeric anti-human CD25 antibody (75G1-chi) was detected with an HRP-linked anti-human IgG antibody. 100 μl / well of TMB was added to each well, and after the reaction was terminated using 0.64M H2SO4, the plate was read on a Thermo Multiscan FC at 450nm. Ab19 was used as control. Chimeric 75G1 antibody retained the human CD25 binding activity (Figure 4) , and also bound to cynomolgus CD25 (Figure 5) .

[0288] Additionally, SU-DHL-1 cell line expressing human CD25 was used to detect the cellular binding activity of the chimeric antibody. 60, 000 SU-DHL-1 cells were plated per well in a 96-V bottom plate. Anti-CD25 antibodies (serially diluted from 11.1111nM in the assay buffer) were added into the plate and incubate at 4℃ for 1h. After washing 2 times, anti-human IgG antibody (PE) (1: 200 dilution) was added into the wells and incubate at 4 ℃ for 1h. After washing 2 times, the plate was ready for detection. FACS assay was performed on Beckman cytoflex FACS device. Antibody 686-m3 (areference anti-human CD25 antibody with higher affinity (～0.3nM) to human CD25, disclosed in US20190284287A1 (Tusk / Roche) ) was included as control. The chimeric 75G1 antibody (75G1-chi) retained the binding activity to human CD25 on SU-DHL-1 cells (Figure 6) .

[0289] The binding activity was also confirmed with Treg cells. CD4+ T cells were isolated using the human  CD4+ T cell isolation kit II (Miltenyi Biotech) according to manufacturer’s instructions. CD4+ T cells were adjusted to a cell density of 1×106 cells / ml, and activated by CD3 / CD28 T Cell Activator (Gibco) for 6 days in RPMI 1640 medium mainly containing 10%FBS, 1%Glutamax, 500 U / ml IL2, 109 nM rapamycin and 10 ng / ml TGFβ1 to produce iTreg cells. The iTreg cells (induced Treg cells) were stained by anti-human CD25 antibody with a serial dilution from 11.11111nM. An anti-human IgG antibody with PE (1: 200 dilution) was used as a secondary antibody. Cells were detected and analyzed by Beckman CytoFLEX flow cytometry. Similar to SU-DHL-1, chimeric 75G1 antibody showed the binding activity to iTreg cells (Figure 7) .

[0290] In vitro IL-2 neutralization Assay

[0291] The CD25 protein with his tag (Acro biosystem) was diluted to 0.5 μg / ml with a coating buffer having a high pH (0.16%Na2CO3, 0.3%NaHCO3, pH9.8) , and was added to an ELISA plate at 100 μl / well and incubated overnight at 4℃ for coating the plate. The coated plate was washed one time on an automatic plate washer using a washing buffer (PBS +0.1%Tween 20 (Sigma) ) . 200 μl of a blocking buffer (PBS+1%BSA+1%Goat serum+0.05%Tween 20) was added per well and incubated for 2 hours at room temperature. The blocking buffer was then aspirated off and 100 μl per well of anti-CD25 antibody serially diluted in dilution buffer (PBS+1%BSA+1%Goat serum+0.01%Tween 20) was transferred into the wells of the ELISA plate and allowed to incubate for 60 min at room temperature. After repeating the washing, the 100 μl / well of 0.1 μg / ml biotinylated IL-2 (R&D) in the dilution buffer was added, and then 100 μl / well of Neutravidin-HRP (Thermo) diluted in the dilution buffer was added to the wells of the plate. The ELISA plate was incubated for 20 min at room temperature, and then washed 3 times with 250 μl / well washing buffer. Finally, 100 μl / well of TMB was added to each well and after the reaction was terminated using 0.64M H2SO4, the plate was read on a Thermo Multiscan FC at 450nm. Daclizumab and Ab19 were included as control. As shown in Figure 8, chimeric 75G1 antibody did not block the IL-2 binding to human CD25 while daclizumab that was set as positive control showed the blocking activity (Figure 8) .

[0292] SU-DHL-1 based assay was also used to detect the blocking activity of the chimeric antibody. 200, 000 SU-DHL-1 cells were plated per well in a 96-V bottom plate. Anti-CD25 antibodies (serially diluted in the assay buffer at 1: 3 from 10 μg / ml ) were added and incubated at 4℃ for 1h. After washing 2 times, 0.2 μg / ml of an IL-2-biotin dilution was added per well. Then, PE-strep-avidin (1: 100) was added into the wells and incubated at 4 ℃ for 1h. After washing 2 times, the plate was ready for detection by Beckman cytoflex FACS device. The chimeric 75G1 antibody, in contrast to Daclizumab, did not block the binding of IL-2 to human CD25 on SU-DHL-1 cells (Figure 9) .

[0293] In Vitro ADCC Assay:

[0294] The chimeric anti-human CD25 antibody was analyzed in an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assay (ADCC assays) , by utilizing Jurkat-NFAT-Luc-CD16a cells as the source of effector cells and SU-DHL-1 human cell line as target cells. The reporter cell line Jurkat-NFAT-Luc-CD16a has been engineered to stably express CD16a and contain a luciferase reporter gene driven by a NFAT-response element. In a 96-well white tissue culture-treated plate, 25 μl of the target cells at 10000 cells / well, 25 μl of serially diluted antibodies, and 50 μl of the Jurkat cells at 60000 cells / well were sequentially added to the wells and incubated for 5 hours. Ab19 was used as a positive control. The Promega ONE-Glo Luciferase Assay Buffer / Substrate was applied, and the reaction was allowed for 15 minutes, and then the value of luminescence was measured via the microplate reader. Strong ADCC activity was exhibited by chimeric 75G1 antibody (Figure 10) .

[0295] Example 3 Molecular construction, production and characterization of humanized antibody

[0296] Humanization design and sequence information

[0297] A humanization process enabling the generation of a highly optimized mAb consists of five steps. The first step is to select acceptor human antibodies for their antigen binding activity, immunogenicity, expression, stability, and pharmacokinetics. The second step is to generate CDR-grafted mAbs by grafting the CDRs of a murine antibody into the frameworks (FRs) of the human antibodies selected in the first step, then modelling the three-dimensional (3D) Fv structures of the parental murine antibody and the CDR-grafted mAbs, and under the guidance of the structures, the FR amino acids , which are close to the CDR regions and located at the interface of the VH and VL in the structures, are back-mutated to the corresponding amino acids in the FRs of the murine antibody. The third step is to prepare expression vectors for the multiple versions of humanized antibodies. The fourth step is to express and purify the humanized antibodies. The last step is to multidimensionally evaluate the humanized antibodies.

[0298] Using this humanization procedure, we obtained the humanized antibody variants of 75G1. The constant regions of humanized mAb variants are of human IgG1 and Kappa, which are listed in table 1. The VH and VL sequences of humanized mAbs variants are list in Table 2.

[0299] Table 2 Variable region sequences of humanized antibodies

[0300] Note: CDRs defined by Kabat are marked with bold and underline

[0301] Expression and Purification of humanized Antibodies

[0302] The plasmids expressing the light chains and the heavy chains of the humanized 75G1 antibodies were transfected into ExpiCHO-Scells with the ExpiFectamine CHO transfection kit. The transfected ExpiCHO-Scells were cultured in the ExpiCHO serum-free Expression Medium. 14 days post transfection, the supernatants were collected. After centrifugation and filtration, the supernatants were loaded onto protein A column and then purified with the GE AKTA purification system. After washing, antibodies were eluted with citric acid (pH3.5) .

[0303] Characterization of Humanized Antibody

[0304] Binding Assay

[0305] 0.5 μg / ml of full-length human CD25 protein with his tag was used to coat an ELISA plate at 100 μl per well. After blocking the plate with PBS containing 1%BSA + 1%normal goat serum + 0.05%Tween20, the antibodies were added to the plate for 1hr. The specific binding of the humanized antibodies to human CD25 was detected with an HRP-linked anti-human IgG antibody. 100 μl / well of TMB was added to each well, and after the reaction was terminated using 0.64M H2SO4, the plate was read on a Thermo Multiscan FC at 450nm. Antibody 686-m3 was used as control. The humanized variants of 75G1 retained the human CD25 binding activity (Table 3 and Figure 11) .

[0306] Table 3. EC50 values of variants for binding to human CD25

[0307] Cell based binding assay was performed with SU-DHL-1 cell line. 100, 000 SU-DHL-1 cells were plated per well in a 96-V bottom plate. Anti-CD25 antibodies (serially diluted from 10 ng / ml with the assay buffer) were added and incubated at 4℃ for 1h. After washing 2 times, anti-human IgG antibody (PE) (1: 200) was then added into the wells and incubated at 4 ℃ for 1h. After washing 2 times, the plate was ready for detection by Beckman cytoflex FACS device. Some of the 75G1 variants retained the binding activity to human CD25 on SU-DHL-1 (Table 4 and Figure 12) .

[0308] Table 4. EC50 values of variants for binding to SU-DHL-1

[0309] In Vitro ADCC Assay

[0310] The humanized antibodies were analyzed in an ADCC assay, wherein SU-DHL-1 human cells were used as target cells , and Jurkat-NFAT-Luc-CD16a cells were used as effector cells. The reporter cells Jurkat-NFAT-Luc-CD16a have been engineered to stably express CD16a and contain a luciferase report gene driven by the NFAT element. In a 96-well White Tissue Culture-treated plate, 25 μl of target cells at 10000 cells / well, 25 μl of serially diluted antibodies, and 50 μl of Jurkat cells at 60000 cells / well were sequentially added to  the plate and incubated for 5 hours. The Promega ONE-Glo Luciferase Assay Buffer / Substrate was applied, and the reaction was allowed for 15 minutes. The value of luminescence was measured using a microplate reader. The variants displayed divergent ADCC activities. For instance, Hu75G1 HeL0 exhibited strong ADCC activity comparable to that of chimeric 75G1 antibody, while Hu75G1-HgLc lost the ADCC activity (Table 5 and Figures 13 and Figures 14) .

[0311] Table 5. EC50 values of variants in ADCC reporter assay

[0312] Example 4 Affinity maturation of humanized antibody candidate

[0313] Affinity maturation screening

[0314] Hu75G1-HeL0 was subjected to affinity maturation. The CDR regions in the Hu75G1-HeL0 sequences were defined by the Chithia scheme. To construct a CDR mutant library, codon-based primers for each of the CDRs (including HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3) were used so that six individual affinity maturation libraries were established for hu75G1-HeL0. The diversified CDR fragments were amplified and the products were transformed into competent TG1 cells by electroporation to construct scFv libraries for screen. The diversity of the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 libraries was greater than 1×10^8. The library screen was performed with four rounds of magnetic bead-based panning by means of DynabeadsTM M-280 Streptavidin (InvitrogenTM, 11205D) . In order to obtaining an affinity-improved antibody, affinity pressures were applied for these selections, either by titrating down biotinylated monomeric antigen or by preincubating the biotinylated antigen with parental IgG for 30 min and then applying that precomplexed mixture to the phage library for a length of time which would allow the selection to reach an equilibrium. The higher affinity antibodies were then able to be sorted.

[0315] The affinity of the maturated antibodies was higher than that of the parent antibody. H5L0 and H8L6 showing the best affinity were expressed as a full IgG format with the constant regions of human IgG1 and kappa (shown in table 7) . The variable region sequences of H5L0 and H8L6 are shown in Table 6.

[0316] Table 6. The sequences of AM75G1 heavy chain and light chain variants

[0317] Note: CDRs defined by Kabat are marked with bold and underline

[0318] Table 7. Affinities of matured variants

[0319] Both H5L0 and H8L6 were chosen for further evaluation. They were expressed in a similar way as described in Example 2 or 3. The SEC-HPLC (Agilent) data showed the products have good purification properties (Figure 15 and 16) .

[0320] Characterization of affinity maturated candidates

[0321] Binding Assay

[0322] SU-DHL-1 cells or iTreg cells were used in the cell-based binding assay. As outlined in example 2, iTreg cells were prepared. In a 96-V bottom plate, 100, 000 cells were plated into each well before a wash and a 1-hour incubation at 4℃ with anti-CD25 antibodies, HeL0 (parent antibody) , H8L6, and H5L0 (serially diluted from 10 ng / ml with the assay buffer) . After two washes, an anti-human IgG antibody (PE, 1: 200) was added to the wells, and incubated at 4 ℃ for 1 hour. After two washes, the plate was ready for detection by Beckman cytoflex FACS device. In comparison to parent antibody Hu75G1-HeL0, the 75G1 variants H8L6 and H5L0 showed increased or comparable binding activity to SU-DHL-1 or iTreg cells (Figures 17 and 18) .

[0323] 100 μl per well of 0.5 μg / ml His-tagged CD25 protein, full-length cynomolgus monkey CD25-His (Sino Biological) or mouse CD25-His (Acro biosystem) , was used to coat an ELISA plate. After blocking the plate with PBS containing 1%BSA + 1%normal goat serum + 0.05%Tween20, anti-CD25 antibodies were added to the plate for 1hr. The specific binding of anti-CD25 to human CD25 was detected with an HRP-linked anti-human IgG antibody. 100 μl / well of TMB was added to each well, and after the reaction was terminated using 0.64M H2SO4, the plate was read on a Thermo Multiscan FC at 450nm. As expected, both H8L6 and H5L0 retained the binding to cynomolgus CD25 (Figure 19) while did not show cross activity with mouse CD25 (data not shown) .

[0324] In vitro IL-2 neutralization Assay

[0325] The human CD25 protein with his tag (Acro biosystem) was diluted to a concentration of 0.5 μg / ml with a coating buffer having a high pH (0.16%Na2CO3, 0.3%NaHCO3, pH9.8) , and was used to coat an ELISA plate at 100 μl / well, and incubated overnight at 4℃. After that, the plate was washed one time on an automatic plate washer using a washing buffer (PBS +0.1%Tween 20 (Sigma) ) . 200 μl of a blocking buffer (PBS+1%BSA+1%Goat serum+0.05%Tween 20) was added to each well and incubated for 2 hours at room temperature. The blocking buffer was then aspirated off and 100 μl of an antibody serially diluted in dilution buffer (PBS+1%BSA+1%Goat serum+0.01%Tween 20) was transferred to each well of the ELISA plate and  allowed to incubate for 60 min at room temperature. After repeating the washing, 100 μL of 0.1 μg / ml biotinylated IL-2 (R&D) in the dilution buffer was added into each well. 100 μl / well of Neutravidin-HRP (Thermo) diluted in the dilution buffer was then added to each well of the plate. After that, the ELISA plate was allowed to incubate for 20 min at room temperature. The plate was washed 3 times with 250 μl / well the washing buffer. Finally, 100 μl / well of TMB was added to each well, and after the reaction was terminated using 0.64M H2SO4, the plate was read on a Thermo Multiscan FC at 450nm. H5L0 and H8L6 did not block the IL-2 binding to human CD25 (Figure 20) , like HeL0 variant which, as control, showed little blocking activity (data not shown) .

[0326] IL-2 Signaling by STAT5 Phosphorylation Assay

[0327] A STAT5 phosphorylation assay was used to evaluate IL-2-blocking, in which IL-2 signaling was investigated. Prior to adding IL-2 (R&D) at 100 ng / ml in RPMI 1640 (Thermo) containing 10%FBS, previously frozen PBMCs (Saily, China) were cultured in a 96-U-bottom well plate in the presence of 10 μg / ml an anti-CD25 antibody for 30 minutes. IL-2 induced STAT5 phosphorylation was stopped when the cells were fixed and permeabilized with the eBioscienceTM Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (Invitrogen) and treated with the BD Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) . Following that, cells were then simultaneously stained with surface and intracellular fluorochrome labelled antibodies (pSTAT5-FITC, CD3-PerCP, FoxP3-PE, BD Bioscience) and samples were acquired and analyzed on the Flow Cytometer (Beckman Cytoflex) . The population of pSTAT5+ / CD3+ T cells or pSTAT5+ / FOXP3+ T cells was collected for statistical analysis. Graphs and statistical analysis were performed using GraphPad Prism v9 (Figures 21 and 22) . Daclizumab was set as a positive control. Comparing with daclizumab, H5L0 had no effects on downstream Stat5 phosphorylation in the IL-2 signaling events .

[0328] Example 5 Afucosylated antibody has enhanced ADCC activity

[0329] Generation of Afucosylated antibody

[0330] The plasmid expressing the light chain and the heavy chain of the H5L0 antibody was transfected into CHOK1SV GS-KO cells by Maxcyte electroporator according to the protocol recommended by the manufacturer. Stable cell pools were obtained by electrotransfection and subsequent selective screening (CD CHO +25uM MSX) . The stable cell pools were assessed in a fed-batch culture. The pooled cells were inoculated at 9×105 cells / mL in basal medium Dynamis containing 4 mM L-Glutamine with different concentrations of 2-fluorofucose (2FF) (0, 10, 20, 30, 50 μM) . 2FF can decrease the fucosylation of Fc domain. The feeding media were Cellboost 7a (CB7a) and Cellboost 7b (CB7b) (purchased from GE Healthcare) , and fed on day3, day6, day8, day10, and day12, respectively. Glucose was also fed on the same feeding day to maintain a minimum concentration of 2g / L based on the glucose consumption rate. All the fed-batch cultures were carried out in shake flasks in a shaker incubator with 26 mm orbital diameter, at 37℃, 5%CO2, and 140 RPM. The culture temperature was shifted to 33℃ when the viable cell density (VCD) reached 15×106 cells / ml. The fed-batch cultures were harvested on day13. After centrifugation and filtration, the supernatants were loaded onto protein A column and then purified with the GE AKTA purification system. After washing, antibodies were eluted with citric acid (pH3.5) . Detection of fucosylation level was then performed and the data are summarized in Table 8.

[0331] Table 8. Fucose levels

[0332] SU-DHL-1 cells or iTreg cells were used for cell-based binding assay. iTreg induction was performed using the procedure outlined in Example 2.100, 000 cells were plated in each well of a 96-V bottom plate before a wash and a 1-hour incubation at 4℃ with H5L0 and afucosylated antibodies (serially diluted from 5 μg / ml with the assay buffer) . After two washes, an anti-human IgG antibody (PE, 1: 200) was added to a well, and incubated at 4 ℃ for 1 hour. After two washes, the plate was ready for detection by Beckman cytoflex FACS device. In comparison to anti-HEL Human IgG1 isotype control (Anti-HEL-huIgG1) , H5L0 and afucosylated antibodies showed increased binding activity to SU-DHL-1 or iTreg (Figures 23 and 24)

[0333] In Vitro ADCC reporter Assay

[0334] Anti-human CD25 antibodies were characterized in ADCC assay using SU-DHL-1 human cell line or iTreg cells as target cells and Jurkat-NFAT-Luc-CD16a cells as the source of effector cells. The iTreg cells were generated as described in the Example 2. The Jurkat-NFAT-Luc-CD16a cells as described above were used. 25 μl target cells at 10000 cells / well, 25 μl serially diluted antibodies and 50 μl Jurkat cells at 60000 cells / well were sequentially added to a White Tissue Culture-treated 96 well plate and incubated in a cell incubator for 5 h. ONE-Glo Luciferase Assay Buffer / Substrate (Promega) was applied, and the reaction was allowed for 15 min and then the value of luminescence was read on the microplate reader. The results are shown in Figures 25 and 26. Compared to control IgG1 antibody and H5L0, afucosylated H5L0 antibodies demonstrated an improved ADCC activity as the level of 2-FF substrate in the medium increased and the fucose level of the antibody was reduced in a dose-dependent manner. The afucosylated versions produced at 30 μM and 50 μM of 2-FF, H5L0-30 μM and H5L0-50 μM, were chose for further development. The performances of the antibodies on the two kinds of target cells, SU-DHL-1 and iTreg, were very comparable.

[0335] The ADCC activity of the antibodies was assessed on CD8+T cells, which have been described to express a significant level of CD25. CD8+ T cells were isolated from PBMC (Saily, China) and were then activated for 72 hours with CD3 / CD28 activator beads (Gibco) . The cells were collected and plated in a White Tissue Culture-treated 96-well plate in 25 μl medium with 10, 000 cells per well. 25 μl serially diluted antibodies and 50 μl Jurkat cells at 60000 cells / well were sequentially added into the plate and incubated for 5 hours. The Promega ONE-Glo Luciferase Assay Buffer / Substrate was applied, and the reaction was allowed for 15 minutes, and then the value of luminescence was measured on the microplate reader. CD8+T cells also express CD25. As a result, afucosylated H5L0 showed ADCC activity on CD8+ T cells in a dose dependent manner. Due to lower CD25 expression on CD8+ T cells, as revealed in the ADCC assay, the maximum RLU values of afucosylated H5L0 antibodies on CD8+ T cells were lower than on SU-DHL-1 and iTreg (Figure 27) .

[0336] In vitro NK cytotoxicity assay

[0337] The following procedures were used to generate activated human NK cells. NK cells were isolated from resting human PBMCs (Saily, China) using the human NK cell isolation kit in accordance with the manufacturer's instructions (Stemcell) . The isolated NK cells were grown at 37℃ and 5%CO2 in Culture medium CTSTM AIM VTM SFM (Thermo) +10ng / ml IL-2 (R&D) + 50ng / ml IL-15 (R&D) . The entire culture  medium was replaced every two days for 10～14 days. To confirm the culture was NK cell population, cell proliferation and cell surface markers (CD56-APC, CD3-PC5.5, CD16-PE, BD bioscience) were detected by FACS. The NK cells were then divided into aliquots and stored at -80℃ for subsequent use.

[0338] Anti-human CD25 antibodies were characterized utilizing ADCC assay with activated NK cells serving as the source of effector cells and iTreg or CD8+T cells as target cells. Following the manufacturer's instructions, the cells were collected, labeled with CFSE, and seeded into each well with 5000 cells in 25 μl medium in a U-bottom 96-well cell culture plate. 25 μl serially diluted antibodies and 50 μl Jurkat cells at 40000 cells  / well were sequentially added into the wells of the plate and incubated in a cell incubator for 16 hours. 10ul / per well of propidium iodide (PI) dye was added. After 10 minutes of incubation, the plate was transferred to Beckman Cytoflex for FACS analysis. The live cells identified as being CFSE positive and PI negative were collected and the cytotoxicity was determined. As expected, the cytotoxicity induced by afucosylated antibodies on iTreg cells with higher CD25 expression was much greater than on CD8+ T cells. Expression data was not shown. The afucosylated versions produced at 30 μM and 50 μM of 2-FF, H5L0-30 μM and H5L0-50 μM, displayed a similar cytotoxicity profile on iTreg cells. It appears that the potency of the afucosylated antibody with about 20%fucose level remaining is enough to deplete iTregs effectively. (Figures 28 and 29) .

[0339] Example 6 In vivo efficacy of anti-CD25 antibodies

[0340] To test the in vivo efficacy of anti-CD25 antibodies, we evaluated anti-CD25 antibody on MC38 / hPD-L1 tumor utilizing hCD25 KI mice. Briefly, 120 female human CD25 knock-in mice of 6～7 weeks age (purchased from Biocytogen company) were inoculated with 2*10^6 MC38 / hPD-L1 cells. The animals were randomized when the tumor was around 60～80mm^3, and were treated with control IgG1 at 10 mg / kg (mpk) , or benchmark RG6292-analog (which is a afucosylated benchmark from Roche, having the same sequence as 686-m3) at 10mpk, or protein-engineered version of H5L0, H5L0_VLPYLL (H5L0 with the Fc region engineered to contain VLPYLL mutation) at 10mpk, or glycol-engineered version of H5L0, H5L0_30% (H5L0 with 38%fucose) at 10mpk or afucosylated H5L0 (H5L0 with about 0.2%fucose) at 10mpk, by Intraperitoneal injection (IP) twice a week for 4 weeks. The results (Figures 30A and Figures 30B) indicate that 10mg / kg engineered anti-CD25 antibodies significantly inhibited tumor growth and had similar anti-tumor activity with benchmark (RG6292-analog) .

[0341] In a companion experiment with the same treatment, peripheral and tumor lymphocytes were collected weekly after dosing for biomarker analysis. The results (Figures 30C) showed that, relative to control IgG1, the anti-CD25 antibodies significantly increased CD8+ / Treg ratio in peripheral blood during the 4-week treatment, and that each of the engineered versions of anti-CD25 antibody H5L0 showed a higher ratio than benchmark. The results (Figures 30D) showed that, relative to control IgG1, the CD8+ / Treg ratio in tumor was also elevated significantly after 2-week treatment.

[0342] Sequence Listing

Claims

1.An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to an CD25, comprising three complementarity determining regions (HCDRs) of a heavy chain variable region having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos: 1, 5-7 and 11-12, and three complementarity determining regions (LCDRs) of a light chain variable region having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos: 2, 8-10 and 13-14,preferably, wherein the CDRs are defined according to Kabat, Chothia, IMGT, or the combination thereof.2.The antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein:a) an HCDR1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15; an HCDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16; an HCDR3 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17; an LCDR1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18; an LCDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19; and an LCDR3 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20;b) an HCDR1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21; an HCDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16; an HCDR3 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17; an LCDR1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18; an LCDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22; and an LCDR3 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20; orc) an HCDR1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23; an HCDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24; an HCDR3 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17; an LCDR1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18; an LCDR2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19; and an LCDR3 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.3.The antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 2, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises a heavy chain variable region comprising or consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos: 1, 5-7 and 11-12, or a sequence at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity thereto.4.The antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 3, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises a light chain variable region comprising or consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos: 2, 8-10 and 13-14, or a sequence at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity thereto.5.The antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 4, comprising:(i) a heavy chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;(ii) a heavy chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, 6 or 7, and a light chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, 9, or 10;(iii) a heavy chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and a light chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14; or(iv) a heavy chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and a light chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.6.The antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 5, wherein the antibody or antigen-binding fragment is monoclonal, chimeric, or humanized, and optionally, wherein the antibody or antigen-binding fragment is selected from the group consisting of: a full-length antibody, a Fab, a Fab', a Fab'-SH, a Fv, a single-chain antibody such as a scFv and scFab, a F (ab′) 2, or a linear antibody.7.The antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 6, wherein the antibody is an antibody of IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 isotype.8.The antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 7, wherein the antibody or antigen-binding fragment has one or more of the following properties:(a) binding the extracellular domain of human CD25;(b) having immunological cross-reactivity with monkey CD25;(c) binding cells expressing human CD25 on their surface;(d) not blocking the binding of Interleukin-2 (IL-2) to CD25;(e) not blocking the IL-2 signaling via CD25;(f) inducing ADCC activity in presence of NK or T cells; and(g) selectively depleting Treg cells over CD8+ T cells.9.The antibody or an antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 8, wherein the antibody or antigen-binding fragment is afucosylated, or the antibody or antigen-binding fragment has a fucose level of less than 50%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%.10.The antibody or an antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 9, wherein the antibody or antigen-binding fragment comprises an Fc region comprising a mutation that confers an enhanced binding to activating FcγR and / or enhanced ADCC activity, preferably wherein the Fc mutation is a VLPYLL mutation.11.A nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment according to any one of claims 1 to 10.12.A vector (preferably an expression vector) or a host cell (preferably, a mammalian cells) comprising the nucleic acid molecule of claim 11.13.A method for producing an anti-CD25 antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 10, wherein the said method comprises culturing a host cell of claim 11 under conditions suitable for expressing the nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.14.The method of claim 13, wherein the host cell is cultured in the presence of a protein fucosylation  inhibitor, e.g., 2-fluorofucose, and preferably wherein the produced antibody or antigen-binding fragment has a fucose level of less than 50%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, or 5%.15.A multispecific antibody (e.g., a bispecific antibody) or an immunoconjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 10.16.A pharmaceutical composition comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 10, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.17.A method for preventing or treating a disease or a disorder associated with an CD25 activity, or for depleting regulatory T cells in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1 to 10, or the pharmaceutical composition of claim 16.18.The method of claim 17 wherein the subject has a disease or cancer, e, g., a solid tumor or a hematological cancer.19.The method of claim 18 wherein the disease or cancer selected from colorectal cancer. multiple sclerosis (MS) or organ transplantation rejection.20.A method for detecting a CD25 in a sample, comprises(a) contacting the sample with an antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of the claims 1 to 10; and(b) detecting the formation of a complex between the antibody or antigen-binding fragment thereof and the CD25;optionally, the antibody is detectably labeled.

Images