Lipid compounds for delivery of therapeutic agents and preparation method and use thereof

Abstract

Disclosed are lipid compounds for delivery of therapeutic agents and preparation method and a use thereof, specifically, a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, the ionizable lipid compounds can effectively deliver nucleic acid molecules, small molecule compounds and other drugs, and by comparison, the lipid nanoparticles have better particle size distribution, high encapsulation efficiency, and the delivery effect can be significantly better than the comparison lipid nanoparticles, which can meet the demand in vivo delivery.

Description

LIPID COMPOUNDS FOR DELIVERY OF THERAPEUTIC AGENTS AND PREPARATION METHOD AND USE THEREOF

[0001] The present invention belongs to the field of biopharmaceuticals and, specifically, relates to lipid compounds for delivery of therapeutic agents and preparation method and its use thereof.Background

[0002] Gene therapy technology is a hot topic of research in modern biomedical field, and the nucleic acid drugs can prevent and treat cancer, bacterial and viral infections, and treat genetic diseases, etc. Since nucleic acid drugs are easily degradable and difficult to enter cells, they usually need to be encapsulated and delivered to target cells with the help of carriers, therefore, the development of safe and efficient delivery carriers is a precondition for the clinical application of gene therapy.

[0003] Lipid nanoparticle (LNP) is currently a hot research topic in the field of non-viral gene vectors. In 2018, FDA approved LNP delivery of patisiran (onpattro) for the treatment of hereditary transthyretin familial amyloidosis, and since then the research on the delivery of nucleic acid drugs using LNP technology has shown a burst of growth. In particular, in the end of 2020, the FDA approved Moderna and BioNtech &Pfizer's novel coronavirus vaccine for COVID 19, respectively, both of which use LNP technology to deliver mRNA drugs for the prevention of SARS-CoV-2. LNPs usually contain ionizable lipids which have an impact on the effectiveness of LNP delivery.

[0004] There is still a need to develop new lipid compounds to facilitate the in vitro or in vivo delivery of nucleic acid molecules for therapeutic and / or prophylactic purposes.Summary of the invention

[0005] It is an object of the present invention to provide novel lipid compounds to facilitate the in vitro or in vivo delivery of nucleic acid molecules for therapeutic and / or prophylactic purposes.

[0006] It is also an object of the present invention to provide a lipid compound or a pharmaceutically acceptable form thereof (e.g., salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug, etc. ) that can be used with other lipid compounds (e.g., neutral lipids, charged lipids, steroids) to prepare lipid nanoparticles for delivery of therapeutic agents (e.g., nucleic acid molecules, specifically also including mRNA) to enhance the delivery efficiency of nucleic acid drugs in vivo, and lipid compounds with specific structures can be used as lipid carriers depending on the organ where the nucleic acid drug needs to be enriched.

[0007] It is a further object of the present invention to provide lipid carriers comprising the above compounds or a pharmaceutically acceptable form thereof.

[0008] It is a further object of the present invention to provide nucleic acid lipid nanoparticle compositions comprising the above compounds or pharmaceutically acceptable forms thereof or the above lipid carriers.

[0009] It is a further object of the present invention to provide pharmaceutical formulations comprising the above compounds or pharmaceutically acceptable forms thereof, or the above lipid carriers, or the above nucleic acid lipid nanoparticle compositions.

[0010] It is a further object of the present invention to provide a method of delivering a therapeutic or prophylactic agent to a subject cell.

[0011] It is a further object of the present invention to provide a method for producing a target protein or target polypeptide in a subject cell.

[0012] It is a further object of the present invention to provide a use of the above compounds or pharmaceutically acceptable forms thereof or the above lipid carriers or the above nucleic acid lipid nanoparticle compositions or the above pharmaceutical formulations in the preparation of nucleic acid drugs, gene vaccines, small molecule drugs, polypeptides or protein drugs.

[0013] It is a further object of the present invention to provide a method for delivering nucleic acid drugs in vivo, comprising administering the above nucleic acid lipid nanoparticle compositions or the above pharmaceutical formulations to a subject in need thereof.

[0014] In a first aspect of the invention, it provides a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure:

[0015] wherein

[0016] Each of R1 and R2 is independently selected from hydrogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl or C1-C10 haloalkyl; or

[0017] R1 and R2 together with the N connecting them form a 4-10-membered heterocyclic group containing 1-3 heteroatoms selected from N, S and O;

[0018] G1 is - (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-15, preferably, a positive integer of 1-10, more preferably a positive integer of 1-6;

[0019] R3 is selected from hydrogen, substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, C3-C20 cycloalkyl, or or Ra-La-Rb, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, O- (C2-C15 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C15 haloalkyl, C1-C15 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2, Ra is - (CH2) s, s is a positive integer of 1-15, preferably, a positive integer of 1-10, La is selected from - (C=O) O-, -O (C=O) -, - (S-S) -, -O (S=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=S) O-, -NH (C=O) -, - (C=S) NH-, -NH (C=S) -, - (C=O) NH-, preferably - (C=O) O; Rb is selected from C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0020] R4 is - (CH2) m-, wherein m is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-15; more preferably a positive integer of 1-10;

[0021] L1 is selected from - (C=O) O-, -O (C=O) -, - (S-S) -, -O (S=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=S) O-, -NH (C=O) -, - (C=S) NH-, -NH (C=S) -, - (C=O) NH-, preferably -  (C=O) O, -O (C=O) -;

[0022] R5 is selected from C1-C30 alkyl, C2-C30 alkenyl, C2-C30 alkynyl;

[0023] R6 is - (CH2) q-, wherein q is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-15; more preferably a positive integer of 1-10;

[0024] L2 is selected from - (C=O) O-, -O (C=O) -, - (S-S) -, -O (S=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=S) O-, -NH (C=O) -, - (C=S) NH-, -NH (C=S) -, - (C=O) NH-, preferably - (C=O) O, -O (C=O) -;

[0025] R7 is selected from substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more (preferably one or two) substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, O- (C2-C15 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C15 haloalkyl, C1-C15 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0026] In another embodiment, R7 is wherein Rc is - (CH2) p-, wherein p is a positive integer of 1-15, preferably, a positive integer of 1-10; more preferably a positive integer of 1-6; each Rd and Re is independently selected from C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl or Rd and Re together with their intervening atoms form an optionally substituted ring:

[0027] wherein x is selected from 1 or 2.

[0028] In another embodiment, each of R1 and R2 is independently selected from hydrogen, C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl or C1-C6 haloalkyl.

[0029] In another embodiment, R1 and R2 together with the N connecting them form a 5-10-membered heterocyclic group containing 1-2 heteroatoms selected from N and O.

[0030] In another embodiment, R1 and R2 together with the N connecting them form a 5-7-membered heterocyclic group containing 1-2 heteroatoms selected from N and O.

[0031] In another embodiment, R3 is selected from substituted or unsubstituted C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, C3-C15 cycloalkyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, O- (C2-C10 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C10 haloalkyl, C1-C10 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0032] In another embodiment, R3 is selected from substituted or unsubstituted C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, C3-C10 cycloalkyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, O- (C2-C10 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C10 haloalkyl, C1-C10 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0033] In another embodiment, Rb is selected from C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl.

[0034] In another embodiment, R5 is selected from C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl.

[0035] In another embodiment, R5 is selected from C2-C12 alkenyl, C2-C12 alkynyl.

[0036] In another embodiment, R7 is selected from C1-C20 alkyl, C2-C12 alkenyl, C2-C12 alkynyl.

[0037] In another embodiment, R7 is selected from substituted C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents (preferably one or two) selected from the group consisting of: halogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, O- (C2-C10 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C10 haloalkyl, C1-C10 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0038] In another embodiment, R7 is selected from substituted C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents (preferably one or two) selected from the group consisting of: halogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, O- (C2-C10 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C10 haloalkyl, C1-C10 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0039] In another embodiment, the compound of Formula I has a structure of Formula I-1 as follows:

[0040] wherein

[0041] R1-R6, G1, L1 are defined as above;

[0042] R7 is selected from substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more (preferably one or two) substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, O- (C2-C15 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C15 haloalkyl, C1-C15 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0043] In another embodiment, R7 is selected from substituted C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents (preferably one or two) selected from the group consisting of: halogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl, O- (C2-C10 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C10 haloalkyl, C1-C10 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0044] In another embodiment, the compound of Formula I has a structure of Formula I-2 as follows:

[0045] wherein

[0046] R1-R6, G1, L1 are defined as above;

[0047] R7 is selected from C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl.

[0048] In another embodiment, R7 is selected from C1-C20 alkyl, C2-C12 alkenyl, C2-C12 alkynyl.

[0049] In another embodiment, R1-R7, G1, L1, L2 are the specific groups corresponding to each specific compound in the embodiment.

[0050] In another embodiment, the compound is each specific compound prepared in the embodiment, preferably selected from the group consisting of (Table 1) :

[0051] Table 1

[0052] In another embodiment, the compound of Formula I preferably has the structure as shown below:

[0053] In another embodiment, the compound of Formula I preferably has the structure as shown below:

[0054] In another embodiment, the compound of Formula I can be used to prepare a drug delivery system, comprising a lipid nanoparticle (LNP) , liposome, polymer nanoparticle, etc., preferably for preparing a lipid nanoparticle.

[0055] In a second aspect of the present invention, it provides a lipid carrier, comprising a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, as described in the first aspect of the present invention.

[0056] In another embodiment, the lipid carrier further comprises a helper lipid.

[0057] In another embodiment, in the lipid carrier, the content of the compound of Formula I is in the range of 30-65%molar ratio of the total lipid content.

[0058] In another embodiment, in the lipid carrier, the content of the compound of Formula I is in the range of 40-60%molar ratio of the total lipid content; preferably, 50%molar ratio.

[0059] In another embodiment, the helper lipid comprises one or a combination of more than two of an anionic lipid, a neutral lipid, a steroid and a polymer conjugated lipid.

[0060] In another embodiment, the lipid carrier further comprises other cationic or ionizable lipid compounds.

[0061] In another embodiment, the lipid carrier comprises a first lipid compound and a second lipid compound, wherein the first lipid compound comprises the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of claim 1 and optionally other ionizable lipids, and the second lipid compound comprises one or a combination of more than two of an anionic lipid, a neutral lipid, a steroid and a polymer conjugated lipid.

[0062] In another embodiment, the first lipid compound is a combination of a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable form thereof such as a salt, stereoisomer, reciprocal isomer, solvate, chelate, non-covalent complex or a precursor drug and other cationic or ionizable lipids.

[0063] In another embodiment, the other cationic or ionizable lipid compounds include one or a combination of more than two of 1, 2-diolethoxy-N, N-dimethylaminopropane (DLinDMA) , 1, 2-diolethoxy-N, N-dimethylaminopropane (DODMA) , DLin-MC2-MPZ, 2, 2-diolethoxy-4- (2-dimethylaminoethyl) - [1, 3] -dioxolane pentane (DLin-KC2-DMA) , 1, 2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) , 1, 1’- (2- (4- (2- ( (2- (bis (2-hydroxydodecyl) amino) ethyl) (2-hydroxydodecyl) amino) ethyl) piperazin-1-yl) ethylazanediyl) didodecan-2-ol (C12-200) , 3β [N-N 'N' -dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) and N- (1- (2, 3-dioleyloxy) propyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) .

[0064] In another embodiment, the anionic lipid comprises one or a combination of more than two of phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) , and dimyristoylphosphatidylglycerol.

[0065] In another embodiment, the neutral lipid comprises at least one of 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) , Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) , 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) , palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamine (POPE) , dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE) , dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE) , distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DSPE) , and 1-stearoyl-2-oleoyl phosphatidy ethanolamine (SOPE) or a lipid modified by an anionic or cationic modification group thereof. The anionic or cationic modification groups are not limited.

[0066] In another embodiment, the steroids include one or more of cholesterol, nonsterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, brassinosteroids, tomatidine, ursolic acid, alpha totaxin, coprosterol, and corticosteroids.

[0067] In another embodiment, the polymer conjugated lipid comprises one or a combination of two or more of 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) , α - (3 ′- { [1, 2-di (myristyloxy) propanoxy] carbonylamino} propyl) -ω-methoxy, polyoxyethylene (PEG-c-DMG) , PEG-1, 2-dimyristoxypropyl-3-amine (PEG-c-DMA) , 1.2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) ] (PEG-DSPE) , pegylated phosphatidylethanoloamine (PEG-PE) , PEG-modified ceramide, PEG-modified dialkylamine, PEG-modified diacylglycerol, Tween-20, Tween-80, 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol (PEG-DPG) , 4-O- (2’, 3’-di (tetradecanoyloxy) propyl-1-O- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) butanedioate (PEG-S-DMG) , PEG-dialkoxypropyl (PEG-DAA) , mPEG2000-1, 2-di-O-alkyl-sn3-carbomoylglyceride (PEG-c-DOMG) and N-Acetylgalactosamine- ( (R) -2, 3-bis (octadecyloxy) propyl-l- (methoxy polyethylene glycol) 2000) propylcarbamate) ) (GalNAc-PEG-DSG) .

[0068] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer conjugated lipid is (20 to 65) : (0 to 20) : (5 to 25) : (25 to 55) : (0.3 to 15) ; exemplarily, the molar ratio may be 20: 20: 5: 50: 5, 30: 5: 25: 30: 10, 20: 5: 5: 55: 15, 65: 0: 9.7: 25: 0.3, etc. ; wherein, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug thereof and other cationic or ionizable ionizable lipids in a molar ratio of (1 to 10) : (0 to 10) ; exemplarily, the molar ratio may be 1: 1, 1: 2, 1: 5, 1: 7.5, 1: 10, 2: 1, 5: 1, 7.5: 1, 10: 1, etc.

[0069] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer conjugated lipid is (20 to 55) : (0 to 13) : (5 to 25) : (25 to 51.5) : (0.5 to 15) ; wherein, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable form thereof such as salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug and other cationic or ionizable lipids in a molar ratio of (3-4) : (0-5) .

[0070] In another embodiment, the lipid carrier further comprises a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier.

[0071] In another embodiment, the bioactive substance is selected from the group consisting of: a nucleic acid, protein, polypeptide, small molecule, and a combination thereof.

[0072] In another embodiment, the nucleic acid comprises RNA, DNA, antisense nucleic acid, aptamer, ribozyme, immunostimulatory nucleic acid, or PNA.

[0073] In another embodiment, the antisense nucleic acid is an antisense oligonucleic acid.

[0074] In another embodiment, the RNA is mRNA, rRNA, circRNA, siRNA, saRNA, tRNA, snRNA, antagomir, microRNA inhibitor, microRNA activator, or shRNA.

[0075] In another embodiment, the DNA comprises a plasmid.

[0076] In another embodiment, the mRNA comprises a sequence encoding an RNA-directed DNA-binding agent, and more specifically, comprises an mRNA encoding a nuclease or a base editor.

[0077] In another embodiment, the nucleic acid further comprises a guide RNA, specifically, the guide RNA comprises a gRNA nucleic acid.

[0078] In another embodiment, the nucleic acid comprises an mRNA encoding a nuclease or a base editor and a gRNA.

[0079] In another embodiment, the gRNA is a modified or unmodified gRNA.

[0080] In another embodiment, the lipid carrier is highly efficient in encapsulating the bioactive substance and greatly enhances the efficiency of delivery of the bioactive substance in vivo.

[0081] In another embodiment, the lipid carrier comprises a first lipid compound and a second lipid compound, wherein the first lipid compound comprises the compound  of Formula I according to the first aspect of the present invention and optionally other ionizable lipids, and the second lipid compound comprises one or a combination of more than two of an anionic lipid, a neutral lipid, a steroid and a polymer conjugated lipid.

[0082] In another embodiment, the first lipid compound is any of the above compounds or a pharmaceutically acceptable form thereof such as a salt, stereoisomer, reciprocal isomer, solvate, chelate, non-covalent complex or a precursor drug.

[0083] In another embodiments, the first lipid compound is a combination of any of the above compounds or a pharmaceutically acceptable form thereof such as a salt, stereoisomer, reciprocal isomer, solvate, chelate, non-covalent complex or a precursor drug and other cationic or ionizable lipids.

[0084] In another embodiments, the other cationic or ionizable lipid compounds include one or a combination of more than two of 1, 2-diolethoxy-N, N-dimethylaminopropane (DLinDMA) , 1, 2-diolethoxy-N, N-dimethylaminopropane (DODMA) , DLin-MC2-MPZ, 2, 2-diolethoxy-4- (2-dimethylaminoethyl) - [1, 3] -dioxolane pentane (DLin-KC2-DMA) , 1, 2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) , 1, 1’- (2- (4- (2- ( (2- (bis (2-hydroxydodecyl) amino) ethyl) (2-hydroxydodecyl) amino) ethyl) piperazin-1-yl) ethylazanediyl) didodecan-2-ol (C12-200) , 3β [N-N 'N' -dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) and N- (1- (2, 3-dioleyloxy) propyl) -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) .

[0085] In another embodiment, the anionic lipid comprises one or a combination of more than two of phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) , and dimyristoylphosphatidylglycerol.

[0086] In another embodiment, the neutral lipid comprises at least one of 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ,

[0087] dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) , 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) , palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamine (POPE) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine DPPE, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE) dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE) , distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DSPE) , and 1-stearoyl-2-oleoyl phosphatidy ethanolamine (SOPE) or a lipid modified by an anionic or cationic modification group thereof. The anionic or cationic modification groups are not limited.

[0088] In another embodiment, the steroids include one or more of cholesterol, nonsterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, brassinosteroids, tomatidine, ursolic acid, alpha totaxin, coprosterol, and corticosteroids.

[0089] In another embodiment, the polymer conjugated lipid comprises one or a combination of two or more of 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) , α- (3′- { [1, 2-di (myristyloxy) propanoxy] carbonylamino} propyl) -ω -methoxy, polyoxyethylene (PEG-c-DMG) , PEG-1, 2-dimyristoxypropyl-3-amine (PEG-c-DMA) , 1.2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) ] (PEG-DSPE) , pegylated  phosphatidylethanoloamine (PEG-PE) , PEG-modified ceramide, PEG-modified dialkylamine, PEG-modified diacylglycerol, Tween-20, Tween-80, 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol (PEG-DPG) , 4-O- (2’, 3’-di (tetradecanoyloxy) propyl-1-O- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) butanedioate (PEG-S-DMG) , PEG-dialkoxypropyl (PEG-DAA) , mPEG2000-1, 2-di-O-alkyl-sn3-carbomoylglyceride (PEG-c-DOMG) and N-acetylgalactosamine ( (R) -2, 3-bis (octadecyloxy) propyl-1- (methoxy polyethylene glycol) 2000) propylcarbamate) ) (GalNAc-PEG-DSG) .

[0090] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer conjugated lipid is (20 to 65) : (0 to 20) : (5 to 25) : (25 to 55) : (0.3 to 15) ; exemplarily, the molar ratio may be 20: 20: 5: 50: 5, 30: 5: 25: 30: 10, 20: 5: 5: 55: 15, 65: 0: 9.7: 25: 0.3, etc. ; wherein, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug thereof and other cationic or ionizable ionizable lipids in a molar ratio of (1 to 10) : (0 to 10) ; exemplarily, the molar ratio may be 1: 1, 1: 2, 1: 5, 1: 7.5, 1: 10, 2: 1, 5: 1, 7.5: 1, 10: 1, etc.

[0091] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer conjugated lipid is (20 to 55) : (0 to 13) : (5 to 25) : (25 to 51.5) : (0.5 to 15) ; wherein, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable form thereof such as salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug and other cationic or ionizable lipids in a molar ratio of (3-4) : (0-5) .

[0092] In a third aspect of the present invention, it provides a lipid nanoparticle (LNP) , comprising a compound of Formula I, or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, as described in the first aspect of the present invention.

[0093] In another embodiment, the lipid nanoparticle further comprises a helper lipid.

[0094] In another embodiment, the lipid nanoparticle further comprises a bioactive substance encapsulated in the lipid nanoparticle.

[0095] In a fourth aspect of the present invention, it provides a lipid nanoparticle composition comprising a lipid carrier as described in a second aspect of the present invention or a lipid nanoparticle as described in a third aspect of the present invention, and a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier or the lipid nanoparticle.

[0096] In another embodiment, the mass ratio of the bioactive substance to the lipid carrier in the composition is 1: (3 to 40) , exemplarily, the mass ratio is 1: 3, 1: 5, 1: 10, 1: 15, 1: 20, 1: 30, 1: 40, etc.

[0097] In another embodiment, the ratio (w / w) of the nuclease or base editor mRNA to gRNA in the bioactive substance is from about 10: 1 to about 1: 10.

[0098] In another embodiment, the ratio (w / w) of the nuclease or base editor mRNA to gRNA of in the bioactive substance is from about 3: 1 to about 1: 3.

[0099] In another embodiment, the ratio (w / w) of the nuclease or base editor mRNA to gRNA in the bioactive substance is about 3: 2.

[0100] In another embodiment, the composition comprises a pharmaceutical composition.

[0101] In a fifth aspect of the present invention, it provides a pharmaceutical composition comprising a lipid carrier as described in a second aspect of the present  invention or a lipid nanoparticle as described in a third aspect of the present invention, and a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier or the lipid nanoparticle, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent.

[0102] In a sixth aspect of the present invention, it provides a pharmaceutical formulation comprising a lipid carrier as described in the second aspect of the present invention or a lipid nanoparticle as described in the third aspect of the present invention, and a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier or the lipid nanoparticle, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent; or the pharmaceutical formulation comprising a lipid nanoparticle composition as described in the fourth aspect of the present invention, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent.

[0103] In another embodiment, the pharmaceutical formulation has a particle size of 30 to 500 nm, exemplarily, the particle size may be 30 nm, 50 nm, 100 nm, 150 nm, 250 nm, 350 nm, 500 nm, etc.

[0104] In another embodiment, the encapsulation efficiency of the bioactive substance in the pharmaceutical formulation is greater than 50%. Exemplarily, the encapsulation efficiency may be 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 79%, 80%, 85%, 89%, 90%, 93%, 95%, etc.

[0105] In another embodiment, the drug has a hydrated particle size of 50-200 nm, preferably 70-150 nm, more preferably 75-110 nm.

[0106] In another embodiment, the pharmaceutical formulation can be applied for the treatment and / or prevention of a disease.

[0107] In another embodiment, the disease is selected from the group consisting of a metabolic disease, genetic disease, cancer, cardiovascular disease, infectious disease, and a combination thereof, preferably the metabolic disease comprises familial hypercholesterolemia (FH) , the genetic disease includes transthyretin amyloidosis (ATTR) , primary hyperoxuria (PH1) , and hereditary angioedema (HAE) , and the infectious disease includes hepatitis B (HEPATITIS B) .

[0108] In another embodiment, the pharmaceutical formulation is in a dosage form selected from the group consisting of: injection, lyophilized agent, aerosol inhalation, smearing preparation.

[0109] In another embodiment, the pharmaceutical agent is administered by injection, i.e. intravenously, intramuscularly, intradermally, subcutaneously, intrathecally, intraduodenally or intraperitoneally.

[0110] In another embodiment, the pharmaceutical formulation is administered by inhalation, for example intranasally.

[0111] In another embodiment, the pharmaceutical formulation is administered transdermally, such as transdermal application administration or electrode introduction administration.

[0112] In a seventh aspect of the present invention, it provides a use of a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof as described in the first aspect of the present invention in the preparation of a lipid nanoparticle.

[0113] In an eighth aspect of the present invention, it provides a use of a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof described in the first aspect of the present  invention or a lipid carrier described in the second aspect of the present invention or a lipid nanoparticle described in the third aspect of the present invention or a lipid nanoparticle composition described in the fourth aspect of the present invention or a pharmaceutical composition described in the fifth aspect of the present invention or a pharmaceutical formulation described in the sixth aspect of the present invention in the preparation of a nucleic acid drug, a genetic vaccine, a small molecule drug, a polypeptide or a protein drug.

[0114] In a ninth aspect of the present invention, it provides a method for preparing a lipid nanoparticle composition as described in a fourth aspect of the present invention, comprising:

[0115] (a) Mixing a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, as described in the first aspect of the present invention with an optionally helper lipid and an organic solvent, thereby obtaining a lipid organic phase;

[0116] (b) Mixing the bioactive substance with an aqueous solvent, thereby obtaining an aqueous phase containing the bioactive substance;

[0117] (c) Mixing the lipid organic phase in step (a) with the aqueous phase in step (b) , thereby obtaining the lipid nanoparticle composition.

[0118] In another embodiment, the organic solvent comprises ethanol, methanol, isopropanol, acetonitrile, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, dioxane, tetrahydrofuran, or a combination thereof.

[0119] In another embodiment, the aqueous solvent is a buffer.

[0120] In another embodiment, the aqueous solvent is a buffer at a pH range of 3-7.

[0121] In another embodiment, the acidic buffer is a citrate buffer at a pH of 4.0.

[0122] In another embodiment, the volume ratio of the lipid organic phase to the aqueous phase containing the bioactive substance is 1: (2-5) , preferably 1: (3-4) .

[0123] In another embodiment, in step (c) , the lipid organic phase and the aqueous phase are mixed by means of a microfluidic chip.

[0124] In another embodiment, the method further comprises step (d) : the lipid nanoparticle composition obtained in step (c) is purified and concentrated and filtered for sterilization.

[0125] In a tenth aspect of the present invention, it provides a use of a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof as described in the first aspect of the present invention for the preparation of a drug delivery system.

[0126] In another embodiment, the delivery system comprises lipid nanoparticle (LNP) , liposome, polymeric nanoparticle, etc., preferably for the preparation of lipid nanoparticle.

[0127] In another embodiment, the drug delivery system is used to deliver drugs for the treatment and / or prevention of tumors, infectious diseases and rare diseases.

[0128] In an eleventh aspect of the present invention, it provides a use of a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof as described in a first aspect of the present invention or a lipid carrier as described in a second aspect of the present invention or lipid nanoparticle as described in a third aspect of the present invention or a lipid nanoparticle composition as described in a fourth aspect of the present invention or a pharmaceutical composition as described in a fifth aspect of the present invention  or a pharmaceutical formulation as described in a sixth aspect of the present invention for the preparation of drugs for the treatment and / or prevention of a disease.

[0129] In another embodiment, the disease is selected from the group consisting of a metabolic disease, genetic disease, cancer, cardiovascular disease, infectious disease, and a combination thereof, preferably the metabolic disease comprises familial hypercholesterolemia (FH) , the genetic disease includes transthyretin amyloidosis (ATTR) , primary hyperoxuria (PH1) , and hereditary angioedema (HAE) , and the infectious disease includes hepatitis B (HEPATITIS B) .

[0130] In a twelfth aspect of the present invention, it provides a method of delivering a therapeutic or prophylactic agent to a cell, tissue or organ in a subject, comprising contacting the cell, tissue or organ in the subject with a lipid nanoparticle composition as described in the fourth aspect of the present invention, a pharmaceutical composition as described in the fifth aspect of the present invention or a pharmaceutical formulation as described in the sixth aspect of the present invention.

[0131] In another embodiment, the therapeutic agent or prophylactic agent is a bioactive substance, preferably mRNA.

[0132] In another embodiment, the cell is selected from the group consisting of: a hepatocyte, lung cell, epithelial cell, hematopoietic cell, endothelial cell, bone cell, stem cell, mesenchymal cell, nerve cell, photoreceptor cell, retinal pigment epithelium cell, secretory cell, heart cell, adipocyte, smooth muscle cell, cardiomyocyte, skeletal muscle cell, β cell, pituicyte, synovial lining cell, ovarian cell, testicular cell, fibroblast, lymphocyte, B cell, T cell, antigen presenting cell, reticulocyte, leukocyte, granulocyte, and tumor cell.

[0133] In another embodiment, the tumor cell includes lung cancer cell, colon cancer cell, rectal cancer cell, anal cancer cell, bile duct cancer cell, small intestine cancer cell, stomach cancer cell, esophageal carcinoma cell, gallbladder carcinoma cell, liver cancer cell, pancreatic cancer cell, appendix cancer cell, breast cancer cell, ovarian cancer cell, cervical cancer cell, prostate cancer cell, kidney cancer cell, cancer cell of the central nervous system, glioblastoma tumor cell, skin cancer cell, lymphoma cell, choriocarcinoma tumor cell, head and neck cancer cell, osteogenic sarcoma tumor cell, and blood cancer cell.

[0134] In another embodiment, the tissue or organ is selected from the group consisting of:heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, lymph node, muscle, blood, spine, bone, and a combination thereof.

[0135] In another embodiment, the subject is a human or non-human mammal (such as mouse, rat, rabbit, monkey) .

[0136] In a thirteenth aspect of the present invention, it provides a method for producing a target protein or target polypeptide in a subject cell, comprising contacting the subject cell with a lipid nanoparticle composition as described in a fourth aspect of the present invention, a pharmaceutical composition as described in a fifth aspect of the present invention, or a pharmaceutical formulation as described in a sixth aspect of the present invention.

[0137] In another embodiment, wherein the bioactive substance in the lipid nanoparticle composition, the pharmaceutical composition or pharmaceutical formulation is mRNA, wherein the mRNA encodes a target protein or polypeptide,  whereby the mRNA is capable of being translated in the cell to produce the target protein or target polypeptide.

[0138] In a fourteenth aspect of the present invention, it provides a method of making a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof,

[0139] comprising: reacting a carboxylic acid compound with an isonitrile compound, an aldehyde compound, an amine compound under Ugi coupling reaction conditions to provide the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, wherein the carboxylic acid compound is the isonitrile compound is CN-R3, the aldehyde compound is the amine compound is R1-R7, L1, L2, G1 are defined as described in claim 1.

[0140] In another embodiment, the Ugi coupling takes place in a solvent.

[0141] In another embodiment, the solvent is methanol.

[0142] It should be understood that within the scope of the present invention, the above-mentioned technical features of the present invention and the technical features described in detail below (such as embodiments) can be combined with each other to form a new or preferred technical solution. Due to space constraints, I will not repeat them here.Description of Drawings

[0143] Figure 1 shows a schematic diagram of the delivery strategy for PCSK9 gene editing efficiency assay in a mouse liver cell in the present invention.

[0144] Figure 2 shows the PCSK9 gene editing efficiency in a mouse liver cell after delivery using LNPs comprising different lipid compound..DETAILED DESCRIPTION

[0145] After a long and thorough research, the present inventors have accidentally discovered for the first time a new ionizable lipid compound for delivering therapeutic agents, and the ionizable lipid compound can effectively deliver drugs such as nucleic acid molecules and small molecule compounds, and by comparison, the lipid nanoparticles of the present invention have better particle size distribution, high encapsulation efficiency, and the delivery effect can be significantly better than that of the comparison lipid nanoparticles, which can meet the demand for in vivo  delivery. On this basis, the present invention is completed.

[0146] For easier understanding of the invention, certain technical and scientific terms are specifically defined below. Unless otherwise expressly defined herein, all other technical and scientific terms used herein have the meanings commonly understood by those skilled in the art.

[0147] In this specification, the range of values indicated by the use of "value A to value B" refers to the range that includes the endpoint values A and B.

[0148] In this specification, the use of "basically " or "substantially" indicates that the standard deviation from the theoretical model or theoretical data is within 5%, preferably 3%, and more preferably 1%.

[0149] In this specification, the use of "may" means both to perform a certain treatment and not to perform a certain treatment.

[0150] In this specification, "optional" or "optionally" means that the next described event or situation may or may not occur, and the description includes the event occurs and the event does not occur.

[0151] In this specification, references to "some specific / preferred embodiments" , "other specific / preferred embodiments" , "embodiments" , etc. refer to the particular elements (e.g., features, structures, properties, and / or characteristics) described in connection with the embodiment are included in at least one of the embodiments described herein and may or may not be present in other embodiments. Further, it should be understood that the elements described may be combined in any suitable manner in various embodiments.

[0152] Before describing the invention further, it should be understood that the invention is not limited to the particular embodiments described herein; it should also be understood that the terms used herein are used only to describe, and not to limit, particular embodiments.

[0153] Unless otherwise stated, the following terms have the following meanings:

[0154] The term "pharmaceutically acceptable salt" refers to a salt of a compound of the present invention that is substantially non-toxic to the organism. A pharmaceutically acceptable salt generally includes, but is not limited to, a salt formed by reaction of a compound of the invention with a pharmaceutically acceptable inorganic / organic acid or inorganic / organic base, which are also referred to as acid addition salts or base addition salts. Common inorganic acids include (but are not limited to) hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc., common organic acids include (but are not limited to) trifluoroacetic acid, citric acid, maleic acid, fumaric acid, succinic acid, tartaric acid, lactic acid, pyruvic acid, oxalic acid, formic acid, acetic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, etc., common inorganic bases include (but are not limited to) sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, barium hydroxide etc. Common organic bases include (but are not limited to) diethylamine, triethylamine, ethambutal, etc.

[0155] The term "stereoisomer " (or "optical isomer " ) refers to stable isomers having a vertical plane of asymmetry due to having at least one chiral factor (including a chiral center, a chiral axis, a chiral plane, etc. ) , and thus capable of rotating plane-polarized light. Since there are asymmetric centers as well as other chemical structures in the compounds of the present invention that may lead to  stereoisomerism, the present invention also includes these stereoisomer and mixtures thereof. Since the compounds of the present invention and their salts include asymmetric carbon atoms, they can exist as mixtures of single stereoisomer, racemates, enantiomers and diastereoisomers. Typically, these compounds can be prepared in the form of racemic mixtures. However, if desired, such compounds can be prepared or isolated to obtain pure stereoisomer, i.e., single enantiomers or diastereoisomers, or mixtures of single stereoisomer enrichment (Purity ≥98%, purity ≥95%, ≥93%, ≥90%, ≥88%, ≥85%or ≥80%) . Single stereoisomers of compounds were prepared synthetically from spin starting materials containing the desired chiral center, or were prepared by preparing a mixture of enantiomeric products followed by separation or splitting, e.g., conversion to a mixture of diastereoisomers followed by separation or recrystallization, chromatography treatment, use of chiral splitting reagents, or direct separation of the enantiomers on a chiral column. Starting compounds with specific stereochemistry can either be commercially available or can be prepared as described herein and then split by methods well known in the art.

[0156] The term "tautomer " (or "tautomeric forms " ) refers to structural isomers with different energies that can be transformed into each other through low energy barriers. If tautomerizm is possible (e.g., in solution) , chemical equilibrium of the tautomer can be achieved. For example, proton tautomer (or proton transfer tautomer) include (but are not limited to) interconversions via proton migration, such as keto-enol isomerization, imine-enamine isomerization, amide-imidohydrine isomerization, etc. Unless otherwise indicated, all tautomer forms of the compounds of the present invention are within the scope of the present invention.

[0157] The term "solvate" refers to a substance formed by combining a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof with at least one solvent molecule by non-covalent intermolecular forces. Common solvate includes (but is not limited to) hydrate, an ethanolate, an acetonide, etc.

[0158] The term "chelate" refers to a complex with a ring structure, obtained by chelating two or more ligands with the same metal ion to form a chelate ring.

[0159] The term "non-covalent complex" is formed by the interaction of a compound with another molecule, where no covalent bond is formed between the compound and the molecule. For example, compounding can occur through van der Waals interactions, hydrogen bonding, and electrostatic interactions (also called ionic bonding) .

[0160] The term "precursor drug" refers to a derivative compound that, when applied to a patient, can directly or indirectly provide a compound of the present invention. Particularly preferred derivative compounds or precursors are compounds that, when administered to a patient, enhance the bioavailability of the compounds of the invention (e.g., are more readily absorbed into the blood) or facilitate the delivery of the parent compound to the site of action (e.g., the lymphatic system) . Unless otherwise noted, all prodrug forms of the compounds of the present invention are within the scope of the present invention, and the various prodrug forms are well known in the art.

[0161] The term "each independently" means that at least two groups (or ring systems) having the same or similar range of values present in the structure may have the same or different meanings in a particular case. For example, if substituent X and substituent Y are each independently hydrogen, halogen, hydroxy, cyano, alkyl or  aryl, then when substituent X is hydrogen, substituent Y can be either hydrogen, halogen, hydroxyl, cyano, alkyl or aryl; similarly, when substituent Y is hydrogen, substituent X can be either hydrogen, halogen, hydroxyl, cyano, alkyl or aryl.

[0162] The terms "comprising" and "including" are used in their open, non-limiting sense.

[0163] The term "alkyl" refers to a monovalent straight or branched alkyl group consisting solely of carbon and hydrogen atoms, containing no unsaturation, and connected by a single bond to other fragments, including (but not limited to) methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sec-butyl, isobutyl, and tert-butyl. For example, the term "C1-30 alkyl" refers to a saturated monovalent straight or branched chain hydrocarbon group containing 1 to 30 carbon atoms.

[0164] The term "alkylene " refers to a divalent straight or branched alkyl group consisting of only carbon and hydrogen atoms, containing no saturation, and connected by two single bonds to other fragments, respectively, including (but not limited to) methylene, 1, 1-ethylidene and 1, 2-ethylidene. For example, "C1-30 alkylene " refers to a saturated, divalent straight or branched alkyl group comprising 1 to 30 carbon atoms.

[0165] The term "cycloalkyl" refers to a saturated, monocyclic or polycyclic (e.g., bicyclic, tricyclic or tetracyclic) non-aromatic hydrocarbon group consisting of only carbon and hydrogen atoms. Cycloalkyl groups may include parallel, bridged or spiro ring systems. For example, the term "C3-6 cycloalkyl" as used in the present invention refers to a cycloalkyl group having from 3 to 6 carbon atoms. For example, a cycloalkyl group may be cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl or bicyclo [2.2.1] heptyl, etc.

[0166] The term "cycloalkylene " refers to a divalent group obtained by removing the hydrogen atom from a cycloalkyl group as defined above, including (but not limited to) cyclopropylidene, cyclobutylidene, cyclopentylidene, cyclohexylidene, cycloheptylidene, etc. For example, "C3-30 cycloalkylene " refers to a divalent group obtained by removing the hydrogen atom from a cycloalkyl group containing 3 to 30 carbon atoms.

[0167] The term "branched alkyl" refers to an alkane radical that is linked to the parent molecule and forms at least two branching structures of its own. For example,

[0168] The term "alkenyl" refers to a monovalent straight or branched alkane group consisting of only carbon and hydrogen atoms, containing at least one double bond, and connected by a single bond to other fragments, including (but not limited to) vinyl, propenyl, allyl, isopropenyl, butenyl and isobutenyl. For example, the term "C2-30 alkenyl" refers to a monovalent straight or branched hydrocarbyl containing 2 to 30 carbon atoms and having at least one carbon-carbon double bond (>C=C<) .

[0169] The term "alkenylene" refers to a divalent straight or branched alkane group consisting of only carbon and hydrogen atoms, containing at least one double bond, and connected by two single bonds to other fragments, respectively, including (but not limited to) a ethenylidene. For example, the term "C2-30 alkenylene " refers to a divalent straight or branched hydrocarbyl containing 2 to 30 carbon atoms and having at least one carbon-carbon double bond (>C=C<) .

[0170] The term "alkynyl" refers to a monovalent straight or branched alkyl group consisting of only carbon and hydrogen atoms, containing at least one carbon-carbon triple bond, and connected by a single bond to other fragments, including (but not limited to) acetenyl, propinyl, butynyl and pentynyl. For example, the term "C2-30 alkynyl" refers to a monovalent straight or branched chain hydrocarbyl containing 2 to 30 carbon atoms and having at least one carbon-carbon triple bond.

[0171] The term "alkynylene " refers to a divalent straight or branched alkyl group consisting of only carbon and hydrogen atoms, containing at least one carbon-carbon triple bond, and connected to other fragments by two single bonds each, including (but not limited to) anethynylene, etc. For example, "C2-30 alkynylene " refers to a divalent straight or branched hydrocarbyl comprising 2 to 30 carbon atoms and having at least one carbon-carbon triple bond.

[0172] The term "cycloalkenyl group " refers to an unsaturated, monocyclic or polycyclic (e.g., bicyclic, tricyclic or tetracyclic) non-aromatic hydrocarbyl consisting of only carbon and hydrogen atoms. Cycloalkenyl group may include merged, bridged or spiro ring systems. Examples include cyclopropanyl and cyclobutene.

[0173] The term "cycloalkenylene" refers to a divalent group obtained by removing the hydrogen atom from a cycloalkenyl group as defined above, including (but not limited to) subcyclopropanyl and subcyclobutene, etc. For example, the term "C3-30 cycloalkenylene" refers to a divalent group obtained by removing hydrogen atoms from a cycloalkenyl group comprising 3 to 30 carbon atoms.

[0174] The term "branched alkenyl" refers to an alkenes radical that is linked to the parent molecule and forms at least two branching structures of its own. For example

[0175] The term "heterocyclyl" refers to a saturated or partially saturated, monocyclic or polycyclic (e.g., bicyclic, e.g., a parallel ring, bridging or spirocyclic) non-aromatic group whose ring atom comprises a carbon atom and at least one heteroatom selected from N, O and S, wherein the S atom is optionally substituted to form S (=O) , S (=O) 2 or S (=O) (=NRx) , Rx being independently selected from H or C1-4 alkyl. The heterocyclic group may be attached to the rest of the molecule by any one of the ring atoms if the valence bond requirement is met. For example, the term "3-8-membered heterocyclic group" as used in the present invention refers to a heterocyclic group having from 3 to 8 ring atoms. For example (but are not limited to) , oxiranyl, aziridinyl, azetidinyl, oxetanyl, tetrahydrofuranyl, dioxolyl, pyrolidinyl, pyrrolidonyl, imidazolidinyl, pyrazolidinyl, tetrahydropyranyl, piperidinyl, piperazinyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, dithianyl or trithianyl.

[0176] The term "aryl" refers to a monocyclic or dense polycyclic aromatic hydrocarbyl having a conjugated π-electron system. For example, the term "C6-10 aryl" as used in the present invention refers to an aryl group having 6 to 10 carbon atoms. For example, aryl can be phenyl, naphthyl, anthryl, phenanthryl, acenaphthenyl, azulenyl, fluorenyl, indenyl, pyrenyl, etc.

[0177] The term "heteroaryl" refers to a monocyclic or dense polycyclic aromatic group having a conjugated π-electron system, where the ring atom consists of a carbon atom and at least one heteroatom selected from N, O and S. The heteroaromatic group can be attached to the rest of the molecule through any one of the ring atoms if the valence  bonding requirement is met. For example, the term "5-10-membered heteroaryl" as used in the present invention refers to a heteroaryl group having 5 to 10 ring atoms. Common heteroaryl groups include (but are not limited to) thienyl, furanyl, pyrrolyl, oxazolyl, thiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, oxadiazolyl, triazolyl, thiadiazolyl, pyridyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, triazinyl and the benzo derivatives thereof, pyrrolopyridyl, pyrrolopyridinyl, pyrazolopyridyl, imidazolopyridyl, pyrrolopyrimidinyl, pyrazolopyrimidinyl, purinyl, and the like..

[0178] The term "halogen" refers to fluorine (F) , chlorine (Cl) , bromine (Br) and iodine (I) .

[0179] The term "hydroxyl" refers to -OH.

[0180] The term "cyano" refers to -CN.

[0181] The term "amino" refers to -NH2.

[0182] The term "nitro" refers to -NO2.

[0183] The term "oxo group" refers to (=O) .

[0184] The term "subject" includes both human and non-human animals. Non-human animals include vertebrates, such as mammals, and non-mammals, such as non-human primates, sheep, cats, horses, cattle, chickens, dogs, mice, rats, goats, rabbits, and pigs. Preferably, the subject is a human. The terms "patient" or "subject" are used interchangeably herein except when indicated.

[0185] The term "nuclease" refers to an enzyme that catalyzes the breaking of phosphodiester bonds between nucleotides in a nucleic acid molecule. In some embodiments, the nuclease is selected from a broad range of nucleases, zinc-finger nucleases (ZFNs) , TAL-effector DNA-binding domain-nuclease fusion proteins (TALEN) , and RNA-directed nucleases or variants thereof in which the nuclease activity has been reduced or inhibited.

[0186] In some embodiments, the RNA-guided nucleases are naturally occurring CRISPR-Cas proteins or active variants or fragments thereof. CRISPR-Cas systems are classified as either class I or class II systems. Class II systems contain single effector nucleases and include types II, V, and VI. Each category is subdivided into types (types I, II, III, IV, V, VI) , some of which are further subdivided into subtypes (e.g., type II-A, II-B, II-C, V-A, V-B) .

[0187] The terms "type II CRISPR-Cas protein" , "type II CRISPR-Cas effector protein" , or "Cas9" refer to CRISPR-Cas effector proteins that require trans-activated RNA (tracrRNA) and contain two nuclease structural domains (RuvC and HNH) (each of which is responsible for cleaving a single strand of a double-stranded DNA molecule) . In other embodiments, the CRISPR-Cas protein is a naturally occurring V-type CRISPR-Cas protein or an active variant or fragment thereof.

[0188] As used herein, the terms "V-type CRISPR-Cas protein, " "V-type CRISPR-Cas effector protein, " or "Cas12" refer to CRISPR-Cas effector protein that cuts dsDNA and contains a single RuvC nuclease domain or a split RuvC nuclease domain and lacks the HNH domain. In other embodiments, the CRISPR-Cas protein is a naturally occurring type VI CRISPR-Cas protein or an active variant or fragment thereof. As used herein, the terms "type VI CRISPR-Cas protein, " "type VI CRISPR-Cas effector protein, " or "Cas13" refer to CRISPR-Cas effector proteins that do not require tracrRNA and contain two HEPN domains that cut RNA.

[0189] The term "gRNA" refers to nucleotide sequences that are sufficiently complementary to the target nucleotide sequence to hybridize to the target sequence  and direct sequence-specific binding of the associated nuclease to the target nucleotide sequence. For CRISPR-Cas enzyme, the corresponding guide RNA is one or more RNA molecules (typically one or two) that bind the Cas enzyme and direct the Cas enzyme to bind a specific target nucleotide sequence and also cleave the target nucleotide sequence in those cases where the Cas enzyme has a nickase or nuclease activity.

[0190] Definition of groups

[0191] As used herein, the terms "C1-C30 alkyl" or "C1-C20 alkyl" or "C1-C12 alkyl" or "C1-C15 alkyl" or "C1-C10 alkyl" or "C1-C6 alkyl" refers to a straight or branched alkyl group having 1-30, or 1-20, or 1-15, or 1-12, or 1-10 or 1-6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, or the like.

[0192] As used herein, the terms "C2-C10 hydrocarbyl" or "C2-C15 hydrocarbyl" refers to a straight or branched alkyl or alkenyl or alkynyl having 2-10 or 2-15 carbon atoms, such as ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, or the like.

[0193] As used herein, the terms "C2-C30 alkenyl " or "C2-C20 alkenyl" or "C2-C15 alkenyl" or "C2-C12 alkenyl" or “C2-C10 alkenyl" or “C2-C6 alkenyl" refer to straight or branched alkenyl having 2-30 or 2-20 or 2-15 or 2-12 or 2-10 or 2-6 carbon atoms, respectively, such as ethenyl, allyl, 1-propenyl, isopropenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, or the like.

[0194] As used herein, the terms "C2-C30 alkynyl" or "C2-C20 alkynyl" or "C2-C15 alkynyl" or "C2-C12 alkynyl" or "C2-C10 alkynyl" or "C2-C6 alkynyl" refer to straight or branched alkynyl having 2-30 or 2-20 or 2-15 or 2-12 or 2-10 or 2-6 carbon atoms, such as an ethynyl, propinyl, or the like.

[0195] As used herein, the term "halogenated" refers to a group substituted with the same or different one or more of the above halogen atoms, either partially or fully halogenated, such as trifluoromethyl, pentafluoroethyl, heptafluoroisopropyl, or the like.

[0196] As used herein, the term "C1-C15 haloalkyl" or "C1-C10 haloalkyl" or "C1-C6 haloalkyl" refers to a straight or branched alkyl group having 1-15 or 1-10 or 1-6 carbon atoms with hydrogen substituted with one or more halogens, for example, a halogenated methyl, halogenated ethyl, halogenated propyl, halogenated isopropyl, or the like, preferably trifluoromethyl.

[0197] As used herein, the term "4-10-membered heterocyclic group" refers to a saturated, partially saturated or unsaturated group (but not aromatic) having a monocyclic or condensed ring (including bridged and spiro systems, with 4 to 10 carbon atoms and 1 to 3 heteroatoms selected from nitrogen, sulphur, or oxygen) , and in the case of a condensed ring system, the one or more rings may be cycloalkyl, aryl or heteroaryl, provided that the point of attachment passes through a non-aromatic ring. The term includes substituted or unsubstituted heterocyclic groups, and so on in a similar fashion.

[0198] The compounds of the present invention may contain one or more asymmetric centers and thus appear as racemates, racemic mixtures, single enantiomers, diastereoisomeric compounds, and single diastereomers. The asymmetric centers that can exist depend on the nature of the various substituents on the molecule. Each such asymmetric center will independently give rise to two optical isomers, and all possible mixtures of optical isomers and diastereomers and pure or partially pure  compounds are included in the scope of the present invention. The present invention includes all isomeric forms of the compounds

[0199] Ionizable Lipids

[0200] As used herein, the terms "ionizable lipid of the present invention" and "ionizable cationic lipid of the present invention" are used interchangeably to refer to a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof.

[0201] Ionizable lipids are protonated and converted to cationic lipids at low pH and then to auxiliary phospholipids at normal physiological pH. Auxiliary phospholipids interact less with the anionic cell membrane of blood cells and improve the biocompatibility of lipid nanoparticles. When lipid nanoparticles are endocytosed, the pH in the endosomes is lower, the lipids are protonated and positively charged, and the stability of the membrane structure becomes less stable or even destroyed, which facilitates the escape of lipid nanoparticle endosomes. In general, it is the pH-sensitive properties of lipids that facilitate the in vivo delivery of lipid nanoparticles encapsulating bioactive components (e.g., mRNA molecules) .

[0202] In one aspect of the present invention, it provides an ionizable lipid having a structure as shown in Formula I:

[0203] wherein

[0204] Each of R1 and R2 is independently selected from hydrogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl or C1-C10 haloalkyl; or

[0205] R1 and R2 together with the N connecting them form a 4-10-membered heterocyclic group containing 1-3 heteroatoms selected from N, S and O;

[0206] G1 is - (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-15, preferably, a positive integer of 1-10, more preferably a positive integer of 1-6;

[0207] R3 is selected from hydrogen, substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, C3-C20 cycloalkyl, or or Ra-La-Rb, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, O- (C2-C15 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C15 haloalkyl, C1-C15 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2, Ra is - (CH2) s, s is a positive integer of 1-15, preferably, a positive integer of 1-10, La is selected from - (C=O) O-, -O (C=O) -, - (S-S) -, -O (S=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=S) O-, -NH (C=O) -, - (C=S) NH-, -NH (C=S) -, - (C=O) NH-, preferably - (C=O) O; Rb is selected from C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;

[0208] R4 is - (CH2) m-, wherein m is a positive integer of 1-20, preferably, a positive  integer of 1-15; more preferably a positive integer of 1-10;

[0209] L1 is selected from - (C=O) O-, -O (C=O) -, - (S-S) -, -O (S=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=S) O-, -NH (C=O) -, - (C=S) NH-, -NH (C=S) -, - (C=O) NH-, preferably - (C=O) O, -O (C=O) -;

[0210] R5 is selected from C1-C30 alkyl, C2-C30 alkenyl, C2-C30 alkynyl;

[0211] R6 is - (CH2) q-, wherein q is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-15; more preferably a positive integer of 1-10;

[0212] L2 is selected from - (C=O) O-, -O (C=O) -, - (S-S) -, -O (S=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=S) O-, -NH (C=O) -, - (C=S) NH-, -NH (C=S) -, - (C=O) NH-, preferably - (C=O) O, -O (C=O) -;

[0213] R7 is selected from substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, O- (C2-C15 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C15 haloalkyl, C1-C15 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0214] In a preferred embodiment of the present invention, R7 is wherein Rc is - (CH2) p-, wherein p is a positive integer of 1-15, preferably, a positive integer of 1-10; more preferably a positive integer of 1-6; each Rd and Re is independently selected from C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl or Rd and Re together with their intervening atoms form an optionally substituted ring:

[0215] wherein x is selected from 1 or 2.

[0216] In a preferred embodiment of the present invention, the ionizable lipids have the substructures shown in the following structures I-1, I-2, respectively:

[0217] In Formula I-1, R1-R6, G1, L1 are defined as above;

[0218] R7 is selected from substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C15 alkyl, C2-C15  alkenyl, C2-C15 alkynyl, O- (C2-C15 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C15 haloalkyl, C1-C15 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.

[0219] In Formula I-2, R1-R6, G1, L1 are defined as above;

[0220] R7 is selected from C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl.

[0221] In a more preferred embodiment of the present invention, the ionizable lipid has a structure selected from those shown in Table 1, wherein, preferably, the following compounds of Table 1 are selected:

[0222] Preferably, the compound of Formula I has the structure as shown below:

[0223] More preferably, the compound of Formula I has the structure as shown below:

[0224] Methods of preparation of compounds

[0225] Methods of preparing the compounds of the structure of Formula I of the present invention are described more specifically below, but these specific methods do not constitute any limitation of the present invention. The compounds of the present invention may also be conveniently made by optionally combining various synthetic methods described in this specification or known in the art, and such combinations may be readily carried out by a person skilled in the art to which the present invention belongs.

[0226] Typically, the process for the preparation of the compounds of the present invention is as follows, wherein the raw materials and reagents used are commercially available if not otherwise specified.

[0227] Specifically, the present invention provides a method of making a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof,

[0228] comprising:

[0229] reacting a carboxylic acid compound with an isonitrile compound, an aldehyde compound, an amine compound under Ugi coupling reaction conditions to provide the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, wherein the carboxylic acid compound is the isonitrile compound is CN-R3, the aldehyde compound is the amine compound is R1-R7, L1, L2, G1 are defined as described in the first aspect of the present invention.

[0230] The method for making the compounds of the present invention is characterized  by, for example, simplicity of operation, short reaction time, low equipment requirements, as well as mild reaction conditions, good selectivity, high yield and easy availability of raw materials.

[0231] The ionizable lipid compounds obtained by the method described in the present invention are capable of effectively delivering nucleic acid molecules, small molecule compounds and other drugs; and by way of comparison, the lipid nanoparticles of the present invention have a better particle size distribution, have a high encapsulation rate, and the delivery effect can be significantly better than that of the comparative lipid nanoparticles, which is capable of meeting the demand for in vivo delivery.

[0232] Helper Lipids

[0233] As used herein, the term "helper Lipids" refers in lipid nanoparticles, other types of lipids besides ionizable lipids, including one or a combination of more than two of anionic lipids, neutral lipids, steroids, and polymer conjugated lipids.

[0234] In some embodiments, helper lipids can be used to improve the properties of lipid nanoparticles, such as enhancing nanoparticle stability, membrane fusion (fusogenicity) , and / or mobility and the like.

[0235] In another embodiment, the anionic lipid comprises one or a combination of more than two of phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) , and dimyristoylphosphatidylglycerol.

[0236] In another embodiment, the neutral lipid comprises at least one of 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) , 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) , 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ,

[0237] Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) , 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) ,

[0238] palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamine (POPE) ,

[0239] dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE)

[0240] Dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE) , distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DSPE) , and 1-stearoyl-2-oleoyl phosphatidy ethanolamine (SOPE) or a lipid modified by an anionic or cationic modification group thereof. The anionic or cationic modification groups are not limited.

[0241] In another embodiment, the steroids include one or more of cholesterol, nonsterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, stigmasterol, brassinosteroids, tomatidine, ursolic acid, alpha totaxin, coprosterol, and corticosteroids.

[0242] In another embodiment, the polymer conjugated lipid comprises one or a combination of two or more of 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) , α - (3 ′- { [1, 2-di (myristyloxy) propanoxy] carbonylamino} propyl) -ω-methoxy, polyoxyethylene (PEG-c-DMG) , PEG-1, 2-dimyristoxypropyl-3-amine (PEG-c-DMA) , 1.2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (polyethylene glycol) ] (PEG-DSPE) , pegylated phosphatidylethanoloamine (PEG-PE) , PEG-modified ceramide, PEG-modified dialkylamine, PEG-modified diacylglycerol, Tween-20, Tween-80, 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol (PEG-DPG) , 4-O- (2’, 3’-di  (tetradecanoyloxy) propyl-1-O- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) butanedioate (PEG-S-DMG) , PEG-dialkoxypropyl (PEG-DAA) , mPEG2000-1, 2-di-O-alkyl-sn3-carbomoylglyceride (PEG-c-DOMG) and N-acetylgalactosamine ( (R) -2, 3-bis (octadecyloxy) propyl-1- (methoxy polyethylene glycol) 2000) propylcarbamate) ) (GalNAc-PEG-DSG) .

[0243] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer conjugated lipid is (20 to 65) : (0 to 20) : (5 to 25) : (25 to 55) : (0.3 to 15) ; exemplarily, the molar ratio may be 20: 20: 5: 50: 5, 30: 5: 25: 30: 10, 20: 5: 5: 55: 15, 65: 0: 9.7: 25: 0.3, etc. ; wherein, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug thereof and other cationic or ionizable lipids in a molar ratio of (1 to 10) : (0 to 10) ; exemplarily, the molar ratio may be 1: 1, 1: 2, 1: 5, 1: 7.5, 1: 10, 2: 1, 5: 1, 7.5: 1, 10: 1, etc.

[0244] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer conjugated lipid is (20 to 55) : (0 to 13) : (5 to 25) : (25 to 51.5) : (0.5 to 15) ; wherein, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable form thereof such as salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug and other cationic or ionizable lipids in a molar ratio of (3-4) : (0-5) .

[0245] In a preferred embodiment of the present invention, the helper lipid is selected from DSPC, cholesterol, and PEG-DMG.

[0246] In another embodiment, the helper lipid comprises DSPC, cholesterol, and PEG-DMG.

[0247] Lipid Nanoparticles (LNP)

[0248] As used herein, the terms "lipid nanoparticles" , or "LNP" refer to particles with a diameter of about 5 to 500 nm. In some embodiments, the lipid nanoparticles contain one or more active agents (bioactive substances) . In some embodiments, the lipid nanoparticles comprise nucleic acids. In some embodiments, the nucleic acids are condensed in the interior of the nanoparticles with cationic lipids, polymers or multivalent small molecules and an external lipid coating that interacts with the biological environment. Due to the repulsive forces between phosphate groups, nucleic acids are naturally rigid polymers, preferring an elongated conformation. In cells, to cope with volume limitations, DNA can package itself in appropriate solution conditions with the help of ions and other molecules. Typically, DNA condensation is defined as the collapse of an extended DNA strand into a compact and ordered particle containing only one or a few molecules. By binding to phosphate groups, cationic lipids can condense DNA by neutralizing the phosphate charge and allowing it to stack tightly.

[0249] In some embodiments, the bioactive substance is encapsulated into the LNP. In some embodiments, the bioactive substance can be an anionic compound including, but not limited to, DNA (including plasmids) , RNA (mRNA, rRNA, circRNA, siRNA, saRNA, tRNA, snRNA, antagomir, microRNA inhibitor, microRNA activator, or shRNA, etc. ) , natural and synthetic oligonucleotides (including antisense oligonucleotides, interfering RNAs and small interfering RNAs) , nuclear proteins, peptides, nucleic acids, ribozyme, aptamers, immunostimulatory nucleic acids or  PNAs, DNA-containing nuclear proteins, such as complete or partially deproteinized viral particles (viral particles) , oligomeric and polymeric anionic compounds other than DNA (e.g., acidic polysaccharides and glycoproteins) ) . In some embodiments, the bioactive substance may be mixed with an adjuvant. In a preferred embodiment, said mRNA comprises sequences encoding RNA-directed DNA binding agents, and more specifically, mRNA encoding a nuclease or base editor.

[0250] In a preferred embodiment, said nucleic acid further comprises a guide RNA, specifically, said guide RNA comprises a gRNA nucleic acid.

[0251] In another embodiment, said nucleic acid comprises an mRNA encoding a nuclease or a base editor; and a gRNA.

[0252] In LNP vaccine products, the bioactive substance is typically contained within the LNP. In some embodiments, the bioactive substance comprises nucleic acids. Typically, water-soluble nucleic acids are condensed with cationic lipids or polycationic polymers inside the particle, and the surface of the particle is enriched with auxiliary phospholipid or PEG lipid derivatives. Additional ionizable cationic lipids may also be located on the surface, and when entering cytolysosome, ionizable cationic lipids are positively charged by ionization through the acidic environment of the lysosome, interacting with the lysosomal membrane and promoting endosomal escape.

[0253] Regarding LNP, ionizable lipids can have different properties or functions. Due to the pKa of the amino group, when the external pH is lower than the pKa of the lipid molecule, it can be protonated and positively charged. Under these conditions, the lipid molecule can electrostatically bind to the phosphate group of the nucleic acid, which allows LNP formation and nucleic acid encapsulation, and the LNP has an essentially neutral surface charge in biological fluids of physiological pH (e.g., blood) . High LNP surface charge is associated with rapid clearance of circulating, hemolytic toxicity, including immune activation, by toxic, fixed and free macrophages (Filion et al. Biochim Biophys Acta. 1997 Oct 23; 1329 (2) : 345-56) .

[0254] In some embodiments, pKa can be sufficiently high such that ionizable cationic lipids can adopt a positively charged form at acidic endosomal pH. In this way, cationic lipids can bind to endogenous endosomal anionic lipids to promote membrane cleavage of non-bilayer structures, such as hexagonal HII phases, to produce more efficient intracellular delivery. In some embodiments, pKa ranges from 6.2 to 6.5. For example, pKa may be about 6.2, about 6.3, about 6.4, about 6.5. Unsaturated tails also contribute to the ability of lipids to adopt non-bilayer structures. (Jayaraman et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Aug 20; 51 (34) : 8529-33) .

[0255] The release of nucleic acids from LNP formulations, as well as other characteristics such as liposome clearance and circulating half-life, can be altered by the presence of polyethylene glycols and / or sterols (e.g., cholesterol) or other potential additives in the LNP, as well as the overall chemical structure, including the pKa of any ionizable cationic lipids that are part of the formulation.

[0256] In one aspect of the present invention, a lipid nanoparticle (LNP) is provided, said lipid nanoparticle comprising a compound of Formula I o or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof as described in a first aspect of the present invention. Further, said lipid nanoparticles further comprise one or more helper lipids, said helper lipids comprising one or a combination of more than two of anionic lipids, neutral lipids,  steroids, and polymer conjugated lipids.

[0257] Pharmaceutical formulation

[0258] In a further aspect of the present invention, it provides a pharmaceutical formulation (or lipid nanoparticle composition, or LNP composition) , said pharmaceutical formulation comprising a lipid carrier as described in a third aspect of the present invention, and a bioactive substance encapsulated in said lipid carrier, and a pharmaceutically acceptable carrier. Said pharmaceutical formulation is used to deliver a bioactive substance to cells in a subject in need thereof.

[0259] In some embodiments, the bioactive substance is encapsulated into an LNP. In some embodiments, the bioactive substance may be an anionic compound including, but not limited to, DNA (including plasmids) , RNA (mRNA, rRNA, circRNA, siRNA, saRNA, tRNA, snRNA, antagomir, microRNA inhibitor, microRNA activator, or shRNA, etc. ) , natural and synthetic oligonucleotides (including antisense oligonucleotides, interfering RNAs and small interfering RNAs) , nuclear proteins, peptides, nucleic acids, ribozyme, aptamers, immunostimulatory nucleic acids or PNAs, DNA-containing nuclear proteins, such as complete or partially deproteinized viral particles (viral particles) , oligomeric and polymeric anionic compounds other than DNA (e.g., acidic polysaccharides and glycoproteins) . In some embodiments, the bioactive substance may be mixed with an adjuvant. In some embodiments, the LNP composition comprises: a nucleic acid, an ionizable lipid having the structure shown in Formula (I) , optionally an auxiliary phospholipid (e.g., Distearoyl Phosphatidylcholine) . In some embodiments, the LNP composition comprises: a nucleic acid; an ionizable lipid having the structure shown in Formula I in an amount of 30-65% (molar ratio) of the total lipid of the composition; and optionally an auxiliary phospholipid (e.g., Distearoyl Phosphatidylcholine) in an amount of 1-10%of the total lipid of the composition.

[0260] In addition, in another embodiment, in the LNP composition, the molar ratio of the first lipid compound (ionizable lipids of the structure shown in Formula (I) and optionally other cationic or ionizable lipids) , the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer conjugated lipid is (20 to 65) : (0 to 20) : (5 to 25) : (25 to 55) : (0.3 to 15) ; exemplarily, the molar ratio may be 20: 20: 5: 50: 5, 30: 5: 25: 30: 10, 20: 5: 5: 55: 15, 65: 0: 9.7: 25: 0.3, etc.

[0261] In another embodiment, in the first lipid compound, the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug thereof and other cationic or ionizable lipids in a molar ratio of (1 to 10) : (0 to 10) ; exemplarily, the molar ratio may be 1: 1, 1: 2, 1: 5, 1: 7.5, 1: 10, 2: 1, 5: 1, 7.5: 1, 10: 1, etc.

[0262] In another embodiment, in the lipid carrier, the molar ratio of the first lipid compound, the anionic lipid, the neutral lipid, the steroid and the polymer conjugated lipid is (20 to 55) : (0 to 13) : (5 to 25) : (25 to 51.5) : (0.5 to 15) ; wherein, in the first lipid compound, any of the above compounds or a pharmaceutically acceptable form thereof such as salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor drug and other cationic or ionizable lipids in a molar ratio of (3-4) : (0-5) .

[0263] As used herein, the terms "encapsulating" and "encapsulated" mean that the mRNA, DNA, siRNA or other nucleic acid drug is inside the lipid nanoparticle or bound to the lipid nanoparticle. As used herein, the term "encapsulated" refers to  fully or partially encapsulated. For example, mRNA may be selected to treat and / or prevent a disease of interest when administering a lipid nanoparticle composition comprising mRNA to a subject in need thereof.

[0264] As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" includes, but is not limited to, any adjuvant, carrier, excipient, scintillant, sweetener, diluent, preservative, dye / colorant, flavor enhancer, surfactant, wetting agent, dispersant, suspending agent, stabilizer, isotonic agent, solvent, or emulsifiers approved by the Food and Drug Administration for use in humans or domestic animals.

[0265] The present invention also provides a method for in vivo delivery of nucleic acid drugs, comprising administering to a subject in need thereof said lipid nanoparticle composition or said pharmaceutical formulation.

[0266] In some embodiments, said lipid nanoparticle composition or said pharmaceutical formulation is administered by one of the following routes of administration: orally, intranasally, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, intra-articularly, intralesionally, intratracheally, subcutaneously, and intradermally. In some embodiments, the above lipid nanoparticle compositions or the above pharmaceutical formulations are administered, for example, via an enteral or parenteral route of administration. In some embodiments, said lipid nanoparticle composition or pharmaceutical formulation is administered to said subject at a dose of about 0.001 mg / kg to about 10 mg / kg.

[0267] Method of preparation of a pharmaceutical formulation

[0268] In another aspect of the present invention, it provides a method of preparing a pharmaceutical formulation, comprising: (a) mixing a compound of Formula I as described in a first aspect of the present invention and optionally an helper lipid with an organic solvent, thereby obtaining a lipid organic phase; (b) mixing a bioactive substance with an aqueous solvent, thereby obtaining an aqueous phase containing the bioactive substance; (c) mixing the lipid organic phase in step (a) with the aqueous phase in step (b) , thereby obtaining said lipid nanoparticle composition. Further, said method further comprises step (d) : purifying and concentrating and filtering the lipid nanoparticle drug obtained in step (c) to remove bacteria.

[0269] In some embodiments, the organic solvent comprises (but is not limited to) ethanol, methanol, isopropanol, acetonitrile, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, dioxane, or tetrahydrofuran, or combinations thereof. In some embodiments, the lipid organic phase comprises a small percentage of water or pH buffer. The lipid organic phase may comprise up to 60 vol%water, such as up to about 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, or 60%by volume. In one embodiment, the lipid organic phase comprises between about 0.05%and 60%water by volume, for example, between about 0.05%and 50%, between about 0.05%and 40%, or between about 5%and 20%water by volume.

[0270] In some embodiments, the aqueous solvent is water. In some embodiments, the aqueous solvent is an aqueous buffer having a pH between 3 and 8 (e.g., a pH of about 3, about 4, about 5, or about 6, etc. ) . A bioactive substance such as a nucleic acid (e.g., mRNA) is dissolved in said aqueous solvent to obtain an aqueous phase containing the bioactive substance. Said aqueous phase may comprise a small percentage of an aqueous miscible organic solvent. Said aqueous phase may comprise up to 60 volume %of at least one organic solvent miscible with water, such as up to  about 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%or any volume in between %of an organic solvent (e.g., an aqueous miscible organic solvent) . In one embodiment, said aqueous phase comprises between about 0.05%and 60%by volume of an organic solvent, e.g., between about 0.05%and 50%by volume, between about 0.05%and 40%by volume, or between about 5%and 20%by volume of an organic solution (e.g., an aqueous miscible organic solvent) . The aqueous phase buffer may be a citrate buffer, a Tris-Hcl buffer solution, a sodium acetate buffer solution, a PBS buffer solution, or a combination thereof, etc. In some embodiments, the aqueous buffer is a citrate buffer with a pH between 4 and 6 (e.g., a pH of about 4, about 5, or about 6) . In one embodiment, the aqueous buffer solution is a citrate buffer with a pH of about 4.

[0271] In some embodiments, a solution comprising a mixture of a lipid organic phase and an aqueous phase containing a bioactive substance can be diluted, the mixture comprising an LNP suspension. In some embodiments, the pH of the solution of the mixture of the lipid organic phase comprising the LNP suspension and the aqueous phase containing the bioactive substance can be adjusted. the pH of the LNP suspension can be diluted or adjusted by adding water, an acid, a base, or an aqueous buffer. in some embodiments, no dilution or adjustment of the pH of the LNP suspension is performed. In some embodiments, dilution and adjustment of the pH of the LNP suspension is performed.

[0272] In some embodiments, excess reagents, solvents, unencapsulated nucleic acids may be removed from the LNP suspension by tangential flow filtration (TFF) (e.g., permeation filtration) . Organic solvents (e.g., ethanol) and buffers can also be removed from the LNP suspension by TFF. In some embodiments, the LNP suspension is dialyzed. In some embodiments, the LNP suspension is subjected to TFF. in some embodiments, the LNP suspension is subjected to dialysis and TFF.

[0273] The main advantages of the present invention include:

[0274] (1) The present invention provides a series of structurally novel compounds of Formula I, which can be used as ionizable lipids to prepare lipid carriers with other lipid compounds with controllable particle size and uniform distribution and high encapsulation efficiency.

[0275] (2) The lipid compounds of the present invention are synthesized in a simple method with high yield, and can be synthesized rapidly and at low cost. The compounds of the present invention can be used to deliver nucleic acid drugs, gene vaccines, small molecule drugs, polypeptide or protein drugs, enriching the variety of ionizable lipid compounds, which is especially important for the development and application of nucleic acid prophylactic and therapeutic agents.

[0276] The present invention is further described below in connection with specific embodiments. It should be understood that these embodiments are intended to illustrate the invention only and are not intended to limit the scope of the invention. Experimental methods for which specific conditions are not indicated in the following embodiments are generally in accordance with conventional conditions, or in accordance with the conditions recommended by the manufacturer. Percentages and parts are percentages by weight and parts by weight unless otherwise noted.

[0277] Reagents and materials used in embodiments of the present invention are commercially available products unless otherwise noted.

[0278] The experimental methods described in the following embodiments are conventional methods, if not specified, and the reagents and materials described are commercially available, if not specified.

[0279] In the present invention, "moderate amount" means that the amount of solvent or drug added is adjustable in a wide range and has a small effect on the synthesis results, so that no specific limitation can be made.

[0280] In the following examples, the solvents and drugs used are analytically or chemically pure; the solvents are redistilled before use; the anhydrous solvents are treated according to standard methods or literature methods.

[0281] Where specific conditions were not indicated in the embodiments, conventional conditions or those recommended by the manufacturer were followed. The reagents or instruments used, where the manufacturer is not specified, are conventional products available commercially. It is known to those skilled in the art that the embodiments describe the invention by way of example and are not intended to limit the scope of the protection claimed by the invention. The technical features involved in the various embodiments of the invention can be combined with each other as long as they do not constitute a conflict between them. All disclosures and other references mentioned herein are incorporated herein by reference in their entirety.

[0282] EXAMPLE 1 Synthesis of compound 1

[0283] 2-butyloctyl 10- (N- (9- ( (2-butyloctyl) oxy) -9-oxononyl) -3- (diethylamino) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0284] Intermediate 1-2: N-octylformamide

[0285] The reaction solution of octan-1-amine (10.00 g, 77.38 mmol, 1.0 eq) in ethyl formate (30 mL) was stirred at 60 ℃ for 16 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure. The desired product was obtained as a colorless oil (12.10 g, 98.6%yield) which can be used for the next step without further purification.

[0286] Intermediate 1-3: 1-isocyanooctane

[0287] Phosphorus oxychloride (18.72 g, 122.10 mmol, 1.6 eq) was added to the solution of 1-2 (12.00 g, 76.31 mmol, 1.0 eq) and TEA (63.47 mL, 457.86 mmol, 6.0 eq) in THF (100 mL) slowly at 0 ℃. The reaction mixture was stirred for 3 hours and quenched by saturated aqueous NaHCO3 (100 mL) , then extracted with EtOAc (100 mL x 3) . The organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 1 / 0 to 40 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (8.00 g, 75.3%yield) .

[0288] Intermediate 1-6: 2-butyloctyl 9- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) nonanoate

[0289] A solution of 9- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) nonanoic acid (6.78 g, 24.79 mmol, 1.1 eq) , 2-butyloctan-1-ol (4.20 g, 22.54mmol, 1.0 eq) , EDCI (8.64g, 45.08mmol, 2.0 eq) , DIEA (8.74 g, 67.62 mmol, 3.0 eq) and DMAP (2.75g, 22.54mmol, 1.0 eq) in DCM (100 mL) was stirred at 25 ℃ for 16 hours. The reaction solution was concentrated and diluted with H2O (200 mL) . The resulting solution was extracted with EtOAc (50 mL x 3) , the organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 1 / 0 to 10 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (8.00 g, 80.3%purity) . MS: m / z [M+H] + =442.4.

[0290] Intermediate 1-7: 2-butyloctyl 9-aminononanoate

[0291] The solution of 1-6 (8.00 g , 18.71 mmol) in HCl / dioxane (50 mL, 4 M) was stirred at 25 ℃ for 2 hours. The reaction solution was concentrated and quenched by saturated aqueous NaHCO3 (50 mL) , then extracted with EtOAc (30 mL x 3) , the organic layers were combined, dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the desired product was obtained as a colorless oil (3.50 g, 57.1%yield) . MS: m / z [M+H] + =342.4.

[0292] Intermediate 1-9: 10- ( (tetrahydro-2H-pyran-2-yl) oxy) decanoic acid

[0293] The solution of 10-hydroxydecanoic acid (5.00 g, 26.56 mmol, 1.0 eq) , DHP (3.35 g, 39.84 mmol, 1.5 eq) , TsOH (0.23 g, 1.33 mmol, 0.05 eq) in THF (50 mL) was stirred at 25 ℃ for 16 hours. The reaction solution was concentrated, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 10 / 1 to 1 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (6.30 g, 87.1%purity) .

[0294] Intermediate 1-10: 2-butyloctyl 10- ( (tetrahydro-2H-pyran-2-yl) oxy) decanoate

[0295] A solution of 1-9 (6.30 g, 23.13 mmol, 1.0 eq) , 1-5 (6.46 g, 34.70 mmol, 1.5 eq) , DMAP (1.41 g, 11.56 mmol, 0.5 eq) , DIPEA (8.97 g, 69.39 mmol, 3.0 eq) , EDCI (6.65 g,  34.70 mmol, 1.5 eq) in DCM (60 mL) was stirred at 25 ℃ for 16 hours. The reaction solution was concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 40 / 1 to 10 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (5.30 g, 52.0%yield) .

[0296] Intermediate 1-11: 2-butyloctyl 10-hydroxydecanoate

[0297] The solution of 1-10 (5.30 g, 12.03 mmol, 1.0 eq) and TsOH (2.07 g, 12.03 mmol, 1.0 eq) in EtOH (20 mL) was stirred at 25 ℃ for 16 hours and concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 20 / 1 to 2 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (1.60 g, 37.3%yield) .

[0298] Intermediate 1-12: 2-butyloctyl 10-oxodecanoate

[0299] To a solution of 1-11 (0.80 g, 2.24 mmol, 1.0 eq) , NaHCO3 (0.47 g, 5.60 mmol, 2.5 eq) in DCM (10 mL) was slowly added DMP (1.14 g, 2.69 mmol, 1.2 eq) at 0 ℃. The reaction solution was stirred at 0 ℃ for 2 hours and quenched by saturated aqueous Na2S2O3 (5 mL) , then extracted with DCM (30 mL x 3) , the organic layers were combined, dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated unde reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 1 / 0 to 4 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (570.0 mg, 71.6%yield) .

[0300] Compound 1: 2-butyloctyl 10- (N- (9- ( (2-butyloctyl) oxy) -9-oxononyl) -3- (diethylamino) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0301] A solution of 1-12 (150.0 mg, 0.42 mmol, 1.0 eq) , 1-7 (144.5 mg, 0.42 mmol, 1.0 eq) in MeOH (2 mL) was stirred at 25 ℃ for 0.5 hour before 1-13 (61.4 mg, 0.42mmol, 1.0 eq) was added, the reaction soluton was stirred for another 0.5 hour at 25 ℃, then 1-3 (58.4 mg, 0.42 mmol, 1.0 eq) was added. After stirring at 25 ℃ for 15 hours, the reaction solution was concentrated and diluted with H2O (30 mL) , then extracted with EtOAc (10 mL x 3) , the organic layers were combined, diried over ahydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (DCM / MeOH = 1 / 0 to 20 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (80.2 mg, 19.8%yield) . MS: m / z [M+H] += 962.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.61 (s, 1H) , 4.74 (s, 1H) , 3.96 (d, J = 8.0 Hz, 4H) , 3.24-3.13 (m, 4H) , 2.90-2.78 (m, 4H) , 2.61-2.49 (m, 4H) , 2.31-2.26 (m, 4H) , 2.04-1.92 (m, 1H) , 1.66-1.55 (m, 8H) , 1.50-1.15 (m, 65H) , 1.10-1.00 (m, 6H) 0.92-0.85 (m, 15H) .

[0302] EXAMPLE 2 Synthesis of compound 2

[0303] 2-butyloctyl 10- (N- (9- ( (2-butyloctyl) oxy) -9-oxononyl) -4- (diethylamino) butanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0304] Intermediate 2-3: methyl 4- (diethylamino) butanoate

[0305] A solution of methyl 4-bromobutanoate (10.00 g, 55.24 mmol, 1.0 eq) and diethylamine (20.20 g, 276.20 mmol, 5.0 eq) in THF (100 mL) was stirred at 70 ℃ for 16 hours. The reaction mixture was concentrated and diluted with H2O (50 mL) , then extracted with EtOAc (30 mL x 3) , the organic layers were combined, dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the desired product was obtained as a colorless oil (8.00 g, 83.6%yield) . MS: m / z [M+H] + = 174.1.

[0306] Intermediate 2-4: 4- (diethylamino) butanoic acid hydrochloride

[0307] A solution of methyl 4- (diethylamino) butanoate (8.00 g, 46.18 mmol, 1.0 eq) in aqueous HCl (6 N) was stirred at 100 ℃ for 16 hours. The reaction mixture was concentrated, the desired product was obtianed as a white solid (6.00 g, 66.4%yield) . MS: m / z [M+H] + = 160.1.

[0308] Compound 2: 2-butyloctyl 10- (N- (9- ( (2-butyloctyl) oxy) -9-oxononyl) -4- (diethylamino) butanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0309] Compound 2 was prepared according to a similar Ugi procedure of compound 1 from 4- (diethylamino) butanoic acid hydrochloride. 22.8%yield. MS: m / z [M+H] + = 976.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.61 (s, 1H) , 4.71 (s, 1H) , 3.96 (d, J = 8.0 Hz, 4H) , 3.26-3.13 (m, 4H) , 2.57-2.43 (m, 5H) , 2.40-2.35 (m, 2H) , 2.31-2.26 (m, 4H) , 1.99-1.89 (m, 1H) , 1.86-1.77 (m, 3H) , 1.66-1.55 (m, 8H) , 1.49-1.16 (m, 63H) , 1.04-1.00 (m, 6H) 0.93-0.83 (m, 15H) .

[0310] EXAMPLE 3 Synthesis of compound 3

[0311] 2-butyloctyl 10- (N- (9- ( (2-butyloctyl) oxy) -9-oxononyl) -3- (dimethylamino) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0312] Compound 3 was prepared according to a similar Ugi procedure of compound 1 from 3- (dimethylamino) propanoic acid. 23.7%yield. MS: m / z [M+H] + = 934.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.60 (s, 1H) , 4.74 (s, 1H) , 4.01-3.90 (m, 4H) , 3.22-3.10 (m, 4H) , 2.90-2.78 (m, 6H) , 2.61-2.49 (m, 4H) , 2.42-2.28 (m, 4H) , 2.13-1.95 (m, 1H) , 1.73-1.58 (m, 8H) , 1.56- 1.17 (m, 65H) , 0.93-0.75 (m, 15H) .

[0313] EXAMPLE 4 Synthesis of compound 4

[0314] 2-butyloctyl 10- (N- (3- ( (4, 4-bis ( ( (Z) -oct-5-en-1-yl) oxy) butanoyl) oxy) propyl) -3- (diethylamino) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0315] Intermediate 4-2: 4, 4-bis ( ( (Z) -oct-5-en-1-yl) oxy) butanenitrile

[0316] A reaction mixtureof (Z) -oct-5-en-1-ol (49.63 g, 387.12 mmol, 2.0 eq) , 4, 4-dimethoxybutanenitrile (25.00 g, 193.56 mmol, 1.0 eq) and PTSA (2.43 g, 9.68 mmol, 2.0 eq) in a sealed tube was heated at 110 ℃ for 72 hours. The reaction mixture was extracted with EtOAc (200 mL x 3) , the organic layers were combined, dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 1 / 0 to 3 / 1) , the desired product was obtained as a light yellow oil (26.52 g, 41.8%yield) . MS: m / z [M+H] + = 357.3. 1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.42-5.28 (m, 4H) , 4.57 (t, J = 5.3 Hz, 1H) , 3.61 (dt, J = 9.3, 6.6 Hz, 2H) , 3.44 (dt, J = 9.3, 6.6 Hz, 2H) , 2.42 (t, J = 7.3 Hz, 2H) , 2.12-1.90 (m, 9H) , 1.66-1.54 (m, 5H) , 0.97 (t, J = 7.5 Hz, 6H) .

[0317] Intermediate 4-3: 4, 4-bis ( ( (Z) -oct-5-en-1-yl) oxy) butanoic acid

[0318] A solution of 4-2 (2.00 g, 6.22 mmol, 1.0 eq) , KOH (1.05 g, 18.66 mmol, 3.0 eq) in ethanol (6 mL) and H2O (6 mL) was heated at 110 ℃ for 16 hours. The reaction mixture was concentrated, diluted with H2O (20 mL) and adjusted to pH = 5. The resulting solution was extracted with EtOAC (15 mL x 3) . The organic layers were combined, dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the desired product was obtained as a colorless oil (1.5 g, 70.8%yield) . 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.41-5.27 (m, 4H) , 4.45 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 3.51 (dt, J = 9.0, 6.7 Hz, 2H) , 3.39 (dt, J = 9.0, 6.7 Hz, 2H) , 2.43 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.12-1.98 (m, 8H) , 1.81 (q, J = 7.3 Hz, 2H) 1.65-1.49 (m, 4H) , 1.44-1.32 (m, 4H) , 0.94 (t, J = 7.5 Hz, 6H) .

[0319] Intermediate 4-4: 2-butyloctyl 10- (3- (diethylamino) -N- (3-hydroxypropyl) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0320] Intermediate 4-4 was prepared according to a similar Ugi procedure of compound 1 from 3-aminopropan-1-ol. 45%yield. MS: m / z [M+H] + = 696.6.

[0321] Compound 4: 2-butyloctyl 10- (N- (3- ( (4, 4-bis ( ( (Z) -oct-5-en-1-yl) oxy) butanoyl) oxy) propyl) -3- (diethylamino) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0322] A solution of 4-4 (200.0 mg, 0.29 mmol, 1.0 eq) , 4-3 (148.1 mg, 0.43 mmol, 1.5 eq) , DMAP (35.4 mg, 0.29 mmol, 1.0 eq) , DIPEA (112.4 mg, 0.87 mmol, 3.0 eq) and EDCI (111.2 mg, 0.58 mmol, 2.0 eq) in DCM (5 mL) was stirred at 25 ℃ for 16 hours. The reaction mixture was concentrated, diluted with H2O (20 mL) and extracted with EtOAc (15 mL x 3) , the organic layers were combined, dried over anhydrous Na2SO4 and concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (DCM / MeOH = 1 / 0 to 20 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (70.0 mg, 23.9%yield) . MS: m / z [M+H] += 1018.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.63 (s, 1H) , 5.50-5.29 (m, 4H) , 4.73 (s, 1H) , 4.60 (t, J = 5.4 Hz, 1H) , 3.98-3.60 (m, 2H) , 3.47-3.13 (m, 6H) , 2.90-2.78 (m, 4H) , 2.66-2.51 (m, 4H) , 2.43-2.22 (m, 6H) , 2.12-1.90 (m, 10H) , 1.63-1.10 (m, 62H) , 0.98-0.73 (m, 15H) .

[0323] EXAMPLE 5 Synthesis of compound 5

[0324] 2-butyloctyl 10- (N- (3- ( (4, 4-bis (octyloxy) butanoyl) oxy) propyl) -3- (diethylamino) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0325] Compound 5 was prepared according to a procedure of compound 4 from 4, 4-bis (octyloxy) butanoic acid and 4-4.40.5%yield. MS: m / z [M+H] + = 1022.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.61 (s, 1H) , 4.66-4.59 (m, 2H) , 3.73-3.52 (m, 2H) , 3.45-3.11 (m, 6H) , 2.90-2.66 (m, 4H) , 2.44-1.90 (m, 9H) , 1.73-1.10 (m, 80H) , 1.00-0.75 (m, 15H) .

[0326] EXAMPLE 6 Synthesis of compound 6

[0327] 2-butyloctyl (Z) -10- (3- (diethylamino) -N- (4- (non-2-en-1-yloxy) -4-oxobutyl) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0328] Intermediate 6-3: (Z) -non-2-en-1-yl 4- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) butanoate

[0329] A solution of 4- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) butanoic acid (1.00 g, 7.03 mmol, 1.0 eq) , (Z) -non-2-en-1-ol (1.43 g, 7.03 mmol, 1.0 eq) , DMAP (860.0 mg, 7.03 mmol, 1.0 eq) , DIPEA (2.73 g, 21.09 mmol, 3.0 eq) , EDCI (2.70 g, 14.06 mmol, 2.0 eq) in DCM (10 mL) was stirred at 25 ℃ for 4 hours. The reaction mixture was concentrated and extracted with EtOAc (20 mL x 3) , the organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, concentrated under reduced pressure, the residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 1 / 0 to 10 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (1.70 g, 73.8%yield) . MS:m / z [M+H] + = 328.2.

[0330] Intermediate 6-4: (Z) -non-2-en-1-yl 4-aminobutanoate

[0331] A solution of 6-3 (1.60 g, 4.89 mmol, 1.0 eq) in HCl / dioxane (25 mL) was stirred at 25 ℃ for 4 hours. The reaction solution was concentrated under reduced pressure, the desired product was obtained as a colorless oil (1.20 g, 93.0%yield) . MS: m / z [M+H] + =228.2.

[0332] Compound 6: 2-butyloctyl (Z) -10- (3- (diethylamino) -N- (4- (non-2-en-1-yloxy) -4-oxobutyl) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0333] Compound 6 was prepared according to a similar Ugi procedure of compound 1 from 6-4. 43.1%yield. MS: m / z [M+H] + = 848.7. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.63 (s, 1H) , 5.68-5.47 (m, 2H) , 4.80-4.76 (m, 1H) , 4.63-4.60 (m, 2H) , 3.95 (d, J = 4.0 Hz, 2H) , 3.32-3.12 (m, 4H) , 2.67-2.54 (m, 4H) , 2.32-2.26 (m, 4H) , 2.11-2.06 (m, 2H) , 2.03-1.77 (m, 4H) , 1.64-1.56 (m, 4H) , 1.48-1.41 (m, 3H) , 1.35-1.19 (m, 43H) , 1.16-1.11 (m, 3H) , 1.09-1.05 (m, 6H) , 0.90-0.85 (m, 12H) .

[0334] EXAMPLE 7 Synthesis of compound 7

[0335] 2-butyloctyl 10- (3- (diethylamino) -N- (4- (non-2-yn-1-yloxy) -4-oxobutyl) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0336] Intermediate 7-1: non-2-yn-1-yl 4-aminobutanoate

[0337] Intermediate 7-1 was prepared according to a procedure of compound 6-4 from non-2-yn-1-ol.

[0338] Compound 7 was prepared according to a Ugi procedure of compound 1 from intermediate 7-1.37.6%yield. MS: m / z [M+H] + = 846.7. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ6.61 (s, 1H) , 4.81-4.65 (m, 1H) , 4.69-4.64 (m, 2H) , 3.95 (d, J = 4.0 Hz, 2H) , 3.38-3.12 (m, 4H) , 2.92-2.69 (m, 3H) , 2.62-2.56 (m, 4H) , 2.35-2.26 (m, 4H) , 2.22-2.16 (m, 3H) , 1.97-1.78 (m, 4H) , 1.64-1.56 (m, 4H) , 1.52-1.46 (m, 5H) , 1.32-1.22 (m, 40H) , 1.09-1.03 (m, 6H) , 0.90-0.85 (m, 12H) .

[0339] EXAMPLE 8 Synthesis of compound 8

[0340] 2-butyloctyl (Z) -10- (3- (diethylamino) -N- (4- (oct-4-en-1-yloxy) -4-oxobutyl) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0341] Intermediate 8-1: (Z) -oct-4-en-1-yl 4-aminobutanoate

[0342] Intermediate 8-1 was prepared according to a procedure of compound 6-4 from (Z) -oct-4-en-1-ol.

[0343] Compound 8 was prepared according to a Ugi procedure of compound 1 from intermediate 8-1.27.0%yield. MS: m / z [M+H] + = 834.7. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ6.59 (s, 1H) , 5.41-5.26 (m, 2H) , 4.79-4.76 (m, 1H) , 4.08-4.04 (m, 2H) , 3.95 (d, J = 4.0 Hz, 2H) , 3.36-3.12 (m, 4H) , 2.90-2.76 (m, 2H) , 2.60-2.55 (m, 4H) , 2.29-2.26 (m, 4H) , 2.08-1.99 (m, 5H) , 1.79-1.59 (m, 4H) , 1.66-1.59 (m, 6H) , 1.43-1.37 (m, 5H) , 1.35-1.19 (m, 35H) , 1.07-1.02 (m, 6H) , 0.95-0.83 (m, 3H) , 0.90-0.84 (m, 9H) .

[0344] EXAMPLE 9 Synthesis of compound 9

[0345] 2-butyloctyl (Z) -11- ( (8- ( (2-butyloctyl) oxy) -8-oxooctyl) amino) -10- (3- (diethylamino) -N-  (4- (non-2-en-1-yloxy) -4-oxobutyl) propanamido) -11-oxoundecanoate

[0346] Intermediate 9-1: 2-butyloctyl 8-aminooctanoate

[0347] Intermediate 9-1 was prepared according to a procedure of compound 1-7 from 8- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) octanoic acid.

[0348] Intermediate 9-2: 2-butyloctyl 8-formamidooctanoate

[0349] A solution of 9-1 (1.70 g, 5.19 mmol, 1.0 eq) in ethyl formate (20 mL) was stirred at 60 ℃ for 12 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated under reduced pressure. The residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 1 / 0 to 2 / 1) , the desired product was obtained as a colorless oil (1.80 g, 97.5%yield) . MS: m / z [M+H] + = 356.3.

[0350] Intermediate 9-3: 2-butyloctyl 8-isocyanooctanoate

[0351] To the solution of 9-3 (1.80 g, 5.06 mmol, 1.0 eq) , TEA (2.56 g, 25.30 mmol, 5.0 eq) in THF (30 mL) was added POCl3 (1.16 g, 7.59 mmol, 1.5 eq) slowly at 0 ℃. The resulting solution was warmed to 25 ℃ and stirred for 2 hours. The reaction was quenched by aqueous saturated NaHCO3 solution (30 mL) and extracted with DCM (30 mL x 3) . The organic layers were combined and dried over anhydrous Na2SO4, then concentrated under reduced pressure. The residue was purified by silica column (PE / EtOAc = 1 / 0 to 20 / 1) . The desired product was obtained as a colorless oil (0.80 g, 46.9%) .

[0352] Compound 9: 2-butyloctyl (Z) -11- ( (8- ( (2-butyloctyl) oxy) -8-oxooctyl) amino) -10- (3- (diethylamino) -N- (4- (non-2-en-1-yloxy) -4-oxobutyl) propanamido) -11-oxoundecanoate

[0353] Compound 9 was prepared according to a Ugi procedure of compound 1 from intermediate 6-4. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.62 (s, 1H) , 5.68-5.47 (m, 1H) , 4.79-4.75 (m, 1H) , 4.63-4.60 (m, 2H) , 3.96 (d, J = 4.0 Hz, 4H) , 3.32-3.10 (m, 2H) , 2.91-2.76 (m, 1H) , 2.61-2.52 (m, 4H) , 2.32-2.26 (m, 6H) , 2.11-2.06 (m, 2H) , 1.98-1.75 (m, 5H) , 1.61-1.58 (m, 7H) , 1.45-1.32 (m, 2H) , 1.34-1.19 (m, 60H) , 1.09-1.00 (m, 6H) 0.90-0.86 (m, 15H) .

[0354] EXAMPLE 10 Synthesis of compound 10

[0355] 2-butyloctyl 10- (N- (3- ( (4, 4-bis ( ( (Z) -oct-5-en-1-yl) oxy) butanoyl) oxy) propyl) -3- (diethylamino) propanamido) -11- ( (8- ( (2-butyloctyl) oxy) -8-oxooctyl) amino) -11- oxoundecanoate

[0356] Intermediate 10-1: 2-butyloctyl 11- ( (8- ( (2-butyloctyl) oxy) -8-oxooctyl) amino) -10- (3- (diethylamino) -N- (3-hydroxypropyl) propanamido) -11-oxoundecanoate

[0357] Intermediate 10-1 was prepared according to a Ugi procedure of compound 1 from 9-3, 1-13, 1-12 and 3-aminopropan-1-ol.

[0358] Compound 10: 2-butyloctyl 10- (N- (3- ( (4, 4-bis ( ( (Z) -oct-5-en-1-yl) oxy) butanoyl) oxy) propyl) -3- (diethylamino) propanamido) -11- ( (8- ( (2-butyloctyl) oxy) -8-oxooctyl) amino) -11-oxoundecanoate

[0359] Compound 10 was prepared according to a condensation procedure of compound 4 from 10-1 and 4-3.40.98%yield. MS: m / z [M+H] + = 1271.1. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.39-5.27 (m, 3H) , 4.50-4.47 (m, 1H) , 4.07-4.04 (m, 2H) , 3.96 (d, J = 4.0 Hz, 4H) , 3.59-3.53 (m, 2H) , 3.43-3.37 (m, 3H) , 3.27-3.05 (m, 4H) , 2.89-2.53 (m, 1H) , 2.41-2.37 (m, 2H) , 2.30-2.26 (m, 4H) , 2.06-1.99 (m, 9H) , 1.94-1.89 (m, 3H) , 1.61-1.53 (m, 12H) , 1.45-1.36 (m, 7H) , 1.33-1.23 (m, 59H) , 1.22-1.09 (m, 3H) , 0.96-0.93 (m, 6H) 0.90-0.86 (m, 12H) .

[0360] EXAMPLE 11 Synthesis of compound 11

[0361] 2-butyloctyl 10- (3- (diethylamino) -N- (7- ( (2-hexyldecyl) oxy) -7-oxoheptyl) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0362] Intermediate 11-1: 2-hexyldecyl 7-aminoheptanoate

[0363] Intermediate 11-1 was prepared according to a procedure of compound 1-7 from 7- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) heptanoic acid and 2-hexyldecan-1-ol.

[0364] Compound 11: 2-butyloctyl 10- (3- (diethylamino) -N- (7- ( (2-hexyldecyl) oxy) -7- oxoheptyl) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0365] Compound 11 was prepared according to a Ugi procedure of compound 1 from 1-3, 1-12, 1-13 and 11-1.21.5%yield. MS: m / z [M+H] + = 990.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ6.65 (s, 1H) , 4.75 (s, 1H) , 3.96 (d, J = 8.0 Hz, 4H) , 3.24-3.15 (m, 4H) , 2.94-2.78 (m, 2H) , 2.65-2.50 (m, 4H) , 2.30-2.26 (m, 4H) , 2.04-1.93 (m, 1H) , 1.65-1.56 (m, 9H) , 1.48-1.39 (m, 5H) , 1.35-1.20 (m, 63H) , 1.09-1.04 (m, 6H) 0.89-0.86 (m, 15H) .

[0366] EXAMPLE 12 Synthesis of compound 12

[0367] 2-hexyldecyl 8- (N- (9- ( (2-butyloctyl) oxy) -9-oxononyl) -3- (diethylamino) propanamido) -9- (octylamino) -9-oxononanoate

[0368] Intermediate 12-1: 2-hexyldecyl 8-oxooctanoate

[0369] Intermediate 12-1 was prepared according to a procedure of compound 1-12 from 2-hexyldecan-1-ol and 8-hydroxyoctanoic acid.

[0370] Compound 12: 2-butyloctyl 10- (3- (diethylamino) -N- (7- ( (2-hexyldecyl) oxy) -7-oxoheptyl) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0371] Compound 12 was prepared according to a Ugi procedure of compound 1 from 1-3, 1-7, 1-13 and 12-1.18.2%yield. MS: m / z [M+H] + = 990.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ6.66 (s, 1H) , 4.75 (s, 1H) , 3.95 (t, J = 4.0 Hz, 4H) , 3.23-3.13 (m, 4H) , 2.96-2.80 (m, 3H) , 2.68-2.54 (m, 4H) , 2.30-2.25 (m, 4H) , 2.04-1.94 (m, 1H) , 1.65-1.54 (m, 9H) , 1.48-1.39 (m, 5H) , 1.35-1.20 (m, 62H) , 1.11-1.07 (m, 6H) 0.88-0.85 (m, 15H) .

[0372] EXAMPLE 13 Synthesis of compound 13

[0373] 2-propylheptyl 10- (N- (9- ( (2-butyloctyl) oxy) -9-oxononyl) -3- (diethylamino) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0374] Intermediate 13-1: 2-propylheptyl 10-oxodecanoate

[0375] Intermediate 13-1 was prepared according to a procedure of compound 1-12 from 2-propylheptan-1-ol.

[0376] Compound 13: 2-propylheptyl 10- (N- (9- ( (2-butyloctyl) oxy) -9-oxononyl) -3- (diethylamino) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0377] Compound 13 was prepared according to a Ugi procedure of compound 1 from 1-3, 1-7, 1-13 and 13-1.20.4%yield. MS: m / z [M+H] + = 934.9. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.59 (s, 1H) , 4.73 (s, 1H) , 3.96 (d, J = 8.0 Hz, 4H) , 3.21-3.13 (m, 4H) , 2.83-2.75 (m, 2H) , 2.70-2.62 (m, 1H) , 2.57-2.48 (m, 5H) , 2.30-2.26 (m, 4H) , 2.03-1.92 (m, 2H) , 1.65-1.54 (m, 8H) , 1.48-1.39 (m, 4H) , 1.37-1.19 (m, 54H) , 1.06-1.02 (m, 6H) 0.90-0.86 (m, 15H) .

[0378] EXAMPLE 14 Synthesis of compound 14

[0379] (Z) -non-2-en-1-yl 10- (N- (3- ( (4, 4-bis ( ( (Z) -oct-5-en-1-yl) oxy) butanoyl) oxy) propyl) -3- (diethylamino) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0380] Intermediate 14-1: (Z) -non-2-en-1-yl 10-oxodecanoate

[0381] Intermediate 14-1 was prepared according to a procedure of compound 1-12 from (Z) -non-2-en-1-ol.

[0382] Compound 14-2: (Z) -non-2-en-1-yl 10- (3- (diethylamino) -N- (3-hydroxypropyl) propanamido) -11- (octylamino) -11-oxoundecanoate

[0383] Compound 14-2 was prepared according to a Ugi procedure of compound 1 from 1-3, 1-13, 14-1 and 3-aminopropan-1-ol.

[0384] Compound 14: (Z) -non-2-en-1-yl 10- (N- (3- ( (4, 4-bis ( ( (Z) -oct-5-en-1-yl) oxy) butanoyl) oxy) propyl) -3- (diethylamino) propanamido) -11- (octylamino) -11- oxoundecanoate

[0385] Compound 14 was prepared according to a condensation procedure of compound 4 from 14-2 and 4-3.43.29%yield. MS: m / z [M+H] + = 974.8. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.66-5.60 (m, 1H) , 5.54-5.48 (m, 1H) , 5.40-5.27 (m, 4H) , 4.79-4.75 (m, 1H) , 4.61 (d, J =8.0 Hz, 2H) , 4.50-4.47 (m, 1H) , 4.06-4.03 (m, 2H) , 3.59-3.54 (m, 2H) , 3.43-3.37 (m, 4H) , 3.23-3.10 (m, 2H) , 2.97-2.78 (m, 2H) , 2.69-2.55 (m, 3H) , 2.40-2.37 (m, 2H) , 2.30-2.27 (m, 2H) , 2.11-1.99 (m, 12H) , 1.94-1.82 (m, 4H) , 1.61-1.53 (m, 8H) , 1.45-1.36 (m, 9H) , 1.31-1.20 (m, 30H) , 1.11-1.09 (m, 3H) , 0.96-0.93 (m, 6H) 0.89-0.85 (m, 6H) .

[0386] Example 15 Preparation, characterization and evaluation for in vivo editing experiments of lipid nanoparticles

[0387] 1. Animal experiment design

[0388] mRNA and sgRNA delivery experiments of the base editor ABE8e targeting PCSK9

[0389] Cholesterol in the blood is mainly synthesized by the liver, and the liver is also the main organ that breaks down excess cholesterol. On the surface of the liver, there exists a kind of low-density lipoprotein LDL receptor (LDLR) , and the LDL receptor is able to bind with the cholesterol that circulates back to the liver, and then breaks down cholesterol into bile acids, which are excreted through the intestine to the outside of the body; PCSK9, a proteases synthesized by the liver, which is able to bind with LDL receptors and facilitates the entry of the LDL receptor into the hepatocyte, leading to lysosomal degradation of the LDL receptor and a decrease in the number of LDL receptors; thus, inhibition of the activity of this enzyme, PSCK9, increases the number of LDLRs, thereby enhancing the uptake and breakdown of cholesterol. Basic and clinical studies have shown that the PCSK9 gene is an effective target for the treatment of hyperlipidemia and atherosclerosis. Figure 1 illustrates the changes in the number of LDL receptors and the eventual alterations in cholesterol metabolism caused before and after site-specific editing of the PCSK9 gene.

[0390] The strategy of PCSK9 gene editing delivery in mice liver cells is shown in Figure 1, and the main process is as follows: mRNA and sgRNA encoding ABE8e were targeted and delivered to mice liver cells by intravenous injection using prepared lipid nanoparticles, and mutations were introduced in the PCSK9 gene under the action of ABE8e and sgRNA to achieve mutation of bases A to G at the specific site, and the editing efficiency was calculated by sequencing.

[0391] The specific experimental design is as follows:

[0392] 1.1 Selection of suitable mutation sites and editing design

[0393] The single base editor ABE8e achieves precise base substitution from A to G without the  need of donor template and without causing DSB, based on which, the first exon of PCSK9 gene was selected as the screening mutation site. The mRNA encoding the single base editing tool ABE8e and sgRNA were co-delivered to the animals via lipid nanoparticles. The mRNA encoding the base editor ABE8e was translated into protein in the cytoplasm, and then entered the nucleus after forming a complex with the sgRNA, and under the guidance of the sgRNA, the base editor ABE8e targeted the splice donor site in the first exon of the PCSK9 gene and deamination of adenine (A) on the template chain of the first exon into inosine (I) , and inosine (I) will be read and copied as guanine (G) at the DNA level, and finally realizes the substitution of A to G, thus destroying the splice donor site and causing the early termination of the reading frame of the PCSK9 gene.

[0394] 1.2 Preparation of mRNA and sgRNA for base editor ABE8e

[0395] The sequences of the first exon and first intron of the mouse PCSK9 gene (NCBI Gene ID: 100102) were selected as the targeting region, and the target sequence of single base editing of PCSK9 gene, PCSK9-sgRNA, was determined.

[0396] By analyzing the sequences across the first exon and intron of the PCSK9 gene, the sgRNA of the targeting region was designed: PCSK9-sgRNA (synthesized by GenScript, Nanjing) , and the sequence of the PCSK9-sgRNA was:

[0397] PCSK9-sgRNA: 5'-CCCATACCTTGGAGCAACGG-3' (SEQ ID NO: 1) ;

[0398] The forward and reverse oligos corresponding to the DNA sequence of the gRNA targeting sequence (PCSK9-sgRNA, SEQ ID NO: 1) were synthesized in the following format:

[0399] Forward: 5’CACC-20 base pair targeting sequence-3’, and Reverse: 5’AAAC-20 base pair reverse complement targeting sequence -3’, wherein 20 base pair targeting sequence is shown in SEQ ID NO: 1.

[0400] The specific sequence of forward and reverse oligos is shown below:

[0401] After synthesis, the forward and reverse oligos were annealed by a preset program (95℃for 5min; 95℃-85℃ at -2℃ / s; 85℃-25℃ at -0.1℃ / s; hold at 4℃) , and the annealed products were ligated into the lenti U6-sgRNA / EF1a-mCherry vector linearized by BbsI (NEB, R3539S) (Addgene, Plasmid, #114199) .

[0402] wherein the systems used in the sgRNA plasmid construction were the following:

[0403] The linearization system for the lenti U6-sgRNA / EF1a-mCherry vector was as follows:  vector 3 μg; buffer (NEB: R0539L) 6 μL; BbsI 2 μL; ddH2O was made up to 60 μL, and enzyme digestion was carried out overnight at 37℃.

[0404] The system for ligating the gRNA annealing product to the linearized vector was as follows: T4 ligase buffer (NEB: M0202L) 1 μL, 20 ng of linearized vector, 5 μL of annealed oligo fragment (10 μM) , 0.5 μL of T4 ligase (NEB: M0202L) , and ddH2O was made up to 10 μL, and ligation was performed at 16℃ overnight.

[0405] The ligated vector was transformed into Escherichia coli DH5a competent cells (Weidibio, DL1001) . The procedure was as follows: DH5α competent cells were taken out from -80℃, quickly inserted into ice, and after 5 min for the bacterial mass to melt, the ligation product was added and gently mixed by dialling the bottom of the centrifuge tube by hand, and left to stand in the ice for 25 min. Heat-shock was performed for the cells in a 42℃ water bath for 45 s, and then quickly put back into the ice and left to stand for 2 min. Adding 700μl of antibiotic-free sterile LB medium into the centrifuge tube, mixed well and recovered at 37℃, 200 rpm for 60 min. Centrifuged at 5000 rpm for one minute to collect the bacteria, and leave about 100 μl of the supernatant to be gently blown to resuspend the bacterial mass and spread onto Amp antibiotic LB medium. The plates were inverted and placed in a 37℃ incubator for overnight incubation. Single colonies were picked, and after confirmation by sequencing, the concentration was determined after shaking the positive clone and extracting the plasmid by the Qiagen EndoFree Maxi Plasmid Kit (TIANGEN: DP120-01) , and stored in the refrigerator at -20℃ for use. The base editor ABE8e used in this experiment is the efficient base editor ABE8e evolved by David R. Liu's team (Richter MF, Zhao KT, Eton E, Lapinaite A, Newby GA, Thuronyi BW, Wilson C, Koblan LW, Zeng J, Bauer DE, Doudna JA, Liu DR. Phage-assisted evolution of an adenine base editor with improved Cas domain compatibility and activity. Nat Biotechnol. 2020 Jul; 38 (7) : 883-891. doi: 10.1038 / s41587-020-0453-z. Epub 2020 Mar 16. Erratum in: Nat Biotechnol. 2020 May 20; PMID: 32433547; PMCID: PMC7357821) . Plasmid ABE8e (Plasmid#138489) was purchased from Addgene and the mRNA for ABE8e was expressed and purified in the laboratory for use.

[0406] 2. Lipid nanoparticles were prepared from ionizable lipids or compounds of the invention / DSPC / cholesterol / PEG-lipids in a molar ratio of 50: 10: 38.5: 1.5.

[0407] 2.1. Dilinoleyl methyl-4-dimethylaminobutyrate (DLin-MC3-DMA, commonly abbreviated as MC3) as well as compounds 1 -compounds 14 of the present invention were dissolved in anhydrous ethanol in the above mentioned molar ratios with DSPC, cholesterol, PEG-DMG, respectively.

[0408] 2.2. The ethanol solutions of the different lipid carriers were made to mix with a buffer of mRNA at 1: 3 (v / v) (wherein the mass ratio of total lipids to mRNA was 40: 1 and  sgRNA: ABE8e mRNA (w / w) was 1: 1) , and nucleic acid lipid nanoparticles 1-15 were obtained at a flow rate of 12 ml / min through a microfluidic nanomedicine manufacturing system (NanoAssemblr Ignite, Canada) . The obtained nucleic acid lipid nanoparticles were immediately diluted in 40-fold volume into 1× DPBS buffer. The diluted nucleic acid lipid nanoparticle solution was passed through an ultracentrifuge tube and concentrated to the target volume. Diluted for DLS particle size measurement and encapsulation efficiency testing.

[0409] 2.3. Particle size and polydispersity index of lipid nanoparticles were determined by dynamic light scattering using a Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern UK) in 173° backscattering detection mode. The encapsulation efficiency of lipid nanoparticles was determined using Quant-it Ribogreen RNA Quantitative Detection Kit (ThermoFisher Scientific, UK) according to the manufacturer's instructions, and the results of the detection are shown in Table 2.

[0410] Table 2 Characterization of Lipid nanoparticles

[0411] 3 Evaluation of in vivo editing experiments

[0412] 3.1 Lipid nanoparticles encapsulating mRNA and sgRNA encoding base editor ABE8e and containing the compounds of the present invention (see Table 2) were administered systemically at a dose of 0.2 mg / kg via tail vein injection to 6-7 week old C57BL / 6 female mice (purchased from Gempharmatech Co., Ltd) . Lipid nanoparticles encapsulating mRNA and sgRNA of the base editor ABE8e and containing dilinoleyl methyl- 4-dimethylaminobutyrate (DLin-MC3-DMA, abbreviated as MC3) were applied in a similar manner to mice of weekly age and sex-equivalent groups as positive controls. In addition, PBS buffer was also injected tail vein in a similar manner into mice of weekly age and sex-equivalent group as a negative control.

[0413] 3.2 Editing efficiency detection

[0414] Editing efficiency detection was carried out one week after drug administration in mice. Liver tissues were taken from mice after execution, and the genome was extracted after lysis for efficiency analysis by deep sequencing.

[0415] The steps of deep sequencing are as follows:

[0416] (1) Design primers according to the target gene location, see Table 3 for details.

[0417] Table 3 Primer design for targeting PCSK9 gene

[0418] (2) Editing efficiency detection.

[0419] The PCR procedure was as follows: 94℃, 2 min; 98℃ 10s, 60℃ 30s, 68℃ 20s, 34 cycles; 68℃, 5 min. After the PCR was completed, verified by gel electrophoresis, and selection of appropriately sized and single bands to determine the correct amplification product, and the PCR product obtained, was sent to GenScript, Nanjing for sequencing.

[0420] (3) The results of deep sequencing were analyzed by crispresso software for reads and carry out site-specific analysis to achieve the calculation of editing efficiency, the results of which are shown in Table 4, and the editing efficiencies corresponding to each lipid nanoparticle can be seen in Figure 2.

[0421] Table 4 Assessment of in vivo editing efficiency

[0422] As shown in Table 4, the ionizable lipid compounds used in the present invention can effectively deliver nucleic acid molecules, small molecule compounds and other drugs; and by comparison, the lipid nanoparticles of the present invention have a better particle size distribution, a high encapsulation rate, and the delivery effect can be significantly better than that of the comparative lipid nanoparticles, which is able to satisfy the demand for in vivo delivery.

[0423] The description presented in the above exemplary embodiments is intended only to illustrate the technical solutions of the present invention and is not intended to be exhaustive, nor is it intended to limit the invention to the precise form described. It is clear that many changes and variations are possible for those of ordinary skill in the art based on the above teachings. The exemplary embodiments have been selected and described in order to explain the particular principles of the invention and its practical application, thereby making it easy for others of skill in the art to understand, realize and utilize the various exemplary embodiments of the invention and its various alternative and modified forms. The scope of protection of the invention is intended to be limited by the requested scope of protection and its equivalent forms.

Claims

1.A compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, having the following structure: whereinEach of R1 and R2 is independently selected from hydrogen, C1-C10 alkyl, C2-C10 alkenyl, C2-C10 alkynyl or C1-C10 haloalkyl; orR1 and R2 together with the N connecting them form a 4-10-membered heterocyclic group containing 1-3 heteroatoms selected from N, S and O;G1 is - (CH2) n-, wherein n is a positive integer of 1-15, preferably, a positive integer of 1-10, more preferably a positive integer of 1-6;R3 is selected from hydrogen, substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, C3-C20 cycloalkyl, or or Ra-La-Rb, wherein the “substituted” is a substitution having one or more substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, O- (C2-C15 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C15 haloalkyl, C1-C15 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2, Ra is - (CH2) s, s is a positive integer of 1-15, preferably, a positive integer of 1-10, La is selected from - (C=O) O-, -O (C=O) -, - (S-S) -, -O (S=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=S) O-, -NH (C=O) -, - (C=S) NH-, -NH (C=S) -, - (C=O) NH-, preferably - (C=O) O; Rb is selected from C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl;R4 is - (CH2) m-, wherein m is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-15; more preferably a positive integer of 1-10;L1 is selected from - (C=O) O-, -O (C=O) -, - (S-S) -, -O (S=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=S) O-, -NH (C=O) -, - (C=S) NH-, -NH (C=S) -, - (C=O) NH-, preferably - (C=O) O, -O (C=O) -;R5 is selected from C1-C30 alkyl, C2-C30 alkenyl, C2-C30 alkynyl;R6 is - (CH2) q-, wherein q is a positive integer of 1-20, preferably, a positive integer of 1-15; more preferably a positive integer of 1-10;L2 is selected from - (C=O) O-, -O (C=O) -, - (S-S) -, -O (S=O) -, - (C=O) S-, -S (C=O) -, - (C=S) O-, -NH (C=O) -, - (C=S) NH-, -NH (C=S) -, - (C=O) NH-, preferably - (C=O) O, -O (C=O) -;R7 is selected from substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl, C2-C20 alkenyl, C2-C20 alkynyl, wherein the “substituted” is a substitution having one or more (preferably one or two) substituents selected from the group consisting of: halogen, C1-C15 alkyl, C2-C15 alkenyl, C2-C15 alkynyl, O- (C2-C15 hydrocarbyl, including alkyl, alkenyl or alkynyl) , C1-C15 haloalkyl, C1-C15 haloalkoxy, -OH, -CN, -NH2.2.A lipid carrier, comprising a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of claim 1.3.A lipid nanoparticle (LNP) , comprising a compound of Formula I, or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of claim 1.4.A lipid nanoparticle composition comprising a lipid carrier of claim 2 or a lipid nanoparticle of claim 3, and a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier or the lipid nanoparticle.5.A pharmaceutical composition comprising a lipid carrier of claim 2 or a lipid nanoparticle of claim 3, and a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier or the lipid nanoparticle, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent.6.A pharmaceutical formulation comprising a lipid carrier of claim 2 or a lipid nanoparticle of claim 3, and a bioactive substance encapsulated in the lipid carrier or the lipid nanoparticle, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent; or the pharmaceutical formulation comprising a lipid nanoparticle composition of claim 4, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent.7.Use of a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of claim 1 in the preparation of a lipid nanoparticle.8.Use of a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of claim 1 or a lipid carrier of claim 2 or a lipid nanoparticle of claim 3 or a lipid nanoparticle composition of claim 4 or a pharmaceutical composition of claim 5 or a pharmaceutical formulation of claim 6 in the preparation of a nucleic acid drug, a genetic vaccine, a small molecule drug, a polypeptide or a protein drug.9.A method for preparing a lipid nanoparticle composition of claim 4, comprising:(a) Mixing a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of claim 1 with an optionally helper lipid and an organic solvent, thereby obtaining a lipid organic phase;(b) Mixing the bioactive substance with an aqueous solvent, thereby obtaining an aqueous phase containing the bioactive substance;(c) Mixing the lipid organic phase in step (a) with the aqueous phase in step (b) , thereby obtaining the lipid nanoparticle composition.10.Use of a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of claim 1 for the preparation of a drug delivery system.11.Use of a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof of claim 1 or a lipid carrier of claim 2 or lipid nanoparticle of claim 3 or a lipid nanoparticle composition of claim 4 or a pharmaceutical composition of claim 5 or a pharmaceutical formulation of claim 6 for the preparation of drugs for the treatment  and / or prevention of a disease.12.A method of delivering a therapeutic or prophylactic agent to a cell, tissue or organ in a subject, comprising contacting the cell, tissue or organ in the subject with a lipid nanoparticle composition of claim 4, a pharmaceutical composition of claim 5 or a pharmaceutical formulation of claim 6.13.A method for producing a target protein or target polypeptide in a subject cell, comprising contacting the subject cell with a lipid nanoparticle composition of claim 4, a pharmaceutical composition of claim 5, or a pharmaceutical formulation of claim 6.14.A method of making a compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, comprising: reacting a carboxylic acid compound with an isonitrile compound, an aldehyde compound, an amine compound under Ugi coupling reaction conditions to provide the compound of Formula I or a pharmaceutically acceptable salt, stereoisomer, tautomer, solvate, chelate, non-covalent complex, or precursor thereof, wherein the carboxylic acid compound isthe isonitrile compound is CN-R3, the aldehyde compound isthe amine compound isR1-R7, L1, L2, G1 are defined as described in claim 1.

Images