Recombinant adeno-associated viral vectors for treating fabry disease

Abstract

Polypeptide variants of the human α-Gal A, codon-optimized coding sequence of the said polypeptide variants and wild-type protein, and recombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors comprising the said coding sequence are provide. Also provided are chimeric promoters that drive high expression in the liver and heart, which is suitable for the rAAVs of the present application.

Description

RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR TREATING FABRY DISEASEFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present disclosure belongs to the field of gene therapy. Specifically, the present disclosure provides nucleotide sequences encoding human alpha-galactosidase-A (α-Gal A) or variants thereof, and recombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors comprising the nucleotide sequence for treating a disorder or condition caused by the deficiency of α-Gal A, especially Fabry disease.

[0002] SEQUENCE LISTING

[0003] The present disclosure includes a sequence listing as a part of the disclosure.BACKGROUND

[0004] Fabry disease (FD, OMIM 301500) is an X-linked, dominantly inherited genetic disorder caused by the deficiency or absence of lysosomal α-galactosidase A (EC 3.2.1.22, α-Gal A) . Deficiency or absence of α-Gal A results in abnormal and excessive deposition of glycosphingolipids, particularly globotriaosylceramide (Gb3 or GL-3) and galactosylceramide. Gb3 accumulation occurs in a variety of tissues and cell types, including capillary endothelial, renal, cardiac and nerve cells. Classical symptoms for FD include burning pain in the arms and legs, angiokeratoma, cornea verticillate, left ventricular hypertrophy and chronic nephrosis. Without proper treatment, the life expectancy of male patients was estimated to be around 58.2 years old based on the data from Fabry Registry. Women can also have symptoms, but usually milder than those for men and life expectancy is reported to be around 75.4 years old, about 5 years shorter than the general woman’s life expectancy.

[0005] Currently available treatments for FD are mainly based on enzyme replacement therapy (ERT) . There are 2 options for FD patients, Agalsidase β and Agalsidase α, both of which are recombinant human α-Gal A enzyme. Both drugs require intravenous injections every other week to relieve their symptoms, which is time and cost consuming. According to the statistical result, 90%of males treated with Agalsidase β and 56%of males treated with Agalsidase αdeveloped antibodies to the injected drugs, reducing the therapeutic effects of ERT drugs. An investigation of patients receiving long-term ERT treatment revealed that although the risk of developing complications declines with increasing treatment duration, ERT does not prevent disease progression [1] .

[0006] Considering the limitations of ERT, there remains an unmet medical need for a better and more affordable therapy for FD patients. An AAV-based gene therapy will deliver the α-Gal A  coding sequence to replace the defective gene and relieve the symptoms resulting from the deficiency of α-Gal A in FD patients, providing an endurable therapy after a single dose to be significantly more convenient and cost effective for FD patients.SUMMARY OF THE INVENTION

[0007] The present inventors have developed codon-optimized sequences encoding α-Gal A, as well as α-Gal A variants having increased activity thereof, thus completing the invention.

[0008] In a first aspect, the present application provides a nucleotide sequence encoding for human α-Gal A polypeptide, wherein the amino acid sequence of the α-Gal A polypeptide is shown in SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence is any one of the nucleotide sequences as shown in SEQ ID NOs: 3-9. In the most preferred embodiment, the nucleotide sequence encoding for human α-Gal A polypeptide is the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 5. In certain embodiments, the nucleotide sequence encoding for human α-Gal A polypeptide is comprised in a rAAV vector.

[0009] In a second aspect, the present application provides a polypeptide variant of human α-Gal A, wherein the polypeptide variant has an enzyme activity of lysosomal α-galactosidase A, and an increased number of N-linked glycosylation sites (specifically, NXS / T motifs) as compared to the wild-type human α-Gal A polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1.

[0010] In a more specific embodiment of the second aspect, the amino acid sequence of the polypeptide variant of human α-Gal A comprises at least one amino acid substitution selected from a group consisting of G274S, G274T, Q280S, Q280T, Q357S, Q357T, Q422N, Q280N, E398N, E418N, D233N, D244N, and R100N, as compared to the wild-type human α-Gal A polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1. In a preferred embodiment, the polypeptide variant of human α-Gal A comprises at least one amino acid substitution selected from a group consisting of Q422N, E418N, D233N, E398N, and D244N, as compared to the wild-type human α-Gal A polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1. In a preferred embodiment of the second aspect, the polypeptide variant of human α-Gal A has an increased enzyme activity of lysosomal α-galactosidase A, as compared to the wild-type human α-Gal A polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1.

[0011] In specific embodiments of the second aspect, the polypeptide variant of human α-Gal A comprises or consists of the amino acid sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 18-30. In preferred embodiments, the polypeptide variant of human α-Gal A comprises or consists of the amino acid sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 24, and 26-29. In more preferred  embodiments, the polypeptide variant of human α-Gal A comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24.

[0012] In a third aspect, the present application provides a nucleotide sequence encoding for the polypeptide variant of human α-Gal A of the second aspect. In the preferred embodiment, the nucleotide sequence encoding for the polypeptide variant of human α-Gal A is codon-optimized for the expression in human. In the preferred embodiment, the nucleotide sequence encoding for the polypeptide variant of human α-Gal A is based on the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 5 that encodes for the wild-type human α-Gal A, containing codon changes for the amino acid residue substituted.

[0013] In specific embodiments of the third aspect, the nucleotide sequence encoding for the polypeptide variant of human α-Gal A comprises or consists of a nucleotide sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 31-43. In preferred embodiments, the nucleotide sequence encoding for the polypeptide variant of the human α-Gal A comprises or consists of a nucleotide sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 37 and 39-42. In more preferred embodiments, the nucleotide sequence encoding for the polypeptide variant of human α-Gal A comprises or consists of a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NOs: 37. In certain embodiments, the nucleotide sequence encoding for the polypeptide variant of human α-Gal A polypeptide is comprised in a rAAV vector.

[0014] In any aspect of the present application, the rAAV vector is a single-stranded AAV (ssAAV) vector or self-complementary AAV (scAAV) vector.

[0015] Furthermore, the inventors have developed chimeric promoters that drive strong expression, especially in the liver. Therefore, in a fourth aspect, the present application provides a chimeric promoter comprising from 5’ to 3’ a cis-regulatory element, a TTR (transthyretin) enhancer, and a TTR promoter, wherein the cis-regulatory element is derived from a gene having high expression in the liver. In a more preferred embodiment of the fourth aspect, the chimeric promoter further comprises a 3 × HS-CRM (hepatocyte-specific cis-regulatory module) sequence. Preferably, the 3 × HS-CRM sequence is located between the cis-regulatory element and the TTR enhancer. For example, the TTR enhancer has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 12. For example, the TTR promoter has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 13. For example, the 3 × HS-CRM has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11. For example, the cis-regulatory element has a nucleotide sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 44, and 47-56. In specific embodiments, the chimeric promoter is selected from P4, P7, P10, P14, P15, P16, P17, P18, P19, P20 and P21 promoters of the present application. Preferably, the chimeric promoter is P10, P14, P16, P18 or P21. More preferably, the chimeric promoter is P14 or P18. For example, the promoter is used in a recombinant AAV vector.

[0016] In a fifth aspect, the present application provides an expression cassette, comprising the nucleotide sequence of the first aspect that encodes for the human α-Gal A polypeptide, or the nucleotide sequence of the third aspect that encodes for the polypeptide variant of the human α-Gal A. In a preferred embodiment, the nucleotide sequence of the first or third aspect is operatively linked to the chimeric promoter of the fourth aspect.

[0017] In a sixth aspect, the present application provides an expression cassette, comprising the chimeric promoter of the fourth aspect and a gene of interest (GOI) . In a preferred embodiment, the GOI is a nucleotide sequence encoding for the human α-Gal A polypeptide or variant thereof enzyme activity of lysosomal α-galactosidase A, e.g., the nucleotide sequence of the first aspect or the third aspect.

[0018] In preferred embodiments of the fifth and sixth aspects, the expression cassette is used for expression via rAAV vectors. Preferably, the expression cassette further comprises a KOZAK sequence and a SV40 polyA. For example, the SV40 polyA has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.

[0019] In a seventh aspect, the present application provides a rAAV vector, comprising the nucleotide sequence of the first aspect or the third aspect, the promoter of the fourth aspect, or the expression cassette of the fifth aspect or sixth aspect. In a preferred embodiment, the rAAV vector provides a desirable expression level of the GOI, e.g., the human α-Gal A protein or variant thereof with enzyme activity of lysosomal α-galactosidase A in target tissues, e.g., plasma, liver, heart and / or kidney, especially liver. In further embodiments, the rAAV vector comprises a 5’ ITR and a 3’ ITR. For example, the 5’ ITR has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, and / or the 3’ ITR has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17. For example, the 5’ ITR has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63, and / or the 3’ ITR has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 64.

[0020] In an eighth aspect, the present application provides an AAV viral particle comprising the rAAV vector of the seventh aspect packaged into an AAV capsid. The AAV capsid can be derived from any one of AAV1, AAV2, AAV3B, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVLK03, AAVS3, AAVKP1, AAVrh10, AAVNP40, AAVNP59, AAV-DJ, AAVAnc80L65, AAVsL65, AAVHSC15, AAVC102, AAV204, AAV214. The AAV capsid can be a wild-type AAV capsid of any of the aforesaid serotypes, a variant thereof, or a chimeric AAV having capsid proteins with amino acid fragments, regions, or domains derived from two or more of the aforesaid AAVs. In one embodiment, the AAV capsid is a capsid with liver tropism, such as the capsid of serotype AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, a variant thereof, or a chimeric AAV capsid having capsid proteins with amino acid fragments, regions, or domains derived from two or more of the aforesaid AAVs.

[0021] In a ninth aspect, the present application provides a pharmaceutical composition comprising the rAAV vectors of the seventh aspect or the viral particle of the eighth aspect, and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0022] In a tenth aspect, the present application provides a method for treating a lysosomal storage disease, especially Fabry disease in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the rAAV vector of the seventh aspect, the rAAV particle of the eighth aspect or the pharmaceutical composition of the ninth aspect.

[0023] In an eleventh aspect, the present application provides the use of the rAAV vector of the seventh aspect, the rAAV particle of the eighth aspect or the pharmaceutical composition of the ninth aspect in treating a lysosomal storage disease, especially Fabry disease.

[0024] In a twelfth aspect, the present application provides the use of the rAAV vector of the seventh aspect, or the rAAV particle of the eighth aspect in the manufacture of a medicament in treating a lysosomal storage disease, especially Fabry disease.BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0025] FIG. 1 illustrates the schematic diagram of the GLA-expressing vector for the evaluation of the optimized coding sequence (CDS) .

[0026] FIG. 2A shows the concentrations of α-Gal A protein expressed by different coding sequences in the supernatants of Hep3B cells.

[0027] FIG. 2B shows the concentrations of α-Gal A protein expressed by different coding sequences in the supernatants of Huh7 cells.

[0028] FIG. 3 illustrates the schematic diagram of the GLA-expressing vector for the evaluation of the α-Gal A mutants.

[0029] FIG. 4A shows the α-Gal A activities of α-Gal A mutant expression evaluated in HepG2 cells.

[0030] FIG. 4B shows the α-Gal A activities of α-Gal A mutant expression evaluated in Hep3B cells.

[0031] FIG. 4C shows the α-Gal A activities of α-Gal A mutant expression evaluated in Huh7 cells.

[0032] FIG. 5 illustrates the schematic diagrams of the two GLA-expressing vectors for the evaluation of the α-Gal A mutants in in vivo mouse studies.

[0033] FIGS. 6A, 6B and 6C show the results of in vivo evaluation of the α-Gal A mutant M7 as compared to the wild-type M0. FIG. 6A shows the time course of the plasma α-Gal A activities. FIG. 6B shows α-Gal A activities in the liver, heart and kidney at day 21. FIG. 6C shows the time course of the plasma lyso-Gb3 concentrations after administration of the rAAVs at the indicated doses.

[0034] FIG. 7 illustrates the schematic diagrams of the Luciferase expression vectors for in vitro evaluation of promoters P0-P13.

[0035] FIG. 8A shows the results of the luciferase assay for evaluation of expression driven by promoters P0-P13 in HepG2 cells.

[0036] FIG. 8B shows the results of the luciferase assay for evaluation of expression driven by promoters P0-P13 in Hep3B cells.

[0037] FIG. 8C shows the results of the luciferase assay for evaluation of expression driven by promoters P0-P13 in Huh7 cells.

[0038] FIG. 9 shows the bioluminescence imaging results comparing the expression efficiency and biodistribution of luciferase after systematic delivery of the rAAVs expressing luciferase driven by four different promoters, P0, P4, P7 and P10. H: heart; Li: liver; S: spleen; Lu: lung; S. i. : small intestine; K: kidney; B: brain; S. m. : skeletal muscle.

[0039] FIG. 10 are bar graphs showing luciferase activities in protein extracts of the indicated tissues (H: heart; Li: liver; S: spleen; Lu: lung; S. i. : small intestine; K: kidney; B: brain; S. m. : skeletal muscle) from mice that received AAV8-P0, AAV8-P4, AAV8-P7 or AAV8-P10 injection.

[0040] FIG. 11 illustrates the schematic diagrams of the Luciferase expression vectors for in vitro evaluation of promoters P14-P21.

[0041] FIG. 12 shows the results of the luciferase assay for evaluation of expression driven by promoters P14-P21 in different types of cells. P0 and cTNT promoters were used as controls.

[0042] FIG. 13 shows bioluminescence imaging results comparing the expression efficiency and biodistribution of luciferase after systematic delivery of rAAVs expressing luciferase driven by four different promoters (P14, P16, P18 and P21) . H: heart; Li: liver; S: spleen; Lu: lung; S. i. : small intestine; K: kidney; B: brain; S. m. : skeletal muscle.

[0043] FIG. 14 are bar graphs showing luciferase activities in protein extracts of the indicated tissues (H: heart; Li: liver; S: spleen; Lu: lung; S. i. : small intestine; K: kidney; B: brain; S. m. : skeletal muscle) from mice that received AAV8-P14, AAV8-P16, AAV8-P18 or AAV8-P21 injection.

[0044] FIG. 15 illustrates the schematic diagrams of the α-Gal A expression vectors for in vivo efficacy study of Example 4.

[0045] FIG. 16 shows the plasma α-Gal A activities in mice that received AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 or AAV8-P21-M7 at the indicated doses before and after (day 7, day 14 and day 28) the rAAV treatment.

[0046] FIG. 17 shows the α-Gal A activities in the heart, liver and kidney of mice that received AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 or AAV8-P21-M7 at 4 weeks  after administration of the respective rAAV.

[0047] FIG. 18 shows the time course of the plasma lyso-Gb3 concentrations of mice that received AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 or AAV8-P21-M7 at different doses (1 × 1011 vg / kg, 1 × 1012 vg / kg, and 1 × 1013 vg / kg) .

[0048] FIG. 19 shows the lyso-Gb3 concentrations in the heart, liver and kidney of mice that received AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 or AAV8-P21-M7 at different doses (1 × 1011 vg / kg, 1 × 1012 vg / kg, and 1 × 1013 vg / kg) at 4 weeks after the rAAV administration.

[0049] FIG. 20A shows the time courses of the plasma α-Gal A activities in mice that received AAV5-P14-M7, AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7 or AAV9-P14-M7 at the indicated doses before and after (day 7, day 14, day 28, day 56, day 84 and day 112) the rAAV treatment.

[0050] FIG. 20B shows the time courses of the plasma α-Gal A activities in mice that received AAV5-P18-M7 or AAV6-P18-M7 at the indicated doses before and after (day 7, day 14, day 28, day 56, day 84 and day 112) the rAAV treatment.

[0051] FIG. 21 shows the α-Gal A activities in the plasma, heart, liver and kidney of mice that received AAV5-P14-M7, AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7, AAV9-P14-M7, AAV5-P18-M7 or AAV6-P18-M7 at 16 weeks after administration of the respective rAAV at the indicated doses.

[0052] FIG. 22A shows the time courses of the plasma lyso-Gb3 concentrations in mice that received AAV5-P14-M7, AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7 or AAV9-P14-M7 at the indicated doses before and after (day 7, day 14, day 28, day 56, day 84 and day 112) the rAAV treatment.

[0053] FIG. 22B shows the time courses of the plasma lyso-Gb3 concentrations in mice that received AAV5-P18-M7 or AAV6-P18-M7 at the indicated doses before and after (day 7, day 14, day 28, day 56, day 84 and day 112) the rAAV treatment.

[0054] FIG. 23 shows the lyso-Gb3 concentrations in the plasma, heart, liver and kidney of mice that received AAV5-P14-M7, AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7, AAV9-P14-M7, AAV5-P18-M7 or AAV6-P18-M7 at the indicated doses at 16 weeks after administration of the respective rAAV.

[0055] FIG. 24 shows the one-year time courses of the plasma α-Gal A activities and lyso-Gb3 concentrations in mice that received 1 × 1013 vg / kg AAV5-P14-M7, 1 × 1013 vg / kg AAV5-P18-M7, 1 × 1012 vg / kg AAV8-P14-M7 or 1 × 1012 vg / kg AAV8-P18-M7.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0056] Unless specifically defined elsewhere in this document, all of the technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.

[0057] As used herein, including the appended claims, the singular forms of words such as “a” ,  “an” , and “the” , include their corresponding plural references unless the context clearly dictates otherwise.

[0058] In the context of the present disclosure, unless being otherwise indicated, the wording “comprise” , and variations thereof such as “comprises” and “comprising” will be understood to imply the inclusion of a stated element, e.g., an amino acid sequence, a nucleotide sequence, a property, a step or a group thereof, but not the exclusion of any other elements, e.g., amino acid sequences, nucleotide sequences, properties and steps. When used herein the term “comprise” or any variation thereof can be substituted with the term “contain” , “include” or sometimes “have” or equivalent variation thereof. In certain embodiments, the wording “comprise” also includes the scenario of “consisting of” .

[0059] I. Definition

[0060] The term “α-galactosidase A” or “α-Gal A” refers to the enzyme of EC 3.2.1.22, which hydrolyzes terminal, non-reducing alpha-D-galactose residues in alpha-D-galactosides. α-Gal A is encoded by GLA gene in human. The amino acid sequence of the wild-type human α-Gal A is shown as SEQ ID NO: 1.

[0061] The term “isolated nucleic acid” means a DNA or RNA which is removed from all or a portion of a polynucleotide in which the isolated polynucleotide is found in nature, or is linked to a polynucleotide to which it is not linked in nature. An isolated nucleic acid molecule “comprising” a specific nucleotide sequence may include, in addition to the specified sequence, operably linked regulatory sequences that control expression of the coding region of the recited nucleic acid sequences. Due to the codon degeneracy, one skilled in the art understands that any specific amino acid sequence can be coded by several different nucleotide sequences.

[0062] The term “codon-optimized coding sequence” herein refers to a nucleotide sequence coding for a polypeptide of interest, e.g., human α-Gal A polypeptide, modified from their wild-type coding sequence accommodating codon bias. Optimization may be achieved by reducing sequence complexity, adjusting GC content, adjusting codon usage and / or avoiding rare codons. The coding sequence which has been codon optimized usually shows an increased translational efficiency of the gene of interest (GOI) , leading to a higher protein expression.

[0063] The term “promoter” refers to a DNA sequence that enables initiation of transcription of a downstream gene under the control of the said promoter. Promoters include but not limited to constitutive promoters, cell type-specific promoters, tissue-specific promoters, development stage-specific promoters. Promoter can be a naturally occurring promoter of a gene, a modified version of a naturally occurring promoter or a synthetic promoter.

[0064] The term “enhancer” is a regulatory DNA sequence which can enhance the transcription  of the GOI in AAV together with the promoter.

[0065] The term “chimeric promoter” refers to a promoter element that drives the expression of a gene that is operatively linked to it. The chimeric promoter of the present application may be consisted of a conventional promoter, such as a minimal promoter, and optionally also an enhancer and / or cis-regulatory element. A minimal promoter is the minimal portion of the promoter required to properly initiate transcription. A cis-regulatory element or a cis-regulatory replication element (CRE) is a nucleotide fragment derived from a non-coding region which has regulatory function on the transcription of a neighboring gene.

[0066] By “operatively linked” , it means that the promoter or chimeric promoter is in a functionally appropriate location and / or orientation in relation to the coding sequence so as to control the transcription of the coding sequence.

[0067] The term “expression cassette” herein refers to a DNA component included in a vector (e.g., rAAV vector) and consisted of a gene (e.g., human GLA gene) to be expressed in host cells transfected by the vector and regulatory sequence (s) .

[0068] The term “N-linked glycosylation” refers to a type of modification in which oligosaccharide is attached to the amino group of an asparagine (N) side chain. N-linked glycosylation predominantly occurs in N-X-S / T peptide sequences, and rarely in N-X-C, in which N is asparagine, S is serine, T is threonine, C is cysteine, and X can be any amino acid other than proline. Accordingly, in the context of the present application, the term “N-linked glycosylation site” refers to any of the aforesaid three-amino-acid peptide stretch selected from N-X-S, N-X-T and N-X-C. Accordingly, the number of “N-linked glycosylation site” in a certain polypeptide, for example a polypeptide variant of the human α-Gal A, is calculated by adding the numbers of N-X-S, N-X-T and N-X-C occurred in the said polypeptide.

[0069] The term “pharmaceutical composition” refers to a composition suitable for delivering to a subject.

[0070] The terms “administration” , “administering” , “treating” and “treatment” as used herein, when applied to a subject, e.g., an animal, including human, or to cell, tissue, organ, or biological fluid, means contact of an exogenous pharmaceutical, therapeutic, diagnostic agent, or composition with the subject, cell, tissue, organ, or biological fluid. Treatment of a cell encompasses contact of a reagent with the cell, as well as contact of a reagent with a fluid, where the fluid is in contact with the cell. The term “administration” and “treatment” also include in vitro and ex vivo treatments, e.g., of a cell, by a reagent, diagnostic, binding compound, or by another cell.

[0071] II. GLA-expressing constructs

[0072] To lower the rAAV treatment dose for safety consideration and cost benefits, efforts were made to increase the GLA enzyme activity by developing α-Gal A variants with an increased number of N-linked glycosylation sites, and to enhance the expression efficiency of GLA-expressing construct by optimizing coding sequence and evaluating chimeric promoters.

[0073] The present application provides polypeptide variants of the human α-Gal A with increased enzyme activity of lysosomal α-galactosidase A. This is mainly achieved by creating new N-linked glycosylation sites in the amino acid sequence of the enzyme variant. In a preferred embodiment, the polypeptide variant of the human α-Gal A comprises at least one amino acid substitution selected from a group consisting of Q422N, E418N, D233N, E398N, and D244N, as compared to the wild-type human α-Gal A polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1.

[0074] In some embodiments, the polypeptide variant of human α-Gal A comprises a single amino acid mutation selected from Q422N, E418N, D233N, E398N, and D244N, and thus comprises or consists of the amino acid sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 24, and 26-29. In more preferred embodiments, the polypeptide variant of the human α-Gal A comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24.

[0075] The variant of the present application can achieve an α-Gal A activity of at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%higher than that of the wild-type human α-Gal A, or as high as at least 1.5-fold, at least 2-fold, at least 2.5-fold, at least 3-fold of that of the wild-type human α-Gal A, when being expressed by a rAAV vector in the same cell type (e.g., liver cells or liver cancer cells) or in the same tissue (liver, heart, kidney, or blood) . The enzyme activity can be determined by any conventional means known in the art.

[0076] The present application also provides codon-optimized coding sequences for the wild-type human α-Gal A and polypeptide variants of the human α-Gal A of the present application. The preferred codon-optimized coding sequences of the present application are designed based on a codon-optimized coding sequence for wild-type human α-Gal A as shown in SEQ ID NO: 5. Therefore, the coding sequence of a variant of the present application only differs from the nucleotide of SEQ ID NO: 5 in the codon (s) corresponding to the amino acid substitution (s) . The codon for replacement can be determined based on the codon usage of the intended host cells. In specific embodiments, the nucleotide sequence encoding for the human α-Gal A variant comprises or consists of a nucleotide sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 37 and 39-42. In more preferred embodiments, the nucleotide sequence encoding for the polypeptide  variant of the human α-Gal A comprises or consists of a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NOs: 37.

[0077] In the process of optimizing the regulatory sequences, the inventors discovered that chimeric promoters comprising the cis-regulatory element, enhancer and (minimal) promoter in specific orders can lead to significantly increased expression of the GOI. Specifically, the cis-regulatory element is arranged in a position 5’ upstream of the enhancer and promoter, instead of between the enhancer and promoter, or any other position.

[0078] In preferred embodiments, the chimeric promoter of the present application from 5’ to 3’ comprises or is consisted of (a) - (c) :

[0079] (a) a cis-regulatory element,

[0080] (b) an enhancer,

[0081] (c) a promoter.

[0082] The cis-regulatory element of the present application can be one derived from the non-coding region, e.g., the intron region, of a gene highly expressed in the target tissue, e.g., liver. The preferred cis-regulatory element of the present application has a nucleotide sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 44, and 47-56.

[0083] The promoter or minimal promoter in the chimeric promoter of the present application can be one that drives higher expression of the gene of interest in liver and preferably also in heart as compared to in other tissues. For example, the promoter or minimal promoter in the chimeric promoter of the present application can be a TTR promoter, e.g., having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13.

[0084] The enhancer in the chimeric promoter of the present application can be one that locates upstream of the promoter in nature. For example, the enhancer in the chimeric promoter of the present application can be a TTR enhancer when the promoter is a TTR promoter. The TTR enhancer can have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.

[0085] The expression cassette can further comprise elements such as KOZAK sequence, polyadenylation sequence and translation termination signal. For example, SV40 polyA sequence can be included after the coding sequence of the GOI. The SV40 polyA sequence can have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.

[0086] III. Recombinant AAV vectors and viral particles

[0087] The coding sequence of α-Gal A or the expression cassette of the present application can be constructed into a recombinant AAV (rAAV) vector, to obtain rAAV particles for delivery into a subject in need thereof.

[0088] The rAAV vectors can be a self-complementary AAV (scAAV) vector or a single- stranded AAV (ssAAV) vector. The rAAV vector is comprised of two inverted terminal repeat (ITR) sequences at both ends of the inserted expression cassette. The ITR of the present disclosure can be ITR derived from any AAV serotypes. When reference is made to serotype of AAV ITR, the phrase “derived from” means that the ITR can be the ITR of a certain serotype or a variant derived therefrom with modification (s) . In a preferred embodiment of the present disclosure, the rAAV vector comprises two ITRs derived from AAV2. For example, the scrAAV vector comprises two AAV2 ITRs, or comprises a wild-type AAV2 ITR and a truncated version of AAV2 ITR lacking the terminal resolution site (trs) and region D. For example, the ssrAAV vector comprises two AAV2 ITRs, or comprises a wild-type AAV2 ITR and a truncated version of AAV2 ITR lacking the region C or region C’ . For example, the wild-type AAV2 ITR locates in the 5’ of the inserted nucleotide sequence, while the AAV2 ITR variant locates in the 3’ of the inserted nucleotide sequence; or vice versa. In one embodiment, the rAAV is scAAV, and the two ITRs comprised in the rAAV have nucleotide sequences as shown in SEQ ID NO: 63 (5’ ITR) and SEQ ID NO: 64 (3’ ITR) , respectively. In one embodiment, the rAAV is ssAAV, and the two ITRs comprised in the rAAV have nucleotide sequences as shown in SEQ ID NO: 10 (5’ ITR) and SEQ ID NO: 17 (3’ ITR) , respectively.

[0089] The rAAV genome was packaged into an AAV capsid. AAV capsid is composed of three viral proteins, namely VP1, VP2 and VP3. The capsid of the present application can be derived from any AAV serotype known in the art or characterized in the future. By “derived from” , it means that the capsid can be the wild-type capsid of a certain AAV serotype or a variant thereof, e.g. a variant comprising one or more amino acid modifications in one or more of VP1, VP2 or VP3. The capsid of the present application can be a chimeric AAV capsid that comprises capsid proteins with amino acid fragments, regions, or domains derived from two or more of AAV serotypes. The capsid and ITRs of the present application can be derived from the same serotype of AAV or from different serotypes of AAV. For example, the capsid can be a capsid suitable for intravenous (IV) delivery (e.g., IV injection) to the peripheral tissues. The term “peripheral tissue” in the context of the present application refers to any tissue that is not a part of the brain or spinal cord. In some preferred embodiments, the AAV vector comprises a capsid of AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAVLK03, AAVS3, AAVKP1, AAVNP40, AAVNP59, AAV-DJ, AAVsL65, AAVHSC15, AAVC102, AAV204, AAV214, AAV PHP. B, AAV2.7m8 or AAVAnc80L65 serotype, a variant thereof, or a chimeric AAV capsid. In more preferred embodiments, the capsid is the AAV5, AAV6, AAV8 or AAV9 capsid, a variant thereof, or a chimeric capsid derived from two or more of AAV5, AAV6, AAV8 and AAV9. In more preferred embodiments, the capsid is the AAV5 or AAV8 capsid, a variant thereof, or a chimeric capsid derived from AAV5 or AAV8.

[0090] IV. Therapeutic uses

[0091] The present application also provides a pharmaceutical composition comprising an isolated nucleic acid comprising the coding sequence, the rAAV vector or the viral particle of the present application, along with a pharmaceutically acceptable excipient. Conventional pharmaceutically acceptable excipients are known in the art and can be solid or liquid excipients. In one embodiment, the pharmaceutical composition can be a liquid for injection.

[0092] In some embodiments, the rAAV vector of the present application can be administered into a subject via systemic delivery or local delivery. In some embodiments, the rAAV vector of the present application can be delivered to peripheral tissues or organs, e.g., into peripheral blood, via any parental or enteral route. For example, the rAAV vector of the present application can be administered by intravenous (IV) , intramuscular (IM) , subcutaneous (SC) , intra-arterial, intraperitoneal (IP) , intradermal, transdermal, oral, nasal or rectal route. For example, the rAAV can be delivered by injection. In some embodiment, the rAAV vector can be delivered by a combined administration via more than one delivery route.

[0093] The rAAV vector can be administered via a single dose or multiple doses. In a specific embodiment, the rAAV vector is administered via a single injection.

[0094] The rAAV vector or the pharmaceutical composition can be used to treat a disease or condition related to or caused by deficiency or absence of lysosomal α-galactosidase A, e.g., a lysosomal storage disease such as Fabry disease.

[0095] The therapeutically effective dosage of the rAAV vector can range from about 1 x 1011 vg / kg to about 5 x 1014 vg / kg. Preferably, the rAAV vector may be administered at a dosage between about 1 x 1012 and about 5 x 1014 vg / kg. For example, the rAAV vector may be administered at a dosage of at least about 1 x 1011, at least about 5 x 1011, at least about 1 x 1012, at least about 5 x 1012, at least about 1 x 1013, at least about 5 x 1013, at least about 1 x 1014 vg / kg, or at least about 5 x 1014 vg / kg. For example, the rAAV vector may be administered at a dosage of about 1 x 1011, about 5 x 1011, about 1 x 1012, about 5 x 1012, about 1 x 1013, about 5 x 1013, or about 1 x 1014 vg / kg, or about 5 x 1014 vg / kg.

[0096] By administration of the rAAV of the present application, one or more of the following therapeutic effects can be achieved: (1) increase of α-Gal A level; (2) increase of α-Gal A activity; (3) decrease or elimination of glycosphingolipids, in particular globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3) , globotriaosylceramide (Gb3 or GL-3) or galactosylceramide. For example, the increase or decrease is determined by comparing to the level or activity of the same subject before receiving the rAAV administration. For example, the increase of α-Gal A level, the increase of α-Gal A activity and / or the decrease or elimination of glycosphingolipids such as lyso-Gb3 is observed  in one or more of the tissues selected from plasma, heart, liver, and kidney of the subject. For example, the α-Gal A amount and / or activity increased by at least about 2 times, at least about 5 times, at least about 10 times, at least about 20 times, at least about 50 times, at least about 100 times, at least about 1,000 times, at least about 2,000 times, at least about 5,000 times, at least about 10,000 times, at least about 20,000 times, at least about 50,000 times, or even more as compared to the α-Gal A amount and / or activity of the same subject before receiving the rAAV administration. For example, the level of glycosphingolipids, in particular globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3) or globotriaosylceramide (Gb3 or GL-3) can be decreased by at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 95, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, or at least about 99%, as compared to the level of the same subject before receiving the rAAV administration. In some embodiments, the glycosphingolipids, in particular globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3) or globotriaosylceramide (Gb3 or GL-3) can be substantially eliminated in the plasma of the subject after the rAAV administration.

[0097] In some embodiments, one or more of the therapeutic effects can be observed immediately after administration of the rAAV. In some embodiments, one or more of the therapeutic effects can be observed at least about 1 week, at least about 2 weeks, at least about 3 weeks, at least about 4 weeks, at least about 1 month, at least about 2 months, at least about 3 months, at least about 4 months, at least about 5 months, at least about 6 months, at least about 7 months, at least about 8 months, at least about 9 months, at least about 10 months, at least about 11 months, at least about 12 months after the administration of the rAAV, or in an even longer period of time.

[0098] EXAMPLES

[0099] To facilitate the understanding and utilization of the present invention, the merits of the present invention will be described in more details with reference to examples and appended drawings. However, it should be understood that the following examples only intend to exemplify the present invention without any intention in limiting the scope of the present invention. The scope of the present invention should be defined by the claims.

[0100] HepG2 cells used in the examples were purchased from ATCC. All the other types of cells were purchased from Procell Life Science &Technology Co., Ltd..

[0101] In the examples, rAAVs were prepared into scAAVs for in vitro coding sequence evaluation and ssAAVs for in vivo and in vitro α-Gal A mutant, chimeric promoter and final construct evaluation.

[0102] Example 1. Optimization of the coding sequence for GLA expression

[0103] To achieve robust GLA expression, optimized coding sequences (CDS) of GLA (GLAop CDS) were designed and synthesized (see Table 1) .

[0104] Table 1. A summary of the codon optimized GLA CDS

[0105] (C0 refers to the wild type GLA CDS, C1-C7 are the optimized CDS. )

[0106] The nucleotide sequences of C0-C7 are shown below.

[0107] SEQ ID NO: 2, wild-type GLA nucleotide sequence (C0)

[0108] SEQ ID NO: 3, GLA C1

[0109] SEQ ID NO: 4, GLA C2

[0110] SEQ ID NO: 5, GLA C3

[0111] SEQ ID NO: 6, GLA C4

[0112] SEQ ID NO: 7, GLA C5

[0113] SEQ ID NO: 8, GLA C6

[0114] SEQ ID NO: 9, GLA C7

[0115] The optimized coding sequences were built into a plasmid vector having the structure as shown in Figure 1 to evaluate the GOI expression. The plasmid vector comprised the following elements between the two ITRs: 3x HS-CRM (SEQ ID NO: 11) , TTR enhancer (SEQ ID NO: 12) , TTR promoter (SEQ ID NO: 13) , a chimeric intron (SEQ ID NO: 14) , the optimized GLA coding sequence (GLAop CDS) (one of SEQ ID NOs: 2-9) , WPRE (SEQ ID NO: 15) , and SV40 poly A (SEQ ID NO: 16) . The sequence information of the various elements is provided in Table 2 below.

[0116] Table 2. Sequence information of the different sequence motifs of the GLA expression vectors for the evaluation of the codon optimized CDS.

[0117] Hep3B and Huh7 cells were maintained in DMEM + 10%FBS and passaged every 3 days. The day before transfection, cells were inoculated into 96-well plates at a density of 1.7×104 cells / well (Hep3B cells) or 1.48×104 cells / well (Huh7 cells) . The cells were transfected by the plasmids comprising C0-C7 with Lipofectamine 3000 Transfection Reagent (Invitrogen, L3000008) following the user’s guide. 72 hours after transfection, supernatants were collected and the α-Gal A concentration was detected by ELISA (Sino Biological, SEK12078) . ELISA results were shown in Figure 2 and Table 3. The results suggested C3 gave the highest GLA expression. Interestingly as shown in Table 1, C3 sequence has the lowest CpG number while the highest percentage GC content. Given that CpG in the AAV vectors has the potential to cause immunoreaction and result in exogenous gene silencing [3, 4] , lower CpG number would be favored for clinical use. Therefore, C3 is a promising candidate to provide more endurable and stronger GLA expression.

[0118] Table 3. The α-Gal A concentrations detected in the Hep3B and Huh7 supernatants.

[0119] Example 2. α-Gal A mutants with enhanced enzyme activity

[0120] A limitation for Fabry Disease treatment is the poor cross uptake efficiency of the α-Gal A protein by the relevant tissues, e.g., heart and kidney. The expressed α-Gal A enters the recipient cells via the mannose-6-phosphate (M6P) receptor (M6PR) [5] . Although M6PR is widely distributed in a variety of tissues and cells, the M6PR expression is limited, which  restricts the amount of α-Gal A entering into heart or kidney, rendering insufficient therapeutic effect.

[0121] M6P is involved in phosphorylation of the protein glycosylation sites, with each glycosylation site having multiple M6Ps. So α-Gal A mutants with increased N-linked glycosylation sites were designed to increase the total numbers of M6P in the expressed α-Gal A protein. Thirteen α-Gal A mutants each with a single amino acid substitution were designed and the sequence information is described in Table 4, including the amino acid sequences and the corresponding nucleotide sequences. The nucleotide sequence selected as the template for the mutants was C3 (SEQ ID NO: 5) as shown in Example 1.

[0122] Recombinant AAV vectors were constructed for each of the mutants following the construct diagram as showed in Figure 3. Specifically, the vector comprised the following elements between the two ITRs: 3x HS-CRM (SEQ ID NO: 11) , TTR enhancer (SEQ ID NO: 12) , TTR promoter (SEQ ID NO: 13) , coding sequence of the wild-type protein or any one of the mutants (see Table 4) , and SV40 poly A (SEQ ID NO: 16) .

[0123] Table 4. A summary of the α-Gal A mutants

[0124] Table 5. The sequence information of the regulatory motifs of the GLA expression vectors for the evaluation of α-Gal A mutants.

[0125] HepG2, Hep3B, and Huh7 cells were maintained in DMEM + 10%FBS and passaged  every 3 days. The day before transfection, cells were inoculated into 96-well plates in 1.48×104 cells / well (HepG2 cells or Huh7 cells) or 1.7×104 cells / well (Hep3B cells) . Plasmids were transfected by Lipofectamine 3000 Transfection Reagent (Invitrogen, L3000008) following the user’s guide.

[0126] 72 hours after transfection, supernatants were collected to determine the α-Gal A activities. The α-Gal A activities were assessed by using a fluorescence-based enzymatic activity assay. Specifically, the supernatants were diluted 10 times. 10 μL diluted supernatants and 20 μL 10 mM 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside (4MU-α-GAL) in assay buffer (0.1 M sodium citrate, 0.05 M Na2HPO4 and 100 mM N-acetyl-D-galactosamine) were incubated at 37℃ for 2 hours. The reaction was terminated by adding 100 μL 0.5 M Glycine (pH = 10.2) . The fluorescence intensities (Em = 365 nm, Ex = 450 nm) were determined by a plate reader. Activity results are showed in Figure 4 and Table 6. Mutant M7 had the best performance in HepG2 and Hep3B cells, and the second best in Huh7 cells among all of the tested mutants and the wild-type sequence. Accordingly, M7 was chosen for further analysis.

[0127] Table 6. Activities of the α-Gal A mutants in HepG2, Hep3B and Huh7 cell supernatants.

[0128] To further evaluate the α-Gal A mutant M7, M0 and M7 were cloned to a liver-specific AAV expression construct for in vivo evaluation. The structure of the construct is shown in Figure 5 (AAV8-P10-M0 and AAV8-P10-M7) . Specifically, the vector comprised the following elements between the two ITRs: CRE I (SEQ ID NO: 44) , 3x HS-CRM (SEQ ID NO: 11) , TTR enhancer (SEQ ID NO: 12) , TTR promoter (SEQ ID NO: 13) , coding sequence of the wild-type protein (SEQ ID NO: 5) or the mutant (SEQ ID NO: 37) , and SV40 poly A (SEQ ID NO: 16) . The sequence information is also shown in Table 7.

[0129] Table 7. The sequence information of the regulatory motifs of the GLA expression vectors for in vivo evaluation of the α-Gal A mutant M7.

[0130] AAV8-P10-M0 and AAV8-P10-M7 were intravenously (I. V. ) injected into GLA- / Y or wild-type (WT) mice (n = 6) at different doses. α-Gal A activities in the plasma and tissue were evaluated. Results are shown in Figures 6A-B and Tables 8-9.

[0131] Table 8. The α-Gal A activities in the plasma of mice receiving AAV8-P10-M0 or AAV8-P10-M7.

[0132] Table 9. The α-Gal A activities in the heart, liver and kidney of mice receiving AAV8-P10-M0 or AAV8-P10-M7 at 4 weeks after rAAV administration.

[0133] Plasma lyso-Gb3 is considered as a promising biomarker for monitoring Fabry disease in the clinic. The plasma lyso-Gb3 concentrations were evaluated by liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS) before and after (days 7, 14, 21 and 28) administration of the rAAVs. Results are shown in Figure 6C and Table 10.

[0134] Table 10. The plasma lyso-Gb3 concentrations of mice receiving AAV8-P10-M0 or AAV8-P10-M7.

[0135] (UD, Undetected. Lower Limit of Quantification (LLOQ) = 0.4 ng / mL)

[0136] Taken together, the results suggested that M7 achieved higher α-Gal A enzyme activities in the liver and heart, and as a result, M7 also achieved better lyso-Gb3 lowering in the plasma.

[0137] Example 3. Screening for chimeric promoters driving stronger GLA expression

[0138] Chimeric promoters based on the TTR promoter were designed to improve GLA liver expression. Cis-regulatory elements (CREs) from genes with high expression in the human liver were selected [6] . The selected CREs were inserted in different locations of P1 to generate P2-P13. A liver-specific promoter, P0, was used as a control. Illustrations of the luciferase expressing constructs comprising P0-P13 are shown in Figure 7. The sequence information is  provided in Table 11.

[0139] Table 11. The sequence information of the Luciferase expression vectors for in vitro evaluation of P0-P13.

[0140] HepG2, Hep3B, and Huh7 cells were maintained in DMEM + 10%FBS and passaged every 3 days. The day before transfection, cells were inoculated into 96-well plates in 1.48×104 cell / well (HepG2 or Huh7 cells) or 1.7×104 cell / well (Hep3B cells) . Plasmids were transfected by Lipofectamine 3000 Transfection Reagent (Invitrogen, L3000008) following the user’s guide.

[0141] 72 hours after transfection, Bright-Lite Luciferase Assay System (Vazyme, DD1204) was used for the luciferase assay. The relative light unit (RLU) results are shown in Figure 8 and Tables 12-14.

[0142] Table 12. The relative light unit (RLU) of P0-P13 in HepG2 cells.

[0143] Table 13. The relative light unit (RLU) of P0-P13 in Hep3B cells.

[0144] Table 14. The relative light unit (RLU) of P0-P13 in Huh7 cells.

[0145] The results revealed that stronger expression was achieved when CREs were located at the 5’ of the 3×HS-CRM, as the constructs comprising P4, P7 and P10 gave higher levels of protein expression. Therefore, rAAVs of AAV8 capsid were generated for P4, P7 and P10 together with P0 as a reference (AAV8-P0, AAV8-P4, AAV8-P7 and AAV8-P10) to evaluate these three promoters in vivo.

[0146] AAV8-P0, AAV8-P4, AAV8-P7 and AAV8-P10 were intravenously injected into the ICR mice at doses of 1×1011 and 1×1012 vg / mouse (n = 3) . 3 weeks after the rAAV administration, bioluminescence imaging was used to evaluate luciferase activities in different tissues (Figure 9) . The results revealed that P0, P4, P7 and P10 all mediated liver-specific biodistribution. Among the three evaluated, P10 mediated the strongest luciferase expression. The luciferase activities in protein extracts from various tissues were evaluated as RLU per 20 μg total protein and the results are shown in Figure 10 and Table 15.

[0147] Table 15. The relative light unit (RLU) of tissues from mice receiving AAV8-P0, AAV8-P4, AAV8-P7 or AAV8-P10 at 3 weeks after rAAV administration.

[0148] (H: heart; Li: liver; S: spleen; Lu: lung; S. i. : small intestine; K: kidney; B: brain; S. m. : skeletal muscle)

[0149] Another series of enhancers were introduced into P1 to generate chimeric promoters P14-P21 in order to enhance GLA expression in the heart. To design P14-P21, we identified heart specific enhancers from the literature [7] . Due to the limitation of the AAV genome size, oversized enhancers were truncated based on the data in Enhancer 2.0. P0 and cTNT were used as controls. Illustrations of the construct structures comprising P14-P21 are shown in Figure 11 and the sequence information is provided in Table 16.

[0150] Table 16. The sequence information of the regulatory motifs of the luciferase expression vectors for in vitro evaluation of P14-P21.

[0151] The HepG2, Hep3B, Huh7, AC16, IHC-SV40 (IHC) , H9C2 and 769P cells were passaged every 3 days. The day before transfection, cells were inoculated into 96-well plates in 1.48×104 cell / well (HepG2 or Huh7 cells) or 1.7×104 cell / well (Hep3B, AC16, IHC, H9C2 or 769P cells) . Plasmids were transfected by Lipofectamine 3000 Transfection Reagent (Invitrogen, L3000008) following the user’s guide.

[0152] 72 hours after transfection, the Bright-Lite Luciferase Assay System (Vazyme, DD1204)  was used for the luciferase assay. The relative light unit (RLU) results are shown in Figure 12 and Table 17.

[0153] Table 17. The relative light unit (RLU) of cell lines transfected with P14-P21, P0 and cTNT.

[0154] The results revealed that P14, P16, P18 and P21 enhanced luciferase expression not only in the heart cell lines, but also in the liver and kidney cell lines. Accordingly, rAAVs of the AAV8 capsid were generated comprising these four chimeric promoters (AAV8-P14, AAV8-P16, AAV8-P18 and AAV8-P21) for in vivo evaluation.

[0155] AAV8-P14, AAV8-P16, AAV8-P18 and AAV8-P21 were intravenously injected into the ICR mice at doses of 1 × 1011 and 1 × 1012 vg / mouse (n = 3) . 3 weeks after the rAAV administration, bioluminescence imaging was used to evaluate the luciferase activities in different tissues (Figure 13) . The results revealed that P14, P16, P18 and P21 all mediated a liver-specific biodistribution. Among them, P14 and P18 mediated stronger luciferase expression. The luciferase activity in protein extracts from various tissues were evaluated as RLU per 20 μg total protein (Figure 14 and Table 18) .

[0156] Table 18. The relative light unit (RLU) of tissues from mice receiving AAV8-P14, AAV8-P16, AAV8-P18 or AAV8-P21 injection.

[0157] (H: heart; Li: liver; S: spleen; Lu: lung; S. i. : small intestine; K: kidney; B: brain; S. m. : skeletal muscle)

[0158] Example 4. In vivo efficacy study of selected constructs

[0159] We combined the selected promoters and the optimized α-Gal A mutant with optimized coding sequence to generate another round of constructs. Illustrations of these constructs are shown in Figure 15 and the sequence information is provided in Table 19.

[0160] Table 19. The sequence information of the regulatory motifs of the α-Gal A expression vectors for in vivo efficacy study.

[0161] AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 and AAV8-P21-M7 were intravenously injected into the GLA- / Y mice (n = 3) . The GLA- / Y mice receiving PBS and WT mice were used as controls. The α-Gal A activities in plasma were evaluated and results are shown in Figure 16 and Table 20.

[0162] As shown in Table 20, 14 days after 1 × 1011 vg / kg AAV administration, the α-Gal A activities increased 1,001.6, 1,381.9, 529.3, 28,875.9 and 722.5 times for AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 and AAV8-P21-M7, respectively, which were 233.2, 321.8, 123.3, 6,723.7 and 168.2 folds higher than that of the WT. 14 days after 1 × 1013 vg / kg AAV administration, the α-Gal A activities increased 38,149.0, 261,649.1, 24,461.2, 515,638.0 and 30,157.0 times for AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 and AAV8-P21-M7, separately, which were 8,882.9, 60,924.5, 5,695.7, 120,065.4 and 7,022.0 folds higher than that of the WT.

[0163] Table 20. The plasma α-Gal A activities in mice receiving AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 or AAV8-P21-M7.

[0164] 4 weeks after the rAAV administration, the α-Gal A activities in the various peripheral tissues were evaluated, results are shown in Figure 17 and Table 21. Significant elevation of the α-Gal A activities were observed in the heart tissue at 1,653.2, 1,470.1, 209.6, 4,506.1 and 119.5 times after administration of 1 × 1013 vg / kg AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 and AAV8-P21-M7, respectively. Accordingly, the α-Gal A activities in the liver were elevated 880.4, 2,289.3, 914.8, 2,105.3 and 573.0 times. The α-Gal A activities in the kidney were elevated 36.3, 470.3, 6.4, 233.6 and 24.6 times.

[0165] Table 21. The α-Gal A activity in the heart, liver, kidney of mice receiving AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 or AAV8-P21-M7 at 4 weeks after rAAV administrations.

[0166] Also assessed was Lyso-Gb3 concentrations in the plasma, heart, liver and kidney by LC-MS.Results are shown in Figures 18-19 and Tables 22-23.4 weeks after 1 × 1013 vg / kg AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 and AAV8-P21-M7 administrations, the plasma lyso-Gb3 decreased 98.7%, 98.9%, 98.6%, 99.1%and 98.8%, respectively. Accordingly, the heart lyso-Gb3 decreased 99.1%, 99.2%, 98.8%, 99.4%and 99.1%. The liver lyso-Gb3 decreased 99.5%, 99.5%, 99.2%, 99.6%and 99.5%. The kidney lyso-Gb3 decreased 98.6%, 99.0%, 97.7%, 99.5%and 97.9%. The above results demonstrated the dramatic therapeutic effects four weeks after the rAAV administrations.

[0167] Table 22. The plasma lyso-Gb3 concentrations of mice receiving AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 or AAV8-P21-M7.

[0168] Table 23. The lyso-Gb3 concentrations in the heart, liver and kidney of mice receiving AAV8-P10-M7, AAV8-P14-M7, AAV8-P16-M7, AAV8-P18-M7 or AAV8-P21-M7 at 4 weeks after the rAAV administrations.

[0169] Example 5. In vivo efficacy study for comparison of 4 AAV serotypes

[0170] This example evaluates the effect of capsids from different serotypes on in vivo efficacy. P14-M7 was packaged into AAV5, AAV6, AAV8 and AAV9, separately. Meanwhile, P18-M7 was packaged into AAV5 and AAV6, separately. Illustrations of constructs P14-M7 and P18-M7 are shown in Figure 15 and the sequence information is provided in Table 19.

[0171] Each of AAV5-P14-M7, AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7, AAV9-P14-M7, AAV5-P18-M7 and AAV6-P18-M7 was intravenously injected into the 15-week-old GLA- / Y mice (n = 3) . AAV5-P14-M7 and AAV5-P18-M7 were dosed at the concentrations of 1 × 1012 vg / kg (low dose) , 1 × 1013 vg / kg (middle dose) and 5 × 1013 vg / kg (high dose) . AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7, AAV9-P14-M7 and AAV6-P18-M7 were dosed at the concentrations of 1 × 1011 vg / kg (low dose) , 1 × 1012 vg / kg (middle dose) and 1 × 1013 vg / kg (high dose) . The GLA- / Y mice receiving PBS and WT mice were used as controls.

[0172] The plasma α-Gal A activities were tracked till 16 weeks after dosing. The results are shown in Figures 20A, 20B, 21 and Table 24. The plasma α-Gal A activities increased since the  AAV administration and reached its plateau on about 14 days after dosing. In the high dose group, at 14 days after dosing, the α-Gal A activities increased 38434.3, 203.5, 303784.6, 183069.0, 106195.3 and 176325.0 times for AAV5-P14-M7, AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7, AAV9-P14-M7, AAV5-P18-M7 and AAV6-P18-M7, respectively, which were 9709.7, 51.4, 76745.6, 46249.0, 26828.3 and 46401.3 folds higher than that of the WT.

[0173] Table 24. The plasma α-Gal A activities in mice receiving AAV5-P14-M7, AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7, AAV9-P14-M7, AAV5-P18-M7 or AAV6-P18-M7.

[0174] 16 weeks after the rAAV administration, the α-Gal A activities in the heart, liver and kidney were evaluated. Results are shown in Figure 21 and Table 25.

[0175] Significant elevation of the α-Gal A activities in the peripheral tissues was observed. In the high dose group, at 16 weeks after dosing, the α-Gal A activities in heart reached 1.1, 1.1, 23.1, 44.0, 30.1 and 15.4 times of that of the WT for GLA- / Y mice receiving AAV5-P14-M7, AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7, AAV9-P14-M7, AAV5-P18-M7 and AAV6-P18-M7, respectively. The α-Gal A activities in the liver reached 107.7, 1.0, 230.5, 110.3, 258.2 and 657.7 times of that of the WT. The α-Gal A activities in the kidney reached 18.8, 1.0, 70.1, 22.1, 21.3 and 20.1 times of that of the WT.

[0176] Table 25. The α-Gal A activity in the heart, liver, and kidney of mice receiving AAV5-P14-M7, AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7, AAV9-P14-M7, AAV5-P18-M7 or AAV6-P18-M7 at 16 weeks after rAAV administrations.

[0177] Also assessed was Lyso-Gb3 concentrations in the plasma, heart, liver and kidney by LC-MS.Results are shown in Figures 22A, 22B, 23 and Tables 26-27.

[0178] 16 weeks after administration of the medium dose of AAV5-P14-M7, AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7, AAV9-P14-M7, AAV5-P18-M7 or AAV6-P18-M7, the plasma lyso-Gb3 decreased 98.5%, 55.5%, 98.6%, 96.8%, 98.2%and 89.0%, respectively, as compared to the level before dosing. The heart lyso-Gb3 decreased 98.9%, 59.2%, 99.3%, 98.9%, 99.4%and 92.3%, respectively. The liver lyso-Gb3 decreased 99.4%, 82.0%, 99.6%, 99.5%, 99.6%and 97.9%, respectively. The kidney lyso-Gb3 decreased 98.0%, 65.7%, 99.2%, 97.3%, 98.5%and 92.4%, respectively. The above results demonstrated the dramatic therapeutic effects at 16 weeks after the rAAV administrations.

[0179] Table 26. The plasma lyso-Gb3 concentrations of mice receiving AAV5-P14-M7, AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7, AAV9-P14-M7, AAV5-P18-M7 or AAV6-P18-M7.

[0180] Table 27. The lyso-Gb3 concentrations in heart, liver and kidney of mice receiving AAV5-P14-M7, AAV6-P14-M7, AAV8-P14-M7, AAV9-P14-M7, AAV5-P18-M7 or AAV6-P18-M7 at 16 weeks after the rAAV administrations.

[0181] Example 6. In vivo long-term efficacy study

[0182] AAV5-P14-M7, AAV5-P18-M7, AAV8-P14-M7 and AAV8-P18-M7 were intravenously injected into the 15-week-old GLA- / Y mice (n = 3) . AAV5-P14-M7 and AAV5-P18-M7 were dosed at the concentration of 1 × 1013 vg / kg. AAV8-P14-M7 and AAV8-P18-M7  were dosed at the concentration of 1 × 1012 vg / kg. The GLA- / Y mice receiving PBS and WT mice were used as controls.

[0183] The plasma α-Gal A activities and lyso-Gb3 concentrations were tracked as long as 52 weeks after dosing. The results are shown in Figure 24 and Tables 28, 29. The plasma α-Gal A activities increased soon after the AAV administration and maintained as a high-level plateau to more than 52 weeks. At 52 weeks after dosing, the α-Gal A activities kept at high levels of 125.8, 2514.6, 591.6 and 2299.7 times of that of the WT for AAV5-P14-M7, AAV5-P18-M7, AAV8-P14-M7 and AAV8-P18-M7, respectively. At 52 weeks after dosing, nearly complete elimination of plasma lyso-Gb3 was sustained in all four groups receiving rAAV treatment.

[0184] The above results suggested a long-term therapeutic elevation of α-Gal A activity and lyso-Gb3 elimination.

[0185] Table 28. The average plasma α-Gal A activities in mice receiving 1 × 1013 vg / kg AAV5-P14-M7, 1 × 1013 vg / kg AAV5-P18-M7, 1 × 1012 vg / kg AAV8-P14-M7 or 1 × 1012 vg / kg AAV8-P18-M7.

[0186] Table 29. The average plasma lyso-Gb3 concentrations in mice receiving 1 × 1013 vg / kg AAV5-P14-M7, 1 × 1013 vg / kg AAV5-P18-M7, 1 × 1012 vg / kg AAV8-P14-M7 or 1 × 1012 vg / kg AAV8-P18-M7.

[0187] (UD, Undetected. Lower Limit of Quantification (LLOQ) = 0.1 ng / mL)

[0188] Sequence information

[0189] SEQ ID NO: 1, wild-type GLA amino acid sequence

[0190] SEQ ID NOs: 2-9, 11-16 are listed above.

[0191] SEQ ID NO: 10, 5’ ITR

[0192] SEQ ID NO: 17, 3’ ITR

[0193] SEQ ID NO: 18, amino acid sequence of M1 (with the single amino acid substitution underlined)

[0194] SEQ ID NO: 19, amino acid sequence of M2

[0195] SEQ ID NO: 20, amino acid sequence of M3

[0196] SEQ ID NO: 21, amino acid sequence of M4

[0197] SEQ ID NO: 22, amino acid sequence of M5

[0198] SEQ ID NO: 23, amino acid sequence of M6

[0199] SEQ ID NO: 24, amino acid sequence of M7

[0200] SEQ ID NO: 25, amino acid sequence of M8

[0201] SEQ ID NO: 26, amino acid sequence of M9

[0202] SEQ ID NO: 27, amino acid sequence of M10

[0203] SEQ ID NO: 28, amino acid sequence of M11

[0204] SEQ ID NO: 29, amino acid sequence of M12

[0205] SEQ ID NO: 30, amino acid sequence of M13

[0206] SEQ ID NO: 31, nucleotide sequence of M1

[0207] SEQ ID NO: 32, nucleotide sequence of M2

[0208] SEQ ID NO: 33, nucleotide sequence of M3

[0209] SEQ ID NO: 34, nucleotide sequence of M4

[0210] SEQ ID NO: 35, nucleotide sequence of M5

[0211] SEQ ID NO: 36, nucleotide sequence of M6

[0212] SEQ ID NO: 37, nucleotide sequence of M7

[0213] SEQ ID NO: 38, nucleotide sequence of M8

[0214] SEQ ID NO: 39, nucleotide sequence of M9

[0215] SEQ ID NO: 40, nucleotide sequence of M10

[0216] SEQ ID NO: 41, nucleotide sequence of M11

[0217] SEQ ID NO: 42, nucleotide sequence of M12

[0218] SEQ ID NO: 43, nucleotide sequence of M13

[0219] SEQ ID NO: 44, CRE I

[0220] SEQ ID NO: 45, Modified 5’ UTR

[0221] SEQ ID NO: 46, nucleotide sequence of Luciferase

[0222] SEQ ID NO: 47, CRE D

[0223] SEQ ID NO: 48, CRE G

[0224] SEQ ID NO: 49, hs1750-5

[0225] SEQ ID NO: 50, hs1750-3

[0226] SEQ ID NO: 51, hs1751-5

[0227] SEQ ID NO: 52, hs1751-3

[0228] SEQ ID NO: 53, hs1760

[0229] SEQ ID NO: 54, hs1958-5

[0230] SEQ ID NO: 55, hs1959

[0231] SEQ ID NO: 56, hs1971-3

[0232] SEQ ID NO: 57, cTNT

[0233] SEQ ID NO: 58, P10-M7

[0234] SEQ ID NO: 59, P14-M7

[0235] SEQ ID NO: 60, P16-M7

[0236] SEQ ID NO: 61, P18-M7

[0237] SEQ ID NO: 62, P21-M7

[0238] References

[0239] 1. Rombach SM, Smid BE, Bouwman MG, Linthorst GE, Dijkgraaf MG, Hollak CE. Long term enzyme replacement therapy for fabry disease: Effectiveness on kidney, heart and brain. Orphanet journal of rare diseases. 2013; 8: 47.

[0240] 2. Chuah MK, Petrus I, De Bleser P, Le Guiner C, Gernoux G, Adjali O et al. Liver-specific transcriptional modules identified by genome-wide in silico analysis enable efficient gene therapy in mice and non-human primates. Molecular Therapy. 2014; 22: 1605-1613.

[0241] 3. Bertolini TB, Shirley JL, Zolotukhin I, Li X, Kaisho T, Xiao W et al. Effect of cpg depletion of vector genome on cd8+ t cell responses in aav gene therapy. Frontiers in Immunology. 2021; 12.

[0242] 4. Konkle BA, Walsh CE, Escobar MA, Josephson NC, Young G, Von Drygalski A et al. Bax 335 hemophilia b gene therapy clinical trial results: Potential impact of cpg sequences  on gene expression. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 2021; 137: 763-774.

[0243] 5. Gary-Bobo M, Nirdé P, Jeanjean A, Morère A, Garcia M. Mannose 6-phosphate receptor targeting and its applications in human diseases. Current medicinal chemistry. 2007; 14: 2945-2953.

[0244] 6. Yamashita T, Hashimoto S-I, Kaneko S, Nagai S, Toyoda N, Suzuki T et al. Comprehensive gene expression profile of a normal human liver. Biochemical and biophysical research communications. 2000; 269: 110-116.

[0245] 7. May D, Blow MJ, Kaplan T, Mcculley DJ, Jensen BC, Akiyama JA et al. Large-scale discovery of enhancers from human heart tissue.Nature genetics.2012;44:89-93.

Claims

1.A nucleotide sequence encoding for the human α-Gal A polypeptide, wherein the amino acid sequence of the α-Gal A polypeptide is as shown in SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence is any one of the nucleotide sequences as shown in SEQ ID NOs: 3-9.2.The nucleotide sequence of claim 1, which is the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 5.3.A polypeptide variant of the human α-Gal A polypeptide, wherein the polypeptide variant has an enzyme activity of lysosomal α-galactosidase A, with an increased numbers of N-linked glycosylation sites as compared to the wild-type human α-Gal A polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1.4.The polypeptide variant of claim 3, which has an amino acid sequence comprising at least one amino acid substitution selected from a group consisting of G274S, G274T, Q280S, Q280T, Q357S, Q357T, Q422N, Q280N, E398N, E418N, D233N, D244N, and R100N as compared to the wild-type human α-Gal A polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1.5.The polypeptide variant of claim 4, which comprises at least one amino acid substitution selected from a group consisting of Q422N, E418N, D233N, E398N, and D244N as compared to the wild-type human α-Gal A polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1.6.The polypeptide variant of any one of claims 3-5, which has an increased enzyme activity of lysosomal α-galactosidase A as compared to the wild-type human α-Gal A polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1.7.The polypeptide variant of any one of claims 3-6, which comprises or consists of the amino acid sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 18-30.8.The polypeptide variant of claim 7, which comprises or consists of the amino acid sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 24, and 26-29.9.The polypeptide variant of claim 8, which comprises or consists of the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24.10.A nucleotide sequence encoding for the polypeptide variant of any one of claims 3-9.11.The nucleotide sequence of claim 10, which is codon-optimized for the α-Gal A protein expression in human cells.12.The nucleotide sequence of claim 10 or 11, which is based on the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 5 that encodes for the wild-type human α-Gal A, with the codon of  the amino acid residue that differs in the variant as compared to the wild-type human α-Gal A being substituted.13.The nucleotide sequence of any one of claims 10-12, which comprises or consists of a nucleotide sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 31-43.14.The nucleotide sequence of claim 13, which comprises or consists of a nucleotide sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 37 and 39-42.15.The nucleotide sequence of claim 14, which comprises or consists of a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NOs: 37.16.A chimeric promoter, comprising from 5’ to 3’ a cis-regulatory element, a 3 × HS-CRM, a TTR enhancer, and a TTR promoter, wherein the cis-regulatory element is derived from a gene having high expression in the liver.17.The chimeric promoter of claim 16, wherein the TTR enhancer has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.18.The chimeric promoter of claim 16 or claim 17, wherein the TTR promoter has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13.19.The chimeric promoter of any one of claims 16-18, wherein the 3 × HS-CRM sequence has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11.20.The chimeric promoter of any one of claims 16-19, the cis-regulatory element has a nucleotide sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 44, and 47-56.21.The chimeric promoter of any one of claims 16-20, the chimeric promoter is selected from P4, P7, P10, P14, P15, P16, P17, P18, P19, P20 or P21 promoter.22.The chimeric promoter of claim 21, the chimeric promoter is P10, P14, P16, P18 or P21 promoter.23.The chimeric promoter of claim 22, which is used in a recombinant AAV vector.24.An expression cassette, comprising the nucleotide sequence of any one of claims 1-2 and 10-15.25.The expression cassette of claim 24, wherein the nucleotide sequence of any one of claims 1-2 and 10-15 is operatively linked to the chimeric promoter of any one of claims 16-23.26.An expression cassette, comprising the chimeric promoter of any one of claims 16-23, which is operatively linked to a gene-of-interest.27.The expression cassette of claim 26, wherein the gene-of-interest is a nucleotide sequence encoding for the human α-Gal A polypeptide or variant thereof with enzyme activity of the lysosomal α-galactosidase A.28.The expression cassette of any one of claims 24-27, which is used for expression via rAAV  vectors.29.The expression cassette of claim 28, further comprising a SV40 polyA.30.The expression cassette of claim 29, wherein the SV40 polyA has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.31.A recombinant AAV (rAAV) vector, comprising the nucleotide sequence of any one of claims 1-2 and 10-15, the chimeric promoter of any one of claims 16-23, or the expression cassette of any one of claims 24-30.32.The rAAV vector of claim 31, which is single-stranded AAV (ssAAV) vector or self-complementary AAV (scAAV) vector.33.The rAAV vector of claim 31 or 32, further comprising a 5’ ITR and a 3’ ITR.34.The rAAV vector of claim 33, wherein the 5’ ITR has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, and / or the 3’ ITR has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17.35.The rAAV vector of claim 33, wherein the 5’ ITR has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63, and / or the 3’ ITR has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 64.36.An AAV viral particle comprising the rAAV vector of any one of claims 31-35 packaged into an AAV capsid.37.The AAV viral particle of claim 36, wherein the AAV capsid is an AAV capsid derived from AAV serotype selected from AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVLK03, AAVS3, AAVKP1, AAVrh10, AAVNP40, AAVNP59, AAV-DJ, AAVAnc80L65, AAVsL65, AAVHSC15, AAVC102, AAV204, AAV214, AAV PHP. B, AAV2.7m8, or a variant thereof, or a chimeric AAV capsid having capsid proteins with amino acid fragments, regions, or domains derived from two or more of the aforesaid AAVs.38.The AAV viral particle of claim 36 or 37, wherein the AAV capsid is a capsid with liver tropism.39.The AAV viral particle of claim 38, wherein the AAV capsid is a capsid of AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, a variant thereof, or a chimeric AAV capsid having capsid proteins with amino acid fragments, regions, or domains derived from two or more of the aforesaid AAVs.40.A pharmaceutical composition comprising the rAAV vectors of any one of claims 31-35 or the viral particle of any one of claims 36-39, and a pharmaceutically acceptable excipient.41.A method for treating a lysosomal storage disease in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the rAAV vectors of any one of claims 31-35, the viral particle of any one of claims 36-39, or the pharmaceutical composition of claim 40.42.The method of claim 41, wherein the lysosomal storage disease is Fabry disease.43.Use of the rAAV vector of the rAAV vectors of any one of claims 31-35, the viral particle of any one of claims 36-39, or the pharmaceutical composition of claim 40 in treating a lysosomal storage disease.44.The use of claim 43, wherein the lysosomal storage disease is Fabry disease.45.Use of the rAAV vector of the rAAV vectors of any one of claims 31-35, or the viral particle of any one of claims 36-39 in the manufacture of a medicament in treating a lysosomal storage disease.46.The use of claim 45, wherein the lysosomal storage disease is Fabry disease.

Images