Multispecific antibodies and uses thereof

Abstract

Disclosed are multispecific antibodies that include an antibody or antigen binding fragment targeting CD3, an antibody or antigen binding fragment targeting 4-1BB, and another antibody or antigen binding fragment having specificity to a tumor associated antigen such as WT1, presented by HLA-A2, which is expressed on various tumor cancers. Such multispecific antibodies have enhanced efficacy and reduced toxicity, and thus are particularly useful for treating diseases such as cancer.

Description

MULTISPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOFBACKGROUND

[0001] T cell engagers are multifunctional molecules capable of recruiting a patient’s own T cells to malignant cells, resulting in cytotoxic activity directed to the malignant cells. A common design of a T cell engager includes an anti-CD3 antibody and another antibody specific to a tumor-associated antigen (TAA) . Current T cell engagers have limited T cell-mediated response, especially in poorly immunogenic tumor. Further, it is known that T cell agonist antibodies, e.g., CD3 antibodies, may cause severe side effects such as cytokine release syndrome (CRS) . Development of a suitable T cell engager, therefore, requires to overcome the multiple challenges in sufficient tumor targeting, minimized systemic activation, and in vitro and in vivo stability.

[0002] Wilms’ tumor gene 1 (WT1) was first identified as an oncogene involved in the development of Wilms’ tumor. The oncogenic properties of WT1 have been demonstrated in various hematological malignancies and solid tumors. On the other hand, WT1 is rarely expression in normal adult tissues. WT1-positive tumors include tumors of the stomach, prostate, and biliary and urinary systems, and malignant melanomas. Among them, glioblastomas, some of soft tissue sarcomas, osteosarcomas, and malignant melanomas of the skin showed extremely strong cytoplasmic staining as compared with other tumors. WT1 is an intracellular protein which is located in the nucleus or cytoplasm. Intracellular proteins can be degraded by the proteasome, processed and presented on the cell surface as major histocompatibility complex (MHC) Ⅰ epitopes and recognized by T cell receptors (TCR) . For WT1, the peptides RMFPNAPYL (WT1RMF) and VLDFAPPGA (WT1VLD) can be presented by HLA-A2 on the cell surface to trigger T-cell recognition.

[0003] WT1 is now regarded as a molecular target of immunotherapy for various malignant tumors by three classes of immunotherapy, i.e., vaccines, cell therapies and T cell engagers. Galinpepimut-Sis a vaccine containing Wilm’s tumor (WT1) heteroclitic peptides, as an immunotherapeutic to trigger an immune response by stimulating CD8+ and CD4+ T-cells, for the potential treatment of first-remission acute myeloid leukemia (AML) , metastatic AML, malignant pleural mesothelioma (MPM) , multiple myeloma (MM) , chronic myelocytic leukemia (CML) , acute leukemia (AL) and also other advanced tumors, including ovarian cancer, colorectal cancer, small-cell lung cancer and triple-negative breast cancer. In the report  from a trial in mesothelioma patients, the study showed greater median overall survival (OS) in patients receiving the WT1 cancer vaccine of 39 months, compared with 18 months for patients in the control arm. In addition, a WT1 cancer vaccine resulted in a median PFS of 11.5 months, compared with 5.5 months for control. Data also demonstrated that the drug exhibited very good safety profile with no grade 3 / 4 toxicities or dose limiting toxicities. For T cell therapy, NexImmune reported results of NEXI-001 in Phase 1 clinical trial. Patients treated with NEXI-001 experienced rapid reconstitution of both CD8+ and CD4+ T-cell subtypes after lymphodepletion chemotherapy. Through all dose levels to date, NEXI-001 maintains a favorable tolerability profile with no grade 3 or greater treatment related SAEs. Two patients experienced grade 2 CRS which resolved within 24 hours with tocilizumab therapy. No cases of ICANS have occurred. All these data suggest that WT1 is a promising target for immunotherapy.SUMMARY

[0004] The present disclosure provides a multi-specific antibody, comprising: (a) an anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3, wherein the VH CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, the VH CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, 27, 28, or 29, the VH CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:23, the VL CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, the VL CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and the VL CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, (b) an anti-4-1BB antibody or antigen-binding fragment thereof, and (c) an anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof.

[0005] In some embodiments, the VH and VL of the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof comprise, respectively, the amino acid sequences of (1) SEQ ID NO: 19 and 20, (2) SEQ ID NO: 30 and 20, (3) SEQ ID NO: 31 and 20, (4) SEQ ID NO: 32 and 33, or (5) SEQ ID NO: 34 and 33. In some embodiments, the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof is a single chain fragment (scFv) .

[0006] In some embodiments, the anti-4-1BB antibody is a single domain antibody (sdAb) . In some embodiments, the sdAb comprises a CDR1, CDR2 and CDR3 which, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 35, 36 and 37. In some embodiments, the  sdAb comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38. In some embodiments, the sdAb is fused to the C-terminus of an Fc fragment in the multi-specific antibody.

[0007] In some embodiments, the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof is fused to the N-terminus of a chain of the Fc fragment.

[0008] In some embodiments, the anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof is fused to the N-terminus of a second chain of the Fc fragment.

[0009] In some embodiments, the multi-specific antibody comprises a second one of the anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof that is fused to the N-terminus of the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof.

[0010] In some embodiments, the anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3, wherein the VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3 comprise, respectively, the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13-18. In some embodiments, the VH and VL of the anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof comprise, respectively, the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and 2.

[0011] Also provided, in one embodiment, is a multi-specific antibody, comprising (a) an anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3, wherein the VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3 comprise, respectively, the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13-18; (b) an anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof; and (c) an anti-4-1BB antibody or antigen-binding fragment thereof.

[0012] In some embodiments, the VH and VL of the anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof comprise, respectively, the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and 2.

[0013] In some embodiments, the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a VH CDR1, VH CDR1 and VH CDR3, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3, wherein the VH CDR1, VH CDR1, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3 comprise, respectively, the amino acid sequences  of (1) SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25 and 26; (2) SEQ ID NO: 21, 27, 23, 24, 25 and 26; (3) SEQ ID NO: 21, 28, 23, 24, 25 and 26; or (4) SEQ ID NO: 21, 29, 23, 24, 25 and 26.

[0014] In some embodiments, the VH and VL of the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof comprise, respectively, the amino acid sequences of (1) SEQ ID NO: 19 and 20, (2) SEQ ID NO: 30 and 20, (3) SEQ ID NO: 31 and 20, (4) SEQ ID NO: 32 and 33, or (5) SEQ ID NO: 34 and 33.

[0015] In some embodiments, the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof is a single chain fragment (scFv) .

[0016] In some embodiments, the anti-4-1BB antibody is a single domain antibody (sdAb) . In some embodiments, the sdAb comprises a CDR1, CDR2 and CDR3 which, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 35, 36 and 37. In some embodiments, the sdAb comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38.

[0017] In some embodiments, the sdAb is fused to the C-terminus of an Fc fragment in the multi-specific antibody. In some embodiments, the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof is fused to the N-terminus of a chain of the Fc fragment. In some embodiments, the anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof is fused to the N-terminus of a second chain of the Fc fragment.

[0018] In some embodiments, the multi-specific antibody comprises a second one of the anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof that is fused to the N-terminus of the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof.

[0019] Also provided are pharmaceutical compositions comprising the multi-specific antibody and a pharmaceutically acceptable carrier, one or more polynucleotide (s) encoding the multi-specific antibody, a vector comprising the one or more polynucleotide (s) , a host cell comprising the one or more polynucleotide (s) or the vector.

[0020] Yet another embodiment provides a method of treating a disease or condition in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of the multi-specific antibody, the pharmaceutical composition, the one or more polynucleotide (s) , the vector, or the host cell. Yet another embodiment provides use of the multi-specific antibody  of, the pharmaceutical composition, the one or more polynucleotide (s) , the vector, or the host cell for the preparation of a medicament for treating a disease or condition.

[0021] In some embodiments, the disease or condition is cancer. In some embodiments, the cancer is selected from the group consisting of ovarian cancer, prostate cancer, cancer of the urinary tract, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, leukemia, liver cancer, lymphoma, melanoma, and thyroid cancer.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0022] FIG. 1 demonstrates that the WT1-09 exhibits higher affinity in comparison to RG-6007.

[0023] FIG. 2 demonstrates that the WT1-09 have no binding to off-target peptides.

[0024] FIG. 3 shows that the on-target binding (A-B) and off-target binding (C-E) of WT1-09 and RG-6007. HLA-A02 phenotype and WT1 mRNA level of different cell lines exhibited in (F) . WT1-09 exhibits HLA-A02 dependent affinity to WT1.

[0025] FIG. 4 demonstrates the 1+1 and 2+1 format of WT1-CD3-4-1BB trispecific antibody.

[0026] FIG. 5 shows that WT1-09 have lower affinity to CD34+ hemopoietic stem cell than RG-6007 (A) . WT1-TOPA can’ t induce HSC-dependent tumor cell lysis (B) .

[0027] FIG. 6 shows that WT1-TOPA can induce cell lysis in different tumor cell lines.

[0028] FIG. 7 shows that WT1-TOPA can induce PBMC release IL-2 and IFN-γ when incubated with SW620 tumor cell lines.

[0029] FIG. 8 shows that the CD3-NFAT (A) and 41BB-NFκB (B) of WT1-TOPA with different CD3 or 41BB sequences.

[0030] FIG. 9 shows that cell lysis activity of WT1-TOPA with different CD3 sequences.

[0031] FIG. 10 shows that WT1-TOPA demonstrated less IL-6 secretion than RG-6007 when treatment with PBMC only.

[0032] FIG. 11 shows that WT1-TOPA exhibits superior long-last killing potency than RG-6007.

[0033] FIG. 12 shows that the treatment of WT1-TOPA causes less CD4 (A) or CD8 (B) T cell exhaustion than RG-6007.

[0034] FIG. 13 shows that WT1-TOPA molecules led to a significant reduction in tumor size compared to RG-6007 (A) . RG-6007 treatment induces activation induced cell death of both CD4 and CD8 T cells, which promotes tumor growth (B-C) .DETAILED DESCRIPTION

[0035] Definitions

[0036] It is to be noted that the term “a” or “an” entity refers to one or more of that entity; for example, “an antibody, ” is understood to represent one or more antibodies. As such, the terms “a” (or “an” ) , “one or more, ” and “at least one” can be used interchangeably herein.

[0037] As used herein, an “antibody” or “antigen-binding moiety” refers to a polypeptide or a polypeptide complex that specifically recognizes and binds to an antigen. An antibody can be a whole antibody and any antigen binding fragment or a single chain thereof. Thus the term “antibody” includes any protein or peptide containing molecule that comprises at least a portion of an immunoglobulin molecule having biological activity of binding to the antigen. Examples of such include, but are not limited to a complementarity determining region (CDR) of a heavy or light chain or a ligand binding portion thereof, a heavy chain or light chain variable region, a heavy chain or light chain constant region, a framework (FR) region, or any portion thereof, or at least one portion of a binding protein.

[0038] A full-length antibody comprises two heavy chains and two light chains. The variable regions of the light and heavy chains are responsible for antigen binding. The variable domains of the heavy chain and light chain may be referred to as “VH” and “VL” , respectively. The variable regions in both chains generally contain three highly variable loops called the complementarity determining regions (CDRs) (light chain (LC) CDRs including LC-CDR1, LC-CDR2, and LC-CDR3, heavy chain (HC) CDRs including HC-CDR1, HC-CDR2, and HC-CDR3) . CDR boundaries for the antibodies and antigen-binding fragments disclosed herein may be defined or identified by the conventions of Kabat, Chothia, or Al-Lazikani (Al-Lazikani 1997; Chothia 1985; Chothia 1987; Chothia 1989; Kabat 1987; Kabat 1991) . The three CDRs  of the heavy or light chains are interposed between flanking stretches known as framework regions (FRs) , which are more highly conserved than the CDRs and form a scaffold to support the hypervariable loops. The constant regions of the heavy and light chains are not involved in antigen binding, but exhibit various effector functions. Antibodies are assigned to classes based on the amino acid sequence of the constant region of their heavy chain. The five major classes or isotypes of antibodies are IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, which are characterized by the presence of α, δ, ε, γ, and μ heavy chains, respectively. Several of the major antibody classes are divided into subclasses such as lgG1 (γ1 heavy chain) , lgG2 (γ2 heavy chain) , lgG3 (γ3 heavy chain) , lgG4 (γ4 heavy chain) , lgA1 (α1 heavy chain) , or lgA2 (α2 heavy chain) .

[0039] The term “half antibody” as used herein refers to one immunoglobulin heavy chain associated with one immunoglobulin light chain. One skilled in the art will readily appreciate that a half-antibody may encompass a fragment thereof and may also have an antigen binding domain consisting of a single variable domain, e.g., originating from a camelidae.

[0040] The term “single chain half antibody” as used herein refers to a single chain polypeptide comprising a VL domain, optionally a CL domain, a tether, a VH domain, optionally a CH1 domain, a hinge domain, a CH2 domain and a CH3 domain, wherein said domains are positioned relative to each other in an N-terminal to C-terminal direction as follows: VL-tether-VH-hinge-CH2-CH3, VL-tether-VH-partial hinge-CH2-CH3, VL-tether-VH-hinge variant -CH2-CH3, or VL-CL-tether-VH-CH1-hinge-CH2-CH3.

[0041] The expression “single domain antibodies” (sdAbs) or “single variable domain (SVD) antibodies” generally refers to antibodies in which a single variable domain (VH or VL) can confer antigen binding. In other words, the single variable domain does not need to interact with another variable domain in order to recognize the target antigen. Examples of single domain antibodies include those derived from camelids (lamas and camels) and cartilaginous fish (e.g., nurse sharks) and those derived from recombinant methods from humans and mouse antibodies (Nature (1989) 341: 544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30: 43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26: 230-235; Trends Biotechnol (2003) : 21: 484-490; WO 2005 / 035572; WO 03 / 035694; Febs Lett (1994) 339: 285-290; WO00 / 29004; WO 02 / 051870) . When the sdAb contains only a heavy chain, it can be exchangably used with “VHH” or “single heavy chain variable domain antibody” or “nanobody” .

[0042] The terms “antibody fragment” or “antigen-binding fragment” , as used herein, is a portion of an antibody such as F (ab’ ) 2, F (ab) 2, Fab’ , Fab, Fv, scFv and the like. Regardless of structure, an antibody fragment binds with the same antigen that is recognized by the intact antibody. The term “antibody fragment” includes aptamers, spiegelmers, and diabodies. The term “antibody fragment” also includes any synthetic or genetically engineered protein that acts like an antibody by binding to a specific antigen to form a complex.

[0043] A “Fab” with regard to an antibody refers to a monovalent antigen-binding fragment of the antibody consisting of a single light chain (both variable and constant regions) bound to the variable region and first constant region of a single heavy chain by a disulfide bond. Fab can be obtained by papain digestion of an antibody at the residues proximal to the N-terminus of the disulfide bond between the heavy chains of the hinge region.

[0044] A “Fab’ ” refers to a Fab fragment that includes a portion of the hinge region, which can be obtained by pepsin digestion of an antibody at the residues proximal to the C-terminus of the disulfide bond between the heavy chains of the hinge region and thus is different from Fab in a small number of residues (including one or more cysteines) in the hinge region.

[0045] A “F (ab) 2” refers to a dimer of Fab’ that comprises two light chains and part of the two heavy chains.

[0046] A “single-chain variable fragment” or “scFv” refers to a fusion protein of the variable regions of the heavy (VH) and light chains (VL) of immunoglobulins. In some aspects, the regions are connected with a short linker peptide of ten to about 25 amino acids. The linker can be rich in glycine for flexibility, as well as serine or threonine for solubility, and can either connect the N-terminus of the VH with the C-terminus of the VL, or vice versa. This protein retains the specificity of the original immunoglobulin, despite removal of the constant regions and the introduction of the linker. ScFv molecules are known in the art and are described, e.g., in US patent 5,892,019.

[0047] The term antibody encompasses various broad classes of polypeptides that can be distinguished biochemically. Those skilled in the art will appreciate that heavy chains are classified as gamma, mu, alpha, delta, or epsilon (γ, μ, α, δ, ε) with some subclasses among them (e.g., γ l-γ4) . It is the nature of this chain that determines the “class” of the antibody as IgG, IgM, IgA IgG, or IgE, respectively. The immunoglobulin subclasses (isotypes) e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, etc. are well characterized and are known to confer functional  specialization. Modified versions of each of these classes and isotypes are readily discernable to the skilled artisan in view of the instant disclosure and, accordingly, are within the scope of the instant disclosure. All immunoglobulin classes are clearly within the scope of the present disclosure, the following discussion will generally be directed to the IgG class of immunoglobulin molecules. With regard to IgG, a standard immunoglobulin molecule comprises two identical light chain polypeptides of molecular weight approximately 23, 000 Daltons, and two identical heavy chain polypeptides of molecular weight 53, 000-70, 000. The four chains are typically joined by disulfide bonds in a “Y” configuration wherein the light chains bracket the heavy chains starting at the mouth of the “Y” and continuing through the variable region.

[0048] Antibodies, antigen-binding moieties, variants, or derivatives thereof of the disclosure include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, multispecific, human, humanized, primatized, or chimeric antibodies, single chain antibodies, epitope-binding fragments, e.g., Fab, Fab’ and F (ab’ ) 2, Fd, Fvs, single-chain Fvs (scFv) , single-chain antibodies, disulfide-linked Fvs (sdFv) , fragments comprising either a VK or VH domain, fragments produced by a Fab expression library, and anti-idiotypic (anti-Id) antibodies (including, e.g., anti-Id antibodies to LIGHT antibodies disclosed herein) . Immunoglobulin or antibody molecules of the disclosure can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class (e.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2) or subclass of immunoglobulin molecule.

[0049] Light chains are classified as either kappa or lambda (K, λ) . Each heavy chain class may be bound with either a kappa or lambda light chain. In general, the light and heavy chains are covalently bonded to each other, and the “tail” portions of the two heavy chains are bonded to each other by covalent disulfide linkages or non-covalent linkages when the immunoglobulins are generated either by hybridomas, B cells or genetically engineered host cells. In the heavy chain, the amino acid sequences run from an N-terminus at the forked ends of the Y configuration to the C-terminus at the bottom of each chain.

[0050] Both the light and heavy chains are divided into regions of structural and functional homology. The terms “constant” and “variable” are used functionally. In this regard, it will be appreciated that the variable domains of both the light (VK) and heavy (VH) chain portions determine antigen recognition and specificity. Conversely, the constant domains of the light chain (CK) and the heavy chain (CH1, CH2 or CH3) confer important biological properties such as secretion, transplacental mobility, Fc receptor binding, complement binding, and the  like. By convention the numbering of the constant region domains increases as they become more distal from the antigen-binding site or amino-terminus of the antibody. The N-terminal portion is a variable region and at the C-terminal portion is a constant region; the CH3 and CK domains actually comprise the carboxy-terminus of the heavy and light chain, respectively.

[0051] As indicated above, the variable region allows the antibody to selectively recognize and specifically bind epitopes on antigens. That is, the VK domain and VH domain, or subset of the complementarity determining regions (CDRs) , of an antibody combine to form the variable region that defines a three dimensional antigen-binding site. This quaternary antibody structure forms the antigen-binding site present at the end of each arm of the Y. More specifically, the antigen-binding site is defined by three CDRs on each of the VH and VK chains (i.e. CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3) . In some instances, e.g., certain immunoglobulin molecules derived from camelid species or engineered based on camelid immunoglobulins, a complete immunoglobulin molecule may consist of heavy chains only, with no light chains. See, e.g., Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993) .

[0052] In naturally occurring antibodies, the six “complementarity determining regions” or “CDRs” present in each antigen-binding domain are short, non-contiguous sequences of amino acids that are specifically positioned to form the antigen-binding domain as the antibody assumes its three-dimensional configuration in an aqueous environment. The remainder of the amino acids in the antigen-binding domains, referred to as “framework” regions, show less inter-molecular variability. The framework regions largely adopt a β-sheet conformation and the CDRs form loops which connect, and in some cases form part of, the β -sheet structure. Thus, framework regions act to form a scaffold that provides for positioning the CDRs in correct orientation by inter-chain, non-covalent interactions. The antigen-binding domain formed by the positioned CDRs defines a surface complementary to the epitope on the immunoreactive antigen. This complementary surface promotes the non-covalent binding of the antibody to its cognate epitope. The amino acids comprising the CDRs and the framework regions, respectively, can be readily identified for any given heavy or light chain variable region by one of ordinary skill in the art, since they have been precisely defined (see “Sequences of Proteins of Immunological Interest, ” Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983) ; and Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196: 901-917 (1987) ) .

[0053] In the case where there are two or more definitions of a term which is used and / or accepted within the art, the definition of the term as used herein is intended to include all such meanings unless explicitly stated to the contrary. A specific example is the use of the term “complementarity determining region” ( “CDR” ) to describe the non-contiguous antigen combining sites found within the variable region of both heavy and light chain polypeptides. This particular region has been described by Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) and by Chothia et al., J. MoI. Biol. 196: 901-917 (1987) , which are incorporated herein by reference in their entireties. The CDR definitions according to Kabat and Chothia include overlapping or subsets of amino acid residues when compared against each other. Nevertheless, application of either definition to refer to a CDR of an antibody or variants thereof is intended to be within the scope of the term as defined and used herein. The appropriate amino acid residues which encompass the CDRs as defined by each of the above cited references are set forth in the table below as a comparison. The exact residue numbers which encompass a particular CDR will vary depending on the sequence and size of the CDR. Those skilled in the art can routinely determine which residues comprise a particular CDR given the variable region amino acid sequence of the antibody.

[0054] Kabat et al. also defined a numbering system for variable domain sequences that is applicable to any antibody. One of ordinary skill in the art can unambiguously assign this system of “Kabat numbering” to any variable domain sequence, without reliance on any experimental data beyond the sequence itself. As used herein, “Kabat numbering” refers to the numbering system set forth by Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983) .

[0055] In addition to table above, the Kabat number system describes the CDR regions as follows: CDR-H1 begins at approximately amino acid 31 (i.e., approximately 9 residues after  the first cysteine residue) , includes approximately 5-7 amino acids, and ends at the next tryptophan residue. CDR-H2 begins at the fifteenth residue after the end of CDR-H1, includes approximately 16-19 amino acids, and ends at the next arginine or lysine residue. CDR-H3 begins at approximately the thirty third amino acid residue after the end of CDR-H2; includes 3-25 amino acids; and ends at the sequence W-G-X-G, where X is any amino acid. CDR-L1 begins at approximately residue 24 (i.e., following a cysteine residue) ; includes approximately 10-17 residues; and ends at the next tryptophan residue. CDR-L2 begins at approximately the sixteenth residue after the end of CDR-L1 and includes approximately 7 residues. CDR-L3 begins at approximately the thirty third residue after the end of CDR-L2 (i.e., following a cysteine residue) ; includes approximately 7-11 residues and ends at the sequence F or W-G-X-G, where X is any amino acid.

[0056] Antibodies disclosed herein may be from any animal origin including birds and mammals. Preferably, the antibodies are human, murine, donkey, rabbit, goat, guinea pig, camel, llama, horse, or chicken antibodies. In another embodiment, the variable region may be condricthoid in origin (e.g., from sharks) .

[0057] As used herein, the term “heavy chain constant region” includes amino acid sequences derived from an immunoglobulin heavy chain. A polypeptide comprising a heavy chain constant region comprises at least one of: a CH1 domain, a hinge (e.g., upper, middle, and / or lower hinge region) domain, a CH2 domain, a CH3 domain, or a variant or fragment thereof. For example, an antigen-binding polypeptide for use in the disclosure may comprise a polypeptide chain comprising a CH1 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, and a CH2 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain and a CH3 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, and a CH3 domain, or a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, a CH2 domain, and a CH3 domain. In another embodiment, a polypeptide of the disclosure comprises a polypeptide chain comprising a CH3 domain. Further, an antibody for use in the disclosure may lack at least a portion of a CH2 domain (e.g., all or part of a CH2 domain) . As set forth above, it will be understood by one of ordinary skill in the art that the heavy chain constant region may be modified such that they vary in amino acid sequence from the naturally occurring immunoglobulin molecule.

[0058] The heavy chain constant region of an antibody disclosed herein may be derived from different immunoglobulin molecules. For example, a heavy chain constant region of a  polypeptide may comprise a CH1 domain derived from an IgGl molecule and a hinge region derived from an IgG3 molecule. In another example, a heavy chain constant region can comprise a hinge region derived, in part, from an IgGl molecule and, in part, from an IgG3 molecule. In another example, a heavy chain portion can comprise a chimeric hinge derived, in part, from an IgGl molecule and, in part, from an IgG4 molecule.

[0059] As used herein, the term “light chain constant region” includes amino acid sequences derived from antibody light chain. Preferably, the light chain constant region comprises at least one of a constant kappa domain or constant lambda domain.

[0060] A “light chain-heavy chain pair” refers to the collection of a light chain and heavy chain that can form a dimer through a disulfide bond between the CL domain of the light chain and the CH1 domain of the heavy chain.

[0061] As previously indicated, the subunit structures and three dimensional configuration of the constant regions of the various immunoglobulin classes are well known. As used herein, the term “VH domain” includes the amino terminal variable domain of an immunoglobulin heavy chain and the term “CH1 domain” includes the first (most amino terminal) constant region domain of an immunoglobulin heavy chain. The CH1 domain is adjacent to the VH domain and is amino terminal to the hinge region of an immunoglobulin heavy chain molecule.

[0062] The “CH1 domain” (also referred to as “C1” of “H1” domain) usually extends from about amino acid 118 to about amino acid 215 (EU numbering system) .

[0063] As used herein, the term “hinge region” includes the portion of a heavy chain molecule that joins the CH1 domain to the CH2 domain, a region in IgG corresponding to Glu216 to Pro230 of human IgG1, EU numbering system (Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985) ) . Hinge regions of other IgG isotypes may be aligned with the IgG1 sequence by placing the first and last cysteine residues forming inter-heavy chain S-Sbonds in the same positions. This hinge region is flexible, thus allowing the two N-terminal antigen-binding regions to move independently. Hinge regions can be subdivided into three distinct domains: upper, middle, and lower hinge domains (Roux et al., J. Immunol 161: 4083 (1998) ) .

[0064] As used herein the term “CH2 domain” includes the portion of a heavy chain molecule that extends, e.g., from about residue 244 to residue 360 of an antibody using conventional numbering schemes (residues 244 to 360, Kabat numbering system; and residues 231-340, EU  numbering system; see Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) . The CH2 domain is unique in that it is not closely paired with another domain. Rather, two N-linked branched carbohydrate chains are interposed between the two CH2 domains of an intact native IgG molecule. It is also well documented that the CH3 domain extends from the CH2 domain to the C-terminal of the IgG molecule and comprises approximately 108 residues.

[0065] The “CH3 domain” (also referred to as “C3” domain) comprises the stretch of residues C-terminal to a CH2 domain in an Fc region (i.e. from about amino acid residue 341 to the C-terminal end of an antibody sequence, typically at amino acid residue 446 or 447 of an IgG, EU numbering system) .

[0066] The term “Fc region” , “Fc domain” or “fragment crystallizable region” herein is used to define a C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including native-sequence Fc regions and variant Fc regions. Although the boundaries of the Fc region of an immunoglobulin heavy chain might vary, the human IgG heavy-chain Fc region is usually defined to stretch from an amino acid residue at position Cys226, or from Pro230, to the carboxyl-terminus thereof. The C-terminal lysine (residue 447 according to the EU numbering system) of the Fc region may be removed, for example, during production or purification of the antibody, or by recombinantly engineering the nucleic acid encoding a heavy chain of the antibody. Accordingly, a composition of intact antibodies may comprise antibody populations with all K447 residues removed, antibody populations with no K447 residues removed, and antibody populations having a mixture of antibodies with and without the K447 residue. Suitable native-sequence Fc regions for use in the antibodies described herein include human IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B) , IgG3 and IgG4.

[0067] As used herein the term “disulfide bond” includes the covalent bond formed between two sulfur atoms. The amino acid cysteine comprises a thiol group that can form a disulfide bond or bridge with a second thiol group. In most naturally occurring IgG molecules, the CH1 and CK regions are linked by a disulfide bond and the two heavy chains are linked by two disulfide bonds at positions corresponding to 239 and 242 using the Kabat numbering system (position 226 or 229, EU numbering system) .

[0068] As used herein, the term “chimeric antibody” will be held to mean any antibody wherein the immunoreactive region or site is obtained or derived from a first species and the  constant region (which may be intact, partial or modified in accordance with the instant disclosure) is obtained from a second species. In certain embodiments the target binding region or site will be from a non-human source (e.g. mouse or primate) and the constant region is human.

[0069] “Humanized antibody” is used herein to describe an antibody that comprises heavy and light chain variable region sequences from a non-human species (e.g. a mouse) but in which at least a portion of the VH and / or VL sequence has been altered to be more “human-like, ” i.e., more similar to human germline variable sequences. A “humanized antibody” is an antibody or a variant, derivative, analog, or fragment thereof, which immuno-specifically binds to an antigen of interest and which comprises a framework (FR) region having substantially the amino acid sequence of a human antibody and a complementary determining region (CDR) having substantially the amino acid sequence of a non-human antibody. As used herein, the term “substantially” in the context of a CDR refers to a CDR having an amino acid sequence at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99%identical to the amino acid sequence of a non-human antibody CDR. A humanized antibody comprises substantially all of at least one, and typically two, variable domains (Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, Fv) in which all or substantially all of the CDR regions correspond to those of a non-human immunoglobulin (i.e., donor antibody) and all or substantially all of the framework regions are those of a human immunoglobulin consensus sequence. In an embodiment, a humanized antibody also comprises at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc) , typically that of a human immunoglobulin. In some embodiments, a humanized antibody contains the light chain as well as at least the variable domain of a heavy chain. The antibody also may include the CH1, hinge, CH2, CH3, and CH4 regions of the heavy chain. In some embodiments, a humanized antibody only contains a humanized light chain. In some embodiments, a humanized antibody only contains a humanized heavy chain. In specific embodiments, a humanized antibody only contains a humanized variable domain of a light chain and / or humanized heavy chain.

[0070] The term “epitope” as used herein refers to the specific group of atoms or amino acids on an antigen to which an antibody or antibody moiety binds. Two antibodies or antibody moieties may bind the same epitope within an antigen if they exhibit competitive binding for the antigen.

[0071] By “specifically binds” or “has specificity to, ” it is generally meant that an antibody binds to an epitope via its antigen-binding domain, and that the binding entails some complementarity between the antigen-binding domain and the epitope. According to this definition, an antibody is said to “specifically bind” to an epitope when it binds to that epitope, via its antigen-binding domain more readily than it would bind to a random, unrelated epitope. The term “specificity” is used herein to qualify the relative affinity by which a certain antibody binds to a certain epitope. For example, antibody “A” may be deemed to have a higher specificity for a given epitope than antibody “B, ” or antibody “A” may be said to bind to epitope “C” with a higher specificity than it has for related epitope “D. ”

[0072] As used herein, the terms “treat” or “treatment” refer to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures, wherein the object is to prevent or slow down (lessen) an undesired physiological change or disorder, such as the progression of cancer. Beneficial or desired clinical results include, but are not limited to, alleviation of symptoms, diminishment of extent of disease, stabilized (i.e., not worsening) state of disease, delay or slowing of disease progression, amelioration or palliation of the disease state, and remission (whether partial or total) , whether detectable or undetectable. “Treatment” can also mean prolonging survival as compared to expected survival if not receiving treatment. Those in need of treatment include those already with the condition or disorder as well as those prone to have the condition or disorder or those in which the condition or disorder is to be prevented.

[0073] By “subject” or “individual” or “animal” or “patient” or “mammal, ” is meant any subject, particularly a mammalian subject, for whom diagnosis, prognosis, or therapy is desired. Mammalian subjects include humans, domestic animals, farm animals, and zoo, sport, or pet animals such as dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, cattle, cows, and so on.

[0074] As used herein, phrases such as “to a patient in need of treatment” or “asubject in need of treatment” includes subjects, such as mammalian subjects, that would benefit from administration of an antibody or composition of the present disclosure used, e.g., for detection, for a diagnostic procedure and / or for treatment.

[0075] T-Cell Engagers Targeting WT1

[0076] T-cell engagers are molecules that bind to both T cells and tumor cells, and thus can recruit T cells to a target tumor cell and kill it. In some examples, such T cell engagers can further include an anti-4-1BB moiety.

[0077] As an example, RG-6007, being developed by Hoffmann-La Roche, is a T-cell receptor (TCR) -like T-cell bispecific antibody targeting the HLA-A2-WT1 complex on tumor cells and CD3 on T cells, for the potential treatment of acute myeloid leukemia (AML) . In vitro data showed significant increase in WT1-TCB mediated lysis by allogeneic heathy donor T-cells when combined with FAP-4-1BBL in the presence of NIH-3T3 cells expressing low or high levels of FAP versus WT1-TCB alone.

[0078] A new anti-WT1 antibody, WT1-09, that targets the WT1 / HLA-A*02 complex presented on tumor cells was developed herein. As compared to the WT1-binding unit of the reference antibody RG-6007, WT1-09 exhibited much better binding specificity, e.g., no binding to MED13L and PIGQ peptide (Example 2) .

[0079] In accordance with one embodiment of the present disclosure, therefore, provided is an antibody or antigen-binding fragment thereof having specificity to WT1. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof binds WT1 presented by HLA-A*02. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof binds to RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 3) . In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof does not bind SEQ ID NO: 4 or 5.

[0080] In some embodiments, the anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof includes a heavy chain variable region (VH) with a VH CDR1, VH CDR1 and VH CDR3, and a light chain variable region (VL) with a VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3. In some embodiments, the VH CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, the VH CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, the VH CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, the VL CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO:16, the VL CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and the VL CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.

[0081] Table A. Anti-WT1 Antibodies

[0082] In some embodiments, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%sequence identity to SEQ ID NO: 2.

[0083] Also provided are antibodies or antigen-binding fragments that competes with WT1-09 in binding to WT1 / HLA-A*02. In some embodiments, the binding is to SEQ ID NO: 3.

[0084] The instant inventors designed and prepared T-cell engager with the new WT1 antibody sequences. They adopted the 1+1 or 2+1 format as illustrated in FIG. 4, and are referred to as T cell Omnipotent Precise Agonism Antibody, or TOPAbody (or simply TOPA) .

[0085] The 1+1 format (FIG. 4A) includes a single VH / VL pair of the anti-WT1 antibody, a single chain fragment (scFv) targeting CD3, both of which are fused to the N-terminus of an Fc fragment. In addition, two anti-4-1BB nanobodies are used to the C-terminus of the Fc fragment. Different from the 1+1 format, a 2+1 format, as illustrated in FIG. 4B, includes two VH / VL pairs targeting WT1. One of the VH / VL pairs, like in the 1+1 format, is directly fused to the Fc; the other one, however, is fused to the N-terminus of the anti-CD3 scFv. TOPObodies that incorporate one or more anti-WT1 units are herein referred to as WT1-TOPA.

[0086] These newly developed WT1-TOPA exhibited excellent safety profile, as they did not cause toxicity to CD34+ hematopoietic stem cells (Example 4) . On the other hand, they showed potent T cell cytotoxicity against various types of HLA-A02+ / WT1+ cancer cells (Example 5) .

[0087] When compared to RG-6007, the WT1-TOPA were more potent in T cell activation (Examples 6 and 9) . Also importantly, WT1-TOPA caused less induction of T cell exhaustion markers than RG-6007 and thus are safer than RG-6007 (Example 9) .

[0088] Accordingly, one embodiment of the present disclosure provides a multi-specific antibody that includes an anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure, an anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof, and an anti-4-1BB antibody or antigen-binding fragment thereof.

[0089] In some embodiments, the anti-CD3 antibody or fragment includes a heavy chain variable region (VH) with a VH CDR1, VH CDR1 and VH CDR3, and a light chain variable region (VL) with a VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3. In some embodiments, the VH CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, the VH CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, the VH CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, the VL CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, the VL CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and the VL CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

[0090] In some embodiments, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. A representative anti-CD3 antibody with such sequences is 155z16. In some embodiments, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32. In some embodiments, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. A representative anti-CD3 antibody with such sequences is 155z05. Notably, they share the same CDRs but have differences in the framework regions.

[0091] Various derivatives of 155z16 and 155z05 have also been prepared and tested. In particular, some mutant versions of the HCDR2 were tested, with excellent performance. They included SEQ ID NO: 27 (PSG version) , 28 (ASG version) and 29 (TG version) (see Table B) .

[0092] Table B. Anti-CD3 Antibodies

[0093] In some embodiments, the VH CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, the VH CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, the VH CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, the VL CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, the VL CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and the VL CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

[0094] In some embodiments, the VH CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, the VH CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, the VH CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, the VL CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, the VL CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and the VL CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

[0095] In some embodiments, the VH CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, the VH CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, the VH CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, the VL CDR1 includes the amino acid  sequence of SEQ ID NO: 24, the VL CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and the VL CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

[0096] In some embodiments, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. In some embodiments, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33.

[0097] In some embodiments, the anti-4-1BB antibody in the multi-specific antibody is a single domain antibody (sdAb) , also known as nanobody. In some embodiments, the sdAb includes a CDR1, CDR2 and CDR3. In some embodiments, the CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, the CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and the CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the sdAb includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38.

[0098] Table C. Anti-4-1BB Antibodies

[0099] In some embodiments, at least one, or two, or three, or four, or five, or six of the VH CDR1, CDR2, and CDR3 of the above are modified by one, two or three amino acid additions, deletions, substitutions, or the combinations thereof.

[0100] The CDRs, heavy chain variable regions, light chain variable regions or single heavy chain variable domains of the present disclosure can be further modified. In some embodiments, the modified heavy chain variable region, light chain variable region or single heavy chain  variable domain retains at least about 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%or 99%sequence identity and is still capable of binding to the target site.

[0101] The WT1-TOPA can adopt different formats. In some embodiments, the anti-4-1BB sdAb, preferably two of them, is fused to the C-terminus of the Fc fragment. In some embodiments, the anti-CD3 fragment, preferably a scFv, is fused to the N-terminus of one of the Fc chains. In some embodiments, the anti-WT1 fragment (e.g., VH-VL pair, optionally with a CH1-CL pair) is fused to the N-terminus of the other Fc chains. In some embodiments, a second copy of the anti-WT1 fragment is used to the N-terminus of the anti-CD3 scFv.

[0102] One or more linkers can optionally be included between adjacent fragments in the multi-specific antibodies. Linkers within the scope of the present disclosure are characterized in terms of amino acid content, length, rigidity and secondary structure. Linkers within the scope of the present disclosure separate a function polypeptide and another functional polypeptide and allow proper folding and functioning of each domain. In this manner, a linker can be tailored to the particular functional polypeptide and the other functional polypeptide. According to one aspect, functional independence of the structural and fused (heterologous) domains is maximized by a suitable linker to limit steric interference between domains during the export and assembly processes of the bacterial cell.

[0103] Linkers within the scope of the present disclosure include amino acid residues. The amino acid residues may be any of the naturally occurring amino acid residues. Amino acid residues may also be synthetic amino acids known to those of skill in the art. Representative amino acids which may be used in linkers include Glycine, Alanine, Valine, Leucine, Isoleucine, Serine, Cysteine, Selenocysteine, Threonine, Methionine, Proline, Phenylalanine, Tyrosine, Tryptophan, Histidine, Lysine, Arginine, Aspartate, Glutamate, Asparagine, and Glutamine.

[0104] In some embodiments, the linker has a length of about three to about fifty amino acids, for example, at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 48 amino acids.

[0105] In some embodiments at least 50%of the amino acids comprised by the linker sequence are glycine or serine residues, e.g., at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or more are glycine or serine residues. In some embodiments, the linker sequence consists of glycine and serine residues.

[0106] Usually, two identical Fc regions form a homodimer. However, two different Fc regions can form a heterodimer with mutations to the one or two individual chains via, for example, a knob-into-hole (KIH) , a disulfide bond (-S-S-) , or via hydrophobic interaction, electrostatic interaction, hydrophilic interaction, or increased flexibility. The Fc region pairing, can be achieved by forming a heterodimer via knob-into-hole (KIH) , hydrophobic interaction, electrostatic interaction, hydrophilic interaction, or increased flexibility.

[0107] In some embodiments, the Fc domain provided herein comprises a knob mutation and the pairing Fc domain comprises hole mutation (s) , or vice versa.

[0108] The term “knob-into-hole” or “KIH” technology as used herein refers to the technology directing the pairing of two polypeptides together in vitro or in vivo by introducing a protuberance (knob) into one polypeptide and a cavity (hole) into the other polypeptide at an interface in which they interact. For example, KIHs have been introduced in the Fc: Fc binding interfaces, CL: CH1 interfaces or VH / VL interfaces of antibodies (see, e.g., US 201 1 / 0287009, US2007 / 0178552, WO 96 / 02701 1, WO 98 / 050431, Zhu et al, 1997, Protein Science 6: 781-788, and WO2012 / 106587) . In some embodiments, KIHs drive the pairing of two different heavy chains together during the manufacture of multispecific antibodies. For example, multispecific antibodies having KIH in their Fc regions can further comprise single variable domains linked to each Fc region, or further comprise different heavy chain variable domains that pair with similar or different light chain variable domains. KIH technology can also be used to pair two different receptor extracellular domains together or any other polypeptide sequences that comprises different target recognition sequences (e.g., including affibodies, peptibodies and other Fc fusions) .

[0109] The term “knob mutation” as used herein refers to a mutation that introduces a protuberance (knob) into a polypeptide at an interface in which the polypeptide interacts with another polypeptide. In some embodiments, the other polypeptide has a hole mutation.

[0110] The term “hole mutation” as used herein refers to a mutation that introduces a cavity (hole) into a polypeptide at an interface in which the polypeptide interacts with another polypeptide. In some embodiments, the other polypeptide has a knob mutation.

[0111] In some embodiments, a knob mutation in a Fc domain comprises T366W (EU numbering) . In some embodiments, a hole mutation in a Fc domain comprises T366S, L368A, and Y407V (EU numbering) .

[0112] In certain embodiments, the Fc domain and the pairing Fc domain form a heterodimer having a knob-into-hole (KIH) : The Fc domain of SEQ ID NO: 98 (or a variant thereof having at least about 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity thereof) can be paired with the pairing Fc domain of SEQ ID NO: 99 (or a variant thereof having at least about 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity thereof) .

[0113] In some embodiments, the Fc region is an Fc domain, namely, an Fc region possessing some or all effector functions, including for example complement-dependent cytotoxicity (CDC) and antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) functions. In some embodiments, the Fc domain is derived from IgG1 or IgG3.

[0114] In some embodiments, one or more amino acid modifications may be introduced into the Fc domain, thereby generating an Fc domain variant. The Fc domain variant may comprise a human Fc domain sequence (e.g., derived from human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 Fc region) comprising an amino acid modification (e.g., a substitution) at one or more amino acid positions. In some embodiments, the Fc domain variant change one or more functional and / or pharmacokinetic properties of the antibody.

[0115] The Fc region can also be engineered to enhance or eliminate effector function. IgG antibodies can induce direct anti-tumor effects by way of indirect anti-tumor effects via the Fc-mediated effector functions that engage other immune cells or killer mechanisms. “Effector functions” or “antibody effector functions” as used herein refer to biological activities attributable to the binding of Fc region of an antibody to its effectors such as C1 complex and Fc receptor (FcγRIIa or FcγRIIIa) . Exemplary effector functions include: complement dependent cytotoxicity (CDC) induced by interaction of antibodies and C1q on the C1 complex; antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) induced by binding of Fc region of an antibody to Fc receptor on an effector cell; and antibody dependent cell mediated phagocytosis (ADCP) , where nonspecific cytotoxic cells that express Fcγ receptors (FcγRs) recognize bound antibody on a target cell and subsequently cause phagocytosis of the target cell.

[0116] In some embodiments, the Fc regions provided herein are maintained or improved with effector function, such as ADCC and / or CDC.

[0117] Among the four IgG subclasses, IgG1 and IgG3 induce the strongest Fc-effector functions. However, since IgG1 has the longest half-life and is more stable than IgG3, most therapeutic antibodies with Fc-mediated functions are of IgG1 isotype.

[0118] IgG2 and IgG4 isotypes have significantly lower binding affinity to FcγRs. Recent evidence suggests that the IgG2 isotype is not completely devoid of effector function, whereas the IgG4 isotype can undergo in vivo Fab arm exchange leading to bispecific antibody and off-target effects.

[0119] In some embodiments, the Fc domain is derived from human IgG1. In some embodiments, the human IgG1 derived Fc domain does not comprise L234A mutation and / or a L235A mutation. In some embodiments, the human IgG1 derived Fc domain comprises a L234A mutation and / or a L235A mutation. In some embodiments, the Fc domain is derived from human IgG3. In some embodiments, the Fc domain is derived from human IgG2 or IgG4. In some embodiments, the Fc domain is derived from human IgG4. In some embodiments, the human IgG4 derived Fc domain comprises a S228P, F234A, and / or a L235A mutation. In some embodiments, the human IgG4 derived Fc domain does not comprise a S228P, F234A, and / or a L235A mutation.

[0120] In some embodiments, alterations are made in the Fc domain that result in altered (i.e., either improved or diminished) C1q binding and / or Complement Dependent Cytotoxicity (CDC) , e.g., as described in US Patent No. 6,194,551, WO 99 / 51642, and Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) .

[0121] In some embodiments, the multi-specific antibody includes a first heavy chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a second heavy chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a light chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

[0122] In some embodiments, the multi-specific antibody includes a first heavy chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a second heavy chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a light chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

[0123] In some embodiments, the multi-specific antibody includes a first heavy chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a second heavy chain that includes the  amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and a light chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

[0124] In some embodiments, the multi-specific antibody includes a first heavy chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a second heavy chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a light chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

[0125] In some embodiments, the multi-specific antibody includes a first heavy chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a second heavy chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and a light chain that includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

[0126] In some embodiments, the multispecific construct comprises a variant Fc domain comprising one or more amino acid substitutions which alters half-life and / or changes binding to the neonatal Fc receptor (FcRn) . Antibodies with increased half-lives and improved binding to the neonatal Fc receptor (FcRn) , which is responsible for the transfer of maternal IgGs to the fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994) ) , are described in US2005 / 0014934A1 (Hinton et al. ) . Those antibodies comprise an Fc region with one or more substitutions therein which alters binding of the Fc region to FcRn. Such Fc variants include those with substitutions at one or more of Fc region residues, e.g., substitution of Fc region residue 434 (US Patent No. 7,371,826) .

[0127] In certain embodiments, the antibody comprises an amino acid sequence or one or more moieties not normally associated with an antibody. Exemplary modifications are described in more detail below. For example, an antibody of the disclosure may comprise a flexible linker sequence, or may be modified to add a functional moiety (e.g., PEG, a drug, a toxin, or a label) .

[0128] Antibodies, variants, or derivatives thereof of the disclosure include derivatives that are modified, i.e., by the covalent attachment of any type of molecule to the antibody such that covalent attachment does not prevent the antibody from binding to the epitope. For example, but not by way of limitation, the antibodies can be modified, e.g., by glycosylation, acetylation, pegylation, phosphorylation, phosphorylation, amidation, derivatization by known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, linkage to a cellular ligand or other protein, etc. Any of numerous chemical modifications may be carried out by known techniques,  including, but not limited to specific chemical cleavage, acetylation, formylation, metabolic synthesis of tunicamycin, etc. Additionally, the antibodies may contain one or more non-classical amino acids.

[0129] In some embodiments, the antibodies may be conjugated to therapeutic agents, prodrugs, peptides, proteins, enzymes, viruses, lipids, biological response modifiers, pharmaceutical agents, or PEG.

[0130] The antibodies may be conjugated or fused to a therapeutic agent, which may include detectable labels such as radioactive labels, an immunomodulator, a hormone, an enzyme, an oligonucleotide, a photoactive therapeutic or diagnostic agent, a cytotoxic agent, which may be a drug or a toxin, an ultrasound enhancing agent, a non-radioactive label, a combination thereof and other such agents known in the art.

[0131] Polynucleotides Encoding the Antibodies and Methods of Preparing the Antibodies

[0132] The present disclosure also provides isolated polynucleotides or nucleic acid molecules encoding the antibodies, variants or derivatives thereof of the disclosure. The polynucleotides of the present disclosure may encode the entire heavy and light chain variable regions of the antigen-binding polypeptides, variants or derivatives thereof on the same polynucleotide molecule or on separate polynucleotide molecules. Additionally, the polynucleotides of the present disclosure may encode portions of the heavy and light chain variable regions of the antigen-binding polypeptides, variants or derivatives thereof on the same polynucleotide molecule or on separate polynucleotide molecules.

[0133] The humanized antibody may be designed to minimize unwanted immunological response toward rodent anti-human antibodies, which limits the duration and effectiveness of therapeutic applications of those moieties in human recipients. The humanized antibody may have one or more amino acid residues introduced into it from a source that is non-human. These non-human residues are often referred to as “import” residues, which are typically taken from a variable domain. Humanization may be performed by substituting hypervariable region sequences for the corresponding sequences of a human antibody. Accordingly, such “humanized” antibodies are chimeric antibodies wherein substantially less than an intact human variable domain has been substituted by the corresponding sequence from a non-human species. For example, see U.S. Patent No. 4,816,567, the contents of which are herein incorporated by reference. The humanized antibody may be a human antibody in which some  hypervariable region residues, and possibly some FR residues are substituted by residues from analogous sites in rodent antibodies. Humanization or engineering of antibodies of the present invention can be performed using any known method, such as but not limited to those described in U.S. Pat. Nos. 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; and 4,816,567.

[0134] Treatment

[0135] As described herein, the antibodies, variants or derivatives of the present disclosure may be used in certain treatment methods.

[0136] The present disclosure is further directed to antibody-based therapies which involve administering the antibodies of the disclosure to a patient such as an animal, a mammal, and a human for treating one or more of the disorders or conditions described herein. Therapeutic compounds of the disclosure include, but are not limited to, antibodies of the disclosure (including variants and derivatives thereof as described herein) and nucleic acids or polynucleotides encoding antibodies of the disclosure (including variants and derivatives thereof as described herein) .

[0137] In some embodiments, provided are methods for treating a cancer in a patient in need thereof. The method, in one embodiment, entails administering to the patient an effective amount of an antibody of the present disclosure.

[0138] In some embodiments, provided are uses of the antibodies of the present disclosure in the manufacture of a medicament for treating a cancer in a patient in need thereof.

[0139] In some embodiments, provided are the antibodies of the present disclosure for use in the treatment of a cancer in a patient in need thereof.

[0140] Unless stated otherwise, the terms “cancer” and “tumor” are used interchangeably herein. These terms in particular relate but are not limited to cancer and tumors selected from the group comprising basal cell carcinoma; bladder cancer; bone cancer such as osteosarcoma; central nervous system tumors such as cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma / malignant glioma, craniopharyngioma, ependymoblastoma, ependymoma, medulloblastoma, medulloepithelioma, pineal parenchymal tumors of intermediate differentiation, primitive  neuroectodermal tumors, pineoblastoma and spinal cord tumors; Burkitt’s lymphoma; breast cancer; cervical cancer; chronic myelogenous leukemia; colon cancer; rectal cancer; colorectal cancer; esophageal cancer; Ewing family of tumors; extrahepatic bile duct cancer; gallbladder cancer; gastrointestinal stromal tumor (GIST) ; glioma; head and neck cancer; islet cell tumors; Kaposi sarcoma; leukemia; liver cancer; lymphoma; Hodgkin’s lymphoma; non-Hodgkin’s lymphoma; T-cell lymphoma; mesothelioma; multiple myeloma / plasma cell neoplasm; myeloid leukemia; multiple myeloma; nasopharyngeal cancer; neuroblastoma; small cell lung cancer; non-small cell lung cancer; oropharyngeal cancer; osteosarcoma; ovarian cancer; pancreatic cancer; parathyroid cancer; penile cancer; pharyngeal cancer; phaeochromocytoma; pituitary tumor; prostate cancer; renal cell cancer; respiratory tract carcinoma; retinoblastoma; skin cancer (melanoma) ; small intestine cancer; soft tissue sarcoma; squamous cell carcinoma; squamous neck cancer; stomach (gastric) cancer; testicular cancer; throat cancer; thyroid cancer; transitional cell cancer of the renal pelvis and ureter; urethral cancer; uterine cancer; vaginal cancer; vulvar cancer and Wilms tumor.

[0141] A specific dosage and treatment regimen for any particular patient will depend upon a variety of factors, including the particular antibodies, variant or derivative thereof used, the patient’s age, body weight, general health, sex, and diet, and the time of administration, rate of excretion, drug combination, and the severity of the particular disease being treated. Judgment of such factors by medical caregivers is within the ordinary skill in the art. The amount will also depend on the individual patient to be treated, the route of administration, the type of formulation, the characteristics of the compound used, the severity of the disease, and the desired effect. The amount used can be determined by pharmacological and pharmacokinetic principles well known in the art.

[0142] Methods of administration of the antibodies, variants or include but are not limited to intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The antigen-binding polypeptides or compositions may be administered by any convenient route, for example by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucocutaneous linings (e.g., oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc. ) and may be administered together with other biologically active agents. Thus, pharmaceutical compositions containing the antigen-binding polypeptides of the disclosure may be administered orally, rectally, parenterally, intracistemally, intravaginally, intraperitoneally,  topically (as by powders, ointments, drops or transdermal patch) , bucally, or as an oral or nasal spray.

[0143] The term “parenteral” as used herein refers to modes of administration which include intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intra-articular injection and infusion.

[0144] Administration can be systemic or local. In addition, it may be desirable to introduce the antibodies of the disclosure into the central nervous system by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injection; intraventricular injection may be facilitated by an intraventricular catheter, for example, attached to a reservoir, such as an Ommaya reservoir. Pulmonary administration can also be employed, e.g., by use of an inhaler or nebulizer, and formulation with an aerosolizing agent.

[0145] It may be desirable to administer the antigen-binding polypeptides or compositions of the disclosure locally to the area in need of treatment; this may be achieved by, for example, and not by way of limitation, local infusion during surgery, topical application, e.g., in conjunction, with a wound dressing after surgery, by injection, by means of a catheter, by means of a suppository, or by means of an implant, said implant being of a porous, non-porous, or gelatinous material, including membranes, such as sialastic membranes, or fibers. Preferably, when administering a protein, including an antibody, of the disclosure, care must be taken to use materials to which the protein does not absorb.

[0146] Compositions

[0147] The present disclosure also provides pharmaceutical compositions. Such compositions comprise an effective amount of an antibody, and an acceptable carrier. In some embodiments, the composition further includes a second anticancer agent (e.g., an immune checkpoint inhibitor) .

[0148] In a specific embodiment, the term “pharmaceutically acceptable” means approved by a regulatory agency of the Federal or a state government or listed in the U.S. Pharmacopeia or other generally recognized pharmacopeia for use in animals, and more particularly in humans. Further, a “pharmaceutically acceptable carrier” will generally be a non-toxic solid, semisolid or liquid filler, diluent, encapsulating material or formulation auxiliary of any type.

[0149] The term “carrier” refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic is administered. Such pharmaceutical carriers can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol and the like. The composition, if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents such as acetates, citrates or phosphates. Antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl parabens; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; and agents for the adjustment of tonicity such as sodium chloride or dextrose are also envisioned. These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsion, tablets, pills, capsules, powders, sustained-release formulations and the like. The composition can be formulated as a suppository, with traditional binders and carriers such as triglycerides. Oral formulation can include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate, etc. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in Remington’s Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin, incorporated herein by reference. Such compositions will contain a therapeutically effective amount of the antigen-binding polypeptide, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier so as to provide the form for proper administration to the patient. The formulation should suit the mode of administration. The parental preparation can be enclosed in ampoules, disposable syringes or multiple dose vials made of glass or plastic.

[0150] In an embodiment, the composition is formulated in accordance with routine procedures as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to human beings. Typically, compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer. Where necessary, the composition may also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lignocaine to ease pain at the site of the injection. Generally, the ingredients are supplied either separately or mixed together in unit dosage form, for example, as a dry lyophilized powder or water free concentrate in a hermetically sealed container such as an ampoule or sachet indicating the quantity of active agent. Where the  composition is to be administered by infusion, it can be dispensed with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. Where the composition is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients may be mixed prior to administration.

[0151] The compounds of the disclosure can be formulated as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include those formed with anions such as those derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids, etc., and those formed with cations such as those derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxides, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylamino ethanol, histidine, procaine, etc.

[0152] EXAMPLES

[0153] Example 1: Preparation and affinity testing of anti-WT1 antibodies

[0154] This example tested a newly developed anti-WT1 antibody (WT1-09, with VH and VL sequences as shown in Table 1) that targets the WT1 / HLA-A02 complex presented on tumor cells.

[0155] The binding affinity of anti-WT1 antibodies to human WT-1 / HLA-A02: 01 complex protein was tested with Biacore using a capture method. The antibodies were captured using Protein A chip. Human WT1-His protein at the concentration of 1 μg / mL was injected over captured antibody for 3 mins at a flow rate of 30 μL / min. The antigen was allowed to associate for 180 s and dissociate for 600 s. All the experiments were carried out on a Biacore 8K. Data analysis was carried out using Biacore 8K evaluation software. The anti-WT1 portion of RG-6007, which is a bispecific antibody targeting both WT1 / HLA-A02 and CD3 developed by Roche, was used as reference. As shown in FIG. 1A-C, WT1-09 had higher binding affinity than the anti-WT1 unit of RG-6007, as WT1-09 dissociated from WT1 more slowly.

[0156] Table 1: WT1-09 sequences

[0157] Example 2: WT1-09 had no cross-reactivity to off-target peptides

[0158] A common problem with antibodies is cross-reactivity with peptide homologues expressed on normal tissue. For instance, Ataie et al. (J Mol Biol. (2016) 428: 194-205) reported that antibody ESK1 bound to homologous peptides derived from protein MED13L and PIGQ. The amino acid sequences of MED13L, PIGQ and WT1-RMF peptides are shown in Table 2.

[0159] To determine the specificity of WT1-09, this example loaded these peptides on T2 cells, and analyzed the binding affinity of WT1-09 by flow cytometry-based binding. As shown in FIG. 2A-C, WT1-09 had no binding to MED13L and PIGQ peptide, while RG-6007 showed an obvious binding at 300 nM and 100 nM.

[0160] Table 2: Antigen sequences

[0161] Example 3: WT1-09 binding was dependent on HLA-A02 and WT1

[0162] To further confirm the specificity of the WT1 antibody, this example selected cells with different HLA-A types and WT1 expression levels for affinity measurement. The information of cell lines is shown in FIG. 3F. As shown in FIG. 3A-B, WT1-09 and RG-6007 showed high binding affinity in WT1 and HLA-A02 double positive cell lines (SKM-1 and THP-1) , with an EC50 around 1 nM. As it is shown in FIG. 3C-E, WT1-09 and RG-6007 showed neglectable binding to HLA-A02+ / WT1-cell lines, and even a lower binding to HLA-A02- / WT1+ cells.

[0163] Example 4: Construction and safety testing of tri-specific antibodies

[0164] In this example, tri-specific antibodies that included a fragment of WT1-09 and also had specificity to CD3 and 4-1BB were prepared and tested.

[0165] The tri-specific antibodies adopted a configuration referred to herein as TOPAbody (T cell Omnipotent Precise Agonism Antibody) . Some representative configurations of these  tri-specific antibodies are illustrated in FIG. 4A-B. FIG. 4A shows a 1+1 format which includes a single VH / VL pair of the anti-WT1 antibody, a single chain fragment (scFv) targeting CD3, both of which are fused to the N-terminus of an IgG1 Fc. In addition, the format includes two anti-4-1BB nanobodies at the C-terminus of the Fc fragment. Different from the 1+1 format, a 2+1 format, as illustrated in FIG. 4B, includes two VH / VL pairs targeting WT1. One of the VH / VL pairs, like in the 1+1 format, is directly fused to the Fc; the other one, however, is fused to the N-terminus of the anti-CD3 scFv. Like the 1+1 format, the 2+1 format also includes two anti-4-1BB nanobodies fused to the C-terminus of the Fc fragment. Fc portion in both configurations was engineered for silencing the effector function by substitution the leucine (L) at the position 234 and 235 with alanine (A) . Both formats are collectively referred to as WT1-TOPA. Relevant sequences are shown in Table 3.

[0166] It has been reported that CD34+ hematopoietic stem cells are WT1-positive. Therefore, it can potentially be harmful if WT1-TOPAbody binds them (Mod Pathol. (2006) 19: 804-814) . HLA-A02+ CD34+ HSC obtained from JUNX-Bio were used to test the binding activity of WT1-TOPA.

[0167] WT1-09 showed lower affinity to CD34+ HSC than RG-6007 (FIG. 5A) . To confirm that TOPA didn’ t induce cytotoxicity against HSC, CD34+ HSCs were seeded at a density of 2×105 cells per well, together with 2×104 SKM-1 cells in a 96-well plate. Bispecific antibody RG-6007 and trispecific antibody WT1-TOPA were 4-fold serially diluted and added to a 96-well assay plate, at a final concentration ranging from 100 nM to 0.0003 nM. Following a 72 hours’ incubation at 37℃, the supernatants were collected and detected lactate dehydrogenase (LDH) activity released from the cytosol of damaged cells was examined by Cytotoxicity Detection KitPLUS (Roche) . As shown in FIG. 5B, WT1-TOPA and RG-6007 had no detectable cytotoxicity against HSCs.

[0168] Table 3: Sequences of WT1-TOPAbody

[0169] Example 5: T cell cytotoxicity to different HLA-A02+ / WT1+ cancer cell lines

[0170] To evaluate the cytotoxicity mediated by WT1-TOPA against HLA02+ / WT1+ tumor cells, lactate dehydrogenase (LDH) activity released from the cytosol of damaged cells was examined by Cytotoxicity Detection KitPLUS (Roche) . Briefly, human PBMCs at a density of 2×105 cells per well were cultured in a 96-well plate. The target cells, THP-1, SW620, MDA-and MB-231 were seeded at a density of 2×104 per well. Thus, the E: T ratio was 10: 1. The antibodies were 4-fold serially diluted and added to a 96-well assay plate, at a final concentration ranging from 100 nM to 0.0003 nM. Following a 72 hours’ incubation at 37℃, the supernatants were collected for further analysis. The LDH were examined following the manufacturer’s protocol. The plate reader was used to measure the absorbance of the samples at 492 nm. As shown in FIG. 6A-D, WT1-TOPA induced cell lysis of different HLA-A02+ / WT1+ tumor cells.

[0171] Example 6: T cell activation

[0172] IL-2 and IFN-γ secretion induced by WT1-TOPA were examined by LANCE (Perkin Elmer) . Briefly, human PBMCs at a density of 2×105 cells per well were cultured in a 96-well plate. Target cells SW620, were seeded at a density of 2×104 per well. Thus, the E: T ratio was 10: 1. The antibodies were 4-fold serially diluted and added to a 96-well plate, at a final concentration ranging from 100 nM to 0.098 nM. Following a 48 hours’ incubation at 37℃, the supernatants were collected for further analysis. IL-2 and IFN-γ was measured by TR-FRET assay, followed by manufacturer’s protocol. Lance signal was detected using Envision. Dual emission from 615nM (channel 1) and 665nM (channel 2) was acquired. A standard curve was generated by plotting the LANCE counts (Ch1 / Ch2 ratio versus the concentration of standards) . Data were analyzed using a nonlinear regression, 4-parameter logistic equation. As shown in FIG. 7A-B, WT1-TOPA effectively induced a much stronger T cell activation as measured by pro-inflammatory cytokine, as compared to benchmark RG-6007.

[0173] Example 7: CD3 engineering of WT1-TOPA to enhance T cell activity

[0174] In order to further improve the activity and stability of the WT1-TOPA, this example generated a series of WT1-TOPA with different anti-CD3 units. The complete sequences of these engineered WT1-TOPA are listed in Table 4.

[0175] Table 4: The complete sequences of WT1-TOPAbodies

[0176] To assess the ability of the WT1-TOPA to activate the CD3 or 4-1BB signaling pathway, Jurkat-CD3-NFAT or Jurkat-4-1BB-NFκB was used as the reporter cell line. The Jurkat-CD3-NFAT cell line is genetically modified with CD3 downstream NFAT response element. The Jurkat-4-1BB-NFκB cell line is transfected with human 4-1BB and modified with 4-1BB downstream NFκB response element. Luciferase expression is induced when antibody active CD3-NFAT or 4-1BB-NFκB pathway. Briefly, both reporter cells and HLA-A02 / WT1 transfected cell line HCT116-B-Tg were plated at a density of 2.5×104 cells per well in a white 96-well plate. The test antibodies were 4-fold serially diluted added to a white 96-well assay plate, at a final concentration starting from 100 nM. Following 6 hours of incubation at 37℃, luminescence was obtained by adding the substrate of luciferase and measured by a microplate reader. Four-parameter logistic curve analysis was performed with GraphPad software.

[0177] From the results as shown in FIG. 8A-B, it was confirmed that WT1-trispecific antibodies with different CD3 sequences induced CD3 and 4-1BB downstream signaling. To determine the cytotoxicity of these WT1-TOPA, LDH activity released from lysed tumor cells was measured, as described previously. As shown in FIG. 9, WT1-TOPA showed cytotoxicity against HLA-A02+ / WT1+ SKM-1 cells, albeit at a different level of potency.

[0178] Example 8: No significant IL6 induction

[0179] To understand the potential of WT1-TOPA in inducing cytokine release syndrome after i. v. administration, antibodies at a high concentration was added to PBMCs, and the level of IL-6, the major driver of cytokine release syndrome, was measured in the supernatant medium. Human PBMCs at a density of 2×105 cells per well were cultured in a 96-well plate. The antibodies were 4-fold serially diluted and added to a 96-well plate, at a final concentration ranging from 400 nM to 1.563 nM. Following a 72-hour incubation at 37℃, the supernatants were collected, and cytokines were detected by Cytometric Bead Array (CBA) Human Th1 / Th2 Cytokine Kit II from BD. As shown in the results of FIG. 10, WT1-TOPA only induced a neglectable increase in IL-6 production, which is much lower than RG-6007 and CD3 antibody OKT3.

[0180] Example 9: WT1-TOPA induced long-term activation to T cells

[0181] It was contemplated that inclusion of 4-1BB signaling in the WT1-TOPA molecule could induce a stronger and longer T cell activation and production, compared to T cell engager  with only CD3 antibody, activating signal 1 only. To test this, this example performed serial killing of tumor cells mediated by WT1-TOPA, compared with RG6007. The assay protocol was to seed 2×105 PBMC and 2×104 target cells in 96-well plates thereby the E: T ratio was 10:1. The target cell OVCAR3 was modified to express luciferase. The test antibodies were 50 nM for final concentration with 6-8 replicates. For each round of killing assay, following 72-96 hours of incubation at 37℃, PBMCs from replicates were collected and stored temporarily for next round of killing assay. Luminescence was obtained by adding the substrate of luciferase and measured by a microplate reader to calculate the killing mediated by antibodies, compared to the blank groups. At the start of each round of killing, the numbers of living PBMC was statistically adjusted to ensure that each group had the same number of PBMC and E: T ratio was maintained at 10: 1. The procedures were repeated for 5 rounds. As shown in the results of FIG. 11, during the 16-day incubation, WT1-CD3-4-1BB trispecific antibodies-stimulated T cells were more potent than RG-6007, especially in the 3-5 rounds of tumor killing, suggesting that WT1-CD3-4-1BB could induce a durable response in T cells.

[0182] To further dissect the underlying the mechanism, this example analyzed T cell exhaustion marker induced by RG-6007 group and WT1-trispecific antibodies. As the T-exhaustion analysis shown in FIG. 12A-B, all of exhaustion markers, included 2B4, PD-1 and etc, in cytotoxic T cell and helper T cell were more significantly upregulated in the RG-6007 group, relative to the WT1-TOPAbody group.

[0183] Example 10: WT1-TOPA showed superior tumor inhibition rate to RG-6007

[0184] The next example tested the in vivo efficacy of WT1-TOPAbody molecules in the syngeneic B-Tg (CAG-WT1 peptide-HLA-A02) MC38 cell tumors. B-Tg (CAG-WT1 peptide-HLA-A02) MC38 cells expressing HLA02 / WT1 were inoculated into CD3 / 4-1BB / HLA-A2.1 humanized mice. When the average tumor size reached 100 mm3, 1.5 mpk or 10 mpk CT01-3-09-155-16-B31Z2-t31-hIgG1LALA, 2.0 mpk CT01-3-09-155-5-B31Z2-t311-hIgG1LALA or 2.0 mpk RG-6007 were administered into animal in a dosing frequency of twice a week for three injections.

[0185] The results in FIG. 13A showed that all treatments of WT1-TOPAbody molecules had a significant tumor inhibition, with an TGI of 51.4%for CT01-3-09-155-5-B31Z2-t311-hIgG1LALA, and 63.3%and 95.9%for 1.5mg / kg and 10mg / kg CT01-3-09-155-16-B31Z2-t31-hIgG1LALA, respectively, at the end of experiment. Unexpectedly, the treatment of RG- 6007 promoted tumor growth inhibition than the PBS group, accompanied by significant decrease of both CD4+ and CD8+ T cells mediated by RG-6007 as measured by FACS at the endpoint of the experiment (FIG. 13B-C) .

[0186] ***

[0187] The present disclosure is not to be limited in scope by the specific embodiments described which are intended as single illustrations of individual aspects of the disclosure, and any compositions or methods which are functionally equivalent are within the scope of this disclosure. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the methods and compositions of the present disclosure without departing from the spirit or scope of the disclosure. Thus, it is intended that the present disclosure cover the modifications and variations of this disclosure provided they come within the scope of the appended claims and their equivalents.

[0188] All publications and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference.

[0189] The present invention has been described in terms of particular embodiments found or proposed by the present inventor to comprise preferred modes for the practice of the invention. It will be appreciated by those of skill in the art that, in light of the present disclosure, numerous modifications and changes can be made in the particular embodiments exemplified without departing from the intended scope of the invention. For example, due to codon redundancy, changes can be made in the underlying DNA sequence without affecting the protein sequence. Moreover, due to biological functional equivalency considerations, changes can be made in protein structure without affecting the biological action in kind or amount. All such modifications are intended to be included within the scope of the appended claims.

Claims

1.A multi-specific antibody, comprising:(a) an anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3, wherein the VH CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, the VH CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, 27, 28, or 29, the VH CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:23, the VL CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, the VL CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and the VL CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26,(b) an anti-4-1BB antibody or antigen-binding fragment thereof, and(c) an anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof.2.The multi-specific antibody of claim 1, wherein the VH and VL of the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof comprise, respectively, the amino acid sequences of (1) SEQ ID NO: 19 and 20, (2) SEQ ID NO: 30 and 20, (3) SEQ ID NO: 31 and 20, (4) SEQ ID NO: 32 and 33, or (5) SEQ ID NO: 34 and 33.3.The multi-specific antibody of any preceding claim, wherein the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof is a single chain fragment (scFv) .4.The multi-specific antibody of any preceding claim, wherein the anti-4-1BB antibody is a single domain antibody (sdAb) .5.The multi-specific antibody of claim 4, wherein the sdAb comprises a CDR1, CDR2 and CDR3 which, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 35, 36 and 37.6.The multi-specific antibody of claim 5, wherein the sdAb comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38.7.The multi-specific antibody of any one of claims 4-6, wherein the multi-specific antibody further comprises an Fc fragment, and wherein the sdAb is fused to the C-terminus of an Fc fragment in the multi-specific antibody.8.The multi-specific antibody of claim 7, wherein the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof is fused to the N-terminus of a chain of the Fc fragment.9.The multi-specific antibody of claim 7 or 8, wherein the anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof is fused to the N-terminus of a second chain of the Fc fragment.10.The multi-specific antibody of claim 9, which comprises a second one of the anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof that is fused to the N-terminus of the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof.11.The multi-specific antibody of any preceding claim, wherein the anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3, wherein the VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3 comprise, respectively, the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13-18.12.The multi-specific antibody of claim 11, wherein the VH and VL of the anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof comprise, respectively, the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and 2.13.A multi-specific antibody, comprising:(a) an anti-WT1 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3, wherein the VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3 comprise, respectively, the amino acid sequences of SEQ ID NO:13-18;(b) an anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof; and(c) an anti-4-1BB antibody or antigen-binding fragment thereof.14.A pharmaceutical composition comprising the multi-specific antibody of any one of claims 1-13, and a pharmaceutically acceptable carrier.15.One or more polynucleotide (s) encoding the multi-specific antibody of any one of claims 1-13.16.A vector comprising the one or more polynucleotide (s) of claim 15.17.A host cell comprising the one or more polynucleotide (s) of claim 13, or the vector of claim 16.18.A method of treating a disease or condition in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of the multi-specific antibody of any one of claims 1-13, the pharmaceutical composition of claim 14, the one or more polynucleotide (s) of claim 15, the vector of claim 16, or the host cell of claim 17.19.Use of the multi-specific antibody of any one of claims 1-13, the pharmaceutical composition of claim 14, the one or more polynucleotide (s) of claim 15, the vector of claim 16, or the host cell of claim 17 for the preparation of a medicament for treating a disease or condition.20.The method of claim 18 or the use of claim 19, wherein the disease or condition is cancer.21.The method or use of claim 20, wherein the cancer is selected from the group consisting of ovarian cancer, prostate cancer, cancer of the urinary tract, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, leukemia, liver cancer, lymphoma, melanoma, and thyroid cancer.

Images