Novel Anti-CD47 antibodies and uses thereof

Abstract

Provided herein are anti-CD47 antibodies and immunologically active fragments thereof that have prolonged antitumor effects and cause low or no level of red blood cell or platelet depletion and hemagglutination. Also provided are as well as pharmaceutical compositions containing such antibodies or antibody fragments, as well as methods of treatment using such antibodies, e.g., as single agents or in combination with other therapeutic agent(s).

Description

NOVEL ANTI-CD47 ANTIBODIES AND USES THEREOFCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0001] This application claims the priority benefit of International Application No. PCT / CN2023 / 137414, filed December 8, 2023, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety. REFERENCE TO AN ELECTRONIC SEQUENCE LISTING

[0002] The contents of the electronic sequence listing (334302001041SEQLIST. xml; Size: 30,346 bytes; and Date of Creation: December 5, 2024) is herein incorporated by reference in its entirety. FIELD OF THE APPLICATION

[0003] The present application relates to anti-CD47 antibodies, methods of producing such antibodies, and use of such antibodies in the treatment of diseases and disorders associated with CD47. BACKGROUND OF THE APPLICATION

[0004] Extensive clinical and experimental evidence suggests that macrophages play a crucial role in cancer immunotherapy. Cluster of differentiation (CD) 47, which is found on both healthy and malignant cells, regulates macrophage-mediated phagocytosis by sending a "don't eat me" signal to the signal regulatory protein alpha (SIRPα) receptor. Increasing evidence demonstrates that blocking CD47 interaction with SIRPα can enhance cancer cell clearance by macrophages. Additionally, inhibition of CD47 / SIRPα interaction can increase antigen cross-presentation, leading to T-cell priming and an activated adaptive antitumor immune response. Therefore, inhibiting CD47 / SIRPα axis has a significant impact on tumor immunotherapy.

[0005] Studies on CD47 monoclonal antibodies are at the forefront of research, and impressive results have been obtained. Nevertheless, hematotoxicity, especially anemia, has become the most common adverse effect of the CD47 monoclonal antibody. See e.g., Biomark Res 11, 15 (2023) .

[0006] The disclosures of all publications, patents, patent applications and published patent applications referred to herein are hereby incorporated herein by reference in their entirety. SUMMARY OF THE APPLICATION

[0007] The present application in one aspect provides antibodies or immunologically active fragments thereof that specifically binds to human CD47 (hCD47) , comprising: (a) a heavy chain variable (VH) domain that comprises (1) a CDR-H1 comprising RAWMN (SEQ ID NO: 6) ; (2) a CDR-H2 comprising RIKRKTDGETTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 7) ; (3) a CDR-H3 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SSRAFDI (SEQ ID NO: 8) , SSYAFDI (SEQ ID NO: 9) , SAYAFDI (SEQ ID NO: 10) , and SARAFDI (SEQ ID NO: 11) ; and (b) a light chain variable (VL) domain that comprises (1) a CDR-L1 comprising KSSQSVLYAGNNRNYLA (SEQ ID NO: 12) ; (2) a CDR-L2 comprising QASTRAS (SEQ ID NO: 13) ; and (3) a CDR-L3 comprising QQYYTPPLA (SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, the CDR-H3 comprises SSRAFDI (SEQ ID NO: 8) . In some embodiments, the CDR-H3 comprises SSYAFDI (SEQ ID NO: 9) . In some embodiments, the CDR-H3 comprises SAYAFDI (SEQ ID NO: 10) . In some embodiments, the CDR-H3 comprises SARAFDI (SEQ ID NO: 11) .

[0008] In some embodiments according to any of the antibodies or immunologically active fragments thereof described above, the VH comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to any one of SEQ ID NOs: 23-26, and / or the VL comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH comprises SEQ ID NO: 23, and the VL comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH comprises SEQ ID NO: 24, and the VL comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH comprises SEQ ID NO: 25, and the VL comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH comprises SEQ ID NO: 26, and the VL comprises SEQ ID NO: 27.

[0009] In some embodiments according to any of the antibodies or immunologically active fragments thereof described above, the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof comprises an Fc domain. In some embodiments, the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof comprises a human IgG Fc domain. In some embodiments, the human IgG Fc domain is an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc domain.

[0010] In some embodiments according to any of the antibodies described above, the antibody is a full-length antibody. In some embodiments, the full-length antibody comprises two heavy chains and two light chains. In some embodiments, the heavy chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-4 and / or the light chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 5.

[0011] In some embodiments according to any of the immunologically active fragments thereof described above, the fragment is a Fab, a Fab’ , a F (ab) ’ 2, a Fab’ -SH, a single-chain Fv (scFv) , an Fv fragment, or a linear antibody.

[0012] In some embodiments according to any of the antibodies or immunologically active fragments thereof described above, the antibody or fragment thereof is a monoclonal antibody or fragment thereof.

[0013] In some embodiments according to any of the antibodies or immunologically active fragments thereof described above, the antibody or fragment thereof is chimeric or humanized.

[0014] In some embodiments according to any of the antibodies or immunologically active fragments thereof described above, the antibody or fragment binds to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell. In some embodiments, the cancer cell is a HL60 cell, a RKO cell, an OCI-LY19 cell, a SK-OV-3 cell, a Toledo cell, a K562 cell, a HCC827 cell, a Jurkat cell, a U937 cell, a TF-1 cell, a Raji cell, a SU-DHL-4 cell, a MDA-MB-231 cell, an A375 cell, or a SK-MES-1 cell. In some embodiments, the cancer cell is a solid tumor cancer. In some embodiments, the solid tumor cancer is lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer. In some embodiments, the cancer cell is a hematological cancer. In some embodiments, the hematological cancer is non-Hodgkin lymphoma.

[0015] In some embodiments according to any of the antibodies or immunologically active fragments thereof described above, the antibody or fragment binds to hCD47 expressed on the surface of a blood cell at a lower level than that 5F9 (e.g., at a level that is at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%less at a concentration of about 1nM, 3.2nM, 10nM, 32nM, 100nM, 320nM, or 1000nM) . In some embodiments, the blood cell is an erythrocyte.

[0016] In some embodiments according to any of the antibodies or immunologically active fragments thereof described above, the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 prevents interaction of the hCD47 with signal-regulatory-protein α (SIRPα) . In some embodiments, the SIRPα is human SIRPα (hSIRPα) .

[0017] In some embodiments according to any of the antibodies or immunologically active fragments thereof described above, the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell promotes macrophage-mediated phagocytosis of the cancer cell. In some embodiments, the cancer cell is a HL60 cell, a RKO cell, an OCI-LY19 cell, a SK-OV-3 cell, a Toledo cell, a K562 cell, a HCC827 cell, a Jurkat cell, a U937 cell, a TF-1 cell, a Raji cell, a SU-DHL-4 cell, a MDA-MB-231 cell, an A375 cell, or a SK-MES-1 cell. In some embodiments, the cancer cell is a solid tumor cancer. In some embodiments, the solid tumor cancer is lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer. In some embodiments, the cancer cell is a hematological cancer. In some embodiments, the hematological cancer is non-Hodgkin lymphoma.

[0018] In some embodiments according to any of the antibodies or immunologically active fragments thereof described above, administration of the antibody or fragment thereof to a subject does not cause a significant level of hemagglutination in the subject, depletion of the subject’s red blood cells (RBC) , and / or the subject’s platelets.

[0019] The present application in another aspect provides nucleic acids encoding any of the anti-CD47 antibodies or immunologically active fragments thereof described above.

[0020] The present application in another aspect provides vectors comprising any of the nucleic acids described above.

[0021] The present application in another aspect provides host cells comprising any of the nucleic acids or vectors described above. In some embodiments, the host cell is a mammalian cell. In some embodiments, the mammalian cell is a Chinese hamster ovary (CHO) cell. In some embodiments, the CHO cell is a CHO-K1 cell.

[0022] The present application in another aspect provides methods of producing an anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof, comprising: a) culturing any of the host cells described above under conditions effective to cause expression of the anti-CD47 antibody or antigen-binding fragment thereof; and b) recovering the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof expressed by the host cell.

[0023] The present application in another aspect provides pharmaceutical compositions comprising any of the anti-CD47 antibodies or immunologically active fragments thereof described above and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0024] The present application in another aspect provides methods of treating cancer in a subject, comprising administering an effective amount of any of the anti-CD47 antibody or immunologically active fragments thereof described above. In some embodiments, the cancer is solid tumor. In some embodiments, the solid tumor is a lung tumor, an ovarian tumor, a colorectal tumor, a pancreatic tumor, a sarcoma tumor, a head and neck tumor, a gastric tumor, a renal tumor, or a skin tumor. In some embodiments, the solid tumor is relapsed and / or refractory solid tumor. In some embodiments, the cancer is a hematological cancer. In some embodiments, the cancer is a non-Hodgkin lymphoma (NHL) , and wherein the method further comprises administering an effective amount of rituximab to the subject. In some embodiments, the NHL is follicular lymphoma (FL) , diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , or mantle cell lymphoma (MCL) . In some embodiments, the NHL is relapsed / refractory NHL. In some embodiments, the subject has undergone at least one prior treatment for NHL. In some embodiments, the subject has undergone between 2 and 10 prior therapies for NHL. In some embodiments, the subject has undergone prior treatment for NHL with an agent that targets CD20. In some embodiments, the subject progressed during or after the prior therapy with an agent that targets CD20. In some embodiments, the anti-CD47 antibody comprises a human IgG4 Fc domain, optionally wherein the human IgG4 Fc domain further comprises an S228P mutation (wherein numbering is according to the EU index) . In some embodiments, the anti-CD47 antibody is administered to the subject at a dose of 10mg / kg. In some embodiments, the anti-CD47 antibody is administered to the subject via intravenous (IV) infusion or subcutaneously. In some embodiments, the subject does not experience significant hematological toxicity due to the treatment with the anti-CD47 antibody. In some embodiments, the subject does not experience any hematological toxicity due to treatment with the anti-CD47 antibody. In some embodiments, the hematological toxicity comprises anemia, thrombocytopenia, cytopenia, and / or hemagglutination. In some embodiments, the VH of the anti-CD47 antibody comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23-26, and the VL of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the anti-CD47 antibody is a full-length antibody comprising two heavy chains comprising any one of SEQ ID NOs: 1-4 and two light chains comprising SEQ ID NO: 5.

[0025] The present application in another aspect provides kits for treating cancer comprising any of the antibodies or immunologically active fragments thereof or any of the pharmaceutical compositions described above. In some embodiments, the kit is for use according to a method of treatment provided herein.

[0026] It is to be understood that one, some, or all of the properties of the various embodiments described herein may be combined to form other embodiments of the present application. These and other aspects of the application will become apparent to one of skill in the art. These and other embodiments of the application are further described by the detailed description that follows. BRIEF DESCRIPTIONS OF THE DRAWINGS

[0027] FIGs. 1A-1C show binding of C4BC1, C4BC2, C4BC3 and C4BC4 to tumor cells expressing CD47. Specifically, FIG. 1A shows binding of C4BC1, C4BC2 and C4BC3 to HL60 cells. FIG. 1B and FIG. 1C show binding of C4BC1, C4BC2, C4BC3, C4BC4 to RKO cells.

[0028] FIGs. 2A-2B show C4BC1, C4BC2, C4BC3 and C4BC4 block the binding between SIRPα and CD47. Specifically, FIG. 2A shows C4BC1, C4BC2 and C4BC3 block the binding of SIRPα to CD47 on HL60 cells. FIG. 2B shows C4BC1 and C4BC4 block the binding of SIRPα to CD47 on RKO cells.

[0029] FIGs. 3A-3C show that C4BC1, C4BC2, C4BC3 and C4BC4 promote phagocytosis of tumor cells. Specifically, FIGs. 3A-3B show C4BC1, C4BC2 C4BC3 and C4BC4 promote phagocytosis of RKO cells. FIG. 3C shows that C4BC1, C4BC2 and C4BC3 promote phagocytosis of OCI-LY19 cells.

[0030] FIG. 4A shows antibodies C4BC1, C4BC2, C4BC3 and C4BC4 exhibit limited human RBC binding, much less than BM 5F9 (i.e., “5F9” , also known as magrolimab) with no RBC agglutination. Specifically, FIG. 4B and FIG. 4C show consistent binding profile of C4BC1 and C4BC2 to RBC from different donors with no RBC agglutination.

[0031] FIGs. 5A-5C show significant tumor grow inhibition effect of antibodies C4BC1 and C4BC2 on HL60 in vivo model. FIG. 5A shows the study design that CB-17 SCID mice bearing HL60 tumor receive a single dose administration of anti-CD47 antibodies C4BC1, C4BC2, as well as isotype control antibody. FIG. 5B and FIG. 5C show tumor volume of CB-17 SCID mice treated with C4BC1 or C4BC2 antibodies over time, as compared to an isotype control.

[0032] FIGs. 6A-6B show pharmacokinetics for C4BC1 and C4BC2 in WT C57BL / 6 mice. Specifically, FIG. 6A shows mean concentration of C4BC1 and C4BC2 in blood. FIG. 6B table describes the pharmacokinetic profile for C4BC1 and C4BC2.

[0033] FIGs. 7A-7B show in vivo safety evaluation, where treatment of C4BC1 and C4BC2 does not induce significant hematologic changes following administration in huCD47 / huSIRPαdouble knock-in mice. Specifically, FIG. 7A shows that C4BC1 and C4BC2 both induced much less RBC decrease as compared to BM 5F9 benchmark antibody. FIG. 7B shows that C4BC1 and C4BC2 both did not induce or induced a negligible decrease of platelet counts as compared to BM 5F9 benchmark antibody. DETAILED DESCRIPTION OF THE APPLICATION Definitions

[0034] Before describing the embodiments in detail, it is to be understood that the present disclosure is not limited to particular compositions or biological systems, which can, of course, vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to be limiting.

[0035] As used in this specification and the appended claims, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural referents unless the content clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “a molecule” optionally includes a combination of two or more such molecules, and the like.

[0036] The term “about” as used herein refers to the usual error range for the respective value readily known to the skilled person in this technical field. Reference to “about” a value or parameter herein includes (and describes) embodiments that are directed to that value or parameter per se.

[0037] It is understood that aspects and embodiments of the present disclosure include “comprising, ” “consisting, ” and “consisting essentially of” aspects and embodiments.

[0038] The term “CD47” (which is also known as Integrin Associated Protein (IAP) , Antigenic Surface Determinant Protein OA3, OA3, CD47 Antigen, Rh-Related Antigen, Integrin-Associated Signal Transducer, Antigen Identified By Monoclonal Antibody 1D8, CD47 glycoprotein) preferably refers to human CD47 and, in particular, to a protein comprising the amino acid sequence or a variant of said amino acid sequence. The term “CD47” also refers to any post translationally  modified variants and conformation variants.

[0039] As used herein, the term “antibody” is used in the broadest sense and specifically covers intact antibodies (e.g., full length antibodies) , antibody fragments (including without limitation Fab, F (ab’ ) 2, Fab’ -SH, Fv, diabodies, scFv, scFv-Fc, single domain antibodies, single heavy chain antibodies, and single light chain antibodies) , monoclonal antibodies, and polyclonal antibodies, so long as they exhibit the desired biological activity (e.g., epitope binding) . “Antibodies” (or “Abs” ) and “immunoglobulins” (or “Igs” ) are glycoproteins having the same structural characteristics. While antibodies exhibit binding specificity to a specific antigen, immunoglobulins include both antibodies and other antibody-like molecules which lack antigen specificity. Polypeptides of the latter kind are, for example, produced at low levels by the lymph system and at increased levels by myelomas.

[0040] As used herein, the term “isolated” antibody may refer to an antibody that is substantially free of other cellular material. In one embodiment, an isolated antibody is substantially free of other proteins from the same species. In another embodiment, an isolated antibody is expressed by a cell from a different species and is substantially free of other proteins from the different species. In some embodiments, an “isolated” antibody is one which has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminant components of its natural environment are materials which would interfere with diagnostic or therapeutic uses for the antibody, and may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. An antibody may be rendered substantially free of naturally associated components (or components associated with the cellular expression system used to produce the antibody) by isolation, using protein purification techniques well known in the art. In some embodiments, the antibody will be purified (1) to greater than 75%by weight of antibody as determined by the Lowry method, and most preferably more than 80%, 90%, 95%or 99%by weight, or (2) to homogeneity by SDS-PAGE under reducing or nonreducing conditions using Coomassie blue or, preferably, silver stain. Isolated antibody includes the antibody in situ within recombinant cells since at least one component of the antibody's natural environment will not be present. Ordinarily, however, isolated antibody will be prepared by at least one purification step.

[0041] As used herein, the term “epitope” means any antigenic determinant on an antigen to which the paratope of an antibody binds. Epitopic determinants usually consist of chemically active surface groupings of molecules such as amino acids or sugar side chains and usually have specific three-dimensional structural characteristics, as well as specific charge characteristics.

[0042] As used herein, the term “native antibodies and immunoglobulins” are usually heterotetrameric glycoproteins of about 150, 000 daltons, composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is linked to a heavy chain by one covalent disulfide bond (also termed a “VH / VL pair” ) , while the number of disulfide linkages varies between the heavy chains of different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has regularly spaced intrachain disulfide bridges. Each heavy chain has at one end a variable domain (VH) followed by a number of constant domains. Each light chain has a variable domain at one end (VL) and a constant domain at its other end; the constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain, and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain. Particular amino acid residues are believed to form an interface between the light-and heavy-chain variable domains. See, e.g., Chothia et al., J. Mol. Biol., 186: 651 (1985) ; Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 4592 (1985) .

[0043] As used herein, the term “variable” refers to the fact that certain portions of the variable domains differ extensively in sequence among antibodies and are used in the binding and specificity of each particular antibody for its particular antigen. However, the variability is not evenly distributed throughout the variable domains of antibodies. It is concentrated in three segments called complementarity-determining regions (CDRs) or hypervariable regions both in the light-chain and the heavy-chain variable domains. The more highly conserved portions of variable domains are called the framework (FR) . The variable domains of native heavy and light chains each comprise four FR regions, largely adopting a β-sheet configuration, connected by three CDRs, which form loops connecting, and in some cases forming part of, the β-sheet structure. The CDRs in each chain are held together in close proximity by the FR regions and, with the CDRs from the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding site of antibodies. See, e.g., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991) . The constant domains are not involved directly in binding an antibody to an antigen, but exhibit various effector functions, such as participation of the antibody in antibody-dependent cellular toxicity. Variable region sequences of interest include the humanized variable region sequences for CD47 antibodies described in detail elsewhere herein.

[0044] The term “hypervariable region (HVR) ” or “complementarity determining region (CDR) ” may refer to the subregions of the VH and VL domains characterized by enhanced sequence variability and / or formation of defined loops. These include three CDRs in the VH domain (H1, H2, and H3) and three CDRs in the VL domain (L1, L2, and L3) . H3 is believed to be critical in imparting fine binding specificity, with L3 and H3 showing the highest level of diversity. See Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N. J., 2003) .

[0045] A number of CDR / HVR delineations are known. The Kabat Complementarity Determining Regions (CDRs) are based on sequence variability and are the most commonly used (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . Chothia refers instead to the location of the structural loops (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) ) . The AbM HVRs represent a compromise between the Kabat HVRs and Chothia structural loops, and are used by Oxford Molecular's AbM antibody modeling software. The “contact” HVRs are based on an analysis of the available complex crystal structures. The residues from each of these HVRs / CDRs are noted below. “Framework” or “FR” residues are those variable domain residues other than the HVR / CDR residues.

[0046] “Extended” HVRs are also known: 24-36 or 24-34 (L1) , 46-56 or 50-56 (L2) and 89-97 or 89-96 (L3) in the VL and 26-35 (H1) , 50-65 or 49-65 (H2) and 93-102, 94-102, or 95-102 (H3) in the VH (Kabat numbering) .

[0047] “Numbering according to Kabat” may refer to the numbering system used for heavy chain variable domains or light chain variable domains of the compilation of antibodies in Kabat et al., supra. The actual linear amino acid sequence may contain fewer or additional amino acids corresponding to a shortening of, or insertion into, a FR or HVR of the variable domain. The Kabat numbering of residues may be determined for a given antibody by alignment at regions of homology of the sequence of the antibody with a “standard” Kabat numbered sequence. Typically, the Kabat numbering is used when referring to a residue in the variable domains (approximately residues 1-107 of the light chain and residues 1-113 of the heavy chain) , whereas the EU numbering system or index (e.g., the EU index as in Kabat, numbering according to EU IgG1) is generally used when referring to a residue in the heavy chain constant region.

[0048] As used herein, a “monoclonal” antibody refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, e.g., substantially identical but allowing for minor levels of background mutations and / or modifications. “Monoclonal” denotes the substantially homogeneous character of antibodies, and does not require production of the antibody by any particular method. In some embodiments, a monoclonal antibody is selected by its HVR, VH, and / or VL sequences and / or binding properties, e.g., selected from a pool of clones (e.g., recombinant, hybridoma, or phage-derived) . A monoclonal antibody may be engineered to include one or more mutations, e.g., to affect binding affinity or other properties of the antibody, create a humanized or chimeric antibody, improve antibody production and / or homogeneity, engineer a multispecific antibody, resultant antibodies of which are still considered to be monoclonal in nature. A population of monoclonal antibodies may be distinguished from polyclonal antibodies as the individual monoclonal antibodies of the population recognize the same antigenic site. A variety of techniques for production of monoclonal antibodies are known; see, e.g., the hybridoma method (e.g., Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975) ; Hongo et al., Hybridoma, 14 (3) : 253-260 (1995) , Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) ; Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) ) , recombinant DNA methods (see, e.g., U.S. Pat. No. 4,816,567) , phage-display technologies (see, e.g., Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) ; Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992) ; Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2) : 299-310 (2004) ; Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5) : 1073-1093 (2004) ; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34) : 12467-12472 (2004) ; and Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2) : 119-132 (2004) , and technologies for producing human or human-like antibodies in animals that have parts or all of the human immunoglobulin loci or genes encoding human immunoglobulin sequences (see, e.g., WO 1998 / 24893; WO 1996 / 34096; WO 1996 / 33735; WO 1991 / 10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993) ; Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993) ; Bruggemann et al., Year in Immunol. 7: 33 (1993) ; U.S. Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; and 5,661,016; Marks et al., Bio / Technology 10: 779-783 (1992) ; Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994) ; Morrison, Nature 368: 812-813 (1994) ; Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996) ; Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) ; and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) .

[0049] “Chimeric” antibodies may refer to an antibody with one portion of the heavy and / or light chain from a particular isotype, class, or organism and another portion from another isotype, class, or organism. In some embodiments, the variable region will be from one source or organism, and the constant region will be from another.

[0050] “Humanized antibodies” may refer to antibodies with predominantly human sequence and a minimal amount of non-human (e.g., mouse or chicken) sequence. In some embodiments, a humanized antibody has one or more HVR sequences (bearing a binding specificity of interest) from an antibody derived from a non-human (e.g., mouse or chicken) organism grafted onto a human recipient antibody framework (FR) . In some embodiments, non-human residues are further grafted onto the human framework (not present in either source or recipient antibodies) , e.g., to improve antibody properties. In general, a humanized antibody will comprise substantially all of at least one, and typically two, variable domains, in which all or substantially all of the hypervariable loops correspond to those of a non-human immunoglobulin, and all or substantially all of the FRs are those of a human immunoglobulin sequence. The humanized antibody optionally will also comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc) , typically that of a human immunoglobulin. See Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986) ; Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) ; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992) .

[0051] A “human” antibody may refer to an antibody having an amino acid sequence which corresponds to that of an antibody produced by a human and / or has been made using any of the techniques for making human antibodies as disclosed herein. Human antibodies can be produced using various techniques known in the art, including phage-display libraries. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991) ; Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991) ; preparation of human monoclonal antibodies as described in Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ; Boerner et al., J. Immunol., 147 (1) : 86-95 (1991) ; and by administering the antigen to a transgenic animal that has been modified to produce such antibodies in response to antigenic challenge, but whose endogenous loci have been disabled, e.g., immunized xenomice (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 6,075,181 and 6,150,584 regarding XENOMOUSETM technology) or chickens with human immunoglobulin sequence (s) (see, e.g., WO2012162422, WO2011019844, and WO2013059159) .

[0052] There are five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and several of these can be further divided into subclasses (isotypes) , e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2. The heavy-chain constant domains that correspond to the different classes of immunoglobulins are called α, δ, ε, γ, and μ, respectively. The subunit structures and three-dimensional configurations of different classes of immunoglobulins are well known.

[0053] As used herein, the term “antibody fragment” , and all grammatical variants thereof, are defined as a portion of an intact antibody comprising the antigen binding site or variable region of the intact antibody which, in certain instances, is free of the constant heavy chain domains (i.e. CH2, CH3, and / or CH4, depending on antibody isotype) of the Fc region of the intact antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab’ , Fab’ -SH, F (ab’ ) 2, and Fv fragments; diabodies; any antibody fragment that is a polypeptide having a primary structure consisting of one uninterrupted sequence of contiguous amino acid residues (referred to herein as a “single-chain antibody fragment” or “single chain polypeptide” ) , including without limitation (1) single-chain Fv (scFv) molecules, (2) single chain polypeptides containing only one light chain variable domain, or a fragment thereof that contains the three CDRs of the light chain variable domain, without an associated heavy chain moiety, and (3) single chain polypeptides containing only one heavy chain variable region, or a fragment thereof containing the three CDRs of the heavy chain variable region, without an associated light chain moiety; and multi-specific or multivalent structures formed from antibody fragments. In an antibody fragment comprising one or more heavy chains, the heavy chain (s) can contain any constant domain sequence (e.g. CH1 in the IgG isotype) found in a non-Fc region of an intact antibody, and / or can contain any hinge region sequence found in an intact antibody, and / or can contain a leucine zipper sequence fused to or situated in the hinge region sequence or the constant domain sequence of the heavy chain (s) .

[0054] Papain digestion of antibodies produces two identical antigen-binding fragments, called “Fab” fragments, each with a single antigen-binding site, and a residual “Fc” fragment, whose name reflects its ability to crystallize readily. Pepsin treatment yields an F (ab’ ) 2 fragment that has two antigen-combining sites and is still capable of cross-linking antigen. “Fv” is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen-recognition and -binding site. In a two-chain Fv species, this region consists of a dimer of one heavy-and one light-chain variable domain in tight, non-covalent association. In a single-chain Fv species (scFv) , one heavy-and one light-chain variable domain can be covalently linked by a flexible peptide linker such that the light and heavy chains can associate in a “dimeric” structure analogous to that in a two-chain Fv species. It is in this configuration that the three CDRs of each variable domain interact to define an antigen-binding site on the surface of the VH-VL dimer. Collectively, the six CDRs confer antigen-binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for an antigen) has the ability to recognize and bind antigen, although at a lower affinity than the entire binding site. See, e.g., Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) .

[0055] The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. Fab’ fragments differ from Fab fragments by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain including one or more cysteines from the antibody hinge region. Fab’ -SH is the designation herein for Fab’ in which the cysteine residue (s) of the constant domains bear a free thiol group. F (ab’ ) 2 antibody fragments originally were produced as pairs of Fab’ fragments which have hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known.

[0056] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable carrier or excipient” refers to a carrier or an excipient that is useful for preparing a pharmaceutical composition or formulation that is generally safe, non-toxic, and neither biologically nor otherwise undesirable. A carrier or excipient employed is typically one suitable for administration to human subjects or other mammals. In making the compositions, the active ingredient is usually mixed with, diluted by, or enclosed with a carrier or excipient. When the carrier or excipient serves as a diluent, it can be a solid, semi-solid, or liquid material, which acts as a vehicle, carrier, or medium for the active ingredient of the antibody.

[0057] As used herein, the term “monoclonal antibody” (mAb) refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site. Each mAb is directed against a single determinant on the antigen. In addition to their specificity, the monoclonal antibodies are advantageous in that they can be synthesized by hybridoma culture, uncontaminated by other immunoglobulins. The modifier “monoclonal” indicates the character of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and is not to be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, the monoclonal antibodies to be used in accordance with the present application may be made in an immortalized B cell or hybridoma thereof, or may be made by recombinant DNA methods.

[0058] The monoclonal antibodies herein include hybrid and recombinant antibodies produced by splicing a variable (including hypervariable) domain of an CD47 antibody with a constant domain (e.g. “humanized” antibodies) , or a light chain with a heavy chain, or a chain from one species with a chain from another species, or fusions with heterologous proteins, regardless of species of origin or immunoglobulin class or subclass designation, as well as antibody fragments (e.g., Fab, F (ab’ ) 2, and Fv) , so long as they exhibit the desired biological activity.

[0059] The monoclonal antibodies herein specifically include chimeric antibodies (immunoglobulins) in which a portion of the heavy and / or light chain is identical with or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, while the remainder of the chain (s) is identical with or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from another species or belonging to another antibody class or subclass, as well as fragments of such antibodies, so long as they exhibit the desired biological activity.

[0060] As used herein, the term “epitope tagged” refers to a CD47 antibody fused to an “epitope tag” . The epitope tag polypeptide has enough residues to provide an epitope against which an antibody can be made, yet is short enough such that it does not interfere with activity of the CD47 antibody. The epitope tag preferably is sufficiently unique so that the antibody specific for the epitope does not substantially cross-react with other epitopes. Suitable tag polypeptides generally have at least 6 amino acid residues and usually between about 8-50 amino acid residues (preferably between about 9-30 residues) . Examples include the c-myc tag and the 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 and 9E10 antibodies thereto (see, e.g., Evan et al., Mol. Cell. Biol., 5 (12) : 3610-3616 (1985) ) ; and the Herpes Simplex virus glycoprotein D (gD) tag and its antibody (see, e.g., Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6) : 547-553 (1990) ) .

[0061] As used herein, the term “label” refers to a detectable compound or composition which is conjugated directly or indirectly to the antibody. The label may itself be detectable by itself (e.g., radioisotope labels or fluorescent labels) or, in the case of an enzymatic label, may catalyze chemical alteration of a substrate compound or composition which is detectable.

[0062] As used herein, the term “treatment” refers to clinical intervention designed to alter the natural course of the individual or cell being treated during the course of clinical pathology. Desirable effects of treatment include decreasing the rate of disease progression, ameliorating or palliating the disease state, and remission or improved prognosis. For example, an individual is successfully “treated” if one or more symptoms associated with cancer are mitigated or eliminated, including, but are not limited to, reducing the proliferation of (or destroying) cancerous cells, decreasing symptoms resulting from the disease, increasing the quality of life of those suffering from the disease, decreasing the dose of other medications required to treat the disease, and / or prolonging survival of individuals.

[0063] As used herein, “delaying progression of a disease” means to defer, hinder, slow, retard, stabilize, and / or postpone development of the disease (such as cancer) . This delay can be of varying lengths of time, depending on the history of the disease and / or individual being treated. As is evident to one skilled in the art, a sufficient or significant delay can, in effect, encompass prevention, in that the individual does not develop the disease. For example, a late stage cancer, such as development of metastasis, may be delayed.

[0064] Exemplary cancers include, but are not limited to, ovarian cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, head and neck cancer, prostate cancer, endometrial carcinoma, bladder cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, non-Hodgkin's lymphoma, acute lymphocytic leukemia (ALL) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , acute myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma, melanoma, leiomyoma, leiomyosarcoma, glioma, glioblastoma, myelomas, monocytic leukemias, B-cell derived leukemias, T-cell derived leukemias, B-cell derived lymphomas, T-cell derived lymphomas, and solid tumors. The fibrotic disease can be, e.g., myocardial infarction, angina, osteoarthritis, pulmonary fibrosis, asthma, cystic fibrosis, bronchitis, or asthma.

[0065] As used herein, the terms “prevent, ” “preventing, ” and “prevention” are meant to include a method of delaying and / or precluding the onset of a condition, disorder, or disease, and / or its attendant symptoms; barring a subject from acquiring a condition, disorder, or disease; or reducing a subject’s risk of acquiring a condition, disorder, or disease.

[0066] As used herein, the term “subject” for purposes of treatment refers to any animal classified as a mammal, including humans, domestic and farm animals, and zoo, sports, or pet animals, such as dogs, horses, cats, cows, etc. Preferably, the mammal is human.

[0067] All references cited herein, including patent applications and publications, are hereby incorporated by reference in their entirety. Overview

[0068] Provided herein are novel anti-CD47 antibodies and immunologically active fragments that prevent human CD47 (hCD47) from interacting with SIRPα (e.g., human SIRPα or “hSIRPα” ) . In some embodiments the anti-CD47 antibody promotes macrophage-mediated phagocytosis of a CD47-expressing cell (e.g., an hCD47-expressing cell, such as a hCD47-expressing cancer cell) . One of the challenges in the development of therapeutic anti-CD47 antibodies has been on-target, off-tissue toxicity. Red blood cells and / platelets also express CD47 to prevent their destruction by the immune system, and CD47 therapies have run into dose-limiting hematological toxicities.

[0069] The anti-CD47 antibodies described herein are more advantageous than other known anti-CD47 antibodies. For example, the anti-CD47 antibodies described herein possess desirable PK profile with extended half-life leading to strong and long-lasting antitumor activity. See e.g., FIG. 5A-5C. In additional, the antibodies of the present application showed a) limited human RBC binding compared to benchmark antibody 5F9, b) no hemagglutination, c) much less reduced RBC depletion after in vivo administration compared to benchmark antibody 5F9, and d) no reduction of negligible reduction of platelets after in vivo administration compared to benchmark antibody 5F9. See, e.g., FIGs. 4A-4C and 7A-7B. Anti-CD47 Antibodies

[0070] An anti-CD47 antibody (or an immunologically active fragment thereof) is an antibody that binds to CD47 (e.g., human CD47 or “hCD47” ) with sufficient affinity and specificity. As used herein, an “immunologically active fragment” of an antibody refers to an antigen-binding fragment of said antibody. The terms “immunologically active fragment” and “antigen-binding fragment” are used interchangeably herein. For example, an anti-CD47 antibody provided herein (or an immunologically active fragment thereof) may be used as a therapeutic agent in targeting and interfering with diseases or conditions associated with aberrant / abnormal CD47 expression and / or activity. In some embodiments, the anti-CD47 antibody is a chimeric (such as humanized) monoclonal antibody. In some embodiments, the anti-CD47 antibody comprises a heavy chain variable domain (VH) , and / or a light chain variable domain (VL) of described herein below.

[0071] In some embodiments, the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) that specifically binds to human CD47 (hCD47) comprises: a heavy chain variable (VH) domain that comprises (1) a CDR-H1 comprising RAWMN (SEQ ID NO: 6) ; (2) a CDR-H2 comprising RIKRKTDGETTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 7) ; (3) a CDR-H3 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SSRAFDI (SEQ ID NO: 8) , SSYAFDI (SEQ ID NO: 9) , SAYAFDI (SEQ ID NO: 10) , and SARAFDI (SEQ ID NO: 11) ; and a light chain variable (VL) domain that comprises (1) a CDR-L1 comprising KSSQSVLYAGNNRNYLA (SEQ ID NO: 12) ; (2) a CDR-L2 comprising QASTRAS (SEQ ID NO: 13) ; and (3) a CDR-L3 comprising QQYYTPPLA (SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to any one of SEQ ID NOs: 23-26, and / or the VL comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the heavy chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-4 and / or the light chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identity to SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the anti-CD47 antibody comprises a human IgG4 Fc region that comprises two human IgG4 Fc domain monomers, wherein each monomer comprises an S228P substitution (wherein the numbering of the residue is according to the EU numbering system) .

[0072] In some embodiments, the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) that specifically binds to human CD47 (hCD47) comprises: a heavy chain variable (VH) domain that comprises (1) a CDR-H1 comprising RAWMN (SEQ ID NO: 6) ; (2) a CDR-H2 comprising RIKRKTDGETTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 7) ; (3) a CDR-H3 comprising SSRAFDI (SEQ ID NO: 8) ; and a light chain variable (VL) domain that comprises (1) a CDR-L1 comprising KSSQSVLYAGNNRNYLA (SEQ ID NO: 12) ; (2) a CDR-L2 comprising QASTRAS (SEQ ID NO: 13) ; and (3) a CDR-L3 comprising QQYYTPPLA (SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 23, and the VL comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH comprises SEQ ID NO: 23, and the VL comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the heavy chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to SEQ ID NO: 1 and / or the light chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identity to SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the fragment is a Fab, a Fab’ , a F (ab) ’ 2, a Fab’ -SH, a single-chain Fv (scFv) , an Fv fragment, or a linear antibody. In some embodiments, the antibody or fragment thereof is a monoclonal antibody or fragment thereof. In some embodiments, the antibody or fragment thereof is chimeric or humanized. In some embodiments, the antibody or fragment binds to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell. In some embodiments, the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell promotes macrophage-mediated phagocytosis of the cancer cell. In some embodiments, the cancer cell is a HL60 cell, a RKO cell, an OCI-LY19 cell, a SK-OV-3 cell, a Toledo cell, a K562 cell, a HCC827 cell, a Jurkat cell, a U937 cell, a TF-1 cell, a Raji cell, a SU-DHL-4 cell, a MDA-MB-231 cell, an A375 cell, or a SK-MES-1 cell. In some embodiments, the cancer cell is a solid tumor cancer. In some embodiments, the solid tumor cancer is lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer. In some embodiments, the cancer cell is a hematological cancer. In some embodiments, the hematological cancer is non-Hodgkin lymphoma. In some embodiments, the antibody or fragment binds to hCD47 expressed on the surface of a blood cell at a lower level than that 5F9 (e.g., at a level that is at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%less at a concentration of about 1nM, 3.2nM, 10nM, 32nM, 100nM, 320nM, or 1000nM) . In some embodiments, the blood cell is an erythrocyte. In some embodiments, the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 prevents interaction of the hCD47 with signal-regulatory-protein α (SIRPα) (e.g., human SIRPα) . In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject does not cause a significant level of hemagglutination in the subject, depletion of the subject’s red blood cells, and / or depletion of the subject’s platelets. In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject causes a lower level of hemagglutination (at a level that is at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%lower) in the subject than 5F9. In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject causes the depletion of the subject’s red blood cells to a lesser degree (at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%lower) than 5F9. In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject causes the depletion of the subject’s platelet to a lesser degree (at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%lower) than 5F9. In some embodiments, the anti-CD47 antibody comprises a human IgG4 Fc region that comprises two human IgG4 Fc domain monomers, wherein each monomer comprises an S228P substitution (wherein the numbering of the residue is according to the EU numbering system) .

[0073] In some embodiments, the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) that specifically binds to human CD47 (hCD47) comprises a heavy chain variable (VH) domain that comprises (1) a CDR-H1 comprising RAWMN (SEQ ID NO: 6) ; (2) a CDR-H2 comprising RIKRKTDGETTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 7) ; (3) a CDR-H3 comprising SSYAFDI (SEQ ID NO: 9) ; and a light chain variable (VL) domain that comprises (1) a CDR-L1 comprising KSSQSVLYAGNNRNYLA (SEQ ID NO: 12) ; (2) a CDR-L2 comprising QASTRAS (SEQ ID NO: 13) ; and (3) a CDR-L3 comprising QQYYTPPLA (SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 24, and the VL comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH comprises SEQ ID NO: 24, and the VL comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the heavy chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to SEQ ID NO: 2 and / or the light chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identity to SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the fragment is a Fab, a Fab’ , a F (ab) ’ 2, a Fab’ -SH, a single-chain Fv (scFv) , an Fv fragment, or a linear antibody. In some embodiments, the antibody or fragment thereof is a monoclonal antibody or fragment thereof. In some embodiments, the antibody or fragment thereof is chimeric or humanized. In some embodiments, the antibody or fragment binds to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell. In some embodiments, the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell promotes macrophage-mediated phagocytosis of the cancer cell. In some embodiments, the cancer cell is a HL60 cell, a RKO cell, an OCI-LY19 cell, a SK-OV-3 cell, a Toledo cell, a K562 cell, a HCC827 cell, a Jurkat cell, a U937 cell, a TF-1 cell, a Raji cell, a SU-DHL-4 cell, a MDA-MB-231 cell, an A375 cell, or a SK-MES-1 cell. In some embodiments, the cancer cell is a solid tumor cancer. In some embodiments, the solid tumor cancer is lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer. In some embodiments, the cancer cell is a hematological cancer. In some embodiments, the hematological cancer is non-Hodgkin lymphoma. In some embodiments, the antibody or fragment binds to hCD47 expressed on the surface of a blood cell at a lower level than that 5F9 (e.g., at a level that is at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%less at a concentration of about 1nM, 3.2nM, 10nM, 32nM, 100nM, 320nM, or 1000nM) . In some embodiments, the blood cell is an erythrocyte. In some embodiments, the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 prevents interaction of the hCD47 with signal-regulatory-protein α (SIRPα) (e.g., human SIRPα) . In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject does not cause a significant level of hemagglutination in the subject, depletion of the subject’s red blood cells, and / or depletion of the subject’s platelets. In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject causes a lower level of hemagglutination (at a level that is at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%lower) in the subject than 5F9. In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject causes the depletion of the subject’s red blood cells to a lesser degree (at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%lower) than 5F9. In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject causes the depletion of the subject’s platelet to a lesser degree (at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%lower) than 5F9. In some embodiments, the anti-CD47 antibody comprises a human IgG4 Fc region that comprises two human IgG4 Fc domain monomers, wherein each monomer comprises an S228P substitution (wherein the numbering of the residue is according to the EU numbering system) .

[0074] In some embodiments, the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) that specifically binds to human CD47 (hCD47) comprises a heavy chain variable (VH) domain that comprises (1) a CDR-H1 comprising RAWMN (SEQ ID NO: 6) ; (2) a CDR-H2 comprising RIKRKTDGETTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 7) ; (3) a CDR-H3 comprising SAYAFDI (SEQ ID NO: 10) ; and a light chain variable (VL) domain that comprises (1) a CDR-L1 comprising KSSQSVLYAGNNRNYLA (SEQ ID NO: 12) ; (2) a CDR-L2 comprising QASTRAS (SEQ ID NO: 13) ; and (3) a CDR-L3 comprising QQYYTPPLA (SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 25, and the VL comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH comprises SEQ ID NO: 25, and the VL comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the heavy chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to SEQ ID NO: 3 and / or the light chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identity to SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the fragment is a Fab, a Fab’ , a F (ab) ’ 2, a Fab’ -SH, a single-chain Fv (scFv) , an Fv fragment, or a linear antibody. In some embodiments, the antibody or fragment thereof is a monoclonal antibody or fragment thereof. In some embodiments, the antibody or fragment thereof is chimeric or humanized. In some embodiments, the antibody or fragment binds to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell. In some embodiments, the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell promotes macrophage-mediated phagocytosis of the cancer cell. In some embodiments, the cancer cell is a HL60 cell, a RKO cell, an OCI-LY19 cell, a SK-OV-3 cell, a Toledo cell, a K562 cell, a HCC827 cell, a Jurkat cell, a U937 cell, a TF-1 cell, a Raji cell, a SU-DHL-4 cell, a MDA-MB-231 cell, an A375 cell, or a SK-MES-1 cell. In some embodiments, the cancer cell is a solid tumor cancer. In some embodiments, the solid tumor cancer is lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer. In some embodiments, the cancer cell is a hematological cancer. In some embodiments, the hematological cancer is non-Hodgkin lymphoma. In some embodiments, the antibody or fragment binds to hCD47 expressed on the surface of a blood cell at a lower level than that 5F9 (e.g., at a level that is at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%less at a concentration of about 1nM, 3.2nM, 10nM, 32nM, 100nM, 320nM, or 1000nM) . In some embodiments, the blood cell is an erythrocyte. In some embodiments, the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 prevents interaction of the hCD47 with signal-regulatory-protein α (SIRPα) (e.g., human SIRPα) . In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject does not cause a significant level of hemagglutination in the subject, depletion of the subject’s red blood cells, and / or depletion of the subject’s platelets. In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject causes a lower level of hemagglutination (at a level that is at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%lower) in the subject than 5F9. In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject causes the depletion of the subject’s red blood cells to a lesser degree (at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%lower) than 5F9. In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject causes the depletion of the subject’s platelet to a lesser degree (at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%lower) than 5F9. In some embodiments, the anti-CD47 antibody comprises a human IgG4 Fc region that comprises two human IgG4 Fc domain monomers, wherein each monomer comprises an S228P substitution (wherein the numbering of the residue is according to the EU numbering system) .

[0075] In some embodiments, the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) that specifically binds to human CD47 (hCD47) comprises: a heavy chain variable (VH) domain that comprises (1) a CDR-H1 comprising RAWMN (SEQ ID NO: 6) ; (2) a CDR-H2 comprising RIKRKTDGETTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 7) ; (3) a CDR-H3 comprising SARAFDI (SEQ ID NO: 11) ; and a light chain variable (VL) domain that comprises (1) a CDR-L1 comprising KSSQSVLYAGNNRNYLA (SEQ ID NO: 12) ; (2) a CDR-L2 comprising QASTRAS (SEQ ID NO: 13) ; and (3) a CDR-L3 comprising QQYYTPPLA (SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 26, and the VL comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH comprises SEQ ID NO: 26, and the VL comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof comprises an Fc domain (e.g., a human IgG Fc domain) , optionally wherein the human IgG Fc domain comprises or is an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc domain. In some embodiments, the antibody is a full-length antibody. In some embodiments, the full-length antibody comprises two heavy chains and two light chains. In some embodiments, the heavy chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to SEQ ID NO: 4 and / or the light chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identity to SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the fragment is a Fab, a Fab’ , a F (ab) ’ 2, a Fab’ -SH, a single-chain Fv (scFv) , an Fv fragment, or a linear antibody. In some embodiments, the antibody or fragment thereof is a monoclonal antibody or fragment thereof. In some embodiments, the antibody or fragment thereof is chimeric or humanized. In some embodiments, the antibody or fragment binds to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell. In some embodiments, the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell promotes macrophage-mediated phagocytosis of the cancer cell. In some embodiments, the cancer cell is a HL60 cell, a RKO cell, an OCI-LY19 cell, a SK-OV-3 cell, a Toledo cell, a K562 cell, a HCC827 cell, a Jurkat cell, a U937 cell, a TF-1 cell, a Raji cell, a SU-DHL-4 cell, a MDA-MB-231 cell, an A375 cell, or a SK-MES-1 cell. In some embodiments, the cancer cell is a solid tumor cancer. In some embodiments, the solid tumor cancer is lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer. In some embodiments, the cancer cell is a hematological cancer. In some embodiments, the hematological cancer is non-Hodgkin lymphoma. In some embodiments, the antibody or fragment binds to hCD47 expressed on the surface of a blood cell at a lower level than that 5F9 (e.g., at a level that is at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%less at a concentration of about 1nM, 3.2nM, 10nM, 32nM, 100nM, 320nM, or 1000nM) . In some embodiments, the blood cell is an erythrocyte. In some embodiments, the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 prevents interaction of the hCD47 with signal-regulatory-protein α(SIRPα) (e.g., human SIRPα) . In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject does not cause a significant level of hemagglutination in the subject, depletion of the subject’s red blood cells, and / or depletion of the subject’s platelets. In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject causes a lower level of hemagglutination (at a level that is at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%lower) in the subject than 5F9. In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject causes the depletion of the subject’s red blood cells to a lesser degree (at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%lower) than 5F9. In some embodiments, administration of the antibody or fragment thereof to a subject causes the depletion of the subject’s platelet to a lesser degree (at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%lower) than 5F9. In some embodiments, the anti-CD47 antibody comprises a human IgG4 Fc region that comprises two human IgG4 Fc domain monomers, wherein each monomer comprises an S228P substitution (wherein the numbering of the residue is according to the EU numbering system) .

[0076] In some embodiments, the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) binds to (e.g., cross-reacts with) CD47 from at least two different species. In some embodiments, for example, the anti-CD47 antibody (or antibody variant) binds to a hCD47 protein (or the extracellular domain thereof) and a CD47 (or the extracellular domain thereof) from a non-human primate (such as a cynomolgus or rhesus monkey) . In some embodiments, the anti-CD47 antibody may be completely specific for human CD47 and may not exhibit species or other types of non-human cross-reactivity.

[0077] The anti-CD47 antibody that binds specifically to hCD47 can be of any of the various types of antibodies as defined above, but is, in certain embodiments, a human, humanized, or chimeric antibody. In some embodiments, the anti-CD47 antibody is a human antibody. In some embodiments, the anti-CD47 is a humanized antibody or comprises a human antibody constant domain (e.g., a human Fc domain, such as a human IgG Fc domain, e.g., a human IgG1, a human IgG2, a human IgG3, or a human IgG4 Fc domain) . In some embodiments, an antibody of the present disclosure is a chimeric antibody. See, e.g., U.S. Patent No. 4,816,567 and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984) . In some embodiments, a chimeric antibody comprises a non-human variable region (e.g., a variable region derived from a chicken, mouse, rat, hamster, rabbit, or non-human primate, such as a monkey) and a human constant region. In some embodiments, a chimeric antibody is a “class switched” antibody in which the class or subclass has been changed from that of the parent antibody. Chimeric antibodies include antigen-binding fragments thereof.

[0078] In some embodiments, a chimeric antibody is a humanized antibody. A non-human antibody can be humanized to reduce immunogenicity to humans, while retaining the specificity and affinity of the parental non-human antibody. Generally, a humanized antibody comprises one or more variable domains in which HVRs, e.g., CDRs, (or portions thereof) are derived from a non-human antibody (e.g., a chicken antibody) , and FRs (or portions thereof) are derived from human antibody sequences. A humanized antibody optionally will also comprise at least a portion of a human constant region. In some embodiments, some FR residues in a humanized antibody are substituted with corresponding residues from a non-human antibody (e.g., the antibody from which the HVR or CDR residues are derived) , e.g., to restore or improve antibody specificity or affinity. Humanized antibodies and methods of making them are reviewed, e.g., in Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008) .

[0079] Human framework regions useful for humanization include but are not limited to: framework regions selected using the “best-fit” method; framework regions derived from the consensus sequence of human antibodies of a particular subgroup of light or heavy chain variable regions; human somatically mutated framework regions or human germline framework regions; and framework regions derived from screening FR libraries. See, e.g., Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993) ; Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992) ; Presta et al. J. Immunol., 151: 2623 (1993) ; Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008) ; and Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) .

[0080] In some embodiments, an anti-CD47 antibody of the present disclosure is a human antibody. Human antibodies can be produced using various techniques known in the art. In some embodiments, the human antibody is produced by a non-human animal, such as the genetically engineered chickens (see, e.g., US Pat. Nos. 8, 592, 644; and 9, 380, 769) and / or mice described herein. Human antibodies are described generally in Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008) .

[0081] In some embodiments, an anti-CD47 antibody of the present disclosure is an antibody fragment, including without limitation a Fab, F (ab’ ) 2, Fab’ -SH, Fv, or scFv fragment, or a single domain, single heavy chain, or single light chain antibody. Antibody fragments can be generated, e.g., by enzymatic digestion or by recombinant techniques. In some embodiments, Proteolytic digestion of an intact antibody is used to generate an antibody fragment, e.g., as described in Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) and Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) . In some embodiments, an antibody fragment is produced by a recombinant host cell. For example, Fab, Fv and ScFv antibody fragments are expressed by and secreted from E. coli. Antibody fragments can alternatively be isolated from an antibody phage library.

[0082] Fab'-SH fragments can be directly recovered from E. coli and chemically coupled to form F (ab') 2 fragments. See Carter et al., Bio / Technology 10: 163-167 (1992) . F (ab') 2 fragments can also be isolated directly from a recombinant host cell culture. Fab and F (ab') 2 fragment with increased in vivo half-life comprising salvage receptor binding epitope residues are described in U.S. Pat. No. 5, 869, 046.

[0083] In some embodiments, an antibody is a single chain Fv fragment (scFv) . See WO 93 / 16185 and U.S. Pat. Nos. 5,571,894 and 5,587,458. scFv fusion proteins can be constructed to produce a fusion of an effector protein at either the amino or the carboxy terminus of an scFv. The antibody fragment may also be a “linear antibody” , e.g., as described in U.S. Pat. No. 5,641,870, for example. Such linear antibodies may be monospecific or bispecific.

[0084] In some embodiments, the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) specifically recognizes (such as binds) to hCD47 expressed on the surface of a cell. In some embodiments, the anti-CD47 antibody specifically recognizes hCD47 expressed on the surface of a cancer cell. In some embodiments, the anti-CD47 antibody specifically recognizes hCD47 expressed on the cell surface of a cancer cell line including, but not limited to, e.g. HL-60, RKO, SK-OV-3, Toledo, K562, HCC827, Jurkat, U937, TF-1, Raji, SU-DHL-4, MDA-MB-231, A375, and SK-MES-1 cell lines. In some embodiments, the anti-CD47 antibody specifically recognizes hCD47 expressed on the cell surface of cancer cells in a subject (e.g., lung cancer cells, an ovarian cancer cells, colorectal cancer cells, pancreatic cancer cells, sarcoma cancer cells, head and neck cancer cells, gastric cancer cells, renal cancer cells, skin cancer cells, and non-Hodgkin lymphoma cells) . In some embodiments, the binding of an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) described herein to hCD47 (e.g., hCD47 expressed on the surface of a cell) prevents the interaction of hCD47 with signal regulatory protein alpha (SIRPα) , such as human SIRPα ( “hSIRPα” ) . In some embodiments, the binding of an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) described herein to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell promotes macrophage mediated phagocytosis of the cancer cell. In some embodiments, the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof does not bind to hCD47 expressed on the surface of a blood cell. In some embodiments, the administration of an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) described herein to a subject (e.g., a human or non-human primate) does not induce or cause significant hematological toxicity (e.g., anemia, cytopenia, or hemagglutination) in the subject or significant depletion of the subject’s red blood cells. In some embodiments, the administration of an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) described herein to a subject (e.g., a human or non-human primate) does not induce or cause hematological toxicity (e.g., anemia, cytopenia, or hemagglutination) in the subject or depletion of the subject’s red blood cells or platelets. Nucleic Acids Encoding Anti-CD47 Antibodies

[0085] Nucleic acid molecules encoding the anti-CD47 antibodies (or immunologically active fragments thereof) described herein are also contemplated. In some embodiments, provided is a nucleic acid (or a set of nucleic acids) encoding an anti-CD47 antibody, including any of the anti-CD47 antibodies described herein. In some embodiments, the nucleic acid sequence (s) (such as a DNA sequence (s) ) encoding an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) have been optimized (such as further optimized) to maximize translation and stability of an RNA transcribed from the nucleic acid (s) , e.g., for the purpose of increasing production yield of the anti-CD47 antibody during the manufacturing process. Exemplary optimizations include, but are not limited to, e.g., removing repeated sequences, removing killer motifs and splice sites, reducing GC content (guanine-cytosine content) , removing / replacing sequences that may form mRNA secondary structures or unstable motifs, and / or optimizing of codon usage in a given host cell (e.g., a CHO cell, such as a CHO-K1 cell) . Codon optimization is a process used to improve gene expression and increase the translational efficiency of a nucleic acid of interest by accommodating codon bias and tRNA frequency of the host organism. In some embodiments, the nucleic acid (s) encoding an anti-CD47 antibody described herein has been codon-optimized, e.g., codon-optimized for expression in a CHO cell (such as a CHO-K1 cell) .

[0086] In some embodiments, a nucleic acid encoding the VH domain of an anti-CD47 antibody provided herein comprises a polynucleotide that encodes an amino acid sequence having at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 23-26. In some embodiments, a nucleic acid encoding the VL domain of an anti-CD47 antibody provided herein comprises a polynucleotide that encodes an amino acid sequence having at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO:27.

[0087] In some embodiments, a nucleic acid encoding the heavy chain of an anti-CD47 antibody provided herein comprises a polynucleotide that encodes an amino acid sequence having at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 1-4. In some embodiments, a nucleic acid encoding the light chain of an anti-CD47 antibody provided herein comprises a polynucleotide that encodes an amino acid sequence having at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 5.

[0088] In some embodiments, the nucleic acid (or set of nucleic acids) encoding an anti-CD47 antibody described herein may further comprises a nucleic acid sequence encoding a peptide tag (such as protein purification tag, e.g., His-tag, HA tag) . In some embodiments, the nucleic acid (or set of nucleic acids) encoding an anti-CD47 antibody (or an immunologically active fragment thereof) comprises a leader sequence. In some embodiments, provided are nucleic acids comprising nucleotide sequences that hybridize to the nucleic acid sequences encoding an anti-CD47 antibody described herein under at least moderately stringent hybridization conditions.

[0089] Also provided are vectors in which a nucleic acid described herein is inserted.

[0090] In brief summary, the expression of an anti-CD47 antibody (or antigen binding fragment thereof) by a natural or synthetic nucleic acid encoding the anti-CD47 antibody (or antigen binding fragment thereof) can be achieved by inserting the nucleic acid into an appropriate expression vector, such that the nucleic acid is operably linked to 5’a nd 3’ regulatory elements, including for example a promoter (e.g., a constitutive, regulatable, tissue-specific promoter) and a 3’ untranslated region (UTR) . The vectors can be suitable for replication and integration in eukaryotic host cells. Typical cloning and expression vectors contain transcription and translation terminators, initiation sequences, and promoters useful for regulation of the expression of the desired nucleic acid sequence.

[0091] The nucleic acid can be cloned into a number of types of vectors. For example, the nucleic acid can be cloned into a vector including, but not limited to a plasmid, a phagemid, a phage derivative, an animal virus, and a cosmid. Vectors of particular interest include expression vectors, replication vectors, probe generation vectors, and sequencing vectors.

[0092] Further, the expression vector may be provided to a cell in the form of a viral vector. Viral vector technology is well known in the art and is described, for example, in Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) , and in other virology and molecular biology manuals. Viruses which are useful as vectors include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, and lentiviruses. In general, a suitable vector contains an origin of replication functional in at least one organism, a promoter sequence, convenient restriction endonuclease sites, and one or more selectable markers (see, e.g., WO 01 / 96584; WO 01 / 29058; and U.S. Pat. No. 6,326,193) .

[0093] A number of viral based systems have been developed for gene transfer into mammalian cells. For example, retroviruses provide a convenient platform for gene delivery systems. A selected gene can be inserted into a vector and packaged in retroviral particles using techniques known in the art. The recombinant virus can then be isolated and delivered to cells of the subject either in vivo or ex vivo. A number of retroviral systems are known in the art. In some embodiments, adenovirus vectors are used. A number of adenovirus vectors are known in the art. In some embodiments, lentivirus vectors are used. Vectors derived from retroviruses such as the lentivirus are suitable tools to achieve long-term gene transfer since they allow long-term, stable integration of a transgene and its propagation in daughter cells. Lentiviral vectors have the added advantage over vectors derived from onco-retroviruses such as murine leukemia viruses in that they can transduce non-proliferating cells, such as hepatocytes. They also have the added advantage of low immunogenicity.

[0094] Additional promoter elements, e.g., enhancers, regulate the frequency of transcriptional initiation. Typically, these are located in the region 30-110 base pairs (bp) upstream of the start site, although a number of promoters have recently been shown to contain functional elements downstream of the start site as well. The spacing between promoter elements frequently is flexible, so that promoter function is preserved when elements are inverted or moved relative to one another. In the thymidine kinase (tk) promoter, the spacing between promoter elements can be increased to 50 bp apart before activity begins to decline.

[0095] One example of a suitable promoter is the immediate early cytomegalovirus (CMV) promoter sequence. This promoter sequence is a strong constitutive promoter sequence capable of driving high levels of expression of any polynucleotide sequence operatively linked thereto. Another example of a suitable promoter is Elongation Growth Factor-1α (EF-1α) . However, other constitutive promoter sequences may also be used, including, but not limited to the simian virus 40 (SV40) early promoter, mouse mammary tumor virus (MMTV) , human immunodeficiency virus (HIV) long terminal repeat (LTR) promoter, MoMuLV promoter, an avian leukemia virus promoter, an Epstein-Barr virus immediate early promoter, a Rous sarcoma virus promoter, as well as human gene promoters such as, but not limited to, the actin promoter, the myosin promoter, the hemoglobin promoter, and the creatine kinase promoter. Further, the application should not be limited to the use of constitutive promoters. Inducible promoters are also contemplated as part of the application. The use of an inducible promoter provides a molecular switch capable of turning on expression of the polynucleotide sequence which it is operatively linked when such expression is desired, or turning off the expression when expression is not desired. Examples of inducible promoters include, but are not limited to a metallothionine promoter, a glucocorticoid promoter, a progesterone promoter, and a tetracycline promoter.

[0096] In some embodiments, the expression of the nucleic acid (s) encoding the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) is inducible. In some embodiments, the nucleic acid (s) encoding the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) is operably linked to an inducible promoter, including any inducible promoter known in the art. In some embodiments, the nucleic acid (s) encoding the an anti-CD47 antibody described herein has been engineered to encode an epitope tag, e.g., to facilitate purification or detection of the antibody. Exemplary epitope tags include, but are not limited to, e.g., 6x His (also known as His-tag or hexahistidine tag) , FLAG, HA, Myc, V5, GFP (green fluorescent protein, e.g., enhanced green fluorescent protein or EGFP) , GST (glutathione-S-transferase) , β-GAL (β-galactosidase) , Luciferase, MBP (Maltose Binding Protein) , RFP (Red Fluorescence Protein) , and VSV-G (Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein) . Methods of Antibody Production

[0097] An anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) of the present disclosure may be produced by any means known in the art. Exemplary techniques for antibody production are described below; however these exemplary techniques are provided for illustrative purposes only and are not intended to be limiting. In addition, exemplary antibody properties contemplated for use with the antibodies described herein are further described.

[0098] To prepare an antigen, the antigen may be purified or otherwise obtained from a natural source, or it may be expressed using recombinant techniques. In some embodiments, the antigen may be used as a soluble protein. In some embodiments, the antigen may be conjugate to another polypeptide or other moiety, e.g., to increase its immunogenicity. For example, an antigen described herein may be coupled with an Fc region. In some embodiments, a cell expressing the antigen on its cell surface may be used as the antigen.

[0099] Polyclonal antibodies can be raised in an animal by multiple subcutaneous (sc) or intraperitoneal (ip) injections of the antigen and an adjuvant. For example, descriptions of chicken immunization are described herein. In some embodiments, the antigen is conjugated with an immunogenic protein, e.g., keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, or soybean trypsin inhibitor using a bifunctional or derivatizing agent. Exemplary methods for immunization of chickens are provided herein. Relevant methods suitable for a variety of other organisms, such as mammals, are well known in the art.

[0100] As described supra, monoclonal antibodies may be produced by a variety of methods. In some embodiments, a monoclonal antibody of the present disclosure is made using the hybridoma method first described by Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975) , and further described in Hongo et al., Hybridoma, 14 (3) : 253-260 (1995) ; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) ; and Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981) . Human hybridoma technology (Trioma technology) is described in Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3) : 927-937 (2005) and Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (3) : 185-91 (2005) . A culture medium in which hybridoma cells are grown may be screened for the presence of an antibody of interest, e.g., by in vitro binding assay, immunoprecipitation, ELISA, RIA, etc. ; and the binding affinity may be determined, e.g., by Scatchard analysis. A hybridoma that produces an antibody with desired binding properties can be subcloned and grown using known culture techniques, grown in vivo as ascites tumors in an animal, and the like.

[0101] In some embodiments, a monoclonal antibody is made using a library method, such as a phage display library. See, e.g., Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) . In some embodiments, repertoires of VH and VL genes are cloned by polymerase chain reaction (PCR) and recombined randomly in phage libraries, which are then screened for antigen-binding phage, e.g., as described in Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994) . Phage typically display antibody fragments, either as single-chain Fv (scFv) fragments or as Fab fragments. Alternatively, the naive repertoire can be cloned (e.g., from human) to provide a single source of antibodies to a wide range of non-self and also self-antigens without any immunization as described by Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993) . Finally, naive libraries can also be made synthetically by cloning unrearranged V-gene segments from stem cells, and using PCR primers containing random sequence to encode the highly variable CDR3 regions and to accomplish rearrangement in vitro, as described by Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992) .

[0102] Antibodies can be produced using recombinant methods. For recombinant production of an anti-antigen antibody, nucleic acid encoding the antibody is isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (amplification of the DNA) or for expression. DNA encoding the antibody may be readily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., by using oligonucleotide probes that are capable of binding specifically to genes encoding the heavy and light chains of the antibody) . Many vectors are available. The vector components generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence.

[0103] An antibody of the present disclosure can be produced recombinantly as a fusion polypeptide with a heterologous polypeptide, e.g., a signal sequence or other polypeptide having a specific cleavage site at the N-terminus of the mature protein or polypeptide. The heterologous signal sequence selected can be one that is recognized and processed (e.g., cleaved by a signal peptidase) by the host cell. For prokaryotic host cells that do not recognize and process a native antibody signal sequence, the signal sequence is substituted by a prokaryotic signal sequence selected, for example, from alkaline phosphatase, penicillinase, lpp, or heat-stable enterotoxin II leaders. For yeast secretion the native signal sequence may be substituted by, e.g., the yeast invertase leader, a factor leader (including Saccharomyces and Kluyveromyces α-factor leaders) , or acid phosphatase leader, the C. albicans glucoamylase leader, etc. In mammalian cell expression, mammalian signal sequences as well as viral secretory leaders, for example, the herpes simplex gD signal, are available.

[0104] Both expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells, e.g., to allow the vector to replicate independently of the host chromosomal DNA. This sequence can include origins of replication or autonomously replicating sequences. Such sequences are well known for a variety of bacteria, yeast, and viruses. Generally, the origin of replication component is not needed for mammalian expression vectors (the SV40 origin may be used because it contains the early promoter) .

[0105] Expression and cloning vectors can contain a selection gene or selectable marker. Typical selection genes encode proteins that (a) confer resistance to antibiotics or other toxins, e.g., ampicillin, neomycin, methotrexate, or tetracycline, (b) complement auxotrophic deficiencies, or (c) supply critical nutrients not available from complex media. Examples of dominant selection use the drugs neomycin, mycophenolic acid and hygromycin. Another example of suitable selectable markers for mammalian cells are those that enable the identification of cells competent to take up antibody-encoding nucleic acid, such as DHFR, glutamine synthetase (GS) , thymidine kinase, metallothionein-I and -II, preferably primate metallothionein genes, adenosine deaminase, ornithine decarboxylase, and the like. For example, a Chinese hamster ovary (CHO) cell line deficient in endogenous DHFR activity transformed with the DHFR gene is identified by culturing the transformants in a culture medium containing methotrexate (Mtx) , a competitive antagonist of DHFR.

[0106] Alternatively, host cells (particularly wild-type hosts that contain endogenous DHFR) transformed or co-transformed with DNA sequences encoding an antibody of interest, wild-type DHFR gene, and another selectable marker such as aminoglycoside 3'-phosphotransferase (APH) can be selected by cell growth in medium containing a selection agent for the selectable marker such as an aminoglycosidic antibiotic, e.g., kanamycin, neomycin, or G418.

[0107] Expression and cloning vectors generally contain a promoter that is recognized by the host organism and is operably linked to nucleic acid encoding an antibody. Promoters suitable for use with prokaryotic hosts include the phoA promoter, β-lactamase and lactose promoter systems, alkaline phosphatase promoter, a tryptophan (trp) promoter system, and hybrid promoters such as the tac promoter. However, other known bacterial promoters are suitable. Promoter sequences are known for eukaryotes. Yeast promoters are well known in the art and can include inducible promoters / enhancers regulated by growth conditions. Virtually all eukaryotic genes have an AT-rich region located approximately 25 to 30 bases upstream from the site where transcription is initiated. Examples include without limitation the promoters for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, triosephosphate isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase. Antibody transcription from vectors in mammalian host cells can be controlled, for example, by promoters obtained from the genomes of viruses. The early and late promoters of the SV40 virus are conveniently obtained as an SV40 restriction fragment that also contains the SV40 viral origin of replication. The immediate early promoter of the human cytomegalovirus is conveniently obtained as a HindIII E restriction fragment. Alternatively, the Rous Sarcoma Virus long terminal repeat can be used as the promoter.

[0108] Transcription of a DNA encoding an antibody of this application by higher eukaryotes is often increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Many enhancer sequences are now known from mammalian genes (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein, and insulin) . Typically, however, one will use an enhancer from a eukaryotic cell virus.

[0109] Expression vectors used in eukaryotic host cells (yeast, fungi, insect, plant, animal, human, or nucleated cells from other multicellular organisms) will also contain sequences necessary for the termination of transcription and for stabilizing the mRNA.

[0110] Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors herein are the prokaryote, yeast, or higher eukaryote cells described above. Suitable prokaryotes for this purpose include eubacteria, such as Gram-negative or Gram-positive organisms, for example, Enterobacteriaceae such as Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans, and Shigella, etc. In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for antibody-encoding vectors. Saccharomyces cerevisiae, or common baker's yeast, is the most commonly used among lower eukaryotic host microorganisms. Certain fungi and yeast strains may be selected in which glycosylation pathways have been “humanized, ” resulting in the production of an antibody with a partially or fully human glycosylation pattern. See, e.g., Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006) .

[0111] Plant cell cultures of cotton, corn, potato, soybean, petunia, tomato, duckweed (Leninaceae) , alfalfa (M. truncatula) , and tobacco can also be utilized as hosts.

[0112] Suitable host cells for the expression of glycosylated antibody are also derived from multicellular organisms (invertebrates and vertebrates) . Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculoviral strains and variants and corresponding permissive insect host cells from hosts such as Spodoptera frugiperda (caterpillar) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (fruitfly) , and Bombyx mori have been identified.

[0113] Vertebrate cells may be used as hosts, and propagation of vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a routine procedure. Examples of useful mammalian host cell lines are monkey kidney CV1 line transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; human embryonic kidney line (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977) ) ; baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10) ; mouse sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980) ) ; monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70) ; African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2) ; canine kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34) ; buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; human lung cells (W138, ATCC CCL 75) ; human liver cells (Hep G2, HB 8065) ; mouse mammary tumor (MMT 060562, ATCC CCL51) ; TRI cells (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982) ) ; MRC 5 cells; FS4 cells; and a human hepatoma line (Hep G2) . Other useful mammalian host cell lines include Chinese hamster ovary (CHO) cells, including DHFR-CHO cells (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980) ) ; and myeloma cell lines such as NS0 and Sp2 / 0. For a review of certain mammalian host cell lines suitable for antibody production, see, e.g., Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N. J., 2003) , pp. 255-268. In some embodiments, the host cell is a CHO-K1 cell. The CHO-K1 cell line is a subclone of CHO cell line (see, e.g., www (dot) phe-culturecollections (dot) org (dot) uk / media / 128263 / chok1-cell-line-profile (dot) pdf and web (dot) expasy (dot) org / cellosaurus / CVCL_0214.

[0114] The host cells of the present disclosure (e.g., a CHO-K1 cell) may be cultured in a variety of media. Commercially available media such as Ham's F10 (Sigma) , Minimal Essential Medium ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , and Dulbecco's Modified Eagle's Medium ( (DMEM) , Sigma) are suitable for culturing the host cells. In addition, any of the media described in Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979) , Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980) , U.S. Pat. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; or 5,122,469; WO 90 / 03430; WO 87 / 00195; or U.S. Pat. Re. 30, 985 may be used as culture media for the host cells. Any of these media may be supplemented as necessary with hormones and / or other growth factors (such as insulin, transferrin, or epidermal growth factor) , salts (such as sodium chloride, calcium, magnesium, and phosphate) , buffers (such as HEPES) , nucleotides (such as adenosine and thymidine) , antibiotics (such as GENTAMYCINTM drug) , trace elements (defined as inorganic compounds usually present at final concentrations in the micromolar range) , and glucose or an equivalent energy source. Any other necessary supplements may also be included at appropriate concentrations that would be known to those skilled in the art. The culture conditions, such as temperature, pH, and the like, are those previously used with the host cell selected for expression, and will be apparent to one of skill in the art.

[0115] When using recombinant techniques, the antibody can be produced intracellularly, in the periplasmic space, or directly secreted into the medium. If the antibody is produced intracellularly, as a first step, the particulate debris, either host cells or lysed fragments, are removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration. Carter et al., Bio / Technology 10: 163-167 (1992) describe a procedure for isolating antibodies which are secreted to the periplasmic space of E. coli.

[0116] The antibody composition prepared from the cells can be purified using, for example, hydroxylapatite chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel electrophoresis, dialysis, and affinity chromatography, with affinity chromatography being among one of the typically preferred purification steps. In some embodiments, an anti-CD47 antibody described herein comprises an epitope tag (e.g., a tag attached to the antibody via a cleavable linker) to facilitate purification. Exemplary epitope tags include, but are not limited to, e.g., , e.g., 6x His (also known as His-tag or hexahistidine tag) , FLAG, HA, Myc, V5, GFP (green fluorescent protein, e.g., enhanced green fluorescent protein or EGFP) , GST (glutathione-S-transferase) , β-GAL (β-galactosidase) , Luciferase, MBP (Maltose Binding Protein) , RFP (Red Fluorescence Protein) , and VSV-G (Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein.

[0117] Thus, in some embodiments, provided is a method of making an anti-CD47 antibody (or an immunologically active fragment thereof) that comprises a heavy chain variable (VH) domain that comprises (1) a CDR-H1 comprising RAWMN (SEQ ID NO: 6) ; (2) a CDR-H2 comprising RIKRKTDGETTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 7) ; (3) a CDR-H3 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SSRAFDI (SEQ ID NO: 8) , SSYAFDI (SEQ ID NO: 9) , SAYAFDI (SEQ ID NO: 10) , and SARAFDI (SEQ ID NO: 11) ; and a light chain variable (VL) domain that comprises (1) a CDR-L1 comprising KSSQSVLYAGNNRNYLA (SEQ ID NO: 12) ; (2) a CDR-L2 comprising QASTRAS (SEQ ID NO: 13) ; and (3) a CDR-L3 comprising QQYYTPPLA (SEQ ID NO: 14) , the method comprising: a) culturing a host cell (such as a CHO cell) that comprises a nucleic acid that encodes the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) under conditions effective to cause expression of the antibody (or fragment) ; and b) recovering the anti-CD47 antibody (or fragment thereof) expressed by the host cell. In some embodiments, the method further comprises the step of c) purifying the antibody. In some embodiments, purifying the anti-CD47 antibody comprises at least one chromatography step, such as a Protein A or Protein L chromatography step. In some embodiments the host cell is a mammalian cell. In some embodiments, the host cell is a CHO cell, e.g., a CHO-K1 cell. In some embodiments the host cell comprises one or more vectors that encode the anti-CD47 antibody. In some embodiments, the host cell has been transfected (e.g., transiently transfected or stably transfected) with nucleic acid (s) that encode the anti-CD47 antibody. In some embodiments, the method of making an anti-CD47 antibody is a manufacturing-scale production process (such as a fermentation process) . In some embodiments, a “manufacturing-scale” production process (e.g., fermentation process) of making an anti-CD47 antibody entails culturing and growing the host cell in a culture volume ranging between about 400L to about 80, 000 L (such as between about 400 L to about 25, 000 L, e.g., about any one of 4, 000 L, 6, 000 L, 8, 000 L, 10, 000 L, 12, 000 L, 14, 000 L, or 16, 000 L) . Glycosylation Variants

[0118] In some embodiments, an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) provided herein is altered to increase or decrease the extent to which the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) is glycosylated. Addition or deletion of glycosylation sites to an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) may be conveniently accomplished by altering the amino acid sequence of the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) or polypeptide portion thereof such that one or more glycosylation sites is created or removed.

[0119] Where the anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) comprises an Fc region, the carbohydrate attached thereto may be altered. Native antibodies produced by mammalian cells typically comprise a branched, biantennary oligosaccharide that is generally attached by an N-linkage to Asn297 of the CH2 domain of the Fc region. See, e.g., Wright et al., TIBTECH 15: 26-32 (1997) . The oligosaccharide may include various carbohydrates, e.g., mannose, N-acetyl glucosamine (GlcNAc) , galactose, and sialic acid, as well as a fucose attached to a GlcNAc in the “stem” of the biantennary oligosaccharide structure. In some embodiments, modifications of the oligosaccharide in an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) herein may be made in order to create anti-CD47 antibody variants (or immunologically active fragments thereof comprising an Fc region) with certain improved properties.

[0120] The N-glycans attached to the CH2 domain of Fc is heterogeneous. Antibodies or Fc fusion proteins generated in CHO cells are fucosylated by fucosyltransferase activity. See Shoji-Hosaka et al., J. Biochem. 2006, 140: 777-83. Normally, a small percentage of naturally occurring afucosylated IgGs may be detected in human serum. N-glycosylation of the Fc is important for binding to FcγR; and afucosylation of the N-glycan increases Fc's binding capacity to FcγRIIIa. Increased FcγRIIIa binding can enhance ADCC, which can be advantageous in certain antibody therapeutic applications in which cytotoxicity is desirable.

[0121] In some embodiments, an enhanced effector function can be detrimental when Fc-mediated cytotoxicity is undesirable. In some embodiments, the Fc fragment or CH2 domain is not glycosylated. In some embodiments, the N-glycosylation site in the CH2 domain is mutated to prevent from glycosylation.

[0122] In some embodiments, anti-CD47 antibody variants (or immunologically active fragments thereof) are provided comprising an Fc region wherein a carbohydrate structure attached to the Fc region has reduced fucose or lacks fucose, which may improve ADCC function. Immunoconjugates and Covalent Modifications

[0123] The application also pertains to immunoconjugates comprising an antibody conjugated to second moiety. In some embodiments, the second moiety is a cytotoxic agent such as a chemotherapeutic agent, toxin (e.g., an enzymatically active toxin of bacterial, fungal, plant, or animal origin, or fragments thereof) , or a radioactive isotope (i.e., a radioconjugate) .

[0124] Enzymatically active toxins and fragments thereof that can be used include diphtheria A chain, nonbinding active fragments of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa) , ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii proteins, dianthin proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S) , momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin, and the tricothecenes. A variety of radionuclides are available for the production of radioconjugated antibodies. Examples include 212Bi, 131I, 131In, 90Y, and 186Re. Exemplary chemotherapeutic agents useful in the generation of such immunoconjugates are described elsewhere herein.

[0125] In certain embodiments, a humanized anti-CD47 antibody provided herein (or an antigen-binding fragment thereof) is conjugated to maytansine, a maytansinoid, or calicheamicin. In certain embodiments, a humanized anti-CD47 antibody provided herein (or an antigen-binding fragment thereof) is conjugated to the maytansinoid DM1.

[0126] Conjugates of the antibody and cytotoxic agent are made using a variety of bifunctional protein-coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP) , iminothiolane (IT) , bifunctional derivatives of imidoesters (such as dimethyl adipimidate HCl) , active esters (such as disuccinimidyl suberate) , aldehydes (such as glutaraldehyde) , bis-azido compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine ) , bisdiazonium derivatives (such as bis-(p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine ) , diisocyanates (such as tolyene 2, 6-diisocyanate) , and bis-active fluorine compounds (such as 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenzene) . For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987) . Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an exemplary chelating agent for conjugation of radionucleotide to the antibody. See, WO94 / 11026.

[0127] In another embodiment, the antibody can be conjugated to a “receptor” (such as streptavidin) for utilization in tumor pre-targeting wherein the antibody-receptor conjugate is administered to the patient, followed by removal of unbound conjugate from the circulation using a clearing agent and then administration of a “ligand” (e.g., avidin) that is conjugated to a cytotoxic agent (e.g., a radionucleotide) .

[0128] Also provided are heteroconjugate antibodies comprising a humanized anti-CD47 antibody described herein covalently joined to at least one other antibody. Heteroconjugate antibodies have, for example, been proposed to target immune-system cells to unwanted cells (U.S. Patent No. 4,676,980) , and for treatment of HIV infection. Heteroconjugate antibodies comprising a humanized anti-CD47 antibody described herein can be prepared in vitro using known methods in synthetic protein chemistry, including those involving crosslinking agents. For example, immunotoxins can be constructed using a disulfide-exchange reaction or by forming a thioether bond. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimidate and those disclosed, for example, in U.S. Patent No. 4,676,980.

[0129] Also provided is a humanized anti-CD47 antibody comprising at least one covalent modification. One type of covalent modification includes reacting targeted amino acid residues of a humanized anti-CD47 with an organic derivatizing agent that is capable of reacting with selected side chains or the N-or C-terminal residues of the antibody. Commonly used crosslinking agents include, but are not limited to, e.g., 1, 1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters, for example, esters with 4-azidosalicylic acid, homobifunctional imidoesters, including disuccinimidyl esters such as 3, 3'-dithiobis (succinimidyl-propionate) , bifunctional maleimides such as bis-N-maleimido-1, 8-octane and agents such as methyl-3- [ (p-azidophenyl) -dithio] propioimidate.

[0130] Other modifications include deamidation of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, respectively, hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of hydroxyl groups of seryl or threonyl residues, methylation of the α-amino groups of lysine, arginine, and histidine side chains [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman &Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983) ] , acetylation of the N-terminal amine, and amidation of any C-terminal carboxyl group.

[0131] Another type of covalent modification comprises linking a humanized anti-CD47 antibody provided herein (or an antigen-binding fragment thereof) to one of a variety of nonproteinaceous polymers, e.g., polyethylene glycol (PEG) , polypropylene glycol, or polyoxyalkylenes, in the manner set forth in U.S. Patent Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 or 4,179,337. Cysteine Engineered Variants

[0132] In some embodiments, it may be desirable to create cysteine engineered anti-CD47 antibodies in which one or more amino acid residues are substituted with cysteine residues. In some embodiments, the substituted residues occur at accessible sites of the anti-CD47 antibody. By substituting those residues with cysteine, reactive thiol groups are thereby positioned at accessible sites of the anti-CD47 antibody and may be used to conjugate the anti-CD47 antibody to other moieties, such as drug moieties or linker-drug moieties, to create an anti-CD47 immunoconjugate, as described further herein. Cysteine engineered anti-CD47 antibodies may be generated as described, e.g., in U.S. Pat. No. 7,521,541. Effector Function Engineering

[0133] It may be desirable to modify an anti-CD47 antibody provided herein with respect to effector function, so as to enhance, e.g., the effectiveness of the antibody in treating cancer. For example, cysteine residue (s) can be introduced into the Fc region, thereby allowing inter-chain disulfide bond formation in this region. The homodimeric antibody thus generated can have improved internalization capability and / or increased complement-mediated cell killing and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) . See, Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shapes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992) . Homodimeric antibodies with enhanced anti-tumor activity can also be prepared using heterobifunctional cross-linkers as described in Wolff et al., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993) . Alternatively, an antibody can be engineered to comprise usual Fc regions and can thereby have enhanced complement lysis and ADCC capabilities. See, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design3: 219-230 (1989) .

[0134] Mutations or alterations in the Fc region sequences can be made to improve FcR binding (e.g., binding to FcγR, FcRn) . In some embodiments, an anti-CD47 antibody provided herein comprises at least one altered effector function, e.g., altered ADCC, CDC, and / or FcRn binding compared to a native IgG or a parent antibody. In some embodiments, the effector function of the antibody comprising the mutation or alteration is increased relative to the parent antibody. In some embodiments, the effector function of the antibody comprising the mutation or alteration is decreased relative to the parent antibody. Examples of several useful specific mutations are described in, e.g., Shields, RL et al. (2001) JBC 276 (6) 6591-6604; Presta, L. G., (2002) Biochemical Society Transactions 30 (4) : 487-490; and WO 00 / 42072.

[0135] In some embodiments, an anti-CD47 antibody provided herein comprises an Fc receptor mutation, e.g., a substitution mutation at least one position of the Fc region. Such substitution mutation (s) may be made to amino acid positions in the Fc domain that include, but are not limited to, e.g., 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 or 439, wherein the numbering of the residues in the Fc region is according to the EU numbering system. In some embodiments, the anti-CD47 antibody comprises a human IgG4 Fc region that comprises two human IgG4 Fc domain monomers, wherein each monomer comprises an S228P substitution (wherein the numbering of the residue is according to the EU numbering system) . Additional suitable mutations are well known in the art. Exemplary mutations are set forth in, e.g., U.S. Patent No. 7,332,581. Pharmaceutical Formulations and Administration Thereof

[0136] The anti-CD47 antibodies (or immunologically active fragments thereof) provided herein can be formulated with pharmaceutically acceptable carriers or excipients so that they are suitable for administration to a subject in need thereof (e.g., a mammal such as a human) . Suitable formulations of the antibodies are obtained by mixing an antibody (or an immunologically active fragment thereof) having the desired degree of purity with optional pharmaceutically acceptable carriers, buffers, excipients or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) ) , in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. Pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffers such as phosphate, citrate, and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propylparaben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol) ; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates including glucose, mannose, or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counter-ions such as sodium; metal complexes (e.g. Zn-protein complexes) ; and / or non-ionic surfactants such as TWEENTM, PLURONICSTM or polyethylene glycol (PEG) .

[0137] The anti-CD47 antibodies (or immunologically active fragments thereof) provided herein can also be formulated as immunoliposomes. Liposomes containing the antibody are prepared by methods known in the art, such as described in Epstein et al., PNAS USA, 82: 3688 (1985) ; Hwang et al., PNAS USA, 77: 4030 (1980) ; and U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545. Liposomes with enhanced circulation time are disclosed in U.S. Patent No. 5,013,556.

[0138] Particularly useful liposomes can be generated by the reverse-phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol, and PEG-derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE) . Liposomes are extruded through filters of defined pore size to yield liposomes with the desired diameter. Fab’ fragments of the antibody of the present application can be conjugated to the liposomes as described in Martinet al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) via a disulfide-interchange reaction. An anti-neoplastic agent, a growth inhibitory agent, or a chemotherapeutic agent (such as doxorubicin) is optionally also contained within the liposome. See, Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81 (19) : 1484 (1989) .

[0139] The active ingredients containing CD47 antibodies may also be entrapped in microcapsule prepared, e.g., by coacervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsule and poly- (methylmethacylate) microcapsule, respectively, in colloidal drug delivery systems (for example, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nano-particles and nanocapsules) or in macroemulsions. Such techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) .

[0140] A pharmaceutical formulation comprising an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) provided herein may also contain more than one active compound as necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. For example, it may be desirable to provide an anti-neoplastic agent, a growth inhibitory agent, a cytotoxic agent, or a chemotherapeutic agent in addition to an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) provided herein. Such molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended. The effective amount of such other agents depends on the amount of antibody present in the formulation, the type of disease or disorder or treatment, and other factors discussed above. The effective amount of such other agents depends on the amount of antibody present in the formulation, the type of disease or disorder or treatment, and other factors discussed above. These are generally used in the same dosages and with administration routes as described herein or about from 1 to 99%of the heretofore employed dosages.

[0141] In some embodiments, an antibody of the present disclosure is lyophilized. Such lyophilized formulations may be reconstituted with a suitable diluent to a high protein concentration, and the reconstituted formulation may be administered to a mammal (such as a human) .

[0142] In certain embodiments, the pharmaceutical formulations to be used for in vivo administration are sterile. This is readily accomplished by, e.g., filtering a solution comprising an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) provided herein through sterile filtration membranes.

[0143] The therapeutic dose of an anti-CD47 antibody described herein may be formulated as a dose of at least about 0.01 μg / kg body weight, at least about 0.05 μg / kg body weight; at least about 0.1 μg / kg body weight, at least about 0.5 μg / kg body weight, at least about 1 μg / kg body weight, at least about 2.5 μg / kg body weight, at least about 5 μg / kg body weight, and not more than about 100 μg / kg body weight. It will be understood by one of skill in the art that such guidelines will be adjusted for the molecular weight of the active agent, e.g. in the use of antibody fragments, or in the use of antibody conjugates. The dosage may also be varied for localized administration, e.g. intranasal, inhalation, etc., or for systemic administration, e.g., intraperitoneal (I. P. ) , intravenous (I. V. ) , intradermal (I. D. ) , intramuscular (I. M. ) , and the like.

[0144] A CD47 antibody or pharmaceutical composition of this application can be administered by any suitable means, including parenteral, subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary, and intranasal. Parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration. In addition, the anti-CD47 antibody is suitably administered by pulse infusion, particularly with declining doses of the antibody.

[0145] For the prevention or treatment of disease, the appropriate dosage of antibody will depend on the type of disease to be treated, as defined above, the severity and course of the disease, whether the antibody is administered for preventive purposes, previous therapy, the patient's clinical history and response to the antibody, and the discretion of the attending physician. The antibody is suitably administered to the patient at one time or over a series of treatments. Methods of Detection and / or Diagnosis

[0146] The anti-CD47 antibodies (or immunologically active fragments thereof) provided herein can be used in methods of detection and diagnosis. The presence and / or amount of amount of CD47 (e.g., hCD47) protein in a sample (e.g., biological sample, such as a tissue sample) from a subject can be determined qualitatively and / or quantitatively using an antibody described herein. In certain embodiments, a method of detecting presence and / or amount of amount of CD47 protein comprises contacting the biological sample with an anti-CD47 antibody described herein under conditions permissive for binding of the antibody to CD47, and detecting whether a complex is formed between the antibody and CD47. Such method may be an in vitro or in vivo method. In one embodiment, the method is used to select subjects eligible for therapy with an anti-CD47 antibody. In dome embodiments, the sample is obtained from the subject prior to the subject’s being treated with an anti-CD47 antibody. In some embodiments, the tissue sample is formalin fixed and paraffin embedded, archival, fresh or frozen. In some embodiments, the presence and / or amount of CD47 in a first sample is increased or elevated as compared to presence and / or amount of CD47 in a second sample. In certain embodiments, the presence and / or amount of CD47 in a first sample is decreased or reduced as compared to the presence and / or amount of CD47 in a second sample. In certain embodiments, the second sample is a reference sample, reference cell, reference tissue, control sample, control cell, or control tissue. The presence and / or amount of CD47 in a sample can be analyzed by a number of methodologies, many of which are known in the art and understood by the skilled artisan, including, but not limited to, immunohistochemistry (IHC) , Western blot analysis, immunoprecipitation, molecular binding assays, ELISA, ELIFA, fluorescence activated cell sorting (FACS) , MassARRAY, proteomics, biochemical enzymatic activity assays. Multiplexed immunoassays such as those available from Rules Based Medicine or Meso Scale Discovery ( “MSD” ) may also be used. Detecting the presence and / or amount of CD47 (e.g., hCD47) protein in a sample (e.g., biological sample, such as a tissue sample) from a subject can be performed in combination with additional techniques such as morphological staining and / or fluorescence in-situ hybridization.

[0147] In some embodiments, CD47 expression is evaluated on a tumor or in tumor sample, e.g., relative to a sample of non-cancerous tissue. As used herein, a tumor or tumor sample may encompass part or all of the tumor area occupied by tumor cells. In some embodiments, a tumor or tumor sample may further encompass tumor area occupied by tumor associated intratumoral cells and / or tumor associated stroma (e.g., contiguous peri-tumoral desmoplastic stroma) . In some embodiments, CD47 expression is evaluated on tumor cells. In some embodiments, the sample is a clinical sample. In some embodiments, the sample is used in a diagnostic assay. In some embodiments, the sample is obtained from a primary or metastatic tumor. Tissue biopsy is often used to obtain a representative piece of tumor tissue. Alternatively, tumor cells can be obtained indirectly in the form of tissues or fluids that are known or thought to contain the tumor cells of interest. For instance, samples for used in the detection methods described herein may be obtained, without limitation, by resection, bronchoscopy, fine needle aspiration, bronchial brushings, or from sputum, pleural fluid, cerebrospinal fluid, blood, serum, and urine. The same techniques discussed above for detection of target genes or gene products in cancerous samples can be applied to other body samples. Cancer cells may be sloughed off from cancer lesions and appear in such body samples. In some embodiments, an early cancer diagnosis can be achieved by screening such body samples for the presence and / or amount of CD47 protein. In some embodiments, the progress of therapy (e.g., therapy with an anti-CD47 antibody) can be monitored more easily by testing such body samples for the presence and / or amount of CD47 protein. Methods of Treatment

[0148] Provided herein is a method of treating a disease or disorder associated with aberrant CD47 expression (e.g., CD47 overexpression) , the method comprising administering an effective amount of an anti-CD47 antibody described herein to a subject in need thereof. In some embodiments, the disease or disorder is cancer.

[0149] In some embodiments, the cancer cells express CD47 at a comparable level as HL-60 cells. In some embodiments, the cancer cells express CD47 at a comparable level as RKO cells. In some embodiments, the cancer cells express CD47 at a comparable level as OCI-LY19 cells. In some embodiments, there is a comparable level of CD47 expression when one level is at least about 10%. 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, or 90%of the other.Treatment of Solid Tumor

[0150] In some embodiments, provided is a method of treating solid tumor in a subject that comprises administering to the subject an effective amount of an anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof to the subject, wherein the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof comprises a heavy chain variable (VH) domain that comprises (1) a CDR-H1 comprising RAWMN (SEQ ID NO: 6) ; (2) a CDR-H2 comprising RIKRKTDGETTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 7) ; (3) a CDR-H3 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SSRAFDI (SEQ ID NO: 8) , SSYAFDI (SEQ ID NO: 9) , SAYAFDI (SEQ ID NO: 10) , and SARAFDI (SEQ ID NO: 11) ; and a light chain variable (VL) domain that comprises (1) a CDR-L1 comprising KSSQSVLYAGNNRNYLA (SEQ ID NO: 12); (2) a CDR-L2 comprising QASTRAS (SEQ ID NO: 13) ; and (3) a CDR-L3 comprising QQYYTPPLA (SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof further comprises a human IgG4 Fc region. In some embodiments, the human IgG4 Fc region comprises S228P substitution.

[0151] In some embodiments, the VH of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 23, and the VL of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 24, and the VL of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 25, and the VL of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 26, and the VL of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the antibody is a full-length antibody having two heavy chains and two light chains. In some embodiments, the antibody has a Fc domain (e.g. a IgG4 domain, e.g., a human IgG4 domain, e.g., a human IgG4 domain with a S228P mutation) . In some embodiments, the antibody has a VH comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to any one of SEQ ID NOs: 23-26, and / or a VL comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 27.

[0152] In some embodiments, the antibody has two heavy chains comprising SEQ ID NO: 1, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 1, and two light chains comprising SEQ ID NO: 5, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the antibody has two heavy chains comprising SEQ ID NO: 2, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 2, and two light chains comprising SEQ ID NO: 5, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the antibody has two heavy chains comprising SEQ ID NO: 3, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 3, and two light chains comprising SEQ ID NO: 5, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the antibody has two heavy chains comprising SEQ ID NO: 4, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 4, and two light chains comprising SEQ ID NO: 5, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 5.

[0153] In some embodiments, the solid tumor is relapsed solid tumor (e.g., relapsed during or following a prior treatment for solid tumor) and / or refractory solid tumor (e.g., refractory or not responsive to a prior treatment for solid tumor) . In some embodiments, “prior treatment” refers to a therapeutic regimen that comprises administration of one or more therapeutic agents. That is, a “prior treatment” for solid tumor may have comprised treatment with a single therapeutic agent or treatment with a combination of therapeutic agents. In some embodiments, the solid tumor is a lung tumor, an ovarian tumor, a colorectal tumor, a pancreatic tumor, a sarcoma tumor, a head and neck tumor, a gastric tumor, a renal tumor, or a skin tumor (e.g., melanoma) , a breast cancer, a prostate cancer, an endometrial carcinoma, a bladder cancer, a colon cancer, a leiomyoma, a leiomyosarcoma, a glioma, a glioblastoma. In some embodiments, the solid tumor is a metastatic solid tumor.

[0154] In some embodiments, the anti-CD47 antibody is administered to the subject at a dose of about 10mg / kg to about 45 mg / mg, including any of about 10mg / kg, 20 mg / kg, 30 mg / kg, 40 mg / kg and 45 mg / kg. In some embodiments, the anti-CD47 antibody is administered to the subject once a week (i.e., qw or q1w) . In some embodiments, the anti-CD47 antibody is administered to the subject once every two weeks (i.e., q2w) . In some embodiments, the anti-CD47 antibody is administered to the subject once every four weeks (i.e., q4w) . In some embodiments, the anti-CD47 antibody is administered via intravenous (IV) infusion or subcutaneously. In some embodiments, the subject does not experience any treatment-related adverse effects (TRAEs) due to treatment with the anti-CD47 antibody. In some embodiments, the subject does not experience any TRAEs greater than Grade 1 or Grade 2. In some embodiments, TRAEs are graded according to the criteria outlined in Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) v 5.0. See, e.g., ctep (dot) cancer (dot) gov / protocoldevelopment / electronic_applications / docs / CTCAE_v5_Quick_Reference_5x7 (dot) pdf.

[0155] In some embodiments, the subject does not experience significant hematological toxicity due to treatment with the anti-CD47 antibody. In some embodiments, the subject does not experience a hematological toxicity due to treatment with the anti-CD47 antibody. In some embodiments, the hematological toxicity comprises anemia, cytopenia, platelet depletion, and / or hemagglutination. In some embodiments, the subject does not require treatment for hematological toxicity during treatment with the anti-CD47 antibody.Treatment of Hematological Cancer

[0156] In some embodiments, provided is a method of treating a hematological cancer (e.g., a non-Hodgkin lymphoma (NHL) , a T-cell lymphoma, an acute myeloid leukemia (AMC) , a myelodysplastic syndrome (MDS) ) in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of an anti-CD47 antibody and optionally an effective amount of rituximab, wherein the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof comprises a heavy chain variable (VH) domain that comprises (1) a CDR-H1 comprising RAWMN (SEQ ID NO: 6) ; (2) a CDR-H2 comprising RIKRKTDGETTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 7) ; (3) a CDR-H3 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SSRAFDI (SEQ ID NO: 8) , SSYAFDI (SEQ ID NO: 9) , SAYAFDI (SEQ ID NO: 10) , and SARAFDI (SEQ ID NO: 11) ; and a light chain variable (VL) domain that comprises (1) a CDR-L1 comprising KSSQSVLYAGNNRNYLA (SEQ ID NO: 12) ; (2) a CDR-L2 comprising QASTRAS (SEQ ID NO:13) ; and (3) a CDR-L3 comprising QQYYTPPLA (SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof further comprises a human IgG4 Fc region. In some embodiments, the human IgG4 Fc region comprises S228P substitution. In some embodiments, the hematological cancer is a lymphoma (e.g., non-Hodgkin lymphoma, B cell lymphoma, T cell lymphoma, NK cell lymphoma) , acute lymphocytic leukemia (ALL) , acute myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma, monocytic leukemias, B-cell derived leukemias, T-cell derived leukemias, Mycosis Fungoides and Sézary Syndrome, multiple myeloma, acute myeloid leukemia (e.g., newly diagnosed AML, e.g., relapsed / refractory (R / R) AML) , myelodysplastic syndrome (e.g., high risk MDS, e.g., untreated MDS) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , or hematological neoplasm.

[0157] In some embodiments, the VH of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 23, and the VL of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 24, and the VL of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 25, and the VL of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 26, and the VL of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the antibody is a full-length antibody having two heavy chains and two light chains. In some embodiments, the antibody has a Fc domain (e.g. a IgG4 domain, e.g., a human IgG4 domain, e.g., a human IgG4 domain with a S228P mutation) . In some embodiments, the antibody has a VH comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to any one of SEQ ID NOs: 23-26, and / or a VL comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 27.

[0158] In some embodiments, the antibody has two heavy chains comprising SEQ ID NO: 1, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 1, and two light chains comprising SEQ ID NO: 5, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the antibody has two heavy chains comprising SEQ ID NO: 2, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 2, and two light chains comprising SEQ ID NO: 5, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the antibody has two heavy chains comprising SEQ ID NO: 3, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 3, and two light chains comprising SEQ ID NO: 5, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the antibody has two heavy chains comprising SEQ ID NO: 4, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 4, and two light chains comprising SEQ ID NO: 5, or a variant comprising an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 5.

[0159] In some embodiments, the anti-CD47 further comprises a human IgG4 Fc region. In some embodiments, the hematological cancer is follicular lymphoma (FL) , diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , or mantle cell lymphoma (MCL) . In some embodiments, the NHL is relapsed NHL (e.g., relapsed during or following a prior treatment for NHL) and / or refractory NHL (e.g., refractory or non-responsive to a prior treatment for NHL) . In some embodiments, the subject has undergone at least one prior treatment (e.g., between 2 and 10 prior treatments) for NHL. In some embodiments, “prior treatment” refers to a therapeutic regimen that comprises administration of one or more therapeutic agents. That is, a “prior treatment” for NHL may have comprised treatment with a single therapeutic agent or treatment with a combination of therapeutic agents. In some embodiments, the subject has undergone prior treatment for NHL that comprised an anti-CD20 agent. In some embodiments, the anti-CD20 agent was an anti-CD20 antibody (e.g., without limitation, rituximab, obinutuzumab, and / or ofatumumab) . In some embodiments, the subject progressed (e.g., demonstrated NHL disease progression) during or after treatment with the anti-CD20 agent (e.g., as a single agent or in combination with one or more therapeutic agents) .

[0160] In some embodiments, the anti-CD47 antibody is administered to the subject once a week (i.e., qw or q1w) . In some embodiments, the anti-CD47 antibody is administered to the subject once every 7 days. In some embodiments, the anti-CD47 antibody is administered via intravenous (IV) infusion or subcutaneously.

[0161] In some embodiments, the rituximab is administered to the subject via IV infusion at a dose of 375 mg / m2 once a week (qw or q1w) for five weeks, and at a dose of 375 mg / m2 once every 4 weeks (e.g., q4w, q28d, or monthly) following the five weeks. In some embodiments, the rituximab is administered according to the directions of the prescribing label (see, e.g., FDA prescribing label at www (dot) accessdata (dot) fda (dot) gov / drugsatfda_docs / label / 2018 / 103705s5450lbl (dot) pdf and EMA prescribing label at www (dot) ema (dot) europa (dot) eu / en / documents / overview / mabthera-epar-medicine-overview_en. pdf) .

[0162] In some embodiments, the subject does not experience any treatment-related adverse effects (TRAEs) due to treatment with the anti-CD47 antibody. In some embodiments, the subject does not experience any TRAEs greater than Grade 1 or Grade 2. In some embodiments, TRAEs are graded according to the criteria outlined in Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) v 5.0. See, e.g., ctep (dot) cancer (dot) gov / protocoldevelopment / electronic_applications / docs / CTCAE_v5_Quick_Reference_5x7 (dot) pdf.

[0163] In some embodiments, the subject does not experience significant hematological toxicity due to treatment with the anti-CD47 antibody. In some embodiments, the subject does not experience any hematological toxicity due to treatment with the anti-CD47 antibody. In some embodiments, the hematological toxicity comprises anemia, thrombocytopenia, cytopenia, and / or hemagglutination. In some embodiments, the subject does not require treatment for hematological toxicity during treatment with the anti-CD47 antibody. Articles of Manufacture and Kits

[0164] Provided is an article of manufacture comprising materials useful for the treatment of CD47-associated disease, e.g., a CD47-expressing (such as CD47-overexpressing) cancer, e.g., solid tumor cancer (such as lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer, etc. ) or hematological cancer, e.g., Non-Hodgkin lymphoma (such as diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , follicular lymphoma (FL) , mantle cell lymphoma (MCL) , etc. ) . In certain embodiments, the article of manufacture or kit comprises a container containing one or more of the anti-CD47 antibodies (or immunologically active fragments thereof) or the compositions described herein. In certain embodiments, the article of manufacture or kit comprises a container containing nucleic acid (s) encoding one (or more) of the anti-CD47 antibodies (or immunologically active fragments thereof) or the compositions described herein. In some embodiments, the kit includes a cell of cell line that produces an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) as described herein. In some embodiments, the kit includes one or more positive controls, for example CD47 (or fragments thereof) or CD47+ cells. In some embodiments, the kit includes negative controls, for example a surface or solution that is substantially free of CD47, or a cell that does not express CD47.

[0165] In certain embodiments, the article of manufacture or kit comprises a container and a label or package insert on or associated with the container. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, IV solution bags, test tubes, etc. The containers may be formed from a variety of materials such as glass or plastic. The container holds a composition which is by itself or combined with another composition effective for treating, preventing and / or diagnosing CD47-associated disease or disorder, e.g., cancer, such as solid tumor cancer (e.g., lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer, etc. ) or a hematological cancer (e.g., Non-Hodgkin lymphoma (NHL) such as diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , follicular lymphoma (FL) , mantle cell lymphoma (MCL) , etc. ) . The container may have a sterile access port (for example the container may be an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle) . At least one agent in the composition is an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) described herein. In some embodiments, the label or package insert indicates that the composition is used for treating a CD47-associated disease or disorder (e.g., cancer, such as solid tumor cancer (e.g., lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer, etc. ) or a hematological cancer (e.g., Non-Hodgkin lymphoma (NHL) such as diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , follicular lymphoma (FL) , mantle cell lymphoma (MCL) , etc. ) . In some embodiments, the label or package insert indicates that the composition is for use in treating solid tumor, such as relapsed and / or refractory solid tumor (e.g., lung, ovarian, colorectal, pancreatic, sarcoma, head and neck, gastric, renal or skin tumor) . In some embodiments, the label or package insert indicates that the composition is for use in combination with rituximab for the treatment of non-Hodgkin lymphoma (NHL) , such as relapsed and / or refractory NHL in a subject, e.g., a subject who has undergone at least one prior treatment for NHL, such as treatment with an anti-CD20 agent.

[0166] Moreover, the article of manufacture or kit may comprise (a) a first container with a composition contained therein, wherein the composition comprises an anti-CD47 antibody (or immunologically active fragment thereof) described herein; and (b) a second container with a composition contained therein, wherein the composition comprises a further cytotoxic or otherwise therapeutic agent (e.g., rituximab, wherein the kit is for treatment of NHL) . Additionally, the article of manufacture may further comprise an additional container comprising a pharmaceutically-acceptable buffer, such as bacteriostatic water for injection (BWFI) , phosphate-buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution. It may further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, including other buffers, diluents, filters, needles, and syringes.

[0167] Kits are also provided that are useful for various purposes, e.g., for isolation or detection of CD47, e.g., in a tissue sample obtained from a subject, optionally in combination with the articles of manufacture. For isolation and purification of CD47, the kit can contain an anti-CD47 antibody (or fragment thereof) provided herein coupled to beads (e.g., sepharose beads) . Kits can be provided which contain the antibodies (or fragments thereof) for detection and quantitation of CD47 in vitro, e.g., in an ELISA or a Western blot. As with the article of manufacture, the kit comprises a container and a label or package insert on or associated with the container. For example, the container holds a composition comprising at least one anti-CD47 antibody provided herein. Additional containers may be included that contain, e.g., diluents and buffers, control antibodies. Where the antibody is labeled with an enzyme, the kit will include substrates and cofactors required by the enzyme (e.g., a substrate precursor which provides the detectable chromophore or fluorophore) . The relative amounts of the various reagents may be varied widely to provide for concentrations in solution of the reagents which substantially optimize the sensitivity of the assay. Particularly, the reagents may be provided as dry powders, usually lyophilized, including excipients which on dissolution will provide a reagent solution having the appropriate concentration. The label or package insert may provide a description of the composition as well as instructions for the intended in vitro or diagnostic use (e.g., detecting CD47, diagnosing a CD47-related disease or disorder) , or monitoring the progress of treatment of a CD47-related disease or disorder) .

[0168] All publications and patent applications cited in this specification are herein incorporated by reference as if each individual publication or patent application were specifically and individually indicated to be incorporated by reference. EXEMPLARY EMBODIMENTS

[0169] Embodiment 1. An antibody or immunologically active fragment thereof that specifically binds to human CD47 (hCD47) , comprising: (a) a heavy chain variable (VH) domain that comprises (1) a CDR-H1 comprising RAWMN  (SEQ ID NO: 6) ; (2) a CDR-H2 comprising RIKRKTDGETTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 7) ; (3) a CDR-H3 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SSRAFDI (SEQ ID NO: 8) , SSYAFDI (SEQ ID NO: 9) , SAYAFDI (SEQ ID NO: 10) , and SARAFDI (SEQ ID NO: 11) ; and (b) a light chain variable (VL) domain that comprises (1) a CDR-L1 comprising  KSSQSVLYAGNNRNYLA (SEQ ID NO: 12) ; (2) a CDR-L2 comprising QASTRAS (SEQ ID NO: 13) ; and (3) a CDR-L3 comprising QQYYTPPLA (SEQ ID NO: 14) .

[0170] Embodiment 2. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 1, wherein the CDR-H3 comprises SSRAFDI (SEQ ID NO: 8) .

[0171] Embodiment 3. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 1, wherein the CDR-H3 comprises SSYAFDI (SEQ ID NO: 9) .

[0172] Embodiment 4. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 1, wherein the CDR-H3 comprises SAYAFDI (SEQ ID NO: 10) .

[0173] Embodiment 5. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 1, wherein the CDR-H3 comprises SARAFDI (SEQ ID NO: 11) .

[0174] Embodiment 6. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of embodiments 1-5, wherein the VH comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to any one of SEQ ID NOs: 23-26, and / or the VL comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 27.

[0175] Embodiment 7. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 6, wherein the VH comprises SEQ ID NO: 23, and the VL comprises SEQ ID NO: 27.

[0176] Embodiment 8. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 6, wherein the VH comprises SEQ ID NO: 24, and the VL comprises SEQ ID NO: 27.

[0177] Embodiment 9. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 6, wherein the VH comprises SEQ ID NO: 25, and the VL comprises SEQ ID NO: 27.

[0178] Embodiment 10. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 6, wherein the VH comprises SEQ ID NO: 26, and the VL comprises SEQ ID NO: 27.

[0179] Embodiment 11. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of embodiments 1-10, comprising an Fc domain.

[0180] Embodiment 12. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 11, comprising a human IgG Fc domain, optionally wherein the human IgG Fc domain is an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc domain.

[0181] Embodiment 13. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 12, wherein the antibody comprises a human IgG4 Fc domain, optionally wherein the human IgG4 Fc domain further comprises an S228P mutation (wherein numbering is according to the EU index) .

[0182] Embodiment 14. The anti-CD47 antibody of any one of embodiments 1-13, wherein the antibody is a full-length antibody.

[0183] Embodiment 15. The anti-CD47 antibody of embodiment 14, wherein the full-length antibody comprises two heavy chains and two light chains.

[0184] Embodiment 16. The anti-CD47 antibody of embodiment 15, wherein the heavy chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-4 and / or the light chain comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 5.

[0185] Embodiment 17. The immunologically active fragment of the anti-CD47 antibody of any one of embodiments 1-13, wherein the fragment is a Fab, a Fab’ , a F (ab) ’ 2, a Fab’ -SH, a single-chain Fv (scFv) , an Fv fragment, or a linear antibody.

[0186] Embodiment 18. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of embodiments 1-17, wherein the antibody or fragment thereof is a monoclonal antibody or fragment thereof.

[0187] Embodiment 19. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of embodiments 1-18, wherein the antibody or fragment thereof is chimeric or humanized.

[0188] Embodiment 20. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of embodiments 1-19, wherein the antibody or fragment binds to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell.

[0189] Embodiment 21. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 20, wherein the cancer cell is a HL60 cell, a RKO cell, an OCI-LY19 cell, a SK-OV-3 cell, a Toledo cell, a K562 cell, a HCC827 cell, a Jurkat cell, a U937 cell, a TF-1 cell, a Raji cell, a SU-DHL-4 cell, a MDA-MB-231 cell, an A375 cell, or a SK-MES-1 cell.

[0190] Embodiment 22. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 20 or embodiment 21, wherein the cancer cell is a solid tumor cancer.

[0191] Embodiment 23. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 22, wherein the solid tumor cancer is lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer.

[0192] Embodiment 24. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 20 or embodiment 21, wherein the cancer cell is a hematological cancer.

[0193] Embodiment 25. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 24, wherein the hematological cancer is non-Hodgkin lymphoma.

[0194] Embodiment 26. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of embodiments 1-25, wherein the antibody or fragment binds to hCD47 expressed on the surface of a blood cell at a lower level than that 5F9.

[0195] Embodiment 27. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 26, wherein the blood cell is an erythrocyte.

[0196] Embodiment 28. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of embodiments 1-27, wherein the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 prevents interaction of the hCD47 with signal-regulatory-protein α (SIRPα) .

[0197] Embodiment 29. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 28, wherein the SIRPα is human SIRPα (hSIRPα) .

[0198] Embodiment 30. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of embodiments 1-29, wherein the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell promotes macrophage-mediated phagocytosis of the cancer cell.

[0199] Embodiment 31. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 30, wherein the cancer cell is a HL60 cell, a RKO cell, an OCI-LY19 cell, a SK-OV-3 cell, a Toledo cell, a K562 cell, a HCC827 cell, a Jurkat cell, a U937 cell, a TF-1 cell, a Raji cell, a SU-DHL-4 cell, a MDA-MB-231 cell, an A375 cell, or a SK-MES-1 cell.

[0200] Embodiment 32. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 30 or embodiment 31, wherein the cancer cell is a solid tumor cancer.

[0201] Embodiment 33. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 32, wherein the solid tumor cancer is lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer.

[0202] Embodiment 34. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 30 or embodiment 31, wherein the cancer cell is a hematological cancer.

[0203] Embodiment 35. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of embodiment 34, wherein the hematological cancer is non-Hodgkin lymphoma.

[0204] Embodiment 36. The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of embodiments 1-35, wherein administration of the antibody or fragment thereof to a subject does not cause a significant level of hemagglutination in the subject, depletion of the subject’s red blood cells, and / or depletion of the subject’s platelets.

[0205] Embodiment 37. A nucleic acid encoding the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof any one of embodiments 1-36.

[0206] Embodiment 38. A vector comprising the nucleic acid of embodiment 37.

[0207] Embodiment 39. A host cell comprising the nucleic acid of embodiment 37, or the vector of embodiment 38.

[0208] Embodiment 40. The host cell of embodiment 39, wherein the host cell is a mammalian cell.

[0209] Embodiment 41. The host cell of embodiment 40, wherein the mammalian cell is a Chinese hamster ovary (CHO) cell.

[0210] Embodiment 42. The host cell of embodiment 41, wherein the CHO cell is a CHO-K1 cell.

[0211] Embodiment 43. A method of producing an anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof, comprising: (a) culturing the host cell of any one of embodiments 39-42 under conditions effective to  cause expression of the anti-CD47 antibody or antigen-binding fragment thereof; and (b) recovering the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof  expressed by the host cell.

[0212] Embodiment 44. A pharmaceutical composition comprising the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of embodiments 1-36 and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0213] Embodiment 45. A method of treating cancer in a subject, comprising administering an effective amount of an anti-CD47 antibody or an immunologically active fragment thereof of any one of embodiments 1-36.

[0214] Embodiment 46. The method of embodiment 45, wherein the cancer is solid tumor.

[0215] Embodiment 47. The method of embodiment 45 or 46, wherein the solid tumor is a lung tumor, an ovarian tumor, a colorectal tumor, a pancreatic tumor, a sarcoma tumor, a head and neck tumor, a gastric tumor, a renal tumor, or a skin tumor.

[0216] Embodiment 48. The method of embodiment 46 or 47, wherein the solid tumor is relapsed and / or refractory solid tumor.

[0217] Embodiment 49. The method of embodiment 45, wherein the cancer is a hematological cancer, optionally wherein the cancer is selected from the group consisting of lymphoma (e.g., non-Hodgkin lymphoma, T cell lymphoma, NK cell lymphoma) , Mycosis Fungoides and Sézary Syndrome, multiple myeloma, acute myeloid leukemia (e.g., newly diagnosed AML, e.g., relapsed / refractory (R / R) AML) , myelodysplastic syndrome (e.g., high risk MDS, e.g., untreated MDS) , chronic lymphocytic leukemia, hematological neoplasm.

[0218] Embodiment 50. The method of embodiment 49, wherein the cancer is a non-Hodgkin lymphoma (NHL) , and wherein the method further comprises administering an effective amount of rituximab to the subject.

[0219] Embodiment 51. The method of embodiment 50, wherein the NHL is follicular lymphoma (FL) , diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , or mantle cell lymphoma (MCL) .

[0220] Embodiment 52. The method of embodiment 50 or 51, wherein the NHL is relapsed / refractory NHL.

[0221] Embodiment 53. The method of any one of embodiments 50-52, wherein the subject has undergone at least one prior treatment for NHL.

[0222] Embodiment 54. The method of embodiment 53, wherein the subject has undergone between 2 and 10 prior therapies for NHL.

[0223] Embodiment 55. The method of embodiment 53 or 54, wherein the subject has undergone prior treatment for NHL with an agent that targets CD20.

[0224] Embodiment 56. The method of embodiment 55, wherein the subject progressed during or after the prior therapy with an agent that targets CD20.

[0225] Embodiment 57. The method of any one of embodiments 45-56, wherein the anti-CD47 antibody comprises a human IgG4 Fc domain, optionally wherein the human IgG4 Fc domain further comprises an S228P mutation (wherein numbering is according to the EU index) .

[0226] Embodiment 58. The method of any one of embodiments 45-57, wherein the anti-CD47 antibody is administered to the subject at a dose of 10mg / kg.

[0227] Embodiment 59. The method of any one of embodiments 45-58, wherein the anti-CD47 antibody is administered to the subject via intravenous (IV) infusion or subcutaneously.

[0228] Embodiment 60. The method of any one of embodiments 45-59, wherein the subject does not experience significant hematological toxicity due to the treatment with the anti-CD47 antibody.

[0229] Embodiment 61. The method of embodiment 60, wherein the subject does not experience any hematological toxicity due to treatment with the anti-CD47 antibody.

[0230] Embodiment 62. The method of embodiment 60 or 61, wherein the hematological toxicity comprises anemia, thrombocytopenia, cytopenia, and / or hemagglutination.

[0231] Embodiment 63. The method of any one of embodiments 45-62, wherein the VH of the anti-CD47 antibody comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23-26, and the VL of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 27.

[0232] Embodiment 64. The method of any one of embodiments 45-63, wherein the anti-CD47 antibody is a full-length antibody comprising two heavy chains comprising any one of SEQ ID NOs: 1-4 and two light chains comprising SEQ ID NO: 5.

[0233] Embodiment 65. A kit for treating cancer comprising the antibody of any one of embodiments 1-36 or the composition of embodiment 44.EXAMPLES

[0234] The following examples are put forth so as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present application, and are not intended to limit the scope of what the inventors regard as their application nor are they intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (e.g. amounts, temperature, etc. ) but some experimental errors and deviations should be accounted for. Unless indicated otherwise, parts are parts by weight, molecular weight is weight average molecular weight, temperature is in degrees Centigrade, and pressure is at or near atmospheric. Example 1. Binding activity of anti-CD47 antibodies against human CD47

[0235] C4BC1, C4BC2, C4BC3, and C4BC4, four full-length anti-CD47 antibodies with CDR sequences as shown in the Table 1 below were constructed. These four antibodies share the same three CDRs of the light chain and two of the three CDRs of the heavy chain. They have a human IgG4 Fc with a S228P mutation. Table 1.

[0236] Hu5F9-G4 (also known as magrolimab, referred as “5F9” or “BM 5F9” herein) was used as a benchmark anti-CD47 antibody.

[0237] Binding property of anti-CD47 antibodies were performed via cell-based binding assay on HL60 and RKO tumor cell line. C4BC1, C4BC2, C4BC3, C4BC4, benchmark antibody 5F9 and isotype control antibody were serial diluted with FACS buffer (DPBS buffer with 2%FBS) , and incubated with tumor cells in 96 well plate for 1 hour at 4℃. After that, tumor cells were washed 3 times with FACS buffer, followed by incubation with PE-Anti-human Fc IgG antibody at 4℃ for 30 minutes. Then the tumor cells were washed twice, suspended with 100 μL FACS buffer and analyzed with Beckman CytoFlex for fluorescence. Data was analyzed with FlowJo.

[0238] As shown in FIG. 1A, the anti-CD47 antibodies C4BC1 and C4BC3 showed a comparable binding intensity with reference anti-CD47 antibody BM 5F9 on HL60 cells. As shown in FIG. 1B and FIG. 1C, the anti-CD47 antibodies C4BC1, C4BC2, C4BC3, and C4BC4 effectively bind to RKO cells. Example 2. SIRPα blocking activity of anti-CD47 antibodies

[0239] CD47 delivers an antiphagocytic signal on macrophages through its interaction with SIRPα. To evaluate the competition ability of anti-CD47 antibodies with SIRPα, cell-based competition assay on HL60 and RKO cell was performed. Briefly, anti-CD47 antibodies, benchmark antibody 5F9 and isotype control antibody were serially diluted with FACS buffer (DPBS buffer with 2%FBS) . PE-SIRPα solution was prepared with FACS buffer (2 μL / well) . Tumor cell suspension was incubated with different serially diluted antibodies as well as PE-SIRPαsolution together for 1 hour at 4℃. After incubation, tumor cells were washed 3 times with FACS buffer, resuspended with 100 μL FACS buffer and analyzed with Beckman CytoFlex for fluorescence. Data was analyzed by FlowJo.

[0240] As shown in FIG. 2A, anti-CD47 antibodies C4BC1, C4BC2 and C4BC3 effectively blocked the binding of CD47 to SIRPα on HL60 cells. As shown in FIG. 2B, anti-CD47 antibodies C4BC1 and C4BC4 effectively blocked the binding of CD47 to SIRPα on RKO cells. Example 3. Phagocytosis activity of anti-CD47 antibodies

[0241] CD47 delivers an antiphagocytic signal on macrophages through its interaction with SIRPα. To evaluate the phagocytosis activity of Anti-CD47 antibodies, ADCP (antibody dependent cell phagocytosis) assay on OCI-LY19 and RKO tumor cell lines was performed. Briefly, Macrophage  was generated via 7 days’ induction by 50ng / mL M-CSF on Monocyte which was isolated from Human PBMC with CD14+ isolation beads. On the day of ADCP assay,  was labelled with cell trace Far red, and RKO was labeled with Violet at 37℃ with 5%CO2 for 15 minutes. After labelling,  and tumor cells were washed with DPBS buffer with 0.1%BSA, resuspended with MACS buffer [PBS, pH 7.2, 0.5%bovine serum albumin (BSA) , and 2 mM EDTA] to the density of 6E5 / mL and tumor cell to 1.8E6 / mL respectively. Anti-CD47 antibodies, benchmark antibody 5F9 and isotype control antibody were serially diluted with MACS buffer, incubated with 50 μL  cell and 50 μL tumor cell at 37℃ for 2 hours. After incubation, cells were washed once with DPBS buffer, resuspended with 100 μL FACS buffer and analyzed with Beckman CytoFlex. Phagocytosis was measured by gating on Far red+ cells and then assessed the percent of Violet+ cells.

[0242] As shown in FIGs. 3A-3C, the anti-CD47 antibodies C4BC1, C4BC2, C4BC3, C4BC4 effectively promoted phagocytosis of RKO and OCI-LY19 tumor cells by human macrophages at various concentrations. Example 4. RBC binding and hemagglutination effect of anti-CD47 antibodies

[0243] Binding of CD47 antibodies against human red blood cells (RBCs) and the effect of the CD47 antibodies on red blood cell agglutination was examined. Anti-CD47 antibodies, benchmark antibody 5F9 and isotype control antibody were serially diluted with DPBS buffer, and then incubated with RBC in 96 well plate for 1 hour at 4℃. After that, RBC was washed 3 times with DPBS buffer, followed by incubation with PE-Anti-human Fc IgG antibody for 30 minutes at 4℃. Then RBC was washed twice, resuspended with 100 μL DPBS buffer and analyzed with Beckman CytoFlex for fluorescence. Data was analyzed by FlowJo.

[0244] For hemagglutination assay, 10mL RBC suspension was centrifugated at 200g for 15 minutes. The supernatant was carefully discarded and cell pellet was washed with DPBS twice at 200g for 15 minutes, and then resuspended with 100 μL DPBS and diluted with 10 mL DPBS. 100 μL  / well RBC cell suspension was added to 96 well plate with round bottom. Anti-CD47 antibodies, benchmark antibody 5F9 and isotype control antibody were serially diluted with DPBS buffer and incubated with RBC in 96 well plate for 2 hours at room temperature. After incubation, pictures were taken at bright field.

[0245] As shown in FIGs. 4A, C4BC1, C4BC2, C4BC3 and C4BC4 showed limited RBC binding, much less than benchmark antibody 5F9 under the same concentrations. In contrast to benchmark antibody 5F9, C4BC1, C4BC2, C4BC3 and C4BC4 did not cause RBC agglutination. As shown in FIG. 4B and FIG. 4C, C4BC1 and C4BC2 showed consistent profile when tested on RBC from other two donors regarding RBC binding and agglutination effect. Example 5. In vivo tumor inhibition activity of anti-CD47 antibodies

[0246] CB17 SCID mice (eight mice in each group) were engrafted subcutaneously with 1x107 HL-60 cells / mouse. Single dose of C4BC1, C4BC2 or isotype control antibody was intraperitoneally administered when tumor reached an average volume of 115mm3. See FIG. 5A. The tumor volume was measured every other day.

[0247] As shown in FIG. 5B and FIG. 5C, strikingly, C4BC1 and C4BC2 antibody treatment resulted in strong and long-lasting anti-tumor activity in each and every mouse (eight out of eight) in the treatment group. These mice were tumor free for over seven weeks after single dose administration of C4BC1 and C4BC2 antibodies. Example 6. PK of anti-CD47 antibodies

[0248] WT C57BL / 6 mice were intravenously injected with anti-CD47 antibody C4BC1 (dose=10 mg / kg) , or anti-CD47 antibody C4BC2 (dose=10 mg / kg) . Blood was collected at 5 min, 4 h, 24 h, 96 h, 168 h (Day 7) , 240 h (Day 10) , 336 h (Day 14) , 408 h (Day 17) , 504 h (Day 21) following antibody administration. Serum was prepared after centrifugation.

[0249] PK detection assay was performed with the quantitative antibody sandwich enzyme immunoassay technique. The CD47 protein was coated in a 96-well immune plate and blocked by blocking buffer. Calibration samples (STDs) , quality control samples (QCs) , and unknown samples were pipetted into the wells. After washing, captured anti-CD47 antibody was detected with anti-human IgG4 Fc-HRP. HPR conjugate bound in the complex was visualized by a chromogenic substrate (TMB) , and the product of this reaction detected with a spectrophotometer was proportional to anti-CD47 antibody. The concentration of Anti-CD47 antibody in samples was then back-calculated from a calibration curve.

[0250] As shown in FIG. 6A and FIG. 6B, C4BC1 and C4BC2 possess desirable pharmacokinetic profiles with extended half-lives. Specifically, the half-life of C4BC1 and C4BC2 are about over 250 and 220 hours, respectively. Cmax of C4BC1 and C4BC2 are about 223 μg / mL and 211 μg / mL respectively. Example 7. In vivo safety evaluation of anti-CD47 antibodies

[0251] huCD47 / huSIRPα double knock-in mice were injected intraperitoneally with anti-CD47 antibody C4BC1 (dose=10 mg / kg) , or anti-CD47 antibody C4BC2 (dose=10 mg / kg) , benchmark antibody 5F9 (dose=10 mg / kg) and isotype control antibody (dose=10 mg / kg) biweekly. RBC and platelet counts were analyzed.

[0252] FIG. 7A and FIG. 7B show that the administration of anti-CD47 antibodies C4BC1 and C4BC2 resulted in much less RBC decrease and negligible platelet decrease in huCD47 / huSIRPα double knock-in mice, as compared to the reference anti-CD47 antibody BM 5F9, demonstrating a favorable toxicity profile.

[0253] The present application has been described in terms of particular embodiments found or proposed by the present inventor to comprise preferred modes for the practice of the application. It will be appreciated by those of skill in the art that, in light of the present disclosure, numerous modifications and changes can be made in the particular embodiments exemplified without departing from the intended scope of the application. For example, due to codon redundancy, changes can be made in the underlying DNA sequence without affecting the protein sequence. Moreover, due to biological functional equivalency considerations, changes can be made in protein structure without affecting the biological action in kind or amount. All such modifications are intended to be included within the scope of the appended claims. SEQUENCE LISTING

Claims

1.An antibody or immunologically active fragment thereof that specifically binds to human CD47 (hCD47) , comprising:(a) a heavy chain variable (VH) domain that comprises (1) a CDR-H1 comprising RAWMN (SEQ ID NO: 6) ; (2) a CDR-H2 comprising RIKRKTDGETTDYAAPVKG (SEQ ID NO: 7) ; (3) a CDR-H3 comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SSRAFDI (SEQ ID NO: 8) , SSYAFDI (SEQ ID NO: 9) , SAYAFDI (SEQ ID NO: 10) , and SARAFDI (SEQ ID NO: 11) ; and(b) a light chain variable (VL) domain that comprises (1) a CDR-L1 comprising KSSQSVLYAGNNRNYLA (SEQ ID NO: 12) ; (2) a CDR-L2 comprising QASTRAS (SEQ ID NO: 13) ; and (3) a CDR-L3 comprising QQYYTPPLA (SEQ ID NO: 14) .2.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of claim 1, wherein the VH comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to any one of SEQ ID NOs: 23-26, and / or the VL comprises an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 27.3.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of claim 2, wherein:(a) the VH comprises SEQ ID NO: 23, and the VL comprises SEQ ID NO: 27;(b) the VH comprises SEQ ID NO: 24, and the VL comprises SEQ ID NO: 27;(c) the VH comprises SEQ ID NO: 25, and the VL comprises SEQ ID NO: 27; or(d) the VH comprises SEQ ID NO: 26, and the VL comprises SEQ ID NO: 27.4.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of claims 1-3, comprising an Fc domain.5.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of claim 4, comprising a human IgG Fc domain, optionally wherein the human IgG Fc domain is an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc domain.6.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of claim 5, wherein the antibody comprises a human IgG4 Fc domain, optionally wherein the human IgG4 Fc domain further comprises an S228P mutation (wherein numbering is according to the EU index) .7.The anti-CD47 antibody of any one of claims 1-6, wherein the antibody is a full-length antibody.8.The anti-CD47 antibody of claim 7, wherein the full-length antibody comprises two heavy chains and two light chains, wherein the heavy chains comprise an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-4, and / or the light chains comprise an amino acid sequence that has at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to SEQ ID NO: 5.9.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of claims 1-6, wherein the antibody or fragment thereof is a Fab, a Fab’, a F (ab) ’2, a Fab’-SH, a single-chain Fv (scFv) , an Fv fragment, or a linear antibody.10.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of claims 1-9, wherein the antibody or fragment thereof is (a) a monoclonal antibody or fragment thereof and / or (b) chimeric or humanized.11.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of claims 1-10, wherein the antibody or fragment thereof binds to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell.12.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of claim 11, wherein the cancer cell is a HL60 cell, a RKO cell, an OCI-LY19 cell, a SK-OV-3 cell, a Toledo cell, a K562 cell, a HCC827 cell, a Jurkat cell, a U937 cell, a TF-1 cell, a Raji cell, a SU-DHL-4 cell, a MDA-MB-231 cell, an A375 cell, or a SK-MES-1 cell.13.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of claim 11 or claim 12, wherein the cancer cell is:(a) a solid tumor cancer, optionally wherein the solid tumor cancer is lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer; or(b) a hematological cancer, optionally wherein the hematological cancer is non-Hodgkin lymphoma.14.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of claims 1-13, wherein the antibody or fragment thereof binds to hCD47 expressed on the surface of a blood cell at a lower level than that of 5F9, optionally wherein the blood cell is an erythrocyte.15.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of claims 1-14, wherein the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 prevents interaction of the hCD47 with signal-regulatory-protein α (SIRPα) , optionally wherein the SIRPα is human SIRPα (hSIRPα) .16.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of claims 1-15, wherein the binding of the antibody or fragment thereof to hCD47 expressed on the surface of a cancer cell promotes macrophage-mediated phagocytosis of the cancer cell, optionally wherein:a) the cancer cell is a HL60 cell, a RKO cell, an OCI-LY19 cell, a SK-OV-3 cell, a Toledo cell, a K562 cell, a HCC827 cell, a Jurkat cell, a U937 cell, a TF-1 cell, a Raji cell, a SU-DHL-4 cell, a MDA-MB-231 cell, an A375 cell, or a SK-MES-1 cell;b) the cancer cell is a solid tumor cancer, further optionally wherein the solid tumor cancer is lung cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, sarcoma cancer, head and neck cancer, gastric cancer, renal cancer, or skin cancer; and / orc) the cancer cell is a hematological cancer; further optionally wherein the hematological cancer is non-Hodgkin lymphoma.17.The anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of claims 1-16, wherein administration of the antibody or fragment thereof to a subject does not cause a significant level of hemagglutination in the subject, depletion of the subject’s red blood cells, and / or depletion of the subject’s platelets.18.A nucleic acid encoding the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof any one of claims 1-17.19.A vector comprising the nucleic acid of claim 18.20.A host cell comprising the nucleic acid of claim 18, or the vector of claim 19.21.A method of producing an anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof, comprising:(a) culturing the host cell of claim 20 under conditions effective to cause expression of the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof; and(b) recovering the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof expressed by the host cell.22.A pharmaceutical composition comprising the anti-CD47 antibody or immunologically active fragment thereof of any one of claims 1-17 and a pharmaceutically acceptable carrier.23.A method of treating cancer in a subject, comprising administering an effective amount of an anti-CD47 antibody or an immunologically active fragment thereof of any one of claims 1-17.24.The method of claim 23, wherein the cancer is:(a) a solid tumor, wherein the solid tumor is a lung tumor, an ovarian tumor, a colorectal tumor, a pancreatic tumor, a sarcoma tumor, a head and neck tumor, a gastric tumor, a renal tumor, or a skin tumor, optionally wherein the solid tumor is relapsed and / or refractory solid tumor; or(b) a hematological cancer, optionally wherein the hematological cancer is selected from the group consisting of lymphoma (e.g., non-Hodgkin lymphoma, T cell lymphoma, NK cell lymphoma) , Mycosis Fungoides and Sézary Syndrome, multiple myeloma, acute myeloid leukemia (e.g., newly diagnosed AML, e.g., relapsed / refractory (R / R) AML) , myelodysplastic syndrome (e.g., high risk MDS, e.g., untreated MDS) , chronic lymphocytic leukemia, hematological neoplasm.25.The method of claim 24, wherein the cancer is a non-Hodgkin lymphoma (NHL) , and optionally whereina) the method further comprises administering an effective amount of rituximab to the subject;b) NHL is (a) follicular lymphoma (FL) , diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) , or mantle cell lymphoma (MCL) and / or (b) relapsed / refractory NHL; and / orc) the subject has undergone (a) at least one prior treatment for NHL and / or (b) between 2 and 10 prior therapies for NHL; further optionally the subject has undergone prior treatment for NHL with an agent that targets CD20, optionally wherein the subject progressed during or after the prior therapy with an agent that targets CD20.26.The method of any one of claims 23-25, wherein the anti-CD47 antibody:a) comprises a human IgG4 Fc domain, optionally wherein the human IgG4 Fc domain further comprises an S228P mutation (wherein numbering is according to the EU index) ;b) the anti-CD47 antibody is administered to the subject at a dose of about 10 mg / kg;c) the anti-CD47 antibody is administered to the subject via intravenous (IV) infusion or subcutaneously;d) the subject does not experience (1) significant hematological toxicity or (2) any hematological toxicity due to the treatment with the anti-CD47 antibody, wherein the hematological toxicity comprises anemia, thrombocytopenia, cytopenia, and / or hemagglutination;e) the VH of the anti-CD47 antibody comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23-26, and the VL of the anti-CD47 antibody comprises SEQ ID NO: 27; and / orf) the anti-CD47 antibody is a full-length antibody comprising two heavy chains comprising any one of SEQ ID NOs: 1-4 and two light chains comprising SEQ ID NO: 5.27.A kit for treating cancer comprising the anti-CD47 antibody of any one of claims 1-17 or the pharmaceutical composition of claim 22.

Images