Multispecific antibodies and uses thereof

Abstract

Provided are multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies or trispecific antibodies) or antigen-binding fragments thereof. In one aspect, the multispecific antibodies or antigen-binding fragments thereof can bind to a T cell antigen (e.g., CD3) and / or one or two tumor-associated antigens (e.g., CAIX, EGFR), or a combination thereof.

Description

MULTISPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF

[0001] CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This claims the benefit of priority to International Application No. PCT / CN2023 / 143088, filed on December 29, 2023, the contents of which are hereby incorporated by reference.TECHNICAL FIELD

[0003] This disclosure relates to multispecific antibodies or antigen-binding fragments thereof.BACKGROUND

[0004] Naturally occurring antibodies typically only target one antigen. A multispecific antibody can be manufactured in different structural formats, so that they can simultaneously bind to two or more different epitopes. These epitopes can be in the same antigen or in different antigens. This opens up a wide range of applications, including redirecting T cells to tumor cells, blocking two different signaling pathways simultaneously, dual targeting of different disease mediators, and delivering payloads to targeted sites.

[0005] Multispecific antibodies have various applications. However, in some cases, a multispecific antibody may not have the desired efficacy and it can be difficult to express and purify. There is a need to continue to develop various therapeutics based on multispecific antibodies.SUMMARY

[0006] This disclosure relates to multispecific antibodies or antigen-binding fragments thereof, wherein the multispecific antibodies or antigen-binding fragments thereof specifically bind to a T cell antigen (e.g., CD3) and / or one or more tumor-associated antigens, or a combination thereof.

[0007] In one aspect, the disclosure is related to a multi-specific antigen binding molecule that comprises a T cell binding domain that specifically binds to a T cell antigen and a CAIX binding domain that specifically binds to CAIX;

[0008] preferably, the CAIX binding domain and human CAIX (hCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM; and / or the CAIX binding domain and cynomolgus monkey CAIX (cCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM; and / or the CAIX binding domain and rat CAIX (rCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM; and / or the CAIX binding domain and mouse CAIX (mCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM;

[0009] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-300nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 0.04nM-0.1nM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 1nM-150nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-150nM;

[0010] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-200nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 1.0nM-1.5pM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 10nM-15nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 10nM-15nM;

[0011] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-80nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 0.04nM-0.1nM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 0.3nM-80nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-30nM;

[0012] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.1nM-8nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 1.0nM-4pM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 3nM-8nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 0.1nM-3nM;

[0013] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-150nM;

[0014] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.03nM-60nM;

[0015] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.07nM-52nM.

[0016] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises: a domain antibody (dAb) , a single domain antibody (sdAb) , a VHH, a humanized VHH, a single-chain variable fragment (scFv) , a VL domain, a VH domain, a combination of VL and VH domains, or a Fab.

[0017] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises a sdAb, a VHH, a scFv, or a humanized VHH.

[0018] In some embodiments, the T cell antigen is CD3;

[0019] preferably, the T cell binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of 0.01nM-500nM;

[0020] preferably, the T cell binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of is 0.2nM-300nM;

[0021] preferably, the T cell binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of 5nM-70nM.

[0022] In some embodiments, the T cell binding domain comprises a Fab, a scFv, or a VHH.

[0023] In some embodiments, the antigen binding molecule further comprises a half-life extending domain.

[0024] In some embodiments, the half-life extending domain is selected from: polyethylene glycol, serum albumin or a fragment thereof, a transferrin receptor or a fragment thereof, and an antibody or a fragment thereof.

[0025] In some embodiments, the half-life extending domain is an immunoglobulin fragment crystallizable region (Fc region) .

[0026] In some embodiments, the Fc region comprises a first Fc subunit and a second Fc subunit.

[0027] In some embodiments, at least one of the T cell binding domain and / or the CAIX binding domain is fused to the Fc region.

[0028] In some embodiments, the T cell binding domain is selected from the group consisting of a Fab, a scFv, and a VHH; and the CAIX binding domain is selected from the group consisting of a scFv and a VHH.

[0029] In some embodiments, the T cell binding domain is fused to the N-terminus or C-terminus of the first Fc subunit, and the CAIX binding domain is fused to the N-terminus or C-terminus of the second Fc subunit.

[0030] In some embodiments, the T cell binding domain is fused to the N-terminus of the first Fc subunit, and the CAIX binding domain is fused to the N-terminus of the second Fc subunit.

[0031] In some embodiments, the antigen binding molecule further comprises a second CAIX binding domain that specifically binds to CAIX.

[0032] In some embodiments, the CAIX binding domain and the second CAIX binding domain bind to (1) different epitopes on CAIX or (2) the same epitope on CAIX.

[0033] In some embodiments, the T cell binding domain comprises a Fab; the CAIX binding domain comprises a VHH; and the second CAIX binding domain comprises a VHH.

[0034] In some embodiments, (1) the T cell binding domain is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; (2) the CAIX binding domain is fused to (a) the N-terminus of the second Fc subunit, (b) the N-terminus of the heavy chain of the Fab in the T cell binding domain, (c) the N-terminus of the light chain of the Fab in the first antigen binding domain, (d) the C-terminus of the light chain of the Fab in the T cell binding domain, (e) the C-terminus of the First Fc subunit, or (f) the C-terminus of the second Fc subunit; or (3) the second CAIX binding domain is fused to (a) the N-terminus of the CAIX binding domain, (b) the N-terminus of the heavy chain of the Fab in the T cell binding domain, (c) the N-terminus of the light chain of the Fab in the first antigen binding domain, (d) the C-terminus of the light chain of the Fab in the T cell binding domain, (e) the C-terminus of the CAIX binding domain, (f) the C-terminus of the First Fc subunit, or (g) the C-terminus of the second Fc subunit.

[0035] In some embodiments, (1) the T cell binding domain is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and (2) the CAIX binding domain and the second CAIX binding domain are fused to (a) the N-terminus of the heavy chain of the Fab in the T cell binding domain, (b) the N-terminus of the light chain of the Fab in the first antigen binding domain, or (c) the C-terminus of the light chain of the Fab in the T cell binding domain.

[0036] In some embodiments, (1) the T cell binding domain is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; (2) the second CAIX binding domain is fused to the N-terminus of the CAIX binding domain; and (3) the CAIX binding domain and the second CAIX binding domain are fused to (a) the N-terminus of the heavy chain of the Fab in the T cell binding domain, (b) the N-terminus of the light chain of the Fab in the first antigen binding domain, or (c) the C-terminus of the light chain of the Fab in the T cell binding domain.

[0037] In some embodiments, T cell binding domain comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) .

[0038] In some embodiments, the VH comprises, according to the IMGT definition:

[0039] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 151, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0040] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 155, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0041] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 89, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0042] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 175, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0043] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 161, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; or

[0044] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 185, or variant sequences having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; and

[0045] the VL comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 153, 184, and 97 or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) . In some embodiments, the VH comprises, according to the Kabat definition:

[0046] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 237, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0047] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 233, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0048] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 198, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0049] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 209, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0050] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 215, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0051] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 223, or variant sequences having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0052] the VL comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 212, 219, and 97, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) . In some embodiments, the VH comprises, according to the Chothia definition:

[0053] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 215, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0054] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 223, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0055] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 237, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0056] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 233, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0057] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 198, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0058] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 209, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0059] the VL comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 212, 219, and 97, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .

[0060] In some embodiments, the T cell binding domain further comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:

[0061] (1) the FR1 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 91, 103, 119, and 183;

[0062] (2) the FR2 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 125, 129, 133, and 156;

[0063] (3) the FR3 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 74, 105, 108, 111, and 121; and

[0064] (4) the FR4 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 115, 124, 142, 152, and 173.

[0065] In some embodiments, (1) the T cell binding domain comprises a heavy chain that comprises:

[0066] (a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29;

[0067] (b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29; or

[0068] (c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region; and

[0069] (2) the T cell binding domain comprises a light chain that comprises:

[0070] (a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34;

[0071] (b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34; or

[0072] (c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region;

[0073] preferably, the heavy chain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29: positions 3, 5, 15, 19, 78, 79, 80, 87, 102, 105, 106, 107, 108, 109, 114, and 120;

[0074] preferably, the heavy chain comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 15: K3Q, L5V, K15G, K19R, Q78K, S79N, I80S, N87S, G102H, G105L / R, N106D / R, S107G, Y108F / K / P, V109M, Y114D, and L120A;

[0075] preferably, the light chain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34: positions 8, 9, 12, 16, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 59, 60, 69, 71, 82, 87, 106, 107, 108, 109, and 46;

[0076] preferably, the light chain comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 16: S8P, A9S, T12V, E16G, E40Q, D43G, H44Q, L45A, F46P, T47R, G59W, V60T, I69L, D71G, T82A, I87D, V106L, E107T, I108V, K109L, and F46P.

[0077] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises, according to the IMGT definition: (A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 168, and SEQ ID NO: 180, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0078] (B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 131, and SEQ ID NO: 134, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0079] (C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 154, and SEQ ID NO: 176 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added;

[0080] preferably, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82;

[0081] preferably, the CDR3 sequence comprises X1X2X3X4WYX5GEYX6X7 (SEQ ID NO: 248) , wherein X1 is N, I, T or A; X2 is A, G, T or L; X3 is Q, H, P or L, X4 is V, Q, G or T, X5 is any amino acid, X6 is any amino acid, X7 is Y or L;

[0082] preferably, the CDR2 sequence comprises IRX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 249) , wherein X1 is K or R; X2 is S or A; X3 is G or L; X4 is R or S, X5 is T, P or K;

[0083] preferably, the CDR1 sequence comprises X1X2X3X4X5ING (SEQ ID NO: 263) , wherein X1 is G or S; X2 is G or T or P or N or E or S; X3 is G or P or Y or L or I, or E; X4 is G or F or V or W or N or A or I; X5 is A, W, L or S.

[0084] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises, according to the Kabat definition:

[0085] (A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 246, , or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0086] (B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 241 and SEQ ID NO: 247, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0087] (C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 217, and SEQ ID NO: 229 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added.

[0088] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises, according to the Chothia definition:

[0089] (A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 242, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0090] (B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 222, and SEQ ID NO: 240, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0091] (C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 217, and SEQ ID NO: 229 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added.

[0092] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises, according to the IMGT definition:

[0093] (a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 176, respectively;

[0094] (b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 86, respectively;

[0095] (c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 100, and 176, respectively;

[0096] (d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 148, respectively;

[0097] (e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 120, respectively;

[0098] (f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 107, and 176, respectively;

[0099] (g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 144, respectively;

[0100] (h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 96, 134, and 176, respectively;

[0101] (i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 143, 134, and 176, respectively;

[0102] (j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 113, 134, and 176, respectively;

[0103] (k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 126, 131, and 154, respectively;

[0104] (l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 168, 131, and 154, respectively;

[0105] (m) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 75, 134, and 176, respectively;

[0106] (n) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 139, 134, and 176, respectively;

[0107] (o) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 77, 134, and 176, respectively; or

[0108] (p) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 180, 134, and 176, respectively.

[0109] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises, according to the Kabat definition:

[0110] (a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 247, and 192, respectively;

[0111] (b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 192, respectively;

[0112] (c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 197, respectively;

[0113] (d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 217, respectively;

[0114] (e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 229, respectively;

[0115] (f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 188, respectively;

[0116] (g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 241, and 192, respectively;

[0117] (h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 191, and 192, respectively;

[0118] (i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 231, 247, and 192, respectively;

[0119] (j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 234, 216, and 194, respectively;

[0120] (k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 213, 216, and 194, respectively;

[0121] (l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 247, and 192, respectively;

[0122] (m) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 225, and 192, respectively;

[0123] (n) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 191, and 192, respectively.

[0124] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises, according to the Chothia definition:

[0125] (a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 230, 211, and 192, respectively;

[0126] (b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 192, respectively;

[0127] (c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 242, 240, and 194, respectively;

[0128] (d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 204, 240, and 194, respectively;

[0129] (e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 193, 211, and 192, respectively;

[0130] (f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 210, 211, and 192, respectively;

[0131] (g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 208, 211, and 192, respectively;

[0132] (h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 224, 211, and 192, respectively;

[0133] (i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 187, 211, and 192, respectively;

[0134] (j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 222, and 192, respectively;

[0135] (k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 197, respectively;

[0136] (l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 217, respectively;

[0137] (m) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 229, respectively;

[0138] (n) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 188, respectively;

[0139] (o) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 226, 211, and 192, respectively.

[0140] In some embodiments, the CAIX binding domain further comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:

[0141] FR1 is selected from: SEQ ID NOS: 72, 81, 106, 114, 122, 138, 146, 158, 159, 162, and 172;

[0142] FR2 is selected from: SEQ ID NOS: 84, 88, 93, 166, 169, 170, 171, and 186;

[0143] FR3 is selected from: SEQ ID NOS: 76, 109, 140, 141, 149, 150, 163, 167, and 179; and

[0144] FR4 is selected from: SEQ ID NOS: 90, 99, 101, and 147.

[0145] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises:

[0146] (a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52;

[0147] (b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52; or

[0148] (c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region;

[0149] preferably, the CAIX binding domain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52: positions 1, 13, 19, 41, 44, 50, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 72, 73, 74, 87, 96, 97, 98, 99, 102, 106, 107, 110, and 113;

[0150] preferably, the CAIX binding domain comprises one or more of the following substitutions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2: Q1E, H13Q, R19K, P41S, P41Q / T, Q44A / g, K53R, S54A, G55L, R56S, T57P / K, D61A, N73D, A74S, P87T, N96N / I / T / a, A97G / T / l, Q98H / P / l, V99Q / g / T, Y107L, Q110R, and Q113L / T.

[0151] Preferably, the antigen binding domain comprises one or more of the below constructs: TA1F-12C9, TA1F-36C1, TA1F-22B3, TA1F-33G5, TA1F-12B9, TA1F-26C8, TA1F-33B12, and TA1F-12G5.

[0152] A detailed description of these constructs can be found in the Example section. The name “X1-X2” indicates a construct comprising (1) a first component, X1, and (2) a second component, X2. For example, the name “TA1F-12C9” indicates that the construct has a first component, TA1F, and a second component, 12C9. In some embodiments, “TA1F” refers to the TA1 Fab (acombination of TA1_VH, TA1_VL, CL, and CH1) . The sequences of these components are listed in FIG. 18.

[0153] Preferably, the antigen binding domain comprises one or more of: TA1F-12C9, TA1F-36C 1, TA1F-22B3, TA1F-33G5, TA1F-12B9, and TA1F-26C8.

[0154] Preferably, the antigen binding domain comprises one or more of: TA1F-36C1, TA1F-33G5, TA1F-12B9, and TA1F-12G5.

[0155] Preferably, the antigen binding domain comprises one or more of: TA1F-33B12, T A1F-12G5, and TA1F-33G5.

[0156] Preferably, the CAIX binding domain comprises one or more of: TCE-1 ～ TCE-65. A detailed description of these constructs can be found in the Example section. For example, Table 28 explains the structures of TCE-1 ～ TCE-65. The sequences of the VH variants and VL variants can be found in FIG. 18.

[0157] In some embodiments, the Fc region is a human IgG1 Fc region or a human IgG4 Fc region; preferably, the human IgG4 Fc region comprises the S228P mutation.

[0158] In some embodiments, the Fc region comprises an amino acid addition, deletion, or substitution that promotes the affinity between the first Fc subunit and the second Fc subunit.

[0159] In some embodiments, the first Fc subunit comprises one or more of the following amino acid substitutions: Y349C, T366S, L368A, and Y407V; and the second Fc subunit comprises one or more of the following amino acid substitutions: S354C and T366W.

[0160] In some embodiments, the Fc region has a reduced binding affinity to a Fc receptor or a reduced ADCC effector function, compared to a natural Fc region.

[0161] In some embodiments, the Fc region comprises one or more amino acid substitutions that reduce (1) binding to the Fc receptor and / or (2) ADCC effector function.

[0162] In some embodiments, the Fc region comprises one or more amino acid substitutions at the following positions according to the EU numbering scheme: positions 234, 235, 237, 265, 329, 331.

[0163] In some embodiments, the Fc region comprises: 234A / 235A; 234A / 235A / 237A; 234A / 235A / 331S; 234A / 235A / 331G; 234A / 235A / 329A; 234A / 235A / 329G; 234F / 235E / 331S; 234F / 235E / 265A; 234A / 235A / 237A / 265A; 234A / 235A / 237A / 329A; 234A / 235A / 237A / 331S; 234A / 235A / 237A / 331G; 234A / 235A / 265A / 329A; 234A / 235A / 265A / 331S; or 234A / 235A / 265A / 331G.

[0164] In some embodiments, the Fc region is a human IgG4 Fc region that comprises mutations 234A, 235A, 329G and 228P.

[0165] In some embodiments, the Fc region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, or an amino acid sequence that is at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the sequence of SEQ ID NO: 12.

[0166] In some embodiments, the antigen binding molecule further comprises a tumor associated antigen (TAA) binding domain;

[0167] preferably, the TAA is selected from the group consisting of: EGFR, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, tyrosine, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, and EphB2;

[0168] preferably, the TAA is EGFR;

[0169] preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of below 10μM;

[0170] preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.01nM-500nM; and / or the TAA binding domain and mouse EGFR have a binding affinity KD value of 0.01nM-300nM; and / or the TAA binding domain and monkey EGFR have a binding affinity KD value of 0.01nM-200nM;

[0171] preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.1nM-300nM;

[0172] preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 1nM-200nM;

[0173] preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.1nM-150nM;

[0174] preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.5nM-122nM;

[0175] preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.5nM-60nM;

[0176] preferably, the T cell binding domain and human CD3 have a binding affinity KD value of 0.02nM-50nM; the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.05nM-500nM; and the CAIX binding domain and human CAIX have a binding affinity KD value of 0.03nM-20nM.

[0177] preferably, the T cell binding domain and human CD3 have a binding affinity KD value of 0.2nM-6nM; the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.5nM-50nM; and the CAIX binding domain and human CAIX have a binding affinity KD value of 0.3nM-2nM.

[0178] In some embodiments, the TAA binding domain comprises: a domain antibody (dAb) , a single domain antibody (sdAb) , a VHH, a humanized VHH, a single-chain variable fragment (scFv) , a VL domain, a VH domain, a combination of VL and VH domains, or a Fab.

[0179] In some embodiments, the TAA binding domain comprises a sdAb or a VHH.

[0180] In some embodiments, the TAA binding domain is monovalent or polyvalent.

[0181] In some embodiments, the TAA binding domain comprises a humanized VHH or a camelid VHH.

[0182] In some embodiments, the T cell binding domain comprises an anti-CD3 Fab; the CAIX binding domain comprises an anti-CAIX VHH; and the TAA binding domain comprises an anti-EGFR VHH; preferably, the antigen binding molecule further comprises a Fc region.

[0183] In some embodiments, (1) the C-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and the anti-CAIX VHH or the anti-EGFR VHH is fused to either (a) the C-terminus of the light chain of the anti-CD3 Fab, or (b) the N-terminus of the second Fc subunit;

[0184] (2) the C-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and the anti-CAIX VHH or the anti-EGFR VHH is fused to either (a) the N-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab, or (b) the N-terminus of the second Fc subunit;

[0185] (3) the C-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and the anti-CAIX VHH or the anti-EGFR VHH is fused to either (a) the N-terminus of the light chain of the anti-CD3 Fab, or (b) the N-terminus of the second Fc subunit;

[0186] (4) the C-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and the anti-CAIX VHH is fused to the anti-EGFR VHH, which is then fused to the N-terminus of the second Fc subunit; or

[0187] (5) the C-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and the anti-EGFR VHH is fused to the anti-CAIX VHH, which is then fused to the N-terminus of the second Fc subunit.

[0188] In some embodiments, the C-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and the anti-EGFR VHH is fused to the C-terminus of the light chain of the anti-CD3 Fab; and the anti-CAIX VHH is fused to the N-terminus of the second Fc subunit.

[0189] In some embodiments, TAA binding domain comprises, according to the IMGT definition:

[0190] (a) a CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 80, 123, 137, and 165, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0191] (b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 164, 177, and 178, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0192] (c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 85, 104, 117, 130, 135, 136, and 181, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0193] preferably, the CDR3 sequence comprises AASYNVYYNX1YX2X3PISX4DEYDY (SEQ ID NO: 250) , wherein X1 is N or any other amino acid; X2 is Y or E; X3 is Y / K / V / R / D / E; and X4 is R or any other amino acid;

[0194] preferably, the CDR2 sequence comprises IAWDX1GSX2 (SEQ ID NO: 251) , wherein X1 is S or G; and X2 is T or S;

[0195] preferably, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123 or SEQ ID NO: 80; the CDR2 sequence comprises IAWDX1GSX2 (SEQ ID NO: 251) , wherein X1 is S or G; X2 is T or S; and the CDR3 comprises AASYNVYYNX1YX2X3PISX4DEYDY (SEQ ID NO: 250) , wherein X1 is N or any other amino acid; X2 is Y or E; X3 is Y / K / V / R / D / E; and X4 is R or any other amino acid.

[0196] In some embodiments, TAA binding domain comprises, according to the Chothia definition:

[0197] (a) CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 220, 228, and 245, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0198] (b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 202, and 238, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0199] (c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 199, 205, 214, 227, 235, 239 and 244, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .

[0200] In some embodiments, TAA binding domain comprises, according to the Kabat definition:

[0201] (a) CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 213, and 236, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0202] (b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 189, 200, 201, 206, 207, 218, and 243, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, ones, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0203] (c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 199, 205, 214, 227, 235, 239, and 244, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .

[0204] In some embodiments, (1) the TAA binding domain comprises, according to the IMGT definition:

[0205] (A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 135, respectively;

[0206] (B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 137, 177 and 135, respectively;

[0207] (C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 80, 177 and 135, respectively;

[0208] (D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 165, 177 and 135 respectively;

[0209] (E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 164 and 135, respectively;

[0210] (F) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 117 respectively;

[0211] (G) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 130 respectively;

[0212] (H) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 85 respectively;

[0213] (I) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 136, respectively;

[0214] (J) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 181, respectively;

[0215] (K) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 104 respectively; or

[0216] (L) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 178, and 104, respectively.

[0217] In some embodiments, the TAA binding domain comprises, according to the Kabat definition:

[0218] (A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 206, and 239, respectively;

[0219] (B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 213, 206, and 239, respectively;

[0220] (C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 213, 207, and 239 respectively;

[0221] (D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 200, and 239, respectively;

[0222] (E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 218, and 227 respectively;

[0223] (F) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 199 respectively;

[0224] (G) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 235 respectively;

[0225] (H) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 201, and 214, respectively;

[0226] (I) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 201, and 199, respectively;

[0227] (J) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 205, respectively;

[0228] (K) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 244 respectively; or

[0229] (L) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 243, and 244, respectively.

[0230] In some embodiments, the EGFR binding domain comprises, according to the Chothia definition:

[0231] (A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 239, respectively;

[0232] (B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 220, 202, and 239, respectively;

[0233] (C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 228, 202, and 239, respectively;

[0234] (D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 238, and 239, respectively;

[0235] (E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 227, respectively;

[0236] (F) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 199, respectively;

[0237] (G) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 235, respectively;

[0238] (H) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 214, respectively;

[0239] (I) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 205, respectively;

[0240] (J) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 244, respectively.

[0241] In some embodiments, the TAA binding domain further comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:

[0242] (1) the FR1 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 79, 103, 110;

[0243] (2) the FR2 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 73, 87, 102, 112, 118, 127, 132, 160;

[0244] (3) the FR3 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 83, 94, 95, 98, 116, 128, 145, 157, 174, 182; and

[0245] (4) the FR4 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101.

[0246] In some embodiments, the TAA binding domain comprises:

[0247] (a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71;

[0248] (b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71; or

[0249] (c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 22 and 53-71, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region; and

[0250] preferably, the TAA binding domain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NO: 22: positions 14, 79, 80, 87, 41, 45, 46, 47, 68, 33, 27, 30, 59, 3, 88, 49, 108, 109, 58, 44, 55, 75, 113, 72, 106;

[0251] preferably, the TAA binding domain comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 22: A14P, V79L, H80Y, K87R / D, T41P, R45L, E46V, F47Y, F68L, V33G, R27Y, S30G, Y59K / N, Q3T, P88A, A49S, Y59N, Y108E, Y109K / V, T58S, Y59R, E44G, S55G, and A75S;

[0252] preferably the antigen binding molecule is selected from: hu-207-1, hu-207-2, hu-207-3, hu-207-4, hu-207-5, hu-207-6, hu-207-7. A detailed description of these constructs can be found in the Example section. For example, the structures and sequences of hu-207-1, hu-207-2, hu-207-3, hu-207-4, hu-207-5, hu-207-6, and hu-207-7 can be found in FIG. 22.

[0253] In one aspect, the disclosure is related to an antigen binding molecule comprising a CD3 binding domain that specifically binds to CD3, wherein the CD3 binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of 0.01nM-1000nM, wherein the CD3 binding domain does not contain the VH and VL sequences as shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16;

[0254] preferably, the CD3 binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of 5nM-400nM;

[0255] preferably, the CD3 binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of 7nM-70nM.

[0256] In one aspect, the disclosure is related to an antigen binding molecule comprising a CD3 binding domain that specifically binds to CD3, wherein the CD3 binding domain comprises a heavy chain variable region (VH) and / or a light chain variable region (VL) .

[0257] In some embodiments, the VH comprises, according to the IMGT definition:

[0258] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 151, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0259] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 155, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0260] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 89, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0261] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 175, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0262] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 161, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; or

[0263] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 185, or variant sequences having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; and

[0264] the VL comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 153, 184, and 97 or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .

[0265] In some embodiments, the VH comprises, according to the Kabat definition:

[0266] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 237, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0267] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 233, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0268] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 198, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0269] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 209, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0270] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 215, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; or

[0271] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 223, or variant sequences having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; and

[0272] the VL comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 212, 219, and 97, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .

[0273] In some embodiments, the VH comprises, according to the Chothia definition:

[0274] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 215, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0275] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 223, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0276] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 237, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0277] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 233, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0278] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 198, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0279] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 209, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0280] the VL comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 212, 219, and 97, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .

[0281] In some embodiments, the CD3 binding domain further comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:

[0282] (1) the FR1 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 91, 103, 119, and 183;

[0283] (2) the FR2 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 125, 129, 133, and 156;

[0284] (3) the FR3 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 74, 105, 108, 111, and 121; and

[0285] (4) the FR4 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 115, 124, 142, 152, and 173.

[0286] In some embodiments, the T cell binding domain comprises a heavy chain that comprises:

[0287] (a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29;

[0288] (b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29; or

[0289] (c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region.

[0290] In some embodiments, the T cell binding domain comprises a light chain that comprises:

[0291] (a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34;

[0292] (b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34; or

[0293] (c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region;

[0294] preferably, the heavy chain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29: positions 3, 5, 15, 19, 78, 79, 80, 87, 102, 105, 106, 107, 108, 109, 114, and 120;

[0295] preferably, the heavy chain comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 15: K3Q, L5V, K15G, K19R, Q78K, S79N, I80S, N87S, G102H, G105L / R, N106D / R, S107G, Y108F / K / P, V109M, Y114D, and L120A;

[0296] preferably, the light chain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34: positions 8, 9, 12, 16, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 59, 60, 69, 71, 82, 87, 106, 107, 108, 109, and 46;

[0297] preferably, the light chain comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 16: S8P, A9S, T12V, E16G, E40Q, D43G, H44Q, L45A, F46P, T47R, G59W, V60T, I69L, D71G, T82A, I87D, V106L, E107T, I108V, K109L, and F46P.

[0298] In one aspect, the disclosure is related to an antigen binding molecule comprising a CAIX binding domain that specifically binds to CAIX, wherein the CAIX binding domain and human CAIX (hCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM; and / or the CAIX binding domain and cattle CAIX (cCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM; and / or the CAIX binding domain and rat CAIX (rCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM; and / or the CAIX binding domain and mouse CAIX (mCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM;

[0299] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-300nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 0.1nM-40pM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 1nM-150nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-150nM;

[0300] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-200nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 1.0nM-1.5pM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 10nM-15nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 10nM-15nM;

[0301] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-80nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 0.1nM-40pM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 0.3nM-80nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-30nM;

[0302] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.1nM-8nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 1.0nM-4pM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 3nM-8nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 0.1nM-3nM;

[0303] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-150nM;

[0304] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.03nM-60nM;

[0305] preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.07nM-52nM.

[0306] In one aspect, the disclosure is related to an antigen binding molecule comprising a CAIX binding domain that specifically binds to CAIX.

[0307] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises:

[0308] (A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 168, and SEQ ID NO: 180, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0309] (B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 131, and SEQ ID NO: 134, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0310] (C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 154, and SEQ ID NO: 176 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three, or four, or five amino acids substituted, deleted, or added;

[0311] preferably, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82;

[0312] preferably, the CDR3 sequence comprises X1X2X3X4WYX5GEYX6X7 (SEQ ID NO: 248) , wherein X1 is N, I, T or A; X2 is A, G, T or L; X3 is Q, H, P or L; X4 is V, Q, G or T; X5 is any amino acid; X6 is any amino acid, X7 is Y or L;

[0313] preferably, the CDR2 sequence comprises IRX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 249) , wherein X1 is K or R; X2 is S or A; X3 is G or L; X4 is R or S; X5 is T, P or K;

[0314] preferably, the CDR1 sequence comprises X1X2X3X4X5ING (SEQ ID NO: 263) , wherein X1 is G or S; X2 is G or T or P or N or E or S; X3 is G or P or Y or L or I, or E; X4 is G or F or V or W or N or A or I; X5 is A, W, L or S;

[0315] preferably, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; CDR2 sequence comprises IRX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 249) , wherein X1 is K or R; X2 is S or A; X3 is G or L; X4 is R or S; X5 is T, P or K; the CDR3 sequence comprises X1X2X3X4WYX5GEYX6X7 (SEQ ID NO: 248) , wherein X1 is N, I, T or A; X2 is A, G, T or L; X3 is Q, H, P or L; X4 is V, Q, G or T; X5 is any amino acid; X6 is any amino acid; X7 is Y or L.

[0316] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises, according to the Kabat definition:

[0317] (A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 246, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0318] (B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 241 and SEQ ID NO: 247, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0319] (C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 217, and SEQ ID NO: 229 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added.

[0320] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises, according to the Chothia definition:

[0321] (A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 242, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0322] (B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 222, and SEQ ID NO: 240, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0323] (C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 217, and SEQ ID NO: 229 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added.

[0324] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises, according to the IMGT definition:

[0325] (a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 176, respectively;

[0326] (b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 86, respectively;

[0327] (c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 100, and 176, respectively;

[0328] (d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 148, respectively;

[0329] (e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 120, respectively;

[0330] (f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 107, and 176, respectively;

[0331] (g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 144, respectively;

[0332] (h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 96, 134, and 176, respectively;

[0333] (i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 143, 134, and 176, respectively;

[0334] (j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 113, 134, and 176, respectively;

[0335] (k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 126, 131, and 154, respectively;

[0336] (l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 168, 131, and 154, respectively;

[0337] (m) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 75, 134, and 176, respectively;

[0338] (n) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 139, 134, and 176, respectively;

[0339] (o) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 77, 134, and 176, respectively; or

[0340] (q) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 180, 134, and 176, respectively.

[0341] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises, according to the Kabat definition:

[0342] (a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 247, and 192, respectively;

[0343] (b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 192, respectively;

[0344] (c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 197, respectively;

[0345] (d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 217, respectively;

[0346] (e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 229, respectively;

[0347] (f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 188, respectively;

[0348] (g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 241, and 192, respectively;

[0349] (h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 191, and 192, respectively;

[0350] (i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 231, 247, and 192, respectively;

[0351] (j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 234, 216, and 194, respectively;

[0352] (k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 213, 216, and 194, respectively;

[0353] (l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 225, and 192, respectively.

[0354] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises, according to the Chothia definition:

[0355] (a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 230, 211, and 192, respectively;

[0356] (b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 192, respectively;

[0357] (c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 242, 240, and 194, respectively;

[0358] (d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 204, 240, and 194, respectively;

[0359] (e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 193, 211, and 192, respectively;

[0360] (f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 210, 211, and 192, respectively;

[0361] (g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 208, 211, and 192, respectively;

[0362] (h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 224, 211, and 192, respectively;

[0363] (i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 187, 211, and 192, respectively;

[0364] (j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 222, and 192, respectively;

[0365] (k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 197, respectively;

[0366] (l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 217, respectively;

[0367] (m) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 229, respectively;

[0368] (n) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 188, respectively;

[0369] (o) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 226, 211, and 192, respectively.

[0370] In some embodiments, the CAIX binding domain further comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:

[0371] FR1 is selected from: SEQ ID NOS: 72, 81, 106, 114, 122, 138, 146, 158, 159, 162, and 172;

[0372] FR2 is selected from: SEQ ID NOS: 84, 88, 93, 166, 169, 170, 171, and 186;

[0373] FR3 is selected from: SEQ ID NOS: 76, 109, 140, 141, 149, 150, 163, 167, and 179; and

[0374] FR4 is selected from: SEQ ID NOS: 90, 99, 101, and 147.

[0375] In some embodiments, the CAIX binding domain comprises:

[0376] (a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52;

[0377] (b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52;

[0378] (d) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region;

[0379] preferably, the CAIX binding domain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52: positions 1, 13, 19, 41, 44, 50, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 72, 73, 74, 87, 96, 97, 98, 99, 102, 106, 107, 110, and 113;

[0380] preferably, the CAIX binding domain comprises one or more of the following substitutions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2: Q1E, H13Q, R19K, P41S, P41Q / T, Q44A / G, K53R, S54A, G55L, R56S, T57P / K, D61A, N73D, A74S, P87T, N96N / I / T / A, A97G / T / l, Q98H / P / l, V99Q / G / T, Y107L, Q110R, and Q113L / T / G;

[0381] preferably, the CAIX binding domain comprises one or more of: TA1F-12C9, TA1F-36 C1, TA1F-22B3, TA1F-33G5, TA1F-12B9, TA1F-26C8, TA1F-33B12, and TA1F-12G5;

[0382] preferably, the CAIX binding domain comprises one or more of: TA1F-12C9, TA1F-36C 1, TA1F-22B3, TA1F-33G5, TA1F-12B9, and TA1F-26C8;

[0383] preferably, the CAIX binding domain comprises one or more of: TA1F-36C1, TA1F-33G5, TA1F-12B9, and TA1F-12G5;

[0384] preferably, the CAIX binding domain comprises one or more of: TA1F-33B12, T A1F-12G5, and TA1F-33G5;

[0385] preferably, the CAIX binding domain comprises one or more of: TCE-1 ～ TCE-65.

[0386] In one aspect, the disclosure is related to an antigen binding molecule comprising an EGFR binding domain that specifically binds to EGFR, wherein the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.01nM-500nM; the EGFR binding domain and mouse EGFR have a binding affinity KD value of 0.01nM-300nM; and / or the EGFR binding domain and monkey EGFR have a binding affinity KD value of 0.01nM-200nM;

[0387] preferably, the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.1nM-300nM;

[0388] preferably, the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.1nM-150nM;

[0389] preferably, the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.5nM-122nM;

[0390] preferably, the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.5nM-60nM;

[0391] preferably, the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.03nM-20nM;

[0392] preferably, the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.5nM-50nM.

[0393] In one aspect, the disclosure is related to an antigen binding molecule comprising an EGFR binding domain that specifically binds to EGFR.

[0394] In some embodiments, the EGFR binding domain comprises:

[0395] (a) a CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 80, 123, 137, and 165, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0396] (b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 164, 177, and 178, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0397] (c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 85, 104, 117, 130, 135, 136, and 181, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, three or four amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0398] preferably, the CDR3 sequence comprises AASYNVYYNX1YX2X3PISX4DEYDY (SEQ ID NO: 250) , wherein X1 is N or any other amino acid; X2 is Y or E; X3 is Y / K / V / R / D / E; and X4 is R or any other amino acid;

[0399] preferably, the CDR2 sequence comprises IAWDX1GSX2 (SEQ ID NO: 251) , wherein X1 is S or G; and X2 is T or S;

[0400] preferably, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123 or SEQ ID NO: 80; the CDR2 sequence comprises IAWDX1GSX2 (SEQ ID NO: 251) , wherein X1 is S or G; X2 is T or S; and the CDR3 comprises AASYNVYYNX1YX2X3PISX4DEYDY (SEQ ID NO: 250) , wherein X1 is N or any other amino acid; X2 is Y or E; X3 is Y / K / V / R / D / E; and X4 is R or any other amino acid.

[0401] In some embodiments, TAA binding domain comprises, according to the Chothia definition:

[0402] (a) CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 220, 228, and 245, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0403] (b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 202, and 238, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0404] (c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 199, 205, 214, 227, 235, 239 and 244, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .

[0405] In some embodiments, TAA binding domain comprises, according to the Kabat definition:

[0406] (a) CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 213, and 236, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0407] (b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 189, 200, 201, 206, 207, 218, and 243, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0408] (c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 199, 205, 214, 227, 235, 239, and 244, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .

[0409] In some embodiments, the EGFR binding domain comprises, according to the IMGT definition:

[0410] (A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 135, respectively;

[0411] (B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 137, 177 and 135, respectively;

[0412] (C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 80, 177 and 135, respectively;

[0413] (D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 165, 177 and 135 respectively;

[0414] (E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 164 and 135, respectively;

[0415] (F) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 117 respectively;

[0416] (G) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 130 respectively;

[0417] (H) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 85 respectively;

[0418] (I) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 136, respectively;

[0419] (J) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 181, respectively;

[0420] (K) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 104 respectively; or

[0421] (L) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 178, and 104, respectively.

[0422] In some embodiments, the EGFR binding domain comprises, according to the Kabat definition:

[0423] (A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 206, and 239, respectively;

[0424] (B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 213, 206, and 239, respectively;

[0425] (C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 213, 207, and 239 respectively;

[0426] (D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 200, and 239, respectively;

[0427] (E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 218, and 227 respectively;

[0428] (F) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 199 respectively;

[0429] (G) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 235 respectively;

[0430] (H) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 201, and 214, respectively;

[0431] (I) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 205, respectively;

[0432] (J) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 244 respectively;

[0433] (K) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 243, and 244, respectively;

[0434] or (L) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 201, and 199, respectively; .

[0435] In some embodiments, the EGFR binding domain comprises, according to the Chothia definition:

[0436] (A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 239, respectively;

[0437] (B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 220, 202, and 239, respectively;

[0438] (C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 228, 202, and 239, respectively;

[0439] (D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 238, and 239, respectively;

[0440] (E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 227, respectively;

[0441] (F) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 199, respectively;

[0442] (G) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 235, respectively;

[0443] (H) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 214, respectively;

[0444] (I) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 205, respectively; or

[0445] (J) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 244, respectively.

[0446] In some embodiments, the EGFR binding domain further comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:

[0447] (1) the FR1 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 79, 103, 110;

[0448] (2) the FR2 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 73, 87, 102, 112, 118, 127, 132, 160;

[0449] (3) the FR3 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 83, 94, 95, 98, 116, 128, 145, 157, 174, 182; and

[0450] (4) the FR4 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101.

[0451] In some embodiments, the EGFR binding domain comprises:

[0452] (a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71;

[0453] (b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71; or

[0454] (c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 22 and 53-71, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region; and

[0455] preferably, the EGFR binding domain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NO: 22: positions 14, 79, 80, 87, 41, 45, 46, 47, 68, 33, 27, 30, 59, 3, 88, 49, 108, 109, 58, 44, 55, 75, 113, 72, 106;

[0456] preferably, the EGFR binding domain comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 22: A14P, V79L, H80Y, K87R / D, T41P, R45L, E46V, F47Y, F68L, V33G, R27Y, S30G, Y59K / N, Q3T, P88A, A49S, Y108E, Y109K / V, T58S, Y59R, E44G, S55G, and A75S.

[0457] In one aspect, the disclosure is related to an antigen binding molecule comprising (1) the CD3 binding domain described herein, and (2) the EGFR binding domain described herein;

[0458] preferably, the antigen binding molecule is any one of TCE-66, TCE-67, TCE-71, TC E-72, TCE-74, TCE-75, TCE-76, TCE-78, TCE-79, TCE-80, TCE-85, TCE-87, TCE-88, TCE-89, TCE-90, TCE-91, TCE-92, TCE-93, TCE-94, and TCE-95. A detailed description of these constructs can be found in the Example section. For example, Table 28 explains the structures of TCE-1 ～ TCE-95. The sequences of the VH variants and VL variants can be found in FIG. 18.

[0459] In one aspect, the disclosure is related to an antigen binding molecule comprising (1) the CAIX binding domain described herein, and (2) the EGFR binding domain described herein;

[0460] preferably, the multispecific antigen binding molecule further comprises the CD3 binding domain described herein.

[0461] In some embodiments, the antigen binding molecule comprises: a domain antibody (dAb) , a single domain antibody (sdAb) , a VHH, a humanized VHH, a single-chain variable fragment (scFv) , a VL domain, a VH domain, a combination of VL and VH domains, or a Fab.

[0462] In some embodiments, the antigen binding molecule further comprises a human IgG1 constant region, a human IgG2 constant region, a human IgG3 constant region, or a human IgG4 constant region.

[0463] preferably, the antigen binding molecule comprises a human IgG1 constant region or a human IgG4 constant region.

[0464] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid encoding the antigen binding molecule described herein.

[0465] In one aspect, the disclosure is related to a vector that comprises the nucleic acid described herein.

[0466] In one aspect, the disclosure is related to a host cell comprising the nucleic acid described herein or the vector described herein.

[0467] In one aspect, the disclosure is related to a method of making an antigen binding molecule, the method comprising: a) culturing the host cell described herein under conditions suitable for expression of the antigen binding molecule; and b) recovering the expressed antigen binding molecules.

[0468] In one aspect, the disclosure is related to an antigen-binding molecule that is generated by the method described herein.

[0469] In one aspect, the disclosure is related to a chimeric antigen receptor (CAR) comprising the antigen binding molecule described herein.

[0470] In one aspect, the disclosure is related to an antibody-drug conjugate (ADC) comprising the antigen binding molecule described herein covalently bound to a therapeutic agent.

[0471] In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.

[0472] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition comprising the antigen binding molecule described herein, or the CAR described herein, or the ADC described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0473] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a subject having a disease, the method comprising administering a pharmaceutically effective amount of the pharmaceutical composition described herein to the subject.

[0474] In some embodiments, the disease is cancer;

[0475] preferably, the cancer is selected from the group consisting of cervical cancer, renal cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, bowel cancer, breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical, adenocarcinoma, pancreatic cancer;

[0476] preferably, the cancer is selected from the group consisting of: colon cancer, pancreas cancer, kidney cancer, cervical, adenocarcinoma.

[0477] In one aspect, the disclosure is related to an antigen-binding protein, comprising:

[0478] (a) a Fc;

[0479] (b) a Fab fragment (Fab) that specifically binds to a T cell antigen; and

[0480] (c) a first single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to carbonic anhydrase IX (CAIX) ;

[0481] (d) a second single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to epidermal growth factor receptor (EGFR) .

[0482] In some embodiments, the Fab comprises or consists of a light chain variable domain (VL) , a light chain constant domain (CL) , a heavy chain variable domain (VH) , and a heavy chain first constant domain (CH1) .

[0483] In some embodiments, the Fab can activate T cells upon binding to the T cell antigen. In some embodiments, the T cell antigen is cluster of differentiation 3 (CD3) .

[0484] In some embodiments, the first VHH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52, and the second VHH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71.

[0485] In some embodiments, the Fab comprises a VH sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 15 and 23-29, and a VL sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 16 and 30-34.

[0486] In some embodiments, the CH1 domain of the Fab is linked to a CH2 domain in the Fc, optionally via a hinge region.

[0487] In some embodiments, the hinge region is a human IgG4 hinge region optionally with S228P mutation according to EU numbering.

[0488] In some embodiments, the first VHH is linked to a CH2 domain in the Fc, optionally via a hinge region.

[0489] In some embodiments, the first VHH is linked to a CH3 domain in the Fc, optionally via a linker sequence.

[0490] In some embodiments, the second VHH is linked to a CH3 domain in the Fc, optionally via a linker sequence.

[0491] In some embodiments, the second VHH is linked to the Fab.

[0492] In some embodiments, the second VHH is linked to the C-terminus of a CL domain in the Fab.

[0493] In some embodiments, the second VHH is linked to the N-terminus of a VH domain in the Fab.

[0494] In some embodiments, the second VHH is linked to the N-terminus of a VL domain in the Fab.

[0495] In one aspect, the disclosure is related to a protein complex, comprising:

[0496] (a) a first polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, a first CH2 domain, and a first CH3 domain;

[0497] (b) a second polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a first VHH, optionally a second hinge region, a second CH2 domain, and a second CH3 domain;

[0498] (c) a third polypeptide comprising in the direction of N-terminus to C-terminus: a VL, and a CL,

[0499] wherein the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen.

[0500] In some embodiments, the third polypeptide comprises in the direction of N-terminus to C-terminus: a VL, a CL domain, and a second VHH.

[0501] In some embodiments, the third polypeptide comprises in the direction of N-terminus to C-terminus: a second VHH, a VL and a CL domain.

[0502] In some embodiments, the first polypeptide comprises in the direction of N-terminus to C-terminus: a second VHH, a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, a first CH2 domain, and a first CH3 domain.

[0503] In some embodiments, the second polypeptide comprises in the direction of N-terminus to C-terminus: a first VHH, a second VHH, optionally a second hinge region, a second CH2 domain, and a second CH3 domain.

[0504] In some embodiments, the second polypeptide comprises in the direction of N-terminus to C-terminus: a first VHH, optionally a second hinge region, a second CH2 domain, a second CH3 domain, and a second VHH.

[0505] In some embodiments, the second polypeptide comprises in the direction of N-terminus to C-terminus: a first VHH, a second VHH, optionally a second hinge region, a second CH2 domain, and a second CH3 domain.

[0506] In some embodiments, the first, the second, or the third polypeptide further comprises a linker.

[0507] In some embodiments, the T cell antigen is CD3.

[0508] In some embodiments, the first VHH specifically binds to CAIX and the second VHH specifically binds to CAIX.

[0509] In some embodiments, the first VHH specifically binds to CAIX and the second VHH specifically binds to EGFR.

[0510] In some embodiments, the first VHH specifically binds to EGFR and the second VHH specifically binds to CAIX.

[0511] In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11, and the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0512] In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12, and the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0513] In some embodiments, the first VHH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-22, and 35-71.

[0514] In some embodiments, the first VHH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52, and the second VHH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71.

[0515] In some embodiments, the second VHH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52, and the first VHH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71.

[0516] In some embodiments, the first CH3 domain comprises one or more knob mutations, and the second CH3 domain comprises one or more hole mutations.

[0517] In some embodiments, the VHH is linked to the CH3 domain via a linker peptide.

[0518] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to CAIX, comprising:

[0519] (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 143; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176;

[0520] (2) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176;

[0521] (3) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 143; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176;

[0522] (4) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176;

[0523] (5) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 126; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 154;

[0524] (6) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 168; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 131; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 154;

[0525] (7) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176;

[0526] (8) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176;

[0527] (9) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 139; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176;

[0528] (10) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176;

[0529] (11) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 180; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176;

[0530] (12) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176;

[0531] (13) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86;

[0532] (14) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 148;

[0533] (15) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 120;

[0534] (16) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 176; or

[0535] (17) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134; and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 144.

[0536] In some embodiments, an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52.

[0537] In one aspect, the disclosure is related to an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to EGFR, comprising:

[0538] according to the IMGT definition:

[0539] (A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 135, respectively;

[0540] (B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 137, 177 and 135, respectively;

[0541] (C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 80, 177 and 135, respectively;

[0542] (D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 165, 177 and 135 respectively;

[0543] (E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 164 and 135, respectively;

[0544] (F) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 117 respectively;

[0545] (G) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 130 respectively;

[0546] (H) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 85 respectively;

[0547] (I) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 136, respectively;

[0548] (J) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 181, respectively;

[0549] (K) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 104 respectively; or

[0550] (L) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 178, and 104, respectively.

[0551] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71.

[0552] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the antigen-binding protein described herein, the protein complex described herein, or the antibody or antigen-binding fragment described herein.

[0553] In some embodiments, the nucleic acid is a DNA (e.g., cDNA) or RNA (e.g., mRNA) .

[0554] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising one or more of the nucleic acids described herein.

[0555] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising the vector described herein.

[0556] In some embodiments, the cell is a HEK293F cell or CHO cell.

[0557] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising one or more of the nucleic acids described herein.

[0558] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing an antigen-binding protein or protein complex, the method comprising culturing the cell described herein under conditions sufficient for the cell to produce the antigen-binding protein or protein complex; and collecting the antigen-binding protein or protein complex produced by the cell.

[0559] In one aspect, the disclosure is related to an antibody-drug conjugate comprising the antigen-binding protein described herein, the protein complex described herein, or the antibody or antigen-binding fragment described herein, covalently bound to a therapeutic agent.

[0560] In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.

[0561] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the antigen-binding protein described herein, the protein complex described herein, the antibody or antigen-binding fragment described herein, or the antibody-drug conjugate described herein, to the subject.

[0562] In some embodiments, the subject has a cancer expressing CAIX.

[0563] In some embodiments, the cancer is renal cancer.

[0564] In one aspect, the disclosure is related to a method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antigen-binding protein described herein, the protein complex described herein, the antibody or antigen-binding fragment described herein, or the antibody-drug conjugate described herein.

[0565] In one aspect, the disclosure is related to a method of killing a tumor cell, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antigen-binding protein described herein, the protein complex described herein, the antibody or antigen-binding fragment described herein, or the antibody-drug conjugate described herein.

[0566] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition comprising the antigen-binding protein described herein, or the protein complex described herein, the antibody or antigen-binding fragment described herein, or the antibody-drug conjugate described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0567] As used herein, the term “antibody” refers to any antigen-binding molecule that contains at least one (e.g., one, two, three, four, five, or six) complementary determining region (CDR) (e.g., any of the three CDRs from an immunoglobulin light chain or any of the three CDRs from an immunoglobulin heavy chain) and is capable of specifically binding to an epitope in an antigen. Non-limiting examples of antibodies include: monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multi-specific antibodies (e.g., bi-specific antibodies) , single-chain antibodies, single variable domain (VHH) antibodies, chimeric antibodies, human antibodies, and humanized antibodies. In some embodiments, an antibody can contain an Fc region of a human antibody. The term antibody also includes derivatives, e.g., multispecific antibodies, bispecific antibodies, trispecific antibodies, single-chain antibodies, diabodies, linear antibodies formed from these antibodies or antibody fragments, and antigen binding protein constructs.

[0568] As used herein, the term “antigen-binding fragment” refers to a portion of a full-length antibody, wherein the portion of the antibody is capable of specifically binding to an antigen. In some embodiments, the antigen-binding fragment contains at least one variable domain (e.g., a variable domain of a heavy chain, a variable domain of light chain or a VHH) . Non-limiting examples of antibody fragments include, e.g., Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, and Fv fragments, scFv, and VHH.

[0569] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present invention is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated in the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0570] As used herein, when referring to an antibody or an antigen-binding fragment, the phrases “specifically binding” and “specifically binds” mean that the antibody or an antigen-binding fragment interacts with its target molecule preferably to other molecules, because the interaction is dependent upon the presence of a particular structure (i.e., the antigenic determinant or epitope) on the target molecule; in other words, the reagent is recognizing and binding to molecules that include a specific structure rather than to all molecules in general. An antibody that specifically binds to the target molecule may be referred to as a target-specific antibody. For example, an antibody that specifically binds to CAIX may be referred to as CAIX-specific antibody or an anti-CAIX antibody.

[0571] As used herein, the term “bispecific antibody” refers to an antibody that binds to two different epitopes. The epitopes can be on the same antigen or on different antigens.

[0572] As used herein, the term “trispecific antibody” refers to an antibody that binds to three different epitopes. The epitopes can be on the same antigen or on different antigens.

[0573] As used herein, the term “multispecific antibody” refers to an antibody that binds to two or more different epitopes. The epitopes can be on the same antigen or on different antigens. A multispecific antibody can be e.g., a bispecific antibody or a trispecific antibody. In some embodiments, the multispecific antibody binds to two, three, four, five, or six different epitopes.

[0574] As used herein, a “VHH” refers to the variable domain of a heavy chain antibody. In some embodiments, the VHH is a humanized VHH. In some embodiments, the VHH is a single-domain antibody (sdAb) .

[0575] As used herein, the terms “polypeptide, ” “peptide, ” and “protein” are used interchangeably to refer to polymers of amino acids of any length of at least two amino acids.

[0576] As used herein, the terms “polynucleotide, ” “nucleic acid molecule, ” and “nucleic acid sequence” are used interchangeably herein to refer to polymers of nucleotides of any length of at least two nucleotides, and include, without limitation, DNA, RNA, DNA / RNA hybrids, and modifications thereof.

[0577] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Methods and materials are described herein for use in the present invention; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0578] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0579] FIGS. 1A-1B show two schematic structures of the CD3 / CAIX bispecific antibody ( “CAIX-BsAb” ) including an anti-CD3 Fab (TA1F) and an anti-CAIX VHH.

[0580] FIG. 2 shows the T cell mediated cell killing effects of target tumor cells (HT29 cells) induced by the CD3 / CAIX bispecific antibodies.

[0581] FIGS. 3A-3F show the cytokine secretion (IL-2, IL-6, IFN-γ and TNF-α) after T cell mediated killing of tumor cells (HT29 cells) induced by CD3 / CAIX bispecific antibodies. INF-γ is shown as INF-g in FIGS. 3A-3F.

[0582] FIGS. 4A-4D show the T cell mediated cell killing effects of target tumor cells (renal cancer cells) induced by the CD3 / CAIX bispecific antibodies (TA1F-33G5 and TA1F-12C9) . The tested renal cancer cells included UT-48 cells (FIG. 4A) , UT-44 cells (FIG. 4B) , UT-16 cells (FIG. 4C) , and UT-33A cells (FIG. 4D) .

[0583] FIGS. 5A-5B show the in vivo anti-tumor effects of the CD3 / CAIX bispecific antibody (TA1F-33G5) in a PBMC / HT-29 human colon cancer model (NCG mice) . FIG. 5A shows tumor size data and FIG. 5B shows tumor weight data.

[0584] FIGS. 6A-6B show the in vivo anti-tumor effects of the CD3 / CAIX bispecific antibody (TA1F-33G5) in a CT26-hCAIX mouse colon cancer model (hCD3E mice) . FIG. 6A shows tumor size data and FIG. 6B shows body weight data.

[0585] FIGS. 7A-7B show the in vivo anti-tumor effects of the CD3 / CAIX bispecific antibody (TA1F-33G5) in a Renca-hCAIX mouse renal cancer model (hCD3E mice) . FIG. 7A shows tumor size data and FIG. 7B shows body weight data.

[0586] FIGS. 8A-8D show schematic structures of several CD3 / CAIX bispecific antibodies ( “CAIX-BsAb” ) including an anti-CD3 arm and an anti-CAIX arm. In FIGS. 8A-8C, the anti-CAIX arm is in single domain antibody form (VHH) and the anti-CD3 arm is in the form of TA1 Fab (TA1F) , TA1 ScFv (TA1 ScFv) , or TA1 single domain antibody. In FIG. 8D, the anti-CAIX arm is in ScFv form, and the anti-CD3 arm is the Fab form.

[0587] FIGS. 8E-8G show the T cell mediated cell killing effects of target tumor cells (HT-29 cells) induced by the CD3 / CAIX bispecific antibodies.

[0588] FIGS. 9A-9J show schematic structures of several CD3 / CAIX / CAIX multispecific antibody constructs including (1) an anti-CD3 Fab (TA1F) , (2) a first anti-CAIX VHH and (3) a second anti-CAIX VHH.

[0589] FIGS. 10A-10C show the T cell mediated cell killing effects of target tumor cells induced by the CD3 / CAIX / CAIX multispecific antibodies. The tested tumor cells included HT-29 cells (FIG. 10A) , Caski cells (FIG. 10B) , and UT-14 cells (FIG. 10C) .

[0590] FIGS. 11A-11D show the expression profiles of potential cancer targets (EGFR and CAIX) in different tissues and cancer types.

[0591] FIGS. 12A-12L show schematic structures of several CD3 / CAIX / EGFR multispecific antibody constructs (201-212) including (1) an anti-CD3 Fab (TA1F) , (2) an anti-CAIX VHH (33G5) and (3) an anti-EGFR VHH (92) .

[0592] FIGS. 13A-13D show the in vivo anti-tumor effects of the CD3 / CAIX / EGFR multispecific antibody constructs (201-212) in a PBMC / HT-29 human colon cancer model (NCG mice) .

[0593] FIGS. 14A-14D show the in vivo anti-tumor effects of the CD3 / CAIX / EGFR multispecific antibody (207) and control bispecific antibodies (EGFR-BsAb and CAIX BsAb) in a PBMC / HT-29 human colon cancer model (NCG mice) . FIGS. 14A and 14C show tumor size data and FIGS. 14B and 14D show body weight data.

[0594] FIGS. 15A-15J show the in vivo cytokine secretion (IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-10, and TNF-α) induced by the CD3 / CAIX / EGFR multispecific antibody (207) and bispecific antibodies (EGFR-BsAb and CAIX BsAb) in BalB / C-hCD3EDG mice.

[0595] FIGS. 16A-16C show the body weight changes induced by the CD3 / CAIX / EGFR multispecific antibody (207) and bispecific antibodies (EGFR-BsAb and CAIX BsAb) in BalB / C-hCD3EDG mice.

[0596] FIGS. 17A-17B show the in vivo anti-tumor effects of the CD3 / CAIX / EGFR multispecific antibody (hu-207-2) in a PBMC / FTC238 human follicular thyroid cancer mouse model (NCG mice) . FIG. 17A shows tumor size data and FIG. 17B shows body weight data.

[0597] FIGS. 18-26 (SEQ ID NOs: 1-264) show relevant amino acid sequences.DETAILED DESCRIPTION

[0598] This disclosure relates to multispecific antibodies (e.g., trispecific antibodies) or antigen-binding proteins. In one aspect, the multispecific antibodies or antigen-binding proteins can bind to a T cell antigen (e.g., CD3) and / or one or more tumor-associated antigens (e.g., CAIX, EGFR) , or a combination thereof.

[0599] Cluster of differentiation 3 (CD3) is known in the art as a multi-protein complex of six chains (see, Abbas and Lichtman, 2003; Janeway et al., p 172 and 178, 1999) . In mammals, the complex comprises a CD3γ chain, a CD3δ chain, two CD3ε chains, and a homodimer of CD3ζ chains. The CD3γ, CD3δ, and CD3ε chains are highly related cell surface proteins of the immunoglobulin superfamily containing a single immunoglobulin domain. The transmembrane regions of the CD3γ, CD3δ, and CD3ε chains are negatively charged, which is a characteristic that allows these chains to associate with the positively charged T cell receptor chains. The intracellular tails of the CD3γ, CD3δ, and CD3ε chains each contain a single conserved motif known as an immunoreceptor tyrosine-based activation motif or ITAM, whereas each CD3ζ chain has three. It is believed the ITAMs are important for the signaling capacity of a TCR complex.

[0600] Carbonic anhydrase IX (CAIX) is a hypoxia-inducible enzyme that is overexpressed by cancer cells from many tumor types, and is a component of the pH regulatory system invoked by these cells to combat the deleterious effects of a high rate of glycolytic metabolism. CAIX is constitutively overexpressed in the vast majority of clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) and can also be induced in hypoxic microenvironments, a major hallmark of most solid tumors. CAIX expression is restricted to a few sites in healthy tissues, positioning this molecule as a strategic target for cancer immunotherapy. Carbonic anhydrases are metalloenzymes that reversibly catalyze the hydration of carbon dioxide, generating bicarbonate ions and protons. Several tumors, such as clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) , glioblastoma, triple-negative breast cancer, ovarian cancer, colorectal, and others overexpress carbonic anhydrase isoform IX (CAIX) . This transmembrane enzyme differs from most other CAs by having its catalytic site located in the extracellular domain, responsible for tumor microenvironment acidification. In consequence of the low pH, cathepsin B and other proteolytic enzymes are activated, creating a favorable environment for cancer cell migration and metastasis. An acidic pH also impairs the tumoricidal function of cytotoxic T cells and natural killer cells (NK) , favoring the occurrence of minimal residual disease and recurrence.

[0601] Solid tumors rely primarily on the blood supply to deliver oxygen and nutrients to help them grow. However, as tumors grow, blood vessels are unable to provide oxygen and nutrients to every part of the tumor, resulting in localized hypoxia. Hypoxia initiates a global adaptive response, mainly by activating hypoxia-inducible factor (HIF) to trigger metabolic shifts that are critical for cell survival to increase reliance on the glycolytic pathway. This will lead to the continuous accumulation of acidic by-products and reliance on pH-regulating enzymes and transporters to maintain intracellular alkaline pH to maintain tumor cell proliferation and survival. The extracellular environment becomes acidic due to increased lactate and proton efflux. Acidic pH also causes metabolic reorganization to meet the cell's macromolecule and bioenergy needs and maintain its own survival.

[0602] Carbonic anhydrase (CA) is a type of metalloprotease that catalyzes the reversible hydration of CO2 into bicarbonate and protons

[0603] CAIX is a tumor-associated cell surface glycoprotein that is induced by hypoxia and is anchored in the plasma membrane via a single transmembrane domain and a short cytoplasmic tail. Its active center faces the outside of the cell and contributes to CO2 hydration and pH regulation, while promoting CO2 diffusion and proton migration in tumor cells, helping the adaptation to acidosis.

[0604] The main function of CAIX is to maintain intracellular pH homeostasis under hypoxic conditions. Overexpression of CAIX in tumor cells is considered a hypoxic marker of the tumor microenvironment and is closely related to poor prognosis of patients. It is now generally believed that CAIX is involved in tumor formation and progression.

[0605] On the one hand, CAIX can cooperate with bicarbonate transporters (NBC) and monocarboxylate transporters (MCT) to remove acid from cells and ensure that alkaline pH is maintained in cells, thus benefiting survival of tumor cells. CAIX catalyzes the conversion of extracellular CO2 into protons and bicarbonate ions through its extracellular active center. Bicarbonate ions are transported from the adjacent NBC to the cytoplasmic matrix. In the cell, bicarbonate is catalyzed by CA II in the cytoplasm matrix and combines with protons to undergo a reverse reaction and is converted into CO2, which leaves the cell through diffusion. On the other hand, the protons generated by the CAIX catalyzed reaction remain outside the cell and contribute to the acidification of the surrounding environment of the cell, supporting tumor cells to invade surrounding tissues and eventually become a more aggressive form of tumor capable of spreading to other organs.

[0606] The CAIX gene is located downstream of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene and is activated by the HIF1 pathway. VHL is a ubiquitin ligase (E3) . Under normoxic conditions, HIF1 / 2α is hydroxylated. VHL targets the hydroxylated HIF1 / 2α to cause ubiquitination and degradation. VHL protein controls the expression of CAIX by degrading HIF protein. Inactivation of VHL is very common in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) . It has been reported that inactivating mutations of VHL exist in up to 90%of ccRCC. In ccRCC, inactivating mutations in VHL lead to the loss of function of the VHL tumor suppressor gene, leading to the accumulation of HIF1 / 2α, thereby upregulating the expression of CAIX.

[0607] Common tumor types overexpressing CAIX include cervical cancer, kidney cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, intestinal cancer, breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, bladder cancer, etc. In normal tissues, CAIX is mainly expressed in epithelial cells of the stomach, bile duct, and small intestine. However, unlike tumor cells, CAIX expressed in normal tissues is mainly located in the cytoplasm.

[0608] Immunohistochemistry studies have shown that more than 85%of primary renal cancers and metastatic renal cancers express CAIX antigen, and almost all ccRCC, which accounts for 90%of renal cancers, express CAIX antigen, while normal renal tissue does not express CAIX antigen. Therefore, CAIX is an ideal target for tumor therapy.

[0609] The epidermal growth factor receptor (EGFR) belongs to the ErbB family of receptor tyrosine kinases (RTKs) and exerts critical functions in epithelial cell physiology (Schlessinger, 2014) . It is frequently mutated and / or overexpressed in different types of human cancers and is the target of multiple cancer therapies currently adopted in the clinical practice (Yarden and Pines, 2012) . The physiological function of the epidermal growth factor receptor (EGFR) is to regulate epithelial tissue development and homeostasis. In pathological settings, mostly in lung and breast cancer and in glioblastoma, the EGFR is a driver of tumorigenesis. Inappropriate activation of the EGFR in cancer mainly results from amplification and point mutations at the genomic locus, but transcriptional upregulation or ligand overproduction due to autocrine / paracrine mechanisms has also been described. Moreover, the EGFR is increasingly recognized as a biomarker of resistance in tumors, as its amplification or secondary mutations have been found to arise under drug pressure. This evidence, in addition to the prominent function that this receptor plays in normal epithelia, has prompted intense investigations into the role of the EGFR both at physiological and at pathological level.

[0610] In general, multispecific antibodies (e.g., trispecific antibodies) include two or more antigen-binding sites targeting different antigens or different epitopes of the same antigen. Thus, multispecific antibodies (e.g., trispecific antibodies) can have more functions than a monospecific antibody. For example, these functions include, but not limited to, stronger binding to an antigen through an avidity effect; co-localization of bound antigens on the cell surface and the effect therefrom; increasing the serum half-life of an antibody fragment by linking it to a second antibody fragment that is bound to a protein with a long serum half-life, e.g., albumin or transferrin; and bringing two cells into proximity by binding to an antigen on each of the cells.

[0611] Among the purposes of multispecific antibodies (e.g., trispecific antibodies) , one class of molecules, T cell engagers (TCE) , has gained more attention. A TCE is a multispecific antibody (e.g., trispecific antibodies) which binds to an antigen on a T cell and an antigen on another cell simultaneously. CD3 is usually selected as the antigen on the T cell. A cancer or tumor cell is usually selected as the other cell type as discussed above. Through binding to CD3 on T cells and a tumor associated antigen (TAA) on cancer cells, the TCE can induce activation of T cells upon binding to cancer cells and cause the killing of the latter.

[0612] Nevertheless, there are some hurdles to overcome in order to generate desirable homogeneous multispecific antibodies (e.g., trispecific antibodies) . The first hurdle is mismatch of heavy chains that bind to the same target (e.g., antigen or epitope) . For example, to generate multispecific antibodies with a desired format, the heavy chains targeting different targets should ideally form a heterodimer. However, the percentage of the desired multispecific antibodies varies greatly in different constructs. Mutations to induce the formation of knobs-into-holes between two heavy chains can be employed to reduce the formation of homodimers of the heavy chains that bind to the same target. Exemplary amino acid sequences of knob-chain and hole-chain Fc that facilitate heterodimer formation are set forth in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, respectively.

[0613] The second hurdle to overcome is the mismatch between heavy chain variable regions (VHs) and light chain variable regions (VLs) . A monoclonal antibody has two identical Fab fragments, each having a paired VH and VL. By contrast, a multispecific antibody usually has several different heavy chain variable regions and several different light chain variable regions. Therefore, there is a possibility that each VH can bind to multiple VLs and each VL can bind to multiple VHs. As a result, only some of the formed multispecific antibodies are functional without addressing this mismatch issue.

[0614] Several strategies have been designed to disable this mismatch. One solution is to design an antibody with a common light chain. Specifically, a light chain, or more precisely a VL, is selected which can form a dimer with all VHs. This design abrogated the necessity of matching VH and VL with the same target-binding specificity. The shortcoming of this strategy is that the contribution of VL in target binding is greatly reduced, leading to difficulty finding an optimal VH as the VH will be greatly if not entirely responsible for target binding.

[0615] Another solution is the use of CrossMAb technology, in which a VL is fused to heavy chain constant domain 1 (CH1) and becomes part of this heavy chain. Meanwhile, the corresponding VH is fused to the light chain constant region (CL) and becomes a part of this light chain.

[0616] The present disclosure provides a different strategy. The reason of employing technologies, e.g., CrossMAb or common light chain, is because conventional antibodies have and need both heavy and light chains to function and / or maintain stability. However, target binding does not necessarily require both heavy and light chains. For example, a Fab fragment (Fab) contains a variable and constant domain of the light chain and a variable domain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain, is fully functional for antigen binding. The variable domain of heavy chain antibodies (VHH) , e.g., derived from camelids such as llama, camel, or alpaca, is fully functional for antigen binding. By fusing antibody fragments (e.g., Fab or VHH) to human Fc with heterodimer preference, multispecific antibodies can be generated without considering the mismatch between heavy and light chains.

[0617] In this disclosure, a Fab that can bind to human CD3 and a VHH that can bind to one or more tumor associated antigens (e.g., CAIX or EGFR) is provided. Either antibody fragment is positioned on each of the four ends of Fc (N-or C-end of knob or hole chain) , and the other antibody fragment on the other three available ends of the Fc. Such a design gives rise to 2 different CD3 / CAIX bispecific antibody molecules (See FIGS. 1A-1B) , 10 different CD3 / CAIX / CAIX multispecific antibodies (See FIGS. 9A-9J) , and 12 different CD3 / CAIX / EGFR multispecific antibodies (See FIGS. 12A-12L, corresponding to 201-212) .

[0618] In some embodiments, the multispecific antibody or antigen-binding protein can include 1, 2, 3, 4 or more than four Fab fragments. In some embodiments, the multispecific antibody or antigen-binding protein can include 1, 2, 3, 4, 5 or more than five VHHs. In some embodiments, the Fab can target CD3 or another tumor associated antigen. In some embodiments, the VHH can target CD3 or another tumor associated antigen. The Fab, the VHH, and the multispecific antibody or the antigen binding proteins with various formats are described in detail below.

[0619] Heavy-chain antibody variable domain (VHH)

[0620] Monoclonal and recombinant antibodies are important tools in medicine and biotechnology. Like all mammals, camelids (e.g., llamas) can produce conventional antibodies made of two heavy chains and two light chains bound together with disulfide bonds in a Y shape (e.g., IgG1) . However, they also produce two unique subclasses of IgG: IgG2 and IgG3, also known as heavy chain antibody. These antibodies are made of only two heavy chains, which lack the CH1 region but still bear an antigen-binding domain at their N-terminus called VHH (or nanobody) . Conventional Ig require the association of variable regions from both heavy and light chains to allow a high diversity of antigen-antibody interactions. Although isolated heavy and light chains still show this capacity, they exhibit very low affinity when compared to paired heavy and light chains. The unique feature of heavy chain antibody is the capacity of their monomeric antigen binding regions to bind antigens with specificity, affinity and especially diversity that are comparable to conventional antibodies without the need of pairing with another region. This feature is mainly due to a couple of major variations within the amino acid sequence of the variable region of the two heavy chains, which induce deep conformational changes when compared to conventional Ig. Major substitutions in the variable regions prevent the light chains from binding to the heavy chains, but also prevent unbound heavy chains from being recycled by the Immunoglobulin Binding Protein.

[0621] The single variable domain of these antibodies (designated VHH, sdAb, nanobody, or heavy-chain antibody variable domain) is the smallest antigen-binding domain generated by adaptive immune systems. The third Complementarity Determining Region (CDR3) of the variable region of these antibodies has often been found to be twice as long as the conventional ones. This results in an increased interaction surface with the antigen as well as an increased diversity of antigen-antibody interactions, which compensates the absence of the light chains. With a long complementarity-determining region 3 (CDR3) , VHHs can extend into crevices on proteins that are not accessible to conventional antibodies, including functionally interesting sites such as the active site of an enzyme or the receptor-binding canyon on a virus surface. Moreover, an additional cysteine residue allows the structure to be more stable, thus increasing the strength of the interaction.

[0622] VHHs offer numerous other advantages compared to conventional antibodies carrying variable domains (VH and VL) of conventional antibodies, including higher stability, solubility, expression yields, and refolding capacity, as well as better in vivo tissue penetration. Moreover, in contrast to the VH domains of conventional antibodies VHHs do not display an intrinsic tendency to bind to light chains. This facilitates the induction of heavy chain antibodies in the presence of a functional light chain loci. Further, since VHHs do not bind to VL domains, it is much easier to reformat VHHs into multispecific antibody constructs than constructs containing conventional VH-VL pairs or single domains based on VH domains.

[0623] The disclosure provides e.g., anti-CAIX antibodies, the modified antibodies thereof, the chimeric antibodies thereof, and the humanized antibodies thereof. The disclosure also provides VHH of these antibodies. These VHHs can be used in various multispecific antibody constructs as described herein.

[0624] The amino acid sequences for various VHHs are also provided. In some embodiments, the VHH domain is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-22, and 35-71. In some embodiments, the VHH domain is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to any one of the VHH sequences in FIG. 18.

[0625] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy-chain antibody variable domain (VHH) containing one, two, or three of VHH CDR1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VHH CDR2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VHH CDR3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions, wherein VHH CDR1, VHH CDR2, and VHH CDR3 are selected from the CDRs shown in FIG. 19 (IMGT CDR) , FIG. 21 (Kabat CDR) or FIG. 22 (Chothia CDR) .

[0626] The insertions, deletions, and substitutions can be within the CDR sequence, or at one or both terminal ends of the CDR sequence. In some embodiments, the CDR is determined based on the Kabat numbering scheme. In some embodiments, the CDR is determined based on the Chothia numbering scheme. In some embodiments, the CDR is determined based on the IMGT numbering scheme. In some embodiments, the CDR is determined based on the AbM numbering scheme. In some embodiments, the CDR is determined the “contact” numbering scheme. In some embodiments, the CDR is determined based on a combination numbering scheme.

[0627] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished, e.g., using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0628] The disclosure also provides nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy-chain antibody variable domain (VHH) .

[0629] In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof comprises an Fc domain that can be originated from various types (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) , or subclass. In some embodiments, the Fc domain is originated from an IgG antibody or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the Fc domain comprises one, two, three, four, or more heavy chain constant regions.

[0630] CAIX binding molecule

[0631] The disclosure provides CAIX binding molecules, e.g., anti-CAIX antibodies and antigen-binding fragments thereof. The disclosure also provides VHHs that specifically bind CAIX. The anti-CAIX VHHs can be used in various multispecific antibody constructs as described herein.

[0632] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can have an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOS: 1-10, 17-21, and 35-52.

[0633] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can have CDR1, CDR2, and CDR3 sequences that are identical to the CDR1, CDR2, and CDR3 sequences of any one of SEQ ID NOS: 1-10, 17-21, and 35-52.

[0634] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a VH containing VH CDR1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VH CDR2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VH CDR3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions, and a VL containing VL CDR1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VL CDR2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VL CDR3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions, wherein the VH CDRs are selected from any VH as described herein, and the VL CDRs are selected from any VL as described herein.

[0635] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises an amino acid sequence that is the same as the amino acid sequence of one of the following constructs in FIG. 18: 33B12, 33G5, 12G5, 36C1, 12B9, 22B3, 12C9, 26C8, 33A10, 35E7, S-3B4, S-2E7, S-5B9, S-7F10, S-2C7, 33G5-2, 33G5-6, 33G5-9, 33G5-10, 33G5-12, 33G5-13, 33G5-14, 33G5-15, 33G5-16, 33G5-17, 33G5-18, 33G5-19, 33G5-23, 33G5-30, S-3B4-3, S-3B4-5, S-3B4-6, S-3B4-7.

[0636] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises:

[0637] (A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 168, and SEQ ID NO: 180, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0638] (B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 131, and SEQ ID NO: 134, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0639] (C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 154, and SEQ ID NO: 176 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0640] In some embodiments, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82;

[0641] In some embodiments, , the CDR3 sequence comprises X1X2X3X4WYX5GEYX6X7 (SEQ ID NO: 248) , wherein X1 is N, I, T or A; X2 is A, G, T or L; X3 is Q, H, P or L, X4 is V, Q, G or T, X5 is any amino acid, X6 is any amino acid, X7 is Y or L;

[0642] In some embodiments, the CDR2 sequence comprises IRX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 249) , wherein X1 is K or R; X2 is S or A; X3 is G or L; X4 is R or S, X5 is T, P or K;

[0643] In some embodiments, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; CDR2 sequence comprises IRX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 249) , wherein X1 is K or R; X2 is S or A; X3 is G or L; X4 is R or S, X5 is T, P or K; the CDR3 sequence comprises X1X2X3X4WYX5GEYX6X7 (SEQ ID NO: 248) , wherein X1 is N, I, T or A; X2 is A, G, T or L; X3 is Q, H, P or L, X4 is V, Q, G or T, X5 is any amino acid, X6 is any amino acid, X7 is Y or L;

[0644] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises, according to the IMGT definition:

[0645] (a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 176, respectively;

[0646] (b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 86, respectively;

[0647] (c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 148, respectively;

[0648] (d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 120, respectively;

[0649] (e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 107, and 176, respectively;

[0650] (f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 144, respectively;

[0651] (g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 96, 134, and 176, respectively;

[0652] (h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 96, 134, and 176, respectively;

[0653] (i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 143, 134, and 176, respectively;

[0654] (j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 113, 134, and 176, respectively;

[0655] (k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 126, 131, and 154, respectively;

[0656] (l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 168, 131, and 154, respectively;

[0657] (m) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 75, 134, and 176, respectively;

[0658] (n) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 139, 134, and 176, respectively;

[0659] (o) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 77, 134, and 176, respectively; or

[0660] (r) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 180, 134, and 176, respectively; or

[0661] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises, according to the Kabat definition:

[0662] (a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 247, and 192, respectively;

[0663] (b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 197, respectively;

[0664] (c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 217, respectively;

[0665] (d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 229, respectively;

[0666] (e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 241, and 192, respectively;

[0667] (f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 188, respectively;

[0668] (g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 247, and 192, respectively;

[0669] (h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 247, and 192, respectively;

[0670] (i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 191, and 192, respectively;

[0671] (j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 231, 247, and 192, respectively;

[0672] (k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 234, 216, and 194, respectively;

[0673] (l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 213, 216, and 194, respectively.

[0674] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises, according to the Chothia definition:

[0675] (a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 230, 211, and 192, respectively;

[0676] (b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 192, respectively;

[0677] (c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 242, 240, and 194, respectively;

[0678] (d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 204, 240, and 194, respectively;

[0679] (e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 193, 211, and 192, respectively;

[0680] (f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 210, 211, and 192, respectively;

[0681] (g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 208, 211, and 192, respectively;

[0682] (h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 224, 211, and 192, respectively;

[0683] (i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 187, 211, and 192, respectively;

[0684] (j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 222, and 192, respectively;

[0685] (k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 197, respectively;

[0686] (l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 217, respectively;

[0687] (m) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 229, respectively;

[0688] (n) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 188, respectively.

[0689] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:

[0690] FR1 is selected from: SEQ ID NOS: 72, 81, 106, 114, 122, 138, 146, 158, 159, 162, and 172;

[0691] FR2 is selected from: SEQ ID NOS: 84, 88, 93, 166, 169, 170, 171, and 186;

[0692] FR3 is selected from: SEQ ID NOS: 76, 109, 140, 141, 149, 150, 163, 167, and 179; and

[0693] FR4 is selected from: SEQ ID NOS: 90, 99, 101, and 147.

[0694] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises: the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52; an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52; or an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region.

[0695] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52: positions 1, 13, 19, 41, 44, 50, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 72, 73, 74, 87, 96, 97, 98, 99, 102, 106, 107, 110, and 113.

[0696] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises one or more of the following substitutions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2: Q1E, H13Q, R19K, P41S, P41Q / T, Q44A / g, K53R, S54A, G55L, R56S, T57P / K, D61A, N73D, A74S, P87T, N96N / I / T / a, A97G / T / l, Q98H / P / l, V99Q / g / T, Y107L, Q110R, and Q113L / T.

[0697] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can have complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected CDR3 amino acid sequence. The selected CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are shown in FIG. 19 (IMGT CDR) , FIG. 21 (Kabat CDR) and FIG. 22 (Chothia CDR) .

[0698] The insertions, deletions, and substitutions can be within the CDR sequence, or at one or both terminal ends of the CDR sequence. In some embodiments, the CDR is determined based on the IMGT definition. In some embodiments, the CDR is determined based on the Kabat definition. In some embodiments, the CDR is determined based on the Chothia definition. In some embodiments, the CDR is determined based on the AbM definition. In some embodiments, the CDR is determined the “contact” definition. In some embodiments, the CDR is determined based on a combination definition.

[0699] The disclosure also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that can compete with the antibodies described herein. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments can bind to the same epitope as the antibodies described herein. The present disclosure also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with any antibody or antigen-binding fragment as described herein. The cross-competing assay is known in the art, and is described e.g., in Moore et al., "Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein. " Journal of virology 70.3 (1996) : 1863-1872, which is incorporated herein reference in its entirety. In one aspect, the present disclosure also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the same epitope or region as any antibody or antigen-binding fragment as described herein. The epitope binning assay is known in the art, and is described e.g., in Estep et al. "High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. " MAbs. Vol. 5. No. 2. Taylor &Francis, 2013, which is incorporated herein reference in its entirety.

[0700] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0701] The disclosure also provides nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide that comprises CDRs as shown in FIG. 19, FIG. 21, or FIG. 22, or have sequences as shown in FIG. 18.

[0702] EGFR binding molecule

[0703] The disclosure provides EGFR binding molecules, e.g., anti-EGFR antibodies and antigen-binding fragments thereof. The disclosure also provides VHHs that specifically bind EGFR. The anti-EGFR VHHs can be used in various multispecific antibody constructs as described herein.

[0704] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can have an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71.

[0705] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can have CDR1, CDR2, and CDR3 sequences that are identical to the CDR1, CDR2, and CDR3 sequences of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71.

[0706] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a VH containing VH CDR1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VH CDR2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VH CDR3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions, and a VL containing VL CDR1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VL CDR2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VL CDR3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions, wherein the VH CDRs are selected from any VH as described herein, and the VL CDRs are selected from any VL as described herein.

[0707] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises an amino acid sequence that is the same as the amino acid sequence of one of the following constructs in FIG. 18: 92, 92-1, 92-11, 92-12, 92-14, 92-15, 92-16, 92-18, 92-19, 92-20, 92-25, 92-27, 92-28, 92-29, 92-30, 92-31, 92-32, 92-33, 92-34, and 92-35.

[0708] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises:

[0709] (a) a CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 80, 123, 137, and 165, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0710] (b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 164, 177, and 178, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and

[0711] (c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 85, 104, 117, 130, 135, 136, and 181, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0712] In some embodiments, the CDR3 sequence comprises AASYNVYYNX1YX2X3PISX4DEYDY (SEQ ID NO: 250) , wherein X1 is N or any other amino acid; X2 is Y or E; X3 is Y / K / V / R / D / E; and X4 is R or any other amino acid;

[0713] In some embodiments, the CDR2 sequence comprises IAWDX1GSX2 (SEQ ID NO: 251) , wherein X1 is S or G; and X2 is T or S;

[0714] In some embodiments, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123; the CDR2 sequence comprises IAWDX1GSX2 (SEQ ID NO: 251) , wherein X1 is S or G; X2 is T or S; and the CDR3 comprises AASYNVYYNX1YX2X3PISX4DEYDY (SEQ ID NO: 250) , wherein X1 is N or any other amino acid; X2 is Y or E; X3 is Y / K / V / R / D / E; and X4 is R or any other amino acid;

[0715] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises, according to the IMGT definition:

[0716] (A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 135, respectively;

[0717] (B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 137, 177 and 135, respectively;

[0718] (C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 80, 177 and 135, respectively;

[0719] (D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 165, 177 and 135 respectively;

[0720] (E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 164 and 135, respectively;

[0721] (F) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 117 respectively;

[0722] (G) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 130 respectively;

[0723] (H) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 85 respectively;

[0724] (I) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 136, respectively;

[0725] (J) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 181, respectively;

[0726] (K) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 104 respectively; or

[0727] (L) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 178, and 104, respectively; or

[0728] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises, according to the Kabat definition:

[0729] (A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 206, and 239, respectively;

[0730] (B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 213, 206, and 239, respectively;

[0731] (C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 213, 207, and 239 respectively;

[0732] (D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 200, and 239, respectively;

[0733] (E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 218, and 227 respectively;

[0734] (F) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 199 respectively;

[0735] (G) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 235 respectively;

[0736] (H) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 201, and 214, respectively;

[0737] (I) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 205, respectively;

[0738] (J) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 244 respectively; or

[0739] (K) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 243, and 244, respectively;

[0740] or (L) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 201, and 199, respectively; or

[0741] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises, according to the Chothia definition:

[0742] (A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 239, respectively;

[0743] (B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 220, 202, and 239, respectively;

[0744] (C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 228, 202, and 239, respectively;

[0745] (D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 238, and 239, respectively;

[0746] (E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 227, respectively;

[0747] (F) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 199, respectively;

[0748] (G) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 235, respectively;

[0749] (H) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 214, respectively;

[0750] (I) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 205, respectively; or

[0751] (J) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 244, respectively.

[0752] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:

[0753] (1) the FR1 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 79, 103, 110;

[0754] (2) the FR2 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 73, 87, 102, 112, 118, 127, 132, 160;

[0755] (3) the FR3 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 83, 94, 95, 98, 116, 128, 145, 157, 174, 182; and

[0756] (4) the FR4 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101.

[0757] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises:

[0758] (a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71;

[0759] (b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71; or

[0760] (c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 22 and 53-71, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region.

[0761] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NO: 22: positions 14, 79, 80, 87, 41, 45, 46, 47, 68, 33, 27, 30, 59, 3, 88, 49, 108, 109, 58, 44, 55, 75, 113, 72, 106.

[0762] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 22: A14P, V79L, H80Y, K87R / D, T41P, R45L, E46V, F47Y, F68L, V33G, R27Y, S30G, Y59K / N, Q3T, P88A, A49S, Y108E, Y109K / V, T58S, Y59R, E44G, S55G, and A75S.

[0763] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can have complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected CDR3 amino acid sequence. The selected CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences are shown in FIG. 19 (IMGT CDR) , FIG. 21 (Kabat CDR) and FIG. 22 (Chothia CDR) .

[0764] The insertions, deletions, and substitutions can be within the CDR sequence, or at one or both terminal ends of the CDR sequence. In some embodiments, the CDR is determined based on the IMGT definition. In some embodiments, the CDR is determined based on the Kabat definition. In some embodiments, the CDR is determined based on the Chothia definition. In some embodiments, the CDR is determined based on the AbM definition. In some embodiments, the CDR is determined the “contact” definition. In some embodiments, the CDR is determined based on a combination definition.

[0765] The disclosure also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that can compete with the antibodies described herein. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments can bind to the same epitope as the antibodies described herein. The present disclosure also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with any antibody or antigen-binding fragment as described herein. The cross-competing assay is known in the art, and is described e.g., in Moore et al., "Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein. " Journal of virology 70.3 (1996) : 1863-1872, which is incorporated herein reference in its entirety. In one aspect, the present disclosure also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the same epitope or region as any antibody or antigen-binding fragment as described herein. The epitope binning assay is known in the art, and is described e.g., in Estep et al. "High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. " MAbs. Vol. 5. No. 2. Taylor &Francis, 2013, which is incorporated herein reference in its entirety.

[0766] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0767] The disclosure also provides nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide that comprises CDRs as shown in FIG. 19 or FIG. 21 or FIG. 22, or have sequences as shown in FIG. 18.

[0768] CD3 binding molecule

[0769] The disclosure provides CD3 binding molecules, e.g., anti-CD3 antibodies and antigen-binding fragments thereof. The disclosure also provides Fab fragments that target CD3. The anti-CD3 Fab fragments can be used in various multispecific antibody constructs as described herein. A Fab fragment (Fab) contains a variable and constant domain of the light chain and a variable domain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain.

[0770] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can have a VH that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 15 (TA1) . In some embodiments, the Fab can have a VL that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to SEQ ID NO: 16 (TA1) . In some embodiments, the Fab comprises a VH sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 15 and 23-29. In some embodiments, the Fab comprises a VL sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 16 and 30-34.

[0771] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can have a heavy chain variable region (VH) comprising VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 that are identical to VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 of any VH as described herein (e.g., SEQ ID NO: 15) ; and a light chain variable region (VL) comprising VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 that are identical to VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 of a VL as described herein (e.g., SEQ ID NO: 16) .

[0772] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a VH containing VH CDR1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VH CDR2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VH CDR3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions, and a VL containing VL CDR1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VL CDR2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VL CDR3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions, wherein the VH CDRs are selected from any VH as described herein, and the VL CDRs are selected from any VL as described herein.

[0773] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a heavy chain variable domain (VH) that is selected from the following heavy chain variable domains in FIG. 18: TA1 VH, TA1 VH-4, TA1 VH-5, TA1 VH-7, TA1 VH-17, TA1 VH-20, TA1 VH-21, and TA1 VH-31.

[0774] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a light chain variable domain (VL) that is selected from the following light chain variable domains in FIG. 18: TA1 VL, TA1 VL-2, TA1 VL-11, TA1 VL-12, TA1 VL-14, and TA1 VL-15.

[0775] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a VH that comprises, according to the IMGT definition:

[0776] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 151, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0777] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 155, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0778] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 89, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0779] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 175, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0780] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 161, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; or

[0781] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 185, or variant sequences having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them.

[0782] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a VL that comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 153, 184, and 97 or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .

[0783] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a VH that comprises, according to the Kabat definition:

[0784] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 237, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0785] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 233, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0786] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 198, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0787] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 209, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;

[0788] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 215, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; or

[0789] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 223, or variant sequences having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them.

[0790] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a VL that comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 212, 219, and 97, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .

[0791] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a VH that comprises, according to the Chothia definition:

[0792] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 215, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0793] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 223, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0794] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 237, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0795] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 233, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0796] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 198, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0797] CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 209, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;

[0798] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a VL that comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 212, 219, and 97, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .

[0799] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:

[0800] (1) the FR1 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 91, 103, 119, and 183;

[0801] (2) the FR2 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 125, 129, 133, and 156;

[0802] (3) the FR3 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 74, 105, 108, 111, and 121; and

[0803] (4) the FR4 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 115, 124, 142, 152, and 173.

[0804] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a heavy chain that comprises:

[0805] (a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29;

[0806] (b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29; or

[0807] (c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region.

[0808] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a light chain that comprises:

[0809] (a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34;

[0810] (b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34; or

[0811] (c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region.

[0812] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a heavy chain that comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29: positions 3, 5, 15, 19, 78, 79, 80, 87, 102, 105, 106, 107, 108, 109, 114, and 120.

[0813] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a heavy chain that comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 15: K3Q, L5V, K15G, K19R, Q78K, S79N, I80S, N87S, G102H, G105L / R, N106D / R, S107G, Y108F / K / P, V109M, Y114D, and L120A.

[0814] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a light chain that comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34: positions 8, 9, 12, 16, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 59, 60, 69, 71, 82, 87, 106, 107, 108, and 109.

[0815] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein comprises a light chain that comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 16: S8P, A9S, T12V, E16G, E40Q, D43G, H44Q, L45A, F46P, T47R, G59W, V60T, I69L, D71G, T82A, I87D, V106L, E107T, I108V, and K109L.

[0816] The amino acid sequences for heavy chain variable regions and light variable regions of an anti-CD3 Fab are also provided. In some embodiments, the heavy chain variable region is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 23-29. In some embodiments, the light chain variable region is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 30-34. Any one of these heavy chain variable region sequences can be paired with any one of these light chain variable region sequences, and together they bind to CD3.

[0817] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can have a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR3 amino acid sequence. In some embodiments, the antibody can have a light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR3 amino acid sequence. The selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences and the selected VL CDRs, 1, 2, 3 amino acid sequences are shown in FIG. 19 (IMGT CDR) , FIG. 21 (Kabat CDR) and FIG. 22 (Chothia) .

[0818] The insertions, deletions, and substitutions can be within the CDR sequence, or at one or both terminal ends of the CDR sequence. In some embodiments, the CDR is determined based on the IMGT definition. In some embodiments, the CDR is determined based on the Kabat definition. In some embodiments, the CDR is determined based on the Chothia definition. In some embodiments, the CDR is determined based on the AbM definition. In some embodiments, the CDR is determined the “contact” definition. In some embodiments, the CDR is determined based on a combination definition.

[0819] The disclosure also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that can compete with the antibodies described herein. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments can bind to the same epitope as the antibodies described herein. The present disclosure also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with any antibody or antigen-binding fragment as described herein. The cross-competing assay is known in the art, and is described e.g., in Moore et al., "Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein. " Journal of virology 70.3 (1996) : 1863-1872, which is incorporated herein reference in its entirety. In one aspect, the present disclosure also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the same epitope or region as any antibody or antigen-binding fragment as described herein. The epitope binning assay is known in the art, and is described e.g., in Estep et al. "High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. " MAbs. Vol. 5. No. 2. Taylor &Francis, 2013, which is incorporated herein reference in its entirety.

[0820] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0821] The disclosure also provides nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy chain or an immunoglobulin light chain. The immunoglobulin heavy chain or immunoglobulin light chain comprises CDRs as shown in FIG. 19, FIG. 21 or FIG. 22, or have sequences as shown in FIG. 18. When the polypeptides are paired with corresponding polypeptide (e.g., a corresponding heavy chain variable region or a corresponding light chain variable region) , the paired polypeptides bind to CD3 (e.g., human CD3) .

[0822] Multispecific Antigen Binding Molecule

[0823] In one aspect, the disclosure provides multispecific antigen binding molecules (e.g., multispecific antibodies) that target multiple antigens (e.g., CAIX, EGFR, and / or CD3) . The multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies or trispecific antibodies) can be designed to include one or more antigen-binding sites that target T cell antigens (e.g., CD3) , and include one or more antigen-binding sites that target a tumor-associated antigen (e.g., CAIX, EGFR) . The antigen-binding site can comprise e.g., a Fab, a scFv, a VHH. In some embodiments, the one or more antigen-binding sites that target a T cell antigen (e.g., CD3) can comprise a Fab. In some embodiments, the one or more antigen-binding sites that target the tumor-associated antigen can comprise a VHH. The tumor-associated antigen refers to an antigen that is specifically expressed on tumor cell surfaces. These antigens can be used to identify tumor cells. Normal cells rarely express these tumor associated antigens. Some exemplary tumor-associated antigens include, e.g., CAIX, CEA, CD20, PSA, PSCA, PD-L1, HER2, Her3, Her1, β-Catenin, CD19, CAIX, EGFR, c-Met, EPCAM, PSMA, CD40, MUC1, and IGF1R, etc.

[0824] In some embodiments, a multispecific antibody (e.g., bispecific antibody or trispecific antibody) or antigen-binding fragment thereof described herein includes a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the T cell antigen is CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the T cell antigen is CD28. In some embodiments, the T cell antigen is CD27. In some embodiments, the T cell antigen is CD137. In some embodiments, the T cell antigen is OX40. In some embodiments, the T cell antigen is PD1. In some embodiments, the T cell antigen is CTLA-4. In some embodiments, the T cell antigen is Tim3. In some embodiments, the T cell antigen is LAG-3. In some embodiments, the multispecific antibody or antigen-binding fragment thereof can activate T cells upon binding to the T cell antigen.

[0825] In some embodiments, a multispecific antibody (e.g., bispecific antibody or trispecific antibody) or antigen-binding fragment thereof described herein includes a VHH that specifically binds to a tumor-associated antigen. In some embodiments, the tumor-associated antigen is CAIX (e.g., human CAIX) . In some embodiments, the tumor-associated antigen is CEA. In some embodiments, the tumor-associated antigen is EGFR or HER2. In some embodiments, the tumor-associated antigen is Claudin18.2. In some embodiments, the tumor-associated antigen is CD166. In some embodiments, the tumor-associated antigen is Glypican-3. These are just examples of tumor-associated antigens. Listing of them does not mean to limit the utility of only these antigens.

[0826] The present disclosure provides antigen-binding protein constructs with various formats as described herein. While not intending to be bound by any theory, it is hypothesized that the in the presence of the target cells (e.g., cancer cells) and T cells, the protein constructs can effectively activate T cells.

[0827] In some embodiments, the multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies or trispecific antibodies) are designed to include a Fab that targets CD3. In some embodiments, the multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies or trispecific antibodies) are designed to include a VHH that targets CAIX. The multispecific antibodies are described below.

[0828] The present disclosure provides multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies or trispecific antibodies) that bind to both a T cell antigen (e.g., CD3) and a tumor associated antigen. The multispecific antibodies can be used to treat tumor associated antigen positive cancers in a subject (e.g., a human patient) . In some embodiments, the tumor associated antigen positive cancer is CAIX-positive (e.g., renal cancers) .

[0829] In general, the multispecific antibody (e.g., bispecific antibody or trispecific antibody) described herein can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (b) a second polypeptide including a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) . In some embodiments, the first Fc region and / or the second Fc region are derived from human IgG4. In some embodiments, the first Fc region and / or the second Fc region include one or more knobs-into-holes mutations. For example, the first Fc region (e.g., the CH3 domain in the Fc region) can include a tryptophan (Trp) at position 366 according to EU numbering; and the second Fc region (e.g., the CH3 domain in the Fc region) can include one or more of the following a serine (Ser) at position 366, an alanine (Ala) at position 368, and / or a valine (Val) at position 407 according to EU numbering.

[0830] In some embodiments, the Fc region is derived from the Fc of any antibody as described herein (e.g. ., IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) . In some embodiments, the Fc region is a human IgG1, IgG2, or IgG4 (e.g., a human IgG4) . In some embodiments, the first Fc region and / or the second Fc region include additional mutations relative to the Fc region of a wild-type human IgG (e.g., IgG4) . For example, the first Fc region and / or the second Fc region can include a proline (Pro) at position 228 according to EU numbering, to reduce chain exchange of the multispecific antibody. The first Fc region and / or the second Fc region can also include an alanine (Ala) at positions 234 according to EU numbering, to reduce ADCC effect of the multispecific antibody. The first Fc region can include a cysteine (Cys) at position 354 and the second Fc region can further include a cysteine (Cys) at position 349 according to EU numbering, to stabilize the multispecific antibody. The second Fc region can include a lysine (Lys) at position 435 and / or a phenylalanine (Phe) at position 436 according to EU numbering, to reduce binding of the second polypeptide to Protein A. In addition, to improve antibody stability, a glycine (Gly) at position 446 and / or a lysine (Lys) at position 447 of the first Fc region and / or the second Fc region can be deleted. While not intending to be bound by any theory, it is understood by a person skilled in the art that the mutations and deletions described herein can be introduced in either the first Fc region or the second Fc region.

[0831] In one aspect, the disclosure is related to an antigen-binding protein, comprising (a) a Fc;(b) a first antigen-binding site comprising a Fab that specifically binds to CD3; and (c) a second antigen-binding site comprising a single-domain antibody variable domain (VHH) that specifically binds to a tumor associated antigen, in some embodiments, the first antigen-binding site and the second antigen-binding site are linked to the Fc.

[0832] In some embodiments, the first antigen-binding site comprises a Fab fragment (Fab) that contains a variable and constant domain of the light chain and a variable domain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. In some embodiments, the Fab can activate T cells upon binding to the CD3. In some embodiments, the Fab is human IgG4 Fab.

[0833] In some embodiments, the Fab is linked to a CH2 domain in the Fc, optionally via a hinge region. In some embodiments, the hinge region is a human IgG4 hinge region optionally with S228P mutation according to EU numbering.

[0834] In some embodiments, the Fab is linked to the C-terminus of a CH3 domain in the Fc. In some embodiments, the Fab is linked to the CH3 domain via a linker peptide.

[0835] In some embodiments, the VHH is linked to a CH2 domain in the Fc, optionally via a hinge region. In some embodiments, the hinge region is a human IgG4 hinge region optionally with S228P mutation according to EU numbering.

[0836] In some embodiments, the VHH is linked to the C-terminus of a CH3 domain in the Fc. In some embodiments, the VHH is linked to the CH3 domain via a linker peptide.

[0837] In some embodiments, the Fc comprises a first polypeptide chain and a second polypeptide chain, in some embodiments, each chain comprises one or more knobs-into-holes mutations.

[0838] In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 15 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 16.

[0839] In some embodiments, the Fc region comprise a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11 or 12.

[0840] In some embodiments, the constant domain of the light chain comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 13.

[0841] In some embodiments, the CH1 domain comprise a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 14.

[0842] In some embodiments, the multispecific antigen binding molecule described herein comprises an amino acid sequence that is the same as the amino acid sequence of one of the following constructs in FIG. 22-25: hu-207-1, hu-207-2, hu-207-3, hu-207-4, hu-207-5, hu-207-6, hu-207-7, hu-207-8, hu-207-9, hu-207-10, hu-207-11, hu-207-12, hu-207-13, hu-207-14, hu-207-15, hu-207-16, hu-207-17, hu-207-18, hu-207-19, hu-207-20, hu-207-21, hu-207-22, hu-207-23, hu-207-24, hu-207-25, hu-207-26, hu-207-27, hu-207-28, hu-207-29, hu-207-30, hu-207-31, hu-207-32, hu-207-33, hu-207-34, hu-207-35, hu-207-36, hu-207-37, hu-207-38 , hu-207-39, hu-207-40, hu-207-41, hu-207-42, hu-207-43, hu-207-44, hu-207-45, hu-207-46, hu-207-47, hu-207-48, hu-207-49, hu-207-50, hu-207-51, hu-207-52, hu-207-53, hu-207-54. All of the 54 multispecific antigen binding molecules have good druggability.

[0843] In some embodiments, the multispecific antigen binding molecule described herein comprises a CAIX binding domain that comprises the amino acid sequence of any of the CAIX binding molecules described herein.

[0844] In some embodiments, the multispecific antigen binding molecule described herein comprises an EGFR binding domain that comprises the amino acid sequence of any of the EGFR binding molecules described herein.

[0845] In some embodiments, the multispecific antigen binding molecule described herein comprises a CD3 binding domain that comprises the amino acid sequence of any of the CD3 binding molecules described herein.

[0846] In some embodiments, the multispecific antigen binding molecule described herein comprises (1) a CAIX binding domain that comprises the amino acid sequence of any of the CAIX binding molecules described herein, (2) an EGFR binding domain that comprises the amino acid sequence of any of the EGFR binding molecules described herein, and (3) a CD3 binding domain that comprises the amino acid sequence of any of the CD3 binding molecules described herein.

[0847] In some embodiments, the multispecific antigen binding molecule described herein comprises (1) a CAIX binding domain that comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1-10, 17-21, and 35-52, (2) an EGFR binding domain that comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71, and (3) a CD3 binding domain that comprises a VH comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29, and a VL comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 16 and 30-34.

[0848] In some embodiments, the multispecific antigen binding molecule described herein comprises (1) a CAIX binding domain that comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1-10, 17-21, and 35-52, (2) an EGFR binding domain that comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71, and (3) a CD3 binding domain that comprises a VH comprising an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29, and a VL comprising an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 16 and 30-34.

[0849] In some embodiments, the multispecific antigen binding molecule has one of the below structures.

[0850] 1. Fab-Fc + VHH-Fc

[0851] As shown in FIGS. 1A-1B and FIG. 8A, a multispecific antibody (e.g., bispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, and a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a single-domain antibody variable domain (VHH) , optionally a second hinge region, and a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (c) a third polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VL, and a CL. In some embodiments, the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the VHH specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0852] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0853] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0854] In some embodiments, the Fab can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 15 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 16. In some embodiments, the VHH can target CAIX or EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1-10, 17-22 and 35-71. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0855] 2. VHH-Fab-Fc (light chain) + VHH-Fc (201, 202, 207, 208)

[0856] As shown in FIG. 12A (201) , FIG. 12B (202) , FIG. 12G (207) , FIG. 12H (208) , FIG. 9B, a multispecific antibody (e.g., trispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a first VHH, optionally a second hinge region, a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (c) a third polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VL, a CL, and a second VHH. In some embodiments, the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the first and / or second VHH specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0857] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0858] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0859] In some embodiments, the Fab can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34. In some embodiments, the first and / or second VHH can target EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71. In some embodiments, the first and / or second VHH can target CAIX, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0860] 3. VHH-Fab-Fc (light chain) + VHH-Fc (203, 204, 209)

[0861] As shown in FIG. 12C (203) , FIG. 12D (204) , FIG. 12I (209) , FIG. 9D, a multispecific antibody (e.g., trispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a first VHH, optionally a second hinge region, a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (c) a third polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a second VHH, a VL, and a CL. In some embodiments, the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the first and / or second VHH specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0862] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0863] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0864] In some embodiments, the Fab can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34. In some embodiments, the first and / or second VHH can target EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71. In some embodiments, the first and / or second VHH can target CAIX, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0865] 4. VHH-Fab-Fc (heavy chain) + VHH-Fc (205, 206)

[0866] As shown in FIG. 12E (205) , FIG. 12F (206) , FIG. 9C, a multispecific antibody (e.g., trispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a first VHH, optionally a first hinge region, a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a second VHH, a VH, a CH1 domain, optionally a second hinge region, a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (c) a third polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VL, and a CL. In some embodiments, the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the first and / or second VHH specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0867] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0868] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0869] In some embodiments, the Fab can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34. In some embodiments, the first and / or second VHH can target EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71. In some embodiments, the first and / or second VHH can target CAIX, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0870] 5. Fab-Fc + VHH-VHH-Fc (210, 211, 212)

[0871] As shown in FIG. 12J (210) , FIG. 12K (211) , FIG. 12L (212) , FIG. 9A, a multispecific antibody (e.g., trispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a first VHH, a second VHH, optionally a second hinge region, a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (c) a third polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VL, and a CL. In some embodiments, the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the first and / or second VHH specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0872] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0873] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0874] In some embodiments, the Fab can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34. In some embodiments, the first and / or second VHH can target EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71. In some embodiments, the first and / or second VHH can target CAIX, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0875] 6. VHH-Fab-Fc (light chain and heavy chain) + Fc

[0876] As shown in FIG. 9E, a multispecific antibody (e.g., trispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a first VHH, a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, and a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (c) a third polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a second VHH, a VL, and a CL. In some embodiments, the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the first and / or second VHH specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0877] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0878] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0879] In some embodiments, the Fab can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34. In some embodiments, the first and / or second VHH can target EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71. In some embodiments, the first and / or second VHH can target CAIX, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0880] 7. VHH-Fab-Fc (light chain and heavy chain) + Fc

[0881] As shown in FIG. 9F, a multispecific antibody (e.g., trispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a first VHH, a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, and a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (c) a third polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VL, a CL, and a second VHH. In some embodiments, the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the first and / or second VHH specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0882] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0883] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0884] In some embodiments, the Fab can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34. . In some embodiments, the first and / or second VHH can target EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71. In some embodiments, the first and / or second VHH can target CAIX, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0885] 8. VHH-Fab-Fc (light chain and light chain) + Fc

[0886] As shown in FIG. 9G, a multispecific antibody (e.g., trispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, and a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (c) a third polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a first VHH, a VL, a CL, and a second VHH. In some embodiments, the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the first and / or second VHH specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0887] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0888] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0889] In some embodiments, the Fab can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34. In some embodiments, the first and / or second VHH can target EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71. In some embodiments, the first and / or second VHH can target CAIX, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0890] 9. VHH-VHH-Fab-Fc (heavy chain) + Fc

[0891] As shown in FIG. 9H, a multispecific antibody (e.g., trispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a first VHH, a second VHH, a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, and a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (c) a third polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VL and a CL. In some embodiments, the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the first and / or second VHH specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0892] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0893] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0894] In some embodiments, the Fab can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34. In some embodiments, the first and / or second VHH can target EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71. In some embodiments, the first and / or second VHH can target CAIX, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0895] 10. VHH-VHH-Fab-Fc (light chain) + Fc

[0896] As shown in FIG. 9I, a multispecific antibody (e.g., trispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, and a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (c) a third polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a first VHH, a second VHH, a VL and a CL. In some embodiments, the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the first and / or second VHH specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0897] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0898] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0899] In some embodiments, the Fab can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34. In some embodiments, the first and / or second VHH can target EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71. In some embodiments, the first and / or second VHH can target CAIX, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0900] 11. VHH-VHH-Fab-Fc (light chain) + Fc

[0901] As shown in FIG. 9J, a multispecific antibody (e.g., trispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (c) a third polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VL, a CL, a first VHH, and a second VHH. In some embodiments, the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the first and / or second VHH specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0902] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0903] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0904] In some embodiments, the Fab can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34. In some embodiments, the first and / or second VHH can target EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 22 and 53-71. In some embodiments, the first and / or second VHH can target CAIX, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 17-21, and 35-52. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0905] 12. scFv-Fc + VHH-Fc

[0906] As shown in FIG. 8B, a multispecific antibody (e.g., bispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a scFv, optionally a first hinge region, and a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a single-domain antibody variable domain (VHH) , optionally a second hinge region, and a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) . In some embodiments, the scFv specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the VHH specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0907] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0908] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0909] In some embodiments, the scFv can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the scFv comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 261 or SEQ ID NO: 262. In some embodiments, the VHH can target CAIX or EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1-10, 17-22 and 35-71. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0910] 13. VHH-Fc + VHH-Fc

[0911] As shown in FIG. 8C, a multispecific antibody (e.g., bispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a first VHH, optionally a first hinge region, and a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a second VHH, optionally a second hinge region, and a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) . In some embodiments, the first and / or second VHH can specifically bind to a T cell antigen. In some embodiments, the first and / or second VHH can specifically bind to a tumor-associated antigen.

[0912] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0913] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0914] In some embodiments, the first and / or second VHH can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the first and / or second VHH comprise a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 258. In some embodiments, the first and / or second VHH can target CAIX or EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1-10, 17-22 and 35-71. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0915] 14. Fab-Fc + scFv-Fc

[0916] As shown in FIG. 8D, a multispecific antibody (e.g., bispecific antibody) can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VH, a CH1 domain, optionally a first hinge region, and a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a scFv, optionally a second hinge region, and a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (c) a third polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a VL, and a CL. In some embodiments, the VH and the VL associate with each other, forming an antigen binding site of a Fab that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the scFv specifically binds to a tumor-associated antigen.

[0917] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12.

[0918] In some embodiments, the first Fc region comprises one or more hole mutations. In some embodiments, the second Fc region comprises one or more knob mutations. In some embodiments, the first polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the second polypeptide comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 11.

[0919] In some embodiments, the Fab can target CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the VH comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 15 and the VL comprises a sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%identical to SEQ ID NO: 16. In some embodiments, the scFv can target CAIX or EGFR, and comprises a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 259 or SEQ ID NO: 260. In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region are derived from the hinge region of human IgG4.

[0920] Antigen-Binding Protein Construct Characteristics

[0921] The anti-CD3, anti-TAA (tumor associated antigen) , or anti-CD3 / TAA antigen-binding protein construct (e.g., antibodies, bispecific antibodies, trispecific antibodies, multispecific antibodies, or antibody fragments thereof) , can include an antigen binding site that is derived from any anti-CD3 antibody, anti-TAA antibody (e.g., anti-CAIX, anti-EGFR) , or any antigen-binding fragment thereof as described herein.

[0922] In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein are CAIX antagonist. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof are CAIX agonist. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof as described herein are CD3 antagonist. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof are CD3 agonist. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof as described herein are EGFR antagonist. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof are EGFR agonist.

[0923] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein can bind to CD3 and a target tumor associated antigen (e.g., CAIX, EGFR) , thereby bridging T cells and target cells; activating T cells; and inducing directly killing the cancer cells by the T cells.

[0924] In some embodiments, affinity can be measured by the methods in Example 2. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein specifically bind to the target antigen (e.g., CD3, CAIX, EGFR) with a dissociation rate (koff, kdis) of less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.00001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.00001 s-1, or greater than 0.000001 s-1. In some embodiments, kinetic association rate (kon, ka) is greater than 1 x 102 M-1s-1, greater than 1 x 103 M-1s-1, greater than 1 x 104 M-1s-1, greater than 1 x 105 M-1s-1, greater than 1 x 106 M-1s-1. In some embodiments, kinetic association rate (kon) is less than 1 x 105 M-1s-1, less than 1 x 106 M-1s-1, or less than 1 x 107 M-1s-1. Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, the KD is less than 1 x 10-4 M, less than 1 x 10-5 M, less than 1 x 10-6 M, less than 1 x 10-7 M, less than 1 x 10-8 M, less than 1 x 10-9 M, or less than 1 x 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 50 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, or 0.1 nM. In some embodiments, the KD is greater than 1 x 10-4 M, greater than 1 x 10-5 M, greater than 1 x 10-6 M, greater than 1 x 10-7 M, greater than 1 x 10-8 M, greater than 1 x 10-9 M, greater than 1 x 10-10 M, greater than 1 x 10-11 M, or greater than 1 x 10-12 M. Furthermore, Ka can be deduced from KD by the formula Ka=1 / KD.

[0925] General techniques for measuring the affinity of an antibody for an antigen include, e.g., ELISA, RIA, and surface plasmon resonance (SPR) .

[0926] In some embodiments, affinity can be measured by the methods in Example 3. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein specifically bind to the target antigen, and only bind weakly or do not bind to control antigens.

[0927] In some embodiments, inhibition of catalytic activity of CAIX can be measured by the methods in Example 5. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein can inhibit the catalytic activity of CAIX by more than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%.

[0928] In some embodiments, the expression level of the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein is at least or about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 50000, or 100000 mg / L, as determined using the method described herein. In some embodiments, the percentage of multispecific antibody (e.g., bispecific antibody or trispecific antibody) formed, as determined by size-exclusion chromatography as described herein, is at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, or at least 97%of the total protein level.

[0929] In some embodiments, in vitro cell killing effects can be measured by the methods described in Example 7. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein have a T cell mediated cell killing EC50 of less than 5 pM, less than 10 pM, less than 50 pM, less than 0.1 nM, less than 0.2 nM, less than 0.5 nM, less than 0.8 nM, less than 1 nM, less than 2 nM, less than 5 nM, less than 8 nM, less than 10 nM, less than 20 nM, less than 50 nM, less than 100 nM, less than 200 nM, less than 500 nM, or less than 800 nM, as determined using the method described herein. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein have a T cell mediated cell killing EC50 of more than 5 pM, more than 10 pM, more than 50 pM, more than 0.1 nM, more than 0.2 nM, more than 0.5 nM, more than 0.8 nM, more than 1 nM, more than 2 nM, more than 5 nM, more than 8 nM, more than 10 nM, more than 20 nM, more than 50 nM, more than 100 nM, more than 200 nM, more than 500 nM, or more than 800 nM, as determined using the method described herein. In some embodiments, the antibodies, antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein have a T cell mediated cell killing EC50 value that is 1 pM-50 pM, 0.1-1 nM, 0.2-2 nM, 0.5-5 nM, 0.8-8 nM, 1-10 nM, 2-20 nM, 5-50 nM, 8-80 nM, 10-100 nM, 20-200 nM, 50-500 nM, or 80-800 nM. In some embodiments, the antibodies, antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein have a T cell mediated cell killing EC50 value that is 1pM-800nM. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein have a T cell mediated cell killing EC50 value that is less than or about 50%, less than or about 30%, less than or about 20%, less than or about 10%, less than or about 5%, less than or about 1%as compared to that of an isotype control antibody.

[0930] In some embodiments, cell-binding can be measured by the methods in Example 1. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein have a cell-binding EC50 of less than or about 0.1 nM, 0.25 nM, 0.5 nM, 0.75 nM, 1 nM, 1.25 nM, 1.5 nM, 2 nM, 2.5 nM, 5 nM, 7.5 nM, 10 nM, or 20 nM, as determined using the methods described herein. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein have a positive rate that is greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein have a positive rate that is below 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%.

[0931] In some embodiments, antigen-binding can be measured by the methods in Example 1. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein have an antigen-binding EC50 of less than or about 0.1 nM, 0.25 nM, 0.5 nM, 0.75 nM, 1 nM, 1.25 nM, 1.5 nM, 2 nM, 2.5 nM, 5 nM, 7.5 nM, 10 nM, or 20 nM, as determined using the methods described herein.

[0932] In some embodiments, in vitro cytokine secretion can be measured by the methods described in Example 8. In some embodiments, the in vitro cytokine release stimulation can be measured by incubating human immune cells (e.g., PBMC) with target tumor cells (e.g., HT-29 cells) and the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein. In some embodiments, in vivo cytokine secretion can be measured by the methods described in Example 21. In some embodiments, the in vivo cytokine release can be measured by administering the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein to animals (e.g., BalB / C-hCD3EDG mice) . In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein can stimulate TNFα release by human immune cells. In some embodiments, the TNF-α cytokine release is above 10 pg / mL, above 25 pg / mL, above 50 pg / mL, above 100 pg / mL, above 250 pg / mL, above 500 pg / mL, above 1000 pg / mL, above 2500 pg / mL, above 5000 pg / mL, or above 7000 pg / mL. In some embodiments, the TNF-α cytokine release is below 10 pg / mL, below 25 pg / mL, below 50 pg / mL, below 100 pg / mL, below 250 pg / mL, below 500 pg / mL, below 1000 pg / mL, below 2500 pg / mL, below 5000 pg / mL, or below 7000 pg / mL. In some embodiments, the TNF-αcytokine release is about 10-500 pg / mL, 50-250 pg / mL, or 50-150 pg / mL.

[0933] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein can stimulate IFNγrelease by human immune cells. In some embodiments, the IFNγ cytokine release is above 10 pg / mL, above 25 pg / mL, above 50 pg / mL, above 100 pg / mL, above 250 pg / mL, above 500 pg / mL, above 1000 pg / mL, above 2500 pg / mL, above 5000 pg / mL, or above 7000 pg / mL. In some embodiments, the IFNγ cytokine release is below 10 pg / mL, below 25 pg / mL, below 50 pg / mL, below 100 pg / mL, below 250 pg / mL, below 500 pg / mL, below 1000 pg / mL, below 2500 pg / mL, below 5000 pg / mL, or below 7000 pg / mL. In some embodiments, the IFNγcytokine release is about 100-7000 pg / mL, 500-5000 pg / mL, 500-2500 pg / mL or 500-1500 pg / mL.

[0934] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein can stimulate IL-2 release by human immune cells. In some embodiments, the IL-2 cytokine release is above 10 pg / mL, above 25 pg / mL, above 50 pg / mL, above 100 pg / mL, above 250 pg / mL, above 500 pg / mL, above 1000 pg / mL, above 2500 pg / mL, above 5000 pg / mL, or above 7000 pg / mL. In some embodiments, the IL-2 cytokine release is below 10 pg / mL, below 25 pg / mL, below 50 pg / mL, below 100 pg / mL, below 250 pg / mL, below 500 pg / mL, below 1000 pg / mL, below 2500 pg / mL, below 5000 pg / mL, or below 7000 pg / mL. In some embodiments, the IL-2 cytokine release is about 10-100 pg / mL, or 10-50 pg / mL.

[0935] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein can stimulate IL-6 release by human immune cells. In some embodiments, the IL-6 cytokine release is above 10 pg / mL, above 25 pg / mL, above 50 pg / mL, above 100 pg / mL, above 250 pg / mL, above 500 pg / mL, above 1000 pg / mL, above 2500 pg / mL, above 5000 pg / mL, or above 7000 pg / mL. In some embodiments, the IL-6 cytokine release is below 10 pg / mL, below 25 pg / mL, below 50 pg / mL, below 100 pg / mL, below 250 pg / mL, below 500 pg / mL, below 1000 pg / mL, below 2500 pg / mL, below 5000 pg / mL, or below 7000 pg / mL. In some embodiments, the IL-6 cytokine release is about 10-300 pg / mL, or 50-300 pg / mL.

[0936] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein can stimulate IL-10 release by human immune cells. In some embodiments, the IL-10 cytokine release is above 10 pg / mL, above 25 pg / mL, above 50 pg / mL, above 100 pg / mL, above 250 pg / mL, above 500 pg / mL, above 1000 pg / mL, above 2500 pg / mL, above 5000 pg / mL, or above 7000 pg / mL. In some embodiments, the IL-10 cytokine release is below 10 pg / mL, below 25 pg / mL, below 50 pg / mL, below 100 pg / mL, below 250 pg / mL, below 500 pg / mL, below 1000 pg / mL, below 2500 pg / mL, below 5000 pg / mL, or below 7000 pg / mL. In some embodiments, the IL-10 cytokine release is about 10-400 pg / mL, or 50-400 pg / mL.

[0937] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complexes described herein have a melting temperature (Tm) value of higher than 60℃, 60.5℃, 61℃, 61.5℃, 62℃, 62.5℃, 63℃, 63.5℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃ or 74℃, as determined using the methods described herein.

[0938] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complex described herein have a tumor growth inhibition percentage (TGITV%) that is greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 99%. In some embodiments, the antibody has a tumor growth inhibition percentage that is less than 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200%. The TGITV%can be determined, e.g., at 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 days after the treatment starts, or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 months after the treatment starts. As used herein, the tumor growth inhibition percentage (TGITV%) is calculated using the following formula: TGITV (%) = [1- (Ti-T0)  /  (Vi-V0) ] ×100 (Ti is the average tumor volume in the treatment group on day i. T0 is the average tumor volume in the treatment group on day zero. Vi is the average tumor volume in the control group on day i. V0 is the average tumor volume in the control group on day zero) . In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complex described herein have a tumor growth inhibition percentage (TGITV%) that is about 70%-100%.

[0939] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, the antigen-binding protein constructs, or protein complex described herein have a serum stability of more than 50%, 55%, 60%, 65%70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%cell binding after 1-10 days of storage in human serum, as determined using the methods described herein.

[0940] Thermal stabilities can also be determined. The antibodies, the antigen-binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs (e.g., bispecific antibody) as described herein can have a Tm greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. As IgG can be described as a multi-domain protein, the melting curve sometimes shows two transitions, with a first denaturation temperature, Tm1, and a second denaturation temperature Tm2. The presence of these two peaks often indicates the denaturation of the Fc domains (Tm1) and Fab domains (Tm2) , respectively. Thus, in some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments as described herein has a Tm1 greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments as described herein has a Tm2 greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, Tm, Tm1, Tm2 are less than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃.

[0941] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs have a functional Fc region. In some embodiments, effector function of a functional Fc region is antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and / or complement-dependent cytotoxicity (CDC) . In some embodiments, the Fc region is human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4.

[0942] In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs do not have a functional Fc region. For example, the antibodies or antigen binding fragments are Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, and Fv fragments. In some embodiments, the antibodies, antigen binding fragments, or the antigen-binding protein constructs have a Fc region that includes one or more mutations to reduce the effector function. In some embodiments, the antibodies, the antigen binding fragments thereof, or the antigen-binding protein constructs described herein do not have antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or complement dependent cytotoxicity (CDC) .

[0943] In some embodiments, the antibodies or antigen binding fragments are humanized antibodies. Humanization percentage means the percentage identity of the heavy chain or light chain variable region sequence as compared to human antibody sequences in International Immunogenetics Information System (IMGT) database. In some embodiments, humanization percentage is greater than 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, or 95%. A detailed description regarding how to determine humanization percentage and how to determine top hits is known in the art, and is described, e.g., in Jones, et al. “The INNs and outs of antibody nonproprietary names. ” MAbs. Vol. 8. No. 1. Taylor &Francis, 2016, which is incorporated herein by reference in its entirety. A high humanization percentage often has various advantages, e.g., more safe and more effective in humans, more likely to be tolerated by a human subject, and / or less likely to have side effects.

[0944] In some embodiments, the multi-specific antibody including the multispecific antibody described herein (e.g., CD3 / CAIX / EGFR multispecific antibody) has an asymmetric structure comprising: 2, 3, 4, 5, or 6 antigen binding sites. In some embodiments, the multispecific antibody described herein comprises 2, 3, 4, 5, or 6 antigen binding sites (e.g., antigen binding scFv domains, Fab, or VHH) that target CAIX.

[0945] The present disclosure also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with any antibody or antigen-binding fragment as described herein. The cross-competing assay is known in the art, and is described e.g., in Moore et al., “Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein. ” Journal of Virology 70.3 (1996) : 1863-1872, which is incorporated herein reference in its entirety. In one aspect, the present disclosure also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to the same epitope or region as any antibody or antigen-binding fragment as described herein. The epitope binning assay is known in the art, and is described e.g., in Estep et al. “High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. ” MAbs. Vol. 5. No. 2. Taylor &Francis, 2013, which is incorporated herein reference in its entirety.

[0946] Antibodies and Antigen Binding Fragments

[0947] In general, antibodies (also called immunoglobulins) are made up of two classes of polypeptide chains, light chains and heavy chains. A non-limiting antibody of the present disclosure can be an intact, four immunoglobulin chain antibody comprising two heavy chains and two light chains. The heavy chain of the antibody can be of any isotype including IgM, IgG, IgE, IgA, or IgD or sub-isotype including IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2, etc. The light chain can be a kappa light chain or a lambda light chain. An antibody can comprise two identical copies of a light chain and / or two identical copies of a heavy chain. The heavy chains, which each contain one variable domain (or variable region, VH) and multiple constant domains (or constant regions) , bind to one another via disulfide bonding within their constant domains to form the “stem” of the antibody. The light chains, which each contain one variable domain (or variable region, VL) and one constant domain (or constant region) , each bind to one heavy chain via disulfide binding. The variable region of each light chain is aligned with the variable region of the heavy chain to which it is bound. The variable regions of both the light chains and heavy chains contain three hypervariable regions sandwiched between more conserved framework regions (FR) .

[0948] These hypervariable regions, known as the complementary determining regions (CDRs) , form loops that comprise the principle antigen binding surface of the antibody. The four framework regions largely adopt a beta-sheet conformation and the CDRs form loops connecting, and in some cases forming part of, the beta-sheet structure. The CDRs in each chain are held in close proximity by the framework regions and, with the CDRs from the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding region.

[0949] Methods for identifying the CDR regions of an antibody by analyzing the amino acid sequence of the antibody are well known, and a number of definitions of the CDRs are commonly used. The Kabat definition is based on sequence variability, and the Chothia definition is based on the location of the structural loop regions. These methods and definitions are described in, e.g., Martin, “Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains, ” Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. “Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains, ” Molecular immunology 45.14 (2008) : 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203: 121-53 (1991) ; Morea et al., Biophys Chem. 68 (1-3) : 9-16 (Oct. 1997) ; Morea et al., J Mol Biol. 275 (2) : 269-94 (Jan. 1998) ; Chothia et al., Nature 342 (6252) : 877-83 (Dec. 1989) ; Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7: 64 (2007) ; Kontermann, R., &Dübel, S. (Eds. ) . (2010) . Antibody engineering: Volume 2. Springer; each of which is incorporated herein by reference in its entirety. In some embodiments, the CDRs are based on Kabat definition. In some embodiments, the CDRs are based on the Chothia definition. In some embodiments, the CDRs are the longest CDR sequences as determined by Kabat, Chothia, AbM, IMGT, or contact definitions.

[0950] The CDRs are important for recognizing an epitope of an antigen. As used herein, an “epitope” is the smallest portion of a target molecule capable of being specifically bound by the antigen binding domain of an antibody. The minimal size of an epitope may be about three, four, five, six, or seven amino acids, but these amino acids need not be in a consecutive linear sequence of the antigen’s primary structure, as the epitope may depend on an antigen’s three-dimensional configuration based on the antigen’s secondary and tertiary structure.

[0951] In some embodiments, the antibody or antigen-binding protein can include an intact immunoglobulin molecule (e.g., IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA) or fragments thereof. The IgG subclasses (IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) are highly conserved, differ in their constant region, particularly in their hinges and upper CH2 domains. The sequences and differences of the IgG subclasses are known in the art, and are described, e.g., in Vidarsson, et al, “IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. ” Frontiers in immunology 5 (2014) ; Irani, et al. “Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases. ” Molecular immunology 67.2 (2015) : 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0952] The antibody or antigen-binding protein can also be an immunoglobulin molecule that is derived from any species (e.g., human, rodent, mouse, rat, camelid) . Antibodies disclosed herein also include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, monospecific, polyspecific antibodies, and chimeric antibodies that include an immunoglobulin binding domain fused to another polypeptide. The term “antigen-binding domain” or “antigen-binding fragment” is a portion of an antibody that retains specific binding activity of the intact antibody, i.e., any portion of an antibody that is capable of specific binding to an epitope on the intact antibody’s target molecule. It includes, e.g., Fab, Fab', F (ab') 2, and variants of these fragments. Thus, in some embodiments, an antibody or an antigen binding fragment thereof can be, e.g., a scFv, a Fv, a Fd, a dAb, a bispecific antibody, a trispecific antibody, a bispecific scFv, a diabody, a linear antibody, a single-chain antibody molecule, a multi-specific antibody formed from antibody fragments, and any polypeptide that includes a binding domain which is, or is homologous to, an antibody binding domain. Non-limiting examples of antigen binding domains include, e.g., the heavy chain and / or light chain CDRs of an intact antibody, the heavy and / or light chain variable regions of an intact antibody, full length heavy or light chains of an intact antibody, or an individual CDR from either the heavy chain or the light chain of an intact antibody.

[0953] In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof can bind to two different antigens or two different epitopes. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof can bind to three different antigens or three different epitopes.

[0954] The Fab fragment contains a variable and constant domain of the light chain and a variable domain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. F (ab') 2 antibody fragments comprise a pair of Fab fragments which are generally covalently linked near their carboxy termini by hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known in the art.

[0955] In some embodiments, the Fc region can be further modified to increase or decrease effector functions as well as serum half-life.

[0956] Any of the antibodies, antigen-binding fragments thereof, or antigen-binding proteins described herein can be conjugated to a stabilizing molecule (e.g., a molecule that increases the half-life of the antibody or antigen-binding fragment thereof in a subject or in solution) . Non-limiting examples of stabilizing molecules include: a polymer (e.g., a polyethylene glycol) or a protein (e.g., serum albumin, such as human serum albumin) . The conjugation of a stabilizing molecule can increase the half-life or extend the biological activity of the antibodies, antigen-binding fragments thereof, or antigen-binding proteins in vitro (e.g., in tissue culture or when stored as a pharmaceutical composition) or in vivo (e.g., in a human) .

[0957] In some embodiments, the antibodies, antigen-binding fragments thereof, or antigen-binding proteins (e.g., multispecific antibodies) described herein can be conjugated to a therapeutic agent. The antibody-drug conjugate comprising the antibodies, antigen-binding fragments thereof, or antigen-binding proteins can covalently or non-covalently bind to a therapeutic agent. In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent (e.g., cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxy anthracin, maytansinoids such as DM-1 and DM-4, dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, epirubicin, and cyclophosphamide and analogs) .

[0958] In some embodiments, the multispecific antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (e.g., CD3 / CAIX / EGFR multispecific antibody) binds to CD3 (e.g., human CD3) with a binding affinity that is about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, about 140%, about 150%, or about 200%to that of an antibody (e.g., an anti-CD3 antibody) comprising the same antigen binding region (e.g., Fab, scFv or VHH) of the multi-specific antibody.

[0959] In some embodiments, the multispecific antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (e.g., CD3 / CAIX / EGFR multispecific antibody) binds to CAIX with a binding affinity that is about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, about 140%, about 150%, or about 200%to that of an antibody (e.g., an anti-CAIX antibody) comprising the same antigen binding region (e.g., Fab, scFv or VHH) of the multi-specific antibody.

[0960] In some embodiments, the multispecific antibody or antigen-binding fragment thereof described herein (e.g., CD3 / CAIX / EGFR multispecific antibody) binds to EGFR with a binding affinity that is about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, about 140%, about 150%, or about 200%to that of an antibody (e.g., an anti-EGFR antibody) comprising the same antigen binding region (e.g., Fab, scFv or VHH) of the multi-specific antibody.

[0961] Recombinant Vectors

[0962] The present disclosure also provides recombinant vectors (e.g., an expression vectors) that include an isolated polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) , host cells into which are introduced the recombinant vectors (i.e., such that the host cells contain the polynucleotide and / or a vector comprising the polynucleotide) , and the production of recombinant antibody polypeptides or fragments thereof or the antigen-binding protein constructs by recombinant techniques.

[0963] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more polynucleotide (s) of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more polynucleotide (s) of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-Atail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector.

[0964] A vector can be introduced into the host cell by methods known in the art, e.g., electroporation, chemical transfection (e.g., DEAE-dextran) , transformation, transfection, and infection and / or transduction (e.g., with recombinant virus) . Thus, non-limiting examples of vectors include viral vectors (which can be used to generate recombinant virus) , naked DNA or RNA, plasmids, cosmids, phage vectors, and DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents.

[0965] In some implementations, a polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) is introduced using a viral expression system (e.g., vaccinia or other pox virus, retrovirus, or adenovirus) , which may involve the use of a non-pathogenic (defective) , replication competent virus, or may use a replication defective virus. In the latter case, viral propagation generally will occur only in complementing virus packaging cells.

[0966] For expression, the DNA insert comprising an antibody-encoding or polypeptide-encoding polynucleotide disclosed herein can be operatively linked to an appropriate promoter (e.g., a heterologous promoter) , such as the phage lambda PL promoter, the E. coli lac, trp and tac promoters, the SV40 early and late promoters and promoters of retroviral LTRs, to name a few. Other suitable promoters are known to the skilled artisan. The expression constructs can further contain sites for transcription initiation, termination and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the mature transcripts expressed by the constructs may include a translation initiating at the beginning and a termination codon (UAA, UGA, or UAG) appropriately positioned at the end of the polypeptide to be translated.

[0967] Representative examples of appropriate hosts include, but are not limited to, bacterial cells, such as E. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium cells; fungal cells, such as yeast cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells such as CHO, COS, Bowes melanoma, and HEK293 cells; and plant cells. Appropriate culture mediums and conditions for the host cells described herein are known in the art.

[0968] Introduction of the construct into the host cell can be effected by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals, such as Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) , which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0969] For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space or into the extracellular environment, appropriate secretion signals may be incorporated into the expressed polypeptide. The signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous signals.

[0970] The polypeptide (e.g., antibody) can be expressed in a modified form, such as a fusion protein (e.g., a GST-fusion) or with a histidine-tag, and may include not only secretion signals, but also additional heterologous functional regions. For instance, a region of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be added to the N-terminus of the polypeptide to improve stability and persistence in the host cell, during purification, or during subsequent handling and storage. Also, peptide moieties can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. The addition of peptide moieties to polypeptides to engender secretion or excretion, to improve stability and to facilitate purification, among others, are familiar and routine techniques in the art.

[0971] The disclosure also provides a nucleic acid sequence that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identical to any nucleotide sequence as described herein, and an amino acid sequence that is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identical to any amino acid sequence as described herein.

[0972] The disclosure also provides a nucleic acid sequence that has a homology of at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%to any nucleotide sequence as described herein, and an amino acid sequence that has a homology of at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%to any amino acid sequence as described herein.

[0973] In some embodiments, the disclosure relates to nucleotide sequences encoding any peptides that are described herein, or any amino acid sequences that are encoded by any nucleotide sequences as described herein. In some embodiments, the nucleic acid sequence is less than 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, or 600 nucleotides. In some embodiments, the amino acid sequence is less than 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, or 400 amino acid residues.

[0974] In some embodiments, the amino acid sequence (i) comprises an amino acid sequence; or (ii) consists of an amino acid sequence, wherein the amino acid sequence is any one of the sequences as described herein.

[0975] In some embodiments, the nucleic acid sequence (i) comprises a nucleic acid sequence; or (ii) consists of a nucleic acid sequence, wherein the nucleic acid sequence is any one of the sequences as described herein.

[0976] The percentage of sequence homology (e.g., amino acid sequence homology or nucleic acid homology) can also be determined. How to determine percentage of sequence homology is known in the art. In some embodiments, amino acid residues conserved with similar physicochemical properties (percent homology) , e.g. leucine and isoleucine, can be used to measure sequence similarity. Families of amino acid residues having similar physicochemical properties have been defined in the art. These families include e.g., amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine) , nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan) , beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . The homology percentage, in many cases, is higher than the identity percentage.

[0977] Methods of Making Antibodies or Antigen-Binding Protein Constructs

[0978] An isolated fragment of human protein (e.g., CD3, EGFR, or CAIX) can be used as an immunogen to generate antibodies using standard techniques for polyclonal and monoclonal antibody preparation. Polyclonal antibodies can be raised in animals by multiple injections (e.g., subcutaneous or intraperitoneal injections) of an antigenic peptide or protein. In some embodiments, the antigenic peptide or protein is injected with at least one adjuvant. In some embodiments, the antigenic peptide or protein can be conjugated to an agent that is immunogenic in the species to be immunized. Animals can be injected with the antigenic peptide or protein more than one time (e.g., twice, three times, or four times) .

[0979] The full-length polypeptide or protein can be used or, alternatively, antigenic peptide fragments thereof can be used as immunogens. The antigenic peptide of a protein comprises at least 8 (e.g., at least 10, 15, 20, or 30) amino acid residues of the amino acid sequence of the protein and encompasses an epitope of the protein such that an antibody raised against the peptide forms a specific immune complex with the protein.

[0980] An immunogen typically is used to prepare antibodies by immunizing a suitable subject (e.g., human or transgenic animal expressing at least one human immunoglobulin locus) . An appropriate immunogenic preparation can contain, for example, a recombinantly-expressed or a chemically-synthesized polypeptide. The preparation can further include an adjuvant, such as Freund’s complete or incomplete adjuvant, or a similar immunostimulatory agent.

[0981] Polyclonal antibodies can be prepared as described above by immunizing a suitable subject with a polypeptide, or an antigenic peptide thereof (e.g., part of the protein) as an immunogen. The antibody titer in the immunized subject can be monitored over time by standard techniques, such as with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the immobilized polypeptide or peptide. If desired, the antibody molecules can be isolated from the mammal (e.g., from the blood) and further purified by well-known techniques, such as protein A of protein G chromatography to obtain the IgG fraction. At an appropriate time after immunization, e.g., when the specific antibody titers are highest, antibody-producing cells can be obtained from the subject and used to prepare monoclonal antibodies by standard techniques, such as the hybridoma technique originally described by Kohler et al. (Nature 256: 495-497, 1975) , the human B cell hybridoma technique (Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72, 1983) , the EBV-hybridoma technique (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985) , or trioma techniques. The technology for producing hybridomas is well known (see, generally, Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds. ) , John Wiley &Sons, Inc., New York, NY) . Hybridoma cells producing a monoclonal antibody are detected by screening the hybridoma culture supernatants for antibodies that bind the polypeptide or epitope of interest, e.g., using a standard ELISA assay.

[0982] VHH can also be obtained from  or designed synthetic llama VHH libraries. PBMC from llamas can be obtained, and RNA can be isolated to generate cDNA by reverse transcription. Then, the VHH genes can be amplified by PCR and cloned to a phage display vector to construct the  VHH library. The synthetic (e.g., humanized) VHH library can be prepared by incorporation of shuffled VHH CDR1, 2 and 3, generated by overlapping PCR, to a modified human VH scaffold to generate enhanced diversity and keep low immunogenicity. The VHH libraries can be then panned against antigens to obtain VHH with desired binding affinities.

[0983] Variants of the antibodies, antigen-binding fragments, or the antigen-binding protein constructs described herein can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the DNA encoding a human, humanized, or chimeric antibody, or antigen-binding fragment thereof described herein, or by peptide synthesis. Such variants include, for example, deletions, insertions, or substitutions of residues within the amino acids sequences that make-up the antigen-binding site of the antibody or an antigen-binding domain. In a population of such variants, some antibodies or antigen-binding fragments will have increased affinity for the target protein. Any combination of deletions, insertions, and / or combinations can be made to arrive at an antibody or antigen-binding fragment thereof that has increased binding affinity for the target. The amino acid changes introduced into the antibody or antigen-binding fragment can also alter or introduce new post-translational modifications into the antibody or antigen-binding fragment, such as changing (e.g., increasing or decreasing) the number of glycosylation sites, changing the type of glycosylation site (e.g., changing the amino acid sequence such that a different sugar is attached by enzymes present in a cell) , or introducing new glycosylation sites.

[0984] Antibodies disclosed herein can be derived from any species of animal, including mammals. Non-limiting examples of native antibodies include antibodies derived from humans, primates, e.g., monkeys and apes, cows, pigs, horses, sheep, camelids (e.g., camels and llamas) , chicken, goats, and rodents (e.g., rats, mice, hamsters and rabbits) , including transgenic rodents genetically engineered to produce human antibodies.

[0985] Human and humanized antibodies include antibodies having variable and constant regions derived from (or having the same amino acid sequence as those derived from) human germline immunoglobulin sequences. Human antibodies may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo) , for example in the CDRs.

[0986] A humanized antibody, typically has a human framework (FR) grafted with non-human CDRs. Thus, a humanized antibody has one or more amino acid sequence introduced into it from a source which is non-human. These non-human amino acid residues are often referred to as “import” residues, which are typically taken from an “import” variable domain. Humanization can be essentially performed by e.g., substituting rodent CDRs or CDR sequences for the corresponding sequences of a human antibody. These methods are described in e.g., Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986) ; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988) ; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988) ; each of which is incorporated by reference herein in its entirety. Accordingly, “humanized” antibodies are chimeric antibodies wherein substantially less than an intact human V domain has been substituted by the corresponding sequence from a non-human species. In practice, humanized antibodies are typically mouse antibodies in which some CDR residues and some FR residues are substituted by residues from analogous sites in human antibodies.

[0987] It is further important that antibodies be humanized with retention of high specificity and affinity for the antigen and other favorable biological properties. To achieve this goal, humanized antibodies can be prepared by a process of analysis of the parental sequences and various conceptual humanized products using three-dimensional models of the parental and humanized sequences. Three-dimensional immunoglobulin models are commonly available and are familiar to those skilled in the art. Computer programs are available which illustrate and display probable three-dimensional conformational structures of selected candidate immunoglobulin sequences. Inspection of these displays permits analysis of the likely role of the residues in the functioning of the candidate immunoglobulin sequence, i.e., the analysis of residues that influence the ability of the candidate immunoglobulin to bind its antigen. In this way, FR residues can be selected and combined from the recipient and import sequences so that the desired antibody characteristic, such as increased affinity for the target antigen (s) , is achieved.

[0988] Identity or homology with respect to an original sequence is usually the percentage of amino acid residues present within the candidate sequence that are identical with a sequence present within the human, humanized, or chimeric antibody or fragment, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity.

[0989] In some embodiments, a covalent modification can be made to the antibody or antigen-binding fragment thereof. These covalent modifications can be made by chemical or enzymatic synthesis, or by enzymatic or chemical cleavage. Other types of covalent modifications of the antibody or antibody fragment are introduced into the molecule by reacting targeted amino acid residues of the antibody or fragment with an organic derivatization agent that is capable of reacting with selected side chains or the N-or C-terminal residues.

[0990] In some embodiments, antibody variants are provided having a carbohydrate structure that lacks fucose attached (directly or indirectly) to an Fc region. For example, the amount of fucose in such antibody may be from 1%to 80%, from 1%to 65%, from 5%to 65%or from 20%to 40%. The amount of fucose is determined by calculating the average amount of fucose within the sugar chain at Asn297, relative to the sum of all glycostructures attached to Asn 297 (e.g. complex, hybrid and high mannose structures) as measured by MALDI-TOF mass spectrometry, as described in WO 2008 / 077546, for example. Asn297 refers to the asparagine residue located at about position 297 in the Fc region (EU numbering of Fc region residues; or position 314 in Kabat numbering) ; however, Asn297 may also be located about ±3 amino acids upstream or downstream of position 297, i.e., between positions 294 and 300, due to minor sequence variations in antibodies. Such fucosylation variants may have improved ADCC function. In some embodiments, to reduce glycan heterogeneity, the Fc region of the antibody can be further engineered to replace the Asparagine at position 297 with Alanine (N297A) .

[0991] In some embodiments, to facilitate production efficiency by avoiding Fab-arm exchange, the Fc region of the antibodies was further engineered to replace the serine at position 228 (EU numbering) of IgG4 with proline (S228P) . A detailed description regarding S228 mutation is described, e.g., in Silva et al. “The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation. ” Journal of Biological Chemistry 290.9 (2015) : 5462-5469, which is incorporated by reference in its entirety.

[0992] In some embodiments, the methods described here are designed to make a bispecific antibody. In some embodiments, the methods described here are designed to make a trispecific antibody. Bispecific or trispecific antibodies can be made by engineering the interface between different antibody molecules to maximize the percentage of heterodimers that are recovered from recombinant cell culture. For example, the interface can contain at least a part of the CH3 domain of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (e.g., tyrosine or tryptophan) . Compensatory “cavities” of identical or similar size to the large side chain (s) are created on the interface of the second antibody molecule by replacing large amino acid side chains with smaller ones (e.g., alanine or threonine) . This provides a mechanism for increasing the yield of the heterodimer over other unwanted end-products such as homodimers. This method is described, e.g., in WO 96 / 27011, which is incorporated by reference in its entirety.

[0993] In some embodiments, one or more amino acid residues in the CH3 portion of the IgG are substituted. In some embodiments, one heavy chain has one or more of the following substitutions T366W. The other heavy chain can have one or more the following substitutions T366S, L368A, and Y407V. Furthermore, a substitution (-ppcpScp (SEQ ID NO: 265) -->-ppcpPcp (SEQ ID NO: 266) -) can also be introduced at the hinge regions of both substituted IgG.

[0994] Furthermore, an anion-exchange chromatography can be used to purify the antibodies or antigen binding fragments described herein. Anion-exchange chromatography is a process that separates substances based on their charges using an ion-exchange resin containing positively charged groups, such as diethyl-aminoethyl groups (DEAE) . In solution, the resin is coated with positively charged counter-ions (cations) . Anion exchange resins will bind to negatively charged molecules, displacing the counter-ion. Anion exchange chromatography can be used to purify proteins based on their isoelectric point (pI) . The isoelectric point is defined as the pH at which a protein has no net charge. When the pH > pI, a protein has a net negative charge and when the pH < pI, a protein has a net positive charge. Thus, in some embodiments, different amino acid substitution can be introduced into two heavy chains, so that the pI for the homodimer comprising two Arm A and the pI for the homodimer comprising two Arm B is different. The pI for the bispecific or trispecific antibody having Arm A and Arm B will be somewhere between the two pIs of the homodimers. Thus, the two homodimers and the bispecific antibody or trispecific antibody can be released at different pH conditions. The present disclosure shows that a few amino acid residue substitutions can be introduced to the heavy chains to adjust pI.

[0995] Methods of Treatment

[0996] The methods described herein include methods for the treatment of disorders associated with cancer. Generally, the methods include administering a therapeutically effective amount of engineered multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies or trispecific antibodies) or the antigen-binding protein constructs as described herein, to a subject who is in need of, or who has been determined to be in need of, such treatment.

[0997] As used in this context, to “treat” means to ameliorate at least one symptom of the disorder associated with cancer. Often, cancer results in death; thus, a treatment can result in an increased life expectancy (e.g., by at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 months, or by at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 years) . Administration of a therapeutically effective amount of an agent described herein (e.g., antigen-binding protein constructs) for the treatment of a condition associated with cancer will result in decreased number of cancer cells and / or alleviated symptoms.

[0998] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for autonomous growth, i.e., an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include all types of cancerous growths or oncogenic processes, metastatic tissues or malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. The term “tumor” as used herein refers to cancerous cells, e.g., a mass of cancerous cells. Cancers that can be treated or diagnosed using the methods described herein include malignancies of the various organ systems, such as affecting lung, breast, thyroid, lymphoid, gastrointestinal, and genito-urinary tract, as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, non-small cell carcinoma of the lung, cancer of the small intestine and cancer of the esophagus. In some embodiments, the agents described herein are designed for treating or diagnosing a carcinoma in a subject. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues including respiratory system carcinomas, gastrointestinal system carcinomas, genitourinary system carcinomas, testicular carcinomas, breast carcinomas, prostatic carcinomas, endocrine system carcinomas, and melanomas. In some embodiments, the cancer is renal carcinoma or melanoma. Exemplary carcinomas include those forming from tissue of the cervix, lung, prostate, breast, head and neck, colon and ovary. The term also includes carcinosarcomas, e.g., which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation.

[0999] In one aspect, the disclosure also provides methods for treating a cancer in a subject, methods of reducing the rate of the increase of volume of a tumor in a subject over time, methods of reducing the risk of developing a metastasis, or methods of reducing the risk of developing an additional metastasis in a subject. In some embodiments, the treatment can halt, slow, retard, or inhibit progression of a cancer. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of in the number, severity, and / or duration of one or more symptoms of the cancer in a subject.

[1000] In one aspect, the disclosure features methods that include administering a therapeutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof, antigen-binding protein constructs, or an antibody drug conjugate disclosed herein to a subject in need thereof, e.g., a subject having, or identified or diagnosed as having, a cancer, e.g., breast cancer (e.g., triple-negative breast cancer) , carcinoid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, renal cancer, colorectal cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, urethral cancer, or hematologic malignancy.

[1001] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present invention is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated by the present invention. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[1002] In some embodiments, the cancer is a cancer expressing CAIX.

[1003] In some embodiments, the cancers are lung cancers, colorectal cancer, head and neck cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, urothelial cancer, breast cancer, cervical cancer, or endometrial cancer.

[1004] In some embodiments, the cancer cells described herein is cell lines, e.g., HT-29 cells. In some embodiments, the cancer cells have an elevated CAIX level, e.g., at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%higher than non-cancerous cells.

[1005] In some embodiments, the compositions and methods disclosed herein can be used for treatment of patients at risk for a cancer. Patients with cancer can be identified with various methods known in the art.

[1006] As used herein, by an “effective amount” is meant an amount or dosage sufficient to effect beneficial or desired results including halting, slowing, retarding, or inhibiting progression of a disease, e.g., a cancer. An effective amount will vary depending upon, e.g., an age and a body weight of a subject to which the antibody, antigen binding fragment, antigen-binding protein constructs, antibody-drug conjugates, antibody-encoding polynucleotide, vector comprising the polynucleotide, and / or compositions thereof is to be administered, a severity of symptoms and a route of administration, and thus administration can be determined on an individual basis.

[1007] An effective amount can be administered in one or more administrations. By way of example, an effective amount of an antibody, an antigen binding fragment, an antigen-binding protein construct, or an antibody-drug conjugate is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, inhibit, slow and / or delay progression of a cancer in a patient or is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, slow and / or delay proliferation of a cell (e.g., a biopsied cell, any of the cancer cells described herein, or cell line (e.g., a cancer cell line) ) in vitro. As is understood in the art, an effective amount may vary, depending on, inter alia, patient history as well as other factors such as the type (and / or dosage) of the agent used.

[1008] Effective amounts and schedules for administering the antibodies, antigen-binding protein constructs, antibody-encoding polynucleotides, antibody-drug conjugates, and / or compositions disclosed herein may be determined empirically, and making such determinations is within the skill in the art.

[1009] A typical dosage of an effective amount of an antibody or antigen-binding protein construct is 0.01 mg / kg to 100 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be less than 100 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be greater than 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, 0.1 mg / kg, 0.05 mg / kg, or 0.01 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.9 mg / kg, 0.8 mg / kg, 0.7 mg / kg, 0.6 mg / kg, 0.5 mg / kg, 0.4 mg / kg, 0.3 mg / kg, 0.2 mg / kg, or 0.1 mg / kg.

[1010] In any of the methods described herein, the at least one antibody, antigen-binding fragment thereof, antigen-binding protein constructs, antibody-drug conjugates, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding fragments, antigen-binding protein constructs, antibody-drug conjugates, or pharmaceutical compositions described herein) and, optionally, at least one additional therapeutic agent can be administered to the subject at least once a week (e.g., once a week, twice a week, three times a week, four times a week, once a day, twice a day, or three times a day) .

[1011] In some embodiments, one or more additional therapeutic agents can be administered to the subject. The additional therapeutic agent can comprise one or more inhibitors selected from the group consisting of an inhibitor of B-Raf, an EGFR inhibitor, an inhibitor of a MEK, an inhibitor of ERK, an inhibitor of K-Ras, an inhibitor of c-Met, an inhibitor of anaplastic lymphoma kinase (ALK) , an inhibitor of a phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) , an inhibitor of an Akt, an inhibitor of mTOR, a dual PI3K / mTOR inhibitor, an inhibitor of Bruton's tyrosine kinase (BTK) , and an inhibitor of Isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) and / or Isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) . In some embodiments, the additional therapeutic agent is an inhibitor of indoleamine 2, 3-dioxygenase-1) (IDO1) (e.g., epacadostat) .

[1012] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more inhibitors selected from the group consisting of an inhibitor of HER3, an inhibitor of LSD1, an inhibitor of MDM2, an inhibitor of BCL2, an inhibitor of CHK1, an inhibitor of activated hedgehog signaling pathway, and an agent that selectively degrades the estrogen receptor.

[1013] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more therapeutic agents selected from the group consisting of Trabectedin, nab-paclitaxel, Trebananib, Pazopanib, Cediranib, Palbociclib, everolimus, fluoropyrimidine, IFL, regorafenib, Reolysin, Alimta, Zykadia, Sutent, temsirolimus, axitinib, everolimus, sorafenib, Votrient, Pazopanib, IMA-901, AGS-003, cabozantinib, Vinflunine, an Hsp90 inhibitor, Ad-GM-CSF, Temazolomide, IL-2, IFN-α, vinblastine, Thalomid, dacarbazine, cyclophosphamide, lenalidomide, azacytidine, lenalidomide, bortezomid, amrubicine, carfilzomib, pralatrexate, and enzastaurin.

[1014] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more therapeutic agents selected from the group consisting of an adjuvant, a TLR agonist, tumor necrosis factor (TNF) alpha, IL-1, HMGB1, an IL-10 antagonist, an IL-4 antagonist, an IL-13 antagonist, an IL-17 antagonist, an HVEM antagonist, an ICOS agonist, a treatment targeting CX3CL1, a treatment targeting CXCL9, a treatment targeting CXCL10, a treatment targeting CCL5, an LFA-1 agonist, an ICAM1 agonist, and a Selectin agonist.

[1015] In some embodiments, carboplatin, nab-paclitaxel, paclitaxel, cisplatin, pemetrexed, gemcitabine, FOLFOX, or FOLFIRI are administered to the subject.

[1016] In some embodiments, the additional therapeutic agent is an anti-OX40 antibody, an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-PD-L2 antibody, an anti-LAG-3 antibody, an anti-TIGIT antibody, an anti-BTLA antibody, an anti-CTLA-4 antibody, or an anti-GITR antibody.

[1017] Pharmaceutical Compositions and Routes of Administration

[1018] Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) . The compositions can include a sterile diluent (e.g., sterile water or saline) , a fixed oil, polyethylene glycol, glycerine, propylene glycol or other synthetic solvents, antibacterial or antifungal agents, such as benzyl alcohol or methyl parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like, antioxidants, such as ascorbic acid or sodium bisulfite, chelating agents, such as ethylenediaminetetraacetic acid, buffers, such as acetates, citrates, or phosphates, and isotonic agents, such as sugars (e.g., dextrose) , polyalcohols (e.g., mannitol or sorbitol) , or salts (e.g., sodium chloride) , or any combination thereof. Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers (see, e.g., U.S. Patent No. 4,522,811) . Preparations of the compositions can be formulated and enclosed in ampules, disposable syringes, or multiple dose vials. Where required (as in, for example, injectable formulations) , proper fluidity can be maintained by, for example, the use of a coating, such as lecithin, or a surfactant. Absorption of the antibody, antigen-binding fragment thereof, or the antigen-binding protein construct can be prolonged by including an agent that delays absorption (e.g., aluminum monostearate and gelatin) . Alternatively, controlled release can be achieved by implants and microencapsulated delivery systems, which can include biodegradable, biocompatible polymers (e.g., ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid; Alza Corporation and Nova Pharmaceutical, Inc. ) .

[1019] Compositions containing one or more of any of the antibodies, antigen-binding fragments, antigen-binding protein constructs, antigen binding proteins, antibody-drug conjugates described herein can be formulated for parenteral (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in dosage unit form (i.e., physically discrete units containing a predetermined quantity of active compound for ease of administration and uniformity of dosage) .

[1020] Toxicity and therapeutic efficacy of compositions can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals (e.g., monkeys) . One can determine the LD50 (the dose lethal to 50%of the population) and the ED50 (the dose therapeutically effective in 50%of the population) : the therapeutic index being the ratio of LD50: ED50. Agents that exhibit high therapeutic indices are preferred. Where an agent exhibits an undesirable side effect, care should be taken to minimize potential damage (i.e., reduce unwanted side effects) . Toxicity and therapeutic efficacy can be determined by other standard pharmaceutical procedures.

[1021] Data obtained from cell culture assays and animal studies can be used in formulating an appropriate dosage of any given agent for use in a subject (e.g., a human) . A therapeutically effective amount of the one or more (e.g., one, two, three, or four) antibodies, antigen-binding fragments thereof, or antigen-binding protein constructs (e.g., any of the antibodies, antibody fragments, or antigen-binding protein constructs described herein) will be an amount that treats the disease in a subject (e.g., kills cancer cells ) in a subject (e.g., a human subject identified as having cancer) , or a subject identified as being at risk of developing the disease (e.g., a subject who has previously developed cancer but now has been cured) , decreases the severity, frequency, and / or duration of one or more symptoms of a disease in a subject (e.g., a human) . The effectiveness and dosing of any of the antibodies, antigen-binding fragments, or antigen-binding protein constructs described herein can be determined by a health care professional or veterinary professional using methods known in the art, as well as by the observation of one or more symptoms of disease in a subject (e.g., a human) . Certain factors may influence the dosage and timing required to effectively treat a subject (e.g., the severity of the disease or disorder, previous treatments, the general health and / or age of the subject, and the presence of other diseases) .

[1022] Exemplary doses include milligram or microgram amounts of any of the antibodies or antigen-binding fragments, antigen-binding protein constructs, or antibody-drug conjugates described herein per kilogram of the subject’s weight (e.g., about 1 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 50 mg / kg; about 10 μg / kg to about 5 mg / kg; about 10 μg / kg to about 0.5 mg / kg; or about 1 μg / kg to about 50 μg / kg) . While these doses cover a broad range, one of ordinary skill in the art will understand that therapeutic agents, including antibodies and antigen-binding fragments thereof, vary in their potency, and effective amounts can be determined by methods known in the art. Typically, relatively low doses are administered at first, and the attending health care professional or veterinary professional (in the case of therapeutic application) or a researcher (when still working at the development stage) can subsequently and gradually increase the dose until an appropriate response is obtained. In addition, it is understood that the specific dose level for any particular subject will depend upon a variety of factors including the activity of the specific compound employed, the age, body weight, general health, gender, and diet of the subject, the time of administration, the route of administration, the rate of excretion, and the half-life of the antibody, antibody fragment, or antigen-binding protein constructs in vivo.

[1023] The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration. The disclosure also provides methods of manufacturing the antibodies, antigen binding fragments thereof, or antigen-binding protein constructs for various uses as described herein.

[1024] EXAMPLES

[1025] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[1026] Unless otherwise stated, temperatures are in degrees Celsius and pressures are at or near atmospheric pressure. Standard abbreviations may be used, such as bp for base pairs; kb for kilobase pairs; pL for picoliter; s for seconds; min for minutes; h or hr for hours; aa for amino acid; nt for nucleotide; i. m. for intramuscular injection; i. p. for intraperitoneal injection; s. c. for subcutaneous injection, MPK for milligrams per kilograms, etc.

[1027] Materials and Methods

[1028] Preparation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC)

[1029] PBMCs were prepared by density gradient centrifugation, and blood samples were from blood banks or healthy human donors.

[1030] The blood of healthy donors was stored in an EDTA-containing anticoagulation tube, and allowed to stand for 10 minutes. An equal volume of 2%PBS (pH 7.4) was added and mix thoroughly. 15 ml Ficoll Paque PLUS low-density centrifugal fluid (GE) was added into a 50 ml Falcon tube, and 30 ml of diluted fresh blood was aspirated and slowly added to the upper layer of the density gradient solution along the side wall of the Falcon tube. The centrifuge was adjusted to the brake off state, the test tube was loaded on the centrifuge, and centrifuged at 1450 rpm at room temperature for 45 minutes. The test tube was gently taken out and visually observed to make sure that the blood in the centrifuge tube was divided into three layers (the upper layer is the serum layer, the white part of the middle layer is the peripheral blood mononuclear cells, and the bottom layer is the red blood cells) . The upper yellow and transparent serum layer was carefully aspirated, leaving only the middle layer, which was transferred to a new 15 ml centrifuge tube. An equal volume of the gradient solution was added and the diluted middle layer was centrifuged at 1450 rpm for 30 minutes at room temperature. The upper suspension was removed, retaining the bottom cell pellet. The cells were re-suspended and washed 3 times until the upper layer was clear. 1 ml of 2%FBS-PBS buffer was added to re-suspend the cells. After the PBMC was counted, the cells were re-suspended in the RPMI1640 medium containing 10%FBS (GIBCO) and 1%L-glutamine (GIBCO) and cultured in a CO2 incubator at 37℃ and 5%CO2.

[1031] DNA Sequencing and synthesis

[1032] The DNA sequence was determined by double-stranded DNA sequencing, and the sequencing was performed by GENEWIZ (Suzhou Jinweizhi Biotechnology Co., Ltd. ) .

[1033] All genes involved in these experiments were synthesized by GenScript (Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd. ) .

[1034] Example 1: Preparation of CAIX antigen and nanobody

[1035] The extracellular domains of human, cynomolgus monkey, mouse and rat CAIX are abbreviated as hCAIX, cCAIX, mCAIX, and rCAIX, respectively. Among them, hCAIX is functionally divided into a carbonic anhydrase catalytic domain (Alpha-carbonic anhydrase, CA) and a proteoglycan-like domain (Proteoglycan-like, PG) . The corresponding proteins are named hCAIX-PG, hCAIX-CA. The 8xHis (SEQ ID NO: 268) tag was fused to the C-terminus of the DNA fragment encoding the above antigen, inserted into the pCDNA3.1 vector, and then the plasmid DNA was transfected into HEK 293F cells through PEI (Polysciences, Cat#24765-2) for transient expression of the target protein. After 5 days of culture, the cell supernatant was harvested, the target protein was purified using Ni Sepharose excel (Cytiva) , and its purity was analyzed by SDS PAGE gel electrophoresis.

[1036] hCAIX antigen (AcroBiosystems, Cat#H5226) was used to immunize alpacas (Llama) . Positive nanobodies that bind to hCAIX were obtained by constructing an immune nanobody library, panning the library, and screening by Phage-ELISA. The nanobody VHH sequence and human IgG1 Fc were inserted into the pCDNA3.1 vector through homologous recombination. 293F cells in suspension were transiently transfected with PEI, and the VHH-Fc fusion protein was obtained through Protein A (Cytiva) affinity purification. CAIX control antibodies Girentuximab and 3ee9 were prepared using 293F cells transiently transfected with PEII.

[1037] ELISA was used to detect the binding affinities of control antibodies Girentuximab, 3ee9 (see FIG. 26 for sequences) to CAIX antigens from different species (Table 1) . The results showed that Girentuximab and 3ee9 bind strongly to hCAIX and cCAIX, with an EC50 of 0.14 nM -0.28 nM. The binding mainly occurs in the hCAIX catalytic domain (Alpha-carbonic anhydrase, CA) . The binding to the hCAIX proteoglycan-like domain is very weak (data not shown) . Girentuximab and 3ee9 bind very weakly to mCAIX and rCAIX.

[1038] Table 1. Binding EC50 (nM) of girentuximab and 3ee9 antibodies to CAIX antigens from different species

[1039] The pCDH lentiviral vector containing hCAIX cDNA (purchased from Invitrogen) was used to generate 293T cells overexpressing hCAIX (293T-hCAIX) . The binding of CAIX nanobody VHH-Fc (5 μg / ml) to 293T-hCAIX cells was measured using a flow cytometer, and the corresponding median fluorescence intensity (MFI) and positive rate were calculated. 293T cells were used as negative control cells that did not express hCAIX.

[1040] The results in Table 2 showed that nanobody samples have strong binding to 293T-hCAIX cells, with a positive rate of 91.14%-98.46%, and the binding activity of some samples is higher than that of the control antibody 3ee9.

[1041] Table 2. Flow cytometric detection of binding of nanobody to 293T and 293T-hCAIX cells

[1042] Example 2: Bio-Layer Interferometry (BLI) detection of affinity between nanobody and hCAIX

[1043] ForteBio was used to detect the affinity of nanobody to hCAIX antigen. Briefly, the Protein A sensor was equilibrated offline in the analysis buffer for 30 min, and then detected online for 60 s to establish a baseline. 200 μL nanobody with a concentration of 5 μg / ml was loaded onto the sensor, and the sensor was placed into a series of concentrations (up to 200 nM, 2-fold dilution, 7 concentration gradients in total) of hCAIX antigen for 5 min, and then the sensor was dissociated in 0.02%PBST for 5 min. Kinetic analysis was performed using a 1: 1 binding model. The results are shown in the table below. All candidate nanobodies bind strongly to hCAIX with affinities in the nanomolar to picomolar range.

[1044] Table 3. Affinity of candidate nanobodies to hCAIX antigen

[1045] Example 3: ELISA detection of the binding of nanobodies to other isoform proteins of the human CA family and CAIX of different species

[1046] hCA I, hCA II, hCA IV, hCA XII and hCA XIV antigens were purchased from Sino Biological. mCAIX, rCAIX, and cCAIX are homemade proteins. ELISA was used to determine the binding of candidate nanobodies (5 μg / ml) to the above antigens.

[1047] Experimental results showed that the nanobodies do not bind or bind very weakly to hCA I, hCA II, hCA IV, hCA XII and hCA XIV proteins. Except for 26C8, which has slightly weaker binding to mCAIX and rCAIX, all candidate nanobodies have strong binding activity to mCAIX, rCAIX, and cCAIX antigens (Table 4) . This showed that the candidate nanobodies has good specificity and reacts with multiple species of CAIX. Clones 35E7 and 33A10 in Table 3 only bind to hCAIX and do not bind to mCAIX antigen, rCAIX antigen and cCAIX antigen.

[1048] Table 4. Binding of candidate Nanobodies to mCAIX antigen, rCAIX antigen and cCAIX antigen

[1049] Example 4: Thermal c...

Claims

1.A multi-specific antigen binding molecule that comprises a T cell binding domain that specifically binds to a T cell antigen and a CAIX binding domain that specifically binds to CAIX;preferably, the CAIX binding domain and human CAIX (hCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM; and / or the CAIX binding domain and cynomolgus monkey CAIX (cCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM; and / or the CAIX binding domain and rat CAIX (rCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM; and / or the CAIX binding domain and mouse CAIX (mCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-300nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 0.04nM-0.1nM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 1nM-150nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-150nM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-200nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 1.0nM-1.5pM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 10nM-15nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 10nM-15nM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-80nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 0.04nM-0.1nM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 0.3nM-80nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-30nM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.1nM-8nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 1.0nM-4pM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 3nM-8nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 0.1nM-3nM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-150nM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.03nM-60nM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.07nM-52nM.2.The antigen binding molecule of claim 1, wherein the CAIX binding domain comprises: a domain antibody (dAb) , a single domain antibody (sdAb) , a VHH, a humanized VHH, a single-chain variable fragment (scFv) , a VL domain, a VH domain, a combination of VL and VH domains, or a Fab.3.The antigen binding molecule of claim 2, wherein the CAIX binding domain comprises a sdAb, a VHH, a scFv, or a humanized VHH.4.The antigen binding molecule of any one of claims 1-3, wherein the T cell antigen is CD3;preferably, the T cell binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of 0.01nM-1000nM;preferably, the T cell binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of is 0.2nM-300nM;preferably, the CD3 binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of 5nM-400nM;preferably, the T cell binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of 5nM-70nM.5.The antigen binding molecule of claim 4, wherein the T cell binding domain comprises a Fab, a scFv, or a VHH.6.The antigen binding molecule of claim 4, wherein the antigen binding molecule further comprises a half-life extending domain.7.The antigen binding molecule of claim 6, wherein the half-life extending domain is selected from: polyethylene glycol, serum albumin or a fragment thereof, a transferrin receptor or a fragment thereof, and an antibody or a fragment thereof.8.The antigen binding molecule of claim 7, wherein the half-life extending domain is an immunoglobulin fragment crystallizable region (Fc region) .9.The antigen binding molecule of claim 8, wherein the Fc region comprises a first Fc subunit and a second Fc subunit.10.The antigen binding molecule of claim 8 or claim 9, wherein at least one of the T cell binding domain and / or the CAIX binding domain is fused to the Fc region.11.The antigen binding molecule of claim 10, wherein the T cell binding domain is selected from the group consisting of a Fab, a scFv, and a VHH; and the CAIX binding domain is selected from the group consisting of a scFv and a VHH.12.The antigen binding molecule of claim 11, wherein the T cell binding domain is fused to the N-terminus or C-terminus of the first Fc subunit, and the CAIX binding domain is fused to the N-terminus or C-terminus of the second Fc subunit.13.The antigen binding molecule of claim 12, wherein the T cell binding domain is fused to the N-terminus of the first Fc subunit, and the CAIX binding domain is fused to the N-terminus of the second Fc subunit.14.The antigen binding molecule of any one of claims 1-13, wherein the antigen binding molecule further comprises a second CAIX binding domain that specifically binds to CAIX.15.The antigen binding molecule of claim 14, wherein the CAIX binding domain and the second CAIX binding domain bind to (1) different epitopes on CAIX or (2) the same epitope on CAIX.16.The antigen binding molecule of claim 15, wherein the T cell binding domain comprises a Fab; the CAIX binding domain comprises a VHH; and the second CAIX binding domain comprises a VHH.17.The antigen binding molecule of claim 16, wherein(1) the T cell binding domain is fused to the N-terminus of the first Fc subunit;(2) the CAIX binding domain is fused to (a) the N-terminus of the second Fc subunit, (b) the N-terminus of the heavy chain of the Fab in the T cell binding domain, (c) the N-terminus of the light chain of the Fab in the first antigen binding domain, (d) the C-terminus of the light chain of the Fab in the T cell binding domain, (e) the C-terminus of the First Fc subunit, or (f) the C-terminus of the second Fc subunit; or(3) the second CAIX binding domain is fused to (a) the N-terminus of the CAIX binding domain, (b) the N-terminus of the heavy chain of the Fab in the T cell binding domain, (c) the N-terminus of the light chain of the Fab in the first antigen binding domain, (d) the C-terminus of the light chain of the Fab in the T cell binding domain, (e) the C-terminus of the CAIX binding domain, (f) the C-terminus of the First Fc subunit, or (g) the C-terminus of the second Fc subunit.18.The antigen binding molecule of claim 16, wherein(1) the T cell binding domain is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and(2) the CAIX binding domain and the second CAIX binding domain are fused to (a) the N-terminus of the heavy chain of the Fab in the T cell binding domain, (b) the N-terminus of the light chain of the Fab in the first antigen binding domain, or (c) the C-terminus of the light chain of the Fab in the T cell binding domain.19.The antigen binding molecule of claim 18, wherein:(1) the T cell binding domain is fused to the N-terminus of the first Fc subunit;(2) the second CAIX binding domain is fused to the N-terminus of the CAIX binding domain; and(3) the CAIX binding domain and the second CAIX binding domain are fused to (a) the N-terminus of the heavy chain of the Fab in the T cell binding domain, (b) the N-terminus of the light chain of the Fab in the first antigen binding domain, or (c) the C-terminus of the light chain of the Fab in the T cell binding domain.20.The antigen binding molecule of any one of claims 1-19, wherein T cell binding domain comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein(1) the VH comprises, according to the IMGT definition:CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 151, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 155, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 89, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 175, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 161, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; orCDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 185, or variant sequences having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; andthe VL comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 153, 184, and 97 or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(2) the VH comprises, according to the Kabat definition:CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 237, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 233, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 198, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 209, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 215, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 223, or variant sequences having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; andthe VL comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 212, 219, and 97, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; or(3) the VH comprises, according to the Chothia definition:CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 215, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 223, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 237, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 233, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 198, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 209, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; andthe VL comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 212, 219, and 97, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .21.The antigen binding molecule of any one of claims 1-19, wherein the T cell binding domain further comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:(1) the FR1 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 91, 103, 119, and 183;(2) the FR2 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 125, 129, 133, and 156;(3) the FR3 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 74, 105, 108, 111, and 121; and(4) the FR4 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 115, 124, 142, 152, and 173.22.The antigen binding molecule of claim 21, wherein(1) the T cell binding domain comprises a heavy chain that comprises:(a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29;(b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29; or(c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region; and(2) the T cell binding domain comprises a light chain that comprises:(a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34;(b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34; or(c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region;preferably, the heavy chain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29: positions 3, 5, 15, 19, 78, 79, 80, 87, 102, 105, 106, 107, 108, 109, 114, and 120;preferably, the heavy chain comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 15: K3Q, L5V, K15G, K19R, Q78K, S79N, I80S, N87S, G102H, G105L / R, N106D / R, S107G, Y108F / K / P, V109M, Y114D, and L120A;preferably, the light chain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34: positions 8, 9, 12, 16, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 59, 60, 69, 71, 82, 87, 106, 107, 108, 109, and 46;preferably, the light chain comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 16: S8P, A9S, T12V, E16G, E40Q, D43G, H44Q, L45A, F46P, T47R, G59W, V60T, I69L, D71G, T82A, I87D, V106L, E107T, I108V, and K109L.23.The antigen binding molecule of any one of claims 1-21, wherein(1) the CAIX binding domain comprises, according to the IMGT definition:(A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 168, and SEQ ID NO: 180, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 131, and SEQ ID NO: 134, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and(C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 154, and SEQ ID NO: 176 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added;preferably, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82;preferably, the CDR3 sequence comprises X1X2X3X4WYX5GEYX6X7 (SEQ ID NO: 248) , wherein X1 is N, I, T or A; X2 is A, G, T or L; X3 is Q, H, P or L, X4 is V, Q, G or T, X5 is any amino acid, X6 is any amino acid, X7 is Y or L;preferably, the CDR2 sequence comprises IRX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 249) , wherein X1 is K or R; X2 is S or A; X3 is G or L; X4 is R or S, X5 is T, P or K;preferably, the CDR1 sequence comprises X1X2X3X4X5ING (SEQ ID NO: 263) , wherein X1 is G or S; X2 is G or T or P or N or E or S; X3 is G or P or Y or L or I, or E; X4 is G or F or V or W or N or A or I; X5 is A, W, L or S;(2) the CAIX binding domain comprises, according to the Kabat definition:(A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 246, , or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 241 and SEQ ID NO: 247, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and(C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 217, and SEQ ID NO: 229 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added; or(3) the CAIX binding domain comprises, according to the Chothia definition:(A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 242, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 222, and SEQ ID NO: 240, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and(C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 217, and SEQ ID NO: 229 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added.24.The antigen binding molecule of claim 23, wherein(1) the CAIX binding domain comprises, according to the IMGT definition:(a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 176, respectively;(b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 86, respectively;(c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 100, and 176, respectively;(d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 148, respectively;(e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 120, respectively;(f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 107, and 176, respectively;(g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 144, respectively;(h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 96, 134, and 176, respectively;(i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 143, 134, and 176, respectively;(j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 113, 134, and 176, respectively;(k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 126, 131, and 154, respectively;(l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 168, 131, and 154, respectively;(m) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 75, 134, and 176, respectively;(n) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 139, 134, and 176, respectively;(o) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 77, 134, and 176, respectively; or(s) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 180, 134, and 176, respectively;(2) the CAIX binding domain comprises, according to the Kabat definition:(a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 247, and 192, respectively;(b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 192, respectively;(c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 197, respectively;(d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 217, respectively;(e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 229, respectively;(f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 188, respectively;(g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 241, and 192, respectively;(h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 191, and 192, respectively;(i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 231, 247, and 192, respectively;(j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 234, 216, and 194, respectively;(k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 213, 216, and 194, respectively;(l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 247, and 192, respectively;(m) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 225, and 192, respectively;(n) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 191, and 192, respectively; or(3) the CAIX binding domain comprises, according to the Chothia definition:(a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 230, 211, and 192, respectively;(b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 192, respectively;(c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 242, 240, and 194, respectively;(d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 204, 240, and 194, respectively;(e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 193, 211, and 192, respectively;(f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 210, 211, and 192, respectively;(g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 208, 211, and 192, respectively;(h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 224, 211, and 192, respectively;(i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 187, 211, and 192, respectively;(j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 222, and 192, respectively;(k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 197, respectively;(l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 217, respectively;(m) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 229, respectively;(n) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 188, respectively;(o) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 226, 211, and 192, respectively.25.The antigen binding molecule of claim 24, wherein the CAIX binding domain further comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:FR1 is selected from: SEQ ID NOS: 72, 81, 106, 114, 122, 138, 146, 158, 159, 162, and 172;FR2 is selected from: SEQ ID NOS: 84, 88, 93, 166, 169, 170, 171, and 186;FR3 is selected from: SEQ ID NOS: 76, 109, 140, 141, 149, 150, 163, 167, and 179; andFR4 is selected from: SEQ ID NOS: 90, 99, 101, and 147.26.The antigen binding molecule of any one of claim 24-25, wherein the CAIX binding domain comprises:(a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52;(b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52; or(e) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17,18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region;preferably, the CAIX binding domain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52: positions 1, 13, 19, 41, 44, 50, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 72, 73, 74, 87, 96, 97, 98, 99, 102, 106, 107, 110, and 113;preferably, the CAIX binding domain comprises one or more of the following substitutions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2: Q1E, H13Q, R19K, P41S, P41Q / T, Q44A / g, K53R, S54A, G55L, R56S, T57P / K, D61A, N73D, A74S, P87T, N96N / I / T / a, A97G / T / l, Q98H / P / l, V99Q / g / T, Y107L, Q110R, and Q113L / T.27.The antigen binding molecule of any one of claims 8-26, wherein the Fc region is a human IgG1 Fc region or a human IgG4 Fc region;preferably, the human IgG4 Fc region comprises the S228P mutation.28.The antigen binding molecule of claim 27, wherein the Fc region comprises an amino acid addition, deletion, or substitution that promotes the affinity between the first Fc subunit and the second Fc subunit.29.The antigen binding molecule of claim 28, wherein the first Fc subunit comprises one or more of the following amino acid substitutions: Y349C, T366S, L368A, and Y407V; and the second Fc subunit comprises one or more of the following amino acid substitutions: S354C and T366W.30.The antigen binding molecule of claim 27, wherein the Fc region has a reduced binding affinity to a Fc receptor or a reduced ADCC effector function, compared to a natural Fc region.31.The antigen binding molecule of claim 30, wherein the Fc region comprises one or more amino acid substitutions that reduce (1) binding to the Fc receptor and / or (2) ADCC effector function.32.The antigen binding molecule of claim 31, wherein the Fc region comprises one or more amino acid substitutions at the following positions according to the EU numbering scheme: positions 234, 235, 237, 265, 329, 331.33.The antigen binding molecule of claim 32, wherein the Fc region comprises:234A / 235A;234A / 235A / 237A;234A / 235A / 331S;234A / 235A / 331G;234A / 235A / 329A;234A / 235A / 329G;234F / 235E / 331S;234F / 235E / 265A;234A / 235A / 237A / 265A;234A / 235A / 237A / 329A;234A / 235A / 237A / 331S;234A / 235A / 237A / 331G;234A / 235A / 265A / 329A;234A / 235A / 265A / 331S; or234A / 235A / 265A / 331G.34.The antigen binding molecule of any one of claims 30-33, wherein the Fc region is a human IgG4 Fc region that comprises mutations 234A, 235A, 329G and 228P.35.The antigen binding molecule of any one of claims 30-34, wherein the Fc region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, or an amino acid sequence that is at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the sequence of SEQ ID NO: 12.36.The antigen binding molecule of any one of claims 1-35, further comprising a tumor associated antigen (TAA) binding domain,preferably, the TAA is selected from the group consisting of: EGFR, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, tyrosine, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, and EphB2;preferably, the TAA is EGFR;preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of below 10μM;preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.01nM-500nM; and / or the TAA binding domain and mouse EGFR have a binding affinity KD value of 0.01nM-300nM; and / or the TAA binding domain and monkey EGFR have a binding affinity KD value of 0.01nM-200nM;preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.1nM-300nM;preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 1nM-200nM;preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.1nM-150nM;preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.5nM-122nM;preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.5nM-60nM;preferably, the T cell binding domain and human CD3 have a binding affinity KD value of 0.02nM-50nM; the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.05nM-500nM; and the CAIX binding domain and human CAIX have a binding affinity KD value of 0.03nM-20nM;preferably, the T cell binding domain and human CD3 have a binding affinity KD value of 0.2nM-6nM; the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.5nM-50nM; and the CAIX binding domain and human CAIX have a binding affinity KD value of 0.3nM-2nM.37.The antigen binding molecule of claim 36, wherein the TAA binding domain comprises: a domain antibody (dAb) , a single domain antibody (sdAb) , a VHH, a humanized VHH, a single-chain variable fragment (scFv) , a VL domain, a VH domain, a combination of VL and VH domains, or a Fab.38.The antigen binding molecule of claim 36, wherein the TAA binding domain comprises a sdAb or a VHH.39.The antigen binding molecule of claim 38, wherein the TAA binding domain is monovalent or polyvalent.40.The antigen binding molecule of claim 39, wherein the TAA binding domain comprises a humanized VHH or a camelid VHH.41.The antigen binding molecule of claim 38, wherein the T cell binding domain comprises an anti-CD3 Fab; the CAIX binding domain comprises an anti-CAIX VHH; and the TAA binding domain comprises an anti-EGFR VHH;preferably, the antigen binding molecule further comprises a Fc region.42.The antigen binding molecule of claim 41, wherein(1) the C-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and the anti-CAIX VHH or the anti-EGFR VHH is fused to either (a) the C-terminus of the light chain of the anti-CD3 Fab, or (b) the N-terminus of the second Fc subunit;(2) the C-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and the anti-CAIX VHH or the anti-EGFR VHH is fused to either (a) the N-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab, or (b) the N-terminus of the second Fc subunit;(3) the C-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and the anti-CAIX VHH or the anti-EGFR VHH is fused to either (a) the N-terminus of the light chain of the anti-CD3 Fab, or (b) the N-terminus of the second Fc subunit;(4) the C-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and the anti-CAIX VHH is fused to the anti-EGFR VHH, which is then fused to the N-terminus of the second Fc subunit; or(5) the C-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and the anti-EGFR VHH is fused to the anti-CAIX VHH, which is then fused to the N-terminus of the second Fc subunit.43.The antigen binding molecule of claim 42, wherein the C-terminus of the heavy chain of the anti-CD3 Fab is fused to the N-terminus of the first Fc subunit; and the anti-EGFR VHH is fused to the C-terminus of the light chain of the anti-CD3 Fab; and the anti-CAIX VHH is fused to the N-terminus of the second Fc subunit.44.The antigen binding molecule of any one of claims 36-43, wherein(1) TAA binding domain comprises, according to the IMGT definition:(a) a CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 80, 123, 137, and 165, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 164, 177, and 178, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and(c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 85, 104, 117, 130, 135, 136, and 181, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;preferably, the CDR3 sequence comprises AASYNVYYNX1YX2X3PISX4DEYDY (SEQ ID NO: 250) , wherein X1 is N or any other amino acid; X2 is Y or E; X3 is Y / K / V / R / D / E; and X4 is R or any other amino acid;preferably, the CDR2 sequence comprises IAWDX1GSX2 (SEQ ID NO: 251) , wherein X1 is S or G; and X2 is T or S;preferably, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123 or SEQ ID NO: 80; the CDR2 sequence comprises IAWDX1GSX2 (SEQ ID NO: 251) , wherein X1 is S or G; X2 is T or S; and the CDR3 comprises AASYNVYYNX1YX2X3PISX4DEYDY (SEQ ID NO: 250) , wherein X1 is N or any other amino acid; X2 is Y or E; X3 is Y / K / V / R / D / E; and X4 is R or any other amino acid;(2) TAA binding domain comprises, according to the Chothia definition:(a) CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 220, 228, and 245, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 202, and 238, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and(c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 199, 205, 214, 227, 235, 239 and 244, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; or(3) TAA binding domain comprises, according to the Kabat definition:(a) CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 213, and 236, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 189, 200, 201, 206, 207, 218, and 243, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and(c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 199, 205, 214, 227, 235, 239, and 244, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .45.The antigen binding molecule of claim 44, wherein(1) the TAA binding domain comprises, according to the IMGT definition:(A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 135, respectively;(B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 137, 177 and 135, respectively;(C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 80, 177 and 135, respectively;(D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 165, 177 and 135 respectively;(E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 164 and 135, respectively;(F) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 117 respectively;(G) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 130 respectively;(H) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 85 respectively;(I) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 136, respectively;(J) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 181, respectively;(K) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 104 respectively; or(L) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 178, and 104, respectively;(2) the TAA binding domain comprises, according to the Kabat definition:(A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 206, and 239, respectively;(B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 213, 206, and 239, respectively;(C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 213, 207, and 239 respectively;(D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 200, and 239, respectively;(E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 218, and 227 respectively;(F) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 199 respectively;(G) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 235 respectively;(H) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 201, and 214, respectively;(I) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 205, respectively;(J) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 244 respectively;(K) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 243, and 244, respectively; or(L) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 201, and 199, respectively;(3) the EGFR binding domain comprises, according to the Chothia definition:(A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 239, respectively;(B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 220, 202, and 239, respectively;(C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 228, 202, and 239, respectively;(D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 238, and 239, respectively;(E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 227, respectively;(F) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 199, respectively;(G) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 235, respectively;(H) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 214, respectively;(I) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 205, respectively;(J) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 244, respectively.46.The antigen binding molecule of claim 45, wherein the TAA binding domain further comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:(1) the FR1 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 79, 103, 110;(2) the FR2 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 73, 87, 102, 112, 118, 127, 132, 160;(3) the FR3 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 83, 94, 95, 98, 116, 128, 145, 157, 174, 182; and(4) the FR4 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101.47.The antigen binding molecule of claim 46, wherein the TAA binding domain comprises:(a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71;(b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71; or(c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 22 and 53-71, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region; andpreferably, the TAA binding domain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NO: 22: positions 14, 79, 80, 87, 41, 45, 46, 47, 68, 33, 27, 30, 59, 3, 88, 49, 108, 109, 58, 44, 55, 75, 113, 72, 106;preferably, the TAA binding domain comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 22: A14P, V79L, H80Y, K87R / D, T41P, R45L, E46V, F47Y, F68L, V33G, R27Y, S30G, Y59K / N, Q3T, P88A, A49S, Y108E, Y109K / V, T58S, Y59R, E44G, S55G, and A75S.48.An antigen binding molecule comprising a CD3 binding domain that specifically binds to CD3, wherein the CD3 binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of 0.01nM-1000nM, wherein the CD3 binding domain does not contain the VH and VL sequences as shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16;preferably, the CD3 binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of 5nM-400nM;preferably, the CD3 binding domain and a human CD3ε / δ or CD3ε protein have a binding affinity KD value of 7nM-70nM.49.An antigen binding molecule comprising a CD3 binding domain that specifically binds to CD3, wherein the CD3 binding domain comprises a heavy chain variable region (VH) and / or a light chain variable region (VL) , wherein(1) the VH comprises, according to the IMGT definition:CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 151, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 155, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 89, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 175, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 161, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; orCDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 78, 92, and 185, or variant sequences having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; andthe VL comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 153, 184, and 97 or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(2) the VH comprises, according to the Kabat definition:CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 237, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 233, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 198, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 209, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 215, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; orCDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 221, 203, and 223, or variant sequences having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) in comparison to them; andthe VL comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 212, 219, and 97, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; or(3) the VH comprises, according to the Chothia definition:CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 215, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 223, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 237, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 233, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 198, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 195, 190, and 209, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;the VL comprises CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ IDs NO: 212, 219, and 97, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;preferably, the CD3 binding domain further comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:(1) the FR1 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 91, 103, 119, and 183;(2) the FR2 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 125, 129, 133, and 156;(3) the FR3 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 74, 105, 108, 111, and 121; and(4) the FR4 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 115, 124, 142, 152, and 173.50.The antigen binding molecule of claim 49, wherein(1) the T cell binding domain comprises a heavy chain that comprises:(a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29;(b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29; or(c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 15 and 23-29, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region; and(2) the T cell binding domain comprises a light chain that comprises:(a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34;(b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34; or(c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 16 and 30-34, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region;preferably, the heavy chain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 15 and 23-29: positions 3, 5, 15, 19, 78, 79, 80, 87, 102, 105, 106, 107, 108, 109, 114, and 120;preferably, the heavy chain comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 15: K3Q, L5V, K15G, K19R, Q78K, S79N, I80S, N87S, G102H, G105L / R, N106D / R, S107G, Y108F / K / P, V109M, Y114D, and L120A;preferably, the light chain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 16 and 30-34: positions 8, 9, 12, 16, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 59, 60, 69, 71, 82, 87, 106, 107, 108, and 109;preferably, the light chain comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 16: S8P, A9S, T12V, E16G, E40Q, D43G, H44Q, L45A, F46P, T47R, G59W, V60T, I69L, D71G, T82A, I87D, V106L, E107T, I108V, and K109L.51.An antigen binding molecule comprising a CAIX binding domain that specifically binds to CAIX, wherein the CAIX binding domain and human CAIX (hCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM; and / or the CAIX binding domain and cattle CAIX (cCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM; and / or the CAIX binding domain and rat CAIX (rCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM; and / or the CAIX binding domain and mouse CAIX (mCAIX) have a binding affinity KD value of below 10 μM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-300nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 0.1nM-40pM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 1nM-150nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-150nM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-200nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 1.0nM-1.5pM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 10nM-15nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 10nM-15nM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-80nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 0.1nM-40pM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 0.3nM-80nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-30nM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.1nM-8nM; and / or the CAIX binding domain and cCAIX have a binding affinity KD value of 1.0nM-4pM; and / or the CAIX binding domain and rCAIX have a binding affinity KD value of 3nM-8nM; and / or the CAIX binding domain and mCAIX have a binding affinity KD value of 0.1nM-3nM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.01nM-150nM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.03nM-60nM;preferably, the CAIX binding domain and hCAIX have a binding affinity KD value of 0.07nM-52nM.52.An antigen binding molecule comprising a CAIX binding domain that specifically binds to CAIX, wherein(1) the CAIX binding domain comprises, according to the IMGT definition:(A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 168, and SEQ ID NO: 180, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 131, and SEQ ID NO: 134, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and(C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 154, and SEQ ID NO: 176 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three, or four, or five amino acids substituted, deleted, or added;preferably, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82;preferably, the CDR3 sequence comprises X1X2X3X4WYX5GEYX6X7 (SEQ ID NO: 248) , wherein X1 is N, I, T or A; X2 is A, G, T or L; X3 is Q, H, P or L; X4 is V, Q, G or T; X5 is any amino acid; X6 is any amino acid, X7 is Y or L;preferably, the CDR2 sequence comprises IRX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 249) , wherein X1 is K or R; X2 is S or A; X3 is G or L; X4 is R or S; X5 is T, P or K;preferably, the CDR1 sequence comprises X1X2X3X4X5ING (SEQ ID NO: 263) , wherein X1 is G or S; X2 is G or T or P or N or E or S; X3 is G or P or Y or L or I, or E; X4 is G or F or V or W or N or A or I; X5 is A, W, L or S;preferably, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; CDR2 sequence comprises IRX1X2X3X4X5 (SEQ ID NO: 249) , wherein X1 is K or R; X2 is S or A; X3 is G or L; X4 is R or S; X5 is T, P or K; the CDR3 sequence comprises X1X2X3X4WYX5GEYX6X7 (SEQ ID NO: 248) , wherein X1 is N, I, T or A; X2 is A, G, T or L; X3 is Q, H, P or L; X4 is V, Q, G or T; X5 is any amino acid; X6 is any amino acid; X7 is Y or L;(2) the CAIX binding domain comprises, according to the Kabat definition:(A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 246, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 241 and SEQ ID NO: 247, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and(C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 217, and SEQ ID NO: 229 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added; or(3) the CAIX binding domain comprises, according to the Chothia definition:(A) a CDR1 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 242 , or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(B) a CDR2 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 222, and SEQ ID NO: 240, or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and(C) a CDR3 sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 217, and SEQ ID NO: 229 or a variant sequence with one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added;preferably,(1) the CAIX binding domain comprises, according to the IMGT definition:(a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 176, respectively;(b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 86, respectively;(c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 100, and 176, respectively;(d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 148, respectively;(e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 120, respectively;(f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 107, and 176, respectively;(g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 82, 134, and 144, respectively;(h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 96, 134, and 176, respectively;(i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 143, 134, and 176, respectively;(j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 113, 134, and 176, respectively;(k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 126, 131, and 154, respectively;(l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 168, 131, and 154, respectively;(m) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 75, 134, and 176, respectively;(n) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 139, 134, and 176, respectively;(o) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 77, 134, and 176, respectively; or(t) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 180, 134, and 176, respectively;(2) the CAIX binding domain comprises, according to the Kabat definition:(a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 247, and 192, respectively;(b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 192, respectively;(c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 197, respectively;(d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 217, respectively;(e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 229, respectively;(f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 232, and 188, respectively;(g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 241, and 192, respectively;(h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 191, and 192, respectively;(i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 231, 247, and 192, respectively;(j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 234, 216, and 194, respectively;(k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 213, 216, and 194, respectively;(l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 246, 225, and 192, respectively; or(3) the CAIX binding domain comprises, according to the Chothia definition:(a) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 230, 211, and 192, respectively;(b) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 192, respectively;(c) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 242, 240, and 194, respectively;(d) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 204, 240, and 194, respectively;(e) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 193, 211, and 192, respectively;(f) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 210, 211, and 192, respectively;(g) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 208, 211, and 192, respectively;(h) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 224, 211, and 192, respectively;(i) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 187, 211, and 192, respectively;(j) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 222, and 192, respectively;(k) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 197, respectively;(l) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 217, respectively;(m) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 229, respectively;(n) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 196, 211, and 188, respectively;(o) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NOS: 226, 211, and 192, respectively.53.The antigen binding molecule of claim 52, wherein the CAIX binding domain further comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:FR1 is selected from: SEQ ID NOS: 72, 81, 106, 114, 122, 138, 146, 158, 159, 162, and 172;FR2 is selected from: SEQ ID NOS: 84, 88, 93, 166, 169, 170, 171, and 186;FR3 is selected from: SEQ ID NOS: 76, 109, 140, 141, 149, 150, 163, 167, and 179; andFR4 is selected from: SEQ ID NOS: 90, 99, 101, and 147.54.The antigen binding molecule of any one of claims 51-53, wherein the CAIX binding domain comprises:(a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52;(b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52;(c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region;preferably, the CAIX binding domain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 19, 20, 21, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, and 52: positions 1, 13, 19, 41, 44, 50, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 61, 72, 73, 74, 87, 96, 97, 98, 99, 102, 106, 107, 110, and 113;preferably, the CAIX binding domain comprises one or more of the following substitutions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2: Q1E, H13Q, R19K, P41S, P41Q / T, Q44A / G, K53R, S54A, G55L, R56S, T57P / K, D61A, N73D, A74S, P87T, N96N / I / T / A, A97G / T / l, Q98H / P / l, V99Q / G / T, Y107L, Q110R, and Q113L / T / G.55.An antigen binding molecule comprising an EGFR binding domain that specifically binds to EGFR, wherein the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.01nM-500nM; the EGFR binding domain and mouse EGFR have a binding affinity KD value of 0.01nM-300nM; and / or the EGFR binding domain and monkey EGFR have a binding affinity KD value of 0.01nM-200nM;preferably, the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.1nM-300nM;preferably, the TAA binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 1nM-200nM;preferably, the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.1nM-150nM;preferably, the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.5nM-122nM;preferably, the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.5nM-60nM;preferably, the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.03nM-20nM;preferably, the EGFR binding domain and human EGFR have a binding affinity KD value of 0.5nM-50nM.56.An antigen binding molecule comprising an EGFR binding domain that specifically binds to EGFR, wherein(1) the EGFR binding domain comprises, according to IMGT definition:(a) a CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 80, 123, 137, and 165, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 164, 177, and 178, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and(c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 85, 104, 117, 130, 135, 136, and 181, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, three or four amino acids substituted, deleted, or added) ;preferably, the CDR3 sequence comprises AASYNVYYNX1YX2X3PISX4DEYDY (SEQ ID NO: 250) , wherein X1 is N or any other amino acid; X2 is Y or E; X3 is Y / K / V / R / D / E; and X4 is R or any other amino acid;preferably, the CDR2 sequence comprises IAWDX1GSX2 (SEQ ID NO: 251) , wherein X1 is S or G; and X2 is T or S;preferably, the CDR1 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123 or SEQ ID NO: 80; the CDR2 sequence comprises IAWDX1GSX2 (SEQ ID NO: 251) , wherein X1 is S or G; X2 is T or S; and the CDR3 comprises AASYNVYYNX1YX2X3PISX4DEYDY (SEQ ID NO: 250) , wherein X1 is N or any other amino acid; X2 is Y or E; X3 is Y / K / V / R / D / E; and X4 is R or any other amino acid;(2) TAA binding domain comprises, according to the Chothia definition:(a) CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 220, 228, and 245, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 202, and 238, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and(c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 199, 205, 214, 227, 235, 239 and 244, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; or(3) TAA binding domain comprises, according to the Kabat definition:(a) CDR1 sequence of any one of SEQ ID NOS: 213, and 236, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ;(b) a CDR2 sequence of any one of SEQ ID NOS: 189, 200, 201, 206, 207, 218, and 243, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) ; and(c) a CDR3 sequence of any one of SEQ ID NOS: 199, 205, 214, 227, 235, 239, and 244, or variant sequences thereof having one or more amino acids substituted, deleted, or added (for example, one, two, or three amino acids substituted, deleted, or added) .preferably, (1) the EGFR binding domain comprises, according to the IMGT definition:(A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 135, respectively;(B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 137, 177 and 135, respectively;(C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 80, 177 and 135, respectively;(D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 165, 177 and 135 respectively;(E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 164 and 135, respectively;(F) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 117 respectively;(G) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 130 respectively;(H) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 85 respectively;(I) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 136, respectively;(J) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177, and 181, respectively;(K) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 177 and 104 respectively; or(L) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 123, 178, and 104, respectively;(2) the EGFR binding domain comprises, according to the Kabat definition:(A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 206, and 239, respectively;(B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 213, 206, and 239, respectively;(C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 213, 207, and 239 respectively;(D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 200, and 239, respectively;(E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 218, and 227 respectively;(F) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 199 respectively;(G) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 235 respectively;(H) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 201, and 214, respectively;(I) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 205, respectively;(J) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 189, and 244 respectively; or(K) CDR1, CDR2, and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 243, and 244, respectively; or(L) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 236, 201, and 199, respectively;(3) the EGFR binding domain comprises, according to the Chothia definition:(A) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 239, respectively;(B) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 220, 202, and 239, respectively;(C) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 228, 202, and 239, respectively;(D) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 238, and 239, respectively;(E) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 227, respectively;(F) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 199, respectively;(G) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 235, respectively;(H) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 214, respectively;(I) CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 205, respectively;CDR1, CDR2 and CDR3 sequences as shown in SEQ ID NO: 245, 202, and 244, respectively.57.The antigen binding molecule of claim 56, wherein the EGFR binding domain further comprises one or more of framework (FR) sequences FR1, FR2, FR3, and FR4, wherein the CDR sequences are determined according to the IMGT definition, and:(1) the FR1 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 79, 103, 110;(2) the FR2 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 73, 87, 102, 112, 118, 127, 132, 160;(3) the FR3 sequence comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 83, 94, 95, 98, 116, 128, 145, 157, 174, 182; and(4) the FR4 sequence comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101.58.The antigen binding molecule of any one of claims 55-57, wherein the EGFR binding domain comprises:(a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71;(b) an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 22 and 53-71; or(c) an amino acid sequence that has one or more additions, deletions and / or substitutions compared to any one of SEQ ID NO: 22 and 53-71, wherein the additions, deletions and / or substitutions do not occur in a CDR region; andpreferably, the EGFR binding domain comprises substitutions and / or additions at one or more of the following positions corresponding to any one of SEQ ID NO: 22: positions 14, 79, 80, 87, 41, 45, 46, 47, 68, 33, 27, 30, 59, 3, 88, 49, 108, 109, 58, 44, 55, 75, 113, 72, 106;preferably, the EGFR binding domain comprises one or more of the following substitutions in SEQ ID NO: 22: A14P, V79L, H80Y, K87R / D, T41P, R45L, E46V, F47Y, F68L, V33G, R27Y, S30G, Y59K / N, Q3T, P88A, A49S, Y108E, Y109K / V, T58S, Y59R, E44G, S55G, and A75S.59.An antigen binding molecule comprising (1) the CD3 binding domain of any one of claims 48-50, and (2) the EGFR binding domain of any one of claims 55-58.60.An antigen binding molecule comprising (1) the CAIX binding domain of any one of claims 51-54, and (2) the EGFR binding domain of any one of claims 55-58;preferably, the multispecific antigen binding molecule further comprises the CD3 binding domain of any one of claims 48-50.61.The antigen binding molecule of any one of claims 48-58, wherein the antigen binding molecule comprises: a domain antibody (dAb) , a single domain antibody (sdAb) , a VHH, a humanized VHH, a single-chain variable fragment (scFv) , a VL domain, a VH domain, a combination of VL and VH domains, or a Fab.62.The antigen binding molecule of any one of 48-61, wherein the antigen binding molecule further comprises a human IgG1 constant region, a human IgG2 constant region, a human IgG3 constant region, or a human IgG4 constant region;preferably, the antigen binding molecule comprises a human IgG1 constant region or a human IgG4 constant region.63.A nucleic acid encoding the antigen binding molecule of any one of claims 1-62.64.A vector that comprises the nucleic acid of claim 63.65.A host cell comprising the nucleic acid of claim 63 or the vector of claim 64.66.A method of making an antigen binding molecule, the method comprising:a) culturing the host cell of claim 65 under conditions suitable for expression of the antigen binding molecule; andb) recovering the expressed antigen binding molecules.67.An antigen-binding molecule that is generated by the method of claim 66.68.A chimeric antigen receptor (CAR) comprising the antigen binding molecule of any one of claims 1-62.69.An antibody-drug conjugate (ADC) comprising the antigen binding molecule of any one of claims 1-62 covalently bound to a therapeutic agent.70.The antibody drug conjugate of claim 69, wherein the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.71.A pharmaceutical composition comprising the antigen binding molecule of any one of claims 1-62, or the CAR of claim 68, or the ADC of claim 69, and a pharmaceutically acceptable carrier.72.A method of treating a subject having a disease, the method comprising administering a pharmaceutically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 71 to the subject.73.The method of claim 72, wherein the disease is cancer;preferably, the cancer is selected from the group consisting of cervical cancer, renal cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, bowel cancer, breast cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical, adenocarcinoma, pancreatic cancer;preferably, the cancer is selected from the group consisting of: colon cancer, pancreas cancer, kidney cancer, cervical, adenocarcinoma.

Images