Recombinant HVT and uses thereof

Abstract

Provided are recombinant herpes viruses of Turkeys comprising at least one recombinant nucleotide sequence encoding an AIV HA protein, wherein the AIV HA protein is selected from an HA protein of a subtype H5N8 or a subtype of H7 avian influenza virus, and wherein the recombinant nucleotide sequence is inserted into an insertion site of the viral genome, located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2.

Description

RECOMBINANT HVT AND USES THEREOFFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present invention relates to recombinant avian herpes viruses encoding different antigens, and the uses thereof. The invention is suited for producing vaccines to immunize avian species against avian pathogen (s) .BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Poultry meat and eggs are important food sources, whose consumption increases continually due to the growth of the human population and their great quality-price ratio. In order to ensure poultry health as well as food safety and security, poultry vaccine technology has become a worldwide concern.

[0003] Viral vectors expressing pathogen proteins are commonly used as poultry vaccines against targeted pathogens. Vaccines including such viral vectors induce expression of foreign pathogen proteins within infected hosts, which may lead to protective immunity.

[0004] Many different classes of viruses have been investigated as candidate vectors for vaccination of avians, such as adenoviruses, AAVs, fowlpox viruses, herpes viruses, and the like.

[0005] Three types of herpes viruses have been determined, MDV1, MDV2 and MDV3 (also known as herpes virus of turkey (HVT) ) . High similarity exists between said viruses (see Kingham et al., Journal of General Virology (2001) 82, 1123-1135) and they all have been used to prepare recombinant viruses in which a foreign gene derived from a pathogen has been integrated, for use as a vaccine in avians, particularly poultry, such as chicken.

[0006] Avian influenza is caused by avian influenza viruses that are classified in the family Orthomyxoviridae, genus Influenzavirus A.

[0007] Influenza virus A (AIV) is classified to subtypes based on serologic reactions of the HA surface protein. Serologic subtyping of HA is done by the hemagglutinin inhibition test. Sixteen subtypes of HA, HA1 to HA16, are recognized for AIV (David E. Swayne, David L. Suarez, and Leslie D. Simes. (2013) . Influenza. In David E. Swayne (Eds. ) . Diseases of Poultry, Thirteenth Edition (pp. 181-218) ) . Any AIV can be easily classified in any such subtype following the above technique and common knowledge.

[0008] There is still a need in the art for further recombinant herpes viruses which can stably express HA surface protein (s) , and are suitable for vaccination of avians, particularly poultry, against AIV.SUMMARY OF THE INVENTION

[0009] The present invention provides recombinant avian herpes viruses, in particular recombinant herpes virus of turkey (HVT) , comprising and stably expressing at least one recombinant nucleotide sequence encoding a HA surface protein of AIV, selected from H5 and H7. The recombinant HVT is able to elicit a serological response and to provide valuable protection against avian influenza. A poultry vaccine comprising the recombinant HVT is also provided.

[0010] It is therefore an object of the present invention to provide a recombinant Herpes Virus of Turkeys (rHVT) which comprises a nucleotide sequence selected from a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H5N8 avian influenza virus, a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H7 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, wherein the nucleotide sequence is under control of a CMV promoter and wherein the nucleotide sequence is inserted into an insertion site of the viral genome, located in a non-coding regions of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2.

[0011] In a particular embodiment, the invention provides a rHVT comprising a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H5N8 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into an insertion site of the viral genome, located in a non-coding regions of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2.

[0012] In another particular embodiment, the invention provides a rHVT comprising a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H7 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into an insertion site of the viral genome, located in a non-coding regions of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2. Advantageously, the Hemagglutinin (HA) protein is of a subtype H7N9 avian influenza virus.

[0013] It is another object of the present invention to provide a multivalent rHVT comprising (i) a first nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H5 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into a first insertion site of the viral genome, located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2 and (ii) a second nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H7 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into a second insertion site of the viral genome, different from the first insertion site, and located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2. Advantageously, the Hemagglutinin (HA) proteins are of subtype H5N8 avian influenza virus and subtype H7N9 avian influenza virus, respectively.

[0014] As illustrated in the application, such recombinant avian herpes virus constructs provide particularly stable and efficient expression of the one or two corresponding HA protein (s) in infected avian cells. In particular, advantageously, the one or two recombinant nucleotide sequences is / are expressed in Chicken Embryo Fibroblast (CEF) cells, even after 5, 10 or more passages, and preferentially even after 15 passages.

[0015] A further object of the invention is a composition comprising a recombinant HVT as defined above and a suitable excipient or diluent.

[0016] Another object of the invention resides in a vaccine which comprises an effective immunizing amount of a recombinant HVT, as defined above.

[0017] A further object of the invention resides in a recombinant HVT, for use for immunizing an avian, such as poultry, against Influenza Virus (AIV) , and / or an associated disease.

[0018] A further object of the invention resides in a recombinant HVT, for use for protecting an avian, such as poultry, against a disease caused by AIV.

[0019] A further object of the invention resides in a vaccine as defined above, for use for vaccinating an avian, such as poultry, against AIV.

[0020] A further object of the invention resides in a method for vaccinating an avian comprising administering to the avian a composition or vaccine or virus as defined above.

[0021] A further object of the invention resides in a method for inducing an immune response to an antigen in an avian comprising administering to the avian a composition or vaccine or virus as defined above.

[0022] The invention also provides a vaccination kit for immunizing an avian which comprises the following components:

[0023] a. an effective amount of a composition or vaccine as defined above, and

[0024] b. means for administering said composition or vaccine to said avian.

[0025] The invention may be used in any avian, for vaccination against AIV, and / or an associated disorder or condition. It is particularly suited to vaccinate poultry, such as chicken.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0026] Figure 1 (a) illustrates the genome structures of examples of recombinant HVT / H5 and HVT / H7 according to the invention (SV40 Poly (A) of SEQ ID NO: 11) .

[0027] Figure 1 (b) shows a diagram of recombinant HVT / AI (FW368) genome, showing the portion amplified in PCR reaction to confirm the genome structure of the virus.

[0028] Figure 1 (c) shows results of PCR analysis for FW368. FW368 was harvested after 5 times passages and sampled for PCR analysis. M : BioMarkerTM 10Kb (BioVentures, Inc., #M10KB) , N.C. : FC 126 (negative control) and P. C. : homology plasmid (positive control) .

[0029] Figure 2 shows the AIV-H5 protein expression or AIV-H7 protein expression evaluated by Black plaque, with first antibody being anti-AIV-H5 rabbit poAb (#11717-RP01. Sino Bio) or anti-AIV-H7 chicken serum (homemade antibody) and second antibody being biotinylated anti-rabbit IgG (Vector Laboratories, Cat#BA-1000) or biotinylated anti-chicken IgY (Vector Laboratories, Cat#BA-9010) .

[0030] Figure 3 (a) illustrates the genome structures of examples of bivalent recombinant HVT / H5-H7s according to the invention. “t” : Synthetic poly (A) signal, of SEQ ID NO: 12.

[0031] Figure 3 (b) shows diagrams of a recombinant HVT / H5-H7 (FW380 and FW381) genome, showing the portion amplified in PCR reaction to confirm the genome structure of the virus.

[0032] Figure 3 (c) shows results of PCR analysis for FW380 and FW381. FW380 and FW381 were harvested after 20 times passages and sampled for PCR analysis. N.C. : negative control and P.C. : positive control.

[0033] Figures 4 (a) and 4 (b) show the AIV-H5 protein expression and AIV-H7 protein expression of FW380 and FW381 constructs evaluated by Immunofluorescence assay, with first antibody being anti-AIV-H5 rabbit poAb (#11717-RP01. Sino Bio) and anti-AIV-H7 chicken serum (homemade antibody) and second antibody being Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG (#A-11008, Thermo Fisher) and Alexa Fluor 546 anti-chicken IgY (#A-11040, Thermo Fisher) .

[0034] Figure 5 (a) and 5 (b) show serological tests to evaluate the antibody titers for AIV-H5 and AIV-H7 in an efficacy test in SPF chickens after a subcutaneous injection at one day of age of a vaccine comprising a recombinant HVT FW368; FW369, FW370; FW380 and FW381. Anti-H5 antibody was detected by indirect ELISA kit (ID Influenza H5 Indirect) . Anti-H7 antibody was detected by competitive ELISA kit (ID Influenza H7 Antibody Competition) .DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0035] The present invention generally relates to recombinant avian herpes viruses stably expressing an Hemagglutinin (HA) protein of subtype H5N8 and / or H7, their manufacture, compositions comprising the same, and the uses thereof.

[0036] Definitions

[0037] The present disclosure will be best understood by reference to the following definitions:

[0038] The term “recombinant” in relation to a sequence, designates a sequence, nucleic acid or unit which does not exist naturally and / or which has been engineered using recombinant DNA technology (also called gene cloning or molecular cloning) .

[0039] The term “recombinant” , in relation to a virus, refers to the genome of a virus which has been modified by insertion of at least one nucleotide sequence (e.g., DNA, such as a gene) which is not found naturally in the genome of said virus, or which is found naturally in said genome but in a different form or at a different position. It will be understood that the recombinant virus can be manufactured by a variety of methods such as recombinant DNA technology as described therein and, once made, can be reproduced without further use of recombinant DNA technology.

[0040] In the present description, the terms “nucleic acid” , “nucleic sequence, ” and “nucleotide sequence” refer to a nucleic acid molecule having a determined sequence, which may be deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides. The nucleotide sequence may be first prepared by e.g., recombinant, enzymatic and / or chemical techniques, and subsequently replicated in a host cell or an in vitro system. A nucleotide sequence preferentially comprises an open reading frame encoding a molecule (e.g. a peptide or protein) . The nucleotide sequence may contain additional sequences such as a promoter, a transcription terminator, a signal peptide, an IRES, etc.

[0041] In the present description, the terms “polypeptide” , “peptide, ” and “protein” refer to any molecule comprising a polymer of at least 10 consecutive amino acids.

[0042] An “immunogenic fragment” or “antigenic fragment” of an antigen, peptide or protein designates any fragment which can elicit an immune response, preferably any fragment which contains an epitope, preferably an antigen-specific epitope. Immunogenic fragments generally contain from 5 to 50 consecutive amino acid residues of an antigen, such as from 5 to 40, or from 10 to 40, or 10-30, 10-25, or 10-20.

[0043] The term “avian” or “avian species” is intended to encompass all kinds of avian such as birds of the class of Aves, i.e., vertebrate animals which are feathered, winged, bipedal, endothermic and egg-laying. In the context of the invention, avian or avian species refer more particularly to birds with economical and / or agronomical interests, such as poultry, (such as chickens and turkeys) , waterfowl poultry (such as ducks and geese) and ornamental birds (such as swans and psittacines) .

[0044] The term "vaccine" or "vaccine composition" as used herein designates an agent which may be used to cause, stimulate or amplify an immune response in an organism.

[0045] The term “non-coding region” is well known in the art and refers to any region of a viral genome which does not encode a protein. The non-coding region between UL45 (HVT053) and UL46 (HVT054) designates typically a region starting immediately 3' of the STOP codon of UL45 and ending immediately 5' of the STOP codon of UL46 (since both ORFs are in opposite orientation) . The non-coding region between UL44 (HVT052) and UL45 (HVT053) designates typically a region starting immediately 3' of the STOP codon of UL44 and ending immediately 5' of the STOP codon of UL45. The non-coding region between SORF3 (HVT087) and US2 (HVT088) designates typically a region starting immediately 3' of the START codon of SORF3 and ending immediately 5' of the STOP codon of US2.

[0046] As used herein, the term “variant” refers to a modified form of a reference antigen or fragment, which retains an immunogenic property thereof. Generally, variants are overall similar and, in many regions, identical to the reference antigen or fragment. For instance, a variant may exhibit at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, or at least about 99 %sequence identity compared to the reference antigen or fragment. Variants particularly designate antigens with 1, 2, 3, 4 or 5 modified amino acid residues as compared to the reference sequence. Modifications include amino acid deletion (s) , substitution (s) , and / or addition (s) . Variants shall retain an immunogenic property of the reference sequence, such as an ability to induce an immune response against the reference sequence or pathogen.

[0047] Recombinant HVT

[0048] The invention relates to recombinant HVT containing at least one foreign gene, encoding HA protein, in particular locations.

[0049] Indeed, the inventors have shown that HA protein of subtype H5N8 avian influenza virus and / or of subtype H7 avian influenza virus may be efficiently and stably expressed in recombinant HVT, when insertion sites selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2 are used, in combination with a CMV promoter.

[0050] The CMV promoter, or cytomegalovirus promoter, is a widely used promoter sequence derived from human cytomegalovirus or murine cytomegalovirus. In particular, the inventors have shown that the use of a CMV promoter, either murine CMV or human CMV, in combination with the HA gene leads to high and uniform serology titers in chickens. Examples of nucleotide sequences of the CMV promoter are described in the literature (M. Boshart et al., 1985, Cell 41: 521-530, GenBank Accession#K03104; WO2008 / 121329; Kai A. Kropp et al., 2009, Journal of General Virology, 90, 2395-2401) . However, as long as a promoter is functional in cells or in the bodies of avian species, the nucleotide sequence of a promoter does not have to be identical to the sequence in the literature.

[0051] In a particular embodiment, the CMV promoter used in the construct of the invention is a murine CMVie1 promoter, i.e., the promoter region associated with the immediate-early 1 (IE1) gene of the murine cytomegalovirus. For instance, the CMVie1 promoter comprises or consists of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7.

[0052] Alternatively or in addition, the CMV promoter used in the construct of the invention is a human CMV promoter. For instance, the human CMV promoter comprises or consists of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 8.

[0053] The promoter used may be either a synthetic or natural, endogenous or heterologous promoter.

[0054] Recombinant HVTs of the invention may be prepared from any HVT, preferably non-pathogenic HVT. An example of a non-pathogenic strain of HVT (MDV3) suitable for use in the invention is the FC126 strain. The genomic sequence of the FC126 strain is available in the art (Afonso et al., supra; Kingham et al. supra) . Another suitable HVT strain is the PB 1 strain, for instance. Any other non-pathogenic strain is suitable as well.

[0055] The location of the targeted non-coding regions in the viral genome can be easily identified by the skilled person using the teachings of the present application, common knowledge and sequence information available in the literature. For instance, Kingham et al. supra, reports the nucleotide sequence of the FC126 reference strain, as well as the location of most ORFs within said genome.

[0056] By reference to a FC 126 complete genome (GenBank: AF291866.1) , a non-coding region between UL45 and UL46 corresponds to nucleotides 95323-95443 of the HVT genome, a non-coding region between UL44 and UL45 corresponds to nucleotides 94243-94683 of the HVT genome, and a non-coding region between SORF3 and US2 corresponds to nucleotides 139867-140064 of the HVT genome. Cloning at any position within said regions is suitable for the present invention.

[0057] Monovalent rHVT

[0058] The invention relates to recombinant HVTs (rHVTs) comprising a nucleotide sequence selected from a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H5N8 avian influenza virus, a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H7 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, wherein the nucleotide sequence is under control of a CMV promoter and wherein the nucleotide sequence is inserted into an insertion site of the viral genome, located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2.

[0059] According to the invention, the rHVT may comprise a nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H5N8 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into an insertion site of the viral genome, located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2.

[0060] In a particular embodiment, the rHVT of the invention comprises a nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H5N8 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, under control of a human CMV, said nucleotide sequence being inserted into the non-coding regions between UL45 and UL46 (FW368) .

[0061] In another particular embodiment, the rHVT of the invention comprises a nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H5N8 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, under control of a murine CMV immediate early promoter, said nucleotide sequence being inserted into the non-coding regions between UL45 and UL46 (FW369) .

[0062] Alternatively, the rHVT of the invention may comprise a nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H7 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into an insertion site of the viral genome, located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2.

[0063] Preferably, the HA protein is of a subtype H7N9 avian influenza virus.

[0064] In a particular embodiment, the rHVT of the invention comprises a nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H7N9 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, under control of a human CMV, said nucleotide sequence being inserted into the non-coding regions between UL45 and UL46 (FW370) .

[0065] As shown in the examples, such constructs are genetically stable over at least 10, preferably at least 15, more preferably at least 20 passages in CEF cells. They can confer strong and long-lasting expression of the genes in vivo, sufficient to procure high protective immunity.

[0066] More particularly, the inventors have demonstrated that the claimed rHVTs correctly express AIV HA-H5N8 and AIV HA-H7 antigens. Advantageously, the claimed rHVTs efficiently induce antibodies against AIV HA-H5N8 and AIV HA-H7.

[0067] The claimed rHVTs thus may confer very efficient clinical protection against challenge with AIV. The invention thus provides novel effective constructs that can be used to protect avians against highly relevant AIV and associated disorders.

[0068] Multivalent rHVT

[0069] A further object of the present invention relates to a multivalent rHVT comprising (i) a first nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H5 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into a first insertion site of the viral genome, located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2 and (ii) a second nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H7 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into a second insertion site of the viral genome, different from the first insertion site, and located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2.

[0070] Such constructs can provide stable co-expression of antigens over at least 10, preferably at least 15, more preferably at least 20 passages in CEF cells.

[0071] According to the invention, the nucleotide sequences are under control of a CMV promoters. Preferably, each nucleotide sequence is under the control of a different promoter. For instance, the first nucleotide sequence is under control of murine CMV protein, and the second nucleotide sequence is under control of a human CMV, or the reverse.

[0072] In a preferred embodiment, one of the HA protein, either of subtype H5 or H7, is inserted in a non-coding region between UL45 and UL46, and the second HA protein is inserted in a non-coding regions of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, and the non-coding region between SORF3 and US2.

[0073] According to the invention, both HA proteins of subtype H5 and subtype H7 are under the control of CMV promoters. CMV promoters may be selected from human CMV and murine CMV. Preferably, each HA protein is under the control of a different CMV promoter. For instance HA protein of subtype H5 is under control of a murine CMV and HA protein of subtype H7 is under control of a human CMV, or the reverse.

[0074] In a particular embodiment, the rHVT comprises (i) inserted into the non-coding region between UL44 and UL45, a first nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H5 avian influenza virus, in particular of subtype H5N8, under control of a murine CMV promoter and (ii) is inserted into the non-coding region between UL45 and UL46, a second nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H7 avian influenza virus, in particular of subtype H7N9, under control of a human CMV promoter (FW380) .

[0075] Alternatively, the rHVT comprises (i) inserted into the non-coding region between UL44 and UL45, a first nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H5 avian influenza virus, in particular of subtype H5N8, under control of a human CMV promoter and (ii) is inserted into the non-coding region between UL45 and UL46, a second nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H7 avian influenza virus, in particular of subtype H7N9, under control of a murine CMV promoter.

[0076] In another particular embodiment, the rHVT comprises (i) inserted into the non-coding region between SORF3 and US2, a first nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H5 avian influenza virus, in particular of subtype H5N8, under control of a murine CMV promoter and (ii) inserted into the non-coding region between UL45 and UL46, a second nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H7 avian influenza virus, in particular of subtype H7N9, under control of a human CMV promoter (FW381) .

[0077] Alternatively, the rHVT comprises (i) inserted into the non-coding region between SORF3 and US2, a first nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H5 avian influenza virus, in particular of subtype H5N8, under control of a human CMV promoter and (ii) inserted into the non-coding region between UL45 and UL46, a second nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H7 avian influenza virus, in particular of subtype H7N9, under control of a murine CMV promoter.

[0078] In another particular embodiment, the rHVT comprises (i) inserted into the non-coding region between UL45 and UL46, a first nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H5 avian influenza virus, in particular of subtype H5N8, under control of a human CMV promoter and (ii) inserted into the non-coding region between UL44 and UL45, a second nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H7 avian influenza virus, in particular of subtype H7N9, under control of a murine CMV promoter (FW382) .

[0079] Alternatively, the rHVT comprises (i) inserted into the non-coding region between UL45 and UL46, a first nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H5 avian influenza virus, in particular of subtype H5N8, under control of a murine CMV promoter and (ii) inserted into the non-coding region between UL44 and UL45, a second nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H7 avian influenza virus, in particular of subtype H7N9, under control of a human CMV promoter.

[0080] In another particular embodiment, the rHVT comprises (i) into the non-coding region between UL45 and UL46, a first nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H5 avian influenza virus, in particular of subtype H5N8, under control of a human CMV promoter and (ii) inserted into the non-coding region between SORF3 and US2, a second nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H7 avian influenza virus, in particular of subtype H7N9, under control of a murine CMV promoter (FW383) .

[0081] Alternatively, the rHVT comprises (i) into the non-coding region between UL45 and UL46, a first nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H5 avian influenza virus, in particular of subtype H5N8, under control of a murine CMV promoter and (ii) inserted into the non-coding region between SORF3 and US2, a second nucleotide sequence encoding an HA protein of a subtype H7 avian influenza virus, in particular of subtype H7N9, under control of a human CMV promoter.

[0082] AIV HA protein

[0083] As indicated, the claimed rHVTs contain a recombinant nucleotide sequence which encodes a HA of a subtype H5 avian influenza virus, a HA of a subtype H7 avian influenza virus or an immunogenic fragment or variant thereof which can induce an anti-AIV immune response.

[0084] Influenza virus A is classified to subtypes based on serologic reactions of the HA surface protein. Serologic subtyping of HA is done by the hemagglutinin inhibition test. Sixteen subtypes of HA, HA1 to HA16, are recognized for AIV (David E. Swayne, David L. Suarez, and Leslie D. Simes. (2013) . Influenza. In David E. Swayne (Eds. ) . Diseases of Poultry, Thirteenth Edition (pp. 181-218) ) . Any AIV can be easily classified in any such subtype following the above technique and common knowledge.

[0085] The HA protein may be any native HA protein of a subtype H5 and / or H7 AIV.

[0086] Subtype H5 includes a specific subclass designated H5N8. Example of subtype H5 AIV strains include A / Whooper Swan / Shanxi / 4-1 / 2020 (H5N8) . Preferably, the HA protein is from a H5N8 subtype AIV, more preferably A / Whooper Swan / Shanxi / 4-1 / 2020 (H5N8) (2.3.4.4b) . In a particular embodiment, the HA of subtype H5N8 comprises or consists of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.

[0087] According to a particular embodiment, the recombinant HVT of the invention comprises a nucleic acid sequence that codes for a HA protein of subtype H5N8 comprising or consisting essentially, or consisting of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. For instance, the recombinant HVT of the invention comprises a nucleic acid sequence comprising or consisting of SEQ ID NO: 1.

[0088] Subtype H7 includes a specific subclass designated H7N9. Example of subtype H7N9 AIV strains. For instance, the HA protein of H7N9 subtype AIV is A / Chicken / Yunnan / SD024 / 2021 (H7N9) , A / Pigeon / ShanghaiS 1069 / 213 (H7N9) , A / Chicken / Guangxi / SD098 / 2017 (H7N9) , or A / Chicken / Inner Mongolia / SD010 / 2019 (H7N9) . Preferably, the HA protein of subtype H7 is from a H7N9 subtype AIV, more preferably A / Chicken / Yunnan / SD024 / 2021 (H7N9) . In a particular embodiment, the HA of subtype H7N9 comprises or consists of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.

[0089] According to a particular embodiment, the recombinant HVT of the invention comprises a nucleic acid sequence that codes for a HA protein of subtype H7N9 comprising or consisting essentially, or consisting of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6. For instance, the recombinant HVT of the invention comprises a nucleic acid sequence comprising or consisting of SEQ ID NO: 2.

[0090] Method of Construction

[0091] The recombinant HVT of the invention may be prepared using techniques known per se in the art, such as recombinant technology, homologous recombination, site-specific insertion, mutagenesis, and the like.

[0092] Gene cloning and plasmid construction are well known to one person of ordinary skill in the art and may be essentially performed by standard molecular biology techniques (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, N.Y. 2012) .

[0093] Herpes viruses may be propagated in any suitable host cell and media. The host and the conditions for propagating herpes viruses include, for instance, cells derived from chicken such as CEF (chick embryo fibroblast) , chicken kidney cells, and the like. Such cells may be cultured in a culture medium such as Eagle's MEM, Leibowitz-L-15 / McCoy 5A (1: 1 mixture) culture medium at about 37℃ for 3 to 4 days.

[0094] Genomic DNA may be extracted from virus-infected cells according to any conventional method. In particular, after proteins are denatured in a lysis buffer and removed, DNA may be extracted with phenol and ethanol.

[0095] Typically, recombinant viruses may be prepared by homologous recombination between a viral genome and a construct (e.g., a plasmid) comprising the recombinant nucleotide sequence or nucleic acid to be inserted, flanked by nucleotides from the insertion site allowing recombination. Briefly, a sequence containing a targeted region is first cloned into a plasmid, or other suitable vector. Examples of plasmids comprise pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC18, pUC19, pUC7, pUC8, and pUC9, examples of phages comprise lambda phage and M13 phage, and example of cosmids comprises pHC79. The cloned region should preferably be of sufficient length so that, upon insertion of the foreign gene, the sequences which flank the foreign gene are of appropriate length so as to allow in vitro homologous recombination with the viral genome. Preferably, each flanking sequence shall have at least approximately 50 nucleotides in length.

[0096] In order to insert one or more recombinant nucleotide sequence (s) into the targeted region, mutation may be carried out at a specific site of the region to create a cleavage site for a restriction enzyme. A method of carrying out mutation may be a conventional method, and a method commonly used by a person skilled in the art such as in vitro mutagenesis and PCR can be used. Thus, in the PCR method, a mutation such as the deletion, replacement, or addition of 1 to 2 nucleotides in the PCR primer is carried out, and the primer is then used to create a mutation. Alternatively, naturally existing restriction sites may be used. The foreign gene (and promoter) is then inserted into the insertion site of the viral genome in the plasmid.

[0097] The resulting plasmid may be introduced into an HVT-infected cell or HVT genome-transfected cells using any suitable technique (e.g., electroporation, calcium phosphate, a lipofectin-based method or the like) . When the amount of the plasmid to be introduced is in the range of 0.1 to 1000 μg, the efficiency of generation of recombinant viruses by recombination between the homologous regions of HVT genome and the plasmid becomes high in cells. This results in a recombination event between the plasmid and the viral genome, leading to insertion of the recombinant nucleotide sequence into the virus.

[0098] The resulting recombinant virus may be selected genotypically or phenotypically using known techniques of selection, e.g., by hybridization, detecting enzyme activity encoded by a gene co-integrated along with the recombinant nucleic acid sequences or detecting the antigenic peptide expressed by the recombinant herpes virus immunologically. The selected recombinant herpes virus can be cultured on a large scale in cell culture. Once created, the virus may be propagated in suitable cells.

[0099] Preferred Embodiments

[0100] The following recombinant HVT are preferred specific embodiments of the invention. As shown in the examples, they allow strong immune response in vivo against antigens encoded by each recombinant nucleotide sequence.

[0101] Particularly preferred recombinant HVT (rHVT) of the invention comprises a nucleotide sequence selected from a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H5N8 avian influenza virus, such as the HA protein of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, or an immunogenic fragment or variant thereof, a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H7 avian influenza virus, such as the HA protein of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, or an immunogenic fragment or variant thereof, wherein the nucleotide sequence is under control of a CMV promoter and wherein the nucleotide sequence is inserted into an insertion site of the viral genome, located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2.

[0102] Preferably, such a recombinant rHVT is selected from the following monovalent constructs, as described in the experimental data:

[0103] .HVT / 45-46 hCMV H5N8 (FW368) ,

[0104] .HVT / 45-46 mCMViel H5N8 (FW369) ,

[0105] .HVT / 45-46 hCMV H7N9 (FW370) ,

[0106] .HVT / 45-46 mCMViel H7N9 (FW371)

[0107] In a preferred embodiment, the monovalent rHVT according to the invention encodes a HA antigen comprising, or consisting essentially of, or consisting of a sequence selected from SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6.

[0108] Additional preferred recombinant HVT (rHVT) of the invention comprises (i) a first nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H5 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into a first insertion site of the viral genome, located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2, wherein the first nucleotide sequence is under control of a CMV promoter and (ii) a second nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H7 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into a second insertion site of the viral genome, different from the first insertion site, and located in a non-coding regions of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2, wherein the second nucleotide sequence is under control of a CMV promoter.

[0109] Preferably, such a recombinant rHVT is selected from the following bivalent constructs, as described in the experimental data:

[0110] .HVT / 45-46 hCMV H7N9 / 44-45 mCMVie 1 H5N8 (FW380) ,

[0111] .HVT / 45-46 hCMV H7N9 / SORF3-US2 mCMVie1 H5N8 (FW381) ,

[0112] .HVT / 45-46 hCMV H5N8 / 44-45 mCMVie 1 H7N9 (FW382) ,

[0113] .HVT / 45-46 hCMV H5N8 / SORF3-US2 mCMVie1 H7N9 (FW383) .

[0114] In a preferred embodiment, the bivalent rHVT according to the invention encodes both antigens HA of H5 subtype and HA of H7 subtype, comprising, or consisting essentially of, or consisting respectively of sequences SEQ ID NO 3 or SEQ ID NO: 4, and, of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.

[0115] Particularly preferred rHVTs of the invention are prepared using the FC 126 or PB 1 strains.

[0116] The recombinant HVT of the present invention may be propagated in cell cultures. In preferred embodiments, CEF, embryonated eggs, chicken kidney cells, and the like are used as the host cells for the propagation of recombinant HVT. Multivalent recombinant HVT of the present invention may be cultured in a culture medium such as Eagle′sMEM, Leibowitz-L-15 / McCoy 5A (1: 1 mixture) culture medium at about 37℃ for 3 to 4 days. The infected cells thus obtained are suspended in a culture medium containing 10%dimethyl sulfoxide (DMSO) and stored frozen under liquid nitrogen.

[0117] Advantageously, the recombinant HVT of the invention presents a high level of stability. They are genetically stable, which means they maintain the inserted gene (s) even after 10 or more passages, preferably after 15 passages, more preferably after 20 passages in cells of avian species, preferably CEF cells. They also provide stable expression of antigens, which means they (co) express the antigens in cells of avian species, preferably CEF cells, even after 10 or more passages, preferably after 15 passages, even more preferably after 20 passages. In the context of the invention a “passage” or “cell passaging” means a culture of cells in suitable conditions for allowing their growth and keeping them alive until they are 90%to 100%confluent. The passaging step consists on transferring a small number of cells of the previous confluent culture into a new culture medium. An aliquot of the previous confluent culture, containing a few cells, may be diluted in a large volume of fresh medium.

[0118] The viruses may be collected or purified using conventional techniques. They may be stored in any suitable medium, frozen and / or lyophilized.

[0119] Vaccine compositions

[0120] The invention also relates to compositions, such as vaccines, which comprise at least one recombinant HVT of the invention.

[0121] In a particular embodiment, the vaccine composition comprises multivalent recombinant HVT of the invention.

[0122] In a further particular embodiment, the vaccine composition comprises at least one recombinant monovalent HVT of the invention, preferably two recombinants monovalent HVTs of the invention.

[0123] In another particular embodiment, the vaccine composition comprises two recombinants monovalent HVTs of the invention, preferably a recombinant HVT / H5N8 of the invention and a recombinant HVT / H7 of the invention.

[0124] Vaccines of the invention typically comprise an immunologically effective amount of a recombinant HVT as described above, in a pharmaceutically acceptable vehicle.

[0125] The compositions and vaccines according to the present invention typically comprise a suitable solvent or diluent or excipient, such as for example an aqueous buffer or a phosphate buffer. The compositions may also comprise additives, such as proteins or peptides derived from animals (e.g., hormones, cytokines, co-stimulatory factors) , nucleic acids derived from viruses and other sources (e.g., double stranded RNA, CpG) , and the like which are administered with the vaccine in an amount sufficient to enhance the immune response. In addition, any number of combinations of the aforementioned substances may provide an immunopotentiation effect, and therefore, can form an immunopotentiator of the present invention.

[0126] The vaccines of the present invention may further be formulated with one or more further additives to maintain isotonicity, physiological pH and stability, for example, a buffer such as physiological saline (0.85%) , phosphate-buffered saline (PBS) , citrate buffers, Tris (hydroxymethyl aminomethane (TRIS) , Tris-buffered saline and the like, or an antibiotic, for example, neomycin or streptomycin, etc.

[0127] The route of administration can be any route including oral (e.g., by water feeding or by gel-drop) , ocular (e.g., by eyedrop) , oculo-nasal administration using aerosol, intranasal, , or by spray, in ovo, topically, or by injection (e.g., intravenous, subcutaneous, intramuscular, intra-orbital, intraocular, intradermal, and / or intraperitoneal) vaccination. The skilled person will easily adapt the formulation of the vaccine composition for each type of route of administration.

[0128] Each vaccine dose may contain a suitable dose sufficient to elicit a protective immune response in avian species. Optimization of such dose is well known in the art. The amount of antigen per dose may be determined by known methods using antigen / anti-body reactions, for example by the ELISA method.

[0129] The vaccines of the invention can be administered as single doses or in repeated doses, depending on the vaccination protocol.

[0130] The vaccines of the present invention are further advantageous in that they confer to bird species up to 100%protection against the targeted avian pathogens after 3 weeks of vaccination.

[0131] The present invention further relates to the use of the vaccine as described above for immunizing avian species, such as poultry, against a pathogen.

[0132] The present invention further relates to a method of immunizing avian species by administering an immunologically effective amount of the vaccine according to the invention. The vaccine may be advantageously administered intradermally, subcutaneously, intramuscularly, orally, in ovo, by spray, by gel-drop or via oculo-nasal administration, preferably in ovo or subcutaneously.

[0133] The present invention further relates to vaccination kits for immunizing avian species which comprises an effective amount of the multivalent vaccine as described above and a means for administering said components to said species. For example, such kit comprises an injection device filled with the multivalent vaccine according to the invention and instructions for intradermic, subcutaneous, intramuscular, or in ovo injection. Alternatively, the kit comprises a spray / aerosol or eye drop device filled with the multivalent vaccine according to the invention and instructions for oculo-nasal administration, oral or mucosal administration.

[0134] Further aspects and advantages of the present application will now be disclosed in the following examples, which are illustrative of the invention.

[0135] EXAMPLES

[0136] In the following examples, recombinant HVT (rHVT) have been prepared and used. They are designated according to the following nomenclature:

[0137] -HVT / insertion site, promoter, inserted antigen (monovalent construct) ;

[0138] -HVT / first insertion site, first promoter, first inserted antigen / second insertion site, second promoter, second inserted antigen (bivalent construct) .

[0139] List ofrHVT prepared and used in the examples:

[0140] FW368: HVT / 45-46 hCMV H5N8 (monovalent) ,

[0141] FW369: HVT / 45-46 mCMV H5N8 (monovalent) ,

[0142] FW370: HVT / 45-46 hCMV H7N9 (monovalent) ,

[0143] HVT / 45-46 hCMV H7N9 / 44-45 mCMV H5N8 (bivalent) ,

[0144] HVT / 45-46 hCMV H7N9 / SORF3-US2 mCMV H5N8 (bivalent) ,

[0145] HVT / 45-46 hCMV H5N8 / 44-45 mCMV H7N9 (bivalent) ,

[0146] HVT / 45-46 hCMV H5N8 / SORF3-US2 mCMV H7N9 (bivalent) .

[0147] Example 1: Construction of homology vectors

[0148] The plasmid construction was essentially performed by the standard molecular biology techniques (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2012) .

[0149] Construction of p45 / 46_hCMV_H5

[0150] The nucleotide sequence of AIV-H5 (SEQ ID NO: 1) was synthesized and digested with XbaI and SalI. That fragment was cloned into XbaI and SalI-digested p45CMVH5wis68 (us 10655146) , resulting in p45 / 46_hCMV_H5.

[0151] Construction of p45 / 46_mCMVie1-H5

[0152] The nucleotide sequence of AIV-H5 (SEQ ID NO: 1) was synthesized and digested with XbaI and SalI. That fragment was clones into XbaI and SalI-digested p45 / 46Mcmv ie 1 H9-CN (EP4228683) , resulting in p45 / 46_mCMVie1_H5.

[0153] Construction of p45 / 46_hCMV_H7

[0154] The nucleotide sequence of AIV-H7 (SEQ ID NO: 2) was synthesized and digested with XbaI and SalI. That fragment was cloned into XbaI and SalI-digested p45CMVH5wis68 (us 10655146) , resulting in p45 / 46_hCMV_H7.

[0155] Construction of p44 / 45d46_mCMVie1_H5

[0156] The nucleotide sequence of AIV-H5 (SEQ ID NO: 1) was synthesized and digested with XbaI and SalI. That fragment was cloned into XbaI and SalI-digested p44 / 45d46_Mcmviel-VP2 (WO 13144355) , resulting in p44 / 45d46_mCMVie1_H5

[0157] Construction of pHVT87-88_mCMVie1_H5

[0158] The nucleotide sequence of AIV-H5 (SEQ ID NO: 1) was synthesized and digested with XbaI and SalI. That fragment was cloned into XbaI and SalI-digested pHVT87-88_Mcmvie 1 -VP2 (WO 13144355) , resulting in pHVT87-88_mCMVie1_H5

[0159] Construction of p44 / 45d46_mCMVie1_H7

[0160] The nucleotide sequence of AIV-H7 (SEQ ID NO: 2) was synthesized and digested with XbaI and SalI. That fragment was cloned into XbaI and SalI-digested p44 / 45d46_Mcmvie1-VP2 (WO 13144355) , resulting in p44 / 45d46_mCMVie1_H7

[0161] Construction of pHVT87-88_mCMVie1_H7

[0162] The nucleotide sequence of AIV-H7 (SEQ ID NO: 2) was synthesized and digested with XbaI and SalI. That fragment was cloned into XbaI and SalI-digested pHVT87-88_Mcmvie1-VP2 (WO13144355) , resulting in pHVT87-88_mCMVie1_H7

[0163] Example 2: Construction of recombinant HVT

[0164] Construction of recombinant HVTs was conducted by homologous recombination in cultured cells. For homologous recombination in cultured cells, viral DNAs of wild type HVT FC-126 strain (PASS+18) and viral DNA of FW370 were prepared as described by Morgan et al. (Avian Diseases, 34: 345-351, 1990) . Approximately 2 μg of the parents viral DNA and 1 μg of one of the homology vector were transfected into approximately 107 CEF cells by electroporation using Nucleofector II (Lonza, Basel, Switzerland) . The transfected cells were added to Leibovitz’s L-15 (Life Technologies Corp., Cat. #41300-39) , McCoy’s 5A Medium (Life Technologies Corp., Cat. #21500-061) (1: 1) and 4%calf serum [LM (+) medium] , planted in 96-well tissue culture plates, and then incubated at 37℃ in 4-5%CO2 for 5-7 days until recombinant HVT plaques became visible. The cells were then detached from the plates by trypsinization, transferred equally to two 96-well plates with CEF, and incubated for 4 to 6 days until plaques were observed. Screening was conducted by the black plaque assay, staining only plaques expressing AIV H5 protein or AIV H7 protein. Briefly, one of the two plates was fixed with methanol: acetone mixture (1: 2) and incubated with anti-AIV-H5 rabbit polyclonal antibody (#11717-RP01. Sino Bio) or anti-AIV-H7 chicken serum (homemade antibody, unpublished) . Next, incubated with biotinylated anti-rabbit IgG antibody (Vector Laboratories, Cat#BA-1000) or biotinylated anti-chicken IgY antibody (Vector Laboratories, Cat#BA-9010) and then with VECTASTAIN ABC-AP kit (Vector Laboratories, Cat#AK-5000) , plaques expressing AIV-H5 protein or AIV-H7 protein were stained by addition of NBT / BCIP solution (Roche Applied Science, Cat#1681451) . Wells containing stained recombinant plaques were identified and cells from the corresponding wells on the other 96-well plate were trypsinized. The cells were then diluted in fresh secondary CEF cells and transferred to 96-well plates to complete the first round of purification. The purification procedure was repeated until all plaques were stained positively in the black plaque assay.

[0165] A list of the constructed recombinant HVTs, their parent viruses and the homology vectors used is provided in Table I below. Diagrams showing genomic structures of the recombinant HVT / AIs are provided in Figure 1 (a) .

[0166] Table I: constructed recombinant HVT, parent viruses, and homology vectors

[0167] Example 3: Verification of genome structure of recombinant HVT / AIs With FW368 as a model case, characterization method of recombinant HVT / AI is described below. Briefly, genome structures of the recombinant HVT / AIs were verified by PCR reaction amplifying flanking region of the inserted genes. Figure 1 (b) shows where is the amplified region in FW368. The primer pairs used in the PCR reaction are SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. Figure l (c) demonstrates that all clones of FW368 have the correct genome structure and those clones are free from the parent virus.

[0168] Example 4: Comparison of HA protein expression from recombinant monovalent HVT / AIs

[0169] Expression of HA antigen by the recombinant monovalent HVT / AI of the invention was confirmed by the Black plaque assay and Western blot assay. The Black plaque and western blot were conducted using CEF cells infected with the recombinant viruses and anti-AIV-H5 rabbit polyclonal antibody (#11717-RP01. Sino Bio) or anti-AIV-H7 chicken serum (homemade antibody, unpublished) .

[0170] For Black plaque, CEF cells in 12-well plates were infected with one of the recombinant viruses at a multiplicity of infection of approximately 0.1. Three days post inoculation, cells were fixed by methanol: acetone mixture (1: 2) . After 3 times washing by PBS, the samples were incubated with anti-AIV-H5 rabbit polyclonal antibody or anti-AIV-H7 chicken serum. After anti-AIV-H5 rabbit polyclonal antibody or anti-AIV-H7 chicken serum was washed off, the samples were incubated with biotinylated anti-rabbit IgG antibody (Vector Laboratories,  Cat#BA-1000)  or biotinylated anti-chicken IgY  antibody (Vector Laboratories, Cat#BA-9010) , and then with VECTASTAIN ABC-AP kit (Vector Laboratories, Cat#AK-5000) . Finally, HA protein expression was visualized by NBT / BCIP solution (Roche Applied Science, Cat#1681451) . The result was observed by using a microscope (Figure 2) .

[0171] For Western blot, CEF cells in 12-well plates were infected with one of the recombinant viruses at a multiplicity of infection of approximately 0.1. Three days post inoculation, cells were harvested with trypsin and centrifuged at 913 x g for 5 minutes. The pellet was washed with PBS and resuspended with 100 μl of PBS. After adding the same volume of 2 x SDS sample buffer (130 mM Tris-C1 (pH6.8) , 6%SDS, 20%Glycerol, 10%2-Mercaptoethanol and 0.01%Bromo Phenol Blue) , cell suspension was boiled for 5 minutes. The samples were separated by SDS-PAGE using 10%polyacrylamide gel and transferred to a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore) . The membrane was dried completely and then incubated with anti-AIV-H5 rabbit polyclonal antibody or anti-AIV-H7 chicken serum. After anti-AIV-H5 rabbit polyclonal antibody or anti-AIV-H7 chicken serum was washed off, biotinylated anti-rabbit IgG antibody or biotinylated anti-chicken IgY antibody. Protein bound with the anti-AIV-H5 rabbit polyclonal antibody or anti-AIV-H7 chicken serum was visualized by addition of NBT / BCIP solution (Roche Applied Science, Cat#1681451) .

[0172] Example 5: Genetic stability of recombinant HVT

[0173] The rHVT constructs prepared in example 2 were passed in CEF 20 times and tested for genetic stability. All of the rHVT after 20 x passages were tested by PCR as described in Example 3 for genome structure and by IFA and the western blot for expression of the antigen proteins as described in Example 4. It was shown that all of the rHVT constructs maintained the inserted genes by PCR and expressed the antigens proteins by IFA and the western blot, demonstrating that these rHVT are genetically stable and provide stable expression of antigens.

[0174] Example 6: Verification of genome structure of recombinant bivalent HVT / H5-H7

[0175] Characterization method of recombinant HVT / AI is described below. Briefly, genome structures of the recombinant HVT / H5-H7s were verified by PCR reaction amplifying flanking region of the inserted genes. Figure 3 (b) shows the location of the amplified region in FW380 and FW381. The primer pairs used in the PCR reaction are SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16. Figure 3 (c) demonstrates that all clones of FW380 and FW381 have the correct genome structure and those clones are free from the parent virus.

[0176] Example 7: Comparison of HA protein expression from recombinant bivalent HVT / H5-H7

[0177] Expression of HA antigen by the recombinant bivalent HVT / H5-H7 of the invention was confirmed by the immunofluorescence assay. This assay was conducted using CEF cells infected with the recombinant viruses and anti-AIV-H5 rabbit polyclonal antibody (#11717-RP01. Sino Bio) or anti-AIV-H7 chicken serum (homemade antibody, unpublished) , or anti-AIV-H7 rabbit polyclonal antibody (#40104-RP01 and #40103-RP01, Sino Bio) .

[0178] For immunofluorescence assay, CEF cells in 12-well plates were infected with one of the recombinant viruses at a multiplicity of infection of approximately 0.1. Three days post inoculation, cells were fixed by methanol: acetone mixture (1: 2) . After 3 times washing by PBS, the samples were incubated with anti-AIV-H5 rabbit polyclonal antibody or anti-AIV-H7 chicken serum. After anti-AIV-H5 rabbit polyclonal antibody or anti-AIV-H7 chicken serum was washed off, the samples were incubated with Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG (#A-11008, Thermo Fisher) or Alexa Fluor 546 anti-chicken IgY antibody (#A-11040, Thermo Fisher) . Finally, the results were observed by using a fluorescence microscope Figures 4 (a) and 4 (b) .

[0179] Example 8: Efficacy of recombinant HVT / AIs in SPF chickens

[0180] The efficacy of recombinant HVT / AIs of the invention, prepared following the method described in example 2, was further investigated in SPF chickens.

[0181] The rHVT vaccines were formulated with PBS. Chickens at one day of age were divided into six groups and chicks from Groups 1 and 5 were vaccinated subcutaneously with approximately 3000 plaque forming units (pfu)  / 0.2 ml of one of the recombinant HVT / AIs of the invention. Chicks in Group 6 (non-immunized control -NI) were left unvaccinated. The chickens were bled each week between 2 and 5 weeks of age and tested for presence of anti-H5 antibodies with a commercial indirect ELISA kit (ID Influenza H5 Indirect) or anti-H7 antibodies with a commercial competitive ELISA kit (ID Influenza H7 Antibody Competition) .

[0182] Table II. Evaluated recombinant HVT / AI by serological testing used SPF chickens.

[0183] Beyond demonstrating that monovalent HVTs of the invention induce an immune response in SPF chickens, the constructs FW368, FW369 and FW370 are also used as positive control or standard in the animal experiment.

[0184] The results of ELISA tests are shown in Figures 5 (a) and 5 (b) .

[0185] Figure 5 (a) shows serological tests to evaluate the antibody titers for AIV-H5. Anti-H5 antibody was detected by indirect ELISA kit (ID Influenza H5 Indirect) . Construct FW370 (rHVT / H7) is a negative control and does not induce anti-H5 antibodies.

[0186] Figure 5 (b) shows serological tests to evaluate the antibody titers for AIV-H7. Anti-H7 antibody was detected by competitive ELISA kit (ID Influenza H7 Antibody Competition) . In competitive ELISA kit, if the S / N value of Y-axis becomes low, it means that the sample contains higher amount of antibodies. Group 6, non-immunized is the negative control and does not present anti-H7 antibodies.

[0187] In conclusion, the results demonstrate that all recombinants FW368, FW369, FW370, FW380 and FW381 induce an immune response by increasing the antibody titers in vivo. Regarding the bivalent rHVT / H5-H7, FW380 showed higher antibody titers than FW381. It is not surprising that monovalent HVTs induce a higher level of antibody titers than bivalent HVT.

[0188] Overall, through the different experiments, it was demonstrated that all the recombinant HVT constructs of the invention stably express HA AI protein in-vitro and in-vivo and induce an immune response in chickens.

[0189] Sequence of the application

[0190] SEQ ID NO : 1 nucleotide sequence of AIV-H5

[0191] SEQ ID NO: 2: nucleotide sequence of AIV-H7

[0192] SEQ ID NO: 3: Amino acid sequence of H5 (564aa. 63.6kDa. )

[0193] SEQ ID NO: 4: Amino acid sequence of H5 without signal peptide (548aa. )

[0194] SEQ ID NO: 5: Amino acid sequence of H7 (560aa, 62.4kDa. )

[0195] SEQ ID NO: 6: Amino acid sequence of H7 without signal peptide (540aa)

[0196] SEQ ID NO: 7: murine CMV ie1 promoter

[0197] SEQ ID NO : 8: Human CMV promoter

[0198] SEQ ID NO: 9: primer forward

[0199] SEQ ID NO: 10: primer reverse

[0200] SEQ ID NO: 11: SV40 polyA signal

[0201] SEQ ID NO: 12: Synthetic poly (A) signal (t)

[0202] SEQ ID NO: 13: Primer forward set2

[0203] SEQ ID NO: 14: Primer reverse set2

[0204] SEQ ID NO: 15: Primer forward set3

[0205] SEQ ID NO: 16: Primer reverse set 3

Claims

1.A recombinant Herpes Virus of Turkeys (rHVT) which comprises a nucleotide sequence selected from a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H5N8 avian influenza virus, a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H7 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, wherein the nucleotide sequence is under control of a CMV promoter and wherein the nucleotide sequence is inserted into an insertion site of the viral genome, located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2.2.The rHVT of claim 1, CMV promoter is selected from murine CMV, murine CMV immediate early promoter, human CMV, human CMV immediate early promoter.3.The rHVT of claim 1 or 2, comprising a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H5N8 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into an insertion site of the viral genome, located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2.4.The rHVT of claim 3, comprising a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H5N8 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, under control of a human CMV, said nucleotide sequence being inserted into the non-coding regions between UL45 and UL46 (FW368) .5.The rHVT of claim 3, comprising a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H5N8 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, under control of a murine CMV immediate early promoter, said nucleotide sequence being inserted into the non-coding regions between UL45 and UL46 (FW369) .6.The rHVT of any one of claims 3 to 5, wherein the nucleotide sequence encodes a HA protein of a subtype H5N8 comprising or consisting of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.7.The rHVT of claim 1 or 2, comprising a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H7 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into an insertion site of the viral genome, located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2.8.The rHVT of claim 7, comprising a nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H7 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, under control of a human CMV, said nucleotide sequence being inserted into the non-coding regions between UL45 and UL46 (FW370) .9.The rHVT of claim 7 or 8, wherein the Hemagglutinin (HA) protein is of a subtype H7N9 avian influenza virus.10.The rHVT of claim 9, wherein the nucleotide sequence encodes a HA protein of a subtype H7N9 comprising or consisting of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.11.A recombinant Herpes Virus of Turkeys (rHVT) , comprising (i) a first nucleotide sequence under the control of a CMV promoter, said first nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H5 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into a first insertion site of the viral genome, located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2 and (ii) a second nucleotide sequence under the control of a CMV promoter, said second nucleotide sequence encoding an Hemagglutinin (HA) protein of a subtype H7 avian influenza virus, or an immunogenic fragment or variant thereof, inserted into a second insertion site of the viral genome, different from the first insertion site, and located in a non-coding region of the viral genome selected from the non-coding region between UL44 and UL45, the non-coding region between UL45 and UL46, and the non-coding region between SORF3 and US2.12.The rHVT of claim 11 wherein the Hemagglutinin (HA) proteins are of subtype H5N8 avian influenza virus and subtype H7N9 avian influenza virus, respectively.13.The rHVT of claim 11 or 12, wherein (i) the first nucleotide sequence is under control a murine CMV promoter and is inserted into the non-coding region between UL44 and UL45 (ii) the second nucleotide sequence is under control a human CMV promoter and is inserted into the non-coding region between UL45 and UL46 (FW380) .14.The rHVT of claim 11 or 12, wherein (i) the first nucleotide sequence is under control a murine CMV promoter and is inserted into the non-coding region between SORF3 and US2 and (ii) the second nucleotide sequence is under control a human CMV promoter and is inserted into the non-coding region between UL45 and UL46 (FW381) .15.The rHVT of claim 11 or 12, wherein (i) the first nucleotide sequence is under control a human CMV promoter and is inserted into the non-coding region between UL45 and UL46 (ii) the second nucleotide sequence is under control a murine CMV promoter and is inserted into the non-coding region between UL44 and UL45 (FW382) .16.The rHVT of claim 11 or 12, wherein (i) the first nucleotide sequence is under control a human CMV promoter and is inserted into the non-coding region between UL45 and UL46 and (ii) the second nucleotide sequence is under control a murine CMV promoter and is inserted into the non-coding region between SORF3 and US2 (FW383) .17.The rHVT of any one of claims 11 to 16, wherein the first nucleotide sequence encodes a HA protein of a subtype H5N8 comprising or consisting of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 and the second nucleotide sequence encodes a HA protein of a subtype H7N9 comprising or consisting of SEQ ID NO 5 or SEQ ID NO: 6, or the reverse.18.A vaccine which comprises at least one rHVT of any one of claims 1 to 17 and a suitable excipient or diluent.19.A rHVT of any one of claims 1 to 17, for use for vaccinating an avian such as a poultry, preferably a chicken, against Influenza Virus (AIV) .20.A vaccination kit for immunizing an avian which comprises the following components:- an effective amount of a vaccine according to claim 18, and- means for administering said vaccine to said avian.

Images