Novel gsdme inhibitors

Abstract

The disclosure is directed to inhibitors of Gasdermins, particularly Gasdermin E. Specifically, the disclosure is directed to a compound of Formula (I), or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and use of the same in treating and / or preventing pro-inflammatory cell death related diseases.

Description

Novel GSDME inhibitorsTECHNICAL FIELD

[0001] The disclosure is directed to inhibitors of Gasdermins, particularly Gasdermin E. Specifically, the disclosure is directed to a compound of Formula (I) , or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and use of the same in treating and / or preventing pro-inflammatory cell death related diseases.BACKGROUND

[0002] Gasdermins are a family of recently identified pore-forming proteins that upon unmasking the intramolecular autoinhibition would disrupt plasma membrane and induce a lytic form of pro-inflammatory cell death called pyroptosis. Human gasdermin family consists of gasdermin A (GSDMA) , GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME and Pejvakin (PJVK) . All GSDMs feature an effector N-terminal domain and an inhibitory C-terminal domain connected by a flexible linker. Proteolytic cleavage within GSDM interdomain linker unleashes the autoinhibition on the N-terminal domain, allowing it to insert into cell membranes and oligomerize to form large transmembrane pores, which serve as conduits to release cell contents and trigger pyroptosis.

[0003] GSDME (also known as ICERE-1 or DFNA5) was initially identified to be encoded by a candidate gene which mutations cause autosomal dominant non-syndromic hearing loss (Van Laer, L., et al., (1998) . Nonsyndromic hearing impairment is associated with a mutation in DFNA5. Nature genetics 20, 194-197) . Later, GSDME was found to bear significant sequence and structural similarities to GSDM proteins (Op de Beeck, K., et al., (2011) . The DFNA5 gene, responsible for hearing loss and involved in cancer, encodes a novel apoptosis-inducing protein. European journal of human genetics: EJHG 19, 965-973) . GSDME expression is variable in different human cells and tissues, including the brain, endometrium, placenta, and intestine (Wang, J., et al., (2022) . Molecular mechanisms and therapeutic relevance of gasdermin E in human diseases. Cellular signalling 90, 110189) . The molecular mechanism underlying GSDME activation was revealed to depend on caspase 3 cleavage (Wang, Y., et al., (2017) . Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature 547, 99-103) . Upon cleaved by caspase-3, GSDME would release its N-terminal pore-forming domain and trigger pyroptosis ultimately.

[0004] Until now, there is no GSDME inhibitor approved all over the world. Developing a highly potent and selective GSDME inhibitor will provide new solutions for all above mentioned unmet medical needs.SUMMARY

[0005] The inventors have made this invention based on the following discovery, that GSDME exhibits a conserved autoinhibition architecture shared by the whole GSDM family. The release of GSDME-N pore-forming domain upon caspase-3 cleavage is prerequisite for its membrane targeting and pyroptosis induction. A chemical compound that simultaneously binds to the GSDME-N and GSDME-C domains with high affinity would act as an intramolecular glue which locks the GSDME in the autoinhibition state and efficiently suppress its pyroptosis activity.

[0006] GSDME-specific inhibitors were developed following this strategy. For this, a GSDME-binding assay was designed to screen such compound (s) . In addition, a domain-dissociation assay was developed to monitor the release of the GSDME-N pore-forming domain from the GSDME-C inhibitory domain in vitro.

[0007] In one aspect, this disclosure features a compound of Formula (I) , or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

[0008] wherein the variables can be as defined anywhere herein.

[0009] In another aspect, pharmaceutical compositions are featured that include a chemical entity described herein and one or more pharmaceutically acceptable excipients.

[0010] In another aspect, kits are featured that include a first container which contains a chemical entity described herein, and optionally, a second container which contains one or more other therapeutic agents; and optionally, a third container which contains pharmaceutically acceptable excipient (s) for diluting or suspending the said compound and / or other therapeutic agent (s) .

[0011] In another aspect, use of a chemical entity described herein in the manufacture of a medicament for treating and / or preventing pro-inflammatory cell death related diseases is featured.

[0012] In another aspect, a chemical entity described herein, for use in treating and / or preventing pro-inflammatory cell death related diseases, is featured.

[0013] In another aspect, method of treating and / or preventing pro-inflammatory cell death related diseases are featured that include administering to a subject in need of such treatment an effective amount of a chemical entity described herein.

[0014] In another aspect, method of preventing pro-inflammatory cell death in a subject in need thereof is featured, comprising administrating to the subject a chemical compound to maintain the intramolecular autoinhibition of effector N-terminal domain and inhibitory C-terminal domain of GSDME, optionally after the flexible linker connecting the both domains is proteolytic cleavaged.

[0015] Other embodiments include those described in the Detailed Description and / or in the claims.

[0016] Chemical Definitions

[0017] Definitions of specific functional groups and chemical terms are described in more detail hereafter.

[0018] When a range of values is listed, each value and sub-range within the range are intended to be included. For example, “C1-6 alkyl” is intended to include C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5 and C5-6 alkyl.

[0019] "C1-6 alkyl" refers to a radical of a straight or branched, saturated hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms. In some embodiments, C1-4 alkyl is preferred. Examples of C1-6 alkyl include methyl (C1) , ethyl (C2) , n-propyl (C3) , iso-propyl (C3) , n-butyl (C4) , tert-butyl (C4) , sec-butyl (C4) , iso-butyl (C4) , n-pentyl (C5) , 3-pentyl (C5) , pentyl (C5) , neopentyl (C5) , 3-methyl-2-butyl (C5) , tert-pentyl (C5) and n-hexyl (C6) . The term "C1-6 alkyl" also includes heteroalkyl, wherein one or more (e.g., 1, 2, 3 or 4) carbon atoms are subsituted with heteroatoms (e.g., oxygen, sulfur, nitrogen, boron, silicon, phosphorus) . Alkyl groups can be optionally substituted with one or more substituents, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent. Conventional abbreviations of alkyl include Me (-CH3) , Et (-CH2CH3) , iPr (-CH (CH3) 2) , nPr (-CH2CH2CH3) , n-Bu (-CH2CH2CH2CH3) or i-Bu (-CH2CH (CH3) 2) .

[0020] “C2-6 alkenyl" refers to a radical of a straight or branched hydrocarbon group having 2 to 6 carbon atoms and at least one carbon-carbon double bond. In some embodiments, C2-4 alkenyl is preferred. Examples of C2-6 alkenyl include vinyl (C2) , 1-propenyl (C3) , 2-propenyl (C3) , 1-butenyl (C4) , 2-butenyl (C4) , butadienyl (C4) , pentenyl (C5) , pentadienyl (C5) , hexenyl (C6) , etc. The term "C2-6 alkenyl" also includes heteroalkenyl, wherein one or more (e.g., 1, 2, 3 or 4) carbon atoms are replaced by heteroatoms (e.g., oxygen, sulfur, nitrogen, boron, silicon, phosphorus) . The alkenyl groups can be optionally substituted with one or more substituents, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent.

[0021] "C2-6 alkynyl" refers to a radical of a straight or branched hydrocarbon group having 2 to 6 carbon atoms, at least one carbon-carbon triple bond and optionally one or more carbon-carbon double bonds. In some embodiments, C2-4 alkynyl is preferred. Examples of C2-6 alkynyl include, but are not limited to, ethynyl (C2) , 1-propynyl (C3) , 2-propynyl (C3) , 1-butynyl (C4) , 2-butynyl (C4) , pentynyl (C5) , hexynyl (C6) , etc. The term "C2-6 alkynyl" also includes heteroalkynyl, wherein one or more (e.g., 1, 2, 3 or 4) carbon atoms are replaced by heteroatoms (e.g., oxygen, sulfur, nitrogen, boron, silicon, phosphorus) . The alkynyl groups can be substituted with one or more substituents, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent.

[0022] “C1-6 alkylene” refers to a divalent group of the “C1-6 alkyl” as defined above. Particularly, "C1-6 alkylene" refers to a divalent group formed by removing another hydrogen of the C1-6 alkyl, and can be a substituted or unsubstituted alkylene. In some embodiments, C2-6 alkylene, C1-4 alkylene, and C2-3 alkylene are particularly preferred. The unsubstituted alkylene groups include, but are not limited to, methylene (-CH2-) , ethylene (-CH2CH2-) , propylene (-CH2CH2CH2-) , butylene (-CH2CH2CH2CH2-) , pentylene (-CH2CH2CH2CH2CH2-) , hexylene (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-) , etc. Examples of substituted alkylene groups, such as those substituted with one or more alkyl (methyl) groups, include, but are not limited to, substituted methylene (-CH (CH3) -, -C (CH3) 2-) , substituted ethylene (-CH (CH3) CH2-, -CH2CH (CH3) -, -C (CH3) 2CH2-, -CH2C (CH3) 2-) , substituted propylene (-CH (CH3) CH2CH2-, -CH2CH (CH3) CH2-, -CH2CH2CH (CH3) -, -C (CH3) 2CH2CH2-, -CH2C (CH3) 2CH2-, -CH2CH2C (CH3) 2-) , etc.

[0023] “C0-6 alkylene” includes chemical bond and “C1-6 alkylene” . Similarly, “C0-4 alkylene” includes chemical bond and “C1-4 alkylene” .

[0024] "Halo" or "halogen" refers to fluorine (F) , chlorine (Cl) , bromine (Br) and iodine (I) .

[0025] "C1-6 haloalkyl" represents the "C1-6 alkyl" described above, which is substituted with one or more halogen groups. Examples include the mono-, di-, poly-halogenated, including perhalogenated, alkyl. A monohalogen substituent may have one iodine, bromine, chlorine or fluorine atom in the group; a dihalogen substituent and a polyhalogen substituent may have two or more identical halogen atoms or a combination of different halogens. In some embodiments, C1-4 haloalkyl is particularly preferred. Examples of preferred haloalkyl groups include monofluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, chloromethyl, dichloromethyl, trichloromethyl, pentafluoroethyl, heptafluoropropyl, difluorochloromethyl, dichlorofluoromethyl, difluoroethyl, difluoropropyl, dichloroethyl and dichloropropyl. The haloalkyl groups can be substituted at any available point of attachment, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent.

[0026] Similarly, "C2-6 haloalkenyl" and "C2-4 haloalkenyl" represents the "C2-6 alkenyl" and "C2-4 alkenyl" described above, which is substituted with one or more halogen groups. "C2-6 haloalkynyl" and "C2-4 haloalkynyl" represents the "C2-6 alkynyl" and "C2-4 alkynyl" described above, which is substituted with one or more halogen groups.

[0027] "C1-6 alkoxy" refers to an -O-C1-6 alkyl radical, and "C1-4 alkoxy" refers to an -O-C1-4 alkyl radical, (e.g., -OCH3) . "C1-6 haloalkoxy" refers to an -O-C1-6 haloalkyl radical, and "C1-4 haloalkoxy" refers to an -O-C1-4 haloalkyl radical, (e.g., -OCF3) .

[0028] "C3-10 cycloalkyl" refers to a radical of non-aromatic cyclic hydrocarbon group having 3 to 10 ring carbon atoms and zero heteroatoms. The term cycloalkyl may include one or more double or triple bonds, as long as it is non-aromatic. In some embodiments, C3-8 cycloalkyl is particularly preferred. In some embodiments, C3-6 cycloalkyl is particularly preferred. In some embodiments, C5-6 cycloalkyl is particularly preferred. In some embodiments, C4-6 cycloalkyl is particularly preferred. In some embodiments, C3-5 cycloalkyl is particularly preferred. In some embodiments, C3-4 cycloalkyl is particularly preferred. The cycloalkyl also includes a ring system in which the cycloalkyl described herein is fused with one or more aryl or heteroaryl groups, wherein the point of attachment is on the cycloalkyl ring, and in such case, the number of carbon atoms continues to represent the number of carbon atoms in the cycloalkyl system. The cycloalkyl can be substituted with one or more substituents, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent.

[0029] Exemplary cycloalkyl groups include, but are not limited to, cyclopropyl (C3) , cyclopropenyl (C3) , cyclobutyl (C4) , cyclobutenyl (C4) , cyclopentyl (C5) , cyclopentenyl (C5) , cyclohexyl (C6) , cyclohexenyl (C6) , cyclohexadienyl (C6) , cycloheptyl (C7) , cycloheptenyl (C7) , cycloheptadienyl (C7) , cycloheptatrienyl (C7) , etc. Examples of cycloalkyl groups further include, without limitation, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, and cyclooctyl. Cycloalkyl may include multiple fused and / or bridged rings. Non-limiting examples of fused / bridged cycloalkyl includes C4-8 bridged bicycloalkyl, for example bicyclo [1.1.0] butanyl, bicyclo [2.1.0] pentanyl, bicyclo [1.1.1] pentanyl, bicyclo [3.1.0] hexanyl, bicyclo [2.1.1] hexanyl, bicyclo [3.2.0] heptanyl, bicyclo [4.1.0] heptanyl, bicyclo [2.2.1] heptanyl, bicyclo [3.1.1] heptanyl, bicyclo [4.2.0] octanyl, bicyclo [3.2.1] octanyl, bicyclo [2.2.2] octanyl, and the like. Cycloalkyl also includes spirocyclic rings (e.g., spirocyclic bicycle wherein two rings are connected through just one atom) . Non-limiting examples of spirocyclic cycloalkyls include spiro [2.2] pentanyl, spiro [2.5] octanyl, spiro [3.5] nonanyl, spiro [3.5] nonanyl, spiro [3.5] nonanyl, spiro [4.4] nonanyl, spiro [2.6] nonanyl, spiro [4.5] decanyl, spiro [3.6] decanyl, spiro [5.5] undecanyl, and the like.

[0030] "4-to 10-membered heterocyclyl" refers to a radical of 4-to 10-membered non-aromatic ring system having ring carbon atoms and 1 to 5 ring heteroatoms, wherein each of the heteroatoms is independently selected from nitrogen, oxygen, sulfur, boron, phosphorus and silicon, or oxidized form such as S (O) , and S (O) 2. In the heterocyclyl containing one or more nitrogen atoms, the point of attachment can be a carbon or nitrogen atom as long as the valence permits. The term heterocyclyl may include one or more double or triple bonds, as long as it is non-aromatic. In some embodiments, 5-to 10-membered heterocyclyl is preferred, which is a radical of 5-to 10-membered non-aromatic ring system having ring carbon atoms and 1 to 5 ring heteroatoms. In some embodiments, 5-to 7-membered heterocyclyl is preferred, which is a radical of 5-to 7-membered non-aromatic ring system having ring carbon atoms and 1 to 5 ring heteroatoms. In some embodiments, 5-to 6-membered heterocyclyl is more preferred, which is a radical of 5-to 6-membered non-aromatic ring system having ring carbon atoms and 1 to 3 ring heteroatoms. In some embodiments, 4-to 6-membered heterocyclyl is preferred, which is a radical of 4-to 6-membered non-aromatic ring system having ring carbon atoms and 1 to 3 ring heteroatoms. The heterocyclyl also includes a ring system wherein the heterocyclyl described above is fused with one or more cycloalkyl groups, wherein the point of attachment is on the cycloalkyl ring, or the heterocyclyl described above is fused with one or more aryl or heteroaryl groups, wherein the point of attachment is on the heterocyclyl ring; and in such cases, the number of ring members continues to represent the number of ring members in the heterocyclyl ring system. Exemplary 3-membered heterocyclyl groups containing one heteroatom include, but are not limited to, aziridinyl, oxiranyl and thiorenyl. Exemplary 4-membered heterocyclyl groups containing one heteroatom include, but are not limited to, azetidinyl, oxetanyl and thietanyl. Exemplary 5-membered heterocyclyl groups containing one heteroatom include, but are not limited to, tetrahydrofuranyl, dihydrofuranyl, tetrahydrothiophenyl, dihydrothienyl, pyrrolidinyl, dihydropyrrolyl and pyrrolyl-2, 5-dione. Exemplary 5-membered heterocyclyl groups containing two heteroatoms include, but are not limited to, dioxolanyl, oxasulfuranyl, disulfuranyl, and oxazolidin-2-one. Exemplary 5-membered heterocyclyl groups containing three heteroatoms include, but are not limited to, triazolinyl, oxadiazolinyl, and thiadiazolinyl. Exemplary 6-membered heterocyclyl groups containing one heteroatom include, but are not limited to, piperidyl, tetrahydropyranyl, dihydropyridyl and thianyl. Exemplary 6-membered heterocyclyl groups containing two heteroatoms include, but are not limited to, piperazinyl, morpholinyl, dithianyl and dioxanyl. Exemplary 6-membered heterocyclyl groups containing three heteroatoms include, but are not limited to, triazinanyl. Exemplary 7-membered heterocycly groups containing one heteroatom include, but are not limited to, azepanyl, oxepanyl and thiepanyl. Exemplary 5-membered heterocyclyl groups fused with a C6 aryl (also referred as 5, 6-bicyclic heterocyclyl herein) include, but are not limited to, indolinyl, isoindolinyl, dihydrobenzofuranyl, dihydrobenzothiophenyl, benzoxazolinonyl, etc. Exemplary 6-membered heterocyclyl groups fused with a C6 aryl (also referred as 6, 6-bicyclic heterocyclyl herein) include, but are not limited to, tetrahydroquinolinyl, tetrahydroisoquinolinyl, etc. The heterocyclyl can be substituted with one or more substituents, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent.

[0031] Specific examples of preferred heterocyclyl groups include, pyrrolinyl, imidazolidinyl, pyrazolidinyl, tetrahydropyranyl, dihydropyranyl, dihydrofuranyl, thiazolidinyl, dihydrothiazolyl, 2, 3-dihydro-benzo [l, 4] dioxol, indolinyl, isoindolinyl, dihydrobenzothiophene, dihydrobenzofuranyl, isodihydrobenzopyranyl, dihydrobenzopyranyl, 1, 2-dihydroisoquinoline, 1, 2, 3, 4-tetrahydroisoquinoline, 1, 2, 3, 4-tetrahydroquinoline, 2, 3, 4, 4a, 9, 9a-hexahydro-1H-3-azafluorene, 5, 6, 7-trihydro-1, 2, 4-triazolo [3, 4-a] isoquinolyl, 3, 4-dihydro-2H-benzo [l, 4] oxazinyl, benzo [l, 4] dioxol, 2, 3-dihydro-lH-lk'-benzo [d] isothiazol-6-yl, 2, 3-di-benzo [l, 4] dioxinyl, dihydrobenzofuran, 2-oxoaziridin -1-yl, 2-oxoazetidin-1-yl, 2-oxopyrrolidin-1-yl, 2-oxopiperidin-1-yl, 2-oxoazepan-1-yl, 2-oxoazocan-1-yl, 2-oxoazonan-1-yl, 2-oxoazecan-1-yl, aziridine, azetidine, pyrrolidinyl, piperidine, azepane, azocane, azonane, azecane, piperidyl, piperazinyl, morpholinyl, diazaspiro [3.3] heptane, diazaspiro [3.4] octane, diazaspiro [3.5] nonane, diazaspiro [4.4] nonane, diazaspiro [4.5] decane, and diazaspiro [5.5] undecane.

[0032] Further examples of heterocyclyl groups include piperazinyl, pyrrolidinyl, dioxanyl, morpholinyl, tetrahydrofuranyl, and the like. Heterocyclyl may include multiple fused and bridged rings. Non-limiting examples of fused / bridged heteorocyclyl includes: 2-azabicyclo [1.1.0] butanyl, 2-azabicyclo [2.1.0] pentanyl, 2-azabicyclo [1.1.1] pentanyl, 3-azabicyclo [3.1.0] hexanyl, 5-azabicyclo [2.1.1] hexanyl, 3-azabicyclo [3.2.0] heptanyl, octahydrocyclopenta [c] pyrrolyl, 3-azabicyclo [4.1.0] heptanyl, 7-azabicyclo [2.2.1] heptanyl, 6-azabicyclo [3.1.1] heptanyl, 7-azabicyclo [4.2.0] octanyl, 2-azabicyclo [2.2.2] octanyl, 3-azabicyclo [3.2.1] octanyl, 2-oxabicyclo [1.1.0] butanyl, 2-oxabicyclo [2.1.0] pentanyl, 2-oxabicyclo [1.1.1] pentanyl, 3-oxabicyclo [3.1.0] hexanyl, 5-oxabicyclo [2.1.1] hexanyl, 3-oxabicyclo [3.2.0] heptanyl, 3-oxabicyclo [4.1.0] heptanyl, 7-oxabicyclo [2.2.1] heptanyl, 6-oxabicyclo [3.1.1] heptanyl, 7-oxabicyclo [4.2.0] octanyl, 2-oxabicyclo [2.2.2] octanyl, 3-oxabicyclo [3.2.1] octanyl, and the like. Heterocyclyl also includes spirocyclic rings (e.g., spirocyclic bicycle wherein two rings are connected through just one atom) . Non-limiting examples of spirocyclic heterocyclyls include 2-azaspiro [2.2] pentanyl, 4-azaspiro [2.5] octanyl, 1-azaspiro [3.5] nonanyl, 2-azaspiro [3.5] nonanyl, 7-azaspiro [3.5] nonanyl, 2-azaspiro [4.4] nonanyl, 6-azaspiro [2.6] nonanyl, 1, 7-diazaspiro [4.5] decanyl, 7-azaspiro [4.5] decanyl, 2, 5-diazaspiro [3.6] decanyl, 3-azaspiro [5.5] undecanyl, 2-oxaspiro [2.2] pentanyl, 4-oxaspiro [2.5] octanyl, 1-oxaspiro [3.5] nonanyl, 2-oxaspiro [3.5] nonanyl, 7-oxaspiro [3.5] nonanyl, 2-oxaspiro [4.4] nonanyl, 6-oxaspiro [2.6] nonanyl, 1, 7-dioxaspiro [4.5] decanyl, 2, 5-dioxaspiro [3.6] decanyl, 1-oxaspiro [5.5] undecanyl, 3-oxaspiro [5.5] undecanyl, 3-oxa-9-azaspiro [5.5] undecanyl and the like. The term “saturated” as used in this context means only single bonds present between constituent ring atoms and other available valences occupied by hydrogen and / or other substituents as defined herein.

[0033] "C6-10 aryl" refers to a radical of monocyclic or polycyclic (e.g., bicyclic) 4n+2 aromatic ring system having 6-10 ring carbon atoms and zero heteroatoms (e.g., having 6 or 10 shared π electrons in a cyclic array) . In some embodiments, the aryl group has six ring carbon atoms ( "C6 aryl" ; for example, phenyl) . In some embodiments, the aryl group has ten ring carbon atoms ( "C10 aryl" ; for example, naphthyl, e.g., 1-naphthyl and 2-naphthyl) . The aryl group also includes a ring system in which the aryl ring described above is fused with one or more cycloalkyl or heterocyclyl groups, and the point of attachment is on the aryl ring, in which case the number of carbon atoms continues to represent the number of carbon atoms in the aryl ring system. The aryl can be substituted with one or more substituents, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent.

[0034] "5-to 10-membered heteroaryl" refers to a radical of 5-to 10-membered monocyclic or bicyclic 4n+2 aromatic ring system (e.g., having 6 or 10 shared π electrons in a cyclic array) having ring carbon atoms and 1-4 ring heteroatoms, wherein each heteroatom is independently selected from nitrogen, oxygen and sulfur. In the heteroaryl group containing one or more nitrogen atoms, the point of attachment can be a carbon or nitrogen atom as long as the valence permits. Heteroaryl bicyclic systems may include one or more heteroatoms in one or two rings. Heteroaryl also includes ring systems wherein the heteroaryl ring described above is fused with one or more cycloalkyl or heterocyclyl groups, and the point of attachment is on the heteroaryl ring. In such case, the number the carbon atoms continues to represent the number of carbon atoms in the heteroaryl ring system. In some embodiments, 5-to 9-membered heteroaryl groups are particularly preferred, which are radicals of 5-to 9-membered monocyclic or bicyclic 4n+2 aromatic ring systems having ring carbon atoms and 1-4 ring heteroatoms. In some embodiments, 5-to 6-membered heteroaryl groups are particularly preferred, which are radicals of 5-to 6-membered monocyclic or bicyclic 4n+2 aromatic ring systems having ring carbon atoms and 1-4 ring heteroatoms. In some embodiments, 5-membered heteroaryl group is particularly preferred, which is a radical of 5-membered monocyclic or bicyclic 4n+2 aromatic ring systems having ring carbon atoms and 1-4 ring heteroatoms. Exemplary 5-membered heteroaryl groups containing one heteroatom include, but are not limited to, pyrrolyl, furyl and thienyl. Exemplary 5-membered heteroaryl groups containing two heteroatoms include, but are not limited to, imidazolyl, pyrazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, thiazolyl, and isothiazolyl. Exemplary 5-membered heteroaryl groups containing three heteroatoms include, but are not limited to, triazolyl, oxadiazolyl (such as, 1, 2, 4-oxadiazoly) , and thiadiazolyl. Exemplary 5-membered heteroaryl groups containing four heteroatoms include, but are not limited to, tetrazolyl. Exemplary 6-membered heteroaryl groups containing one heteroatom include, but are not limited to, pyridyl. Exemplary 6-membered heteroaryl groups containing two heteroatoms include, but are not limited to, pyridazinyl, pyrimidinyl, and pyrazinyl. Exemplary 6-membered heteroaryl groups containing three or four heteroatoms include, but are not limited to, triazinyl and tetrazinyl, respectively. Exemplary 7-membered heteroaryl groups containing one heteroatom include, but are not limited to, azepinyl, oxepinyl, and thiepinyl. Exemplary 5, 6-bicyclic heteroaryl groups include, but are not limited to, indolyl, isoindolyl, indazolyl, benzotriazolyl, benzothiophenyl, isobenzothiophenyl, benzofuranyl , benzoisofuranyl, benzimidazolyl, benzoxazolyl, benzoisoxazolyl, benzoxadiazolyl, benzothiazolyl, benzoisothiazolyl, benzothiadiazolyl, indolizinyl and purinyl. Exemplary 6, 6-bicyclic heteroaryl groups include, but are not limited to, naphthyridinyl, pteridinyl, quinolyl, isoquinolyl, cinnolinyl, quinoxalinyl, phthalazinyl and quinazolinyl. The heteroaryl can be substituted with one or more substituents, for example, with 1 to 5 substituents, 1 to 3 substituents or 1 substituent.

[0035] Specific examples of preferred heteroaryl groups include: pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, pyridazinyl, triazolyl (4H-l, 2, 4-triazolyl, 1H-1, 2, 3-triazolyl, 2H-1, 2, 3-triazolyl, pyranyl, 2-furyl, 3-furyl, 2-thienyl, 3-thienyl, oxazolyl, isoxazolyl, oxazolyl (1, 2, 4-oxazolyl, 1, 3, 4-oxazolyl, 1, 2, 5-oxazolyl, thiazolyl, thiadiazolyl (1, 2, 4-thiadiazolyl, 1, 3, 4-thiadiazolyl, 1, 2, 5-thiadiazolyl) .

[0036] Further examples of heteroaryl include thienyl, pyridinyl, furyl, oxazolyl, oxadiazolyl, pyrrolyl, imidazolyl, triazolyl, thiodiazolyl, pyrazolyl, isoxazolyl, thiadiazolyl, pyranyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, triazinyl, thiazolyl benzothienyl, benzoxadiazolyl, benzofuranyl, benzimidazolyl, benzotriazolyl, cinnolinyl, indazolyl, indolyl, isoquinolinyl, isothiazolyl, naphthyridinyl, purinyl, thienopyridinyl, pyrido [2, 3-d] pyrimidinyl, pyrrolo [2, 3-b] pyridinyl, quinazolinyl, quinolinyl, thieno [2, 3-c] pyridinyl, pyrazolo [3, 4-b] pyridinyl, pyrazolo [3, 4-c] pyridinyl, pyrazolo [4, 3-c] pyridinyl, pyrazolo [4, 3-b] pyridinyl, tetrazolyl, chromanyl, 2, 3-dihydrobenzo [b] [1, 4] dioxinyl, benzo [d] [1, 3] dioxolyl, benzo [d] thiazolyl, 2, 3-dihydrobenzofuran, tetrahydroquinolinyl, 2, 3-dihydrobenzo [b] [1, 4] oxathiinyl, indolinyl, isoindolinyl, and others. In some embodiments, the heteroaryl is selected from thienyl, pyridinyl, furyl, pyrazolyl, imidazolyl, isoindolinyl, pyranyl, pyrazinyl, and pyrimidinyl.

[0037] As used herein, when a ring is described as being “aromatic” , it means said ring has a continuous, delocalized π-electron system. Typically, the number of out of plane π-electrons corresponds to the Hückel rule (4n+2) .

[0038] "Oxo" represents =O.

[0039] For the avoidance of doubt, and unless otherwise specified, for rings and cyclic groups (e.g., aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heterocycloalkenyl, cycloalkenyl, cycloalkyl, and the like described herein) containing a sufficient number of ring atoms to form bicyclic or higher order ring systems (e.g., tricyclic, polycyclic ring systems) , it is understood that such rings and cyclic groups encompass those having fused rings, including those in which the points of fusion are located (i) on adjacent ring atoms (e.g., [x. x. 0] ring systems, in which 0 represents a zero atom bridge (e.g.,  ) ) ; (ii) a single ring atom (spiro-fused ring systems) (e.g.,  ) , or (iii) a contiguous array of ring atoms (bridged ring systems having all bridge lengths > 0) (e.g.,  ) .

[0040] In addition, atoms making up the compounds of the present embodiments are intended to include all isotopic forms of such atoms. Isotopes, as used herein, include those atoms having the same atomic number but different mass numbers. By way of general example and without limitation, isotopes of hydrogen include tritium and deuterium, and isotopes of carbon include 13C and 14C.

[0041] In addition, the compounds generically or specifically disclosed herein are intended to include all tautomeric forms. Thus, by way of example, a compound containing the moiety:  encompasses the tautomeric form containing the moiety:  Similarly, a pyridinyl or pyrimidinyl moiety that is described to be optionally substituted with hydroxyl encompasses pyridone or pyrimidone tautomeric forms.

[0042] "Amino protecting groups" are used to prevent amino groups from undergoing undesired reactions. The selection of suitable protecting groups for specific functional groups as well as suitable conditions for protecting and deprotecting are well known in the art. For example, numerous protecting groups and their introduction and removal are described in T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991 and references cited therein. Exemplary amino protecting agent is selected from Cbz, Boc, Fmoc, Alloc, and Teoc.

[0043] Alkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl as defined herein are optionally substituted groups.

[0044] Exemplary substituents on carbon atoms include, but are not limited to, halogen, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -ORaa, -ON (Rbb) 2, -N (Rbb) 2, -N (Rbb) 3+X-, -N (ORcc) Rbb, -SH, -SRaa, -SSRcc, -C (=O) Raa, -CO2H, -CHO, -C (ORcc) 2, -CO2Raa, -OC (=O) Raa, -OCO2Raa, -C (=O) N (Rbb) 2, -OC (=O) N (Rbb) 2, -NRbbC (=O) Raa, -NRbbCO2Raa, -NRbbC (=O) N (Rbb) 2, -C (=NRbb) Raa, -C (=NRbb) ORaa, -OC (=NRbb) Raa, -OC (=NRbb) ORaa, -C (=NRbb) N (Rbb) 2, -OC (=NRbb) N (Rbb) 2, -NRbbC (=NRbb) N (Rbb) 2, -C (=O) NRbbSO2Raa, -NRbbSO2Raa, -SO2N (Rbb) 2, -SO2Raa, -SO2ORaa, -OSO2Raa, -S (=O) Raa, -OS (=O) Raa, -Si (Raa) 3, -OSi (Raa) 3, -C (=S) N (Rbb) 2, -C (=O) SRaa, -C (=S) SRaa, -SC (=S) SRaa, -SC (=O) SRaa, -OC (=O) SRaa, -SC (=O) ORaa, -SC (=O) Raa, -P (=O) 2Raa, -OP (=O) 2Raa, -P (=O) (Raa) 2, -OP (=O) (Raa) 2, -OP (=O) (ORcc) 2, -P (=O) 2N (Rbb) 2, -OP (=O) 2N (Rbb) 2, -P (=O) (NRbb) 2, -OP (=O) (NRbb) 2, -NRbbP (=O) (ORcc) 2, -NRbbP (=O) (NRbb) 2, -P (Rcc) 2, -P (Rcc) 3, -OP (Rcc) 2, -OP (Rcc) 3, -B (Raa) 2, -B (ORcc) 2, -BRaa (ORcc) , alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rdd groups;

[0045] or two geminal hydrogen on a carbon atom are replaced with =O, =S, =NN (Rbb) 2, =NNRbbC (=O) Raa, =NNRbbC (=O) ORaa, =NNRbbS (=O) 2Raa, =NRbb or =NORcc groups;

[0046] each of the Raa is independently selected from alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, or two of the Raa groups are combined to form a heterocyclyl or heteroaryl ring, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rddgroups;

[0047] each of the Rbb is independently selected from hydrogen, -OH, -ORaa, -N (Rcc) 2, -CN, -C (=O) Raa, -C (=O) N (Rcc) 2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C (=NRcc) ORaa, -C (=NRcc) N (Rcc) 2, -SO2N (Rcc) 2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C (=S) N (Rcc) 2, -C (=O) SRcc, -C (=S) SRcc, -P (=O) 2Raa, -P (=O) (Raa) 2, -P (=O) 2N (Rcc) 2, -P (=O) (NRcc) 2, alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, or two Rbb groups are combined to form a heterocyclyl or a heteroaryl ring, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1 , 2, 3, 4 or 5 Rdd groups;

[0048] each of the Rcc is independently selected from hydrogen, alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, or two Rcc groups are combined to form a heterocyclyl or a heteroaryl ring, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rdd groups;

[0049] each of the Rdd is independently selected from halogen, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -ORee, -ON (Rff) 2, -N (Rff) 2, -N (Rff) 3+X-, -N (ORee) Rff, -SH, -SRee, -SSRee, -C (=O) Ree, -CO2H, -CO2Ree, -OC (=O) Ree, -OCO2Ree, -C (=O) N (Rff) 2, -OC (=O) N (Rff) 2, -NRffC (=O) Ree, -NRffCO2Ree, -NRffC (=O) N (Rff) 2, -C (=NRff) ORee, -OC (=NRff) Ree, -OC (=NRff) ORee, -C (=NRff) N (Rff) 2, -OC (=NRff) N (Rff) 2, -NRffC (=NRff) N (Rff) 2, -NRffSO2Ree, -SO2N (Rff) 2, -SO2Ree, -SO2ORee, -OSO2Ree, -S (=O) Ree, -Si (Ree) 3, -OSi (Ree) 3, -C (=S) N (Rff) 2, -C (=O) SRee, -C (=S) SRee, -SC (=S) SRee, -P (=O) 2Ree, -P (=O) (Ree) 2, -OP (=O) (Ree) 2, -OP (=O) (ORee) 2, alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl, heteroaryl, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rgg groups, or two geminal Rddsubstituents can be combined to form=O or =S;

[0050] each of the Ree is independently selected from alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, aryl, heterocyclyl, and heteroaryl, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rgg groups;

[0051] each of the Rff is independently selected from hydrogen, alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, or two Rff groups are combined to form a heterocyclyl or a heteroaryl ring, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rgggroups;

[0052] each of the Rgg is independently selected from halogen, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -OC1-6 alkyl, -ON (C1-6alkyl) 2, -N (C1-6alkyl) 2, -N (C1-6alkyl) 3+X-, -NH (C1-6alkyl) 2+X-, -NH2 (C1-6alkyl) +X-, -NH3+X-, -N (OC1-6 alkyl) (C1-6 alkyl) , -N (OH) (C1-6 alkyl) , -NH (OH) , -SH, -SC1-6 alkyl, -SS (C1-6 alkyl) , -C (=O) (C1-6 alkyl) , -CO2H, -CO2 (C1-6alkyl) , -OC (=O) (C1-6alkyl) , -OCO2 (C1-6alkyl) , -C (=O) NH2, -C (=O) N (C1-6alkyl) 2, -OC (=O) NH (C1-6 alkyl) , -NHC (=O) (C1-6 alkyl) , -N (C1-6 alkyl) C (=O) (C1-6 alkyl) , -NHCO2 (C1-6 alkyl) , -NHC (=O) N (C1-6 alkyl) 2, -NHC (=O) NH (C1-6 alkyl) , -NHC (=O) NH2, -C (=NH) O (C1-6 alkyl) , -OC (=NH) (C1-6 alkyl) , -OC (=NH) OC1-6 alkyl, -C (=NH) N (C1-6 alkyl) 2, -C (=NH) NH (C1-6 alkyl) , -C (=NH) NH2, -OC (=NH) N (C1-6alkyl) 2, -OC (NH) NH (C1-6alkyl) , -OC (NH) NH2, -NHC (NH) N (C1-6alkyl) 2, -NHC (=NH) NH2, -NHSO2 (C1-6 alkyl) , -SO2N (C1-6 alkyl) 2, -SO2NH (C1-6 alkyl) , -SO2NH2, -SO2C1-6 alkyl, -SO2OC1-6 alkyl, -OSO2C1-6 alkyl, -SOC1-6 alkyl, -Si (C1-6 alkyl) 3, -OSi (C1-6 alkyl) 3, -C (=S) N (C1-6 alkyl) 2, C (=S) NH (C1-6 alkyl) , C (=S) NH2, -C (=O) S (C1-6 alkyl) , -C (=S) SC1-6 alkyl, -SC (=S) SC1-6 alkyl, -P (=O) 2 (C1-6 alkyl) , -P (=O) (C1-6 alkyl) 2, -OP (=O) (C1-6alkyl) 2, -OP (=O) (OC1-6alkyl) 2, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl, C3-C7 carbocyclyl, C6-C10 aryl, C3-C7 heterocyclyl, C5-C10 heteroaryl; or two geminal Rgg substituents may combine to form =O or =S; wherein X-is a counter-ion.

[0053] Exemplary substituents on nitrogen atoms include, but are not limited to, hydrogen, -OH, -ORaa, -N (Rcc) 2, -CN, -C (=O) Raa, -C (=O) N (Rcc) 2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C (=NRbb) Raa, -C (=NRcc) ORaa, -C (=NRcc) N (Rcc) 2, -SO2N (Rcc) 2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C (=S) N (Rcc) 2, -C (=O) SRcc, -C (=S) SRcc, -P (=O) 2Raa, -P (=O) (Raa) 2, -P (=O) 2N (Rcc) 2, -P (=O) (NRcc) 2, alkyl, haloalkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl, or two Rcc groups attached to a nitrogen atom combine to form a heterocyclyl or a heteroaryl ring, wherein each of the alkyl, alkenyl, alkynyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl and heteroaryl is independently substituted with 0, 1, 2, 3, 4 or 5 Rdd groups, and wherein Raa, Rbb, Rcc and Rdd are as described herein.

[0054] Additional Definitions

[0055] To facilitate understanding of the disclosure set forth herein, a number of additional terms are defined below. Generally, the nomenclature used herein and the laboratory procedures in organic chemistry, medicinal chemistry, and pharmacology described herein are those well-known and commonly employed in the art, for example, the nomenclature can be generated by using the software ChemDraw. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein generally have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. Each of the patents, applications, published applications, and other publications that are mentioned throughout the specification and the attached appendices are incorporated herein by reference in their entireties.

[0056] The term “comprising” , “including” , “having” , or “containing” means “including but not limited to” as well as “consisting of’ , e.g. a composition “comprising” X may consist exclusively of X or may include something additional e.g. X + Y. Additionally, whenever “comprising” or another open-ended term is used in an embodiment, it is to be understood that the same embodiment can be more narrowly claimed using the intermediate term “consisting essentially of’ or the closed term “consisting of” . As used herein, the articles “a” and “an” refer to one or to more than one (e.g., to at least one) of the grammatical object of the article. The term “or” is used herein to mean, and is used interchangeably with, the term “and / or” , unless context clearly indicates otherwise.

[0057] As used herein, the term “GSDME inhibitors” refers to any compound that can inhibitor the disassociation of the effector N-terminal domain and the inhibitory C-terminal domain of GSDME, and consequently leads to the intramolecular autoinhibition of the effector N-terminal domain, which could insert into cell membranes and oligomerize to form large transmembrane pores, serving as conduits to release cell contents and trigger pyroptosis.

[0058] The terms “treat, ” “treating, ” and “treatment, ” in the context of treating a disease, disorder, or condition are meant to include alleviating or abrogating a disorder, disease, or condition, or one or more of the symptoms associated with the disorder, disease, or condition; or slowing the progression, spread or worsening of a disease, disorder or condition or of one or more symptoms thereof. Often, the beneficial effects that a subject derives from a therapeutic agent do not result in a complete cure of the disease, disorder or condition. In some embodiments, the terms “treat, ” “treating, ” and “treatment, ” include virologically curing a viral disorder, disease, or condition; reducing viral shedding; decreasing viral RNA load (e.g., a measured by PCR) ; reducing the length of stay in a hospital; reducing the length of stay in an infectious disease unit and / or intensive care unit; or slowing (including stopping) the progression / development of respiratory (or other serious) symptoms.

[0059] The “treatment of cancer” , refers to one or more of the following effects: (1) inhibition, to some extent, of tumor growth, including, (i) slowing down and (ii) complete growth arrest; (2) reduction in the number of tumor cells; (3) maintaining tumor size; (4) reduction in tumor size; (5) inhibition, including (i) reduction, (ii) slowing down or (iii) complete prevention, of tumor cell infiltration into peripheral organs; (6) inhibition, including (i) reduction, (ii) slowing down or (iii) complete prevention, of metastasis; (7) enhancement of anti-tumor immune response, which may result in (i) maintaining tumor size, (ii) reducing tumor size, (iii) slowing the growth of a tumor, (iv) reducing, slowing or preventing invasion and / or (8) relief, to some extent, of the severity or number of one or more symptoms associated with the disorder.

[0060] The term “therapeutically effective amount” refers to the amount of a drug or other pharmaceutical agent (e.g., a compound disclosed herein) , that will elicit the biological and / or medical response of a tissue, system, animal or human (e.g., subject or patient) that is being sought, for instance, by a researcher or clinician. Furthermore, the term “therapeutically effective amount” means any amount, as compared to a corresponding subject (e.g., patient) who has not received such amount, which is sufficient to decrease the rate of advancement of, prevent development of, or alleviate to some extent, one or more of the symptoms of the condition or disorder being treated. The therapeutically effective amount will vary depending on the compound, the disease and its severity and the age, weight, etc., of the mammal to be treated. In addition, the therapeutically effective amount can be administered in one or more administrations, applications or dosages and is not intended to be limited to a particular formulation or administration route.

[0061] As used herein, the term “subject or patient” used interchangeably herein refers to an animal, including, but not limited to, a primate (e.g., human) , monkey, cow, pig, sheep, goat, horse, dog, cat, rabbit, rat, or mouse. In some embodiments, the subject is a human to be treated by the methods and compositions of the present disclosure. In some embodiments, the methods described herein further include the step of identifying a subject (e.g., a patient) in need of such treatment (e.g., by way of biopsy, endoscopy, or other conventional method known in the art) .

[0062] As used herein, the term “cancer” refers to the physiological condition in subjects that is characterized by unregulated or dysregulated cell growth or death. The term "cancer" includes solid tumors and blood-born tumors, whether malignant or benign.

[0063] The term “acceptable” with respect to a formulation, composition or ingredient, as used herein, means having no persistent detrimental effect on the general health of the subject being treated.

[0064] “API” refers to an active pharmaceutical ingredient.

[0065] The term “excipient” or “pharmaceutically acceptable excipient” means a pharmaceutically-acceptable material, composition, or vehicle, such as a liquid or solid filler, diluent, carrier, solvent, or encapsulating material. In one embodiment, each component is “pharmaceutically acceptable” in the sense of being compatible with the other ingredients of a pharmaceutical formulation, and suitable for use in contact with the tissue or organ of humans and animals without excessive toxicity, irritation, allergic response, immunogenicity, or other problems or complications, commensurate with a reasonable benefit / risk ratio. See, e.g., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed.; Lippincott Williams &Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed.; Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009.

[0066] The term “pharmaceutically acceptable salt” refers to a formulation of a compound that does not cause significant irritation to an organism to which it is administered and does not abrogate the biological activity and properties of the compound. In certain instances, pharmaceutically acceptable salts are obtained by reacting a compound described herein, with acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, salicylic acid and the like. In some instances, pharmaceutically acceptable salts are obtained by reacting a compound having acidic group described herein with a base to form a salt such as an ammonium salt, an alkali metal salt, such as a sodium or a potassium salt, an alkaline earth metal salt, such as a calcium or a magnesium salt, a salt of organic bases such as dicyclohexylamine, N-methyl-D-glucamine, tris (hydroxymethyl) methylamine, and salts with amino acids such as arginine, lysine, and the like, or by other methods previously determined. The pharmacologically acceptable salt s not specifically limited as far as it can be used in medicaments. Examples of a salt that the compounds described hereinform with a base include the following: salts thereof with inorganic bases such as sodium, potassium, magnesium, calcium, and aluminum; salts thereof with organic bases such as methylamine, ethylamine and ethanolamine; salts thereof with basic amino acids such as lysine and ornithine; and ammonium salt. The salts may be acid addition salts, which are specifically exemplified by acid addition salts with the following: mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid: organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, lactic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, methanesulfonic acid, and ethanesulfonic acid; acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid.

[0067] Compounds described herein can comprise one or more asymmetric centers, and thus can exist in various stereoisomeric forms, e.g., enantiomers and / or diastereomers. For example, the compounds described herein can be in the form of an individual enantiomer, diastereomer or geometric isomer (such as cis-and trans-isomer) , or can be in the form of a mixture of stereoisomers, including racemic mixtures and mixtures enriched in one or more stereoisomer. Isomers can be isolated from mixtures by methods known to those skilled in the art, including chiral high pressure liquid chromatography (HPLC) and the formation and crystallization of chiral salts; or preferred isomers can be prepared by asymmetric syntheses.

[0068] In addition, prodrugs are also included within the context of the present disclosure. The term "prodrug" as used herein refers to a compound which is converted in vivo to an active form thereof having a medical effect by, for example, hydrolysis in blood. Pharmaceutically acceptable prodrugs are described in T. Higuchi and V. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, A. C. S. Symposium Series, Vol. 14, Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, and D.Fleisher, S. Ramon and H. Barbra “Improved oral drug delivery: solubility limitations overcome by the use of prodrugs” , Advanced Drug Delivery Reviews (1996) 19 (2) 115-130, each is incorporated herein by reference.

[0069] A prodrug is any covalently bonded carrier which, when administered to a patient, releases the compound of formula (I) in vivo. Prodrugs are typically prepared by modifying functional groups in such a way that the modifications can be cleaved by routine manipulation or in vivo to yield the parent compound. Prodrugs include, for example, compounds disclosed herein wherein a hydroxy, amine or sulfhydryl group is bonded to any group which, when administered to a patient, can be cleaved to form a hydroxy, amine or sulfhydryl group. Thus, representative examples of prodrugs include, but are not limited to, acetate, formate and benzoate derivatives of alcohol, mercapto and amine functional groups of the compounds of formula (I) . Further, in the case of a carboxylic acid (-COOH) , an ester such as a methyl ester, an ethyl ester or the like can be used. The ester itself may be active and / or may hydrolyze under conditions in human bodies. Suitable pharmaceutically acceptable hydrolysable in vivo ester groups include those groups which readily decompose in the human body to release the parent acid or a salt thereof.

[0070] Also disclosed herein are all suitable isotopical derivertives of the compounds disclosed herein. An isotope derivative of a compound disclosed herein is defined as wherein at least one atom is replaced by an atom having the same atomic number but differing in atomic mass from the atomic mass typically found in nature. Examples of isotopes that can be listed as compounds disclosed herein include hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, fluorine, and chlorine isotopes, such as 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 18F, 31P, 32P, 35S and 36Cl, respectively. Certain isotopical derivertives of the compounds disclosed herein, such as the radioisotopes of3H and 14C, are also among them and are useful in the tissue distribution experiments of drugs and substrates. Tritium, i.e., 3H, and carbon-14, i.e., 14C, are easier to prepare and detect and are the first choice for isotopes. In addition, substitution with isotopes such as deuterium, i.e., 2H, has advantages in some therapies due to its good metabolic stability, for example, increased half-life in vivo or reduced dosage, and thus priority may be given in some cases. Isotopical derivertives of the compounds disclosed herein can be prepared by conventional procedures, for example by descriptive methods or by the preparations described in the Examples below, using appropriate isotopic derivatives of the appropriate reagents. The term “stable isotope” refers to those exist stably in nature.

[0071] The term “pharmaceutical composition” refers to a mixture of a compound described herein with other chemical components (referred to collectively herein as “excipients” ) , such as carriers, stabilizers, diluents, dispersing agents, suspending agents, and / or thickening agents. The pharmaceutical composition facilitates administration of the compound to an organism. Multiple techniques of administering a compound exist in the art including, but not limited to: rectal, oral, intravenous, aerosol, parenteral, ophthalmic, pulmonary, and topical administration.

[0072] The details of one or more embodiments of this disclosure are set forth in the description below. Other features and advantages of the invention will be apparent from the description, and from the claims.DETAILED DESCRIPTION

[0073] This disclosure is directed to inhibitors of Gasdermins, particularly Gasdermin E. Specifically, the disclosure is directed to a compound of Formula (I) , or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and use of the same in treating and / or preventing pro-inflammatory cell death related diseases.

[0074] Detailed Description of the Embodiments

[0075] In one aspect, the present disclosure provides a compound of Formula (I) :

[0076] wherein,

[0077] represents a single bond, or a double bond;

[0078] L is selected from C (O) O, C (O) NH, OC (O) , or NHC (O) ;

[0079] RE is selected from H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, or C (O) Ra;

[0080] X is selected from N or CRx;

[0081] Rx is selected from H, D, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl;

[0082] R1 is selected from H, D, CN, C (O) Ra, C (O) ORa, C (O) NRbRc, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, -C1-6 alkylene-S (O) 2Ra, -C1-6 alkylene-ORa, -C1-6 alkylene-NRbRc, C3-8 cycloalkyl, 4-to 10-membered heterocyclyl, C6-10 aryl, or 5-to 10-membered heteroaryl, each of which is optionally substituted with 1, 2, 3, 4, 5, or more R1s;

[0083] R1s is selected from H, D, CN, halo, OH, C1-6 alkoxyl, C1-6 haloalkoxyl, NH2, NHC1-6 alkyl, N (C1-6 alkyl) 2, C (O) Ra, S (O) Ra, S (O) 2Ra, S (NH) (O) Ra, OP (O) (OH) 2, NHS (O) Ra, NHS (O) 2Ra, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C3-8 cycloalkyl, 4-to 10-membered heterocyclyl, C6-10 aryl, or 5-to 10-membered heteroaryl, each of which is optionally substituted with 1 or 2 halo, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl;

[0084] R2 is selected from H, D, or halo;

[0085] R3 is selected from H, D, halo, ORa, NRbRc, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, or C (O) NH2;

[0086] R4 is selected from H, D, halo, or CN;

[0087] R5 is selected from H, D, halo, CN, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl;

[0088] Y is selected from C (O) , S (O) , or S (O) 2;

[0089] Ra, Rb, and Rc are independently selected from H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, -C0-4 alkylene-C3-8 cycloalkyl, -C0-4 alkylene-4-to 10-membered heterocyclyl, -C0-4 alkylene-C6-10 aryl, or -C0-4 alkylene-5-to 10-membered heteroaryl, or Rb, and Rc together with the atom to which they connected to form 4-to 10-membered heterocyclyl; each of which is optionally substituted with 1 or 2 halo, OH, C1-6 alkoxyl, C1-6 haloalkoxyl, NH2, NHC1-6 alkyl, N (C1-6 alkyl) 2, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl;

[0090] Rp and Rq are independently selected from H, D, CN, or halo;

[0091] or Rp, and Rq are linked together to form an extra bond;

[0092] RY is selected from H, D, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl;

[0093] wherein the groups mentioned above could be substituted with 1, 2, 3, 4, 5, or more deuterium, until perdeuterated;

[0094] or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[0095] In some embodiments,  represents a single bond; in some embodiments,  represents a double bond.

[0096] L

[0097] In some embodiments, L is C (O) O; in some embodiments, L is C (O) NH; in some embodiments, L is OC (O) ; in some embodiments, L is NHC (O) .

[0098] X

[0099] In some embodiments, X is N; in some embodiments, X is CRx.

[0100] In some embodiments, Rx is H; in some embodiments, Rx is D; in some embodiments, Rx is C1-6 alkyl; in some embodiments, Rx is C1-6 haloalkyl.

[0101] In some embodiments, RE is H; in some embodiments, RE is C1-6 alkyl; in some embodiments, RE is C1-6 haloalkyl; in some embodiments, RE is C (O) Ra.

[0102] R1, R1s, R2, R3, R4, R5

[0103] In some embodiments, R1 is H; in some embodiments, R1 is D; in some embodiments, R1 is CN; in some embodiments, R1 is C (O) Ra; in some embodiments, R1 is C (O) ORa; in some embodiments, R1 is C (O) NRbRc; in some embodiments, R1 is C1-6 alkyl; in some embodiments, R1 is C1-6 haloalkyl; in some embodiments, R1 is -C1-6 alkylene-S (O) 2Ra; in some embodiments, R1 is -C1-6 alkylene-ORa; in some embodiments, R1 is -C1-6 alkylene-NRbRc; in some embodiments, R1 is C3-8 cycloalkyl; in some embodiments, R1 is 4-to 10-membered heterocyclyl; in some embodiments, R1 is C6-10 aryl; in some embodiments, R1 is 5-to 10-membered heteroaryl; in some embodiments, each of above groups is optionally substituted with 1, 2, 3, 4, 5, or more R1s.

[0104] In some embodiments, R1s is H; in some embodiments, R1s is D; in some embodiments, R1s is CN; in some embodiments, R1s is halo; in some embodiments, R1s is OH; in some embodiments, R1s is C1-6 alkoxyl; in some embodiments, R1s is C1-6 haloalkoxyl; in some embodiments, R1s is NH2; in some embodiments, R1s is NHC1-6 alkyl; in some embodiments, R1s is N (C1-6 alkyl) 2; in some embodiments, R1s is C (O) Ra; in some embodiments, R1s is S (O) Ra; in some embodiments, R1s is S (O) 2Ra; in some embodiments, R1s is NHS (O) Ra; in some embodiments, R1s is S (NH) (O) Ra; in some embodiments, R1s is OP (O) (OH) 2; in some embodiments, R1s is NHS (O) 2Ra; in some embodiments, R1s is C1-6 alkyl; in some embodiments, R1s is C1-6 haloalkyl; in some embodiments, R1s is C3-8 cycloalkyl; in some embodiments, R1s is 4-to 10-membered heterocyclyl; in some embodiments, R1s is C6-10 aryl; in some embodiments, R1s is 5-to 10-membered heteroaryl; in some embodiments, each of groups is optionally substituted with 1 or 2 halo, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl.

[0105] In some embodiments, R2 is H; in some embodiments, R2 is D; in some embodiments, R2 is halo.

[0106] In some embodiments, R3 is H; in some embodiments, R3 is D; in some embodiments, R3 is halo; in some embodiments, R3 is ORa; in some embodiments, R3 is NRbRc; in some embodiments, R3 is C1-6 alkyl; in some embodiments, R3 is C1-6 haloalkyl; in some embodiments, R3 is C (O) NH2.

[0107] In some embodiments, R4 is H; in some embodiments, R4 is D; in some embodiments, R4 is halo; in some embodiments, R4 is CN.

[0108] In some embodiments, R5 is H; in some embodiments, R5 is D; in some embodiments, R5 is halo; in some embodiments, R5 is CN; in some embodiments, R5 is C1-6 alkyl; in some embodiments, R5 is C1-6 haloalkyl.

[0109] Y, Rp, Rq

[0110] In some embodiments, Y is C (O) ; in some embodiments, Y is S (O) ; in some embodiments, Y is S (O) 2.

[0111] In some embodiments, Rp is H; in some embodiments, Rp is D; in some embodiments, Rp is CN; in some embodiments, Rp is halo.

[0112] In some embodiments, Rq is H; in some embodiments, Rq is D; in some embodiments, Rq is CN; in some embodiments, Rq is halo.

[0113] In some embodiments, RY is H; in some embodiments, RY is D; in some embodiments, RY is C1-6 alkyl; in some embodiments, RY is C1-6 haloalkyl.

[0114] Ra, Rb, Rc

[0115] In some embodiments, Ra is H; in some embodiments, Ra is C1-6 alkyl; in some embodiments, Ra is C1-6 haloalkyl; in some embodiments, Ra is -C0-4 alkylene-C3-8 cycloalkyl; in some embodiments, Ra is -C0-4 alkylene-4-to 10-membered heterocyclyl; in some embodiments, Ra is -C0-4 alkylene-C6-10 aryl; in some embodiments, Ra is -C0-4 alkylene-5-to 10-membered heteroaryl.

[0116] In some embodiments, Rb is H; in some embodiments, Rb is C1-6 alkyl; in some embodiments, Rb is C1-6 haloalkyl; in some embodiments, Rb is -C0-4 alkylene-C3-8 cycloalkyl; in some embodiments, Rb is -C0-4 alkylene-4-to 10-membered heterocyclyl; in some embodiments, Rb is -C0-4 alkylene-C6-10 aryl; in some embodiments, Rb is -C0-4 alkylene-5-to 10-membered heteroaryl.

[0117] In some embodiments, Rc is H; in some embodiments, Rc is C1-6 alkyl; in some embodiments, Rc is C1-6 haloalkyl; in some embodiments, Rc is -C0-4 alkylene-C3-8 cycloalkyl; in some embodiments, Rc is -C0-4 alkylene-4-to 10-membered heterocyclyl; in some embodiments, Rc is -C0-4 alkylene-C6-10 aryl; in some embodiments, Rc is -C0-4 alkylene-5-to 10-membered heteroaryl.

[0118] In some embodiments, Rb, and Rc together with the atom to which they connected to form 4-to 10-membered heterocyclyl.

[0119] In some embodiments, each of above groups is optionally substituted with 1 or 2 halo, OH, C1-6 alkoxyl, C1-6 haloalkoxyl, NH2, NHC1-6 alkyl, N (C1-6 alkyl) 2, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl.

[0120] Detailed Description of the Embodiments

[0121] The present invention discloses novel heterocyclic compounds as inhibitors of GSDME.

[0122] General method for series A compounds:

[0123] Synthesis of intermediate

[0124] represents a single bond, or a double bond;

[0125] X is CH or N; R1 = H or C (O) NRbRc; R2, R3, R4 = H, F or CN.

[0126] Hydrolysis of intermediate I afforded II, which was reacted with various amines to obtain III. After removal of Boc, the resulted IV was coupled with the active carbonate intermediate to afford the target compounds V.

[0127] Example 1:

[0128] Preparation of 4- ( (E) -3-oxobut-1-en-1-yl) cyclohexyl (S) -6-fluoro-3- (2- ( ( (R) -1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (Compound A6)

[0129] Step 1: Synthesis of tert-butyl (R) - (1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) carbamate

[0130] To a solution of (R) -2- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) -3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanoic acid (800 mg, 2.51 mmol) in DMF (10 mL) , was added methylamine hydrochloride (183.32 mg, 2.76 mmol) , DIEA (971.50 mg, 7.52 mmol, 1.31 mL) and HATU (1.43 g, 3.76 mmol) . The mixture was stirred for 2 h at room temperature and then quenched by water (100 mL) . The aqueous phase was extracted with ethyl acetate (2×50 mL) . The organic layers were combined, washed with brine (2×50 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (ethyl acetate / petroleum ether = 1 / 10) to afford the title product (810 mg, 2.44 mmol, 97.3%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M+H] +333.1.

[0131] Step 2: Synthesis of (R) -2-amino-N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propenamide hydrochloride

[0132] To a solution of tert-butyl (R) - (1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) carbamate (810 mg, 2.44 mmol) in DCM (5 mL) was added hydrogen chloride (5 mL, 4 M in 1, 4-dioxane) . The mixture was stirred for 3 h at room temperature and concentrated under vacuum to afford the title compound (650 mg, 2.43 mmol, 99.6%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M+H] +233.1.

[0133] Step 3: Synthesis oftert-butyl 4- (1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene) piperidine-1-carboxylate

[0134] The mixture oftert-butyl 4-oxopiperidine-1-carboxylate (50 g, 250.95 mmol) , ethyl 2-cyanoacetate (28.39 g, 250.95 mmol, 26.71 mL) , NH4OAc (1.93 g, 25.09 mmol) and AcOH (1.51 g, 25.09 mmol) was co-evaporated with toluene (500 mL) at 110℃ for 16 h to remove water by Dean-Stark trap. The resulting mixture was extracted with ethyl acetate (3×300 mL) . The organic layers were combined, washed with saturated solution of sodium bicarbonate (3×300 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (ethyl acetate / petroleum ether = 1 / 10) to provide the title compound (62.5 g, 212.34 mmol, 84.6%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M-Boc+H] +295.1.

[0135] Step 4: Synthesis of tert-butyl 4- (1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethyl) -4- (3-fluorophenyl) piperidine-1-carboxylate

[0136] To a solution of CuCN (12.59 g, 134.54 mmol) in THF (300 mL) was added bromo- (3-fluorophenyl) magnesium (55.86 g, 280.28 mmol, 280.6 mL) dropwise at -50℃ under nitrogen atmosphere. The mixture was warmed to room temperature and stirred for 1 h. Then, the mixture was cooled to -50℃. Tert-butyl-4- (1-cyano-2-ethoxy-2-oxo-ethylidene) piperidine-1-carboxylate (33 g, 112.11 mmol) was added dropwise to the above mixture. The resulting mixture was stirred for additional 3 h at -50℃ and quenched with saturated solution of ammonium chloride (100 mL) at 0℃. After filtration, the filtrate was diluted with water (300 mL) and extracted with ethyl acetate (3×300 mL) . The organic layers were combined, washed with water (3×300 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (petroleum ether / ethyl acetate = 1 / 5) to provide the title compound (37.2 g, 95.28 mmol, 85%yield) as yellow oil. MS (ESI) m / z [M-Boc+H] +291.2.

[0137] Step 5: Synthesis oftert-butyl 4- (cyanomethyl) -4- (3-fluorophenyl) piperidine-1-carboxylate

[0138] The solution oftert-butyl 4- (1-cyano-2-ethoxy-2-oxo-ethyl) -4- (3-fluorophenyl) piperidine-1-carboxylate (37.2 g, 95.28 mmol) and lithium chloride (5.65 g, 133.39 mmol) in water (10 mL) and DMSO (400 mL) was stirred for 3 h at 160℃. The reaction was quenched with ice water at 0℃. The resulting mixture was extracted with ethyl acetate (3×300 mL) . The organic layers were combined, washed with water (3×300 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was flash chromatography on silica gel (ethyl acetate / petroleum ether = 1 / 7) to afford the title compound (27.34 g, 85.87 mmol, 90.1%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M-Boc+H] +219.1.

[0139] Step 6: Synthesis of 2- (1- (tert-butoxycarbonyl) -4- (3-fluorophenyl) piperidin-4-yl) acetic acid

[0140] The solution oftert-butyl-4- (cyanomethyl) -4- (3-fluorophenyl) piperidine-1-carboxylate (27.34 g, 85.87 mmol) and NaOH (44.65 g, 1.12 mol) in water (60 mL) and EtOH (300 mL) was stirred for 72 h at 90℃. The resulting mixture was concentrated under vacuum. The mixture was diluted with water (300 mL) and extracted with ethyl acetate (3×300 mL) . The organic layers were combined, washed with water (3×300 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum to afford the title compound (28.0 g, 82.99 mmol, 96.6%yield) as yellow oil. The by-product (de-Boc, about 10%) in water could be transformed into product through adding di-tert-butyl dicarbonate (5.0 eq) . MS (ESI) m / z [M-t-Bu+H] +282.1.

[0141] Step 7: Synthesis of tert-butyl 6-fluoro-3-oxo-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate

[0142] The solution of 2- [1-tert-butoxycarbonyl-4- (3-fluorophenyl) -4-piperidyl] acetic acid (22.37 g, 66.30 mmol) in trifluoromethanesulfonic acid (150 mL) was stirred for 16 h at 50℃. pH value of the solution was adjusted to 10 with NaOH (1.0 M) . To the above mixture was added di-tert-butyl dicarbonate (21.68 g, 99.46 mmol) dropwise over 2 min at room temperature. The resulting mixture was stirred for additional 16 h at room temperature and extracted with DCM (3×200 mL) . The organic layers were combined, washed with water (3×300 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (ethyl acetate / petroleum ether = 1 / 5) to afford the title compound (16.5 g, 51.66 mmol, 77.9%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.78-7.55 (m, 2H) , 7.37-7.16 (m, 1H) , 4.00 (dd, J = 18.1, 11.1 Hz, 2H) , 2.62-2.03 (m, 4H) , 2.05-1.76 (m, 2H) , 1.57-1.30 (m, 11H) . MS (ESI) m / z [M+H] +320.1.

[0143] Step 8: Synthesis of the mixture products of tert-butyl 3- (2-ethoxy-2-oxoethylidene) -6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate and tert-butyl 3- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -6-fluorospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate

[0144] The solution oftert-butyl 6-fluoro-3-oxo-spiro [indane-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (13.2 g, 41.33 mmol) , ethyl 2-diethoxyphosphorylacetate (16.68 g, 74.40 mmol, 14.83 mL) and potassium tert-butoxide (6.94 g, 62.00 mmol) in THF (150 mL) was stirred for 16 h at 70℃ under nitrogen atmosphere. The reaction was quenched with saturated solution of ammonium chloride (50 mL) at 0℃. The mixture was diluted with water (150 mL) and extracted with ethyl acetate (3×100 mL) . The organic layers were combined, washed with water (3×100 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (ethyl acetate / petroleum ether = 1 / 5) to afford the title compound (13.58 g, 34.87 mmol, 84.4%yield) as colorless oil. MS (ESI) m / z [M-t-Bu+H] +334.2, [M+Na] +412.2.

[0145] Step 9: Synthesis of tert-butyl 3- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate

[0146] To a solution of the above products (13.58 g, 34.89 mmol) in THF (200 mL) was added Pd / C (617.47 mg, 10%) . The mixture was stirred for 16 h at 25℃ under hydrogen atmosphere. The resulting mixture was filtered. The cake was washed with DCM. The filtrate was concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (ethyl acetate / petroleum ether = 1 / 5) to afford the title compound (9.94 g, 25.42 mmol, 72.9%yield) as colorless oil. MS (ESI) m / z [M+Na] +414.2.

[0147] Step 10: Synthesis of tert-butyl (R) -3- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate and tert-butyl (S) -3- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate

[0148] Tert-butyl 3- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (9.94 g, 25.42 mmol) was separated by chiral separation under the following separation conditions:

[0149] Apparatus: SFC Thar prep 80

[0150] Column: CHIRALPAK AD-H, 250 mm× 20 mm, 5 μm

[0151] Modifier: 25%MeOH (0.2%NH4OH)

[0152] Total Flow: 40 g / min

[0153] Peak 1: tR = 2.73 min, R isomer (3.85 g, 9.82 mmol, 40.2%yield) . MS (ESI) m / z [M+Na] +414.2.

[0154] Peak 2: tR = 3.16 min, the configuration was determined by single-crystal X-ray diffraction as S configuration (4.14 g, 10.56 mmol, 41.56%yield) . MS (ESI) m / z [M+Na] +414.2.

[0155] Step 11: Synthesis of (S) -2- (1'- (tert-butoxycarbonyl) -6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetic acid

[0156] To a solution of tert-butyl (S) -3- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (80 mg, 204.36 μmol) in MeOH (3 mL) and water (3 mL) added NaOH (16.35 mg, 408.71 μmol) . The mixture was stirred for 3 h at room temperature. pH value of the solution was adjusted to 6 with citric acid. The mixture was extracted with ethyl acetate (2×20 mL) , washed with brine (2×20 mL) and dried over anhydrous sodium sulfate. After filtering, the solvent was evaporated under vacuum to get the title compound (70 mg, 192.61 μmol, 94.3%yield) as light-yellow oil. MS (ESI) m / z [M+H] +364.2.

[0157] Step 12: Synthesis of tert-butyl (S) -6-fluoro-3- (2- ( ( (R) -1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate

[0158] To a solution of (R) -2-amino-N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propenamide hydrochloride (100 mg, 373.62 μmol) in acetonitrile (5 mL) was added (S) -2- (1'- (tert-butoxycarbonyl) -6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetic acid (135.78 mg, 373.62 μmol) , T3P (356.63 mg, 560.42 μmol, 50%in ethyl acetate) , and DIEA (144.82 mg, 1120.86 μmol) . The mixture was stirred for 4 h at room temperature, and then quenched by water (30 mL) . The mixture was extracted with ethyl acetate (2×20 mL) , washed with brine (2×20 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (ethyl acetate / petroleum ether = 1 / 10) to get the title compound (180 mg, 311.63 μmol, 83.4%yield) as yellow oil. MS (ESI) m / z [M+H] +578.3.

[0159] Step 13: Synthesis of (R) -2- (2- ( (S) -6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetamido) -N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propenamide hydrochloride

[0160] To a solution of tert-butyl (S) -6-fluoro-3- (2- ( ( (R) -1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (180.00 mg, 311.63 μmol) in DCM (3 mL) was added hydrogen chloride (3 mL, 4 M in 1, 4-dioxane) . The mixture was stirred for 4 h at room temperature and concentrated under vacuum to get the title compound (150 mg, 292.43 μmol, 93.8%yield) as yellow oil. MS (ESI) m / z [M+H] +478.2.

[0161] Step14: Synthesis of methyl 4- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) cyclohexane-1-carboxylate

[0162] The solution of methyl 4-hydroxycyclohexane-1-carboxylate (1 g, 6.32 mmol) , TBSCl (729 mg, 8.85 mmol) and imidazole (861 mg, 12.65 mmol) in DMF (10 mL) was stirred for 2 h at room temperature. The resulting mixture was diluted with ethyl acetate (100 mL) and washed with water (3×20 mL) . The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate. After filtration, the filtrate was concentrated under vacuum to afford the title compound (1.5 g, 5.51 mmol, 87.1%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M+Na] +295.2.

[0163] Step15: Synthesis of (4- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) cyclohexyl) methanol

[0164] To a stirred solution of methyl 4- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) cyclohexane-1-carboxylate (1 g, 3.67 mmol) in THF (15 mL) was added lithium aluminum hydride (279 mg, 7.34 mmol) at 0℃ under nitrogen atmosphere. The mixture was stirred for 2 h at room temperature and quenched with sodium sulfate decahydrate at 0℃. After filtration, the filtrate was concentrated under vacuum to afford the title compound (750 mg, 3.07 mmol, 83.6%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M+Na] +267.2.

[0165] Step16: Synthesis of 4- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) cyclohexane-1-carbaldehyde

[0166] The solution of (4- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) cyclohexyl) methanol (840 mg, 3.44 mmol) and Dess-Martin periodinane (2.19 g, 5.15 mmol) in DCM (15 mL) was stirred for 2 h at room temperature. The reaction was quenched with saturated solution of sodium thiosulfate and sodium bicarbonate. The mixture was diluted with water (20 mL) and extracted with DCM (3×20 mL) . The combined organic layers were washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate. After filtration, the filtrate was concentrated under vacuum to afford the title compound (650 mg, 2.68 mmol, 78%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M+H] +364.2, [M+Na] +265.1.

[0167] Step17: Synthesis of (E) -4- (4- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) cyclohexyl) but-3-en-2-one

[0168] The solution of 4- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) cyclohexane-1-carbaldehyde (500 mg, 2.06 mmol) and 1- (triphenyl-phosphanylidene) propan-2-one (985 mg, 3.09 mmol) in toluene (10 mL) was stirred for 16 h at 90℃. The resulting mixture was diluted with water (20 mL) and extracted with ethyl acetate (3×30 mL) . The combined organic layers were washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate. After filtration, the filtrate was concentrated under vacuum to afford the title compound (510 mg, 1.81 mmol, 87.5%yield) as colorless oil. MS (ESI) m / z [M+Na] +305.1.

[0169] Step18: Synthesis of (E) -4- (4-hydroxycyclohexyl) but-3-en-2-one

[0170] The solution of (E) -4- (4- ( (tert-butyldimethylsilyl) oxy) cyclohexyl) but-3-en-2-one

[0171] (100 mg, 353.99 μmol) and tetrabutylammonium fluoride (525 μL, 1.0 M in THF) in THF (3 mL) was stirred for 2 h at room temperature. The mixture was diluted with ethyl acetate (50 mL) and washed with water (3×20 mL) . The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate. After filtration, the filtrate was concentrated under vacuum to afford the title compound (50 mg, 297.21 μmol, 84%yield) as yellow oil. MS (ESI) m / z [M+H] +169.2, [M+Na] +191.2.

[0172] Step19: Synthesis of (E) -4- (3-oxobut-1-en-1-yl) cyclohexyl carbonochloridate

[0173] To a stirred solution of (E) -4- (4-hydroxycyclohexyl) but-3-en-2-one (50 mg, 297.21 μmol) and DIEA (115 mg, 891.47 μmol) in THF (2 mL) was added trichloromethyl carbonochloridate (76.44 mg, 386.37 μmol, 46.64 μL) dropwise at 0℃ under nitrogen atmosphere. The mixture was stirred for 20 min at 0℃. The reaction mixture was used directly for the next step without further purification.

[0174] Step 20: Synthesis of 4- ( (E) -3-oxobut-1-en-1-yl) cyclohexyl (S) -6-fluoro-3- (2- ( ( (R) -1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (Compound A6)

[0175] The solution of (R) -2- (2- ( (S) -6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetamido) -N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propenamide (50 mg, 104.71 μmol) and sodium bicarbonate (44 mg, 523.81 μmol) in water (2 mL) and THF (2 mL) was stirred for 10 min at 0℃. To the above mixture was added the solution of (E) -4- (3-oxobut-1-en-1-yl) cyclohexyl carbonochloridate (36 mg, 156.06 μmol) in THF dropwise over 5 min at 0℃. The resulting mixture was stirred for additional 30 min at 0℃. The resulting mixture was diluted with water (20 mL) and extracted with ethyl acetate (3×30 mL) . The combined organic layers were washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate. After filtration, the filtrate was concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel on octadecylsilyl with the following conditions: column, C18 silica gel; mobile phase, CH3CN in water, 5%to 40%gradient in 15 min; detector, UV 254 nm to afford the title compound: (4.18 mg, 6.22 μmol, 5.9%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.23 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 7.99-7.91 (m, 1H) , 7.26-7.16 (m, 2H) , 7.07 (dd, J = 9.5, 2.5 Hz, 1H) , 6.93-6.86 (m, 1H) , 6.85-6.77 (m, 2H) , 6.01 (dd, J = 16.2, 1.3 Hz, 1H) , 4.62-4.45 (m, 2H) , 4.06-3.89 (m, 2H) , 3.41-3.32 (m, 1H) , 3.02 (dd, J = 13.7, 4.5 Hz, 1H) , 2.95-2.70 (m, 4H) , 2.65-2.54 (m, 4H) , 2.31-2.13 (m, 6H) , 2.04-1.89 (m, 3H) , 1.84-1.75 (m, 2H) , 1.52-1.32 (m, 7H) . MS (ESI) m / z [M+H] +672.3, [M+Na] +694.3. Example 2:

[0176] Preparation of (E) -4- (3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl (R) -6-fluoro-3- (2- ( (1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) spiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (Compound A7)

[0177] Step 1: Synthesis of 2- (1'- (tert-butoxycarbonyl) -6-fluorospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetic acid

[0178] To a solution oftert-butyl 3- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -6-fluorospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (80 mg, 205.41 μmol) in MeOH (3 mL) and water (3 mL) was added lithium hydroxide monohydrate (17.25 mg, 410.83 μmol) . The mixture was stirred for 2 h at room temperature. pH value of the solution was adjusted to 6 with citric acid. The mixture was extracted with ethyl acetate (2×20 mL) , washed with brine (2×20 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated to afford the crude title compound (70 mg, 193.69 μmol, 94.3%yield) as yellow oil. MS (ESI) m / z [M+Na] +384.2.

[0179] Step 2: Synthesis of tert-butyl (R) -6-fluoro-3- (2- ( (1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) spiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate

[0180] To a solution of 2- (1'- (tert-butoxycarbonyl) -6-fluorospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetic acid (70 mg, 193.69 μmol) in acetonitrile (5 mL) was added (R) -2-amino-N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanamide hydrochloride (51.84 mg, 193.69 μmol) , DIEA (75.1 mg, 581.07 μmol) , and T3P (184.91 mg, 290.53 μmol, 50%in ethyl acetate) . The mixture was stirred for 3 h at room temperature and quenched by water (30 mL) . The aqueous phase was extracted with ethyl acetate (2×20 mL) . The combined organic layer was washed with brine (2×20 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (ethyl acetate / petroleum ether = 1 / 10) to afford the title compound (70 mg, 121.61 μmol, 62.8%yield) as yellow oil. MS (ESI) m / z [M+H] +576.2.

[0181] Step 3: Synthesis of (R) -2- (2- (6-fluorospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetamido) -N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanamide hydrochloride

[0182] To a solution of tert-butyl (R) -6-fluoro-3- (2- ( (1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) spiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (70 mg, 121.61 μmol) in DCM (5 mL) was added hydrogen chloride (1 mL, 4 M in 1, 4-dioxane, ) . The mixture was stirred for 3 h at room temperature and concentrated under vacuum to dryness to afford the title compound (60 mg, 117.43 μmol, 96.6%yield) as a gray solid. MS (ESI) m / z [M+H] +476.1.

[0183] Step 4: Synthesis of (E) -4- (3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl (R) -6-fluoro-3- (2- ( (1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) spiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (Compound A7)

[0184] To a solution of (R) -2- (2- (6-fluorospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetamido) -N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanamide hydrochloride (60 mg, 117.43 μmol) in THF (3 mL) and water (3 mL) was added sodium bicarbonate (48.15 mg, 587.16 μmol) and €-4- (3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl carbonochloridate (31.66 mg, 140.92 μmol, solution in 1.5 mL THF) at 0℃. The mixture was stirred for 20 min at 0℃ and quenched by water (30 mL) . The aqueous phase was extracted with ethyl acetate (2×20 mL) . The combined organic layers were washed with brine (2×20 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (DCM / MeOH = 20 / 1) to give a crude product which was purified by Prep-HPLC (column: Waters Xbridge Prep OBD C18 150× 40 mm× 10 μm; mobile phase: [water (FA) -CH3CN] ; CH3CN: 25%-65%, 8 min) to afford the title compound (63.1 mg, 95.08 μmol, 80.9%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.34 (d, J = 8.6 Hz, 1H) , 8.02-7.94 (m, 1H) , 7.80-7.74 (m, 2H) , 7.65 (d, J = 16.3 Hz, 1H) , 7.42 (dd, J = 9.2, 2.4 Hz, 1H) , 7.29-7.23 (m, 2H) , 7.16-7.06 (m, 2H) , 7.04 (dd, J = 8.3, 5.2 Hz, 1H) , 6.91 (td, J = 8.9, 2.4 Hz, 1H) , 6.83-6.74 (m, 2H) , 4.51 (ddd, J = 10.4, 8.5, 4.4 Hz, 1H) , 4.26 (d, J = 13.7 Hz, 1H) , 4.12 (d, J = 13.4 Hz, 1H) , 3.43-3.34 (m, 3H) , 3.25-3.13 (m, 1H) , 3.00 (dd, J = 13.8, 4.4 Hz, 1H) , 2.76 (dd, J = 13.9, 10.4 Hz, 1H) , 2.61 (d, J = 4.5 Hz, 3H) , 2.34 (s, 3H) , 2.17-2.01 (m, 2H) , 1.24-1.16 (m, 2H) . MS (ESI) m / z [M+H] +664.1, [M+Na] +686.1.

[0185] Example 3:

[0186] Preparation of (E) -4- (3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl (R) -5-fluoro-1- (2- ( (1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) spiro [indoline-3, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (Compound A8)

[0187] Step 1: Synthesis oftert-butyl 5-fluoro-2-oxospiro [indoline-3, 4'-piperidine] -1'-carboxylate

[0188] To a stirred solution of 5-fluoroindolin-2-one (3.0 g, 19.85 mmol) in THF (45 mL) was added LHMDS (59.55 mL, 1 M solution in THF) dropwise at -78℃ under nitrogen atmosphere. The mixture was stirred at -78℃ for 90 min. Then a solution oftert-butyl bis (2-chloroethyl) carbamate (4.81 g, 19.85 mmol) in THF (22.5 mL) was added to the above mixture at -78℃. The mixture was warmed to room temperature and stirred for 18 h. The mixture was quenched with saturated solution of ammonium chloride (60 mL) and extracted with ethyl acetate (3×35 mL) . The combined organic layers were washed with brine (2×50 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (ethyl acetate / petroleum ether = 1 / 3) to afford the title compound (830 mg, 2.59 mmol, 13.1%yield) as a light yellow solid. MS (ESI) m / z [M+Na] +343.2.

[0189] Step 2: Synthesis oftert-butyl 5-fluorospiro [indoline-3, 4'-piperidine] -1'-carboxylate

[0190] To a solution of tert-butyl 5-fluoro-2-oxospiro [indoline-3, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (800 mg, 2.50 mmol) in THF (10 mL) was added borane-tetrahydrofuran complex (5 mL, 1 M in THF) at 0℃. The mixture was stirred overnight at 50℃ and cooled down to rt. The reaction quenched by EtOH (10 mL) and then stirred for 3 h at 80℃. The mixture was concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (DCM / MeOH = 20 / 1) to afford the title compound (510 mg, 1.66 mmol, 66.7%yield) as light-yellow oil. MS (ESI) m / z [M+H] +307.1, [M+Na] +329.1.

[0191] Step 3: Synthesis oftert-butyl 5-fluoro-1- (2-methoxy-2-oxoethyl) spiro [indoline-3, 4'-piperidine] -1'-carboxylate

[0192] To a solution oftert-butyl 5-fluorospiro [indoline-3, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (240 mg, 783.36 μmol) in THF (10 mL) was added methyl 2-bromoacetate (239.71 mg, 1.57 mmol) and triethylamine (237.80 mg, 2.35 mmol) . The mixture was stirred for 2 days at room temperature. The solvent was evaporated to dryness under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (ethyl acetate / petroleum ether = 1 / 4) to afford the title compound (120 mg, 317.09 μmol, 40.5%yield) . MS (ESI) m / z [M+H] +379.2, [M+Na] +401.1.

[0193] Step 4: Synthesis of 2- (1'- (tert-butoxycarbonyl) -5-fluorospiro [indoline-3, 4'-piperidin] -1-yl) acetic acid

[0194] To a solution of tert-butyl 5-fluoro-1- (2-methoxy-2-oxoethyl) spiro [indoline-3, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (100 mg, 264.24 μmol) in MeOH (3 mL) and water (3 mL) was added sodium hydroxide (21.14 mg, 528.49 μmol) . The mixture was stirred for 2 h at room temperature. pH value of the solution was adjusted to 6 with citric acid. The mixture was extracted with ethyl acetate (2×20 mL) , washed with brine (2×20 mL) , and dried over anhydrous sodium sulfate. After filtration, the filtrate was concentrated to dryness under vacuum to afford the title compound (86 mg, 236.00 μmol, 89.3%yield) as yellow oil. MS (ESI) m / z [M-H] -363.2.

[0195] Step 5: Synthesis of tert-butyl (R) -5-fluoro-1- (2- ( (1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) spiro [indoline-3, 4'-piperidine] -1'-carboxylate

[0196] To a solution of 2- (1'- (tert-butoxycarbonyl) -5-fluorospiro [indoline-3, 4'-piperidin] -1-yl) acetic acid (43.32 mg, 118.88 μmol) , (R) -2-amino-N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanamide hydrochloride (35 mg, 130.77 μmol) and DIEA (76.82 mg, 594.39 μmol) in acetonitrile (5 mL) was added T3P (113.5 mg, 178.32 μmol, 50%in ethyl acetate) dropwise at 0℃. The mixture was stirred at room temperature for 1 h and then quenched by water (20 mL) . The mixture was extracted with ethyl acetate (3×15 mL) , washed with brine (2×15 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (DCM / MeOH = 15 / 1) to afford the title compound (46 mg, 79.50 μmol, 66.9%yield) as a yellow solid. MS (ESI) m / z [M+Na] +601.1.

[0197] Step 6: Synthesis of (R) -2- (2- (5-fluorospiro [indoline-3, 4'-piperidin] -1-yl) acetamido) -N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanamide hydrochloride

[0198] To a solution of tert-butyl (R) -5-fluoro-1- (2- ( (1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) spiro [indoline-3, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (46 mg, 79.50 μmol) in DCM (5 mL) was added hydrogen chloride (1 mL, 4 M in 1, 4-dioxane) . The mixture was stirred at room temperature for 2 h. The solvent was evaporated under vacuum to afford the title compound (36 mg, 70.05 μmol, 88.1%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M+H] +479.2.

[0199] Step 7: Synthesis of (R) -2- (2- (5-fluorospiro [indoline-3, 4'-piperidin] -1-yl) acetamido) -N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanamide hydrochloride _ (Compound A8)

[0200] To a solution of (R) -2- (2- (5-fluorospiro [indoline-3, 4'-piperidin] -1-yl) acetamido) -N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanamide hydrochloride (40 mg, 77.83 μmol) in THF (5 mL) and water (5 mL) was added sodium bicarbonate (32.69 mg, 389.15 μmol) and (E) -4- (3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl carbonochloridate (17.48 mg, 77.83 μmol, solution in THF) at 0℃. The mixture was stirred for 30 min at 0℃ and diluted with water (20 mL) . The mixture was extracted with ethyl acetate (3×15 mL) , washed with brine (2×15 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (DCM / MeOH = 20 / 1) to afford the title compound (10.52 mg, 15.78 μmol, 20.3%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.10 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 8.01-7.93 (m, 1H) , 7.80-7.72 (m, 2H) , 7.64 (d, J = 16.4 Hz, 1H) , 7.27-7.20 (m, 2H) , 7.18-7.08 (m, 2H) , 7.03 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1H) , 6.79 (d, J = 16.4 Hz, 1H) , 6.69 (td, J = 9.0, 2.6 Hz, 1H) , 6.16 (dd, J = 8.6, 4.2 Hz, 1H) , 4.57-4.47 (m, 1H) , 4.20-3.94 (m, 2H) , 3.76-3.57 (m, 2H) , 3.43-3.37 (m, 1H) , 3.31-3.25 (m, 1H) , 3.20-2.89 (m, 3H) , 2.86-2.75 (m, 1H) , 2.61 (d, J = 4.5 Hz, 3H) , 2.34 (s, 3H) , 1.97-1.62 (m, 4H) . MS (ESI) m / z [M+H] +667.3, [M+Na] +689.2.

[0201] Example 4:

[0202] Preparation of 4- ( (E) -3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl (S) -2- (2- ( ( (R) -1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -8-azaspiro [4.5] decane-8-carboxylate (Compound A10)

[0203] Step 1: Synthesis of tert-butyl (E) -2- (2-ethoxy-2-oxoethylidene) -8-azaspiro [4.5] decane-8-carboxylate

[0204] To a solution of ethyl 2-diethoxyphosphorylacetate (531.33 mg, 2.37 mmol) in THF (5 mL) was added KHMDS (1 M in THF, 551.19 mg, 2.76 mmol, 625.64 μL) at 0℃. The mixture was stirred for 45 min. Then, tert-butyl 2-oxo-8-azaspiro [4.5] decane-8-carboxylate (500 mg, 1.97 mmol, solution in 10 mL THF) was added to the above mixture. The mixture was stirred for 1 h at 0℃. Then, the mixture was stirred overnight at room temperature. The reaction was quenched using saturated solution of ammonium chloride (30 mL) and extracted with ethyl acetate (2×20 mL) . The combined organic layers were washed with brine (2×20 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (DCM / MeOH = 20 / 1) to afford the title compound (340 mg, 1.05 mmol, 53.3%yield) as light-yellow oil. MS (ESI) m / z [M+Na] +346.2.

[0205] Step 2: Synthesis oftert-butyl 2- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -8-azaspiro [4.5] decane-8-carboxylate

[0206] To a solution of tert-butyl (E) -2- (2-ethoxy-2-oxoethylidene) -8-azaspiro [4.5] decane-8-carboxylate (340 mg, 1.05 mmol) in THF (10 mL) was added Pd / C (127.67 mg, 10%) . The mixture was stirred overnight at room temperature under hydrogen atmosphere (1 atm) . After filtration, the filtrate was concentrated to dryness under vacuum to afford the title compound (320 mg, 983.28 μmol, 93.5%yield) as light-yellow oil. MS (ESI) m / z [M+Na] +348.1.

[0207] Step 3: Synthesis of 2- (8- (tert-butoxycarbonyl) -8-azaspiro [4.5] decan-2-yl) acetic acid

[0208] To a solution of tert-butyl 2- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -8-azaspiro [4.5] decane-8-carboxylate (340 mg, 1.04 mmol) in MeOH (5 mL) and water (5 mL) was added sodium hydroxide (83.33 mg, 2.08 mmol) . The mixture was stirred for 2 h at room temperature. pH value of the solution was adjusted to 6 with citric acid. The mixture was extracted with ethyl acetate (2×20 mL) . The combined organic layers were washed with brine (2×20 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated to dryness under vacuum to afford the title compound (300 mg, 1.01 mmol, 96.6%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M-H] -296.2, [M+Na] +320.1.

[0209] Step 4: Synthesis of tert-butyl (R) -2- (2- ( ( (R) -1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -8-azaspiro [4.5] decane-8-carboxylate and tert-butyl (S) -2- (2- ( ( (R) -1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -8-azaspiro [4.5] decane-8-carboxylate

[0210] To a solution of 2- (8- (tert-butoxycarbonyl) -8-azaspiro [4.5] decan-2-yl) acetic acid (150 mg, 504.39 μmol) in acetonitrile (20 mL) was added (R) -2-amino-N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanamide hydrochloride (135.00 mg, 504.39 μmol) , DIEA (325.94 mg, 2.52 mmol, 439.27 μL) and T3P (240.73 mg, 756.59 μmol, 50%in ethyl acetate) at 0℃. The mixture was stirred for 2 h at room temperature and quenched by water (50 mL) . The aqueous phase was extracted with ethyl acetate (2×30 mL) , washed with brine (2×20 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by Prep-HPLC (water (0.05%FA)  / acetonitrile = 20 / 1) to afford the title compound:

[0211] Peak 1: tR = 5.35 min, the configuration was determined by biological data as R configuration (65 mg, 127.06 μmol, 25.2%yield) . MS (ESI) m / z [M+Na] +534.1.

[0212] Peak 2: tR = 5.52 min, the configuration was determined by biological data as S configuration (60 mg, 117.28 μmol, 23.3%yield) . MS (ESI) m / z [M+Na] +534.1.

[0213] Step 5: Synthesis of (R) -2- (2- ( (S) -8-azaspiro [4.5] decan-2-yl) acetamido) -N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanamide hydrochloride

[0214] To a solution of tert-butyl (S) -2- (2- ( ( (R) -1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -8-azaspiro [4.5] decane-8-carboxylate (60 mg, 117.28 μmol) in DCM (10 mL) was added hydrogen chloride (1 mL, 4 M in 1, 4-dioxane) . The mixture was stirred for 3 h at room temperature. The solvent was evaporated under vacuum to afford the title compound (41 mg, 91.74 μmol, 78.22%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M+H] +412.2.

[0215] Step 6: Synthesis of (R) -2- (2- ( (S) -8-azaspiro [4.5] decan-2-yl) acetamido) -N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanamide hydrochloride (Compound A10)

[0216] To a solution of (R) -2- (2- ( (S) -8-azaspiro [4.5] decan-2-yl) acetamido) -N-methyl-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanamide (50 mg, 121.52 μmol) in THF (5 mL) and water (5 mL) was added sodium bicarbonate (51.04 mg, 607.59 μmol) and (E) -4- (3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl carbonochloridate (30.03 mg, 133.67 μmol, solution in 1.5 mL THF) at 0℃. The mixture was stirred for 1 h at 0℃ and then diluted with water (30 mL) . The mixture was extracted with ethyl acetate (2×20 mL) . The combined organic layers were washed with brine (2×20 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by Prep-HPLC to afford the title compound (21.1 mg, 35.19 μmol, 29%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.05 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.94-7.86 (m, 1H) , 7.77-7.71 (m, 2H) , 7.63 (d, J = 16.4 Hz, 1H) , 7.23-7.14 (m, 4H) , 6.78 (d, J = 16.4 Hz, 1H) , 4.50 (ddd, J = 11.0, 8.8, 4.2 Hz, 1H) , 3.49 (br. s, 2H) , 3.35 (br. s, 2H) , 3.30-3.21 (m, 1H) , 3.02 (dd, J = 13.9, 4.3 Hz, 1H) , 2.70 (dd, J = 13.8, 11.0 Hz, 1H) , 2.60 (d, J = 4.6 Hz, 3H) , 2.33 (s, 3H) , 2.14-2.01 (m, 3H) , 1.65-1.52 (m, 1H) , 1.51-1.28 (m, 7H) , 1.21-1.07 (m, 1H) . MS (ESI) m / z [M+H] +600.1, [M+Na] +622.1.

[0217] Example 5:

[0218] Preparation of 4- ( (E) -3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl (R) -6-fluoro-3- ( (S) -2, 2, 5-trimethyl-4, 9, 12-trioxo-10- (3, 4, 5-trifluorobenzyl) -3-oxa-5, 8, 11-triazatridecan-13-yl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (Compound A26)

[0219] Step 1: Synthesis of (R) -2- (6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetic acid hydrochloride

[0220] To a solution of (R) -2- (1'- (tert-butoxycarbonyl) -6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetic acid (100 mg, 275.16 μmol) in DCM (5 mL) was added hydrogen chloride (1 mL, 4 M in 1, 4-dioxane) . The mixture was stirred for 4 h at room temperature. The solvent was evaporated under vacuum to get the title compound (80 mg, 267.77 μmol, 97.3%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M+H] +264.1.

[0221] Step 2: Synthesis of (R, E) -2- (6-fluoro-1'- ( (4- (3-oxobut-1-en-1-yl) phenoxy) carbonyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetic acid

[0222] To a solution of (R) -2- (6-fluoro-2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetic acid hydrochloride (46 mg, 153.97 μmol) in THF (4 mL) and water (4 mL) was added sodium bicarbonate (64.68 mg, 769.85 μmol) and (E) -4- (3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl carbonochloridate (solution in 1.5 mL THF ) at 0℃. The mixture was stirred for 30 min at 0℃ and then diluted with water (30 mL) . The aqueous phase was extracted with ethyl acetate (2×20 mL) , washed with brine (2×20 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by Prep-HPLC to get the title compound (53 mg, 117.39 μmol, 76.2%yield) as yellow oil. MS (ESI) m / z [M-H] -450.2.

[0223] Step 3: Synthesis of methyl (S) -2- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) -3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanoate

[0224] To a solution of (S) -2- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) -3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanoic acid (100 mg, 313.21 μmol) in DMF (3 mL) was added potassium carbonate (86.57 mg, 626.42 μmol) and iodomethane (53.37 mg, 375.85 μmol) at room temperature. The mixture was stirred overnight at 30℃ and quenched by water (50 mL) . The aqueous phase was extracted with ethyl acetate (2×20 mL) , washed with brine (2×20 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (DCM / MeOH = 20 / 1) to get the title compound (86 mg, 258.02 μmol, 82.4%yield) as light-yellow oil. MS (ESI) m / z [M+H] +334.3.

[0225] Step 4: Synthesis of methyl (S) -2-amino-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanoate hydrochloride

[0226] To a solution of methyl (S) -2- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) -3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanoate (50 mg, 150.01 μmol) in DCM (6 mL) was added hydrogen chloride (1 mL, 4 M in 1, 4-dioxane) . The mixture was stirred for 3 h at room temperature. The solvent was evaporated under vacuum to get the title compound (36 mg, 89.3%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M+H] +234.2.

[0227] Step 5: Synthesis of 4- ( (E) -3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl (R) -6-fluoro-3- (2- ( ( (S) -1-methoxy-1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate

[0228] To a solution of methyl (S) -2-amino-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanoate hydrochloride (36 mg, 134.01 μmol) in acetonitrile (6 mL) was added (R, E) -2- (6-fluoro-1'- ( (4- (3-oxobut-1-en-1-yl) phenoxy) carbonyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetic acid (60.50 mg, 134.01 μmol) , DIEA (86.60 mg, 670.04 μmol, 116.71 μL) and T3P (127.92 mg, 201.01 μmol, 50%in ethyl acetate) at 0℃. The mixture was stirred at room temperature for 3 h and quenched by water (20 mL) . The aqueous phase was extracted with ethyl acetate (3×15 mL) . The combined organic layers were washed with brine (2×15 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (DCM / MeOH = 20 / 1) to get the title compound (67 mg, 75%yield) as yellow oil. MS (ESI) m / z [M+H] +667.3.

[0229] Step 6: Synthesis of (S) -2- (2- ( (R) -6-fluoro-1'- ( (4- ( (E) -3-oxobut-1-en-1-yl) phenoxy) carbonyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetamido) -3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanoic acid

[0230] To a solution of 4- ( (E) -3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl (R) -6-fluoro-3- (2- ( ( (S) -1-methoxy-1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (67 mg, 100.50 μmol) in MeOH (3 mL) and water (3 mL) was added sodium hydroxide (8.04 mg, 201.00 μmol) The mixture was stirred for 2 h at room temperature. pH value of the solution was adjusted to 5 with hydrochloric acid (1 N) . The mixture was extracted with ethyl acetate (3×15 mL) , washed with brine (2×15 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum to get the title compound (50 mg, 76.61 μmol, 76.2%yield) as a yellow solid. MS (ESI) m / z [M-H] -651.7.

[0231] Step 7: Synthesis of 4- ( (E) -3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl (R) -6-fluoro-3- ( (S) -2, 2, 5-trimethyl-4, 9, 12-trioxo-10- (3, 4, 5-trifluorobenzyl) -3-oxa-5, 8, 11-triazatridecan-13-yl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (Compound A26)

[0232] To a solution of (S) -2- (2- ( (R) -6-fluoro-1'- ( (4- ( (E) -3-oxobut-1-en-1-yl) phenoxy) carbonyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetamido) -3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanoic acid (50 mg, 76.61 μmol) in acetonitrile (8 mL) was added tert-butyl (2-aminoethyl) (methyl) carbamate (13.35 mg, 76.61 μmol) , DIEA (29.70 mg, 229.84 μmol, 40.03 μL) and T3P (36.57 mg, 114.92 μmol, 50%in ethyl acetate) at 0℃. The mixture was stirred overnight at room temperature and then quenched by water (30 mL) . The aqueous phase was extracted with ethyl acetate (2×20 mL) , washed with brine (2×20 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by Prep-HPLC (water (0.1%FA)  / CH3CN=27% / 73%to get the title compound (30 mg, 37.09 μmol, 48.4%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M+Na] +831.2.

[0233] Example 6:

[0234] Preparation of 4- ( (E) -3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl (S) -6-fluoro-3- (2- ( ( (R) -1-hydroxy-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (Compound A28)

[0235] Step 1: Synthesis of tert-butyl (R) - (1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) carbamate

[0236] To a solution of (R) -2- ( (tert-butoxycarbonyl) amino) -3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propanoic acid (80 mg, 250.57 μmol) in THF (3 mL) was added lithium aluminum hydride (28.56 mg, 751.70 μmol) in portions at 0℃. The mixture was stirred for 3 h at room temperature and then quenched by sodium sulfate decahydrate. The mixture was filtered, and the filtrate was concentrated to dryness under vacuum to afford the title compound (43 mg, 140.85 μmol, 56.2%yield) as light-yellow oil. MS (ESI) m / z [M+Na] +328.1.

[0237] Step 2: Synthesis of (R) -2-amino-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-1-ol hydrochloride

[0238] To a solution of tert-butyl (R) - (1- (methylamino) -1-oxo-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) carbamate (43 mg, 140.85 μmol) in DCM (5 mL) was added hydrogen chloride (1 mL, 4 M in 1, 4-dioxane) . The mixture was stirred for 3 h at room temperature. The solvent was evaporated under vacuum to afford the title compound (31 mg, 128.83 μmol, 91.5%yield) as a white solid. MS (ESI) m / z [M+H] +206.1.

[0239] Step 3: Synthesis of 4- ( (E) -3-oxobut-1-en-1-yl) phenyl (S) -6-fluoro-3- (2- ( ( (R) -1-hydroxy-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-2-yl) amino) -2-oxoethyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidine] -1'-carboxylate (Compound A28)

[0240] To a solution of (S, E) -2- (6-fluoro-1'- ( (4- (3-oxobut-1-en-1-yl) phenoxy) carbonyl) -2, 3-dihydrospiro [indene-1, 4'-piperidin] -3-yl) acetic acid (40 mg, 88.60 μmol) in acetonitrile (6 mL) was added (R) -2-amino-3- (3, 4, 5-trifluorophenyl) propan-1-ol hydrochloride (21.32 mg, 88.60 μmol) , DIEA (57.25 mg, 442.98 μmol, 77.16 μL) and T3P (42.28 mg, 132.89 μmol, 50%in ethyl acetate) at 0℃. The mixture was stirred at room temperature overnight and then quenched by water (30 mL) . The aqueous phase was extracted with ethyl acetate (2×20 mL) , washed with brine (2×20 mL) , dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under vacuum. The residue was purified by Prep-HPLC (column: Waters Xbridge Prep OBD C18 150× 40 mm×10 μm; mobile phase: [water (FA) -CH3CN] ; CH3CN: 27%-73%, 8 min) to afford the title compound (8.37 mg, 13.11 μmol, 14.8%yield) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.82 (d, J= 8.7 Hz, 1H) , 7.79-7.73 (m, 2H) , 7.64 (d, J = 16.4 Hz, 1H) , 7.28-7.13 (m, 5H) , 6.97 (dd, J = 8.3, 5.3 Hz, 1H) , 6.85 (td, J= 8.8, 2.5 Hz, 1H) , 6.79 (d, J = 16.4 Hz, 1H) , 4.94-4.86 (m, 1H) , 4.23-3.97 (m, 3H) , 3.48-3.35 (m, 3H) , 3.23-2.86 (m, 4H) , 2.69-2.55 (m, 2H) , 2.41-2.31 (m, 4H) , 2.21-1.96 (m, 3H) , 1.68-1.44 (m, 4H) . MS (ESI) m / z [M+H] +639.1, [M+Na] +661.1.

[0241] The following compounds (Series A) in Table 1 were synthesized with similar procedures as described for Examples 1-6 using appropriate starting materials and corresponding intermediates.

[0242] Table 1:

[0243] Table 1a:

[0244] Biological assays

[0245] Probe competition assay of GSDME

[0246] The binding potency of compounds disclosed herein was evaluated by probe competition assay with GSDME and a biotin labeled probe (the following compound) . Recombinant GSDME protein fusion with a His-sumo tag at the N-terminal and a Flag tag at the C-terminal was expressed in E. coli. The protein was captured from supernatant of the E. coli. cell lysis by Ni-NTA affinity beads (Smart-Lifesciences, SA005500) and treated with ULP1 peptidase (Merck, SAE0067) to remove the His-sumo tag, followed by further purification with ion-exchange and gel filtration columns. In the presence of HTRF detection reagents (Streptavidin-XL665 and Mab anti-Flag Tb cryptate (Revvity) ) , the binding of GSDME and probe was detected by the increased FRET signal.

[0247] Determination of the competitive binding activity of compounds disclosed herein was carried out at room temperature. 400 nL of compounds with different concentrations and 10 nL of 170 μM probe in DMSO (MP Biomedicals) were dispensed into wells of 384-well plate (Corning 3575) by I. DOT (Cellink) . 16 μL of 70 nM GSDME buffer solution was added into wells. After incubation at room temperature for 1 hour, 4 μL of 5x detection reagents mixture containing Streptavidin-XL665 and Mab anti-Flag Tb cryptate (Revvity) were added to incubate for 30 minutes. FRET signal was measured on a microplate reader (PHERAstar FSX, BMG LABTECH) . IC50 values were calculated based on inhibition of probe binding signal in the presence of increasing concentrations of compounds. Compounds provided herein exhibit competitive binding activity with probe on GSDME.

[0248] List of buffer composition

[0249] Cell-based Assay and Data

[0250] Hela-hGE cellular assay

[0251] The compounds disclosed herein inhibit the GSDME activity in the Hela stable cell lines with GSDME over-expression as determined by the LDH release assay. For the stable cell line, the pWPI lentiviral vector containing the desired gene, together with the packing plasmids pMD2G and pSPAX2 (Addgene) , were transfected into 293T cells (ATCC) at the ratio of 5: 2: 3. After 48 hours, cell supernatants containing the lentivirus were collected and used to infect HeLa for another 48 hours. The infected GFP-positive cells were sorted by flow cytometry using the BD Biosciences FACSAriaⅢ. LDH release assay was determined using the CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit (Promega) according to the manufacturer’s instructions.

[0252] The IC50 values of the compounds disclosed herein were determined by the LDH release assay using the Hela stable cell lines with GSDME over-expression. Briefly, the cells were harvested cells and seeded to each well of several 96-well plates (Corning) to give a density of 0.1x106 cells per ml. After overnight incubation at 37℃ in 5%CO2, the cells were treated with the indicated compounds with series dilution (2 nM-20 μM) and incubated for 2 hours. And then, TNF-alpha (Invivogen) plus cycloheximide (MCE) was added to the cells as a trigger. 3.5 hours later, the supernatant of cells was collected and measured using the CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit (Promega) according to the manufacturer’s instructions. The results indicate that compounds provided herein exhibit activity for the inhibition of GSDME. Thus, according to the foregoing, the chemical entities disclosed herein exhibit antagonistic activity against GSDME.

[0253] GSDME-Related Diseases and Conditions

[0254] There are emerging evidences showed that GSDME is closely related to several pathological contexts, including but not limited to:

[0255] ● Genetic disease

[0256] GSDME was first characterized as a deafness-related gene product because its mutation was causative for a specific form of autosomal dominant progressive sensorineural hearing loss (Croes, L., et al., (2015) . Role of DFNA5 in hearing loss and cancer -a comment on Rakusic et al. OncoTargets and therapy 8, 2613-2615; Van Laer et al., 1998, ibid) . Further studies reported that the genetic mutations in GSDME lead to the skipping of exon 8 and premature termination of the open reading frame, resulting in a truncated protein showing evident pyroptosis activity (Jin, Z., et al., (2011) . [Characteristics of audiology and clinical genetics of a Chinese family with the DFNA5 genetic hearing loss] . Journal of clinical otorhinolaryngology, head, and neck surgery 25, 395-398; Li-Yang, M.N., et al., (2015) . IVS8+1 DelG, a Novel Splice Site Mutation Causing DFNA5 Deafness in a Chinese Family. Chinese medical journal 128, 2510-2515) . This premature GSDME mutant likely kill hair cells, eventually leading to late-onset, post-lingual, and progressive hearing loss.

[0257] ● Virus infection

[0258] Recently, some studies demonstrated that GSDME may play a detrimental role in virus infection. For instance, highly pathogenic avian influenza H7N9 infection induced 100%mortality in wildtype mice, but Gsdme- / -mice showed complete resistance to lethal H7N9 infection (Wan, X., et al., (2022) . H7N9 virus infection triggers lethal cytokine storm by activating gasdermin E-mediated pyroptosis of lung alveolar epithelial cells. National science review 9, nwab137) . Zika virus infection was shown to cause abnormal pregnancy in wildtype mice. However, the number and severity of affected dams and fetuses were markedly decreased in Gsdme- / -dams compared to the WT dams (Zhao, Z., et al., (2022) . Zika virus causes placental pyroptosis and associated adverse fetal outcomes by activating GSDME. eLife 11) . In addition, GSDME was also found to play a crucial role in EV71 and H1N1 virus infection-related pathology (Dong, S., et al., (2022) . Gasdermin E is required for induction of pyroptosis and severe disease during enterovirus 71 infection. The Journal of biological chemistry 298, 101850; Wei, Z., et al., (2023) . Baicalin inhibits influenza A (H1N1) -induced pyroptosis of lung alveolar epithelial cells via caspase-3 / GSDME pathway. Journal of medical virology 95, e28790) .

[0259] ● Adverse effect of cancer therapy

[0260] Chemotherapy drugs widely used in clinical practice, such as topotecan, etoposide, cisplatin and CPT-11, were shown to induce caspase-3 activation and subsequently trigger GSDME-mediated pyroptosis in serval cell lines. However, in GSDME-negative cells these chemotherapy drugs induce apoptosis instead (Wang et al., 2017, ibid) . Given the highly proinflammatory property of pyroptosis, GSDME-related pyroptosis may be responsible for some of the side effects of chemotherapy treatment, as Gsdme- / -mice appeared more resistant to tissue damage and weight loss induced by cisplatin injection than wildtype animals (Zhao et al., 2022, ibid) .

[0261] Moreover, cytokine release syndrome (CRS) is a major obstacle hindering the widespread clinical application of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies. There are experimental evidences showing that GSDME deletion could eliminate CRS occurrence in mouse models (Liu, Y., et al., (2020) . Gasdermin E-mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome. Science immunology 5) .

[0262] ● CNS disease

[0263] GSDME is a unique GSDM family member which expresses in neuron cells, suggesting a potential role of GSDME in CNS-related disease. A recent study reported that frontotemporal dementia (FTD)  / amyotrophic lateral sclerosis (ALS) -associated proteins TDP-43 and PR-50 induce GSDME-mediated damage to mitochondria and lead to neurite loss. knockdown of GSDME protected against neurite loss in ALS patient iPSC-derived motor neurons. Knockout of GSDME in SOD1G93A-induced ALS mice prolonged survival, ameliorated motor dysfunction, rescued motor neuron loss, and reduced neuroinflammation (Neel, D. V., et al., (2023) . Gasdermin-E mediates mitochondrial damage in axons and neurodegeneration. Neuron 111, 1222-1240 e1229) .

[0264] ● Autoimmune diseases

[0265] Monocytes and synovial macrophages derived from rheumatic arthritis (RA) patients showed increased expression and activation of caspase 3 and GSDME characterized by the N-terminal fragment of GSDME (GSDME-N) . The protein level of GSDME-N in monocytes from RA patients was shown to positively correlated with disease activity. Gsdme deficiency effectively alleviated arthritis in a mouse model (Zhai, Z., et al., (2022) . Attenuation of Rheumatoid Arthritis Through the Inhibition of Tumor Necrosis Factor-Induced Caspase 3 / Gasdermin E-Mediated Pyroptosis. Arthritis &rheumatology 74, 427-440) .

[0266] High levels of GSDME expression was also observed in the renal tubules of systemic lupus erythematosus (SLE) patients, which suggests the involvement of GSDME SLE-related pathology. In mouse model, knockout of GSDME effectively ameliorated lupus-like features through abolishing GSDME-mediated renal tubular epithelial cell pyroptosis (Luo, G., et al., (2022) . Blocking GSDME-mediated pyroptosis in renal tubular epithelial cells alleviates disease activity in lupus mice. Cell death discovery 8, 113) .

[0267] These studies indicated that targeting GSDME could be a potentially promising therapeutic approach for RA and SLE.

[0268] ● Kidney diseases

[0269] There are several studies focused on the role of GSDME in kidney diseases. GSDME deletion could not only alleviate renal fibrosis and inflammation in both unilateral ureteral ligation (UUO) and 5 / 6 nephrectomy (5 / 6Nx) models along with the attenuation of renal dysfunction (Li, Y., et al., (2021) . GSDME-mediated pyroptosis promotes inflammation and fibrosis in obstructive nephropathy. Cell death and differentiation 28, 2333-2350; Wu, M., et al., (2021) . Gasdermin E Deletion Attenuates Ureteral Obstruction-and 5 / 6 Nephrectomy-Induced Renal Fibrosis and Kidney Dysfunction. Frontiers in cell and developmental biology 9, 754134) , but also mitigate cisplatin and IR-induced acute kidney injury (Xia, W., et al., (2021) . Gasdermin E deficiency attenuates acute kidney injury by inhibiting pyroptosis and inflammation. Cell death &disease 12, 139) , as well as diabetic nephropathy in animal models (Wen, S., et al., (2020) . Caspase-3 Promotes Diabetic Kidney Disease Through Gasdermin E-Mediated Progression to Secondary Necrosis During Apoptosis. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy 13, 313-323) .

[0270] ● Other diseases

[0271] More and more genetic evidences are emerging to suggest that GSDME is involved in some other pathological contexts. For example, Gsdme- / -mice showed significantly reduced photoreceptors degeneration in a dry AMD and STGD1 mouse disease model (Cai, B., et al., (2022) . Gasdermin E mediates photoreceptor damage by all-trans-retinal in the mouse retina. The Journal of biological chemistry 298, 101553) . GSDME was upregulated in human carotid atherosclerotic plaques compared with control vessels. Further studies reported that GSDME is mainly expressed in atherosclerotic macrophages and GSDME deletion could attenuate atherosclerotic lesion area and size in ApoE- / -mouse models (Wei, Y., et al., (2023) . GSDME-mediated pyroptosis promotes the progression and associated inflammation of atherosclerosis. Nature communications 14, 929) .

[0272] While specific embodiments described herein have been shown and described in detai to illustrate the application of the principles of the disclosure, it will be understood that the disclosure may be embodied otherwise without departing from such principles. Numerous variations, changes, and substitutions will be understood by those skilled in the art without departing from the disclosure. It should be understood that various alternatives to the specific embodiments of the disclosure described herein may be employed in practicing the disclosure. It is intended that the claims define the scope of the disclosure, and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.

Claims

1.A compound of Formula (I) : wherein,represents a single bond, or a double bond;L is selected from C (O) O, C (O) NH, OC (O) , or NHC (O) ;RE is selected from H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, or C (O) Ra;X is selected from N or CRx;Rx is selected from H, D, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl;R1 is selected from H, D, CN, C (O) Ra, C (O) ORa, C (O) NRbRc, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, -C1-6 alkylene-S (O) 2Ra, -C1-6 alkylene-ORa, -C1-6 alkylene-NRbRc, C3-8 cycloalkyl, 4-to 10-membered heterocyclyl, C6-10 aryl, or 5-to 10-membered heteroaryl, each of which is optionally substituted with 1, 2, 3, 4, 5, or more R1s;R1s is selected from H, D, CN, halo, OH, C1-6 alkoxyl, C1-6 haloalkoxyl, NH2, NHC1-6 alkyl, N (C1-6 alkyl) 2, C (O) Ra, S (O) Ra, S (O) 2Ra, S (NH) (O) Ra, OP (O) (OH) 2, NHS (O) Ra, NHS (O) 2Ra, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C3-8 cycloalkyl, 4-to 10-membered heterocyclyl, C6-10 aryl, or 5-to 10-membered heteroaryl, each of which is optionally substituted with 1 or 2 halo, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl;R2 is selected from H, D, or halo;R3 is selected from H, D, halo, ORa, NRbRc, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, or C (O) NH2;R4 is selected from H, D, halo, or CN;R5 is selected from H, D, halo, CN, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl;Y is selected from C (O) , S (O) , or S (O) 2;Ra, Rb, and Rc are independently selected from H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, -C0-4 alkylene-C3-8 cycloalkyl, -C0-4 alkylene-4-to 10-membered heterocyclyl, -C0-4 alkylene-C6-10 aryl, or -C0-4 alkylene-5-to 10-membered heteroaryl, or Rb, and Rc together with the atom to which they connected to form 4-to 10-membered heterocyclyl; each of which is optionally substituted with 1 or 2 halo, OH, C1-6 alkoxyl, C1-6 haloalkoxyl, NH2, NHC1-6 alkyl, N (C1-6 alkyl) 2, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl;Rp and Rq are independently selected from H, D, CN, or halo;or Rp, and Rq are linked together to form an extra bond;RY is selected from H, D, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl;wherein the groups mentioned above could be substituted with 1, 2, 3, 4, 5, or more deuterium, until perdeuterated;or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.2.The compound according to claim 1, which is a compound of Formula (I-1a) or Formula (I-1b) : wherein,represents a single bond, or a double bond;X is selected from CH, or N, and when X is CH, is selected fromY is selected from C (O) , S (O) , or S (O) 2;RY is selected from H, D, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl;R1 is selected from H, D, -C1-4 alkylene-ORa, -C1-4 alkylene-NRbRc, C (O) ORa, or C (O) NRbRc;R2 and R4 are independently selected from H, D, or halo;R3 is selected from halo, or CN;RE is selected from H, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl; alternatively, H;Rp and Rq are independently selected from H, D, CN, or halo;or Rp, and Rq are linked together to form an extra bond;Ra, Rb, and Rc are independently selected from H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, C3-8 cycloalkyl, 4-to 10-membered heterocyclyl, C6-10 aryl, or 5-to 10-membered heteroaryl (alternatively, H, C1-6 alkyl, C1-6 haloalkyl, or C3-8 cycloalkyl) , each of which is optionally substituted with 1 or 2 halo, OH, C1-6 alkoxyl, C1-6 haloalkoxyl, NH2, NHC1-6 alkyl, N (C1-6 alkyl) 2, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl; andwherein the groups mentioned above could be substituted with 1, 2, 3, 4, 5, or more deuterium, until perdeuterated;or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.3.The compound according to claim 2, which is a compound of Formula (I-2a) , Formula (I-2b) , Formula (I-2c) , or Formula (I-2d) : wherein,R1 is selected from -C1-4 alkylene-ORa, C (O) ORa, or C (O) NRbRc;R2 and R4 are independently selected from H, D, or halo;R3 is selected from halo, or CN;RE is selected from H, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl; alternatively, H;Ra, Rb, and Rc are independently selected from H, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl, each of which is optionally substituted with 1 or 2 halo, OH, C1-6 alkyl, or C1-6 haloalkyl; andwherein the groups mentioned above could be substituted with 1, 2, 3, 4, 5, or more deuterium, until perdeuterated;or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.4.The compound of Formula (I-2a) , Formula (I-2b) , Formula (I-2c) , or Formula (I-2d) according to claim 3, wherein:wherein,R1 is selected fromR2 and R4 are independently selected from H, D, or F;R3 is selected from F, or CN; andRE is selected from H, C1-4 alkyl, or C1-4 haloalkyl; alternatively, H;or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.5.A compound selected from the group consisting of the compounds delineated in Table 1, or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.6.A pharmaceutical composition, comprising:the compound, or the stereoisomer, the tautomer, the stable isotopic variant, the prodrug, or the crystal form thereof, or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of claims 1 to 5;pharmaceutically acceptable excipient (s) ; andoptionally, one or more other therapeutic agents.7.A kit, comprising:a first container which contains the compound, or the stereoisomer, the tautomer, the stable isotopic variant, the prodrug, or the crystal form thereof, or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of claims 1 to 5; andoptionally, a second container which contains one or more other therapeutic agents; andoptionally, a third container which contains pharmaceutically acceptable excipient (s) for diluting or suspending the said compound and / or other therapeutic agent (s) .8.Use of a compound, or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of claims 1 to 5, in the manufacture of a medicament for treating and / or preventing pro-inflammatory cell death related diseases.9.The compound, or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of claims 1 to 5, for use in treating and / or preventing pro-inflammatory cell death related diseases.10.A method of treating and / or preventing pro-inflammatory cell death related diseases in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a compound, or a stereoisomer, a tautomer, a stable isotopic variant, a prodrug, or a crystal form thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of claims 1 to 5.

Images