Car with improved intracellular domain

Abstract

The present invention belongs to the technical field of cellular immunotherapy and relates to an intracellular domain of a chimeric antigen receptor and uses thereof in Chimeric Antigen Receptor T (CAR-T) cell therapy.

Description

CAR WITH IMPROVED INTRACELLULAR DOMAIN

[0001] SEQUENCE LISTING

[0002] The present application is filed together with a Sequence Listing in electronic form. The entire contents of the Sequence Listing are hereby incorporated by reference.FIELD OF THE INVENTION

[0003] The present invention belongs to the technical field of cellular immunotherapy and relates to an intracellular domain of a chimeric antigen receptor (CAR) , a CAR comprising the intracellular domain, and methods and uses thereof in Chimeric Antigen Receptor T (CAR-T) cell therapy.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0004] Chimeric Antigen Receptor T (CAR-T) cell therapy has achieved breakthrough efficacy against B-cell malignancies, and at present, a number of related products have been approved for marketing. As CAR-T cell therapy is widely used in clinical practice, the toxic and side effects caused by this therapy have received increasing attention. Cytokine release syndrome (CRS) and immune effector cell-associated neurotoxic syndrome (ICANS) are common and life-threatening toxic side effects in CAR-T cell therapy. Up to 93%of patients will develop varying degrees of CRS after receiving CAR-T cell therapy, and up to 10%-30%will develop severe CRS. The incidence rate of ICANS after patients receive currently marketed CAR-T cell products targeting CD19 and BCMA is approximately 10%to 87%. For example, the incidence of ICANS of any grade after treatment with the marketed CAR-T cell products axicabtagene ciloleucel (axi-cel) and brexucabtagene autoleucel (brexu-cel) vary from study to study, but can range from 55-69%, and the incidence of ICANS of grade ≥3 is 21-31%. On the other hand, CRS rates are highest for axi-cel and brexu-cel (90-93%) but are lower for other CAR-T cell products (e.g., around 40-50%for liso-cel) .

[0005] CRS is a reaction resulting from the activation of endogenous or infused T cells or other immune cells in the body caused by immunotherapy, including CAR-T cell therapy. The pathophysiology of CAR-T cell-related CRS involves production of cytokines, such as IFN-γand GM-CSF, by CAR-T cells, which cross-activate myeloid cells to result in production of other cytokines and the clinical manifestations. According to the site of occurrence, CRS can be divided into local CRS and systemic CRS. Local CRS is mainly manifests as an inflammatory reaction in and around the lesion, while the main symptoms of systemic CRS include fever, hypotension, and hypoxemia. According to the clinical manifestations of CRS, it is generally divided into four grades. For CRS of grades 1-2, symptomatic and supportive treatment is generally adopted, and if necessary, specific treatment using IL-6 receptor antagonists, with or without corticosteroids can be used. Grades 3-4 represent severe CRS, and in addition to symptomatic treatment, which may involve inotropic and respiratory support, IL-6 receptor antagonists and steroids are given, with additional measures for refractory cases. In some cases, CRS can progress rapidly and become life-threatening.

[0006] ICANS is specifically defined as a series of clinical manifestations of neurological abnormalities caused by the activation or involvement of endogenous or exogenous T cells and / or other immune effector cells after patients receive immunotherapy including CAR-T cells. Like CRS, CAR-T cell-related ICANS involves the production of inflammatory cytokines by CAR-T cells, resulting in recruitment and activation of myeloid cells –here resulting in inflammation within the central nervous system. The clinical manifestations of ICANS are diverse. Early symptoms often include weakened attention, language impairment, and reduced writing ability. It can further develop into disorientation, abnormal mood, aphasia, drowsiness, confusion, and tremor. A small number of patients may develop severe clinical symptoms, including epileptic seizures, amentia, and increased intracranial pressure. The most severe  clinical manifestation of ICANS is acute cerebral edema, the patient can progress from mild drowsiness to cloudiness of consciousness within a few hours, and further progress can lead to death. Early onset cytokine release syndrome (CRS) is a risk factor for severe ICANS. In clinical treatment, patients are generally divided into four grades according to their symptoms of ICANS. For patients with ICANS scores reaching grades 3 to 4, it is generally recommended to transfer them to the intensive care unit and provide mechanical ventilation support if necessary. To treat ICANS, supportive care and corticosteroid treatment are often used clinically. The preventive use of IL-1 receptor blockers can reduce the incidence and severity of ICANS after receiving CAR-T cell therapy. However, the occurrence of ICANS cannot be completely avoided.

[0007] Improved CAR-T cell therapies are therefore required.SUMMARY OF THE INVENTION

[0008] The present inventors have surprisingly identified an arrangement of intracellular binding domain components that is safer and / or more effective. In particular, the present inventors have identified that interposing a TLR co-stimulatory domain between a second co-stimulatory domain and a signal transduction domain imparts improved safety and / or efficacy in cell therapy.

[0009] These results are particularly surprising because they demonstrate improvements over intracellular domains comprising the same components in alternative arrangement. Further, the results indicate that the improved arrangement of intracellular binding domain components is sufficiently generic to be utilized to impart one or more advantages in various formats, including both treatment of “solid” and “liquid” cancers. In other words, the present inventors have arrived at a general principle for application in cell therapy and, in particular, CAR-T cell therapy.

[0010] Indeed, in certain embodiments, by changing the CAR molecular intracellular domain, the present disclosure provides for reduced secretion of cytokines such as IFN-γ and GM-CSF that contribute to CRS and ICANS.

[0011] In a first aspect the present disclosure relates to a nucleic acid molecule encoding an intracellular domain, wherein the intracellular domain comprises two co-stimulatory domains and a signal transduction domain, wherein a first co-stimulatory domain is a Toll-like receptor (TLR) signaling domain and wherein the TLR signaling domain is interposed between a second costimulatory domain and the signal transduction domain. In an example, the nucleic acid further encodes an scFv. Important here is the present inventors findings showing one or more improvement, despite changing both scFv target and, target cell. These data support general applicability to various scFv’s and, by extension, killing of various cell types.

[0012] In an example, the nucleic acid of the disclosure encodes a CAR. Accordingly, in another aspect, the present disclosure also relates to a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an scFv and an intracellular domain, wherein the intracellular domain comprises two co-stimulatory domains and a signal transduction domain, wherein a first co-stimulatory domain is a Toll-like receptor (TLR) signaling domain and wherein the TLR signaling domain is interposed between a second costimulatory domain and the signal transduction domain.

[0013] In another aspect, the present disclosure relates to a polypeptide, wherein the polypeptide comprises an intracellular binding domain, wherein the intracellular domain comprises two co-stimulatory domains and a signal transduction domain, wherein a first co-stimulatory domain is a Toll-like receptor (TLR) signaling domain and wherein the TLR signaling domain is interposed between a second costimulatory domain and the signal transduction domain. In an example, the polypeptide further comprises an scFv. In an example, the polypeptide is a CAR.

[0014] In an example, the TLR signaling domain in the nucleic acid, polypeptide or CAR is a TLR2 signaling domain. In an example, the TLR signaling domain comprises a Toll / interleukin-1 receptor (TIR) domain of TLR2. In an example, the TLR signaling domain is a Toll / interleukin-1 receptor (TIR) domain of TLR2.

[0015] In an example, the signal transduction domain is derived from TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε,  CD3γ, CD3Δ, CD3ε and CD3ζ. In an example, the signal transduction domain comprises a CD3ζ signaling domain.

[0016] In another example, the second costimulatory domain is selected from the group consisting of CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, CD27 or CD40. In an example, the second costimulatory domain is CD28.

[0017] In an example, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 6 or a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7. In another example, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 8 or a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9. In another example, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 10 or a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11. In another example, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 12 or a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 19, and SEQ ID NO: 20. In another example, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 13 or a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in any one of the following:

[0018] SEQ ID NO: 2;

[0019] SEQ ID NO: 3;

[0020] SEQ ID NO: 14; and

[0021] SEQ ID NO: 21.

[0022] In another example, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid sequence encoding either the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.

[0023] In an example, the CAR comprises SEQ ID NO: 7. In another example, the CAR comprises SEQ ID NO: 9. In another example, the CAR comprises SEQ ID NO: 11. In another example, the CAR comprises SEQ ID NO: 1. In another example, the CAR comprises SEQ ID NO: 19. In another example, the CAR comprises SEQ ID NO: 20. In another example, the CAR comprises the amino acid sequence set forth in any one of the following:

[0024] SEQ ID NO: 2;

[0025] SEQ ID NO: 3;

[0026] SEQ ID NO: 14; and

[0027] SEQ ID NO: 21.

[0028] In an example, the CAR comprises either SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.

[0029] In an example, the CAR further includes a connecting peptide, a hinge region, and a transmembrane domain.

[0030] In an example, the nucleic acid molecule is a polynucleotide. In an example, the polynucleotide is selected from the group consisting of: DNA, RNA, messenger RNA (mRNA) or circular RNA (cRNA) .

[0031] In an example, the present disclosure encompasses a recombinant vector which comprises a nucleic acid disclosed herein. In an example, the recombinant vector is a PiggyBac (PB) transposon vector, a Sleeping Beauty (SB) transposon vector, a plasmid, a cosmid, a phage or a viral vector. In an example, the recombinant vector is a viral vector derived from a Lentivirus, a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes simplex virus (HSV) .

[0032] In another aspect, the present disclosure relates to an immune cell or population thereof, wherein the immune cell or population thereof comprises an above referenced nucleic acid, polypeptide and / or CAR.

[0033] In an example, the immune cell (s) is selected from the group consisting of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , T cells, NK cells, NKT cells, ITNK cells, macrophages, B cells, monocytes, neutrophils, eosinophils and combinations thereof.

[0034] In an example, the immune cell is a T-cell, preferably wherein the T-cell is a gamma delta (γδ) T cell, a cytotoxic T cell, or a helper T cell.

[0035] In an example, the immune cell is a NK-92 cell.

[0036] In another aspect, the present disclosure relates to a stem cell which expresses an above referenced nucleic acid, polypeptide and / or CAR. In an example, the stem cell is an embryonic stem cells (ESs) or an induced pluripotent stem cells (iPSCs) .

[0037] Another aspect of the disclosure relates to a method of producing a genetically modified cell for adoptive cell therapy, the method comprising introducing a vector comprising an above referenced nucleic acid molecule.

[0038] In another aspect, the present disclosure relates to a method of treating a proliferative disease in a subject in need thereof, the method comprising administering a nucleic acid molecule, polypeptide, CAR or composition described herein. In an example, the proliferative disease is a malignant proliferative disease. In an example, the proliferative disease is a CD19-expressing malignant proliferative disease. In an example, the CD19-expressing malignant proliferative disease is selected from the group consisting of acute lymphoblastic leukemia (ALL) such as B-cell acute lymphoblastic leukemia (BALL) and T-cell acute lymphoblastic leukemia (TALL) , chronic myelogenous leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , Burkitt's lymphoma, B-cell non-Hodgkin lymphoma (including large B-cell lymphomas such as diffuse large B cell lymphoma, primary mediastinal B-cell lymphoma or follicular large cell lymphoma; indolent B-cell lymphomas such as marginal zone lymphomas, MALT lymphoma and mantle cell lymphoma) , follicular lymphomas, hairy cell leukemia, malignant lymphoproliferative conditions, multiple myeloma, variants of myeloma such as plasmacytoma and amyloidosis, non-Hodgkin's lymphoma, plasmablastic lymphoma, plasmacytoid dendritic cell neoplasm, and preleukemia.

[0039] In an example, the malignant proliferative disease is a solid tumour. In an example, the solid tumour is GPC3+. In an example, the GPC3+ solid tumour is a liver cancer, a skin cancer, preferably melanoma, an ovarian cancer, a lung cancer, a renal cancer, preferably Wilms tumour, or, a yolk sac tumour.

[0040] In an example, the solid tumour is liver cancer, colorectal cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, lung cancer, gastric cancer, head and neck cancer, esophageal cancer or melanoma.

[0041] In an example, the method comprises administering a population of cells expressing a CAR which comprises either SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5. In an example, the method comprises administering between 5 × 104 and 1 × 106 viable cells per kilogram body weight of the subject. In this example, the viable cells can express a CAR which comprises either SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.

[0042] In an example, the present disclosure encompasses a composition comprising a population of CAR-T cells, wherein the CAR-T cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 4 or 5, and wherein the CAR-T cells in the composition are characterized by the following expression profile: 45 to 55% (preferably 39%) CD4+, 35 to 45% (preferably 41%) CD8+, and 30 to 40%(preferably 34%) CD62L+, based on the total number of cells in the composition.

[0043] In another aspect, the present disclosure encompasses a method of treating a CD19-expressing malignant proliferative disease in a subject in need thereof, comprising administering a composition disclosed herein. In an example, the malignant proliferative disease is Relapse or Refractory B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. In an example, between 5 ×104 and 1 × 106 CAR-T cells are administered per kilogram body weight of the subject.

[0044] In another aspect, the present disclosure encompasses a method of treating an autoimmune disease in a subject in need thereof, comprising administering a nucleic acid molecule, polypeptide, CAR or composition described herein. In another example, the present disclosure encompasses a method of treating an antibody-mediated autoimmune disease in a subject in need thereof, comprising administering a nucleic acid molecule, polypeptide, CAR or composition described herein.

[0045] In another example, the present disclosure encompasses a method of treating a CD19-expressing autoimmune disease in a subject in need thereof, comprising administering a  nucleic acid molecule, polypeptide, CAR or composition described herein.

[0046] In an example, the autoimmune disease includes, but is not limited to, systemic lupus erythematosus, autoimmune encephalitis, myasthenia gravis, systemic sclerosis,  syndrome, mixed connective tissue disorder, type 1 diabetes, pemphigus, autoimmune hemolytic anemia, immune thrombocytopenic purpura, thrombotic thrombocytopenic purpura, multiple sclerosis, asthma, psoriasis, rheumatoid arthritis, Hashimoto's thyroiditis and Crohn's disease.

[0047] In an example, the autoimmune disease is a CD19+ autoimmune disease.

[0048] KEY TO THE SEQUENCE LISTING

[0049] The following sequences are shown in Table 1.

[0050] SEQ ID NO: 1 -amino acid sequence of 28T2z

[0051] SEQ ID NO: 2 -amino acid sequence of FMC63 scFv

[0052] SEQ ID NO: 3 -amino acid sequence of Hu19 scFv

[0053] SEQ ID NO: 4 -amino acid sequence of WZTL-002

[0054] SEQ ID NO: 5 -amino acid sequence of G28T2z

[0055] SEQ ID NO: 6 -nucleic acid sequence of TLR2

[0056] SEQ ID NO: 7 -amino acid sequence of TLR2

[0057] SEQ ID NO: 8 -nucleic acid sequence of CD28

[0058] SEQ ID NO: 9 -amino acid sequence of CD28

[0059] SEQ ID NO: 10 -nucleic acid sequence of CD3zeta

[0060] SEQ ID NO: 11 -amino acid sequence of CD3zeta

[0061] SEQ ID NO: 12 -nucleic sequence of 28T2z

[0062] SEQ ID NO: 13 -nucleic acid sequence of FMC63 scFv

[0063] SEQ ID NO: 14 -amino acid sequence of scFv binding to GPC3

[0064] SEQ ID NO: 15 -full length nucleic acid sequence of WZTL-002

[0065] SEQ ID NO: 16 -alternative amino acid sequence of WZTL-002

[0066] SEQ ID NO: 17 -alternative amino acid sequence of G28T2z

[0067] SEQ ID NO: 18 –signal sequence

[0068] SEQ ID NO: 19 –amino acid sequence of 4-1BBT2z.

[0069] SEQ ID NO: 20 -amino acid sequence of ICOST2z.

[0070] SEQ ID NO: 21 –alternative amino acid sequence of FMC63 scFv

[0071] SEQ ID NO: 22 –amino acid sequence of the VL CDR1 of FMC63 (IMGT)

[0072] SEQ ID NO: 23 –amino acid sequence of the VL CDR2 of FMC63 (IMGT)

[0073] SEQ ID NO: 24 –amino acid sequence of the VL CDR3 of FMC63 (IMGT)

[0074] SEQ ID NO: 25 –amino acid sequence of the VH CDR1 of FMC63 (IMGT)

[0075] SEQ ID NO: 26 –amino acid sequence of the VH CDR2 of FMC63 (IMGT)

[0076] SEQ ID NO: 27 –amino acid sequence of the VH CDR3 of FMC63 (IMGT)

[0077] SEQ ID NO: 28 –FMC63 linker

[0078] SEQ ID NO: 29 –Hu19 Linker

[0079] SEQ ID NO: 30 –GPC3 Linker

[0080] SEQ ID NO: 31 –amino acid sequence of the VL CDR1 of Hu19 (IMGT)

[0081] SEQ2ID NO: 32 –amino acid sequence of the VL CDR2 of Hu19 (IMGT)

[0082] SEQ ID NO: 33 –amino acid sequence of the VL CDR3 of Hu19 (IMGT)

[0083] SEQ ID NO: 34 –amino acid sequence of the VH CDR1 of Hu19 (IMGT)

[0084] SEQ ID NO: 35 –amino acid sequence of the VH CDR2 of Hu19 (IMGT)

[0085] SEQ ID NO: 36 –amino acid sequence of the VH CDR3 of Hu19 (IMGT)

[0086] SEQ ID NO: 37 –nucleic acid sequence of Hu19 scFv

[0087] SEQ ID NO: 38 –nucleic acid sequence of scFv binding to GPC3

[0088] SEQ ID NO: 39 –amino acid sequence of the VL CDR1 of GPC3 (IMGT)

[0089] SEQ ID NO: 40 –amino acid sequence of the VL CDR2 of GPC3 (IMGT)

[0090] SEQ ID NO: 41 -amino acid sequence of the VL CDR3 of GPC3 (IMGT)

[0091] SEQ ID NO: 42 -amino acid sequence of the VH CDR1 of GPC3 (IMGT)

[0092] SEQ ID NO: 43 -amino acid sequence of the VH CDR2 of GPC3 (IMGT)

[0093] SEQ ID NO: 44 -amino acid sequence of the VH CDR3 of GPC3 (IMGT)

[0094] Table 1: DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0095] Fig. 1: Comparison of 1928T2z cells and second-generation 1928z cells

[0096] Fig. 2: Cytokine production by 1928T2z cells and second-generation 1928z cells co-incubated with K562-CD19 tumour cells;

[0097] Fig. 3: Serial anti-tumour activity by 1928T2z cells and second-generation 1928z cells co-incubated with K562-CD19 tumour cells;

[0098] Fig. 4: NALM6-GL cells in mice detected by in vivo imaging;

[0099] Fig. 5: Survival curves of NALM6-GL tumor-bearing mice after injection of 1928T2z T cells or 1928z T cells;

[0100] Fig. 6: Cytokine production by G28T2z cells and G28z cells co-incubated with K562-CD19 tumour cell;

[0101] Fig. 7: Cytokine production by 1928T2z cells and 1928BBz cells co-incubated with K562-CD19 tumour cell;

[0102] Fig. 8: Anti-tumour activity by 1928T2z cells and 1928BBz cells co-incubated with K562-CD19 tumour cell;

[0103] Fig. 9: Serial anti-tumour activity by 1928T2z cells and 1928BBz cells co-incubated with K562-CD19 tumour cell; and

[0104] Fig. 10: Results of gene set enrichment analysis.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0105] General

[0106] Throughout this specification, unless specifically stated otherwise or the context requires otherwise, reference to a single step, composition of matter, group of steps or group of compositions of matter shall be taken to encompass one and a plurality (i.e. one or more) of those steps, compositions of matter, groups of steps or groups of compositions of matter.

[0107] Those skilled in the art will appreciate that the present disclosure is susceptible to variations and modifications other than those specifically described. It is to be understood that the disclosure includes all such variations and modifications. The disclosure also includes all of the steps, features, compositions and compounds referred to or indicated in this specification, individually or collectively, and any and all combinations or any two or more of said steps or features.

[0108] The present disclosure is not to be limited in scope by the specific examples described herein, which are intended for the purpose of exemplification only. Functionally-equivalent products, compositions and methods are clearly within the scope of the present disclosure.

[0109] Any example of the present disclosure herein shall be taken to apply mutatis mutandis to any other example of the disclosure unless specifically stated otherwise. Stated another way, any specific example of the present disclosure may be combined with any other specific example of the disclosure (except where mutually exclusive) .

[0110] Any example of the present disclosure disclosing a specific feature or group of features or method or method steps will be taken to provide explicit support for disclaiming the specific feature or group of features or method or method steps.

[0111] Unless specifically defined otherwise, all technical and scientific terms used herein shall be taken to have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art (for example, in cell culture, molecular genetics, immunology, immunohistochemistry, protein chemistry, and biochemistry) .

[0112] Unless otherwise indicated, the nucleic acid molecules, recombinant protein, cell culture, and genetic engineering techniques utilized in the present disclosure are standard procedures, well known to those skilled in the art. Such techniques are described and explained throughout the literature in sources such as, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984) , J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989) , T.A. Brown (editor) , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991) , D.M. Glover and B.D. Hames (editors) , DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996) , and F.M. Ausubel et al. (editors) , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present) , Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988) , and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley &Sons (including all updates until present) .

[0113] The term “and / or” , e.g., “X and / or Y” shall be understood to mean either “X and Y” or “X or Y” and shall be taken to provide explicit support for both meanings or for either meaning.

[0114] Throughout this specification the word “comprise” , or variations such as “comprises” or “comprising” , will be understood to imply the inclusion of a stated element, integer or step, or group of elements, integers or steps, but not the exclusion of any other element, integer or step, or group of elements, integers or steps.

[0115] As used herein the term “derived from” shall be taken to indicate that a specified integer may be obtained from a particular source albeit not necessarily directly from that source.

[0116] As used herein, the terms "first" , "additional" and "further" throughout this specification are reference terms to distinguish between various forms and components of constructs. For example, a "first co-stimulatory domain" may define a domain with a specified sequence that is different to a “second co-stimulatory domain” . Alternatively, in another example the use of “first co-stimulatory domain” and for example “second co-stimulatory domain” may be used to distinguish the co-stimulatory domains positionally. In an embodiment of the present invention, a first co-stimulatory domain is described as being interposed between a second costimulatory domain and the signal transduction domain. Thus in this particular embodiment the use of a “first” and “second” is meant to distinguish the co-stimulatory domains positionally and does not exclude the possibility that the “first co-stimulatory domain” comprises the same structural or sequence make-up as the “second co-stimulatory domain” .

[0117] The terms "additional co-stimulatory domain" or “"further co-stimulatory domain" refer to a co-stimulatory domain (e.g., a second, third or fourth co-stimulatory domain) that differs either structurally or positionally from any other co-stimulatory domain. Accordingly, unless indicated otherwise, the terms "first" , "second" , "third" , "fourth" , "fifth" , "sixth, "seventh" and "eighth" , refer to an element (e.g., nucleic acid molecule, co-stimulatory domain, signaling domain, antigen, and the like) , where the recited "first" , "second" , "third" , "fourth" , "fifth" , "sixth, "seventh" and "eighth" elements may be the same or may be different.

[0118] Selected Definitions

[0119] As used herein, the term "T cell receptor" (abbreviated TCR) refers to a heterodimeric molecule comprising an alpha polypeptide chain (alpha chain) and a beta polypeptide chain (beta chain) , wherein the heterodimeric receptor is capable of binding to a peptide antigen presented  by an HLA molecule.

[0120] “Chimeric Antigen Receptor” or “CAR” refers to a protein or polypeptide comprising an extracellular domain capable of binding an antigen (i.e., an antigen binding domain) linked to intracellular immune cell signaling domain (s) . However, as would be appreciated by those of skill in the art, CARs are generally designed in a modular fashion that typically consists of an extracellular target-binding domain, a hinge region, a transmembrane domain that anchors the CAR to the cell membrane, and one or more intracellular domains that transmit activation signals. As the name suggests, an “intracellular domain” is designed to be positioned inside a cell of interest, in particular the cytoplasm, generally to direct certain cellular function (s) . In keeping with the modular nature of CARs, in certain examples, it is envisaged that nucleic acids and polypeptides encoding intracellular binding domains of the disclosure can be incorporated into an overarching CAR structure as required.

[0121] Indeed, CARs can redirect T-cell specificity and reactivity toward a selected target in a non-MHC-restricted manner, thus giving T cells expressing CARs the ability to recognize antigens independent of antigen processing. CARs do not dimerize with endogenous T cell receptor (TCR) α-and β-chains. A “CD19-CAR” refers to a CAR having an extracellular binding domain specific for CD19. A “glypican-3 (GPC3) CAR” refers to a CAR having an extracellular binding domain specific for GPC3. CARs of the present disclosure may be expressed on various immune cells. T cells expressing a CAR are referred to herein as CAR T cells or CAR modified T cells, and these terms may be used interchangeably herein.

[0122] As used herein, the terms “CAR-T cell” or “CAR-T” refers to T-cells comprising the CARs of the present invention. These CAR-T cells or CAR-Ts have been genetically engineered to express CAR constructs by transfecting a population of T-cells with nucleic acids or vectors of the present invention.

[0123] The term “co-stimulatory domain” refers to any oligopeptide or polypeptide known to act as a domain that transmits signals to direct biological processes such as sustained signaling, prevention of anergy, proliferation and T-cell memory. The co-stimulatory domain may provide one or more of these properties, or otherwise complement the effect (s) of another co-stimulatory domain. In an example, the co-stimulatory domain is obtained from native co-stimulatory molecules such as CD28 and 4–1BB. Other examples of co-stimulatory domains include CD27, CD40, TLR2, DAP10, OX40, GITR, HVEM and ICOS. In an example, at least one co-stimulatory domain is TLR2 (e.g. SEQ ID NO: 7) and the other co-stimulatory domain is selected from the group consisting of CD28, 4-1BB, CD27, CD40, OX40, GITR, HVEM or ICOS. Co-stimulatory domains are usually included in-cis with a signal transduction domain such as a CD3ζ cytoplasmic domain.

[0124] A “signal transduction domain” refers to a domain which, on antigen binding, primes a representative immune cell for anti-tumour activity. In certain examples, the signal transduction domain triggers activation of one or more co-stimulatory domains. An example of a signal transduction domain is CD3ζ. Other examples include TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε, CD3γ, CD3Δ, CD3ε.

[0125] As used herein, the term “transmembrane domain” refers to any three-dimensional structure formed by a sequence of amino acids which is thermodynamically stable in a biological membrane, e.g. a cell membrane.

[0126] The term “hinge region” refers to an amino acid sequence which provides for flexible linkage of the antigen-binding and transmembrane domains of the CAR.

[0127] As used herein, the term “nucleotide sequence” or “nucleic acid sequence” will be understood to mean a series of contiguous nucleotides (or bases) covalently linked to a phosphodiester backbone. By convention, sequences are presented from the 5'end to the 3'end, unless otherwise specified.

[0128] As used herein, the term “nucleic acid molecule” includes for example “polynucleotide” and “oligonucleotide” , and generally means a polymer of DNA or RNA, which can be single-or  double-stranded. The nucleic acid molecule may contain natural, non-natural or altered internucleotide linkage, such as a phosphoroamidate linkage or a phosphorothioate linkage, instead of the phosphodiester found between the nucleotides of an unmodified oligonucleotide. In certain examples, the nucleic acid molecule is selected from the group consisting of: DNA, RNA, messenger RNA (mRNA) or circular RNA (cRNA) . In certain examples, the nucleic acid molecule is selected from the group consisting of DNA, RNA or messenger RNA (mRNA) .

[0129] Preferably, the nucleic acid molecules of the present invention are recombinant. The term “recombinant” shall be understood to mean the product of artificial genetic recombination.

[0130] As used herein, the term “antigen” refers to a molecule or structure containing one or more epitopes that induce, elicit, augment or boost a cellular and / or humoral immune response. Antigens can include, for example, proteins and peptides from a tumor, or a pathogen such as a virus, bacteria, fungus, protozoan, or plant.

[0131] The term “polypeptide” or “polypeptide chain” will be understood to mean a series of contiguous amino acids linked by peptide bonds. For example, a protein shall be taken to include a single polypeptide chain i.e., a series of contiguous amino acids linked by peptide bonds or a series of polypeptide chains covalently or non-covalently linked to one another (i.e., a polypeptide complex) . The series of polypeptide chains can be covalently linked using a suitable chemical or a disulfide bond. Examples of non-covalent bonds include hydrogen bonds, ionic bonds, Van der Waals forces, and hydrophobic interactions.

[0132] As used herein, the terms “disease” , “disorder” or “condition” refers to a disruption of or interference with normal function, and is not to be limited to any specific condition, and will include diseases or disorders.

[0133] As used herein, the terms “treating” , “treat” or “treatment” include administering a nucleic acid molecule, CAR, recombinant vector, population of cells or composition described herein to provide benefit or therapeutic effect, such as reducing or eliminating at least one symptom of a specified disease or condition.

[0134] An “effective amount” refers to at least an amount effective, at dosages and for periods of time necessary, to achieve the desired result. For example, the desired result may be a therapeutic result. An effective amount can be provided in one or more administrations. In some examples of the present disclosure, the term “effective amount” is meant an amount necessary to effect treatment of a disease as herein described. In some examples of the present disclosure, the term “effective amount” refers to an amount necessary to effect a change associated with a disease as herein described. The effective amount may vary according to the disease to be treated or factor to be altered and also according to the weight, age, racial background, sex, health and / or physical condition and other factors relevant to the subject being treated. The effective amount can be administered in a single dose or in a dose repeated once or several times over a treatment period.

[0135] A “therapeutically effective amount” is at least the minimum concentration required to effect a measurable improvement of a particular disease. A therapeutically effective amount herein may vary according to factors such as the disease state, age, sex, and weight of the patient, and the ability of the cells of the present disclosure to elicit a desired response in the individual. A therapeutically effective amount is also one in which any toxic or detrimental effects of the cells are outweighed by the therapeutically beneficial effects. In an example, a therapeutically effective amount does not result in immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome (ICANS) . Accordingly, in certain examples, treatment methods of the present disclosure encompass administration of a cell population or composition disclosed herein, wherein a treated subject does not develop ICANS after administration (e.g. 3 months after administration the subject has not developed ICANS) .

[0136] As used herein, the terms “adoptive cell therapy” (ACT) or “CAR-T cell therapy” primarily refer to a treatment that involves the collection of immune cells from a subject, modifying the cells to express a CAR, growing or expanding these cells in vitro and reinfusing the modified  cells back into the subject. Nonetheless, these terms also encompass administering a nucleic acid molecule or a vector encoding a CAR directly to the patient. Additionally, these terms also encompass producing genetically modified or engineered CAR T-cells from a healthy donor (allogeneic) or from a cell line (allogeneic / off the shelf) , then administering these cells to the subject.

[0137] As used herein, the term “subject” shall be taken to mean any animal including humans, for example a mammal. Exemplary subjects include but are not limited to humans and non-human primates. For example, the subject is a human.

[0138] As used herein, the term “antigen binding domain” shall be taken to mean a structure formed by a protein that is capable of binding or specifically binding to an antigen. The antigen binding domain need not be a series of contiguous amino acids. For example, in a scFv the antigen binding domain is made up of a series of amino acids of a VL and a VH that interact with the antigen and that are generally, however not always in the one or more of the CDRs in each variable region. In some examples, an antigen binding domain is a VH or a VL or a scFv. In an example, the antigen binding domain is in an scFv. In an example, the antigen binding domain is a single variable domain on a heavy chain (VHH) . In an example, the antigen binding domain is a nanobody.

[0139] As used herein, the term “Fv” shall be taken to mean any protein, whether comprised of multiple polypeptides or a single polypeptide, in which a VL and a VH associate and form a complex having an antigen binding domain, i.e., capable of specifically binding to an antigen. A “single chain Fv” or “scFv” is a recombinant molecule containing the variable region fragment (Fv) of an antibody in which the variable region of the light chain and the variable region of the heavy chain are covalently linked by a suitable, flexible polypeptide linker.

[0140] As used herein, “variable region" refers to the portions of the light and / or heavy chains of an antibody as defined herein that is capable of specifically binding to an antigen and includes amino acid sequences of complementarity determining regions (CDRs) ; i.e., CDRl, CDR2, and CDR3, and framework regions (FRs) . Exemplary variable regions comprise three or four FRs (e.g., FR1, FR2, FR3 and optionally FR4) together with three CDRs. VH refers to the variable region of the heavy chain. VL refers to the variable region of the light chain.

[0141] As used herein, the term "complementarity determining regions” (syn. CDRs; i.e., CDRl, CDR2, and CDR3) refers to the amino acid residues of a variable region the presence of which are necessary for antigen binding. Each variable region typically has three CDR regions identified as CDRl, CDR2 and CDR3. The amino acid positions assigned to CDRs and FRs can be defined according to Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991 or other numbering systems in the performance of this disclosure, e.g., the canonical numbering system of Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989; and / or Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273: 927-948, 1997; the IMGT numbering system of Lefranc et al., Devel. And Compar. Immunol., 27: 55-77, 2003; or the AHO numbering system of Honnegher and Plükthun J. Mol. Biol., 309: 657-670, 2001. For example, according to the numbering system of Kabat, VH framework regions (FRs) and CDRs are positioned as follows: residues 1-30 (FRl ) , 31-35 (CDR1) , 36-49 (FR2) , 50-65 (CDR2) , 66-94 (FR3) , 95-102 (CDR3) and 103-113 (FR4) . According to the numbering system of Kabat, VL FRs and CDRs are positioned as follows: residues 1–23 (FRl) , 24-34 (CDR1) , 35-49 (FR2) , 50-56 (CDR2) , 57-88 (FR3) , 89-97 (CDR3) and 98-107 (FR4) . The present disclosure is not limited to FRs and CDRs as defined by the Kabat numbering system, but includes all numbering systems, including those discussed above. In one example, reference herein to a CDR (or a FR) is in respect of those regions according to the Kabat numbering system.

[0142] "Framework regions" (FRs) are those variable region residues other than the CDR residues.

[0143] As used herein, the term “specifically binds” or “binds specifically” shall be taken to mean that the interaction between an antigen binding domain of the disclosure with an antigen is  dependent upon the presence of a particular structure (e.g., an antigenic determinant or epitope) on the antigen. In addition, an antigen binding domain of the disclosure reacts or associates more frequently, more rapidly, with greater duration and / or with greater affinity with a particular antigen or cell expressing same than it does with alternative antigens or cells. For example, a CAR comprising an antigen binding domain of the disclosure binds to CD19 with materially greater affinity (e.g., 20 fold or 40 fold or 60 fold or 80 fold to 100 fold or 150 fold or 200 fold) than it does to other antigens. Reference to binding means specific binding, and each term shall be understood to provide explicit support for the other term.

[0144] For the purposes of clarification and as will be apparent to the skilled artisan based on the exemplified subject matter herein, reference to “affinity” in this specification is a reference to KD of a protein or scFv.

[0145] As used herein, the term “epitope” (syn. “antigenic determinant” ) shall be understood to mean a region of an antigen (e.g. CD19 or GPC3) to which a protein comprising an antigen binding site of an antibody binds. This term is not necessarily limited to the specific residues or structure to which the protein makes contact. For example, this term includes the region spanning amino acids contacted by the protein and / or 5-10 or 2-5 or 1-3 amino acids outside of this region. Those of skill in the art will also be aware that the term "epitope" is not limited to peptides or polypeptides. For example, the term “epitope” includes chemically active surface groupings of molecules such as sugar side chains, phosphoryl side chains, or sulfonyl side chains, and, in certain examples, may have specific three dimensional structural characteristics, and / or specific charge characteristics.

[0146] As used herein, the term “interposed” refers to the positioning of a particular domain between two or more particular elements. Such positional language, as used herein, unless explicitly indicated otherwise, does not imply that additional domains are not interposed between the reference elements. For example, in an embodiment of the present invention wherein a first co-stimulatory domain is described as being interposed between a second costimulatory domain and the signal transduction domain, additional domains (e.g., a further co-stimulatory domain) may be present between the second co-stimulatory domain and the signal transduction domain.

[0147] Nucleic acid molecules and polypeptides

[0148] The present disclosure relates to nucleic acid molecules which encode intracellular domains of the present disclosure and chimeric antigen receptors which encompass the same. In an example, the nucleic acid molecule encodes an intracellular domain comprising a first co-stimulatory domain which is interposed between a second costimulatory domain and a signal transduction domain. For example, the interposed costimulatory domain may be a TLR signaling domain. In an example, the TLR signaling domain is derived from Toll-like receptor 2 (TLR2) . For example, the TLR signaling domain may be Toll / interleukin-1 receptor (TIR) domain of TLR2. TLR signaling domains are known in the art and have previously been described in patents such as US10,093,717. In an example, the TLR2 signaling domain is encoded by a nucleic acid which comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 6. Accordingly, in an example, nucleic acids of the present disclosure can comprise SEQ ID NO: 6, wherein SEQ ID NO: 6 is interposed between a nucleotide sequence encoding another costimulatory domain and a nucleic acid sequence encoding a signal transduction domain.

[0149] In an example, the signal transduction domain is CD3ζ. In this example, the TLR2 signaling domain is interposed between another co-stimulatory domain and CD3ζ. In an example, the CD3ζ is encoded by a nucleic acid which comprises SEQ ID NO: 10.

[0150] In another example, the TLR2 domain (e.g. SEQ ID NO: 6) is interposed between a second co-stimulatory domain, such as CD28, and a CD3ζ signal transduction domain. In an example, the second co-stimulatory domain is selected from the group consisting of 4-1BB, ICOS, OX40, CD27 and CD40. In an example, the second co-stimulatory domain is CD28 (e.g. SEQ ID NO: 8) .

[0151] Accordingly, in an example, the nucleic acid encoding an intracellular binding domain of the present disclosure encodes CD28 and TLR2 co-stimulatory domains, and a CD3ζ signal transduction domain, wherein the TLR2 co-stimulatory domain is interposed between the CD28 co-stimulatory domain and the CD3ζ. In an example, the TLR2 co-stimulatory domain is encoded by a nucleic acid which comprises the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, the CD28 co-stimulatory domain is encoded by the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO:8 and the CD3ζ is encoded by the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, wherein SEQ ID NO: 6 is interposed between SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO 10. For example, the intracellular domain can be encoded by a nucleic acid which comprises SEQ ID NO: 12.

[0152] The present disclosure also relates to polypeptides which comprise an intracellular domain. In an example, the polypeptide may be present in a chimeric antigen receptor. In one example, the polypeptide comprises an intracellular domain comprising a first co-stimulatory domain, which is interposed between a second costimulatory domain and a signal transduction domain. For example, the interposed costimulatory domain may be a TLR signaling domain. In an example, the TLR signaling domain is derived from Toll-like receptor 2 (TLR2) . For example, the TLR signaling domain may be Toll / interleukin-1 receptor domain of TLR2. In an example, the TLR2 signaling domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7. Accordingly, in an example, polypeptides of the present disclosure can comprise SEQ ID NO: 7, wherein SEQ ID NO: 7 is interposed between an amino acid sequence encoding another costimulatory domain and an amino acid sequence encoding a signal transduction domain. In an example, the TLR2 signaling domain comprises an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.

[0153] In an example, the signal transduction domain is CD3ζ. In an example, the CD3ζ has an amino acid sequence which comprises SEQ ID NO: 11.

[0154] In another example, the polypeptide has a TLR2 domain (e.g. SEQ ID NO: 7) which is interposed between a second co-stimulatory domain, such as CD28, and a CD3ζ signal transduction domain. In an example, the second co-stimulatory domain is a polypeptide selected from the group consisting of 4-1BB, ICOS, OX40, CD27 and CD40. In an example, the second co-stimulatory domain is CD28 (e.g. SEQ ID NO: 9) .

[0155] Accordingly, in an example, the polypeptide comprises CD28 co-stimulatory domain, a TLR2 co-stimulatory domain, and a CD3ζ signal transduction domain, wherein the TLR2 co-stimulatory domain is interposed between the CD28 co-stimulatory domain and the CD3ζ. In an example, the TLR2 co-stimulatory domain has an amino acid sequence which comprises SEQ ID NO: 7, the CD28 co-stimulatory domain has an amino acid sequence which comprises SEQ ID NO: 9 and the CD3ζ has an amino acid sequence which comprises SEQ ID NO: 11, wherein SEQ ID NO: 7 is interposed between SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO 11. For example, the intracellular domain may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The intracellular domain maly also comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20.

[0156] Chimeric antigen receptors (CARs)

[0157] "Chimeric antigen receptors” (abbreviated CARs) are receptors that have been engineered to bind and target a particular antigen that is not necessarily presented by a HLA molecule. A CAR generally comprises an extracellular antigen recognition domain (or antigen binding domain) , a transmembrane domain and an intracellular signaling domain. These components are often connected via one or more linkers. In the context of the present disclosure, the intracellular domain of the CAR comprises a co-stimulatory domain interposed between another co-stimulatory domain and a signal transduction domain. In an example, the interposed co-stimulatory domain is a TLR co-stimulatory domain such as TLR2 (e.g. SEQ ID NO: 7) .

[0158] In an example a CAR of the disclosure is encoded by the nucleic acid sequence shown in  SEQ ID NO: 15. In another example, a CAR of the disclosure comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. In another example, a CAR of the disclosure comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. Of course, in these examples, the CAR may not comprise the signal peptide corresponding to SEQ ID NO: 18. Accordingly, in another example, a CAR of the disclosure comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16. In another example, a CAR of the disclosure comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.

[0159] Extracellular antigen binding domain

[0160] The present disclosure provides a CAR, or polynucleotide encoding the CAR, comprising an extracellular antigen binding domain. In an example, the extracellular binding domain comprises an scFv.

[0161] ScFv’s comprise VH and VL regions in a single polypeptide chain and a polypeptide linker between the VH and VL which enables the scFv to form the desired structure for antigen binding (i.e., for the VH and VL of the single polypeptide chain to associate with one another to form a Fv) .

[0162] In one example, the linker is a peptide linker. For example, a peptide linker comprising at least 2 amino acids in length. In one example, the peptide linker is between 2 and 35 amino acids in length. For example, the linker is about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 amino acids in length. In another example, the linker is between about 10 and 20 amino acids in length. For example, the peptide linker is about 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 amino acids in length. In one example, the peptide linker is 15 amino acids in length. In another example, the peptide linker is between about 20 and 35 amino acids in length. For example, the peptide linker is about 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 or 35 amino acids in length.

[0163] Suitable linkers for use in the present disclosure for linking the VH and VL will be apparent to the skilled person and / or disclosed herein. Exemplary linkers include GS linkers. For example, the linker is selected from the group consisting of a GS linker, a GSGGS linker, a GGSSG linker, a GGGGS linker, a GSGSG linker, a (Gly4Ser) 3 linker, a (Gly) 8 linker, a (Gly) 6 linker and a (GGGS) n linker, wherein n=1, 2, 3 or 4.

[0164] In an example, the linker comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28. In another example, the linker comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29. In another example, the linker comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30.

[0165] In one example, the scFv is a humanised scFv. The term "humanized scFv” shall be understood to refer to a scFv having an antigen binding domain or variable region derived from an antibody from a non-human species (e.g., murine) and the remaining antibody structure based upon the structure and / or sequence of a human antibody. In a humanized scFv, the antigen-binding domain generally comprises the CDRs from the non-human antibody grafted onto appropriate FRs in the human variable regions and the antigen binding domains are modified by one or more amino acid substitutions. In some instances, FR residues of the human antibody are replaced by corresponding non-human residues.

[0166] Methods for modifying non-human antibodies or parts thereof (e.g., variable regions) are known in the art. Modification can be performed following the method of US5225539, or US5585089. Other methods for modifying an antibody are not excluded.

[0167] In an example the scFv specifically binds human CD19. CD19 is a 556 amino acid Type I transmembrane glycoprotein that is encoded by the CD19 gene located on the short arm of chromosome 16. It contains at least fifteen exons, four that encode extracellular domain and nine that encode cytoplasmic domains. In an example, the scFv is encoded by a nucleic acid molecule which comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 37. In an example, the scFv comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In another example, the scFv comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. In another example, the scFv comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21.

[0168] Accordingly, in an example, the present disclosure provides a CAR comprising an extracellular antigen binding domain comprising a scFv that specifically binds human cluster of differentiation 19 (CD19) antigen, wherein the scFv comprises:

[0169] (i) a VL comprising a CDR1 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 22; a CDR2 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 23; and a CDR3 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 24; and

[0170] a VH comprising a CDR1 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 25; a CDR2 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 26; and a CDR3 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 27.

[0171] In another example, the CAR comprising an extracellular antigen binding domain comprising a scFv that specifically binds human cluster of differentiation 19 (CD19) antigen, wherein the scFv comprises:

[0172] (i) a VL comprising a CDR1 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 31; a CDR2 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 32; and a CDR3 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 33; and

[0173] (ii) a VH comprising a CDR1 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 34; a CDR2 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 35; and a CDR3 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 36.

[0174] In another example, the scFv specifically binds human Glypican-3 (GPC3) . GPC3 is a a heparin sulphate proteoglycan that is associated with various solid tumours. It is encoded by the GPC3 gene. In an example, the scFv is encoded by a nucleic acid molecule which comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 38. In an example, the scFv comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.

[0175] Accordingly, in an example, the CAR comprising an extracellular antigen binding domain comprising a scFv that specifically binds human GPC3, wherein the scFv comprises:

[0176] (i) a VL comprising a CDR1 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 39; a CDR2 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 40; and a CDR3 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 41; and

[0177] (ii) a VH comprising a CDR1 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 42; a CDR2 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 43; and a CDR3 comprising a sequence set forth in SEQ ID NO: 44.

[0178] In an example, the extracellular binding domain comprises a signal peptide. In an example, the signal peptide is a CD8α signal peptide. In an example, the signal peptide is a GM-CSF signal peptide.

[0179] In an example, the extracellular binding domain comprises a single variable domain on a heavy chain (VHH) . In an example, the extracellular binding domain comprises a nanobody. In an example, the VHH is a nanobody.

[0180] Single variable domain on a heavy chain (VHH) , also known as nanobodies, have also been used as the extracellular binding domain of CARs. Nanobodies are derived from the variable domain of heavy chain-only antibodies (HcAbs) . Naturally, animals from the Camelidae family as well as sharks produce HcAbs. Nanobodies recognize and bind their target antigen with similar binding ability and specificity in comparison with those of traditional full-length mAbs or scFvs. Moreover, the solubility and stability of nanobodies are also comparable to those of full-length mAbs. Of note, nanobodies possess these characteristics even in the absence of the variable light-chain (VL) and constant domains.

[0181] Transmembrane Domain and Hinge region

[0182] In certain examples, CARs of the present disclosure comprise a transmembrane domain. The transmembrane domain anchors the CAR to the cell membrane of a cell, with the antigen-binding domain in the extracellular space and intracellular domain (i.e. the interposed co-stimulatory domain) inside the cell.

[0183] In one example, the transmembrane domain comprises or consist of a sequence of amino acids which forms a hydrophobic alpha helix or beta-barrel. The amino acid sequence of the transmembrane domain of the CAR of the present disclosure may be, or may be derived from, the amino acid sequence of a transmembrane domain of a protein comprising a transmembrane domain. Transmembrane domains are recorded in databases such as GenBank, UniProt, Swiss-Prot, TrEMBL, Protein Information Resource, Protein Data Bank, Ensembl, and InterPro, and / or can be identified / predicted e.g. using amino acid sequence analysis tools such as TMHMM (Krogh et al., J Mol Biol (2001) 305: 567-580) .

[0184] In one example, the transmembrane domain is from a CD8 molecule or a CD28 molecule. For example, the transmembrane domain is a CD8α. In another example, the transmembrane domain is a CD28 molecule.

[0185] In one example, the transmembrane domain is human. For example, the transmembrane domain is a human CD8. In another example, the transmembrane domain is a human CD28.

[0186] In one example, the transmembrane domain that can be directly or indirectly connected to the extracellular antigen binding domain.

[0187] In one example, the transmembrane domain is directly connected to the extracellular antigen binding domain.

[0188] In one example, the transmembrane domain is indirectly connected to the extracellular antigen binding domain. For example, the extracellular antigen binding domain is operably linked to the transmembrane domain through a hinge region. In one example, the CAR further comprises a hinge region located between the C-terminus of the extracellular antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain.

[0189] The hinge region not only provides separation between the antigen binding domain and the transmembrane domain but also allows the binding moiety to orient in different directions.

[0190] Intracellular domain

[0191] Intracellular domains according to the present disclosure comprise an interposed TLR domain. TLRs are type I transmembrane receptors belonging to a class of pattern recognition receptors (PRR) that play a role in recognizing microorganisms that are invading the body and thus activating immune cell responses. Thus, TLRs play a key role in the functionality of the innate immune system. TLR1 and TLR2 are important members of the Toll-like receptor family. The TLR signaling domain is part of the intracellular signaling region, also known as a TLR domain.

[0192] The inventors have advantageously found that incorporation of a TLR signaling domain in a particular position on a CAR intracellular domain results in certain advantages in CAR-T cell therapy. Specifically, the inventors observed these improved properties when the TLR signaling domain, acting as a first costimulatory domain, is interposed between a second costimulatory domain and the signal transduction domain. These findings are unexpected as the inventors have shown for the first time that the presence of costimulatory domains in the configuration as described herein modulates or improves the intracellular signaling and subsequent activation of T-cells. As shown within the Examples, and in particular Figures 7-9, an exemplary form of the presently described CAR intracellular domain (in the data within these Figures, a third generation CAR T-cell was utilised) resulted in lower cytokine production compared to another third generation CAR T-cell that did not comprise an interposed TLR signaling domain. This suggests that the lower cytokine production is not a general feature of any third generation CAR T-cell, but rather an advantageous property of the presently described CAR intracellular domain.

[0193] In some embodiments, the Toll-like receptor (called TLR) signaling domain is a TLR1 or TLR2 signaling domain. In an example, the TLR signaling domain is a TLR2 signaling domain.

[0194] In one example, the CAR of the present disclosure comprises, from N-terminus to C-terminus, an extracellular antigen binding domain such as an scFv, a hinge region, a transmembrane domain and an intracellular domain which comprises an interposed TLR  co-stimulatory domain disclosed herein.

[0195] In an example, the CAR comprises an intracellular domain comprising a first co-stimulatory domain, which is interposed between a second costimulatory domain and a signal transduction domain. For example, the interposed costimulatory domain may be a TLR signaling domain. In an example, the TLR signaling domain is derived from Toll-like receptor 2 (TLR2) . For example, the TLR signaling domain may be Toll / interleukin-1 receptor domain of TLR2. In an example, the TLR2 signaling domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7. In an example, the signal transduction domain is CD3ζ. In an example, the CD3ζ has an amino acid sequence which comprises SEQ ID NO: 11. In another example, the CAR has an intracellular domain which comprises a TLR2 domain (e.g. SEQ ID NO: 7) which is interposed between a second co-stimulatory domain, such as CD28, and a CD3ζ signal transduction domain. In an example, the CAR comprises a CD28 co-stimulatory domain, a TLR2 co-stimulatory domain, and a CD3ζ signal transduction domain, wherein the TLR2 co-stimulatory domain is interposed between the CD28 co-stimulatory domain and the CD3ζ. In an example, the TLR2 co-stimulatory domain has an amino acid sequence which comprises SEQ ID NO: 7, the CD28 co-stimulatory domain has an amino acid sequence which comprises SEQ ID NO: 9 and the CD3ζ has an amino acid sequence which comprises SEQ ID NO: 11, wherein SEQ ID NO: 7 is interposed between SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO 11. For example, CAR can comprise an intracellular domain which comprises SEQ ID NO: 1. The CAR may also comprise an intracellular domain which comprises SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20.

[0196] In one example, the intracellular domain also comprises an ITAM-containing sequence. An ITAM-containing sequence comprises one or more immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs) . ITAMs comprise the amino acid sequence YXXL / I, wherein “X” denotes any amino acid. In ITAM-containing proteins, ITAM sequences are often separated by 6 to 8 amino acids. When phosphate groups are added to the tyrosine residue of an ITAM by tyrosine kinases, a signalling cascade is initiated within the cell. In an example, the ITAM containing sequence is CD3ζ.

[0197] Vectors

[0198] The present disclosure also provides a vector comprising the nucleic acid molecules disclosed herein.

[0199] Suitable vectors and methods of preparing a vector will be apparent to the skilled person and / or described herein. For example, the vector can be a transposon vector, a plasmid, a cosmid, a phage or a viral vector. In one example, the viral vector is a lentiviral vector, an adeno-associated viral vector (AAV) , an adenoviral vector, a herpes simplex viral (HSV) vector or a retroviral vector. In one example, the transposon vector is a PiggyBac (PB) transposon vector or a Sleeping Beauty (SB) transposon vector.

[0200] In an example, the viral vector is derived from the genome of an adenovirus (e.g. Ad5) , an adeno-associated virus (e.g. AAV2, 3, 5, 6, 8 or 9) , a herpes simplex virus (e.g. HSV, HSV1) , a retrovirus (e.g. avian leukosis virus (ALV) , mouse mammary tumour virus (MMTV) , murine leukemia virus (MLV) , human T-lymphotropic virus (HTLV) , Walleye dermal sarcoma virus (WDSV) or murine stem cell virus (MSCV) ) , a spumavirus (e.g., a human foamy virus (HFV) or simian foamy virus (SFV) ) , a lentivirus (e.g. simian immunodeficiency viruses (SIV) , equine infectious anemia virus (EIAV) , feline immunodeficiency virus (FIV) , caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) , or the ovine visna-maedi virus (VMV) ) , an alphavirus (e.g. Semliki forest virus (SFV) , Sindbis virus (SIN) , Venezuelan equine encephalitis (VEE) ) , a flavivirus (e.g. Kunjin, West Nile, Dengue) , a rhabdovirus (e.g. rabies) , a measles virus, (e.g. MV-Edm) , Newcastle disease virus, a poxvirus (e.g. Vaccinia virus) or a picornavirus (e.g. Coxsackievirus) .

[0201] In another example, the viral vector is derived from the genome of a retrovirus. For example, the viral vector is a retroviral vector.

[0202] In another example, the viral vector is derived from the genome of a lentivirus. For example, the viral vector is a lentiviral vector. In one example, the lentiviral vector is a pseudotyped lentiviral vector. In another example, the lentiviral vector is a self-inactivating lentiviral vector.

[0203] In another example, the viral vector is derived from the genome of human immunodeficiency virus (HIV) . For example, the viral vector is derived from the genome of HIV-1. It will be apparent to the skilled person that to increase safety, the viral vector only contains HIV genes which are necessary for infection and gene delivery, whilst the genes necessary for replication and virulence factors have been removed. For example, the envelope protein of HIV-1 is exchanged with that of another virus (e.g., VSV-G protein from Vesicular stomatitis Indiana virus (VSV) ) to allow infection of a wide range of target cells.

[0204] Methods for the production of viruses, viral vectors and viral particles will be apparent to the skilled person and / or described, for example, in Ansorge et al., (2010) Biochem. Eng. J. 48: 362-377; Schweizer and Merten (2010) Curr. Gene Ther. 10: 474-486; and Rodrigues et al., (2011) Viral Gene Therapy. Xu, InTech. Chapter 2: 15-40. Other suitable methods are exemplified below. For example, the methods generally involve introducing plasmids encoding a nucleic acid molecule of the disclosure together with packaging components encoding the structural proteins required for virion assembly. These plasmids can be transiently transfected into the cells, or a producer cell line is created with stable integration of the plasmids with inducible promoters, in which virus (e.g. lentivirus) production can be induced. Once virus production has been induced, the release of the virus occurs by budding after successful assembly within the cells. The virus (e.g. lentivirus) (comprising the nucleic acid molecule encoding the CAR of the disclosure introduced into its genome) is harvested from these producer cells and subsequently purified and concentrated for use in the downstream process, e.g., in the transduction of immune cells.

[0205] The skilled person will be aware of the cell types suitable for transfection with viral plasmids (e.g. producer cells, or ‘host’ cell) . For example, mammalian cells are well known hosts for the production of viral vectors and are suitable for transfection with viral plasmids.

[0206] As used herein, “transfection” , “transformation” , or transduction” refer to the introduction of one or more exogenous polynucleotides into a cell by using physical or chemical methods.

[0207] The host or producer cell may be selected from any cell allowing production of e.g., the lentivirus. According to one example, the cell is selected from a human cell (HEK293T, HEK293FT, HEK293S, HEK29FTM, HEK293SG, HEK293SGGD, HEK293H, HEK293E, HEKEBNA1-6E, HEK293MSR and HEK293A cells) , a musteli cell (NIH-3T3) , a mustelidae cell (Mpf) , a canid cell (D17) , and derivatives thereof. According to one example, the cell is selected from CHO cells, BHK cells, MDCK cells, C3H 10T1 / 2 cells, FLY I, Psi-2 cells, BOSC 23 cells, PA317 cells, WEHI cells, COS cells, BSC 1 cells, BSC 40 cells, BMT 10 cells, VERO cells, W138 cells, MRC5 cells, A549 cells, HT1080 cells, B-50 cells, 3T3 cells, NIH3T3 cells, HepG2 cells, Saos-2 cells, Huh7 cells, HeLa cells, W163 cells, 211 cells, and 211 A cells, and derivatives thereof.

[0208] The skilled person will be aware that in addition to the nucleic acid sequences encoding the CAR, the vector additionally comprises expression control sequences, such as promoters, enhancers, polyadenylation signals, transcription terminators and internal ribosome entry sites (IRES) , that provide for the expression of the polynucleotide sequence in the host cell. Exemplary expression control sequences are known in the art and described in, for example, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) .

[0209] Genetically Modified Cells

[0210] The present disclosure also provides a genetically modified cell comprising a nucleic acid molecule of the disclosure, a polypeptide of the disclosure and / or a vector of the disclosure.

[0211] As used herein, the term “cell” refers to any type of cell that can contain one or more or all of these elements. For example, the cell is modified to express an expression vector (e.g., a retroviral, lentiviral, adenoviral, adeno-associated viral vector) . In one example, the cell comprises a nucleic acid molecule of the present disclosure. In one example, the cell is modified to express a nucleic acid molecule of the present disclosure. In another example, the cell is modified to express a polypeptide of the disclosure. For example, the cell can be modified to express a CAR of the present disclosure.

[0212] Methods of genetically modifying cells with viral vectors will be apparent to the skilled person and / or described herein. For example, the lentivirus (comprising the polynucleotide encoding the CAR of the disclosure introduced into its genome) is harvested from the producer cells and applied to the cells to be modified, resulting in expression of the CAR of the disclosure by the modified cell.

[0213] In an example, the cell is a cultured cell or a primary cell, i.e., isolated directly from an organism (e.g., a human) .

[0214] In an example, the cell is an immune cell. For example, the cell is an immune effector cell. In one example, the immune effector cell expresses FcγRIII and performs antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) effector function.

[0215] In an example, the immune effector cell is selected from the group consisting of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , natural killer (NK) cells, monocytes, T cells, neutrophils, eosinophils and combinations thereof.

[0216] In an example, the cell is of hematopoietic origin. For example, the cell is a neutrophil, an eosinophil, a basophil, a lymphocyte, or a monocyte. In one example, the lymphocyte is a T cell, a B cell, a NK cell or precursor thereof.

[0217] In an example, the cell expresses CD3 polypeptides. For example, the cell expresses a CD3γ, a CD3ε, a CD3ζ or CD3δ polypeptide.

[0218] In an example, the cell expresses a T cell receptor (TCR) polypeptide. For example, a TCRα or TCRβ polypeptide.

[0219] In an example, the cell expresses CD27, CD28, CD4 and / or CD8. For example, the cell can express CD4 and / or CD8.

[0220] In one example, the cell is a T-cell. For example, the T-cell is a human T-cell. For example, the T-cell can be isolated from a human. In one example, the T cells are autologous T cells. In one example, the T cells are allogeneic T cells.

[0221] In an example, the T-cell is of any developmental stage. Stages of T cell differentiation include T cells, stem central memory T cells, central memory T cells, effector memory T cells, and terminal effector T cells, from least to most differentiated. Methods of identifying T cells at different stages of differentiation will be apparent to the skilled person and / or described herein. For example,  T cells express the cell surface markers CCR7+, CD62L+, CD45RO-, CD95-, stem central memory T cells (Tscm) express CCR7+, CD62L+, CD45RO-, CD95+, central memory T cells (Tcm) express CCR7+, CD62L+, CD45RO+, CD95+, effector memory T cells (Tem) express CCR7-, CD62L-, CD45RO+, CD95+, and terminal effector T cells (Teff) express CCR7-, CD62L-, CD45RO-, CD95+.

[0222] In an example, the T cell is a gamma delta (γδ) T cell, a cytotoxic T cell, or a helper T cell. In another example, the T cell is a CD3+ / CD8+ T cell. In another example, the T cell is a CD4+ / CD8+ double positive T-cell, a CD4+ helper T-cell, (e.g., Th and Th2 cells) , a CD8+ T-cell (e.g., a cytotoxic T-cell) , a tumour infiltrating cell, a memory T-cell, or a naive T-cell. In one embodiment, the T-cell is a CD8+ T-cell or a CD4+ T-cell. Suitable T-cell lines for use in the present disclosure will be apparent to the skilled person and / or described herein. For example, suitable T cell lines are available from, e.g., the American Type Culture Collection (ATCC) , and the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) and include, for example, K-562 cells (ATCC CCL-243) , Jurkat cells (ATCC TIB-152) , Sup-Tl cells (ATCC CRL-1942) , RPMI 8402 cells (DSMZ ACC-290) , Karpas 45 cells (DSMZ ACC-545) , and derivatives thereof.

[0223] In an example, the cell is a natural killer (NK) cell. In one example, the NK cell is a human NK cell. For example, the NK cell is isolated from a human. In one example, the NK cells are autologous NK cells. In one example, the NK cells are allogeneic NK cells. In one example, the NK cells are engineered allogeneic NK cells. Exemplary NK cell lines suitable for use in the present disclosure are available from, e.g., the American Type Culture Collection (ATCC) and include, for example, NK-92 cells (ATCC CRL-2407) , NK92MI cells (ATCC CRL-2408) , and derivatives thereof.

[0224] In an example, the cell is a stem cell. In an example, the stem cell is derived from bone marrow or adipose tissue. In an example, the stem cell is an induced pluripotent stem cell (iPS cell) . In certain examples, the stem cell may be an embryonic stem cell.

[0225] Methods of obtaining cells (e.g., T cells or NK cells) suitable for use in the present disclosure will be apparent to the skilled person and / or described herein.

[0226] In an example, the cell is a cultured cell, a primary cell, or a cell from a cultured cell line, or a cell obtained from a mammal. In one example, the cell is a cultured cell. In another example, the cell is a primary cell. In a further example, the cell is a cultured cell line. In one example, the cell is a cell obtained from a mammal (e.g., a human subject) . In one example, the cell has been previously obtained from the subject (i.e., the human subject) . In one example, the cells have been obtained from a tissue sample or biopsy.

[0227] It will be apparent to the skilled person that if obtained from a mammal, the cell can be obtained from numerous sources, including but not limited to blood, bone marrow, lymph node, the thymus, or other tissues or fluids. Cells for use in the present disclosure can also be enriched for or purified. Such methods may involve removing or substantially reducing the amount of, erythrocytes, platelets, serum and / or plasma in a sample. Methods disclosed herein may be performed on isolated immune cells, or a sample containing immune cells in addition to other cells.

[0228] In an example, the genetically modified cell of the disclosure is a CAR-expressing immune cell. In another example, the genetically modified cell of the disclosure is a CAR-T cell. In a further example, the genetically modified cell of the disclosure is a CAR-NK cell.

[0229] In an example, methods of producing a genetically modified cell of the disclosure comprises the stimulation and / or expansion of the immune cell. For example, stimulation and / or expansion of PBMCs or an immune cell population (e.g., T cells) from within a population of immune cells (e.g., PBMCs) . In one example, a population of T-cells is expanded from within a population of PBMCs by stimulation of the T-cells within the population of PBMCs. In one example, stimulation and / or expansion of T cells involves stimulation of a population of PBMCs. In one example, a population of T-cells are expanded from within a population of tumor-infiltrating lymphocytes, by stimulation of the T-cells within the population of tumor-infiltrating lymphocytes. For example, in one example, stimulation and / or expansion of T cells involves stimulation of a population of tumor-infiltrating lymphocytes. In one example, a population of T-cells are expanded from within a population of T-cells (e.g. a population of T cells of heterogeneous specificity) obtained from a blood sample, a population of PBMCs, or from a population of tumor-infiltrating lymphocytes. In one example, the method involves the stimulation and / or expansion of T cells.

[0230] Pharmaceutical Compositions

[0231] The present disclosure provides a composition comprising a population of genetically modified cells of the disclosure for use as a medicament. In one example, the present disclosure provides a composition for use in adoptive cell therapy. For example, adoptive T cell therapy.

[0232] Accordingly, the present disclosure provides a composition comprising a population of genetically modified cells of the disclosure and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0233] The present disclosure also provides a composition comprising a population of CAR-T cells, wherein the CAR-T cells express a CAR comprising an scFv and an intracellular domain,  wherein the intracellular domain comprises two co-stimulatory domains and a signal transduction domain, wherein a first co-stimulatory domain is a Toll-like receptor (TLR) signaling domain and wherein the TLR signaling domain is interposed between a second costimulatory domain and the signal transduction domain.

[0234] The present disclosure also provides a composition comprising a population of CAR-T cells, wherein the CAR-T cells express a CAR comprising an scFv and an intracellular domain of the present disclosure.

[0235] The present disclosure also provides a composition comprising a population of CAR-T cells, wherein the CAR-T cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 4 or 5. In one example, the CAR-T cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 4. In one example, the CAR-T cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 5.

[0236] The present disclosure also provides a composition comprising a population of CAR-T cells, wherein the CAR-T cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 4 or 5, and wherein the CAR-T cells in the composition are characterized by the following expression profile: 45 to 55%CD4+, 35 to 45%CD8+, and 30 to 40%CD62L+, based on the total number of cells in the composition.

[0237] Compositions for in vivo transduction are also envisaged, i.e, administration of nucleic acid molecules or recombinant vectors of the present disclosure specifically to the subject, thus resulting in the CAR-T cells being generated within the patient, rather than the CAR T-cells being made exogenously then delivered.

[0238] Accordingly, the present disclosure also provides a composition comprising a nucleic acid molecule of the disclosure or the recombinant vector according to the disclosure.

[0239] In an example, the CAR-T cells in the composition comprise 39%CD4+ cells, based on the total number of cells in the composition.

[0240] In an example, the CAR-T cells in the composition comprise 41%CD8+ cells, based on the total number of cells in the composition.

[0241] In an example, the CAR-T cells in the composition comprise 34%CD62L+ cells, based on the total number of cells in the composition.

[0242] It will be apparent to the skilled person that the population of genetically modified cells of the disclosure, e.g., population of genetically modified T cells, comprises a population of cells at different stages of differentiation.

[0243] Methods for preparing a compound into a suitable form for administration (e.g. a pharmaceutical composition) are known in the art and include, for example, methods as described in Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990) .

[0244] An appropriate pharmaceutical composition comprising a population of genetically modified cells to be administered can be prepared in a physiologically acceptable carrier. Intravenous vehicles may be used and can include various additives, preservatives, or fluid, nutrient or electrolyte replenishers (See, generally, Remington’s Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980) . The compositions can optionally contain pharmaceutically acceptable auxiliary substances as required to approximate physiological conditions such as pH adjusting and buffering agents and toxicity adjusting agents, for example, sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride and sodium lactate.

[0245] In an example, the composition additionally comprises human serum albumin.

[0246] In an example, the composition additionally comprises dimethylsulfoxide (DMSO) . In an example, the composition additionally comprises PlasmaLyte.

[0247] Upon formulation, compositions of the present disclosure will be administered in a manner compatible with the dosage formulation and in such amount as is therapeutically effective. The dosage ranges for the administration of the composition of the disclosure are those large enough to produce the desired effect. For example, the composition comprises an effective amount of the population of genetically modified cells. In one example, the composition comprises a therapeutically effective amount of the genetically modified cells.

[0248] The dosage should not be so large as to cause unreasonable adverse side effects. Generally, the dosage will vary with the age, condition, sex and extent of the disease in the patient and can be determined by one of skill in the art. The dosage can be adjusted by the individual physician in the event of any complication.

[0249] In an example, the composition is formulated for infusion, e.g., via intravenous infusion.

[0250] In an example, the composition comprises between 5 x 104 to 6 x 108 cells / kg of the CAR-T cells. In one example, the composition comprises between 5 x 104 to 3 x 106 cells / kg of the CAR-T cells. In one example, the composition comprises between 5 x 104 to 1 x 106 cells / kg of the CAR-T cells. For example, the composition comprises about 5 x 104 cells / kg of the CAR-T cells. In another example, the composition comprises about 5 × 105 cells / kg of the CAR-T cells. In another example, the composition comprises about 1 × 106 cells / kg of the CAR-T cells. In one example, the composition comprises less than 1.0 x 106 cells per / kg of the CAR-T cells.

[0251] In an example, the CAR-T cells are formulated at a dose between 5 x 104 to 6 x 108 cells / kg. In one example, the CAR-T cells are formulated at a dose between 5 x 104 to 3 x 106 cells / kg. In one example, the CAR-T cells are formulated at a dose between 5 x 104 to 1 x 106 cells / kg. For example, the CAR-T cells are formulated at a dose of about 5 x 104 cells / kg. In another example, the CAR-T cells are formulated at a dose of about 5 × 105 cells / kg. In another example, the CAR-T cells are formulated at a dose of about 1 × 106 cells / kg. In one example, the CAR-T cells are formulated at a dose of less than 1.0 x 106 cells per / kg.

[0252] Methods of Treatment

[0253] The present disclosure provides a method of treating a proliferative disease in a subject in need thereof, the method comprising administering the nucleic acid molecule of the disclosure, the CAR according to the disclosure, the recombinant vector according to the disclosure, the population of immune cells according to the disclosure, or the population of genetically modified stem cell according to the disclosure.

[0254] The present disclosure also provides a nucleic acid molecule of the disclosure, a CAR according to the disclosure, a recombinant vector according to the disclosure, a population of immune cells according to the disclosure, or a population of genetically modified stem cells according to the disclosure for use in treating a proliferative disease in a subject in need thereof.

[0255] The present disclosure also provides the use of a nucleic acid molecule of the disclosure, a CAR according to the disclosure, a recombinant vector according to the disclosure, a population of immune cells according to the disclosure, or a population of genetically modified stem cells according to the disclosure in the manufacture of a medicament for treating a proliferative disease in a subject in need thereof.

[0256] In an example, the proliferative disease is a malignant “liquid cancer” . These cancers are generally found in blood. In an example, the liquid cancer is CD19+. In another example, the proliferative disease is a “solid cancer” . These cancers are not generally found in blood unless a primary tumour has spread to the blood stream (e.g. metastasized) . In an example, the solid cancer is GPC3+.

[0257] In an example, the proliferative disease is a CD19-expressing or CD19-associated proliferative disease. In an example, the proliferative disease is responsive to CD19 antibody therapy.

[0258] For example, the present disclosure encompasses a method of treating a CD19-expressing malignant proliferative disease in a subject in need thereof, comprising administering the composition of the present disclosure. In an example, the CD19-malignant proliferative disease is Relapse or Refractory B-cell Non-Hodgkin Lymphoma.

[0259] In another example, the CD19-expressing malignant proliferative disease is Relapse or Refractory B-cell Non-Hodgkin Lymphoma.

[0260] In another example, treatment according to the present disclosure relates to treatment of Relapse or Refractory B-cell Non-Hodgkin Lymphoma, and wherein between 5 × 104 and 1 × 106 CAR-T cells are administered per kilogram body weight of the subject.

[0261] The present disclosure provides a method of treating an autoimmune disease in a subject in need thereof, the method comprising administering the nucleic acid molecule of the disclosure, the CAR according to the disclosure, the recombinant vector according to the disclosure, the population of immune cells according to the disclosure, or the population of genetically modified stem cell according to the disclosure.

[0262] In an example, the autoimmune disease is an antibody-mediated autoimmune disease.

[0263] In an example, the autoimmune disease is a CD19-expressing or CD19-associated autoimmune disease. In an example, the autoimmune disease is responsive to CD19 antibody therapy.

[0264] In an example, the autoimmune disease includes, but is not limited to, systemic lupus erythematosus, autoimmune encephalitis, myasthenia gravis, systemic sclerosis,  syndrome, mixed connective tissue disorder, type 1 diabetes, pemphigus, autoimmune hemolytic anemia, immune thrombocytopenic purpura, thrombotic thrombocytopenic purpura, multiple sclerosis, asthma, psoriasis, rheumatoid arthritis, Hashimoto’s thyroiditis and Crohn’s disease.

[0265] The treatment of the present disclosure encompass allogeneic immunotherapy. Allogeneic immunotherapy involves transformation of immune cells such as T-cells from donor (s) into non-alloreactive cells. A number of standard protocols are known in the art to isolate these immune cells, and subsequently genetically modify them using the nucleic acid molecule of the disclosure, the CAR according to the disclosure, or the recombinant vector according to the disclosure. These genetically modified cells may be pooled from multiple donors and administered to the subject in need thereof. These genetically modified cells may also be provided as an “off the shelf” therapeutic product.

[0266] In an example, the proliferative disease is a malignant or benign tumor disease. In one example, the proliferative disease is a malignant tumor disease. In one example, the proliferative disease is a benign tumor disease.

[0267] In an example, the proliferative disease is a CD19-expressing malignant proliferative disease. In an example, the proliferative disease is a CD19-expressing malignant tumour disease.

[0268] In an example, the CD19-expressing malignant proliferative disease is selected from the group consisting of acute lymphoblastic leukemia (ALL) such as B-cell acute lymphoblastic leukemia (BALL) and T-cell acute lymphoblastic leukemia (TALL) , chronic myelogenous leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , Burkitt's lymphoma, B-cell non-Hodgkin lymphoma (including large B-cell lymphomas such as diffuse large B cell lymphoma, primary mediastinal B-cell lymphoma or follicular large cell lymphoma; indolent B-cell lymphomas such as marginal zone lymphomas, MALT lymphoma and mantle cell lymphoma) , follicular lymphomas, hairy cell leukemia, malignant lymphoproliferative conditions, multiple myeloma, variants of myeloma such as plasmacytoma and amyloidosis, non-Hodgkin's lymphoma, plasmablastic lymphoma, plasmacytoid dendritic cell neoplasm, and preleukemia.

[0269] In an example, the malignant proliferative disease is Relapse or Refractory B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. In an example, the malignant proliferative disease is Relapse B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. In an example, the malignant proliferative disease is Refractory B-cell Non-Hodgkin Lymphoma.

[0270] In an example, the malignant proliferative disease is a solid tumour.

[0271] In an example, the solid tumour is GPC3+.

[0272] Glypican-3 (GPC3) is a heparan sulfate proteoglycan bound to the cell membrane and expressed in the liver and the kidney of healthy fetuses but is hardly expressed in adults, except in the placenta. Contrarily, GPC3 is specifically expressed in hepatocellular carcinoma (HCC) , ovarian clear cell carcinoma, melanoma, squamous cell carcinoma of the lung, hepatoblastoma, nephroblastoma (Wilms tumor) , yolk sac tumor, and some pediatric cancers.

[0273] In an example, the GPC3+ solid tumour is a liver cancer, a skin cancer, preferably melanoma, an ovarian cancer, a lung cancer, a renal cancer, preferably Wilms tumour, or, a yolk sac tumour. In an example, the GPC+ solid tumour is prostate cancer.

[0274] In an example, the malignant proliferative disease is a CD19-expressing malignant proliferative disease.

[0275] The treatment may be administered alongside or in combination with one or more therapies.

[0276] In an example, the treatment is administered in combination with one or more therapies selected from the group consisting of: antibody therapy, chemotherapy, cytokine therapy, gene therapy, hormone therapy, surgical therapy and radiation therapy. In an example, the cells are administered in conjunction or in combination with one or more therapies before, simultaneously or following the one or more therapies. In an example, the antibody therapy is bispecific antibody therapy. In an example, the bispecific antibody is an immunotherapeutic bispecific antibody. In an example, the bispecific antibody is an anti-cancer bispecific antibody.

[0277] In an example, the method comprises administering between 5 x 104 to 6 x 108 cells / kg. In one example, the method comprises administering between 5 x 104 to 3 x 106 cells / kg. In one example, the method comprises administering between 5 x 104 to 1 x 106 cells / kg. For example, the method comprises administering about 5 x 104 cells / kg. In another example, the method comprises administering about 5 × 105 cells / kg. In another example, the method comprises administering about 1 × 106 cells / kg. In one example, the method comprises administering less than 1.0 x 106 cells per / kg.

[0278] In an example, the cells are administered systemically, which refers to the administration of cells other than directly into a target site, tissue, or organ, such that it enters, instead, through the subject’s circulatory system. In an example, a composition of the disclosure is administered by intravenous (i.v. ) injection. In another example, the cells are administered directly into a target site, tissue, or organ. The cells may also be injected directly into a tumor, lymph node, or site of infection.

[0279] Immunotherapies are sometimes associated with toxic side effects and immunogenicity from the infusion and treatment of these modified immune cells. CRS and ICANS are among potential side effects of treatment with biologics; symptoms of CRS and ICANS may appear immediately or hours or days following infusion.

[0280] Cytokine Release Syndrome (CRS)

[0281] CRS is a major toxicity reported with certain CAR-T cell therapies. CRS is due to hyperactivation of the immune system in response to CAR engagement of the target antigen, resulting in multi-cytokine elevation from rapid T cell stimulation and proliferation (Frey et al., (2014) Blood, 124, 2296; Maude et al., (2014) Cancer J, 20, 119-122) . When cytokines are released, a variety of clinical signs and symptoms associated with CRS may occur, including cardiac, gastrointestinal (GI) , neurological, respiratory (dyspnea, hypoxia) , skin, cardiovascular (hypotension, tachycardia) , and constitutional (fever, rigors, sweating, anorexia, headaches, malaise, fatigue, arthralgia, nausea, and vomiting) symptoms, and laboratory (coagulation, renal, and hepatic) abnormalities.

[0282] The goal of CRS management is to prevent life-threatening sequelae while preserving the potential for the antitumor effects of the engineered T-cells. Symptoms usually occur 1 to 14 days after CAR T cell therapy, but may occur in the months following therapy.

[0283] CRS should be identified and treated based on clinical presentation and not rely solely on laboratory cytokine measurements. Since the establishment of the original CRS grading criteria, physicians using CAR T cell therapies have gained further understanding of the presentation and time course of CRS. This understanding has led to clinicians revising the CRS grading criteria and toxicity management algorithms to reflect the ASBMT consensus proposal laid out in Table 2 based on clinical experience with published CAR T cell therapies. However, it should be appreciated that the administering medical professional or clinician may elect to revise the CRS  grading criteria and toxicity management algorithms to reflect the CRS grading based on other known grading schema, i.e., the Lee criteria, Penn criteria, MSKCC criteria, or CARTOX criteria.

[0284] Table 2. ASTCT CRS Consensus Grading

[0285] Organ toxicities associated with CRS may be graded according to CTCAE v5.0 but they do not influence CRS grading.

[0286] * Fever is defined as temperature ≥38℃ not attributable to any other cause. In subjects who have CRS then receive antipyretic or anticytokine therapy such as tocilizumab or steroids, fever is no longer required to grade subsequent CRS severity. In this case, CRS grading is driven by hypotension and / or hypoxia.

[0287] CRS grade is determined by the more severe event: hypotension or hypoxia not attributable to any other cause. For example, a subject with temperature of 39.5℃, hypotension requiring 1 vasopressor, and hypoxia requiring low-flow nasal cannula is classified as grade 3 CRS.

[0288] Low-flow nasal cannula is defined as oxygen delivered at ≤6L / minute. Low flow also includes blow-by oxygen delivery, sometimes used in pediatrics. High-flow nasal cannula is defined as oxygen delivered at >6L / minute.

[0289] Immune Effector Cell-associated Neurotoxicity Syndrome (ICANS)

[0290] Neurotoxicity has been observed with certain CAR T cell therapies. It may occur at the time of CRS, during the resolution of CRS, or following resolution of CRS, and its pathophysiology is unclear. The recent ASBMT consensus further defined neurotoxicity associated with CRS as immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome (ICANS) , a disorder characterized by a pathologic process involving the CNS following any immune therapy that results in activation or engagement of endogenous or infused T cells and / or other immune effector cells (Lee et al., (2018) Biol Blood Marrow Transplant) . Signs and symptoms can be progressive and may include aphasia, altered level of consciousness, impairment of cognitive skills, motor weakness, seizures, and cerebral edema. ICANS grading was developed based on CAR T cell-therapy-associated TOXicity (CARTOX) working group criteria used previously in autologous CAR T cell trials (Neelapu et al., (2018) N Engl J Med, 377, 2531-2544) . ICANS incorporates assessment of level of consciousness, presence / absence of seizures, motor findings, presence / absence of cerebral edema, and overall assessment of neurologic domains by using a modified assessment tool called the ICE (immune effector cell-associated encephalopathy) assessment tool (see Table 3) .

[0291] Table 3. ASTCT ICANS Consensus Grading for Adults

[0292] ICANS grade is determined by the most severe event (ICE score, level of consciousness, seizure, motor findings, raised ICP / cerebral edema) not attributable to any other cause; for example, a subject with an ICE score of 3 who has a generalized seizure is classified as grade 3 ICANS.

[0293] N / Aindicates not applicable.

[0294] * A subject with an ICE score of 0 may be classified as grade 3 ICANS if awake with global aphasia, but a subject with an ICE score of 0 may be classified as grade 4 ICANS if unarousable.

[0295] Depressed level of consciousness should be attributable to no other cause (eg, no sedating medication) .

[0296] Tremors and myoclonus associated with immune effector cell therapies may be graded according to CTCAE v5.0, but they do not influence ICANS grading.

[0297] § Intracranial hemorrhage with or without associated edema is not considered a neurotoxicity feature and is excluded from ICANS grading. It may be graded according to CTCAE v5.0.

[0298] Following each dosing of cells, the subject may be monitored for acute toxicities manifesting as cytokine release syndrome (CRS) , immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome (ICANS) , B cell aplasia, hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) , cytopenia, graft-versus-host disease (GvHD) , hypertension, renal insufficiency, or a combination thereof.

[0299] In an example, treatment methods of the present disclosure do not result in cytokine release syndrome (CRS) and / or immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome (ICANS) .  Accordingly, in certain examples, treatment methods of the present disclosure encompass administration of a cell population or composition disclosed herein, wherein a treated subject does not develop CRS and / or ICANS after administration (e.g. 3 months after administration the subject has not developed CRS and / or ICANS) .

[0300] In an example, the subject does not develop CRS following treatment. In an example, the subject does not develop greater than CRS 2 following treatment.

[0301] In an example, the subject does not develop CRS for about 1 day following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 2 days following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 3 days following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 4 days following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 5 days following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 6 days following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 1 week following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 2 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 3 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 4 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 5 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 6 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 7 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 8 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 9 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 10 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 11 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 12 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 13 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 14 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 15 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 1 month following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 2 months following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 3 months following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 4 months following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 5 months following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 6 months following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 7 months following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 8 months following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 9 months following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 10 months following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 11 months following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 12 months following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 1 year following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 2 years following treatment. In an example, the subject does not develop CRS for about 3 years following treatment.

[0302] In an example, the subject does not develop ICANS following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 5 days following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 6 days following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 1 week following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 2 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 3 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 4 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 5 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 6 weeks following treatment. In an example, the subject does not  develop ICANS for about 7 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 8 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 9 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 10 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 11 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 12 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 13 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 14 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 15 weeks following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 1 month following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 2 months following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 3 months following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 4 months following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 5 months following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 6 months following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 7 months following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 8 months following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 9 months following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 10 months following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 11 months following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 12 months following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 1 year following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 2 years following treatment. In an example, the subject does not develop ICANS for about 3 years following treatment.

[0303] In an example, the treatment of the present disclosure reduces the risk of developing CRS, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, the treatment of the present disclosure reduces the risk of developing ICANS, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure.

[0304] In an example, the treatment of the present disclosure reduces the risk of developing grade 3 CRS or above, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, the treatment of the present disclosure reduces the risk of developing grade 3 CRS, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, the treatment of the present disclosure reduces the risk of developing grade 4 CRS, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, the treatment of the present disclosure reduces the risk of developing grade 3 CRS or above as determined by the ASTCT CRS consensus grading, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure.

[0305] In an example, the treatment of the present disclosure reduces the risk of developing grade 3 ICANS or above, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, the treatment of the present disclosure reduces the risk of developing grade 3 ICANS, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, the treatment of the present disclosure reduces the risk of developing grade 4 ICANS, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, the treatment of the present disclosure reduces the risk of developing grade 3 ICANS or above as determined by the ASTCT ICANS consensus grading, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present  disclosure.

[0306] In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is modulated, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, expression levels of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, serum levels of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure.

[0307] In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased by about 10%, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, one or more expression of biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased by about 20%, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased by about 30%, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased by about 40%, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased by about 50%, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased by about 60%, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased by about 70%, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased by about 80%, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased by about 90%, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased by about 100%, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased by about 150%, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure. In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS following treatment is decreased by about 200%, compared to a reference subject treated with a CAR cell therapy that does not comprise the intracellular domain of the present disclosure.

[0308] In an example, expression of one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS are modulated or decreased at about day 1, at about day 2, at about day 3, at about day 4, at  about day 5, at about day 6, at about day 7, at about week 1, at about week 2, at about week 3, at about week 4, at about month 1, at about month 2, at about month 3, at about month 4, at about month 5, at about month 6, at about month 7, at about month 8, at about month 9, at about month 10, at about month 11, at about year 1, or about year 2 following treatment.

[0309] In some examples, expression of the one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS refers to expression levels and / or serum levels in the subject.

[0310] In an example, the one or more biomarkers associated with CRS and / or ICANS are selected from the group consisting of: CRP, ferritin, procalcitonin, IL1-Rα, IL-2, IL2-Rα IL-6, IL-6R, soluble IL-6R, soluble gp130, IFNα, IFNγ, IL-15, IL-8, IL-2, sIL2Rα, IL8, CXCL10, IP10, MCP1, MIG, GM-CSF, TNFα, MIP-1α, MIP1β IL-10, MAO and ChE enzyme activity, D2 receptor, mACh receptor, Hsp70, autoantibodies, c-fos expression, ornithine decarboxylase gene expression, cerebrospinal fluid markers, and / or plasma components (e.g. myelin basic protein, anti-NF, anti-myelin antibody, anti-GFAP antibody, anti-nerve growth factor antibody) , IFNg, TNFRp55, Endothelin-1, soluble Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM) , Intra-Cellular Adhesion Molecule (ICAM) , E-selectin, soluble Thrombomodulin, Von Willebrand factor (vWF) , DAMP (damage-associated molecular patterns) , and PAMP (pathogen-associated molecular patterns) or a combination thereof.

[0311] In an example, the reference subject is a subject that is presently undergoing treatment for a proliferative disease. In an example, the reference subject is a subject that has a proliferative disease. In an example, the proliferative disease is a malignant or benign tumor.

[0312] In an example, the proliferative disease is an autoimmune disease.

[0313] In an example, the subject has a malignant proliferative disease and has failed at least three lines of therapy. In another example, the subject has failed four lines of therapy. In an example, the subject has failed between 2 and 4 lines of therapy.

[0314] In an example, the subject is a human. In an example, the subject is a pediatric subject or an adult. In an example, the subject is a pediatric subject. In an example, the subject is an adult.

[0315] In an example, the subject is 65 years or older.

[0316] In an example, the subject has one or more of the following clinical features: underlying disease, increased disease burden, increased number of prior therapy lines (e.g., is a third-line, fourth-line or later line subject) , undergone prior stem cell transplantation, bone marrow infiltration, preexisting cytopenia, increased serum CRP, increased serum ferritin, and previously been diagnosed with CRS and / or ICANS.

[0317] In an example, the subject has a cytopenia. In another example, the subject has a pre-existing cytopenia.

[0318] In an example, the subject has a partial response within three months of treatment. In an example, the subject has a complete response withing three months of treatment.

[0319] In an example, the subject does not have any cytopenia dose limiting toxicities three months after treatment. For example, the subject does not have greater than grade 2 cytopenia dose limiting toxicities three months after treatment.

[0320] In an example, the population of cells express a CAR which comprises either SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5. In an example, the population of cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 4. In an example, the population of cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 5.

[0321] In an example, the method comprises administering between 5 × 104 and 1 × 106 viable cells per kilogram body weight of the subject, wherein the cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 4 or 5. In an example, the method comprises administering between 5 × 104 and 1 × 106 viable cells per kilogram body weight of the subject, wherein the cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 4. In an example, the method comprises administering between 5 × 104 and 1 × 106 viable cells per kilogram body weight of the subject, wherein the cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 5.

[0322] In an example, the medicament comprises between 5 × 104 and 1 × 106 viable cells per  kilogram body weight of the subject, wherein the cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 4 or 5. In an example, the medicament comprises between 5 × 104 and 1 × 106 viable cells per kilogram body weight of the subject, wherein the cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 4. In an example, the medicament comprises between 5 × 104 and 1 × 106 viable cells per kilogram body weight of the subject, wherein the cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 5.

[0323] In an example, the cells are administered daily or weekly, such as once a day, two times a day, three times a day, every day, every other day, one time weekly, two times weekly, three times weekly, or any other suitable regimen.

[0324] In an example, the medicament is formulated to be administered once a day, two times a day, three times a day, every day, every other day, one time weekly, two times weekly, three times weekly.

[0325] Kits

[0326] The present disclosure provides kits containing the nucleic acid molecule of the present disclosure, the CAR according to the present disclosure, the recombinant vector according to the present disclosure, the population of immune cells according to the present disclosure, or the population of genetically modified stem cell according to the present disclosure, useful for the treatment or prevention or delaying progression of a disease or disorder as described above. In one example, the kit comprises (a) a nucleic acid molecule of the present disclosure, a CAR according to the present disclosure, a recombinant vector according to the present disclosure, a population of immune cells according to the present disclosure, or a population of genetically modified stem cell according to the present disclosure, optionally in a delivery system and / or a pharmaceutically acceptable carrier or diluent; and (b) a package insert with instructions for treating or preventing or delaying progression of a disease or disorder (e.g., proliferative disease, tumours, or autoimmune diseases) in a subject.

[0327] In accordance with this example of the disclosure, the package insert is on or associated with the container. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, etc. The containers may be formed from a variety of materials such as glass or plastic. The container holds or contains a composition that is effective for a disease or disorder of the disclosure and may have a sterile access port (for example, the container may be an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle) . At least one active agent in the composition is one or more of: the nucleic acid molecule of the present disclosure, the CAR according to the present disclosure, the recombinant vector according to the present disclosure, the population of immune cells according to the present disclosure, and the population of genetically modified stem cell according to the present disclosure. The label or package insert indicates that the composition is used for treating a subject eligible for treatment, e.g., one having or predisposed to developing proliferative disease, tumours, or autoimmune diseases, with specific guidance regarding dosing amounts and intervals of treatment and any other medicament being provided. The kit may further comprise an additional container comprising a pharmaceutically acceptable diluent buffer, such as bacteriostatic water for injection (BWFI) , phosphate-buffered saline, Ringer’s solution, and / or dextrose solution. The kit may further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, including other buffers, diluents, filters, needles, and syringes.

[0328] The present disclosure includes the following non-limiting Examples.

[0329] EXAMPLES

[0330] Example 1: Comparison of 1928T2z cells and second-generation 1928z cells (i.e. intracellular domain containing only CD28 costimulatory molecule and CD3ζ signal transduction domain) : Anti-tumor activity and risk of inducing CRS and ICANS.

[0331] Construction of 1928T2z and 1928z

[0332] (1) CAR molecule 1928T2z containing extracellular murine single-chain variable region  antibody fragment (scFv) targeting CD19 and an intracellular domain (SEQ ID NO: 1) comprising Toll-like receptor 2 intracellular segment (T2) interposed between CD28 costimulatory molecule and CD3ζ chain was synthesized (RHS of Figure 1) ;

[0333] (2) CAR molecule 1928z containing extracellular murine single-chain variable region antibody fragment (scFv) targeting CD19, and intracellular domain comprising CD28 costimulatory molecule and CD3ζ chain was synthesized (LHS of Figure 1) ;

[0334] (3) The 1928T2z and control 1928z sequences were double-digested by using PmeI and SpeI restriction endonucleases, and either pWPXLd-2A-eGFP or LeGo lentiviral expression vector with the eGFP reporter gene was double-digested by using PmeI and SpeI restriction endonucleases;

[0335] (4) The target fragment and lentiviral expression vector were separated using agarose gel electrophoresis, and then the target fragment and vector were recovered using a gel recovery kit;

[0336] (5) The target fragment was ligated to the lentiviral vector by using Solution I ligase;

[0337] (6) The ligation product was transformed into competent cells TransStbl3, and then positive clones were screened on ampicillin-resistant LB plates;

[0338] (7) Positive clones were picked into 2 mL of ampicillin-resistant liquid LB medium for small-scale culture of the bacterial liquid;

[0339] (8) Plasmids were extracted by using a plasmid mini-extraction kit;

[0340] (9) Positive plasmids were identified by using the restriction endonuclease PmeI and SpeI double enzyme digestion, and the positive plasmid was further sequenced and identified using the Sanger sequencing method;

[0341] (10) Expanded culture was carried out to identify the bacterial liquid of correct positive clones, and plasmids were extracted by using an endotoxin-free plasmid extraction kit;

[0342] (11) The positive plasmid was digested and sequenced again for identification, and the correctly identified plasmid was stored at -20℃; and

[0343] (12) The amino acid sequence of the intracellular domain of 28T2z is as set forth in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of 1928T2z is as set forth in SEQ ID NO: 4.

[0344] Packaging of lentivirus vector encoding 1928T2z and 1928z

[0345] (1) 6×106 HEK293T cells in the logarithmic growth phase were placed into a 100 mm cell culture dish, 8 mL of DMEM medium containing 10%FBS was added, and the cells were placed into a 37℃, 5%CO2 incubator;

[0346] (2) Virus packaging could begin when HEK293T cells covered 80%of the bottom of the culture dish;

[0347] (3) The culture medium in the original cell culture dish was aspirated, 6 mL of fresh DMEM culture medium containing 1%FBS was added, and the culture dish was placed into a 37℃, 5%CO2 incubator for 2 h;

[0348] (4) Preparation of transfection complex: Liquid A was Opti-MEM containing the lentiviral expression plasmid encoding the CAR molecule such as a LeGo transfer plasmid, a 3rd generation lentiviral packaging system comprising pMD2. G, pMDLg / pRRE and pRSV-Rev, ; liquid B was Opti-MEM containing 72 μg of PEI; and liquid A and liquid B were mixed and placed at room temperature for 20 min;

[0349] (5) The transfection complex was added dropwise to the HEK 293T cells and the cells were incubated in a 37℃, 5%CO2 incubator for 6 h;

[0350] (6) After 6 h of incubation, the culture medium in the cell culture dish was aspirated, 8 mL of fresh DMEM culture medium containing 1%FBS was added, and the culture dish was placed into a 37℃, 5%CO2 incubator;

[0351] (7) The virus supernatant was collected every 24 h, and 8 mL of fresh DMEM medium containing 1%FBS was supplemented again at the same time, and the collection was carried out until 72 h;

[0352] (8) The virus supernatant was filtered through a 0.45 μm filter;

[0353] (9) Jurkat or K-562 cells in logarithmic growth phase were selected for virus titer detection; and

[0354] (10) The lentivirus with determined titer was stored at 4℃ and used within a week or frozen at 80℃ and thawed immediately prior to use.

[0355] Preparation of 1928T2z T cells and 1928z T cells targeting CD19

[0356] (1) The peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from adult peripheral blood were isolated using Ficoll-hypaque (polysucrose-meglumine diatrizoate) lymphocyte separating medium;

[0357] (2) The T cells in peripheral blood were isolated using a Pan T cell isolation kit (MACS) ;

[0358] (3) The T cells were activated using TransACT (MACS) ;

[0359] or as an alternative to steps (2) and (3) , T-cells can be both selected and activated by anti-CD3 / anti-CD28 Dynabeads (Gibco, Invitrogen) ;

[0360] (4) After 24 h of T cell activation, lentiviruses encoding 1928T2z and 1928z were added, respectively, with an appropriate MOI, e.g., MOI of 10;

[0361] (5) 24 h after lentiviral transduction, the virus was removed by centrifuging and fresh 1640 medium containing 10%FBS and 300 IU / mL IL-2 was replaced;

[0362] (6) The cell density was adjusted by supplementing fresh culture medium every two days, and the cell density was maintained at 1×106-2×106 / mL; and

[0363] (7) After 10-14 days of culture, when the number of CAR-T cells reached the target dose, they were used fresh in functional assays or cryopreserved for subsequent experiments.

[0364] In vitro model comparative assessment of the ability of 1928T2z T cells and 1928z T cells to induce CRS and ICANS

[0365] A CRS and ICANS in vitro assessment model, tumor cells and CAR-T cells was established. This model predicts the risk level of CRS and ICNAS induced by CAR-T cells by detecting the secretion levels of IFN-γ and GM-CSF in the co-culture system.

[0366] (1) Preparation of tumor target cells: CD19+ tumor target cells K562-CD19 and CD19-tumor target cells K562 were suspended (2×106 / mL) in 1640 medium containing 10%FBS;

[0367] (2) Preparation of CAR-T cells: 1928T2z T cells, 1928z T cells and wild-type T cells (WT T) were defrosted (the 1928T2z T cells and 1928z T cells were adjusted to have consistent CAR frequency by adding WT T cells thereto) and resuspended (2×106 / mL) in 1640 culture medium containing 10%FBS.

[0368] (3) The cells were added to a 96-well U-shaped plate according to Table 4, including 100 μL / well CAR-T cells (1928T2z T cells, 1928z T cells and WT T cells) , 50 μL / well tumor cells (K562-CD19 or K562) ;

[0369] (4) 50 μL of medium was supplemented to the wells that were less than 200 μL of medium;

[0370] (5) The cells were co-cultured at 37 degrees for 24 h; and

[0371] (6) The supernatant was taken from the 96-well plate by centrifuging, and IFN-γ and GM-CSF in the supernatant were detected respectively. The grouping design to assess the ability of 1928T2z T cells to induce CRS and ICANS is shown in Table 4.

[0372] Table 4

[0373] Experimental results show that compared with WT T cells, for 1928z T cells and 1928T2z T cells, IFN-γ and GM-CSF significantly increased after co-culture with CD19+ K562-CD19 cells in the in-vitro CRS and ICANS evaluation models containing Monocytes; compared with 1928z T cells, 1928T2z T cells secreted lower levels of IFN-γ and GM-CSF in the in-vitro CRS and ICANS assessment models containing Monocytes (Figure 2) , surprisingly indicating that 1928T2z T cells have a lower risk of inducing CRS and ICANS in patients.

[0374] 1928T2z T cells show improved serial cytotoxicity compared to 1928z T cells

[0375] In vitro continuous killing refers to the continuous addition of target cells to CAR-T cells, allowing the CAR-T cells to receive multiple tumor cell challenges. Therefore, this method can fully reflect the sustained anti-tumor activity and anti-depletion ability of CAR-T cells, which can better represent the anti-tumor activity of CAR-T cells in patients.

[0376] In this experiment, 1928T2z T cells, 1928z T cells and WT T cells were co-cultured with CD19+ K562-CD19 respectively. Since K562-CD19 cells carry GFP fluorescent protein, the killing of target cells K562-CD19 can be continuously monitored through InCuCyte. Target cells K562-CD19 were added at 0 h, 48 h, and 120 h, respectively. During the entire experiment, the killing of target cells K562-CD19 was continuously monitored by using InCuCyte.

[0377] The experimental results show that compared with WT T cells, both 1928T2z T cells and 1928z T cells had tumor killing activity, but after the second addition of the target cell K562-CD19, 1928T2z T cells began to show more durable anti-tumor activity than 1928z T cells, and the difference between them became more significant as the continuous killing experiment proceeded (Figure 3) , indicating that 1928T2z T cells may have stronger anti-tumor activity and were more durable, i.e., had higher resistance to depletion in patients.

[0378] Assessment of the in vivo anti-tumor activity of 1928T2z T cells through humanized tumor mouse models

[0379] NSI immunodeficient mice aged 6-8 weeks were selected and injected into the tail vein with CD19+ NALM6-GL cells, at 2×105 / mouse; and on the second day after injection, 1928T2z T cells, 1928z T cells or WT T cells were injected, at 5×106 / mouse. On days 8, 15, 22 and 29 after the mice were injected with CAR-T cells, the distribution and expansion of tumor cells in the mice were detected by using in vivo imaging (Figure 4) . The survival of mice was also assessed (Figure 5) .

[0380] Experimental results show that compared with WT T cells, both 1928T2z T cells and 1928z T cells can effectively inhibit the growth of NALM6-GL cells and have excellent anti-tumor activity (Figure 4) . 1928T2z T cells and 1928z T cells can also significantly prolong the survival time of mice transplanted with NALM6-GL tumor cells (Figure 5) .

[0381] Assessment of the safety and effectiveness of 1928T2z cells in the treatment of refractory / recurrent non-Hodgkin lymphoma through clinical trials

[0382] Based on the excellent safety and anti-tumor activity of 1928T2z cells in preclinical studies, a phase I clinical trial of autologous 1928T2z T cells for the treatment of refractory / recurrent non-Hodgkin lymphoma was subsequently carried out. This study was a 3+3 dose escalation clinical trial, with the dose being 5×104-1×106 1928T2z T cells / kg.

[0383] From November 2019 to February 2023, this clinical trial included 25 patients, 21 of whom received autologous 1928T2z T cell therapy. Among the 21 patients treated, the median age was 57 years (23-70 years) , and 10 (48%) were female. The participants had received a median of 4 previous treatments for lymphoma, and none of the participants had received previous CAR-T cell therapy.

[0384] As of June 14, 2023, all treated patients had reached the primary treatment follow-up time point (3 months after 1928T2z T cell therapy) . Among the 21 patients, 13 (62%) developed grade 1 to 2 CRS, and no ≥ grade 3 CRS. However, in keeping with the favourable safety profile  indicated by the in vitro studies, no neurotoxic syndromes of any grade (ICANS) were observed. Lymphoma response was observed with 1928T2z T cells at all dose levels, including fully metabolized levels, with 11 patients (52%) achieving complete response at 3 months after injection of the cells. Pharmacokinetic studies demonstrated that 1928T2z T cells were able to effectively expand in patients at all dose levels.

[0385] In this clinical trial, in addition to exhibiting excellent anti-tumor activity, 1928T2z T cells also demonstrated an excellent safety profile, that is, no ICANS of any grade or severe (≥ Level 3) CRS occurred in any of the 21 patients treated with 1928T2z T cells. Patient outcomes are summarized in Table 5 below. This observed safety profile is remarkable, in particular when compared with currently marketed products directed against CD19 and incorporating a CD28 co-stimulatory domain (axicabtagene ciloleucel, brexucabtagene autoleucel) . Indeed, it is worth noting that previous approaches to manage the side effects associated with a CD28 co-stimulatory domain have included replacing it with an alternative co-stimulatory domain, with these products being favoured in certain instances, irrespective of reduced efficacy, due to an improved safety profile. This further evidences the unexpected and significant nature of the present inventors findings as they underpin a general approach for increasing safety of CARs which incorporate a CD28 co-stimulatory domain.

[0386] Table 5: Dose levels, key toxicities and 3 month response for patients treated with 1928T2z CAR-T cells within dose escalation trial study

[0387] CRS, cytokine release syndrome; DLT, dose-limiting toxicity; ICANS, immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome. 1Dose level 1-5 interim results (n=21) , dose expansion cohort enrolling; 2Resolved to grade 2 on day 35; 3Grade 1 CRS at day 6, then Grade 2 CRS at day 122 following pembrolizumab administration; 4Resolved to Grade 2 on day 77.

[0388] Example 2: GPC3-targeted CAR molecule G28T2z containing 28T2z intracellular  domain and comparison with second-generation G28z cells (i.e. intracellular domain containing only CD28 costimulatory molecule and CD3ζ signal transduction domain) : Anti-tumor activity and risk of inducing CRS and ICANS

[0389] Construction of G28T2z and G28z

[0390] (1) CAR molecule G28T2z containing extracellular single-chain variable region antibody fragment (scFv) targeting GPC3 and an intracellular domain (SEQ ID NO: 1) comprising Toll-like receptor 2 intracellular segment (T2) interposed between CD28 costimulatory molecule and CD3ζ chain was synthesized;

[0391] (2) CAR molecule G28z containing extracellular single-chain variable region antibody fragment (scFv) targeting GPC3, and intracellular CD28 costimulatory molecule and CD3ζ chain was synthesized;

[0392] (3) The G28T2z and control G28z sequences were double-digested by using PmeI and SpeI restriction endonucleases, and either the pWPXLd-2A-eGFP or LeGo lentiviral expression vector with the eGFP reporter gene was double-digested by using PmeI and SpeI restriction endonucleases;

[0393] (4) The target fragment and lentiviral expression vector were separated by using agarose gel electrophoresis, and then the target fragment and vector were recovered by using a gel recovery kit;

[0394] (5) The target fragment was ligated to the lentiviral vector by using Solution I ligase;

[0395] (6) The ligation product was transformed into competent cells TransStbl3, and then positive clones were screened on ampicillin-resistant LB plates;

[0396] (7) Positive clones were picked into 2 mL of ampicillin-resistant liquid LB medium for small-scale culture of the bacterial liquid;

[0397] (8) Plasmids were extracted by using a plasmid mini-extraction kit;

[0398] (9) Positive plasmids were identified by using the restriction endonuclease PmeI and SpeI double enzyme digestion, and the positive plasmid was further sequenced and identified using the Sanger sequencing method;

[0399] (10) Expanded culture was carried out to identify the bacterial liquid of correct positive clones, and plasmids were extracted by using an endotoxin-free plasmid extraction kit;

[0400] (11) The positive plasmid was digested and sequenced again for identification, and the correctly identified plasmid was stored at -20℃; and

[0401] (12) The amino acid sequence of G28T2z is as set forth in SEQ ID NO: 5.

[0402] Packaging of lentivirus encoding G28T2z and G28z

[0403] (1) 6×106 HEK293T cells in the logarithmic growth phase were placed into a 100 mm cell culture dish, 8 mL of DMEM medium containing 10%FBS was added, and the cells were placed into a 37℃, 5%CO2 incubator;

[0404] (2) Virus packaging could begin when HEK293T cells covered 80%of the bottom of the culture dish;

[0405] (3) The culture medium in the original cell culture dish was aspirated, 6 mL of fresh DMEM culture medium containing 1%FBS was added, and the culture dish was placed into a 37℃, 5%CO2 incubator for 2 h;

[0406] (4) Preparation of transfection complex: Liquid A was Opti-MEM containing the lentiviral expression plasmid encoding the CAR molecule, a 3rd generation lentiviral packaging system comprising pMD2. G, pMDLg / pRRE and pRSV-Rev, and the added amounts of the three plasmids were 9 μg, 3 μg and 12 μg, respectively; liquid B was Opti-MEM containing 72 μg of PEI; and liquid A and liquid B were mixed and placed at room temperature for 20 min;

[0407] (5) The transfection complex was added dropwise to the HEK 293T cells and the cells were incubated in a 37℃, 5%CO2 incubator for 6 h;

[0408] (6) After 6 h of incubation, the culture medium in the cell culture dish was aspirated, 8 mL of fresh DMEM culture medium containing 1%FBS was added, and the culture dish was placed  into a 37℃, 5%CO2 incubator;

[0409] (7) The virus supernatant was collected every 24 h, and 8 mL of fresh DMEM medium containing 1%FBS was supplemented again at the same time, and the collection was carried out until 72 h;

[0410] (8) The virus supernatant was filtered through a 0.45 μm filter;

[0411] (9) Jurkat or K-562 cells in logarithmic growth phase were selected for virus titer detection; and

[0412] (10) The lentivirus with determined titer was stored at 4℃ and used within a week or frozen at 80℃ and thawed immediately prior to use.

[0413] Preparation of G28T2z T cells and G28z T cells targeting GPC3.

[0414] (1) The peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from adult peripheral blood were isolated using Ficoll-hypaque (polysucrose-meglumine diatrizoate) lymphocyte separating medium;

[0415] (2) The T cells in peripheral blood were isolated using a Pan T cell isolation kit (MACS) ;

[0416] (3) The T cells were activated using TransACT (MACS) ;

[0417] or as an alternative to steps (2) and (3) , T-cells can be both selected and activated by anti-CD3 / anti-CD28 Dynabeads (Gibco, Invitrogen) ;

[0418] (4) After 24 h of T cell activation, lentiviruses encoding G28T2z and G28z were added respectively, with an appropriate MOI, e.g., MOI of 10;

[0419] (5) 24 h after lentiviral transduction, the virus was removed by centrifuging and fresh 1640 medium containing 10%FBS and 300 IU / mL IL-2 was replaced;

[0420] (6) The cell density was adjusted by supplementing fresh culture medium every two days, and the cell density was maintained at 1×106-2×106 / mL; and

[0421] (7) After 10-14 days of culture, when the number of CAR-T cells reached the target dose, they were cryopreserved for subsequent experiments.

[0422] In vitro comparative assessment of the ability of G28T2z T cells and G28z T cells to induce CRS and ICANS.

[0423] An ICANS in vitro assessment model containing monocytes, tumor cells and CAR-T cells was established. This model predicts the risk level of CRS and ICANS induced by CAR-T cells by detecting the secretion levels of IFN-γ and GM-CSF in the co-culture system.

[0424] (1) Preparation of tumor target cells: GPC3+ tumor target cells Huh7 were suspended (2×106 / mL) using 1640 medium containing 10%FBS;

[0425] (2) Preparation of CAR-T cells: G28T2z T cells, G28z T cells and wild-type T cells (WT T) were defrosted, the G28T2z T cells and G28z T cells were adjusted to have consistent CAR frequency by adding WT T cells thereto, and resuspended in 1640 culture medium containing 10%FBS. The cell density was adjusted to 2×106 / mL;

[0426] (3) The G28T2z T cells, G28z T cells and WT T cells (100 μL / well) were co-cultured with Huh7 cells (50 μL / well) ;

[0427] (4) The cells were co-cultured at 37 degrees for 24 h; and

[0428] (5) The 96-well plate was centrifuged to take the supernatant, and IFN-γ, GM-CSF and TNF-α in the supernatant were detected respectively.

[0429] Consistent with the results obtained with the 28T2z intracellular domain in Example 1, G28T2z T cells secreted lower levels of IFN-γ and GM-CSF after co-culture with GPC3+ Huh7 cells (Figure 6) . Reduced TNF-α was also observed in this study (not assessed in Example 1) . TNF-α, IFN-γ and GM-CSF are closely related to the occurrence of CRS and ICANS. Therefore, this experiment indicates that G28T2z T cells will, like the cells comprising the 28T2z intracellular domain used in Example 1, also have a lower risk of inducing ICANS in patients. The CAR-T cells used in this experiment have the same intracellular domain as the CAR-T cells used in Example 1, differing only in terms of their scFv. By controlling for the impact of the  extracellular binding domain (i.e. the scFv) in this way, the present inventors have surprisingly shown that their intracellular binding domain (i.e. TLR2 interposed between CD28 costimulatory molecule and CD3ζ) represents a component for generic insertion into CAR programs to improve safety and / or durability.

[0430] Example 3: Comparison of 1928T2z with third-generation 1928BBz cells (i.e. intracellular domain containing 4-1BB interposed between CD28 costimulatory molecule and CD3ζ signal transduction domain) : Anti-tumor activity and risk of inducing CRS and ICANS

[0431] Construction of 1928T2z and 1928BBz vectors.

[0432] (1) CAR molecule 1928T2z containing extracellular murine single-chain variable region antibody fragment (scFv) targeting CD19, and intracellular CD28 costimulatory molecule, Toll-like receptor 2 intracellular segment (T2) and CD3ζ chain was synthesized;

[0433] (2) CAR molecule 1928BBz containing extracellular murine single-chain variable region antibody fragment (scFv) targeting CD19, and intracellular CD28 and 4-BB dual costimulatory molecule and CD3ζ chain was synthesized;

[0434] (3) The 1928T2z and control 1928BBz sequences were double-digested by using PmeI and SpeI restriction endonucleases, and either the pWPXLd-2A-eGFP or LeGo lentiviral expression vector with the eGFP reporter gene was double-digested by using PmeI and SpeI restriction endonucleases;

[0435] (4) The target fragment and lentiviral expression vector were separated by using agarose gel electrophoresis, and then the target fragment and vector were recovered by using a gel recovery kit;

[0436] (5) The target fragment was ligated to the lentiviral vector by using Solution I ligase;

[0437] (6) The ligation product was transformed into competent cells TransStbl3, and then positive clones were screened on ampicillin-resistant LB plates;

[0438] (7) Positive clones were picked into 2 mL of ampicillin-resistant liquid LB medium for small-scale culture of the bacterial liquid;

[0439] (8) Plasmids were extracted by using a plasmid mini-extraction kit;

[0440] (9) Positive plasmids were identified by using the restriction endonuclease PmeI and SpeI double enzyme digestion, and the positive plasmid was further sequenced and identified using the Sanger sequencing method;

[0441] (10) Expanded culture was carried out to identify the bacterial liquid of correct positive clones, and plasmids were extracted by using an endotoxin-free plasmid extraction kit;

[0442] (11) The positive plasmid was digested and sequenced again for identification, and the correctly identified plasmid was stored at -20℃; and

[0443] (12) The amino acid sequence of the intracellular domain of 28T2z is as set forth in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of 1928T2z is as set forth in SEQ ID NO: 4.

[0444] Packaging of lentivirus encoding 1928T2z and 1928BBz

[0445] (1) 6×106 HEK293T cells in the logarithmic growth phase were placed into a 100 mm cell culture dish, 8 mL of DMEM medium containing 10%FBS was added, and the cells were placed into a 37℃, 5%CO2 incubator;

[0446] (2) Virus packaging could begin when HEK293T cells covered 80%of the bottom of the culture dish;

[0447] (3) The culture medium in the original cell culture dish was aspirated, 6 mL of fresh DMEM culture medium containing 1%FBS was added, and the culture dish was placed into a 37℃, 5%CO2 incubator for 2 h;

[0448] (4) Preparation of transfection complex: Liquid A was Opti-MEM containing the lentiviral expression plasmid encoding the CAR molecule such as the LeGo transfer plasmid, a 3rd generation lentiviral packaging system comprising pMD2. G, pMDLg / pRRE and pRSV-Rev ;  liquid B was Opti-MEM containing 72 μg of PEI; and liquid A and liquid B were mixed and placed at room temperature for 20 min;

[0449] (5) The transfection complex was added dropwise to the HEK 293T cells and the cells were incubated in a 37℃, 5%CO2 incubator for 6 h;

[0450] (6) After 6 h of incubation, the culture medium in the cell culture dish was aspirated, 8 mL of fresh DMEM culture medium containing 1%FBS was added, and the culture dish was placed into a 37℃, 5%CO2 incubator;

[0451] (7) The virus supernatant was collected every 24 h, and 8 mL of fresh DMEM medium containing 1%FBS was supplemented again at the same time, and the collection was carried out until 72 h;

[0452] (8) The virus supernatant was filtered through a 0.45 μm filter;

[0453] (9) Jurkat or K-562 cells in logarithmic growth phase were selected for virus titer detection; and

[0454] (10) The lentivirus with determined titer was stored at 4℃ and used within a week or frozen at 80℃ and thawed immediately prior to use.

[0455] Preparation of 1928T2z cells and 1928BBz cells targeting CD19.

[0456] (1) The peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from adult peripheral blood were isolated using Ficoll-hypaque (polysucrose-meglumine diatrizoate) lymphocyte separating medium;

[0457] (2) The T cells in peripheral blood were isolated and activated using anti-CD3 / anti-CD28 coated magnetic beads (Dynabeads, Gibco) ;

[0458] (3) After 24 h of T cell activation, lentiviruses overexpressing 1928T2z and 1928z were added, respectively;

[0459] (4) 24 h after lentiviral transduction, the virus was removed by centrifuging and fresh 1640 medium containing 10%FBS and 300 IU / mL IL-2 was replaced;

[0460] (5) The cell density was adjusted by supplementing fresh culture medium every two days, and the cell density was maintained at 1×106-2×106 / mL; and

[0461] (6) After 10-14 days of culture, when the number of CAR-T cells reached the target dose, they were used fresh in functional assays or cryopreserved for subsequent experiments

[0462] In vitro model comparative assessment of the ability of 1928T2z cells and 1928BBz cells to induce CRS and ICANS.

[0463] A CRS and ICANS in vitro assessment model, tumor cells and CAR-T cells was established. This model predicts the risk level of CRS and ICNAS induced by CAR-T cells by detecting the secretion levels of IFN-γ and GM-CSF in the co-culture system. The method is described in Example 1 with the addition of autologous monocytes prepared as follows:

[0464] Isolation of monocytes: 5×106 PBMCs from the same source as CAR-T cells were thawed, monocytes were isolated using Invitrogen Dynabeads Untouched Human Monocytes Kit (Thermo Fisher Scientific) , the finally obtained monocytes were resuspended using 1640 culture medium containing 10%FBS, and the cell density was adjusted to 2×106 / mL.

[0465] The grouping design to assess the ability of 1928T2z T cells to induce CRS and ICANS is shown in Table 6.

[0466] Table 6

[0467] Experimental results show that 1928BBz T cells significantly increased IFN-γ and GM-CSF levels in the presence of monocytes compared with 1928T2z T cells (Figure 7) , indicating that 1928T2z T cells have a significantly lower risk of inducing CRS and ICANS in patients than 1928BBz T cells containing CD28 and 4-1BB dual costimulatory molecules. These data provide further support for the general application of an intracellular domain comprising a TLR2 interposed between CD28 costimulatory molecule and CD3ζ.

[0468] Assessment of the expression levels of key genes associated with CRS and ICANS in 1928T2z T cells and 1928BBz T cells at the transcriptional level

[0469] The expression levels of key inflammatory cytokine gene pathways that are associated with CRS and ICANS were examined in 1928T2z T cells and 1928BBz T cells using bulk RNA sequencing technology, with gene expression in activated cells being normalised to unstimulated controls.

[0470] (1) 3 x 105 1928T2z T cells or 1928BBz T cells were co-cultured with 2 x 104 CD19+K562-CD19 respectively, to activate CAR-T cells or with 2 x 104 CD19-K562 cells as unstimulated controls;

[0471] (2) After 6 hr stimulated and unstimulated 1928T2z CAR T-cells and 1928BBz CAR T-cells were harvested and RNA was extracted using the RNeasy Mini kit (Qiagen) ;

[0472] (3) Sample clean-up was performed using the RNA Clean &Concentrator kit (DNase included, Zymo Research) ;

[0473] (4) RNA quality was checked using the Tapestation (Agilent) ;

[0474] (5) Bulk RNA sequencing was then performed on an Illumina NextSeq 2000 System, with P2-200 sequencing kit, 2x100bp PE.

[0475] (6) Gene set enrichment analysis (GSEA) for inflammation-related cytokine signaling pathways was performed using Bioconductor tools DESeq2, for differential gene expression analysis; and fgsea, for gene set enrichment. The results, displayed as normalised enrichment scores (NES) , are summarized below in Figure 10.

[0476] The gene set enrichment analysis results show that upon specific antigen stimulation, signaling pathways associated with the CRS-and ICANS-associated cytokines IFN-γ and IL-6 are enriched in 1928BBz CAR T-cells, compared with 1928T2z CAR T-cells. Consistent with the results shown in Figure 7, IFN-γ and IL-6-related gene signatures were reduced in 1928T2z CAR T-cells. Conversely, 1928T2z CAR T-cells show an enrichment for genes associated with anti-inflammatory cytokine production.

[0477] These results indicate that the 28T2z intracellular domain changes the cytokine expression profile of traditional CAR-T cells, causing reducing levels of problematic IL-6, IFN-γ and GM-CSF. The observed changes in expression further support that incorporation of a 28T2z domain into CAR-T cells may help reduce the incidence of CRS and ICANS

[0478] In vitro killing comparative assessment of the anti-tumor activity of 1928T2z T cells and 1928BBz T cells

[0479] Single in vitro killing refers to adding tumor target cells to CAR-T cells only once, and then continuously monitoring the killing of tumor target cells by CAR-T cells. In this experiment, 1928T2z T cells, 1928BBz CAR T cells and WT T cells (T-cells) were co-cultured with CD19+K562-CD19 tumour cells as targets, and the effector-to-target ratio was 1: 1 (E: T=1: 1) . Since K562-CD19 cells carry GFP fluorescent protein, the killing of target cells K562-CD19 can be continuously monitored through the IncuCyte Live-Cell Analysis System (Sartorius) . In this experiment, the killing of target cells K562-CD19 by CAR-T cells was monitored by using the IncuCyte for 7 days. Experimental results show that compared with T cells, both 1928T2z CAR T cells and 1928BBz CAR T cells had sustained killing activity against K562-CD19, and the  killing activities of the two were equivalent (Figure 8) .

[0480] In vitro continuous killing refers to the continuous addition of target cells to CAR-T cells, allowing the CAR-T cells to receive multiple tumor cell challenges. Therefore, this method can fully reflect the sustained anti-tumor activity and durability of CAR-T cells, which can better represent the anti-tumor activity of CAR-T cells in patients.

[0481] In this experiment, 1928T2z T cells, 1928BBz T cells and WT T cells were co-cultured with K562-CD19 of CD19+, and the effector-to-target ratio was 2: 1 (E: T=2: 1) . Since K562-CD19 cells carry GFP fluorescent protein, the killing of target cells K562-CD19 can be continuously monitored through the IncuCyte system. Target cells K562-CD19 were added on days 0, 2, 5, 8 and 11. During the entire experiment, the killing of target cells K562-CD19 was continuously monitored by using the IncuCyte system.

[0482] Experimental results show that compared with T cells, 1928T2z T cells and 1928BBz T cells can effectively kill target cells K562-CD19 after continuous K562-CD19 challenges; after the fifth consecutive addition of target cells (D16) , 1928T2z T cells began to show more durable tumor killing activity than 1928BBz T cells (Figure 9) . The above continuous killing and cytokine results show that 1928T2z T cells have a favorable safety profile and also have more durable anti-tumor activity than third-generation CAR-T cells containing dual costimulatory molecules.

[0483] The pathogenesis of CRS and ICANS involves cross-activation of patient myeloid cells by activated CAR T-cells, a process driven by the CAR T-cell-derived cytokines IFN-γ and GM-CSF. In animal models, suppression of IFN-γ and GM-CSF has been associated with reduced CRS and ICANS severity but retained CAR T-cell anti-tumour efficacy. Taken together, this suggests that CAR T-cells exhibiting lower IFN-γ and GM-CSF production have the potential to combine reduced CAR T-cell toxicity without compromising efficacy. Accordingly, the findings disclosed herein represent a significant advance in the field as they underpin a general platform for inclusion in CAR molecules and immune cells, such as T-cells, expressing the same. Such molecules may be particularly advantageous in view of the observed improvements in durability and safety profile.

[0484] Example 4: Generation of 19BBT2z cells and 19ICOST2z cells

[0485] Construction of 19BBT2z

[0486] (1) CAR molecule 19BBT2z containing extracellular murine single-chain variable region antibody fragment (scFv) targeting CD19 and an intracellular domain (SEQ ID NO: 19) comprising Toll-like receptor 2 intracellular segment (T2) interposed between 4-1BB costimulatory molecule and CD3ζ chain was synthesized;

[0487] (2) The 19BBT2z sequence was double-digested by using PmeI and SpeI restriction endonucleases, and either pWPXLd-2A-eGFP or LeGo lentiviral expression vector with the eGFP reporter gene was double-digested by using PmeI and SpeI restriction endonucleases;

[0488] (3) The target fragment and lentiviral expression vector were separated using agarose gel electrophoresis, and then the target fragment and vector were recovered using a gel recovery kit;

[0489] (4) The target fragment was ligated to the lentiviral vector by using Solution I ligase;

[0490] (5) The ligation product was transformed into competent cells TransStbl3, and then positive clones were screened on ampicillin-resistant LB plates;

[0491] (6) Positive clones were picked into 2 mL of ampicillin-resistant liquid LB medium for small-scale culture of the bacterial liquid;

[0492] (7) Plasmids were extracted by using a plasmid mini-extraction kit;

[0493] (8) Positive plasmids were identified by using the restriction endonuclease PmeI and SpeI double enzyme digestion, and the positive plasmid was further sequenced and identified using the Sanger sequencing method;

[0494] (9) Expanded culture was carried out to identify the bacterial liquid of correct positive clones, and plasmids were extracted by using an endotoxin-free plasmid extraction kit;

[0495] (10) The positive plasmid was digested and sequenced again for identification, and the correctly identified plasmid was stored at -20℃.

[0496] Construction of 19ICOST2z

[0497] (1) CAR molecule 19ICOST2z containing extracellular murine single-chain variable region antibody fragment (scFv) targeting CD19 and an intracellular domain (SEQ ID NO: 20) comprising Toll-like receptor 2 intracellular segment (T2) interposed between ICOS costimulatory molecule and CD3ζ chain was synthesized;

[0498] (2) The 19ICOST2z sequence was double-digested by using PmeI and SpeI restriction endonucleases, and either pWPXLd-2A-eGFP or LeGo lentiviral expression vector with the eGFP reporter gene was double-digested by using PmeI and SpeI restriction endonucleases;

[0499] (3) The target fragment and lentiviral expression vector were separated using agarose gel electrophoresis, and then the target fragment and vector were recovered using a gel recovery kit;

[0500] (4) The target fragment was ligated to the lentiviral vector by using Solution I ligase;

[0501] (5) The ligation product was transformed into competent cells TransStbl3, and then positive clones were screened on ampicillin-resistant LB plates;

[0502] (6) Positive clones were picked into 2 mL of ampicillin-resistant liquid LB medium for small-scale culture of the bacterial liquid;

[0503] (7) Plasmids were extracted by using a plasmid mini-extraction kit;

[0504] (8) Positive plasmids were identified by using the restriction endonuclease PmeI and SpeI double enzyme digestion, and the positive plasmid was further sequenced and identified using the Sanger sequencing method;

[0505] (9) Expanded culture was carried out to identify the bacterial liquid of correct positive clones, and plasmids were extracted by using an endotoxin-free plasmid extraction kit;

[0506] (10) The positive plasmid was digested and sequenced again for identification, and the correctly identified plasmid was stored at -20℃.

[0507] The applicant declares that the present invention illustrates the detailed methods of the present invention through the above examples, but the present invention is not limited to the above detailed methods, that is, it does not mean that the implementation of the present invention must rely on the above detailed methods. Those skilled in the art should understand that any improvements to the present invention, equivalent replacement of raw materials of the product of the present invention, addition of auxiliary ingredients, selection of specific methods, etc., all fall within the protection scope and disclosure scope of the present invention.

[0508] All publications discussed above are incorporated herein in their entirety. Any discussion of documents, acts, materials, devices, articles or the like which has been included in the present specification is solely for the purpose of providing a context for the present disclosure. It is not to be taken as an admission that any or all of these matters form part of the prior art base or were common general knowledge in the field relevant to the present disclosure as it existed before the priority date of each claim of this application.

Claims

1.A nucleic acid molecule encoding an intracellular domain, wherein the intracellular domain comprises two co-stimulatory domains and a signal transduction domain, wherein a first co-stimulatory domain is a Toll-like receptor (TLR) signaling domain and wherein the TLR signaling domain is interposed between a second costimulatory domain and the signal transduction domain.2.The nucleic acid of claim 1, wherein the nucleic acid further encodes an scFv.3.The nucleic acid of claim 1 or claim 2, wherein the nucleic acid encodes a chimeric antigen receptor (CAR) .4.A chimeric antigen receptor (CAR) comprising an scFv and an intracellular domain, wherein the intracellular domain comprises two co-stimulatory domains and a signal transduction domain, wherein a first co-stimulatory domain is a Toll-like receptor (TLR) signaling domain and wherein the TLR signaling domain is interposed between a second costimulatory domain and the signal transduction domain.5.The nucleic acid molecule or CAR according to any one of claims 1 to 5, wherein the TLR signaling domain is a TLR2 signaling domain.6.The nucleic acid molecule or CAR according to any one of claims 1 to 5, wherein the signal transduction domain is derived from TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε, CD3γ, CD3Δ, CD3ε and CD3ζ.7.The nucleic acid molecule or CAR according to any one of claims 1 to 6, wherein the signal transduction domain comprises a CD3ζ signaling domain.8.The nucleic acid molecule or CAR according to any one of claims 1 to 7, wherein the second costimulatory domain is selected from the group consisting of CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, CD27 and CD40.9.The nucleic acid molecule or CAR of claim 8, wherein the second costimulatory domain is CD28.10.The nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 9, which comprises SEQ ID NO: 6 or a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.11.The nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 10, which comprises SEQ ID NO: 8 or a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9.12.The nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 11, which comprises SEQ ID NO: 10 or a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11.13.The nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 12, which comprises SEQ ID NO: 12 or a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in any one of the following:SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 19; andSEQ ID NO: 20.14.The nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 13, which comprises SEQ ID NO: 13 or a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in any one of the following:SEQ ID NO: 2;SEQ ID NO: 3;SEQ ID NO: 14; andSEQ ID NO: 21.15.The nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 13, which comprises SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid sequence encoding either the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.16.The CAR according to any one of claims 4 to 15, which comprises SEQ ID NO: 7.17.The CAR according to any one of claims 4 to 16, which comprises SEQ ID NO: 9.18.The CAR according to any one of claims 4 to 17, which comprises SEQ ID NO: 11.19.The CAR according to any one of claims 4 to 18, which comprises any one of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 19; and SEQ ID NO: 20.20.The CAR according to any one of claims 4 to 19, which comprises the amino acid sequence set forth in any one of the following:SEQ ID NO: 2;SEQ ID NO: 3;SEQ ID NO: 14.21.The CAR according to any one of claims 4 to 19, which comprises either SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.22.The chimeric antigen receptor according to any one of claims 4 to21, wherein the chimeric antigen receptor further includes a connecting peptide, a hinge region, and a transmembrane domain.23.The nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 9, which is a polynucleotide, preferably wherein the polynucleotide is selected from the group consisting of: DNA, RNA, messenger RNA (mRNA) or circular RNA (cRNA) .24.A recombinant vector comprising a nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 15.25.The recombinant vector of claim 24, wherein the recombinant vector is a PiggyBac (PB) transposon vector, a Sleeping Beauty (SB) transposon vector, a plasmid, a cosmid, a phage or a viral vector.26.The recombinant vector of claim 25, wherein the recombinant vector is a viral vector derived from a Lentivirus, a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes simplex virus (HSV) .27.An immune cell or population thereof, wherein the immune cell or population thereof comprises a nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 15, or the recombinant vector according to any one of claims 24 to 26.28.An immune cell or population thereof, wherein the immune cell or population thereof expresses a CAR according to any one of claims 4 to 9 or 16 to 22.29.The immune cell (s) of claim 27 or claim 28, wherein the immune cell (s) is selected from the group consisting of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , T cells, NK cells, NKT cells, ITNK cells, macrophages, B cells, monocytes, neutrophils, eosinophils and combinations thereof.30.The immune cell of claim 29, wherein the immune cell is a T-cell, preferably wherein the T-cell is a gamma delta (γδ) T cell, a cytotoxic T cell, or a helper T cell.31.The immune cell of claim 29, wherein the immune cell is a NK-92 cell.32.A population of immune cells, wherein the population consists essentially of the immune cells according to any one of claims 29 to 31.33.A genetically modified stem cell or population thereof, wherein the stem cell has been genetically modified to express a CAR according to any one of claims 4 to 9 or 16 to 22.34.The genetically modified stem cell of claim 33 or population thereof, which is an embryonic stem cells (ESs) or an induced pluripotent stem cells (iPSCs) .35.A method of producing a genetically modified cell for adoptive cell therapy, the method comprising introducing a vector comprising the nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 15 into a cell, thereby producing the genetically modified cell, preferably wherein the cell is an immune cell, more preferably wherein the immune cell is a T-cell.36.A method of treating a proliferative disease in a subject in need thereof, the method comprising administering the nucleic acid molecule of any one of claims 1 to 15, the CAR according to any one of claims 4 to 22, the recombinant vector according to any one of claims 24 to 26, the population of immune cells according to any one of claims 27 to 32, or the population of genetically modified stem cell according to claim 33 or 34.37.Use of a nucleic acid molecule of any one of claims 1 to 15, a CAR according to any one of claims 4 to 9 or 16 to 22, a recombinant vector according to any one of claims 24 to 26, a population of immune cells according to any one of claims 27 to 32, or a population of genetically modified stem cells according to claim 33 or 34 in the manufacture of a medicament for treating a proliferative disease in a subject in need thereof.38.The method of claim 36 or use of claim 37, wherein the proliferative disease is a malignant or benign tumor disease.39.The method or use according to any one of claims 36 to 38, wherein the proliferative disease is a CD19-expressing malignant proliferative disease.40.The method or use of claim 39, wherein the CD19-expressing malignant proliferative disease is selected from the group consisting of acute lymphoblastic leukemia (ALL) such as B-cell acute lymphoblastic leukemia (BALL) and T-cell acute lymphoblastic leukemia (TALL) , chronic myelogenous leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , Burkitt's lymphoma, B-cell non-Hodgkin lymphoma (including large B-cell lymphomas such as diffuse large B cell lymphoma, primary mediastinal B-cell lymphoma or follicular large cell lymphoma; indolent B-cell lymphomas such as marginal zone lymphomas, MALT lymphoma and mantle cell lymphoma) , follicular lymphomas, hairy cell leukemia, malignant lymphoproliferative conditions, multiple myeloma, variants of myeloma such as plasmacytoma and amyloidosis, non-Hodgkin's lymphoma, plasmablastic lymphoma, plasmacytoid dendritic cell neoplasm, and preleukemia.41.The method of claim 36 or use of claim 37, wherein the malignant proliferative disease is a solid tumour.42.The method or use according to claim 41, wherein the solid tumour is GPC3+.43.The method or use of claim 42, wherein the GPC3+ solid tumour is a liver cancer, a skin cancer, preferably melanoma, an ovarian cancer, a lung cancer, a renal cancer, preferably Wilms tumour, or, a yolk sac tumour.44.The method or use according to any one of claims 36 to 43, wherein the population of cells express a CAR which comprises either SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.45.The method of claim 44, wherein the method comprises administering between 5 × 104 and 1 × 106 viable cells per kilogram body weight of the subject, wherein the cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 4 or 5.46.Use of claim 41, wherein the medicament comprises between 5 × 104 and 1 × 106 viable cells per kilogram body weight of the subject, wherein the cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 4 or 5.47.A composition comprising a population of CAR-T cells, wherein the CAR-T cells express a CAR which comprises SEQ ID NO: 4 or 5, and wherein the CAR-T cells in the composition are characterized by the following expression profile: 45 to 55% (preferably 39%) CD4+, 35 to 45%(preferably 41%) CD8+, and 30 to 40% (preferably 34%) CD62L+, based on the total number of cells in the composition.48.A method of treating a CD19-expressing malignant proliferative disease in a subject in need thereof, comprising administering the composition of claim 47, preferably, wherein the malignant proliferative disease is Relapse or Refractory B-cell Non-Hodgkin Lymphoma, more preferably, wherein between 5 × 104 and 1 × 106 CAR-T cells are administered per kilogram body weight of the subject.49.Use of a nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 15, a CAR according to any one of claims 4 to 9 or 16 to 22, a vector according to any one of claims 24 to 26, a population of immune cells according to any one of claims 27 to 32, or a population of genetically modified stem cells according to claim 33 or 34 in the manufacture of a medicament for the treatment of a tumor or an autoimmune disease.50.Use of a nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 15, a CAR according to any one of claims 4 to 9 or 16 to 22, a vector according to any one of claims 24 to 26, a population of immune cells according to any one of claims 27 to 32, or a population of genetically modified stem cells according to claim 33 or 34 in the manufacture of a medicament for the treatment of diseases of tumors or autoimmune diseases.51.Use of claim 49 or claim 50, wherein the autoimmune disease is a CD19+ autoimmune disease.

Images