Circular RNA-based therapeutics for methylmalonic acidemia

Abstract

Provided is a circular RNA encoding MUT or CblC and the use thereof for the treatment of Methylmalonic Acidemia.

Description

Circular RNA-based Therapeutics for Methylmalonic AcidemiaTECHNICAL FIELD

[0001] The present invention relates to the field of the circular RNA and the use thereof for the treatment of Methylmalonic Acidemia.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Methylmalonic Acidemia (MMA) is an autosomal recessive metabolic disorder with significant mortality, which were 0.79, 1.12, 1.22 and 6.04 per 100,000 newborns in Asia-Pacific, Europe, North America, the Middle East and North Africa regions as illuminated by meta-analysis. The disease is mainly due to methylmalonyl-CoA mutase (MUT) defect or metabolism abnormalities of its coenzyme cobalamin, resulting in accumulation of methylmalonate and methylcitrate, leading to multi-organs dysfunction in nerves, liver, kidneys, and bone marrow. Specifically, methylmalonyl-CoA mutase is the enzyme most frequently mutated in MMA, it catalyses the conversion of methylmalonyl-CoA to succinyl-CoA in mitochondria, which is divided into complete enzyme defect called mut0 subtype and enzyme partial defect called mut-subtype. Cobalamin metabolism is associate with several genes such as MMAA (cblA) , MMAB (cblB type) , MMACHC (cblC type) , MMADHC (cblD type) , LMBD1 (cblF type) , in which, cblC type is most common in Chinese patients, and c. 609G>A is the highest frequency pathogenic mutation as reported in previous literature (He R, et al., Orphanet J Rare Dis. 15: 200 (2020) ) .

[0003] Despite the high unmet need for methylmalonic acidemia, however, there is no approved therapy for it. Current treatments include dietary restriction, cofactor supplement, liver and / or kidney transplant, which is the only effective treatment even in infants, but transplant is not curative and is associated with mortality.

[0004] There is a need to develop new therapeutics for treating MMA.SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] The invention relates to a novel circular RNA encoding MUT or CblC and the use thereof for treating methylmalonic acidemia (MMA) .

[0006] In one aspect, the invention provides a circular RNA, comprising a regulatory element and an expression element comprising a polynucleotide encoding MUT or a variant thereof.

[0007] In one aspect, the invention provides a circular RNA, comprising a regulatory element and an expression element comprising a polynucleotide encoding CblC or a variant thereof.

[0008] In one aspect, the invention provides a combination of circular RNAs, wherein the combination comprising: (1) the circular RNA comprising a polynucleotide encoding MUT or a variant thereof as disclosed herein; and (2) the circular RNA comprising a polynucleotide encoding CblC or a variant thereof as disclosed herein.

[0009] In one aspect, the invention provides a composition comprising the circular RNA disclosed herein or the combination disclosed herein, wherein the composition comprises pharmaceutically acceptable excipients.

[0010] In one aspect, the invention provides a method for treating methylmalonic acidemia in a subject, comprising administering a therapeutically effective amount of the circular RNA, the combination or the composition disclosed herein to the subject.

[0011] In one aspect, the invention provides the use of the circular RNA, the combination or the composition disclosed herein in the manufacture of a medicament for treating methylmalonic acidemia in a subject.

[0012] In one aspect, the invention provides a circular RNA, the combination or the composition disclosed herein, for use in treating methylmalonic acidemia in a subject.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0013] Figure 1: circRNA preparation by Group1 intron self-splicing. High purity circRNA coding human MUT (hMUT) (A) , human CblC (hCblC) (B) , and mouse CblC (mCblC) (C) was prepared by Group 1 intron self-splicing. The purified circRNA was analyzed by 1%agarose gel.

[0014] Figure 2: circRNA preparation by T4 Rnl2. The purified human CblC circRNA was prepared by T4 Rnl2 ligation and RNase R enrichment and was analyzed by 1%agarose gel.

[0015] Figure 3: Expression of circRNAs in 293T cells. Circular RNAs encoding human MUT (A) , human CblC (B) , and mouse CblC (C) , generated via Group 1 intron self-splicing, were transfected into 293T cells. Expression levels were assessed by western blotting after 16 hours. Five codon optimized sequences were tested for each circRNA to get the most effective sequence for subsequent experiments.

[0016] Figure 4: Expression of hMUT circRNAs with different IRES sequence in 293T cells. The expression of hMUT circRNAs with different IRES were determined by western blotting. Three codon-optimized hMUT sequences were tested for three IRES including CVB3, EV71 and HRV-A1 to get the most effective sequence for subsequent experiments.

[0017] Figure 5: Mitochondrial localization of hMUT protein in mut0 fibroblasts. (A) hMUT circRNA expression was confirmed in mut0 fibroblasts by western blot. (B) Immunofluorescence analysis of hMUT protein subcellular localization in hMUT circRNA-transfected mut0 fibroblasts. hMUT protein is shown in green, MitoTracker staining in red, and DAPI (nuclear) staining in blue. Scale bars, 20 μm.

[0018] Figure 6: CircRNA expression in mouse hepatic tissue following intravenous administration. Wild-type C57BL / 6 mice (n=3 mice / dose) received a single intravenous bolus injection of 0.2 mg / kg or 1.0 mg / kg of lipid nanoparticle-formulated circRNAs encoding hMUT (A) , hCblC (B) , or mCblC (C) . Mice were sacrificed 24 hours post-injection. CircRNA levels were quantified by RT-qPCR. Protein expression in liver tissue was assessed by western blotting.

[0019] Figure 7: Pharmacokinetics of hepatic protein levels following circRNA administration. Wild-type C57BL / 6 mice were administered a single intravenous bolus of 0.5 mg / kg lipid nanoparticle formulations of circRNA, and sacrificed at various time points (1, 2, 6 hours, 1, 2, 3, 5, 7 days; n = 3 mice / time point) . hMUT and hCblC expression level in mouse hepatic tissue were determined by western blotting.

[0020] Figure 8: Expression of hMUT and hCblC in mouse hepatic tissue following circRNAs co-administration. Wild-type C57BL / 6 mice (n=3 mice / dose) received a single intravenous bolus of lipid nanoparticles containing both hMUT and hCblC circRNAs, each at a dose of 0.2 mg / kg or 1.0 mg / kg. Mice were sacrificed 24 hours post-injection. Expression of hMUT and hCblC in hepatic tissue was assessed by western blotting.

[0021] Figure 9: hMUT circRNA improved cell viability in MUT-deficient fibroblasts. MUT0 fibroblasts (GM01673) , which lack detectable MUT activity, were transfected with hMUT circRNA or a control transfection reagent (vehicle) and then cultured in a 10 mM propionate-enriched medium. Cell viability was assessed at 24-and 48-hour post-transfection using a CCK-8 assay. Data are presented as mean ± SEM (n = 3) .

[0022] Figure 10: hCblC circRNA reduced boold Methylmalonic Acid in a muscle-specific Mmachc knock-in mouse model. Mice received a single intravenous bolus of hCblC circRNA formulated in lipid nanoparticles either at 0.2 mg / kg or 1 mg / kg. Methylmalonic acid levels were measured at various time points post-injection. Data are presented as mean ± SEM (n = 4-5 mice per group) .DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0023] Unless otherwise defined below, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as commonly understood by an ordinary skilled person in the art. References to techniques used herein are intended to refer to techniques that are generally understood in the art, including those obvious changes or equivalent replacements of the techniques for those skilled in the art. While it is believed that the following terms are well understood by those skilled in the art, the following definitions are set forth to better explain the invention.

[0024] As used herein, the terms “including” , “comprising” , “having” , “containing” or “comprising” , and other variants thereof, are inclusive or open, and do not exclude other unlisted elements or method steps.

[0025] As used herein, the terms “embodiment” , “disclosed herein” or “disclosure” are not meant to be limiting, but applies generally to any of the embodiments defined in the claims or described herein. These terms are used interchangeably herein.

[0026] As used herein, the terms “treat” , “treating” , “treatment” and the like refer to eliminating, reducing, or ameliorating a disease or condition, and / or symptoms associated therewith. Although not precluded, treating a disease or condition does not require that the disease, condition, or symptoms associated therewith be completely eliminated. The term “treat” and synonyms contemplate administering a therapeutically effective amount of the circular RNA or the composition disclosed herein to a subject in need of such treatment. The treatment can be orientated symptomatically, for example, to suppress symptoms. It can be effected over a short period, be oriented over a medium term, or can be a long-term treatment, for example within the context of a maintenance therapy.

[0027] Throughout this disclosure, the terms “a” or “an” entity refers to one or more of that entity; for example, “apolynucleotide” is understood to represent one or more polynucleotides. As such, the terms “a” (or “an” ) , “one or more” and “at least one” can be used interchangeably herein.

[0028] The term “variant” , as used herein, refers to a peptide that differs from the recited peptide due to amino acid substitutions, deletions, insertions, and / or modifications. Variants can be produced using art-known mutagenesis techniques.

[0029] The terms “composition” or “pharmaceutical composition” refer to compositions comprising the circular RNA provided herein, along with e.g., pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or diluents for administration to a subject in need of treatment.

[0030] The term “pharmaceutically acceptable” refers to compositions that are, within the scope of sound medical judgment, suitable for contact with the tissues of human beings and animals without excessive toxicity or other complications commensurate with a reasonable benefit / risk ratio.

[0031] An “effective amount” is that amount of a circular RNA provided herein, the administration of which to a subject, either in a single dose or as part of a series, is effective for treatment. For example, with respect to obesity, an amount is effective, for example, when its administration results in one or more of weight loss or weight maintenance (e.g., prevention of weight gain) , loss of body fat, prevention or modulation hypoglycemia, prevention or modulation hyperglycemia, promotion of insulin synthesis, or reduction in food intake. This amount can be a fixed dose for all subjects being treated, or can vary depending upon the weight, health, and physical condition of the subject to be treated, the extent of weight loss or weight maintenance desired, the formulation of the circular RNA or the composition disclosed herein, a professional assessment of the medical situation, and other relevant factors.

[0032] The term “subject” is meant any subject, particularly a mammalian subject, in need of treatment with the circular RNA or the composition provided herein. Mammalian subjects include, but are not limited to, humans, dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, cattle, bears, cows, apes, monkeys, orangutans, and chimpanzees, and so on. In one embodiment, the subject is a human subject.

[0033] Methylmalonyl-CoA mutase (MUT) , encoded by MMUT gene, is a mitochondrial homodimer apoenzyme (EC. 5.4.99.2) that is responsible for the catalysis of methylmalonyl CoA to succinyl CoA.

[0034] Cyanocobalamin reductase (CblC) is a protein encoded by MMACHC gene.

[0035] The term “about” as used herein, includes the recited number ± 10%. Thus, “about 10” means 9 to 11.

[0036] Circular RNA

[0037] As used herein, the terms “circRNA” or “circular polyribonucleotide” or “circular RNA” are used interchangeably and can refer to a polyribonucleotide that forms a circular structure through covalent or non-covalent bonds. When it comes to circular RNA, a skilled person would understand that a polynucleotide in a RNA refers to a polyribonucleotide. The term “circRNA” refers to both modified and un-modified circRNA.

[0038] In one aspect, the invention provides a circular RNA, comprising a regulatory element and an expression element comprising a polynucleotide encoding MUT or a variant thereof.

[0039] In one aspect, the invention provides a circular RNA, comprising a regulatory element and an expression element comprising a polynucleotide encoding CblC or a variant thereof.

[0040] In some embodiments, the polynucleotide encoding MUT or a variant thereof has at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%or 100%identity with the sequence set forth as any one of SEQ ID NOs: 1-4 and SEQ ID NOs: 16-18, preferably the polynucleotide encoding MUT or a variant thereof is set forth as SEQ ID NO: 16.

[0041] In some embodiments, the polynucleotide encoding CblC or a variant thereof has at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%or 100%identity with the sequence set forth as any one of SEQ ID NOs: 6-15, preferably the polynucleotide encoding CblC or a variant thereof is set forth as SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 11.

[0042] In some embodiments, the amino acid sequence of MUT or a variant thereof is set forth as SEQ ID NO: 30.

[0043] In some embodiments, the amino acid sequence of CblC or a variant thereof is set forth as any one of SEQ ID NOs: 31-32.

[0044] In some embodiments, the circular RNA comprises a sequence set forth as any one of SEQ ID NOs: 33-35.

[0045] In one aspect, the invention provides a DNA vector for synthesizing any of the circular RNA provided herein.

[0046] The circular RNA disclosed herein can be prepared using methods in the prior art. In a preferred embodiment, the circular RNA is prepared using the method in the Examples.

[0047] Regulatory elements

[0048] A regulatory element may include a sequence that is located adjacent to an expression element that encodes an expression product. A regulatory element may be linked operatively to the adjacent sequence. A regulatory element may increase an amount of product expressed as compared to an amount of the expressed product when no regulatory element exists. In addition, one regulatory element can increase an amount of products expressed for multiple expression sequences attached in tandem. Hence, one regulatory element can enhance the expression of one or more expression sequences.

[0049] In some embodiments, the regulatory element comprises an internal ribosomal entry site (IRES) or a fragment thereof.

[0050] A suitable IRES element to include in a circular polyribonucleotide comprises an RNA sequence capable of engaging a eukaryotic ribosome. In some embodiments, the IRES element is at least about 5 nt, at least about 8 nt, at least about 9 nt, at least about 10 nt, at least about 15 nt, at least about 20 nt, at least about 25 nt, at least about 30 nt, at least about 40 nt, at least about 50 nt, at least about 100 nt, at least about 200 nt, at least about 250 nt, at least about 350 nt, or at least about 500 nt.

[0051] In some embodiments, the IRES is selected from the group consisting of Coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, Enterovirus 71 (EV71) IRES, encephalomyocarditis virus (EMCV) IRES, picornavirus (PV) IRES, hepatitis C virus (HCV) IRES, adenovirus (AdV) IRES, human papillomavirus type 31 (HPV31) IRES, human herpesvirus (HHV) IRES, Rous sarcoma virus (RSV) IRES, classical swine fever virus (CSFV) IRES, FGF9 IRES, SLC7A1 IRES, HRV-A1 IRES and RUNX1 IRES. In a preferred embodiment, the IRES is selected from CVB3 IRES, EV71 IRES and HRV-A1 IRES.

[0052] In some embodiments, the polynucleotide sequence of the IRES is set forth as any one of SEQ ID NOs: 19 and 22-29.

[0053] Administration of circular RNA to the subject

[0054] In one aspect, the invention provides a combination of circular RNAs, wherein the combination comprising: (1) the circular RNA comprising a polynucleotide encoding MUT or a variant thereof as disclosed herein; and (2) the circular RNA comprising a polynucleotide encoding CblC or a variant thereof as disclosed herein.

[0055] In one aspect, the invention provides a composition comprising the circular RNA or the combination disclosed herein, wherein the composition comprises pharmaceutically acceptable excipients.

[0056] In some embodiments, the composition comprises nanoparticle, for example, lipid nanoparticle.

[0057] In some embodiments, the circRNA is administered as naked circRNA, or as a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable excipient. In non-limiting examples, the pharmaceutically acceptable excipient is polyethylenimine (PEI) or a lipid nanoparticle (LNP) . Other examples of liposomes that can be used to administer the circRNA or the composition for administration include protamines, cationic nanoemulsions, modified dendrimer nanoparticles, protamine liposomes, cationic polymers, cationic polymer liposomes, polysaccharide particles, cationic lipid nanoparticles, cationic lipid-cholesterol nanoparticles, cationic lipid-cholesterol PEG nanoparticle, cationic lipid transfection reagents sold under the trademark LIPOFECTAMINE, nonliposomal transfection reagents sold under the trademark FUGENE, or any combination thereof can be used as the pharmaceutically acceptable excipient.

[0058] In some embodiments, the pharmaceutical compositions may optionally comprise one or more additional active substances, e.g. therapeutically and / or prophylactically active substances.

[0059] Diseases

[0060] In one aspect, the invention provides a method for treating methylmalonic acidemia in a subject, comprising administering a therapeutically effective amount of the circular RNA, the combination or the composition disclosed herein to the subject.

[0061] In one aspect, the invention provides the use of the circular RNA, the combination or the composition disclosed herein in manufacture of a medicament for treating methylmalonic acidemia in a subject.

[0062] In one aspect, the invention provides a circular RNA, the combination or the composition disclosed herein, for use in treating methylmalonic acidemia in a subject.

[0063] Although the descriptions of pharmaceutical compositions provided herein are principally directed to pharmaceutical compositions which are suitable for administration to humans, it will be understood by the skilled artisan that such compositions are generally suitable for administration to any other animal, e.g., to non-human animals, e.g. non-human mammals.

[0064] Examples

[0065] To make the objects and technical solutions of the present invention clearer, the present invention will be further described below in conjunction with specific examples. It should be understood that the examples are not intended to limit the scope of the invention. Further, specific experimental methods not mentioned in the following examples were carried out in accordance with a conventional experimental method.

[0066] Example 1:

[0067] Production of circRNA Encoding human MUT, human CblC and mouse CblC by Group1 intron self-splicing reaction

[0068] The codon optimized nucleotide sequences of human Methylmalonyl-CoA mutase (SEQ ID NO: 1-5) , human Cyanocobalamin reductase (SEQ ID NO: 6-10) and mouse Cyanocobalamin reductase (SEQ ID NOs: 11-15) were synthesized by Beijing Ruibo Biotech Co., Ltd. The CVB3 IRES sequence was provided as SEQ ID NO: 19 and the Anabaena Group 1 intron permuted-intron-exon sequence were provided as SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21. In the case of circRNA produced by Group 1 intron self-splicing reaction, the linear RNA undergoes two sequential trans-esterification reactions to obtain covalently 5′ to 3′ linked circular RNA with the help of Mg2+ and exogenous guanosine or guanosine nucleotide.

[0069] Example 1A: RNA transcription and circularization.

[0070] Briefly, the linearized plasmid DNA template was obtained by digesting with Pme1 restriction endonuclease (New England Biolabs) , and column purified using DNA Clean &Concentrator-25 Kit (ZYMO RESEARCH) . The precursor RNA was synthesized by in vitro transcription using a T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs) . In a traditional IVT reaction system, reaction components were assembled with 400 ng linearized DNA template, 100 U T7 RNA Polymerase, 10 mM NTP solution mix, 10×reaction buffer, 10 U RNase Inhibitor and 0.008 U pyrophosphatase, then program the thermocycler for the IVT reaction by incubation at 37℃ for 2 hours. After in vitro transcription, the IVT reaction was treated with 10 U DNase I (New England Biolabs) , and incubation at 37℃ for 30 minutes to remove the linearized DNA template. After DNase I treatment, additional GTP nucleotide was added to the IVT reaction system, and the reactions were heated at 55℃for 15 minutes to get as many transesterification reactions as possible, RNA was then purified by RNA Cleanup Kit (New England Biolabs) .

[0071] Example 1B: CircRNA purification by HPLC.

[0072] To remove the small, spliced intron fragments accompanied by group 1 intron splicing reaction, high-performance liquid chromatography-based purification was analyzed. The stock RNA solution was diluted to 500 ng / μL first, then run through a 4.6 × 300 mm size exclusion column with particle size of 5 μm and pore size of  (Sepax Technologies) on an Agilent 1100 Series HPLC (Agilent) . In detail, the mobile phase was RNase-free TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH: 6) , the flow rate was 1.0 mL / minute, the separated circRNA fractions were collected and column purified using RNA Cleanup Kit (ZYMO RESEARCH) . To reduce the immunity induced by triphosphates at the 5′ends of the nicked or the remaining precursor RNA, a phosphatase treatment step after HPLC purification was performed as follows, reaction was assembled with 1 μg circRNA, 0.5 U calf intestinal alkaline phosphatase (CIP, New England Biolabs) , and 10×reaction buffer, then incubated at 37℃ for 30 minutes. The final products were column purified using DNA Clean &Concentrator-25 Kit (ZYMO RESEARCH) . The purified circular RNA was analyzed, and the results are shown in Figure 1A, 1B and 1C.

[0073] EXAMPLE 2

[0074] Production of circRNA Encoding human CblC and human MUT by T4 RNA ligase II (Rnl2)

[0075] The codon optimized nucleotide sequences of human Methylmalonyl-CoA mutase (SEQ ID NOs: . 16-18) were synthesis by Beijing Ruibo Biotech Co., Ltd. The construct sequence of the human CblC was provided as SEQ ID NO: 7. The spliced CBV3, EV71 and HRV-A1 IRES sequences were provided in SEQ ID NOs: 22-29. In the case of circRNA produced by enzyme ligation method, the T4 RNA ligase II catalysis the formation of a phosphodiester bond between adjacent 5′ monophosphate and 3′ hydroxyl of linear RNA.

[0076] Example 2A: RNA transcription and circularization by T4 Rnl2

[0077] Briefly, the linearized plasmid DNA template was obtained by digesting with restriction endonuclease (New England Biolabs) and purified using DNA Clean &Concentrator-25 Kit (ZYMO RESEARCH) . RNA was synthesized by in vitro transcription using a T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs) . In a traditional IVT reaction system, reaction components were assembled with 400 ng linearized DNA template, 100 U T7 RNA Polymerase, a NTP solution mix including 2 mM GTP, 8 mM GMP solution, 10 mM ATP, 10 mM CTP, 10 mM UTP, 10×reaction buffer, 10 U RNase Inhibitor and 0.008 U Pyrophosphatase, then program the thermocycler for the IVT reaction by incubation at 37℃ for 2 hours. After in vitro transcription, the reaction was treated with 10 U DNase I (New England Biolabs) , and incubation at 37℃ for 30 minutes to remove the linearized DNA template. After DNase I treatment, the RNA transcripts were purified by RNA Cleanup Kit (New England Biolabs) . Then, the RNA ligation reactions were assembled with 2 U T4 Rnl2 per microgram linear RNA, and the reactions were incubated at 25℃for 8 hours. The RNA transcripts contained circRNA were then purified by  RNA Cleanup Kit (New England Biolabs) .

[0078] Example 2B: circRNA enrichment by RNase R.

[0079] To remove the remaining linear RNA after the T4 RNA ligation step, Ribonuclease R which is a magnesium-dependent exoribonuclease, was then added to the solution. A mixture of 1 μg column purified RNA product, 2 U RNase R (Novoprotein) was assembled to the 20 μL reaction system, and the reactions were incubated at 37 ℃ for 25 minutes. At last, the circular RNA was purified by RNA Cleanup Kit (New England Biolabs) , the purity of circular RNA was analyzed by 1%agarose gel electrophoresis. The quality of purified circRNA encoding human CblC, which is prepared by T4 RNA ligase II (Rnl2) was shown in Figure 2.

[0080] EXAMPLE 3

[0081] Lipid Nanoparticle Formulations of circRNA.

[0082] CircRNA-LNPs were prepared by mixing the ethanolic solution of lipids with an aqueous solution of circRNA at 50 mM citrate buffer (pH 4.0) . Upon mixing, the ionizable lipids become cationic in acidic buffer, and interact with anionic RNA through electrostatic complexation, rapid mixing leading to circRNA being encapsulated in homogeneous LNPs. In detail, the lipid mixture consists of four main components, ionizable lipid SM102, DSPC, cholesterol and PEG-DMG, which were dissolved in ethanol at molar ratios of 50: 10: 38.5: 1.5. The ethanolic and aqueous solutions were mixed at a volume ratio of 3: 1 with a flow rate of 12 mL / min using the microfluidic mixer NanoAssemblr system (Precision NanoSystems, Vancouver, BC) . After mixing, the circRNA-LNPs product were buffer-exchanged into phosphate-buffered saline (pH 7.4) with 4%sucrose and concentrated by ultrafiltration using Millipore Ultra-15 centrifugal filters (100 kDa MWCO) . Finally, the circRNA-LNPs were filtrated through a 0.22 μm filter and stored in presterilized vials at -80℃ until use. For quality control, the encapsulation efficiency, particle size and PDI were determined by a QUANT-ITTM RNA assay (Invitrogen Corporation Carlsbad, CA) and A Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, UK) equipment respectively.

[0083] EXAMPLE 4

[0084] In vitro expression efficacy of circRNA in 293T cell.

[0085] The expression efficiency of various circRNA constructs were evaluated in 293T cells. Cells were seeded in 24-well plates and transfected at 70-80%confluency with 1 μg circRNAs using Lipofectamine MessengerMAX Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific) . After 24 hours, cells were lysed in RIPA buffer (Beyotime) containing proteinase inhibitor cocktail (Biosharp) . Protein expression was assessed by western blotting using antibodies against methylmalonyl-CoA mutase (Origene, TA506883) , MMACHC (Abcam, ab177956) , or MMACHC (Proteintech, 21462-1-AP) . As shown in Figure 3, all circRNA constructs were efficiently expressed, albeit with slight variations. The efficiency of different IRES elements driving human MUT protein translation was also evaluated (Figure 4) . All tested IRES elements facilitated efficient protein translation in 293T cells.

[0086] EXAMPLE 5

[0087] hMUT circRNA transfection rescued MUT protein expression and restored its mitochondrial localization in MUT-deficient fibroblasts

[0088] The mut0 fibroblasts (GM50) which exhibit no detectable enzyme activity and expresses decreased amounts of MUT mRNA were purchased from Coriell Institute, those cells were plated on glass coverslips in 6-well plates and transfected with 2 μg hMUT circRNA-LNP. 24 hours after transfection, 200 nM MitoTracker Red CMXRos (M7512, ThermoFisher Scientific) were added to the culture medium and incubated at 37℃ for 30 minutes to label mitochondria, after that cells were washed with prewarmed 1×PBS three times, then fixed, permeabilized, and incubated with an anti-MUT monoclonal antibody (Origene, TA506873; 1: 300 dilution) overnight at 4℃, followed by an Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibody (Beyotime, P0188; 1: 1000 dilution) . Nuclei were counterstained with DAPI. Images were acquired using a Nikon A1RSi+ confocal microscope with a 100× / 1.45 oil objective and NIS-Elements software. As shown in Figure 5A and Figure 5B, upon hMUT circRNA-LNP transfection, the expression of human MUT protein was effectively restored and co-localized with mitochondria correctly in mut0 fibroblasts.

[0089] EXAMPLE 6

[0090] In vivo expression efficacy of circRNA in mouse hepatic tissue.

[0091] This study was designed to characterize hMUT and hCblC protein expression efficiency in vivo following intravenous administration of circRNA-loaded lipid nanoparticles (LNPs) in C57BL / 6 mice. Two dose levels (0.2 mg / kg and 1 mg / kg) of circRNA-LNPs were administered, as well as a combined administration of hMUT and hCblC circRNAs. 24 hours after injection, mice were euthanized by cervical dislocation and hepatic tissue were collected, then hepatic tissues were homogenized in RIPA buffer (Beyotime) supplied with 100× diluted proteinase inhibitor (Biosharp) using bead-based Homogenizer (Jingxin, JXFSTPRP-L) , the sonication process was programmed with 60 Hz for 1.5 min, the supernatant was collected by centrifuge at 13000 g for 10 min and protein expression level was measured by western blot using anti-Flag tag antibody (Proteintech, 66008-4-Ig) and anti-MMACHC antibody (Abcam, ab177956) respectively. The results revealed a dose-dependent increase in protein expression, correlating with increased circRNA levels (Figures 6 and 8) . Moreover, the expression levels of both proteins were not comprised when the hMUT circRNA and hCblC circRNA administrated simutaniously (Figure 8) , indicating the potential of combo treatment in clinic.

[0092] For the metabolic and pharmacokinetic studies, C57BL / 6 mice were administered a single intravenous bolus of 0.5 mg / kg hMUT or hCblC circRNA LNPs and sacrificed at various time points (1, 2, 6, 16 hours, 1, 2, 3, 5, 7 days; n = 3 mice / time point) , the Hepatic hMUT and hCblC protein levels were quantified by western blot as mentioned above and the results were shown in Figure 7, both human MUT and CblC are expressed shortly after injection and sustained for at least one week in mouse liver.

[0093] EXAMPLE 7

[0094] hMUT circRNA improved cell viability in MUT-deficient fibroblasts.

[0095] Cells deficient in the MUT gene exhibit metabolic imbalances when cultured in medium enriched with methylmalonyl-CoA precursors such as propionate. To investigate whether hMUT circRNA could ameliorate these imbalances and improve cell viability, we utilized a propionate-enriched culture medium on MUT0 fibroblasts (GM01673) . These cells lack detectable MUT activity and exhibit reduced MUT mRNA expression. Cell viability, proliferation, and cytotoxicity were assessed using a CCK-8 assay after transfecting MUT0 cells with hMUT circRNA and incubating them in a 10 mM propionate-enriched medium for 24 and 48 hours. The CCK-8 assay quantifies viable cells by measuring their metabolic activity. Live cells convert the WST-8 reagent into a formazan dye, and the resulting absorbance at 450 nm correlates directly with cell viability. The results demonstrated that hMUT circRNA significantly improved the viability of MUT0 cells compared to vehicle controls, suggesting a functional replenishment effect. This was likely through the compensation of the missing or diminished MUT enzyme activity (Figure 9) .

[0096] EXAMPLE 8

[0097] hCblC circRNA reduced Methylmalonic Acid in a skeletal muscle-specific Mmachc knock-in mouse model

[0098] A muscle-specific Mmachc knock-in (cki) mouse model was generated by inserting a "loxP-En2 SA-β-geo-6×SV40 pA-loxP" cassette into intron 1 of the Mmachc gene (NM_025962.3) on chromosome 4 via homologous recombination. Subsequent breeding with a Myf5-Cre strain enabled skeletal muscle-specific expression of Mmachc upon Cre-mediated excision of the floxed Stop cassette, rescuing the neonatal lethality observed in Mmachc null mice. These cki mice lacked hepatic methylmalonyl-CoA mutase activity, exhibited reduced weight, and accumulated methylmalonic acid, mimicking severe methylmalonic acidemia in humans. A single intravenous injection of hCblC circRNA encapsulated in lipid nanoparticles in Mmachc cki mice resulted in a substantial and sustained reduction of plasma methylmalonic acid. At doses of both 0.2 mg / kg and 1 mg / kg, a rapid reduction of 70-76%was observed, sustained for at least 5 days post-injection (Figure 10, n = 4-5 mice) . These results demonstrated the therapeutic potential of hCblC circRNA for treating methylmalonic acidemia.

[0099] Having now fully described the methods, compounds, and compositions herein, it will be understood by those of skill in the art that the same can be performed within a wide and equivalent range of conditions, formulations, and other parameters without affecting the scope of the methods, compounds, and compositions provided herein or any embodiment thereof.

[0100] All patents, patent applications, and publications cited herein are fully incorporated by reference herein in their entirety.

[0101] Sequence listing

Claims

1.A circular RNA, comprising a regulatory element and an expression element comprising a polynucleotide encoding MUT or a variant thereof.2.A circular RNA, comprising a regulatory element and an expression element comprising a polynucleotide encoding CblC or a variant thereof.3.The circular RNA of claim 1 or 2, wherein the regulatory element comprises an internal ribosomal entry site (IRES) or a fragment thereof.4.The circular RNA of claim 3, wherein the IRES is selected from the group consisting of Coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, Enterovirus 71 (EV71) IRES, encephalomyocarditis virus (EMCV) IRES, picornavirus (PV) IRES, hepatitis C virus (HCV) IRES, adenovirus (AdV) IRES, human papillomavirus type 31 (HPV31) IRES, human herpesvirus (HHV) IRES, Rous sarcoma virus (RSV) IRES, classical swine fever virus (CSFV) IRES, FGF9 IRES, SLC7A1 IRES, HRV-A1 IRES and RUNX1 IRES, preferably the IRES is selected from CVB3 IRES, EV71 IRES and HRV-A1 IRES.5.The circular RNA of claim 3, wherein the polynucleotide sequence of the IRES is set forth as any one of SEQ ID NOs: 19 and 22-29.6.The circular RNA of any one of preceding claims, wherein the polynucleotide encoding MUT or a variant thereof has at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%or 100%identity with the sequence set forth as any one of SEQ ID NOs: 1-4 and SEQ ID NOs: 16-18, preferably the polynucleotide encoding MUT or a variant thereof is set forth as SEQ ID NO: 16.7.The circular RNA of any one of preceding claims, wherein the polynucleotide encoding CblC or a variant thereof has at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%or 100%identity with the sequence set forth as any one of SEQ ID NOs: 6-15, preferably the polynucleotide encoding CblC or a variant thereof is set forth as SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 11.8.The circular RNA of any one of preceding claims, wherein the amino acid sequence of MUT or a variant thereof is set forth as SEQ ID NO: 30.9.The circular RNA of any one of preceding claims, wherein the amino acid sequence of CblC or a variant thereof is set forth as any one of SEQ ID NOs: 31-32.10.The circular RNA of any one of preceding claims, wherein the circular RNA comprises a sequence set forth as any one of SEQ ID NOs: 33-35.11.A DNA vector for synthesizing the circular RNA of any one of preceding claims.12.A combination of circular RNAs, wherein the combination comprising:(1) the circular RNA comprising a polynucleotide encoding MUT or a variant thereof as defined in any one of the preceding claims; and(2) the circular RNA comprising a polynucleotide encoding CblC or a variant thereof as defined in any one of the preceding claims.13.A composition comprising the circular RNA of any one of the preceding claims or the combination of claim 12, wherein the composition comprises pharmaceutically acceptable excipients.14.The composition of claim 13, wherein the composition comprises nanoparticle, for example, lipid nanoparticle.15.A method for treating methylmalonic acidemia in a subject, comprising administering a therapeutically effective amount of the circular RNA of any one of claims 1-10 to the subject, the combination of claim 12 or the composition of claim 13 or claim 14 to the subject.16.Use of the circular RNA of any one of claims 1-10, the combination of claim 12 or the composition of claim 13 or claim 14 in the manufacture of a medicament for treating methylmalonic acidemia in a subject.17.The circular RNA of any one of claims 1-10, the combination of claim 12 or the composition of claim 13 or claim 14, for use in treating methylmalonic acidemia in a subject.

Images