Recombinant fusion protein targeting siglec15 and GM-csfr

Abstract

A recombinant fusion protein comprises (a) an anti-Siglec15 antibody or an antigen binding portion thereof comprising a heavy chain and a light chain, and (b) a GM-CSF molecule. The GM-CSF molecule is linked to the C-terminus of the heavy chain of the anti-Siglec15 antibody or the antigen binding portion thereof.

Description

Recombinant Fusion Protein Targeting SIGLEC15 and GM-CSFRINCORPORATION BY REFERENCE

[0001] All documents cited or referenced herein (including without limitation all literature documents, patents, published patent applications cited herein) ( “herein cited documents” ) , and all documents cited or referenced in herein cited documents, together with any manufacturer’s instructions, descriptions, product specifications, and product sheets for any products mentioned herein or in any document incorporated by reference herein, are hereby incorporated herein by reference, and may be employed in the practice of the invention. More specifically, all referenced documents are incorporated by reference to the same extent as if each individual document was specifically and individually indicated to be incorporated by reference. Any Genbank sequences mentioned in this disclosure are incorporated by reference with the Genbank sequence to be that of the earliest effective filing date of this disclosure. This application claims priority from PCT international application PCT / CN2024 / 096239 filed on May 30, 2024, which is incorporated herein by reference in its entirety.FIELD OF THE INVENTION

[0002] The present disclosure relates generally to a recombinant fusion protein, comprising an anti-SIGLEC15 antibody and a GM-CSF molecule. A nucleic acid molecule encoding the recombinant fusion protein, an expression vector, a host cell and a method for expressing the recombinant fusion protein are also provided. The present disclosure further provides a pharmaceutical composition which may comprise the recombinant fusion protein, as well as a treatment method using the recombinant fusion protein of the disclosure.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0003] Immunotherapy is a revolutionary therapeutic approach that boosts the immune system to fight diseases such as cancer. It is applicable to many indications and offers a lesser high-grade toxicity compared with other standard therapies. The PD-1 / PD-L1 pathway is a hot target in tumor immunotherapy, and several inhibitors of either PD-1 or PD-L1 have been clinically approved, such as the anti-PD-1 antibodies and and the anti-PD-L1 antibody However, a subset of patients do not respond to such treatments. As revealed by a recent study, Siglec15 targeting may be a complementary approach for cancer patients unresponsive to PD-1 / PD-L1 targeting therapies (Jun Wang et al., (2019) Nature Medicine 25: 656-666) .

[0004] Siglec15 is a member of Siglec family with a sialic acid-binding immunoglobulin-type lectin structure. It contains two extracellular immunoglobulin-like domains, a transmembrane domain with a lysine residue that is essential for the interaction with adapter protein DAP12, and a cytoplasmic tail (Takashi Angata et al., (2007) Glycobiology 17 (8) : 838-846) .

[0005] Siglec15 is expressed on osteoclasts, and plays a role in osteoclast differentiation and bone remodeling (Hiruma Y et al., (2011) Biochemical and Biophysical Research Communications 409 (3) : 424-429; Takashi Angata (2020) Journal of Biomedical Science 27: 10) . The administration of anti-Siglec15 antibodies inhibited osteoclastic bone resorption and increased bone mass in rodent models (Stuible M et al., (2014) Journal of Biological Chemistry 289 (10) : 6498-6512; Sato D et al., (2018) Bone 116: 172-180) .

[0006] Siglec15 is also expressed on tumor-associated macrophages and preferentially recognizes the sialyl-Tn antigen, a tumor associated glycan structure. The co-culture of sialyl-Tn / -cancer cell line and M-CSF-induced human macrophages or Siglec15+ myeloid cell line induced the production of transforming growth factor-β, which promoted epithelia-mesenchymal transition and metastasis of cancer cells (Takamiya R et al., (2013) Glycobiology 23 (2) : 178-187) . Lieping Cheng et al., recently discovered that Siglec15 is further expressed on tumor cells and / or tumor-associated stromal cells in clinical non-small cell lung cancer samples. They also found Siglec15 proteins suppressed T cell proliferation and activation, and the anti-Siglec15 antibodies reversed T cell suppression and attenuated cancer growth in vivo. As Siglec15 and PD-L1 are mutually exclusive in cancer tissues, Siglec15 may serve as a complementary therapeutic target and offers alternative treatment to patients that are refractory to PD-1 / PD-L1 blockade (Jun Wang et al., (2019) supra) . NC318, a humanized anti-Siglec15 antibody, has been clinically tested in patients with advanced solid tumors, including non-small cell lung cancer, ovarian cancer, melanoma, colorectal cancer, and breast cancer, and prolonged stabilization of disease was observed in 54%of the patients and objective response in 5.4% (Sun J et al., (2021) Clin Cancer Res. 27 (3) : 680-688) .

[0007] Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) , also known as colony stimulating factor 2 (CSF2) , is a monomeric glycoprotein secreted by epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, stromal cells and hematopoietic cells, while the high-affinity receptor for GM-CSF, a heterodimeric complex comprising a GM-CSF-specific α chain and a signal-transducing β subunit, is mostly expressed by dendritic cells (DCs) , monocytes and macrophages, and may activate the JAK-STAT pathway, SRC family kinases, and the PI3K and MAPK pathways.

[0008] GM-CSF signaling has been reported to promote DC differentiation from monocytes or matopoietic progenitors, and shift macrophage phenotype from M2 to M1 (Caux, C. et al., (1996) J. Exp. Med. 184: 695–706; Parronchi, P. et al., (1997) Am. J. Pathol. 150: 823–832) . In inflammatory conditions, GM-CSF is produced by several cell types and acts on monocyte-derived cells (MCs) to trigger cytokine release, which may lead to tissue damage and functional deficit. On the other hand, GM-CSF can induce long-lasting immune responses against e.g., cancer (Burkhard Becher et al., (2016) Immunity, 45 (5) : 963-973) . GM-CSF may gather and activate MCs and DCs in tumor microenvironment, which may phagocytose, process and present tumor associated antigens. The reprogramming of pro-tumor M2 macrophages to pro-inflammatory M1 type is key to boost the anti-tumor effects by macrophages. Studies also showed that GM-CSF is able to increase leukocyte levels in chemotherapy-treated patients with leukopenia (Gianni, A.M. et al., (1990) . J. Clin. Oncol. 8: 768–778) .

[0009] No recombinant fusion proteins containing Siglec15 binding moieties and GM-CSF molecules have been reported to date.

[0010] Citation or identification of any document in this application is not an admission that such document is available as prior art to the present invention.SUMMARY OF THE INVENTION

[0011] The inventors of the disclosure have designed and prepared recombinant fusion proteins that a) bind Siglec15 (e.g., human Siglec15) , b) bind GM-CSFR, c) inhibit binding / interaction between Siglec15 and its receptor such as LRRC4C, d) reverse Siglec15-mediated immune suppression, e) increase IFN-γ secretion by immune cells, f) shift macrophage phenotype from M2 to M1, g) enhanced tumor cell phagocytosis by e.g., macrophages, h) promote leukocyte proliferation, and / or i) provide in vivo anti-tumor effects, at comparable, if not higher, activity as compared to their monospecific counterparts (i.e., the Siglec15 binding molecule, and the GM-CSF molecule) .

[0012] The recombinant fusion proteins of the disclosure may be used for in vitro and in vivo assays and treatment of diseases associated with Siglec15 and / or GM-CSF signaling such as tumors.

[0013] In a first aspect, the disclosure provides a recombinant fusion protein that binds Siglect15 and GM-CSFR, which may comprise an anti-Siglec15 antibody or an antigen binding portion thereof, and a GM-CSF molecule.

[0014] The anti-Siglec15 antibody or the antigen-binding portion thereof may comprise a heavy chain and a light chain. The heavy chain may comprise a heavy chain variable region, and optionally a heavy chain constant region linked to the C-terminus of the heavy chain variable region. The light chain may comprise a light chain variable region and optionally a light chain constant region linked to the C-terminus of the light chain variable region.

[0015] The anti-Siglec15 antibody or the antigen-binding portion thereof may comprise, or consist of, two heavy chains and two light chains. In certain embodiments, the anti-Siglec15 antibody or the antigen-binding portion thereof may comprise, or consist of, two identical heavy chains and two identical light chains. The anti-Siglect15 antibody or the antigen-binding portion thereof may be a full-length antibody, a Fab fragment, a F (ab') 2 fragment, a Fd fragment, or a Fv fragment. The anti-Siglec15 antibody or the antigen-binding portion thereof may be an antagonistic one.

[0016] The heavy chain variable region may comprise a VH CDR1, a VH CDR2 and a VH CDR3 that may comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively. The heavy chain variable region may comprise an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 7.

[0017] The light chain variable region may comprise a VL CDR1, a VL CDR2 and a VL CDR3 that may comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively. The light chain variable region may comprise an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 8.

[0018] The heavy chain constant region may be an IgG1, IgG2, or IgG4 heavy chain constant region, or a functional fragment thereof, such as an Fc fragment. The heavy chain constant region may be naturally occurring or engineered to have certain desired characteristics, such as decreased FcR binding capability. In certain embodiments, the heavy chain constant region may be human IgG1, IgG2 or IgG4, especially IgG4, heavy chain constant region or a functional fragment thereof, having e.g., the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 18 or 23 (X1=M, X2=S, X3=T; X1=Y, X2=T, X3=E) .

[0019] The light chain constant region may be a kappa or lambda light chain constant region, such as human kappa or lambda light chain constant region. In certain embodiments, the light chain constant region may comprise e.g., the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.

[0020] The heavy chain of the anti-Siglec15 antibody or antigen-binding portion thereof, comprising a heavy chain variable region and a heavy chain constant region, may comprise an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 22.

[0021] The light chain of the anti-Siglec15 antibody or antigen-binding portion thereof, comprising a light chain variable region and a light chain constant region, may comprise an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 14.

[0022] The GM-CSF molecule may be a wild-typed one or a variant. In certain embodiments, the GM-CSF molecule may be a wild-type GM-CSF, having e.g., the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (X1=S, X2=S, X3=T, X4=N, X5=N) . In certain embodiments, the GM-CSF molecule may be a GM-CSF variant, having e.g., the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (X1=A, X2=A, X3=G, X4=N, X5=N; X1=A, X2=A, X3=G, X4=Q, X5=A) .

[0023] The GM-CSF molecule may be linked to the C-terminus of the anti-Siglec15 antibody or antigen-binding portion thereof. In certain embodiments, the GM-CSF molecule may be linked to the C-terminus of the heavy chain of the anti-Siglec15 antibody or antigen-binding portion thereof.

[0024] The GM-CSF molecule may be linked to the anti-Siglec15 antibody or antigen-binding portion thereof with or without a linker. The linker may be a short peptide chain of 5 to 20 amino acid residues. In certain embodiments, the linker may be a GS linker.

[0025] The recombinant fusion protein of the disclosure, in certain embodiments, may comprise: i) an anti-Siglect15 heavy chain variable region-heavy chain constant region-GM-CSF  polypeptide chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 11, 12 or 13, and ii) an anti-Siglec15 light chain variable region-light chain constant region polypeptide  chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.

[0026] The recombinant fusion protein of the disclosure, in certain embodiments, may comprise: i) an anti-Siglect15 heavy chain variable region-heavy chain constant region-GM-CSF  polypeptide chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 11, 12 or 13, and ii) an anti-Siglec15 light chain variable region.

[0027] The recombinant fusion protein of the disclosure may comprise: i) a first polypeptide chain and a second polypeptide chain each comprising the anti- Siglec15 heavy chain variable region, the heavy chain constant region, and the GM-CSF molecule, and ii) a third polypeptide chain and a fourth polypeptide chain each comprising the anti- Siglec15 light chain variable region and optionally the light chain constant region, wherein the heavy chain variable region in the first polypeptide chain and the light chain  variable region in the third polypeptide chain associate to form an Siglec15 binding domain, wherein the heavy chain variable region in the second polypeptide chain and the light  chain variable region in the fourth polypeptide chain associate to form an Siglect15 binding domain, wherein the heavy chain constant region in the first polypeptide chain and the heavy  chain constant region in the second polypeptide chain are associated together via e.g., the disulfide bond (s) .

[0028] In certain embodiments, the recombinant fusion protein may comprise: i) a first polypeptide chain and a second polypeptide chain each, from the N terminus  to the C terminus, comprising the anti-Siglec15 heavy chain variable region, the heavy chain constant region, and the GM-CSF molecule, and ii) a third polypeptide chain and a fourth polypeptide chain each, from the N terminus  to the C terminus, comprising the anti-Siglec15 light chain variable region and optionally the light chain constant region;

[0029] In certain embodiments, the recombinant fusion protein of the disclosure comprises: i) a first polypeptide chain and a second polypeptide chain each comprising the amino  acid sequence of SEQ ID NO: 11, 12 or 13, and ii) a third polypeptide chain and a fourth polypeptide chain each comprising the amino  acid sequence of SEQ ID NO: 14.

[0030] The present application also provides a nucleic acid molecule encoding the recombinant fusion protein of the disclosure, as well as an expression vector that may comprise such a nucleic acid, and a host cell transformed or transfected with such an expression vector or with such a nucleic acid. A method for preparing the recombinant fusion protein of the disclosure using the host cell is also provided, that may comprise steps of (i) expressing the recombinant fusion protein in the host cell and (ii) isolating the recombinant fusion protein from the host cell or its cell culture.

[0031] The present application also provides a pharmaceutical composition that may comprise the recombinant fusion protein, the nucleic acid molecule, the expression vector, or the host cell of the disclosure, and a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition may further comprise an additional agent, such as an anti-tumor agent.

[0032] In a second aspect, the present application provides a method for treating a disease associated with Siglec15 and / or GM-CSF signaling in a subject in need thereof, which may comprise administering to the subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of the disclosure.

[0033] The disease may be a cancer. The cancer may be a solid cancer, including, but not limited to, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, melanoma, colorectal cancer, breast cancer, endometrial cancer, and squamous cell carcinoma. In certain embodiments, the pharmaceutical composition of the disclosure may be used in combination with chemotherapy and checkpoint blockade therapy, such as an anti-PD-L1 antibody, and / or an anti-PD-1 antibody.

[0034] The disease may be a cardiovascular disease. The cardiovascular disease may be atherosclerosis, stroke, hypertensive heart disease, rheumatic heart disease, cardiomyopathy, heart arrhythmia, congenital heart disease, valvular heart disease, carditis, aortic aneurysms, p eripheral artery disease, or venous thrombosis.

[0035] In certain embodiments, the subject is human.

[0036] In a third aspect, the present application provides a method for increasing leukocyte levels in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure.

[0037] In certain embodiments, the subject is human.

[0038] The present application also provides a method for enhancing immune response, or reversing or reducing an immune-suppression in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure.

[0039] In certain embodiments, the subject is human.

[0040] The present application also provides a method for enhancing phagocytosis in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure.

[0041] In certain embodiments, the subject is human.

[0042] Also provided is the use of the pharmaceutical composition of the disclosure in treating a disease associated with Siglec15 and / or GM-CSF signaling, in elevating leukocyte levels, in enhancing an immune response, in reversing or reducing an immune-suppression, and / or enhancing phagocytosis; or in preparation of a medicament for treating a disease associated with Siglec15 and / or GM-CSF signaling, in elevating leukocyte levels, in enhancing an immune response, in reversing or reducing an immune-suppression, and / or enhancing phagocytosis.

[0043] In a fourth aspect, the present application provides a kit that may comprise the recombinant fusion protein, the pharmaceutical composition, the nucleic acid molecule, the expression vector, or the host cell of the disclosure. The term “kit” means two or more components -one of which corresponding to the recombinant fusion protein, the pharmaceutical composition, the nucleic acid molecule, the expression vector or the host cell of the disclosure -packaged together in a container, recipient or otherwise. A kit can hence be described as a set of products and / or utensils that are sufficient to achieve a certain goal, which can be marketed as a single unit.

[0044] The kit may comprise one or more recipients (such as vials, ampoules, containers, syringes, bottles, bags) of any appropriate shape, size and material (preferably waterproof, e.g. plastic or glass) containing the recombinant fusion protein or the pharmaceutical composition of the disclosure. The kit may additionally contain directions for use (e.g., in the form of a leaflet or instruction manual) .

[0045] Other features and advantages of the instant disclosure will be apparent from the following detailed description and examples, which should not be construed as limiting. The contents of all references, Genbank entries, patents and published patent applications cited throughout this application are expressly incorporated herein by reference.

[0046] Accordingly, it is an object of the invention not to encompass within the invention any previously known product, process of making the product, or method of using the product such that Applicants reserve the right and hereby disclose a disclaimer of any previously known product, process, or method. It is further noted that the invention does not intend to encompass within the scope of the invention any product, process, or making of the product or method of using the product, which does not meet the written description and enablement requirements of the USPTO (35 U.S.C. §112, first paragraph) or the EPO (Article 83 of the EPC) , such that Applicants reserve the right and hereby disclose a disclaimer of any previously described product, process of making the product, or method of using the product. It may be advantageous in the practice of the invention to be in compliance with Art. 53 (c) EPC and Rule 28 (b) and (c) EPC. All rights to explicitly disclaim any embodiments that are the subject of any granted patent (s) of applicant in the lineage of this application or in any other lineage or in any prior filed application of any third party is explicitly reserved. Nothing herein is to be construed as a promise.

[0047] It is noted that in this disclosure and particularly in the claims and / or paragraphs, terms such as "comprises" , "comprised" , "comprising" and the like can have the meaning attributed to it in U.S. Patent law; e.g., they can mean "includes" , "included" , "including" , and the like; and that terms such as "consisting essentially of" and "consists essentially of" have the meaning ascribed to them in U.S. Patent law, e.g., they allow for elements not explicitly recited, but exclude elements that are found in the prior art or that affect a basic or novel characteristic of the invention.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0048] The following detailed description, given by way of example, but not intended to limit the invention solely to the specific embodiments as described, may best be understood in conjunction with the accompanying drawings.

[0049] FIG. 1 is the schematic of recombinant fusion proteins of the disclosure.

[0050] FIG. 2 shows the binding capability of the recombinant fusion proteins to human Siglec15 in a capture ELISA.

[0051] FIG. 3 shows the binding capability of the recombinant fusion proteins to HEK-293T-OKT3-S15 cells expressing human Siglec15 in a cell based binding FACS assay.

[0052] FIG. 4 shows the ability of the recombinant fusion proteins to block human Siglec15-LRRC4C binding in a competitive ELISA.

[0053] FIG. 5A shows the ability of the recombinant fusion proteins of the disclosure to reverse siglec15-mediated inhibition on CD4+ T cell proliferation.

[0054] FIG. 5B shows the ability of the recombinant fusion proteins of the disclosure to reverse siglec15-mediated inhibition on CD8+ T cells proliferation.

[0055] FIG. 5C shows the ability of the recombinant fusion proteins of the disclosure to block Siglec15-mediated inhibition on IFNγ release by PBMCs.

[0056] FIG. 6A shows the ability of the recombinant fusion proteins of the disclosure to promote TF1 cell proliferation.

[0057] FIG. 6B shows the ability of the recombinant fusion proteins of the disclosure to promote TF1 cell proliferation.

[0058] FIGs. 7A shows the percentage of macrophages in M1 type treated by the recombinant fusion proteins of the disclosure.

[0059] FIGs. 7B shows the percentage of macrophages in M2 type treated by the recombinant fusion proteins of the disclosure.

[0060] FIG. 8 shows the tumor sizes in C57BL / 6-hSiglec15 mice treated by the recombinant fusion proteins of the disclosure.

[0061] FIG. 9 shows the tumor weights in C57BL / 6-hSiglec15 mice treated by the recombinant fusion proteins of the disclosure.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0062] To ensure that the present disclosure may be more readily understood, certain terms are first defined. Additional definitions are set forth throughout the detailed description.

[0063] The term “Siglec15” comprises variants, isoforms, homologs, orthologs and paralogs. For example, an antibody specific for a human Siglec15 protein may, in certain cases, cross-react with a Siglec15 protein from a species other than human, such as monkey. In other embodiments, an antibody specific for a human Siglec15 protein may be completely specific for the human Siglec15 protein and exhibit no cross-reactivity to other species or of other types, or may cross-react with Siglec15 from certain other species but not all other species.

[0064] The term “GM-CSF” refers to granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, comprising variants, isoforms, homologs, orthologs and paralogs. The GM-CSF variants used in the recombinant fusion proteins of the disclosure, compared to the wild-typed one, have the glycosylation site (s) removed, to e.g., improve product stability / developability.

[0065] The term “immune response” refers to the action of, for example, lymphocytes, antigen presenting cells, phagocytic cells, granulocytes, and soluble macromolecules produced by the above cells or the liver (including antibodies, cytokines, and complement) that results in selective damage to, destruction of, or elimination from the human body of invading pathogens, cells or tissues infected with pathogens, cancerous cells, or, in cases of autoimmunity or pathological inflammation, normal human cells or tissues.

[0066] The term “immune suppression” or “immunosuppression” refers to the reduction of the immune system’s activation or efficacy, caused by e.g., age, persisting disease, malnutrition, cancers, chemotherapy or radiotherapy, or the like. The immune suppression can be reversed in certain circumstances by e.g., manipulating some pathways.

[0067] The term “phagocytosis” refers to the engulfing and ingestion of bacteria or other foreign bodies by phagocytes.

[0068] The term “antibody” as used herein refers to an immunoglobulin molecule that recognizes and specifically binds a target, such as Siglec15, through at least one antigen-binding site wherein the antigen-binding site is usually within the variable region of the immunoglobulin molecule. As used herein, the term encompasses intact polyclonal antibodies, intact monoclonal antibodies, single-chain Fv (scFv) antibodies, heavy chain antibodies (HCAbs) , light chain antibodies (LCAbs) , multi-specific antibodies, bi-specific antibodies, monospecific antibodies, monovalent antibodies, fusion proteins comprising an antigen-binding site of an antibody, and any other modified immunoglobulin molecules comprising an antigen-binding site (e.g., dual variable domain immunoglobulin molecules) as long as the antibodies exhibit the desired biological activity. Antibodies also include, but are not limited to, mouse antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies. An antibody can be any of the five major classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, or subclasses (isotypes) thereof (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) , based on the identity of their heavy-chain constant domains referred to as alpha, delta, epsilon, gamma, and mu, respectively. The different classes of immunoglobulins have different and well-known subunit structures and three-dimensional configurations. Antibodies can be naked or conjugated to other molecules, including but not limited to, toxins and radioisotopes. Unless expressly indicated otherwise, the term “antibody” as used herein includes the “antigen-binding portion” of the intact antibodies. A conventional IgG is a glycoprotein which may comprise two identical heavy (H) chains and two identical light (L) chains inter-connected by disulfide bonds. Each heavy chain may be comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region CH. The heavy chain constant region may be comprised of three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain may be comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region CL. The light chain constant region may be comprised of one domain, CL. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDR) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR) . Each VH and V L is composed of three CDRs and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen. The constant regions of the antibodies can mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (C1q) of the classical complement system. The “functional fragment” of the heavy chain constant region refers to a part of the constant region that maintains the desired characteristics, such as the binding affinity to Fc receptors and / or the complement system proteins.

[0069] The term “antigen-binding portion” of an antibody (or simply “antibody portion” ) , as used herein, refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen (e.g., a Siglec15 protein) . It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and C H1 domains; (ii) a F (ab') 2 fragment, a bivalent fragment which may comprise two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iv) a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546) , which consists of a VH domain; (vi) an isolated complementarity determining region (CDR) ; and (viii) a nanobody, a heavy chain variable region containing a single variable domain and two constant domains. Furthermore, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are coded by separate genes, they can be joined, using recombinant methods, by a synthetic linker that enables them to be made as a single protein chain in which the VL and VH regions pair to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv) ; see e.g., Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883) . Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody. These antibody fragments are obtained using conventional techniques known to those with skill in the art, and the fragments are screened for utility in the same manner as are intact antibodies.

[0070] The “antagonistic” anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof or “antagonistic activity” on Siglec15 signaling means the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof can bind Siglec15, block interaction between Siglec15 and its receptors such as LRRC4C, and inhibit Siglec15 signaling, resulting in e.g., Siglec15-mediated immune suppression.

[0071] As used herein, a recombinant fusion protein that “specifically binds to Siglec15 (such as human Siglec15) ” is intended to refer to a fusion protein that binds to the Siglec15 protein (human Siglec15 and possibly a Siglec15 protein from one or more non-human species) but does not substantially bind to non-Siglec15 proteins. Similarly, a fusion protein that “specifically binds to GM-CSFR (such as human GM-CSFR) ” refers to a fusion protein that binds to the GM-CSFR protein from human or another non-human species but does not binds to non-GM-CSFR proteins. Preferably, the fusion protein binds to Siglec15 or GM-CSFR with “high affinity” , namely with a KD of 5.0 x10-8 M or less.

[0072] The term “does not bind” or “does not substantially bind” to a protein or cells, as used herein, means does not bind or does not bind with a high affinity to the protein or cells, i.e. binds to the protein or cells with a KD of 1.0 x 10-6 M or more, more preferably 1.0 x 10-5 M or more, more preferably 1.0 x 10-4 M or more, more preferably 1.0 x 10-3 M or more, even more preferably 1.0 x 10-2 M or more.

[0073] The term “high affinity” refers to a KD of 1.0 x 10-6 M or less, more preferably 5.0 x 10-8 M or less for a target antigen.

[0074] The term “Kassoc” or “Ka” , as used herein, is intended to refer to the association rate of a particular protein-protein interaction, such as an antibody-antigen interaction, whereas the term “Kdis” or “Kd” , as used herein, is intended to refer to the dissociation rate of a particular protein-protein interaction. The term “KD” , as used herein, is intended to refer to the dissociation constant, which is obtained from the ratio of Kd to Ka (i.e., Kd / Ka) and is expressed as a molar concentration (M) . KD values can be determined using methods well established in the art. A preferred method for determining the KD is by using surface plasmon resonance, preferably using a biosensor system such as a BiacoreTM system.

[0075] The term “EC50” , also known as half maximal effective concentration, refers to the concentration of a recombinant fusion protein of the disclosure which induces a response halfway between the baseline and maximum after a specified exposure time.

[0076] The term “IC50” , also known as half maximal inhibitory concentration, refers to the concentration of a recombinant fusion protein of the disclosure which inhibits a specific biological or biochemical function by 50%relative to the absence of such a recombinant fusion protein.

[0077] The term “subject” includes any human or nonhuman animal. The term “nonhuman animal” includes all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as non-human primates, sheep, dogs, cats, cows, horses, chickens, amphibians, and reptiles, although mammals are preferred, such as non-human primates, sheep, dogs, cats, cows and horses.

[0078] The term “therapeutically effective amount” means an amount of the recombinant fusion protein of the present disclosure sufficient to prevent or ameliorate the symptoms associated with a disease or condition (such as a cancer) and / or lessen the severity of the disease or condition. A therapeutically effective amount is understood to be in context to the condition being treated, where the actual effective amount is readily discerned by those of skill in the art.

[0079] The percent “identity” as used herein in the context of two or more nucleic acids or polypeptides, refers to two or more sequences or subsequences that are the same or have a specified percentage of nucleotides or amino acid residues that are the same, when compared and aligned (introducing gaps, if necessary) for maximum correspondence, considering or not considering conservative amino acid substitutions as part of the sequence identity. The percent identity can be measured using sequence comparison software or algorithms or by visual inspection. Various algorithms and software that can be used to obtain alignments of amino acid or nucleotide sequences are well-known in the art. These include, but are not limited to, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package, and variants thereof. In some embodiments, two nucleic acids or polypeptides of the disclosure are substantially identical, meaning they have at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, and in some embodiments at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%nucleotide or amino acid residue identity, when compared and aligned for maximum correspondence, as measured using a sequence comparison algorithm or by visual inspection.

[0080] Various aspects of the disclosure are described below in further detail.

[0081] It must be noted that as used herein, the singular forms “a” , “an” , and “the” , include plural references unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, reference to “amolecule” includes one or more of such molecules and reference to “the method” includes reference to equivalent steps and methods known to those of ordinary skill in the art that could be modified or substituted for the methods described herein.

[0082] The recombinant fusion protein of the disclosure may comprise: (a) an anti-Siglec15 antibody or an antibody binding portion thereof, and (b) a GM-CSF molecule. The GM-CSF molecule may be linked, optionally via a linker, to the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof.

[0083] The recombinant fusion protein of the disclosure is with low aggregation. Further, it a) binds Siglec15 (e.g., human Siglec15) , b) binds GM-CSFR, c) inhibits binding / interaction between Siglec15 and its receptor such as LRRC4C, d) reverses Siglec15-mediated immune suppression, e) increases IFN-γ secretion by immune cells, f) shifts macrophage phenotype from M2 to M1, g) promotes leukocyte proliferation, and / or h) provides in vivo anti-tumor effects, at comparable, if not higher, activity as compared to their monospecific counterparts (i.e., the Siglec15 binding molecule, and the GM-CSF molecule) .

[0084] The components in the recombinant fusion protein of the present application are the GM-CSF molecule, the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof, and an optional linker. A person of ordinary skills in the art will recognize that there are many design choices for selecting the above components. The GM-CSF molecule may be linked to e.g., the C-terminus of the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof. Preferably, human-derived sequence is used in human cancer therapies, as the strong immunogenicity of the proteins or peptides from non-human animals may lead to allergy and other adverse effects. For example, a humanized anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof is used in the recombinant fusion protein of the disclosure. However, other animal proteins or peptides, humanized if appropriate, may also be used in the present application based on different application purposes.

[0085] The GM-CSF molecule may be a wild-typed one or a variant, especially an affinity optimized variant. A “variant” of the GM-CSF molecule is defined as a GM-CSF amino acid sequence that is altered by one or more amino acids as compared to wild-type GM-CSF. The variant may have “conservative” changes, wherein a substituted amino acid has similar structural or chemical properties, e.g., replacement of leucine with isoleucine. More rarely, a variant can have “non-conservative” changes, e.g., replacement of a glycine with a tryptophan. Similar minor variations can also include amino acid deletions or insertions, or both. In one embodiment, GM-CSF variants include polypeptides that have at least about 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity with wild-type GM-CSF.

[0086] In certain embodiments, the GM-CSF molecule may be a wild-type one comprising an amino acid sequence having at least 95%sequence identity to SEQ ID NO: 9 (X1=S, X2=S, X3=T, X4=N, X5=N) . In certain embodiments, the GM-CSF molecule may be a variant comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (X1=A, X2=A, X3=G, X4=N, X5=N; or X1=A, X2=A, X3=G, X4=Q, X5=A) .

[0087] Linkers serve primarily as a spacer between the GM-CSF molecule and the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof. The linker may be made up of amino acids linked together by peptide bonds, preferably from 5 to 30 amino acids, from 10 to 30 amino acids, from 10 to 20 amino acids, or 15 amino acids, linked by peptide bonds, wherein the amino acids are selected from the 20 naturally occurring amino acids. One or more of these amino acids may be glycosylated, as is understood by those of skill in the art. In one embodiment, the 5 to 30 amino acids may be selected from glycine, alanine, proline, asparagine, glutamine, serine and lysine. In one embodiment, a linker is made up of a majority of amino acids that are sterically unhindered, such as glycine and alanine. Exemplary linkers are polyglycines (particularly (Glys, poly (Gly-Ala) , and polyalanine, such as GS linkers. Linkers may also be non-peptide linkers. For example, alkyl linkers such as -NH-, - (CH2) s-C (O) -, wherein s=2-20 can be used. These alkyl linkers may further be substituted by any non-sterically hindering group such as lower alkyl (e.g., C1-4) lower acyl, halogen (e.g., CI, Br) , CN, NH2, phenyl, etc.

[0088] The anti-Siglec15 antibody may be an isolated monoclonal antibody, such as the one disclosed in WO2021 / 190622. The anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure may be humanized.

[0089] The anti-Siglec15 antibody or the antigen-binding portion thereof of the disclosure may comprise a heavy chain variable region and a light chain variable region. In certain embodiments, the anti-Siglec15 antibody or the antigen-binding portion thereof may comprise two identical heavy chain variable regions and two identical light chain variable regions. In certain embodiments, the antibody or antigen binding portion thereof comprises a heavy chain constant region, linked to the C-terminus of the heavy chain variable region. In certain embodiments, the antibody or antigen binding portion thereof comprises a light chain constant region linked to the C-terminus of the light chain variable region.

[0090] The anti-Siglec15 antibody or the antigen-binding portion thereof of the disclosure may comprise a heavy chain and a light chain. In certain embodiments, the anti-Siglec15 antibody or the antigen-binding portion thereof of the disclosure comprises two identical heavy chains and two identical light chains. The heavy chain may comprise a heavy chain variable region and a heavy chain constant region. The light chain may comprise a light chain variable region and an optional light chain constant region.

[0091] The heavy chain variable region of the disclosure may comprise a VH CDR1, a VH CDR2 and a VH CDR3 that may comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively. The heavy chain variable region may comprise an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 7.

[0092] The heavy chain constant region may be human IgG1, IgG2 or IgG4 heavy chain constant region, optionally engineered to have altered Fc receptor binding affinity, such as reduced FcR binding affinity. The heavy chain constant region may comprise an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%sequence identity to SEQ ID NOs: 18 or 23 (X1=M, X2=S, X3=T; X1=Y, X2=T, X3=E) . In certain embodiments, the heavy chain constant region may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 18 or 23 (X1=M, X2=S, X3=T; X1=Y, X2=T, X3=E) .

[0093] The light chain variable region may comprise a VL CDR1, a VL CDR2 and a VL CDR3 that may comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively. The light chain variable region may comprise an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 8. The light chain constant region may be human kappa or lambda light chain constant region. The light chain constant region may comprise an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In certain embodiments, the light chain constant region may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.

[0094] The heavy chain variable region may comprise a VH CDR1, a VH CDR2 and a VH CDR3 that may comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively, and the light chain variable region may a VL CDR1, a VL CDR2 and a VL CDR3 that may comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively. The heavy chain variable region may comprise an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 7, and the light chain variable region may comprise an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 8. In certain embodiments, the heavy chain variable region may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and the light chain variable region may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. The heavy chain constant region may comprise an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%sequence identity to SEQ ID NOs: 18 or 23 (X1=M, X2=S, X3=T; X1=Y, X2=T, X3=E) , and the light chain constant region may comprise an amino acid sequence having at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%sequence identity to SEQ ID NO: 24. In certain embodiments, the heavy chain constant region may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 18 or 23 (X1=M, X2=S, X3=T; X1=Y, X2=T, X3=E) , and the light chain constant region may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.

[0095] The recombinant fusion protein of the disclosure may comprise: i) a first polypeptide chain and a second polypeptide chain each comprising the anti- Siglec15 heavy chain variable region, the heavy chain constant region, and the GM-CSF molecule, and ii) a third polypeptide chain and a fourth polypeptide chain each comprising the anti- Siglec15 light chain variable region and optionally the light chain constant region, wherein the heavy chain variable region in the first polypeptide chain and the light chain  variable region in the third polypeptide chain associate to form an Siglec15 binding domain, wherein the heavy chain variable region in the second polypeptide chain and the light  chain variable region in the fourth polypeptide chain associate to form an Siglect15 binding domain, wherein the heavy chain constant region in the first polypeptide chain and the heavy  chain constant region in the second polypeptide chain are associated together via e.g., the disulfide bond (s) .

[0096] In certain embodiments, the recombinant fusion protein may comprise: i) a first polypeptide chain and a second polypeptide chain each, from the N terminus  to the C terminus, comprising the anti-Siglec15 heavy chain variable region, the heavy chain constant region, and the GM-CSF molecule, and ii) a third polypeptide chain and a fourth polypeptide chain each, from the N terminus  to the C terminus, comprising the anti-Siglec15 light chain variable region and optionally the light chain constant region;

[0097] In certain embodiments, the recombinant fusion protein of the disclosure comprises: i) a first polypeptide chain and a second polypeptide chain each comprising the amino  acid sequence of SEQ ID NO: 11, 12 or 13, and ii) a third polypeptide chain and a fourth polypeptide chain each comprising the amino  acid sequence of SEQ ID NO: 14.

[0098] The recombinant fusion protein of the disclosure may be engineered by modifying one or more residues within one or both variable regions (i.e., VH and / or VL) , for example within one or more CDR regions and / or within one or more framework regions of the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof. Additionally or alternatively, the recombinant fusion protein can be engineered by modifying the residues within the constant region (s) , for example to alter the effector function (s) of the recombinant fusion protein. Additionally, the recombinant fusion protein may be modified at residues at the GM-CSF molecule, to alter the binding affinity to GM-CSFR.

[0099] In certain embodiments, CDR grafting can be used to engineer variable regions of the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof. Antibodies interact with target antigens predominantly through amino acid residues that are located in the six heavy and light chain complementarity determining regions (CDRs) . For this reason, the amino acid sequences within CDRs are more diverse between individual antibodies than sequences outside of CDRs. Because CDR sequences are responsible for most antibody-antigen interactions, it is possible to express recombinant antibodies that mimic the properties of the parent antibodies by constructing expression vectors that include CDR sequences from the parent antibody grafted onto framework sequences from a different antibody with different properties (see, e.g., Riechmann et al., (1998) Nature 332: 323-327; Jones et al., (1986) Nature 321: 522-525; Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. See also U.S.A. 86: 10029-10033; U.S. Pat. Nos. 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 and 6,180,370) .

[0100] Accordingly, another embodiment of the disclosure pertains to a recombinant fusion protein, which may comprise an anti-Siglec15 heavy chain variable region that may comprise VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 sequences which may comprise the sequences of the present disclosure, as described above, and / or an anti-Siglec15 light chain variable region which may comprise the VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 sequences which may comprise the sequences of the present disclosure, as described above. While these fusion proteins contain the VH and VL CDR sequences of the anti-Siglec15 antibody of the present disclosure, they can contain different framework sequences.

[0101] Such framework sequences can be obtained from public DNA databases or published references that include germline antibody gene sequences. For example, germline DNA sequences for human heavy and light chain variable region genes can be found in the “VBase” human germline sequence database. As another example, the germline DNA sequences for human heavy and light chain variable region genes can be found in the Genbank database.

[0102] Antibody protein sequences are compared against a compiled protein sequence database using one of the sequence similarity searching methods called the Gapped BLAST (Altschul et al., (1997) , supra) , which is well known to those skilled in the art.

[0103] Preferred framework sequences for use in the anti-Siglec15 antibodies of the disclosure are those that are structurally similar to the framework sequences used by the antibodies of the disclosure. The VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3 sequences can be grafted onto framework regions that have the identical sequence as that found in the germline immunoglobulin gene from which the framework sequence derives, or the CDR sequences can be grafted onto framework regions that contain one or more mutations as compared to the germline sequences. For example, it has been found that in certain instances it is beneficial to mutate residues within the framework regions to maintain or enhance the antigen binding ability of the antibody (see e.g., U.S. Pat. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 and 6,180,370) .

[0104] In addition, or as an alternative to modifications made within the framework or CDR regions, the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof in the recombinant fusion protein of the disclosure can be engineered to include modifications within the Fc region, typically to alter one or more functional properties of the recombinant fusion protein, such as serum half-life, complement fixation, Fc receptor binding, and / or antigen-dependent cellular cytotoxicity. Furthermore, a recombinant fusion protein of the disclosure can be chemically modified (e.g., one or more chemical moieties can be attached to the fusion protein) or be modified to alter its glycosylation, again to alter one or more functional properties.

[0105] In one embodiment, the hinge region of CH1 is modified in such that the number of cysteine residues in the hinge region is altered, e.g., increased or decreased. This approach is described further in U.S. Pat. No. 5,677,425. The number of cysteine residues in the hinge region of CH1 is altered to, for example, facilitate assembly of the light and heavy chains or to increase or decrease the stability of the antibody.

[0106] In another embodiment, the Fc hinge region in the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof of the disclosure is mutated to alter the biological half-life of the recombinant fusion protein. Specifically, in another embodiment, one or more amino acid mutations are introduced into the CH2-CH3 domain interface region of the Fc-hinge fragment such that the fusion protein has impaired Staphylococcyl protein A (SpA) binding relative to native Fc-hinge domain SpA binding. This approach is described in further detail in U.S. Pat. No. 6,165,745.

[0107] Alteration of amino acids near the junction of the Fc portion and the non-Fc portion can significantly increase the serum half-life of the Fc fusion protein. Thus, the junction region of the fusion protein of the disclosure may comprise changes relative to the sequences of naturally occurring immunoglobulin heavy chains, preferably within about 10 amino acids of the junction. These amino acid changes can result in increased hydrophobicity. In one embodiment, the constant region is derived from an IgG sequence in which the C-terminal lysine residue is replaced. Preferably, the C-terminal lysine of the IgG sequence is replaced with a non-lysine amino acid (e.g., alanine or leucine) to further increase serum half-life.

[0108] In still another embodiment, the glycosylation of the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof in recombinant fusion protein is modified. Glycosylation can be altered to, for example, increase the affinity of the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof for the antigen. Such carbohydrate modifications can be accomplished by, for example, altering one or more sites of glycosylation within the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion sequence. For example, one or more amino acid substitutions can be made that result in elimination of one or more variable region framework glycosylation sites to thereby eliminate glycosylation at that site. Such aglycosylation may increase the affinity of the antibody for antigen. See, e.g., U.S. Pat. Nos. 5,714,350 and 6,350,861.

[0109] Another modification of the anti-Siglec15 antibody or antigen binding portion thereof in recombinant fusion protein herein that is contemplated by this disclosure is pegylation. An antibody can be pegylated to, for example, increase the biological (e.g., serum) half-life of the antibody. As used herein, the term “polyethylene glycol” is intended to encompass any of the forms of PEG that have been used to derivatize other proteins, such as mono (C1-C10) alkoxy-or aryloxy-polyethylene glycol or polyethylene glycol-maleimide. Methods for pegylating proteins are known in the art and can be applied to the antibodies of the disclosure. See, e.g., EP 0 154 316 and EP 0 401 384.

[0110] The GM-CSF molecule in the recombinant fusion protein of the disclosure may be modified to possess higher GM-CSFR binding affinity. In some embodiments, a GM-CSF variant includes one or more mutations in the GM-CSF molecule as compared to wild-type GM-CSF. To determine the affinity of a GM-CSF variant for GM-CSFR binding, surface plasmon resonance (SPR) may be used. In an alternative method to determine the avidity of a GM-CSF variant for GM-CSFR binding, a cell binding assay may be used. When mutations are introduced into GM-CSF or the recombinant fusion protein of the disclosure, the resulting variant or fusion protein generally has enough GM-CSF biological activity to be useful as a therapeutic protein. In some embodiments, the biological activity of the GM-CSF variant is at least 0.01 fold, 0.03 fold, 0.06 fold, 0.1 fold, 0.3 fold, 0.6 fold, 1 fold, 3 fold, 5, fold, 6 fold, 10 fold, 20 fold, 30 fold, 40 fold, 50 fold, 60 fold or 100 fold of the biological activity of wild type GM-CSF or a fusion protein containing wild-type GM-CSF. Biological activity of the GM-CSF variants can be tested in an in vitro or in vivo assay.

[0111] In another aspect, the disclosure provides a nucleic acid molecule that encodes the recombinant fusion protein of the disclosure. In certain embodiments, the disclosure provides nucleic acid molecules encoding an anti-Siglec15 heavy chain variable region-heavy chain constant region-GM-CSF polypeptide chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 11, 12 or 13, and an anti-Siglec15 light chain variable region-light chain constant region polypeptide chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. The nucleic acids can be present in whole cells, in a cell lysate, or in a partially purified or substantially pure form. A nucleic acid is “isolated” or “rendered substantially pure” when purified from other cellular components or other contaminants, e.g., other cellular nucleic acids or proteins, by standard techniques. A nucleic acid of the disclosure can be, e.g., DNA or RNA and may or may not contain intronic sequences. In a preferred embodiment, the nucleic acid is a DNA molecule.

[0112] Nucleic acids of the disclosure can be obtained using standard molecular biology techniques. For example, the nucleic acid molecules of the disclosure may be chemically synthesized.

[0113] The present disclosure also provides an expression vector comprising the nucleic acid molecules of the disclosure. Examples of vectors include but are not limited to plasmids, viral vectors, yeast artificial chromosomes (YACs) , bacterial artificial chromosomes (BACs) , transformation-competent artificial chromosomes (TACs) , mammalian artificial chromosomes (MACs) and human artificial episomal chromosomes (HAECs) . The present disclosure further provides host cells transformed or transfected with the expression vectors or the nucleic acid of the disclosure. Suitable host cells include Escherichia coli, yeasts and other eukaryotes. In one embodiment, DNAs encoding the polypeptide chains forming each recombinant fusion protein of the disclosure are inserted into one or more expression vectors such that the genes are operatively linked to transcriptional and translational regulatory sequences. In this context, the term “operatively linked” is intended to mean that the coding nucleotides are ligated into a vector such that transcriptional and translational control sequences within the vector serve their intended functions of regulating the transcription and translation of the antibody gene (s) .

[0114] The term “regulatory sequence” is intended to include promoters, enhancers and other expression control elements (e.g., polyadenylation signals) that control the transcription or translation of the nucleotides. Such regulatory sequences are described, e.g., in Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) ) . Preferred regulatory sequences for mammalian host cell expression include viral elements that direct high levels of protein expression in mammalian cells, such as promoters and / or enhancers derived from cytomegalovirus (CMV) , Simian Virus 40 (SV40) , adenovirus, e.g., the adenovirus major late promoter (AdMLP) and polyomavirus enhancer. Alternatively, non-viral regulatory sequences can be used, such as the ubiquitin promoter or β-globin promoter. Still further, regulatory elements composed of sequences from different sources, such as the SRα promoter system, which contains sequences from the SV40 early promoter and the long terminal repeat of human T cell leukemia virus type 1 (Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472) . The expression vector and expression control sequences are chosen to be compatible with the expression host cell used.

[0115] In addition to the recombinant fusion protein coding nucleotides and regulatory sequences, the expression vectors of the disclosure can carry additional sequences, such as sequences that regulate replication of the vector in host cells (e.g., origins of replication) and selectable marker genes. The selectable marker gene facilitates selection of host cells into which the vector has been introduced (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 4,399,216; 4,634,665 and 5,179,017) . For example, typically the selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, on a host cell into which the vector has been introduced. Preferred selectable marker genes include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in dhfr-host cells with methotrexate selection / amplification) and the neo gene (for G418 selection) .

[0116] For expression of the peptide chains constituting the recombinant fusion protein, the expression vector (s) encoding the peptide chains is (are) transfected into a host cell by standard techniques. The various forms of the term “transfection” are intended to encompass a wide variety of techniques commonly used for the introduction of exogenous DNA into a prokaryotic or eukaryotic host cell, e.g., electroporation, calcium-phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection and the like. Although it is theoretically possible to express the recombinant fusion proteins of the disclosure in either prokaryotic or eukaryotic host cells, expression in eukaryotic cells, and most preferably mammalian host cells, is the most preferred because such eukaryotic cells, and in particular mammalian cells, are more likely than prokaryotic cells to assemble and secrete a properly folded and immunologically active recombinant fusion protein.

[0117] Preferred mammalian host cells for expressing the recombinant antibodies of the disclosure include Chinese Hamster Ovary (CHO cells) (including dhfr-CHO cells, described in Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, used with a DHFR selectable marker, e.g., as described in R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159: 601-621) , NSO myeloma cells, COS cells and SP2 cells. In particular for use with NSO myeloma cells, another preferred expression system is the GS gene expression system disclosed in WO 87 / 04462, WO 89 / 01036 and EP 338, 841. When recombinant expression vectors are introduced into mammalian host cells, the recombinant fusion proteins are produced by culturing the host cells for a period of time sufficient to allow for expression of the recombinant fusion protein in the host cells or, more preferably, secretion of the recombinant fusion protein into the culture medium in which the host cells are grown. The recombinant fusion proteins can be recovered from the culture medium using standard protein purification methods.

[0118] In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition which may comprise the recombinant fusion protein, the nucleic acid molecule, the expression vector, and / or the host cell of the present disclosure formulated together with a pharmaceutically acceptable carrier. The recombinant fusion protein, the nucleic acid molecule, the expression vector, and / or the host cell can be dosed separately when the pharmaceutical composition contains more than one recombinant fusion protein, nucleic acid molecule, expression vector or host cell. The pharmaceutical composition may optionally contain one or more additional pharmaceutically active ingredients, such as another antibody or a drug, such as an anti-tumor drug.

[0119] The pharmaceutical composition may comprise any number of excipients. Excipients that can be used include carriers, thickening or emulsifying agents, solid binders, dispersion or suspension aids, solubilizers, colorants, flavoring agents, coatings, disintegrating agents, lubricants, sweeteners, preservatives, and combinations thereof. The selection and use of suitable excipients are taught in Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams &Wilkins 2003) , the disclosure of which is incorporated herein by reference.

[0120] Preferably, the pharmaceutical composition is suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, parenteral, spinal or epidermal administration (e.g., by injection or infusion) . Depending on the route of administration, the active ingredient can be coated in a material to protect it from the action of acids and other natural conditions that may inactivate it. The phrase “parenteral administration” as used herein means modes of administration other than enteral and topical administration, usually by injection, and includes, without limitation, intravenous, intramuscular, intra-arterial, intrathecal, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subcutaneous, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subarachnoid, intraspinal, epidural and intrasternal injection and infusion. Alternatively, an antibody of the disclosure can be administered via a non-parenteral route, such as a topical, epidermal or mucosal route of administration, e.g., intranasally, orally, vaginally, rectally, sublingually or topically.

[0121] Pharmaceutical compositions can be in the form of sterile aqueous solutions or dispersions. They can also be formulated in a microemulsion, liposome, or other ordered structure suitable to high drug concentration.

[0122] A “therapeutically effective dosage” of the recombinant fusion protein, nucleic acid molecule, expression vector or host cell of the disclosure preferably results in a decrease in severity of disease symptoms, an increase in frequency and duration of disease symptom-free periods, or a prevention of impairment or disability due to the disease affliction. For example, for the treatment of tumor-bearing subjects, a “therapeutically effective dosage” preferably inhibits tumor growth by at least about 20%, more preferably by at least about 40%, even more preferably by at least about 60%, and still more preferably by at least about 80%relative to untreated subjects. A therapeutically effective amount of a therapeutic recombinant fusion protein, nucleic acid molecule, expression vector or host cell of the disclosure can decrease tumor size, or otherwise ameliorate symptoms in a subject, which is typically a human or can be another mammal.

[0123] The pharmaceutical composition can be a controlled release formulation, including implants, transdermal patches, and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. See, e.g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0124] Therapeutic compositions can be administered via medical devices such as (1) needleless hypodermic injection devices (e.g., U.S. Pat. Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; and 4,596,556) ; (2) micro-infusion pumps (U.S. Pat. No. 4,487,603) ; (3) transdermal devices (U.S. Pat. No. 4,486,194) ; (4) infusion apparatuses (U.S. Pat. Nos. 4,447,233 and 4,447,224) ; and (5) osmotic devices (U.S. Pat. Nos. 4,439,196 and 4,475,196) ; the disclosures of which are incorporated herein by reference.

[0125] The pharmaceutical composition which may comprise the recombinant fusion protein, nucleic acid molecules, expression vectors or host cells of the present disclosure have numerous in vitro and in vivo utilities involving, for example, treatment of diseases associated with Siglec15 and / or GM-CSF signaling such as tumors or cardiovascular diseases.

[0126] The disclosure provides a method for treating a disease associated with Siglec15 and / or GM-CSF signaling in a subject in need thereof, which may comprise administering to the subject a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of the disclosure.

[0127] The disease may be a tumor or cancer. The tumor may be a solid cancer, including, but not limited to, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, melanoma, colorectal cancer, breast cancer, endometrial cancer, and squamous cell carcinoma. In certain embodiments, the subject is human.

[0128] The disease may be a cardiovascular disease. The cardiovascular disease may be atherosclerosis, stroke, hypertensive heart disease, rheumatic heart disease, cardiomyopathy, heart arrhythmia, congenital heart disease, valvular heart disease, carditis, aortic aneurysms, p eripheral artery disease, or venous thrombosis. In certain embodiments, the subject is human.

[0129] In yet another aspect, the disclosure provides a method for increasing leukocyte levels in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure.

[0130] In yet another aspect, the disclosure provides a method of enhancing immune response, or reversing or reducing an immune-suppression in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure.

[0131] The disclosure also provides a method for enhancing phagocytosis in a subject in need thereof, comprising administering to the subject the pharmaceutical composition of the disclosure.

[0132] Although the present invention and its advantages have been described in detail, it should be understood that various changes, substitutions and alterations can be made herein without departing from the spirit and scope of the invention as defined in the appended claims.

[0133] The present disclosure is further illustrated by the following examples, which should not be construed as further limiting. The contents of all figures and all references, Genbank sequences, patents and published patent applications cited throughout this application are expressly incorporated herein by reference. ExamplesExample 1. Construction of Exemplary Recombinant Fusion Protein

[0134] Recombinant fusion proteins were constructed by linking human GM-CSF to C-terminus of the heavy chain of a humanized anti-Siglec15 antibody termed as A2A5 (A2A5C7E8-3) , as described in WO2021 / 190622 with a human IgG4 (S228P or S228P / YTE) heavy chain constant region.

[0135] The human GM-CSF was a wild type one, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (X1=S, X2=S, X3=T, X4=N, X5=N) , or a variant with certain mutations designed for avoiding glycosylation and / or enhancing protein stability, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (X1=A, X2=A, X3=G, X4=N, X5=N; or X1=A, X2=A, X3=G, X4=Q, X5=A) . The anti-Siglec15 antibody A2A5 was an IgG antibody with two heavy chains and two light chains, comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprised a VH CDR1, a VH CDR2, and a VH CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively, and the light chain variable region comprised a VL CDR1, a VL CDR2 and a VL CDR3 having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively.

[0136] FIG. 1 shows the structure schematic of the recombinant fusion proteins of the disclosure, and the sequences of the exemplary recombinant fusion proteins were set forth in Table 1 below. Table 1. Molecular Structure and Amino Acid Sequence ID NOs of Exemplary  Recombinant Fusion Proteins Example 2. Expression and Identification of Exemplary Recombinant Fusion Proteins

[0137] Briefly, nucleic acids encoding the polypeptide chains constituting each fusion protein were synthesized, and then inserted into pTT5 vectors, respectively. Afterwards, the above expression vectors were transfected into mammalian cells (CHO cells) , and the exemplary fusion proteins of the disclosure were expressed and secreted by the CHO cells. The fusion proteins were then purified on protein A affinity chromatography columns, and subject to SDS-PAGE and SEC-HPLC analysis, the results of which were shown in Tables 2-1 and 2-2. Table 2-1. SDS-PAGE Results of Exemplary Recombinant Fusion Proteins Table 2-2. SEC-HPLC Results of Exemplary Recombinant Fusion Proteins

[0138] It can be seen from the results that the fusion proteins of the disclosure exhibited high purity, and most fusion proteins were present as monomers.Example 3. Binding Affinity Determination of Exemplary Recombinant Fusion Proteins Using BIACORE Surface Plasmon Resonance Technology

[0139] The purified fusion proteins were characterized for their binding affinity and binding kinetics by Biacore T200 system (GE healthcare, Pittsburgh, PA, USA) .

[0140] A Protein A chip (Cat#: 29-1275-56, GE healthcare) was used for affinity determination. The recombinant fusion proteins of the disclosure at the concentration of 2 μg / ml were respectively flowed onto the chip at a flow rate of 10 μl / min. Then, serially diluted recombinant human Siglec15-his proteins (Biosion in house made, SEQ ID NO: 16) or human GM-CSFR-his proteins (purchased from Acro biosystems Inc., Cat#GRA-H52H7) , 2-fold dilution in HBS-EP+ buffer (provided by Biacore) starting at 200 nM, were flowed onto the chip at a flow rate of 30 μl / min. The association kinetics was followed for 2 minutes and the dissociation kinetics was followed for 10 minutes. The association and dissociation curves were fit to a 1: 1 Langmuir binding model using the Biacore evaluation software. The KD, Ka and Kd values were determined and summarized in Tables 3-1 and 3-2 below. Table 3-1. Binding Affinity of Recombinant Fusion Proteins to Human Siglec15 Table 3-2. Binding Affinity of Recombinant Fusion Proteins to Human GM-CSFR

[0141] All recombinant fusion proteins of the disclosure specifically bound to human Siglec15 with high binding affinity.

[0142] Further, the fusion proteins of the disclosure also specifically bound to human GM-CSFR, wherein BSI060×S-003’s GM-CSFR binding affinity was the highest.Example 4. Binding Activity of Exemplary Recombinant Fusion Proteins

[0143] The binding activity of the fusion proteins of the disclosure to human Siglec15 was further determined by Capture ELISA and Flow Cytometry (FACS) . The anti-Siglec15 antibody A2A5 (comprising the heavy chain and the light chain of SEQ ID NOs: 22 and 14) was used as a positive control. 4.1 Capture ELISA

[0144] Briefly, 96-well plates were coated with 100 μl 2 μg / ml AffiniPure Goat Anti-Human IgG F (ab') 2 fragment specific (Cat#109-005-097, Jackson Immuno Research) in PBS for 2 hours at 37℃. Plates were washed once with wash buffer (PBS+0.05%v / v Tween-20, PBST) and then blocked with 200 μl blocking buffer (5%w / v non-fatty milk in PBST) overnight at 4℃. Plates were washed 4 times and respectively incubated with 100 μl serially diluted fusion proteins of the disclosure, the control and hIgG (human immunoglobulin (pH4) for intravenous injection, Hualan Biological Engineering Inc. ) , 5-fold dilution in 2.5%w / v non-fatty milk in PBST starting at 66.7 nM, for 40 minutes at 37℃, and then washed 4 times again. Plates containing captured fusion proteins were incubated with 100 μl biotin-labeled human Siglec15-his protein (in house made with SEQ ID NO: 16, 145 ng / ml in 2.5%w / v non-fatty milk in PBST) for 40 minutes at 37℃, washed 4 times, and incubated with streptavidin conjugated HRP (1: 10000 dilution in PBST, Cat#016-030-084, Jackson Immuno Research, 100 μl / well) for 40 minutes at 37℃. After a final wash, plates were incubated with 100 μl / well ELISA substrate TMB (Cat#TMB-S-002, Innoreagents) . The reaction was stopped in 4 minutes at room temperature with 50 μl / well 1M H2SO4, and the absorbance of each well was read on a microplate reader using dual wavelength mode with 450 nm for TMB and 630 nm as the reference wavelength, then the OD (450-630) values were plotted against antibody concentration. Data was analyzed using Graphpad Prism and EC50 values were reported. 4.2 Cell based binding FACS

[0145] The binding activity of the fusion proteins to cell surface Siglec15 was tested by flow cytometry (FACS) , using in-house prepared HEK-293T-OKT3-S15 cells expressing human Siglec15 (amino acid residues Met1-Pro328 of uniprot#Q6ZMC9) on cell membranes. The HEK-293T-OKT3-S15 cells were prepared by transfecting HEK-293T cells (Cat#CRL-3216, ATCC) with OKT3 plasmid (OKT3scFv gene inserted into pcBSD vector) inserted with coding sequence of human Siglec15, following the instruction of lipofectamine 3000 transfection reagent (Thermo Fisher) . The HEK-293T-OKT3-S15 cells were harvested from cell culture flasks, washed twice and re-suspended in phosphate buffered saline (PBS) containing 2%v / v Fetal Bovine Serum (FACS buffer) . 2 x 105 cells per well in 96 well-plates were incubated in 100 μL serially diluted fusion proteins or the control (starting at 66.67 nM, 5-fold serial dilution) in FACS buffer for 40 minutes on ice. Cells were washed twice with FACS buffer, and 100 μL R-Phycoerythrin AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (1: 1000 dilution in FACS buffer, Cat#109-115-098, Jackson Immunoresearch) was added. Following a 40-minute incubation at 4℃ in dark, cells were washed three times and re-suspended in FACS buffer. Fluorescence was measured using a Becton Dickinson FACS Canto II-HTS equipment. Data was analyzed using Graphpad Prism and EC50 values were reported.

[0146] The results of the capture ELISA and cell based binding FACS were shown in FIGs. 2 and 3.

[0147] It can be seen from FIG. 2 that the recombinant fusion protein of the disclosure specifically bound to human Siglec15 protein, and retained the high binding activity of the monospecific anti-Siglec15 monoclonal antibody A2A5.

[0148] According to FIG. 3, the fusion protein of the disclosure specifically bound to cell surface human Siglec15. In addition, the binding activity of the recombinant fusion protein to cell surface human Siglec15 was comparable to that of the control antibody A2A5.Example 5. Blocking activity of Exemplary Recombinant Fusion Proteins on Siglec15-LRRC4C Binding

[0149] The activity of the fusion proteins of the disclosure to block Siglec15-LRRC4C binding was measured in a competitive ELISA assay. LRRC4C (Leucine rich repeat containing protein 4C) is a ligand of Siglec15 and may be expressed by cancer cells (WO2018057735) .

[0150] Briefly, 100 μl human Siglec15-Fc protein (prepared in-house with amino acid of SEQ ID NO: 15) were coated on 96-well ELISA plates at 2 μg / mL in carbonate / bicarbonate buffer for 2 hours at 37℃. Plates were washed once with wash buffer (PBS+0.05%v / v Tween-20, PBST) , and blocked with 5%w / v non-fatty milk in PBST overnight at 4℃. Plates were then washed 4 times using wash buffer.

[0151] Serially diluted fusion proteins of the disclosure or the control (starting at 66.67 nM with a 5-fold serial dilution) in PBST with 2.5%w / v non-fatty milk were added to the Siglec15-Fc coated ELISA plates, 100 μl per well, and the plates were incubated at 37℃ for 40 minutes. Plates were washed 4 times again using wash buffer, then added and incubated for 40 minutes at 37℃ with 100 μl / well 290 ng / ml biotin-labeled human LRRC4C-Fc protein (prepared in-house with SEQ ID NO: 17) . Plates were washed again using wash buffer. Thereafter, the plates were added with 100 μl / well streptavidin conjugated HRP (1: 5000 dilution in PBST buffer, Cat#016-030-084, Jackson Immunoresearch) and incubated for 40 minutes at 37℃. Plates were washed again using wash buffer. Finally, TMB was added and the reaction was stopped using 1M H2SO4, the absorbance of each well was read on a microplate reader using dual wavelength mode with 450 nm for TMB and 630 nm as the reference wavelength, and the OD (450-630) values were plotted against antibody concentration. Data was analyzed using Graphpad Prism and IC50 values were reported.

[0152] The results of ligand blocking ELISA were shown in FIG. 4.

[0153] It can be seen from FIG. 4 that the fusion protein of the disclosure was capable of blocking human Siglec15-human LRRC4C binding, and the blocking activity was similar to the monospecific anti-Siglec15 antibody A2A5.Example 6. Exemplary Recombinant Fusion Proteins Reversed Siglec15-Mediated T cell Suppression

[0154] Anti-CD3 monoclonal antibodies (OKT3) (Cat#16-0037-85, eBioscience Inc. ) were coated on 96-well micro plates at 50 ng / mL in DPBS, 100 μl per well, overnight at 4℃. The next day, the unbound anti-CD3 monoclonal antibodies were removed immediately prior to PBMC addition. 5G12, an anti-Siglec15 antibody disclosed in US20190202912A1, having the heavy chain and light chain amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 19 and 20, respectively, was used as the benchmark (BM) .

[0155] Total PBMCs from a healthy human donor were washed with RPMI-1640 medium (Cat#A10491-01, Gibco) supplemented with 10%FBS (Cat#10099-141, Gibco) and centrifuged at 200 g for 15 minutes to remove the supernatants. Then, PBMC cells were incubated and labeled with 1 mL 0.5 μM CFSE (Cat#C1157, Invitrogen) for 20 minutes on ice and the final cell density was adjusted to 1 x 106 cells / mL. The cells were added with 4 mL RPMI-1640 medium supplemented with 10%FBS and incubated for 5 minutes at room temperature. Plates were centrifuged at 300 g for 10 minutes, and cells were re-suspended in RPMI-1640 medium supplemented with 10%FBS at a density of 6×106 cells / mL. Meanwhile, serially diluted fusion proteins of the disclosure or the controls (4-fold dilution in RPMI-1640 medium supplemented with 10%FBS, starting at 120 μg / ml) were mixed with human Siglec15-Fc protein (prepared in-house with SEQ ID NO: 15, 40 μg / ml in RPMI-1640 medium supplemented with 10%FBS) at 1: 1 volume ratio, and incubated at room temperature for 30 minutes. Then, 50 μL medium containing PBMC cells and 50 μl fusion protein / human Siglec15-Fc mixtures were added to the anti-CD3 bound plates, and incubated in a CO2 incubator at 37℃ for 3 days. The supernatants were collected for IFNγ measurement, as described below. Then, 100 μL FACS buffer was added into each well, the cells were pipetted several times and transferred to U-shaped plates. The U-shaped plates were centrifuged to remove the supernatants. And then, the cells were incubated for 15 minutes at 4℃ in dark with 50 μl / well Human TruStain FcXTM(Fc Receptor Blocking Solution) (1: 10 dilution in FACS buffer, Cat#422302, Biolegend Inc. ) . Cells were stained with anti-CD4 (Cat#357410, Biolegend Inc. ) and anti-CD8 (Cat#301066, Biolegend Inc. ) fluorescent mAbs (1: 10 dilution in FACS buffer) for 30 minutes at 4℃. Cells were washed twice in FACS buffer (200 μL / well) and re-suspended in FACS buffer (200 μL / well) . Fluorescence was measured using a Becton Dickinson FACS Canto II-HTS equipment. Data was analyzed using Graphpad Prism. The description of the test groups was shown in Table 4 and test results were shown in FIGs. 5A-5B. Table 4. Test Groups

[0156] The supernatants as collected above were used to measure IFNγ levels using an ELISA kit (Human IFN-γ ELISA Kit from MultiSciences company, Cat#EK180-96) , with a microplate reader set at 450 nm and 630 nm. The result was shown in FIG. 5C.

[0157] It can be seen that the exemplary fusion proteins of the disclosure, including BSI060×S-001, were able to reverse Siglec15 mediated CD4+ T cell (FIG. 5A) and CD8+ T cell (FIG. 5B) proliferation suppression. Notably, BSI060×S-001 was more efficacious than the benchmark in reversing T cell suppression, resulting in higher CD4+ and CD8+ T cell proliferation percentages.

[0158] In addition, according to FIG. 5C, plate-bound anti-CD3 antibody significantly increased IFNγ secretion from PBMCs, the addition of soluble Siglec15-Fc proteins significantly reduced anti-CD3 stimulated IFNγ secretion from PBMCs, and BSI060×S-001 reversed Siglec15-mediated inhibition of IFNγ secretion at significantly higher activity than BM.Example 7. Exemplary Recombinant Fusion Proteins Promoted TF-1 Cell Proliferation

[0159] TF-1 cells (ahuman erythroleukemic cell line purchased from ATCC, Catalog No. CRL-2003) were seeded at the density of 10000 cells per well in 100 μl RPMI-1640 (Cat#A10491-01, Gibco) with 10%FBS on 96-well microplates on the day of assay. Recombinant fusion proteins, GM-CSF (Cat#GMF-H4214, Acro biosystems Inc. ) and isotype control (an anti-CD22 antibody) were 3-fold diluted to the final concentrations of 0.7 nM to 0.0001 nM in RPMI-1640 with 10%FBS. The cells were added and mixed with 100 μl fusion proteins, GM-CSF and the isotype control, respectively, and then incubated in a 5%CO2 incubator at 37℃ for 48h. The plates were added and incubated with 50 μl Cell Counting-Lite 2.0 reagent (Cat#DD1101, Vazyme) for 5 min. Luminescence were measured using Microplate Reader. The result was shown in FIGs. 6A-6B.

[0160] Luminescence signals were highly increased with the addition of either the fusion protein of the disclosure or GM-CSF, compared to that of the isotype control. In addition, the EC50 values of BSI060×S-001 and BSI060×S-003 treatment were lower than that of GM-CSF, indicating the fusion proteins of the disclosure were more potent in promoting TF-1 cell proliferation.Example 8. Effect of Exemplary Recombinant Fusion Proteins on Macrophage Repolarization from M2 to M1

[0161] M2 macrophages were prepared as follows. Briefly, 1.0×106 human CD14+monocytes (purchased from Leide Biosciences Co. Ltd, China) were differentiated to M2 macrophages in 2.5 mL RPMI-1640 (Cat#A10491-01, Gibco) supplemented with 10%FBS, 1%penicillin–streptomycin (Cat#15140-122, Gibco) , and 75 ng / mL M-CSF (Glu33-Asn190 of uniprot#P09603) . On Day 4, the cells were additionally added with 1 mL RPMI-1640 supplemented with 10%FBS (Cat#10099-141, Gibco) , 1%penicillin–streptomycin, and 75 ng / mL M-CSF. M2 macrophages were harvested with Accutase (Cat#07922, Stemcell) on Day 6.

[0162] M2 macrophages (1.0×104 cells / well, 100 μL) were seeded in 96-well flat bottom plates, the plates were added and incubated in a 5%CO2 incubator at 37℃ for 3 days with 100 μL 20 nM fusion proteins of the disclosure, hIgG1 or GM-CSF (Cat#GMF-H4214, Acrobiosystems) . M2 macrophages without any test article (100 μL medium only) served as baseline (Medium: drug 0 group) . All cells were harvested with Accutase and transferred into 96-well V bottom plates. The harvested cells were incubated with Human FcX blocker (Cat#422302, Biolegend) at 4℃ for 20 minutes to block Fc receptors, and then incubated with CD11b-APC (APC anti-human CD11b, Cat#301310, Biolegend) , CD163-PerCp / Cy5.5 (PerCP-Cy5.5 anti-human CD163, Cat#333608, Biolegend) and CD86-FITC (FITC anti-human CD86, Cat#374204, Biolegend) at 4℃ for 30 minutes. After centrifugation, the cells were resuspended in 50 μL staining buffer, and added with 10 μL PI (Propidium Iodide P3566, Cat#2229176, Thermo) . M2 macrophages were identified as the PI-CD11b+CD163+CD86-cells, and M1 macrophages as the PI-CD11b+CD163-CD86+ cells. The ratio of M2 or M1 macrophages to PI-CD11b+ cells was determined. The results were shown in FIGs. 7A-7B.

[0163] Without any treatment (Medium: drug 0) or with the treatment of the isotype controls, the majority of macrophages maintained as the M2 type (PI-CD11b+CD163+CD86-) , as showed in FIG. 7B. With the treatment of GM-CSF, about 20%of macrophages became M1 type (PI-CD11b+CD163-CD86+) , as showed in FIG. 7A, suggesting the effect of GM-CSF on repolarizing macrophages from M2 to M1 type. Similar to the GM-CSF, the fusion proteins of the disclosure promoted macrophage repolarization from M2 type to M1 type, as showed in FIG. 7A, while the anti-siglec15 monoclonal antibody A2A5 did not show such effects.Example 9. In vivo Anti-tumor Efficacy of Exemplary Recombinant Fusion Proteins in Mouse Tumor Model

[0164] The anti-tumor efficacy of the exemplary recombinant fusion proteins of the disclosure was tested with mouse GM-CSF fused to the anti-Siglec 15 antibody, as there was no animal model on market for the fusion proteins with human GM-CSF. The fusion protein with mouse GM-CSF (referred to as BSI060×S-004, amino acid sequences of heavy chain and light chain set forth in SEQ ID NOs: 21 and 14) was constructed by linking the mouse GM-CSF (SEQ ID NO:10) to the C-terminus of the heavy chain of the humanized anti-Siglec15 antibody A2A5.

[0165] The in vivo anti-tumor activity of BSI060×S-004 was tested in C57BL / 6-hSiglec15 mice (Shanghai Model Organisms Center, Inc. ) . MC38-hSiglec15 cells, purchased from Kyinno Inc. (Beijing, China) , were cultured in RPMl1640 medium containing 10%inactivated fetal bovine serum at 37.0℃ and 5%CO2. Briefly, MC38-hSiglec15 cells were inoculated subcutaneously at the right groin of C57BL / 6-hSiglec15 mice, 5×107 cells in 0.2 mL per mouse. When the average tumor volume reached 76 mm3, the mice were randomly assigned into three groups based on the tumor sizes, eight mice in each group, and this day was designated as Day 1. During the study phase, the animals were measured twice a week for their tumor volumes and body weights. The animals in Group 1 (G1) , G2 and G3 (control group) were intraperitoneally injected with BSI060×S-004 (5.0 mg / kg) , A2A5 (5.0 mg / kg) , and IgG4-Fc (SEQ ID NO: 18) , respectively, twice a week.

[0166] The study was terminated on Day 38. Tumor growth inhibition (TGI) was calculated based on the tumor volumes or tumor weights. The results were shown in Tables 5-1, 5-2, 5-3 and FIGs. 8-9.

[0167] As shown in FIG. 8 and Table 5-2, compared with G3, tumor growth was inhibited to some extent in G2 with TGITv being 60.27%, and while BSI060×S-004 treatment significantly suppressed tumor growth with TGITV being 71.32%.

[0168] As shown in FIG. 9 and Table 5-1, compared with G3, there was significant tumor weight decline in G1 and G2. The TGITW rates of G1 and G2 were 53.78%and 45.42%, respectively.

[0169] In addition, all the animals were in good shape during the experiment, and the body weights increased steadily. According to Table 5-3, there was no significant difference in body weight among groups (P>0.05) . Table 5-1. Anti-tumor effect of fusion proteins as determined with tumor weight on Day 38 a: Mean ± SEM b: Statistical analysis via student’s t test based on tumor weight at Day 38, compared with G3 Table 5-2. Anti-tumor effect of fusion proteins as determined with tumor sizes a: Mean ± SEM b: Statistical analysis via student’s t test based on tumor size on Day 38. *0.01≤P＜0.05, ** 0.001≤P＜0.01, ***P＜0.001 Table 5-3. Body weight change of C57BL / 6-hSiglec15 mice inoculated with MC38- hSiglec15 cells a: Mean ± SEM b: Statistical analysis via student’s t test based on animal body weights at Day 38, compared  with G3.

[0170] Sequences in the present application are summarized below. ***

[0171] Having thus described in detail preferred embodiments of the present invention, it is to be understood that the invention defined by the above paragraphs is not to be limited to particular details set forth in the above description as many apparent variations thereof are possible without departing from the spirit or scope of the present invention.

Claims

1.A recombinant fusion protein comprising:(a) an anti-Siglec15 antibody or an antigen binding portion thereof, and(b) a GM-CSF molecule.2.The recombinant fusion protein of claim 1, wherein the anti-Siglec15 antibody or an antigen binding portion thereof comprises a heavy chain variable region, a heavy chain constant region, and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises a VH CDR1, a VH CDR2 and a VH CDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively, and the light chain variable region comprises a VL CDR1, a VL CDR2 and a VL CDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively.3.The recombinant fusion protein of claim 2, wherein the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to SEQ ID NO: 7, and / or the light chain variable region comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to SEQ ID NO: 8.4.The recombinant fusion protein of claims 2 or 3, wherein the heavy chain constant region is a human IgG1, IgG2 or IgG4 heavy chain constant region.5.The recombinant fusion protein according to any one of claims 2 to 4, wherein the GM-CSF molecule is linked to C-terminus of the heavy chain constant region.6.The recombinant fusion protein of claim 1, wherein the GM-CSF molecule is linked to the anti-Siglec15 antibody or the antigen binding portion thereof.7.The recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 6, wherein the GM-CSF molecule is wild-type GM-CSF or a GM-CSF variant.8.The recombinant fusion protein of claim 7, wherein the GM-CSF molecule comprises the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 9 (X1=S, X2=S, X3=T, X4=N, X5=N; X1=A, X2=A, X3=G, X4=N, X5=N; or X1=A, X2=A, X3=G, X4=Q, X5=A) .9.The recombinant fusion protein according to any one of claims 1 to 8, comprising:i) an anti-Siglec15 heavy chain variable region-heavy chain constant region-GM-CSF polypeptide chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, 12 or 13, andii) an anti-Siglec15 light chain variable region-light chain constant region polypeptide chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.10.A nucleic acid encoding the recombinant fusion protein according to any one of claims 1-9.11.An expression vector comprising the nucleic acid of claim 10.12.A host cell transformed or transfected with the expression vector of claim 11 or with the nucleic acid of claim 10.13.A pharmaceutical composition comprising the recombinant fusion protein according to any one of claims 1-9, the nucleic acid of claim 10, the expression vector of claim 11, or the host cell of claim 12, and a pharmaceutically acceptable carrier.14.Use of the pharmaceutical composition of claim 13 in preparation of a medicament for treating a disease associated with Siglec15 and / or GM-CSF signaling.15.The use of claim 14, wherein the disease is a cancer or a cardiovascular disease.16.The use of claim 15, wherein the cancer is a solid cancer.17.The use of claim 16, wherein the cancer is non-small cell lung cancer, ovarian cancer, melanoma, colorectal cancer, breast cancer, endometrial cancer, or squamous cell carcinoma.18.The use of claim 15, wherein the cardiovascular disease is atherosclerosis, stroke, hypertensive heart disease, rheumatic heart disease, cardiomyopathy, heart arrhythmia, congenital heart disease, valvular heart disease, carditis, aortic aneurysms, p eripheral artery disease, or venous thrombosis.

Images