Engineered il-15 variants and methods of use thereof

Abstract

Provided are engineered IL-15 variants, protein constructs thereof, and methods of use thereof. In some embodiments, the engineered IL-15 variants include a non-native disulfide bond.

Description

ENGINEERED IL-15 VARIANTS AND METHODS OF USE THEREOF

[0001] CLAIM OF PRIORITY

[0002] This application claims priority to U.S. Provisional Patent Application No. 63 / 655,435, filed on June 03, 2024, the entire contents of which are hereby incorporated by reference.

[0003] SEQUENCE LISTING

[0004] This application contains a Sequence Listing that has been submitted electronically as an XML file named 52246-0027WO1_SL_ST26. xml. The XML file, created on May 15, 2025, is 50, 706 bytes in size. The material in the XML file is hereby incorporated by reference in its entirety.TECHNICAL FIELD

[0005] This disclosure relates to engineered IL-15 variants, and methods of use thereof.BACKGROUND

[0006] Cytokines belonging to the common γ chain (γc) family are central regulators of the development, proliferation, survival and differentiation of multiple cell lineages of the innate and adaptive immune system, and as such are of high interest for anticancer therapeutic applications.

[0007] Among them, IL-2 is the most comprehensively one. It became the first immunotherapy approved by the United States Food and Drug Administration (FDA) for cancer treatment nearly 30 years ago. However, IL-2 has the effect of promoting the proliferation of regulatory T cells and CD4+ helper T cells. It can also eliminate self-relative T cells via activation-induced cell death (AICD) to prevent autoimmunity. Thus, IL-15 has gradually emerged as an alternative to IL-2 in cancer treatment because of its functional similarity to IL-2 with several added benefits. For example, the physiological / pathological roles and mechanisms of action of IL-15 in immunity have been more thoroughly investigated. IL-15 is essential in the growth, mobilization and activation of immune cells such as natural killer (NK) cells, CD8+ T cells, γδ T cells and natural killer T (NKT) cells. IL-15 can also enhance the anti-tumor activity of immune cells.

[0008] However, wildtype IL-15 is relatively unstable. Thus, there is a need to develop cancer therapies targeting the IL-15 pathway with improved stability.SUMMARY

[0009] This disclosure relates to engineered IL-15 variants, protein constructs (e.g., fusion proteins or protein complexes) , and methods of use thereof. In some embodiments, the engineered IL-15 variants and protein constructs include a non-native disulfide bond formed by mutating two or more residues (e.g., a pair of residues) of wildtype IL-15 to cysteines, without interfering the overall structure or residues critical for IL-15 receptor interaction. As a result, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof can be more stable than a wildtype IL-15 or protein construct thereof. In some embodiments, the protein constructs showed enhanced thermostability (e.g., increased melting temperatures) , a medium to high T cell response, and / or a comparable CD122 / CD132-binding affinity than a wildtype IL-15 or protein construct thereof. These engineered IL-15 variants and protein constructs thereof described herein can be used for cancer therapies.

[0010] In some embodiments, the engineered IL-15 variants described herein include one or more non-native disulfide bonds, which can stabilize the internal core of IL-15, with purposes of increasing the thermostability of the engineered IL-15 variants. In some embodiments, the one or more non-native disulfide bonds can also exhibit beneficial effects on pharmacokinetics (PK) . In addition, by gently modifying the internal core of IL-15, subtle structural changes and / or unique functional properties (e.g., different potencies, different binding affinities, etc. ) can be achieved. Without wishing to be bound by theory, it is contemplated that such effects are not achievable by making surface mutations of IL-15.

[0011] Also provided herein are methods for screening IL-15 (e.g., human IL-15) with increased stability and / or anti-tumor efficacy.

[0012] In one aspect, the disclosure is related to an engineered IL-15 polypeptide, in some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises a non-native disulfide bond. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide described herein comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises one or more of the following: (a) the amino acid that corresponds to position 1 of SEQ ID NO: 1 is C (cysteine) , and the amino acid that corresponds to position 73 of SEQ ID NO: 2 is C; (b) the amino acid that corresponds to position 1 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 69 of SEQ ID NO: 2 is C; (c) the amino acid that corresponds to position 2 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 111 of SEQ ID NO: 2 is C; (d) the amino acid that corresponds to position 5 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 66 of SEQ ID NO: 2 is C; (e) the amino acid that corresponds to position 8 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 62 of SEQ ID NO: 2 is C; (f) the amino acid that corresponds to position 8 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 66 of SEQ ID NO: 2 is C; (g) the amino acid that corresponds to position 23 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 95 of SEQ ID NO: 2 is C; (h) the amino acid that corresponds to position 24 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 93 of SEQ ID NO: 2 is C; (i) the amino acid that corresponds to position 24 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 95 of SEQ ID NO: 2 is C; (j) the amino acid that corresponds to position 25 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 46 of SEQ ID NO: 2 is C; (k) the amino acid that corresponds to position 26 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 89 of SEQ ID NO: 2 is C; (l) the amino acid that corresponds to position 26 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 91 of SEQ ID NO: 2 is C; (m) the amino acid that corresponds to position 26 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 93 of SEQ ID NO: 2 is C; (n) the amino acid that corresponds to position 27 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 92 of SEQ ID NO: 2 is C; (o) the amino acid that corresponds to position 27 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 94 of SEQ ID NO: 2 is C; (p) the amino acid that corresponds to position 27 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 99 of SEQ ID NO: 2 is C; (q) the amino acid that corresponds to position 28 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 39 of SEQ ID NO: 2 is C; (r) the amino acid that corresponds to position 28 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 91 of SEQ ID NO: 2 is C; (s) the amino acid that corresponds to position 29 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 102 of SEQ ID NO: 2 is C; and (t) the amino acid that corresponds to position 51 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 60 of SEQ ID NO: 2 is C.

[0013] In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide described herein comprises comprising an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 2-21. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 3. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 7. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 9. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 13. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 15. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 16. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 21.

[0014] In some embodiments, the non-native disulfide bond can stabilize the internal core of IL-15, optionally wherein the engineered IL-15 polypeptide has an increased thermostability and / or an improved pharmacokinetic profile as compared to a wildtype IL-15 or a functional fragment thereof.

[0015] In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide can regulate IL-15 / IL-15 receptor signaling pathways (e.g., activation of the JAK / STAT pathway) and / or induce proliferation of immune cells (e.g., human PBMCs) . In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide can bind to CD122 (e.g., human or mouse CD122) and / or CD132 (e.g., human or mouse CD132) .

[0016] In one aspect, the disclosure is related to a fusion protein comprising the engineered IL-15 polypeptide described herein. In some embodiments, the fusion protein further comprises a His-tag, optionally at the N-terminus. In some embodiments, the fusion protein further comprises a sushi domain of interleukin 15 receptor, alpha subunit (IL15Rα) . In some embodiments, the fusion protein comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 26-46. In some embodiments, the fusion protein can regulate IL-15 / IL-15 receptor signaling pathways (e.g., activation of the JAK / STAT pathway) and / or induce proliferation of immune cells (e.g., human PBMCs) . In some embodiments, the fusion protein can bind to CD122 (e.g., human CD122) and / or CD132 (e.g., human CD132) . In some embodiments, the fusion protein described herein further comprises an Fc region. In some embodiments, the fusion protein comprises or consisting of an immunocytokine.

[0017] In one aspect, the disclosure is related to a protein complex comprising the engineered IL-15 polypeptide described herein, in some embodiments, the protein complex comprises an immunocytokine.

[0018] In one aspect, the disclosure is related to a protein complex comprising: (a) a first polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an optional first hinge region, a first Fc region, an optional linker peptide, and the engineered IL-15 polypeptide described herein; and (b) a second polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an optional second hinge region, and a second Fc region. In one aspect, the disclosure is related to a protein complex comprising: (a) the engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-26, an optional first hinge region, and a first Fc region; and (b) a second polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an optional second hinge region, and a second Fc region. In some embodiments, the first hinge region, the first Fc region, the second hinge region, and / or the second Fc region are derived from IgG4 (e.g., human IgG4) . In some embodiments, the first Fc region and / or the second Fc region comprise one or more knob-into-hole (KIH) mutations. In some embodiments, the protein complex can regulate IL-15 / IL-15 receptor signaling pathways (e.g., activation of the JAK / STAT pathway) and / or induce proliferation of immune cells (e.g., human PBMCs) . In some embodiments, the protein complex can bind to CD122 (e.g., human CD122) and / or CD132 (e.g., human CD132) .

[0019] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition comprising the engineered IL-15 polypeptide, the fusion protein, or the protein complex described herein; and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0020] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid encoding the engineered IL-15 polypeptide, the fusion protein, or the protein complex described herein.

[0021] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising the nucleic acid described herein. In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising the nucleic acid or the vector described herein. In some embodiments, the cell is a Expi293 cell or a CHO cell (e.g., a CHO-Scell) .

[0022] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing an engineered IL-15 polypeptide, a fusion protein comprising the engineered IL-15 polypeptide, or a protein complex comprising the engineered IL-15 polypeptide, the method comprising (a) culturing the cell described herein under conditions sufficient for the cell to produce the engineered IL-15 polypeptide, the fusion protein, or the protein complex; and (b) collecting the engineered IL-15 polypeptide, the fusion protein, or the protein complex produced by the cell.

[0023] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the engineered IL-15 polypeptide, the fusion protein, or the protein complex described herein to the subject. In some embodiments, the subject has a solid tumor or a hematologic cancer. In some embodiments, the cancer is melanoma, head and neck cancer, colorectal cancer, lymphoma, leukemia, bladder cancer, multiple myeloma, pancreatic cancer, gastric cancer, or lung cancer.

[0024] In one aspect, the disclosure is related to a method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the engineered IL-15 polypeptide, the fusion protein, or the protein complex described herein.

[0025] In one aspect, the disclosure is related to a method of killing a tumor cell, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the engineered IL-15 polypeptide, the fusion protein, or the protein complex described herein.

[0026] In one aspect, the disclosure is related to a method of improving the stability of IL-15, comprising (a) providing a 3D structure of IL-15, (b) measuring distance of the Calpha atoms of one or more of amino acid residues in the 3D structure; and (c) selecting two amino acid residues from the one or more amino acid residues, in some embodiments, the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are within 3-7 angstroms. In some embodiments, the method described herein further comprises expressing a IL-15 variant, in some embodiments, the IL-15 variant comprises a non-native disulfide bond formed by mutating the two selected amino acid residues to cysteines. In some embodiments, the mutating the two selected amino acid residues to cysteines does not substantially change the 3D structure of IL-15.

[0027] In one aspect, the disclosure is related to a method of screening an IL-15 variant with an improved anti-tumor efficacy, comprising (a) providing a 3D structure of IL-15, (b) measuring distance of the Calpha atoms of one or more of amino acid residues in the 3D structure; and (c) selecting two amino acid residues from the one or more amino acid residues, in some embodiments, the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are within 3-7 angstroms. In some embodiments, the method described herein further comprises (d) expressing an IL-15 variant, in some embodiments, the IL-15 variant comprises a non-native disulfide bond formed by mutating the two selected amino acid residues to cysteines; (e) administering the IL-15 variant to a tumor-bearing animal; and (f) determining tumor growth (e.g., by measuring tumor volume) in the tumor-bearing animal.

[0028] In some embodiments, the IL-15 described herein is human IL-15. In some embodiments, the IL-15 described herein comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%to SEQ ID NO: 1 or 22.

[0029] As used herein, the term “non-native disulfide bond” refers to a disulfide bond that does not naturally exist in a wild-type protein. In some embodiments, the non-native disulfide bond is formed by two cysteine residues, wherein at least one of them is a mutation. In some embodiments, two of them are mutations. In some embodiments, at least one or two cysteine residues are introduced by insertion. In some embodiments, a deletion changes the distance between two existing cysteine residues, which then forms a disulfide bond that does not exist in a wild-type protein.

[0030] As used herein, the term “engineered IL-15 polypeptide” refers to a polypeptide derived from a wildtype IL-15 polypeptide or a portion thereof, optionally with one or more mutations (e.g., insertions, deletions, or substitutions) . In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide comprises or consists of an amino acid sequence corresponding to amino acids 49-162 of human IL-15 (SEQ ID NO: 22) . In some embodiments, the engineered IL-15 polypeptide has one or more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10) mutations (e.g., amino acids are substituted by cysteine) .

[0031] As used herein, the term “protein construct” refers to a complex having one or more polypeptides. In some embodiments, the protein construct is a fusion protein, e.g., a fusion protein including a His tag and an engineered IL-15 polypeptide (e.g., any of the engineered IL-15 polypeptides described herein) . In some embodiments, the protein construct is a protein complex. In some embodiments, the protein construct has two or more polypeptides, wherein the polypeptides can associate with each other, forming a dimer or a multimer (e.g., a trimer) . In some embodiments, the protein construct is a heterodimeric Fc-fused IL-15 (e.g., any of the heterodimeric Fc-fused IL-15 or its variants described herein) .

[0032] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for uncontrolled autonomous growth. Examples of such cells include cells having an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include cancerous growths, e.g., tumors; oncogenic processes, metastatic tissues, and malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. Also included are malignancies of the various organ systems, such as respiratory, cardiovascular, renal, reproductive, hematological, neurological, hepatic, gastrointestinal, and endocrine systems; as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, non-small cell carcinoma of the lung, and cancer of the small intestine. Cancer that is “naturally arising” includes any cancer that is not experimentally induced by implantation of cancer cells into a subject, and includes, for example, spontaneously arising cancer, cancer caused by exposure of a patient to a carcinogen (s) , cancer resulting from insertion of a transgenic oncogene or knockout of a tumor suppressor gene, and cancer caused by infections, e.g., viral infections. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues. The term also includes carcinosarcomas, which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation. The term “hematopoietic neoplastic disorders” includes diseases involving hyperplastic / neoplastic cells of hematopoietic origin. A hematopoietic neoplastic disorder can arise from myeloid, lymphoid or erythroid lineages, or precursor cells thereof. A hematologic cancer is a cancer that begins in blood-forming tissue, such as the bone marrow, or in the cells of the immune system. Examples of hematologic cancer include e.g., leukemia, lymphoma, and multiple myeloma etc.

[0033] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present invention is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated in the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0034] As used herein, the terms “polypeptide, ” “peptide, ” and “protein” are used interchangeably to refer to polymers of amino acids of any length of at least two amino acids.

[0035] As used herein, the terms “polynucleotide, ” “nucleic acid molecule, ” and “nucleic acid sequence” are used interchangeably herein to refer to polymers of nucleotides of any length of at least two nucleotides, and include, without limitation, DNA, RNA, DNA / RNA hybrids, and modifications thereof.

[0036] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Methods and materials are described herein for use in the present invention; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0037] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0038] FIGS. 1A-1D show the absorbance value at 630 nm of H8-sushi-IL15_wt and it variants measured using the HEK-BlueTM IL-15 reporter assay.

[0039] FIGS. 2A-2D show the absorbance value at 450 nm of H8-sushi-IL15_wt and it variants binding to recombinant human CD122 / CD132, as determined by the ELISA binding assay.

[0040] FIGS. 3A-3D show the absorbance value at 450 nm of H8-sushi-IL15_wt and it variants binding to recombinant human CD122 / CD132, as determined by the ELISA binding assay.

[0041] FIGS. 3E-3H show the absorbance value at 450 nm of H8-sushi-IL15_wt and it variants binding to recombinant mouse CD122 / CD132, as determined by the ELISA binding assay.

[0042] FIGS. 4A-4D show the absorbance value at 450 nm of H8-sushi-IL15_wt and it variants binding to recombinant human CD122 / CD132 at pH 7.5, as determined by the ELISA binding assay.

[0043] FIGS. 4E-4H show the absorbance value at 450 nm of H8-sushi-IL15_wt and it variants binding to recombinant human CD122 / CD132 at pH 6.0, as determined by the ELISA binding assay.

[0044] FIGS. 5A-5D show the fold change of the luminescence signal from PBMCs treated with H8-sushi-IL15_wt and it variants relative to that of non-treated PBMCs.

[0045] FIG. 6 lists sequences discussed in the disclosure.DETAILED DESCRIPTION

[0046] Interleukin 15 (also known as IL-15 or IL15) plays an important role in innate and adaptive immunity. It is a four-helix bundle cytokine, and was discovered in 1994. It was described as a T cell proliferation factor which shared IL-2 receptor β subunit with IL-2. IL-15 is a pleiotropic cytokine, constitutively expressed by many type of cells such as macrophages, monocytes, dendritic cells (DCs) , T cells, as well as epithelial cells, fibroblasts, keratinocytes, and nerve cells. However, IL-15 is mainly produced by macrophages, monocytes and DCs.

[0047] IL-15 is especially involved in lymphocyte and NK cell functioning and homeostasis. IL-15 signals through a heterotrimeric receptor which consist of three subunits, the IL-15 receptor α (IL15Rα or CD215) specific subunit, IL2 / IL-15 receptor β subunit (IL2Rβ, IL15Rβ, or CD122) , and γc (CD132) subunit, a common chain for other cytokines such as IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, and IL-21. After activation, myeloid cells produce IL-15 as a membrane-bound heterodimer complexed with IL15Rα, and it is dominantly trans-presented to the cells expressing the dimeric IL2Rβ / γc receptor. IL-15 signaling requires Janus kinases (Jak) -1 and Jak-3 to phosphorylate and activate the signal transducer and activator of transcription (STAT) 3 and STAT5. Furthermore, IL-15 stimulates both the phosphatidylinositol 3-kinase / protein kinase B (PI3K / AKT) and RAS / mitogen-activated protein kinase (RAS / MAPK) pathways. IL-15 acts on many cells of the immune system, being able to increase proliferation of B cells and secretion of immunoglobulins, and is critical for the ontogeny of NK and CD8+ T cells, inducing cell activation, proliferation, cytolytic activity and the production of cytokines such as interferon-γ (IFN-γ) by these cells. Although IL-2 and IL-15 present many similar functions on lymphocytes, there are some differences. IL-15 does not exert significant effects on regulatory T cells (Tregs) , a subset of cells that inhibit antitumor immunity and promote tumor development and progression; and by acting as a survival factor of CD8 memory T cells, it plays an important role in supporting the long-term maintenance, high-avidity T cell responses to malignant cells.

[0048] A detailed description of IL-15 and its functions can be found, e.g., in Isvoranu, G., et al. "Therapeutic potential of interleukin‐15 in cancer. "Experimental and Therapeutic Medicine 22.1 (2021) : 1-6; and Cai, M., et al. "Research progress of interleukin-15 in cancer immunotherapy. "Frontiers in Pharmacology 14 (2023) : 1184703; each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0049] The present disclosure provides engineered IL-15 variants having at least one non-native disulfide bond. In some embodiments, two amino acid residues in a wildtype human IL-15 sequence (e.g., SEQ ID NO: 1) are selectively mutated to cysteines, which can form the non-native disulfide bond. In some embodiments, the mutations do not substantially change the overall structure of IL-15, e.g., the relative position of the four alpha helices of IL-15. In some embodiments, the non-native disulfide bond formed by the cysteine mutations can stabilize IL-15. In some embodiments, the engineered IL-15 variants described herein can bind to the CD122 / CD132 complex, and induce downstream signaling pathways (e.g., the JAK / STAT pathway) and / or immune cell (e.g., human PBMC) proliferation. In some embodiments, the engineered IL-15 variants comprises or consists of any of the engineered IL-15 polypeptides described herein.

[0050] Also provided herein are protein constructs (e.g., fusion proteins) that further include a His tag and a sushi domain of IL15Rα that are fused to the engineered IL-15 variants described herein. In some embodiments, the protein constructs can induce downstream signaling pathways (e.g., the JAK / STAT pathway) and / or immune cell (e.g., human PBMC) proliferation.

[0051] Without wishing to be bound by theory, it is contemplated that the at least one non-native disulfide bonds can (1) increase thermostability of the engineered IL15 variants or protein constructs; and / or (2) fine-tune the potency of the engineered IL-15 variants or protein constructs so there is a wide spectrum of candidates that can be used for different purposes (e.g., treating cancers or immune disorders) . For example, some of the engineered IL-15 variants or protein constructs described herein have a comparable potency (e.g., at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 110%, or at least 120%) as compared to a wildtype IL-15 or protein construct thereof, whereas some of the engineered IL-15 variants described herein have a more gentle potency (e.g., less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, or less than 50%) as compared to a wildtype IL-15 or protein construct thereof.

[0052] The disclosure also provides methods of screening cytokine (e.g., IL-15) variants having a higher stability and / or improved anti-tumor efficacy.

[0053] Engineered IL-15 variants

[0054] IL-15 is 14-15 kDa glycoprotein encoded by the 34 kb region of chromosome 4q31 in humans, and at the central region of chromosome 8 in mice. The human IL-15 gene comprises nine exons and eight introns, four of which (exons 5 through 8) code for the mature protein. Human IL-15 (SEQ ID NO: 22; NP_000576.1) includes, from N-terminus to C-terminus, a signal peptide, a propeptide, and a soluble chain. According to the UniProt Database (UniProt ID: P40933) , the signal peptide of human IL-15 corresponds to amino acids 1-29 of SEQ ID NO: 22, the propeptide of human IL-15 corresponds to amino acids 30-48 of SEQ ID NO: 22, and the soluble chain of human IL-15 corresponds to amino acids 49-162 of SEQ ID NO: 22. The soluble chain of human IL-15 is also shown as SEQ ID NO: 1.

[0055] The soluble chain contains four highly conserved helical domains (helices) , i.e., from N-terminus to C-terminus, helix A, helix B, helix C, and helix D. In a wildtype IL-15, helix A corresponds to amino acids 1-16 of SEQ ID NO: 1; helix B corresponds to amino acids 36-53 of SEQ ID NO: 1; helix C corresponds to amino acids 59-74 of SEQ ID NO: 1; and helix D corresponds to amino acids 96-111 of SEQ ID NO: 1. Details of the position of the four helices can be found, e.g., in Chirifu, M., et al. "Crystal structure of the IL-15–IL-15Rαcomplex, a cytokine-receptor unit presented in trans. "Nature Immunology 8.9 (2007) : 1001-1007, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0056] Specifically, helix A corresponds to N1 to I16 of SEQ ID NO: 1, helix B corresponds to K36 to E53 of SEQ ID NO: 1, helix C corresponds to I59 to L74 of SEQ ID NO: 1, and helix D corresponds to I96 to I111 of SEQ ID NO: 1. The AB loop is between helix A and helix B. The BC loop is between helix B and helix C. The CD loop is between helix C and helix D. According to the model (e.g., 3D protein structure) of IL-15, the following residues of IL-15 were identified as positions that may enhance IL-15 stability and / or potency: amino acids corresponding to positions 1, 2, 8, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 39, 46, 51, 60, 62, 66, 69, 73, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 99, 102, and 111 of SEQ ID NO: 1. Specifically, these residues N1, W2, D8, A23, T24, L25, Y26, T27, E28, S29, A39, E46, S51, H60, T62, L66, L69, S73, E89, L91, E92, E93, K94, N95, F99, S102, and I111 in SEQ ID NO: 1.

[0057] Based on the 3D structure of human IL-15, distance of the Calpha atoms of one or more amino acid residues (e.g., those in close proximity) in the 3D structure can be determined. Two residues whose Calpha atoms are within 3-7 angstroms (e.g., 4.5-6.5 angstroms) can be selectively mutated to cysteines, without interfering the overall structure (e.g., the core structure formed by the four-helical bundle) of IL-15. It is contemplated that the newly introduced cysteines can form a disulfide bond non-native to the wild-type IL-15, which can stabilize IL-15 and / or improve the functional potencies of IL-15.

[0058] Thus, in one aspect, the engineered IL-15 variants (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) includes a first cysteine mutation and a second cysteine mutation, such that the two cysteines can form a non-native disulfide bond. In some embodiments, the first cysteine mutation occurs at an amino acid residue in helix A that corresponds to position 1, 2, 5, or 8 of SEQ ID NO: 1; and the second cysteine mutation occurs at an amino acid residue in helix C that corresponds to position 60, 62, 66, 69, or 73 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the first cysteine mutation occurs at an amino acid residue in helix A that corresponds to position 1, 2, 5, or 8 of SEQ ID NO: 1; and the second cysteine mutation occurs at an amino acid residue in helix D that corresponds to position 99, 102, or 111 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the first cysteine mutation occurs at an amino acid residue in helix B that corresponds to position 39, 46, or 51 of SEQ ID NO: 1; and the second cysteine mutation occurs at an amino acid residue in helix C that corresponds to position 60, 62, 66, 69, or 73 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the first cysteine mutation occurs at an amino acid residue in AB loop that corresponds to position 23, 24, 25, 26, 27, 28, or 29 of SEQ ID NO: 1; and the second cysteine mutation occurs at an amino acid residue in CD loop that corresponds to position 89, 91, 92, 93, 94, or 95 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the first cysteine mutation occurs at an amino acid residue in AB loop that corresponds to position 23, 24, 25, 26, 27, 28, or 29 of SEQ ID NO: 1; and the second cysteine mutation occurs at an amino acid residue in helix B that corresponds to position 39, 46, or 51 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the first cysteine mutation occurs at an amino acid residue in AB loop that corresponds to position 23, 24, 25, 26, 27, 28, or 29 of SEQ ID NO: 1; and the second cysteine mutation occurs at an amino acid residue in helix D that corresponds to position 99, 102, or 111 of SEQ ID NO: 1.

[0059] In some embodiments, the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are within or In some embodiments, any of the first cysteine mutations can be paired with any of the second cysteine mutations described herein, when distance of the Calpha atoms of the two selected amino acid residues is within the range described above. In some embodiments, the non-native disulfide bond can further stabilize the overall structure of IL-15, e.g., the relative position and angles of the four-helical bundle in IL-15 are maintained.

[0060] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V1 (or IL15_C01) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 1 (e.g., N1) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 73 (S73) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V1 is set forth in SEQ ID NO: 2.

[0061] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V2 (or IL15_C02) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 1 (e.g., N1) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 69 (L69) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V2 is set forth in SEQ ID NO: 3.

[0062] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V3 (or IL15_C03) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 2 (e.g., W2) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 111 (I111) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V3 is set forth in SEQ ID NO: 4.

[0063] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V4 (or IL15_C04) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 5 (e.g., V5) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 66 (L66) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V4 is set forth in SEQ ID NO: 5.

[0064] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V5 (or IL15_C05) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 8 (e.g., D8) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 62 (T62) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V5 is set forth in SEQ ID NO: 6.

[0065] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V6 (or IL15_C06) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 8 (e.g., D8) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 66 (L66) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V6 is set forth in SEQ ID NO: 7.

[0066] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V7 (or IL15_C07) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 23 (e.g., A23) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 95 (N95) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V7 is set forth in SEQ ID NO: 8.

[0067] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V8 (or IL15_C08) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 24 (e.g., T24) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 93 (E93) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V8 is set forth in SEQ ID NO: 9.

[0068] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V9 (or IL15_C09) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 24 (e.g., T24) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 95 (N95) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V9 is set forth in SEQ ID NO: 10.

[0069] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V10 (or IL15_C10) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 25 (e.g., L25) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 46 (E46) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V10 is set forth in SEQ ID NO: 11.

[0070] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V11 (or IL15_C11) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 26 (e.g., Y26) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 89 (E89) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V11 is set forth in SEQ ID NO: 12.

[0071] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V12 (or IL15_C12) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 26 (e.g., Y26) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 91 (L91) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V12 is set forth in SEQ ID NO: 13.

[0072] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V13 (or IL15_C13) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 26 (e.g., Y26) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 93 (E93) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V13 is set forth in SEQ ID NO: 14.

[0073] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V14 (or IL15_C14) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 27 (e.g., T27) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 92 (E92) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V14 is set forth in SEQ ID NO: 15.

[0074] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V15 (or IL15_C15) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 27 (e.g., T27) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 94 (K94) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V15 is set forth in SEQ ID NO: 16.

[0075] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V16 (or IL15_C16) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 27 (e.g., T27) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 99 (F99) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V16 is set forth in SEQ ID NO: 17.

[0076] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V17 (or IL15_C17) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 28 (e.g., E28) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 39 (A39) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V17 is set forth in SEQ ID NO: 18.

[0077] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V18 (or IL15_C18) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 28 (e.g., E28) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 91 (L91) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V18 is set forth in SEQ ID NO: 19.

[0078] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V19 (or IL15_C19) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 29 (e.g., S29) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 102 (S102) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V19 is set forth in SEQ ID NO: 20.

[0079] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant IL15_V20 (or IL15_C20) , which includes a first cysteine residue corresponding to position 51 (e.g., S51) of SEQ ID NO: 1, and a second cysteine residue corresponding to position 60 (H60) of SEQ ID NO: 1. The sequence of IL15_V20 is set forth in SEQ ID NO: 21.

[0080] In some embodiments, provided herein is a wildtype IL-15 without signal peptide and propeptide IL15_wt. The sequence of IL15_wt is set forth in SEQ ID NO: 1.

[0081] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-15 variant comprising one or more of the following: (a) the amino acid that corresponds to N1 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to S73 of SEQ ID NO: 1 is C; (b) the amino acid that corresponds to N1 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to L69 of SEQ ID NO: 1 is C; (c) the amino acid that corresponds to W2 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to I111 of SEQ ID NO: 1 is C; (d) the amino acid that corresponds to V5 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to L66 of SEQ ID NO: 1 is C; (e) the amino acid that corresponds to D8 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to T62 of SEQ ID NO: 1 is C; (f) the amino acid that corresponds to D8 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to L66 of SEQ ID NO: 1 is C; (g) the amino acid that corresponds to A23 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to N95 of SEQ ID NO: 1 is C; (h) the amino acid that corresponds to T24 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to E93 of SEQ ID NO: 1 is C; (i) the amino acid that corresponds to T24 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to N95 of SEQ ID NO: 1 is C; (j) the amino acid that corresponds to L25 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to E46 of SEQ ID NO: 1 is C; (k) the amino acid that corresponds to Y26 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to E89 of SEQ ID NO: 1 is C; (l) the amino acid that corresponds to Y26 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to L91 of SEQ ID NO: 1 is C; (m) the amino acid that corresponds to Y26 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to E93 of SEQ ID NO: 1 is C; (n) the amino acid that corresponds to T27 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to E92 of SEQ ID NO: 1 is C; (o) the amino acid that corresponds to T27 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to K94 of SEQ ID NO: 1 is C; (p) the amino acid that corresponds to T27 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to F99 of SEQ ID NO: 1 is C; (q) the amino acid that corresponds to E28 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to A39 of SEQ ID NO: 1 is C; (r) the amino acid that corresponds to E28 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to L91 of SEQ ID NO: 1 is C; (s) the amino acid that corresponds to S29 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to S102 of SEQ ID NO: 1 is C; and (t) the amino acid that corresponds to S51 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to H60 of SEQ ID NO: 1 is C.

[0082] In some embodiments, the engineered IL-15 variant comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 2-21, as shown in Table 1. In some embodiments, the engineered IL-15 variant described herein comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 22, wherein the amino acid sequence comprises one or more of the mutations described herein. In some embodiments, the engineered IL-15 variant described herein includes at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, or at least 5 pairs of the cysteine mutations described in Table 2.

[0083] The disclosure also provides a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding an engineered IL-15 variant comprising a sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any sequence of SEQ ID NOs: 2-21.

[0084] In some embodiments, the engineered IL-15 variant can have at least or about 1 (e.g., at least or about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40) amino acid insertions, deletions, or substitutions as compared to any one of SEQ ID NOs: 2-21.

[0085] The engineered IL-15 variant can have additional modifications. In some embodiments, the engineered IL-15 variant can have a CH2 domain and / or a CH3 domain of Fc. In some embodiments, the engineered IL-15 variant can be linked to the N-terminus of the CH2 domain (e.g., optionally through a hinge region, a GS linker, or any of the linker peptides described herein) . In some embodiments, the engineered IL-15 variant can be linked to the C-terminus of the CH3 domain (e.g., optionally through a GS linker or any of the linker peptides described herein) . In some embodiments, the hinge region is an IgG hinge region (e.g., IgG4 hinge region) . In some embodiments, the CH2 domain is an IgG CH2 domain (e.g., IgG4 CH2 domain) . In some embodiments, the CH3 domain is an IgG CH3 domain (e.g., IgG4 CH3 domain) .

[0086] In some embodiments, the engineered IL-15 variant described herein can be expressed in Expi293 or CHO (e.g., CHO-S) cells. In some embodiments, the cells are Expi293FTM cells or ExpiCHO-STM cells

[0087] IL-15 protein constructs

[0088] The disclosure provides protein constructs (e.g., fusion proteins or protein complexes) comprising the engineered IL-15 variants described herein (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) . In some embodiments, the protein constructs described herein comprise or consist of an immunocytokine.

[0089] In some embodiments, the protein construct further includes a tag (e.g., a His tag) that is fused to the engineered IL-15 variant, e.g., to facilitate screening and / or detection. In some embodiments, the His tag comprises or consists of at least 6, at least 7, or at least 8 contiguous histidine residues. In some embodiments, the His tag has a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the tag (e.g., the His tag) is connected to the N-terminus or C-terminus of any engineered IL-15 variants described herein.

[0090] In some embodiments, the protein constructs further includes a sushi domain of interleukin 15 receptor, alpha subunit (IL15Rα) . The IL-15 receptor is composed of three subunits: IL15Rα, CD122, and CD132. Two of these subunits, CD122 and CD132, are shared with the receptor for IL-2, but IL-2 receptor has an additional subunit (CD25) . The shared subunits contain the cytoplasmic motifs required for signal transduction, and this forms the basis of many overlapping biological activities of IL15 and IL2, although in vivo the two cytokines have separate biological effects. IL-15Rα specifically binds IL15 with very high affinity, and is capable of binding IL-15 independently of other subunits.

[0091] According to the UniProt Database (UniProt ID: Q13261) , human IL15Rα (SEQ ID NO: 25, NP_002180.1) is a 267 amino acid having a signal peptide that corresponds to amino acids 1-30 of SEQ ID NO: 25, an extracellular region that corresponds to amino acids 31-205 of SEQ ID NO: 25, a transmembrane region that corresponds to amino acids 206-228 of SEQ ID NO: 25, and a cytoplasmic region that corresponds to amino acids 229-267 of SEQ ID NO: 25. In particular, the sushi domain corresponds to amino acids 31-95 of SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the sushi domain described herein contains at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 additional amino acid residues in the extracellular region of human IL15Rα. In some embodiments, the additional amino acid residues correspond to any one or more of amino acids 96-107 of SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the sushi domain described herein comprises or consists of amino acids 31-107 of SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the sushi domain has a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 24. Details of the sushi domain can be found, e.g., in Orchardson, M., et al. "The Sushi domain of soluble IL-15 receptor alpha is essential for binding IL-15 and inhibiting inflammatory and allogenic responses in vitro and in vivo. "The Journal of Immunology 167.1 (2001) : 277-82, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0092] In some embodiments, the fusion proteins described herein comprise or consist of, optionally from N-terminus to C-terminus, a His tag (e.g., any of the His tags described herein) a sushi domain of IL15Rα (e.g., any of the IL15Rα sushi domains described herein) , and an engineered IL-15 variant (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) . In some embodiments, the sushi domain and the engineered IL-15 variant are connected via a linker peptide. In some embodiments, the linker peptide has a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 47 or 49. In some embodiments, the fusion proteins described herein comprise or consist of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to any one of SEQ ID NOs: 27-46.

[0093] The disclosure also provides a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a fusion protein comprising a sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any sequence of SEQ ID NOs: 27-46.

[0094] In some embodiments, the protein constructs (e.g., any of the fusion proteins or protein complexes described herein) can be expressed in Expi293 or CHO (e.g., CHO-S) cells. In some embodiments, the cells are Expi293FTM cells or ExpiCHO-STM cells.

[0095] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0096] The engineered IL-15 variants (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) and protein constructs can further comprises an Fc region of an antibody. These antibodies can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class or subclass (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE1, IgE2) . In some embodiments, the Fc region is derived from human IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4) . In some embodiments, the Fc region is an IgG4 Fc region (e.g., human IgG4 Fc region) .

[0097] In some embodiments, the engineered IL-15 variant is linked to the Fc region through an antibody hinge region (e.g., IgG, IgE hinge region) . In addition, the Fc region can be modified to provide desired effector functions or serum half-life.

[0098] In some embodiments, the protein constructs as described herein include a functional Fc region. In some embodiments, the Fc region is human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4. In some embodiments, effector function of a functional Fc region is antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) . In some embodiments, effector function of a functional Fc region is phagocytosis. In some embodiments, effector function of a functional Fc region is ADCC and phagocytosis. In some embodiments, the protein constructs as described herein have an Fc region without effector function. In some embodiments, the Fc is a human IgG4 Fc. In some embodiments, the Fc does not have a functional Fc region. For example, the Fc region has LALA mutations (L234A and L235A mutations in EU numbering) , or LALA-PG mutations (L234A, L235A, P329G mutations in EU numbering) .

[0099] In some embodiments, the engineered IL-15 variant (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) is linked to the N-terminus or C-terminus of the Fc region. In some embodiments, the engineered IL-15 variant is linked to the Fc region via a linker peptide (e.g., any of the linker peptides described herein) .

[0100] In some embodiments, provided herein are protein constructs that include, from N-terminus to C-terminus, a human IgG4 hinge region, a human IgG4 Fc region, a linker peptide (e.g., any of the linker peptides described herein) , and an engineered IL-15 variant (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) .

[0101] Some other modifications to the Fc region can be made. For example, a cysteine residue (s) can be introduced into the Fc region, thereby allowing interchain disulfide bond formation in this region. The homodimeric fusion protein thus generated may have any increased half-life in vitro and / or in vivo. In some embodiments, the IgG4 has S228P mutation (EU numbering) . The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange.

[0102] In some embodiments, Fc regions are provided having a carbohydrate structure that lacks fucose attached (directly or indirectly) to an Fc region. For example, the amount of fucose in such Fc region composition may be from 1%to 80%, from 1%to 65%, from 5%to 65%or from 20%to 40%. The amount of fucose is determined by calculating the average amount of fucose within the sugar chain at Asn297, relative to the sum of all glycostructures attached to Asn297 (e.g. complex, hybrid and high mannose structures) as measured by MALDI-TOF mass spectrometry, as described in WO 2008 / 077546, for example. Asn297 refers to the asparagine residue located at about position 297 in the Fc region (EU numbering of Fc region residues; or position 314 in Kabat numbering) ; however, Asn297 may also be located about ±3 amino acids upstream or downstream of position 297, i.e., between positions 294 and 300, due to minor sequence variations in Fc region sequences. Such fucosylation variants may have improved ADCC function. In some embodiments, to reduce glycan heterogeneity, the Fc region can be further engineered to replace the Asparagine at position 297 with Alanine (N297A) .

[0103] In some embodiments, the disclosure is related to a protein construct comprising the engineered IL-15 variant described herein. In some embodiments, the protein construct comprises two or more engineered IL-15 variants. In some embodiments, at least two of the engineered IL-15 variants are identical. In some embodiments, at least two of the engineered IL-15 variants are different. In some embodiments, the protein construct further comprises an Fc region. In some embodiments, the Fc region is an IgG4 Fc region. In some embodiments, the Fc region is an IgG1 Fc region (e.g., with LALA mutations or LALA-PG mutations) . In some embodiments, the engineered IL-15 variant is linked to the C-terminus of the Fc region. In some embodiments, the engineered IL-15 variant is linked to the C-terminus of the Fc region via a linker peptide (e.g., any of the linker peptides described herein) .

[0104] The disclosure provides protein complexes comprising the engineered IL-15 variants described herein (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) . In some embodiments, the disclosure is related to a protein complex comprising a first polypeptide and a second polypeptide. In some embodiments, the first polypeptide comprises or consists of, optionally from N-terminus to C-terminus: an optional first hinge region (e.g., a human IgG4 hinge region) , a first Fc region (e.g., a human IgG4 Fc region) , an optional linker peptide (e.g., any of the linker peptides described herein) , and an engineered IL-15 variant (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) . In some embodiments, the second polypeptide comprises or consists of, optionally from N-terminus to C-terminus: an optional second hinge region (e.g., a human IgG4 hinge region) , and a second Fc region (e.g., a human IgG4 Fc region) . In some embodiments, the first Fc region and / or the second Fc region described herein do not include a hinge region. In some embodiments, the first Fc region and / or the second Fc region described herein consists of a CH2 domain (e.g., a human IgG4 CH2 domain) and a CH3 domain (e.g., a human IgG4 CH3 domain) .

[0105] In some embodiments, the first and / or the second hinge regions include all or a portion of the hinge region of an immunoglobulin, e.g., human IgG4 hinge region. In some embodiments, the first and the second hinge regions are identical. In some embodiments, the first and the second hinge regions are different.

[0106] In some embodiments, the first and / or the second Fc region are different. In some embodiments, the first and / or the second Fc regions can form a Fc heterodimer by introducing one or more mutations. In some cases, the first and / or the second Fc region can include one or more knob-into-hole (KIH) mutations. For example, the first Fc region can include a cysteine at position 349, a serine at position 366, an alanine at position 368, and / or a valine at position 407 according to EU numbering; and the second Fc region can include a cysteine at position 354 and / or a tryptophan at position 366 according to EU numbering. In some embodiments, the first and / or the second Fc region can form a Fc heterodimer using other technologies. Details of the KIH mutations and other heterodimeric Fc technologies can be found, e.g., in Ha, et al. "Immunoglobulin Fc heterodimer platform technology: from design to applications in therapeutic antibodies and proteins. "Frontiers In Immunology 7 (2016) : 394, which is incorporated herein by reference in its entirety. In some embodiments, the first and / or the second Fc regions described herein are derived from human IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4) . In some embodiments, the first and / or second Fc regions are IgG4 Fc regions (e.g., human IgG4 Fc regions) . In some embodiments, the first and / or second Fc regions are IgG Fc regions (e.g., human IgG1 Fc regions) whose effector function is silenced. Details of methods to modulate Fc effector functions can be found, e.g., in Liu, R., et al. "Fc-engineering for modulated effector functions -improving antibodies for cancer treatment. "Antibodies. 2020; 9: 64; and Saunders, K. O. "Conceptual approaches to modulating antibody effector functions and circulation half-life. Front Immunol 10: 1296. " (2019) ; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0107] In some embodiments, the hole chain described herein includes a cysteine at position 349, a serine at position 366, an alanine at position 368, and / or a valine at position 407 according to EU numbering. In some embodiments, the knob chain described herein includes a cysteine at position 354 and / or a tryptophan at position 366 according to EU numbering. In some embodiments, the KIH mutations described herein include any of the mutations at the positions described above.

[0108] In some embodiments, the linker peptide described herein includes an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to one or more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8) repeats of GGGGS (SEQ ID NO: 48) . In some embodiments, the linker peptide is a GS linker. As used herein, the term “GS linker” refers to a linker having sequences comprising primarily of glycine and serine residues. In some embodiments, the GS linker consists of glycine and serine residues. In some embodiments, the linker peptide is a flexible linker. Details of flexible linkers can be found, e.g., Chen, X., et al. "Fusion protein linkers: property, design and functionality. "Advanced Drug Delivery Reviews 65.10 (2013) : 1357-1369, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0109] In some embodiments, provided herein is a protein complex with a heterodimeric structure.

[0110] In some embodiments, the disclosure is related to a protein complex comprising a first polypeptide and a second polypeptide. In some embodiments, the first polypeptide comprises or consists of, optionally from N-terminus to C-terminus: an optional first hinge region (e.g., a human IgG4 hinge region) , and a first Fc region (e.g., a human IgG4 Fc region) . In some embodiments, the second polypeptide comprises or consists of, optionally from N-terminus to C-terminus: an optional second hinge region (e.g., a human IgG4 hinge region) , a second Fc region (e.g., a human IgG4 Fc region) , an optional linker peptide (e.g., any of the linker peptides described herein) , and an engineered IL-15 variant (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) . In some embodiments, the first Fc region includes a cysteine at position 349, a serine at position 366, an alanine at position 368, and / or a valine at position 407 according to EU numbering; and the second Fc region includes a cysteine at position 354 and / or a tryptophan at position 366 according to EU numbering.

[0111] In some embodiments, the disclosure is related to a protein complex comprising a first polypeptide and a second polypeptide. In some embodiments, the first polypeptide comprises or consists of, optionally from N-terminus to C-terminus: an optional first hinge region (e.g., a human IgG4 hinge region) , a first Fc region (e.g., a human IgG4 Fc region) , an optional first linker peptide (e.g., any of the linker peptides described herein) , and a first engineered IL-15 variant (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) . In some embodiments, the second polypeptide comprises or consists of, optionally from N-terminus to C-terminus: an optional second hinge region (e.g., a human IgG4 hinge region) , a second Fc region (e.g., a human IgG4 Fc region) , an optional second linker peptide (e.g., any of the linker peptides described herein) , and a second engineered IL-15 variant (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) . In some embodiments, the first Fc region includes a cysteine at position 349, a serine at position 366, an alanine at position 368, and / or a valine at position 407 according to EU numbering; and the second Fc region includes a cysteine at position 354 and / or a tryptophan at position 366 according to EU numbering. In some embodiments, the first and / or second engineered IL-15 variants are identical. In some embodiments, the first and / or second engineered IL-15 variants are identical are different.

[0112] In some embodiments, the disclosure provides protein complexes having a Fc homodimer structure. In some embodiments, the disclosure is related to a protein complex comprising two identical polypeptides. In some embodiments, each polypeptide comprises or consists of, optionally from N-terminus to C-terminus: an optional hinge region (e.g., a human IgG4 hinge region) , a Fc region (e.g., a human IgG4 Fc region) , an optional linker peptide (e.g., any of the linker peptides described herein) , and an engineered IL-15 variant (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) .

[0113] Without wishing to be bound by theory, it is hypothesized that the protein complexes with a Fc heterodimer structure may exhibit a higher in vitro potency (e.g., induction of IL-15 / IL-15 receptor signaling pathways and / or induction of immune cell proliferation) and / or a higher in vivo efficacy (e.g., anti-tumor efficacy) than the corresponding protein complexes with a Fc homodimer structure described herein. This can be attributed to the spatial hindrance when the two engineered IL-15 variants (e.g., connected to the C-terminus of the Fc region of the protein complexes) simultaneously interact with the CD122 / CD132 complex.

[0114] Characterization of the engineered IL-15 variants or protein constructs

[0115] In some embodiments, the engineered IL-15 variants (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) or protein constructs (e.g., fusion proteins or protein complexes) thereof described herein can bind to a complex formed by human IL2Rβ (CD122) and common cytokine γ chain (γc, or CD132) . Because the newly introduced non-native disulfide bond can stabilize IL-15 (e.g., the core structure formed by the four-helical bundle) without causing substantial conformational changes of the protein structure, and the residues critical for CD122 / CD132 binding are unmutated, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof can induce downstream signaling pathways, e.g., the JAK / STAT pathway, by binding to the CD122 / CD132 complex expressed on immune cells (e.g., human PBMCs) .

[0116] In some embodiments, introduction of the non-native disulfide bond, or cysteine mutations (e.g., any of the cysteine mutations described herein) can lead to protein conformational change with a RMSD (root-mean-square deviation of atomic positions) value of less than less than less than less than less than less than less than less than less than or less than In some embodiments, the RMSD value is calculated by structurally align the wild-type protein and the protein variants. In some embodiments, only Calpha atoms are used for determining the conformational change.

[0117] In some embodiments, the engineered IL-15 variants (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) or protein constructs thereof described herein (e.g., any of the H8-sushi-IL15_wt or its variants described herein) have a high potency, a medium potency, or a low potency to induce IL-15 / IL-15R signaling pathways. In some embodiments, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof can induce IL-15 / IL-15R signaling pathways (e.g., activation of the JAK / STAT pathway) with a high potency that is at least about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, or about 120%as compared to that of a wildtype IL-15 or protein construct thereof. In some embodiments, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof can induce IL-15 / IL-15R signaling pathways (e.g., activation of the JAK / STAT pathway) with a medium potency that is at least about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, or about 100%as compared to that of a wildtype IL-15 or protein construct thereof. In some embodiments, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof can induce IL-15 / IL-15R signaling pathways (e.g., activation of the JAK / STAT pathway) with a low potency that is less than about 50%, about 40%, about 40%, about 20%, or about 10%as compared to that of a wildtype IL-15 or protein construct thereof.

[0118] In some embodiments, the engineered IL-15 variants (e.g., any of the engineered IL-15 variants described herein) or protein constructs thereof described herein (e.g., any of the H8-sushi-IL15_wt or its variants described herein) have a high potency, a medium potency, or a low potency to induce proliferation of immune cells (e.g., human PBMCs) . In some embodiments, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof can induce proliferation of immune cells (e.g., human PBMCs) with a high potency that is at least about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, or about 120%as compared to that of a wildtype IL-15 or protein construct thereof. In some embodiments, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof can induce proliferation of immune cells (e.g., human PBMCs) with a medium potency that is at least about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, or about 100%as compared to that of a wildtype IL-15 or protein construct thereof. In some embodiments, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof can induce proliferation of immune cells (e.g., human PBMCs) with a low potency that is less than about 50%, about 40%, about 40%, about 20%, or about 10%as compared to that of a wildtype IL-15 or protein construct thereof.

[0119] In some embodiments, the engineered IL-15 variants described herein includes an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 1-21 (e.g., SEQ ID NO: 21) . In some embodiments, the protein constructs (e.g., any of the H8-sushi-IL15_wt or its variants) described herein includes an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 26-46 (e.g., SEQ ID NO: 46) .

[0120] In some embodiments, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof as described herein can increase immune response, activity or number of immune cells (e.g., primary T cells) by at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 folds, 3 folds, 5 folds, 10 folds, or 20 folds.

[0121] In some implementations, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof can bind to CD122, CD132, or the complex thereof (e.g., human or mouse CD122 / CD132 complex) with a dissociation rate (koff) of less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.00001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.00001 s-1, or greater than 0.000001 s-1.

[0122] In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 × 102 / Ms, greater than 1 × 103 / Ms, greater than 1 × 104 / Ms, greater than 1 × 105 / Ms, or greater than 1 ×106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 × 105 / Ms, less than 1 × 106 / Ms, or less than 1 × 107 / Ms.

[0123] Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 × 10-6 M, less than 1 × 10-7 M, less than 1 × 10-8 M, less than 1 × 10-9 M, or less than 1 × 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 300 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, or 10 pM. In some embodiments, KD is greater than 1 × 10-7 M, greater than 1 × 10-8 M, greater than 1 × 10-9 M, greater than 1 × 10-10 M, greater than 1 × 10-11 M, or greater than 1 × 10-12 M.

[0124] General techniques for measuring the affinity include, e.g., ELISA, radioimmunoassay (RIA) , and surface plasmon resonance (SPR) . In some embodiments, the affinity is determined by cell-based assays.

[0125] In some embodiments, the engineered IL-15 protein constructs thereof described herein (e.g., any of the H8-sushi-IL15_wt or its variants described herein) can be expressed and purified by methods commonly used in the art, e.g., affinity chromatography. In some cases, the protein constructs can be purified by size-exclusive chromatography (SEC) coupled with HPLC. In some embodiments, the percentage of the main peak in the SEC-HPLC analysis result is at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%. In some embodiments, the percentage of high molecular weight peak (HMW%) and / or low molecular weight peak (LMW%) is less than 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2%, or less than 1%.

[0126] In some embodiments, thermal stabilities of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein (e.g., any of the H8-sushi-IL15_wt or its variants described herein) are determined. The engineered IL-15 variants and protein constructs thereof described herein can have a Tm1, Tm2, or Tm3 greater than 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, Tm1, Tm2, or Tm3 is less than 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, the melting temperature (Tm) of the engineered IL-15 variants and protein constructs thereof described herein can be measured by application on a heat ramp (e.g., from 20-95℃) based on differential scanning fluorimetry (DSF) . DSF is a commonly used method for measuring protein thermal shifts that utilizes specialized fluorogenic dyes. With the increase of temperature, the sample will gradually unfold. The unfolded portion of the sample can bind to a specialized fluorogenic dye and emit fluorescence signals for determination of Tm. Thus, the melting temperature (Tm) is considered a key predictor of stability. In some embodiments, the Tm (e.g., Tm2, Tm2, or Tm3) of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein is at least 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃.

[0127] The Tm values (e.g., Tm1, Tm2, and Tm3) were determined from the maximum of the first derivatives of the sigmoidal thermal unfolding profiles using the instrument software. Tm1, Tm2 and Tm3 were assigned to the peaks corresponding to the first, second, and third transitions, respectively. Details of Tm measurement can be found, e.g., in Niedziela-Majka, A., et al. "High-throughput screening of formulations to optimize the thermal stability of a therapeutic monoclonal antibody. "Journal of Biomolecular Screening 20.4 (2015) : 552-559, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0128] In some embodiments, the cysteine mutations (e.g., any of the cysteine mutations or a combination thereof described herein) can increase the melting temperature (Tm1, Tm2, or Tm3) of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein by at least 0.5℃, at least 1℃, at least 1.5℃, at least 2℃, at least 2.5℃, at least 3℃, at least 3.5℃, at least 4℃, at least 4.5℃, at least 5℃, at least 5.5℃, at least 6℃, at least 6.5℃, at least 7℃, at least 7.5℃, at least 8℃, at least 8.5℃, at least 9℃, at least 9.5℃, at least 10℃, at least 10.5℃, at least 11℃, at least 11.5℃, at least 12℃, at least 12.5℃, at least 13℃, at least 13.5℃, at least 14℃, at least 14.5℃, or at least 15℃.

[0129] In some embodiments, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein (e.g., any of the H8-sushi-IL15_wt or its variants described herein) can inhibit tumor growth, e.g., when administered in a tumor-bearing animal. In some cases, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof has a tumor growth inhibition percentage (TGI%) that is greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200%. In some embodiments, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein has a tumor growth inhibition percentage that is less than 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200%. The TGI%can be determined, e.g., at 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 days after the treatment starts. As used herein, the tumor growth inhibition percentage (TGI%) is calculated using the following formula:

[0130] TGI (%) = [1-Mean (Tfinal-Tinitial)  / Mean (Cfinal-Cinitial) ] ×100

[0131] Tfinal is the average tumor volume in the treatment group on the final day. Tinitial is the average tumor volume in the treatment group on Day 0. Cfinal is the average tumor volume in the control group on the final day. Cinitial is the average tumor volume in the control group on Day 0.

[0132] In some embodiments, the TGI%of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein is at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, at least 150%, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, or at least 10-fold greater that of a wildtype IL-15 or protein construct thereof.

[0133] In some embodiments, the percentage of tumor-bearing mice treated with the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein (e.g., any of the H8-sushi-IL15_wt or its variants described herein) having a tumor volume that is less than half the value of the mean tumor volume of the control tumor-bearing mice (e.g., mice treated with vehicle) is at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%after 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or 25 days of tumor inoculation, relative to the total number of surviving mice on the same day.

[0134] In some embodiments, the survival rate of tumor-bearing mice after treatment of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein (e.g., any of the H8-sushi-IL15_wt or its variants described herein) is at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%after 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or 25 days of tumor inoculation.

[0135] In some embodiments, the body weight of tumor-bearing mice after treatment of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein (e.g., any of the H8-sushi-IL15_wt or its variants described herein) is at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%as compared to that of tumor-bearing mice after treatment of a wildtype IL-15 or protein construct thereof.

[0136] In some embodiments, the half-life of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein (e.g., any of the H8-sushi-IL15_wt or its variants described herein) can be increased by at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 1-fold, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, or at least 100-fold, as compared to that of a wildtype IL-15 or protein construct thereof. In some embodiments, the half-life is determined by measuring the in vivo concentration of the molecule over time, after administration into a subject.

[0137] Methods of making engineered IL-15 variants and protein constructs

[0138] The engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the DNA encoding a IL-15 peptide or a part thereof or by peptide synthesis. Such variants include, for example, deletions, insertions, or substitutions of residues within the amino acids sequences. In some embodiments, selective cysteine mutations can be introduced to one or more pairs of residues whose Calpha atoms are within  angstroms of a 3D structure of human IL-15. In some embodiments, the 3D structure of human IL-15 has a PDB (protein data bank) ID of 4GS7.

[0139] The engineered IL-15 variants were fused with an N-terminal His tag and a sushi domain of IL15Rα to generate H8-sushi-IL15 variants (e.g., any of the H8-sushi-IL15 variants described herein) . The potency of the H8-sushi-IL15 variants on T cell response can be determined by detecting activation of the JAK / STAT pathway and / or induction of human PBMC proliferation. Based on the experimental results above, some of the H8-sushi-IL15 variants with a good expression / purification profile and a medium to high T cell response potency can be selected for subsequent experiments.

[0140] Screening of the H8-sushi-IL15 variants can also be performed by measuring their stability. For example, some H8-sushi-IL15 variants may have an increased melting temperature (Tm1, Tm2, or Tm3) determined by DSF as compared to that of a wildtype IL-15 or protein construct thereof.

[0141] In some embodiments, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof (e.g., any of the H8-sushi-IL15 variants described herein) may have a comparable affinity for the CD122 / CD132 complex (e.g., human CD122 / CD132 complex) as compared to that of a wildtype IL-15 or protein construct thereof. Any combination of deletions, insertions, and / or combinations can be made to arrive at a variant that has increased binding affinity for the binding partner (e.g., CD122 / CD132 complex) . The amino acid changes introduced into the variant can also alter or introduce new post-translational modifications into the polypeptide, such as changing (e.g., increasing or decreasing) the number of glycosylation sites, changing the type of glycosylation site (e.g., changing the amino acid sequence such that a different sugar is attached by enzymes present in a cell) , or introducing new glycosylation sites. In some embodiments, the binding affinity of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof (e.g., any of the H8-sushi-IL15 variants described herein) binding to human CD122 / CD132 complex is at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%as compared to that of a wildtype IL-15 or protein construct thereof. In some embodiments, the binding affinity of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof (e.g., any of the H8-sushi-IL15 variants described herein) binding to human CD122 / CD132 complex is less than 100%, less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, or less than 10%as compared to that of a wildtype IL-15 or protein construct thereof.

[0142] In some embodiments, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof (e.g., any of the H8-sushi-IL15 variants described herein) may have a comparable affinity binding to the mouse CD122 / CD132 complex (e.g., human CD122 / CD132 complex) as compared to that when binding to human CD122 / CD132 complex. In some embodiments, the affinity of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof (e.g., any of the H8-sushi-IL15 variants described herein) binding to mouse CD122 / CD132 complex is at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%as compared to that when binding to human CD122 / CD132 complex. In some embodiments, the affinity of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof (e.g., any of the H8-sushi-IL15 variants described herein) binding to mouse CD122 / CD132 complex is less than 100%, less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, or less than 10%as compared to that when binding to human CD122 / CD132 complex.

[0143] In some embodiments, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof (e.g., any of the H8-sushi-IL15 variants described herein) may have comparable affinities for the CD122 / CD132 complex (e.g., human) at a neutral pH (e.g., pH 7.5) and an acidic pH (pH 6.0) . In some embodiments, the neutral pH described herein is at about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1, about 7.2, about 7.3, about 7.4, about 7.5, about 7.6, about 7.7, about 7.8, about 7.9, or about 8.0. In some embodiments, the neutral pH described herein is about 6.5 to about 8.0, about 6.5 to about 7.5, about 6.5 to about 7.0, about 7.0 to about 8.0, about 7.0 to about 7.5, or about 7.5 to about 8.0. In some embodiments, the acidic pH described herein is about 5.0 to about 6.4, about 5.0 to about 6.0, about 5.0 to about 5.5, about 5.5 to about 6.4, about 5.5 to about 6.0, or about 6.0 to about 6.4. In some embodiments, the acidic pH described herein is about 5.0, about 5.1, about 5.2, about 5.3, about 5.4, about 5.5, about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, or about 6.4. In some embodiments, the binding affinity of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof (e.g., any of the H8-sushi-IL15 variants described herein) at an acidic pH is at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%as compared to that at a neutral pH. In some embodiments, the binding affinity of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof (e.g., any of the H8-sushi-IL15 variants described herein) at an acidic pH is less than 100%, less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, or less than 10%as compared to that at a neutral pH.

[0144] Engineered IL-15 variants can be derived from any species of animal, including mammals. Non-limiting examples of IL-15 variants include IL-15 variants derived from humans, primates, e.g., monkeys and apes, cows, pigs, horses, sheep, camelids (e.g., camels and llamas) , chicken, goats, and rodents (e.g., rats, mice, hamsters and rabbits) .

[0145] The present disclosure also provides recombinant vectors (e.g., an expression vectors) that include an isolated polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) , host cells into which are introduced the recombinant vectors (i.e., such that the host cells contain the polynucleotide and / or a vector comprising the polynucleotide) , and the production of recombinant polypeptides or fragments thereof by recombinant techniques.

[0146] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more polynucleotide (s) of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more polynucleotide (s) of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-A tail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector.

[0147] A vector can be introduced into the host cell by methods known in the art, e.g., electroporation, chemical transfection (e.g., DEAE-dextran) , transformation, transfection, and infection and / or transduction (e.g., with recombinant virus) . Thus, non-limiting examples of vectors include viral vectors (which can be used to generate recombinant virus) , naked DNA or RNA, plasmids, cosmids, phage vectors, and DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents.

[0148] In some implementations, a polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) is introduced using a viral expression system (e.g., vaccinia or other pox virus, retrovirus, or adenovirus) , which may involve the use of a non-pathogenic (defective) , replication competent virus, or may use a replication defective virus. Techniques for incorporating DNA into such expression systems are well known to those of ordinary skill in the art. The DNA may also be “naked. ” The uptake of naked DNA may be increased by coating the DNA onto biodegradable beads that are efficiently transported into the cells.

[0149] For expression, the DNA insert comprising a polypeptide-encoding polynucleotide disclosed herein can be operatively linked to an appropriate promoter (e.g., a heterologous promoter) , such as the phage lambda PL promoter, the E. coli lac, trp and tac promoters, the SV40 early and late promoters and promoters of retroviral LTRs, to name a few. Other suitable promoters are known to the skilled artisan. In some embodiments, the promoter is a cytomegalovirus (CMV) promoter. In some embodiments, the promoter is a human promoter, e.g., uHS or HS promoter. The human promoters can improve expression of proteins derived from human. Details of such human promoters can be found, e.g., in Antoniou, M., et al. "Transgenes encompassing dual-promoter CpG islands from the human TBP and HNRPA2B1 loci are resistant to heterochromatin-mediated silencing. "Genomics 82.3 (2003) : 269-279; and Zhang, F., et al. "Aubiquitous chromatin opening element (UCOE) confers resistance to DNA methylation–mediated silencing of lentiviral vectors. "Molecular Therapy 18.9 (2010) : 1640-1649; each of which is incorporated herein by reference in its entirety. The expression constructs can further contain sites for transcription initiation, termination and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the mature transcripts expressed by the constructs may include a translation initiating at the beginning and a termination codon (UAA, UGA, or UAG) appropriately positioned at the end of the polypeptide to be translated.

[0150] As indicated, the expression vectors can include at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture and tetracycline or ampicillin resistance genes for culturing in E. coli and other bacteria. Representative examples of appropriate hosts include, but are not limited to, bacterial cells, such as E. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium cells; fungal cells, such as yeast cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells such as CHO, COS, Bowes melanoma, and HEK 293 cells; and plant cells. Appropriate culture mediums and conditions for the host cells described herein are known in the art.

[0151] Non-limiting vectors for use in bacteria include pQE70, pQE60 and pQE-9, available from Qiagen; pBS vectors, Phagescript vectors, Bluescript vectors, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, available from Stratagene; and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 available from Pharmacia. Non-limiting eukaryotic vectors include pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG available from Stratagene; and pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL available from Pharmacia. Other suitable vectors will be readily apparent to the skilled artisan.

[0152] Non-limiting bacterial promoters suitable for use include the E. coli lacI and lacZ promoters, the T3 and T7 promoters, the gpt promoter, the lambda PR and PL promoters and the trp promoter. Suitable eukaryotic promoters include the CMV immediate early promoter, the HSV thymidine kinase promoter, the early and late SV40 promoters, the promoters of retroviral LTRs, such as those of the Rous sarcoma virus (RSV) , and metallothionein promoters, such as the mouse metallothionein-I promoter.

[0153] In the yeast Saccharomyces cerevisiae, a number of vectors containing constitutive or inducible promoters such as alpha factor, alcohol oxidase, and PGH can be used.

[0154] Introduction of the construct into the host cell can be affected by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals, such as Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) , which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0155] In some embodiments, the host cell is a human cell suitable for protein expression, e.g., HEK293 cells or CHO cells (e.g., CHO-Scells) . In some embodiments, the host cells are Expi293 cells. The Expi293 Expression System is designed to deliver up to 6× more protein in just one week, compared with other transient 293 expression systems that can take two weeks or more. This is in part due to the fact that Expi293F cells are adapted to achieve higher pg / cell / day productivity than standard HEK 293 cells, and the Expifectamine 293 Transfection Reagent and enhancers enable high-efficiency transfection and expression levels of high-density HEK 293 cultures. Additionally, the Expi293 Expression System requires less plasticware, which means less waste and more incubator space.

[0156] Transcription of DNA encoding a polypeptide of the present disclosure by higher eukaryotes may be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about from 10 to 300 bp that act to increase transcriptional activity of a promoter in a given host cell-type. Examples of enhancers include the SV40 enhancer, which is located on the late side of the replication origin at base pairs 100 to 270, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers.

[0157] For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space or into the extracellular environment, appropriate secretion signals may be incorporated into the expressed polypeptide. The signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous signals.

[0158] The polypeptide (e.g., engineered IL-15 variants) can be expressed in a modified form, such as a fusion protein (e.g., a HSA-fusion or GST-fusion) or with a histidine-tag, and may include not only secretion signals, but also additional heterologous functional regions. For instance, a region of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be added to the N-terminus of the polypeptide to improve stability and persistence in the host cell, during purification, or during subsequent handling and storage. Also, peptide moieties can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. The addition of peptide moieties to polypeptides to engender secretion or excretion, to improve stability and to facilitate purification, among others, are familiar and routine techniques in the art.

[0159] Methods of treatment

[0160] The engineered IL-15 variants and protein constructs thereof of the present disclosure can be used for various therapeutic purposes.

[0161] In one aspect, the disclosure provides methods for treating a cancer in a subject, methods of reducing the rate of the increase of volume of a tumor in a subject over time, methods of reducing the risk of developing a metastasis, or methods of reducing the risk of developing an additional metastasis in a subject. In some embodiments, the treatment can halt, slow, retard, or inhibit progression of a cancer. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of in the number, severity, and / or duration of one or more symptoms of the cancer in a subject.

[0162] In one aspect, the disclosure features methods that include administering a therapeutically effective amount of engineered IL-15 variants and protein constructs disclosed herein to a subject in need thereof (e.g., a subject having, or identified or diagnosed as having, a cancer) , e.g., breast cancer (e.g., triple-negative breast cancer) , carcinoid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, renal cancer, colorectal cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, urethral cancer, stomach cancer, urothelial cancer, skin cancer, or hematologic malignancy. In some embodiments, the cancer is unresectable melanoma or metastatic melanoma, non-small cell lung carcinoma (NSCLC) , small cell lung cancer (SCLC) , bladder cancer, or metastatic hormone-refractory prostate cancer. In some embodiments, the subject has a solid tumor. In some embodiments, the cancer is squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN) , renal cell carcinoma (RCC) , triple-negative breast cancer (TNBC) , or colorectal carcinoma. In some embodiments, the subject has Hodgkin's lymphoma. In some embodiments, the subject has triple-negative breast cancer (TNBC) , gastric cancer, urothelial cancer, Merkel-cell carcinoma, or head and neck cancer.

[0163] In some embodiments, the cancer described herein is melanoma, head and neck cancer, colorectal cancer, lymphoma, leukemia, bladder cancer, multiple myeloma, pancreatic cancer, gastric cancer, or lung cancer. In some embodiments, the lymphoma is Non-Hodgkin’s lymphoma.

[0164] In some embodiments, the compositions and methods disclosed herein can be used for treatment of patients at risk for a cancer. Patients with cancer can be identified with various methods known in the art.

[0165] As used herein, by an “effective amount” is meant an amount or dosage sufficient to effect beneficial or desired results including halting, slowing, retarding, or inhibiting progression of a disease, e.g., a cancer. An effective amount will vary depending upon, e.g., an age and a body weight of a subject to which the engineered IL-15 variants and protein constructs, vector comprising the polynucleotide encoding the engineered IL-15 variants and protein constructs, and / or compositions thereof is to be administered, a severity of symptoms and a route of administration, and thus administration can be determined on an individual basis.

[0166] An effective amount can be administered in one or more administrations. By way of example, an effective amount of the engineered IL-15 variants and / or protein constructs is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, inhibit, slow and / or delay progression of a cancer in a patient or is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, slow and / or delay proliferation of a cell (e.g., a biopsied cell, any of the cancer cells described herein, or cell line (e.g., a cancer cell line) ) in vitro. As is understood in the art, an effective amount may vary, depending on, inter alia, patient history as well as other factors such as the type (and / or dosage) of the engineered IL-15 variants and protein constructs used.

[0167] Effective amounts and schedules for administering the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof, the polynucleotides encoding the engineered IL-15 variants or protein constructs, and / or compositions disclosed herein may be determined empirically, and making such determinations is within the skill in the art. Those skilled in the art will understand that the dosage that must be administered will vary depending on, for example, the mammal that will receive the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof, the polynucleotides, and / or compositions disclosed herein, the route of administration, the particular type of polynucleotides, and / or compositions disclosed herein used and other drugs being administered to the mammal.

[0168] A typical daily dosage of an effective amount of the engineered IL-15 variants and / or protein constructs is 0.1 mg / kg to 100 mg / kg (mg per kg of patient weight) . In some embodiments, the dosage can be less than 100 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be greater than 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, or 1 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about 1 to 10 mg / kg, about 1 to 5 mg / kg, or about 2 to 5 mg / kg.

[0169] In any of the methods described herein, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof can be administered to the subject at least once a week (e.g., once a week, twice a week, three times a week, four times a week, once a day, twice a day, or three times a day) .

[0170] In some embodiments, the one or more additional therapeutic agents can be administered to the subject prior to, or after administering the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof. In some embodiments, the one or more additional therapeutic agents are administered to the subject such that there is an overlap in the bioactive period of the one or more additional therapeutic agents and the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof in the subject.

[0171] Pharmaceutical compositions and routes of administration

[0172] Also provided herein are pharmaceutical compositions that contain the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein. The pharmaceutical compositions can be formulated in any manner known in the art.

[0173] Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) . The compositions can include a sterile diluent (e.g., sterile water or saline) , a fixed oil, polyethylene glycol, glycerine, propylene glycol or other synthetic solvents, antibacterial or antifungal agents, such as benzyl alcohol or methyl parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like, antioxidants, such as ascorbic acid or sodium bisulfite, chelating agents, such as ethylenediaminetetraacetic acid, buffers, such as acetates, citrates, or phosphates, and isotonic agents, such as sugars (e.g., dextrose) , polyalcohols (e.g., mannitol or sorbitol) , or salts (e.g., sodium chloride) , or any combination thereof. Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. Preparations of the compositions can be formulated and enclosed in ampules, disposable syringes, or multiple dose vials. Where required (as in, for example, injectable formulations) , proper fluidity can be maintained by, for example, the use of a coating, such as lecithin, or a surfactant. Absorption of the agents can be prolonged by including an agent that delays absorption (e.g., aluminum monostearate and gelatin) . Alternatively, controlled release can be achieved by implants and microencapsulated delivery systems, which can include biodegradable, biocompatible polymers (e.g., ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid) .

[0174] Compositions containing the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein can be formulated for parenteral (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in dosage unit form (i.e., physically discrete units containing a predetermined quantity of active compound for ease of administration and uniformity of dosage) .

[0175] Pharmaceutical compositions for parenteral administration are preferably sterile and substantially isotonic and manufactured under Good Manufacturing Practice (GMP) conditions. Pharmaceutical compositions can be provided in unit dosage form (i.e., the dosage for a single administration) . Pharmaceutical compositions can be formulated using one or more physiologically acceptable carriers, diluents, excipients or auxiliaries. The formulation depends on the route of administration chosen. For injection, the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof can be formulated in aqueous solutions, preferably in physiologically-compatible buffers to reduce discomfort at the site of injection. The solution can contain formulatory agents such as suspending, stabilizing and / or dispersing agents. Alternatively the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof can be in lyophilized form for constitution with a suitable vehicle, e.g., sterile pyrogen-free water, before use.

[0176] Toxicity and therapeutic efficacy of compositions can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals (e.g., monkeys) . One can, for example, determine the LD50 (the dose lethal to 50%of the population) and the ED50 (the dose therapeutically effective in 50%of the population) : the therapeutic index being the ratio of LD50: ED50. Agents that exhibit high therapeutic indices are preferred. Where an agent exhibits an undesirable side effect, care should be taken to minimize potential damage (i.e., reduce unwanted side effects) . Toxicity and therapeutic efficacy can be determined by other standard pharmaceutical procedures.

[0177] Exemplary doses include milligram or microgram amounts of any of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof described herein per kilogram of the subject’s weight (e.g., about 1 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 50 mg / kg; about 10 μg / kg to about 5 mg / kg; about 10 μg / kg to about 0.5 mg / kg; about 1 μg / kg to about 50 μg / kg; about 1 mg / kg to about 10 mg / kg; or about 1 mg / kg to about 5 mg / kg) . While these doses cover a broad range, one of ordinary skill in the art will understand that therapeutic agents can vary in their potency, and effective amounts can be determined by methods known in the art. Typically, relatively low doses are administered at first, and the attending health care professional or veterinary professional (in the case of therapeutic application) or a researcher (when still working at the development stage) can subsequently and gradually increase the dose until an appropriate response is obtained. In addition, it is understood that the specific dose level for any particular subject will depend upon a variety of factors including the activity of the specific compound employed, the age, body weight, general health, gender, and diet of the subject, the time of administration, the route of administration, the rate of excretion, and the half-life of the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof in vivo.

[0178] The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration. The disclosure also provides methods of manufacturing the engineered IL-15 variants or protein constructs thereof for various uses as described herein.

[0179] Methods of engineering cytokines

[0180] Provided herein are methods of improving the properties (e.g., stability, activity or affinity) of a protein (e.g., a cytokine) , comprising one or more of the following steps: (a) providing a 3D structure of the protein (e.g., the cytokine) , (b) measuring distance of the Calpha atoms of one or more of amino acid residues in the 3D structure; and (c) selecting two amino acid residues from the one or more amino acid residues, wherein the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are within In some embodiments, the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are within e.g., about or In some embodiments, the directionality from Calpha to Cbeta atoms of the two selected amino acid residues are in favor of forming a non-native disulfide bond. For example, the Cbeta atoms point to a direction (from Calpha to Cbeta) that is possible to form a disulfide bond. In some cases, the angel between the direction of the Cbeta atom of the first selected amino acid residue (from Calpha to Cbeta of the first selected amino acid residue) and the direction of the Cbeta atom of the second selected amino acid residue (from Calpha to Cbeta of the second selected amino acid residue) is less than 120 degrees. In some cases, the Cbeta atoms dot not point away from each other. In some embodiments, the 3D structure of the protein (e.g., the cytokine) is derived from a PDB structure of the protein (e.g., the cytokine) , a fragment thereof, or a complex of the protein (e.g., the cytokine) bound with its binding partner (s) . In some embodiments, the spatial coordinates of all atoms of the 3D structure can be loaded to a software (e.g., a software for modeling and simulation) , and the distance of any two atoms in the 3D structure can be determined.

[0181] In some embodiments, the angel between the direction of the Cbeta atom of the first selected amino acid residue and the direction of the Cbeta atom of the second selected amino acid residue is less than 120 degrees, e.g., less than 120, 119, 118, 117, 116, 115, 114, 113, 112, 111, 110, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 degree.

[0182] In some embodiments, the distance of the Calpha atoms of the two selected amino acid residues described herein is about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3.5 to about about 3.5 to about about 3.5 to about about 3.5 to about about 3.5 to about about 3.5 to about about 3.5 to about about 4 to about about 4 to about about 4 to about about 4 to about about 4 to about about 4 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 5 to about about 5 to about about 5 to about about 5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 6 to about about 6 to about or about 6.5 to about

[0183] In some embodiments, the distance of the Calpha atoms of the two selected amino acid residues described herein is about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about  about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.8 to about about 5.8 to about about 5.8 to about about 5.8 to about about 5.8 to about about 5.8 to about about 5.8 to about about 5.9 to about about 5.9 to about about 5.9 to about about 5.9 to about about 5.9 to about about 5.9 to about about 6.0 to about about 6.0 to about about 6.0 to about about 6.0 to about about 6.0 to about about 6.1 to about about 6.1 to about about 6.1 to about about 6.1 to about about 6.2 to about about 6.2 to about about 6.2 to about about 6.3 to about about 6.3 to about or about to about In some embodiments, the ranges described herein are inclusive, i.e., the values at the boundary of the range are included in the range.

[0184] In some embodiments, the distance of the Cbeta atoms of the two selected amino acid residues described herein is about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3 to about about 3.5 to about about 3.5 to about about 3.5 to about about 3.5 to about about 3.5 to about  about 3.5 to about about 3.5 to about about 3.5 to about about 3.5 to about about 4 to about about 4 to about about 4 to about about 4 to about about 4 to about about 4 to about about 4 to about about 4 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 5 to about about 5 to about about 5 to about about 5 to about about 5 to about about 5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 6 to about about 6 to about about 6 to about about 6 to about about 6.5 to about about 6.5 to about about 6.5 to about about 7 to about about 7 to about or about 7.5 to about

[0185] In some embodiments, the distance of the Cbeta atoms of the two selected amino acid residues described herein is about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.5 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.6 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.7 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.8 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 4.9 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.0 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about about 5.1 to about  about 5.1 to about  about 5.1 to about  about 5.1 to about  about 5.1 to about  about 5.1 to about  about 5.1 to about  about 5.1 to about  about 5.2 to about  about 5.2 to about  about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.2 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.3 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.4 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.5 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.6 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.7 to about about 5.8 to about about 5.8 to about about 5.8 to about about 5.8 to about about 5.8 to about about 5.8 to about about 5.8 to about about 5.9 to about about 5.9 to about about 5.9 to about about 5.9 to about about 5.9 to about about 5.9 to about about 6.0 to about about 6.0 to about about 6.0 to about about 6.0 to about about 6.0 to about about 6.1 to about about 6.1 to about about 6.1 to about about 6.1 to about about 6.2 to about about 6.2 to about about 6.2 to about about 6.3 to about about 6.3 to about or about to about In some embodiments, the ranges described herein are inclusive, i.e., the values at the boundary of the range are included in the range.

[0186] In some embodiments, the distance of the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are close enough to form a non-native disulfide bond. In some embodiments, the two selected amino acid residues are not involved in the protein (e.g., the cytokine) interaction with its binding partners (e.g., a receptor binding to the protein (e.g., the cytokine) ) . In some embodiments, the methods further comprise expressing a protein variant (e.g., a cytokine variant) , wherein the variant comprises a non-native disulfide bond formed by mutating the two selected amino acid residues to cysteines. In some embodiments, mutating the two selected amino acid residues to cysteines does not substantially change the 3D structure of the protein (e.g., the cytokine) . For example, the cysteine mutations do not substantially interfere the overall structure of the protein (e.g., cytokine) . In some cases, the mutated residues do not exhibit any spatial clashes with the un-mutated residues. In some cases, a skilled person in the art may perform a simulation of the mutated protein (e.g., the mutated cytokine) structure in silico, and determine the associated conformational change caused by the cysteine mutations. In some embodiments, the associated conformational change is minimal, e.g., with a RMSD value that is considered insignificant by a skilled person in the art.

[0187] Also provided herein are methods of screening a cytokine variant with an improved anti-tumor efficacy, comprising (a) providing a 3D structure of the cytokine, (b) measuring distance of the Calpha atoms of one or more of amino acid residues in the 3D structure; and (c) selecting two amino acid residues from the one or more amino acid residues, wherein the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are within or or in any of the ranges described herein.

[0188] In some embodiments, the protein or cytokine has no more than 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, or 200 amino acid residues.

[0189] In some embodiments, the methods further comprise (d) expressing a cytokine variant, wherein the variant comprises a non-native disulfide bond formed by mutating the two selected amino acid residues to cysteines; (e) administering the cytokine variant to a tumor-bearing animal; and (f) determining tumor growth (e.g., by measuring tumor volume) in the tumor-bearing animal. In some embodiments, administering the cytokine variant does not cause substantial toxicity to the animal. For example, the body weight of the animal administered with the cytokine variant does not drop significantly as compared to that of a reference animal (e.g., an animal administered with vehicle) .

[0190] In some embodiments, the cytokine described herein is IL-15 (e.g., human IL-15) .

[0191] In some embodiments, functional assays are performed to compare the one or more expressed protein variants (e.g., IL-15 variants) .

[0192] EXAMPLES

[0193] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0194] Example 1. Design of IL-15 variants by introducing an artificial disulfide bond

[0195] Human IL-15 (SEQ ID NO: 22) is a 162 amino acid cytokine that belongs to the four α-helix bundle family of cytokines. The protein includes a signal peptide that corresponds to amino acids 1-29 of SEQ ID NO: 22, and a propeptide that corresponds to amino acids 30-48 of SEQ ID NO: 22. The mature IL-15 protein (corresponding to amino acids 49-162 of SEQ ID NO: 22) has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

[0196] To screen IL-15 variants with enhanced stability and different functional potencies (e.g., induction of IL-15 signaling pathways and induction of immune cell proliferation) , variants of wildtype IL-15 without signal peptide and propeptide (IL15_wt, SEQ ID NO: 1) were designed by selectively mutating two spatially proximate residues to cysteines, according to the distance of the Calpha atoms and directionalities of the Cbeta atoms of the two residues within the 3D structure of IL-15 (e.g., PDB ID: 4GS7) . It was contemplated that the two newly introduced cysteines can form an artificial disulfide bond, thereby stabilizing IL-15 and / or changing its functional potency.

[0197] The amino acid sequences of the IL-15 variants are shown in the table below.

[0198] Table 1.

[0199] The mutation sites of these IL-15 variants are also summarized in the table below.

[0200] Table 2.

[0201] The positions corresponding to SEQ ID NO: 1 are referred to in Table 2. For example, IL15_V1 (or IL15_C01; SEQ ID NO: 2) contains a cysteine corresponding to position 1 of SEQ ID NO: 1, and a cysteine corresponding to position 73 of SEQ ID NO: 1.

[0202] A fusion protein H8-sushi-IL15_wt including the following elements from N-to C-terminus: a His tag (H8; SEQ ID NO: 23) , a sushi domain of human IL15Rα (SEQ ID NO: 24) , and IL15_wt (SEQ ID NO: 1) , was designed. The amino acid sequence of H8-sushi-IL15_wt is set forth in SEQ ID NO: 26. Sequences of the obtained H8-sushi-IL15 variants, e.g., H8-sushi-IL15_V1 to H8-sushi-IL15_V20, are shown in FIG. 6, with amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 27-46, respectively.

[0203] Example 2. Determination of IL-15 potency of H8-sushi-IL15_wt and it variants by HEK-BlueTM CD122 / CD132 pSTAT5 reporter assay

[0204] The IL-15 reporter assay was performed using the HEK-BlueTM CD122 / CD132 pSTAT5 reporter cells (InvivoGen, Cat#: hkb-il2bg) to test the potency of H8-sushi-IL15_wt and it variants to activate JAK-STAT pathway. 2.77 × 105 cells / mL of HEK-BlueTM IL15 reporter cells were resuspended in a pre-warmed assay medium. 180 μL of HEK-BlueTM IL-15 reporter cells were incubated with 20 μL of serially diluted H8-sushi-IL15_wt or it variants in 96-well TC-treated microplates (CORNING, Cat#: 3599) at 37℃ for 22 hours. After incubation, 20 μL of induced HEK-BlueTM IL-15 reporter cell supernatant was incubated with 180 μL QUANTI-BlueTM Solution (InvivoGen, Cat#: rep-qbs2) in a flat-bottom 96-well plate at 37℃ for 2-3 hours. The SEAP activity was measured by a spectrophotometer at 630 nm (VarioskanTM LUK, Thermo Scientific, type3020) .

[0205] As shown in FIGS. 1A-1D, the tested His-sushi-IL15_wt and its variants showed different potencies using the HEK-BlueTM IL-15 reporter assay. The EC50 values were calculated, and results are shown in the table below.

[0206] Table 3. CD122 / CD132 reporter assay results of His-sushi-IL15_wt and its variants

[0207] Note: N.A.: not available

[0208] Example 3. Recombinant human IL2Rβ / Fcγc (CD122 / CD132) ELISA binding assay

[0209] To determine the binding affinity with CD122 / CD132, H8-sushi-IL15_wt and its variants were diluted in in a coating buffer (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 7.7 mM NaN3 , pH 9.6 in ddH2O) (10 μg / mL) and incubated in a 96-well half area plate (CORNING, Cat#: 3690) at 4℃ overnight. The wells were blocked with 2%BSA (APOLO Biochemical, Cat#: APL-007-500g) in PBS (Gibco, Cat#: 14190-136) at room temperature for 1 hour, and then washed with PBST (0.05% 20 in PBS) . After washing, the wells were incubated with serially diluted recombinant human CD122 / CD132-Fc &Fc tag complex (ACROBiosystem, Cat#: ILG-H5254-100g) at room temperature for 2 hours. The plate was washed three times with PBST, and then incubated with anti-human Fcγ-HRP antibody in dilution solution (1: 3000 dilute in 0.2%BSA containing PBS; Jackson ImmunoResearch, Cat#: 109-005-098) at room temperature for 1 hour. Next, the plate was washed four to five times with PBST. Finally, color development was carried out with TMB substrate (Invitrogen, Cat#: 00-4201-56) . Color development was stopped by adding an equal volume of 2N H2SO4 per well as TMB substrate solution. Absorbance at 450 nm in each well was measured using a microplate reader (VarioskanTM LUK, Thermo Scientific, type3020) .

[0210] As shown in FIGS. 2A-2D, the tested His-sushi-IL15_wt and its variants showed different binding affinities to human CD122 / CD132. The EC50 values were calculated, and results are shown in the table below.

[0211] Table 4. Human CD122 / CD132 binding assay results of His-sushi-IL15_wt and its variants

[0212] Example 4. Recombinant human and mouse IL2Rβ / Fcγc (CD122 / CD132) ELISA binding assays

[0213] To determine the binding affinity with CD122 / CD132, H8-sushi-IL15_wt and its variants were diluted in in a coating buffer (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 7.7 mM NaN3 , pH 9.6 in ddH2O) (10 μg / mL) and incubated in a 96-well half area plate (CORNING, Cat#: 3690) at 4℃ overnight. The wells were blocked with 2%BSA (APOLO Biochemical, Cat#: APL-007-500g) in PBS (Gibco, Cat#: 14190-136) at room temperature for 1 hour, and then washed with PBST (0.05% 20 in PBS) . After washing, the wells were incubated with serially diluted recombinant human and mouse CD122 / CD132-Fc &Fc tag complex (ACROBiosystem; Human IL-2RB&IL-2RG Heterodimer Protein, Fc Tag&Fc Tag, Cat#: ILG-H5254-100g; mouse IL-2RB&IL-2RG Heterodimer Protein, Fc Tag&Fc Tag, Cat#: ILG-M5254-100g) at room temperature for 2 hours. The plate was washed three times with PBST, and then incubated with anti-human Fcγ-HRP antibody in dilution solution (1: 3000 dilute in 0.2%BSA containing PBS; Jackson ImmunoResearch, Cat#: 109-005-098) at room temperature for 1 hour. Next, the plate was washed four to five times with PBST. Finally, color development was carried out with TMB substrate (Invitrogen, Cat#: 00-4201-56) . Color development was stopped by adding an equal volume of 2N H2SO4 per well as TMB substrate solution. Absorbance at 450 nm in each well was measured using a microplate reader (VarioskanTM LUK, Thermo Scientific, type3020) .

[0214] As shown in FIGS. 3A-3D (human CD122 / CD132 binding assays) and FIGS. 3E-3H (mouse CD122 / CD132 binding assays) , the tested His-sushi-IL15_wt and its variants showed different binding affinities to human and mouse CD122 / CD132. The EC50 values were calculated, and results are shown in the tables below.

[0215] Table 5. Human CD122 / CD132 binding assay results of His-sushi-IL15_wt and its variants

[0216] Table 6. Mouse CD122 / CD132 binding assay results of His-sushi-IL15_wt and its variants

[0217] Example 5. Human IL2Rβ / Fcγc (CD122 / CD132) ELISA binding assay at pH 7.5 and pH 6.0

[0218] To determine the binding affinity with CD122 / CD132, H8-sushi-IL15_wt and its variants were diluted in in a coating buffer (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, 7.7 mM NaN3 , pH 9.6 in ddH2O) (10 μg / mL) and incubated in a 96-well half area plate (CORNING, Cat#: 3690) at 4℃ overnight. The wells were blocked with 2%BSA (APOLO Biochemical, Cat#: APL-007-500g) in PBS (Gibco, Cat#: 14190-136) at room temperature for 1 hour, and then washed with PBST (0.05% 20 in PBS) . After washing, the wells were incubated with serially diluted recombinant human CD122 / CD132-Fc &Fc tag complex (ACROBiosystem, Cat#: ILG-H5254-100g) at room temperature for 2 hours. The plate was washed three times with PBST, and then incubated at pH 7.5 or pH 6.0 in 0.5%BSA (1× DPBS) at room temperature for 30 minutes. After incubation, the plate was washed three times with PBST, and then incubated with anti-human Fcγ-HRP antibody in dilution solution (1: 3000 dilute with 0.2%BSA in 1× DPBS; Jackson ImmunoResearch, Cat#: 109-005-098) at room temperature for 1 hour. Next, the plate was washed four to five times with PBST. Finally, color development was carried out with TMB substrate (Invitrogen, Cat#: 00-4201-56) . Color development was stopped by adding an equal volume of 2N H2SO4 per well as TMB substrate solution. Absorbance at 450 nm in each well was measured using a microplate reader (VarioskanTM LUK, Thermo Scientific, type3020) .

[0219] As shown in FIGS. 4A-4D (pH 7.5) and FIGS. 4E-4H (pH 6.0) , the tested His-sushi-IL15_wt and its variants showed comparable binding affinities to human CD122 / CD132 at neutral and acidic pHs. The EC50 values were calculated, and results are shown in the tables below.

[0220] Table 7. Human CD122 / CD132 binding assay results at pH 7.5

[0221] Note: N.A.: not available

[0222] Table 8. Human CD122 / CD132 binding assay results at pH 6.0

[0223] Note: N.A.: not available

[0224] Example 6. Human PBMC proliferation assay

[0225] PBMCs (STEMCELL TECHNOLOGIESTM, Cat#: 70025) were seeded at a density of 1 × 104 cells / well in 50 μL of Complete RPMI (10%FBS (GibcoTM, Cat#: A52567-01) +90%RPMI 1640 medium, HEPES (GibcoTM, Cat#: 22400-089) ) with equal volume of titrated doses of H8-sushi-IL15_wt and its variants in 96-well F-bottom microplates (Greiner Bio-one, Cat#: 655098) and cultured for 4 days in a 37℃ incubator. Each concentration was tested in triplicate. The proliferation was assessed by the CellTiter- Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Cat#: G7573) . In brief, the plates were removed from the incubator and conditioned at room temperature for 15 minutes, and a volume of pre-mixed Reagent equal to the volume of cell culture medium present in each well was added. The contents were mixed by gently tapping on each side of the walls, followed by incubating at room temperature in the dark for 10 minutes. The luminescent signals were then measured with a microplate reader (VarioskanTM LUK, Thermo Scientific, type3020) . The results were further analyzed using GraphPad Prism software.

[0226] As shown in FIGS. 5A-5D, the tested His-sushi-IL15_wt and its variants showed different abilities to induce human PBMC proliferation. The EC50 values were calculated, and results are shown in the table below.

[0227] Table 9. Human PBMC proliferation assay results

[0228] Note: N.A.: not avai la ble

[0229] Example 7. Thermostability assay

[0230] The protein stability of H8-sushi-IL15_wt and its variants was determined by differential scanning fluorimetry (DSF) . Assays were performed with a Bio-Rad CFX ConnectTM Real-Time PCR System (Hercules, CA, USA) into MultiplateTM 96-Well PCR Plates, low profile, unskirted, clear (Bio-Rad; Hercules, CA, USA) . Wells were filled to 25 μL, each composed of 2.5 μL of Orange (Sigma-Aldrich; Cat#: S5692) 5,000×, for a final concentration of 5×; 10 μL of each tested sample at a final protein concentration of 0.4 mg / mL; and the remaining 12.5 μL with the appropriate buffer. The protocol was set with a temperature analysis range from 20℃ to 95℃, with steps of 1℃ increasing every 10 seconds and fluorescence recorded at the end of each step. Raw fluorescence data were analyzed to determine the melting temperature (Tm) , from non-linear fitting of thermal denaturation data.

[0231] As shown in the table below, the tested His-sushi-IL15_wt and its variants showed different Tm1, Tm2, and / or Tm3 values as determined by DSF. In particular, the Tm2 value of some variants (e.g., His-sushi-IL15_V20) showed a significant increase as compared to that of His-sushi-IL15_wt, indicating an increased thermostability.

[0232] Table 10. Thermostability analysis results

[0233] OTHER EMBODIMENTS

[0234] It is to be understood that while the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.An engineered IL-15 polypeptide, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises a non-native disulfide bond.2.The engineered IL-15 polypeptide of claim 1, comprising an amino acid sequence that is at least 80%identical to SEQ ID NO: 1.3.The engineered IL-15 polypeptide of claim 1 or 2, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises one or more of the following:(a) the amino acid that corresponds to position 1 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 73 of SEQ ID NO: 2 is C;(b) the amino acid that corresponds to position 1 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 69 of SEQ ID NO: 2 is C;(c) the amino acid that corresponds to position 2 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 111 of SEQ ID NO: 2 is C;(d) the amino acid that corresponds to position 5 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 66 of SEQ ID NO: 2 is C;(e) the amino acid that corresponds to position 8 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 62 of SEQ ID NO: 2 is C;(f) the amino acid that corresponds to position 8 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 66 of SEQ ID NO: 2 is C;(g) the amino acid that corresponds to position 23 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 95 of SEQ ID NO: 2 is C;(h) the amino acid that corresponds to position 24 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 93 of SEQ ID NO: 2 is C;(i) the amino acid that corresponds to position 24 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 95 of SEQ ID NO: 2 is C;(j) the amino acid that corresponds to position 25 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 46 of SEQ ID NO: 2 is C;(k) the amino acid that corresponds to position 26 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 89 of SEQ ID NO: 2 is C;(l) the amino acid that corresponds to position 26 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 91 of SEQ ID NO: 2 is C;(m) the amino acid that corresponds to position 26 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 93 of SEQ ID NO: 2 is C;(n) the amino acid that corresponds to position 27 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 92 of SEQ ID NO: 2 is C;(o) the amino acid that corresponds to position 27 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 94 of SEQ ID NO: 2 is C;(p) the amino acid that corresponds to position 27 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 99 of SEQ ID NO: 2 is C;(q) the amino acid that corresponds to position 28 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 39 of SEQ ID NO: 2 is C;(r) the amino acid that corresponds to position 28 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 91 of SEQ ID NO: 2 is C;(s) the amino acid that corresponds to position 29 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 102 of SEQ ID NO: 2 is C; and(t) the amino acid that corresponds to position 51 of SEQ ID NO: 1 is C, and the amino acid that corresponds to position 60 of SEQ ID NO: 2 is C.4.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-3, comprising an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 2-21.5.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 2.6.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 3.7.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 4.8.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 5.9.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 6.10.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 7.11.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 8.12.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 9.13.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 10.14.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 11.15.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 12.16.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 13.17.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 14.18.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 15.19.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 16.20.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 17.21.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 18.22.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 19.23.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 20.24.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-15 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 21.25.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-24, wherein the non-native disulfide bond can stabilize the internal core of IL-15, optionally wherein the engineered IL-15 polypeptide has an increased thermostability and / or an improved pharmacokinetic profile as compared to a wildtype IL-15 or a functional fragment thereof.26.The engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-25, wherein the engineered IL-15 polypeptide can regulate IL-15 / IL-15 receptor signaling pathways (e.g., activation of the JAK / STAT pathway) and / or induce proliferation of immune cells (e.g., human PBMCs) ; and / or wherein the engineered IL-15 polypeptide can bind to CD122 (e.g., human or mouse CD122) and / or CD132 (e.g., human or mouse CD132) .27.A fusion protein comprising the engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-26.28.The fusion protein of claim 27, wherein the fusion protein further comprises a His-tag, optionally at the N-terminus.29.The fusion protein of claim 27 or 28, wherein the fusion protein further comprises a sushi domain of interleukin 15 receptor, alpha subunit (IL15Rα) .30.The fusion protein of any one of claims 27-29, wherein the fusion protein comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 26-46.31.The fusion protein of any one of claims 27-30, wherein the fusion protein can regulate IL-15 / IL-15 receptor signaling pathways (e.g., activation of the JAK / STAT pathway) and / or induce proliferation of immune cells (e.g., human PBMCs) ; wherein the fusion protein can bind to CD122 (e.g., human CD122) and / or CD132 (e.g., human CD132) .32.The fusion protein of any one of claims 27-31, further comprising an Fc region.33.The fusion protein of any one of claims 27-32, wherein the fusion protein comprises or consisting of an immunocytokine.34.A protein complex comprising the engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-26, wherein the protein complex comprises an immunocytokine.35.A protein complex comprising:(a) a first polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an optional first hinge region, a first Fc region, an optional linker peptide, and the engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-26; and(b) a second polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an optional second hinge region, and a second Fc region.36.A protein complex comprising:(a) a first polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: the engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-26, an optional first hinge region, and a first Fc region; and(b) a second polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an optional second hinge region, and a second Fc region.37.The protein complex of claim 35 or 36, wherein the first hinge region, the first Fc region, the second hinge region, and / or the second Fc region are derived from IgG4 (e.g., human IgG4) , optionally wherein the first Fc region and / or the second Fc region comprise one or more knob-into-hole (KIH) mutations.38.The protein complex of any one of claims 35-37, wherein the protein complex can regulate IL-15 / IL-15 receptor signaling pathways (e.g., activation of the JAK / STAT pathway) and / or induce proliferation of immune cells (e.g., human PBMCs) ; wherein the protein complex can bind to CD122 (e.g., human CD122) and / or CD132 (e.g., human CD132) .39.A pharmaceutical composition comprising the engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-26, the fusion protein of any one of claims 27-33, or the protein complex of any one of claims 34-38; and a pharmaceutically acceptable carrier.40.A nucleic acid encoding the engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-26, the fusion protein of any one of claims 27-33, or the protein complex of any one of claims 34-38.41.A vector comprising the nucleic acid of claim 40.42.A cell comprising the nucleic acid of claim 40 or the vector of claim 41.43.The cell of claim 42, wherein the cell is a Expi293 cell or a CHO cell (e.g., a CHO-S cell) .44.A method of producing an engineered IL-15 polypeptide, a fusion protein comprising the engineered IL-15 polypeptide, or a protein complex comprising the engineered IL-15 polypeptide, the method comprising(a) culturing the cell of claim 42 or 43 under conditions sufficient for the cell to produce the engineered IL-15 polypeptide, the fusion protein, or the protein complex; and(b) collecting the engineered IL-15 polypeptide, the fusion protein, or the protein complex produced by the cell.45.A method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-26, the fusion protein of any one of claims 27-33, or the protein complex of any one of claims 34-38 to the subject.46.The method of claim 45, wherein the subject has a solid tumor or a hematologic cancer.47.The method of claim 45, wherein the cancer is melanoma, head and neck cancer, colorectal cancer, lymphoma, leukemia, bladder cancer, multiple myeloma, pancreatic cancer, gastric cancer, or lung cancer.48.A method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprisingcontacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-26, the fusion protein of any one of claims 27-33, or the protein complex of any one of claims 34-38.49.A method of killing a tumor cell, the method comprisingcontacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the engineered IL-15 polypeptide of any one of claims 1-26, the fusion protein of any one of claims 27-33, or the protein complex of any one of claims 34-38.50.A method of improving the stability of IL-15, comprising(a) providing a 3D structure of IL-15,(b) measuring distance of the Calpha atoms of one or more of amino acid residues in the 3D structure; and(c) selecting two amino acid residues from the one or more amino acid residues, wherein the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are within 3-7 angstroms.51.The method of claim 50, further comprising expressing a IL-15 variant, wherein the IL-15 variant comprises a non-native disulfide bond formed by mutating the two selected amino acid residues to cysteines.52.The method of claim 51, wherein the mutating the two selected amino acid residues to cysteines does not substantially change the 3D structure of IL-15.53.A method of screening an IL-15 variant with an improved anti-tumor efficacy, comprising(a) providing a 3D structure of IL-15,(b) measuring distance of the Calpha atoms of one or more of amino acid residues in the 3D structure; and(c) selecting two amino acid residues from the one or more amino acid residues, wherein the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are within 3-7 angstroms.54.The method of claim 53, further comprising(d) expressing an IL-15 variant, wherein the IL-15 variant comprises a non-native disulfide bond formed by mutating the two selected amino acid residues to cysteines;(e) administering the IL-15 variant to a tumor-bearing animal; and(f) determining tumor growth (e.g., by measuring tumor volume) in the tumor-bearing animal.55.The method of any one of claims 50-54, wherein the IL-15 is human IL-15.56.The method of any one of claims 50-55, wherein the IL-15 comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, 95%, or 100%to SEQ ID NO:1 or 22.

Images