Modified grna for gene editing using crispr / cas system

Abstract

A modified gRNA for gene editing using CRISPR / Cas system is provided. A single guide RNA represented by the following formula (I), wherein specific segments selected from one or more of the regions of the formula comprise one or more chemical modifications is also provided.

Description

Modified gRNA for gene editing using CRISPR / Cas systemFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present disclosure belongs to the field of gene therapy. Specifically, the present disclosure provides modified gRNA sequences for gene editing using CRISPR / Cas12b. SEQUENCE LISTING

[0002] The present disclosure includes a sequence listing as a part of the disclosure.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0003] The native prokaryotic CRISPR-Cas system comprises an array of short repeats with intervening variable sequences of constant length (i.e., clusters of regularly interspaced short palindromic repeats, or “CRISPR” ) , and CRISPR-associated ( “Cas” ) proteins. The RNA of the transcribed CRISPR array is processed by a subset of the Cas proteins into small guide RNAs, which generally have two components as discussed below. There are at least six different types of systems: Type I, Type III and Type IV which belong to Class I and Type II, Type V and Type VI which belong to Class II. The CRISPR-Cas9 system which belongs to the Type II was the first engineered CRISPR-Cas system which can edit eukaryotic genome. The CRISPR-Cas12b system which belongs to Type V-B was the third engineered CRISPR / Cas type reported. In the CRISPR-Cas12b system, the guide RNA ( “gRNA” ) comprises two short, non-coding RNA species referred to as CRISPR RNA ( “crRNA” ) and trans-acting RNA ( “tracrRNA” ) . In an exemplary system, the gRNA forms a complex with a Cas nuclease. The gRNA: Cas nuclease complex binds a target polynucleotide sequence having a protospacer adjacent motif ( “PAM” ) and a protospacer, which is a sequence complementary to a portion of the gRNA. The recognition and binding of the target polynucleotide by the gRNA: Cas nuclease complex induces cleavage of the target polynucleotide. The native CRISPR-Cas system functions as an immune system in prokaryotes, where gRNA: Cas nuclease complexes recognize and silence exogenous genetic elements in a manner analogous to RNAi in eukaryotic organisms, thereby conferring resistance to exogenous genetic elements such as plasmids and phages. It has been demonstrated that a single-guide RNA ( “sgRNA” ) can replace the complex formed between the naturally-existing crRNA and tracrRNA.

[0004] Considerations relevant to the developing of a gRNA, including a sgRNA, include efficacy, specificity and stability. Efficacy refers to the efficiency of a particular gRNA: Cas nuclease complex to bind, nick, and / or cleave a desired target sequence. Specificity refers to reduced or no binding, nicking, and / or cleavage of polynucleotides different in sequences and / or locations from the desired target occurs. Thus, specificity refers to minimizing off-target effects of the gRNA: Cas nuclease complex. There is a need for providing gRNA, including sgRNA, having desired binding affinity for the target polynucleotide with reduced off-target effects while having desired gRNA efficacy. There is also a need for improved designs to make and use gRNA, including sgRNA, resulting in enhanced specificity, with desired binding affinity for the target polynucleotide and / or reduced off-target binding. Upon delivery, the unmodified exogenous RNA is rapidly degraded in the host and exhibits minimal efficacy. So modifications on RNA are important to increase stability in the cells and / or in vivo. Therefore, chemical modifications were introduced into the three functional regions of the gRNA, the nucleobase, the carbohydrate and the phosphodiester linkage. Nucleobase modifications are usually used in RNAs for mRNA silencing to increase the thermal stability of the duplex formed between RNA and its target, with 5-methyl-C and 5-propynyl being the 2 commonly used nucleobase modifications. The ribose in RNA can be modified to increase the stability against nuclease degradation. The most widely used modification is the 2’-O-methyl (2’-OMe) . Other common modifications are 2’-O-methoxyethyl (2’-OMOE) and 2’-fluoro RNA (2’-F-RNA) . The sugar group and phosphodiester (PO) linkage gives the RNA strand its helix structure to form the backbone. However, the backbone is the target for degradative endo-and exonucleases. By using a sulfur atom to replace the oxygen in the PO linkage to form a phosphorothioate (PS) linkage instead of PO, it protects the RNA from the degradation of nucleases, therefore prolongs the half-life and increases the efficiency of cellular uptake.SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] The present disclosure provides a single guide RNA represented by the following formula (I) : contains: a) An optional 5’-overhang region comprising a contiguous sequence of CCAG, or no  nucleotides; b) Stem loop 1 region, comprising a contiguous sequence of GUCGUCUAUAGGACGGC (SEQ ID NO: 123) , wherein nucleotide residues comprising a region of reverse complementary sequences to form a double helix that ends in a region of an unpaired loop; c) Junction 1 region, comprising a contiguous sequence of GAGUUUU; d) Stem 1 region, containing 18 nucleotides, among which 9 base pairs are formed, wherein Stem 1-F comprises a contiguous sequence of UCAACGGGU, and Stem 1-R comprises a contiguous sequence of GCCCGUUGA; e) Junction 2 region, comprising a contiguous sequence of AAUG; f) Stem loop 2 region, comprising a contiguous sequence of GCCACUUUCCAGGUGGC (SEQ ID NO: 124) , wherein nucleotide residues comprising a region of reverse complementary sequences to form a double helix that ends in a region of an unpaired loop; g) Junction 3 region, comprising a contiguous sequence of AAA; h) Stem loop 3 region, comprising a contiguous sequence of GCUUCAAAGAAGU (SEQ ID NO: 125) , wherein nucleotide residues comprising a region of reverse complementary sequences to form a double helix that ends in a region of an unpaired loop; i) Stem 2 region, containing 10 nucleotides, among which 5 Watson-Crick pairs are formed, wherein Stem 2-F comprises a contiguous sequence of GUGCC, and Stem 2-R comprises a contiguous sequence of GGCAC; j) Spacer region, ranging from 18 to 35 nucleotides represented by N in formula (I) which could independently be Adenine (A) , Guanine (G) , Cytosine (C) or Uracil (U) ; wherein solid line linked nucleotide residues of formula (I) represent formation of Watson-Crick pairs to form a double helix, dotted line linked nucleotide residues of formula (I) represent formation of non-Watson-Crick interactions to form three-dimensional structures; and nucleotide residues are arranged from 5’-terminus to 3’-terminus following the direction of the arrows shown in formula (I) ; and one or more of the regions selected from a) to d) , f) to h) and j) comprise one or more chemical modifications.

[0006] In some embodiments, said chemical modification comprises a 2’-O-methyl (2’-OMe) modified nucleotide and / or a phosphorothioate (PS) bond between nucleotides.

[0007] In some embodiments, the first 3 nucleotide residues at 5’-terminus are 2’-OMe modified and / or the first 4 nucleotide residues at 5’-terminus are linked with PS bonds.

[0008] In some embodiments, said spacer region comprises a targeting region of 18-35 nucleotide residues.

[0009] In some embodiments, the last 2 or 3 nucleotide residues of said targeting region are 2’-OMe modified and / or the last 3 or 4 nucleotide residues of said targeting region are linked with PS bonds.

[0010] In some embodiments, at least one of the following domains comprise one or more said chemical modifications: a) A-domain is consisting of the last 3 nucleotides of said Junction 1 and the first 6 nucleotides of said Stem 1-F; b) B-domain is consisting of the first 8 nucleotides of said Stem loop 2; c) C-domain is consisting of the last 3 nucleotides of said Stem loop 2, all nucleotides of said Junction 3, and the first nucleotide of said Stem 1-R; d) D-domain is consisting of the last 6 nucleotides of said Stem 1-R, and all nucleotides except the last three of said Stem loop 3.

[0011] In some embodiments, said A-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said A-domain is with said chemical modifications; or b) at least one nucleotide is 2’-OMe modified; and / or c) at least one PS bond is formed between nucleotides.

[0012] In some embodiments, said B-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said B-domain is with said chemical modifications; or b) at least one nucleotide is 2’-OMe modified; and / or c) at least one PS bond is formed between nucleotides.

[0013] In some embodiments, said C-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said C-domain is with said chemical modifications; or b) at least one nucleotide is 2’-OMe modified; and / or c) at least one PS bond is formed between nucleotides.

[0014] In some embodiments, said D-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said D-domain is with said chemical modifications; or b) at least one nucleotide is 2’-OMe modified; and / or c) at least one PS bond is formed between nucleotides.

[0015] In some embodiments, said A-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said A-domain is with said chemical modifications; or b) all nucleotides of said A-domain are 2’-OMe modified; or c) all nucleotides of said A-domain are linked with PS bonds; or d) all nucleotides except the first two and the last two of said A-domain are 2’-OMe modified.

[0016] In some embodiments, said B-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said B-domain is with said chemical modifications; or b) all nucleotides of said B-domain are 2’-OMe modified; or c) all nucleotides of said B-domain are linked with PS bonds; or d) all nucleotides except the first two and the last two of said B-domain are 2’-OMe modified; or e) all nucleotides except the first two and the last two of said B-domain are linked with PS bonds; or f) all nucleotides of said B-domain are 2’-OMe modified and linked with PS bonds.

[0017] In some embodiments, said C-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said C-domain is with said chemical modifications; or b) all nucleotides of said C-domain are 2’-OMe modified; or c) all nucleotides of said C-domain are linked with PS bonds; or d) all nucleotides except the first two and the last two of said C-domain are 2’-OMe modified; or e) all nucleotides except the first two and the last two of said C-domain are linked with PS bonds; or f) all nucleotides of said C-domain are 2’-OMe modified and linked with PS bonds.

[0018] In some embodiments, said D-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said D-domain is with said chemical modifications; or b) all nucleotides of said D-domain are 2’-OMe modified; or c) all nucleotides of said D-domain are linked with PS bonds; or d) all nucleotides except the first two and the last two of said D-domain are 2’-OMe modified; or e) all nucleotides except the first two and the last two of said D-domain are linked with PS bonds; or f) all nucleotides except the first four and the last four of said D-domain are 2’-OMe modified.

[0019] In some embodiments, a) said A-domain is anyone of the following: i. UUUUCAACG, or ii. mUmUmUmUmCmAmAmCmG, or iii. U*U*U*U*C*A*A*C*G, or iv. UUmUmUmCmAmACG; and / or b) said B-domain is anyone of the following: i. GCCACUUU, or ii. mGmCmCmAmCmUmUmU, or iii. G*C*C*A*C*U*U*U, or iv. GCmCmAmCmUUU, or v. GCC*A*C*UUU, or vi. mG*mC*mC*mA*mC*mU*mU*mU; and / or c) said C-domain is anyone of the following: i. GGCAAAG, or ii. mGmGmCmAmAmAmG; or iii. G*G*C*A*A*A*G, or iv. GGmCmAmAAG, or v. GGC*A*AAG, or vi. mG*mG*mC*mA*mA*mA*mG; and / or d) said D-domain is anyone of the following: i. CGUUGAGCUUCAAAGA (SEQ ID NO: 126) , or ii. mCmGmUmUmGmAmGmCmUmUmCmAmAmAmGmA (SEQ ID NO: 127) , or iii. C*G*U*U*G*A*G*C*U*U*C*A*A*A*G*A (SEQ ID NO: 128) , or iv. CGmUmUmGmAmGmCmUmUmCmAmAmAGA (SEQ ID NO: 129) , or v. CGU*U*G*A*G*C*U*U*C*A*A*AGA (SEQ ID NO: 130) , or vi. CGUUmGmAmGmCmUmUmCmAAAGA (SEQ ID NO: 131) , wherein each m represents the nucleotide residue after it is 2’-OMe modified, and each *represents  the nucleotide residue on either side of it is linked with PS bonds.

[0020] In some embodiments, said single guide RNA comprises a scaffold sequence having any one of the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 85-122, and said spacer region of 18-35 nucleotide residues. The spacer region ( (NNN…N) x) of formula (I) as described herein refers to a nucleic acid sequence present in the single guide RNA to which a subject DNA will bind. Therefore, the sequence of the spacer region could be specifically synthesized or modified according to subject DNA or gene in need. For example, the single guide RNA for AaCas12b comprises the sequence:

[0021] In some preferred embodiments, the scaffold sequences of single guide RNA for AaCas12b comprises the sequence:Table 1. Scaffold sequence of gRNAs

[0022] In some embodiments, the last 2 or 3 nucleotide residues at 3’-terminus of said spacer region are 2’-OMe modified and / or the last 3 or 4 nucleotide residues at 3’-terminus are linked with PS bonds.

[0023] In some embodiments, at least one nucleotide residue other than the last 3 at 3’-terminus of said spacer region are 2’-OMe modified and / or at least one nucleotide residue other than the last 4 at 3’-terminus of said spacer region are linked with PS bonds.

[0024] In some embodiments, said single guide RNA comprises a scaffold sequence having any one of the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 90, 97, or 117, and said spacer region of 18-35 nucleotide residues, wherein the last 3 nucleotide residues at 3’-terminus of said spacer region are 2’-OMe modified and / or the last 3 or 4 nucleotide residues at 3’-terminus are linked with PS bonds.

[0025] In some embodiments, said single guide RNA comprises any one of the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 1-69. Exemplary sequences of designed gRNAs with single locus modification or with combined modifications are listed in Table 2. Target DNA-specific (KLKB1 (Kallikrein B1) or TTR (Transthyretin) ) spacer sequences are designed in these single guide RNAs. Table 2. gRNAs for optimization of modifications

[0026] In some embodiments, said single guide RNA comprises any one of the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 90, 97, or 117.

[0027] In some embodiments, said RNA is capable of forming a ribonucleoprotein complex with a Cas12b protein.

[0028] In some embodiments, said RNA is capable of forming a ribonucleoprotein complex with a Cas12b protein, for example a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .

[0029] In another aspect, the present disclosure provides a composition comprising the single guide RNA described herein, and further comprising a nuclease or an mRNA which encodes the nuclease.

[0030] In some embodiments, said nuclease is a Cas protein.

[0031] In some embodiments, said Cas protein is a Cas12b protein, for example a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .

[0032] In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical formulation comprising the single guide RNA described herein, or the composition described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0033] In another aspect, the present disclosure provides a method of modifying a target gene comprising delivering a Cas protein or a nucleic acid encoding said Cas protein, and the single guide RNA described herein in vitro or in vivo.

[0034] In some embodiments, said Cas protein is a Cas12b protein, for example a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .

[0035] In some embodiments, said method results in a single-or double-stranded cleavage, insertion or deletion of said target gene.

[0036] In some embodiments, the method has reduced off-target effects.

[0037] In another aspect, the present disclosure provides use of the single guide RNA described herein in preparing a medicament for treating a disease or disorder associated with a target gene.

[0038] Additional aspects and advantages of the present disclosure will become readily apparent to those skilled in this art from the following detailed description, wherein only illustrative embodiments of the present disclosure are shown and described. As will be realized, the present disclosure is capable of other different embodiments, with details of modifications in various obvious respects, all without departing from the disclosure. Accordingly, the drawings and descriptions are to be regarded as illustrative in nature, and not as restrictive. INCORPORATION BY REFERENCE

[0039] All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication, patent, or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference. BRIEF DESCRIPTIONS OF THE DRAWINGS

[0040] The novel features of the invention are set forth with the appended particular claims. A better understanding of the features and advantages of the present invention will be obtained by reference to the following detailed descriptions that set forth illustrative embodiments, in which the principles of the invention are employed, and the accompanying drawings (also “figure” and “FIG. ” herein) , of which:

[0041] FIG. 1 illustrates the four identified loci of A-domain to D-domain that were designed to introduce 2’-OMe and phosphorothioate modifications.

[0042] FIGs. 2A-2C illustrate the T7E1 and NGS results of gRNAs transfected with AaCas12b mRNA into Hep3B and Huh7.

[0043] FIGs. 3A-3L illustrate the T7E1 and NGS results of gRNAs transfected with AaCas12b mRNA into HepG2, Hep3B and Huh7 at the concentrations of 1 pmol and 0.33 pmol.

[0044] FIGs. 4A-4F illustrate the T7E1 and NGS results of gRNAs transfected with AaCas12b mRNA into HepG2, Hep3B and Huh7 at the concentration of 0.33 pmol.

[0045] FIGs. 5A-5C illustrate 3 modification patterns of gRNAs.

[0046] FIGs. 6A-6C illustrate the T7E1 results of LNPs containing AaCas12b mRNA and gRNA targeting human KLKB1 delivered into Hep3B cells, Huh7 cells and primary human hepatocytes (PHH, lot 386549) .

[0047] FIGs. 7A-7D illustrate the T7E1 and NGS results of LNPs containing AaCas12b mRNA and gRNA targeting human KLKB1 delivered into PHH (lot 201904001) , PHH (lot 386549) and primary cynomolgus monkey hepatocytes (PCH, lot CCH100CY-V09555) .

[0048] FIG. 8 illustrates the T7E1 results of LNPs containing AaCas12b mRNA and gRNA targeting human TTR delivered into Huh7 cells.

[0049] FIGs. 9A-9B illustrate the T7E1 results of LNPs containing AaCas12b mRNA and gRNA targeting mouse TTR delivered into Neuro2A and Hepa1-6 cells.

[0050] FIGs. 10A-10B illustrate the T7E1 and NGS results of LNPs containing AaCas12b mRNA and gRNA targeting mouse TTR that were intravenously injection into the wild type C57BL / 6J mice.

[0051] FIGs. 11A-11B illustrate the editing efficiency and prekallikrein 1B level (indicating the expression of KLKB1) in primary hepatocytes mediated by the deeply modified human KLKB1 gRNA. FIG. 11A illustrates the correlation between indel frequency and prekallikrein 1B level in PHH. FIG. 11B illustrates the editing efficiency in PCH. Chemically modified gRNAs were commercially customized based on designed sequences.

[0052] FIG. 12 illustrates the off-target pattern obtained by TAG-seq. The 10 batches of study were conducted in HEK293 cells.

[0053] FIGs. 13A-13D illustrate the efficacy of human KLKB1 gRNA in huKLKB1 mice. Chemically modified gRNAs were commercially customized. AaCas12bMax mRNA and gRNAs were co-packaged into LNPs. LNPs were intravenously injected into huKLKB1 mice. FIGs. 13A-13C show the vascular leakage study results in colon, small intestine and hind limbs. The correlation between liver KLKB1 editing efficiency and plasma (sodium citrate) total kallikrein concentration were shown in FIG. 13D.

[0054] FIGs. 14A-14D illustrate the efficacy of human KLKB1 gRNA in cynomolgus monkey. Chemically modified gRNAs were commercially purchased. AaCas12bMax mRNA and gRNAs were co-packaged into LNPs. LNPs were intravenously injected into cynomolgus monkey. FIG. 14A shows the liver KLKB1 editing efficiency on day 15 and day 29. FIG. 14B shows the time curves of plasma (sodium citrate) total kallikrein concentration. FIG. 14C shows the time curves of plasma (sodium citrate) kallikrein activity. FIG. 14D shows the editing efficiency of the on-target site and the potential off-target site.DETAILED DESCRIPTION

[0055] While various embodiments of the invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by examples only. Numerous variations, changes, and substitutions may occur to those skilled in the art without departing from the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed. Definition

[0056] The term “mRNA (messenger RNA) ” refers to a polynucleotide that encodes at least one peptide, polypeptide or protein. mRNA as used herein encompasses both modified and unmodified RNA. mRNA may contain one or more coding and non-coding regions. mRNA can be purified from natural sources, produced using recombinant expression systems and optionally purified, chemically synthesized, etc. Where appropriate, e.g., in the case of chemically synthesized molecules, mRNA can comprise nucleoside analogs such as analogs having chemically modified bases or sugars, backbone modifications, etc. An mRNA sequence is presented in the 5’ to 3’ direction unless otherwise indicated. In some embodiments, an mRNA is or comprises natural nucleosides (e.g., adenosine, guanosine, cytidine, uridine) ; nucleoside analogs (e.g., 2-aminoadenosine, 2-thiothymidine, inosine, pyrrolo-pyrimidine, 3-methyl adenosine, 5-methylcytidine, C-5 propynyl-cytidine, C-5 propynyl-uridine, 2-aminoadenosine, C5-bromouridine, C5-fluorouridine, C5-iodouridine, C5-propynyl-uridine, C5-propynyl-cytidine, C5-methylcytidine, 2-aminoadenosine, 7-deazaadenosine, 7-deazaguanosine, 8-oxoadenosine, 8-oxoguanosine, O (6) -methylguanine, 2-thiocytidine, pseudouridine, and 5-methylcytidine) ; chemically modified bases; biologically modified bases (e.g., methylated bases) ; intercalated bases; modified sugars (e.g., 2’-fluroribose, ribose, 2’-deoxyribose, arabinose, and hexose) ; and / or modified phosphate groups (e.g., phosphorothioates and 5’-N-phosphoramidite linkages) .

[0057] The term “Guide RNA” and “gRNA” are used herein interchangeably to refer collectively to either an sgRNA, a trRNA (also known as tracrRNA) , or a crRNA (also known as CRISPR RNA) . The crRNA and trRNA may be linked as one RNA molecule (single guide RNA, also known as sgRNA) or in two separate RNA molecules (dual guide RNA, also known as dgRNA) . “Guide RNA” or “gRNA” refers to each type. The trRNA sequences may be naturally occurring, or the trRNA sequence may include modifications or variations of the naturally-occurring sequences.

[0058] The terms “target sequence” , “target site” , “target protospacer DNA” and the like are used interchangeably herein, and refer to a nucleic acid sequence present in a target DNA to which a DNA-targeting segment of a subject DNA-targeting RNA will bind, provided sufficient conditions for binding exist. Suitable DNA / RNA binding conditions include physiological conditions normally present in a cell. Other suitable DNA / RNA binding conditions (e.g., conditions in a cell-free system) are known in the art; see, e.g., Sambrook, supra. The strand of the target DNA that is complementary to and hybridizes with the DNA-targeting RNA is referred to as the “complementary strand” and the strand of the target DNA that is complementary to the “complementary strand” (and is therefore not complementary to the DNA-targeting RNA) is referred to as the “noncomplementary strand” or “non-complementary strand” .

[0059] The term “Regions” as used herein describes conserved groups of nucleic acids. Regions may also be referred to as “modules” or “domains. ” Regions of a gRNA may perform specific functions, e.g., in directing endonuclease activity of the RNP, for example as described in Briner A E et al., Molecular Cell 56: 333-339 (2014) . Examples of regions of a gRNA are described in formula (I) or the present disclosure.

[0060] The term “Stem loop” as used herein describes a secondary structure of nucleotides that form a base-paired “stem” that ends in a loop of unpaired nucleic acids. A stem may be formed when two regions of the same nucleic acid strand are at least partially complementary in sequence when read in opposite directions. “Loop” as used herein describes a region of nucleotides that do not pair (i.e., are not complementary) and may cap a stem. The “stem” region as used herein describes a secondary structure of nucleotides that forms a base-paired region between specific regions.

[0061] The term “2’-O-methyl (modification) ” as used herein describes the substitutions of methyl group on the hydroxyl group (-OH) of nucleotide sugar rings which therefore alter the confirmation of these sugar rings to influence the oligonucleotide binding affinity for complementary strands, duplex formation, and interactions with nucleases. For example, 2’-O-methyl (2’-OMe) modifications can increase binding affinity and nuclease stability of oligonucleotides, though as shown in the Examples, the effects of any modification at a given position in an oligonucleotide need to be empirically determined. In certain embodiments, the terms “mA, ” “mC, ” “mU, ” or “mG” may be used to denote a nucleotide that has been modified with 2’-OMe.

[0062] The term “phosphorothioate (PS) bond” as used herein refers to a bond where a sulfur is substituted for one nonbridging phosphate oxygen in a phosphodiester linkage, for example in the bonds between nucleotides bases. When phosphorothioates are used to generate oligonucleotides, the modified oligonucleotides may also be referred to as S-oligos. A “*” may be used to depict a PS modification. In this application, the terms A*, C*, U*, or G*may be used to denote a nucleotide that is linked to the next (e.g., 3’-terminus) nucleotide with a PS bond. In this application, the terms “mA*, ” “mC*, ” “mU*” or “mG*” may be used to denote a nucleotide that has been substituted with 2’-O-Me and that is linked to the next (e.g., 3’-terminus) nucleotide with a PS bond. The terms “*mA, ” “*mC, ” “*mU” or “*mG” may be used to denote a nucleotide that has been substituted with 2’-O-Me and that is linked to the front (e.g., 5’-terminus) nucleotide with a PS bond. Equivalents of a PS linkage or bond are encompassed by embodiments described herein.

[0063] The terms “endonuclease” , “nucleic acid endonuclease” , “DNA endonuclease” and “nuclease” as used herein are interchangeable herein, and refer to an enzyme which possesses catalytic activity for DNA cleavage. By “cleavage” it is meant as the breakage of the covalent backbone of a DNA molecule. Both single-stranded cleavage and double-stranded cleavage are possible, and double-stranded cleavage can occur as a result of two distinct single-stranded cleavage events. DNA cleavage can result in the production of either blunt ends or staggered ends. In certain embodiments, a complex comprising a DNA-targeting RNA and a site-directed modifying polypeptide is used for targeted double-stranded DNA cleavage.

[0064] The term “in vitro” as used herein refers to an artificial environment and to processes or reactions that occur within an artificial environment. In vitro environments exemplified, but are not limited to, test tubes and cell cultures. On the other hand, the term “in vivo” refers to the natural environment (e.g., an animal) and to processes or reactions that occur within a natural environment, such as embryonic development, cell differentiation, neural tube formation, etc.

[0065] The term “treating” , “treatment” and the like as used herein are used herein to generally mean obtaining a desired pharmacologic and / or physiologic effect. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or symptom thereof and / or may be therapeutic in terms of a partial or complete cure for a disease and / or adverse effect attributable to the disease. “Treating” as used herein covers any treatment of a disease or symptom in a mammal, and includes: 1) preventing the disease or symptom from occurring in a subject which may be predisposed to acquiring the disease or symptom but has not yet been diagnosed as having it; 2) inhibiting the disease or symptom, i.e., arresting its development; or 3) relieving the disease, i.e., causing regression of the disease. The therapeutic agent may be administered before, during or after the onset of disease or injury. The treatment of ongoing disease, where the treatment stabilizes or reduces the undesirable clinical symptoms of the patient, is of particular interest. Such treatment is desirably performed prior to complete loss of function in the affected tissues. The subject therapy will desirably be administered during the symptomatic stage of the disease, and in some cases after the symptomatic stage of the disease.

[0066] The terms “subject” , “individual” and “patient” are used interchangeably herein for therapeutic purposes and refer to any animal classified as a mammal, including humans, domestic and farm animals, as well as zoos, gyms or pet animals such as dogs, horses, cats, cattle, and the like. In some embodiments, the subject is a human subject.

[0067] As used herein and in the appended claims, the singular forms “a” , “an” , “one” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. It should also be noted that the claims may be drafted to exclude any optional element. It is thus intended that such statements be regarded as antecedent basis for use of such exclusive terminology as “solely” , “only” and the like, or as limitations upon the use of “no” in connection with the recitation of claim elements.

[0068] The term “and / or” in words such as “a and / or B” as used herein is intended to include both a and B; a or B; a (alone) ; and B (alone) . Likewise, as used herein, the term “and / or” in words such as “A, b and / or C” is intended to include each of the following embodiments: A, b and C; A, b or C; A or C; A or b; b or C; A and C; A and b; b and C; A (alone) ; b (alone) ; and C (alone) . CRISPR-Cas

[0069] In some embodiments, said nuclease could be a CRISPR / Cas protein. A CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) genomic locus can be found in the genomes of many prokaryotes (e.g., bacterium and archaeans) . In prokaryotes, the CRISPR locus encodes products that function as a type of immune system to help defend the prokaryotes against foreign invaders, such as virus and phage. There are three stages of CRISPR locus function: integration of new sequences into the CRISPR locus, expression of CRISPR RNA (crRNA) , and silencing of the foreign invader nucleic acid. Six types of CRISPR systems (e.g., Type I, Type II, Type III, Type IV, Type V and Type VI) have been identified.

[0070] A CRISPR locus includes a number of short repeating sequences referred to as “repeats” . When expressed, the repeats can form secondary structures (e.g., hairpins) and / or comprise unstructured single-stranded sequences. The repeats usually occur in clusters and frequently diverge between species. The repeats are regularly interspaced with unique intervening sequences referred to as “spacers, ” resulting in a repeat-spacer-repeat locus architecture. The spacers are identical to or have high homology with known foreign invader sequences. A spacer-repeat unit encodes a crisprRNA (crRNA) , which is processed into a mature form of the spacer-repeat unit. A crRNA comprises a “seed” or spacer sequence that is involved in targeting a target nucleic acid (in the naturally occurring form in prokaryotes, the spacer sequence targets the foreign invader nucleic acid) . A spacer sequence is located at the 5’ or 3’ end of the crRNA. A CRISPR locus also comprises polynucleotide sequences encoding CRISPR Associated (Cas) genes. Cas genes encode endonucleases involved in the biogenesis and the interference stages of crRNA function in prokaryotes. Some Cas genes comprise homologous secondary and / or tertiary structures.

[0071] In some embodiments, said CRISPR / Cas protein is Cas12b. “Cas12b” , “Cas12b nuclease” , “Cas12b protein” , “C2C1” , “C2C1 nuclease” and “C2C1 protein” are used interchangeably herein to refer to an RNA-guided sequence-specific nuclease from a microbial CRISPR system. Cas12b is capable of targeting and cleaving a DNA target sequence under the direction of a guide RNA to form a DNA double strand break (DSB) , also known as classical dsDNA cleavage activity or cis dsDNA cleavage activity. Upon recognition and binding of the corresponding target DNA sequence, the complex of Cas12b with the gRNA is also able to activate its trans single-stranded DNA cleavage activity, also referred to as non-classical bypass ssDNA cleavage activity.

[0072] In some embodiments, the Cas12b protein is an AaCas12b protein from Alicyclobacillus acidophilus, an AkCas12b protein from Alicyclobacillus kakegawensis, an AmCas12b protein from Alicyclobacillus macroreticulatus, a BhCas12b protein from Bacillus hisshi, a BsCas12b protein from Bacillus, a Bs3Cas12b protein from Bacillus, a Disulfovibrio inopinatus Cas12b protein, a lacs Cas12b protein from lacyella sediminis, an SbCas12b protein from sporohae bacteria, a Cas12b protein from leptotus caliidus. In some preferred embodiments, the Cas12b protein is a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidophilus (AaCas12b) . The Cas12b proteins described herein can be used for genome editing in mammals, as well as for the nucleic acid detection methods of the invention.

[0073] In some preferred embodiments, the Cas12b protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 84. In some embodiments, the Cas12b protein comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 84. In some embodiments, the amino acid sequence of the Cas12b protein has one or more amino acid residue substitutions, deletions, or additions relative to SEQ ID NO: 84. For example, the Cas12b protein has an amino acid sequence with 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acid residue substitutions, deletions, or additions relative to SEQ ID NO: 84.

[0074] In some preferred embodiments, the engineered Cas12b protein comprises any one of the following substitutions or combinations thereof: 1) D116R; 2) E475R; 3) Q119F and E475R; 4) Q119F, E475R, and E758R; 5) Q119Y; (6) Q119F; 7) Q119W; 8) I757R; 9) E758R; 10) E761R; 11) K768R; 12) I757R and E758R; 13) I757R and E761R; 14) I757R and K768R; 15) E758R and E761R; 16) E758R and K768R; 17) E761R and K768R; 18) I757R, E758R, and E761R; 19) I757R, E758R, and K768R; 20) I757R, E761R and K768R; 21) E758R, E761R, and K768R; 22) I757R, E758R, E761R, and K768R; 23) Q866M; 24) Q869M; 25) Q866M and Q869M; 26) E636R; 27) Q854R; 28) N857K; 29) N865W; 30) N865Y; 31) Q1093W; 32) Q1093Y; and 33) D858R; and wherein the amino acid residue numbering is according to SEQ ID NO: 84. In some embodiments, the engineered Cas12b protein comprises any one of the following substitutions or combinations thereof: 1) Q866M and Q869M; (2) Q119F and E475R; and (3) Q119F, E475R and E758R; and wherein the amino acid residue numbering is according to SEQ ID NO: 84. mRNA

[0075] Here we provide an exemplary AaCas12bMax mRNA (including its motifs, sequences and modifications) that can be delivered using non-viral vectors. The non-viral delivery vectors include cationic lipids, ionizable lipids, lipid-like materials, polymers, dendrimers, and cell-penetrating peptides (CPPs) . The AaCas12bMax open reading frame (ORF) includes nuclear localization sequences (NLS) and a coding sequence (CDS) . Different aspects of the AaCas12bMax sequence were optimized to maximize its in vivo editing efficacy when delivered as mRNA by LNP, including 5’ cap, 5’ UTR, NLS, CDS, 3’ UTR, poly A tail and ribonucleotide chemical modifications.

[0076] In some embodiments, the mRNA comprising: a) a 5’-cap structure; b) a 5’ untranslated region (UTR) ; c) an open reading frame (ORF) comprising a ribonucleotide sequence that encodes a Cas12b endonuclease; d) a 3’ untranslated region (UTR) ; and e) a poly-Aregion of least 100 ribonucleotides in length. In preferred embodiments, the Cas12b endonuclease is a Cas12bMax endonuclease.

[0077] In some embodiments, said 5’-cap structure comprises a Cap-1 structure, wherein said Cap-1 refers to m7GpppNm-, where Nm denotes any ribonucleotide with a 2′O methylation.

[0078] In some embodiments, said 5’-UTR comprises a Kozak sequence, which is adjacent to the 5’ of said ORF.

[0079] In some embodiments, said 5’-UTR is derived from HBA1 (hemoglobin subunit alpha 1) .

[0080] In some embodiments, said 3’-UTR comprises an alpha-globin 3’-UTR structure.

[0081] In some embodiments, said poly-Aregion has 100-250 ribonucleotides in length.

[0082] In some embodiments, said poly-Aregion has about 100 ribonucleotides in length.

[0083] In some embodiments, said ORF further comprises a ribonucleotide sequence that encodes one or more nuclear localization signal (NLS) peptides.

[0084] In some embodiments, any one of said one or more NLS peptides is independently selected from a group consisting of nucleoplasmin NLS, SV40 NLS, and c-myc NLS.

[0085] In some embodiments, said ORF further comprises a ribonucleotide sequence that encodes a 2×Flag-tag protein.

[0086] In some embodiments, one or more said NLS peptides are linked with a peptide linker, preferably a 3×HA tag peptide.

[0087] In some embodiments, said Cas12b endonuclease is a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .

[0088] In some embodiments, said mRNA sequentially comprises a HBA1-derived 5'UTR, a Kozak sequence, a SV40 NLS, a Cas12bMax endonuclease coding sequence, a SV40 NLS, a linker sequence, a c-myc NLS sequence, a linker sequence, a nucleoplasmin NLS sequence, a α-globin 3’ UTR and a poly-A.

[0089] In another aspect, the present disclosure provides a system for editing a target gene in the genome of a cell, comprising: a) the mRNA described herein; and b) at least one guide RNA (gRNA) directed to the target gene, wherein a site-directed endonuclease is provided when the mRNA enters the cell and is translated to a protein.

[0090] In some embodiments, said site-directed endonuclease is able to combine with said gRNA to induce a double-stranded DNA break (DSB) at a target site of the target gene.

[0091] In some embodiments, said site-directed endonuclease is a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .

[0092] In another aspect, the present disclosure provides a therapeutic composition comprising the mRNA described herein or the system described herein encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) .

[0093] In some embodiments, said composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.

[0094] In another aspect, the present disclosure provides a method for delivering the mRNA described herein and at least a target specific gRNA to a cell, wherein a site-directed endonuclease is provided when the mRNA enters the cell and is translated to a protein.

[0095] In some embodiments, said site-directed endonuclease is able to combine with said gRNA to induce a double-stranded DNA break (DSB) at a target site of the target gene.

[0096] The mRNA describe herein has the following improvements: a) higher translation efficiency, b) improved mRNA stability against endonuclease cleavage and degradation to increase mRNA half-life and boost protein yield, c) N1-methyl-pseudouridine substitution of uridines in mRNA increases base pair stability to reduce translational mistakes, d) removed potentially detrimental repeats or palindromic sequences by synonymous mutations. Use

[0097] In some embodiments, the target region located on the spacer region of the single guide RNA will target any natural or artificial protein (s) . Furthermore, the pharmaceutical formulation with the single guide RNA have a capacity of modifying a target gene encoding the natural or artificial protein, in order to treat a disease or disorder associated with the target gene in a subject.

[0098] In certain embodiments, the target gene is KLKB1. In more certain embodiments, the present disclosure provides a composition for reducing or eliminating the expression or function of the gene products of KLKB1 gene in a subject. Specifically, the reduction or elimination will occur in a cell, an organ or s tissue in the subject. In some embodiments, the subject suffers from one or more diseases associated with one or more abnormalities of KLKB1. In some embodiments, the abnormality of KLKB1 could be the overexpression of KLKB1. In some embodiments, the abnormality of KLKB1 could be the mutation (e.g., insertion, deletion, or substitution) of the product of KLKB1. In some embodiments, the abnormality of KLKB1 could be the variation (e.g., copy number variation, or epigenetic modification) of the product of KLKB1. In some embodiments, the disease associated with one or more abnormalities of KLKB1 is selected from the group consist of angioedema (e.g., hereditary angioedema) , cardiovascular disease (e.g., hypertension) , kidney disease (e.g., lupus nephritis, or systemic lupus erythematosus) , and tumor (e.g., colorectal cancer) .

[0099] In certain embodiments, the target gene is TTR. In more certain embodiments, the present disclosure provides a composition for reducing or eliminating the expression or function of the gene products of TTR gene in a subject. Specifically, the reduction or elimination will occur in a cell, an organ or s tissue in the subject. In some embodiments, the subject suffers from one or more diseases associated with one or more abnormalities of TTR. In some embodiments, the abnormality of TTR could be the overexpression of TTR. In some embodiments, the abnormality of TTR could be the mutation (e.g., insertion, deletion, or substitution) of the product of TTR. In some embodiments, the abnormality of TTR could be the variation (e.g., copy number variation, or epigenetic modification) of the product of TTR. In some embodiments, the disease associated with one or more abnormalities of TTR is selected from the group consist of transthyretin amyloidosis (e.g., hereditary or wild-type transthyretin amyloidosis) , central nervous system disorders, diabetes, and lipid metabolic disorders. Examples

[0100] The following examples are set forth so as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present invention, and are not intended to limit the scope of what the inventors regard as their invention nor are they intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (e.g., amounts, temperature, etc. ) but some experimental errors and deviations should be accounted for. Unless indicated otherwise, parts are parts by weight, molecular weight is weight average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or near atmospheric. Standard abbreviations may be used, e.g., bp, base pair (s) ; kb, kilobase (s) ; pl, picoliter (s) ; s or sec, second (s) ; min, minute (s) ; h or hr, hour (s) ; aa, amino acid (s) ; nt, nucleotide (s) ; i.m., intramuscular (ly) ; i. p., intraperitoneal (ly) ; s. c., subcutaneous (ly) ; and the likes. Example 1. Analysis of the on-target cleavage efficiencies Guide RNA (gRNA)

[0101] gRNAs without modifications were in vitro transcribed using T7 RNA polymerase (NEB, E2050S) following the user’s guide. Chemically modified gRNAs were commercially customized. In vitro transcription of the Cas mRNA

[0102] The coding sequence of the target protein was inserted into the plasmid to form the DNA template which contains sequences of the target protein (e.g. AaCas12bMax protein) , 5’a nd 3’ UTRs, and a T7 promoter upstream of the 5’ UTR. PCR products which contain a poly A tail from the above plasmid is used for in vitro transcription (IVT) . T7 RNA polymerase recognizes the T7 promoter of the DNA template and initiates the in vitro mRNA transcription. The 5’ cap structure of the in vitro transcribed mRNA was capped by the addition of cap analogs during IVT and N1-methyl-pseudo-U was used to substitute UTPs. All IVT reactions were performed at 37 ℃ for 2 hours. And DNA template is removed by DNase I at 37 ℃ for 30 minutes, then column-purification performed to obtain full length IVT mRNA. Cell culture

[0103] HepG2 was purchased from American Type Culture Collection (ATCC) . Hep3B, Huh7, Neuro2A Hepa1-6 and Huh7 cells were purchased from Wuhan Pricella Biotechnology Co., Ltd.. HEK293 cells were purchased from ATCC. HepG2, Hep3B, Huh7 Hepa1-6 and HEK293 cells were maintained in DMEM + 10%FBS and passaged every 3 days by TrypLE. Aa-Cas12b mRNA and gRNA transfection

[0104] 24 hours before transfection, HepG2, Hep3B, Huh7, Neuro2A Hepa1-6 and Huh7 cells were inoculated into 96-well plates at the density of 1×104 cells / well. 50 ng AaCas12bmax mRNA and 120 ng gRNA or 100 ng AaCas12bmax mRNA and 114 ng gRNA or otherwise indicated amounts of AaCas12bmax mRNA and gRNA were transfected using Lipofectamine 3000 Transfection Reagent (Invitrogen, L3000008) following the user’s guide. 72 hours after transfection, cells were collected for analysis of the indel frequency. Primary hepatocytes

[0105] Primary human hepatocytes (PHH) were recovered and inoculated into 96-well plates at a density of 2×105 cells / well in plating medium. Primary cynomolgus monkey hepatocytes (PCH) were recovered and inoculated into 96-well plates at a density of 1.5×105 cells / well in plating medium. After overnight cell recovery, cell media were changed to the maintenance medium and then replaced with fresh media every 2 days. PHH (lot. HUM182641) was purchased from Lonza. PCH (lot. 20210127) , PHH (lot. 386549) and PHH (lot. 201904001) were purchased from Liver Biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd.. PCH (lot. CCH100CY-V09555) was purchased from Milestone Biological Science &Technology Co., Ltd.. Lipid nanoparticle formulation for cells and mouse

[0106] Lipid Nanoparticles were prepared by mixing the RNA containing aqueous phase which contains Cas mRNA and gRNA with the lipid containing ethanol phase. The two phases were mixed by using a microfluidic mixing process with a standard staggered herringbone mixer.

[0107] The ethanol phase was prepared by adding (1) an ionizable cationic lipid, L52715, structure was shown in Table 3, or SM102 (2) a neutral lipid, specifically DSPC, (3) a steroid, specifically cholesterol, and (4) a PEG lipid, specifically DMG-PEG2000 into ethanol (PEG-DMG) . The ratio of the lipid components was 50: 10: 38.5: 1.5 mol%of ionizable cationic lipid: DSPC: cholesterol: PEG-DMG. Table 3. Structure of L52715.

[0108] RNA was dissolved in 50 mM sodium citrate buffer (pH = 4.0) at a concentration of 0.1 mg / mL. The weight ratio of the RNA molecules to the ionizable cationic lipid was kept at 1: 10 (the cationic lipid amine to RNA phosphate (N: P) molar ratio is about 4.5) . The ratio of Aa-Cas12b mRNA: sgRNA was approximately 1: 1, by weight of the RNA components, unless indicated otherwise. The LNP concentration was determined by the concentration of total RNA.

[0109] The lipid solution (ethanol phase) was injected at 1 mL / min, and aqueous phase was injected at 3 mL / min into the mixer. The volume ratio of the aqueous phase to the ethanol phase was 3: 1. The mixed LNP solution was subjected to dialysis to remove ethanol and achieve buffer exchange. Dialysis was conducted twice against Tris-HCl Solution (20 mM, pH 7.4) at volumes about 2500 times that of the mixed solution using Slide-A-Lyzer cassettes (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, Ill. ) with a molecular weight cutoff of 100 KD at 4℃ overnight. Then the LNPs were concentrated using 100 kDa Amicon spin filter (centrifugation at 4,000 ×g at 4℃. ) to achieve the desired concentration. Finaly, 40%sucrose solution was added to give rise to the final nanoparticle solution with 8%sucrose for storage at -80℃. Lipid nanoparticle formulation for non-human primates

[0110] Lipid nanoparticles for non-human primates (NHP) were prepared by mixing the RNA containing aqueous phase with the lipid containing ethanol phase using T-Junction mixer.

[0111] The ethanol phase was prepared by adding (1) an ionizable cationic lipid, L52715, (2) a neutral lipid, DSPC, (3) a steroid, cholesterol, and (4) a PEG lipid, DMG-PEG2000 into ethanol (PEG-DMG) . The ratio of the lipid components was 40: 47.5: 10: 2.5 mol%of L52715: DSPC: cholesterol: PEG-DMG.

[0112] RNA was dissolved in acetic acid buffer (pH = 5.0) at a concentration of 0.2 mg / mL. The cationic lipid amine to RNA phosphate (N: P) molar ratio is about 6. The weight ratio of Aa-Cas12b mRNA: sgRNA was approximately 1: 1.

[0113] The volume ratio of the aqueous phase to the ethanol phase was 3: 1. The mixed LNP solution was subjected to Tangential Flow Filtration (TFF) to buffer exchange and concentration. Finally, Tris-HCl Solution (20 mM, pH 7.4) with 40%sucrose was added to make the final nanoparticle formulation to be Tris-HCl Solution (20 mM, pH 7.4) with 8%sucrose. Then LNP was stored at -80 ℃. Lipid nanoparticle (LNP) delivery in vitro

[0114] 24 hours before transfection, HepG2, Hep3B, Huh7, Neuro2A and Hepa1-6 cells were inoculated into 96-well plates at a density of 1×104 cells / well. On the day of LNP delivery, LNPs were diluted to the desired concentration in DMEM + 10%FBS. Cell media were then replaced with DMEM + 10%FBS plus the above LNP mixture.

[0115] 48 hours before LNP delivery, PHH or PCH were recovered and inoculated to 96-well plated at the indicated density. On the day of LNP delivery, LNPs were diluted to the desired concentration in the maintenance medium + 6%FBS, then replaced by maintenance medium + 6%FBS plus the LNP mixture described earlier. 6 hours or overnight after LNP delivery, cell medium was aspirated and replaced by the maintenance medium. 72 hours after LNP delivery, cell supernatants and cells were collected for indel frequency analysis and the detection of prekallikrein 1B protein level (Abcam, ab202405, indicating the expression level of KLKB1) . LNP delivery in vivo

[0116] C57BL / 6J mice, ranging 6-8 weeks of age were used for the studies. Animals were weighed and grouped randomly. LNP were diluted in PBS or normal saline to the desired concentration and intravenously injected via the lateral tail vein in a volume of 100-200 μL / animal. The animals were observed at approximately 6 hours post dose for adverse effects. Animals were euthanized at various time points. Liver tissues were collected for DNA extraction. Plasma (sodium citrate) samples were collected for the ELISA detection of total kallikrein. In vivo study in non-human primates

[0117] The management and use of animals during the study followed the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011) issued by the US National Research Council, the Regulations on the Administration of Laboratory Animals (revised in 2017) issued by the Science and Technology Commission of China, and the Management Measures for Experimental Animals in Jiangsu Province issued by the Experimental Animal Management Association of Jiangsu in 2008. The animal application and management used in this experiment has been approved by the Animal Management and Use Committee (IACUC) of Shanghai InnoStar Bio-tech Co., Ltd..

[0118] Male cynomolgus monkeys aged at 3-5 years old, weighing 3-5 kg were used. On the day before dosing (Day 0) , animals received immunosuppression by intramuscularly injection of 1 mg / kg dexamethasone. On the dosing day (Day 1) , animals received immunosuppression by intramuscularly injection of 1 mg / kg dexamethasone, 0.5 mg / kg famotidine and 5 mg / kg diphenhydramine. One hour after immunosuppressor injection, LNPs at the indicated concentrations were intravenously infused. Plasma (sodium citrate) were collected before dosing and on days 2, 4, 8, 15, 29 for the analysis of total kallikrein concentration and kallikrein activity analysis. Liver biopsy was conducted on days 15 and 29 for the analysis of on-and off-target editing efficiency. Vascular leakage study

[0119] The HAE attack has been described as increased vascular permeability which causes angioedema. Evans Blue, an albumin-binding dye, which indicates the vascular permeability, has been used in the studies of edema and vascular leakage. Under normal physiological conditions, albumin cannot cross epithelium. While under pathologic conditions with increased vascular permeability, epithelium is no longer impermeable to albumin. When there is Evans Blue binding, the blue dye can be visible in the nose, ears and feet; after extraction by formamide, Evans Blue inside tissues can be quantified.

[0120] An induced model was used to mimic the HAE attack. Bradykinin, a hexapeptide generated from the cleavage of high-molecular-weight kininogen, plays a key role in vasodilation and is a well-known mediator of swelling in HAE. Angiotensin converting enzyme (ACE) mediated the hydrolysis of bradykinin. ACE inhibitor, captopril, inhibit the hydrolysis of bradykinin and therefore increases basal permeability. Dextran sulfate (DSS) is a classically used inducer for mouse colitis. An increase in colonic mucosal permeability has been identified in the DSS-induced murine colitis. In our studies, we used captopril and DSS to increase basal vascular permeability. The lower of Evans Blue inside tissues indicated the effect of KLKB1 editing.

[0121] The vascular leakage study was described as below. At first, 2.5 mg / kg captopril was intraperitoneal injected to mice. 15 minutes later, a mixture of Evans Blue (30 mg / kg) and DSS (0.3 mg / kg) was intravenously injected via the lateral tail vein. Another 15 minutes later, mice were euthanized, the colon, small intestine and both hind feet were removed and extracted by 1 mL formamide at 55℃. After overnight extraction, the supernatants were measured at 600 nm for quantification. Detection of plasma total kallikrein concentration

[0122] 1 μg / mL mouse anti-KLKB1 antibody (Sino Biological, STY28 MM10) in 1× PBS (pH 7.4) was coated onto a 96-well microplate (CORNING) overnight at 4℃. After washing three times with wash buffer (PBST, PBS with 0.05%Tween 20, pH7.4) , the plate was blocked with a blocking solution (5%bovine serum albumin (BSA) in 1× PBS) for 2 hours at room temperature. Plasma samples and standards (Arco, KL1-H52H9) were applied diluted in a 1%BSA-PBST solution and incubated for 2 hours at room temperature. After washing, Biotin-labeled anti-KLKB1 antibody was used as the detector antibody (Vitalgen, Biotin-STY28 MM07) at a 1: 2000 dilution in a 1%BSA-PBST solution and incubated for 1 hour at room temperature. Next, a 1: 200 dilution of streptavidin-HRP (R&D Systems, DY998) was added, and the plates were incubated for 30 minutes at room temperature. TMB Single-Component Substrate solution (Solarbio, PR1200) was then added and allowed to develop for 15 minutes before ELISA stop solution (Solarbio, C1058) was added to stop the reaction. The absorbance at 450 nm (with a reference wavelength of 630 nm) was analyzed using a SpectraMax ix3 microplate reader (Molecular Devices) . Detection of plasma kallikrein activity

[0123] Plasma samples were diluted 90-fold with assay buffer (20 mmol / l of Tris-HCl [pH 7.5] ; 150 mmol / L of NaCl, 1 mmol / L of EDTA, 0.1%polyethylene glycol 8000, and 0.1%Triton X-100) . Subsequently, 90 μL of the diluted samples were added to a 96-well microplate. After 10 minutes of adding of 10 μL of 0.1 mmol / L fluorogenic substrate H-Pro-Phe-Arg-AMC (Sigma-Aldrich, P9273) , fluorescence values were then measured in a SpectraMax i3x plate reader (Molecular Devices) , with excitation and emission wavelengths at 380 and 460 nm, respectively. The activity of KLKB1 was evaluated based on fluorescence signal values, with the enzyme activity in the pre-dose plasma sample set at 100%. The percentage of activity after administration was calculated using the following formula: KLKB1 activity (%) = (postdose fluorescence values  / predose fluorescence values) × 100. DNA editing efficiency analysis

[0124] For cell samples, cells were lysed and genomic DNAs were extracted using One Step Mouse Genotyping Kit (Vazyme, PD101-01) . For liver tissue samples, tissues were homogenized and genomic DNA were extracted using FastPure Cell / Tissue DNA Isolation Mini Kit (Vazyme, DC102-01) .

[0125] To qualitatively determine the frequency of insertions and deletions (indels) at the target site, T7E1 assay was utilized. PCR primers around the target sites were designed and the genomic areas of interest were amplified. Primer sequences were listed below in Table 4. The PCR reactions were performed and products were annealed and later digested by T7 Endonuclease I (NEB, M0302L) to reveal fragments with indels by agarose gel electrophoresis. Table 4. Primer sequences used for the T7E1 assay

[0126] To quantitatively determine the frequency of insertions and deletions (indels) at the target site, next generation sequencing (NGS) was utilized. PCR primers around the target sites were designed and the genomic areas of interest were amplified. Primer sequences were listed below in Table 5. A second round of PCR was performed to add the needed DNA motifs for Illumina sequencing (VAHTS Dual UMI UDI Adapters Set 1-4 for Illumina, N351-N354) . The amplicons were sequenced on Novaseq S4 (Illumina) . The reads were analyzed on Cas-Analyzer and the indel frequencies were calculated. Table 5. Primer sequences used for NGS Example 2. In vitro and in vivo evaluation of the modified gRNAs

[0127] Four loci without AaCas12b protein binding were identified [3, 4] (A-domain to D-domain as described herein, FIG. 1) . 2’-OMe and phosphorothioate were introduced to the four loci and the spacer. gRNAs with single locus modification or with combined modifications were designed as listed in Table 2. gRNAs were chemically synthesized by commercial vendors.

[0128] gRNAs (SEQ ID NOs: 1-38) were transfected together with the AaCas12b mRNA into Hep3B and Huh7 cells. T7E1 and NGS were used to determine the indel frequencies. As shown in FIGs. 2A-2C, compared to the unmodified control (SEQ ID NO: 1) , some of the modified gRNAs enhanced the editing efficiency while some others decreased the editing efficiency.

[0129] In another experiment, gRNAs (SEQ ID NOs: 1-3, 6, 8, 9, 14, 24, 26, 30, 34-36, 39-44) were transfected together with the AaCas12b mRNA into HepG2, Hep3B and Huh7 cells at the concentrations of 1 and 0.33 pmol. The T7E1 results and indel frequencies based on NGS were shown in FIGs. 3A-3L.

[0130] In another experiment, gRNAs (SEQ ID NOs: 1-3, 6, 8, 9, 14, 24, 26, 30, 34-36, 39-54) were transfected together with the AaCas12b mRNA into HepG2, Hep3B and Huh7 cells at the concentration of 0.33 pmol. The T7E1 results and indel frequencies based on NGS were shown in FIGs. 4A-4F.

[0131] We observed that 2’-OMe on D-domain (FIG. 5A) , 2’-OMe on A-domain and D-domain (FIG. 5B) , and 2’-OMe on A-domain to C-domain with short 2’-OMe on D-domain (FIG. 5C) steadily enhanced editing efficiency. To further evaluate the above 3 modification patterns, more gRNAs were synthesized. In SEQ ID NOs: 1-54, spacers of 20 nt was included, with 3 additional nucleotides added to the 3’ (UUU) end of the gRNAs. Results from a parallel study revealed that replacing the 20 nt length spacer and the 3 additional nucleotides on the 3’ end (UUU) with a 23 nt length spacer enhanced the editing efficiency. Hence, in SEQ ID NOs: 55-69, spacers of 23 nt were used to replace the 20 nt spacers and the UUU.

[0132] LNPs containing AaCas12b mRNA and gRNA were generated. LNPs carrying gRNAs targeting the human KLKB1 (SEQ ID NOs: 55-57) were delivered into Hep3B cells, Huh7 cells and PHH (lot 386549) . The T7E1 results were shown in FIGs. 6A-6C.

[0133] LNPs carrying gRNAs targeting the human KLKB1 (SEQ ID NOs: 58-60) were delivered into PHH (lot 201904001) , PHH (lot 386549) and PCH (lot CCH100CY-V09555) . The T7E1 results and indel frequencies based on NGS were shown in FIGs. 7A-7D.

[0134] LNPs carrying gRNAs targeting the human TTR (SEQ ID NOs: 61-63) were delivered into Huh7 cells. The T7E1 results were shown in FIG. 8.

[0135] LNPs carrying gRNAs targeting the mouse TTR (SEQ ID NOs: 64-69) were delivered into Neuro2A and Hepa1-6 cells. The T7E1 results were shown in FIGs. 9A-9B.

[0136] To evaluate modification patterns in vivo, LNPs carrying gRNAs targeting the mouse TTR (SEQ ID NOs: 67-69) were intravenously injection into the wild type C57BL / 6J mice. The indel frequencies of the liver TTR gene at 7 days after dosing were analyzed (FIGs. 10A-10B) .

[0137] The in vitro and in vivo results on the targets evaluated revealed that 2’-OMe on D-domain (FIG. 5A) , 2’-OMe on A-domain and D-domain (FIG. 5B) , and 2’-OMe on A-domain to C-domain with short 2’-OMe on D-domain (FIG. 5C) all mediated robust gene editing. Among the various modifications, 2’-OMe on A-domain and D-domain mediated the most robust and consistent activity. As the spacer sequence may have effects on the gRNA structure, it would be prudent to evaluate and identify the best modification pattern for each different spacer. Example 3. in vitro efficacy study in PHH

[0138] Deeply modified gRNA with 23 nt spacer was designed and synthesized, of which the sequence was listed in Table 6. gRNA (SEQ ID NO: 59) together with Cas12bMax mRNA were packaged into LNP for evaluating efficacy in PHH (lot: HUM182641) and PCH (lot: CCH100CY-V09555) . Indel frequency and supernatant kallikrein level were analyzed (FIGs. 11A-11B) . The results suggested dose-dependent indel increase and total kallikrein reduction. 3 days after LNP administration, NGS were used to evaluate the editing efficiency. ELISA was used to evaluate the prekallikrein 1B level in the supernatant. Table 6. Chemically modified gRNA with 23 nt spacer Example 4. off-target evaluation of human KLKB1

[0139] Off-target editing of human KLKB1 gRNA was evaluated by TAG-seq. 1 off-target site was detected in 2 of 10 batches of repeat study on HEK293 (FIG. 12) . The potential off-target site locates at the intron of PCDH7 where the closest exon nearby is 5 kilobases away. Example 5. in vivo efficacy study in huKLKB1 mice

[0140] To evaluate human KLKB1 gRNA in vivo, we constructed a KLKB1 humanized (huKLKB1) C57BL / 6J mouse with an in situ substitution of the exons 2-3 by the human counterpart. LNP carrying Aa-Cas12bMax mRNA and chemically modified human KLKB1 gRNA (SEQ ID NO: 59) was intravenously injected into male huKLKB1 mice (n = 3) via the lateral tail vein at the concentrations of 0.1, 0.3 and 1 mg / kg. At 2 weeks after LNP administration, vascular leakage study, plasma total kallikrein level detection and liver KLKB1 editing efficiency analysis were conducted (FIGs. 13A-13D) as described in Example 1. The results revealed a dose-dependent reduction of Evans Blue in colon, small intestine and hind limbs, suggesting a functional reduction of vascular permeability (FIGs. 13A-13C) . What’s more, dose-dependent increase of liver KLKB1 editing efficiency and reduction of plasma total kallikrein level were observed (FIG. 13D) . Example 6. in vivo study in non-human primates

[0141] Since human KLKB1 gRNA is homologous to cynomolgus monkey, in vivo editing study in cynomolgus monkey was conducted. LNP carrying Aa-Cas12bMax mRNA and chemically modified human KLKB1 gRNA (SEQ ID NO: 59) was intravenously injected into cynomolgus monkey at the concentrations of 0.3 mg / kg, 1 mg / kg, 3 mg / kg and 6 mg / kg. Liver biopsy was conducted at the day 15 and day 29 after LNP administration. Indel frequency increases in a dose-dependent manner (FIG. 14A) . The highest indel frequency was detected as 64.3%which was observed on the liver sample of the 3 mg / kg group at day 29 (FIG. 14A) . What’s more, plasma total kallikrein level decreases dose-dependently (FIG. 14B) . One week after LNP administration, the 3 mg / kg and 6 mg / kg group reached a therapeutically meaningful level of 60%plasma kallikrein activity reduction (FIG. 14C) . The off-target site detected in example 4 was analyzed in the liver sample. The indel frequency was analyzed using NGS as below 0.0001% (FIG. 14D) .

[0142] While preferred embodiments of the present invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. It is not intended that the invention be limited by the specific examples provided within the specification. While the invention has been described with reference to the aforementioned specifications, the descriptions and illustrations of the embodiments herein are not meant to be construed in a limiting sense. Numerous variations, changes, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the invention. Furthermore, it shall be understood that all aspects of the invention are not limited to the specific depictions, configurations or relative proportions set forth herein which depend upon a variety of conditions and variables. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed in practicing the invention. It is therefore contemplated that the invention shall also cover any such alternatives, modifications, variations or equivalents. It is intended that the following claims define the scope of the invention and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby. 1. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N et al. Multiplex genome engineering  using crispr / cas systems. Science. 2013. 2. Teng F, Cui T, Feng G, Guo L, Xu K, Gao Q et al. Repurposing crispr-cas12b for mammalian  genome engineering. Cell Discovery. 2018; 4: 63. 3. Yang H, Gao P, Rajashankar KR, Patel DJ. Pam-dependent target DNA recognition and  cleavage by c2c1 crispr-cas endonuclease. Cell. 2016; 167: 1814-1828 e1812. 4. Liu L, Chen P, Wang M, Li X, Wang J, Yin M et al. C2c1-sgrna complex structure reveals  rna-guided DNA cleavage mechanism. Mol Cell. 2017; 65: 310-322.

Claims

1.A single guide RNA represented by the following formula (I) : contains:a) An optional 5’-overhang region comprising a contiguous sequence of CCAG, or no nucleotide;b) Stem loop 1 region, comprising a contiguous sequence of GUCGUCUAUAGGACGGC (SEQ ID NO: 123) , wherein the nucleotide residues comprising a region of reverse complementary sequences to form a double helix that ends in a region of an unpaired loop;c) Junction 1 region, comprising a contiguous sequence of GAGUUUU;d) Stem 1 region, containing 18 nucleotides, among which 9 base pairs are formed, wherein Stem 1-F comprises a contiguous sequence of UCAACGGGU, and Stem 1-R comprises a contiguous sequence of GCCCGUUGA;e) Junction 2 region, comprising a contiguous sequence of AAUG;f) Stem loop 2 region, comprising a contiguous sequence of GCCACUUUCCAGGUGGC (SEQ ID NO: 124) , wherein the nucleotide residues comprising a region of reverse complementary sequences to form a double helix that ends in a region of an unpaired loop;g) Junction 3 region, comprising a contiguous sequence of AAA;h) Stem loop 3 region, comprising a contiguous sequence of GCUUCAAAGAAGU (SEQ ID NO: 125) , wherein the nucleotide residues comprising a region of reverse complementary sequences to form a double helix that ends in a region of an unpaired loop;i) Stem 2 region, containing 10 nucleotides, among which 5 Watson-Crick pairs are formed, wherein Stem 2-F comprises a contiguous sequence of GUGCC, and Stem 2-R comprises a contiguous sequence of GGCAC;j) Spacer region, ranging from 18 to 35 nucleotides represented by N in formula (I) which is independently Adenine (A) , Guanine (G) , Cytosine (C) or Uracil (U) ;wherein solid line linked nucleotide residues of formula (I) represent formation of the Watson-Crick pairs to form a double helix, the dotted line linked nucleotide residues of formula (I) represent formation of non-Watson-Crick interactions to form three-dimensional structures; and nucleotide residues are arranged from 5’-terminus to 3’-terminus following the direction of the arrows shown in formula (I) ; and one or more of the regions selected from a) to d) , f) to h) and j) comprise one or more chemical modifications.2.The single guide RNA according to claim 1, wherein said chemical modification comprises a 2’-O-methyl (2’-OMe) modified nucleotide and / or a phosphorothioate (PS) bond between nucleotides.3.The single guide RNA according to claim 1 or 2, wherein the first 3 nucleotide residues at 5’-terminus are 2’-OMe modified and / or the first 4 nucleotide residues at 5’-terminus are linked with PS bonds.4.The single guide RNA according to any one of claims 1-3, wherein said spacer region comprises a targeting region of 18-35 nucleotide residues.5.The single guide RNA according to claim 4, wherein the last 2 or 3 nucleotide residues of said targeting regions are 2’-OMe modified and / or the last 3 or 4 nucleotide residues of said target region are linked with PS bonds.6.The single guide RNA according to any one of claims 1-5, wherein at least one of the following domains comprise one or more said chemical modifications:a) A-domain is consisting of the last 3 nucleotides of said Junction 1 and the first 6 nucleotides of said Stem 1-F;b) B-domain is consisting of the first 8 nucleotides of said Stem loop 2;c) C-domain is consisting of the last 3 nucleotides of said Stem loop 2, all nucleotides of said Junction 3, and the first nucleotide of said Stem 1-R;d) D-domain is consisting of the last 6 nucleotides of said Stem 1-R, and all nucleotides except the last three of said Stem loop 3.7.The single guide RNA according to claim 6, wherein said A-domain comprises one of the following modifications:a) none of the nucleotides of said A-domain is with said chemical modifications; orb) at least one nucleotide is 2’-OMe modified; and / orc) at least one PS bond is formed between nucleotides.8.The single guide RNA according to claim 6 or 7, wherein said B-domain comprises one of the following modifications:a) none of the nucleotides of said B-domain is with said chemical modifications; orb) at least one nucleotide is 2’-OMe modified; and / orc) at least one PS bond is formed between nucleotides.9.The single guide RNA according to any one of claims 6-8, wherein said C-domain comprises one of the following modifications:a) none of the nucleotides of said C-domain is with said chemical modifications; orb) at least one nucleotide is 2’-OMe modified; and / orc) at least one PS bond is formed between nucleotides.10.The single guide RNA according to any one of claims 6-9, wherein said D-domain comprises one of the following modifications:a) none of the nucleotides of said D-domain is with said chemical modifications; orb) at least one nucleotide is 2’-OMe modified; and / orc) at least one PS bond is formed between nucleotides.11.The single guide RNA according to any one of claims 6-10, wherein said A-domain comprises one of the following modifications:a) none of the nucleotides of said A-domain is with said chemical modifications; orb) all nucleotides of said A-domain are 2’-OMe modified; orc) all nucleotides of said A-domain are linked with PS bonds; ord) all nucleotides except the first two and the last two of said A-domain are 2’-OMe modified.12.The single guide RNA according to any one of claims 6-11, wherein said B-domain comprises one of the following modifications:a) none of the nucleotides of said B-domain is with said chemical modifications; orb) all nucleotides of said B-domain are 2’-OMe modified; orc) all nucleotides of said B-domain are linked with PS bonds; ord) all nucleotides except the first two and the last two of said B-domain are 2’-OMe modified; ore) all nucleotides except the first two and the last two of said B-domain are linked with PS bonds; orf) all nucleotides of said B-domain are 2’-OMe modified and linked with PS bonds.13.The single guide RNA according to any one of claims 6-12, wherein said C-domain comprises one of the following modifications:a) none of the nucleotides of said C-domain is with said chemical modifications; orb) all nucleotides of said C-domain are 2’-OMe modified; orc) all nucleotides of said C-domain are linked with PS bonds; ord) all nucleotides except the first two and the last two of said C-domain are 2’-OMe modified; ore) all nucleotides except the first two and the last two of said C-domain are linked with PS bonds; orf) all nucleotides of said C-domain are 2’-OMe modified and linked with PS bonds.14.The single guide RNA according to any one of claims 6-13, wherein said D-domain comprises one of the following modifications:a) none of the nucleotides of said D-domain is with said chemical modifications; orb) all nucleotides of said D-domain are 2’-OMe modified; orc) all nucleotides of said D-domain are linked with PS bonds; ord) all nucleotides except the first two and the last two of said D-domain are 2’-OMe modified; ore) all nucleotides except the first two and the last two of said D-domain are linked with PS bonds; orf) all nucleotides except the first four and the last four of said D-domain are 2’-OMe modified.15.The single guide RNA according to any one of claims 6-14, wherein:a) said A-domain is anyone of the following:i. UUUUCAACG, orii. mUmUmUmUmCmAmAmCmG, oriii. U*U*U*U*C*A*A*C*G, oriv. UUmUmUmCmAmACG; and / orb) said B-domain is anyone of the following:i. GCCACUUU, orii. mGmCmCmAmCmUmUmU, oriii. G*C*C*A*C*U*U*U, oriv. GCmCmAmCmUUU, orv. GCC*A*C*UUU, orvi. mG*mC*mC*mA*mC*mU*mU*mU; and / orc) said C-domain is anyone of the following:i. GGCAAAG, orii. mGmGmCmAmAmAmG; oriii. G*G*C*A*A*A*G, oriv. GGmCmAmAAG, orv. GGC*A*AAG, orvi. mG*mG*mC*mA*mA*mA*mG; and / ord) said D-domain is anyone of the following:i. CGUUGAGCUUCAAAGA (SEQ ID NO: 126) , orii. mCmGmUmUmGmAmGmCmUmUmCmAmAmAmGmA (SEQ ID NO: 127) , oriii. C*G*U*U*G*A*G*C*U*U*C*A*A*A*G*A (SEQ ID NO: 128) , oriv. CGmUmUmGmAmGmCmUmUmCmAmAmAGA (SEQ ID NO: 129) , orv. CGU*U*G*A*G*C*U*U*C*A*A*AGA (SEQ ID NO: 130) , orvi. CGUUmGmAmGmCmUmUmCmAAAGA (SEQ ID NO: 131) ,wherein each m represents the nucleotide residue after it is 2’-OMe modified, and each *represents the nucleotide residue on either side of it is linked with PS bonds.16.The single guide RNA according to any one of claims 1-15, comprising a scaffold sequence having any one of the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 85-122, and said spacer region of 18-35 nucleotide residues.17.The single guide RNA according to any one of claims 1-16, wherein the last 2 or 3 nucleotide residues at 3’-terminus of said spacer region are 2’-OMe modified and / or the last 3 or 4 nucleotide residues at 3’-terminus are linked with PS bonds.18.The single guide RNA according to any one of claims 1-17, wherein at least one nucleotide residue other than the last 3 at 3’-terminus of said spacer region are 2’-OMe modified and / or at least one nucleotide residue other than the last 4 at 3’-terminus of said spacer region are linked with PS bonds.19.The single guide RNA according to any one of claims 1-18, comprising a scaffold sequence having any one of the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 90, 97, or 117, and said spacer region of 18-35 nucleotide residues, wherein the last 3 nucleotide residues at 3’-terminus of said spacer region are 2’-OMe modified and / or the last 3 or 4 nucleotide residues at 3’-terminus are linked with PS bonds.20.The single guide RNA according to any one of claims 1-19, comprising any one of the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 1-69.21.The single guide RNA according to any one of claims 1-20, wherein said RNA is capable of forming a ribonucleoprotein complex with a Cas12b protein.22.The single guide RNA according to any one of claims 1-21, wherein said RNA is capable of forming a ribonucleoprotein complex with a Cas12b protein, for example a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .23.A composition comprising the single guide RNA of any one of claims 1-22, and further comprising a nuclease or an mRNA which encodes the nuclease.24.The composition according to claim 23, wherein said nuclease is a Cas protein.25.The composition according to claim 24, wherein said Cas protein is a Cas12b protein, for example a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .26.A pharmaceutical formulation comprising the single guide RNA of any one of claims 1-22, or the composition of any one of claims 23-25 and a pharmaceutically acceptable carrier.27.A method of modifying a target gene comprising delivering a Cas protein or a nucleic acid encoding said Cas protein, and the single guide RNA of any one of claims 1-22 in vitro or in vivo.28.The method according to claim 23, wherein said Cas protein is a Cas12b protein, for example a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .29.The method according to claim 27 or 28, wherein said method results in a single-or double-stranded cleavage, insertion or deletion of said target gene.30.Use of the single guide RNA of any one of claims 1-22 in preparing a medicament for treating a disease or disorder associated with a target gene.

Images