Interleukin-2 muteins and uses thereof

Abstract

Provided are IL-2 muteins, fusion proteins and methods of use thereof. The fusion proteins include an IL-2 mutein and a Fc region.This disclosure relates to IL-2 muteins, fusion proteins and methods of use thereof. The fusion proteins include an IL-2 mutein and a Fc region.

Description

INTERLEUKIN-2 MUTEINS AND USES THEREOF

[0001] CLAIM OF PRIORITY

[0002] This application claims the benefit of PCT / CN2024 / 105281, filed on July 12, 2024. The entire contents of the foregoing applications are incorporated herein by reference.TECHNICAL FIELD

[0003] This disclosure relates to Interleukin-2 (IL-2) muteins, IL-2 fusion proteins, and uses thereof.BACKGROUND

[0004] Interleukin-2 (IL-2) is a potent stimulator of the immune system activating T cells, NK cells, B cells and monocytes besides stimulating growth of regulatory T cells (Treg) . It was by virtue of these activities that IL-2 was tested and is used as an approved treatment of cancer (aldesleukin,  ) . However, therapeutic administration of IL-2 results in undesirable toxicity.

[0005] To decrease the undesirable toxicity there is a need for IL-2 variants for the treatment of immune disorders or cancer.SUMMARY

[0006] Human interleukin-2 (IL-2) muteins or variants thereof are provided herein. In particular, provided are IL-2 muteins that have a decreased binding capacity for IL-2Rβγreceptor. Such IL-2 muteins find use, for example, as IL-2 partial agonists and antagonists in applications where reduction or inhibition of one or more IL-2 and / or IL-15 functions is useful (e.g., cancer) . Also provided are nucleic acids encoding such IL-2 muteins, methods of making such IL-2 muteins, pharmaceutical compositions that include such IL-2 muteins and methods of treatment using such IL-2 muteins. Also provided are fusion proteins that have decreased toxicity and have pharmacological activity.

[0007] In one aspect, the disclosure is related to a Interleukin-2 (IL-2) polypeptide that comprises one or more of the following: (a) . the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W; and (b) . the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y.

[0008] In some embodiments, the polypeptide further comprises one or more of the following: (a) . the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L; and (b) . the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A.

[0009] In some embodiments, the polypeptide further comprises one or more of the following:

[0010] (a) the amino acid that corresponds to E15 of SEQ ID NO: 1 is P;

[0011] (b) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is F, I, or L;

[0012] (c) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is P or D;

[0013] (d) the amino acid that corresponds to I92 of SEQ ID NO: 1 is S, E, or K;

[0014] (e) the amino acid that corresponds to I93 of SEQ ID NO: 1 is R;

[0015] (f) the amino acid that corresponds to Q126 of SEQ ID NO: 1 is A; and

[0016] (g) the amino acid that corresponds to T133 of SEQ ID NO: 1 is K, P, W, or M.

[0017] In some embodiments, the polypeptide comprises a sequence that is at least 90%, 95%, or 99%identical to SEQ ID NO: 1.

[0018] In some embodiments, the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W. In some embodiments, the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y.

[0019] In some embodiments, the IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of the sequences of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.

[0020] In some embodiments, the polypeptide has a reduced binding affinity to IL-2Rβγ as compared to a wildtype IL-2 polypeptide.

[0021] In one aspect, the disclosure is related to a fusion protein that comprises the polypeptide described herein and a fragment crystallizable region ( “Fc” ) .

[0022] In one aspect, the disclosure is related to a fusion protein that comprises (1) a first polypeptide chain that comprises, from the N-terminus to the C-terminus, optionally a first hinge region, and a first Fc region; and (2) a second polypeptide chain that comprises, from the N-terminus to the C-terminus, a IL-2 polypeptide, optionally a second hinge region, and a second Fc region, wherein the IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:

[0023] (a) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W;

[0024] (b) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y;

[0025] (c) the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L; and

[0026] (d) the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A.

[0027] In some embodiments, the IL-2 polypeptide has a reduced binding affinity to IL-2Rα, IL-2Rβγ and / or IL-2Rαβγ as compared to a wildtype IL-2 polypeptide.

[0028] In some embodiments, the IL-2 polypeptide further comprises one or more of the following:

[0029] (a) the amino acid that corresponds to E15 of SEQ ID NO: 1 is P;

[0030] (b) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is F, I, or L;

[0031] (c) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is P or D;

[0032] (d) the amino acid that corresponds to I92 of SEQ ID NO: 1 is S, E, or K;

[0033] (e) the amino acid that corresponds to I93 of SEQ ID NO: 1 is R;

[0034] (f) the amino acid that corresponds to Q126 of SEQ ID NO: 1 is A; and

[0035] (g) the amino acid that corresponds to T133 of SEQ ID NO: 1 is K, P, W, or M.

[0036] In some embodiments, the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W. In some embodiments, the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y.

[0037] In some embodiments, the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L and the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A.

[0038] In some embodiments, the IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of the sequences of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.

[0039] In some embodiments, an antigen binding domain (e.g., Fab, scFv, or VHH) is linked to the N-terminus of the first polypeptide.

[0040] In one aspect, the disclosure is related to a fusion protein that comprises: (1) a first polypeptide chain that comprises, from the N-terminus to the C-terminus, optionally a first hinge region, a first Fc region, optionally a first linker, and a first IL-2 polypeptide; and (2) a second polypeptide chain that comprises, from the N-terminus to the C-terminus, optionally a second hinge region, a second Fc region, optionally a second linker, and an optional second IL-2 polypeptide, wherein the first and / or second IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:

[0041] (a) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W;

[0042] (b) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y;

[0043] (c) the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L; and

[0044] (d) the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A.

[0045] In some embodiments, the first IL-2 polypeptide and / or the optional second IL-2 polypeptide has a reduced binding affinity to IL-2Rα, IL-2Rβγ, and / or IL-2Rαβγ as compared to a wildtype IL-2 polypeptide.

[0046] In some embodiments, the first IL-2 polypeptide and / or second IL-2 polypeptide further comprises one or more of the following:

[0047] (a) the amino acid that corresponds to E15 of SEQ ID NO: 1 is P;

[0048] (b) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is F, I, or L;

[0049] (c) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is P or D;

[0050] (d) the amino acid that corresponds to I92 of SEQ ID NO: 1 is S, E, or K;

[0051] (e) the amino acid that corresponds to I93 of SEQ ID NO: 1 is R;

[0052] (f) the amino acid that corresponds to Q126 of SEQ ID NO: 1 is A; and

[0053] (g) the amino acid that corresponds to T133 of SEQ ID NO: 1 is K, P, W, or M.

[0054] In some embodiments, the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W. In some embodiments, the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y.

[0055] In some embodiments, the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L and the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A.

[0056] In some embodiments, the first IL-2 polypeptide and / or second IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of the sequences of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.

[0057] In some embodiments, an antigen binding domain (e.g., Fab, scFv, or VHH) is linked to the N-terminus of the first and / or the second polypeptide.

[0058] In one aspect, the disclosure is related to a fusion protein, comprising a first Fc region, a second Fc region, and one or more IL-2 polypeptides, wherein each of the one or more IL-2 polypeptides independently comprises one or more of the following:

[0059] (a) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W;

[0060] (b) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y;

[0061] (c) the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L; and

[0062] (d) the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A,

[0063] In some embodiments, the one or more IL-2 polypeptides have a reduced binding affinity to IL-2Rα, IL-2Rβγ and / or IL-2Rαβγ as compared to a wildtype IL-2 polypeptide.

[0064] In some embodiments, the fusion protein comprises one IL-2 polypeptide, wherein the IL-2 polypeptide is linked to the N-terminus of the second Fc region, optionally via a hinge region.

[0065] In some embodiments, the fusion protein comprises a first IL-2 polypeptide and a second IL-2 polypeptide, wherein (2) the first IL-2 polypeptide is linked to the C-terminus of the first Fc region, optionally via a first linker peptide and (2) the second polypeptide is linked to the C-terminus of the second Fc region, optionally via a second linker peptide.

[0066] In some embodiments, the Fc is human IgG4 Fc.

[0067] In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region is a human IgG4 hinge region optionally with S228P mutation according to EU numbering.

[0068] In some embodiments, the first hinge region and / or the second hinge region comprise an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 87.

[0069] In some embodiments, the first Fc region comprises a knob mutation, and the second Fc region comprises a hole mutation.

[0070] In some embodiments, the first Fc region comprise an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 21; and the second Fc region comprise a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22.

[0071] In some embodiments, the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 21, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 23-41.

[0072] In some embodiments, the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 21, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 26 and 28.

[0073] In some embodiments, the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 43-61, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 63-81.

[0074] In some embodiments, the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 46, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 66.

[0075] In some embodiments, the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 48, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 68.

[0076] In some embodiments, the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 62, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 82.

[0077] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the IL-2 polypeptide described herein, or the fusion protein described herein.

[0078] In some embodiments, the nucleic acid is a DNA (e.g., cDNA) or RNA (e.g., mRNA) .

[0079] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising one or more of the nucleic acids described herein.

[0080] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising the vector described herein.

[0081] In some embodiments, the cell is a CHO cell.

[0082] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising one or more of the nucleic acids described herein.

[0083] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing a IL-2 polypeptide or a fusion protein, the method comprising (a) culturing the cell described herein under conditions sufficient for the cell to produce the IL-2 polypeptide or the fusion protein; and (b) collecting the IL-2 polypeptide or the fusion protein produced by the cell.

[0084] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the IL-2 polypeptide described herein or the fusion protein described herein, to the subject.

[0085] In some embodiments, the cancer is breast cancer, prostate cancer, non-small cell lung cancer, pancreatic cancer, diffuse large B-cell lymphoma, mesothelioma, lung cancer, ovarian cancer, colon cancer, pleural tumor, glioblastoma, esophageal cancer, gastric cancer, synovial sarcoma, thymic carcinoma, endometrial carcinoma, stomach cancer, cholangiocarcinoma, head and neck cancer, blood cancer, or a combination thereof.

[0086] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition comprising the IL-2 polypeptide described herein or the fusion protein described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0087] In one aspect, the disclosure is related to an IL-2 mutein that comprises a decreased binding affinity for IL-2Rbg receptor as compared to wild-type human IL-2 (hIL-2) .

[0088] In some embodiments, provided herein is an IL-2 mutein having a reduced binding affinity for IL-2Rβγ receptor as compared to wild-type human IL-2 (hIL-2) .

[0089] In some embodiments, the IL-2 mutein has at least one amino acid substitution at a position selected from the group consisting of: 15, 16, 91, and 133.

[0090] In some embodiments, the amino acids at positions 15 are substituted by P.

[0091] In some embodiments, the amino acids at positions 16 are substituted by F or W.

[0092] In some embodiments, the amino acids at positions 91 are substituted by P or Y.

[0093] In some embodiments, the amino acids at positions 133 are substituted by K, P, W or M.

[0094] In another aspect, provided herein is an IL-2 mutein fusion protein comprising any one of the IL-2-muteins described herein linked to a human Fc region.

[0095] In some embodiments, the IL-2 mutein has at least one mutation selected from E15P, H16F, H16 W, V91P, V91Y, T133K, T133P, T133M, and T133W numbered in accordance with wild-type hIL-2.

[0096] In some embodiments, the IL-2 mutein further comprises at least one amino acid substitution at a position 15, 16, 91, or 133.

[0097] In some embodiments, the amino acids at positions 15 are substituted by P; the amino acids at positions 16 are substituted by F or W; amino acids at positions 91 are substituted by P or Y; and / or the amino acids at positions 133 are substituted by K, P , W or M.

[0098] In one aspect, the disclosure is related to an IL-2 mutein that comprises a decreased binding affinity for IL-2Rβγ receptor as compared to wild-type human IL-2 (hIL-2) ,

[0099] In some embodiments, the IL-2 mutein has at least one amino acid substitution at a position selected from the group consisting of: 15, 16, 91, and 133.

[0100] In some embodiments, the amino acids at positions 15 are substituted by P; the amino acids at positions 16 are substituted by F or W; the amino acids at positions 91 are substituted by P or Y; and / or the amino acids at positions 133 are substituted by K, P, W or M.

[0101] In some embodiments, the IL-2 mutein further comprises amino acid substitutions R38L and F42A.

[0102] In some embodiments, the IL-2 mutein stimulates T cells proliferation.

[0103] In some embodiments, the IL-2 mutein is T cell activator.

[0104] In one aspect, the disclosure is related to an IL-2-Fc fusion protein comprising a Fc region and the IL-2 mutein described herein.

[0105] In some embodiments, the IL-2-Fc fusion protein comprises an Fc dimer.

[0106] In some embodiments, the IL-2-Fc fusion protein comprises two IL-2 muteins.

[0107] In some embodiments, the IL-2-Fc fusion protein comprises a single IL-2 mutein.

[0108] In one aspect, the disclosure is related to a medicament comprising the IL-2 mutein described herein and / or the IL-2-Fc fusion protein described herein.

[0109] In some embodiments, the medicament is an agent for immune disorders disease (e.g., acute or chronic inflammatory, allergic, autoimmune or infectious diseases, graft-versus-host disease, graft-rejection, or cancer) .

[0110] In one aspect, the disclosure is related to a method of treatment of immune disorders disease (e.g., acute or chronic inflammatory, allergic, autoimmune or infectious diseases, graft-versus-host disease, graft-rejection, or cancer) in a mammal, which comprises administering an effective amount of the IL-2 mutein described herein and / or the IL-2-Fc fusion protein described herein to the mammal.

[0111] In one aspect, the disclosure is related to the use of the IL-2 mutein described herein, the IL-2-Fc fusion protein described herein for the production of an agent for treatment of immune disorders disease (e.g., acute or chronic inflammatory, allergic, autoimmune or infectious diseases, graft-versus-host disease, graft-rejection, or cancer) .

[0112] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for autonomous growth. Examples of such cells include cells having an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include cancerous growths, e.g., tumors; oncogenic processes, metastatic tissues, and malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. Also included are malignancies of the various organ systems, such as respiratory, cardiovascular, renal, reproductive, hematological, neurological, hepatic, gastrointestinal, and endocrine systems; as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, non-small cell carcinoma of the lung, and cancer of the small intestine. Cancer that is “naturally arising” includes any cancer that is not experimentally induced by implantation of cancer cells into a subject, and includes, for example, spontaneously arising cancer, cancer caused by exposure of a patient to a carcinogen (s) , cancer resulting from insertion of a transgenic oncogene or knockout of a tumor suppressor gene, and cancer caused by infections, e.g., viral infections. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues. The term also includes carcinosarcomas, which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation. The term “hematopoietic neoplastic disorders” includes diseases involving hyperplastic / neoplastic cells of hematopoietic origin. A hematopoietic neoplastic disorder can arise from myeloid, lymphoid or erythroid lineages, or precursor cells thereof. A hematologic cancer is a cancer that begins in blood-forming tissue, such as the bone marrow, or in the cells of the immune system. Examples of hematologic cancer include e.g., leukemia, lymphoma, and multiple myeloma etc.

[0113] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present disclosure is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated in the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0114] As used herein, the terms “polypeptide, ” “peptide, ” and “protein” are used interchangeably to refer to polymers of amino acids of any length of at least two amino acids.

[0115] As used herein, the terms “polynucleotide, ” “nucleic acid molecule, ” and “nucleic acid sequence” are used interchangeably herein to refer to polymers of nucleotides of any length of at least two nucleotides, and include, without limitation, DNA, RNA, DNA / RNA hybrids, and modifications thereof.

[0116] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The length of a reference sequence aligned for comparison purposes is at least 80%of the length of the reference sequence, and in some embodiments is at least 90%, 95%, or 100%. The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0117] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. Methods and materials are described herein for use in the present disclosure; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0118] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0119] FIG. 1 shows the structure of IL-2 complex containing IL-2 and its intermediate affinity receptor IL-2Rβγ. Four residues having close proximity with the receptor are labeled.

[0120] FIGS. 2A-2B show exemplary structures of IL-2 Fc fusion proteins. FIG. 2A shows a monovalent, N-terminal fusion (e.g., B#IL-2) ; FIG. 2B shows a bivalent C-terminal fusion (e.g., CD#IL-2) . K and H indicate the knob-in-hole structure formed by the Fc.

[0121] FIG. 3 shows STAT5 phosphorylation of human CD4, CD8, Treg and NK cells induced by IL-2-Fc fusions.

[0122] FIG. 4 shows STAT5 phosphorylation of human CD4, CD8, Treg and NK cells induced by monovalent N-terminal fusions of normal IL-2Rα binding version (B#IL-2) and low affinity IL-2Rα binding version (B#la-IL-2) of IL-2-Fc fusions.

[0123] FIG. 5 shows STAT5 phosphorylation of human CD4, CD8, Treg and NK cells induced by monovalent N-terminal fusions of WT IL-2 and its variants.

[0124] FIG. 6 shows STAT5 phosphorylation of human CD4, CD8, Treg and NK cells induced by bivalent C-terminal fusions of WT IL-2 and its variants.

[0125] FIG. 7 shows STAT5 phosphorylation of mouse CD4, CD8, Treg and NK cells induced by bivalent C-terminal fusions of WT IL-2 and its variants.

[0126] FIG. 8 shows STAT5 phosphorylation of mouse CD4, CD8, Treg and NK cells induced by monovalent N-terminal fusions of WT IL-2 and its variants.

[0127] FIGS. 9A-9C show toxicity of IL-2-Fc fusions in monovalent, N-terminal (FIG. 9A) and bivalent C-terminal (FIG. 9B) formats, as measured by highest non-lethal dose (NLD) . Arrows in FIG. 9B indicate that the highest NLD are equal to or higher than the value of 11 mpk. FIG. 9C shows the specific death rates at different dosages.

[0128] FIG. 10 lists sequences discussed in the disclosure.DETAILED DESCRIPTION

[0129] The present disclosure provides IL-2 muteins and IL-2-Fc fusion proteins. In some embodiments, the IL-2 muteins include one or more mutations with respect to wildtype IL-2 (e.g., SEQ ID NO: 1) . In some embodiments, the IL-2 muteins comprise one or more amino acid mutations at positions corresponding to H16 and / or V91 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IL-2 muteins include an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 1-19 (preferably SEQ ID NO: 4 or 6) . In some embodiments, the IL-2 muteins include the H16W mutation with respect to SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IL-2 muteins include the V91Y mutation with respect to SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IL-2 muteins comprise the R38L and F42A mutations with respect to SEQ ID NO: 1.

[0130] In one aspect, the disclosure relates to IL-2-Fc fusion proteins that comprise any one of the IL-2 muteins described herein and a Fc region. Without wishing to be bound by theory, linking the IL-2 muteins to the Fc region can extend the serum half-life of the IL-2 muteins. In some embodiments, the IL-2-Fc fusion protein or the protein construct comprises 1, 2, 3, 4, 5, or 6 IL-2 muteins. In some embodiments, the IL-2-Fc fusion protein comprises two or more IL-2 muteins. In some embodiments, the Fc comprises a first Fc region and a second Fc region. In some embodiments, the first and / or the second Fc region can be identical and can form a Fc homodimer. In some embodiments, the first and / or the second Fc region include all or a portion of the Fc region of an immunoglobulin, e.g., human IgG4 Fc region (SEQ ID NO:88) or human IgG1 Fc region (SEQ ID NO: 90) . In some embodiments, the first Fc region can comprise a knob mutation, and the second Fc region can comprise a hole mutation. In some embodiments, the first and / or the second Fc region include an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 21 or 22.

[0131] Without wishing to be bound by theory, the IL-2 muteins and IL-2-Fc fusion proteins described herein can be used for cancer treatment by modulating T cell and NK cell functions through activation of IL-2 / IL-2R pathway.

[0132] IL-2 muteins

[0133] In one aspect, the present disclosure provides IL-2 variants / muteins having at least one mutation. In some embodiments, one or two amino acid residues in a wild-type human IL-2 (e.g., SEQ ID NO: 1) are selectively mutated. In some embodiments, the mutations do not substantially change the overall structure of IL-2. In some embodiments, the IL-2 variants / muteins described herein can bind to the IL-2 receptors (e.g., IL-2Rα, IL-2Rβγ, IL-2Rαβγ) , and induce downstream signaling. In some embodiments, the IL-2 variants / muteins described herein have reduced binding to the IL-2 receptor (e.g., IL-2Rβγ) , as compared to wildtype IL-2.

[0134] IL-2 is an interleukin, a type of cytokine signaling molecule in the immune system. It is a 15.5-16 kDa protein that regulates the activities of white blood cells (leukocytes, often lymphocytes) that are responsible for immunity. IL-2 is part of the body's natural response to microbial infection, and in discriminating between foreign ( "non-self" ) and "self. ” Human IL-2 (NCBI reference sequence: NP_000577.2; UniProt ID: Q0GK43) is a 153 amino acid protein that includes, from N-terminus to C-terminus, a signal peptide (corresponding to amino acids 1-20) , and a soluble chain (corresponding to amino acids 21-153) .

[0135] IL-2 is a member of a cytokine family, each member of which has a four-alpha helix bundle. The family also includes IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 and IL-21. IL-2 signals through the IL-2 receptor, a complex having three chains, i.e., interleukin-2 receptor alpha chain (or IL-2RΑ, CD25) , interleukin-2 receptor subunit beta (or IL-2RB, CD122) and interleukin-2 receptor subunit gamma (or IL-2RG, common gamma chain, CD132) . The gamma chain is shared by all family members. IL-2 has essential roles in key functions of the immune system, tolerance and immunity, primarily via its direct effects on T cells. For example, in the thymus, where T cells mature, it prevents autoimmune diseases by promoting the differentiation of certain immature T cells into regulatory T cells, which suppress other T cells that are otherwise primed to attack normal healthy cells in the body. IL-2 also promotes the differentiation of T cells into effector T cells and into memory T cells when the initial T cell is also stimulated by an antigen, thus helping the body fight off infections. Interestingly, IL-2 can stimulate immune response by regulating effector T cells (primarily expressing IL-2RB and IL-2RG) , and dampen immune response by regulating regulatory T cells (primarily expressing IL-2RΑ, IL-2RB, and IL-2RG) .

[0136] The trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ comprises three subunits: α (CD25) , β(CD122) , and γ (γcommon) . The dimeric IL-2Rβγ comprises two subunits: β (CD122) , and γ(γcommon) . The trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ is typically expressed at high levels by Treg cells, whereas the dimeric IL-2Rβγ is expressed mostly on activated CD8+ T cells and NK cells. Low-dose IL-2 therapy preferentially activates Treg cells because of the constitutive high expression of IL-2Rα.

[0137] A detailed description of IL-2, IL-2R and their functions can be found, e.g., in Muhammad, Shan, et al. "Reigniting hope in cancer treatment: the promise and pitfalls of IL-2 and IL-2R targeting strategies. " Molecular cancer 22.1 (2023) : 121; Abbas, Abul K., et al. "Revisiting IL-2: Biology and therapeutic prospects. " Science immunology 3.25 (2018) : eaat1482; Spolski, Rosanne, Peng Li, and Warren J. Leonard. "Biology and regulation of IL-2:from molecular mechanisms to human therapy. " Nature Reviews Immunology 18.10 (2018) : 648-659; Arenas-Ramirez, Natalia, Janine Woytschak, and Onur Boyman. "Interleukin-2: biology, design and application. " Trends in immunology 36.12 (2015) : 763-777, each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0138] The present disclosure provides engineered IL-2 variants / muteins having at least one mutation. In some embodiments, one or two amino acid residues in a wild-type human IL-2 (e.g., SEQ ID NO: 1) are selectively mutated. In some embodiments, the mutations do not substantially change the overall structure of IL-2. In some embodiments, the engineered IL-2 variants described herein can bind to the IL-2 receptor, and induce downstream signaling. In some embodiments, the engineered IL-2 variants can selectively activate Treg cells while minimizing the activation of effector T cells. In some embodiments, the IL-2 muteins include an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 1.

[0139] In some embodiments, the IL-2 muteins include one or more mutations with respect to wildtype IL-2 (e.g., SEQ ID NO: 1) . In some embodiments, the IL-2 muteins comprise one or more amino acid mutations at positions corresponding to H16, V91, I92, I93 and / or Q126 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IL-2 muteins include one or more of the following mutations: H16W, V91Y, I92S, Q126A, V91D, H16I, H16L, I92E, I92K, and I93R, with respect to SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IL-2 muteins include one or more of the following mutations: H16W, V91Y, I92S, Q126A, and V91D, with respect to SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IL-2 muteins include one or more of the following mutations: H16W and V91Y, with respect to SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IL-2 muteins include an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NO: 1-19 (preferably SEQ ID NO:4 or 6) . In some embodiments, the IL-2 muteins include the H16W mutation with respect to SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IL-2 muteins include the V91Y mutation with respect to SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the IL-2 muteins comprise the R38L and F42A mutations with respect to SEQ ID NO: 1.

[0140] In some embodiments, the IL-2 muteins comprise one or more of the following:

[0141] (a) the amino acid that corresponds to E15 of SEQ ID NO: 1 is P;

[0142] (b) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is F, W, I, or L;

[0143] (c) the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L;

[0144] (d) the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A;

[0145] (e) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y, P or D;

[0146] (f) the amino acid that corresponds to I92 of SEQ ID NO: 1 is S, E, or K;

[0147] (g) the amino acid that corresponds to I93 of SEQ ID NO: 1 is R;

[0148] (h) the amino acid that corresponds to Q126 of SEQ ID NO: 1 is A; and

[0149] (i) the amino acid that corresponds to T133 of SEQ ID NO: 1 is K, P, W, or M.

[0150] In some embodiments, the IL-2 muteins comprise one or more of the following:

[0151] (a) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W;

[0152] (b) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y;

[0153] (c) the amino acid that corresponds to I92 of SEQ ID NO: 1 is S;

[0154] (d) the amino acid that corresponds to Q126 of SEQ ID NO: 1 is A;

[0155] (e) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is D;

[0156] (f) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is I;

[0157] (g) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is L;

[0158] (h) the amino acid that corresponds to I92 of SEQ ID NO: 1 is E;

[0159] (i) the amino acid that corresponds to I92 of SEQ ID NO: 1 is K; and

[0160] (j) the amino acid that corresponds to I93 of SEQ ID NO: 1 is R.

[0161] In some embodiments, the IL-2 muteins comprise R38L and F42A.

[0162] In some embodiments, the IL-2 mutein can bind to a cell expressing IL-2R and / or activate IL-2 / IL-2R signaling pathway. In some embodiments, the IL-2 mutein comprises all or a portion of IL-2. In some embodiments, the IL-2 is human IL-2 with one or more mutations (e.g., any of the IL-2 mutations described herein) . In some embodiments, the IL-2 mutein comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 4 or 6.

[0163] In some embodiments, the IL-2 muteins comprises a histidine at position 16 with respect to SEQ ID NO: 1.

[0164] In some embodiments, the IL-2 muteins comprises a valine at position 91 with respect to SEQ ID NO: 1.

[0165] In some embodiments, the IL-2 muteins comprises an arginine at position 38 with respect to SEQ ID NO: 1.

[0166] In some embodiments, the IL-2 muteins comprises a phenylalanine at position 45 with respect to SEQ ID NO: 1.

[0167] The serum half-life of the IL-2 muteins provided herein may be extended by essentially any method known in the art. Such methods include altering the sequence of the IL-2 mutein to include a peptide that binds to the neonatal Fcγ receptor or bind to a protein having extended serum half-life, e.g., IgG or human serum albumin. In other embodiments, the IL-2 mutein is fused to a polypeptide that confers extended half-life on the fusion molecule. Such polypeptides include an IgG Fc or other polypeptides that bind to the neonatal Fcγ receptor, human serum albumin, or polypeptides that bind to a protein having extended serum half-life. In preferred embodiments, the IL-2 mutein is fused to an IgG Fc molecule.

[0168] The IL-2 muteins can also include conservative modifications and substitutions at other positions of IL-2 (i.e., those that have a minimal effect on the secondary or tertiary structure of the mutein) . Such conservative substitutions include those described by Dayhoff in The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) , and by Argos in EMBO J., 8: 779-785 (1989) . For example, amino acids belonging to one of the following groups represent conservative changes: Group I: ala, pro, gly, gin, asn, ser, thr; Group II: cys, ser, tyr, thr; Group III: val, ile, leu, met, ala, phe; Group IV: lys, arg, his; Group V: phe, tyr, trp, his; and Group VI: asp, glu.

[0169] The IL-2 mutein may be fused to the N-terminus or the C-terminus of the IgG Fc region.

[0170] IL-2 fusion proteins

[0171] In one aspect, the disclosure relates to IL-2 fusion proteins or protein constructs comprising or consisting of any of the IL-2 muteins described herein fused to a suitable protein, such as an antibody, antibody fragment (e.g., scFv or Fab) , Fc domain, cytokine, chemokine, albumin, receptor ligand, receptor ectodomain, scaffold protein, or a targeting moiety (e.g., a peptide or nanobody) .

[0172] In one aspect, the disclosure relates to IL-2-Fc fusion proteins or protein constructs that comprise any one of the IL-2 muteins described herein and a Fc region. Without wishing to be bound by theory, linking the IL-2 muteins to the Fc region can extend the serum half-life of the IL-2 muteins.

[0173] In some embodiments, the Fc region is derived from human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4. In some embodiments, the Fc is human IgG1 Fc. In some embodiments, the Fc is human IgG4 Fc. In some embodiments, the IL-2 mutein is linked to the N-terminus of a CH2 domain in the Fc, optionally via a hinge region. In some embodiments, the IL-2 mutein is linked to the C-terminus of a CH3 domain in the Fc, optionally via a linker.

[0174] In some embodiments, the Fc region is linked to an antibody hinge region (e.g., IgG, IgE hinge region) . In addition, the Fc region can be modified to provide desired effector functions or serum half-life. In some embodiments, effector function of a Fc region is antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) . In some embodiments, effector function of a Fc region is phagocytosis. In some embodiments, effector function of a Fc region is ADCC and phagocytosis. In some embodiments, the protein constructs as described herein have an Fc region without effector function. In some embodiments, the Fc is a human IgG1 Fc. In some embodiments, the Fc does not have a functional Fc region. For example, the Fc region has LALA mutations (L234A and L235A mutations in EU numbering) , or LALA-PG mutations (L234A, L235A, P329G mutations in EU numbering) . In some embodiments, the LALA mutation can reduce binding to the IgG Fc receptors FcγRI, FcγRII and FcγRIII as well as to complement component C1q. Some other modifications to the Fc region can be made. For example, a cysteine residue (s) can be introduced into the Fc region, thereby allowing interchain disulfide bond formation in this region. The homodimeric fusion protein thus generated may have any increased half-life in vitro and / or in vivo. In some embodiments, the hinge region is a human IgG4 hinge region optionally with S228P mutation according to EU numbering. In some embodiments, the IgG4 has S228P mutation (EU numbering) . The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange.

[0175] In some embodiments, Fc regions are provided having a carbohydrate structure that lacks fucose attached (directly or indirectly) to an Fc region. For example, the amount of fucose in such Fc region composition may be from 1%to 80%, from 1%to 65%, from 5%to 65%or from 20%to 40%. The amount of fucose is determined by calculating the average amount of fucose within the sugar chain at Asn297, relative to the sum of all glycostructures attached to Asn297 (e.g. complex, hybrid and high mannose structures) as measured by MALDI-TOF mass spectrometry, as described in WO 2008 / 077546, for example. Asn297 refers to the asparagine residue located at about position 297 in the Fc region (EU numbering of Fc region residues; or position 314 in Kabat numbering) ; however, Asn297 may also be located about ±3 amino acids upstream or downstream of position 297, i.e., between positions 294 and 300, due to minor sequence variations in Fc region sequences. Such fucosylation variants may have improved ADCC function. In some embodiments, to reduce glycan heterogeneity, the Fc region can be further engineered to replace the Asparagine at position 297 with Alanine (N297A) .

[0176] In some embodiments, the Fc region can have knobs-into-holes (KIH) mutations, which can promote heterodimerization and avoid mispairing between two peptide chains. This involves engineering CH3 domains to create either a “knob” or a “hole” to promote heterodimerization. The KIH technique is described e.g., in Xu, Yiren, et al. "Production of bispecific antibodies in ‘knobs-into-holes’ using a cell-free expression system. " MAbs. Vol. 7. No. 1. Taylor &Francis, 2015, which is incorporated by reference in its entirety. In some embodiments, the Fc region comprises a hole chain comprising G1LA-HoleFc and a knob chain comprising G1LA-KnobFc. In some embodiments, either the hole chain or the knob chain can be linked to the IL-2 mutein described herein to create a heterodimer structure. In some embodiments, the IL-2 mutein is linked to the hole chain. In some embodiments, the IL-2 mutein is linked to the knob chain. In some embodiments, both the hole chain and the knob chain can be linked to the IL-2 mutein described herein to create a homodimer structure.

[0177] In some embodiments, the Fc region can be further linked to a hinge region (e.g., SEQ ID NO: 87 or 89) . In some embodiments, the Fc region comprises an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 21, 22, 83, 84, 88, and 90. In some embodiments, the Fc region comprises a knob chain comprising G1LA-KnobFc and a hinge region. In some embodiments, the Fc region comprises a hole chain comprising G1LA-HoleFc and a hinge region.

[0178] In some embodiments, the Human IgG4 Fc region comprises an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 83.

[0179] In some embodiments, the Human IgG4 Fc region comprises an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 88.

[0180] In some embodiments, the knob chain comprises an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 21, and the hole chain comprises an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 22.

[0181] In some embodiments, the knob chain comprises an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 21, and the hole chain comprises an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 23-41.

[0182] In some embodiments, the knob chain comprises an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 43-61, and the hole chain comprises an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 63-81.

[0183] In some embodiments, the IL-2 mutein is linked to the Fc region via a linker peptide (e.g., any one of SEQ ID NO: 85, 86, and 91-94) . In some embodiments, the linker peptide is a flexible linker. Details of flexible linkers can be found, e.g., Chen, X., et al. “Fusion protein linkers: property, design and functionality. ” Advanced Drug Delivery Reviews 65.10 (2013) : 1357-1369, which is incorporated herein by reference in its entirety. In some embodiments, the linker peptide comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 94. Various linker sequences can be used, including, without limitation, glycine serine (GS) linkers such as (GS) n, (SG) n, (GGS) n, (GSG) n, (GSGGS) n (SEQ ID NO: 93) and (GGGS) n (SEQ ID NO: 91) , where n represents an integer of at least 1. In some embodiments, n is 5-8. In some embodiments, n is 3-5.

[0184] In some embodiments, the IL-2-Fc fusion protein or the protein construct comprises 1, 2, 3, 4, 5, or 6 IL-2 muteins. In some embodiments, the IL-2-Fc fusion protein comprises two or more IL-2 muteins. In some embodiments, the Fc comprises a first Fc region and a second Fc region. In some embodiments, the first Fc region comprises a knob mutation and the second Fc region comprises a hole mutation.

[0185] In some embodiments, the IL-2 mutein is linked to the N-terminus or C-terminus of the Fc region. In some embodiments, the IL-2 mutein is linked to the N-terminus of the Fc region. In some embodiments, the IL-2 mutein is linked to the C-terminus of the Fc region. In some embodiments, the Fc region is linked to a hinge region.

[0186] In some embodiments, the IL-2-Fc fusion protein comprises a first IL-2 mutein and a second IL-2 mutein. In some embodiments, the first and the second IL-2 muteins are identical. In some embodiments, the first and / or the second IL-2 mutein include an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of the sequences of SEQ ID NO: 1-19 (e.g., SEQ ID NO: 4 or 6) . In some embodiments, the first and the second IL-2 muteins are different.

[0187] In some embodiments, the first and / or the second hinge region can include all or a portion of the hinge region of an immunoglobulin, e.g., human IgG4 hinge region. In some embodiments, the first and / or the second hinge region include an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 87. In some embodiments, the first and the second hinge regions are identical.

[0188] In some embodiments, the first and / or the second Fc region can be identical and can form a Fc homodimer. In some embodiments, the first and / or the second Fc region include all or a portion of the Fc region of an immunoglobulin, e.g., human IgG4 Fc region (SEQ ID NO: 88) . In some embodiments, the first Fc region can comprise a knob mutation, and the second Fc region can comprise a hole mutation. In some embodiments, the first and / or the second Fc region include an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 21 or 22.

[0189] In some embodiments, the first and / or the second linker peptide described herein include an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 85, 86, and 91-94. In some embodiments, the first and / or the second linker peptides described herein include an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to one or more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8) repeats of GGGGS (SEQ ID NO: 91) , GSGGSG (SEQ ID NO: 92) , or GSGGS (SEQ ID NO: 93) .

[0190] In any of the IL-2-Fc fusion proteins described herein, the first and the second hinge regions can be different. In any of the IL-2-Fc fusion proteins described herein, the first and / or the second Fc region can be different. In some embodiments, the first and / or the second Fc region can form a Fc heterodimer by introducing one or more mutations. For example, the first and / or the second Fc region can include one or more knob-in-hole (KIH) mutations. In some embodiments, the first and / or the second Fc region can form a Fc heterodimer using other technologies known in the art. Details heterodimeric Fc technologies can be found, e.g., in Ha, et al. "Immunoglobulin Fc heterodimer platform technology: from design to applications in therapeutic antibodies and proteins. " Frontiers In Immunology 7 (2016) : 394, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0191] Some embodiments of the IL-2-Fc fusion proteins are shown in FIGS. 2A-2B. They are described in detail below.

[0192] In one aspect, the disclosure is related to a IL-2-Fc fusion protein including a first polypeptide and a second polypeptide.

[0193] In some embodiments, the first polypeptide includes, preferably from N-terminus to C-terminus, an optional first hinge region, and a first Fc region. The second polypeptide includes, preferably from N-terminus to C-terminus, an IL-2 mutein, an optional second hinge region, and a second Fc region. A schematic structure of an exemplary IL-2-Fc fusion protein is shown in FIG. 2A.

[0194] The first Fc region can comprise a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 21. The second Fc region can comprise a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 22.

[0195] The IL-2 mutein can comprise an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 1-19.

[0196] In some embodiments, the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 21, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 23-41.

[0197] In some embodiments, the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 21, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 26 and 28.

[0198] In one aspect, the disclosure is related to a IL-2-Fc fusion protein including a first polypeptide and a second polypeptide.

[0199] In some embodiments, the first polypeptide includes, preferably from N-terminus to C-terminus, an optional first hinge region, a first Fc region, and a first IL-2 mutein. The second polypeptide includes, preferably from N-terminus to C-terminus, an optional second hinge region, a second Fc region, and a second IL-2 mutein. A schematic structure of an exemplary IL-2-Fc fusion protein is shown in FIG. 2B. In some embodiments, the first IL-2 mutein is linked to the first Fc region via a first linker. In some embodiments, the second IL-2 mutein is linked to the second Fc region via a second linker.

[0200] The first Fc region can comprise a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 21. The second Fc region can comprise a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 22.

[0201] The first IL-2 mutein and / or the second IL-2 mutein can comprise an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 1-19.

[0202] In some embodiments, the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 43-61, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 63-81.

[0203] In some embodiments, the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 46, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 66.

[0204] In some embodiments, the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 48, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 68.

[0205] In some embodiments, the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 62, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 82.

[0206] Characteristics of IL-2-Fc fusion proteins

[0207] In some embodiments, the IL-2-Fc fusion protein can comprise any of the IL-2 muteins as described herein. The disclosure also provides nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide described herein.

[0208] In some implementations, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can bind to IL-2R (e.g., IL-2Rβγ) with a dissociation rate (koff) of less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.00001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.00001 s-1, or greater than 0.000001 s-1. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 × 102 / Ms, greater than 1 ×103 / Ms, greater than 1 × 104 / Ms, greater than 1 × 105 / Ms, or greater than 1 × 106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 × 105 / Ms, less than 1 × 106 / Ms, or less than 1 × 107 / Ms. Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 x 10-6 M, less than 1 x 10-7 M, less than 1 × 10-8 M, less than 1 × 10-9 M, or less than 1 × 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 300 nM, 200 nM, 100 nM, 50nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, or 10 pM. In some embodiments, KD is greater than 1 × 10-7 M, greater than 1 × 10-8 M, greater than 1 × 10-9 M, greater than 1 × 10-10 M, greater than 1 × 10-11 M, or greater than 1 ×10-12 M. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein has a reduced IL-2R binding affinity as compared to a wildtype IL-2.

[0209] In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can bind to the dimeric IL-2 receptor complex IL-2Rβγ. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.00001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.00001 s-1, or greater than 0.000001 s-1. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 × 102 / Ms, greater than 1 × 103 / Ms, greater than 1 × 104 / Ms, greater than 1 × 105 / Ms, or greater than 1 ×106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 × 105 / Ms, less than 1 × 106 / Ms, or less than 1 × 107 / Ms. Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 × 10-6 M, less than 1 × 10-7 M, less than 1 × 10-8 M, less than 1 × 10-9 M, or less than 1 × 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 300 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, or 10 pM. In some embodiments, KD is greater than 1 × 10-7 M, greater than 1 × 10-8 M, greater than 1 × 10-9 M, greater than 1 × 10-10 M, greater than 1 × 10-11 M, or greater than 1 × 10-12 M. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein has a reduced IL-2R binding affinity as compared to a wildtype IL-2.

[0210] In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can bind to the dimeric IL-2 receptor complex IL-2Rβγ with a lower affinity than the wildtype IL-2. In some embodiments, the binding affinity between the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein and the dimeric IL-2 receptor complex IL-2Rβγ is at least about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 200%, about 300%, about 400%, about 500%, or about 1000%lower than the binding affinity between the wild type IL-2 and the dimeric IL-2 receptor complex IL-2Rβγ.

[0211] General techniques for measuring the affinity include, e.g., ELISA, RIA, and surface plasmon resonance (SPR) . In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can bind to monkey IL-2R, and / or mouse IL-2R. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein cannot bind to monkey IL-2R, and / or mouse IL-2R. In some embodiments, the IL-2 mutein can bind to a cell expressing IL-2R and / or activate IL-2 / IL-2R signaling pathway. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can activate an immune cell (e.g., CD4, CD8, Treg and NK cells) . In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can induce STAT5 phosphorylation in an immune cell.

[0212] In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can induce STAT5 signaling (e.g., STAT5 phosphorylation) in immune cells (e.g., Treg cells) . In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can induce STAT5 phosphorylation with a potency that is less than about 1%, about 5%, about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, or about 140%as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can induce STAT5 phosphorylation with a potency that is higher than about 1%, about 5%, about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, or about 140%as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof.

[0213] In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can induce less STAT5 phosphorylation as compared to a wildtype IL-2. In some embodiments, compared to a wildtype IL-2, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can induce STAT5 phosphorylation at a level that is less than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 100%. In some embodiment, the ability to induce STAT5 phosphorylation (e.g., in CD4, CD8, Treg or NK cells) can be measured by the methods described in Examples 3-7. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein have a STAT5 activation EC50 of less than 5 pM, less than 10 pM, less than 50 pM, less than 0.1 nM, less than 0.2 nM, less than 0.5 nM, less than 0.8 nM, less than 1 nM, less than 2 nM, less than 5 nM, less than 8 nM, less than 10 nM, less than 20 nM, less than 50 nM, less than 100 nM, less than 200 nM, less than 500 nM, or less than 800 nM, as determined using the method described herein. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein have a STAT5 activation EC50 of more than 5 pM, more than 10 pM, more than 50 pM, more than 0.1 nM, more than 0.2 nM, more than 0.5 nM, more than 0.8 nM, more than 1 nM, more than 2 nM, more than 5 nM, more than 8 nM, more than 10 nM, more than 20 nM, more than 50 nM, more than 100 nM, more than 200 nM, more than 500 nM, or more than 800 nM, as determined using the method described herein. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein have a STAT5 activation EC50 value that is 1 pM-50 pM, 0.1-1 nM, 0.2-2 nM, 0.5-5 nM, 0.8-8 nM, 1-10 nM, 2-20 nM, 5-50 nM, 8-80 nM, 10-100 nM, 20-200 nM, 50-500 nM, or 80-800 nM. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein have a STAT5 activation that is less than or about 50%, less than or about 30%, less than or about 20%, less than or about 10%, less than or about 5%, less than or about 1%as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can decrease STAT5 activation (increase STAT5 activation EC50) by about 2-50 folds as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof, for CD4, CD8, Treg and / or NK cells.

[0214] In some embodiments, the half-life of the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can be increased by at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 1-fold, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, or at least 100-fold, as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof. In some embodiments, the half-life is determined by measuring the in vivo concentration of the molecule over time, after administration into a subject.

[0215] In some embodiments, after being administered in vivo, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can have a higher serum concentration (for example, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 1-fold, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, or at least 20-fold, at least 50-fold, or at least 100-fold higher) , as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof, after 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 days.

[0216] In some embodiments, after being administered in vivo, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can reduce the GvHD of the subject, by at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 1-fold, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, at least 50-fold, or at least 100-fold, as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof.

[0217] In some embodiments, after being administered in vivo, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein do not cause significant toxicity. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein has an increased highest non-lethal dose (NLD) as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can reduce toxicity and / or increase NLD by at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 1-fold, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, at least 50-fold, or at least 100-fold, as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can reduce toxicity by at least 2-8 folds (e.g., 4 folds) as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein can increase the NLD by above 20-60 folds (e.g., 33 folds) as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof.

[0218] In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein has a tumor growth inhibition percentage (TGI%) that is greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200%. In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein has a tumor growth inhibition percentage that is less than 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, or 200%. The TGI%can be determined, e.g., at 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 days after the treatment starts, or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 months after the treatment starts. As used herein, the tumor growth inhibition percentage (TGI%) is calculated using the following formula: TGI (%) = [1- (Ti-T0)  /  (Vi-V0) ] ×100

[0219] Ti is the average tumor volume in the treatment group on day i. T0 is the average tumor volume in the treatment group on day zero. Vi is the average tumor volume in the control group on day i. V0 is the average tumor volume in the control group on day zero.

[0220] In some embodiments, the IL-2 mutein and / or IL-2-Fc fusion protein described herein does not induce cytokine storm in human. In some embodiments, the IL-2-Fc fusion protein described herein is not a superagonist. Details of cytokine storm and superagonist can be found, e.g., in Shimabukuro-Vornhagen, A. et al. "Cytokine release syndrome. " Journal for ImmunoTherapy of Cancer 6.1 (2018) : 1-14, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0221] Methods of making IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins

[0222] Variants of the IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins described herein can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the DNA encoding a polypeptide / protein. Such variants include, for example, deletions, insertions, or substitutions of residues within the amino acids sequences.

[0223] Screening can be performed to adjust the binding affinity of the IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins. Any combination of deletions, insertions, and / or combinations can be made to arrive at a variant that has increased binding affinity for the target. The amino acid changes introduced into the variant can also alter or introduce new post-translational modifications into the polypeptide / protein, such as changing (e.g., increasing or decreasing) the number of glycosylation sites, changing the type of glycosylation site (e.g., changing the amino acid sequence such that a different sugar is attached by enzymes present in a cell) , or introducing new glycosylation sites.

[0224] The IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins can be derived from any species of animal, including mammals. Non-limiting examples of these species include humans, primates, e.g., monkeys and apes, cows, pigs, horses, sheep, camelids (e.g., camels and llamas) , chicken, goats, and rodents (e.g., rats, mice, hamsters and rabbits) .

[0225] The present disclosure also provides recombinant vectors (e.g., an expression vectors) that include an isolated polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide / protein disclosed herein) , host cells into which are introduced the recombinant vectors (i.e., such that the host cells contain the polynucleotide and / or a vector comprising the polynucleotide) , and the production of recombinant polypeptides or fragments thereof by recombinant techniques.

[0226] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more polynucleotide (s) of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more polynucleotide (s) of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-Atail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector.

[0227] A vector can be introduced into the host cell by methods known in the art, e.g., electroporation, chemical transfection (e.g., DEAE-dextran) , transformation, transfection, and infection and / or transduction (e.g., with recombinant virus) . Thus, non-limiting examples of vectors include viral vectors (which can be used to generate recombinant virus) , naked DNA or RNA, plasmids, cosmids, phage vectors, and DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents.

[0228] In some implementations, a polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide / protein disclosed herein) is introduced using a viral expression system (e.g., vaccinia or other pox virus, retrovirus, or adenovirus) , which may involve the use of a non-pathogenic (defective) , replication competent virus, or may use a replication defective virus. Techniques for incorporating DNA into such expression systems are well known to those of ordinary skill in the art. The DNA may also be “naked. ” The uptake of naked DNA may be increased by coating the DNA onto biodegradable beads that are efficiently transported into the cells.

[0229] For expression, the DNA insert comprising a polypeptide-encoding polynucleotide disclosed herein can be operatively linked to an appropriate promoter (e.g., a heterologous promoter) , such as the phage lambda PL promoter, the E. coli lac, trp and tac promoters, the SV40 early and late promoters and promoters of retroviral LTRs, to name a few. Other suitable promoters are known to the skilled artisan. In some embodiments, the promoter is a cytomegalovirus (CMV) promoter. The expression constructs can further contain sites for transcription initiation, termination and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the mature transcripts expressed by the constructs may include a translation initiating at the beginning and a termination codon (UAA, UGA, or UAG) appropriately positioned at the end of the polypeptide to be translated.

[0230] As indicated, the expression vectors can include at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture and tetracycline or ampicillin resistance genes for culturing in E. coli and other bacteria. Representative examples of appropriate hosts include, but are not limited to, bacterial cells, such as E. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium cells; fungal cells, such as yeast cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells such as CHO, COS, Bowes melanoma, and HK 293 cells; and plant cells. Appropriate culture mediums and conditions for the host cells described herein are known in the art.

[0231] Non-limiting vectors for use in bacteria include pQE70, pQE60 and pQE-9, available from Qiagen; pBS vectors, Phagescript vectors, Bluescript vectors, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, available from Stratagene; and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 available from Pharmacia. Non-limiting eukaryotic vectors include pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG available from Stratagene; and pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL available from Pharmacia. Other suitable vectors will be readily apparent to the skilled artisan.

[0232] Non-limiting bacterial promoters suitable for use include the E. coli lacI and lacZ promoters, the T3 and T7 promoters, the gpt promoter, the lambda PR and PL promoters and the trp promoter. Suitable eukaryotic promoters include the CMV immediate early promoter, the HSV thymidine kinase promoter, the early and late SV40 promoters, the promoters of retroviral LTRs, such as those of the Rous sarcoma virus (RSV) , and metallothionein promoters, such as the mouse metallothionein-I promoter.

[0233] In the yeast Saccharomyces cerevisiae, a number of vectors containing constitutive or inducible promoters such as alpha factor, alcohol oxidase, and PGH can be used.

[0234] Introduction of the construct into the host cell can be affected by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals, such as Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) , which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0235] Transcription of DNA encoding a polypeptide / protein of the present disclosure by higher eukaryotes may be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about from 10 to 300 bp that act to increase transcriptional activity of a promoter in a given host cell-type. Examples of enhancers include the SV40 enhancer, which is located on the late side of the replication origin at base pairs 100 to 270, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers.

[0236] For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space or into the extracellular environment, appropriate secretion signals may be incorporated into the expressed polypeptide. The signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous signals.

[0237] The polypeptides and / or proteins can be expressed in a modified form, such as a fusion protein (e.g., a GST-fusion) or with a histidine-tag, and may include not only secretion signals, but also additional heterologous functional regions. For instance, a region of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be added to the N-terminus of the polypeptide to improve stability and persistence in the host cell, during purification, or during subsequent handling and storage. Also, peptide moieties can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. The addition of peptide moieties to polypeptides to engender secretion or excretion, to improve stability and to facilitate purification, among others, are familiar and routine techniques in the art.

[0238] Methods of Treatment

[0239] The IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins can be used for various therapeutic purposes.

[0240] In one aspect, the disclosure provides methods for treating a cancer in a subject, methods of reducing the rate of the increase of volume of a tumor in a subject over time, methods of reducing the risk of developing a metastasis, or methods of reducing the risk of developing an additional metastasis in a subject. In some embodiments, the treatment can halt, slow, retard, or inhibit progression of a cancer. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of in the number, severity, and / or duration of one or more symptoms of the cancer in a subject.

[0241] In one aspect, the disclosure features methods that include administering a therapeutically effective amount of the IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins disclosed herein to a subject in need thereof (e.g., a subject having, or identified or diagnosed as having, a cancer) , e.g., breast cancer (e.g., triple-negative breast cancer) , carcinoid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, renal cancer, colorectal cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, urethral cancer, or hematologic malignancy. In some embodiments, the cancer is unresectable melanoma or metastatic melanoma, non-small cell lung carcinoma (NSCLC) , small cell lung cancer (SCLC) , bladder cancer, or metastatic hormone-refractory prostate cancer. In some embodiments, the subject has a solid tumor. In some embodiments, the cancer is squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN) , renal cell carcinoma (RCC) , triple-negative breast cancer (TNBC) , or colorectal carcinoma. In some embodiments, the cancer is melanoma, pancreatic carcinoma, mesothelioma, hematological malignancies, especially Non-Hodgkin's lymphoma, lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, or advanced solid tumors.

[0242] In some embodiments, the IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins disclosed herein can be used for treatment of patients at risk for a cancer. Patients with cancer can be identified with various methods known in the art.

[0243] As used herein, by an “effective amount” is meant an amount or dosage sufficient to effect beneficial or desired results including halting, slowing, retarding, or inhibiting progression of a disease, e.g., a cancer. An effective amount will vary depending upon, e.g., an age and a body weight of a subject to which the protein constructs or the polypeptides, vector comprising the polynucleotide encoding the protein constructs or the polypeptides, and / or compositions thereof is to be administered, a severity of symptoms and a route of administration, and thus administration can be determined on an individual basis.

[0244] An effective amount can be administered in one or more administrations. By way of example, an effective amount of the IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, inhibit, slow and / or delay progression of a cancer in a patient or is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, slow and / or delay proliferation of a cell (e.g., a biopsied cell, any of the cancer cells described herein, or cell line (e.g., a cancer cell line) ) in vitro. As is understood in the art, an effective amount may vary, depending on, inter alia, patient history as well as other factors such as the type (and / or dosage) of the protein constructs or the polypeptides used.

[0245] Effective amounts and schedules for administering the IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins may be determined empirically, and making such determinations is within the skill in the art. Those skilled in the art will understand that the dosage that must be administered will vary depending on, for example, the mammal that will receive the protein constructs or the polypeptides, the polynucleotides, and / or compositions disclosed herein, the route of administration, the particular type of polynucleotides, and / or compositions disclosed herein used and other drugs being administered to the mammal.

[0246] A typical daily dosage of an effective amount of the IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins is 0.01 mg / kg to 100 mg / kg (mg per kg of patient weight) . In some embodiments, the dosage can be less than 100 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg, 0.05 mg / kg, 0.01 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be greater than 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg.

[0247] In any of the methods described herein, the IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins can be administered to the subject at least once a week (e.g., once a week, twice a week, three times a week, four times a week, once a day, twice a day, or three times a day) . In some embodiments, the IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins can be administered to the subject once every two weeks, once every four weeks, once every two months, once every four months, once every six months.

[0248] In some embodiments, the one or more additional therapeutic agents can be administered to the subject prior to, or after administering the protein constructs or the polypeptides. In some embodiments, the one or more additional therapeutic agents are administered to the subject such that there is an overlap in the bioactive period of the one or more additional therapeutic agents and the protein constructs or the polypeptides in the subject.

[0249] In some embodiments, one or more additional therapeutic agents can be administered to the subject. The additional therapeutic agent can comprise one or more inhibitors selected from the group consisting of an inhibitor of B-Raf, an EGFR inhibitor, an inhibitor of a MEK, an inhibitor of ERK, an inhibitor of K-Ras, an inhibitor of c-Met, an inhibitor of anaplastic lymphoma kinase (ALK) , an inhibitor of a phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) , an inhibitor of an Akt, an inhibitor of mTOR, a dual PI3K / mTOR inhibitor, an inhibitor of Bruton's tyrosine kinase (BTK) , and an inhibitor of Isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) and / or Isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) . In some embodiments, the additional therapeutic agent is an inhibitor of indoleamine 2, 3-dioxygenase-1) (IDO1) (e.g., epacadostat) .

[0250] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more inhibitors selected from the group consisting of an inhibitor of HER3, an inhibitor of LSD1, an inhibitor of MDM2, an inhibitor of BCL2, an inhibitor of CHK1, an inhibitor of activated hedgehog signaling pathway, and an agent that selectively degrades the estrogen receptor.

[0251] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more therapeutic agents selected from the group consisting of Trabectedin, nab-paclitaxel, Trebananib, Pazopanib, Cediranib, Palbociclib, everolimus, fluoropyrimidine, IFL, regorafenib, Reolysin, Alimta, Zykadia, Sutent, temsirolimus, axitinib, everolimus, sorafenib, Votrient, Pazopanib, IMA-901, AGS-003, cabozantinib, Vinflunine, an Hsp90 inhibitor, Ad-GM-CSF, Temazolomide, IL-2, IFNa, vinblastine, Thalomid, dacarbazine, cyclophosphamide, lenalidomide, azacytidine, lenalidomide, bortezomid, amrubicine, carfilzomib, pralatrexate, and enzastaurin.

[0252] In some embodiments, the additional therapeutic agent can comprise one or more therapeutic agents selected from the group consisting of an adjuvant, a TLR agonist, tumor necrosis factor (TNF) alpha, IL-1, HMGB1, an IL-10 antagonist, an IL-4 antagonist, an IL-13 antagonist, an IL-17 antagonist, an HVEM antagonist, an ICOS agonist, a treatment targeting CX3CL1, a treatment targeting CXCL9, a treatment targeting CXCL10, a treatment targeting CCL5, an LFA-1 agonist, an ICAM1 agonist, and a Selectin agonist.

[0253] In some embodiments, carboplatin, nab-paclitaxel, paclitaxel, cisplatin, pemetrexed, gemcitabine, FOLFOX, or FOLFIRI are administered to the subject.

[0254] In some embodiments, the additional therapeutic agent is an anti-OX40 antibody, an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L2 antibody, an anti-IL-2 antibody, an anti-IL-2R antibody, an anti-LAG-3 antibody, an anti-TIGIT antibody, an anti-BTLA antibody, an anti-CTLA-4 antibody, or an anti-GITR antibody. In some embodiments, the additional therapeutic agent is an anti-CD20 antibody (e.g., rituximab) or an anti-EGF receptor antibody (e.g., cetuximab) .

[0255] The mutant IL-2 polypeptides can be used to treat patients who have, who are suspected of having, or who may be at high risk for developing proliferative disorders and / or differentiative disorders including hematopoietic neoplastic disorders. Other examples of proliferative and / or differentiative disorders include skin disorders.

[0256] The skin disorder may involve the aberrant activity of a cell or a group of cells or layers in the dermal, epidermal, or hypodermal layer, or an abnormality in the dermal-epidermal junction. For example, the skin disorder may involve aberrant activity of keratinocytes (e.g., hyperproliferative basal and immediately suprabasal keratinocytes) , melanocytes, Langerhans cells, Merkel cells, immune cell, and other cells found in one or more of the epidermal layers, e.g., the stratum basale (stratum germinativum) , stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum or stratum corneum. In other embodiments, the disorder may involve aberrant activity of a dermal cell, for example, a dermal endothelial, fibroblast, immune cell (e.g., mast cell or macrophage) found in a dermal layer, for example, the papillary layer or the reticular layer.

[0257] Examples of skin disorders include psoriasis, psoriatic arthritis, dermatitis (eczema) , for example, exfoliative dermatitis or atopic dermatitis, pityriasis rubra pilaris, pityriasis rosacea, parapsoriasis, pityriasis lichenoiders, lichen planus, lichen nitidus, ichthyosiform dermatosis, keratodermas, dermatosis, alopecia areata, pyoderma gangrenosum, vitiligo, pemphigoid (e.g., ocular cicatricial pemphigoid or bullous pemphigoid) , urticaria, prokeratosis, rheumatoid arthritis that involves hyperproliferation and inflammation of epithelial-related cells lining the joint capsule; dermatitises such as seborrheic dermatitis and solar dermatitis; keratoses such as seborrheic keratosis, senile keratosis, actinic keratosis, photo-induced keratosis, and keratosis follicularis; acne vulgaris; keloids and prophylaxis against keloid formation; nevi; warts including verruca, condyloma or condyloma acuminatum, and human papilloma viral (HPV) infections such as venereal warts; leukoplakia; lichen planus; and keratitis. The skin disorder can be dermatitis, e.g., atopic dermatitis or allergic dermatitis, or psoriasis.

[0258] Patients amenable to treatment may also have psoriasis. The term “psoriasis” is intended to have its medical meaning, namely, a disease which afflicts primarily the skin and produces raised, thickened, scaling, nonscarring lesions. The lesions are usually sharply demarcated erythematous papules covered with overlapping shiny scales. The scales are typically silvery or slightly opalescent. Involvement of the nails frequently occurs resulting in pitting, separation of the nail, thickening and discoloration. Psoriasis is sometimes associated with arthritis, and it may be crippling. Hyperproliferation of keratinocytes is a key feature of psoriatic epidermal hyperplasia along with epidermal inflammation and reduced differentiation of keratinocytes. Multiple mechanisms have been invoked to explain the keratinocyte hyperproliferation that characterizes psoriasis. Disordered cellular immunity has also been implicated in the pathogenesis of psoriasis. Examples of psoriatic disorders include chronic stationary psoriasis, psoriasis vulgaris, eruptive (gluttate) psoriasis, psoriatic erythroderma, generalized pustular psoriasis (Von Zumbusch) , annular pustular psoriasis, and localized pustular psoriasis.

[0259] Alternatively, or in addition to methods of direct administration to patients, in some embodiments, mutant IL-2 polypeptides can be used in ex vivo methods. For example, cells (e.g., peripheral blood lymphocytes or purified populations of lymhocytes isolated from a patient and placed or maintained in culture) can be cultured in vitro in culture medium and the contacting step can be affected by adding the IL-2 mutant to the culture medium. The culture step can include further steps in which the cells are stimulated or treated with other agents, e.g., to stimulate proliferation, or to expand a population of cells that is reactive to an antigen of interest (e.g., a cancer antigen or a viral antigen) . The cells are then administered to the patient after they have been treated.

[0260] In certain embodiments, the subject IL-2 mutein that function as IL-2 antagonists described herein are useful for the treatment of one or more conditions wherein suppression of one or more IL-2 and / or IL-15 dependent functions is useful. In certain embodiments, the IL-2 mutein antagonists described herein is used for the treatment of one or more diseases or conditions wherein suppression of IL-2Rβ / IL-2Rγ heterodimerization and downstream signaling is useful (e.g., GVDH or leukemia) .

[0261] In one embodiment, the method of treatment is for the treatment of graft versus host disease (GVHD) . In some embodiments, the treatment includes the step of administering to a subject having GVHD a therapeutically effective amount of an IL-2 mutein that is an IL-2 antagonist. IL-2 and IL-15 is known to contribute to GVHD ( (Ferrara et al., Journal of Immunology 137: 1874 (1986) ; and Blaser et al., Blood 105: 894 (2005) ) . Therefore, without being bound by any particular theory of operation, it is believed that the IL-2 antagonists described herein are useful for the treatment of GVHD. In one embodiment, the IL-2 mutein for the treatment of GVHD includes one or more mutations that reduces its binding to IL-2Rγc receptor as compared to wild type IL-2 (e.g., any one of the mutations that reduces IL-2Rγc receptor binding as described herein) . In some embodiments, the IL-2 mutein further with decreased IL-2Rγc receptor binding affinity further includes one or more amino acid mutations that decrease the IL-2 muteins binding affinity for IL-2Rβ, as compared to wild-type IL-2 (e.g., any one of the mutations that decrease IL-2Rβ binding as described herein) . In another embodiment, the method of treatment is for the treatment of an IL-2 and / or IL-15 mediated leukemia. In particular embodiments, the leukemia is adult T-cell leukemia (ATL) . ATL is characterized by a malignant expansion of CD4+ T cells that exhibit an early growth phase that involves autocrine signals by IL-2 and IL-15 as well as paracrine signals by IL-9. Such cytokine-dependent proliferation is evident in patients with chronic and smoldering but not acute ATL. Therefore, without being bound by any particular theory of operation, it is believed that IL-2 partial agonists and antagonists can be used to treat such forms of leukemia. In some embodiments, the treatment includes the step of administering to a subject having adult T-cell leukemia a therapeutically effective amount of an IL-2 mutein that is an IL-2 antagonist. In some embodiments, the patient has chronic and smoldering ATL. In one embodiment, the IL-2 mutein for the treatment of ATL includes one or more mutations that reduces its binding to IL-2R γc receptor as compared to wild type IL-2 (e.g., any one of the mutations that reduces IL-2R γc receptor binding as described herein) . In some embodiments, the IL-2 mutein further with decreased IL-2Rγc receptor binding affinity further includes one or more amino acid mutations that decrease the IL-2 muteins binding affinity for IL-2Rβ, as compared to wild-type IL-2 (e.g., any one of the mutations that decrease IL-2Rβ binding as described herein) .

[0262] Pharmaceutical Compositions and Routes of Administration

[0263] Also provided herein are pharmaceutical compositions that contain the IL-2 muteins and / or IL-2 fusion proteins described herein. The pharmaceutical compositions can be formulated in any manner known in the art.

[0264] Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) . The compositions can include a sterile diluent (e.g., sterile water or saline) , a fixed oil, polyethylene glycol, glycerine, propylene glycol or other synthetic solvents, antibacterial or antifungal agents, such as benzyl alcohol or methyl parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like, antioxidants, such as ascorbic acid or sodium bisulfite, chelating agents, such as ethylenediaminetetraacetic acid, buffers, such as acetates, citrates, or phosphates, and isotonic agents, such as sugars (e.g., dextrose) , polyalcohols (e.g., mannitol or sorbitol) , or salts (e.g., sodium chloride) , or any combination thereof. Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. Preparations of the compositions can be formulated and enclosed in ampules, disposable syringes, or multiple dose vials. Where required (as in, for example, injectable formulations) , proper fluidity can be maintained by, for example, the use of a coating, such as lecithin, or a surfactant. Absorption of the agents can be prolonged by including an agent that delays absorption (e.g., aluminum monostearate and gelatin) . Alternatively, controlled release can be achieved by implants and microencapsulated delivery systems, which can include biodegradable, biocompatible polymers (e.g., ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid) .

[0265] Compositions containing the protein constructs or the polypeptides described herein can be formulated for parenteral (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in dosage unit form (i.e., physically discrete units containing a predetermined quantity of active compound for ease of administration and uniformity of dosage) .

[0266] Pharmaceutical compositions for parenteral administration are preferably sterile and substantially isotonic and manufactured under Good Manufacturing Practice (GMP) conditions. Pharmaceutical compositions can be provided in unit dosage form (i.e., the dosage for a single administration) . Pharmaceutical compositions can be formulated using one or more physiologically acceptable carriers, diluents, excipients or auxiliaries. The formulation depends on the route of administration chosen. For injection, the agents can be formulated in aqueous solutions, preferably in physiologically-compatible buffers to reduce discomfort at the site of injection. The solution can contain formulatory agents such as suspending, stabilizing and / or dispersing agents. Alternatively, the protein constructs or the polypeptides can be in lyophilized form for constitution with a suitable vehicle, e.g., sterile pyrogen-free water, before use.

[0267] Toxicity and therapeutic efficacy of compositions can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals (e.g., monkeys) . One can, for example, determine the LD50 (the dose lethal to 50%of the population) and the ED50 (the dose therapeutically effective in 50%of the population) : the therapeutic index being the ratio of LD50: ED50. Agents that exhibit high therapeutic indices are preferred. Where an agent exhibits an undesirable side effect, care should be taken to minimize potential damage (i.e., reduce unwanted side effects) . Toxicity and therapeutic efficacy can be determined by other standard pharmaceutical procedures.

[0268] Exemplary doses include milligram or microgram amounts of any of the protein constructs or the polypeptides described herein per kilogram of the subject’s weight (e.g., about 1 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 50 mg / kg; about 10 μg / kg to about 5 mg / kg; about 10 μg / kg to about 0.5 mg / kg; about 1 μg / kg to about 50 μg / kg; about 1 mg / kg to about 10 mg / kg; or about 1 mg / kg to about 5 mg / kg) . While these doses cover a broad range, one of ordinary skill in the art will understand that therapeutic agents can vary in their potency, and effective amounts can be determined by methods known in the art. Typically, relatively low doses are administered at first, and the attending health care professional or veterinary professional (in the case of therapeutic application) or a researcher (when still working at the development stage) can subsequently and gradually increase the dose until an appropriate response is obtained. In addition, it is understood that the specific dose level for any particular subject will depend upon a variety of factors including the activity of the specific compound employed, the age, body weight, general health, gender, and diet of the subject, the time of administration, the route of administration, the rate of excretion, and the half-life in vivo.

[0269] The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration. The disclosure also provides methods of manufacturing the protein constructs or the polypeptides for various uses as described herein.

[0270] EXAMPLES

[0271] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0272] Example 1. Design and expression of IL-2 variants

[0273] Based on the structure of IL-2 / IL-2 receptor complex (FIG. 1) , nine IL-2 variants with reduced affinity to intermediate IL-2 receptor IL-2Rβγ were designed: IL-2E15P, IL-2H16F, IL-2H16W, IL-2V91P, IL-2V91Y, IL-2T133K, IL-2T133P, IL-2T133W and IL-2T133Y.

[0274] The sequence of human IL-2 is shown in SEQ ID NO: 1. Nine IL-2 mutants, IL-2E15P, IL-2H16F, IL-2H16W, IL-2V91P, IL-2V91Y, IL-2T133K, IL-2T133P, IL-2T133W and IL-2T133Y and their low affinity-IL-2Rα-binding versions (la-IL-2, each containing additional R38L and F42A mutations) , la-IL-2E15P, la-IL-2H16F, la-IL-2H16W, la-IL-2V91P, la-IL-2V91Y, la-IL-2T133K, la-IL-2T133P, la-IL-2T133W (SEQ ID NO: 2-20) were selected for expression and characterization (FIG. 10) .

[0275] To extend the serum half life of IL-2 and its variants, the above listed 20 IL-2 and IL-2 variants were fused to human Fc.

[0276] A version of human IgG4 Fc, designated 4N4+4O4, consisting of two different chains (SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22) and capable of forming stable heterodimers, was employed. IL-2 and its mutants (SEQ ID NOS: 1-20) were either fused to the N-terminus of the hole chain of 4N4+4O4 to form a monovalent N terminal IL-2 fusion (e.g., B#IL-2) through 4O4’s natural hinge (FIG. 2A) , or to the C-termini of both chains of 4N4+4O4 through GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 94) linkers to form a bivalent C terminal fusion (FIG. 2B) . In the latter case, the last two residues in both chains of the Fc, GK, were removed to prevent potential cleavage at these sites.

[0277] 40 constructs were generated based on the table below. Plasmids containing the constructs were co-transfected into 293F cells by polyethylenimine (PEI) -mediated plasmid. Expression was carried out, and purification was performed with Protein A chromatography.

[0278] The majority of the constructs have reasonably good expression levels with the exception of E15P and V91P, which have lower than average expressions in the monovalent N-terminal format and very low / no expression in the bivalent C-terminal fusion format.

[0279] Table 1: IL-2 constructs

[0280] Example 2: Determination of affinities of IL-2-Fc to IL-2Rβγ

[0281] The affinities of the generated IL-2-Fc fusions to human IL-2Rβγ (ACRO Biosystems, Cat#: ILG-H5283) and mouse IL-2Rβγ (ACRO Biosystems, Cat#: ILG-M5283) were measured. Briefly, a streptavidin (SA) reagent kit (Sartorius, Cat#: 18-5019) was used to capture the fusion proteins at a final concentration of 5 μg / mL to the surface of the SA biosensor. Thereafter, the sensor was placed in IL-2Rβγ solutions with serially diluted concentrations (the highest concentration being 200 nM, 2-fold gradient dilution, 7 concentrations in total) for 4 minutes. After the binding phase, the sensors were transferred to 0.02%PBST (PBS supplemented with 0.02% 20) for dissociation for 10 minutes. Kinetic association rates (ka) and dissociation rates (kdis) were obtained simultaneously by fitting the data globally to a 1: 1 Langmuir binding model (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6.99-110) using Data Analysis HT 12 software. Affinities were deduced from the equation

[0282] kinetic rate constants (KD) = ka / kdis.

[0283] The R38M / F42A mutations only affect binding of IL-2 to IL-2Rα. Therefore, only constructs that did not have these two mutations were measured for their bindings to IL-2Rβγ. Although human IL-2 was used in this study, bindings of the IL-2-Fc fusions to mouse IL-2Rβγ was also measured, as mouse is the predominant species to test the toxicity and efficacy of IL-2 based constructs.

[0284] The obtained affinity data of IL-2-Fc fusion proteins to IL-2Rβγ are listed in the table below. It is noted that affinities of the monovalent N-terminal fusions (e.g., B#IL-2) are higher than that of bivalent C terminal fusions (e.g., CD#IL-2) , also higher than the affinity of wild type IL-2 to IL-2Rβγ. The reason for the affinity difference is unknown.

[0285] In comparison to wild type monovalent N-terminal IL-2-Fc, IL-2 Fc fusion proteins based on H16F, E15P, H16W, V91P and V91Y mutants have an over 2 fold KD value increase to human IL-2Rβγ, suggesting their lowered affinities to the target. Among them, H16W and V91P have an over 20-fold increase in KD values. The affinities of H16W and V91P variants to mouse IL-2Rβγ are also lowered, although t not as significant as to human IL-2Rβγ.

[0286] In comparison to wild type bivalent C-terminal IL-2-Fc, only IL-2 Fc fusion protein based on H16W variant demonstrated an over 2 fold increase in KD value for human IL-2Rβγ. IL-2 Fc fusion proteins based on H16F, H16W, V91Y, T133K and T133M demonstrated over 2 fold increases in KD values for mouse IL-2Rβγ.

[0287] In summary, IL-2 variants with reduced affinities to human and mouse IL-2Rβγ were identified with the H16W variant being the most reliable version: its affinities in both formats to both human and mouse antigens are reduced. It is also the variant with the biggest affinity reduction in almost all cases.

[0288] Table 2. Affinities of IL-2-Fc Fusions to Human and Mouse IL-2Rβγ

[0289] Example 3: Capability of monovalent N-terminal IL-2 fusion and bivalent C-terminal IL-2 fusion in inducing pSTAT5 phosphorylation

[0290] The capability of the IL-2 Fc fusions to induce STAT5 phosphorylation was evaluated. Cryopreserved human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were thawed and resuspended in PBS at a density of 5 × 106 cells / mL. Cells were stained with Fixable Viability Stain 510 (FVS510; BD Biosciences, 1: 1000 dilution) for 15 min at room temperature (RT) , washed once with complete RPMI-1640 medium (Gibco, supplemented with 10%FBS and 1%penicillin-streptomycin) , and adjusted to 3 × 106 cells / mL.

[0291] PBMCs (1.5 × 105 cells / well in 50 μL) were seeded into 96-well V-bottom plates (Corning #3897) and treated with 50 μL of serially diluted test wild type and mutant IL-2 molecules (10-point dilution series, starting at 100 nM) . After 25 min incubation at 37℃ / 5%CO2, reactions were terminated by adding 100 μL pre-warmed fixation buffer (BD Biosciences #554655; 37℃, 12 min) . Cells were centrifuged (900 × g, 7 min) and permeabilized with 100 μL 1× Perm III buffer (BD Biosciences #558050) for 30 min on ice.

[0292] Permeabilized cells were washed twice with PBS and stained with 100 μL of a pre-mixed antibody cocktail for 1 h at RT, containing CD4-BB700 (1 μL / test, BD #566392) , CD8-PE (1.2 μL / test, Absin #abs180038) , CD56-APC / Cy7 (0.5 μL / test, BioLegend #362512) , CD25-BV421 (0.5 μL / test, BD #562442) , FOXP3-AF488 (0.5 μL / test, BD#561181) , and p-STAT5-AF647 (0.5 μL / test, BD #562076) .

[0293] Cells were washed twice, resuspended in 85 μL PBS, and analyzed on an Agilent flow cytometer (50 μL acquisition volume) . Data were processed using NovoExpress software.

[0294] As shown in FIG. 3, both monovalent N-terminal fusion (B#IL-2) and bivalent C-terminal fusion (CD#IL-2) largely maintained the capability of inducing STAT5 phosphorylation of CD4, CD8, Treg and NK cells.

[0295] The capability of the bivalent C-terminal fusion (CD#IL-2) in inducing STAT5 phosphorylation was nearly identical as wildtype IL-2 for CD4, Treg and NK cells, and slightly lower than wildtype IL-2 for CD8 cells, a ～5 fold increase in EC50 was observed (Table 3) .

[0296] In contrast, the potency of the monovalent N-terminal IL-2-Fc fusion (B#IL-2) has decreased in all cell types, with a 6-, 8-, 21-and 7-fold increase in EC50 for CD4, CD8, Treg and NK cells, respectively (Table 3) .

[0297] Table 3. EC50 values of IL-2-Fc fusions in inducing STAT5 phosphorylation

[0298] Example 4: Influence of low affinity IL-2Rα binding version of IL-2 on STAT5 signaling

[0299] The STAT5 phosphorylation inducing capability of an IL-2 variant, B#la-IL-2, which has low affinity to IL-2Rα but retained its binding affinity to IL-2Rβγ, was evaluated. The method was the same as described for Example 3.

[0300] In comparison to B#IL-2, the low affinity IL-2Rα binding version B#la-IL-2 has little change in its potency in inducing CD8 and NK cell STAT5 phosphorylation (FIG. 4 and Table 4) . These two cell types are known to not expressing IL-2Rα, and hence the change in IL-2Rα binding affinity had little impact on inducing CD8 and NK cell STAT5 phosphorylation.

[0301] In contrast, Treg cells reacted differently to the normal and low affinity IL-2Rαbinding versions of IL-2-Fc fusions. The low affinity version has a 320-fold increase in EC50, which is comprehensible because Tregs express IL-2Rα to form high affinity IL-2 receptor IL-2Rαbg.

[0302] CD4 cells consist of conventional CD4 and Treg, and its reactions to the two IL-2 versions are the results of both cell types.

[0303] Table 4: EC50 values of normal and low affinity IL-2Rα binding versions of IL-2-Fc fusions in inducing STAT5 phosphorylation

[0304] Example 5. H16W variant of monovalent N-terminal fusion has decreased potency in inducing STAT5 phosphorylation

[0305] Two monovalent N-terminal fusion of IL-2 variants, B#IL-2H16W and B#IL-2T133K, were tested for their capability in inducing STAT5 phosphorylation in human lymphocytes. The method used is identical as described in Example 3.

[0306] B#IL-2T133K showed nearly identical profiles as B#IL-2 in inducing STAT5 phosphorylation in CD4, CD8, Treg and NK cells. In contrast, B#IL-2H16W’s potency in inducing STAT5 phosphorylation of these cells were greatly reduced (FIG. 5 and Table 5) .

[0307] Table 5. EC50 values of monovalent N-terminal fusions of IL-2 variants in inducing STAT5 phosphorylation

[0308] Example 6. H16W and V91Y variants of bivalent C-terminal fusions have decreased potency in inducing STAT5 phosphorylation

[0309] Six bivalent C-terminal fusion of IL-2 variants were tested for their capability in inducing STAT5 phosphorylation. The method used is identical as described in Example 3.

[0310] H16F, T133K, T133M and T133P variants of the bivalent C-terminal IL-2 fusions have similar profiles as the WT version CD#IL-2 for all cell types, whereas H16W and V91Y have greatly decreased potency in inducing STAT5 phosphorylation of CD4, CD8 and NK cells, but their potency in inducing Treg STAT5 phosphorylation is only slightly affected (FIG. 6 and Table 6) . To compare, the H16W and V91Y versions have 39 and 31 fold increase in EC50 in inducing NK cell STAT5 phosphorylation, the same constructs showed only 6 and 3-fold increase in EC50 in inducing Treg cell STAT5 phosphorylation.

[0311] Table 6. EC50 values of bivalent C-terminal fusions of IL-2 variants in inducing STAT5 phosphorylation

[0312] Example 7. Monovalent N-terminal fusion and bivalent C-terminal fusion of H16W variant have decreased potency in inducing STAT5 phosphorylation in mouse lymphocytes

[0313] H16W and V91Y variants were demonstrated to have decreased potency / efficacy in inducing STAT5 phosphorylation in human lymphocytes. The capability of the two variants in inducing STAT5 phosphorylation in mouse lymphocytes were also tested.

[0314] Bivalent C-terminal Fc fusion of V91Y variant, CD#IL-2V91Y, maintained the capability of inducing STAT5 phosphorylation of mouse CD4, CD8, Treg and NK cells when compared to bivalent wild type IL-2 Fc fusion, CD#IL-2 (FIG. 7) .

[0315] Bivalent C-terminal Fc fusion of H16W variant, CD#IL-2H16W, demonstrated reduced capability of inducing STAT5 phosphorylation of mouse CD8 and NK cells when compared to bivalent wild type IL-2 Fc fusion, CD#IL-2 (FIG. 7) .

[0316] The reduction of H16W variant’s capability in inducing STAT5 phosphorylation of mouse lymphocytes were also observed in its monovalent N-terminal fusion format, B#IL-2H16W. This molecule barely induced STAT5 phosphorylation in mouse CD8 and NK cells (FIG. 8) . Its capability in inducing Treg STAT5 phosphorylation was not impacted, probably because Treg express IL-2Rα as well, and simultaneous binding of B#IL-2H16W to both IL-2Rα and IL-2Rβγ compensates the reduction in affinity of IL-2H16W.

[0317] Example 8. Reduced toxicity of IL-2 variants-Fc fusions

[0318] High dose IL-2 therapy is associated with severe toxic side effects. Similar effects were also observed in mice. Administration of IL-2 causes death of mice at doses intolerable to the animals, usually shortly after the second weekly dosing. This observation provides an easy and convenient means to evaluate the toxicity of IL-2 constructs.

[0319] H16W and V91Y muteins of IL-2 were found to reduce its binding to IL-2Rβγ and its capability in inducing STAT5 phosphorylation. Monovalent, N terminal and bivalent C-terminal fusions of IL-2-Fc, as well as their H16W and V91Y versions were tested for causing death of C57 mice. In some cases R38L / F42A mutations (designated laIL-2) with reduced binding to IL-2Rα were also incorporated.

[0320] The 10 constructs listed in FIG. 9C were i. v. injected into C57 mice at indicated doses, two mice at each dose for each construct, on Day 0 and D7, and animal deaths were recorded on Day 8. For each construct, the highest doses that did not cause animal death were recorded as highest non-lethal dose (NLD) (FIGS. 9A-9C) .

[0321] For monovalent N-terminal IL-2-Fc fusion, induction of H16W and V91Y did not result in reduction of highest NLD (FIG. 9A) , despite the observation that these two mutations lowered the affinity of IL-2 to mouse IL-2Rβγ and reduced the capability in inducing mouse CD8 and CD4 STAT5 phosphorylation compared to their wildtype IL-2 counterpart.

[0322] Interestingly, induction of the R38L / F42A (la-IL-2) mutations even increased the toxicity of monovalent N-terminal IL-2-Fc fusions compared to their normal IL-2Rα binding versions (FIG. 9A) .

[0323] For bispecific, C-terminal IL-2-Fc fusions, induction of H16W and V91Y reduced the toxicity as indicated by a ～4 fold and above 33 fold increase in highest NLD, respectively (FIG. 9B) .

[0324] Interestingly, the R38L / F42A mutations, which slightly increased the toxicity of IL-2-Fc fusions in monovalent N-terminal format, reduced the toxicity in the bispecific, C-terminal fusion format. When comparing the wildtype IL-2 versions in regard to IL-2Rβγ binding, the low IL-2Rα binding (la-IL-2) version with R38L / F42A mutant increased the highest NLD by above 33 fold. When comparing the H16W IL-2 versions in regard to IL-2Rβγ binding, the la-IL-2 version with R38L / F42A mutations increased the highest NLD by above 9 fold.

[0325] These results suggest that IL-2 toxicity can be reduced by inducing low affinity IL-2Rβγ binding and low affinity IL-2Rα binding mutations. Furthermore, toxicity reduction by both low affinity IL-2Rβγ and IL-2Rα binding mutations are format dependent. Toxicity reduction is more evident in bispecific, C-terminal IL-2-Fc fusions.

[0326] OTHER EMBODIMENTS

[0327] It is to be understood that while the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.A Interleukin-2 (IL-2) polypeptide that comprises one or more of the following:(a) . the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W; and(b) . the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y.2.The polypeptide of claim 1, wherein the polypeptide further comprises one or more of the following:(a) . the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L; and(b) . the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A.3.The polypeptide of claim 1 or claim 2, wherein the polypeptide further comprises one or more of the following:(a) the amino acid that corresponds to E15 of SEQ ID NO: 1 is P;(b) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is F, I, or L;(c) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is P or D;(d) the amino acid that corresponds to I92 of SEQ ID NO: 1 is S, E, or K;(e) the amino acid that corresponds to I93 of SEQ ID NO: 1 is R;(f) the amino acid that corresponds to Q126 of SEQ ID NO: 1 is A; and(g) the amino acid that corresponds to T133 of SEQ ID NO: 1 is K, P, W, or M.4.The polypeptide of any one of claims 1-3, wherein the polypeptide comprises a sequence that is at least 90%, 95%, or 99%identical to SEQ ID NO: 1.5.The polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W.6.The polypeptide of any one of claims 1-5, wherein the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y.7.The polypeptide of any one of claims 1-6, wherein the IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of the sequences of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.8.The polypeptide of any one of claims 1-7, wherein the polypeptide has a reduced binding affinity to IL-2Rβγ as compared to a wildtype IL-2 polypeptide.9.A fusion protein that comprises the polypeptide of any one of claims 1-8 and a fragment crystallizable region ( “Fc” ) .10.A fusion protein that comprises(1) a first polypeptide chain that comprises, from the N-terminus to the C-terminus, optionally a first hinge region, and a first Fc region; and(2) a second polypeptide chain that comprises, from the N-terminus to the C-terminus, a IL-2 polypeptide, optionally a second hinge region, and a second Fc region,wherein the IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:(a) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W;(b) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y;(c) the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L; and(d) the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A,wherein the IL-2 polypeptide has a reduced binding affinity to IL-2Rα, IL-2Rβγand / or IL-2Rαβγ as compared to a wildtype IL-2 polypeptide.11.The fusion protein of claim 10, wherein the IL-2 polypeptide further comprises one or more of the following:(a) the amino acid that corresponds to E15 of SEQ ID NO: 1 is P;(b) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is F, I, or L;(c) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is P or D;(d) the amino acid that corresponds to I92 of SEQ ID NO: 1 is S, E, or K;(e) the amino acid that corresponds to I93 of SEQ ID NO: 1 is R;(f) the amino acid that corresponds to Q126 of SEQ ID NO: 1 is A; and(g) the amino acid that corresponds to T133 of SEQ ID NO: 1 is K, P, W, or M.12.The fusion protein of any one of claims 10-12, wherein the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W.13.The fusion protein of any one of claims 10-13, wherein the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y.14.The fusion protein of any one of claims 10-13, wherein the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L and the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A.15.The fusion protein of any one of claims 10-15, wherein the IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of the sequences of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.16.The fusion protein of any one of claims 10-16, wherein an antigen binding domain (e.g., Fab, scFv, or VHH) is linked to the N-terminus of the first polypeptide.17.A fusion protein that comprises:(1) a first polypeptide chain that comprises, from the N-terminus to the C-terminus, optionally a first hinge region, a first Fc region, optionally a first linker, and a first IL-2 polypeptide; and(2) a second polypeptide chain that comprises, from the N-terminus to the C-terminus, optionally a second hinge region, a second Fc region, optionally a second linker, and an optional second IL-2 polypeptide,wherein the first and / or second IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:(a) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W;(b) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y;(c) the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L; and(d) the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A,wherein the first IL-2 polypeptide and / or the optional second IL-2 polypeptide has a reduced binding affinity to IL-2Rα, IL-2Rβγ, and / or IL-2Rαβγ as compared to a wildtype IL-2 polypeptide.18.The fusion protein of claim 17, wherein the first IL-2 polypeptide and / or second IL-2 polypeptide further comprises one or more of the following:(a) the amino acid that corresponds to E15 of SEQ ID NO: 1 is P;(b) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is F, I, or L;(c) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is P or D;(d) the amino acid that corresponds to I92 of SEQ ID NO: 1 is S, E, or K;(e) the amino acid that corresponds to I93 of SEQ ID NO: 1 is R;(f) the amino acid that corresponds to Q126 of SEQ ID NO: 1 is A; and(g) the amino acid that corresponds to T133 of SEQ ID NO: 1 is K, P, W, or M.19.The fusion protein of claim 17 or claim 18, wherein the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W.20.The fusion protein of any one of claims 17-19, wherein the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y.21.The fusion protein of any one of claims 17-20, wherein the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L and the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A.22.The fusion protein of any one of claims 17-21, wherein the first IL-2 polypeptide and / or second IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of the sequences of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.23.The fusion protein of any one of claims 17-22, wherein an antigen binding domain (e.g., Fab, scFv, or VHH) is linked to the N-terminus of the first and / or the second polypeptide.24.A fusion protein, comprising a first Fc region, a second Fc region, and one or more IL-2 polypeptides, wherein each of the one or more IL-2 polypeptides independently comprises one or more of the following:(a) the amino acid that corresponds to H16 of SEQ ID NO: 1 is W;(b) the amino acid that corresponds to V91 of SEQ ID NO: 1 is Y;(c) the amino acid that corresponds to R38 of SEQ ID NO: 1 is L; and(d) the amino acid that corresponds to F42 of SEQ ID NO: 1 is A,wherein the one or more IL-2 polypeptides have a reduced binding affinity to IL-2Rα, IL-2Rβγ and / or IL-2Rαβγ as compared to a wildtype IL-2 polypeptide.25.The fusion protein of claim 24, wherein the fusion protein comprises one IL-2 polypeptide, wherein the IL-2 polypeptide is linked to the N-terminus of the second Fc region, optionally via a hinge region.26.The fusion protein of claim 24, wherein the fusion protein comprises a first IL-2 polypeptide and a second IL-2 polypeptide, wherein (2) the first IL-2 polypeptide is linked to the C-terminus of the first Fc region, optionally via a first linker peptide and (2) the second polypeptide is linked to the C-terminus of the second Fc region, optionally via a second linker peptide.27.The fusion protein of any one of claims 9-26, wherein the Fc is human IgG4 Fc.28.The fusion protein of any one of claims 10-23, wherein the first hinge region and / or the second hinge region is a human IgG4 hinge region optionally with S228P mutation according to EU numbering.29.The fusion protein of any one of claims 10-23, wherein the first hinge region and / or the second hinge region comprise an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 87.30.The fusion protein of any one of claims 10-29, wherein the first Fc region comprises a knob mutation, and the second Fc region comprises a hole mutation.31.The fusion protein of any one of claims 10-30, wherein the first Fc region comprise an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 21; and the second Fc region comprise a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22.32.The fusion protein of any one of claims 10-16, 24 and 25, wherein the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 21, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 23-41.33.The fusion protein of claim 32, wherein the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 21, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 26 and 28.34.The fusion protein of any one of claims 17-23, 24 and 26, wherein the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 43-61, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 63-81.35.The fusion protein of claim 34, wherein the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 46, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 66.36.The fusion protein of claim 34, wherein the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 48, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 68.37.The fusion protein of claim 34, wherein the first polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 62, and the second polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 82.38.A nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the IL-2 polypeptide of any one of claims 1-8, or the fusion protein of any one of claims 9-37.39.The nucleic acid of claim 38, wherein the nucleic acid is a DNA (e.g., cDNA) or RNA (e.g., mRNA) .40.A vector comprising one or more of the nucleic acids of claim 38 or 39.41.A cell comprising the vector of claim 40.42.The cell of claim 41, wherein the cell is a CHO cell.43.A cell comprising one or more of the nucleic acids of claim 38 or 39.44.A method of producing a IL-2 polypeptide or a fusion protein, the method comprising(a) culturing the cell of any one of claims 41-43 under conditions sufficient for the cell to produce the IL-2 polypeptide or the fusion protein; and(b) collecting the IL-2 polypeptide or the fusion protein produced by the cell.45.A method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the IL-2 polypeptide of any one of claims 1-8 or the fusion protein of any one of claims 9-37, to the subject.46.The method of claim 45, wherein the cancer is breast cancer, prostate cancer, non-small cell lung cancer, pancreatic cancer, diffuse large B-cell lymphoma, mesothelioma, lung cancer, ovarian cancer, colon cancer, pleural tumor, glioblastoma, esophageal cancer, gastric cancer, synovial sarcoma, thymic carcinoma, endometrial carcinoma, stomach cancer, cholangiocarcinoma, head and neck cancer, blood cancer, or a combination thereof.47.A pharmaceutical composition comprising the IL-2 polypeptide of any one of claims 1-8 or the fusion protein of any one of claims 9-37, and a pharmaceutically acceptable carrier.

Images