DSG2 antibody and uses thereof

Abstract

The present disclosure provides an antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds DSG2, its multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof, antibody conjugate, pharmaceutical composition, combination, and a method of treating tumor using the above.

Description

DSG2 ANTIBODY AND USES THEREOF

[0001] CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] The present application claims the priority to PCT Application No. PCT / CN2024 / 108538, filed on July 30, 2024. The disclosure of the prior application is considered part of the disclosure of the present application and is incorporated herein in its entirety.

[0003] REFERENCE TO THE SEQUENCE LISTING

[0004] The Sequence Listing titled DCF240284WO-sequence listing, which was created on July 27, 2024 and is 42,561 bytes in size, is hereby incorporated by reference in its entirety.TECHNICAL FIELD

[0005] The present disclosure relates to the immunotherapy field, particularly relates to an antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds DSG2.BACKGROUND

[0006] The advancement of immunotherapy offers effective treatment options for cancer patients. One promising approach involves using T cells for cancer therapy, which emerged from the discovery that T cells can be redirected to tumor cells by a type of bispecific hybrid antibodies (Abs) . Generally, these bispecific antibodies combine a tumor-binding domain directed to a tumor-associated antigen with a T cell recruitment domain, most often targeted to CD3. These bispecific antibodies, also known as T cell engagers (TCE) , can induce T cell-mediated cytotoxicity towards tumor cells by simultaneously binding to the target antigen and CD3, without engaging specific T cell receptor (TCR) -MHC complexes (Brischwein et al. Journal of Immunotherapy 30 (8) ) .

[0007] γδ T cells are a subgroup of T cells characterized by distinct T cell receptor γ and δ chains on their surfaces, accounting for 0.5–5%of all T-lymphocytes. γδ T cells are typically less common than αβ T cells, with their highest abundance in the gut mucosa, within a population of lymphocytes known as intraepithelial lymphocytes (Zhao et al. J Transl Med (2018) 16: 3) . Human γδ T cells can be subdivided into Vδ1, Vδ2, and Vδ3 T cells based on their surface antigens. Typically, about 50%to 75%of γδ T lymphocytes in peripheral blood are Vγ9Vδ2 T cells, which express Vδ2 chains and Vγ9 chains (Chen et al. Ann Blood 2022; 7: 42) . Vγ9Vδ2 T cells have demonstrated antitumor efficacy against a broad range of cancers.

[0008] Desmoglein-2 (DSG2) is a calcium-binding transmembrane glycoprotein belonging to the desmosomal cadherin family, which plays a critical role in mediating intercellular adhesion in epithelial and cardiac tissues. As the most widely expressed member of its family, DSG2 is present in all tissues that form desmosomes-structures that connect cells tightly to each other. It is especially common in heart muscle tissue, where it helps maintain the structure of the heart and ensures that heart cells contract in a coordinated way. Changes in the amount or function of DSG2 can be associated with cancers.SUMMARY

[0009] The present disclosure provides an antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds Desmoglein 2 (DSG2) , comprising:

[0010] a HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions;

[0011] a HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions;

[0012] a HCDR3 comprising the amino acid sequence set forth as KAY with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions;

[0013] a LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions;

[0014] a LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions; and

[0015] a LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions.

[0016] The present disclosure provides an antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds DSG2, comprising a VH and / or a VL, wherein the VH comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 38, and / or the VL comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 39.

[0017] The present disclosure provides an antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds DSG2, comprising the following CDRs with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions for each CDR sequence: three CDRs of a VH as set forth in SEQ ID NO: 38, and three CDRs of a VL as set forth in SEQ ID NO: 39.

[0018] The present disclosure provides a multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof comprises a first antibody or antigen binding fragment thereof (AB1) targeting DSG2, and at least a second antibody or antigen binding fragment thereof (AB2) that specifically binds a second target, preferably the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof is bispecific. In some embodiments, the AB1 targeting DSG2 comprises the antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds Desmoglein 2 (DSG2) disclosed herein.

[0019] The present disclosure provides an antibody conjugate, comprising the antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein, or the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein.

[0020] The present disclosure provides an isolated nucleic acid encoding the antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein, or the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein.

[0021] The present disclosure provides a vector comprising the isolated nucleic acid disclosed herein.

[0022] The present disclosure provides a host cell comprising the isolated nucleic acid disclosed herein, or the vector disclosed herein.

[0023] The present disclosure provides a pharmaceutical composition, comprising the antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein, the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein, the antibody conjugate disclosed herein, the isolated nucleic acid disclosed herein, the vector disclosed herein, or the host cell disclosed herein, and a pharmaceutically acceptable excipient or carrier.

[0024] The present disclosure provides a method of treating tumor, preventing tumor occurrence, preventing tumor metastasis, activating T cell, or inducing cytotoxicity of tumor cells in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein, the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein, the antibody conjugate disclosed herein, or the pharmaceutical composition disclosed herein.

[0025] The present disclosure also provides the use of the antibody or antigen binding fragment thereof described in the present disclosure, the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof described in the present disclosure, the antibody conjugate described in the present disclosure, or the pharmaceutical composition described in the present disclosure in the preparation of a medicament for treating tumor, preventing tumor occurrence, preventing tumor metastasis, activating T cell, or inducing cytotoxicity of tumor cells in a subject in need thereof.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0026] The following is a brief description of the drawings, which are presented for the purposes of illustrating the exemplary embodiments disclosed herein and not for the purposes of limiting the same.

[0027] Figure 1 shows FACS binding results for the anti-DSG2 antibody hu10F07 towards high DSG2 expression cell line A549 and low DSG2 expression cell line ASG in Example 3. hu10F7 exhibited stronger binding to DSG2 on A549 or AGS cells as compared to benchmark mAbs (6D8, 3D4) and human IgG.

[0028] Figure 2 shows the internalization results induced by anti-DSG2 antibody hu10F07 in Example 4. hu10F7, along with benchmark mAbs 6D8 and 3D4, could induce potent DSG2 internalization, both in A549 and AGS cells.

[0029] Figure 3A-C show the molecular constructs of the bispecific antibody follows a "1+1" (V1) , "2+2" (V2) , and F3 (V3) pattern in Example 5.

[0030] Figure 4 shows the cytoxicity led by DSG2-specific γδ T cell engagers against target cell A549, OE19, MKN-74 in Example 6. All DSG2-specific γδ T cell engagers with V1, V2 or V3 format showed potent killing activity against target cells, especially BsAbs in “V2” formats, which were 10-fold more potent than BsAbs in “V1” format.

[0031] Figure 5 A-C show the bodyweight change of OE19 xenograft model treating with γδ T cell engagers 3G2 x 10F7 in Example 7.DETAILED DESCRIPTION OF EMBODIMENTS

[0032] The aforementioned features and advantages of the disclosure as well as additional features and advantages thereof will be more clearly understood hereafter as a result of a detailed description of the following embodiments when taken in conjunction with the drawings. The embodiments described herein with reference to drawings are explanatory, illustrative, and shall not be construed to limit the scope of the present disclosure.

[0033] The description is not intended to be a detailed catalog of all the different ways in which the disclosure may be implemented or all the features that may be added to the instant disclosure. For example, features illustrated with respect to one embodiment may be incorporated into other embodiments, and features illustrated with respect to a particular embodiment may be deleted from that embodiment. In addition, numerous variations and additions to the various embodiments suggested herein will be apparent to those skilled in the art in light of the instant disclosure which do not depart from the instant disclosure. Hence, the following description is intended to illustrate some particular embodiments of the disclosure, and not to exhaustively specify all permutations, combinations and variations thereof.

[0034] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the disclosure pertains. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice for testing of the present disclosure, the preferred materials and methods are described herein. In describing and claiming the present disclosure, the following terminology will be used.

[0035] Unless clearly indicated otherwise, the term “comprise” , “include” , “contain” , and their variations such as “comprising” , “comprises” as used herein should be understood to imply the inclusion of a stated element or step or a group of elements or steps, but not the exclusion of any other element or step or a group of elements or steps.

[0036] Unless clearly contraindicated in the context herein or indicated otherwise, the expression of “A and / or B” includes three situations: (1) A, (2) B, and (3) A and B; the expression of “A, B and / or C” includes seven situations: (1) A, (2) B, (3) C, (4) A and B, (5) A and C, (6) B and C, and (7) A, B and C. The meaning of similar expressions can be inferred in this manner.

[0037] Unless indicated otherwise, a singular form of a referent shall include its plural counterparts, and plural terms shall include the singular counterpart.

[0038] As used herein, the term “antibody” refers to an immunoglobulin (Ig) molecule that specifically binds an antigen. A basic antibody unit is in a tetramer form consisting of two identical light chains (LC) and two identical heavy chains (HC) . The N-terminal of each chain contains a variable region with highly diverse amino acid sequence, and the rest of each chain contains the constant region. The heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) are responsible for antigen binding, while the constant regions may participate in the binding of an immunoglobulin to host cells or factors, including immune cells and components of the complement system.

[0039] An immunoglobulin can be categorized into five classes based on heavy chain constant region, that are IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM. Further, an immunoglobulin can be further divided into subtypes, such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2. Whereas, the antibody light chain may be a lambda (λ) chain or a kappa (κ) chain.

[0040] An exemplary heavy chain constant region could be the wild-type shown as:

[0041] An exemplary light chain constant region could be the wild-type shown as:

[0042] A full-length antibody includes two heavy chains and two light chains. The variable regions / domains of the light and heavy chains are responsible for antigen binding. The “variable region” or “variable domain” of an antibody refers to the amino-terminal domains of the heavy or light chain of the antibody. The variable domains of the heavy chain and light chain may be referred to as “VH” and “VL” , respectively. These domains are generally the most variable parts of the antibody (relative to other antibodies of the same class) and contain the antigen-binding sites. In some embodiments, from the N-to the C-terminus, the variable domain of heavy chain / domain / region, was followed by three constant heavy domains (CH1, CH2, and CH3) . Similarly, from the N-to the C-terminus, the variable domain of light chain / domain / region, was followed by a constant light (CL) domain.

[0043] The light chain variable region (VL) or heavy chain variable region (VH) from N-terminal to C-terminus is in an arrangement of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, where FR represents framework region, and CDR represents complementarity determining region. CDRs 1, 2, and 3 of VL can also be denoted as LCDR1, LCDR2, and LCDR3 respectively; CDRs 1, 2, and 3 of VH can also be denoted as HCDR1, HCDR2, and HCDR3 respectively. The FRs curl to bring the CDRs close to each other, and the CDRs are in a 3D conformation providing an antigen binding surface complementary to the antigen target.

[0044] The terms “complementarity determining region” or “CDR, ” as used herein, refer to the sequences of amino acids within antibody variable regions which confer antigen specificity and binding affinity. In some embodiments, there are three CDRs in each heavy chain variable region (HCDR1, HCDR2, and HCDR3) and three CDRs in each light chain variable region (LCDR1, LCDR2, and LCDR3) .

[0045] A number of hypervariable region or CDR delineations are in use and are encompassed herein. The Kabat Complementarity Determining Regions (Kabat CDRs) are based on sequence variability and are the most commonly used (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . Chothia refers instead to the location of the structural loops (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 -917 (1987) ) . The AbM hypervariable regions represent a compromise between the Kabat CDRs and Chothia structural loops, (Chothia "CDRs" ) and are used by Oxford Molecular's AbM antibody modeling software. The "contact" hypervariable regions are based on an analysis of the available complex crystal structures. Another universal numbering system that has been developed and widely adopted is ImMunoGeneTics (IMGT) Information   (Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27 (1) : 55-77 (2003) ) . IMGT is an integrated information system specializing in immunoglobulins (IG) , T-cell receptors (TCR) , and major histocompatibility complex (MHC) of human and other vertebrates.

[0046] Unless otherwise stated, in the present invention, the term "CDRs" or "CDR sequences" encompasses CDR sequences determined in any of the ways described above.

[0047] As used herein, the term “antibody” should be understood in its broadest interpretation, including, but not limited to monoclonal antibodies (mAbs) , polyclonal antibodies, fusion antibodies, multi-specific (such as bispecific) antibodies, diabodies, nanobodies, triabody, multivalent antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, fully human antibodies, single chain antibodies, antibody fragments that preserve the antigen binding specificity, such as antigen binding fragment. The antibody may contain additional modifications, such as mutations in non-CDR regions, constant regions, glycosylation sites, post-translational modifications and others under the condition that the resulting antibody has the preserved binding specificity to a target antigen.

[0048] As used herein, the term “antigen-binding fragment” refers to an antibody fragment including VH, VL, a diabody, a Fab, a Fab’ , a F (ab’ ) 2, scFab, VHH (sdAb or dAb) , an Fv fragment, a disulfide stabilized Fv fragment (dsFv) , a (dsFv) 2, a bispecific dsFv (dsFv-dsFv’ ) , a disulfide stabilized diabody (ds diabody) , a single-chain Fv (scFv) , an scFv dimer (bivalent diabody) , taFv, DART and   (bispecific T-cell engager) , a multi-specific antibody formed from a portion of an antibody including one or more CDRs, a camelized single domain antibody, a nanobody, a domain antibody, a bivalent domain antibody, or any other antibody fragment that binds to an antigen but does not include a complete antibody structure. An antigen-binding fragment is capable of binding to the same antigen to which the parent antibody or a parent antibody fragment (e.g., a parent scFv) binds.

[0049] As used herein, the term “specifically bind” or “bind” refers to the non-covalent interactions between an immunoglobulin and an antigen for which the immunoglobulin is specific. The strength or affinity of the interaction can be expressed by the equilibrium dissociation constant (KD or Kd) for an antigen and the corresponding antibody: the lesser the value of the KD, the stronger the binding strength between an epitope and the antibody. Equilibrium dissociation constant (KD) is calculated as the ratio of koff / kon, where the “on rate constant (Kon) ” and the “off rate constant (Koff) ” can be determined by calculation of the concentrations and the actual rates of association and dissociation. (See, Nature 361: 186-87 (1993) ) .

[0050] In some embodiment of the present disclosure, an antibody is said to specifically bind to an antigen when a dissociation constant (KD) is less than or equal to 1X10-6M, in some embodiments less than or equal to 1x10-7M, in some embodiments less than or equal to 1x10-8M, and in some embodiments less than or equal to 1x10-9M, and in some embodiments is in a range between 1x10-8 to 1x10-12M.

[0051] As used herein, the term “multispecific antibody” is to be understood as an antibody having binding specificities for at least two different antigens or epitopes, including bispecific antibodies.

[0052] Multispecificity can be provided for by a variety of different formats (see Spiess et al. Molecular Immunology. 2015.67 (2 Pt A) : 95-106 and Brinkmann et al. MAbs. 2017.9 (2) : 182-212, both of which are incorporated by reference herein in their entirety) . Examples of such formats include Fab-scFab, orthogonal Fab, DuetMab, CrossMAb, DVD-IgTM (dual variable domain immunoglobulin) , and TriFabs.

[0053] As used herein, the term “subject” includes animals such as vertebrate, preferably mammals, such as dogs, cats, pigs, sheep, horses, goats, rodents (e.g., mice, rates, guinea pigs) or primates (e.g., gorillas, chimpanzees, monkeys, and humans) .

[0054] The term "monoclonal antibody (mAb) ” as used herein refers to a type of immunoglobulin that has identical CDRs, which specifically binds to an antigen or epitope.

[0055] As used herein, the term "humanized antibody" generally refers to an antibody containing a heavy and a light chain variable region sequence from a non-human species (e.g., rabbit, mouse, etc. ) , where at least part of the VH and / or VL sequence has been altered to be more "human-like" , i.e. more similar to a human variable sequence. For a type of humanized antibody, at least one human CDR sequence is introduced into the non-human VH and / or VL sequences to replace the non-human CDR counterpart.

[0056] In the polypeptide notation used herein, the left-hand end corresponds to the amino terminal / N-terminal, and the right-hand end corresponds to the carboxy-terminal / C-terminal, in accordance with convention. Likewise, the left-hand end of single-stranded polynucleotide sequence is the 5’ end, the left-hand direction of double-stranded polynucleotide sequences is the 5’direction, the right-hand end of single-stranded polynucleotide sequence is the 3’ end, and the right-hand direction of double-stranded polynucleotide sequences is the 3’ direction.

[0057] As used herein, the term “sequence identity” is usually determined using sequence analysis software. Protein analysis software uses similarity measures assigned to various substitutions, deletions, and other modifications, including conservative amino acid substitutions, to match similar sequences. For example, GCG software includes programs such as Gap and Bestfit that can be used to determine sequence homology or sequence identity between closely related polypeptides, such as homologous polypeptides from organisms of different species, or wild-type proteins and their mutant protein. See, eg, GCG version 6.1. Polypeptide sequences can also be compared using FASTA with default or recommended parameters, and programs in GCG version 6.1. FASTA (eg, FASTA2 and FASTA3) provide alignments and percent sequence identity (Pearson) of the region of optimal overlap between the query and search sequences. (2000) , op. cit. ) . Another preferred algorithm is the computer program BLAST, especially BLASTP, BLASTN, using default parameters when comparing the sequences of the present disclosure with databases containing a large number of sequences from different organisms. See, eg, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389402.

[0058] In some embodiments, the "sequence identity" is determined by comparing two optimally aligned sequences, wherein the portion of the polynucleotide or polypeptide sequence may comprise additions or deletions (i.e., gaps) of 20 percent or less as compared to the reference sequences (which does not comprise additions or deletions) for optimal alignment of the two sequences. The percentage is calculated by determining the number of positions at which the identical nucleic acid bases or amino acid residue occurs in both sequences to yield the number of matched positions, dividing the number of matched positions by the total number of positions in the reference sequence and multiplying the results by 100 to yield the percentage of sequence identity.

[0059] As used herein, the term "conservative substitution" means the substitution of an amino acid that is not essential for the activity of the peptide, or the substitution of an amino acid with another amino acid that has similar properties (e.g., acidic, basic, positively or negatively charged, polar or non-polar, etc. ) , such that even the substitution of an essential amino acid does not reduce the activity of the peptide. Conservative substitution that provides functionally similar amino acids is well-known in the field.

[0060] In some embodiments, the conservative substitution could be the one occurs within the same group listed below, (a) small aliphatic, nonpolar or slightly polar residues: Ala, Ser, Thr, Pro and Gly; (b) polar, negatively charged residues and their (uncharged) amides: Asp, Asn, Glu and Gln; (c) polar, positively charged residues: His, Arg and Lys; (d) large aliphatic, nonpolar residues: Met, Leu, He, Val and Cys; and (e) aromatic residues: Phe, Tyr and Trp. For example, Asp is substituted with Glu, Ala is substituted with Gly or Ser.

[0061] Antibody or antigen binding fragment thereof

[0062] The present disclosure provides an antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds DSG2, comprising: a HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions; a HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions; a HCDR3 comprising the amino acid sequence set forth as KAY with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions; a LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions; a LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions; and a LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions.

[0063] In some embodiments, CDR sequences are defined according to Kabat system.

[0064] The present disclosure provides an antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds DSG2, comprising: a HCDR1 comprising a VH and / or a VL, wherein the VH comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 38, and / or the VL comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 39.

[0065] The present disclosure provides an antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds DSG2, comprising the following CDRs with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions for each CDR sequence: three CDRs of a VH as set forth in SEQ ID NO: 38, and three CDRs of a VL as set forth in SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds DSG2 is anti-DSG2 antibody or antigen binding fragment thereof.

[0066] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein comprises a CH (heavy chain constant region) and / or a CL (light chain constant region) . In some embodiments, the CH comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 45 or its functional variant, preferably the functional variant of CH has 1, 2, 3, or 4 substitutions as SEQ ID NO: 45. In some embodiments, the CL comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 46 or its functional variant, preferably the functional variant of CL has 1, 2, 3, or 4 substitutions as SEQ ID NO: 46.

[0067] As used herein, when referring to amino acid sequences, “functional variant” means an amino acid sequence that serves the same or similar function as the reference sequence. The functional variant could have one or more amino acid substitutions as the reference sequence so long as the same or similar function could be achieved. Same or similar function could be interpreted as that the functional variant’s activity level is superior, the same, or at least 30%、40%、50%、60%of that of the reference sequence.

[0068] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds DSG2 disclosed herein is an antagonist antibody or antigen binding fragment thereof for DSG2.

[0069] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein is selected from the following isotypes: IgG, IgM, IgE, IgA, and IgD. In some embodiments, which is selected from the following subtypes: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2.

[0070] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein is selected from at least one of the following: a monoclonal antibody, polyclonal antibody, chimeric antibody, humanized antibody, CDR-grafted antibody, fully human antibody.

[0071] Multi-specific antibody

[0072] The present disclosure also provides a multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof comprises a first antibody or antigen binding fragment thereof (AB1) targeting DSG2, and at least a second antibody or antigen binding fragment thereof (AB2) that specifically binds a second target. In some preferred embodiments, the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof is bispecific.

[0073] In some embodiments, the AB1 of the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein comprises any one of the antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds DSG2 disclosed herein.

[0074] In some embodiments, the AB1 of the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein is linked to the AB2 in the form of V1, V2 or V3, as schematically shown in Fig 3 A-C. The conformational allocation of AB1 and AB2 in the bispecific antibody formats can be exchanged.

[0075] In some embodiments, for V1 form the AB1 and AB2 are linked to Fc via hinge region. In some preferred embodiments, the AB1 and / or AB2 are Fab (s) . In some preferred embodiments, the AB1 is anti-DSG2 Fab, and the AB2 is anti-γδ TCR Fab.

[0076] In some embodiments, for V2 form the AB1 is in a conventional immunoglobulin form, and the AB2 comprising Fab (s) or modified Fab (s) is fused to the C-terminus of the heavy chain or light chain of the conventional immunoglobin (such as IgG) of AB1. In some embodiments, the modified Fab includes but is not limited to a Fab with the CH1 and CL interchanged. In some embodiments, the AB2 is connected to the C-terminus of the heavy chain or light chain of the conventional immunoglobin of AB1 via a linker.

[0077] In some embodiments, for V3 form the AB2 is in a conventional immunoglobin form, and the AB1 comprising two single chain variable fragments (scFvs) is connected to the C-terminus of the heavy chain or light chain of the conventional immunoglobin of AB2. In some embodiments, for AB1 the VL1 of scFv and VH1 of scFv is linked together via a linker. In some embodiments, the scFvs of AB1 is linked to the C-terminus of the heavy chain or light chain of the conventional immunoglobulin (such as IgG) of AB2 via a linker.

[0078] The Fc fragment and hinge region of conventional immunoglobin, linker to construct scFv, and linker to link the scFv or Fab to the conventional immunoglobin are well known in the art. In some preferred embodiments, the linker is ( (G) nS) m, in which the n or m is any integer selected from 1-8. In some more preferred embodiments, the linker is (GGGS) m or (GGGGS) m, in which the m is any integer selected from 1-8.

[0079] n some embodiments, the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein comprises a CH and / or a CL. In some embodiments, the CH comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 45 or its functional variant, preferably the functional variant of CH has 1, 2, 3, or 4 substitutions as SEQ ID NO: 45. In some embodiments, the CL comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 46 or its functional variant, preferably the functional variant of CL has 1, 2, 3, or 4 substitutions as SEQ ID NO: 46.

[0080] In preferred embodiments, the CH2 and the CH3 of IgG constitute Fc fragment which can be recognized by FcR to trigger antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) etc. In the present multi-specific antibody or antigen binding fragment, Fc induced FcR binding and the corresponding activation are eliminated or reduced by introduction of mutations or modifications in Fc region. The well-known Fc silencing strategy in the art include L234A / L235A (LALA) , L234A / L235A  / P329G (LALAPG) , which are all applicable for the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein. And in a more preferred embodiment, L234A / L235A (LALA) is introduced in the wild type Fc region.

[0081] Antibody conjugate

[0082] The present disclosure also provides an antibody conjugate, comprising the antibody or antigen binding fragment thereof described in the present disclosure, or the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof described in the present disclosure.

[0083] In some embodiments, the antibody conjugate further comprising a drug moiety linked to the antibody or antigen binding fragment thereof or the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof disclosed herein directly or through a linker. In some embodiments, the linker is selected from cleavable and non-cleavable linkers.

[0084] In some embodiments, the drug moiety is selected from cytotoxic agents. The cytotoxic agent may be any compound that results in the death of a cell, or induces cell death, or in some manner decreases cell viability. Preferred cytotoxic agents include, for example, maytansinoids and maytansinoid analogs, taxoids, taxanes such as paclitaxel and docetaxel, CC-1065 and CC-1065 analogs, dolastatin and dolastatin analogs, methotrexate, daunorubicin, doxorubicin, vincristine, vinblastine, melphalan, mitomycin C, chlorambucil, calicheamicin, tubulysin and tubulysin analogs, duocarmycin and duocarmycin analogs, taxanes such as paclitaxel and docetaxel.

[0085] Isolated nucleic acid, vector, host cell

[0086] The present disclosure also provides an isolated nucleic acid encoding the antibody or antigen binding fragment thereof described in the present disclosure, or the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof described in the present disclosure.

[0087] As used herein, the term "nucleic acid" includes both single-stranded and double-stranded nucleotide polymers. The nucleic acid can be ribonucleotides or deoxyribonucleotides or a modified form of either type of nucleotide. Said modifications include base modifications such as bromouridine and inosine derivatives, ribose modifications such as 2', 3'-dideoxyribose, and internucleotide linkage modifications such as phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoroselenoate, phosphorodiselenoate, phosphoroanilothioate, phoshoraniladate and phosphoroamidate.

[0088] An “isolated” nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a protein, or portion or fragment thereof described herein is a nucleic acid molecule that is identified and separated from at least one contaminant nucleic acid molecule with which it is ordinarily associated in the environment in which it was produced. Preferably, the isolated nucleic acid is free of association with all components associated with the production environment. The isolated nucleic acid encoding the protein, or portion or fragment thereof described herein is in a form other than in the form or setting in which it is found in nature. Isolated nucleic acid, therefore, are distinguished from nucleic acid encoding the protein, or portion or fragment thereof described herein existing naturally in cells.

[0089] The present disclosure also provides a vector comprising the isolated nucleic acid described in the present disclosure.

[0090] As used herein, the term “vector” refers to a nucleic acid molecule used as a vehicle to carry genetic material into another cell, where it can be replicated and / or expressed. In some embodiments, the vector is an expression vector. In some embodiments, the vector is a viral vector. In some embodiments, the vector is a retroviral vector, a DNA vector, a murine leukemia virus vector, an SFG vector, a plasmid, an RNA vector, an adenoviral vector, a baculoviral vector, an Epstein Barr viral vector, a papovaviral vector, a vaccinia viral vector, a herpes simplex viral vector, an adenovirus associated vector (AAV) , a lentiviral vector, or any combination thereof.

[0091] The present disclosure also provides a host cell comprising the isolated nucleic acid described in the present disclosure, or the vector described in the present disclosure.

[0092] In some embodiments, the cell can be a prokaryotic cell, fungal cell, yeast cell, or eukaryotic cells such as a mammalian cell. Suitable prokaryotic cells include, without limitation, eubacteria, such as Gram-negative or Gram-positive organisms, for example, Enterobactehaceae such as Escherichia, e.g., E. coli; Enterobacter; Erwinia; Klebsiella; Proteus; Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium; Serratia, e.g., Serratia marcescans, and Shigella; Bacilli such as B. subtilis and B. licheniformis; Pseudomonas such as P. aeruginosa; and Streptomyces. In some embodiments, the cell is a human cell. In some embodiments, the cell is an immune cell. In some embodiments, host cells include, for example, CHO cells, such as CHOS cells and CHO-K1 cells, or HEK293 cells, such as HEK293A, HEK293T and HEK293FS.

[0093] Pharmaceutical composition

[0094] The present disclosure also provides a pharmaceutical composition, comprising the antibody or antigen binding fragment thereof described in the present disclosure, the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof described in the present disclosure, the antibody conjugate described in the present disclosure, the isolated nucleic acid described in the present disclosure, the vector described in the present disclosure, or the host cell described in the present disclosure, and a pharmaceutically acceptable excipient or carrier.

[0095] As used herein, the term “pharmaceutical composition” means a mixture of the elements disclosed herein with other chemical components (such as carriers or excipients) that are compatible with pharmaceutical administration. The pharmaceutical composition facilitates the administration of the disclosed elements (such as the antibody, activable antibody disclosed herein) to the subject in need. Various administration methods are known in the art, including but not limited to subcutaneous, intramuscular, oral, transdermal, parenteral, intravenous, intraperitoneal, intrathecal, transpulmonary, transnasal, ocular, systemic, and topical administration.

[0096] The pharmaceutical composition disclosed herein may be configured in a dosage form suitable for administration to a subject by the desired route of administration. Said dosage forms include, but are not limited to, tablets, capsules, caplet, pills, soft gel, troche, powders, syrups, elixir, suspensions, solutions, emulsions, transdermal patches, suppositories, inhalations, creams, pastes, lotions, ointment, sprays, lyophilized preparation, injectables, and gels.

[0097] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable carrier or excipient” refers to the carrier or excipient compatible with the other ingredients of the composition and not substantially deleterious to the recipient thereof and / or that such carrier or excipient is approved or approvable for inclusion in a pharmaceutical composition for parenteral administration to subject. The term includes all pharmaceutically acceptable materials, solvents, carriers, excipients, stabilizers, diluents, dispersants, suspending agents, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, thickeners and / or excipients. Examples of such carriers or excipients include, but are not limited to, water, saline, ringer's solutions, dextrose solution, and 5%human serum albumin, liposomes and non-aqueous vehicles such as fixed oils.

[0098] Method and use

[0099] The present disclosure also provides a method of treating tumor, preventing tumor occurrence, preventing tumor metastasis, activating T cell, or inducing cytotoxicity of tumor cells in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody or antigen binding fragment thereof described in the present disclosure, the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof described in the present disclosure, the antibody conjugate described in the present disclosure, or the pharmaceutical composition described in the present disclosure.

[0100] The present disclosure also provides the use of the antibody or antigen binding fragment thereof described in the present disclosure, the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof described in the present disclosure, the antibody conjugate described in the present disclosure, or the pharmaceutical composition described in the present disclosure in the preparation of a medicament for treating tumor, preventing tumor occurrence, preventing tumor metastasis, activating T cell, or inducing cytotoxicity of tumor cells in a subject in need thereof.

[0101] In some embodiments, tumor is selected from solid tumors or hematologic tumors, such as liposarcoma, neuroblastoma, melanoma, synovial sarcoma, esophageal cancer, gastric cancer, hepatocellular cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, fallopian tube cancer, prostate cancer, bladder cancer, colon cancer, rectal cancer, astrocytoma, glioblastoma multiforme, anaplastic astrocytoma, brain tumor, peritoneal cavity carcinoma, soft tissue sarcoma, sarcoma, rhabdomyosarcoma, advanced myxoid disease, myelodysplastic syndrome, leukemia, acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's disease, myeloma, multiple myeloma.

[0102] In some embodiments, the subject is a mammal, such as mouse, monkey, or human.

[0103] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof, the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof, the antibody conjugate, or the pharmaceutical composition is administered through subcutaneous route, intravenous route, oral route, intragastric route, intramuscular route, intraperitoneal route, intrathecal route, transnasal route, transpulmonary route, transdermal, parenteral, intracranial route, ocular route, topical route, intratumoral route, and intracavity route.

[0104] As used herein, the term “treat” , “treatment” , or “treating” refers to the alleviation or amelioration of a disease or disorder (i.e., slowing or stopping the progression of a disease or at least one clinical symptom) ; or the alleviation or amelioration of at least one physical parameter or biomarker associated with the disease or disorder.

[0105] As used herein, the term “prevent” or “preventing” includes providing prophylaxis with respect to the occurrence or recurrence of a disease in an individual that may be predisposed to the disease but has not yet been diagnosed with the disease.

[0106] As used herein, the term “disease” refers to any alteration in the state of the body or some organs that interrupts or interferes with the performance of a function and / or causes symptoms (e.g., discomfort, dysfunction, distress, or even death) in the subject who is ill or in contact with the patient.

[0107] As used herein, the term “therapeutically effective amount” indicates that when comparing to a subject without receiving any treatment, the subject administered with such amount of the therapeutics shows a beneficial effect or therapeutic effect towards a disease, but the amount is sufficiently low in the range of sound medical judgment to avoid serious side effects. The therapeutically effective amount of the antibody, multi-specific antibody and others disclosed herein will vary at least based on the following factors, the route of administration; the severity of the disease being treated; the age, height, weight and physical condition of the patient; the medical history of the patient; the duration of the treatment; the desired therapeutic effect. However, the therapeutically effective amount can still be determined in a conventional manner by those skilled in the art.

[0108] EXAMPLES

[0109] The following examples, both actual and prophetic, are provided in conjunction with the accompanying drawings for the purpose of illustrating specific embodiments or features of the present invention and are not intended to limit its scope.

[0110] The skilled in the art should recognize that various alterations and modifications can be made to the embodiments described herein without departing from the spirit and scope of the present disclosure. Description of well-known functions, structures and the like in the art are omitted from the following description for conciseness.

[0111] The experimental methods in the following embodiments, if not otherwise specified, are conventional methods, performed in accordance with the techniques or conditions described in the literature in the field or in accordance with the product protocols. The materials, reagents, and the like used in the following embodiments are commercially available, if not otherwise specified.

[0112] Example 1. Humanization of the mAb

[0113] Humanization of murine monoclonal antibodies (mAbs) was carried out by a complementarity-determining region (CDR) grafting approach, which has been reported in many previous studies (Proc. Nal. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989) ) . Briefly, the framework regions (FRs) of the parental (murine) antibody variable heavy (VH) and light (VL) chains were replaced with corresponding human germline V and J gene segments. The human germline genes were selected based on sequence homology between the parental antibody and available human V and J genes. The VH and VL amino acid sequences of the antibody were separately analyzed by IgBlast or IMGT / DomainGapAlign against the entire human antibody germline V gene repertoire. Human IGVH and IGVK genes with the highest homology to the parental mAb were selected as templates for humanization. The CDRs of each murine antibody were then grafted into the selected human germline templates. Key framework residues, including vernier zone residues that support CDR conformation and interchain packing residues located at the VH-VL interface, were back-mutated to their parental murine counterparts. The amino acid sequences of the humanized variable regions were converted into nucleotide sequences based on human codon usage preferences. Appropriate restriction sites and external amplification primer sequences were added to the 5’ -and 3’-ends of the designed nucleotide sequences. The complete DNA sequences were commercially synthesized (GeneWiz) and subcloned into modified pCDNA3.4 vectors containing human IgG1 or kappa constant regions, generating pCDNA3.4-hIgG1 and pCDNA3.4-hKappa expression vectors respectively. The resulting constructs were sequenced to confirm identity.

[0114] Certain motifs in the antibody CDR regions can be prone to chemical instabilities such as deamidation and isomerization. These unstable motifs may potentially impair the antibody structure and function. To mitigate this risk, site-directed mutagenesis was utilized to eliminate potential unstable motifs in the CDR regions, aiming to enhance the stability and optimize the antibody candidates.

[0115] Therefore, humanized and optimized antibody expression plasmids were generated, consisting of a humanized VH region connected to human IgG1 constant regions and a humanized VL region connected to human Ig kappa constant regions.

[0116] The antibody purification was performed on a protein purification system (Cytiva, AKTA Avant 25) , using MabSelect PrismA Preloaded Column (Cytiva) . Cell culture was clarified by centrifugation and filtration. Then the supernatant was loaded to the PrismA column through AKTA system. The columns were washed with neutral pH buffer (PBS) , then eluted with low pH buffer (50mM NaAc, pH 3.5) . Eluted polypeptides were then titrated to neutral pH by addition of high pH buffer (1M Arg, pH 9, 0) . Protein concentration was quantified by UV-Vis absorbance measurement at 280 nm.

[0117] Example 2. Generation of Humanized Anti-DSG2 Antibodies

[0118] DSG2 (Desmoglein 2) is a member of the desmogleins (DSGs) family of the cadherin family. It is an important part of the tight junction of cells (desmosomes) , and plays an important role in cell-to-cell adhesion and information transmission. DSG2 protein structure mainly includes four extracellular cadherin repeat regions (EC1-4) , transmembrane region TM, intracellular cadherin fragment ICD, proline-rich linker sequence LD, repeat unit region RUD and terminal glycine-rich region TD (1-2) . DSG2 expression changes in a variety of tumors. In esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) , DSG2 expression is increased relative to the normal adjacent tissues. In addition, through its phosphorylation, DSG2 can promote ESCC cell migration and invasion.

[0119] For generation of anti-DSG2 antibodies, BALB / c mice were immunized with recombinant DSG-2 protein (KactusBio, Cat#DSG-HM102) for four rounds over a course of 42 days. In the first immunization, 40ug recombinant antigen was mixed with equal volume of Freund's adjuvant. Then the mixture was administered by intraperitoneal or subcutaneous injection to multiple sites of the mice. Booster immunizations (20 μg) were given on Days 14, 28 and 42 in a similar fashion. Mice serum was collected and tested for DSG-2 binding by ELISA. Four days after the final immunization, mice were euthanized. Spleen and lymph nodes were isolated and dissociated into single cell suspension. Then B cells were enriched with mouse pan-B cell isolation kit (Stemcell, Cat#19844) following the manufacture’s instruction. The isolated B cells were resuspended in PBS and stained with the following antibodies: anti-mouse IgM, anti-mouse IgD, anti-mouse IgG1, anti-mouse B220 (all purchased from BD Bioscience) . Antigen DSG-2 labeled with FITC was added into cells. Cells were incubated in the dark for 30 minutes at 4℃ and then washed twice with PBS. Then cells were resuspended with PBS and subjected for FACS sorting. FACS sorting was carried out on a Sony FACS sorter MA900. Single cells were identified using FSC-Aversus SSC-Aand FSC-W versus FSC-A. B220+IgG+IgM-IgD-B cells were identified and gated. Finally, a gate was drawn around DSG-2-FITC positive population. The DSG-2-positive B cells were sorted in a single-cell mode into 96-well PCR plates containing reverse transcription mixture. DNA sequences encoding antibodies were determined by PCR and Sanger’s sequencing (Sanger, 1977) .

[0120] The humanization and production process of the anti-DSG2 antibody 10F7 was similar to that described in Example 1. The final humanized anti-DSG2 VH, VLand CDR sequences are listed in Table 1 and Table 2.

[0121] Table 1. Amino Acid Sequences of VH and VL for Humanized Antibodies

[0122] Table 2. Amino Acid Sequences of CDRs for Humanized Antibodies

[0123] Example 3. FACS Analysis of Humanized Anti-DSG2 Antibodies

[0124] DSG2-positive A549 (ATCC, high expression of DSG-2) or AGS cells (ATCC, low expression of DSG-2) were stained with humanized anti-DSG2 mAbs hu10F7, followed by staining with a secondary antibody (Jackson, 109-605-098, 1: 1000) . DSG2 binding was determined by flow cytometry with Thermo Attune NxT. As shown in Figure 1, hu10F7 exhibited stronger binding to DSG2 on A549 or AGS cells as compared to benchmark mAbs (6D8, Hybridoma (2005) 27 (4) : 249-58; 3D4, US Patent 10836823B2) and human IgG (isotype control) .

[0125] Example 4. Anti-DSG2 Antibodies Could Induce Potent Target Internalization

[0126] Target cells, A549 or AGS cells were incubated with 3 μg / ml indicated antibodies hu10F7, placed on ice for 45 min, washed with PBS (containing 2%FBS) to remove unbound antibodies, then half of treated cells were placed at 37 ℃ for different durations (15min, 30min, 1h, 2h, 3h, 4h and 6 h) , and the rest half of cells were placed at 4℃ for the same durations (15 mins-6h) as negative controls for internalization. Finally, a secondary antibody (Goat Anti-Human IgG (H+L) AF647, (Jackson; Cat. No: 109-606-003) was added. The internalization efficiency (%) was determined by flow cytometry as follows:

[0127] Antibody endocytosis efficiency (%) = 100 %x (1 -Mean fluorescence intensity (at 37℃)  / Mean fluorescence intensity value (at 4℃) .

[0128] As shown in Figure 2, hu10F7, along with benchmark mAbs 6D8 and 3D4, could induce potent DSG2 internalization, both in A549 and AGS cells.

[0129] Example 5. Construct of DSG2-targeting Bispecific Antibodies

[0130] To enable effective engagement between γδ T cells and DSG2-expressing tumor cells, three molecular formats of bispecific antibodies, named V1, V2, and V3, were designed.

[0131] First, a bispecific antibody was generated from a conventional IgG by principally structuring. This bispecific antibody contains two antigen binding sites, with one binding site targeting the tumor-associated antigen (TAA) and the other binding site targeting the γδ T cell receptor (γδ TCR) . The design of this bispecific antibody follows a "1+1" (V1) pattern as shown in Figure 3A. Briefly, one arm is composed of anti-γδ TCR Fab, the other arm is composed of anti-TAA Fab, and the two arms are linked to Fc via hinge region. In addition, "2+2" (V2) and F3 (V3) molecular constructs were also designed and generated as shown in Figure 3B and 3C. In "2+2" (V2) construct, two single chain variable fragments (scFvs) targeting the TAA were fused to the C-terminus of the heavy chain or light chain of a conventional IgG targeting the γδ TCR. In Format 3 (V3) construct, scFvs targeting the γδ TCR were fused to the C-terminus of the light chain of a conventional IgG targeting TAA. The Fc fragment, hinge region, linker to construct scFv, linker to link the scFv to the conventional IgG are well known in the art.

[0132] The formats mentioned above were merely used to test the feasibility of combining the γδT cell engager using the selected anti-γδTCR antibodies and anti-TAA antibodies. Other bispecific antibody formats are also applicable for the skilled person in the art. Further, the conformational allocation of the anti-γδ TCR antibody or the binding moiety thereof and anti-TAA antibody or the binding moiety thereof in the bispecific antibody formats can be exchanged.

[0133] In this example, bispecific antibodies named “3G2x10F7-V1” , “3G2x10F7-V2” , and “3G2x10F7-V3” were generated, targeting both DSG2 and γδ TCR. For example, 3G2x10F7-V1 represents that anti-γδTCR hu3G2 antibody or antigen binding fragment thereof, and anti-DSG2 hu10F7 antibody or antigen binding fragment thereof are formed in the V1 format. Reference bispecific antibody, “Vg9 B2 scFv×10F7-V1” (Vg9 B2 scFv: J&J anti-TCRγ9 reference antibody) , was also generated. The recombinant bispecific antibodies were expressed for 7 days in ExpiCHO, then purified with Protein A affinity purification and ion exchange chromatography to obtain high purity.

[0134] 3G2x10F7-V1, 3G2x10F7-V2, and 3G2x10F7-V3 each comprises the anti-γδTCR hu3G2 antibody or antigen binding fragment thereof, and the anti-DSG2 hu10F7 antibody or antigen binding fragment thereof.

[0135] The sequences of hu3G2 antibody or antigen binding fragment thereof are shown in Table 3 and Table 4.

[0136] Table 3. Amino Acid Sequences of VH and VL for hu3G2

[0137] Table 4. Amino Acid Sequences of CDRs for hu3G2

[0138] Vg9 B2 scFv×10F7-V1 comprises the Vg9 B2 scFv (J&J anti-TCRγ9 reference antibody B420) , and the hu10F7 antibody or antigen binding fragment thereof comprising a VH as set forth in SEQ ID NO: 38, and a VL as set forth in SEQ ID NO: 39, in the V1 format.

[0139] Example 6. γδ T Cell Engagers Induce γδ T cells to Exhibit Potent Cytotoxicity Against DSG2-Positive Target Cells

[0140] To determine the ability of γδ T cell engagers to induce γδ T cells to kill DSG2-positive target cells, Nanoluc-stably transfected human target cells, A549 (lung cancer) , OE-19 (esophageal adenocarcinoma) or MKN-74 (gastric tubular adenocarcinoma) were mixed with in vitro expanded γ9δ2 T cells at an E: T ratio of 5: 1 in the presence of indicated BsAb of Example 5 and hIgG1-LALA for 24h (all the cell lines were from ATCC) .

[0141] The construction of the Nanoluc-stably transfected human target cells was according to manufacturer’s instruction of  system (Promega) .

[0142] Luciferase activity in the supernatant after co-culture was determined by a  Luciferase Assay kit (Promega, N1110) and a Perkin Elmer Envision plate reader. The cytotoxicity is calculated as follows:

[0143] %Cytotoxicity=RLU (sample) -RLU (tumor cell only)  / RLU (100%lysis with Triton-100) -RLU(tumor cell only)

[0144] As shown in Figure 4, all DSG2-specific γδ T cell engagers show potent killing activity against target cells, especially BsAbs in “V2” formats, which were 10-fold more potent than BsAbs in “V1” format.

[0145] Example 7. In Vivo Activity of γδ T cell engagers in OE19 xenograft model

[0146] We next confirmed the in vivo function of drug candidates (BsAb 3G2 x 10F7 with different formats) in an OE19 xenograft model. Female B-NDG-mice (6-8 weeks old) were obtained from Biocytogen and acclimated in house for 3 days before the study under specific pathogen free conditions in accredited animal facilities. All mice received a single subcutaneous (s. c. ) injection of 2x106 OE19 cells (ATCC) , mixed with 50%Matrigel (Absin) in the right flank on Day 0 (the day of tumor inoculation was defined as Day0) . On Day 0, mice were randomized into eight groups (5 or 6 mice per group) according to the bodyweight. Treatment groups were shown as below: G0 HL-60 tumor only, G1 hIgG1 (Fc-silent) control, G2: 3G2 x 10F7-V1, G3: 3G2 x 10F7-V2 , G4: 3G2 x 10F7-V3, G5: Vg9 B2 scFv x 10F7-V1 (J&J, also referred as B420 x 10F7-V1) ) . Treatment was started on Day 0. Mice in Group 1 to Group 6 separately received a subcutaneous injection of previously expanded γ9δ2 T cells (2 million  / mouse) and an IL-2 variant (IL-2Rα-non-binder, 10 μg  / mouse, Demaria et al., 2022, Cell Reports Medicine 3, 100783) , for selectively stimulating effector T cells on Day 0, Days 3, 6, 9, and 12. While equimolar drugs (0.9-1.7 mpk) were injected intravenously with the same frequency as γ9δ2 T cells. Tumor volume and body weight were recorded 2-3 times per week. Tumor volume (TV) was calculated according to the formula: TV (mm3) = L*W2 / 2, where L is the length of the tumor and W is the width of the tumor.

[0147] In vivo data demonstrates that drug candidates have shown great antitumor efficacy. As shown in Figures 5A-B, all drug candidates have good anti-tumor activity comparing to hIgG1 (Fc-silent) control. BsAb candidates in the Group 2-Group 4 show better efficacy than the benchmarks in Group 5 (Vg9 B2 scFv x 10F7-V1 (J&J) ) . All mice were well-tolerated upon drug treatment as suggested by negative impact on bodyweight change (Figure 5C) .

Claims

1.An antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds Desmoglein 2 (DSG2) , comprising:a HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions;a HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions;a HCDR3 comprising the amino acid sequence set forth as KAY with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions;a LCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions;a LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions; anda LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions.2.An antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds DSG2, comprising a VH and / or a VL, wherein the VH comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 38, and / or the VL comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 39.3.An antibody or antigen binding fragment thereof that specifically binds DSG2, comprising the following CDRs with 0, 1, 2, or 3 conservative substitutions for each CDR sequence: three CDRs of a VH as set forth in SEQ ID NO: 38, and three CDRs of a VL as set forth in SEQ ID NO: 39.4.A multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof comprises a first antibody or antigen binding fragment thereof (AB1) targeting DSG2, and at least a second antibody or antigen binding fragment thereof (AB2) that specifically binds a second target, preferably the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof is bispecific.5.The multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof of claim 4, wherein the AB1 is linked to the AB2 in the form of V1, V2 or V3.6.The multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 4-5, wherein the AB1 comprises any one of the antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-3.7.An antibody conjugate, comprising the antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-3, or the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 4-6.8.The antibody conjugate of claim 7, further comprising a drug moiety linked to the antibody or antigen binding fragment thereof or the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof directly or through a linker, wherein the linker is selected from cleavable, and non-cleavable linkers.9.An isolated nucleic acid encoding the antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-3, or the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 4-6.10.A vector comprising the isolated nucleic acid of claim 9.11.A host cell comprising the isolated nucleic acid of claim 9, or the vector of claim 10.12.A pharmaceutical composition, comprising the antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-3, the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 4-6, the antibody conjugate of claim 7 or 8, the isolated nucleic acid of claim 9, the vector of claim 10, or the host cell of claim 11, and a pharmaceutically acceptable excipient or carrier.13.A method of treating tumor, preventing tumor occurrence, preventing tumor metastasis, activating T cell, or inducing cytotoxicity of tumor cells in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-3, the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 4-6, the antibody conjugate of claim 7 or 8, or the pharmaceutical composition of claim 12.14.The method of claim 13, wherein the tumor is selected from solid tumors or hematologic tumors, such as liposarcoma, neuroblastoma, melanoma, synovial sarcoma, esophageal cancer, gastric cancer, hepatocellular cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, fallopian tube cancer, prostate cancer, bladder cancer, colon cancer, rectal cancer, astrocytoma, glioblastoma multiforme, anaplastic astrocytoma, brain tumor, peritoneal cavity carcinoma, soft tissue sarcoma, sarcoma, rhabdomyosarcoma, advanced myxoid disease, myelodysplastic syndrome, leukemia, acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's disease, myeloma, multiple myeloma.15.The method of claim 13, wherein the subject is a mammal, such as mouse, monkey, or human.16.The method of claim 13, wherein the antibody or antigen binding fragment thereof, the multi-specific antibody or antigen binding fragment thereof, the antibody conjugate, or the pharmaceutical composition is administered through subcutaneous route, intravenous route, oral route, intragastric route, intramuscular route, intraperitoneal route, intrathecal route, transnasal route, transpulmonary route, transdermal, parenteral, intracranial route, ocular route, topical route, intratumoral route, and intracavity route.

Images