Multispecific fusion proteins targeting angiogenic factors

Abstract

A fusion protein comprises two VEGF-binding units, a least one of which comprises at least an extracellular domain of at least a VEGF receptor. The other VEGF-binding unit can comprise a VEGF-C antibody or at least a different extracellular domain of at least a VEGF receptor. The fusion protein can further comprise an Ang-2-binding unit. The fusion protein is useful in treating or controlling an ocular or systemic disease, condition, or disorder that has etiology in at least one of aberrant angiogenesis, increased vascular leakage, and inflammation.

Description

MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS TARGETING ANGIOGENIC FACTORSBACKGROUND OF THE INVENTION

[0001] The present invention relates to multispecific fusion proteins targeting angiogenic factors. In particular, the present invention relates to multispecific fusion proteins targeting certain members of the family of vascular endothelial growth factors ( “VEGF” ) and, in certain embodiments, also angiopoietin-2 ( “Ang-2” ) . More particular, the present invention relates to multispecific fusion proteins targeting at least VEGF-A and VEGF-C, and, in certain embodiments, also Ang-2. The present invention also relates to such fusion proteins, their uses, and processes for production.

[0002] The major cellular components of the mammalian vascular system are the endothelium, smooth muscle cells, and pericytes. Endothelial cells form the lining of the inner surface of all blood vessels in the mammal and constitute a non-thrombogenic interface between blood and tissue. Therefore, the proliferation of endothelial cells is an important component for the development of new capillaries and blood vessels which, in turn, is a necessary process for the growth and / or regeneration of mammalian tissues.

[0003] In recent decades, a variety of signaling molecules have been identified as playing important roles in angiogenesis and increased vascular permeability (vascular leakage) . These signaling molecules include members of the VEGF family ( “VEGF family members” ) , angiopoietins, ephrin, Delta-like 4 ligand, and certain members of the interleukin family (such as IL-3, IL-6, IL-8, and IL-17) . VEGF family members of secreted polypeptides have been shown to play an extremely important role in promoting endothelial cell proliferation and angiogenesis. A pathological feature of uncontrolled angiogenesis caused by VEGF over-expression is increased vascular permeability, which results in fluid leakage into, and swelling of, the surrounding tissues. In mammals, this family consists of five related growth factors having highly conserved receptor-binding structure: vascular endothelial growth factors A-D ( “VEGF-A, ” “VEGF-B, ” “VEGF-C, ” and “VEGF-D” ) and placental growth factor ( “PlGF” ) . In this disclosure, this family of growth factors is also referred to as the VEGF family.

[0004] The angiopoietin / Tie ligand / receptor system has a key regulatory role in regulating vascular integrity and quiescence and consists of three ligands (Ang-1, Ang-2, and Ang-4) and two receptors (Tie-1 and Tie-2) . Besides its role in angiogenesis, it is an important regulator in numerous diseases including inflammation. Ang-1 and Ang-2 are important members of the angiopoietin family. Ang-2 is primarily expressed by endothelial cells. Tie-2 is found on endothelial cells, haematopoietic stem cells, and tumor cells. Ang-1-mediated Tie-2 activation is required to maintain the quiescent resting state of the endothelium. Agonistic Ang-1 functions are antagonized by Ang-2, which is believed to inhibit Ang-1 / Tie-2 signaling. Ang-2 destabilizes the quiescent endothelium and primes it to respond to exogenous stimuli, thereby facilitating the activities of inflammatory and angiogenic cytokines. It has been shown that Ang-2 promotes the proangiogenic action of VEGF and that VEGF up-regulates Ang-2 expression in endothelial cells. The Ang-2 / Tie-2 system has been demonstrated to regulate tumor vessel plasticity, allowing vessels to respond to VEGF and FGF2 (fibroblast growth factor 2) , which is also an angiogenic factor and inflammation enhancer.

[0005] The VEGF-family growth factors act through a family of cognate receptor tyrosine kinases, which exist only on the surface of vascular endothelial cells, to stimulate formation of blood vessels: VEGF receptor-1 ( “VEGFR-1, ” also known as “flt-1” ) , VEGF receptor-2 ( “VEGFR-2, ” also known as “KDR” in humans and “flk-1” in mice) , VEGF receptor-3 ( “VEGFR-3, ” also known as “flt-4” ) .

[0006] VEGF-A (also sometimes simply referred to as VEGF) has emerged as the most important member of this family of growth factors. Human VEGF-A is expressed in a variety of tissues as multiple homodimeric forms (121, 145, 165, 183, 189 and 206 amino acids per monomer ( “VEGF-A isoforms” ) ) , wherein each form arises as a result of alternative splicing of a single RNA transcript.

[0007] VEGF-A acts through VEGFR-1 and VEGFR-2 on endothelial cells. In contrast to VEGF-A, VEGF-B and PlGF are only able to interact with VEGFR-1. Almost all the important functions of VEGF-A are mediated via the signal transduction of VEGFR-2; and accordingly, VEGF-B and PlGF are only weakly angiogenic. VEGF-C  and VEGF-D can both interact with VEGFR-2 and VEGFR-3. Their main function is the stimulation of the growth of lymphatic vessels (lymphangiogenesis) .

[0008] Since VEGFs promote vascular endothelial cell proliferation and angiogenesis, they may be useful for the therapeutic treatment of numerous conditions in which a growth-promoting activity on the vascular endothelial cells is beneficially important; for example, in treatment of ulcers, vascular injuries, and myocardial infarction.

[0009] In contrast, however, while vascular endothelial proliferation is desirable under certain circumstances, vascular endothelial proliferation and angiogenesis are also undesirable components of a variety of diseases and disorders including tumor growth and metastasis, rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, diabetic retinopathy, retrolental fibroplasia, neovascular glaucoma, neovascular age-related macular degeneration, hemangiomas, immune rejection of transplanted corneal tissue and other tissues, and chronic inflammation. In individuals suffering from any of these disorders, one would want to inhibit, or at least substantially reduce, the endothelial proliferating activity of the aforementioned angiogenic factors.

[0010] Each of flt-1, KDR, and flt-4 tyrosine kinase receptors has seven extracellular immunoglobulin-like ( “Ig-like” ) domains that are available for ligand binding, a transmembrane domain that serves to anchor the receptor on the surface of cells in which it is expressed, and an intracellular catalytic tyrosine kinase domain. Flt-1 binds VEGF-A, VEGF-B, and PlGF. KDR binds VEGF-A, VEGF-C, and VEGF-D. Flt-4 binds VEGF-C and VEGF-D.

[0011] In view of the role of the growth factors of the VEGF family in vascular endothelial proliferation and angiogenesis, and the role that these processes play in many different diseases and disorders, treatments have been devised that target the control of these growth factors. However, anti-VEGF therapy targeting mainly one or limited number of VEGF family members has not been able to block completely the progression of angiogenic diseases. For example, in patients with neovascular age-related macular degeneration, intravitreal injection of VEGF inhibitors including bevacizumab, a monoclonal antibody against VEGF-A, and aflibercept, a humanized Fc fusion protein for  trapping VEGF-A, VEGF-B, and PlGF, significantly reduced the aqueous levels of VEGF-A but also increased levels of VEGF-C and Ang-2, thus leading to sub-optimal clinical outcomes. A similar phenomenon was also observed in tumor treatments with bevacizumab and aflibercept. There is evidence that tumor resistance to bevacizumab and aflibercept therapies coincided with increased levels of VEGF-C, an important lymphangiogenic growth factor for tumor metastasis.

[0012] Therefore, it is desirable to have a pharmacological means for more completely reducing or inhibiting multispecific biological activities of these angiogenic factors in patients whose pathological conditions are rooted in aberrant angiogenesis. It is also desirable to have a pharmacological means for improved treatment or control of pathological conditions that are rooted in aberrant angiogenesis.SUMMARY OF THE INVENTION

[0013] As used herein, the term “control” also includes reduction, alleviation, amelioration, or prevention.

[0014] In general, the present invention provides multispecific fusion or chimeric proteins, methods of producing and compositions comprising the same, and methods for treating or controlling at least a pathological condition in a subject, which condition has etiology in at least one of aberrant angiogenesis, increased vascular permeability (vascular leakage) , and inflammation. In this disclosure, a “fusion protein” may be referred to as a “chimeric protein” for its inclusion of components from different origins.

[0015] In one aspect, a multispecific fusion protein or an antigen-binding fragment or domain thereof of the present invention comprises a first VEGF-binding unit and a second VEGF-binding unit; wherein the first VEGF-binding unit comprises at least an Ig-like domain of one or more VEGF receptors, and the second VEGF-binding unit comprises: (1) at least another Ig-like domain of one or more VEGF receptors, which is different from said at least an Ig-like domain included in the first VEGF-binding unit, or (2) a VEGF-C antibody; and wherein when each of the first and second VEGF-binding units comprises an Ig-like domain of a VEGF receptor, the multispecific fusion protein further comprises an Ang-2-binding unit.

[0016] In another aspect, a multispecific fusion protein or an antigen-binding fragment or domain thereof of the present invention comprises a first VEGF-binding unit and a second VEGF-binding unit; wherein the first VEGF-binding unit comprises at least an Ig-like domain of one or more VEGF receptors, and the second VEGF-binding unit comprises: (1) at least another Ig-like domain of one or more VEGF receptors of one or more VEGF receptors, which is different from said at least an Ig-like domain included in the first VEGF-binding unit, or (2) a VEGF-C antibody; wherein when each of the first and second VEGF-binding units comprises an Ig-like domain of a VEGF receptor, the multispecific fusion protein further comprises an Ang-2-binding unit; and wherein the first VEGF-binding unit, the second VEGF-binding unit, and the Ang-2-binding unit, when present, are linked together.

[0017] In another aspect, a multispecific fusion protein or an antigen-binding fragment or domain thereof of the present invention comprises a first VEGF-binding unit and a second VEGF-binding unit; wherein the first VEGF-binding unit comprises at least an Ig-like domain of one or more VEGF receptors, and the second VEGF-binding unit comprises at least another Ig-like domain of one or more VEGF receptors, which is different from said at least an Ig-like domain included in the first VEGF-binding unit, or a VEGF-C antibody; wherein (1) when each of the first and second VEGF-binding units comprises an Ig-like domain of a VEGF receptor, the multispecific fusion protein further comprises an Ang-2-binding unit, or (2) when the second VEGF-binding unit comprises a VEGF-C antibody, the multispecific fusion protein (a) does not comprise, or is devoid of, an Ang-2 -binding unit, or (b) further comprises an Ang-2-binding unit; and wherein the first VEGF-binding unit, the second VEGF-binding unit, and the Ang-2-binding unit, when present, are linked together.

[0018] In still another aspect, an Ig-like domain of a VEGF receptor included in a multispecific fusion protein of the present invention comprises a portion of the extracellular ligand-biding domain ( “ECD” ) of the VEGF receptor.

[0019] A VEGF-binding unit is a polypeptide or protein that is capable of binding, or substantially binding, to one or more VEGF family members. An Ang-2-binding unit is a polypeptide or protein that is capable of binding, or substantially binding, to Ang-2.

[0020] In one aspect, the present invention provides multispecific fusion or chimeric proteins, or antigen-binding fragments or antigen-binding domains thereof that are capable of binding substantially to at least two VEGF family members; thereby, reducing or inhibiting signaling transduction by said VEGF family members. In another aspect, one of said VEGF family members comprises VEGF-C.

[0021] In another aspect, the present invention provides multispecific fusion or chimeric proteins, or antigen-binding fragments or antigen-binding domains thereof that are capable of binding substantially to VEGF-A, VEGF-B, PlGF, and VEGF-C; thereby, reducing or inhibiting VEGF family member signaling transduction. The term “VEGF-A, ” as used herein, includes all VEGF-A isoforms.

[0022] In still another aspect, when the multispecific fusion protein comprises an Ang-2-binding unit, the multispecific fusion protein, or an antigen-binding fragment or antigen-binding domain thereof is capable of binding, or binding substantially, to VEGF-A, VEGF-B, PlGF, VEGF-C, and Ang-2; thereby, reducing or inhibiting VEGF family member and Ang-2 signaling transduction.

[0023] In yet another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises (1) VEGF-binding units linked together; or (2) VEGF-binding units and Ang-2-binding units that are linked together. Such binding units comprise, consist of, or consist essentially of antigen-binding domains or moieties that target (1) at least two VEGF family members; or (2) at least two VEGF family members and Ang-2. In yet another aspect, one of said at least two VEGF family members comprises VEGF-C.

[0024] In still another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises two VEGF-binding units linked together, and an Ang-2-binding unit linked to one of the VEGF-binding units.

[0025] The present invention also provides an antigen-binding fragment or domain of such fusion proteins.

[0026] In another aspect, an Ang-2-binding unit comprises an antibody or a biologically active polypeptide that is capable of binding, or binding substantially, to  Ang-2. In the present disclosure, the term “antibody” encompasses, without limitation, full-length antibodies, single-chain FV antibodies (scFV) , Fab antibodies, Fab’ antibodies, (Fab’ ) 2 antibodies, single-domain antibodies (sdAbs, also known as nanobodies) , minibodies, maxibodies, diabodies, peptibodies, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multivalent antibodies, multispecific antibodies, antibody fragments so long as they exhibit the desired biological activity.

[0027] In yet another aspect, an Ang-2-binding unit comprises an sdAb or a biologically active polypeptide that is capable of binding, or binding substantially, to Ang-2.

[0028] In still another aspect, a multispecific fusion protein comprises: (1) a first VEGF-binding unit that comprises an Ig-like domain selected from the group consisting of Ig-like domains of VEGF receptors; and (2) a second VEGF-binding unit that comprises a VEGF-C antibody. In one aspect, the first VEGF-binding unit binds, or binds substantially, to at least a VEGF family member selected from the group consisting of VEGF-A, VEGF-B, and PlGF. In another aspect, the first VEGF-binding unit binds, or binds substantially, to VEGF-A, VEGF-B, and PlGF.

[0029] Thus, in one aspect, a fusion protein of the present invention may be viewed at least as a multispecific ligand-binding construct that can bind to at least two distinct ligands or types of ligands that are involved in an event selected from the group consisting of pathological angiogenesis, vascular leakage, and inflammation.

[0030] In one aspect, a multispecific fusion protein of the present invention comprises a first VEGF-binding unit and a second binding unit; wherein the first VEGF-binding unit comprises a plurality of Ig-like domains of one or more VEGF receptors; the second VEGF-binding unit comprises (1) a plurality of Ig-like domains of one or more VEGF receptors, which Ig-like domains are different from the Ig-like domains included in the first VEGF-binding unit, or (2) a VEGF-C antibody; with the proviso that (A) when each of the first and second VEGF-binding units comprises an Ig-like domain of a VEGF receptor, the multispecific fusion protein further comprises an Ang-2-binding unit, or (B) when the second VEGF-binding unit comprises a VEGF-C antibody, the multispecific fusion protein (a) does not comprise, or is devoid of, an Ang-2 -binding unit, or (b)  further comprises an Ang-2-binding unit. In some embodiments, the first VEGF-binding unit comprises a plurality of Ig-like domains of VEGF receptors 1 and 2 ( “VEGFR-1” and “VEGFR-2” ) , and the second VEGF-binding unit comprises a plurality of Ig-like domains of VEGF receptor 3 ( “VEGFR-3” ) or a VEGF-C antibody. In some other embodiments, said first VEGF-binding unit comprises Ig-like domain (extracellular domain) 2, or substantially Ig-like domain 2, of VEGFR-1 ( “VEGFR-1-D2” ) and Ig-like domain (extracellular domain) 3, or substantially Ig-like domain 3, of VEGFR-2 ( “VEGFR-2-D3” ) ; and said second VEGF-binding unit comprises (1) Ig-like domains (extracellular domains) 1 and 2, or substantially Ig-like domains 1 and 2, of VEGFR-3 ( “VEGFR-3-D1D2” ) , or (2) Ig-like domains (extracellular domains) 1, 2 and 3, or substantially Ig-like domains 1, 2, and 3 of VEGFR-3 ( “VEGFR-3-D1D2D3” ) , or (3) a VEGF-C antibody. In still some other embodiments, when the VEGF-binding units comprises Ig-like domains of VEGF receptors, the VEGF-binding units are linked to an Fc domain of IgG1, and the Ang-2-binding unit is linked to the Fc domain of IgG1.

[0031] In still another aspect, said VEGFR-1, VEGFR-2, and VEGFR-3 are human VEGFR-1, VEGFR-2, and VEGFR-3, and said Ang-2 is human Ang-2.

[0032] In still another aspect, the second VEGF-binding unit comprises a full-length VEGF-C antibody, or a VEGF-C-binding fragment or domain thereof.

[0033] In one aspect, the Ang-2-binding unit comprises an sdAb or a biologically active polypeptide directed against Ang-2.

[0034] In yet another aspect, an sdAb against Ang-2, or an antigen-binding fragment or domain thereof, comprises the heavy-chain variable region of a heavy-chain antibody against Ang-2. Such an sdAb can bind specifically to Ang-2 without requiring a complementary variable region as in a conventional four-chain immunoglobulin molecule.

[0035] In still another aspect, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding a fusion or chimeric protein of the present invention.

[0036] In still another aspect, the present invention provides a vector that comprises said nucleic acid molecule, including an expression vector comprising said nucleic  molecule operatively linked to an expression control sequence. As used herein, the phrase “operatively linked” refers to components of a construct being placed in a functional relationship with each other and each component retaining its function. A nucleic acid is “operatively linked” when it is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, DNA for a pre-sequence or secretory leader is “operatively linked” to DNA encoding a polypeptide if it is expressed as a pre-protein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operatively linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operatively linked to a coding sequence if it is positioned so as to facilitate translation.

[0037] In still another aspect, the present invention provides a host-vector system for the production of said antibody fusion or chimeric protein that comprises the expression vector in a suitable host cell.

[0038] In another aspect, the present invention provides a method of producing a fusion or chimeric protein, which method comprises: (a) growing cells of the host-vector system under conditions permitting production of the fusion or chimeric protein; and (b) recovering the fusion or chimeric protein so produced. Such method can further comprise purifying the fusion or chimeric protein.

[0039] In still another aspect, the present invention provides a method for treating or controlling, or a composition for use to treat or control, at least a disease, condition, or disorder, in a subject, which has etiology in a condition selected from the group consisting of aberrant angiogenesis, vascular leakage, inflammation, and combinations thereof.

[0040] In yet another aspect, the present invention provides a use of a multispecific fusion protein of the present invention for the preparation of a medicament for treating or controlling at least a disease, condition, or disorder, in a subject, which has etiology in a condition selected from the group consisting of aberrant angiogenesis, vascular leakage, inflammation, and combinations thereof.

[0041] In certain embodiments, such disease, condition, or disorder is an ocular disease, condition, or disorder. In certain other embodiments, such disease, condition, or disorder involves tumor growth and metastasis. In other embodiments, such disease, condition, or disorder is rheumatoid arthritis, psoriasis, or atherosclerosis.

[0042] Other features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description and claims.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0043] Figure 1 shows a schematic diagram of the first embodiment of the present invention.

[0044] Figure 2 shows a schematic diagram of the second embodiment of the present invention.

[0045] Figure 3 shows a schematic diagram of the third embodiment of the present invention.

[0046] Figure 4 shows a schematic diagram of the fourth embodiment of the present invention.

[0047] Figure 5 shows a schematic diagram of the fifth embodiment of the present invention.

[0048] Figure 6 shows a schematic diagram of the sixth embodiment of the present invention.

[0049] Figure 7 shows a schematic diagram of the seventh embodiment of the present invention.

[0050] Figure 8 shows a schematic diagram of the eighth embodiment of the present invention.

[0051] Figure 9 shows a schematic diagram of the nineth embodiment of the present invention.

[0052] Figure 10 shows a schematic diagram of the tenth embodiment of the present invention.

[0053] Figures 11A-11D show the purity of antibody fusion proteins of the third, fourth, seventh and eighth embodiments including EB-110BI-L7C1, EB-110BIb, EB-111BIb1 and EB-111BId1 as exhibited by chromatograms of SEC-HPLC.

[0054] Figures 12A-12C show ELISA binding affinity of some representative antibody fusion proteins of the present invention for human VEGF-A165, wherein aflibercept, a clinical stage of human Fc fusion protein, was used as a comparator.

[0055] Figure 13 shows ELISA binding affinity of some representative antibody fusion proteins of embodiments 1-3 for human VEGF-B167, wherein aflibercept, a clinical stage of human Fc fusion protein, was used as a comparator.

[0056] Figure 14 shows ELISA binding affinity of some representative antibody fusion proteins of embodiments 1-3 for human PlGF, wherein aflibercept, a clinical stage of human Fc fusion protein, was used as a comparator.

[0057] Figures 15A-15C show ELISA binding affinity of some representative antibody fusion proteins of the present invention for human VEGF-C, wherein aflibercept, a clinical stage of human Fc fusion protein, was used as a comparator (negative control) . rhVEGFR3, a recombinant human Fc fusion protein containing the extracellular domain (Met 1-Ile 776) of human VEGFR3, was used as a positive control.

[0058] Figures 16A-16C show ELISA binding affinity of some representative antibody fusion proteins of the present invention for human Ang-2, wherein faricimab (abispecific antibody against VEGF-A and Ang-2) and nesvacumab (a monoclonal antibody against Ang-2) were used as comparators.

[0059] Figures 17A-17B show ELISA binding affinity of some representative antibody fusion proteins of the present invention for human Ang-1, wherein faricimab (a  bispecific antibody against VEGF-A and Ang-2) and nesvacumab (a monoclonal antibody against Ang-2) , were used as comparators.

[0060] Figures 18A-18C show inhibition of VEGF-A165-mediated VEGFR-2 signaling by some representative antibody fusion proteins of the present invention, wherein aflibercept, a clinical stage of human Fc fusion protein, was used as a comparator.

[0061] Figures 19A-19D show inhibition of VEGFR-2 signaling mediated by human VEGF-A165 + VEGF-C by some representative antibody fusion proteins of the present invention, wherein aflibercept, a clinical stage of human Fc fusion protein, was used as a comparator.

[0062] Figures 20A-20C show inhibition of Ang-2 binding to Tie-2 receptor on engineered cells by some representative antibody fusion proteins of the present invention, wherein faricimab (a bispecific antibody against VEGF-A and Ang-2) and nesvacumab, (a monoclonal antibody against Ang-2) , were used as comparators. Aflibercept, a clinical stage of human Fc fusion protein for inhibition of VEGF-A, VEGF-B and PlGF, was used as a negative control.

[0063] Figures 21A and 21B show inhibition of Ang-1 binding to Tie-2 receptor on engineered cells by some representative antibody fusion proteins of the present invention, wherein faricimab and nesvacumab were used as comparators. Faricimab is a bispecific antibody that inhibits VEGF-A and Ang-2. Nesvacumab is a monoclonal antibody against Ang-2. hTie-2, a recombinant human Fc fusion protein containing the extracellular domain (Met1-Lys745) of human Tie-2 receptor, was used as a positive control. Aflibercept, a clinical stage of human Fc fusion protein for inhibition of VEGF-A, VEGF-B and PlGF, was used as a negative control.

[0064] Figure 22 shows inhibition of VEGF-A165 + VEGF-C mediated VEGFR-2 signaling by EB-110BI-L7C1 after formulated in a buffer solution for drug developability assessments at various conditions, wherein aflibercept, a clinical stage of human Fc fusion protein that was designed for inhibition of VEGF-A, VEGF-B, PlGF but not VEGF-C, was used as a comparator.

[0065] Figure 23 shows inhibition of Ang-2 binding to Tie-2 receptor on engineered cells by EB-110BI-L7C1 that was formulated in a buffer solution for drug developability assessments at various conditions, wherein faricimab (a bispecific antibody against VEGF-A and Ang-2) and nesvacumab (a monoclonal antibody against Ang-2) , were used as comparators.

[0066] Figures 24A-24D show fractionations of charge variants analyzed by imaged capillary isoelectric focusing (icIEF) of EB-111BIb1 (Figures 24A and 24B) and EB-111BId1 (Figures 24C and 24D) formulated in buffer solutions containing 40 mM NaCl, 0.08%Na2HPO4, 0.127%NaH2OP4, 5%sucrose, 0.03%Tween-20, with a final pH 7.5 and 6.2 respectively.

[0067] Figures 25A and 25B show inhibition of VEGF-A165 mediated VEGFR-2 signaling by EB-111BIb1 and EB-111BId1 formulated in two buffer solutions for drug developability assessments at various conditions, wherein aflibercept, a clinical stage of human Fc fusion protein that was designed for inhibition of VEGF-A, VEGF-B and PlGF, was used as a comparator.

[0068] Figures 26A and 26B show inhibition of VEGF-A165 + VEGF-C mediated VEGFR-2 signaling by EB-111BIb1 and EB-111BId1 formulated in two buffer solutions for drug developability assessments at various conditions, wherein aflibercept, a clinical stage of human Fc fusion protein that was designed for inhibition of VEGF-A, VEGF-B, PlGF but not VEGF-C, was used as a comparator.

[0069] Figures 27A and 27B show inhibition of Ang-2 binding to Tie-2 receptor on engineered cells by EB-111BIb1 and EB-111BId1 formulated in two buffer solutions for drug developability assessments at various conditions, wherein nesvacumab, a monoclonal antibody against Ang-2, were used as a comparator.

[0070] Figure 28 shows the effects of fusion antibody proteins including EB-111BId, EB-110BI-L7C1, EB-111BIb1 and EB-111BId1, on inhibition of neovascular leakage from pre-retinal neovascularization (PRN) induced by DL-α-aminoadipic acid (DL-AAA) in Dutch belted rabbits, wherein vehicle was used as a negative control, and aflibercept and faricimab were used as two clinical comparators.

[0071] Figure 29 shows the effects of two doses of monthly intravitreal injection of EB-110BI-L7C1 and EB-111BId1 on inhibition of neovascular leakage from laser-induced choroidal neovascularization (CNV) in monkeys, with aflibercept and faricimab as two clinical comparators. The clear fundus images at bottom row indicate that no noticeable intraocular inflammation was found by 8 weeks after two doses of monthly intravitreal injection of vehicle, aflibercept, faricimab, EB-110BI-L7C1, or EB-111BId1 in monkeys.

[0072] Figure 30 shows quantitative analysis of the averaged areas of subretinal hyperreflective material (SHRM) with time after intravitreal injections of vehicle, aflibercept, faricimab, EB-110BI-L7C1 and EB-111BId1 in laser-induced CNV in monkeys. Data were normalized to pre-dosing level in each group (%) for comparisons among 5 groups at each time point. The results indicate that treatment with aflibercept, faricimab, EB-110BI-L7C1 and EB-111BId1 significantly reduced SHRM development.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0073] The terms “protein, ” “polypeptide, ” and “peptide” are used interchangeably herein to refer to a polymer of amino acid residues.

[0074] In general, the present invention provides a multispecific fusion or chimeric protein or an antigen-binding fragment or domain thereof that is at least capable of binding, or binding substantially, to one or more VEGF family members; thereby, reducing or inhibiting VEGF family member signaling transduction. Furthermore, certain embodiments of the multispecific fusion or chimeric protein or an antigen-binding fragment or domain thereof are also capable of binding, or binding substantially, to Ang-2; thereby, also reducing or inhibiting Ang-2 signaling transduction.

[0075] In one aspect, the multispecific fusion or chimeric protein comprises an antibody fusion or chimeric protein.

[0076] In this disclosure, the term “fusion protein” may be used in place of “fusion or chimeric protein. ”

[0077] In one aspect, a multispecific fusion protein or an antigen-binding fragment or domain thereof of the present invention comprises a first VEGF-binding unit and a second VEGF-binding unit; wherein the first VEGF-binding unit comprises at least an Ig-like domain of one or more VEGF receptors; the second VEGF-binding unit comprises: (1) at least another Ig-like domain of one or more VEGF receptors, which is different from said at least an Ig-like domain included in the first VEGF-binding unit, or (2) a VEGF-C antibody; wherein when each of the first and second VEGF-binding units comprises an Ig-like domain of a VEGF receptor, the multispecific fusion protein further comprises an Ang-2-binding unit.

[0078] In another aspect, a multispecific fusion protein or an antigen-binding fragment or domain thereof of the present invention comprises a first VEGF-binding unit and a second VEGF-binding unit; wherein the first VEGF-binding unit comprises at least an Ig-like domain of one or more VEGF receptors; the second VEGF-binding unit comprises at least another Ig-like domain of one or more VEGF receptors, which is different from said at least an Ig-like domain included in the first VEGF-binding unit, or a VEGF-C antibody; wherein (1) when each of the first and second VEGF-binding units comprises an Ig-like domain of a VEGF receptor, the multispecific fusion protein further comprises an Ang-2-binding unit, or (2) when the second VEGF-binding unit comprises a VEGF-C antibody, the multispecific fusion protein (a) does not comprise, or is devoid of, an Ang-2-binding unit, or (b) further comprises an Ang-2-binding unit.

[0079] In still another aspect, a multispecific fusion protein or an antigen-binding fragment or domain thereof of the present invention comprises: (1) a first VEGF-binding unit comprising at least an Ig-like domain of one or more VEGF receptors; (2) a second VEGF-binding unit comprising at least another Ig-like domain of one or more VEGF receptors, which is different from said at least an Ig-like domain included in the first VEGF-binding unit; (3) an Fc domain of IgG1 ( “IgG1 Fc domain” ) ; and (4) an Ang-2-binding unit.

[0080] In still another aspect, the first and second VEGF-binding units, each comprising Ig-like domains of one or more VEGF receptors are linked together in series in any order; an N-terminus of the IgG1 Fc domain is linked to a free C-terminus of the first or second VEGF-binding unit; and an N-terminus of the Ang-2-binding unit is linked  to a C-terminus of the IgG1 Fc domain. A “free C-terminus” of a VEGF-binding unit means the C-terminus of said VEGF-binding unit that is not linked to the N-terminus of the other VEGF-binding unit.

[0081] In still another aspect, a linked chain comprising the first and second VEGF-binding units, each comprising Ig-like domains of one or more VEGF receptors, the IgG1 Fc domain, and the Ang-2-binding unit comprises a fusion polypeptide member, and a multispecific fusion protein of the present invention comprises two such fusion polypeptide members, linked together at the hinge portion of the IgG1 Fc domain.

[0082] In still another aspect, a multispecific fusion protein or an antigen-binding fragment or domain thereof of the present invention comprises two fusion polypeptide members, each of which comprises: (1) a first VEGF-binding unit comprising at least an Ig-like domain of one or more VEGF receptors; (2) a second VEGF-binding unit comprising at least another Ig-like domain of one or more VEGF receptors, which is different from said at least an Ig-like domain included in the first VEGF-binding unit; (3) an IgG1 Fc domain; and (4) an Ang-2-binding unit; wherein the first VEGF-binding unit, the second VEGF-binding unit, the IgG1 Fc domain, and the Ang-2-binding unit are linked together in one fusion polypeptide member; and the two fusion polypeptide members are linked together at a hinge region of the IgG1 Fc domain.

[0083] In still another aspect, the first and second VEGF-binding units of a fusion polypeptide member are linked together in series; an N-terminus of the IgG1 Fc domain is linked to a C-terminus of the first or second VEGF-binding unit; and an N-terminus of the Ang-2-binding unit is linked to a C-terminus of the IgG1 Fc domain.

[0084] In one aspect, a fusion protein or an antigen-binding fragment thereof is a multispecific fusion protein capable of binding, or substantially binding, to at least two VEGF family members; thereby, reducing or inhibiting signaling transduction of said at least two VEGF family members. In another aspect, one of said at least two VEGF family members comprises VEGF-C. In yet another aspect, said at least two VEGF family members comprise VEGF-C and at least one of VEGF-A, VEGF-B, and PlGF.

[0085] In another aspect, a fusion protein or an antigen-binding fragment thereof comprises a multispecific fusion protein capable of binding, or substantially binding, to at least two VEGF family members and Ang-2; thereby, reducing or inhibiting signaling transduction of said at least two VEGF family members and Ang-2. In another aspect, one of said at least two VEGF family members comprises VEGF-C. In still another aspect, said at least two VEGF family members comprise VEGF-A and VEGF-C. In yet another aspect, said at least two VEGF family members comprise VEGF-C and at least one of VEGF-A, VEGF-B, and PlGF.

[0086] In another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises binding units that target at least two VEGF family members and Ang-2, and are linked together. Such binding units comprise, consist of, or consist essentially of antigen-binding domains or moieties that target at least two VEGF family members and Ang-2. In still another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises binding units that target at least two VEGF family members and Ang-2, and are linked together, wherein one of said at least two VEGF family members comprises VEGF-C. In yet another aspect, such VEGF family members comprise VEGF-A and VEGF-C. In still another aspect, such VEGF family members comprise VEGF-C and at least one of VEGF-A, VEGF-B, and PlGF.

[0087] In still another aspect, a multispecific fusion protein of the present invention does not bind, or substantially bind, to Ang-1. In another aspect, a multispecific antibody fusion protein of the present invention has an affinity to Ang-1 that is less than about 10-3 times the affinity to Ang-2.

[0088] In some embodiments, the two VEGF-binding units are linked through a short peptide linker. In some other embodiments, the two VEGF-binding units are linked directly together. Non-limiting examples of short peptide linkers are disclosed hereinafter.

[0089] In one aspect, the Ang-2-binding unit comprises an antigen-binding fragment of an antibody against Ang-2, or a biologically active peptide that binds, or substantially binds, to Ang-2 ( “Ang-2-binding polypeptide” ) .

[0090] In another aspect, an antibody against Ang-2 comprises an sdAb directed against Ang-2 ( “Ang-2 sdAb” ) .

[0091] In still another aspect, an Ang-2-binding unit that targets Ang-2 comprises an Ang-2 sdAb or an Ang-2-binding polypeptide.

[0092] In yet another aspect, the first VEGF-binding unit comprises a plurality of Ig-like domains of a first and a second VEGF receptors linked together. In still another aspect, said first and second VEGF receptors comprise VEGFR-1 and VEGFR-2. In yet another aspect, the first VEGF-binding unit comprises the second Ig-like domain of VEGFR-1 ( “VEGFR-1-D2” ) and the third Ig-like domain of VEGFR-2 ( “VEGFR-2-D3” ) linked together. The amino acid sequences of VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, as included in certain embodiments of multispecic fusion proteins of the present invention, are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.

[0093] In still another aspect, the second VEGF-binding unit comprises a plurality of Ig-like domains of a third VEGF receptor linked together. In still another aspect, said third VEGF receptor comprises VEGFR-3. In yet another aspect, the second VEGF-binding unit comprises the first and second Ig-like domains of VEGFR-3 ( “VEGFR-3-D1D2” ) or the first, second, and third Ig-like domains of VEGFR-3 ( “VEGFR3-D1D2D3” ) . The amino acid sequences of VEGFR-3-D1, VEGFR-3-D2, and VEGFR-3-D3, as included in certain embodiments of multispecic fusion proteins of the present invention, are shown in SEQ ID NOs: 3, 4, and 5, respectively.

[0094] In still another aspect, said VEGFR-1, VEGFR-2, and VEGFR-3 are human VEGFR-1, VEGFR-2, and VEGFR-3.

[0095] In still another aspect, a multispecific fusion protein comprises: (1) a first VEGF-binding unit comprising a plurality of Ig-like domains of a first and a second VEGF receptors linked in series; (2) a second VEGF-binding unit comprising a plurality of Ig-like domains of a third VEGF receptor linked in series; (3) an IgG1 Fc domain; and (4) an Ang-2-binding unit; wherein an N-terminus of the IgG1 Fc domain is linked to a free C-terminus of the first or second VEGF-binding unit, and an N-terminus of the Ang-2-binding unit is linked to the C-terminus of the IgG1 Fc domain.

[0096] In still another aspect, a multispecific fusion protein comprises: (1) a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D1 and VEGFR-2-D3 linked in series; (2) a second VEGF-binding unit comprising (a) VEGFR-3-D1 and VEGFR-3-D2 linked in series, or (b) VEGFR-3-D1, VEGFR-3-D2, and VEGFR-3-D3 linked in series; (3) an IgG1 Fc domain; and (4) an Ang-2-binding unit comprising an Ang-2-binding polypeptide or an Ang-2 sdAb; wherein an N-terminus of the IgG1 Fc domain is linked to a free C-terminus of the first or second VEGF-binding unit, and an N-terminus of the Ang-2-binding unit is linked to the C-terminus of the IgG1 Fc domain.

[0097] In still another aspect, the second VEGF-binding unit comprises a VEGF-C antibody or a ligand-binding fragment or domain thereof.

[0098] In still another aspect, a VEGF-C antibody included in a multispecific fusion protein comprises two heavy chains and two light chains.

[0099] Non-limiting examples of VEGF-C antibodies include the VEGF-C antibody denoted as VGX-100, as disclosed in US Patent Application 2012 / 0207671, the heavy chain and light chain of which are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 disclosed therein. The amino acid sequences of the heavy chain and light chain of VGX-100 are shown herein as SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively. Other non-limiting examples of VEGF-C antibodies include those disclosed in US Patents 7,423,125; 8,486,397; and 9,562,093; and US Patent Application Publication 2023 / 0192833. Other non-limiting examples of VEGF-C antibodies can be the VEGF-C sdAbs disclosed in US Patent 11,161,916. The contents of the foregoing patents and patent applications are incorporated herein by reference to the extent of their disclosure of VEGF-C antibodies and their manufacture and use.

[0100] In still another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention, or an antigen-binding fragment or domain thereof, comprises an antibody against VEGF-C linked to a VEGF-binding unit that comprises at least an Ig-like domain of a VEGF receptor; wherein the antibody against VEGF-C comprises a full-length antibody, a VEGF-C-binding fragment thereof, or an sdAb directed against VEGF-C. In some embodiments, a VEGF-C-binding antibody fragment comprises complementarity determining regions ( “CDRs” ) of the heavy chain and the light chain of  a VEGF-C antibody. In some other embodiments, a VEGF-C-binding antibody fragment comprises fewer than all CDRs of the heavy chain and the light chain of a VEGF-C antibody.

[0101] In still another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention, or an antigen-binding fragment or domain thereof, comprises an antibody against VEGF-C linked to a VEGF-binding unit that comprises at least an Ig-like domain of a VEGF receptor; wherein the antibody against VEGF-C comprises a full-length antibody having two heavy chains and two light chains, and an N-terminus of a heavy chain or light chain is linked to a C-terminus of the VEGF-binding unit.

[0102] In still another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention, or an antigen-binding fragment or domain thereof, comprises an antibody against VEGF-C linked to a VEGF-binding unit that comprises a plurality of Ig-like domains of VEGFR-1 and VEGFR-2 linked in series; wherein the antibody against VEGF-C comprises a full-length antibody having two heavy chains and two light chains, and an N-terminus of a heavy chain or light chain is linked to a C-terminus of the VEGF-binding unit. In some embodiments of the multispecific fusion protein, said plurality of Ig-like domains of VEGFR-1 and VEGFR-2 comprises VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3.

[0103] In yet another aspect, a multispecific fusion protein of the present invention comprises: (1) a first VEGF-binding unit comprising at least an Ig-like domain of a VEGF receptor; (2) a full-length antibody against VEGF-C ( “VEGF-C antibody” ) comprising two heavy chains and two light chains; and (3) an Ang-2-binding polypeptide; wherein an N-terminus of a heavy chain or light chain is linked to a C-terminus of the fir st VEGF-binding unit, and an N-terminus of the Ang-2-binding unit is linked to a C-terminus of a heavy chain. Alternatively, an N-terminus of the Ang-2-binding unit may be linked to a C-terminus of a light chain.

[0104] In still another aspect, a multispecific fusion of the present invention comprises : (1) a first VEGF-binding unit comprising a plurality of Ig-like domains of VEGFR-1 and VEGFR-2 linked in series; (2) a full-length antibody against VEGF-C comprising two heavy chains and two light chains; and (3) an Ang-2-binding polypeptide comprising an Ang-2-binding polypeptide or an Ang-2 sdAb; wherein an N-terminus of a  heavy chain or light chain is linked to a C-terminus of the first VEGF-binding unit, and an N-terminus of the Ang-2-binding unit is linked to a C-terminus of a heavy chain. Alternatively, an N-terminus of the Ang-2-binding unit may be linked to a C-terminus of a light chain. In some embodiments of the multispecific fusion protein, said plurality of Ig-like domains of VEGFR-1 and VEGFR-2 comprises VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3.

[0105] In still another aspect, two Ig-like domains of a VEGF-binding unit or two VEGF-binding units may be linked together directly or through a peptide linker. Such a peptide linker, when used, is preferably a short peptide linker, such as having fewer than 30, 25, 20, 15, or 10 amino acid residues. Peptide linkers are known in the art, such as peptides comprising glycine, serine, and / or threonine residues. Common peptide linkers comprise short sequences of glycine and serine residues. Non-limiting examples of peptide linkers may be those including or consisting of a motif of (GGGGS) x (x=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) , such as GGGGSGGGGSGGGGS, GGGGSGGGGS, and GGGGSGGGS.

[0106] A non-limiting example of short peptide linkers has an amino acid sequence of GGSGGGSGGGGSGGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 8) .

[0107] In one aspect, an IgG1 Fc domain included in an embodiment of the multispecific fusion protein of the present invention comprises a human IgG1 Fc domain. The amino acid sequence of human IgG1 Fc domain is shown below as SEQ ID NO: 9.

[0108] In still another aspect, the binding unit that targets Ang-2 comprises an sdAb or a biologically active polypeptide directed against Ang-2.

[0109] Non-limiting examples of Ang-2-binding polypeptide that may be used in Ang-2-binding units to construct many fusion proteins of the present invention are shown below in SEQ ID NOs: 10-15. Other non-limiting examples of Ang-2-binding polypeptides suitable for use in constructing fusion proteins of the present invention are disclosed in US Patents 7,138,370 and 7,205,275, and US Patent Application Publication 2013 / 0142799, the contents of which are incorporated herein by reference to the extent of the disclosure of these Ang-2-binding polypeptides and their manufacture and use.

[0110] In yet another aspect, an Ang-2-binding unit comprises an Ang-2 sdAb, or an antigen-binding fragment or domain thereof. Such an Ang-2 sdAb comprises the heavy-chain variable region of a heavy-chain antibody (VHH) against Ang-2 and can bind specifically to Ang-2 without requiring a complementary variable region as in a conventional four-chain immunoglobulin molecule.

[0111] As disclosed herein, an “antigen-binding fragment or domain” of an antibody refers to a fragment or portion of such antibody, which fragment or portion is capable of binding, or binding substantially, to the antigen. In one embodiment, an antigen-binding fragment or domain of such antibody comprises, consists essentially of, or consists of a variable domain of the heavy chain (VH) of such antibody.

[0112] An Ang-2 sdAb included in some embodiments of the present invention consists of three CDRs of an antibody heavy chain, each CDR being flanked by framework domains. Such sdAb lacks the CH1 domain of the antibody heavy chain. Despite possessing only three CDRs, sdAbs show equivalent antigen-binding affinity and other effector functions compared to conventional antibodies comprising six CDRs (three CDRs of the heavy chain and three CDRs of the light chain) . Single-domain antibodies are described, for example, in Li et al., Front. Oncol., 13: 1257175 (2023) ; Hu et al., Front. Immunol., 8: 1442 (2017) ; Bathula et al., Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, Vol. 36, No. 2, 109-122 (2021) .

[0113] An Ang-2 sdAb included in embodiments of the present invention is capable of binding to Ang-2 with an equilibrium dissociation constant (KD) in the range from about 1x10-6 M to 1x10-12 M. In some embodiments, the sdAb against Ang-2 is capable of binding to its corresponding ligand with KD in the range from about 1x10-7 M to about 1x10-12 M. In some other embodiments, the sdAb against Ang-2 is capable of binding to its corresponding ligand with KD in the range from about 1x10-8 M to about 1x10-12 M. In still some other embodiments, the sdAb against Ang-2 is capable of binding to its corresponding ligand with KD in the range from about 1x10-9 M to about 1x10-12 M.

[0114] The present inventors generated Ang-2 sdAbs in a discovery program, the amino acid sequences of eight of which are shown in SEQ ID NOs: 16-23. Other Ang-2 sdAbs that may be used in an Ang-2-binding unit to construct a fusion protein of the  present invention are disclosed, for example, in US Patent 9,527,925, which is incorporated herein by reference to the extent of the disclosure of the Ang-2 sdAbs and their manufacture and use.

[0115] FIRST EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE PRESENT INVENTION

[0116] In one aspect, a first embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises two fusion polypeptide members, each of which comprises: (a) a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, linked together in series; (b) a second VEGF-binding unit comprising VEGFR-3-D1D2D3; (c) a human IgG1 Fc domain; and (d) an Ang-2-binding polypeptide; wherein a C-terminus of the first VEGF-binding unit is linked to an N-terminus of the second VEGF-binding unit, the C-terminus of the second VEGF-binding unit is linked to the N-terminus of the IgG1 Fc domain, the C-terminus of the IgG1 Fc domain is linked to the N-terminus of the Ang-2-binding polypeptide, and the two fusion polypeptide members are linked together at the hinge region of the IgG1 Fc domain.

[0117] The flexible linker having SEQ ID NO: 8 was used to link the C-terminus of the first VEGF-binding unit to the N-terminus of the second VEGF-binding unit. A flexible linker having amino acid sequence of GGGGSGGGGSGGGGS was used to link the N-terminus of the Ang-2-binding polypeptide to the C-terminus of the IgG1 Fc domain.

[0118] The amino acid sequences disclosed or claimed herein also encompass conservative amino acid substitutions in these sequences, which do not generally alter the biological activity of the proteins or peptides. The most commonly occurring substitutions are Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly, in both directions.

[0119] Six representative fusion proteins of the first embodiment were constructed (denoted as EB-110BI-L7C, EB-110BI-L10C, EB-110BI-L15C, EB-110BI-L21C, EB- 110BI-Con4C, and EB-110BI-Con4-40CA) , each including one of the six Ang-2-binding polypeptides having amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 10-15.

[0120] Complete amino acid sequences of the fusion polypeptide members of these fusion proteins are disclosed in SEQ ID NO: 24 through SEQ ID NO: 29.

[0121] It is within the scope of this invention that the order of VEGFR-1-D2 and VEGFR2-D3 in the first VEGF-binding unit may be exchanged. Thus, the C-terminus of either of these Ig-like domains may be linked to the N-terminus of the second VEGF-binding unit.

[0122] SECOND EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE PRESENT INVENTION

[0123] In one aspect, a second embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises two fusion polypeptide members, each of which comprises: (a) a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, linked together in series; (b) a second VEGF-binding unit comprising VEGFR-3-D1D2D3; (c) a human IgG1 Fc domain; and (d) an Ang-2-binding polypeptide; wherein a C-terminus of the second VEGF-binding unit is linked to an N-terminus of the first VEGF-binding unit, the C-terminus of the first VEGF-binding unit is linked to the N-terminus of the IgG1 Fc domain, the C-terminus of the IgG1 Fc domain is linked to the N-terminus of the Ang-2-binding polypeptide, and the two fusion polypeptide members are linked together at a hinge region of the IgG1 Fc domain.

[0124] The flexible linker having SEQ ID NO: 8 was used to link the C-terminus of the second VEGF-binding unit to the N-terminus of the first VEGF-binding unit. A flexible linker having amino acid sequence of GGGGSGGGGSGGGGS was used to link the N-terminus of the Ang-2-binding polypeptide to the C-terminus of the IgG1 Fc domain.

[0125] A representative fusion protein was constructed (denoted as EB-110BI-L7C2) that included Ang-2-binding polypeptide 1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.

[0126] The complete amino acid sequence of a fusion polypeptide member of this fusion protein is disclosed in SEQ ID NO: 30.

[0127] It is within the scope of the present invention that the order of VEGFR-1-D2 and VEGFR2-D3 in the first VEGF-binding unit may be exchanged. Thus, the N-terminus of either of these Ig-like domains may be linked to the C-terminus of the second VEGF-binding unit.

[0128] THIRD EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE PRESENT INVENTION

[0129] In one aspect, a third embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises two fusion polypeptide members, each of which comprises: (a) a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, linked together in series; (b) a second VEGF-binding unit comprising VEGFR-3-D1D2; (c) a human IgG1 Fc domain; and (d) an Ang-2-binding polypeptide; wherein a C-terminus of the second VEGF-binding unit is linked to an N-terminus of the first VEGF-binding unit, the C-terminus of the first VEGF-binding unit is linked to the N-terminus of the IgG1 Fc domain, the C-terminus of the IgG1 Fc domain is linked to the N-terminus of the Ang-2-binding polypeptide, and the two fusion polypeptide members are linked together at a hinge region of the IgG1 Fc domain.

[0130] The flexible linker having SEQ ID NO: 8 was used to link the C-terminus of the second VEGF-binding unit to the N-terminus of the first VEGF-binding unit. A flexible linker having amino acid sequence of GGGGSGGGGSGGGGS was used to link the N-terminus of the Ang-2-binding polypeptide to the C-terminus of the Fc domain.

[0131] A representative fusion protein was constructed (denoted as EB-110BI-L7C1) that included Ang-2-binding polypeptide 1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.

[0132] The complete amino acid sequence of a fusion polypeptide member of fusion protein EB-110BI-L7C1 is disclosed in SEQ ID NO: 31.

[0133] It is within the scope of the present invention that the order of VEGFR-1-D2 and VEGFR2-D3 in the first VEGF-binding unit may be exchanged. Thus, the N-terminus of either of these Ig-like domains may be linked to the C-terminus of the second VEGF-binding unit.

[0134] FOURTH EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE PRESENT INVENTION

[0135] In one aspect, a fourth embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises a variant of any one of the first, second, and third embodiment herein disclosed above, wherein the Ang-2-binding polypeptide is replaced by an Ang-2 sdAb. Any Ang-2 sdAb disclosed herein (e.g., one of the sdAbs having SEQ ID NOs: 16-23) may be used to construct a fusion protein of the fourth embodiment.

[0136] A representative fusion protein of the fourth embodiment (denoted as EB-110BIb) was constructed. EB-110BIb was a variant of EB-110BI-L7C1 (afusion protein of the third embodiment) , wherein Ang-2 sdAb A38-196 having the amino acid sequence SEQ ID NO: 17 replaced Ang-2-binding polypeptide 1.

[0137] The complete amino acid sequence of a fusion polypeptide member of fusion protein EB-110BIb is shown in SEQ ID NO: 32.

[0138] FIFTH EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE PRESENT INVENTION

[0139] In one aspect, a fifth embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, linked together in series; and (b) a second VEGF-binding unit comprising a VEGF-C antibody having two heavy chains and two light chains; wherein a C-terminus of the first VEGF-binding unit is linked to an N-terminus of a light chain of the VEGF-C antibody directly or through a short peptide linker.

[0140] In another aspect, the VEGF-C antibody comprises a full-length antibody.

[0141] Two representative fusion proteins of the fifth embodiment (denoted as EB-111BIa and EB-111BIc) were constructed, each comprising the VEGF-C antibody VGX-100 disclosed herein above. The first VEGF-binding unit of EB-111BIa was linked directly to the N-terminus of a light chain of the VEGF-C antibody. The first VEGF-binding unit of EB-111BIc was linked to the N-terminus of a light chain of the VEGF-C antibody through a peptide linker having an amino acid sequence of GGGGSGGGGS.

[0142] The amino acid sequences of the heavy chain and the light chain of EB-111BIa are shown in SEQ ID NOs: 33 and 34.

[0143] The amino acid sequences of the heavy chain and the light chain of EB-111BIc are shown in SEQ ID NOs: 35 and 36.

[0144] Other VEGF-C antibodies disclosed herein (e.g., those disclosed in US Patent 8,486,397) may be used to construct a multispecific fusion protein of the fifth embodiment.

[0145] SIXTH EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE PRESENT INVENTION

[0146] In one aspect, a sixth embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, linked together in series; and (b) a second VEGF-binding unit comprising a VEGF-C antibody having two heavy chains and two light chains; wherein a C-terminus of the first VEGF-binding unit is linked to an N-terminus of a heavy chain of the VEGF-C antibody directly or through a short peptide linker.

[0147] In another aspect, the VEGF-C antibody comprises a full-length antibody.

[0148] A representative fusion protein of the sixth embodiment (denoted as EB-111BId) was constructed, comprising the VEGF-C antibody VGX-100 disclosed herein above. The first VEGF-binding unit of EB-111BId is linked to the N-terminus of a heavy chain of the VEGF-C antibody through a peptide linker having an amino acid sequence of GGGGSGGGGS.

[0149] The amino acid sequences of the heavy chain and the light chain of EB-111BId are shown in SEQ ID NOs: 37 and 38.

[0150] Other VEGF-C antibodies disclosed herein (e.g., those disclosed in US Patent 8,486,397) may be used to construct a multispecific fusion protein of the sixth embodiment.

[0151] SEVENTH EMBODIMENT OF THE FUSION PROTEINS OF THE PRESENT INVENTION

[0152] In one aspect, a seventh embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, linked together in series; (b) a second VEGF-binding unit comprising a VEGF-C antibody having two heavy chains and two light chains; and (c) an Ang-2-binding polypeptide; wherein a C-terminus of the first VEGF-binding unit is linked directly to an N-terminus of a light chain of the VEGF-C antibody, and the N-terminus of the Ang-2-binding polypeptide is linked to the C-terminus of the Fc domain of a heavy chain of the VEGF-C antibody through a peptide linker.

[0153] In another aspect, the VEGF-C antibody comprises a full-length antibody.

[0154] Two fusion proteins of the seventh embodiment (denoted as EB-111BIb and EB-111BIb1) were constructed, each comprising the first VEGF-binding unit that comprises VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, the VEGF-C antibody VGX-100 (disclosed herein above) , and Ang-2 polypeptide 1 (SEQ ID NO: 10) . Peptide linkers having amino acid sequences of GGGGSGGGGS and GGGGSGGGGSGGGGS were used to link Ang-2 polypeptide 1 to the C-terminus of the Fc domain of a heavy chain the VEGF-C antibody in EB-111BIb and EB-111BIb1, respectively. The C-terminus of the first VEGF-binding unit was linked directly to the N-terminus of a light chain of the VEGF-C antibody.

[0155] The amino acid sequences of the heavy chain and the light chain of EB-111BIb are shown in SEQ ID NOs: 39 and 40.

[0156] The amino acid sequences of the heavy chain and the light chain of EB-111BIb1 are shown in SEQ ID NOs: 41 and 42.

[0157] Other VEGF-C antibodies disclosed herein (e.g., those disclosed in US Patent 8,486, 397) may be used to construct a multispecific fusion protein of the seventh embodiment.

[0158] EIGHTH EMBODIMENT OF THE MUTISPECIFIC FUSION PROTEINS OF THE PRESENT INVENTION

[0159] In one aspect, an eighth embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, linked together in series; (b) a second VEGF-binding unit comprising a VEGF-C antibody having two heavy chains and two light chains; and (c) an Ang-2-binding polypeptide; wherein a C-terminus of the first VEGF-binding unit is linked to an N-terminus of a heavy chain of the VEGF-C antibody through a short peptide linker, and the N-terminus of the Ang-2-binding polypeptide is linked to the C-terminus of the Fc domain of a heavy chain of the VEGF-C antibody through another peptide linker.

[0160] In another aspect, the VEGF-C antibody comprises a full-length antibody.

[0161] A representative fusion protein of the eighth embodiment (denoted as EB-111BId1) was constructed, comprising the first VEGF-binding unit that comprises VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, the VEGF-C antibody VGX-100 (disclosed herein above) , and Ang-2 polypeptide 1 (SEQ ID NO: 10) . Peptide linkers having amino acid sequences of GGGGSGGGGS and GGGGSGGGGSGGGGS were used to link the first VEGF-binding unit and Ang-2 polypeptide 1 to a heavy chain the VEGF-C antibody, respectively.

[0162] The amino acid sequences of the heavy chain and the light chain of EB-111BId1 are shown in SEQ ID NOs: 43 and 44.

[0163] Other VEGF-C antibodies disclosed herein (e.g., those disclosed in US Patent 8,486,397) may be used to construct a multispecific fusion protein of the eighth embodiment.

[0164] NINTH EMBODIMENT OF THE MULTISPECIFIC FUSION PROTEIN OF THE PRESENT INVENTION

[0165] In one aspect, a ninth embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, linked together in series; (b) a second VEGF-binding unit comprising a VEGF-C antibody having two heavy chains and two light chains; and (c) an Ang-2 sdAb; wherein a C-terminus of the first VEGF-binding unit is linked to an N-terminus of a light chain of the VEGF-C antibody directly or through a peptide linker, and the N-terminus of the Ang-2 sdAb is linked to the C-terminus of the Fc domain of a heavy chain of the VEGF-C antibody through another peptide linker.

[0166] In another aspect, the VEGF-C antibody comprises a full-length antibody.

[0167] Two representative fusion proteins of the ninth embodiment (denoted as EB-111BIb2 and EB-111BIb3) were constructed, each comprising the first VEGF-binding unit that comprises VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, the VEGF-C antibody VGX-100 (disclosed herein above) , and an Ang-2 sdAb. EB-111BIb2 and EB-111BIb3 included Ang-2 sdAbs A38-196 (SEQ ID NO: 17) and Ang-2 sdAb A41-089 (SEQ ID NO: 18) , respectively. The first VEGF-binding unit in EB-111BIb2 was linked to a light chain of the VEGF-C antibody through a peptide linker having amino acid sequences of GGGGSGGGGS. The first VEGF-binding unit in EB-111BIb3 was linked directly to a light chain of the VEGF-C antibody. Ang-2 sdAbs A38-196 and A41-089 were linked to the Fc domain of a heavy chain of the VEGF-C antibody through peptide linker having a sequence of GGGGSGGGGSGGGGS, in EB-111BIb2 and EB-111BIb3, respectively.

[0168] The amino acid sequences of the heavy chain and the light chain of EB-111BIb2 are shown in SEQ ID NOs: 45 and 46.

[0169] The amino acid sequences of the heavy chain and the light chain of EB-111BIb3 are shown in SEQ ID NOs: 47 and 48.

[0170] Other VEGF-C antibodies disclosed herein (e.g., those disclosed in US Patent 8,486,397) may be used to construct a multispecific fusion protein of the ninth embodiment.

[0171] TENTH EMBODIMENT OF THE FUSION PROTEINS OF THE PRESENT INVENTION

[0172] In one aspect, a tenth embodiment of the multispecific fusion proteins of the present invention comprises: (a) a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, linked together in series; (b) a second VEGF-binding unit comprising a VEGF-C antibody having two heavy chains and two light chains; and (c) an Ang-2 sdAb; wherein a C-terminus of the first VEGF-binding unit is linked to an N-terminus of a heavy chain of the VEGF-C antibody through a peptide linker, and the N-terminus of the Ang-2 sdAb is linked to the C-terminus of the Fc domain of a heavy chain of the VEGF-C antibody through another peptide linker.

[0173] In another aspect, the VEGF-C antibody comprises a full-length antibody.

[0174] Two representative fusion proteins of the tenth embodiment (denoted as EB-111BId2 and EB-111BId3) were constructed, each comprising the VEGF-C antibody VGX-100 (disclosed herein above) . EB-111BId2 and EB-111BId3 included Ang-2 sdAbs A38-196 (SEQ ID NO: 17) and Ang-2 sdAb A41-089 (SEQ ID NO: 18) , respectively. The first VEGF-binding unit was linked to a heavy chain of the VEGF-C antibody through a peptide linker having amino acid sequences of GGGGSGGGGS. Ang-2 sdAbs A38-196 and A41-089 were linked to the Fc domain of a heavy chain of the VEGF-C antibody through peptide linker having a sequence of GGGGSGGGGSGGGGS, in EB-111BId2 and EB-111BId3, respectively.

[0175] The amino acid sequences of the heavy chain and the light chain of EB-111BId2 are shown in SEQ ID NOs: 49 and 50.

[0176] The amino acid sequences of the heavy chain and the light chain of EB-111BId3 are shown in SEQ ID NOs: 51 and 52.

[0177] Other VEGF-C antibodies disclosed herein (e.g., those disclosed in US Patent 8,486,397) may be used to construct a multispecific fusion protein of the ninth embodiment.

[0178] An Ang-2-binding unit included in a multispecific fusion protein of the present invention is capable of binding Ang-2 with KD in the range from about 1x10-6 M to about 1x10-12 M. In some embodiments, said KD is in the range from about 1x10-7 M to about 1x10-12 M. In some other embodiments, said KD in the range from about 1x10-8 M to about 1x10-12 M. In still some embodiments, said KD is in the range from about 1x10-9 M to about 1x10-12 M. As a result, said fusion protein substantially inhibits biological activity of Ang-2 in promoting at least one of angiogenesis, increased vascular permeability, and inflammation; thereby, controlling a pathological condition having etiology in at least one of aberrant angiogenesis, vascular leakage, and inflammation.

[0179] A first VEGF-binding unit included in a multispecific fusion protein of the present invention is capable of binding a VEGF family member selected from the group consisting of VEGF-A, VEGF-B, PlGF, and combinations thereof and a second VEGF-binding unit is capable of binding VEGF-C with KD in the range from about 1x10-6 M to about 1x10-12 M. In some embodiments, said KD is in the range from about 1x10-7 M to about 1x10-12 M. In some other embodiments, said KD in the range from about 1x10-8 M to about 1x10-12 M. In still some other embodiments, said KD is in the range from about 1x10-9 M to about 1x10-12 M. As a result, said antibody fusion protein substantially inhibits biological activity of said at least one of VEGF-A, VEGF-B, and PlGF, and VEGF-C in promoting at least one of angiogenesis, vascular leakage, and inflammation; thereby, controlling a pathological condition having etiology in at least one of aberrant angiogenesis, vascular leakage, and inflammation.

[0180] In some embodiments, the present invention also provides a binding construct that comprises, consists of, or consists essentially of a plurality of multispecific fusion or chimeric proteins, herein described, that are linked to or associated with each other by covalent bonds or other forms of attachment; wherein the multispecific fusion proteins of  such a binding construct may be the same or different. Such a binding construct of the present invention is capable of binding (1) at least one of VEGF-A, VEGF-B, and PlGF, and (2) VEGF-C with high affinity. In some embodiments, such a binding construct invention is capable of binding (1) at least one of VEGF-A, VEGF-B, and PlGF, (2) VEGF-C, and (3) Ang-2 with high affinity. In the case where the multispecific fusion proteins are different, each can comprise a different binding unit against VEGF family members or Ang-2 selected from the binding units disclosed herein.

[0181] A multispecific fusion protein or a binding construct may further include a heterologous peptide or other chemical moieties. Such additions can modify its properties such as stability, solubility, toxicity, serum half-life, immunogenicity, detectability, or other properties.

[0182] The term “high affinity” is used in a physiological context pertaining to the relative affinity of the multispecific fusion protein for said VEGF family members and Ang-2 in vivo in a mammal, such as a laboratory test animal, a domesticated farm or pet animal, or a human. Multispecific fusion proteins binding said VEGF family members and Ang-2 in the present invention can have characteristic affinities for their ligands in vivo, typically measured in terms of sub-nanomolar values of equilibrium dissociation constants (KD) . For the purposes of this invention, a multispecific fusion protein of the present invention can bind to its targeted ligand with a KD less than or equal to about 1, or about 5, or about 10, or about 50, or about 100, or about 500, or about 1000 times the KD of the natural ligand / receptor pair.

[0183] A multispecific fusion proteins of the present invention is capable of binding to at least a VEGF family member and Ang-2 with an equilibrium dissociation constant (KD) in the range from about 1x10-6 M to 1x10-12 M. In some embodiments, the KD value is in the range from about 1x10-7 M to about 1x10-12 M, or from about 1x10-8 M to about 1x10-12 M, or from about 1x10-9 M to about 1x10-12 M.

[0184] In another aspect, a multispecific fusion protein may comprise more than one of each of the VEGF-binding unit and the Ang-2-binding unit.

[0185] In one aspect, the amino acid sequences of the non-limiting various portions or embodiments of a multispecific fusion protein of the present invention are listed in Table 1.

[0186] Table 1

[0187] Amino Acid Sequences

[0188] In another aspect, the nucleic acid sequences encoding the amino acid sequences of Table 1 are listed in Table 2.

[0189] Table 2

[0190] Nucleic Acid Sequences

[0191] In yet another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to any one of SEQ ID NO: 1 through SEQ ID NO: 52.

[0192] In still another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises an amino acid sequence that is at least 95%identical to any one of SEQ ID NO: 1 through SEQ ID NO: 52.

[0193] In still another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises an amino acid sequence that is at least 98%identical to any one of SEQ ID NO: 1 through SEQ ID NO: 52.

[0194] In still another aspect, a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention comprises an amino acid sequence that is at least 99%identical to any one of SEQ ID NO: 1 through SEQ ID NO: 52.

[0195] In still another aspect, the present invention provides a multispecific fusion protein comprising a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 24-32.

[0196] In still another aspect, the present invention provides a multispecific fusion protein comprising a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 24-32.

[0197] In still another aspect, the present invention provides a multispecific fusion protein comprising a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 98% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 24-32.

[0198] In still another aspect, the present invention provides a multispecific fusion protein comprising a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 99%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 24-32

[0199] In still another aspect, the present invention provides a multispecific fusion protein comprising polypeptides having a pair of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 33 and 34, 35 and 36, 37 and 38, 39 and 40, 41 and 42, 43 and 44, 45 and 46, 47 and 48, 49 and 50, and 51 and 52.

[0200] In still another aspect, the present invention provides a multispecific fusion protein comprising polypeptides having a pair of amino acid sequences that is at least 95%identical to a pair of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 33 and 34, 35 and 36, 37 and 38, 39 and 40, 41 and 42, 43 and 44, 45 and 46, 47 and 48, 49 and 50, and 51 and 52.

[0201] In still another aspect, the present invention provides a multispecific fusion protein comprising polypeptides having a pair of amino acid sequences that is at least 98%identical to a pair of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 33 and 34, 35 and 36, 37 and 38, 39 and 40, 41 and 42, 43 and 44, 45 and 46, 47 and 48, 49 and 50, and 51 and 52.

[0202] In still another aspect, the present invention provides a multispecific fusion protein comprising polypeptides having a pair of amino acid sequences that is at least 99%identical to a pair of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 33 and 34, 35 and 36, 37 and 38, 39 and 40, 41 and 42, 43 and 44, 45 and 46, 47 and 48, 49 and 50, and 51 and 52.

[0203] In still another aspect, one or more amino acid substitutions can be made in any one of the above-described amino acid sequences. Preferably, such substitution is a conservative substitution, wherein an amino acid in one of the following groups is  substituted with another in the same group: (1) A, G; (2) D, E; (3) N, Q; (4) R, K; (5) I, L, M, V; (6) F, Y, W; (7) S, T; and (8) C, M; and such substitution is selected so as to preserve substantially the binding activity of the fusion protein. In one embodiment, a multispecific fusion protein of the present invention having a conservative substitution has a KD value for Ang-2, VEGF-A, VEGF-B, PlGF, or VEGF-C ligand less than about 120%of that before such substitution. Preferably, the KD value is less than about 110%of that before such substitution. More preferably, the KD value is less than about 105%of that before such substitution. Still more preferably, the KD value is less than about 100%of that before such substitution.

[0204] In addition, the amino acid sequences disclosed or claimed herein also encompass their “conservatively modified variants, ” which are the results of a substitution, deletion, or addition of a single amino acid or a small percentage of amino acids (such as ≤ 5, ≤ 4, ≤ 3, ≤ 2, or ≤ 1%) in the original sequence of a peptide, polypeptide, or protein sequence that does not substantially alter the biological activity of the original peptide, polypeptide, or protein. For example, such conservatively modified variants can retain about ≥ 95, ≥ 96, ≥ 97, ≥ 98, ≥ 99, or 100%of the biological activity of the original peptide, polypeptide, or protein.

[0205] Most conservative substitutions are not expected to produce radical changes in the characteristics of the Ig-like domain or other domains of the fusion polypeptide. However, when it is difficult to predict the exact effect of the substitution in advance of doing so, one skilled in the art will appreciate that the effect can be evaluated by routine screening assays. For example, an Ig-like domain or other domain variant typically is made by site-specific mutagenesis of the nucleic acid encoding the intact fusion polypeptide, expression of the variant nucleic acid in recombinant cell culture, purification of the variant fusion polypeptide from the cell culture, and detecting the ability of the variant fusion polypeptide to specifically bind to Ang-2 or an aforementioned VEGF ligand. An exemplary binding assay which can be employed to determine if a particular substitution or substitutions in an Ig-like domain or other domains affect the capability of the fusion polypeptide to bind to and inhibit the activity of Ang-2 or an aforementioned VEGF family member is described in the article by Park et al., J. Biol. Chem., 269: 25646-25654 (1994) .

[0206] The VEGFR-1-D2 domain of the fusion protein is capable of binding free VEGF-A, VEGF-B, and PlGF with high affinity (see; e.g, Davis-Smyth et al., EMBO J., 15 (18) : 4919 (1996) ) . The VEGFR-2-D3 domain of the fusion protein is capable of binding free VEGF-A, VEGF-C, and VEGF-D with high affinity (see; e.g, Stuttfeld et al., Life, 61 (9) : 915 (2009) ) . The VEGFR-3-D1D2 or, likely, VEGFR-3-D2D3 is capable of binding free VEGF-C with high affinity (see; e.g, Leppanen et al., PNAS, 110 (32) : 12960 (2013) ; Roskoski et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 375: 287 (2008) ) . The Ang-2-binding unit is capable of inhibiting the activation of Tie-2 by Ang-2. Thus, a fusion protein of the present invention is capable of substantially inhibiting the angiogenic activity of these growth factors on endothelial cells at the site of the disease.

[0207] In still another aspect, the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding said multispecific fusion proteins.

[0208] In yet another aspect, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding a multispecific antibody fusion protein of any of the first through tenth embodiments disclosed herein above, the nucleic acid sequences of which are listed in Table 2.

[0209] In one aspect, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding a multispecific fusion protein; wherein the isolated nucleic acid molecule comprises: (1) a first nucleic acid sequence encoding a first VEGF-binding unit; and (2) a second nucleic acid sequence encoding a second VEGF-binding unit; wherein the first VEGF-binding unit comprises at least an Ig-like domain of one or more VEGF receptors; the second VEGF-binding unit comprises: (a) at least another Ig-like domain of one or more VEGF receptors, which is different from said at least an Ig-like domain included in the first VEGF-binding unit, or (b) a VEGF-C antibody; wherein the nucleic acid sequences of the first and second VEGF-binding units are operatively linked together; and wherein when each of the first and second VEGF-binding units comprises an Ig-like domain of a VEGF receptor, the isolated nucleic acid molecule further comprises (3) a third nucleic acid sequence encoding an Ang-2-binding unit comprising an Ang-2-binding polypeptide or an Ang-2 sdAb, operatively linked to the first or second nucleic acid sequence.

[0210] In another aspect, an isolated nucleic acid molecule encoding a multispecific fusion protein or an antigen-binding fragment or domain thereof of the present invention comprises: (1) a first nucleic acid sequence encoding a first VEGF-binding unit; (2) and a second nucleic acid sequence encoding a second VEGF-binding unit; wherein the first VEGF-binding unit comprises at least an Ig-like domain of one or more VEGF receptors; the second VEGF-binding unit comprises: (a) at least another Ig-like domain of one or more VEGF receptors, which is different from said at least an Ig-like domain included in the first VEGF-binding unit, or (b) a VEGF-C antibody; wherein (I) when each of first and second VEGF-binding units comprises an Ig-like domain of a VEGF receptor, the isolated nucleic acid molecule encoding the multispecific fusion protein or an antigen-binding fragment or domain thereof further comprises (3) a third nucleic acid sequence encoding an Ang-2-binding unit, or (II) when the second VEGF-binding unit comprises a VEGF-C antibody, the isolated nucleic acid molecule (A) does not comprise, or is devoid of, a nucleic acid sequence encoding an Ang-2-binding unit, or (B) further comprises a fourth nucleic acid sequence encoding an Ang-2-binding unit.

[0211] In still another aspect, an isolated nucleic acid molecule encoding one of two identical fusion polypeptide members of a multispecific fusion protein or an antigen-binding fragment or domain thereof of the present invention comprises: (1) a first nucleic acid sequence encoding a first VEGF-binding unit; (2) a second nucleic acid sequence encoding a second VEGF-binding unit; (3) a third nucleic acid sequence encoding an IgG1 Fc domain; and (4) a fourth nucleic acid sequence encoding an Ang-2-binding unit; wherein the first VEGF-binding unit comprises at least an Ig-like domain of one or more VEGF receptors; the second VEGF-binding unit comprises at least another Ig-like domain of one or more VEGF receptors, which is different from said at least an Ig-like domain included in the first VEGF-binding unit; and wherein the first, second, third, and fourth nucleic acid sequences are operatively linked together in the isolated nucleic acid molecule. In some embodiments, the 3’ end of the first nucleic acid sequence is linked operatively to the 5’ end of the second nucleic acid sequence, the 3’ end of the second nucleic acid sequence is operatively linked to the 5’ end of the third nucleic acid sequence, and the 3’ end of the third nucleic acid sequence is operatively linked to the 5’ of the fourth nucleic acid sequence. In some other embodiments, the 3’ end of the second nucleic acid sequence is linked operatively to the 5’ end of the first nucleic acid sequence, the 3’ end of the first nucleic acid sequence is operatively linked to the 5’ end of the third  nucleic acid sequence, and the 3’ end of the third nucleic acid sequence is operatively linked to the 5’ of the fourth nucleic acid sequence.

[0212] In yet another aspect, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding one of two fusion polypeptide members of a multispecific fusion protein; wherein said isolated nucleic acid molecule comprises: (1) a first nucleic acid sequence encoding a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2-VEGFR-2-D3; and (2) a second nucleic acid sequence encoding a second VEGF-binding unit comprising: (a) VEGFR-3-D1D2, or (b) VEGFR-3-D1D2D3, operatively linked to said first nucleic acid; (3) a third nucleic acid sequence encoding an IgG1 Fc domain, operatively linked to the first or second nucleic acid sequence; and (4) a fourth nucleic acid sequence encoding an Ang-2-binding polypeptide or an Ang-2 sdAb, operatively linked to the third nucleic acid sequence. In some embodiments, the 3’ end of the first nucleic acid sequence is linked operatively to the 5’ end of the second nucleic acid sequence, the 3’ end of the second nucleic acid sequence is operatively linked to the 5’ end of the third nucleic acid sequence, and the 3’ end of the third nucleic acid sequence is operatively linked to the 5’ of the fourth nucleic acid sequence. In some other embodiments, the 3’ end of the second nucleic acid sequence is linked operatively to the 5’ end of the first nucleic acid sequence, the 3’ end of the first nucleic acid sequence is operatively linked to the 5’ end of the third nucleic acid sequence, and the 3’ end of the third nucleic acid sequence is operatively linked to the 5’ of the fourth nucleic acid sequence.

[0213] In yet another aspect, the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding a multispecific fusion protein; wherein said isolated nucleic acid molecules comprise: (1) first and second nucleic acid sequences encoding a heavy chain and a light chain of VGX-100, respectively, as listed in SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 59; and (2) a third nucleic acid sequence encoding a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2-VEGFR-2-D3, (see SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54) , the 3’ end of which is operatively linked to the 5’ end of the second nucleic acid sequence.

[0214] In yet another aspect, the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding a multispecific antibody fusion protein; wherein said isolated nucleic acid molecules comprise: (1) first and second nucleic acid sequences encoding a heavy chain and a light chain of VGX-100, respectively, as listed in SEQ ID NO: 58 and SEQ  ID NO: 59; and (2) a third nucleic acid sequence encoding a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2-VEGFR-2-D3 (see SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54) , the 3’ end of which is operatively linked to the 5’ end of the first nucleic acid sequence.

[0215] In still another aspect, the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding a multispecific antibody fusion protein; wherein said isolated nucleic acid molecules comprise: (1) first and second nucleic acid sequences encoding the heavy chain and light chain of VGX-100, respectively, as listed in SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 59; (2) a third nucleic acid sequence encoding a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2-VEGFR-2-D3 (see SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54) , the 3’ end of which is operatively linked to the 5’ end of the second nucleic acid sequence; and (3) a fourth nucleic acid sequence encoding an Ang-2-binding peptide or an Ang-2 sdAb, having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 62-75, the 5’ end of which is operatively linked to the 3’ end of the first nucleic acid sequence.

[0216] In still another aspect, the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding a multispecific antibody fusion protein; wherein said isolated nucleic acid molecules comprise: (1) first and second nucleic acid sequences encoding the heavy chain and light chain of VGX-100, respectively, as listed in SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 59; (2) a third nucleic acid sequence encoding a first VEGF-binding unit comprising VEGFR-1-D2-VEGFR-2-D3 (see SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54) , the 3’ end of which is operatively linked to the 5’ end of the first nucleic acid sequence; and (3) a fourth nucleic acid sequence encoding an Ang-2-binding peptide or an Ang-2 sdAb, having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 62-75, the 5’ end of which is operatively linked to the 3’ end of the first nucleic acid sequence.

[0217] In another aspect, the present invention provides isolated nucleic acid molecules encoding a multispecific fusion or chimeric protein of the present invention; wherein said isolated nucleic acid molecules comprise a nucleic acid sequence that, as a result of the degeneracy of the genetic code, differs in one or more codons from a nucleic acid sequence listed in this disclosure. Such different nucleic acid sequence is within the scope of the present invention.

[0218] In still another aspect, the present invention provides a vector that comprises any of the nucleic acid molecules herein disclosed, including an expression vector comprising any of said nucleic molecules operatively linked to an expression control sequence.

[0219] In yet another aspect, a vector comprises a nucleic acid sequence encoding a multispecific fusion protein or a portion thereof, as listed in SEQ ID NOs: 76-104.

[0220] In still another aspect, the present invention provides a host-vector system for the production of any of said multispecific fusion or chimeric proteins, which host-vector system comprises the expression vector in a suitable host cell.

[0221] In one aspect, the present invention provides for the construction of a nucleic acid molecule encoding a multispecific fusion protein disclosed herein, which nucleic acid molecule is inserted into a vector that is able to express the fusion protein when introduced into an appropriate host cell. Appropriate host cells include, but are not limited to, bacterial cells, yeast cells, insect cells, and mammalian cells. Any of the methods known to one skilled in the art for the insertion of DNA fragments into a vector may be used to construct expression vectors encoding chimeric polypeptide molecules under control of transcriptional / translational control signals. These methods may include in vitro recombinant DNA and synthetic techniques and in vivo recombination (genetic recombination) (See; e.g., Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) .

[0222] Expression of nucleic acid molecules encoding a fusion protein of the present invention may be regulated by a second nucleic acid sequence (apromoter) so that the fusion protein is expressed in a host transformed with the nucleic acid molecules. For example, expression of a fusion protein described herein may be controlled by any promoter / enhancer element known in the art.

[0223] In general, plasmid vectors containing replicon and control sequences that are derived from species compatible with the host cell are used in connection with these hosts. The vector ordinarily carries a replication site, as well as marking sequences that are  capable of providing phenotypic selection in transformed cells. For example, E. coli is typically transformed using pBR322, a plasmid derived from an E. coli species (see; e.g., Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977) ) . The plasmid pBR322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance and thus provides easy means for identifying transformed cells. The pBR322 plasmid, or other microbial plasmid or phage, must also contain, or be modified to contain, promoters that can be used by the microbial organism for expression of proteins.

[0224] Those promoters most commonly used in recombinant DNA construction include the β-lactamase (penicillinase) and lactose promoter systems or a tryptophan (trp) promoter system (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) ) . While these are the most commonly used, other microbial promoters have been discovered and utilized. For example, the tac promoter is a synthetically produced DNA promoter produced from the combination of promoters from the trp and lac operons (de Boer et al., PNAS, (1983-01-80 (1) : 21–25 (1983) ) . It is commonly used for protein production in Escherichia coli. (Amann et al., Gene, 25: 167 (1983) ) . Any of these promoters may be used in connection with a method of producing a fusion protein of the present invention.

[0225] In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes, such as yeast cultures, may also be used. Saccharomyces cerevisiae, or common baker's yeast, is the most commonly used among eukaryotic microorganisms, although a number of other strains are commonly available. For expression in Saccharomyces, the plasmid YRp7, for example (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979) ) is commonly used. Other exemplary plasmids are disclosed in US Patent 4,615,974; Struhl et al., PNAS, 76 (3) : 1035 (1979) . The plasmid YRp7 contains the trp1 gene that provides a selection marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow without tryptophan, for example, ATCC No. 44, 076 or RH218 (Jones, Genetics, 85: 23 (1977) ) . The presence of the trp1 lesion as a characteristic of the yeast host cell genome then provides an effective environment for detecting transformation by growth in the absence of tryptophan.

[0226] Suitable promoting sequences in yeast vectors include the promoters for 3-phosphoglycerate kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980) ) or other glycolytic enzymes, such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylas, and glucokinase (Romanos et al., Yeast, 8: 423 (1992) ; Weinhandl  et al., Microb. Cell Factories, 13: 5 (2014) ) . In constructing suitable expression plasmids, the termination sequences associated with these genes are also ligated into the expression vector 3'of the sequence desired to be expressed to provide polyadenylation of the mRNA and termination. Other promoters, which have the additional advantage of transcription controlled by growth conditions, such as the promoter region for alcohol dehydrogenase 2, and enzymes responsible for maltose and galactose utilization (Romanos et al., Weinhandl et al., supra) , may be used for the vector construction. Any plasmid vector containing yeast-compatible promoter, origin of replication and termination sequences is suitable.

[0227] In addition to microorganisms, cultures of cells derived from multicellular organisms may also be used as hosts. In principle, any such cell culture is workable, whether from vertebrate or invertebrate culture. However, much interest has been in vertebrate cells, and propagation of vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a routine procedure in recent years. Examples of such useful host cell lines are VERO and HeLa cells, Chinese hamster ovary (CHO) cell lines, and W138, BHK, COS-7, HEK293, and MDCK cell lines. Expression vectors for such cells ordinarily include (if necessary) an origin of replication, a promoter located in front of the gene to be expressed, along with any necessary ribosome binding sites, RNA splice sites, polyadenylation sites, and transcriptional terminator sequences.

[0228] For use in mammalian cells, the control functions on the expression vectors are often provided by viral material. For example, commonly used promoters are derived from polyoma, Adenovirus 2, and most frequently Simian Virus 40 (SV40) . The early and late promoters of SV40 virus are particularly useful because both are obtained easily from the virus as a fragment that also contains the SV40 viral origin of replication (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978) ) . Smaller or larger SV40 fragments may also be used, provided there is included the approximately 250-bp sequence extending from the HindIII site toward the BglI site located in the viral origin of replication. Further, it is also possible, and often desirable, to utilize promoter or control sequences normally associated with the desired gene sequence, provided such control sequences are compatible with the host cell systems.

[0229] Thus, according to the invention, expression vectors capable of being replicated in a bacterial, a yeast cell, an insect cell, or a mammalian cell host, comprising a fusion protein-encoding nucleic acid as described herein, are used to transfect the host and thereby direct expression of such nucleic acids to produce the fusion polypeptide, which may then be recovered in a biologically active form. As used herein, a biologically active form includes a form capable of binding to at least a VEGF family member.

[0230] In some embodiments, the host cell can be E. coli, a COS cell, a HEK 293 cell (also known simply as 293 cells) , or a Chinese hamster ovary ( “CHO” ) cell. Preferably, the host cell is a HEK 293 or CHO cell.

[0231] A non-limiting example is the plasmid pcDNA3.4, which is suitable to be used in a mammalian host cell, such as the CHO cell. The plasmid pcDNA3.4 contains genes for ampicillin resistance and genes for SV40 and CMV promoters.

[0232] Vector Construction

[0233] Construction of suitable vectors containing the desired coding and control sequences employ standard ligation techniques. Isolated plasmids or DNA fragments are cleaved, tailored, and ligated in the form desired to form the plasmids required. The methods employed are not dependent on the DNA source or intended host. Cleavage is performed by treating with restriction enzyme (or enzymes) in suitable buffer.

[0234] A nucleic acid sequence substantially encoding one or more Ig-like domains of VEGFR-1, VEGFR-2, or VEGFR-3 can be produced according to the method disclosed in U.S. Patent 6,897,294.

[0235] In one aspect, nucleic acid sequences substantially encoding the Ig-like domain 2 of VEGFR-1 and the Ig-like domain 3 of VEGFR-2 are ligated in tandem in the desired order to produce a first nucleic acid construct. Nucleic acid sequences substantially encoding the Ig-like domains 1 and 2 of VEGFR-3, or the Ig-like domains 1, 2, and 3 of VEGFR-3 are ligated in tandem in the desired order to produce a second nucleic acid construct. The first and second nucleic acid construct are ligated together to produce a third nucleic acid construct. The 3’ end of the third nucleic acid construct is  then ligated to the 5’ end of a nucleic acid sequence encoding the IgG1 Fc domain to produce a fourth nucleic acid construct. A nucleic acid sequence encoding an Ang-2-binding unit is ligated to the 3’ end of the fourth nucleic acid construct. Such entire nucleic acid construct may be referred to as a chimeric nucleic acid sequence.

[0236] An entire chimeric nucleic acid sequence is then positioned in a vector which contains a promoter in the reading frame with the gene and compatible with the proposed host cell. A number of plasmids, such as those described in U.S. Patents 4,456,748; 5,460,811; 5,888,808; and 6,333,147 may be used in a production of a fusion protein of the present invention.

[0237] In one aspect, the vector system pcDNA3.4 is suitable to express a fusion protein of the present invention in a mammalian cell.

[0238] In one embodiment, a fusion protein of the present invention may be produced according to the method described in U.S. Patent 7,070,959. For example, the chimeric nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 85 and 86 are inserted into the expression vector pcDNA3.4 having the CMV promoter.

[0239] In one embodiment, CHO cells are transfected with pcDNA3.4 / SEQ ID NOs: 85 and 86. The fusion protein obtained from the CHO cells may be purified and characterized by binding assay, as described in U.S. Patent 7,070,959.

[0240] Similarly, a nucleic acid molecule encoding another multispecific fusion protein described herein above may be produced by ligating nucleic acid sequences encoding the various desired ligand-binding units in a desired order and then inserting into the expression vector pcDNA3.4. CHO cells are transfected with such vector and grown. Antibody fusion proteins obtained from these CHO cells may be similarly purified and characterized.

[0241] In one embodiment, a fusion protein of the present invention can bind to human Ang-2 ( “hAng-2” ) and VEGF family members with KD ≤ 10-9 M. In another embodiment, a fusion protein of the present invention can bind to hAng-2 and VEGF  family members with KD ≤ 5x10-10 M. In still another embodiment, a fusion protein of the present invention can bind to hAng-2 and VEGF family members with KD ≤ 10-10 M.

[0242] In one aspect, the present invention provides compounds, compositions, and methods for treating or controlling a disease, condition, or disorder having etiology in at least one of aberrant angiogenesis, increased vascular permeability, and inflammation.

[0243] In another aspect, the present invention provides a method for treating or controlling at least an ocular or systemic disease, condition, or disorder, in a subject, which has etiology in at least one of aberrant angiogenesis, increased vascular permeability, and inflammation. The method comprises administering to a subject in need of such treating or controlling a composition comprising a multispecific fusion protein herein disclosed. Non-limiting embodiments of such a fusion protein comprise amino acid sequences listed in SEQ ID NOs: 24-52.

[0244] In still another aspect, the present invention provides a composition for use to treat or control at least an ocular or systemic disease, condition, or disorder, in a subject, which has etiology in at least one of aberrant angiogenesis, increased vascular permeability, and inflammation, wherein composition comprises a multispecific fusion protein herein disclosed. Non-limiting embodiments of such a fusion protein comprise amino acid sequences listed in SEQ ID NOs: 24-52.

[0245] In still another aspect, the present invention provides a use of a multispecific fusion protein herein disclosed for the preparation of a pharmaceutical composition or a medicament for the treatment or control of at least an ocular or systemic disease, condition, or disorder, in a subject, which has etiology in at least one of aberrant angiogenesis, increased vascular permeability, and inflammation. Non-limiting embodiments of such a fusion protein have amino acid sequences listed in SEQ ID NOs: 24-52.

[0246] In still another aspect, said ocular disease, condition, or disorder is selected from the group consisting of: macular edema resulting from diabetes, uveitis, central and branch retinal vein occlusion, choroidal neovascularization, neovascular age-related macular degeneration (wet age-related macular degeneration) , polypoidal choroidal  vasculopathy ( “PCV” ) , myopic choroidal neovascularization, vascular leak, non-proliferative and proliferative diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, corneal neovascularization, corneal inflammation, and neovascular glaucoma.

[0247] In one embodiment, the subject is administered with a dose of about 25-8000 micrograms of the fusion protein. In another embodiment, the subject is administered with a dose of about 50-8000, about 100-8000, about 500-8000, about 1000-8000, about 2000-8000, about 50-6000, about 50-5000, about 50-4000, about 50-3000, about 50-2000, or about 50-1000 micrograms of the fusion protein.

[0248] In still another aspect, the composition comprising the fusion protein is in the form of an eye drop or an ocular injection (such as intravitreal, intracameral, peri-orbital, subtenon, subretinal, or suprachoroidal injection) . Such a composition comprises an ophthalmic composition. A fusion protein of the present invention may also be incorporated in a medical device that is implantable into or near a diseased tissue.

[0249] In one embodiment, the present invention provides a method for treating or controlling, or a composition for use to treat or control, an anterior-segment disease, condition, or disorder; such as corneal neovascularization, corneal inflammation, or neovascular glaucoma. The composition comprising the fusion protein may be in the form of an eye drop or intracameral or subconjunctival injection. In another embodiment, the present invention provides a method or composition for treating or controlling a posterior-segment disease, condition, or disorder; such as choroidal neovascularization, neovascular age-related macular degeneration (wet age-related macular degeneration) , polypoidal choroidal vasculopathy ( “PCV” ) , myopic choroidal neovascularization, vascular leak, macular edema resulting from diabetes, uveitis, central and branch retinal vein occlusion, non-proliferative and proliferative diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity. In this case, the composition comprising the fusion protein may be administered in the form of an intravitreal injection.

[0250] In yet another aspect, an eye drop is administered to the subject at least once per day, at least once per week, or at least once per month until the disease, condition, or disorder is substantially treated, controlled, or ameliorated.

[0251] In yet another aspect, the composition is administered via sustained drug release to the subject for a period of at least one month, at least two months, at least three months, or at least six months.

[0252] In still another aspect, an intravitreal injection or an injection into, or near, a diseased tissue is administered to the subject according to a regimen recommended by a medical practitioner for a particular patient. For example, an injection may be administered at least once per month, at least once every two months, at least once every three months, at least once every four months or at least once every six months until the disease, condition, or disorder is substantially treated or controlled. In one embodiment, treatment may be administered more frequently at the beginning, and then less frequently after a period of time. Such period of time may be determined by a medical practitioner.

[0253] The concentration of a fusion protein of the present invention in such an ophthalmic composition can be in the range from about 0.1 to about 200 mg / ml (or, alternatively, from about 0.25 to about 200 mg / ml, or from about 0.25 to about 160 mg / ml, or from about 0.5 to about 100 mg / ml, or from about 0.25 to about 80 mg / ml, or from about 0.5 to about 200 mg / ml, or from about 0.5 to about 160 mg / ml, or from about 0.5 to about 100 mg / ml, or from about 0.5 to about 80 mg / ml, or from about 1 to about 200 mg / ml, or from 1 to about 160 mg / ml, or from about 0.5 to about 100 mg / ml, or from about 1 to about 80 mg / ml) .

[0254] In still another aspect, a method for preparing a composition of the present invention comprises combining: (a) an amount of a multispecific fusion protein of the present invention; and (b) a physiologically acceptable carrier.

[0255] In one embodiment, such a physiologically acceptable carrier can be a sterile saline solution or a physiologically acceptable buffer. In another embodiment, such a carrier comprises a hydrophobic medium, such as a pharmaceutically acceptable oil. In still another embodiment, such a carrier comprises an emulsion of a hydrophobic material and water. In yet another embodiment, a fusion protein of the present invention may be associated or linked with a physiologically acceptable high-molecular weight material to provide a long circulation time.

[0256] Physiologically acceptable buffers include, but are not limited to, a phosphate buffer or a Tris-HCl buffer (comprising tris (hydroxymethyl) aminomethane and HCl) . For example, a Tris-HCl buffer having pH of 7.4 comprises 3 g / l of tris (hydroxymethyl) aminomethane and 0.76 g / l of HCl. In yet another aspect, the buffer is 10X phosphate buffer saline ( “PBS” ) or 5X PBS solution. Non-limiting examples of buffers used for injectable compositions comprising biologics include phosphate, citric acid, acetic acid, tromethamine, histidine, arginine, gluconic acid, lactic acid, tartaric acid, aspartic acid, and glutamic acid.

[0257] Other buffers also may be found suitable or desirable in some circumstances, such as buffers based on HEPES (N- {2-hydroxyethyl} peperazine-N’ - {2-ethanesulfonic acid} ) having pKa of 7.5 at 25 ℃ and pH in the range of 6.8-8.2; BES (N, N-bis {2-hydroxyethyl} 2-aminoethanesulfonic acid) having pKa of 7.1 at 25℃ and pH in the range of 6.4-7.8; MOPS (3- {N-morpholino} propanesulfonic acid) having pKa of 7.2 at 25℃ and pH in the range from of 6.5-7.9; TES (N-tris {hydroxymethyl} -methyl-2-aminoethanesulfonic acid) having pKa of 7.4 at 25℃ and pH in the range of 6.8-8.2; MOBS (4- {N-morpholino} butanesulfonic acid) having pKa of 7.6 at 25℃ and pH in the range of 6.9-8.3; DIPSO (3- (N, N-bis {2-hydroxyethyl} amino) -2-hydroxypropane)) having pKa of 7.52 at 25℃ and pH in the range of 7-8.2; TAPSO (2-hydroxy-3 {tris (hydroxymethyl) methylamino} -1-propanesulfonic acid) ) having pKa of 7.61 at 25℃ and pH in the range of 7-8.2.

[0258] In certain embodiments, a composition of the present invention is formulated in a buffer having an acidic pH, such as from about 4 to about 6.8, or alternatively, from about 5 to about 6.8. In such embodiments, the buffer capacity of the composition desirably allows the composition to come rapidly to a physiological pH after being administered into the patient.

[0259] In addition to a buffer, a composition of the present invention can comprise a material selected from the group consisting of surfactants, stabilizers, preservatives, co-solvent, humectants, emollients, chelating agents, tonicity-adjusting agents, and antioxidants.

[0260] In one aspect, any of these materials that may be used in a composition of the present invention is a physiologically acceptable material. In certain embodiments, any of these materials that may be used in a composition of the present invention is an ophthalmically or systemically acceptable material.

[0261] Water-soluble preservatives that may be employed include quaternary ammonium compounds such as benzalkonium chloride and various polyquaternium compounds. These agents may be present in individual amounts of from about 0.001 to about 2%by weight (preferably, about 0.01%to about 0.05%by weight) .

[0262] Non-limiting examples of surfactants include, but are not limited to, non-ionic surfactants, for example, polysorbates (such as polysorbate 20, polysorbate 80) , 4- (1, 1, 3, 3-tetramethylbutyl) phenol / poly (oxyethylene) polymers (such as the polymer sold under the trademark Tyloxapol) , poly (oxyethylene) -poly (oxypropylene) block copolymers, glycolic esters of fatty acids and the like, and mixtures thereof.

[0263] In one aspect, the pH of the composition is in the range from about 4 to about 8. Alternatively, the pH of the composition is in the range from about 6 to about 8, or from about 6.5 to about 8, or from about 6.5 to about 7.5.

[0264] In another aspect, the composition has a pH of about 7. Alternatively, the composition has a pH in a range from about 7 to about 7.5.

[0265] In still another aspect, the composition has a pH of about 7.4.

[0266] In yet another aspect, a composition also can comprise a viscosity-modifying compound designed to facilitate the administration of the composition into the subject or to promote the bioavailability in the subject. In still another aspect, the viscosity-modifying compound may be chosen so that the composition is not readily dispersed after being administered into an environment of an eye. Such compounds may enhance the viscosity of the composition, and include, but are not limited to: monomeric polyols, such as, glycerol, propylene glycol, ethylene glycol; polymeric polyols, such as, polyethylene glycol; various polymers of the cellulose family, such as hydroxypropylmethyl cellulose ( “HPMC” ) , carboxymethyl cellulose ( “CMC” ) sodium, hydroxypropyl cellulose ( “HPC” ) ;  polysaccharides, such as hyaluronic acid and its salts, chondroitin sulfate and its salts, dextrans, such as, dextran 70; water soluble proteins, such as gelatin; vinyl polymers, such as, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, povidone; carbomers, such as carbomer 934P, carbomer 941, carbomer 940, or carbomer 974P; and acrylic acid polymers. In general, a desired viscosity can be in the range from about 1 to about 400 centipoises ( “cps” ) or mPa. s.

[0267] Non-limiting examples of chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid ( “EDTA” ) , diethylenetriaminepentakis (methylphosphonic acid) , etidronic acid, tetrasodium salt of etidronic acid (also known as “HAP” ) .

[0268] While the buffer itself is a “tonicity-adjusting agent” and a “pH-adjusting agent” that broadly maintains the pharmaceutical formulation at a particular ion concentration and pH, additional “tonicity-adjusting agents” can be added to adjust the final tonicity of the solution. Such tonicity-adjusting agents are well known to those of skill in the art and include, but are not limited to, mannitol, sorbitol, dextrose, sucrose, urea, propylene glycol, and glycerin. Also, various salts, including halide salts of a monovalent cation (e.g., NaCl or KCl) can be utilized. Typically, the tonicity of a formulation of the present invention is in the range from about 200 to 400 mOsm / kg. Alternatively, the tonicity of a formulation of the present invention is in the range from about 220 to 400 mOsm / kg, or from about 220 to 350 mOsm / kg, or from about 220 to 300 mOsm / kg, or from about 250 to 350 mOsm / kg.

[0269] Non-limiting examples of anti-oxidants include ascorbic acid (vitamin C) and its salts and esters; tocopherols (such as α-tocopherol) and tocotrienols (vitamin E) , and their salts and esters (such as vitamin E TGPS (D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate) ) ; glutathione; lipoic acid; uric acid; butylated hydroxyanisole ( “BHA” ) ; butylated hydroxytoluene ( “BHT” ) ; tertiary butylhydroquinone ( “TBHQ” ) ; and polyphenolic anti-oxidants (such as gallic acid, cinnanmic acid, flavonoids, and their salts, esters, and derivatives) .

[0270] Non-limiting examples of stabilizers includes sucrose, mannitol, sorbitol, and trehalose.

[0271] It should be understood that the proportions of the various components or mixtures may be adjusted for the appropriate circumstances.

[0272] In another aspect, a fusion protein of the present invention and appropriate amounts of one or more desired excipients are incorporated into a formulation for topical administration or injection to a portion of the eye, such as the anterior or posterior segment, or the vitreous humor. An injectable formulation can desirably comprise a carrier that provides a sustained-release of the active ingredients, such as for a period longer than about 1 week (or longer than about 1, 2, 3, 4, 5, or 6 months) . In certain embodiments, a fusion protein of the present invention is included in a delivery device for sustained release of the active ingredients over a long period of time, such as 4, 5, 6 months or longer. An example of such delivery device is described in U.S. Patents 8,399,006 and 9,417,238.

[0273] In still another aspect, a composition comprising a fusion protein of the present invention and desired excipients is lyophilized and is reconstituted with a physiologically acceptable liquid carrier substantially immediately before administration to a subject.

[0274] In one embodiment, a compound or composition of the present invention can be injected with a fine-gauge needle, such as 25-35 gauge. Typically, an amount from about 25 μl to about 100 μl of a composition comprising about 25-4000 μg of a fusion protein of the present invention is administered into a patient. In one aspect, the antibody fusion protein has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12-29, 38-41, and 57-62, and conservatively modified variants thereof. A concentration of such antibody fusion protein is selected from the ranges disclosed above. Other antibody fusion proteins comprising various Ang-2-and VEGF-binding units as disclosed herein can also be incorporated into compositions disclosed herein.

[0275] In still another aspect, a fusion protein of the present invention is incorporated into an ophthalmic device that comprises a biodegradable material, and the device is implanted into a posterior-segment tissue of a subject to provide a long-term (e.g., longer than about 1 week, or longer than about 1, 2, 3, 4, 5, or 6 months) treatment or control of an angiogenic disease, condition, or disorder. Such a device may be implanted by a  skilled physician in the subject’s ocular or periocular tissue. Non-limiting examples of ophthalmic implant systems or devices for the sustained-release of an active ingredient are disclosed in U.S. Patents 5,378,475; 5,773,019; 5,902,598; 6,001,386; 6,051,576; and 6,726,918.

[0276] In still another aspect, a method for treating or controlling an ophthalmic angiogenic disease, condition, or disorder comprises administering a composition comprising a fusion protein of the present invention to a subject in need thereof.

[0277] In still another aspect, a method for treating or controlling an ophthalmic angiogenic disease, condition, or disorder comprises administering a composition comprising a fusion protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 24-52 and conservatively modified variants thereof to a subject in need of such treatment or control. Other fusion proteins comprising various Ang-2-and components of VEGF-binding units as disclosed herein can also be used in such method.

[0278] In still another aspect, a method for treating or controlling an ophthalmic angiogenic disease, condition, or disorder having an etiology in aberrant angiogenesis in the posterior segment of an eye comprises intravitreally injecting a composition comprising a fusion protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 24-52 and conservatively modified variants thereof.

[0279] In another embodiment, such disease, condition, or disorder is selected from the group consisting of: macular edema resulting from diabetes, uveitis, central and branch retinal vein occlusion, choroidal neovascularization including neovascular age-related macular degeneration (wet age-related macular degeneration) , polypoidal choroidal vasculopathy (PCV) and myopic choroidal neovascular degeneration, vascular leak, non-proliferative and proliferative diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, corneal neovascularization, corneal inflammation, and neovascular glaucoma.

[0280] In yet another aspect, a composition of the present invention is administered once a week, once a month, once a year, twice a year, three times a year, four times a year,  or at a suitable frequency that is determined to be appropriate for treating, controlling, or ameliorating an anterior-segment inflammatory disease, condition, or disorder.

[0281] In still another aspect, a fusion protein of the present invention can also be used for the treatment or control of tumors, systemic inflammatory diseases or conditions, or autoimmune diseases such as arthritis. Such treatment or control may be effected by, for example, systemic administration. Dosages and regimens for treating or controlling such diseases or conditions may be determined or recommended for the particular disease or condition by medical practitioners.

[0282] EXAMPLE 1: Expression and Purification of Fusion Proteins of the Present Invention

[0283] Fusion proteins of the present invention were successfully expressed in Chinese hamster ovarian ( “CHO” ) cells. With one round of purification by Protein A affinity chromatography, purities about 95%or higher were achieved for most proteins produced.

[0284] cDNAs encoding the amino acid sequences of fusion proteins identified in Table 1 were synthetized, and an expressing vector based on the circular pcDNA3.4 vector system was constructed for each cDNA. The expression vector was used to transiently transfect CHO cells with chemically defined culture media. The produced antibody proteins were purified by Protein A affinity chromatography and then subjected to 0.2μm sterile filtration to get the bulk of high purity. Analysis by size exclusion chromatography (SEC-HPLC) showed a purity ranged from 94.4%to 100%after one round of purification by Protein A affinity chromatography. See Fig. 11A-11D.

[0285] EXAMPLE 2: ELISA Binding Affinities for Human VEGF-A165

[0286] ELISA assay was performed using 96-well plates coated with recombinant human VEGF-A165 (4 μg / ml, 50μl / well) at +4℃ for 16 hours. After non-specific blocking using 1%BSA at 25℃ for 1 hour, a series of dilutions of test antibodies ( “Abs” ) were added into the coated wells and incubated at 25℃ for 1 hour. The bound Abs were detected using a secondary Ab (goat anti-human IgG1-Fc) conjugated with HRP followed by OD450 reading. The binding affinities of EB-110 and EB-111 series of molecules for  human VEGF-A165 are at picomolar or sub-nanomolar scales. Aflibercept is a human Fc fusion protein that binds to VEGF-A, VEGF-B and PlGF. See Fig. 12A-12C.

[0287] EXAMPLE 3: ELISA Binding Affinities for Human VEGF-B167

[0288] The same ELISA procedure was performed with human VEGF-B167. The binding affinities of EB-110 series of molecules for human VEGF-B167 are at picomolar scales. Aflibercept is a human Fc fusion protein that binds to VEGF-A, VEGF-B and PlGF. See Fig. 13.

[0289] EXAMPLE 4: ELISA Binding Affinities for Human PlGF

[0290] The same ELISA procedure was performed with human PlGF. The binding affinities of most EB-110 series of molecules for human PlGF are at sub-nanomolar scales. Aflibercept is a human Fc fusion protein that binds to VEGF-A, VEGF-B and PlGF. See Fig. 14.

[0291] EXAMPLE 5: ELISA Binding Affinities for Human VEGF-C

[0292] The same ELISA procedure was performed with human VEGF-C. The binding affinities of most EB-110 and EB-111 series of molecules for human VEGF-C are at sub-nanomolar scales. Aflibercept is a human Fc fusion protein that binds to VEGF-A, VEGF-B, and PlGF, but not VEGF-C. rhVEGFR-3, a recombinant human Fc fusion protein containing the extracellular domain (Met 1-Ile 776) of human VEGFR-3, was used as a positive control. See Fig. 15A-15C.

[0293] EXAMPLE 6: ELISA Binding Affinities for Human Ang-2

[0294] The same ELISA procedure was performed with recombinant human Ang-2. The binding affinities of EB-110 and EB-111 series of molecules for human Ang-2 are at picomolar or sub-nanomolar scales, more potent than faricimab and comparable to nesvacumab. Faricimab is a bispecific antibody against VEGF-A and Ang-2.

[0295] Nesvacumab is a mAb against Ang-2. See Fig. 16A-16C.

[0296] EXAMPLE 7: ELISA Binding Affinities for Human Ang-1

[0297] The same ELISA procedure was performed with recombinant human Ang-1. The binding of some EB-110 and EB-111 series of molecules including EB-110BI-L10C, EB-110BI-L7C1, and EB-110BI-L7C2 to human Ang-1 are low, with an affinity similar to or weaker than faricimab and nesvacumab. Faricimab is a bispecific antibody against VEGF-A and Ang-2. Nesvacumab is a mAb against Ang-2. See Fig. 17A and 17B.

[0298] EXAMPLE 8: SPR Biacore Binding Affinity Assays

[0299] SPR Biacore assay was performed at 25℃ with HBS-EP+ as a running buffer. The assay was performed by immobilization of the anti-human IgG (Fc) antibody onto the CM5 sensor chip surface and determined the level of ligand immobilization. The amount of anti-Fc antibody coupling onto the CM5 sensor chip was about 7,000～14,000 response unit (RU) . Test antibodies were injected over the surface of Series S Sensor Chip CM5 as Capture. The analytes (target proteins) were diluted with running buffer into different concentrations and injected over the sensor surface as the association phase for affinity and kinetics measurements. The 1: 1 binding model was used to measure the binding affinity and / or kinetics.

[0300] SPR Biacore assays indicate that EB-110 and EB-111 series of molecules bind to target proteins at picomolar or sub-nanomolar scales, with binding affinities comparable or better than their comparators in most cases (Table 3) . Aflibercept is a clinical stage human FC fusion that binds to VEGF-A, VEGF-B and PlGF. Faricimab is the first FDA approved bispecific antibody that binds to VEGF-A and Ang-2 for the treatment of neovascular age-related macular degeneration (nAMD) and diabetic macular edema (DME) .

[0301] Table 3

[0302] Measurements binding affinities for target proteins by SPR Biacore assays

[0303] Rmax: Maximum response correlated with ligand density. RU: Resonance unit. SPR: surface plasmon resonance.

[0304] EVALUATION OF IN VITRO CELL-BASED FUNCTIONS OF FUSION PROTEINS OF THE PRESENT INVENTION

[0305] EXAMPLE 9: Inhibition of VEGF-A165-Mediated VEGFR-2 Signaling

[0306] The effect of representative EB-110 and EB-111 series of molecules on inhibiting VEGF-A165-mediated VEGFR-2 signaling was studied using an engineered HEK-293 cell line, in which the firefly luciferase gene is expressed under the control of nuclear factor activated T cell response elements (VEGFR-2-NF-AT) . Aflibercept was used as a comparator. The results indicate that EB-110 and EB-111 series of molecules are comparable to aflibercept in dose-dependent inhibition of VEGF-A165-stimulated VEGFR-2 signaling. See Fig. 18A-18C.

[0307] Serial dilutions of EB-110 and EB-111 series of molecules and aflibercept were incubated with 70 ng / ml of human VEGF-A165 at room temperature for 30 minutes, then VEGFR-2 luciferase reporter cells were added into each well to study the effects of test materials on inhibiting VEGF-A165 mediated VEGFR-2 signaling. EB-110 and EB-111 series of molecules are comparable to aflibercept in inhibiting VEGF-A165-stimulated VEGFR-2 signaling in a dose response manner as indicated by their IC50 values. Aflibercept is a human Fc fusion protein containing VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3 for inhibition of VEGF-A, VEGF-B, and PlGF.

[0308] EXAMPLE 10: Inhibition VEGFR-2 Signaling Mediated by VEGF-A165 + VEGF-C

[0309] The effect of representative EB-110 and EB-111 series of molecules on inhibiting VEGF-A165 + VEGF-C mediated VEGFR-2 signaling was studied using the firefly luciferase reporter cell line as described above. Aflibercept was used as a comparator. See Fig. 19A-19D.

[0310] Serial dilutions of EB-110 and EB-111 series of molecules and aflibercept were incubated with a cocktail solution containing 30 ng / ml of human VEGF-A165 and 25 ng / ml of human VEGF-C at room temperature for 30 minutes, then VEGFR-2 luciferase reporter cells were added into each well to study the effects of test materials on inhibiting VEGF-A165 + VEGF-C mediated VEGFR-2 signaling. The results indicate that EB-110  and EB-111 series of molecules showed potently dose-dependent inhibition of VEGFR-2 signaling stimulated by VEGF-A165 + VEGF-C as indicated by their IC50 values, whereas aflibercept showed incomplete inhibition of VEGF-A165 + VEGF-C mediated VEGFR-2 signaling. Aflibercept is a human Fc fusion protein containing VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3 for inhibition of VEGF-A, VEGF-B, and PlGF, but not VEGF-C.

[0311] EXAMPLE 11: Inhibition of Ang-2 Binding to Tie-2 Receptor

[0312] The effects of EB-110 and EB-111 series of molecules on inhibiting Ang-2 binding to Tie-2 receptor was studied by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis using engineered HEK-293 cells that overexpress human Tie-2 receptor, with faricimab and nesvacumab as two comparators. Faricimab is a clinical stage bispecific antibody against human VEGF-A and Ang-2 for retinal vascular diseases including nAMD, DME, and macular edema due to retinal vein occlusion. Nesvascumab is an investigational mAb against Ang-2. Serial dilutions of test antibodies were incubated with 200 ng / ml of human Ang-2 tagged with IgG1-Fc at 4℃ for 60 minutes, then Tie-2-expressing HEK-293 cells were added into each well to study the effects of test antibodies on blocking Ang-2 binding to Tie-2 receptor via FACS analysis. The results indicate that EB-110 and EB-111 series of molecules, in a dose response manner, showed a similar effect to nesvacumab and more potent than faricimab in blocking Ang-2 binding to Tie-2 receptor. See Figure 20A-20C.

[0313] EXAMPLE 12: Inhibition of Ang-1 Binding to Tie-2 Receptor

[0314] The effects of EB-110 and EB-111 series of molecules on inhibition of Ang-1 binding to Tie-2 receptor was studied by FACS analysis using engineered HEK-293 cells that overexpress human Tie-2 (hTie-2) receptor, with faricimab and nesvascumab as two comparators. Serial dilutions of EB-110 and EB-111 series of molecules, faricimab, nesvascumab, and hTie-2 were incubated with 2 μg / ml of human Ang-1 tagged with IgG1-Fc at 4℃ for 60 minutes, then Tie-2-expressing cells were added into each well to study the effects of test materials on blocking Ang-1 binding to Tie-2 receptor. Recombinant hTie-2 was used as a positive control in this assay. EB-110 and EB-111 series of molecules showed no or low effects on blocking the binding of Ang-1 to Tie-2 receptor. See Fig. 21A-21B.

[0315] DRUG DEVELOPABILITY ASSESSMENTS OF FUSION PROTEINS OF THE PRESENT INVENTION

[0316] EXAMPLE 13: Drug Developability Assessments of EB-110BI-L7C1

[0317] EB-110BI-L7C1 was assessed for drug developability after formulating it in a buffer solution containing 40 mM NaCl, 0.08%Na2HPO4, 0.127%NaH2OP4, 5%sucrose, 0.03%Tween-20, with a final pH 7.2. The relationship between temperature and antibody aggregation was studied by dynamic light scattering (DLS) analysis. The relationship between temperature and antibody unfolding was studied by differential scanning fluorimetry (DSF) . Changes in protein concentrations under test conditions were studied by measuring the UV absorbance at 280nm. Antibody purity was analyzed by size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography (SEC-HPLC) .

[0318] Table 4

[0319] DLS and DSF Measurements of EB-110BI-L7C1

[0320] Table 5

[0321] EB-110BI-L7C1 stability after repeatedly freezing-thawing for 3 and 5 cycles

[0322] Table 6

[0323] EB-110BI-L7C1 stability after placing at +25℃ and +40℃ for 7, 14 and 28 days

[0324] EXAMPLE 14: Drug Developability Assessments of EB-111BIb1 and EB-111BId1

[0325] EB-111BIb1 and EB-111BId1 were assessed for drug developability after formulating it in a buffer solution containing 40 mM NaCl, 0.08%Na2HPO4, 0.127%NaH2OP4, 5%sucrose, 0.03%Tween-20, with a final pH 7.5 and 6.2, respectively. DLS, DSF, protein concentration and purity were analyzed as described above. Fractionations of charge variants of EB-111BIb1 and EB-111BId1 formulated in the two buffer solutions were analyzed by imaged capillary isoelectric focusing (icIEF) . See Fig. 24A-24D.

[0326] Table 7

[0327] DLS and DSF measurements of EB-111BIb1 and EB-111BId1 in two buffer solutions

[0328] Buffer A: 40 mM NaCl, 10 mM PB that consists of 0.08%Na2HPO4 and 0.127%NaH2OP4, 5%sucrose, 0.03%Tween-20, with a final pH 7.5.

[0329] Buffer B: 40 mM NaCl, 10 mM PB that consists of 0.08%Na2HPO4 and 0.127%NaH2OP4, 5%sucrose, 0.03%Tween-20, with a final pH 6.2.

[0330] Table 8

[0331] Assessments of EB-111BIb1 and EB-111BId1 stability after placing them at +25℃ and +40℃ for 14 and 28 days

[0332] EXAMPLE 15: Functional Evaluations of EB-110BI-L7C1, EB-111BIb1 and EB-111BId1 after Placing at Various Conditions for Drug Developability Assessments

[0333] After placing EB-110BI-L7C1, EB-111BIb1 and EB-111BId1 at test conditions for 14 and 28 days, their effects on inhibition of VEGFR-2 signaling under stimulation by VEGF-A alone and VEGF-A+ VEGF-C were studied as described in EXAMPLES 9 and 10, respectively. EB-110BI-L7C1, EB-111BIb1 and EB-111BId1 remained at fully functional potency in inhibition of VEGF-A and VEGF-C mediated VEGF-R2 signaling, whereas aflibercept effectively inhibited VEGF-A mediated VEGF-R2 signaling but showed incomplete inhibition of VEGF-A + VEGF-C mediated VEGF-R2 signaling. See Fig. 22, 25A-25B, 26A-26B.

[0334] After placing EB-110BI-L7C1, EB-111BIb1 and EB-111BId1 at test conditions for 14 and 28 days, their effects on inhibition of Ang-2 binding to human Tie-2 receptor were studied as described in EXAMPLE 11. EB-110BI-L7C1, EB-111BIb1 and EB-111BId1 remained at fully functional potency in inhibition of human Ang-2 binding to Tie-2 receptor. See Fig. 23, 27A-27B.

[0335] PHARMACOLOGY STUDIES IN TWO ANIMAL MODELS

[0336] EXAMPLE 16: Effect of a Single Dose intravitreal (IVT) Injection of EB-110 and EB-111 Series of Molecules on Vascular Leakage from PRN in Rabbits

[0337] EB-111BId, EB-110BI-L7C1, EB-111BIb1 and EB-111BId1 were formulated in phosphate buffer solutions for IVT injection to study their efficacy in inhibition of neovascular leakage from pre-retinal neovascularization (PRN) in Dutch belted rabbits as described below. Aflibercept and faricimab were used as two clinical comparators in the rabbit model.

[0338] PRN was induced by IVT injection of DL-α-aminoadipic acid (DL-AAA, 80mM, 50 μl / eye) in Dutch belted rabbits. After confirmation of the development of PRN eight weeks post DL-AAA injection, each eye received a single IVT injection of 50μl of vehicle or test antibodies (0.5 mg / eye, n=6 eyes per group) to study their effect on inhibiting vascular leakage from PRN. Fundus fluorescein angiography (FFA) was performed to monitor changes of vascular leakage after treatment. As demonstrated, all test antibodies effectively inhibited vascular leakage at 7 days after treatment, whereas eyes receiving vehicle remained relatively un-changed when comparing the status of vascular leakage before vs 7 days after treatment. See Fig. 28.

[0339] EXAMPLE 17: Effect of a Single-Dose IVT Injection of EB-110BI-L7C1 and EB-111BId1 on Vascular Leakage in Laser-Induced Choroidal Neovascularization (CNV) in Monkeys

[0340] The effects of EB-110BI-L7C1 and EB-111BId1 on inhibition of vascular leakage were studied in laser-induced CNV in cynomolgus monkeys, with clinical formats of aflibercept and faricimab as two comparators. The development of CNV was confirmed by FFA after twelve days of laser photocoagulation. Two days later (fourteen days after laser photocoagulation) , each eye received a single IVT injection of 50μl of vehicle, 0.5 mg / eye of aflibercept, faricimab, EB-110BI-L7C1, or EB-111BId1. The above treatment was repeated with the second dose of IVT injection 4 weeks after the first dose of treatment. Color fundus photography and FFA were performed to monitor changes in the fundus and vascular leakage 1, 2, 4, 6, and 8 weeks after treatment. The results indicate that EB-110BI-L7C1 or EB-111BId1 effectively inhibited CNV-related vascular leakage, with an apparent efficacy comparable to aflibercept and faricimab (see  Fig. 29) . Persistent vascular leakage from CNV lesions was observed in vehicle treated eyes (n=6) . In contrast, eyes receiving aflibercept, faricimab, EB-110BI-L7C1 or EB-111BId1 (n=6-8 / group) showed nearly complete inhibition of vascular leakage across the study. By 8 weeks after treatment, fundus photography showed no noticeable inflammation in the posterior vitreous and retina after two doses of IVT injection of vehicle, aflibercept, faricimab, EB-110BI-L7C1, or EB-111BId1 (see Fig. 29, last row of fundus images) .

[0341] Figure 30 shows the results of the quantitative analysis of the averaged areas of SHRM in laser spots showing Grades III and IV CNV lesions before treatment and their changes overtime after treatment. Data were normalized to pre-dosing level in each group (%) for comparisons among 5 groups at each time point. Eyes receiving vehicle developed persistent SHRM pre-dosing, and 1, 2, 4, 6 and 8 weeks after IVT injection. In contrast, EB-110BI-L7C1 and EB-111BId1 inhibited the development of SHRM, with an efficacy comparable to aflibercept and faricimab.

[0342] AMINO ACID AND NUCLEIC ACID SEQUENCE LISTING

[0343] The contents of the electronic sequence listing (EB-110 &EB-111 Sequence Listing (1) . xml; Size: 204 KB; and Date of Creation: July 19, 2024) is herein incorporated by reference in its entirety.

[0344] While specific embodiments of the present invention have been described in the foregoing, it will be appreciated by those skilled in the art that many equivalents, modifications, substitutions, and variations may be made thereto without departing from the spirit and scope of the invention as defined in the appended claims.

Claims

1.A fusion protein or an antigen-binding fragment or domain thereof comprising a first VEGF-binding unit and a second VEGF-binding unit; wherein the first VEGF-binding unit comprises at least an Ig-like domain of one or more VEGF receptors; the second VEGF-binding unit comprises: (1) at least another Ig-like domain of one or more VEGF receptors, which is different from said at least an Ig-like domain included in the first VEGF-binding unit, or (2) a VEGF-C antibody; and wherein when each of the first and second VEGF-binding units comprises an Ig-like domain of a VEGF receptor, the fusion protein further comprises an Ang-2-binding unit.2.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1; wherein when the second VEGF-binding unit comprises a VEGF-C antibody, the fusion protein (a) does not comprise, or is devoid of, an Ang-2 -binding unit, or (b) further comprises an Ang-2-binding unit; and the first VEGF-binding unit, the second VEGF-binding unit, and the Ang-2-binding unit, when present, are linked together.3.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 2; wherein said first VEGF-binding unit comprises a plurality of Ig-like domains of VEGFR-1 and VEGFR-2; and said second VEGF-binding unit comprises a plurality of Ig-like domains of VEGFR-3.4.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 3; wherein said plurality of Ig-like domains of VEGFR-1 and VEGFR-2 comprises VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3; said plurality of Ig-like domains of VEGFR-3 comprise VEGFR-3-D1D2 or VEGFR-3-D1D2D3.5.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 3 or 4; wherein the Ang-2-binding unit comprises an Ang-2-binding polypeptide or an Ang-2 sdAb.6.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 5, further comprising an IgG1 Fc domain; wherein an N-terminus of the IgG1 Fc domain is  linked to a free C-terminus of the first or second VEGF-binding unit, and the N-terminus of the Ang-2-binding unit is linked to the C-terminus of the IgG1 Fc domain.7.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 2; wherein said first VEGF-binding unit comprises a plurality of Ig-like domains of VEGFR-1 and VEGFR-2 linked in series; said second VEGF-binding unit comprises a VEGF-C antibody comprising two heavy chains and two light chains; and N-terminus of a heavy chain or a light chain is linked to a C-terminus of the first VEGF-binding unit.8.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 7, further comprising an Ang-2-binding unit; wherein an N-terminus of the Ang-2-binding unit is linked to the C-terminus of a heavy chain.9.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 8; wherein the plurality of Ig-like domains of VEGFR-1 and VEGFR-2 comprises VEGFR-1-D2 and VEGFR-2-D3, and said Ang-2-binding unit comprises an Ang-2-binding polypeptide or an Ang-2 sdAb.10.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1, comprising a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 24-32.11.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 1, comprising a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 24-32.12.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 2, comprising polypeptides having a pair of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 33 and 34, 35 and 36, 37 and 38, 39 and 40, 41 and 42, 43 and 44, 45 and 46, 47 and 48, 49 and 50, and 51 and 52.13.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 2, comprising polypeptides having a pair of amino acid sequences that is at least 95%identical to a pair of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID  NOs: 33 and 34, 35 and 36, 37 and 38, 39 and 40, 41 and 42, 43 and 44, 45 and 46, 47 and 48, 49 and 50, and 51 and 52.14.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 2; wherein said fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof is capable of binding to VEGF-C and at least a VEGF family member selected from the group consisting of VEGF-A, VEGF-B, PlGF, and combinations thereof with an equilibrium dissociation constant (KD) in the range from about 1x10-6 M to about 1x10-12 M or from about 1x10-8 M to about 1x10-12 M.15.The fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of claim 14; wherein when an Ang-2-binding unit is present, said fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof is further capable of binding to Ang-2 with an equilibrium dissociation constant (KD) in the range from about 1x10-6 M to about 1x10-12 M or from about 1x10-8 M to about 1x10-12 M.16.An isolated nucleic acid molecule encoding a fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-15.17.The isolated nucleic acid molecule of claim 16, wherein said nucleic acid molecule comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 62-104.18.An expression vector comprising the nucleic acid molecule of claim 16 or 17.19.The expression vector of claim 18, comprising said nucleic molecule operatively linked to an expression control sequence.20.A host-vector system comprising the expression vector of claim 19 in a host cell.21.A method of producing a substantially purified fusion protein, which method comprises: (a) growing cells of the host-vector system of claim 20 under conditions permitting production of the fusion protein; and (b) recovering the fusion protein to produce a recovered fusion protein; and (c) purifying said recovered fusion protein to produce the substantially purified fusion protein.22.A method for treating or controlling at least a disease, condition, or disorder, in a subject in need thereof, which has etiology in at least one of aberrant angiogenesis, increased vascular permeability, and inflammation; wherein said method comprises administering to said subject an amount of a composition comprising a fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-15.23.The method of claim 22; wherein said at least a disease, condition, or disorder is selected from the group consisting of: macular edema resulting from diabetes, uveitis, central and branch retinal vein occlusion, choroidal neovascularization, neovascular age-related macular degeneration, polypoidal choroidal vasculopathy, myopic choroidal neovascularization, vascular leak, non-proliferative and proliferative diabetic retinopathy, corneal neovascularization, corneal inflammation, myopic neovascularization, and neovascular glaucoma.24.The method of claim 23; wherein the subject is administered with a dose of about 25-8000 micrograms of the fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof.25.The method of claim 24; wherein the composition is administered to the subject as an eye drop, a punctal plug, intracameral, retrobulbar, subconjunctival, peribulbar, subtenon, juxta-scleral, trans-scleral, intravitreal, subretinal, or suprachoroidal injection.26.The method of claim 24; wherein the composition is administered to the subject for a period of at least one month if intraocularly administered.27.The method of claim 24; wherein the composition is administered to the subject at a frequency of at least once per month if intraocularly administered.28.A method for treating or controlling at least a systemic disease, condition, or disorder, in a subject in need thereof, which has etiology in at least on of aberrant angiogenesis, increased vascular permeability, and inflammation; wherein said method comprises administering to said subject an amount of a composition of a fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-15.29.The method of claim 28; wherein said at least a systemic disease, condition, or disorder involves tumor growth, tumor metastasis, a combination of tumor growth and metastasis, atherosclerosis, and psoriasis.30.A pharmaceutical composition for use to treat or control at least a disease, condition, or disorder, which has etiology in at least one of aberrant angiogenesis, increased vascular permeability, and inflammation; wherein said composition comprises a fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-15.31.The pharmaceutical composition of claim 30, wherein said at least a disease, condition, or disorder is selected from the group consisting of macular edema resulting from diabetes, uveitis, central and branch retinal vein occlusion, choroidal neovascularization, neovascular age-related macular degeneration, polypoidal choroidal vasculopathy, myopic choroidal neovascularization, vascular leak, non-proliferative and proliferative diabetic retinopathy, corneal neovascularization, corneal inflammation, myopic neovascularization, neovascular glaucoma, tumor growth, tumor metastasis, a combination of tumor growth and metastasis, atherosclerosis, and psoriasis.32.A pharmaceutical composition comprising a fusion protein or antigen-binding fragment or domain thereof of any one of claims 1-15, and a pharmaceutically acceptable carrier.

Images