Anti-beta amyloid antibodies and uses thereof

Abstract

Deposition of N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Abeta peptides (AβpE3) play an important role in the aggregation of the amyloid-β (Aβ) protein in the brain. The N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Abeta peptides, therefore, can be a suitable target for the prevention and treatment of Alzheimer's Disease (AD). Disclosed herein are antibodies and fragments having excellent specificity to N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Abeta peptides, as well as uses of these antibodies and fragments for the prevention and treatment of AD.

Description

ANTI-BETA AMYLOID ANTIBODIES AND USES THEREOFBACKGROUND

[0001] Alzheimer’s Disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder and the leading cause of dementia. It is characterized by a gradual deterioration in cognitive function, manifesting as a decline in memory, speech, language and other thinking abilities. The pathology of AD is complicated, and numerous factors are thought to be involved in the AD initiation and progression, including the accumulation of the amyloid-β (Aβ) protein, the abnormal phosphorylation of tau protein, and the presence of aberrant inflammation. Aβaccumulation in the brain is an early hallmark of AD.

[0002] Aβ protein is produced from proteolysis of amyloid precursor protein (APP) by β-secretase and γ-secretase, resulting in Aβ (1-40) and the more amyloidogenic Aβ (1-42) . Besides Aβ peptides starting with aspartate as the first amino acid, several N-terminally truncated and modified Aβ species have been found in AD brains, such as Aβ (4–42) and Aβ (pE3–42) . Aβ (pE3–42) is formed by two steps: (1) removal of the first two N-terminal amino acids of Aβ (1-42) , and (2) dehydration of the glutamate at position 3 to pyroglutamate by glutaminyl cyclase (QC) , which leads to the properties of increased hydrophobicity, elevated peptide stability, increased aggregation propensity and resistant to enzymatic degradation. The deposits found in plaques are comprised mainly of a heterogeneous mixture of Αβ peptides.

[0003] Although Aβ (pE3–42) represents 25%of the total Aβ in senile plaques in vivo, it has been detected exclusively in the core of amyloid aggregates but not in the periphery. Its early accumulation in the deposition cascade has led to the hypothesis that Aβ (pE3–42) deposition plays a central role in initiating the aggregation of full-length Aβ. Therefore, Aβ (pE3–42) can be a suitable target for AD therapy and prevention.SUMMARY

[0004] The present disclosure, in various embodiments, provides antibodies and antigen-binding fragments having high binding affinity and selectivity to N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Abeta peptides (Aβ pE3, e.g., Aβ (pE3-16) ) over the unmodified amyloid-β (Aβ) protein (e.g., Aβ (E3-16) ) . Such antibodies and antigen-binding fragments, therefore, can be suitably used for the prevention and treatment of Alzheimer’s Disease.

[0005] In accordance with one embodiment of the present disclosure, provided is an antibody or antigen binding fragment thereof that has binding specificity to an N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Abeta peptide. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3.

[0006] In some embodiments, the VH CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, the VH CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, the VH CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, the VL CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, the VL CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the VL CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

[0007] In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 20, 21, 22, 23, 30 and 31, or an amino acid sequence having at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NO: 1, , 20, 21, 22, 23, 30 and 31.

[0008] In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence having at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 30 and comprises the amino acid residues selected from the group consisting of V67, V71, A78, T93 (Kabat numbering) , and combinations thereof. In some embodiments, the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.

[0009] In some embodiments, the VL comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 24, 25 and 26, or an amino acid sequence having at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NO: 2, 24, 25 and 26.

[0010] In some embodiments, the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 and the VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

[0011] In some embodiments, the VH CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, the VH CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, the VH CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, the VL CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, the VL CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and the VL CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

[0012] In some embodiments, the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 38, 39, 40, 41 and 42, or an amino acid sequence having at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NO: 3, 38, 39, 40, 41 and 42. In some embodiments, the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39.

[0013] In some embodiments, the VL comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, 43 and 44, or an amino acid sequence having at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NO: 4, 43 and 44.

[0014] In some embodiments, the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 and the VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44.

[0015] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof further comprises an IgG Fc fragment. In some embodiments, the Fc fragment has disabled complement function and has antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) function. In some embodiments, the Fc fragment is a human IgG Fc fragment with a K322A mutation (EU numbering) .

[0016] Also provided, in some embodiments, are uses and methods for treating or preventing Alzheimer’s disease that comprises administering to the subject an effective amount of the antibody or antigen binding fragment of the present disclosure or polynucleotides encoding the antibody or fragment.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0017] FIG. 1A-F show the ELISA binding activity of 122B9 and 146C8 chimeric monospecific antibodies against human Aβ peptides.

[0018] FIG. 2A-B show the non-specific binding of 122B9 and 146C8 chimeric monospecific antibodies to HEK293 cells.

[0019] FIG. 3A-B show that the humanized 122B9 antibodies have similar binding activity to Aβ (pE3-16) or Aβ (E3-16) , compared to the chimeric 122B9 mAb.

[0020] FIG. 4 shows that 122B9-z10-KA with K322A-mutated (EU numbering) human IgG1 has comparable binding activity to Aβ (pE3-16) , compared to 122B9-z10 with wild-type human IgG1.

[0021] FIG. 5 shows that 122B9-z10-KA with K322A-mutated human IgG1 induces similar levels of Aβ (pE3-42) -FITC phagocytosis by BV2 cells compared to 122B9-z10 with wild-type human IgG1.

[0022] FIG. 6A-B show that a valine substitution at position 68 (A68V, or A67V according to Kabat numbering) reduced the immunogenicity of 122B9-z10 and 122B9-z8, as indicated by the percentage of predicted MHCII binding across nine populations.

[0023] FIG. 7A-C show the ELISA binding activity of 122B9-z10-A68V-KA and 122B9-z8-A68V-KA against human Aβ peptides.

[0024] FIG. 8A-F show that the Aβ residues critical for 122B9-z8-A68V-KA binding are similar as benchmarks.

[0025] FIG. 9A-B show that 122B9-z8-A68V-KA induces dose-dependent phagocytosis of Aβ (pE3-42) -FITC on BV2 cells.

[0026] FIG. 10 shows that 122B9-z8-A68V-KA has no poly-reactivity on HEK293 cells.

[0027] FIG. 11A-11B show that the humanized 146C8 antibodies have similar binding activity to Aβ (pE3-16) or Aβ (E3-16) , compared to the chimeric 146C8 mAb.

[0028] FIG. 12 shows that 146C8-z4-KA with K322A-mutated (EU numbering) human IgG1 has comparable binding activity to Aβ (pE3-16) , compared to 146C8-z4 with wild-type human IgG1.

[0029] FIG. 13 shows that 146C8-z4-KA with K322A-mutated human IgG1 induces similar levels of Aβ (pE3-42) -FITC phagocytosis by BV2 cells compared to 146C8-z4 with wild-type human IgG1.

[0030] FIG. 14A-H show that the Aβ residues critical for 146C8-z4-KA binding are similar as benchmarks.

[0031] FIG. 15 shows that 146C8-z4-KA has no poly-reactivity on HEK293 cells.DETAILED DESCRIPTIONDefinitions

[0032] It is to be noted that the term “a” or “an” entity refers to one or more of that entity; for example, “an antibody, ” is understood to represent one or more antibodies. As such, the terms “a” (or “an” ) , “one or more, ” and “at least one” can be used interchangeably herein.

[0033] As used herein, the term “polypeptide” is intended to encompass a singular “polypeptide” as well as plural “polypeptides, ” and refers to a molecule composed of monomers (amino acids) linearly linked by amide bonds (also known as peptide bonds) . The term “polypeptide” refers to any chain or chains of two or more amino acids, and does not refer to a specific length of the product. Thus, peptides, dipeptides, tripeptides, oligopeptides, “protein, ” “amino acid chain, ” or any other term used to refer to a chain or chains of two or more amino acids, are included within the definition of “polypeptide, ” and the term “polypeptide” may be used instead of, or interchangeably with any of these terms. The term “polypeptide” is also intended to refer to the products of post-expression modifications of the polypeptide, including without limitation glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization by known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, or modification by non-naturally occurring amino acids. A polypeptide may be derived from a natural biological source or produced by recombinant technology, but is not necessarily translated from a designated nucleic acid sequence. It may be generated in any manner, including by chemical synthesis.

[0034] The term “isolated” as used herein with respect to cells, nucleic acids, such as DNA or RNA, refers to molecules separated from other DNAs or RNAs, respectively, that are present in the natural source of the macromolecule. The term “isolated” as used herein also refers to a nucleic acid or peptide that is substantially free of cellular material, viral material, or culture medium when produced by recombinant DNA techniques, or chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized. Moreover, an “isolated nucleic acid” is meant to include nucleic acid fragments which are not naturally occurring as fragments and would not be found in the natural state. The term “isolated” is also used herein to refer to cells or polypeptides which are isolated from other cellular proteins or tissues. Isolated polypeptides are meant to encompass both purified and recombinant polypeptides.

[0035] As used herein, an “antibody” or “antigen-binding polypeptide” refers to a polypeptide or a polypeptide complex that specifically recognizes and binds to an antigen. An antibody can be a whole antibody and any antigen binding fragment or a single chain thereof. Thus, the term “antibody” includes any protein or peptide containing molecule that comprises at least a portion of an immunoglobulin molecule having biological activity of binding to the antigen. Examples of such include but are not limited to a complementarity determining region (CDR) of a heavy or light chain or a ligand binding portion thereof, a heavy chain or light chain variable region, a heavy chain or light chain constant region, a framework (FR) region, or any portion thereof, or at least one portion of a binding protein.

[0036] The terms “antibody fragment” or “antigen-binding fragment” , as used herein, is a portion of an antibody such as F (ab’ ) 2, F (ab) 2, Fab’ , Fab, Fv, scFv and the like. Regardless of structure, an antibody fragment binds with the same antigen that is recognized by the intact antibody. The term “antibody fragment” includes aptamers, spiegelmers, and diabodies. The term “antibody fragment” also includes any synthetic or genetically engineered protein that acts like an antibody by binding to a specific antigen to form a complex.

[0037] A “single-chain variable fragment” or “scFv” refers to a fusion protein of the variable regions of the heavy (VH) and light chains (VL) of immunoglobulins. In some aspects, the regions are connected with a short linker peptide of ten to about 25 amino acids. The linker can be rich in glycine for flexibility, as well as serine or threonine for solubility, and can either connect the N-terminus of the VH with the C-terminus of the VL, or vice versa. This protein retains the specificity of the original immunoglobulin, despite removal of the constant regions and the introduction of the linker. ScFv molecules are known in the art and are described, e.g., in US patent 5, 892, 019.

[0038] The term antibody encompasses various broad classes of polypeptides that can be distinguished biochemically. Those skilled in the art will appreciate that heavy chains are classified as gamma, mu, alpha, delta, or epsilon (γ, μ, α, δ, ε) with some subclasses among them (e.g., γl-γ4) . It is the nature of this chain that determines the “class” of the antibody as IgG, IgM, IgA, IgG, or IgE, respectively. The immunoglobulin subclasses (isotypes) e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, etc. are well characterized and are known to confer functional specialization. Modified versions of each of these classes and isotypes are readily discernable to the skilled artisan in view of the instant disclosure and, accordingly, are within the scope of the instant disclosure. All immunoglobulin classes are clearly within the scope of the present disclosure, the following discussion will generally be directed to the IgG class of immunoglobulin molecules. With regard to IgG, a standard immunoglobulin molecule comprises two identical light chain polypeptides of molecular weight approximately 23,000 Daltons, and two identical heavy chain polypeptides of molecular weight 53,000-70,000. The four chains are typically joined by disulfide bonds in a “Y” configuration wherein the light chains bracket the heavy chains starting at the mouth of the “Y” and continuing through the variable region.

[0039] Antibodies, antigen-binding polypeptides, variants, or derivatives thereof of the disclosure include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, multispecific, human, humanized, primatized, or chimeric antibodies, single chain antibodies, epitope-binding fragments, e.g., Fab, Fab’ and F (ab’ ) 2, Fd, Fvs, single-chain Fvs (scFv) , single-chain antibodies, disulfide-linked Fvs (sdFv) , fragments comprising either a VK or VH domain, fragments produced by a Fab expression library, and anti-idiotypic (anti-Id) antibodies (including, e.g., anti-Id antibodies to LIGHT antibodies disclosed herein) . Immunoglobulin or antibody molecules of the disclosure can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2) or subclass of immunoglobulin molecule.

[0040] Light chains are classified as either kappa or lambda (K, λ) . Each heavy chain class may be bound with either a kappa or lambda light chain. In general, the light and heavy chains are covalently bonded to each other, and the “tail” portions of the two heavy chains are bonded to each other by covalent disulfide linkages or non-covalent linkages when the immunoglobulins are generated either by hybridomas, B cells or genetically engineered host cells. In the heavy chain, the amino acid sequences run from an N-terminus at the forked ends of the Y configuration to the C-terminus at the bottom of each chain.

[0041] Both the light and heavy chains are divided into regions of structural and functional homology. The terms “constant” and “variable” are used functionally. In this regard, it will be appreciated that the variable domains of both the light (VK) and heavy (VH) chain portions determine antigen recognition and specificity. Conversely, the constant domains of the light chain (CK) and the heavy chain (CH1, CH2 or CH3) confer important biological properties such as secretion, transplacental mobility, Fc receptor binding, complement binding, and the like. By convention the numbering of the constant region domains increases as they become more distal from the antigen-binding site or amino-terminus of the antibody. The N-terminal portion is a variable region and at the C-terminal portion is a constant region; the CH3 and CK domains actually comprise the carboxy-terminus of the heavy and light chain, respectively.

[0042] As indicated above, the variable region allows the antibody to selectively recognize and specifically bind epitopes on antigens. That is, the VK domain and VH domain, or subset of the complementarity determining regions (CDRs) , of an antibody combine to form the variable region that defines a three-dimensional antigen-binding site. This quaternary antibody structure forms the antigen-binding site present at the end of each arm of the Y. More specifically, the antigen-binding site is defined by three CDRs on each of the VH and VK chains (i.e., CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3) . In some instances, e.g., certain immunoglobulin molecules derived from camelid species or engineered based on camelid immunoglobulins, a complete immunoglobulin molecule may consist of heavy chains only, with no light chains. See, e.g., Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993) .

[0043] In naturally occurring antibodies, the six “complementarity determining regions” or “CDRs” present in each antigen-binding domain are short, non-contiguous sequences of amino acids that are specifically positioned to form the antigen-binding domain as the antibody assumes its three-dimensional configuration in an aqueous environment. The remainder of the amino acids in the antigen-binding domains, referred to as “framework” regions, show less inter-molecular variability. The framework regions largely adopt a β-sheet conformation and the CDRs form loops which connect, and in some cases form part of, the β-sheet structure. Thus, framework regions act to form a scaffold that provides for positioning the CDRs in correct orientation by inter-chain, non-covalent interactions. The antigen-binding domain formed by the positioned CDRs defines a surface complementary to the epitope on the immunoreactive antigen. This complementary surface promotes the non-covalent binding of the antibody to its cognate epitope. The amino acids comprising the CDRs and the framework regions, respectively, can be readily identified for any given heavy or light chain variable region by one of ordinary skill in the art, since they have been precisely defined (see “Sequences of Proteins of Immunological Interest, ” Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983) ; and Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196: 901-917 (1987) ) .

[0044] In the case where there are two or more definitions of a term which is used and / or accepted within the art, the definition of the term as used herein is intended to include all such meanings unless explicitly stated to the contrary. A specific example is the use of the term “complementarity determining region” ( “CDR” ) to describe the non-contiguous antigen combining sites found within the variable region of both heavy and light chain polypeptides. This particular region has been described by Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) and by Chothia et al., J. MoI. Biol. 196: 901-917 (1987) , which are incorporated herein by reference in their entireties. The CDR definitions according to Kabat and Chothia include overlapping or subsets of amino acid residues when compared against each other. Nevertheless, application of either definition to refer to a CDR of an antibody or variants thereof is intended to be within the scope of the term as defined and used herein. The appropriate amino acid residues which encompass the CDRs as defined by each of the above cited references are set forth in the table below as a comparison. The exact residue numbers which encompass a particular CDR will vary depending on the sequence and size of the CDR. Those skilled in the art can routinely determine which residues comprise a particular CDR given the variable region amino acid sequence of the antibody.

[0045] Kabat et al. also defined a numbering system for variable domain sequences that is applicable to any antibody. One of ordinary skill in the art can unambiguously assign this system of “Kabat numbering” to any variable domain sequence, without reliance on any experimental data beyond the sequence itself. As used herein, “Kabat numbering” refers to the numbering system set forth by Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983) .

[0046] Antibodies disclosed herein may be from any animal origin including birds and mammals. Preferably, the antibodies are human, murine, donkey, rabbit, goat, guinea pig, camel, llama, horse, or chicken antibodies. In another embodiment, the variable region may be condricthoid in origin (e.g., from sharks) .

[0047] As used herein, the term “heavy chain constant region” includes amino acid sequences derived from an immunoglobulin heavy chain. A polypeptide comprising a heavy chain constant region comprises at least one of: a CH1 domain, a hinge (e.g., upper, middle, and / or lower hinge region) domain, a CH2 domain, a CH3 domain, or a variant or fragment thereof. For example, an antigen-binding polypeptide for use in the disclosure may comprise a polypeptide chain comprising a CH1 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, and a CH2 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain and a CH3 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, and a CH3 domain, or a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, a CH2 domain, and a CH3 domain. In another embodiment, a polypeptide of the disclosure comprises a polypeptide chain comprising a CH3 domain. Further, an antibody for use in the disclosure may lack at least a portion of a CH2 domain (e.g., all or part of a CH2 domain) . As set forth above, it will be understood by one of ordinary skill in the art that the heavy chain constant region may be modified such that they vary in amino acid sequence from the naturally occurring immunoglobulin molecule.

[0048] The heavy chain constant region of an antibody disclosed herein may be derived from different immunoglobulin molecules. For example, a heavy chain constant region of a polypeptide may comprise a CH1 domain derived from an IgG1 molecule and a hinge region derived from an IgG3 molecule. In another example, a heavy chain constant region can comprise a hinge region derived, in part, from an IgG1 molecule and, in part, from an IgG3 molecule. In another example, a heavy chain portion can comprise a chimeric hinge derived, in part, from an IgG1 molecule and, in part, from an IgG4 molecule.

[0049] As used herein, the term “light chain constant region” includes amino acid sequences derived from antibody light chain. Preferably, the light chain constant region comprises at least one of a constant kappa domain or constant lambda domain.

[0050] By “specifically binds” or “has specificity to, ” it is generally meant that an antibody binds to an epitope via its antigen-binding domain, and that the binding entails some complementarity between the antigen-binding domain and the epitope. According to this definition, an antibody is said to “specifically bind” to an epitope when it binds to that epitope, via its antigen-binding domain more readily than it would bind to a random, unrelated epitope. The term “specificity” is used herein to qualify the relative affinity by which a certain antibody binds to a certain epitope. For example, antibody “A” may be deemed to have a higher specificity for a given epitope than antibody “B, ” or antibody “A” may be said to bind to epitope “C” with a higher specificity than it has for related epitope “D. ”

[0051] As used herein, the terms “treat” or “treatment” refer to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures, wherein the object is to prevent or slow down (lessen) an undesired physiological change or disorder, such as the progression of cancer. Beneficial or desired clinical results include, but are not limited to, alleviation of symptoms, diminishment of extent of disease, stabilized (i.e., not worsening) state of disease, delay or slowing of disease progression, amelioration or palliation of the disease state, and remission (whether partial or total) , whether detectable or undetectable. “Treatment” can also mean prolonging survival as compared to expected survival if not receiving treatment. Those in need of treatment include those already with the condition or disorder as well as those prone to have the condition or disorder or those in which the condition or disorder is to be prevented.

[0052] By “subject” or “individual” or “animal” or “patient” or “mammal, ” is meant any subject, particularly a mammalian subject, for whom diagnosis, prognosis, or therapy is desired. Mammalian subjects include humans, domestic animals, farm animals, and zoo, sport, or pet animals such as dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, cattle, cows, and so on.

[0053] As used herein, phrases such as “to a patient in need of treatment” or “asubject in need of treatment” includes subjects, such as mammalian subjects, that would benefit from administration of an antibody or composition of the present disclosure used, e.g., for detection, for a diagnostic procedure and / or for treatment. Anti-beta Amlyoid (Aβ) Antibodies

[0054] As provided, deposition of N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Abeta peptides (Aβ pE3) play an important role in the aggregation of the amyloid-β (Aβ) protein in the brain. Moreover, Aβ pE3 is solely detected in the Aβ plague and absent in the periphery. These Aβ pE3 peptides, therefore, can be a suitable target for the prevention and treatment of Alzheimer’s Disease (AD) .

[0055] Antibodies have been developed to target Aβ pE3 as a disease modified therapy for AD. Donanemab is the first FDA-approved anti-Aβ pE3 drug. The FDA label for donanemab, however, contains a boxed warning about amyloid-related imaging abnormalities (ARIA) . Besides, the high immunogenicity of donanemab causes anti-drug antibody in 88%of patients after 18-month treatment. Side effects include, in particular, severe life-threatening ARIA-edoma / effusion (ARIA-E) , ARIA-hemorrhage (ARIA-H) , and allergic reactions. There is an unmet medical need, therefore, to develop antibodies having excellent target specificity and greatly reduced immunogenicity.

[0056] Disclosed herein are antibodies and fragments having excellent specificity to AβpE3. As shown in Table 4, both 122B9 and 146C8 had similar binding affinities, as compared to donanemab, to pyroglutamate-modified Aβ (pE3-16) and yet exhibited markedly lower affinity to the un-modified counterpart, Aβ (E3-16) . Meanwhile, both of them had higher affinity to Aβ (pE3-16) than remternetug, another anti-Aβ pE3 antibody under phase 3 clinical development.

[0057] The 122B9 clone was subjected to humanization. The humanized versions retained the high affinity and selectivity of the mouse counterpart (Table 6) . Moreover, a complement function-disabled version (with K322A mutation in human IgG1) was prepared which also retained the affinity and selectivity (Table 9) and antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) function (FIG. 5) .

[0058] Selected humanized 122B9 antibodies were further subjected to sequence optimization to reduce immunogenicity. The optimized antibodies, in particular 122B9-z8-A68V, showed markedly lower predicted immunogenicity than the benchmarks donanemab and remternetug (FIG. 6) yet retained the excellent properties of the parental antibody.

[0059] In accordance with one embodiment of the present disclosure, therefore, provided is an antibody or antigen binding fragment thereof that has binding specificity to an N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Abeta peptide (Aβ pE3) , comprising a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3, wherein: the VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3, respectively, are those of antibodies shown in Table 1. Representative CDR sequences (Kabat numbering) of these antibodies are respectively shown in Table 1-1 and Table 1-2, such as those in SEQ ID NO: 5-10 and 11-16.

[0060] In one embodiment, an antibody or antigen binding fragment thereof of the present disclosure includes the CDR regions of antibody 122B9, which has a VH sequence of SEQ ID NO: 1 and a VL sequence of SEQ ID NO: 2.

[0061] In some embodiments, the VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 include the sequences of SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9 and 10, respectively. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof of the present disclosure includes these CDR sequences and has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to antibody 122B9, or any of its humanized counterparts. In one embodiment, the VH has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 1. In one embodiment, VL has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 2.

[0062] In some embodiments, the 122B9 antibody is humanized. Example VH sequences of a humanized 122B9 antibody include SEQ ID NO: 20-23 and 30-31. Example VL sequences of a humanized 122B9 antibody include SEQ ID NO: 24-26.

[0063] In one embodiment, the VH has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 1. In one embodiment, the VH has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 20. In one embodiment, the VH has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 21. In one embodiment, the VH has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 22. In one embodiment, the VH has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 23. In one embodiment, the VH has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 30. In one embodiment, the VH has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 31. In some embodiments, the VH retains the VH CDR sequences of the reference VH (i.e., SEQ ID NO: 5, 6 and 7) .

[0064] In some embodiments, the VH has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 1, 20, 21, 22, 23, 30 or 31, retains the VH CDR sequences of SEQ ID NO: 1, and includes one or more back mutations (including back-to-mouse mutations from humanized sequences as well as inversion of the back mutations) . In one embodiment, the back mutations include, for instance, V67, V71, A78, and T93 (Kabat numbering) as shown in Table 10 for SEQ ID NO: 30. In one embodiment, the back mutations include at least V67 (Kabat numbering) (referred to as “A68V” in the examples) . In one embodiment, the back mutations include all of V67, V71, A78, and T93 (Kabat numbering) .

[0065] In some embodiments, the VH has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 30, retains the VH CDR sequences of SEQ ID NO: 30, and includes one or more back mutations. In one embodiment, the back mutations include, for instance, V67, V71, A78, and T93 (Kabat numbering) . In one embodiment, the back mutations include at least V67 (Kabat numbering) (referred to as “A68V” in the examples) . In one embodiment, the back mutations include all of V67, V71, A78, and T93 (Kabat numbering) .

[0066] In some embodiments, the VH has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 31, retains the VH CDR sequences of SEQ ID NO: 31, and includes one or more back mutations. In one embodiment, the back mutations include, for instance, I37, I48, V67, L69, V71, A78, F91, and T93 (Kabat numbering) as shown in Table 10 for SEQ ID NO: 31. In one embodiment, the back mutations include at least V67 (Kabat numbering) (referred to as “A68V” in the examples) . In one embodiment, the back mutations include all of I37, I48, V67, L69, V71, A78, F91, and T93 (Kabat numbering) .

[0067] In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24. In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24. In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

[0068] In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

[0069] In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24. In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

[0070] In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24. In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

[0071] In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24. In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

[0072] In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24. In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

[0073] Also provided, in some embodiments, are antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind to the same epitope on Aβ pE3 as 122B9. Also provided, in some embodiments, are antibodies and antigen-binding fragments thereof that competes with 122B9 in binding to Aβ pE3.

[0074] In one embodiment, an antibody or antigen binding fragment thereof of the present disclosure includes the CDR regions of antibody 146C8, which has a VH sequence of SEQ ID NO: 3 and a VL sequence of SEQ ID NO: 4.

[0075] In some embodiments, the VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 have the sequences of SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 and 16, respectively. In one embodiment, the VH has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 3. In one embodiment, VL has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 4.

[0076] In one embodiment, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

[0077] Also provided, in some embodiments, are antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind to the same epitope on Aβ pE3 as 146C8. Also provided, in some embodiments, are antibodies and antigen-binding fragments thereof that competes with 146C8 in binding to Aβ pE3.

[0078] In some embodiments, the antibody of the present disclosure is a full-size IgG antibody, such as IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4. In some embodiments, the antibody has an Fc fragment without effector function (e.g., not capable of binding to an Fcγ receptor or complement protein) . In some embodiments, the antibody has an Fc fragment that has intact antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) function. In some embodiments, the antibody has an Fc fragment that has intact antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) function.

[0079] Modifications to the wild-type Fc fragments are known that can deprive / retain the Fc fragment such binding activities. An example is the IgG1 LALAPG mutant (L234A / L235A / P329G, EU numbering) . Another example is IgG1 Fc with L234A / L235A (LALA) which substitutions reduce binding to the IgG Fc receptors FcγRI, FcγRII and FcγRIII as well as to complement component C1q. Yet additional examples are L234F / L235E / P331S (FES) , L234F / L235Q / K322Q (FQQ) , L234A / G237A, L234A / L235A / G237A, L234A / L235A / G237A / P238S / H268A / A330S / P330S, L234A / L235E, G236R / L328R, and L234A / L235A / K322A. For IgG2 Fc, an example is A330S / P331S (also EU numbering) .

[0080] In some embodiments, the Fc is an IgG1 Fc with the K322A substitution (EU numbering) . In some embodiments, the Fc includes a heavy chain constant region of SEQ ID NO: 28 and a light chain constant region of SEQ ID NO: 29. Polynucleotides, mRNA, and Methods of Expressing or Preparing Antibodies

[0081] The present disclosure also provides polynucleotides or nucleic acid molecules encoding the antibodies and antigen-binding fragments thereof of the disclosure. The polynucleotides of the present disclosure may encode the entire heavy and light chain variable regions of the antibodies and antigen-binding fragments thereof on the same polynucleotide molecule or on separate polynucleotide molecules. Additionally, the polynucleotides of the present disclosure may encode portions of the heavy and light chain variable regions of the antibodies and antigen-binding fragments thereof on the same polynucleotide molecule or on separate polynucleotide molecules.

[0082] In some embodiments, the polynucleotide is an mRNA molecule. In some embodiments, the mRNA can be introduced into a target cell for expressing the antibody or fragment thereof.

[0083] mRNAs may be synthesized according to any of a variety of known methods. For example, the mRNAs may be synthesized via in vitro transcription (IVT) . Briefly, IVT is typically performed with a linear or circular DNA template containing a promoter, a pool of ribonucleotide triphosphates, a buffer system that may include DTT and magnesium ions, and an appropriate RNA polymerase (e.g., T3, T7 or SP6 RNA polymerase) , DNAse I, pyrophosphatase, and / or RNAse inhibitor. The exact conditions will vary according to the specific application.

[0084] In some embodiments, for the preparation of antibody-coding mRNA, a DNA template is transcribed in vitro. A suitable DNA template typically has a promoter, for example a T3, T7 or SP6 promoter, for in vitro transcription, followed by desired nucleotide sequence for desired antibody encoding (e.g., heavy chain or light chain encoding) mRNA and a termination signal.

[0085] Desired antibody encoding (e.g., heavy chain or light chain encoding) mRNA sequence may be determined and incorporated into a DNA template using standard methods. For example, starting from a desired amino acid sequence (e.g., a desired heavy chain or light chain sequence) , a virtual reverse translation is carried out based on the degenerated genetic code. Optimization algorithms may then be used for selection of suitable codons. Typically, the G / C content can be optimized to achieve the highest possible G / C content on one hand, taking into the best possible account the frequency of the tRNAs according to codon usage on the other hand. The optimized RNA sequence can be established and displayed, for example, with the aid of an appropriate display device and compared with the original (wild-type) sequence. A secondary structure can also be analyzed to calculate stabilizing and destabilizing properties or, respectively, regions of the RNA.

[0086] The mRNA may be synthesized as unmodified or modified mRNA. Typically, mRNAs are modified to enhance stability. Modifications of mRNA can include, for example, modifications of the nucleotides of the RNA. A modified mRNA can thus include, for example, backbone modifications, sugar modifications or base modifications. In some embodiments, antibody encoding mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) may be synthesized from naturally occurring nucleotides and / or nucleotide analogues (modified nucleotides) including, but not limited to, purines (adenine (A) , guanine (G) ) or pyrimidines (thymine (T) , cytosine (C) , uracil (U) ) , and as modified nucleotides analogues or derivatives of purines and pyrimidines, such as e.g. 1-methyl-adenine, 2-methyl-adenine, 2-methylthio-N-6-isopentenyl-adenine, N6-methyl-adenine, N6-isopentenyl-adenine, 2-thio-cytosine, 3-methyl-cytosine, 4-acetyl-cytosine, 5-methyl-cytosine, 2, 6-diaminopurine, 1-methyl-guanine, 2-methyl-guanine, 2, 2-dimethyl-guanine, 7-methyl-guanine, inosine, 1-methyl-inosine, pseudouracil (5-uracil) , dihydro-uracil, 2-thio-uracil, 4-thio-uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thio-uracil, 5- (carboxyhydroxymethyl) -uracil, 5-fluoro-uracil, 5-bromo-uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-uracil, 5-methyl-2-thio-uracil, 5-methyl-uracil, N-uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, 5-methylaminomethyl-uracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thio-uracil, 5’ -methoxycarbonylmethyl-uracil, 5-methoxy-uracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid (v) , 1-methyl-pseudouracil, queosine, 13-D-mannosyl-queosine, wybutoxosine, and phosphoramidates, phosphorothioates, peptide nucleotides, methylphosphonates, 7-deazaguanosine, 5-methylcytosine and inosine. The preparation of such analogues is known to a person skilled in the art e.g. from the U.S. Pat. Nos. 4,373,071, 4,401,796, 4,415,732, 4,458,066, 4,500,707, 4,668,777, 4,973,679, 5,047,524, 5,132,418, 5,153,319, 5,262,530 and 5,700,642, the disclosure of which is included here in its full scope by reference.

[0087] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) may contain RNA backbone modifications. Typically, a backbone modification is a modification in which the phosphates of the backbone of the nucleotides contained in the RNA are modified chemically. Exemplary backbone modifications typically include, but are not limited to, modifications from the group consisting of methylphosphonates, methylphosphoramidates, phosphoramidates, phosphorothioates (e.g. cytidine 5’ -O- (1-thiophosphate) ) , boranophosphates, positively charged guanidinium groups etc., which means by replacing the phosphodiester linkage by other anionic, cationic or neutral groups.

[0088] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) may contain sugar modifications. A typical sugar modification is a chemical modification of the sugar of the nucleotides it contains including, but not limited to, sugar modifications chosen from the group consisting of 2’ -deoxy-2’ -fluoro-oligoribonucleotide (2’ -fluoro-2’ -deoxycytidine 5’ -triphosphate, 2’ -fluoro-2’ -deoxyuridine 5’ -triphosphate) , 2’ -deoxy-2’ -deamine-oligoribonucleotide (2’ -amino-2’ -deoxycytidine 5’ -triphosphate, 2’ -amino-2’ -deoxyuridine 5’ -triphosphate) , 2’ -O-alkyloligoribonucleotide, 2’ -deoxy-2’ -C-alkyloligoribonucleotide (2’ -O-methylcytidine 5’ -triphosphate, 2’ -methyluridine 5’ -triphosphate) , 2’ -C-alkyloligoribonucleotide, and isomers thereof (2’ -aracytidine 5’ -triphosphate, 2’ -arauridine 5’ -triphosphate) , or azidotriphosphates (2’ -azido-2’ -deoxycytidine 5’ -triphosphate, 2’ -azido-2’ -deoxyuridine 5’ -triphosphate) .

[0089] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) may contain modifications of the bases of the nucleotides (base modifications) . A modified nucleotide which contains a base modification is also called a base-modified nucleotide. Examples of such base-modified nucleotides include, but are not limited to, 2-amino-6-chloropurine riboside 5’ -triphosphate, 2-aminoadenosine 5’ -triphosphate, 2-thiocytidine 5’ -triphosphate, 2-thiouridine 5’ -triphosphate, 4-thiouridine 5’ -triphosphate, 5-aminoallylcytidine 5’ -triphosphate, 5-aminoallyluridine 5’ -triphosphate, 5-bromocytidine 5’ -triphosphate, 5-bromouridine 5’ -triphosphate, 5-iodocytidine 5’ -triphosphate, 5-iodouridine 5’ -triphosphate, 5-methylcytidine 5’ -triphosphate, 5-methyluridine 5’ -triphosphate, 6-azacytidine 5’ -triphosphate, 6-azauridine 5’ -triphosphate, 6-chloropurine riboside 5’ -triphosphate, 7-deazaadenosine 5’ -triphosphate, 7-deazaguanosine 5’ -triphosphate, 8-azaadenosine 5’ -triphosphate, 8-azidoadenosine 5’ -triphosphate, benzimidazole riboside 5’ -triphosphate, N1-methyladenosine 5’ -triphosphate, N1-methylguanosine 5’ -triphosphate, N6-methyladenosine 5’ -triphosphate, O6-methylguanosine 5’ -triphosphate, pseudouridine 5’ -triphosphate, puromycin 5’ -triphosphate or xanthosine 5’ -triphosphate.

[0090] Typically, mRNA synthesis includes the addition of a “cap” on the N-terminal (5’ ) end, and a “tail” on the C-terminal (3’ ) end. The presence of the cap is important in providing resistance to nucleases found in most eukaryotic cells. The presence of a “tail” serves to protect the mRNA from exonuclease degradation.

[0091] Thus, in some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) include a 5’ cap structure. A 5’ cap is typically added as follows: first, an RNA terminal phosphatase removes one of the terminal phosphate groups from the 5’ nucleotide, leaving two terminal phosphates; guanosine triphosphate (GTP) is then added to the terminal phosphates via a guanylyl transferase, producing a 5’ 5’ 5 triphosphate linkage; and the 7-nitrogen of guanine is then methylated by a methyltransferase. Examples of cap structures include, but are not limited to, m7G (5’ ) ppp (5’ (A, G (5’ ) ppp (5) A and G (5) ppp (5’ ) G.

[0092] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) include a 3’ poly (A) tail structure. A poly-Atail on the 3’ terminus of mRNA typically includes about 10 to 300 adenosine nucleotides (e.g., about 10 to 200 adenosine nucleotides, about 10 to 175 adenosine nucleotides, about 10 to 150 adenosine nucleotides, about 10 to 125 adenosine nucleotides, 10 to 100 adenosine nucleotides, about 10 to 75 adenosine nucleotides, about 20 to 70 adenosine nucleotides, or about 20 to 60 adenosine nucleotides) . In some embodiments, antibody encoding mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) include a 3’ poly (C) tail structure. A suitable poly-C tail on the 3’ terminus of mRNA typically include about 10 to 200 cytosine nucleotides (e.g., about 10 to 150 cytosine nucleotides, about 10 to 100 cytosine nucleotides, about 20 to 70 cytosine nucleotides, about 20 to 60 cytosine nucleotides, or about 10 to 40 cytosine nucleotides) . The poly-C tail may be added to the poly-Atail or may substitute the poly-Atail.

[0093] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) include a 5’ and / or 3’ untranslated region. In some embodiments, a 5’ untranslated region includes one or more elements that affect an mRNA’s stability or translation, for example, an iron responsive element. In some embodiments, a 5’ untranslated region may be between about 50 and 500 nucleotides in length (e.g., about 50 and 400 nucleotides in length, about 50 and 300 nucleotides in length, about 50 and 200 nucleotides in length, or about 50 and 100 nucleotides in length) .

[0094] In some embodiments, a 5’ region of an mRNA (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) includes a sequence encoding a signal peptide, such as those described herein. In particular embodiments, a signal peptide derived from human growth hormone (hGH) is incorporated in the 5’ region. Typically, a signal peptide encoding sequence is linked, directly or indirectly, to the heavy chain or light chain encoding sequence at the N-terminus.

[0095] Methods of making antibodies are well known in the art and described herein. In certain embodiments, both the variable and constant regions of the antigen-binding polypeptides of the present disclosure are fully human. Fully human antibodies can be made using techniques described in the art and as described herein. For example, fully human antibodies against a specific antigen can be prepared by administering the antigen to a transgenic animal which has been modified to produce such antibodies in response to antigenic challenge, but whose endogenous loci have been disabled. Exemplary techniques that can be used to make such antibodies are described in U.S. patents: 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140 which are incorporated by reference in their entireties. Treatment and Uses

[0096] As described herein, the antibodies and antigen-binding fragments thereof of the present disclosure may be used in certain treatment and diagnostic methods.

[0097] The present disclosure is further directed to antibody-based therapies which involve administering the antibodies or fragments of the disclosure to a patient such as an animal, a mammal, and a human for preventing or treating AD. Therapeutic agents of the disclosure include, but are not limited to, antibodies of the disclosure (including variants and derivatives thereof as described herein) and nucleic acids or polynucleotides encoding antibodies of the disclosure (including variants and derivatives thereof as described herein) .

[0098] Accordingly, in some embodiments, provided are methods for preventing or treating AD in a patient in need thereof. The method, in one embodiment, entails administering to the patient an effective amount of an antibody or fragment of the present disclosure.

[0099] A specific dosage and treatment regimen for any particular patient will depend upon a variety of factors, including the particular antibodies and antigen-binding fragments thereof used, the patient’s age, body weight, general health, sex, and diet, and the time of administration, rate of excretion, drug combination, and the severity of the particular disease being treated. Judgment of such factors by medical caregivers is within the ordinary skill in the art. The amount will also depend on the individual patient to be treated, the route of administration, the type of formulation, the characteristics of the compound used, the severity of the disease, and the desired effect. The amount used can be determined by pharmacological and pharmacokinetic principles well known in the art.

[0100] Methods of administration of the antibody or fragment, or polynucleotide include but are not limited to intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The antigen-binding polypeptides or compositions may be administered by any convenient route, for example by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucocutaneous linings (e.g., oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc. ) and may be administered together with other biologically active agents. Thus, pharmaceutical compositions containing the antigen-binding polypeptides of the disclosure may be administered orally, rectally, parenterally, intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, topically (as by powders, ointments, drops or transdermal patch) , buccally, or as an oral or nasal spray.

[0101] The term “parenteral” as used herein refers to modes of administration which include intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intra-articular injection and infusion.

[0102] Administration can be systemic or local. In addition, it may be desirable to introduce the antibodies of the disclosure into the central nervous system by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injection; intraventricular injection may be facilitated by an intraventricular catheter, for example, attached to a reservoir, such as an Ommaya reservoir. Pulmonary administration can also be employed, e.g., by use of an inhaler or nebulizer, and formulation with an aerosolizing agent.

[0103] It may be desirable to administer the antigen-binding polypeptides or compositions of the disclosure locally to the area in need of treatment; this may be achieved by, for example, and not by way of limitation, local infusion during surgery, topical application, e.g., in conjunction, with a wound dressing after surgery, by injection, by means of a catheter, by means of a suppository, or by means of an implant, said implant being of a porous, non-porous, or gelatinous material, including membranes, such as sialastic membranes, or fibers. Preferably, when administering a protein, including an antibody, of the disclosure, care must be taken to use materials to which the protein does not absorb.

[0104] The amount of the antibody, fragment, or polynucleotide of the disclosure which will be effective in the treatment, inhibition and prevention of an inflammatory, immune or malignant disease, disorder or condition can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro assays may optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. The precise dose to be employed in the formulation will also depend on the route of administration, and the seriousness of the disease, disorder or condition, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient’s circumstances. Effective doses may be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems.

[0105] As a general proposition, the dosage administered to a patient of the antibody, fragment, or polynucleotide of the present disclosure is typically 0.001 mg / kg to 100 mg / kg of the patient’s body weight, between 0.01 mg / kg and 20 mg / kg of the patient’s body weight, or 0.5 mg / kg to 10 mg / kg of the patient’s body weight. Generally, human antibodies have a longer half-life within the human body than antibodies from other species due to the immune response to the foreign polypeptides. Thus, lower dosages of human antibodies and less frequent administration is often possible. Further, the dosage and frequency of administration of antibodies of the disclosure may be reduced by enhancing uptake and tissue penetration (e.g., into the brain) of the antibodies by modifications such as, for example, lipidation.

[0106] Also provided is a method (e.g., an in vitro method) for detecting the presence of an N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Abeta peptide in a biological sample. In some embodiments, the method entails contacting the biological sample with the antibody or antigen binding fragment of the present disclosure and detecting binding of the antibody or antigen binding fragment to an N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Abeta peptide in the biological sample. Compositions

[0107] The present disclosure also provides pharmaceutical compositions. Such compositions comprise an effective amount of an antibody, fragment or polynucleotide, and an acceptable carrier.

[0108] In a specific embodiment, the term “pharmaceutically acceptable” means approved by a regulatory agency of the Federal or a state government or listed in the U.S. Pharmacopeia or other generally recognized pharmacopeia for use in animals, and more particularly in humans. Further, a “pharmaceutically acceptable carrier” will generally be a non-toxic solid, semisolid or liquid filler, diluent, encapsulating material or formulation auxiliary of any type.

[0109] The term “carrier” refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic is administered. Such pharmaceutical carriers can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol and the like. The composition, if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents such as acetates, citrates or phosphates. Antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl parabens; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; and agents for the adjustment of tonicity such as sodium chloride or dextrose are also envisioned. These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsion, tablets, pills, capsules, powders, sustained-release formulations and the like. The composition can be formulated as a suppository, with traditional binders and carriers such as triglycerides. Oral formulation can include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate, etc. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in Remington’s Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin, incorporated herein by reference. Such compositions will contain a therapeutically effective amount of the antigen-binding polypeptide, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier so as to provide the form for proper administration to the patient. The formulation should suit the mode of administration. The parental preparation can be enclosed in ampoules, disposable syringes or multiple dose vials made of glass or plastic.

[0110] In an embodiment, the composition is formulated in accordance with routine procedures as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to human beings. Typically, compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer. Where necessary, the composition may also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lignocaine to ease pain at the site of the injection. Generally, the ingredients are supplied either separately or mixed together in unit dosage form, for example, as a dry lyophilized powder or water free concentrate in a hermetically sealed container such as an ampoule or sachette indicating the quantity of active agent. Where the composition is to be administered by infusion, it can be dispensed with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. Where the composition is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients may be mixed prior to administration.

[0111] The compounds of the disclosure can be formulated as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include those formed with anions such as those derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids, etc., and those formed with cations such as those derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxides, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylamino ethanol, histidine, procaine, etc. EXAMPLES Example 1: Generation of Mouse Monoclonal Antibodies against Human Aβ (pE3-x)

[0112] This example describes the generation of anti-human-Aβ (pE3-x) mouse monoclonal antibodies using the hybridoma technology.

[0113] Antigen: human Aβ (pE3-x) -KLH conjugate which is an N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Aβ peptide (residue 3 to residue x) conjugated to the carrier protein Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) .

[0114] Immunization: To generate mouse monoclonal antibodies targeting human Aβ (pE3-x) , SJL mice, Balb / c mice and C57BL / 6 mice were first immunized with the human Aβ (pE3-16) -KLH. The immunized mice were subsequently boosted with the Aβ (pE3-42) -KLH or Aβ (pE3-16) -BSA. To select mice producing antibodies that bind to human Aβ (pE3-x) , the serum of immunized mice was subjected to the antibody titer evaluation by ELISA. Briefly, microtiter plates were coated with streptavidin at 1 μg / ml in ELISA coating buffer, 100 μl / well at 4℃ overnight, then blocked with 150 μl / well of 1%BSA. Synthetic human Aβ (pE3-16) or Aβ (pE3-42) was then added at 1 μg / ml and incubated for 1 hour, after which dilutions of serum from immunized mice were added to each well and incubated for 1 hour. The plates were washed with PBS / Tween and then incubated with anti-mouse IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase (HRP) for 30 min. After washing, the plates were developed with TMB (3, 3’ , 5, 5’ -tetramethylbenzidine) substrate and analyzed by spectrophotometer at OD 450 nm. The resulting mice were used for fusions. The hybridoma supernatants were screened by ELISA.

[0115] Cell fusion: Fusion was performed by electro fusion. Fused cells were plated into 50 96-well plates for each fusion.

[0116] Screening: The supernatants were screened by ELISA against synthetic human Aβ (pE3-16) , Aβ (pE3-42) , Aβ (E3-16) and Aβ (1-42) . Supernatants positive against Aβ (pE3-16) were chosen for confirmative screening. Clones positive against Aβ (pE3-x) and negative against Aβ (E3-16) and Aβ (1-42) were selected for subcloning.

[0117] Subcloning and screening: Positive primary clones from each fusion were subcloned by limiting dilution to ensure that the subclones were derived from a single parental cell. The subclones were screened in the same approach as the primary clones.

[0118] Hybridoma clones 122B9 and 146C8 were selected for further analysis. The amino acid sequences of the variable regions of these clones are listed in Table 1 below. Table 1. Sequences of the variable regions of selected clones Table 1-1. CDR sequences of 122B9 Table 1-2. CDR sequences of 146C8 Example 2: Binding Affinity of mAbs to Human Aβ 2.1 Affinity measured by SPR

[0119] The binding of 122B9 and 146C8 against synthetic human Aβ (pE3-16) was tested with Biacore using a capture method. The mAbs were captured using Protein A chip. A serial dilution of Aβ (pE3-16) was injected over captured antibody for 300s at a flow rate of 30 μl / min. The antigen was allowed to dissociate for 600s. All the experiments were carried out on a Biacore 8K. Data analysis was carried out using Biacore 8K evaluation software.

[0120] As shown in the results of Table 2 below, both tested antibodies exhibited nanomolar binding affinity to Aβ (pE3-16) . Table 2. Affinity measured by SPR 2.2 Binding activity by ELSA

[0121] ELISA testing was carried out to evaluate the binding of 122B9 and 146C8 to human Aβ(pE3-16) , Aβ (E3-16) and Aβ (1-42) , respectively. The amino acid sequences of the tested Aβ peptides are listed in Table 3. The antibodies donanemab and remternetug were used as benchmarks. Donanemab is the first FDA-approved antibody drug targeting Aβ (pE3-x) , and remternetug is another Aβ (pE3-x) -targeted antibody drug undergoing phase 3 clinical development, both of which were developed for AD therapy by Lilly. Table 3. Sequences of the tested Aβ peptides

[0122] Briefly, microtiter plates were coated with streptavidin at 1 μg / ml in PBS, 100 μl / well at 4℃ overnight, then blocked with 100 μl / well of BlockerTM Casein (Thermo Fisher Scientific) . Aβ (pE3-16) , Aβ (E3-16) or Aβ (1-42) was then added at 1 μg / ml and incubated for 1 hour at RT. After washing, serial dilutions of 122B9 and 146C8 were added to each well and incubated for another 1 hour at RT. The plates were washed with PBS / Tween and then incubated with goat anti-human IgG Fc antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) for 30 min at RT. After washing, the plates were developed with TMB substrate and analyzed by spectrophotometer at OD 450nm. Both 122B9 and 146C8 showed similar binding activity to donanemab for Aβ (pE3-16) , and reduced binding activity to Aβ (E3-16) (FIG. 1A-1F and Table 4) . While remternetug had even weaker off-target binding to Aβ (E3-16) , its binding to Aβ (pE3-16) was limited. Moreover, 122B9 and 146C8 did not bind to Aβ(1-42) , indicating a specific recognition of the Aβ (pE3-x) isoform. Table 4. Binding activity evaluated by ELISA 2.3 Non-specific binding with HEK293 by FACS

[0123] FACS was used to evaluate the non-specific binding of 122B9 and 146C8 on HEK293 cell line.

[0124] Briefly, HEK293 cells were washed by FACS buffer and serially diluted 122B9 and 146C8 antibodies were added to each well at 4℃ for 30 min. After washing by FACS buffer, PE goat anti-human IgG Fc secondary antibody (eBioscienceTM, Invitrogen) was added to each well and incubated at 4℃ for 30 min. The samples were washed twice with FACS buffer. The mean fluorescence intensity (MFI) of PE was evaluated by MACSQuant Analyzer 16. As shown in FIG. 2A-2B, 122B9 and 146C8 showed no detectable non-specific binding to HEK293 cells. Example 3: Humanization of the 122B9 Antibody

[0125] The 122B9 variable region genes were employed to create humanized antibodies. In the first step of this process, the amino acid sequences of the VH and VK of 122B9 were compared against the available database of human Ig gene sequences to find the overall best-matching human germline Ig gene sequences.

[0126] The sequences of the human germlines used for CDR grafting, as well as the resulting humanized sequences are listed in Table 5. Table 5-1. Humanization of 122B9 Table 5-2. Humanized antibodies from 122B9 Example 4: Binding Activity of 122B9 Humanized Antibodies to Human Aβ

[0127] This example tested the binding activities of the 122B9 humanized antibodies to synthetic human Aβ (pE3-16) and Aβ (E3-16) . The 122B9 chimeric antibody along with 122B9 humanized mAbs were subjected to ELISA test.

[0128] Briefly, microtiter plates were coated with Aβ (pE3-16) or Aβ (E3-16) at 0.5 μg / ml in PBS, 100μl / well at 4℃ overnight, then blocked with 100μl / well of 1%BSA. Serial dilutions of 122B9 humanized antibodies were added to each well and incubated for 1 hour at 37℃. The plates were washed with PBS / Tween and then incubated with goat anti-human IgG-HRP for 30 min at 37℃. After washing, the plates were developed with TMB substrate and analyzed by spectrophotometer at OD 450 nm. As shown in FIG. 3A-3B and Table 6, most of the humanized antibodies bound with Aβ (pE3-16) with high activity and to Aβ (E3-16) with low activity, comparable to the chimeric counterpart. Table 6. Binding activity of humanized 122B9 antibodies to human Aβ Example 5: Fc Optimization with Disabled Complement Function

[0129] Complement-mediated damage in AD is complex and may result from multiple mechanisms, including neuroinflammation, excessive synaptic pruning, direct neurotoxicity by C5a, and direct or indirect gliosis. In addition, C1q binding to the Fc domain could potentially induce vasogenic edema when anti-Aβ antibodies bind to vascular amyloid. Therefore, we adopted a modified Fc region of human IgG1 on the mAb with an alanine substitution at position 322 (EU numbering) , termed the K322A mutation (abbreviation as KA) , to inactivate C1q binding and subsequent complement function while retaining the antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) function.

[0130] The sequences of CH and CL sequences are listed in Table 7. Table 7. Constant region of anti-human Aβ mAbs 5.1 Human C1q binding by BLI

[0131] The binding of human IgG1 with K322A mutation (KA) against human C1q was tested with Octet using a capture method. Antibodies with either human IgG1 wildtype (donanemab and remternetug) or human IgG1 with K322A mutation (122B9-z10-KA) were captured using Fab2G sensors. The sensors were then incubated with serial dilutions of human C1q (Merck, C1740) for 600s. Afterwards, the antigen was allowed to dissociate for 600s. All the experiments were carried out on an Octet RED96e. Data analysis was carried out using Octet Analysis Studio 12.2.1.23.

[0132] As shown in the results of Table 8 below, wild-type human IgG1 was able to bind to human C1q with nanomolar affinity, while K322A-mutated human IgG1 did not bind to human C1q. Table 8. Binding activity measured by BLI 5.2 Aβ (pE3-16) binding by ELSA

[0133] ELISA testing was carried out to evaluate whether K322A mutation on Fc region would affect the Fab binding with human Aβ (pE3-16) .

[0134] Briefly, microtiter plates were coated with streptavidin at 0.1 μg / ml in PBS, 100 μl / well at 4℃ overnight, then blocked with 100 μl / well of 1%BSA. Aβ (pE3-16) was then added at 0.1 μg / ml and incubated for 1 hour at RT. After washing, serial dilutions of 122B9-z10 (wildtype human IgG1) and 122B9-z10-KA (K322A-mutated human IgG1) were added to each well and incubated for another 1 hour at RT. The plates were washed with PBS / Tween and then incubated with goat anti-human IgG Fc antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) for 30 min at RT. After washing, the plates were developed with TMB substrate and analyzed by spectrophotometer at OD 450 nm. It was shown that 122B9-z10 and 122B9-z10-KA bound to Aβ (pE3-16) in a similar range of activity. The slightly stronger binding signal of 122B9-z10 might be due to the preferential binding of the secondary antibody to the wild-type Fc (FIG. 4 and Table 9) . Table 9. Binding activity evaluated by ELISA 5.3 Antibody effector function of ADCP

[0135] The ADCP effector function of IgG1 antibodies is thought to be involved in the phagocytotic clearance of insoluble Aβ deposits. To evaluate the ADCP function of mAbs with either human IgG1 wild-type (122B9-z10) or human IgG1 with K322A mutation (122B9-z10-KA) , a C57BL / 6 microglial cell line, named BV2 cell line, was used for antibody-dependent phagocytosis of FITC-labelled Aβ (pE3-42) , named as Aβ (pE3-42) -FITC.

[0136] Briefly, BV2 cells in the logarithmic growth phase were digested and plated into the 24-well plate at a density of 1x105 / well. Cells were cultured in the incubator overnight. Serial dilutions of antibodies and 100 nM of Aβ (pE3-42) -FITC were thoroughly mixed and incubated at 37℃ for 30 min. The culture medium of the pre-plated BV2 cells was then removed. The antibody / Aβ mixture was immediately added to the wells and incubated at 37℃ for 5 hours. Then the antibody / Aβ mixture was removed and the cells were washed three times with PBS. BV2 cells were collected and the MFI of FITC was evaluated by BD Fortessa.

[0137] As shown in FIG. 5, both 122B9-z10 and 122B9-z10-KA promoted the phagocytosis of Aβ (pE3-42) -FITC in a dose-dependent manner. Furthermore, the ADCP function of 122B9-z10 and 122B9-z10-KA was generally the same, indicating that the K322A mutation on the human IgG1 does not interfere with the ADCP effector function. Example 6: Immunogenicity Prediction and De-immunization

[0138] The immunogenicity of biological therapeutics could induce anti-drug antibodies (ADAs) in the clinic, including neutralizing antibodies. ADAs can reduce drug activity, accelerate drug clearance, increase the risk of adverse reactions such as allergies, and cause inflammation and tissue damage. Therefore, it is necessary to assess the immunogenicity of antibodies and de-immunization accordingly to reduce the ADAs-related immune response in patients.

[0139] To evaluate the immunogenicity of humanized 122B9 antibodies, an in-house tool based on the NetMHCIIpan algorithm was applied. The coverage represented the percentage of potential MHCII binding peptides on the antibody. The variable fragments (Fv) of an antibody were subjected to immunogenicity evaluation. The back-mutated amino acid on the humanized antibody would be resubstituted to the corresponding human germ line amino acid if this site contributed to increased immunogenicity.

[0140] As shown in FIG. 6A-6B, the immunogenicity of 122B9-z10 and 122B9-z8 was reduced by a valine re-substitution at position 68 (or 67 according to Kabat number) on the VH region, named as A68V. 122B9-z8-A68V exhibited the lowest potential MHCII binding across all nine populations. In particular, 122B9-z8-A68V showed markedly lower predicted immunogenicity than the benchmarks donanemab and remternetug.

[0141] The amino acid sequences of the variable regions of the de-immunized antibodies are listed in Table 10 below. Table 10. Sequences of the variable regions of de-immunized antibodies Example 7: Binding Affinity of De-immunized Antibodies to Human Aβ variants 7.1 Binding activity by ELISA

[0142] ELISA testing was carried out to evaluate the binding activity of humanized 122B9 antibodies and their de-immunized versions to human Aβ (pE3-16) , Aβ (E3-16) and Aβ (1-42) .

[0143] Briefly, microtiter plates were coated with streptavidin at 0.1 μg / ml or 1 μg / ml in PBS, 100 μl / well at 4℃ overnight, then blocked with 100 μl / well of BlockerTM Casein (Thermo Fisher Scientific) . Aβ (pE3-16) and Aβ (E3-16) at 0.1 μg / ml, or Aβ (1-42) at 1 μg / ml were then added into the wells with 0.1 μg / ml SA (streptavidin) or 1 μg / ml SA, respectively, and incubated for 1 hour at RT. After washing, serial dilutions of antibodies were added to each well and incubated for another 1 hour at RT. The plates were washed with PBS / Tween and then incubated with goat anti-human IgG Fc antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) for 30 min at RT. After washing, the plates were developed with TMB substrate and analyzed by spectrophotometer at OD 450 nm. As shown in FIG. 7A-7C, the de-immunized antibodies showed similar binding activity to their parental humanized antibodies (122B9-z8-A68V-KA vs. 122B9-z8, 122B9-z10-A68V-KA vs. 122B9-z10-KA) . 7.2 Affinity measured by SPR

[0144] The binding of 122B9-z8-A68V-KA and 122B9-z10-A68V-KA against synthetic human Aβ (pE3-16) was tested with Biacore using a capture method. The mAbs were captured using Protein A chip. A serial dilution of Aβ (pE3-16) was injected over the captured antibody for 300s at a flow rate of 30 μl / min. The antigen was allowed to dissociate for 600s. All the experiments were carried out on a Biacore 8K. Data analysis was carried out using Biacore 8K evaluation software.

[0145] As shown in the results of Table 11 below, the de-immunized antibodies exhibited nanomolar binding affinity to Aβ (pE3-16) . Table 11. Affinity measured by SPR Example 8: Binding Epitope of 122B9-z8-A68V-KA to Human Aβ

[0146] To evaluate the binding epitope of 122B9-z8-A68V-KA, a series of Aβ (pE3-16) derivatives with positional glycine changes were subjected to ELISA testing. The antibodies donanemab and remternetug were used as benchmarks.

[0147] The amino acid sequences of the derivatives of Aβ (pE3-16) peptides are listed in Table 12 below. Table 12. Sequences of the derivatives of Aβ (pE3-16) peptides

[0148] Briefly, microtiter plates were coated with streptavidin at 0.1 μg / ml in PBS, 100 μl / well at 4℃ overnight, then blocked with 100 μl / well of 1%BSA. Aβ (pE3-16) and the derivatives were then added at 0.1 μg / ml and incubated for 1 hour at RT. After washing, serial dilutions of antibodies were added to each well and incubated for another 1 hour at RT. The plates were washed with PBS / Tween and then incubated with goat anti-human IgG Fc antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) for 30 min at RT. After washing, the plates were developed with TMB substrate and analyzed by spectrophotometer at OD 450 nm. As shown in FIG. 7A-7C, 8A-8F and Table 13, the Aβ residues critical for 122B9-z8-A68V-KA binding were pyroE at position 3 (numbering from the first amino acid of full-length Aβ (1-42) ) , F at position 4, R at position 5, H at position 6, and D at position 7, where the glycine substitution decreased the 122B8-z8-A68V-KA binding significantly. Table 13. Binding activity of 122B9-z8-A68V-KA to the derivatives of Aβ (pE3-16) peptides Example 9: ADCP function of 122B9-z8-A68V-KA by BV2 cells

[0149] Microglia-mediated phagocytosis of insoluble Aβ plays a critical role in the clearance of deposited Aβ in the brain. ADCP could further aid the clearance of Aβ plagues. To evaluate the ADCP function of 122B9-z8-A68V-KA, Aβ (pE3-42) -FITC peptide was subjected to phagocytosis by BV2 cells.

[0150] Briefly, BV2 cells in the logarithmic growth phase were digested and plated in a 96-well plate at a density of 3x104 / well. Cells were cultured in the incubator overnight. Serial dilutions of antibodies and 100 nM of Aβ (pE3-42) -FITC were mixed thoroughly and incubated at 37℃ for 30 min. Afterwards, the culture medium of the pre-plated BV2 cells was removed. The antibody / Aβ mixture was immediately added into the wells and incubated at 37℃ for 5 hours. Then the antibody / Aβ mixture was removed and the cells were washed three times with PBS. BV2 cells were collected and the MFI of FITC were evaluated by BD Fortessa.

[0151] As shown in FIG. 9, 122B9-z8-A68V-KA promoted the phagocytosis of Aβ (pE3-42) -FITC by BV2 cells in a dose-dependent manner, comparable to the benchmark donanemab. Example 10: Non-specific binding of 122B9-z8-A68V-KA with HEK293

[0152] In this example, the poly-reactivity of 122B9-z8-A68V-KA was tested using human HEK293 cells. FACS was used to evaluate the non-specific binding.

[0153] Briefly, HEK293 cells were washed with FACS buffer and plated into each well with serially diluted antibodies at 4℃ for 30 min. After washing by FACS buffer, PE goat anti-human IgG Fc secondary antibody was added to each well and incubated at 4℃ for 30 min. The samples were washed twice with FACS buffer. The MFI of PE was evaluated by MACSQuant Analyzer 16. As shown in FIG. 10, 122B9-z8-A68V-KA showed no detectable non-specific binding to the HEK293 cell line. Example 11: Humanization of the 146C8 Antibody

[0154] The 146C8 variable region genes were employed to create humanized antibody. In the first step of this process, the amino acid sequences of the VH and VK of 146C8 were compared against the available database of human Ig gene sequences to find the overall best-matching human germline Ig gene sequences.

[0155] The sequences of the human germlines used for CDR grafting, as well as the resulting humanized sequences are listed in Table 14. Table 14-1. Humanization of 146C8 Table 14-2. Humanized antibodies from 146C8 Example 12: Binding Activity of 146C8 Humanized Antibodies to Human Aβ

[0156] This example tested the binding activities of the 146C8 humanized antibodies to synthetic human Aβ (pE3-16) and Aβ (E3-16) . The 146C8 chimeric antibody along with 146C8 humanized mAbs were subjected to ELISA test.

[0157] Briefly, microtiter plates were coated with Aβ (pE3-16) or Aβ (E3-16) at 0.5 μg / ml in PBS, 100μl / well at 4℃ overnight, then blocked with 100μl / well of 1%BSA. Serial dilutions of 146C8 humanized antibodies were added to each well and incubated for 1 hour at 37℃. The plates were washed with PBS / Tween and then incubated with goat anti-human IgG-HRP for 30 min at 37℃. After washing, the plates were developed with TMB substrate and analyzed by spectrophotometer at OD 450 nm. As shown in FIG. 11A-11B and Table 15, most of the humanized antibodies bound with Aβ (pE3-16) with high activity and to Aβ (E3-16) with low activity, comparable to the chimeric counterpart. Table 15. Binding activity of humanized 146C8 antibodies to human Aβ Example 13: Fc Optimization for 146C8-z4

[0158] As referred to the potential negative effect of complement function in AD, we adopted a modified Fc region of human IgG1 on the mAb with an alanine substitution at position 322 (EU numbering) , termed the K322A mutation (abbreviation as KA) , to inactivate C1q binding and subsequent complement function while retaining the antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) function.

[0159] The sequences of CH and CL sequences are listed in Table 7. 13.1 Human C1q binding by BLI

[0160] The binding of human IgG1 with K322A mutation (KA) against human C1q was tested with Octet using a capture method. Antibodies with either human IgG1 wildtype (donanemab and remternetug) or human IgG1 with K322A mutation (146C8-z4-KA) were captured using Fab2G sensors. The sensors were then incubated with serial dilutions of human C1q (Merck, C1740) for 600s. Afterwards, the antigen was allowed to dissociate for 600s. All the experiments were carried out on an Octet RED96e. Data analysis was carried out using Octet Analysis Studio 12.2.1.23.

[0161] As shown in the results of Table 16 below, wild-type human IgG1 was able to bind to human C1q with nanomolar affinity, while K322A-mutated human IgG1 did not bind to human C1q, regardless of the Fab fragment. Table 16. Binding activity measured by BLI 13.2 Aβ (pE3-16) binding by ELSA

[0162] ELISA testing was carried out to evaluate whether K322A mutation on Fc region would affect the Fab binding with human Aβ (pE3-16) .

[0163] Briefly, microtiter plates were coated with streptavidin at 0.1 μg / ml in PBS, 100 μl / well at 4℃ overnight, then blocked with 100 μl / well of 1%BSA. Aβ (pE3-16) was then added at 0.1 μg / ml and incubated for 1 hour at RT. After washing, serial dilutions of 146C8-z4 (wildtype human IgG1) and 146C8-z4-KA (K322A-mutated human IgG1) were added to each well and incubated for another 1 hour at RT. The plates were washed with PBS / Tween and then incubated with goat anti-human IgG Fc antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) for 30 min at RT. After washing, the plates were developed with TMB substrate and analyzed by spectrophotometer at OD 450 nm. It was shown that 146C8-z4 and 146C8-z4-KA bound to Aβ (pE3-16) in a similar range of activity. The slightly stronger binding signal of 146C8-z4 might be due to the preferential binding of the secondary antibody to the wild-type Fc (FIG. 12 and Table 17) . Table 17. Binding activity evaluated by ELISA 13.3 Antibody effector function of ADCP

[0164] The ADCP effector function of IgG1 antibodies is thought to be involved in the phagocytotic clearance of insoluble Aβ deposits. To evaluate the ADCP function of mAbs with either human IgG1 wild-type (146C8-z4) or human IgG1 with K322A mutation (146C8-z4-KA) , a C57BL / 6 microglial cell line, named BV2 cell line, was used for antibody-dependent phagocytosis of FITC-labelled Aβ (pE3-42) , named as Aβ (pE3-42) -FITC.

[0165] Briefly, BV2 cells in the logarithmic growth phase were digested and plated into the 24-well plate at a density of 1x105 / well. Cells were cultured in the incubator overnight. Serial dilutions of antibodies and 100 nM of Aβ (pE3-42) -FITC were thoroughly mixed and incubated at 37℃ for 30 min. The culture medium of the pre-plated BV2 cells was then removed. The antibody / Aβ mixture was immediately added to the wells and incubated at 37℃ for 5 hours. Then the antibody / Aβ mixture was removed and the cells were washed three times with PBS. BV2 cells were collected and the MFI of FITC was evaluated by BD Fortessa.

[0166] As shown in FIG. 13, both 146C8-z4 and 146C8-z4-KA promoted the phagocytosis of Aβ (pE3-42) -FITC in a dose-dependent manner. Furthermore, the ADCP function of 146C8-z4 and 146C8-z4-KA was generally the same, indicating that the K322A mutation on the human IgG1 does not interfere with the ADCP effector function. Example 14: Binding Affinity of 146C8-z4-KA to Human Aβ

[0167] The binding affinity of 146C8-z4-KA against synthetic human Aβ (pE3-16) was tested with Biacore using a capture method. 146C8-z4-KA were captured using Protein A chip. A serial dilution of Aβ (pE3-16) was injected over the captured antibody for 300s at a flow rate of 30 μl / min. The antigen was allowed to dissociate for 600s. All the experiments were carried out on a Biacore 8K. Data analysis was carried out using Biacore 8K evaluation software.

[0168] As shown in the results of Table 18 below, 146C8-z4-KA exhibited nanomolar binding affinity to Aβ (pE3-16) . Table 18. Affinity measured by SPR Example 15: Binding Epitope of 146C8-z4-KA to Human Aβ

[0169] To evaluate the binding epitope of 146C8-z4-KA, a series of Aβ (pE3-16) derivatives with positional glycine changes were subjected to ELISA testing. The antibodies donanemab and remternetug were used as benchmarks.

[0170] The amino acid sequences of the derivatives of Aβ (pE3-16) peptides are listed in Table 3 and Table 12.

[0171] Briefly, microtiter plates were coated with streptavidin at 0.1 μg / ml in PBS, 100 μl / well at 4℃ overnight, then blocked with 100 μl / well of 1%BSA. Aβ (pE3-16) and the derivatives were then added at 0.1 μg / ml and incubated for 1 hour at RT. After washing, serial dilutions of antibodies were added to each well and incubated for another 1 hour at RT. The plates were washed with PBS / Tween and then incubated with goat anti-human IgG Fc antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) for 30 min at RT. After washing, the plates were developed with TMB substrate and analyzed by spectrophotometer at OD 450 nm.As shown in FIG. 14A-4H and Table 19, the Aβ residues critical for 146C8-z4-KA binding were pyroE at position 3, F at position 4, R at position 5, H at position 6, and D at position 7, where the glycine substitution decreased the 146C8-z4-KA binding significantly. Table 19. Binding activity of 146C8-z4-KA to the derivatives of Aβ (pE3-16) peptides Example 16: Non-specific binding of 146C8-z4-KA with HEK293

[0172] In this example, the poly-reactivity of 146C8-z4-KA was tested using human HEK293 cells. FACS was used to evaluate the non-specific binding.

[0173] Briefly, HEK293 cells were washed with FACS buffer and plated into each well with serially diluted antibodies at 4℃ for 30 min. After washing by FACS buffer, PE goat anti-human IgG Fc secondary antibody was added to each well and incubated at 4℃ for 30 min. The samples were washed twice with FACS buffer. The MFI of PE was evaluated by MACSQuant Analyzer 16. As shown in FIG. 15, 146C8-z4-KA showed no detectable non-specific binding to the HEK293 cell line. * * *

[0174] The present disclosure is not to be limited in scope by the specific embodiments described which are intended as single illustrations of individual aspects of the disclosure, and any compositions or methods which are functionally equivalent are within the scope of this disclosure. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the methods and compositions of the present disclosure without departing from the spirit or scope of the disclosure. Thus, it is intended that the present disclosure cover the modifications and variations of this disclosure provided they come within the scope of the appended claims and their equivalents.

[0175] All publications and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference.

Claims

1.An antibody or antigen binding fragment thereof that has binding specificity to an N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Abeta peptide (Aβ pE3) , comprising a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1, VH CDR2, and VH CDR3, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3, wherein:(a) the VH CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, the VH CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, the VH CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, the VL CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, the VL CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the VL CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; or(b) the VH CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, the VH CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, the VH CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, the VL CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, the VL CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and the VL CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.2.The antibody or antigen binding fragment thereof of claim 1, wherein the VH CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, the VH CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, the VH CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, the VL CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, the VL CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the VL CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.3.The antibody or antigen binding fragment thereof of claim 2, wherein the VH comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 20, 21, 22, 23, 30 and 31, or an amino acid sequence having at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NO: 1, 20, 21, 22, 23, 30 and 31.4.The antibody or antigen binding fragment thereof of claim 3, wherein the VH comprises an amino acid sequence having at least 90%sequence identity to SEQ ID NO: 30 and comprises the amino acid residues selected from the group consisting of V67, V71, A78, T93 (Kabat numbering) , and combinations thereof.5.The antibody or antigen binding fragment thereof of claim 3, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.6.The antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 2-5, wherein the VL comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO:2, 24, 25 and 26, or an amino acid sequence having at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NO: 2, 24, 25 and 26.7.The antibody or antigen binding fragment thereof of claim 2, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 and the VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.8.The antibody or antigen binding fragment thereof of claim 1, wherein the VH CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, the VH CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, the VH CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, the VL CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, the VL CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and the VL CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.9.The antibody or antigen binding fragment thereof of claim 8, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 38, 39, 40, 41 and 42, or an amino acid sequence having at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NO: 3, 38, 39, 40, 41 and 42.10.The antibody or antigen binding fragment thereof of claim 9, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39.11.The antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 8-10, wherein the VL comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, 43 and 44, or an amino acid sequence having at least 90%sequence identity to any one of SEQ ID NO: 4, 43 and 44.12.The antibody or antigen binding fragment thereof of claim 11, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 and the VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44.13.The antibody or antigen binding fragment thereof of any one of claims 1-12, which further comprises an IgG Fc fragment.14.The antibody or antigen binding fragment thereof of claim 13, wherein the Fc fragment has disabled complement function and has antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) function.15.The antibody or antigen binding fragment thereof of claim 13, wherein the Fc fragment is a human IgG Fc fragment with a K322A mutation (EU numbering) .16.One or more polynucleotides encoding the antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-15.17.The one or more polynucleotides of claim 16, which is an mRNA.18.A cell comprising the one or more polynucleotide (s) of claim 16 or 17.19.A method for treating or preventing Alzheimer’s disease in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-15 or the one or more polynucleotides of claim 16 or 17.20.Use of the antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-15 or the one or more polynucleotides of claim 16 or 17 for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of Alzheimer’s disease.21.An in vitro method for detecting the presence of an N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Abeta peptide in a biological sample, comprising contacting the biological sample with the antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-15 and detecting binding of the antibody or antigen binding fragment to an N-terminally truncated and pyroglutamate-modified Abeta peptide in the biological sample.

Images