Multi-specific molecules and uses thereof

Abstract

Provided is a multi-specific molecule targeting CD16A expressed on NK cells and 5T4 expressed on tumor cells, enhanced by a complex formed by IL-15 and IL-15Rα contained in the multi-specific molecule. Also provided are polypeptides, compositions and methods relevant to the multi-specific molecule.

Description

MULTI-SPECIFIC MOLECULES AND USES THEREOFTechnical Filed

[0001] The present disclosure relates to a multi-specific molecule, and in particular to a multi-specific antibody and uses thereof. The present disclosure is more specifically directed to a trispecific killer engager (TriKE) targeting both 5T4 and CD16A and crosslinking an IL-15 / IL-15Rα complex. The present disclosure also relates to polypeptides, pharmaceutical compositions, uses and methods in relation to the trispecific killer engager.Background

[0002] Natural killer (NK) cells are defined by the expression of the cell adhesion marker CD56 and lack of the T-cell receptor CD3 (CD56+CD3-) . NK cells can be divided into two functionally distinct subsets, CD56bright and CD56dim, based on the cell surface density of CD56. Comprising approximately 10%of circulating NK cells, CD56brightNK cells are generally thought to be more proliferative, to have a higher capacity for cytokine production after stimulation with IL-12 and IL-18, and to have poor cytotoxic effector activity at rest. CD56dimNK cells, however, are potently cytotoxic without stimulation, mediate antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) , and produce cytokines after stimulation with target cells.

[0003] CD16 (FcγRIII) binds to the Fc portion of IgG antibodies; one type, CD16A, is a transmembrane protein that co-localizes with CD3ζ and Fc-εRI-γ on NK cells. Upon ligation, it induces a potent series of signals resulting in cytokine production and cytotoxic effector activity via ADCC. The second type, CD16B, is found on neutrophils and is not involved in tumor cell killing. Although the extracellular domains are highly homologous, glycosylphosphatidylinositol linkage differentiates CD16B from CD16A. Most CD56brightNK cells in the peripheral blood express little to no CD16A. In contrast, the majority of CD56dim cells uniformly express high levels of CD16A. Down-regulation of CD16A occurs after mitogen stimulation and co-culture with malignant targets, an effect that is presumably mediated by a metalloprotease. This process may be important for rapid modulation of the surface density of CD16A, and in turn the activation status and effector function of NK cells.

[0004] The ADCC function of NK cells is highly pursued in antibody intervening immunotherapy. Bispecific antibodies with two targeting modules, one for recruiting ADCC receptors CD16A and the other for recognizing antigen, have drawn extensive attention due to the high efficacy for engaging NK cells to kill the target cells both in vitro and in vivo.

[0005] Interleukine-15 (IL-15) is a 15KD cytokine that enhances the proliferation and effector functions of IL-2Rβ / γ-expressing lymphocytes, such as NK cells and T cell subtypes. IL-15 is expressed in many cell types and tissues including monocytes, macrophages, DCs, keratinocytes fibroblasts, muscle cells, and neural cells. It shows 19%sequence homology but high similarity of many biological functions to IL-2. Unlike IL-2 receptor, IL-15 receptor alpha is trans expressed on IL-15 producing cells and forms IL-15α / IL-15 complex to deliver signals to NK, NKT, and memory CD8 T cells expressing IL-15Rβ (IL-2Rβ) and common γchain. This signaling induces the recruitment and activation of JAK1 and JAK3 then escalates to STAT3 and STAT5. The phosphorylated STAT3 and STAT5 form the homodimer which translocate to the nucleus and promote the transcription of target genes which can strongly promote the proliferation and differentiation of NK cells, enhance the proliferation and cytotoxicity of T lymphocytes. Although IL-15 activates the lymphocytes like IL-2, but IL-15 has no obvious effect on Treg cells and does not cause capillary leak syndrome, so IL-15 is a superior choice for tumor immunotherapy compared to IL-2.

[0006] Recombinant human IL-15 (rhIL-15) was evaluated in patients with metastatic melanoma and was shown to induce regression of lung metastases in two patients, but the narrow therapeutic window limited its continued development (NCT01021059) . Since the heterodimer IL-15 / IL-15Rα is a natural form of the IL-15 that is cleaved from cells and can also stimulate the downstream signaling independently, many studies are designed to explore the clinical efficacy of the IL-15 / IL-15Rα sushi complex. ImmunityBio’s nogapendekin alfa inbakicept (N803, IL-15N72D: IL-15RαSu / Fc) is approved by FDA in combination with the Bacillus Calmette–Guérin (BCG) vaccine for BCG-unresponsive non-muscle invasive bladder cancer in 2024. IL-15N72D mutation increases the affinity to bind IL-15Rβγc and enhanced biological activity; IL-15RαSu, N-terminal IL-15Rα fragments, the so-called sushi domain (Su) , can act as the IL-15Rβ chain agonist independent of cell membrane IL-15Rα; IgG1 Fc fusion is used to improve the half-life and the biodistribution. Although the nogapendekin alfa inbakicept achieved proof of concept in bladder cancer treatment by intravesical administration, it is still very challenging to broaden the cancer indications due to the non-targeted exposure and systematic immune activation (NCT03228667) .

[0007] 5T4, also known as trophoblast glycoprotein (TPBG) , is a 72 kDa N-glycosylated transmembrane glycoprotein, containing eight leucine-rich repeats for protein–protein interaction. 5T4 protein is expressed in many solid tumors including colorectal, breast, ovarian, lung, gastric, liver, and renal carcinomas but is minimal in normal adult tissues. High 5T4 expression is associated with advanced disease and worse prognosis in colorectal, ovarian, non-small-cell lung (NSCLC) and gastric cancer. Beyond oncofetal tumor associated antigen, 5T4 is also identified as a cancer stem cell marker. Functionally, 5T4 expression is associated with epithelial to mesenchymal transition (EMT) , C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4)  / CXCL12 chemotaxis, and noncanonical Wnt signaling which involved tumor metastasis and survival.

[0008] Multiple agents targeting 5T4 are evaluated in clinical trials. Naptumomab estafenatox, an anti-5T4-Fab staphylococcal-enterotoxin-A conjugate, is studied in phase2 / 3 (NCT00420888) and efficacy is shown in the anti-SEA normal / IL-6 low renal carcinoma population; APV-527, a bispecific antibody both targeting 5T4 and CD137, is in phase 1 exploration in solid tumor including breast cancer; GEN1044, a T cell engager, is terminated at phase1 / 2 due to safety issues inducing by anti-CD3 arm to over activate endogenous T cells. A lot of preclinical studies are on-going to discover the anti-tumoral effect of 5T4 targeting agents, such as antibody drug conjugates (ADC) and bispecific antibodies.

[0009] Currently, several formats of these bispecific antibodies are undergoing basic and clinical research, such as Bispecific Killer Cell Engager (BiKE) , bispecific diabody (BidAb) and tetra-valent, bispecific TandAb. Recently, the more promising format TandAb has been developed by Affimed Therapeutics AG (Heidelberg, Germany) . TandAb is a tetravalent, bispecific, tandem diabody composed of the tail-to-head homodimer of the two tandem scFv connected by three (GGS) 3 linkers. One TandAb, CD16 / CD30 AFM13, has completed phase II clinical trials for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma (clinical trial no. NCT02321592) . However, TandAb likely will encounter more production problems than BidAb since it contains more sub-domains, all of which should be paired elegantly to promise a correct TandAb. Furthermore, due to its tetra valence, two for CD16A and two for CD30, TandAb has risks for non-specifically activating CD16A in the absence of CD30 and inducing side effects. TriKEs, designed to target NK cells and tumor cells are actively evaluated in pre-clinical stage. TriKEs form an immune synapse between the NK cell and the tumor cell, mediate ADCC through the highly potent CD16 activating receptor, further enhances NK cell proliferation and persistence by IL-15 fusion.Summary

[0010] One aspect of the present disclosure provides a multi-specific molecule comprising (a) an anti-5T4 antibody comprising two heavy chains and two light chains; (b) an IL-15 polypeptide, covalently linked to C-terminus of one of the two heavy chains of the anti-5T4 antibody; (c) an IL-15Rα Sushi polypeptide, covalently linked to C-terminus of the other of the two heavy chains of the anti-5T4 antibody; and (d) an anti-CD16A VHH polypeptide, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide.

[0011] Another aspect of the disclosure provides polypeptides selected from a group consisting of (a) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-5T4 antibody, a heavy chain constant region of the anti-5T4 antibody, an IL-15Rα Sushi polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide; (b) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-5T4 antibody, a heavy chain constant region of the anti-5T4 antibody, an IL-15 polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide; (c) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-5T4 antibody, a heavy chain constant region of the anti-5T4 antibody, a peptide linker, an IL-15Rα Sushi polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide; and (d) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-5T4 antibody, a heavy chain constant region of the anti-5T4 antibody, a peptide linker, an IL-15 polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0012] Further aspects of the disclosure provide polynucleotides encoding the multi-specific molecule or the polypeptide, vectors and host cells comprising the polynucleotides, pharmaceutical compositions comprising the multi-specific molecules, the polypeptides, the polynucleotides, the vectors, or the host cells, and uses and methods of treatment involving the multi-specific molecules, the polypeptides, the polynucleotides, the vectors, or the host cells.

[0013] More aspects and advantages of the present disclosure will become apparent from the detailed description of the invention disclosed herein as set forth below.Brief Description of the Drawings

[0014] Figure 1. Diagram of a trispecific format according to some embodiments of the present disclosure.

[0015] Figure 2: Binding of BMP05-02, BMP02-10 and m603 to human, cynomolgus, mouse and rat 5T4 protein on ELISA.

[0016] Figure 3: Binding affinities of BMP05-02 to human CD16A-158V and CD16A-158F protein determined by SPR.

[0017] Figure 4: Weaker binding of BMP05-02 to human, cynomolgus, mouse and rat CD122 / CD132 heteromeric receptor than N-803 on ELISA.

[0018] Figure 5: Binding affinities of BMP05-02 and N-803 to human and monkey CD122 / CD132 heteromeric receptor determined by SPR.

[0019] Figure 6: Attenuated IL-15 receptor activation of BMP05-02 compared to N-803 and rhIL-15.

[0020] Figure 7. BMP05-02 showed ADCC activity in reporter assay.

[0021] Figure 8: BMP05-02 exhibited enhanced ADCC than BMP02-10 and m603.

[0022] Figure 9: Superior ADCC activity of BMP05-02 against JIMT-1.

[0023] Figure 10: The evaluation of anti-tumor activity in MDA-MB-231 xenografted mice treated with BMP05-02. FIG. 10A shows the illustration of the regimen of experiment. FIG. 10B shows the time course of tumor growth (a mean value of tumor volume + standard deviation) of a control group (PBS) , 3 administration groups and a parental bispecific antibody (BMP02-10) . The arrow indicates an antibody administration period. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (by Student's t-test) . The tumor growth of individual mouse for PBS vs BMP05-02 0.8mpk (FIG. 10C) , PBS vs BMP05-02 2.4mpk (FIG. 10D) , and PBS vs BMP05-02 7.2mpk (FIG. 10E) were plotted on right. FIG. 12F shows the time course of body weight (a mean value + standard deviation) of a control group (PBS) , 3 administration groups and a parental bispecific antibody (BMP02-10) .

[0024] Figure 11. BMP05-02 shows anti-tumor activity and enhanced anti-tumor immune responses in MDA-MB-231 xenografted CB17-SCID mice with hCD16a bone-marrow transplantation. FIG. 11A shows the plotted tumor weight of each mouse at the time of the 25th day (Day 25) (the final day of experiment) in the test of FIG. 10. The numerical value on each plot indicates a mean value + standard deviation. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (by Student's t-test) . FIG. 11B graphically depicts the absolute counts of lymphocytes (mCD45+) , NK cells (mNKp46+) , hCD16+NK cells (gated on mMKp46 cells) and hCD16+ lymphocytes (gated on mCD45 cells) in peripheral blood collected before tumor excision.

[0025] Figure 12. The evaluation of anti-tumor activity in A375 xenografted mice treated with BMP05-02. FIG. 12A shows the illustration of the regimen of experiment. FIG. 12B shows the time course of tumor growth (a mean value of tumor volume + standard deviation) of a control group (PBS) , 4 administration groups and a positive control antibody (Keytruda) . The arrow indicates an antibody administration period. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (by Student's t-test) . The tumor growth of individual mouse for PBS vs BMP05-02 0.03 &0.1 mpk (FIG. 12D) , PBS vs BMP05-02 0.3 mpk (FIG. 12E) , PBS vs BMP05-02 1 mpk (FIG. 12F) , and PBS vs Keytruda 5 mpk (FIG. 12G) were plotted on bottom. FIG. 12C shows the time course of body weight (a mean value + standard deviation) of a control group (PBS) , 4 administration groups and a positive control antibody (Keytruda) .

[0026] Figure 13. BMP05-02 shows anti-tumor activity and enhanced anti-tumor immune responses in A375 xenografted humanized immune system mice. Flow cytometry performed on the day of tumor excision. FIG. 13A shows the plotted tumor weight of each mouse at the time of the 14th day (Day 14) (the final day of experiment) in the test of FIG. 12. The numerical value on each plot indicates a mean value ± standard deviation. *P<0.05, **P<0.01. (by Student's t-test) . FIG. 13B graphically depicts the proportion of lymphocytes (hCD45+) , T cells (hCD3+hCD56-) , cytotoxic T cells (hCD8+ gated on hCD3+hCD56-cells) , NK subsets (hCD56+) and NK cells (hCD3-gated on hCD56+ cells) infiltrating tumor locations determined by FACS analyses. **P<0.01. (by Student's t-test) . FIG. 13C graphically depicts the absolute counts of lymphocytes (hCD45+) , T cells (hCD3+hCD56-) , cytotoxic T cells (hCD8+ gated on hCD3+hCD56-cells) , NK subsets (hCD56+) and NK cells (hCD3-gated on hCD56+ cells) in peripheral blood collected before tumor excision. *P<0.05. (by Student's t-test) .

[0027] Figure 14. The evaluation of anti-tumor activity in DU 145 xenografted humanized immune system mice treated with BMP05-02. FIG. 14A shows the time course of tumor growth (a mean value of tumor volume + standard deviation) of 2 control group (PBS) and 2 administration groups. The arrow indicates an antibody administration period. The tumor growth of individual mouse for PBS vs BMP05-02 3mpk (FIG. 14B) were plotted as well.  FIG. 14C shows the time course of body weight (a mean value + standard deviation) of 2 control group (PBS) and 2 administration groups. Sequence Listings Detailed Description

[0028] Definition

[0029] Unless stated otherwise, the following terms and phrases as used herein are intended to have the following meanings.

[0030] As used herein, the term “antibody” generally refers to a tetramer comprising at least two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds. Each heavy chain (HC) is comprised of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) . The heavy chain constant region is comprised of three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain (LC) is comprised of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . The light chain constant region is comprised of one domain. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDRs) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR) . Each VH and VL is composed of three CDRs and four FRs arranged from amino-terminus to carboxy -terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4. The CDRs in the heavy chain are termed HCDRs, i.e., HCDR1, HCDR2, and HCDR3. The CDRs in the light chain are termed LCDRs, i.e., LCDR1, LCDR2, and LCDR3. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen. The constant regions of the antibodies may mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (Clq) of the classical complement system.

[0031] The term “antibody” includes, but is not limited to, monoclonal antibodies, human antibodies, humanized antibodies, and chimeric antibodies. The antibodies can be of any isotype / class (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY) or subclass (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) .

[0032] A “heavy chain antibody” is devoid of a light chain and in the case of the heavy chain antibodies in camelids the CH1 domain is also missing. Consequently, a camelid heavy chain antibody associates with its cognate antigen via a single domain, the variable heavy chain domain of a heavy chain antibody or VHH. The terms VHH, nanobody or single domain antibody are used interchangeably herein. Therefore, an anti-CD16A VHH is an anti-CD16A nanobody, or an anti-CD16A single domain antibody. Throughout the disclosure, CD16A is sometime referred to as CD16. VHH antibodies are the isolated VHH domains of heavy-chain only antibodies produced by camelid species, such as alpaca, llama, and camel. These proteins consist of framework regions and three highly variable loops: CDR1, CDR2 and CDR3. Research has shown that it is the CDR3 loop that enables VHH antibodies to have such a wide range of bind specificities; the CDR3 loop tends to be 3-4 residues longer than that of conventional antibodies, allowing them to use these protrusions to extend into “hidden” epitope cavities; the CDR3 loop also has more variation in amino acid sequences in VHH antibodies than conventional antibodies, leading to ～7%higher sequence diversity per residue.

[0033] “Linker” refers to a sequence of amino acids comprising a linker peptide joining two juxtaposed variable domains forming an antigen-binding moiety with the C-terminus of one domain linked to the N-terminus of the other juxtaposed domain or vice versa. Regarding the amino acid composition, a peptide linker sequence is selected that does not interfere with the formation of Fv, i.e. VH / VL, antigen binding-and recognition sites as well as does not interfere with the multimerization, e.g., dimerization of the polypeptides of a multi-specific antigen-binding protein. For example, a linker comprising glycine and serine residues generally provides protease resistance. In some embodiments (G2S) X peptide linkers are used, wherein, for example, x = 1-20, e.g., (G2S) , (G2S) 2, (G2S) 3, (G2S) 4, (G2S) 5, (G2S) 6, (G2S) 7 or (G2S) 8 , or (G3S) X peptide linkers are used, wherein, for example, x=1-15 or (G4S) X peptide linkers are used, wherein, for example, x=1-10, preferably 1-6. The amino acid sequence of the linker can be optimized, for example, by phage-display methods to improve the formation of the antigen binding site and production yield of the polypeptide.

[0034] The term “ (specifically) binds to” , “ (specifically) recognizes, ” “is (specifically) directed to, ” or “ (specifically) reacts with” means in accordance with this invention that a binding domain interacts or specifically interacts with a given epitope or a given target side on the target molecules (antigens) , e.g. CD16A, and the target cell surface antigen, e.g., 5T4, respectively.

[0035] The term “does not essentially / substantially bind” or “is not capable of binding” means that a binding domain of the present invention does not bind a protein or antigen other than CD16A, and  / or the target cell surface antigen, i.e., does not show reactivity of more than about 30%, preferably not more than about 20%, more preferably not more than about 10%, particularly preferably not more than about 9%, about 8%, about 7%, about 6%or about 5%with proteins or antigens other than CD16A, and / or the target cell surface antigen, whereby binding to CD16a, and / or the target cell surface antigen, respectively, is set to be about 100%.

[0036] As used herein, the term “complementarity determining domains” is used herein interchangeably with the term “complementary determining regions” ( “CDRs” ) , and generally refers to the hypervariable regions of VL and VH. The CDRs are the target protein-binding sites of the antibody chains that harbor specificity for such target protein. There are three CDRs (CDR1-3, numbered sequentially from the N-terminus) in each human VL or VH, constituting about 15-20%of the variable domains. CDRs can be referred to by their region and order. For example, “VH CDR1” or “HCDR1” both refer to the first CDR of the heavy chain variable region. The CDRs are structurally complementary to the epitope of the target protein and are thus directly responsible for the binding specificity. The remaining stretches of the VL or VH, the so-called framework regions, exhibit less variation in amino acid sequence (Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W. H. Freeman &Co., New York, 2000) . In the art, the CDR of the antibody can be defined by various methods / schemes, such as a Kabat definition scheme based on sequence variability (see Kabat et al., protein sequence in immunology, 5th edition, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991) ) , a Chothia definition scheme based on the position of a structural loop region (see A1-Lazikani et al., Jmol Biol 273: 927-48, 1997) and a IMGT definition scheme based on the concept of IMGT-ONTOLOGY and IMGT Scientific chart rules. In certain embodiments, the present application uses the IMGT rules to define the CDRs of an antibody. The definition rules of Martin, PyIgClassify and Combined definition rules of Kabat, Chothia, IMGT, Martin and PyIgClassify are also included in this application (see Mark L. Chiu et al., Antibodies 8 (4) , 55, 2019) .

[0037] Table A. Comparation of CDR numbering among different definition schemes (in Chothia numbering)

[0038] wherein, Laa-Lbb or Haa-Hbb may refer to, from N-terminal, the amino acids sequence from No. aa to No. bb of light chain or heavy chain respectively. For example, L24-L34 refers to the amino acid sequence from positions Nos. 24 to 34 of light chain.

[0039] Both the light and heavy chains are divided into regions of structural and functional homology. The terms “constant” and “variable” are used functionally. In this regard, it will be appreciated that the variable domains of both the light (VL) and heavy (VH) chain portions determine antigen recognition and specificity. Conversely, the constant domains of the light chain (CL) and the heavy chain (CH1, CH2 or CH3) confer important biological properties such as secretion, transplacental mobility, Fc receptor binding, complement binding, and the like. By convention, the numbering of the constant region domains increases as they become more distal from the antigen binding site or amino terminus of the antibody. The N-terminus is a variable region and at the C-terminus is a constant region; the CH3 and CL domains actually comprise the carboxy-terminal domains of the heavy and light chain, respectively.

[0040] As used herein, the term “humanized antibody” generally refers to an antibody which includes sequences of heavy chain variable regions and light chain variable regions derived from non-human species (e.g., mice) , but in which at least a portion of the VH and / or VL sequences have been changed to be similar to the human germline variable sequences. For example, the term “humanized antibody” is an antibody or a variant, derivative, analogue or fragment thereof that can bind to a related antigen with immune specificity and includes a framework region (FR) which includes substantially an amino acid sequence of a human antibody and a complementary determining region (CDR) which includes substantially an amino acid sequence of a non-human antibody. In the context of CDR, the term “substantially” means that the amino acid sequence of CDR has at least 80%, e.g., at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%or at least 99%identity with an amino acid sequence of CDR of a non-human antibody. The humanized antibodies include substantially at least one, typically two variable domains (Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, Fab, Fv) , wherein all or substantially all CDR regions correspond to the CDR region of a non-human immunoglobulin and all or substantially all framework regions are frame regions with consensus sequence of human immunoglobulin. In some embodiments, the humanized antibody can further include at least a portion of a constant region of immunoglobulin (Fc) , typically a constant region of human immunoglobulin.

[0041] As used herein, the term “human antibody” generally refers to an antibody with variable and constant regions derived from the sequence of immunoglobulin of human germ line. Human antibodies are well known in the prior art (e.g., van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374) . The human antibodies can also be generated in transgenic animals (e.g., mice) which can generate a complete or selected set of human antibodies in absence of generated endogenous immunoglobulin after immunization (e.g., Jakobovits, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A. et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M. et al., YearImmunol. 7 (1993) 33-40) . The human antibodies can also be generated in a phage display library (e.g., Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597) . The term “human antibody” can also include antibodies modified in the constant regions.

[0042] As used herein, the term “chimeric antibody” generally refers to an engineered antibody which in its broadest sense contains one or more regions from one antibody and one or more regions from one or more other antibody (ies) . In particular a chimeric antibody comprises a VH domain and a VL domain of an antibody derived from a non-human animal, in association with a CH domain and a CL domain of another antibody, in particular a human antibody. As the non-human animal, any animal such as camel, mouse, rat, hamster, rabbit or the like can be used.

[0043] The term “bispecific antibody” as used herein refers to an antibody having two specificities to one or more antigens. For example, a bispecific antibody may comprise a first specificity to a first antigen (e.g., CD16A) and a second specificity to a second antigen (e.g., 5T4) different from the first antigen.

[0044] The term “multi-specific molecule” or “multi-specific antibody” as used interchangeably herein refers to a molecule or antibody having at least two specificities to at least two different antigens, with and without one or more additional functionalities. For example, a multi-specific antibody may comprise a first specificity to a first antigen (e.g., CD16A) and a second specificity to a second specificity to a second antigen (e.g., 5T4) , with additional functional domains such as IL-15 polypeptide and IL-15 receptor polypeptide (or a Sushi domain thereof) . A multi-specific molecule can be e.g. a bi-, tri-specific, tetra-or even more specific molecule. In this disclosure, a tri-specific molecule with one specificity to CD16A expressed on a NK cell and another specificity to a tumor specific antigen (or tumor associated antigen) such as 5T4, and an additional functional domain (such as IL-15 / IL-15Rαcomplex) , is sometimes referred to as tri-specific killer engage (or TriKE) .

[0045] As used herein, the term “percent identical” or “percent identity, ” in the context of two or more nucleic acids or polypeptide sequences, refers to the extent to which two or more sequences or subsequences that are the same. Two sequences are “identical” if they have the same sequence of amino acids or nucleotides over the region being compared. Two sequences are “substantially identical” if two sequences have a specified percentage of amino acid residues or nucleotides that are the same (i.e., 60%identity, optionally 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%or 99%identity over a specified region or, when not specified, over the entire sequence) , when compared and aligned for maximum correspondence over a comparison window or designated region as measured using one of the following sequence comparison algorithms or by manual alignment and visual inspection. Optionally, the identity exists over a region that is at least about 30 nucleotides (or 10 amino acids) in length or more preferably over a region that is 100 to 500 or 1000 or more nucleotides (or 20, 50, 200 or more amino acids) in length. Two examples of algorithms that are suitable for determining percent sequence identity and sequence similarity are the BLAST and BLAST 2.0 algorithms, which are described in Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, 1977; and Altschul et al , J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990, respectively.

[0046] Other than percentage of sequence identity noted above, another indication that two nucleic acid sequences or polypeptides are substantially identical is that the polypeptide encoded by the first nucleic acid is immunologically cross reactive with the antibodies raised against the polypeptide encoded by the second nucleic acid. Thus, a polypeptide is typically substantially identical to a second polypeptide, for example, where the two peptides differ only by conservative substitutions. Another indication that two nucleic acid sequences are substantially identical is that the two molecules or their complements hybridize to each other under stringent conditions. Yet another indication that two nucleic acid sequences are substantially identical is that the same primers can be used to amplify the sequence.

[0047] As used herein, the term “polypeptide” is used herein interchangeably with the term “protein” and refers to a polymer of amino acid residues. The terms apply to amino acid polymers in which one or more amino acid residue is an artificial chemical mimetic of a corresponding naturally occurring amino acid, as well as to naturally occurring amino acid polymers and non-naturally occurring amino acid polymer. Unless otherwise indicated, a particular polypeptide sequence also implicitly encompasses conservatively modified variants thereof.

[0048] The term "knob-into-hole" or "KiH" technology as used herein refers to the technology directing the pairing of two polypeptides together in vitro or in vivo by introducing a protuberance (knob) into one polypeptide and a cavity (hole) into the other polypeptide at an interface in which they interact. For example, KiHs have been introduced in the Fc: Fc binding interfaces, CL: CH1 interfaces or VH / VL interfaces of antibodies (see, e.g., US 2011 / 0287009, US2007 / 0178552, WO 96 / 027011, WO 98 / 050431, and Zhu et al., 1997, Protein Science 6: 781-788) . In some embodiments, KiHs drive the pairing of two different heavy chains together during the manufacture of multispecific antibodies. For example, multispecific antibodies having KiH in their Fc regions can further comprise single variable domains linked to each Fc region, or further comprise different heavy chain variable domains that pair with similar or different light chain variable domains. KiH technology can also be used to pair two different receptor extracellular domains together or any other polypeptide sequences that comprises different target recognition sequences (e.g., including affibodies, peptibodies and other Fc fusions) .

[0049] The term "knob mutation" as used herein refers to a mutation that introduces a protuberance (knob) into a polypeptide at an interface in which the polypeptide interacts with another polypeptide. In some embodiments, the other polypeptide has a hole mutation (see e.g., US 5,731,168, US 5,807,706, US 5,821,333, US 7,695,936, US 8,216,805, each incorporated herein by reference in its entirety) .

[0050] The term "hole mutation" as used herein refers to a mutation that introduces a cavity (hole) into a polypeptide at an interface in which the polypeptide interacts with another polypeptide. In some embodiments, the other polypeptide has a knob mutation (see e.g., US 5,731,168, US 5,807,706, US 5,821,333, US 7,695,936, US 8,216,805, each incorporated herein by reference in its entirety) .

[0051] "Complex" or "complexed" as used herein refers to the association of two or more molecules that interact with each other through bonds and / or forces (e.g., van der waals, hydrophobic, hydrophilic forces) that are not peptide bonds. In one embodiment, the complex is heteromultimeric.

[0052] The term "5T4" as used herein, refers to the protein entitled 5T4, which is also referred to as trophoblast glycoprotein, 5T4 oncofetal antigen, 5T4 oncofetal trophoblast glycoprotein, TPBG, WAIF1 and M6P1. It is a 72-80 kDa transmembrane protein with an extensively N-linked glycosylated core. In humans (Homo sapiens) , the 5T4 protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 (Human Trophoblast glycoprotein: Uniprot accession no. Q13641) . In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, amino acid residues 1-31 are a signal peptide, and amino acid residues 32-420 are the mature polypeptide. In cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) , the 5T4 protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (Uniprot accession no. Q4R8Y9) . In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, amino acid residues 1-34 are a signal peptide, and amino acid residues 35-420 are the mature polypeptide. In chicken (Gallus gallus) , the 5T4 protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (Uniprot accession no. R4GM46) . In the sequence shown in SEQ ID NO: 10, amino acid residues 1-27 are a signal peptide, and amino acid residues 28-379 are the mature polypeptide. In mouse (Mus musculus) , the 5T4 protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 (Uniprot accession no. Q9Z0L0.3) . In the sequence shown in SEQ ID NO: 11, amino acid residues 1-31 are a signal peptide, and amino acid residues 32-426 are the mature polypeptide.

[0053] When 5T4 is amplified or overexpressed in or on a cell, especially a cancer cell, the cell is referred to as being “5T4 positive” . Exemplary 5T4 positive cancers include, but are not limited to, solid cancers such as colorectal, breast, ovarian, lung (including non-small-cell lung (NSCLC) ) , gastric, liver, and renal carcinomas.

[0054] The term “IL-15 receptor” , “IL-15R” , “IL-15Ra” or “IL-15Rα” as used herein refers to a full-length naturally-occurring IL-15 receptor alpha (IL-15Ra) (e.g., a mammalian IL-15Ra, e.g., human IL-15Ra, e.g., GenBank Accession Number AAI21141.1) , an active fragment of IL-15Ra, or an active variant having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to a naturally-occurring wild type polypeptide of IL-15Ra or fragment thereof. As used herein, the terms IL-15R and IL-15Ra are interchangeable. The Sushi domain of IL-15Ra ( “IL-15RαSu” or “IL-15Rα Sushi” ) refers to a domain beginning at the first cysteine residue after the signal peptide of IL-15Ra, and ending at the fourth cysteine residue after said signal peptide.

[0055] The term “IL-15” as used herein refers to a full-length naturally-occurring IL-15 (e.g., a mammalian IL-15, e.g., human IL-15, e.g., GenBank Accession Number AAI00963.1) , an active fragment of IL-15, or an active variant having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to a naturally-occurring wild type polypeptide of IL-15 or fragment thereof. The variant includes a derivative, e.g., a mutant, of a wild type polypeptide or nucleic acid encoding the same. The IL-15 variant may have at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%activity of the wild type IL-15 polypeptide.

[0056] As used herein, the term “anti-tumor agent” or “antitumor drug” as used herein generally refers to any agent that can be used to treat a cell proliferative disorder such as cancer, including but not limited to, cytotoxic agents, chemotherapeutic agents, radiotherapy and radiotherapeutic agents, targeted anti-cancer agents, and immunotherapeutic agents.

[0057] As used herein, the term “anti-tumor activity” means a reduction in the rate of tumor cell proliferation, viability or metastatic activity. A possible way of showing anti-tumor activity is to show a decline in growth rate of tumor cells, tumor size stasis or tumor size reduction. Such activity can be assessed using accepted in vitro or in vivo tumor models, including but not limited to xenograft models, allograft models, MMTV models, and other known models known in the art to investigate anti-tumor activity.

[0058] As used herein, the term “subject” includes human and non-human animals. Non-human animals include all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as non-human primates, sheep, dog, cow, chickens, amphibians, and reptiles. Except when noted, the terms “patient” or “subject” are used herein interchangeably.

[0059] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” generally refers to one or more non-toxic substances that do not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient. Such formulations may typically contain salts, buffers, preservatives, compatible carriers, and optionally other therapeutic agents. Such pharmaceutically acceptable formulations may also typically contain compatible solid or liquid fillers, diluents, or encapsulating materials suitable for administration to humans. When used in medicine, the salt should be a pharmaceutically acceptable salt, but non-pharmaceutically acceptable salts can be conveniently used to prepare pharmaceutically acceptable salts and cannot be excluded from the scope of the present invention. Such pharmacologically and pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, salts prepared from the following acids: hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, maleic acid, acetic acid, salicylic acid, citric acid, boric acid, formic acid, malonic acid, succinic acid, etc. Pharmacologically acceptable salts can also be prepared as alkali metal salts or alkaline earth metal salts, such as sodium, potassium or calcium salts. The term “solvate” is used herein in the conventional sense to refer to a complex of a solute (e.g., an active compound, a salt of an active compound) and a solvent. Solvates usually do not significantly alter the physiological activity or toxicity of the compound and therefore can act as pharmacological equivalents. If the solvent is water, the solvent compound may be conveniently referred to as a hydrate, e.g., monohydrate, dihydrate, trihydrate, etc.

[0060] As used herein, the terms “treat, ” “treating, ” or “treatment” of any disease or disorder generally refer in one aspect, to ameliorating the disease or disorder (i.e., slowing or arresting or reducing the development of the disease or at least one of the clinical symptoms thereof) . In another aspect, “treat, ” “treating, ” or “treatment” refers to alleviating or ameliorating at least one physical parameter including those which may not be discernible by the patient. In yet another aspect, “treat, ” “treating, ” or “treatment” refers to modulating the disease or disorder, either physically, (e.g., stabilization of a discernible symptom) , physiologically, (e.g., stabilization of a physical parameter) or both. In yet another aspect, “treat, ” “treating, ” or “treatment” refers to preventing or delaying the onset or development or progression of the disease or disorder.

[0061] As used herein, the term “therapeutically acceptable amount” or “therapeutically effective dose” interchangeably refers to an amount sufficient to effect the desired result (i.e., a reduction in tumor size, inhibition of tumor growth, prevention of metastasis, inhibition or prevention of viral, bacterial, fungal or parasitic infection) . In some embodiments, a therapeutically acceptable amount does not induce or cause undesirable side effects. A therapeutically acceptable amount can be determined by first administering a low dose, and then incrementally increasing that dose until the desired effect is achieved. A “prophylactically effective dosage, ” and a “therapeutically effective dosage, ” of the molecules of the present disclosure can prevent the onset of or result in a decrease in severity of, respectively, disease symptoms, including symptoms associated with cancer.

[0062] As used herein, the terms “comprising” , “containing” , “having” , “include” , and “including” are to be construed as “including, but not limited to” unless otherwise noted. The terms “a, ” “an, ” and “the” and similar referents in the context of describing the invention and, specifically, in the context of the appended claims, are to be construed to cover both the singular and the plural unless otherwise noted. The use of any and all examples or exemplary language ( “for example” , “e.g. ” , “such as” ) is intended merely to illustrate aspects or embodiments of the invention and is not to be construed as limiting the scope thereof, unless otherwise claimed.

[0063] As used herein, the term “about” when referring to a measurable value such as an amount, a temporal duration, and the like, is meant to encompass variations of ±20%or in some instances ±10%or in some instances ±5%or in some instances ±1%or in some instances ±0.1%from the specified value, as such variations are appropriate to perform the disclosed methods.

[0064] The term “vector” includes shuttle and expression vectors. Typically, a vector could be a plasmid construct that also includes an origin of replication (e.g., the Col E1 origin of replication) and a selectable marker (e.g., ampicillin or tetracycline resistance) , for replication and selection, respectively, of plasmids in bacteria. An “expression vector” refers to a vector that contains the necessary control sequences or regulatory elements for expression of the antibodies including antibody fragment of the present disclosure, in bacterial or eukaryotic cells.

[0065] Multi-specific Molecules Targeting 5T4

[0066] A first aspect of the disclosure provides a multi-specific molecule comprising: (a) an anti-5T4 antibody comprising two heavy chains and two light chains; (b) an IL-15 polypeptide, covalently linked to C-terminus of one of the two heavy chains of the anti-5T4 antibody; (c) an IL-15Rα Sushi polypeptide, covalently linked to C-terminus of the other of the two heavy chains of the anti-5T4 antibody; and (d) an anti-CD16A VHH polypeptide, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide.

[0067] Anti-5T4 Antibodies

[0068] In the present disclosure, any IgG antibodies binding specifically to 5T4 are expected to be used in the multi-specific molecules described herein. In some embodiments, an anti-5T4 antibody specifically binding to a human, monkey, chicken or mouse 5T4 mature polypeptide are used in the multi-specific molecules described herein. Human 5T4 mature polypeptide, e.g., has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8. Monkey 5T4 mature polypeptide, e.g., has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9. Chicken 5T4 mature polypeptide, e.g., has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10. Mouse 5T4 mature polypeptide, e.g., has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.

[0069] Anti-5T4 antibodies are widely described and available in the art. In the present disclosure, the anti-5T4 antibodies can be a human antibody, a chimeric antibody, or a humanized antibody, with human or humanized ones preferable. In the present disclosure, the anti-5T4 antibodies can be an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 subtype antibodies, with IgG1 subtype be preferable. In preferable embodiments, the anti-5T4 antibodies used in the multi-specific molecules described herein are human or humanized IgG1 subtype anti-5T4 antibodies.

[0070] These anti-5T4 antibodies are available or engineered to be available from the disclosure of, e.g., WO2024197151A1, WO2024208145A1, WO2024183811A1, WO2024179528A1, WO2024140904A1, WO2023220626A1, CN116769036A, WO2023107954A1, WO2007106744A2, and etc.

[0071] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition.

[0072] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, GAS, and 23, respectively, according to IMGT definition.

[0073] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively.

[0074] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 39 and 40, respectively.

[0075] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 41 and 42, respectively.

[0076] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 43 and 44, respectively.

[0077] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 45 and 46, respectively.

[0078] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 47 and 48, respectively.

[0079] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 49 and 50, respectively.

[0080] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition, and comprises a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region.

[0081] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, GAS, and 23, respectively, according to IMGT definition, and comprises a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region.

[0082] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively, and comprises a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region.

[0083] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 39 and 40, respectively, and comprises a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region.

[0084] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 41 and 42, respectively, and comprises a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region.

[0085] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 43 and 44, respectively, and comprises a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region.

[0086] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 45 and 46, respectively, and comprises a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region.

[0087] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 47 and 48, respectively, and comprises a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region.

[0088] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 49 and 50, respectively, and comprises a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region.

[0089] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition, and comprises a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region.

[0090] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, GAS, and 23, respectively, according to IMGT definition, and comprises a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region.

[0091] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively, and comprises a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region.

[0092] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 39 and 40, respectively, and comprises a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region.

[0093] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 41 and 42, respectively, and comprises a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region.

[0094] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 43 and 44, respectively, and comprises a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region.

[0095] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 45 and 46, respectively, and comprises a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region.

[0096] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 47 and 48, respectively, and comprises a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region.

[0097] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 49 and 50, respectively, and comprises a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region.

[0098] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition, and comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively.

[0099] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, GAS, and 23, respectively, according to IMGT definition, and comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively.

[0100] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively, and comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively.

[0101] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 39 and 40, respectively, and comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively.

[0102] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 41 and 42, respectively, and comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively.

[0103] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 43 and 44, respectively, and comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively.

[0104] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 45 and 46, respectively, and comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively.

[0105] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 47 and 48, respectively, and comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively.

[0106] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 49 and 50, respectively, and comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively.

[0107] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition, and comprises a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.

[0108] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, GAS, and 23, respectively, according to IMGT definition, and comprises a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.

[0109] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively, and comprises a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.

[0110] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 39 and 40, respectively, and comprises a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.

[0111] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 41 and 42, respectively, and comprises a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.

[0112] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 43 and 44, respectively, and comprises a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.

[0113] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 45 and 46, respectively, and comprises a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.

[0114] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 47 and 48, respectively, and comprises a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.

[0115] In some embodiments, the anti-5T4 antibody of the multi-specific molecule is an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 49 and 50, respectively, and comprises a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.

[0116] IL-15 Polypeptides

[0117] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is a human IL-15 polypeptide.

[0118] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4.

[0119] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is linked to the heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0120] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering scheme.

[0121] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering scheme.

[0122] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide is a human IL-15 polypeptide and linked to the heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering scheme.

[0123] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4 and the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is linked to the heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering scheme.

[0124] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is linked to the heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38 and the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is linked to the heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering scheme.

[0125] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4, is linked to the heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38, and is linked to the heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering scheme.

[0126] IL-15Rα Sushi Polypeptides

[0127] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is a human IL-15Rα sushi polypeptide.

[0128] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 3.

[0129] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is linked to the heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0130] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering.

[0131] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering.

[0132] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is a human IL-15Rα sushi polypeptide and linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering.

[0133] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is linked to a heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38 and to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering.

[0134] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is a human IL-15Rα sushi polypeptide, linked to a heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38 and to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering.

[0135] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 3, linked to a heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38, and to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering.

[0136] Anti-CD16A VHH Polypeptides

[0137] In the present disclosure, any VHH binding specifically to CD16A are expected to be used in the multi-specific molecules described herein. In some embodiments, an anti-CD16A VHH specifically binding to a human, monkey, chicken or mouse CD16A polypeptide (either 158V or 158F or both) are used in the multi-specific molecules described herein. Human CD16A (158V) polypeptide, e.g., has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 61. Monkey CD16A polypeptide, e.g., has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 58. Mouse CD16A polypeptide, e.g., has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 59. Rat CD16A polypeptide, e.g., has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 60.

[0138] Anti-CD16A VHH are widely described and available in the art. In the present disclosure, the anti-CD16A VHH can be a human antibody, a chimeric antibody, or a humanized antibody, with human or humanized ones being preferable. These anti-CD16A VHH are available or engineered to be available from the disclosure of, e.g., WO2024206126A1, WO2023274183A1, WO2023079493A1, WO2023078968A1, CN112679609A, WO2017219974A1, CN113912726B and etc.

[0139] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 27, 28, and 29, respectively, according to Kabat definition.

[0140] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, respectively, according to IMGT definition.

[0141] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 26.

[0142] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 51.

[0143] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 52.

[0144] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 53.

[0145] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 54.

[0146] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 55.

[0147] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 56.

[0148] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 57.

[0149] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0150] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 27, 28, and 29, respectively, according to Kabat definition, and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0151] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, respectively, according to IMGT definition, and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0152] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 26 and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0153] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 51 and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0154] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 52 and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0155] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 53 and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0156] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 54 and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0157] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 55 and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0158] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 56 and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0159] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 57 and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0160] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptides linked to the IL-15 polypeptide and to the IL-15Rα sushi polypeptide have same CDRs. In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptides linked to the IL-15 polypeptide and to the IL-15Rα sushi polypeptide have different CDRs. In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptides linked to the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα sushi polypeptide have same amino acid sequences.

[0161] In preferable embodiments, provided is a multi-specific molecule comprising:

[0162] (a) an anti-5T4 antibody comprising a first heavy chain comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24 and a first heavy chain constant region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24 and a second heavy chain constant region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 35, and two light chains with each light chain comprising a light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 25 and a light chain constant region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 36;

[0163] (b) an IL-15 polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4, covalently linked to C-terminus of the second heavy chain of the anti-5T4 antibody, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38;

[0164] (c) an IL-15Rα Sushi polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3, covalently linked to C-terminus of the first heavy chain of the anti-5T4 antibody, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and

[0165] (d) an anti-CD16A VHH polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 26, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0166] In preferable embodiments, provided is a multi-specific molecule comprising:

[0167] (a) an anti-5T4 antibody comprising a first heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5 and a second heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 6, and two light chains each having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2;

[0168] (b) an IL-15 polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4, covalently linked to C-terminus of the second heavy chain of the anti-5T4 antibody, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38;

[0169] (c) an IL-15Rα Sushi polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3, covalently linked to C-terminus of the first heavy chain of the anti-5T4 antibody, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and

[0170] (d) an anti-CD16A VHH polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 26, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0171] In preferable embodiments, provided is a multi-specific molecule comprising:

[0172] (a) an anti-5T4 antibody comprising two heavy chains each having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1, and two light chains each having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2;

[0173] (b) an IL-15 polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4, covalently linked to C-terminus of one of the heavy chains of the anti-5T4 antibody, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38;

[0174] (c) an IL-15Rα Sushi polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3, covalently linked to C-terminus of the other of the heavy chains of the anti-5T4 antibody, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and

[0175] (d) an anti-CD16A VHH polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 26, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0176] Polypeptides, Polynucleotides, Vectors, and Host Cells

[0177] Polypeptides

[0178] A second aspect of the disclosure provides a plurality of polypeptides.

[0179] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-5T4 antibody, a heavy chain constant region of the anti-5T4 antibody, an IL-15Rα Sushi polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0180] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-5T4 antibody, a heavy chain constant region of the anti-5T4 antibody, an IL-15 polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0181] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-5T4 antibody, a heavy chain constant region of the anti-5T4 antibody, a peptide linker, an IL-15Rα Sushi polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0182] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-5T4 antibody, a heavy chain constant region of the anti-5T4 antibody, a peptide linker, an IL-15 polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0183] In any one of the embodiments described above under this section, the anti-5T4 antibody may be any one of the anti-5T4 antibodies described above under the section subtitled Anti-5T4 Antibodies.

[0184] In any one of the embodiments described above under this section, the IL-15 polypeptide may be any one of the IL-15 polypeptides described above under the section subtitled IL-15 Polypeptides.

[0185] In any one of the embodiments described above under this section, the IL-15RαSushi polypeptide may be any one of the IL-15Rα Sushi polypeptides described above under the section subtitled IL-15Rα Sushi Polypeptides.

[0186] In any one of the embodiments described above under this section, the anti-CD16A VHH polypeptide may be any one of the anti-CD16A VHH polypeptides described above under the section subtitled Anti-CD16A VHH Polypeptides.

[0187] In any one of the embodiments described above under this section, the linker may be independently a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38. In preferable embodiments, all the linkers contained in the same molecule are the same. In preferable embodiments, all the linkers contained in the same molecule are the same and have an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 38.

[0188] In preferable embodiments, provided is a polypeptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or 6. In preferable embodiments, provided is a polypeptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5. In preferable embodiments, provided is a polypeptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:6.

[0189] Polynucleotides, Vectors, and Host Cells

[0190] Additional aspects of the disclosure provide a polynucleotide encoding any one of the multi-specific molecules and the polypeptides described above.

[0191] In some embodiments, provided is a polynucleotide encoding any one of the polypeptides described above. In some embodiments, provided is a polynucleotide encoding a polypeptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5. In some embodiments, provided is a polynucleotide encoding a polypeptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.

[0192] In some embodiments, the polynucleotide is DNA, cDNA or RNA. In some embodiments, polynucleotide is cDNA. In some embodiments, polynucleotide is mRNA.

[0193] In some embodiments, provided is a vector comprising the polynucleotide. In some embodiments, the vector is an expression vector. In some embodiments, the vector is a plasmid. In some embodiments, the plasmid is from E. coli. In some embodiments, the vector is a viral vector. In some embodiments, the viral vector is an AAV vector. In some embodiments, the viral vector is an AAV vector comprising the polynucleotide in the form of mRNA.

[0194] In some embodiments, provided is a host cell comprising the vector or the polynucleotide. In some embodiments, the host cell is a prokaryotic cell. In some embodiments, the host cell is a non-human eukaryotic cell. In some embodiments, the host cell is a HEK cell. In some embodiments, the host cell is a Vero cell. In some embodiments, the host cell is a CHO cell.

[0195] Pharmaceutical Compositions

[0196] The present disclosure, in another aspect, provides a pharmaceutical composition comprising a multi-specific molecule, a polypeptide, a vector, or a host cell ( “collectively referred to as active ingredient” ) , as disclosed herein above, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0197] The present compositions can be in any form that allows for the composition to be administered to a patient. For example, the composition can be in the form of a solid, liquid or gas (aerosol) . Typical routes of administration include, without limitation, oral, topical, parenteral, sublingual, rectal, vaginal, ocular, intra-tumor, and intranasal. Parenteral administration includes subcutaneous injections, intravenous, intramuscular, intrasternal injection or infusion techniques. In one aspect, the compositions are administered parenterally. In yet another aspect, the compositions are administered intravenously.

[0198] Pharmaceutical compositions can be formulated so as to allow the active ingredient to be bioavailable upon administration of the composition to a patient. Compositions can take the form of one or more dosage units, where for example, a tablet can be a single dosage unit, and a container in aerosol form can hold a plurality of dosage units.

[0199] Materials used in preparing the pharmaceutical compositions can be non-toxic in the amounts used. It will be evident to those of ordinary skill in the art that the optimal dosage of the active ingredient (s) in the pharmaceutical composition will depend on a variety of factors. Relevant factors include, without limitation, the type of animal (e.g., human) , the particular form of the active ingredient, the manner of administration, and the employed composition.

[0200] The pharmaceutically acceptable carrier or vehicle can be particulate, so that the compositions are, for example, in tablet or powder form. The carrier (s) can be liquid, with the compositions being, for example, an oral syrup or injectable liquid. In addition, the carrier (s) can be gaseous or particulate, so as to provide an aerosol composition useful in, e.g., inhalatory administration.

[0201] The composition can be in the form of a liquid, e.g., an elixir, syrup, solution, emulsion or suspension. The liquid can be useful for oral administration or for delivery by injection. When intended for oral administration, a composition can comprise one or more of a sweetening agent, preservatives, dye / colorant and flavor enhancer. In a composition for administration by injection, one or more of a surfactant, preservative, wetting agent, dispersing agent, suspending agent, buffer, stabilizer and isotonic agent can also be included.

[0202] The liquid compositions, whether they are solutions, suspensions or other like form, can also include one or more of the following: sterile diluents such as water for injection, saline solution, preferably physiological saline, Ringer’s solution, isotonic sodium chloride, fixed oils such as synthetic mono or digylcerides which can serve as the solvent or suspending medium, polyethylene glycols, glycerin, cyclodextrin, propylene glycol or other solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl paraben; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; buffers such as acetates, citrates or phosphates and agents for the adjustment of tonicity such as sodium chloride or dextrose. A parenteral composition can be enclosed in ampoule, a disposable syringe or a multiple-dose vial made of glass, plastic or other material. Physiological saline is an exemplary adjuvant. An injectable composition is preferably sterile.

[0203] The amount of the active ingredient that is effective in the treatment of a particular disorder or condition will depend on the nature of the disorder or condition and can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro or in vivo assays can optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. The precise dose to be employed in the compositions will also depend on the route of administration, and the seriousness of the disease or disorder, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient’s circumstances.

[0204] The compositions comprise an effective amount of an active ingredient such that a suitable dosage will be obtained. Typically, this amount is at least about 0.01%of an active ingredient by weight of the composition. When intended for oral administration, this amount can be varied to range from about 0.1%to about 80%by weight of the composition. In one aspect, oral compositions can comprise from about 4%to about 50%of the active ingredient by weight of the composition. In yet another aspect, present compositions are prepared so that a parenteral dosage unit contains from about 0.01%to about 2%by weight of the active ingredient.

[0205] For intravenous administration, the composition can comprise from about 0.01 to about 100 mg of an active ingredient per kg of the animal’s body weight. In one aspect, the composition can include from about 1 to about 100 mg of an active ingredient per kg of the animal’s body weight. In another aspect, the amount administered will be in the range from about 0.1 to about 25 mg / kg of body weight of the active ingredient.

[0206] Generally, the dosage of an active ingredient administered to a patient is typically about 0.01 mg / kg to about 2000 mg / kg of the animal’s body weight. In one aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.01 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal’s body weight, in another aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.1 mg / kg and about 250 mg / kg of the animal’s body weight, in yet another aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.1 mg / kg and about 20 mg / kg of the animal’s body weight, in yet another aspect the dosage administered is between about 0.1 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal’s body weight, and in yet another aspect, the dosage administered is between about 1 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal’s body weight.

[0207] The pharmaceutical compositions provided herein can further comprise one or more additional anti-cancer agent available in the market.

[0208] Uses and Therapies

[0209] The multi-specific molecule, the polypeptide, the vector, and the host cell (“collectively referred to as active ingredient” ) , as disclosed herein above, are useful for treating a 5T4 positive cancer in a patient. The active ingredient can be used accordingly in a variety of settings for the treatment of animal cancers. Without being bound by theory, in one embodiment, the active ingredient disclosed herein binds to or associates with CD16A expressed on, or associated with, the NK cell surface, to 5T4 expressed on a tumor cell and forms a “NK engager” to induce the NK cells to kill the tumor cells. In the present disclosure, the NK engager is further enhanced due to the IL-15 / IL-15Ra complex.

[0210] The present disclosure, in a further aspect, provides a method for treating a 5T4 positive cancer in a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the active ingredient disclosed herein.

[0211] The present disclosure, in a further aspect, provides a method for prevention of a 5T4 positive cancer in a subject at a risk of suffering from the cancer, comprising administering to the subject a prophylactically effective amount of the active ingredient disclosed herein.

[0212] In some embodiments, provided are methods for treating or preventing a 5T4 positive cancer are provided, including administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of the active ingredient disclosed herein and a chemotherapeutic agent. In one embodiment, the chemotherapeutic agent is that with which treatment of the cancer has not been found to be refractory. In another embodiment, the chemotherapeutic agent is that with which the treatment of cancer has been found to be refractory. The active ingredient can be administered to a patient that has also undergone surgery as treatment for the cancer. In some embodiments, the patient has been found to be refractory to a 5T4 antibody.

[0213] In a specific embodiment, the active ingredient is administered concurrently with the chemotherapeutic agent or with radiation therapy. In another specific embodiment, the chemotherapeutic agent or radiation therapy is administered prior or subsequent to administration of the active ingredient, in one aspect at least an hour, five hours, 12 hours, a day, a week, a month, in further aspects several months (e.g., up to three months) , prior or subsequent to administration of the active ingredient.

[0214] Additionally, methods of treatment of a 5T4 positive cancer with the active ingredient disclosed herein are provided as an alternative to chemotherapy or radiation therapy where the chemotherapy or the radiation therapy has proven or can prove too toxic, e.g., results in unacceptable or unbearable side effects, for the subject being treated. The animal being treated can, optionally, be treated with another cancer treatment such as surgery, radiation therapy or chemotherapy, depending on which treatment is found to be acceptable or bearable.

[0215] In some instances, the 5T4 positive cancer is a 5T4 positive solid tumor. Additionally, or alternatively, the 5T4 positive cancer may be a locally advanced or metastatic 5T4 positive cancer. Exemplary 5T4 positive cancers include, but are not limited to, colorectal, breast, ovarian, lung (including non-small-cell lung (NSCLC) ) , gastric, liver, and renal carcinomas.

[0216] Equivalently, the present disclosure also provides the active ingredient as disclosed herein for use in the treatment of a 5T4 positive cancer in a subject. Equivalently, the present disclosure also provides use of the active ingredient as disclosed herein in the manufacturing of a medicament for treatment of a 5T4 positive cancer in a subject. Examples

[0217] The following examples are included to demonstrate preferred embodiments of the present invention and should not be used to limit the scope of the claims.

[0218] Example 1: Design TriKE with KiH mutations

[0219] This example shows construction and engineering of an exemplary triKE of the present disclosure.

[0220] A bispecific antibody (BMP02-10) was constructed using an anti-5T4 IgG1 antibody m603 (HC: SEQ ID NO: 1 and LC: SEQ ID NO: 2) as a building block and a selected CD16A VHH (SEQ ID NO: 26) was fused via (G4S) 4 linker (SEQ ID NO: 38) to the C termini of the heavy chains of m603. The light chain (SEQ ID NO: 2) of m603 was not modified.

[0221] Trispecific antibody BMP05-02 exemplified in the examples was constructed by fusing IL-15 (SEQ ID NO: 4) to C-terminal of m603 hole heavy chain (SEQ ID NO: 6) with (G4S) 4 linkers (SEQ ID NO: 38) , while IL-15RαSu (SEQ ID NO: 3) to C-terminal of m603 knob heavy chain (SEQ ID NO: 5) with (G4S) 4 linkers (SEQ ID NO: 38) , and CD16A VHHs (SEQ ID NO: 26) to C-terminal of IL-15 and IL-15RαSu with (G4S) 4 linkers (SEQ ID NO: 38) . The light chain (SEQ ID NO: 2) of m603 was not modified. The format is illustrated in Figure 1.

[0222] Example 2: CHO production and binding characterization of trispecific to 5T4 by ELISA

[0223] This example demonstrates CHO production and binding characterization of trispecific to 5T4 protein by ELISA.

[0224] Different heavy chains together with corresponding light chain were transiently co-expressed in the ExpiCHO-S cell line (Thermo, A29127) to generate trispecific antibodies. The protein from the ExpiCHO-S supernatant was purified using HiTrap MabSelect PrismA (Cytiva, 17549854) , then further purified using POROSTM GoPureTM XS (Thermo, A36638) through AKTA avant150 following manufacturer's instructions. The purified antibody was subjected to in vitro binding and functional characterizations.

[0225] The 5T4 proteins from different species including human (KACTUS, 5T4-HM101) , cynomolgus (KACTUS, 5T4-CM101) , mouse (KACTUS, 5T4-MM401) and rat (ACRO, TPG-R52H6) were coated on the ELISA plate 4℃ overnight, then washed with PBS containing 0.05%Tween20 (PBST) . Serially diluted trispecific antibody BMP03 and control antibodies were added to coated ELISA plate and incubated at 37℃ for 1 hour, and the binding ability of trispecific antibody to 5T4 was detected with an HRP-conjugated Goat anti-human Fab antibody (Sigma-Aldrich, A0293) . The ELISA results showed the binding of BMP05-02 trispecific antibody and control antibody to human, cynomolgus, mouse and rat 5T4 proteins. Detailed results were shown in Figure 2.

[0226] In experiments performed essentially as described above, trispecific antibodies BMP05-02 bonded to human and cynomolgus 5T4 with affinity below nanomolar. BMP05-02, BMP02-10 and m603 showed similar binding affinities on human, cynomolgus 5T4, and none of them showed cross-binding to mouse or rat 5T4. The detailed results were shown in Figure 2 and Table 1.

[0227] Table 1: EC50 for Binding of BMP05-02, BMP02-10, m603 and IgG1κ isotype to human, cynomolgus, mouse and rat 5T4 on ELISA

[0228] Example 3: Binding characterization of trispecific to huCD16A by SPR.

[0229] Full binding kinetic study of BMP05-02 to human CD16A by SPR was performed on a BIAcore T200 instrument (Cytiva) .

[0230] For both human CD16A158V and 158F, the antigens were immobilized indirectly on a Series S Sensor Chip CM5 (Cytiva, 29149603) pre-labeled using the His Capture Kit (Cytiva, 29234602) . The analytes were then injected at different concentrations for 100 s and allowed to dissociate for 300 s. Regeneration of the BMP05-02 surface was performed using a 30 s injection of 3 M magnesium chloride. Evaluation of the binding curves was done using Biacore Insight Evaluation Software. Kinetic analysis was performed by fitting 1: 1 binding model.

[0231] In experiments performed essentially as described above, trispecific antibody BMP05-02 bond to human CD16A with high affinity. Its affinity to human CD16A 158V and 158F was determined to be 12.8 nM and 0.636 nM by SPR, respectively. Results were shown in Figure 3 and summarized in Table 2.

[0232] Table 2: Binding affinities of BMP05-02 to human CD16A 158F and human CD16A 158V

[0233] Example 4: Cross-binding with CD122 / CD132 heterodimer receptor from different species

[0234] The binding of trispecific antibodies to CD122 / CD132 (IL-2Rβγ or IL-15Rβγ) heterodimeric receptor protein from different species including human, cynomolgus, mouse and rat were characterized by ELISA. The heterodimer protein from human (ACROBiosystems, ILG-H5283) , cynomolgus (ACROBiosystems, ILG-C5283) , mouse (ACROBiosystems, ILG-M5283) and rat (ACROBiosystems, ILG-R5283) were coated on the ELISA plate 4℃ overnight, then washed with PBS containing 0.05%Tween20 (PBST) . Serially diluted trispecific antibody BMP05-02 and the positive control N-803 (MCE, HY-P99661) were added to coated ELISA plate and incubated at 37℃ for 1 hour, and the binding ability of trispecific antibody to the heteromeric receptor was detected with an HRP-conjugated Goat anti-human Fc antibody (Jackson Immuno Research, 109-035-098) . The ELISA results showed the binding of BMP05-02 trispecific antibody and control antibody N-803 to human, cynomolgus, mouse and rat CD122 / CD132 heterodimers. Detailed results were shown in Figure 4.

[0235] In experiments performed essentially as described above, trispecific antibodies BMP05-02 bonded to IL-15Rβγ with much weaker binding than N-803. N-803 bond to human IL-15Rβγ with high EC50 at 0.0388 nM, while trispecific antibody BMP05-02 bond to human IL-15Rβγ with much lower EC50 at 27.1 nM. There was around 700-fold decreased affinity.

[0236] Example 5: Binding characterization of trispecific to CD122 / CD132 heterodimer by SPR.

[0237] Full binding kinetic study of BMP05-02 to human and monkey CD122 / CD132 (IL-2Rβγ or IL-15Rβγ) by SPR was performed on a BIAcore 8K instrument (Cytiva) .

[0238] For both human and monkey CD122 / CD132 heterodimer, around 400 RU of BMP05-02 and N-803 were immobilized directly on a Series S Sensor Chip CM5 (Cytiva, 29149603) with immobilization buffer (10 mM Sodium Acetate, pH4.5) . The analytes were then injected at different concentrations (BMP05-02 was between 7.813 and 500 nM, while N-803 was between 0.977 and 62.5 nM) for 90 s and allowed to dissociate for 210 s. Regeneration of the BMP05-02 surface was performed using a 30 s injection of 3 M magnesium chloride. Evaluation of the binding curves was done using Biacore Insight Evaluation Software. Kinetic analysis was performed by fitting 1: 1 binding model.

[0239] In experiments performed essentially as described above, trispecific antibody BMP05-02 bond to CD122 / CD132 with much lower affinity than N-803. The affinities to human CD122 / CD132 heterodimer of BMP05-02 and N-803 were determined to be 11.3 nM and 6.25 pM by SPR, respectively. The affinities to monkey CD122 / CD132 heterodimer of BMP05-02 and N-803 were determined to be 15.2 nM and 0.371 nM by SPR, respectively. Results were shown in Figure 5 and summarized in Table 3.

[0240] Table 3: Binding affinities of BMP05-02 to human and monkey CD122 / CD132 heterodimer

[0241] Example 6: IL-15 receptor assay

[0242] This example demonstrates evaluation of IL-15 biological activity of BMP05-02 antibody by luciferase reporter assay using hIL2 / IL15 dual effector (hCD122 / hCD132) reporter cells.

[0243] IL-2 and IL-15 share the heterodimeric CD122 (IL-2Rβ)  / CD132 (IL-2Rγ) receptor to deliver their signals within target cells. Their specificity of action is conferred by their αreceptor chains, CD25 (IL-2Rα) and CD215 (IL-15Rα) . The binding of IL-15 or IL-15 / IL-15RαSu complex to their heterodimeric or heterotrimeric receptors leads to the activation of a signaling cascade through tyrosine kinases of the Janus family (JAK1 and JAK3) and signal transducer and transcription activator 5 (STAT5) . Thus, IL-15 activity can be measured using hIL2 / IL15 dual effector (hCD122 / hCD132) reporter cell (Cobier, CBP74170) that expresses an inducible produced firefly luciferase after IL-15 receptor activation.

[0244] The day before experiment, hIL2 / IL15 dual effector (hCD122 / hCD132) reporter cells were inoculated onto 96 plates at a density of 5×105 per well, 100 μL / well, and cultured overnight at 37℃ in a 5%CO2 incubator. On the day of the experiment, the antibody to be tested was diluted 3 times in RPMI-1640 medium containing 10%heat-inactivated FBS. Then 11.1 μL diluted antibody was added to each well containing effector cells and cultured further in a 5%CO2 incubator at 37℃ for 6 hours. Recombinant human IL-15 (Sino Biological, GMP-10360-HNAE) was used as assay controls. At the end of incubation, 100 μL of Ultra Luciferase Detection Kit (Cobier) reaction substrate was added to each well, pipette repeatedly to lyse the cells, leave at room temperature for 3-10 min, then transfer the lysate to a 96-well white plate to avoid the generation of air bubbles, and use a microplate reader to detect the fluorescence value. The relative light unit (RLU) value of the test well was shown and putted into GraphPad Prism software for statistical analysis and graphing.

[0245] In experiments performed essentially as described above, BMP05-02, N-803 and rhIL-15 treatments resulted in induction of luciferase production in a dose dependent manner, while N-803 and rhIL-15 demonstrated superior activity compared to BMP05-02 with regards to EC50. EC50 for N-803, rhIL-15 and BMP05-02 were 0.05696 nM, 0.5532 nM and 61.66 nM respectively. Compared to N-803, there was more than 1000-fold decreased reporter activity of BMP05-02. BMP02-10 and m603 showed no signal here since they don’ t contain IL-15 in structures. Detailed results were shown in Figure 6.

[0246] Example 7: T cell activation

[0247] This example demonstrates the T cell-activation potency of BMP05-02 antibody. T cell function was assessed based on proliferation and expression of activation markers.

[0248] CD3+ T cells were isolated from PBMCs (Oricells) using human CD3 MicroBeads (Miltenyi Biotec, 130-097-043) following manufacturer's instructions. 1×105  / 100 μL / well T-cells were seeded in 2 96-well plates, and stimulated with 50 μL 3-times serial-diluted antibodies with KBM 581 media. IL-2 was used as positive control. Cells were incubated for 72 hours at 37℃ in a 5%CO2 incubator, then phase contrast images were collected. A96-well plate of T-cells were seeded and stimulated for 96 hours at 37℃ in a 5%CO2 incubator. Afterward, cells were subjected to immunostaining and fluorescent analysis. Cells were collected and stained with CD3-Alexa Flour 700 (Invitrogen, 56-0038-42) , CD4-APC (BioLegend, 300514) , CD8-eFluor 450 (Invitrogen, 48-0088-42) , CD25-R-PE (BioLegend, 356105) and CD69-Alexa Fluor 488 (BioLegend, 310916) under corresponding conditions, after which flowcytometry and fluorescent-pattern analysis were conducted using the AttuneTM NxT flow cytometer (Invitrogen, A24860) and FlowJo analysis software.

[0249] In experiments performed essentially as described above, T-cell activation was determined by observing cell proliferation and measuring the expression of CD69 and CD25 on T cells, which was assessed through immunostaining. As shown in Figure 7, BMP05-02 treatments resulted in apparent cell expansion, which indicated an increase of T-cell proliferation, just like IL-2. BMP05-02 also exhibited dose-dependent enhancement of the expression of activation markers. CD3+T-cells derived from PBMC expressed CD69 in the early stage under BMP05-02 or IL-2 stimulation (data not shown) , and both CD4+T-cells and CD8+T-cells expressed more CD25, which was upregulated by the presence of IL-2 or IL-15. Detailed results were shown in Figure 8.

[0250] Example 7: ADCC reporter assay

[0251] This example demonstrates evaluation of ADCC biological activity of BMP05-02 antibody by luciferase reporter assay using Jurkat / NFAT-luc-CD16A transgenic cell line as effector cells and 5T4 expressing tumor cell line as target cells.

[0252] The day before the ADCC experiment, 5T4+ / -target cells were inoculated onto 96 plates at a density of 2×104 per well, 100 μL / well, and cultured overnight at 37℃ in a 5%CO2 incubator. On the day of the experiment, the antibody to be tested was diluted 5 times in RPMI-1640 medium containing 10%heat-inactivated FBS. 50 μL diluted antibody was added to each well containing target cells. Human IgG1κ isotype (MCE, HY-P99001) was used as negative control. Then 2×104 Jurkat-NFAT-Luc2-CD16a-158V or Jurkat-NFAT-Luc2-CD16a-158F effector cells (50 μL / well) were added to the wells and cultured further in a 5%CO2 incubator at 37℃ for 6 hours. At the end of incubation, 100 μL of Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega, E2520) reaction substrate was added to each well, pipette repeatedly to lyse the cells, leave at room temperature for 5-30 min, then transfer the lysate to a 96-well white plate to avoid the generation of air bubbles, and use a microplate reader to detect the fluorescence value.

[0253] The ADCC Luciferase induction fold is calculated by the fold change of the relative light unit (RLU) value of the test well and the control well (simulated buffer reaction with target cells and effector cells) : Fold change = (RLU test drug-RLU culture medium control)  / (RLU NC-RLU culture medium control) , using GraphPad Prism software for statistical analysis and graphing.

[0254] Culture medium control: only add culture medium

[0255] NC control: target cells + effector cells without samples to be tested

[0256] In experiments performed essentially as described above, BMP05-02 treatment resulted in induction of ADCC in a dose and target cell dependent manner on different target cell lines. BMP05-02 shows 5T4 antigen-dependent ADCC when comparing MC38 and MC38-5T4 as target cell (Table 4) . . BMP05-02 had good ADCC activity regardless of CD16 genotype. Detailed results were shown in Figure 7.

[0257] Table 4. EC50 of luciferase activity of Jurkat T-CD16A-158F or 158V cells after incubation with antibodies

[0258] Example 8: NK cell killing assay

[0259] This example demonstrates enhancement of NK cell killing activity of BMP05-02 antibody by cell counting kit-8 assay using NK expanded from PBMC as effector cells and 5T4-expressing tumor cell lines as target cells.

[0260] One day before NK killing experiment, 1×104 / 100μL target cells were seeded in a 96 plate and incubated overnight at 37℃ in a 5%CO2 incubator. On the day of the experiment, the antibody to be tested was serially diluted 5 times with RPMI-1640 medium. The target cell culture medium was discarded, and 50 μL diluted antibody were added to each well containing target cells. Then 3×104 NK cells expanded from isolated human PBMCs were added to each well at 50 μL / well. Set up the following three groups of controls at the same time. (1) Target cell maximum growth group: same amount of target cells and 100 μL test medium without test molecules; (2) Antibody-independent cytotoxicity group: same amount of target cells and effector NK cells with 50 μL medium without test molecules; and (3) Media only group: same total amount of 100 μL medium as other wells. Incubate further for 48-72 hours in a 5%CO2 incubator at 37℃.

[0261] At the end of incubation, 10 μL of Cell Counting Kit-8 (Beyotime, C0046) solution was added to each well, mixed by gently tapping, allowing to continuously culture for indicated duration in cell culture incubator. The absorbance at 450 nm were then measured in a microplate reader. Medium only wells were served as blank control.

[0262] The cell killing ratio was calculated by the following formula. Statistical analysis and graphing of data were carried out with GraphPad Prism software.

[0263] Cell killing%= 100%-100* [ (antibody sample OD –blank OD) – (antibody-independent cytotoxicity group OD –blank OD) ]  /  [ (target cell maximum growth group OD -blank OD) – (independent cytotoxicity group OD –blank OD) ]

[0264] In experiments performed essentially as described above, BMP05-02 treatments resultED in various degree of induction of cell killing depending on cell type and 5T4 expression levels. In all cases, especially DS8201 resistant cell lines IGROV-1 and MKN-45, BMP05-02 demonstrated superior enhancement of NK killing activity compared to BMP02-10 and m603 with regards to EC50 and maximum cytotoxicity. Detailed results shown in Figure 8.

[0265] Example 9: PBMC cell killing assay

[0266] This example demonstrates enhancement of immune cell killing activity of BMP05-02 antibody by live cell imaging-based assay using PBMC as effector cells and 5T4-expressing tumor cell line JIMT-1 as target cells.

[0267] One day before ADCC killing experiment, target cells were digested and well-stained with Celltracker CM-DiI (YEASEN, 40718ES72) , then 5×103 / 100μL target cells were seeded in a 96 plate and incubated overnight at 37℃ in a 5%CO2 incubator. On the day of the experiment, the antibody to be tested was serially diluted 5 times with RPMI-1640 medium. The target cell culture medium was discarded, and 50 μL diluted antibody were added to each well containing target cells. Then 1×105 human PBMC cells were added to each well at 50 μL / well. Finally, diluted   Caspase -3 / 7 Dye for Apoptosis (Sartorius, 4440) were added to each well at 50 μL / well. Set up the following three groups of controls at the same time. (1) Target cell maximum growth group: same amount of target cells and 100 μL test medium without test molecules; and (2) Antibody-independent cytotoxicity group: same amount of target cells and effector NK cells with 50 μL medium without test molecules; and (3) Effector only group: same amount of effector cells and 100 μL test medium without test molecules. Plate was placed in   S3 Live-Cell Analysis Instrument and incubate further for more than 3 days inside a 5%CO2 incubator at 37℃ with a scan every 2 hours.

[0268] After incubation, the scan schedule was terminated, and all the images were analyzed with   S3 Live-Cell Analysis System. Both green and red fluorescent channels plus HD phase contrast images were collected and analyzed. Red signal represented target cells, green signal represented apoptosis cells and green plus red signals represented dead target cells. Here, total overlap area (μm2 / image) was used to indicate cytotoxicity level in the time courses.

[0269] In experiments performed essentially as described above, BMP05-02 treatments result in induction of target cell apoptosis in a time course manner. n consistent with previous luciferase reporter assay and NK killing assay, in case of JIMT-1, BMP05-02 demonstrated superior enhancement of PBMC killing activity compared to m603 and BMP02-10 with regards to maximum overlap signal. Detailed results shown in Figure 9.

[0270] Example 10: In vivo efficacy of BMP05-02 in MDA-MB-231 CDX mouse model

[0271] This example demonstrates the in vivo efficacy testing of antibody using the MDA-MB-231 mouse model.

[0272] Bone marrow cells from CB-17 / SCID-hCD16A mice (Beijing Biocytogen Co., Ltd) were transplanted into the tail vein of irradiated 4-week old CB17 / SCID mice (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. ) to construct hCD16A knock-in mice. MDA-MB-231 cells were cultured in DMEM medium containing 10%heat-inactivated FBS, and the tumor cells were collected when the required cell number was reached. One month later, 0.2 ml 5×106 MDA-MB-231 human breast cancer cells + 50%Matrigel (Corning, 354234) (PBS : Matrigel at 1: 1 volume ratio) were injected subcutaneously into the right forelimb of each mouse for tumor engraftment. When the average tumor volume reached 68.05±0.74 mm3, the tumor-bearing mice were randomly divided into 5 groups (8 mice per group) according to the tumor volume and body weight, and the tumor volume CV within group is <1 / 3. The day of grouping was defined as PG-D0, and the test antibody was given on the day of random grouping. The doses were 0.8 mg / kg, 2.4 mg / kg and 7.2 mg / kg BMP05-02, respectively. The related parental bispecific antibody BMP02-10 was dosed at 6.4 mg / kg, which was an equal molar to the highest dose of BMP05-02. Antibodies were intraperitoneally administered twice a week in the following 4 weeks. Body weight and tumor volume were measured twice a week. Tumor growth inhibition (TGI) was calculated as follows: TGI%= (1-T / C) x100%, T and C were the average TVs of the treatment group and the control group at the end of the experiment. Data analysis was performed using GraphPad Prism software, and the results were shown as the mean + S. E. M of tumor volume.

[0273] In experiments performed essentially as described above, at a concentration of 0.8mg / kg, 2.4 mg / kg or 7.2 mg / kg, BMP05-02 treatment significantly reduced tumor growth and tumor sizes compared to the control group, while BMP02-10 modestly reduced tumor burden even at a high 6.4 mg / kg concentration. On the on day 25 after grouping, the time point at which the study was terminated, BMP05-02 administrated groups had significant tumor growth inhibition with TGI at 59%, 78%and 93%, respectively. Detailed results were shown in Figure 10. On the final day of the experiment, fresh blood was collected for FACS, then mice were sacrificed, and the tumors were collected and weighed. Figure 11A depicted a consistent result with the anti-tumor effect shown in Figure 10.

[0274] The peripheral blood was stained and determined by flow cytometry. The absolute counts of lymphocytes (mCD45+) , NK cells (mNKp46+) , hCD16+NK cells (gated on mMKp46 cells) and hCD16+ lymphocytes (gated on mCD45 cells) were analyzed. Mice that received middle and high doses of BMP05-02 had significant expansion of immune cells, especially NK cells. Detailed results were shown in Figure 11.

[0275] Example 11: In vivo efficacy of BMP05-02 in A375 CDX mouse model

[0276] This example demonstrates the in vivo efficacy testing of BMP05-02 antibody in human melanoma cell line A375 xenografted humanized immune system NOG mice.

[0277] A375 cells were cultured in DMEM medium containing 10%heat-inactivated FBS, and the tumor cells were collected when the required cell number was reached. One month later, 0.2 ml 5×106 A375 human melanoma cancer cells + 50%Matrigel (Corning, 354234) (PBS: Matrigel at 1:1 volume ratio) were injected subcutaneously into the right forelimb of each mouse for tumor engraftment. When the average tumor volume reached 76.03 mm3, 1×107 human PBMC (Donor:XW0801084W) were injected intravenously through the tail. On the next day, the tumor-bearing mice were randomly divided into 6 groups (8 mice per group) according to the tumor volume and body weight, and the tumor volume CV within group is <1 / 3. The day of grouping was defined as PG-D0, and the test antibody was given on the day of random grouping. The doses were 0.03 mg / kg, 0.1 mg / kg, 0.3 mg / kg and 1 mg / kg BMP05-02, respectively. BMP05-02 antibodies were intraperitoneally administered once a week in the following 3 weeks. Besides, 5 mg / kg Keytruda was included as a positive control antibody since its efficacy on A375 model was well studied. Keytruda was intraperitoneally administered twice a week in the following 3 weeks. Body weight and tumor volume were measured twice a week. Tumor growth inhibition (TGI) was calculated as follows: TGI%=(1-T / C) x100%, T and C were the average TVs of the treatment group and the control group at the end of the experiment. Data analysis was performed using GraphPad Prism software, and the results were shown as the mean 士 S.E.M of tumor volume.

[0278] In experiments performed essentially as described above, BMP05-02 treatment at a concentration of 0.03 mg / kg or 0.1 mg / kg modestly reduced tumor burden. At a concentration of 0.3 mg / kg or 1 mg / kg, BMP05-02 treatment significantly reduced tumor growth and tumor sizes compared to the control group with TGI at 48% or 61%, respectively. Detailed results were shown in Figure 12.

[0279] On the final day of the experiment, fresh blood was collected for FACS, then the mice were sacrificed, and the tumors were collected and weighed. FIG 13A depicted a consistent result with the anti-tumor effect shown in FIG 12B.

[0280] Tumor tissues were sliced into two pieces, one of which was dissociated into single-cell suspension and multi-stained with Live / Dead, mCD45, hCD45, hCD3, hCD8 and hCD56. The proportion of lymphocytes (hCD45+) , T cells (hCD3+hCD56-) , cytotoxic T cells (hCD8+ gated on hCD3+hCD56- cells) , NK subsets (hCD56+) and NK cells (hCD3- gated on hCD56+ cells) were analyzed. Mice that received 1 mg / kg BMP05-02 had higher portion of NK cells (hCD3- gated on hCD56+ cells) infiltrated in tumor tissues as shown in FIG 13B.

[0341] The peripheral blood was collected, stained and determined by flow cytometry. The absolute counts of lymphocytes, T-cell subsets and NK-cell subsets were analyzed as described above. According to the absolute counts, there was no statistical difference of human CD45+ cells, CD3+CD56- T cells, CD8+ T cells and CD56+ NK cells compared to the vehicle group. However, mice that received 0.3 mg / kg or 1 mg / kg BMP05-02 had significant expansion of human immune cells such as cytotoxic T cells and NK cells. As shown in FIG 13C, these data demonstrated that BMP05-02 inhibits A375 melanoma tumor growth in vivo via expanding NK and T cells and recruiting NK cells into tumor tissues.

[0281] Example 13: In vivo efficacy of BMP05-02 in DU 145 CDX mouse model

[0282] This example demonstrates the in vivo efficacy testing of BMP08-02 antibody in human prostate carcinoma cell line DU 145 xenografted humanized immune system NOG mice.

[0283] DU 145 cells were cultured in RPMI-1640 medium containing 10%heat-inactivated FBS, and the tumor cells were collected when the required cell number was reached. On day 0, 0.1 ml 8×10^6 DU 145 cells + 0.53×10^6 human PBMCs (Hycells, WEZ4375) (DU 145 : huPBMC at 15: 1 density ratio) or 0.1 ml 8×10^6 DU 145 cells + 0.3×10^6 human PBMCs (Hycells, WEZ4375) (DU 145 : huPBMC at 30: 1 density ratio) were mixed and injected subcutaneously into the right forelimb of 6～8-week-old female NOG mice (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. ) . The engrafted mice were randomly divided into 2 groups with 3 mice in each group according to the tumor volume and body weight. The day of engrafting was defined as D0, and the test antibody was given on the day 27 (PG-D0) . Mice were treated with either PBS or 3 mg / kg BMP05-02 intraperitoneally twice a week for 1 week. Tumor volumes were recorded twice a week from the day post administration. Data analysis and graphing were performed using GraphPad Prism software.

[0284] In experiments performed essentially as described above, there was significant tumor growth inhibition with BMP05-02 under both co-engrafting ratios after PG-D10, and the weights of mice recovered soon. The reduction of tumor growth and tumor sizes was evident that almost no tumors could be collected at the end of experiment. Detailed results were shown in Figure 14.

Claims

1.A multi-specific molecule comprising(a) an anti-5T4 antibody comprising two heavy chains and two light chains;(b) an IL-15 polypeptide, covalently linked to C-terminus of one of the two heavy chains of the anti-5T4 antibody;(c) an IL-15Rα Sushi polypeptide, covalently linked to C-terminus of the other of the two heavy chains of the anti-5T4 antibody; and(d) an anti-CD16A VHH polypeptide, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide.2.The multi-specific molecule of claim 1, wherein the anti-5T4 antibody is selected from a group consisting of:(a) an anti-5T4 antibody specifically binding to a human, monkey, chicken or mouse 5T4 mature polypeptide, preferably, having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 8, 9, 10, and 11, respectively;(b) an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition;(c) an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, GAS, and 23, respectively, according to IMGT definition;(d) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively;(e) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 39 and 40, respectively;(f) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 41 and 42, respectively;(g) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 43 and 44, respectively;(h) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 45 and 46, respectively;(i) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 47 and 48, respectively; and(j) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 49 and 50, respectively.3.The multi-specific molecule of claim 2, wherein the anti-5T4 antibody comprises:(a) a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region;(b) a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region;(c) a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively; or(d) a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.4.The multi-specific molecule of any one of claims 1-3, wherein the IL-15 polypeptide has one or more features selected from a group consisting of:(a) is a human IL-15 polypeptide;(b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4;(c) is linked to a heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and(d) is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering.5.The multi-specific molecule of any one of claims 1-4, wherein the IL-15Rα sushi polypeptide has one or more features selected from a group consisting of:(a) is a human IL-15Rα sushi polypeptide;(b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 3;(c) is linked to a heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and(d) is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering.6.The multi-specific molecule of any one of claims 1-5, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has one or more features selected from a group consisting of:(a) binds specifically to a monkey, mouse, rat or human CD16A polypeptide, preferably having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 58, 59, 60, and 61, respectively;(b) has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 27, 28, and 29, respectively, according to Kabat definition;(c) has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, respectively, according to IMGT definition;(d) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in any of SEQ ID NOs: 26, 51, 52, 53, 54, 55, 56, and 57, respectively; and(e) is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.7.The multi-specific molecule of any one of claims 1-6, wherein the multi-specific molecule comprises:(a) an anti-5T4 antibody comprising a first heavy chain comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24 and a first heavy chain constant region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24 and a second heavy chain constant region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 35, and two light chains with each light chain comprising a light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 25 and a light chain constant region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 36;(b) an IL-15 polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4, covalently linked to C-terminus of the second heavy chain of the anti-5T4 antibody, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38;(c) an IL-15Rα Sushi polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO:3, covalently linked to C-terminus of the first heavy chain of the anti-5T4 antibody, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and(d) an anti-CD16A VHH polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 26, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15RαSushi polypeptide, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.8.A polypeptide selected from a group consisting of:(a) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-5T4 antibody, a heavy chain constant region of the anti-5T4 antibody, an IL-15Rα Sushi polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide;(b) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-5T4 antibody, a heavy chain constant region of the anti-5T4 antibody, an IL-15 polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide;(c) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-5T4 antibody, a heavy chain constant region of the anti-5T4 antibody, a peptide linker, an IL-15Rα Sushi polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide; and(d) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-5T4 antibody, a heavy chain constant region of the anti-5T4 antibody, a peptide linker, an IL-15 polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide.9.The polypeptide of claim 8, wherein the anti-5T4 antibody is selected from a group consisting of:(a) an anti-5T4 antibody specifically binding to a human, monkey, chicken or mouse 5T4 mature polypeptide, preferably, having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 8, 9, 10, and 11, respectively;(b) an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition;(c) an anti-5T4 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, GAS, and 23, respectively, according to IMGT definition;(d) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively;(e) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 39 and 40, respectively;(f) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 41 and 42, respectively;(g) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 43 and 44, respectively;(h) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 45 and 46, respectively;(i) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 47 and 48, respectively; and(j) an anti-5T4 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 49 and 50, respectively.10.The polypeptide of claim 9, wherein the anti-5T4 antibody comprises:(a) a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region;(b) a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively; or(c) a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region; and(d) a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.11.The polypeptide of any one of claims 8-10, wherein the IL-15 polypeptide:(a) is a human IL-15 polypeptide; and / or(b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4.12.The polypeptide of any one of claims 8-11, wherein the IL-15Rα sushi polypeptide:(a) is a human IL-15Rα sushi polypeptide; and / or(b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 3.13.The polypeptide of any one of claims 8-12, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has one or more features selected from a group consisting of:(a) binds specifically to a monkey, mouse, rat or human CD16A polypeptide, preferably having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 58, 59, 60, and 61, respectively;(b) has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 27, 28, and 29, respectively, according to Kabat definition;(c) has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, respectively, according to IMGT definition; and(d) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in any of SEQ ID NOs: 26, 51, 52, 53, 54, 55, 56, and 57, respectively.14.The polypeptide of any one of claims 8-13, wherein the peptide linker is independently a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.15.A polynucleotide encoding the polypeptide of any one of claims 8 to 14.16.A vector, preferably a plasmid, comprising the polynucleotide of claim 15.17.A host cell, preferably a eukaryotic cell, comprising the polynucleotide of claim 16.18.A pharmaceutical composition comprising the multi-specific molecule of any one of claims 1 to 7, the polypeptide of any one of claims 8 to 14, the polynucleotide of claim 15, the vector of claim 16, or the host cell of claim 17; and a pharmaceutically acceptable carrier.19.Use of the multi-specific molecule of any one of claims 1 to 7, the polypeptide of any one of claims 8 to 14, the polynucleotide of claim 15, the vector of claim 16, the host cell of claim 17, or the pharmaceutical composition of claim 18, in the preparation of a medicament for treatment of a 5T4 positive cancer.

Images