Methods and devices for detection of Anti-lipoidal antibodies

Abstract

A lateral flow assay device, comprises: a substrate having an anti-lipoidal antibody capture area, wherein the anti-lipoidal antibody capture area comprises a lipoidal antigen that are cardiolipin and lecithin, and the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen have been immobilized onto the substrate without via a protein carrier, as well as the methods for detecting anti-lipoidal antibody by using the lateral flow assay device.

Description

METHODS AND DEVICES FOR DETECTION OF ANTI-LIPOIDAL ANTIBODIESTechnical Field

[0001] This disclosure generally relates to methods and immunoassay devices useful, for example, for detection of anti-lipoidal antibodies and / or diagnosis of a disease such as syphilis.Background

[0002] Syphilis is a sexually transmitted disease (STD) caused by the spirochete bacterium Treponema pallidum (T. pallidum) . The immune response in syphilis includes production of treponemal antibodies, and (ii) anti-lipoidal antibodies.

[0003] Tests for anti-lipoidal antibodies, sometimes called "non-treponemal tests" , are typically based on naturally occurring cardiolipin, lecithin and cholesterol. Treponemal tests are based on antigens derived from T. pallidum and include T. pallidum particle agglutination (TP-PA) , the fluorescent treponemal antibody-absorbed test (FTA-ABS) and immunoassays. Non-treponemal tests are considered a better choice for monitoring treatment or testing for reinfection, because anti-lipoidal antibody titers decrease with treatment of syphilis, eventually disappearing in most patients, while treponemal antibodies titers remain high for years or even a lifetime. A combination of a non-treponemal test and a treponemal test is useful for syphilis screening and diagnostic purposes.

[0004] There is still a need of a rapid, point-of-care test for anti-lipoidal antibodies, and also a long-felt need of an easy-to-use, rapid, point-of-care test capable of concurrently detecting both non-treponemal and treponemal antibodies.SUMMARY

[0005] The inventors of the present disclosure found that anti-lipoidal antigens made up of at least cardiolipin and phosphatidylcholine (also referred to as "lecithin" ) can be reliably attached to a solid substrate (such as, a microporous membrane) without utilizing a medium such as a proteinaceous carrier, while maintaining the antigenicity and specificity of the anti-lipoidal antigens for anti-lipoidal antibodies. The inventors of the present disclosure further found that a higher amount of lipoidal antigens attached to the solid substrate is useful for maintaining the antigenicity and specificity of the anti-lipoidal antigens for anti-lipoidal antibodies. The lateral flow assay device as disclosed herein is also capable of detecting the anti-lipoidal antibodies in finger stick blood from a syphilis-infected subject, and meet the WHO target profile for Syphilis POCT detection.

[0006] In one aspect, the present disclosure therefore provides a lateral flow assay device for determining the presence or amount of an anti-lipoidal antibody in a biological sample. Such devices include a substrate having an anti-lipoidal antibody capture area, which comprises a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin, and the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen have been attached or substantially attached to the substrate without via a proteinaceous carrier.

[0007] In another aspect, the present disclosure therefore provides a lateral flow assay device for determining the presence or amount of an anti-lipoidal antibody in a biological sample, comprising a substrate having an anti-lipoidal antibody capture area, wherein the anti-lipoidal antibody capture area comprises a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin, the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen are or have been attached or substantially to the substrate, and the anti-lipoidal antibody capture area comprises, per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, at least about 0.01 μg of cardiolipin and / or at least about 0.01 μg of lecithin.

[0008] In another aspect, the present disclosure provides a lateral flow assay device for determining at least one of the presence or amount of an anti-lipoidal antibody in a biological sample, comprising an anti-lipoidal antibody capture area comprising cardiolipin and lecithin, wherein the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen have been attached or substantially attached to the substrate without via a proteinaceous carrier, and the anti-lipoidal antibody capture area comprises, per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, at least about 0.01 μg of cardiolipin and / or at least about 0.01 μg of lecithin.

[0009] The devices described herein can be used, for instance, for rapid, on-site testing of non-treponemal antibodies. In some embodiments, the lateral flow assay devices disclosed herein also include T. pallidum antigens that are specifically recognized by treponemal antibodies, such that the device is capable of conveniently and concurrently detecting both non-treponemal (i.e., anti-lipoidal) and treponemal (i.e., anti-T. pallidum) antibodies.

[0010] The foregoing and other features and advantages will become more apparent from the following detailed description.Detailed Description

[0011] In one aspect, disclosed herein are immunoassay devices (such as a lateral flow assay device) comprising a substrate having an anti-lipoidal antibody capture area, wherein the anti-lipoidal antibody capture area comprises a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin, and the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen are or have been substantially attached to (e.g., substantially immobilized onto) the substrate without via a proteinaceous carrier or without via a peptidic (e.g., polypeptide) carrier. In some further embodiments, the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen are or have been substantially attached to (e.g., substantially immobilized onto) the substrate without via an additional chemical moiety such as a linker or an anchor antibody.

[0012] In some further embodiments, the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen are or have been directly substantially attached to (e.g., substantially immobilized onto) the substrate, for example by physical adsorption (such as through hydrogen bonding, hydrophobic interactions, and electrostatic mechanism) .

[0013] In some further embodiments, the anti-lipoidal antibody capture area may comprise: (i) at least about 0.01 μg, at least about 0.02 μg, at least about 0.03 μg, at least about 0.04 μg, at least about 0.05 μg, at least about 0.06 μg, at least about 0.07 μg, at least about 0.08 μg, at least about 0.09 μg, at least about 0.1 μg, at least about 0.15 μg, at least about 0.2 μg, at least about 0.3 μg, at least about 0.4 μg, at least about 0.5 μg, at least about 0.6 μg, at least about 0.7 μg, at least about 0.8 μg, at least about 0.9 μg, at least about 1 μg, from about 0.01 to about 1 μg, from about 0.02 to about 0.5 μg, from about 0.03 to about 0.25 μg, from about 0.04 to about 0.2 μg, from about 0.05 to about 0.15 μg, from about 0.06 to about 0.12 μg, or from about 0.08 to about 0.11 μg of cardiolipin per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, and / or (ii) at least about 0.01 μg, at least about 0.02 μg, at least about 0.03 μg, at least about 0.04 μg, at least about 0.05 μg, at least about 0.06 μg, at least about 0.07 μg, at least about 0.08 μg, at least about 0.09 μg, at least about 0.1 μg, at least about 0.15 μg, at least about 0.2 μg, at least about 0.3 μg, at least about 0.4 μg, at least about 0.5 μg, at least about 0.6 μg, at least about 0.7 μg, at least about 0.8 μg, at least about 0.9 μg, at least about 1 μg, at least about 1.5 μg, at least about 2 μg, from about 0.01 to about 2 μg, from about 0.02 to about 1.5 μg, from about 0.03 to about 1 μg, from about 0.04 to about 0.8 μg, from about 0.05 to about 0.5 μg, from about 0.06 to about 0.4 μg, from about 0.07 to about 0.3 μg, from about 0.08 to about 0.2 μg, from about 0.09 to about 0.15 μg, or from about 0.1 to about 0.12 μg of lecithin per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area.

[0014] In some further embodiments, the cardiolipin and lecithin components in the anti-lipoidal antibody capture area are at a weight ratio of from about 1: 16 to about 8: 1, from about 1: 15 to about 7.5: 1, about 1: 14 to about 7: 1, from about 1: 13 to about 6.5: 1, about 1: 12 to about 6: 1, from about 1: 11 to about 5.5: 1, about 1: 10 to about 5: 1, from about 1: 9 to about 4.5: 1, from about 1: 8 to about 4: 1, from about 1: 7 to about 3.5: 1, from about 1: 6 to about 3: 1, from about 1: 5 to about 2.5: 1, from about 1: 4 to about 2: 1, from about 1: 3 to about 1.5: 1, or about 1: 2 to about 1: 1.

[0015] In some further embodiments, the anti-lipoidal antibody capture area may comprise, per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, (i) at least about 0.05 μg of cardiolipin and (ii) at least about 0.05 μg of lecithin, and the cardiolipin and lecithin components in the anti-lipoidal antibody capture area are at a weight ratio of from about 1: 12 to about 6: 1, such as from about 1: 10 to about 6: 1, from about 1: 8 to about 4: 1, from about 1: 6 to about 2: 1, from about 1: 4 to about 1: 1, or about 1: 2. In some further embodiments, the anti-lipoidal antibody capture area may comprise, per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, (i) at least about 0.06 μg of cardiolipin and (ii) at least about 0.06 μg of lecithin (such as from about 0.06 μg to about 0.5 μg of cardiolipin and from about 0.06 μg to about 1.5 μg of lecithin, from about 0.08 μg to about 0.4 μg of cardiolipin and from about 0.1 μg to about 1 μg of lecithin, from about 0.1 μg to about 0.25 μg of cardiolipin and from about 0.2 μg to about 0.5 μg of lecithin, or about 0.1 μg of cardiolipin and about 0.2 μg of lecithin) , and the cardiolipin and lecithin components in the anti-lipoidal antibody capture area are at a weight ratio of from about 1: 8 to about 4: 1, from about 1: 4 to about 1: 1, or about 1: 2.

[0016] In another aspect, disclosed herein are immunoassay devices (such as a lateral flow assay device) comprising a substrate having an anti-lipoidal antibody capture area, wherein the anti-lipoidal antibody capture area comprises a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin, and the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen are or have been substantially attached to (e.g., substantially immobilized onto) the substrate, and the anti-lipoidal antibody capture area comprises, per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, at least about 0.01 μg of cardiolipin and / or at least about 0.01 μg of lecithin.

[0017] In some further embodiments, the anti-lipoidal antibody capture area may comprise: (i) at least about 0.01 μg, at least about 0.02 μg, at least about 0.03 μg, at least about 0.04 μg, at least about 0.05 μg, at least about 0.06 μg, at least about 0.07 μg, at least about 0.08 μg, at least about 0.09 μg, at least about 0.1 μg, at least about 0.15 μg, at least about 0.2 μg, at least about 0.3 μg, at least about 0.4 μg, at least about 0.5 μg, at least about 0.6 μg, at least about 0.7 μg, at least about 0.8 μg, at least about 0.9 μg, at least about 1 μg, from about 0.01 to about 1 μg, from about 0.02 to about 0.5 μg, from about 0.03 to about 0.25 μg, from about 0.04 to about 0.2 μg, from about 0.05 to about 0.15 μg, from about 0.06 to about 0.12 μg, or from about 0.08 to about 0.11 μg of cardiolipin per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, and / or (ii) at least about 0.01 μg, at least about 0.02 μg, at least about 0.03 μg, at least about 0.04 μg, at least about 0.05 μg, at least about 0.06 μg, at least about 0.07 μg, at least about 0.08 μg, at least about 0.09 μg, at least about 0.1 μg, at least about 0.15 μg, at least about 0.2 μg, at least about 0.3 μg, at least about 0.4 μg, at least about 0.5 μg, at least about 0.6 μg, at least about 0.7 μg, at least about 0.8 μg, at least about 0.9 μg, at least about 1 μg, at least about 1.5 μg, at least about 2 μg, from about 0.01 to about 2 μg, from about 0.02 to about 1.5 μg, from about 0.03 to about 1 μg, from about 0.04 to about 0.8 μg, from about 0.05 to about 0.5 μg, from about 0.06 to about 0.4 μg, from about 0.07 to about 0.3 μg, from about 0.08 to about 0.2 μg, from about 0.09 to about 0.15 μg, or from about 0.1 to about 0.12 μg of lecithin per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area.

[0018] In some further embodiments, the cardiolipin and lecithin components in the anti-lipoidal antibody capture area are at a weight ratio of from about 1: 16 to about 8: 1, from about 1: 15 to about 7.5: 1, about 1: 14 to about 7: 1, from about 1: 13 to about 6.5: 1, about 1: 12 to about 6: 1, from about 1: 11 to about 5.5: 1, about 1: 10 to about 5: 1, from about 1: 9 to about 4.5: 1, from about 1: 8 to about 4: 1, from about 1: 7 to about 3.5: 1, from about 1: 6 to about 3: 1, from about 1: 5 to about 2.5: 1, from about 1: 4 to about 2: 1, from about 1: 3 to about 1.5: 1, or about 1: 2 to about 1: 1.

[0019] In some further embodiments, the anti-lipoidal antibody capture area may comprise, per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, (i) at least about 0.05 μg of cardiolipin and (ii) at least about 0.05 μg of lecithin, and the cardiolipin and lecithin components in the anti-lipoidal antibody capture area are at a weight ratio of from about 1: 12 to about 6: 1, such as from about 1: 10 to about 6: 1, from about 1: 8 to about 4: 1, from about 1: 6 to about 2: 1, from about 1: 4 to about 1: 1, or about 1: 2. In some further embodiments, the anti-lipoidal antibody capture area may comprise, per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, (i) at least about 0.06 μg of cardiolipin and (ii) at least about 0.06 μg of lecithin (such as from about 0.06 μg to about 0.5 μg of cardiolipin and from about 0.06 μg to about 1.5 μg of lecithin, from about 0.08 μg to about 0.4 μg of cardiolipin and from about 0.1 μg to about 1 μg of lecithin, from about 0.1 μg to about 0.25 μg of cardiolipin and from about 0.2 μg to about 0.5 μg of lecithin, or about 0.1 μg of cardiolipin and about 0.2 μg of lecithin) , and the cardiolipin and lecithin components in the anti-lipoidal antibody capture area are at a weight ratio of from about 1: 8 to about 4: 1, from about 1: 4 to about 1: 1, or about 1: 2.

[0020] In some embodiments of every and each aspect of the present disclosure, the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen have not been subjected to a chemical modification, e.g., have not been subjected to oxidization or conjugation to another moiety (e.g., a chemical moiety) . In some further embodiments, the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen are natural or synthesized.

[0021] In some embodiments of every and each aspect of the present disclosure, the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen are immobilized onto the substrate by applying (e.g., coating) an alcohol solution (such as ethanol solution) of the cardiolipin and lecithin components onto the substrate and then drying the alcohol solution, e.g., drying by heat at a temperature higher than room temperature e.g., up to 37℃.

[0022] In some embodiments of every and each aspect of the present disclosure, the substrate is a microporous substrate, such as a microporous membrane, e.g., nitrocellulose membrane.

[0023] In some embodiments of every and each aspect of the present disclosure, the substrate may comprise nitrocellulose, polyvinylidene fluoride (PVDF) , polycarbonate, polyester, polyethersulfone, cellulose acetate, mixed cellulose esters, nylon, or combinations thereof.

[0024] In some embodiments of every and each aspect of the present disclosure, the lateral flow assay device may further comprise a sample application area and a flow path from the sample application area to the anti-lipoidal antibody capture area. The sample application area is in fluid-continuous contact with the anti-lipoidal capture area such that a fluid sample placed in the sample application area can flow through or along the substrate (e.g., microporous membrane) (for example by capillary action or chromatographic flow) to the anti-lipoidal antibody capture area.

[0025] In some embodiments of every and each aspect of the present disclosure, the lateral flow assay device may further comprise a treponemal capture area comprising: (a) an immobilized treponemal antigen capable of being specifically bound by an anti-T. pallidum antibody, or (b) an immobilized anti-T. pallidum antibody capable of being specifically bound by a mobile treponemal antigen. In these embodiments, a fluid sample applied in the sample application area can flow through or along the substrate (e.g., a microporous membrane) to the anti-lipoidal antibody capture area and to the treponemal capture area.

[0026] In some embodiments of every and each aspect of the present disclosure, the anti-lipoidal antibody capture area may be in the form of one or more test lines, dots or other shapes. In some further embodiments, the one or more test lines may have a width from about 0.5 mm to about 2 mm (such as 1 mm or 1.5 mm) and / or a length from about 2 mm to about 6 mm (such as about 3 mm to about 6 mm, or about 3.5 mm to about 5 mm) .

[0027] In some embodiments of every and each aspect of the present disclosure, the substrate may have a pore size up to about 20 μm, e.g., up to about 15 μm, up to about 12 μm, up to about 10 μm, up to about 8 μm, up to about 6 μm, from about 0.01 μm to about 12 μm, from about 0.1 μm to about 10 μm, from about 0.22 μm to about 5 μm, or from about 1 μm to about 2 μm.

[0028] In some embodiments of every and each aspect of the present disclosure, the lateral flow assay device may further comprise a conjugate pad located in the flow path, wherein the conjugate pad comprises a mobile or mobilizable detector reagent specific for Fc portion of a human antibody. In some embodiments, the detector reagent is labeled Protein A, Fc-specific Protein G or anti-human antibody. In some embodiments, the label is an enzyme, a colloidal gold particle, a silver particle, an iron particle, a copper particle, a selenium particle, a sulfur particle, a tellurium particle, a carbon particle, a chemiluminescent agent, or a fluorescent agent. In some embodiments, the detector reagent comprises gold-conjugated Protein A, gold-conjugated Fc-specific Protein G, or gold-conjugated Fc-specific anti-human antibody.

[0029] The conjugate pad may include a mobile or mobilizable detector reagent for an anti-lipoidal antibody, such that flow of liquid through the pad moves the detector reagent to the anti-lipoidal antibody capture area. Formation of a complex among the detector reagent, anti-lipoidal antibody, and the immobilized lipoidal antigen provides a visible or otherwise detectable indicator of the presence of the anti-lipoidal antibody in a biological sample. In alternative embodiments, the detector reagent is not supplied in a conjugate pad, but is instead applied to the substrate.

[0030] In some further embodiments, the conjugate pad further comprises a mobile or mobilizable detector reagent specific for the anti-T. pallidum antibody or the mobile treponemal antigen. In some still further embodiments, the detector reagent specific for the anti-T. pallidum antibody comprises gold-conjugated Protein A, gold-conjugated Fc-specific Protein G, or gold-conjugated Fc-specific anti-human antibody, or the detector reagent for the mobile treponemal antigen comprises gold-labeled anti-treponemal antigen antibody.

[0031] In some embodiments of every and each aspect of the present disclosure, the lipoidal antigen does not comprise cholesterol or does not comprise a phospholipid other than cardiolipin and lecithin.

[0032] In another aspect, disclosed herein is a lateral flow assay device for determining at least one of the presence or amount of an anti-lipoidal antibody in a biological sample, comprising:

[0033] a microporous membrane;

[0034] a sample application area;

[0035] an anti-lipoidal antibody capture area comprising a lipoidal antigen, wherein the lipoidal antigen comprises cardiolipin and lecithin and the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen are or have been directly immobilized onto the substrate, e.g., by physical adsorption, and the anti-lipoidal antibody capture area comprises, per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, at least about 0.05 μg of cardiolipin and / or at least about 0.05 μg of lecithin; and

[0036] a flow path from the sample application area to the anti-lipoidal antibody capture area; wherein the presence or amount of the anti-lipoidal antibody in the biological sample is determined by detecting the formation of a complex between the anti-lipoidal antibody and the immobilized cardiolipin and lecithin.

[0037] In some embodiments of every and each aspect of the present disclosure, the immobilized cardiolipin and lecithin maintain the antigenicity and / or specificity of the anti-lipoidal antigens for anti-lipoidal antibodies, e.g., for anti-lipoidal antibodies present in a biological sample from a syphilis-infected subject.

[0038] In another aspect, disclosed herein is a kit comprising the lateral flow assay device disclosed herein. Also disclosed herein are kits for the diagnosis of syphilis. These kits may include a device as disclosed herein and instructions for applying a biological sample to the sample application area or the device. The kit may also include instructions for interpreting test results.

[0039] In another aspect, disclosed herein is a method for detecting anti-lipoidal antibodies in a subject, comprising: applying a biological sample from a subject to the lateral flow assay device or the kit as disclosed herein; and detecting the formation of a complex between an anti-lipoidal antibody present in the biological sample and the immobilized cardiolipin and lecithin, wherein the formation of the complex indicates the presence of the anti-lipoidal antibody in the subject.

[0040] In some embodiments, detection of the anti-lipoidal antibody is used to diagnose syphilis in the subject.

[0041] In some embodiments, the biological sample is blood, serum, skin ulcer exudate, urine, saliva, sputum, earwax, or cerebrospinal fluid. In some embodiments, the biological sample is whole blood, finger stick blood, serum, or plasma.

[0042] In another aspect, disclosed herein is a method for diagnosing syphilis in a subject, comprising: applying a biological sample to the lateral flow assay device or the kit as disclosed herein; detecting in the anti-lipoidal antibody capture area the formation of a first complex between an anti-lipoidal antibody present in the biological sample and the immobilized cardiolipin and lecithin; and detecting in the treponemal capture area the formation of a second complex between: (a) an anti-T. pallidum antibody present in the biological sample and the immobilized treponemal antigen, or (b) a treponemal antigen present in the biological sample and the immobilized anti-T pallidum antibody; wherein detection of the formation of the first complex and the second complex is used to diagnose syphilis in the subject. In some embodiments, the biological sample is a human blood sample such as whole blood or serum.

[0043] Terms

[0044] Unless otherwise noted, technical terms are used according to conventional usage.

[0045] Throughout this application, the term “about” is used to indicate that a value includes the inherent variation of error for the measurement or quantitation method.

[0046] The words “comprising” (and any form of comprising, such as “comprise” and “comprises” ) , “having” (and any form of having, such as “have” and “has” ) , “including” (and any form of including, such as “includes” and “include” ) or “containing” (and any form of containing, such as “contains” and “contain” ) are inclusive or open-ended and do not exclude additional, unrecited elements or method steps.

[0047] Devices, kits or methods for their use can “comprise” , “consist essentially of” or “consist of” any of the components or steps disclosed throughout the specification. Devices, kits and methods “consisting essentially of” any of the components or steps disclosed limits the scope of the claim to the specified materials or steps which do not materially affect the basic and novel characteristic of the claimed invention.

[0048] As used herein, the term “anti-lipoidal antibody” may refer to an antibody (such as IgM or IgG or IgA) having specificity for a lipoidal antigen. In some instances, anti-lipoidal antibodies are produced by the immune system of a subject (such as a human) in response to a disease state, such as a microbial (e.g., bacterial) infection. For example, this term contemplates anti-lipoidal antibodies produced as a consequence of T. pallidum infection in a human subject.

[0049] As used herein, the term “capture area” refers to a region of an immunoassay device (such as a lateral flow device) where a capture reagent (such as a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin) is immobilized. An immunoassay device may have more than one capture area, for example, a "primary capture area, " a "secondary capture area, " and so on, which may have any orientation with respect to each other on the substrate; for example, distal or proximal or perpendicularly to each other.

[0050] As used herein, the term “anti-lipoidal antibody capture area” refers to a capture area wherein a lipoidal antigen capable of being specifically bound by an anti-lipoidal antibody (such as a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin) is immobilized as the capture reagent.

[0051] As used herein, the term “lipoidal antigen” refers to an antigen including (but not limited to) cardiolipin, lecithin and / or cholesterol that is capable of being specifically bound by anti-lipoidal antibodies, for instances, an antigen comprising cardiolipin and lecithin as used in the present disclosure.

[0052] As used herein, the term “microporous membrane” refers to a thin film or structure having microscopic-sized pores. Microporous membranes at least permit fluids and the analytes therein to travel along or through the membrane, for example by capillary action. Membranes are made of a wide variety of materials or composites of materials, including, for example, nitrocellulose, polyethersulfone, nylon, polycarbonate, polyester, cellulose acetate, mixed cellulose esters, and / or polyvinylidene fluoride. Non-limiting suitable pore sizes can be up to about 0.22 micron, from about 0.22 micron to about 0.45 micron, from about 0.22 micron to about 0.65 micron, from about 0.22 micro to about 0.8 micron, from about 0.22 micron to about 1.2 micron, from about 0.65 micron to about 3 micron, from about 0.65 micron to about 5 micron, from about 0.65 micron to about 8 micron, from about 5 micron to about 10 micron, or from about 5 micron to about 20 micron. In particular instances, pore size can be about 0.22 micron, about 0.45 micron, about 0.65 micron, about 0.8 micron, about 1.2 micron, about 3 micron, about 5 micron, about 8 micron, about 10 micron, or about 20 micron. Any membrane known to those of ordinary skill in the art to be suitable for lateral-flow devices is contemplated to be within the scope of the term "microporous membrane" .

[0053] As used herein, the term “proteinaceous carrier” or “peptidic carrier” may refer to a substance of a protein or peptide (e.g., polypeptide) nature which can be natural or synthesized and is used as a medium to attach a lipoidal antigen (e.g., an antigen comprising cardiolipin and lecithin) to a substrate (e.g., microporous membrane) , such that the lipoidal antigen is not directly attached to or immobilized onto the substrate.

[0054] Unless otherwise explained, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. The singular terms "a, " "an, " and "the" include plural referents unless context clearly indicates otherwise. Suitable methods and materials used in the practice or testing of the disclosed subject matter are described below; however such materials and methods are illustrative only and not intended to be limiting. Methods and materials similar or equivalent to those described herein also can be used. All publications, patent applications, patents, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety to the extent permitted by applicable rules. In case of conflict, the present specification, including explanations of terms, will control.

[0055] Cardiolipin

[0056] Cardiolipin is diphosphatidyl glycerol (specifically, 1, 3-diphosphatidylglycerol) , which has a backbone consisting of three molecules of glycerol joined by two phosphodiester bridges. The four hydroxyl groups of cardiolipin’s external glycerol moieties are each esterified with a saturated or unsaturated fatty acid chain (typically from 14 to 18 carbons in length) . As used herein, the term "cardiolipin" contemplates 1, 3-diphosphatidylglycerol having any distribution of fatty acid side chains. Thus, the four fatty acid side chains of cardiolipin can independently vary in length (e.g., from about 14 to about 25 carbons, from about 14 to about 22 carbons, from about 14 to about 20 carbons, from about 14 to about 18 carbons, or from about 14 to about 16 carbons) and / or degree of saturation (e.g., from completely saturated to having about 6 double bonds, from completely saturated to having about 4 double bonds, or from completely saturated to having about 2 double bonds) . Exemplary fatty acid side chains of cardiolipin, as contemplated herein, include myristoyl (14: 0) ; palmitoyl (16: 0) ; stearoyl (18: 0) ; oleoyl (18: 1) ; myristoleoyl (14: 1) ; palmitoleoyl (16: 1) ; petroselinoyl (18: 1) ; linoleoyl (18: 2) ; linolenoyl (18: 3) ; eicosenoyl (20: 1) ; arachidonoyl (20: 4) ; erucoyl (22: 1) ; DHA (22: 6) ; or nervonoyl (24: 1) .

[0057] In some embodiments, cardiolipin is a naturally occurring form of cardiolipin. The fatty acid composition of naturally occurring cardiolipin is generally distributed according to a wide variety of natural occurring fatty acids such as palmitoyl (16: 0) ; stearoyl (18: 0) ; oleoyl (18: 1) ; and linoleoyl (18: 2) . The most abundant fatty acid molecular species in naturally occurring forms of cardiolipin are linoleic acid at 90%, followed by oleic acid at 5%, and palmitric acid at 1%. In other embodiments, cardiolipin is a non-naturally occurring form (also referred to as "synthetic cardiolipin" ) . Non-limiting examples of synthetic cardiolipin include, for example, tetramyristoyl cardiolipin, tetraoleoyl cardiolipin, tetramyristoyl-bis- (L- [alpha] -glyceryl) phosphoric acid, bis (dipalmitoyl D, L- [alpha] -glycerylphosphoryl) -l, 3 glycerol benzyl ether disodium salt, bis (dipalmitoyl D, L- [alpha] -glycerylphosphoryl) -l, 5 pentanediol disodium salt, bis (dipalmitoyl D, L- [alpha] -glycerylphosphoryl) -l, 3 propanediol disodium sal, bis (dipalmitoyl D, L- [alpha] -glycerylphosphoryl) -l, 4 butanediol disodium salt, bis (dipalmitoyl D, L- [alpha] -glycerylphosphoryl) -l, 2 ethanediol disodium salt, bis (dipalmitoyl D, L- [alpha] -glycerylphosphoryl) -methanediol disodium salt, bis (dipalmitoyl D, L- [alpha] -glycerylphosphoryl) -l, 3 glycerol disodium salt, bis (benzylphosphoryl) -l, 3-propanediol disodium salt, or D, L- [alpha] -dipalmitoyl bis-phosphatidic acid.

[0058] Lecithin

[0059] Lecithin is the common name for phosphatidylcholine which is a glycerophospholipid As used herein, the term "lecithin" contemplates phosphatidylcholine having any distribution of fatty acid side chains. Thus, the two fatty acid side chains of cardiolipin can independently vary in length (e.g., from about 14 to about 25 carbons, from about 14 to about 22 carbons, from about 14 to about 20 carbons, from about 14 to about 18 carbons, or from about 14 to about 16 carbons) and / or degree of saturation (e.g., from completely saturated to having about 6 double bonds, from completely saturated to having about 4 double bonds, or from completely saturated to having about 2 double bonds) . Exemplary fatty acid side chains of lecithin, as contemplated herein, include myristoyl (14: 0) ; palmitoyl (16: 0) ; stearoyl (18: 0) ; oleoyl (18: 1) ; myristoleoyl (14: 1) ; palmitoleoyl (16: 1) ; petroselinoyl (18: 1) ; linoleoyl (18: 2) ; linolenoyl (18: 3) ; eicosenoyl (20: 1) ; arachidonoyl (20: 4) ; erucoyl (22: 1) ; DHA (22: 6) ; or nervonoyl (24: 1) .

[0060] In some embodiments, lecithin is a naturally occurring form of lecithin. The fatty acid composition of naturally occurring lecithin includes palmitoyl (16: 0) , palmitoleoyl (16: 1) , linoleoyl (18: 2) , stearoyl (18: 0) , arachidonoyl (20: 4) , myristoyl (14: 0) , oleoyl (18: 1) , and linolenoyl (18: 3) . The relative percentages of fatty acids in naturally occurring lecithin vary depending upon the source of the lecithin. For example, lecithin in human gallbladder bile is reported to be about 45%16: 0, 4%16: 1, 4%18: 0, 16%18: 1, 23%18: 2, 4%20: 4 with traces of 18: 3 and 14: 0; and lecithin in human plasma is reported to be about 35%16: 0, 1%16: 1, 14%18: 0, 17%18: 1, 17%18: 2, 14%20: 4 with traces of 18: 3 and 14: 0. In other embodiments, lecithin is a non-naturally occurring form (also referred to as "synthetic lecithin" ) .

[0061] Immobilizing lipoidal antigen onto substrate

[0062] The methods of immobilizing a lipoidal antigen disclosed herein can be used with any substrate to which the immobilized cardiolipin and lecithin will attach in a manner that substantially resists detachment when contacted with a fluid sample (such as a biological sample) . Preferred solid support embodiments for disclosed immunoassay devices involve microporous membranes, such as nitrocellulose, polyvinylidene fluoride (PVDF) , polyethersulfone, polycarbonate, polyester, cellulose acetate, mixed cellulose esters, nylon, or combinations thereof. In some embodiments , a lipoidal antigen is substantially attached to or substantially immobilized onto a substrate where no more than about 1%, no more than about 2%, no more than about 5%, no more than about 10%, or no more than about 25%of the attached or immobilized cardiolipin and lecithin become detached from the substrate when the substrate is contacted with a fluid sample for a time sufficient for the fluid sample to wet the substrate (e.g., for a time sufficient for a fluid sample to migrate along a membranous strip and contact an area where a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin is attached to or immobilized) .

[0063] Directly attaching or immobilizing a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin to a solid support such as a substrate while maintaining the antigenicity and specificity of the anti-lipoidal antigens for anti-lipoidal antibodies can be achieved by physical adsorption, through e.g., ionic interactions, hydrophobic interactions, hydrogen bonding or the like.

[0064] A suitable substrate can be chosen for its intrinsic ability to attract and immobilize a capture reagent, such as a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin. Alternatively, the solid phase can possess a factor that has the ability to attract and immobilize a capture reagent, such as a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin. The factor can include a charged substance that is oppositely charged with respect to, for example, a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin.

[0065] Except as otherwise physically constrained, a substrate may be used in any suitable shape, such as films, sheets, strips, or plates, or it may be coated onto or bonded or laminated to appropriate inert carriers, such as paper, glass, plastic films, or fabrics.

[0066] Lateral Flow Assay Device

[0067] Lateral flow assay devices are commonly known in the art. Briefly, a lateral flow assay device is an analytical device having as its essence a test strip, through which flows a test sample fluid that is suspected of containing an analyte of interest. The test fluid and any suspended analyte can flow along the strip to a detection zone (such as a capture area) in which the analyte (if present) interacts with a capture agent and a detection agent to indicate a presence, absence and / or quantity of the analyte.

[0068] Numerous lateral flow assay devices have been disclosed, and include those shown in U.S. Patent Nos. 4,313,734; 4,703,017; 4,740,468; 4,806,312; 4,855,240; 4,943,522; 4,945,042; 4,496,654; 5,126,241; 5,451,504; 6,555,390; and 6,368,876, each of which is incorporated by reference.

[0069] The construction and design of lateral flow devices is very well known in the art, as described, for example, in Schleicher &Schuell, Easy to Work with BioScience, Products and Protocols 2003, pp. 73-98, 2003, 2003, which is incorporated herein by reference in its entireties.

[0070] Lateral flow devices have a wide variety of physical formats that are equally well known in the art. Any physical format that supports and / or houses the basic components of a lateral flow device in the proper function relationship is contemplated by the present disclosure.

[0071] Exemplary basic components of a particular embodiment of a lateral flow device may include an elongated housing which contains a bibulous lateral flow strip that extends substantially the entire length of the housing. Lateral flow strip is divided into a proximal sample application pad positioned below a sample introduction port, an intermediate test result membrane, and a distal absorbent pad. Flow strip is interrupted by a conjugate pad that contains labeled conjugate (such as gold-conjugated Protein A, gold-conjugated Protein G, gold-conjugated anti-human Ab) . A flow path along the flow strip passes from proximal pad, through conjugate pad, into test result membrane for eventual collection in absorbent pad. Selective capture agents (such as a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin) are positioned on a proximal test line in test result membrane. A control line is provided in test result membrane slightly distal to test line.

[0072] The sample pad is an optional component of a lateral flow device that initially receives the sample, and may serve to remove particulates from the sample. Sample pads may be treated with one or more release agents, such as buffers, salts, proteins, detergents, and surfactants. Such release agents may be useful, for example, to promote resolubilization of conjugate-pad constituents, and to block non-specific binding sites in other components of a lateral flow device, such as a nitrocellulose membrane.

[0073] The conjugate pad may serve to, among other things, hold a detector reagent. In some embodiments, a detector reagent may be applied externally, for example, from a developer bottle, in which case a lateral flow device need not contain a conjugate pad.

[0074] Detector reagent (s) contained in a conjugate pad is released into solution upon application of the test sample. A conjugate pad may be treated with various substances to influence release of the detector reagent into solution. For example, the conjugate pad may be treated with PVA or PVP (0.5%to 2%) and / or Triton X-100 (0.5%) .

[0075] The use of an absorbent pad in a lateral flow device is optional. The absorbent pad acts to increase the total volume of sample that enters the device. Any of a variety of materials is useful to prepare an absorbent pad. In some device embodiments, an absorbent pad can be paper (i.e., cellulosic fibers) . One of skill in the art may select a paper absorbent pad on the basis of, for example, its thickness, compressibility, manufacturability, and uniformity of bed volume.

[0076] Kits

[0077] Disclosed herein are kits for use in detecting anti-lipoidal antibodies in a sample (such as, a biological sample) . Such kits can also be used, for example, in the diagnosis of diseases in which the presence of anti-lipoidal antibodies is symptomatic of the disease (such as, syphilis) . Certain embodiments of the disclosed kits are generally portable and provide a simple, rapid, and / or cost-effective way to detect anti-lipoidal antibodies and / or diagnose disease (such as syphilis) without the need for laboratory facilities, such as in a point-of-care facility.

[0078] Exemplary kits may include one or more immunoassay devices as disclosed herein and a carrier means, such as a box, a bag, or other container. In some examples, kit components will be enclosed in a single packaging unit, such as a box or other container, which packaging unit may have compartments into which one or more components of the kit can be placed. In other examples, a kit includes one or more containers, for instance vials, tubes, and the like that can retain, for example, one or more biological samples to be tested, positive and / or negative control samples or solutions (such as, a positive control serum containing anti-lipoidal or treponemal antibodies) , and / or diluents (such as, phosphate buffers, or saline buffers) , detector reagents (e.g., for external application to a kit device) .

[0079] In some embodiments, a disclosed kit may include instructions for the use of an immunoassay device as described herein. The instructions may provide direction on how to apply sample to the test device, the amount of time necessary or advisable to wait for results to develop, and details on how to read and interpret the results of the test. Such instructions may also include standards, such as standard tables, graphs, or pictures for comparison of the results of a test. These standards may optionally include the information necessary to quantify analyte using the test device, such as a standard curve relating intensity of signal or number of signal lines to an amount of analyte therefore present in the sample.

[0080] Examples

[0081] The following Examples are included to illustrate certain particular features and / or embodiments. These examples should not be construed to limit the invention to the particular features or embodiments as described. Those of skill in the art should, in light of the present disclosure, appreciate that many changes can be made in the specific embodiments which are disclosed and still obtain a like or similar result without departing from the spirit and scope of the invention.

[0082] Example 1 Preparation of Lateral Flow Assay Device (LFA device)

[0083] Instruments and Materials

[0084] 1. Instruments: XYZ Platform Precision Dispense, Programmable Strip Cutter, Assembly Roller, Constant Temperature Drum Wind Drying Box.

[0085] 2. Materials: Syphilis gold-labelled antigen Tp96, Syphilis gold-labelled antigen Tp58, Syphilis protein T1, Cardiolipin solution from bovine heart, Lecithin from egg yolk, Mouse Anti-Human IgG, Sheep Anti-Chicken IgY, Chicken IgY, Anti-RBC Antibody.

[0086] 3. Consumables: Nitrocellulose Membrane, Glass Fiber, Polyester Membrane, Plastic Card Shell, Absorbent Paper, Colloidal gold particles, etc.

[0087] Preparation Process

[0088] 1. Preparation of Syphilis gold labelled antigen Tp96: Dilute Tp96 antigen to 0.45mg / ml with phosphate buffer, and standby.

[0089] 2. Phospholipids raw material preparation

[0090] 1) Use a pipette to aspirate an appropriate amount of cardiolipin solution as stock solution A.

[0091] 2) Weigh an appropriate amount of lecithin solid raw material, dissolve it completely in ethanol solution and mix well to prepare lecithin solution as stock solution B.

[0092] 3) Mix stock solution A of cardiolipin and stock solution B of lecithin at different mass ratios using ethanol solvent, and mix thoroughly to prepare phospholipid mixed antigen.

[0093] 3. Preparation of sheep anti-chicken IgY raw material

[0094] Dilute sheep anti-chicken IgY to an appropriate concentration using a phosphate buffer, and keep it on standby. The concentration of sheep anti-chicken IgY is 1.5 mg / mL.

[0095] 4. Apply the prepared materials from steps 1 and 3 to the corresponding positions on nitrocellulose membrane, with a spotting volume of 1 μl / cm and a strip width of 0.35 cm.

[0096] 1) C (Control) line position: anti-chicken IgY raw material, i.e., 0.525 μg of anti-chicken IgY is coated on 0.35 cm of the C line, with a coating amount per unit area of 0.15 μg / mm2.

[0097] 2) NT (Non-Treponemal) line position: phospholipid (cardiolipin &lecithin) mixed antigen raw material, the amounts of mixed antigens (cardiolipin &lecithin) coating the NT line position are shown in Table 1 as follows:

[0098] Table 1

[0099] 5. Place the nitrocellulose membrane coated with the material in a 37℃ oven and dry for 16-18 hours. Remove and store in a dry environment (temperature 15-25℃; humidity ≤40%) .

[0100] 6. Colloidal gold labelling

[0101] 6.1 Labeling of Syphilis protein T1 and Syphilis antigen Tp58

[0102] 1) Take 10 ml of 0.04%colloidal gold (4 OD / ml) , add 120 μl of 0.2M K2CO3 with stirring, stir for 5 minutes and then add 100 μg of T1 protein, continue stirring for 5 minutes, terminate by adding 100 μl of 10%BSA (aqueous solution) and stir slowly for 5 minutes;

[0103] 2) Centrifuge the mixture obtained from step 1) at 10,000 rpm for 10 min, collect the precipitate, reconstitute to 1 ml (40 OD / ml) with gold label diluent, then add 5 μg of TP58, mix well and leave for 30 min, and record the obtained mixture as T1-TP58-Au (40 OD / ml) ;

[0104] 3) Dilute T1-TP58-Au with gold label reconstitution solution to 6 OD / ml before use, spray the diluted T1-TP58-Au on polyester membrane, dry it for 16-18 hours, place the sprayed membranes in a dry environment (at a temperature of 15-25℃; humidity ≤40%) for storage, and then standby.

[0105] 6.2 Mouse anti-human IgG and chicken IgY labeling

[0106] 1) Take two parts of 10 ml of 0.04%colloidal gold (4 OD / ml) respectively, add 120 μl of 0.2M K2CO3 respectively with stirring, stir for 5 minutes, then add 100 μg of mouse anti-human IgG and chicken IgY respectively, continue stirring for 5 minutes, add 100 μl of 10%BSA (aqueous) for termination, and stir slowly for 5 minutes;

[0107] 2) Centrifuge the mixture obtained in step 1) at 10,000 rpm for 10 min, collect the precipitate, reconstitute it with gold label diluent to 1 ml (40 OD / ml) , mix well and leave it for 30 min, and record the obtained mixtures as mouse anti-human IgG-Au (40 OD / ml) and chicken IgY-Au (40 OD / ml) respectively.

[0108] 3) Dilute mouse anti-human IgG-Au (40 OD / ml) and chicken IgY-Au (40 OD / ml) to 6 OD / ml with gold label reconstitution solution before, spray the diluted anti-human IgG-Au (40 OD / ml) and chicken IgY-Au (40 OD / ml) on a polyester film respectively, dry for 16-18 hours, and place the sprayed membranes in a dry environment (at a temperature of 15-25℃; humidity ≤40%) for storage, and then standby.

[0109] 7. Cut strips, assemble, and prepare reagent strips from the prepared nitrocellulose membrane, glass fiber, polyester membrane, etc.

[0110] Example 2 Detection of Anti-Lipoidal Antibodies in Human Serum

[0111] 1. Balance the LFA devices prepared in Example 1 to room temperature, take out the test card and place it flat on a level laboratory bench, and test the blank buffer solution, negative clinical sample, and positive sample from a syphilis patient, respectively.

[0112] 2. Add 10μl of human serum sample, followed by 60μl of buffer solution, wait for 15-20 minutes, read the color intensity of the lines on the test card, compare with the standard color card, and record the experimental results.

[0113] 3. Use the LFA devices prepared in Example 1 to detect negative and positive samples and blank buffer solution, and the corresponding color intensity results are shown in Table 2.

[0114] Table 2: Color Intensity Results

[0115] Note: The scoring range (Grade) of the standard color chart is G1 to G10, where the values G1 to G10 indicate a progressively increasing color development intensity of the corresponding red band (test line) . When the score is < G5, the red band is not visible to the naked eye; when the score is ≥ G5, red bands of varying intensity can be observed with the naked eye.

[0116] 2. Experimental result

[0117] This Example demonstrates that anti-lipoidal antibodies in syphilitic serum can be detected by using a lateral flow assay device having anti-lipoidal antigens comprising cardiolipin and lecithin being immobilized to the substrate without utilizing a proteinaceous or peptide carrier.

[0118] Example 3. Clinical Performance Evaluation on Simultaneous Detection of Non-Treponemal and Treponemal Antibodies

[0119] To evaluate the clinical performance on simultaneous detection of Non-Treponemal and Treponemal antibodies, 120 patient serum samples (each 20μl) were detected for anti-treponemal and anti-non-treponemal (anti-lipoidal) antibodies using the LFA device (1 mg / mL of Cardiolipin and 1 mg / mL of Lecithin, i.e., Cardiolipin  / Lecithin concentration = 1: 1) prepared in Example 1, and a commercial TRUST kit from Shanghai Rongsheng Biological Pharmaceutical Co., Ltd. and a commercial TPPA kit from Zhuhai Livzon Diagnostics Inc.

[0120] In the LFA device test, the samples were detected by following the steps of Example 2 above and the Non-Treponemal and Treponemal antibodies test results were recorded.

[0121] The traditional TRUST and TPPA tests were performed according to the Instruction for use provided by the manufacturer.

[0122] The performance characteristics of the LFA device as compared to the TPPA and TRUST assays in the testing of a population of 120 patients are presented in Table 3 below.

[0123] Table 3.

[0124] As can be seen from Table 3, the sensitivity of the LFA device for detecting anti-treponemal antibodies was 98.4%and the specificity was 100%, while the sensitivity of the LFA device for detecting anti-non-treponemal (anti-lipoidal) antibodies was 91.8%, 97.7%, 100%and 100%at different titers of 1: 1, 1: 2, 1: 4 and 1: 8, and the specificity was 97.2%.

[0125] Example 4. Clinical Performance Evaluation on Simultaneous Detection of Non-Treponemal and Treponemal Antibodies in finger stick blood.

[0126] Prior serological testing using venous blood drawn from patients, requiring patients to visit medical institutions. However, many patients are reluctant to seek for medical care due to privacy concerns regarding sexually transmitted infections and the cumbersome procedures involved, leading to delays or missed opportunities for syphilis testing. To promote syphilis screening, this study aims to evaluate the clinical performance of the LFA device of the present disclosure on the detection of treponemal and non-treponemal antibodies in fingerstick blood. The study will assess the validity of fingerstick blood testing to provide clinical evidence for at-home syphilis self-testing.

[0127] 89 finger stick blood samples (each 40μl) were detected for anti-treponemal and anti-non-treponemal (anti-lipoidal) antibodies using the LFA device (1 mg / mL of Cardiolipin and 1 mg / mL of Lecithin, i.e., Cardiolipin  / Lecithin concentration =1: 1) prepared in Example 1, and a commercial Syphilis Rapid Plasma Reagin (RPR) kit from Shanghai Kehua Biotech Co., Ltd. and a commercial TPPA kit from Zhuhai Livzon Diagnostics Inc.

[0128] In the LFA device test, the samples were detected by following the steps of Example 2 above and the Non-Treponemal and Treponemal antibodies test results were recorded.

[0129] The traditional RPR and TPPA tests were performed according to the Instruction for use provided by the manufacturer.

[0130] The performance characteristics of the LFA device as compared to the TPPA and RPR assays are presented in Table 4 below.

[0131] Table 4.

[0132] As can be seen from Table 4, the sensitivity of the LFA device for detecting anti-treponemal antibodies was 98.08%and the specificity was 97.30%, while the sensitivity of the LFA device for detecting anti-non-treponemal (anti-lipoidal) antibodies was 97.37%, 100%, 100%and 100%at different titers of 1: 1, 1: 2, 1: 4 and 1: 8, and the specificity was 96.08%.

[0133] Example 5. Storage stability

[0134] The LFA device (1 mg / mL of Cardiolipin and 1 mg / mL of Lecithin, i.e., Cardiolipin  / Lecithin concentration = 1: 1) prepared in Example 1 underwent accelerated stability testing at 45℃ for 95 days. Tests were performed on negative serum samples, NT weak-positive serum samples, TP weak-positive serum samples, and NT / TP moderate-positive serum samples. The results showed that, compared with Day 0, the color intensity changes of the C / T / N lines before and after acceleration were within the range of one chromaticity grade. It was accordingly estimated that the LFA devices can be stored at 2–35℃ with a shelf life of at least 18 months.

[0135] Example 6. Verification of High-Titer Sample Detection and Hook Effect Assessment.

[0136] This Example is to demonstrate that the LFA device of the present disclosure can accurately detect clinical samples at a titer of 1: 128, and to confirm that no high-dose Hook Effect occurs at significantly higher concentrations, ensuring result reliability.

[0137] Syphilis patient serum samples at a titer of 1: 128 were detected for anti-treponemal and anti-non-treponemal (anti-lipoidal) antibodies by following the assay of Example 3. Results showed the test lines for anti-treponemal and anti-non-treponemal (anti-lipoidal) antibodies are clearly visible with a color intensity score > G8.

[0138] Results showed the LFA device effectively detects clinical samples at a titer of 1: 128, producing a strong positive signal with a color intensity greater than G8. Furthermore, the absence of signal attenuation demonstrates that the LFA device is robust and free from the high-dose Hook Effect within the tested titer, ensuring accurate detection in high-titer syphilis cases.

[0139] Comparison with WHO Target Profile for POCT Syphilis Detection Kit

[0140] The results in the above Examples have demonstrated that the LFA devices of the present disclosure meet all the WHO POCT Target Profile, as shown in Table 5 below:

[0141] Table 5

[0142] All documents mentioned in the present application are hereby incorporated by reference in their entireties. In addition, it is to be understood that various modifications and changes may be made by those skilled in the art in the form of the appended claims.

Claims

1.A lateral flow assay device comprising a substrate having an anti-lipoidal antibody capture area, wherein the anti-lipoidal antibody capture area comprises a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin, and the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen have been immobilized onto the substrate without via a proteinaceous carrier.2.The lateral flow assay device of claim 1, wherein the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen have been immobilized onto the substrate without via an additional chemical moiety such as a linker or an anchor antibody.3.The lateral flow assay device of claim 1 or 2, wherein the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen have been directly immobilized onto the substrate, e.g., by physical adsorption.4.The lateral flow assay device of any of the preceding claims, wherein the anti-lipoidal antibody capture area comprises:at least about 0.01 μg, at least about 0.02 μg, at least about 0.03 μg, at least about 0.04 μg, at least about 0.05 μg, at least about 0.06 μg, at least about 0.07 μg, at least about 0.08 μg, at least about 0.09 μg, at least about 0.1 μg, at least about 0.15 μg, at least about 0.2 μg, at least about 0.3 μg, at least about 0.4 μg, at least about 0.5 μg, at least about 0.6 μg, at least about 0.7 μg, at least about 0.8 μg, at least about 0.9 μg, at least about 1 μg, from about 0.01 to about 1 μg, from about 0.02 to about 0.5 μg, from about 0.03 to about 0.25 μg, from about 0.04 to about 0.2 μg, from about 0.05 to about 0.15 μg, from about 0.06 to about 0.12 μg, or from about 0.08 to about 0.11 μg of cardiolipin per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, and / orat least about 0.01 μg, at least about 0.02 μg, at least about 0.03 μg, at least about 0.04 μg, at least about 0.05 μg, at least about 0.06 μg, at least about 0.07 μg, at least about 0.08 μg, at least about 0.09 μg, at least about 0.1 μg, at least about 0.15 μg, at least about 0.2 μg, at least about 0.3 μg, at least about 0.4 μg, at least about 0.5 μg, at least about 0.6 μg, at least about 0.7 μg, at least about 0.8 μg, at least about 0.9 μg, at least about 1 μg, at least about 1.5 μg, at least about 2 μg, from about 0.01 to about 2 μg, from about 0.02 to about 1.5 μg, from about 0.03 to about 1 μg, from about 0.04 to about 0.8 μg, from about 0.05 to about 0.5 μg, from about 0.06 to about 0.4 μg, from about 0.07 to about 0.3 μg, from about 0.08 to about 0.2 μg, from about 0.09 to about 0.15 μg, or from about 0.1 to about 0.12 μg of lecithin per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area.5.The lateral flow assay device of any of the preceding claims, wherein the cardiolipin and lecithin components in the anti-lipoidal antibody capture area are at a weight ratio of from about 1: 16 to about 8: 1, from about 1: 15 to about 7.5: 1, about 1: 14 to about 7: 1, from about 1: 13 to about 6.5: 1, about 1: 12 to about 6: 1, from about 1: 11 to about 5.5: 1, about 1: 10 to about 5: 1, from about 1: 9 to about 4.5: 1, from about 1: 8 to about 4: 1, from about 1: 7 to about 3.5: 1, from about 1: 6 to about 3: 1, from about 1: 5 to about 2.5: 1, from about 1: 4 to about 2: 1, from about 1: 3 to about 1.5: 1, or about 1: 2 to about 1: 1.6.A lateral flow assay device comprising a substrate having an anti-lipoidal antibody capture area, wherein the anti-lipoidal antibody capture area comprises a lipoidal antigen comprising cardiolipin and lecithin, the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen have been immobilized onto the substrate, and the anti-lipoidal antibody capture area comprises, per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, at least about 0.01 μg of cardiolipin and / or at least about 0.01 μg of lecithin.7.The lateral flow assay device of claim 6, wherein the anti-lipoidal antibody capture area comprises:at least about 0.02 μg, at least about 0.03 μg, at least about 0.04 μg, at least about 0.05 μg, at least about 0.06 μg, at least about 0.07 μg, at least about 0.08 μg, at least about 0.09 μg, at least about 0.1 μg, at least about 0.15 μg, at least about 0.2 μg, at least about 0.3 μg, at least about 0.4 μg, at least about 0.5 μg, at least about 0.6 μg, at least about 0.7 μg, at least about 0.8 μg, at least about 0.9 μg, at least about 1 μg, from about 0.01 to about 1 μg, from about 0.02 to about 0.5 μg, from about 0.03 to about 0.25 μg, from about 0.04 to about 0.2 μg, from about 0.05 to about 0.15 μg, from about 0.06 to about 0.12 μg, or from about 0.08 to about 0.11 μg of cardiolipin per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, and / orat least about 0.02 μg, at least about 0.03 μg, at least about 0.04 μg, at least about 0.05 μg, at least about 0.06 μg, at least about 0.07 μg, at least about 0.08 μg, at least about 0.09 μg, at least about 0.1 μg, at least about 0.15 μg, at least about 0.2 μg, at least about 0.3 μg, at least about 0.4 μg, at least about 0.5 μg, at least about 0.6 μg, at least about 0.7 μg, at least about 0.8 μg, at least about 0.9 μg, at least about 1 μg, at least about 1.5 μg, at least about 2 μg, from about 0.01 to about 2 μg, from about 0.02 to about 1.5 μg, from about 0.03 to about 1 μg, from about 0.04 to about 0.8 μg, from about 0.05 to about 0.5 μg, from about 0.06 to about 0.4 μg, from about 0.07 to about 0.3 μg, from about 0.08 to about 0.2 μg, from about 0.09 to about 0.15 μg, or from about 0.1 to about 0.12 μg of lecithin per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area.8.The lateral flow assay device of any of claim 6 or 7, wherein the cardiolipin and lecithin components in the anti-lipoidal antibody capture area are at a weight ratio of from about 1: 16 to about 8: 1, from about 1: 15 to about 7.5: 1, about 1: 14 to about 7: 1, from about 1: 13 to about 6.5: 1, about 1: 12 to about 6: 1, from about 1: 11 to about 5.5: 1, about 1: 10 to about 5: 1, from about 1: 9 to about 4.5: 1, from about 1: 8 to about 4: 1, from about 1: 7 to about 3.5: 1, from about 1: 6 to about 3: 1, from about 1: 5 to about 2.5: 1, from about 1: 4 to about 2: 1, from about 1: 3 to about 1.5: 1, or about 1: 2 to about 1: 1.9.The lateral flow assay device of any of the preceding claims, wherein the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen have not been subjected to a chemical modification, e.g., oxidization or conjugation to another moiety.10.The lateral flow assay device of any of the preceding claims, wherein the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen are natural or synthesized.11.The lateral flow assay device of any of the preceding claims, wherein the substrate is a microporous substrate, such as a microporous membrane.12.The lateral flow assay device of any of the preceding claims, further comprising a sample application area and a flow path from the sample application area to the anti-lipoidal antibody capture area.13.The lateral flow assay device of any of the preceding claims, further comprising a treponemal capture area comprising: (a) an immobilized treponemal antigen capable of being specifically bound by an anti-T. pallidum antibody, or (b) an immobilized anti-T. pallidum antibody capable of being specifically bound by a mobile treponemal antigen.14.The lateral flow assay device of any of the preceding claims, wherein the substrate comprises nitrocellulose, polyvinylidene fluoride (PVDF) , polycarbonate, polyester, polyethersulfone, cellulose acetate, mixed cellulose esters, nylon, or combinations thereof.15.The lateral flow assay device of any of the preceding claims, wherein the anti-lipoidal antibody capture area is in the form of one or more test lines, dots or other shapes.16.The lateral flow assay device of claim 15, wherein the one or more test lines have a width from about 0.5 mm to about 2 mm and / or a length from about 3 mm to about 6 mm.17.The lateral flow assay device of any of the preceding claims, wherein the substrate has a pore size up to about 12 μm.18.The lateral flow assay device of any of the preceding claims, further comprising a conjugate pad located in the flow path, wherein the conjugate pad comprises a mobile or mobilizable detector reagent specific for Fc portion of a human antibody.19.The lateral flow assay device of claim 18, wherein the detector reagent is labeled Protein A, Fc-specific Protein G or anti-human antibody.20.The lateral flow assay device of claim 18, wherein the label is an enzyme, a colloidal gold particle, a chemiluminescent agent, or a fluorescent agent.21.The lateral flow assay device of claim 20, wherein the detector reagent comprises gold-conjugated Protein A, gold-conjugated Fc-specific Protein G, or gold-conjugated Fc-specific anti-human antibody.22.The lateral flow assay device of any of claims 18-21, wherein the conjugate pad further comprises a mobile or mobilizable detector reagent specific for the anti-T. pallidum antibody or the mobile treponemal antigen.23.The lateral flow assay device of claim 22, wherein the detector reagent specific for the anti-T. pallidum antibody comprises gold-conjugated Protein A, gold-conjugated Fc-specific Protein G, or gold-conjugated Fc-specific anti-human antibody, or the detector reagent for the mobile treponemal antigen comprises gold-labeled anti-treponemal antigen antibody.24.The lateral flow assay device of any of the preceding claims, wherein the lipoidal antigen does not comprise cholesterol or does not comprise a phospholipid other than cardiolipin and lecithin.25.The lateral flow assay device of claim 12, wherein a biological sample has been applied to the sample application area.26.A lateral flow assay device for determining at least one of the presence or amount of an anti-lipoidal antibody in a biological sample, comprising:a microporous membrane;a sample application area;an anti-lipoidal antibody capture area comprising a lipoidal antigen, wherein the lipoidal antigen comprises cardiolipin and lecithin and the cardiolipin and lecithin components of the lipoidal antigen have been directly immobilized onto the substrate by physical adsorption, and the anti-lipoidal antibody capture area comprises, per mm2 of the anti-lipoidal antibody capture area, at least about 0.05 μg of cardiolipin and / or at least about 0.05 μg of lecithin; anda flow path from the sample application area to the anti-lipoidal antibody capture area; wherein the presence or amount of the anti-lipoidal antibody in the biological sample is determined by detecting the formation of a complex between the anti-lipoidal antibody and the immobilized cardiolipin and lecithin.27.A kit comprising the lateral flow assay device of any of claims 1-24 and 26.28.A method for detecting anti-lipoidal antibodies in a subject, comprising: applying a biological sample from a subject to the lateral flow assay device of any of claims 1-24 and 26 or the kit of claim 27; and detecting the formation of a complex between an anti-lipoidal antibody present in the biological sample and the immobilized cardiolipin and lecithin, wherein the formation of the complex indicates the presence of the anti-lipoidal antibody in the subject.29.The method of claim 28, wherein detection of the anti-lipoidal antibody is used to diagnose syphilis in the subject.30.The method of claim 28 or 29, wherein the biological sample is blood, serum, plasma, finger stick blood, skin ulcer exudate, urine, saliva, sputum, earwax, or cerebrospinal fluid.31.A method for diagnosing syphilis in a subject, comprising: applying a biological sample to the lateral flow assay device of any of claims 1-24 and 26 or the kit of claim 27; detecting in the anti-lipoidal antibody capture area the formation of a first complex between an anti-lipoidal antibody present in the biological sample and the immobilized cardiolipin and lecithin; and detecting in the treponemal capture area the formation of a second complex between: (a) an anti-T. pallidum antibody present in the biological sample and the immobilized treponemal antigen, or (b) a treponemal antigen present in the biological sample and the immobilized anti-T pallidum antibody; wherein detection of the formation of the first complex and the second complex is used to diagnose syphilis in the subject.32.The method of claim 31, wherein the biological sample is a human blood sample.33.The method of claim 32, wherein the human blood sample is whole blood, serum, finger stick blood, or plasma.

Images