Mincle aptamer

Abstract

An aptamer that specifically binds to MINCLE, and a composition comprising said aptamer. Methods of using said aptamer to modulate MINCLE-mediated cellular signaling, to detect the presence of cells expressing MINCLE, and for targeted delivery to cells expressing MINCLE; and a kit for modulating MINCLE-mediated cellular signaling.

Description

MINCLE APTAMERRELATED APPLICATIONS

[0001] This application claims priority to U.S. Provisional Patent Application No. 63 / 744,766, filed January 13, 2025, the contents of which are hereby incorporated by reference in the entirety for all purposes.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] In the past decade or so, it has become increasingly clear that tumor-infiltrating myeloid cells drive not just carcinogenesis via cancer-related inflammatory processes, but also tumor development, invasion, and metastasis. Tumor-associated macrophages (TAMs) in particular are the most common kind of leucocytes in many malignancies and play a crucial role in establishing a favorable microenvironment for tumor cells. TAMs are vital as the primary immune cell subset present in the tumor microenvironment (TME) . In order to proliferate and spread to new locations, cancer cells need to be able to evade the constant surveillance of the immune system by way of creating an immune-suppressive environment. Because of the existence of pro-tumoral TAMs, conventional therapies like chemotherapy and radiotherapy often fail to restrain cancer growth. These cells are also to blame for the failure of innovative immunotherapies premised on immune-checkpoint suppression. The effect of TAMs is an important consideration in anti-cancer immunotherapy. Thus, there is a pressing need for developing new and effective treatment methods targeting macrophages. The present invention fulfills this and other related needs by providing a new aptamer that binds MINCLE with high affinity and specificity as well as by providing compositions and methods useful for inflammatory condition or cancer treatment with an emphasis on blocking MINCLE-mediated disease progression. BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

[0003] The invention resides in the construction of a novel aptamer and the revelation of its desirable characteristics of high affinity and specificity to cell surface antigen MINCLE. These findings also provide new compositions and methods for the use of this aptamer in regulating MINCLE-mediated cellular signaling, for treating inflammatory conditions or cancer, for detection of MINCLE-expressing cells / tissues, and for targeted delivery to MINCLE-positive cells / tissues. Thus, in the first aspect, the present invention provides a novel aptamer, which comprises an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and which specifically binds MINCLE. Optionally, the aptamer further includes a heterologous moiety, such as detectable moiety, a therapeutic agent, or a solid support, which is conjugated to the oligonucleotide. In some embodiments, the aptamer consists of or consists essentially of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the oligonucleotide may be further conjugated to a heterologous moiety, such as a detectable moiety, a therapeutic agent, or a solid support. In some embodiments, the nucleotide sequence of the aptamer comprises at least one chemical modification. In some embodiments, the aptamer binds MINCLE with an equilibrium dissociation constant KD in the nanomolar range, for instance, no greater than about 500 nM, or less than about 100, 50, 20, 10, or 5 nM.

[0004] In a related aspect, the present invention provides a composition comprising the MINCLE aptamer as described above and herein, plus at least one pharmaceutically acceptable excipient. In some embodiments, the composition further includes at least one anti-inflammatory therapeutic agent or at least one anti-cancer therapeutic agent, such as one or more checkpoint inhibitors. In some embodiments, the composition is formulated for administration by injection, by oral ingestion, by nasal inhalation, or by topical application.

[0005] In a second aspect, the present invention provides a method for modulating MINCLE-mediated cellular signaling. The method comprises the step of contacting a MINCLE-expressing cell with the aptamer described above and herein under conditions permissible for specific binding between the aptamer and MINCLE, thereby blocking or inhibiting / reducing MINCLE-mediated cellular signaling. In some embodiments, the MINCLE-expressing cell is located within a patient’s body and the aptamer is administered to the patient by injection, for example, by injection of any one of the aptamer-containing compositions described above and herein. In some embodiments, the patient has been diagnosed with an inflammatory condition or cancer and is being treated for the condition or cancer. In some embodiments, in addition to the aptamer, the patient is further administered an anti-inflammatory therapeutic agent or an anti-cancer therapeutic agent, for example, one or more of the checkpoint blocker drugs.

[0006] In a third aspect, the present invention provides a method for detecting the presence of MINCL-expressing cells. The method comprises these steps: (1) contacting a plurality of cells potentially comprising MINCLE-expressing cells with the aptamer described above and herein under conditions permissible for specific binding between the aptamer and MINCLE; and (2) detecting cells specifically bound to the aptamer and identifying such cells as MINCLE-expressing cells. In some embodiments, the plurality of cells are present in a biological sample taken from a person, for example, a blood sample or a biopsy sample. In some embodiments, the plurality of cells are present in a person’s body. In some embodiments, the aptamer comprises a detectable moiety or an imaging agent, which allows for ready detection, for example, real-time imaging of the distribution of MINCLE+ cells, such as MINCLE+ cancer-associated cells. In some embodiments, the aptamer is immobilized to a solid substrate. In some embodiments, the method further includes a step subsequent to step (2) to isolate the cells specifically bound to the aptamer and identified as MINCLE-bearing cells, such as MINCLE+ cancer-associated cells.

[0007] In a fourth aspect, a method is provided for targeted delivery to MINCLE-expressing cells. The method comprises administering to a patient in need thereof an effective amount of the aptamer comprising an imaging or therapeutic agent as described above and herein, for example, to treat a patient diagnosed to have an inflammatory disease or cancer. In some embodiments, the aptamer is administered systemically, e.g., by intravenous, intramuscular, or subcutaneous injection. In some embodiments, the aptamer is administered locally, e.g., intratumorally injected. In some embodiments, the aptamer consists essentially of SEQ ID NO: 1 and the imaging or therapeutic agent, or the aptamer consists of SEQ ID NO: 1 and the imaging or therapeutic agent. In some embodiments, the therapeutic agent is an anti-inflammation drug or an anti-cancer drug.

[0008] In a fifth aspect, a kit is provided for modulating MINCLE-mediated cellular signaling. The kit includes a first container containing a pharmaceutical composition comprising an effective amount of a MINCLE aptamer as described above and herein. Optionally, the kit also includes a second container containing a second pharmaceutical composition comprising an effective amount of another, different therapeutic agent such as a drug possessing anti-inflammatory or anti-cancer properties, including any one of those known in the medical field or named in a previous section, preferably approved for treating inflammation or treating cancer. For instance, an anti-cancer therapeutic agent in the second pharmaceutical composition may comprise one or more chemotherapeutic agents or immunotherapeutic agents, such as one or more checkpoint inhibitors that specifically block PD-1 / PD-L1 binding. Either or both of the first and second compositions are in some cases formulated for administration by injection. In some instances, the kit includes an instruction manual to guide users for the proper usage of the composition (s) included in the kit.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0009] Figures 1A-1E: Development and Characterization of Anti-Mincle, a Novel DNA Aptamer Targeting Tumor-Associated Macrophages. Figure 1A: Top 10 sequence with strongest binding-affinity and highest enrichment degree towards Mincle. Figure 1B: Comparative docking analysis of Anti-Mincle aptamer and a previously reported aptamer by Stephens et al., Mol Ther Nucleic Acids. 2022 Jun 2; 28: 935-947. Figure 1C: Specific binding of Cy3-conjugated Anti-Mincle aptamer in murine tumor tissue, demonstrated by immunofluorescence staining. Figure 1D: MicroScale Thermophoresis (MST) Analysis of Anti-Mincle Binding Affinity to Mincle Protein. Figure 1E: Western blot analysis demonstrating the inhibitory effect of Anti-Mincle aptamer on the Mincle / Syk / NF-κB signaling pathway in LLC-conditioned medium (LLC-CM) stimulated mouse bone marrow-derived macrophages (BMDMs) .

[0010] Fig. 2: Anti-Mincle as an effective immunotherapy for solid cancer. Figure 2A-B:Anti-Mincle Therapy Reduces Tumor Growth and Promotes M1 Macrophage Polarization in LLC-Bearing Mice. Figure 2C: Main organs (The orange-red fluorescence signal from the Cy3-conjugated Anti-Mincle in the lung, heart, spleen, liver, kidney, and tumor tissue collected from mice given Cy3-labeled Anti-Mincle treatment one hour before scarification.

[0011] Fig. 3: Anti-Mincle as an effective immunotherapy combined with Anti-PD-1 / L1 anticancer immunotherapy for solid cancer. Figure 3A: Online TCGA database analysis in GEPIA2 (website: gepia2. cancer-pku. cn / ) shows Mincle+ TAM positively correlated with T cell exhaustion in NSCLC. Figure 3B-D: Anti-Mincle / Anti-PD-1 Combined Therapy Reduces Tumor Growth, Promotes M1 Macrophage Polarization and Increases Cytotoxic T Cell Abundance in LLC-Bearing Mice. DEFINITIONS

[0012] The term “MINCLE” refers to a cell surface receptor also known as macrophage inducible Ca2+-dependent lectin. It is a member of the C-type lectin superfamily encoded by the gene CLEC4E (C-type lectin domain family 4, member E) located on human chromosome 12p13.31 and its genomic DNA sequence is set forth in, for example, GenBank Accession No. NC_000012.12. A lipopolysaccharide-induced protein, MINCLE is a natural immune receptor widely expressed on immune cells, especially antigen-presenting cells such as macrophages, dendritic cells, neutrophils and monocytes. MINCLE is involved in many signal transduction pathways.

[0013] As used herein, the term "aptamer" or "oligonucleotide aptamer" refers in general to an oligonucleotide of a single defined sequence (e.g., SEQ ID NO: 1) , which is optionally conjugated with an additional moiety (such as a detectable moiety, a therapeutic agent, or a solid substrate) and / or optionally includes chemical modification, and which retains the properties of binding specifically to a pre-determined target molecule, such as MINCLE. Typically, an "aptamer" is a single-stranded nucleic acid. Structurally, the aptamers of the present disclosure are specifically binding oligonucleotides. Aptamers may comprise RNA, DNA or both RNA and DNA. The aptamer may be synthetically produced using well-known methods. Alternatively, the aptamer may be recombinantly produced.

[0014] The term “inflammation” refers an immune response by an organism (e.g., an animal, especially a mammal such as a primate including human) to irritation, toxic substances, pathogens, or other stimuli. The response can involve innate immune components and / or adaptive immunity. Inflammation is generally characterized as either chronic or acute. Acute inflammation can be characterized by, e.g., redness, pain, heat, swelling, and / or loss of function due to infiltration of plasma proteins and leukocytes to the affected area. Chronic inflammation can be characterized by, e.g., persistent inflammation, tissue destruction, and / or attempts at repair. Monocytes, macrophages, plasma B cells, and other lymphocytes are commonly recruited to the affected area, and angiogenesis and fibrosis can occur, in some instances leading to scar tissue.

[0015] The term “inflammatory condition / disorder” or “inflammatory disease” refer to a condition or disorder that is characterized by, involving, or exacerbated by an inflammatory response, as described above. Exemplary inflammatory conditions include: systemic lupus erythematosus (SLE) , diabetes, chronic renal disease, asthma, autoimmune disease, chronic inflammation, chronic prostatitis, glomerulonephritis, hypersensitivities and allergies, skin disorders such as eczema, inflammatory bowel disease, pelvic inflammatory disease, reperfusion injury, rheumatoid arthritis, transplant rejection, and vasculitis.

[0016] The term “cancer” encompasses any of various malignant neoplasms characterized by the proliferation of anaplastic cells that tend to invade surrounding tissue and metastasize to new anatomic sites within a patient’s body. Non-limiting examples of different types of cancer suitable for treatment using the compositions and methods of the present invention include colorectal cancer, colon cancer, anal cancer, liver cancer, ovarian cancer, breast cancer, lung cancer, bladder cancer, thyroid cancer, pleural cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, testicular cancer, bile duct cancer, gastrointestinal carcinoid tumors, esophageal cancer, gall bladder cancer, rectal cancer, appendix cancer, small intestine cancer, stomach (gastric) cancer, renal cancer (e.g., renal cell carcinoma) , cancer of the central nervous system, skin cancer, oral squamous cell carcinoma, choriocarcinomas, head and neck cancers, bone cancer, osteogenic sarcomas, fibrosarcoma, neuroblastoma, glioma, melanoma, leukemia (e.g., acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, acute myelogenous leukemia, chronic myelogenous leukemia, or hairy cell leukemia) , lymphoma (e.g., non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, B-cell lymphoma, or Burkitt's lymphoma) , and multiple myeloma.

[0017] The term “macrophage” refers to a type of white blood cells of the immune system that engulfs and digests cellular debris, foreign substances, microbes, cancer cells, and anything else that does not present on its surface the specific protein (s) healthy body cells normally present on the cell surface. This process is termed phagocytosis. Also known as phagocytes, macrophages play a critical role in nonspecific cellular defense (innate immunity) and in initiating specific cellular defense mechanisms (adaptive immunity) by recruiting other immune cells such as lymphocytes, e.g., by acting as antigen presenters to T cells. Further, macrophages are involved in the regulation of inflammation.

[0018] The term “nucleic acid” or “polynucleotide” refers to deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA) and polymers thereof in either single-or double-stranded form. Unless specifically limited, the term encompasses nucleic acids containing known analogues of natural nucleotides that have similar binding properties as the reference nucleic acid and are metabolized in a manner similar to naturally occurring nucleotides. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence also implicitly encompasses conservatively modified variants thereof (e.g., degenerate codon substitutions) , alleles, orthologs, SNPs, and complementary sequences as well as the sequence explicitly indicated. Specifically, degenerate codon substitutions may be achieved by generating sequences in which the third position of one or more selected (or all) codons is substituted with mixed-base and / or deoxyinosine residues (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991) ; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985) ; and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994) ) . The term nucleic acid is used interchangeably with gene, cDNA, and mRNA encoded by a gene.

[0019] The term “gene” means the segment of DNA involved in producing a polypeptide chain. It may include regions preceding and following the coding region (leader and trailer) as well as intervening sequences (introns) between individual coding segments (exons) .

[0020] The term “amino acid” refers to naturally occurring and synthetic amino acids, as well as amino acid analogs and amino acid mimetics that function in a manner similar to the naturally occurring amino acids. Naturally occurring amino acids are those encoded by the genetic code, as well as those amino acids that are later modified, e.g., hydroxyproline, γ-carboxyglutamate, and O-phosphoserine. Amino acid analogs refers to compounds that have the same basic chemical structure as a naturally occurring amino acid, i.e., an α carbon that is bound to a hydrogen, a carboxyl group, an amino group, and an R group, e.g., homoserine, norleucine, methionine sulfoxide, methionine methyl sulfonium. Such analogs have modified R groups (e.g., norleucine) or modified peptide backbones, but retain the same basic chemical structure as a naturally occurring amino acid. “Amino acid mimetics” refers to chemical compounds having a structure that is different from the general chemical structure of an amino acid, but that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid. Many methods are known in the art that permit the incorporation of an unnatural amino acid, a derivative or analog of a natural amino acid into a polypeptide chain in a site-specific manner, see, e.g., WO 02 / 086075.

[0021] Amino acids may be referred to herein by either the commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides, likewise, may be referred to by their commonly accepted single-letter codes. In the present application, amino acid residues are numbered according to their relative positions from the left most residue, which is numbered 1, in an unmodified wild-type polypeptide sequence.

[0022] “Polypeptide, ” “peptide, ” and “protein” are used interchangeably herein to refer to a polymer of amino acid residues. All three terms apply to amino acid polymers in which one or more amino acid residue is an artificial chemical mimetic of a corresponding naturally occurring amino acid, as well as to naturally occurring amino acid polymers and non-naturally occurring amino acid polymers. As used herein, the terms encompass amino acid chains of any length, including full-length proteins, wherein the amino acid residues are linked by covalent peptide bonds.

[0023] The term "oligonucleotide" sequence and “nucleotide” sequence are used herein interchangeably to generically refer to polydeoxyribonucleotides (containing 2'-deoxy-D-ribose or modified forms thereof) , i.e., DNA, to polyribonucleotides (containing D ribose or modified forms thereof) , i.e., RNA, and to any other type of polynucleotide, which is an N-glycoside or C-glycoside of a purine or pyrimidine base, or modified purine or pyrimidine base or abasic nucleotides. According to the present disclosure, the term "oligonucleotide" includes not only those with conventional nucleobases, sugar residues, and internucleotide linkages, but also those that contain modifications of any one or more of these three components. For example, an oligonucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encompasses the phosphorothioate-modified version of the sequence in which the phosphodiester bonds connecting the individual nucleotides are replaced with phosphorothioate (PS) bonds by substituting a sulfur atom for a non-bridging oxygen in the phosphate backbone of an oligonucleotide. This modification renders the internucleotide linkage resistant to nuclease degradation. In some cases, phosphorothioate bonds can be introduced between the last 3-5 nucleotides at the 5'-and / or 3'-end of the oligonucleotide sequence.

[0024] As used herein, the term "binding affinity" refers to the tendency of an aptamer to bind or not bind a target molecule and describes the measure of the strength of the binding or affinity of the aptamer to bind the target. The energetics of said interactions are significant in "binding affinity" because they define the necessary concentrations of interacting partners, the rates at which these partners are capable of associating, and the relative concentrations of bound and free molecules in a solution. The energetics are characterized herein through, among other ways, by the determination of a dissociation constant, Kd. As is known in the art, a low dissociation constant indicates stronger binding and affinity of the molecules to each other.

[0025] As used herein, the term "biological sample" refers to a cell or a population of cells or a quantity of tissue or fluid from a subject. Often, a "biological sample" will contain cells from the subject. Biological samples include, but are not limited to, tissue biopsies, needle biopsies, scrapes (e.g., buccal scrapes) , whole blood as well as acellular and cellular fractions of the blood (i.e., plasma, serum, blood cells) , lymph, bone marrow, urine, stool, saliva, sputum, primary or permanent cell culture, spinal fluid, pleural fluid, pericardial fluid, ascitic fluid, or cerebrospinal fluid. Samples may be paraffin-embedded or frozen tissue.

[0026] The term "isolated" as used herein is intended to refer to the aptamer purified from other components or chemicals, which may be present during the process of generating and purifying the aptamer (e.g., using the SELEX method) . In the context of cells, the term also refers to cells isolatable or purified from other components in the environment in which it may naturally occur. The isolated cell may be purified to any degree relative to its naturally-obtainable state.

[0027] The term "conjugated with" or "coupled to" encompasses any construction whereby a molecule (e.g., the aptamer of this invention) is covalently linked, attached, or joined, for example, at its 3'or 5'terminal or at any side reactive group to an agent that may serve as a detectable moiety or a therapeutically active agent for the purpose of detecting or imaging of target cells or tissue or for the purpose of treating a medical condition.

[0028] A "label, " "detectable label, " or "detectable moiety" is a composition detectable by radiological, spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, chemical, or other physical means. For example, useful labels include radioisotopes such as 32P, fluorescent dyes, electron-dense reagents, enzymes (e.g., as commonly used in an ELISA) , biotin, digoxigenin, or haptens and proteins that can be made detectable, e.g., by incorporating a radioactive component into a polypeptide or used to detect antibodies specifically reactive with the polypeptide. Typically, a detectable label is a heterologous moiety attached to a probe or a molecule (e.g., a protein or nucleic acid) with defined binding characteristics (e.g., a polypeptide with a known binding specificity or a polynucleotide) , so as to allow the presence of the probe / molecule (and therefore its binding target) to be readily detectable. The heterologous nature of the label ensures that it has an origin different from that of the probe or molecule that it labels, such that the probe / molecule attached with the detectable label does not constitute a naturally occurring composition (e.g., a naturally occurring polynucleotide or polypeptide sequence) .

[0029] As used herein, the term "specifically binds" indicates that a molecule (such as the aptamer of this invention) reacts or associates more frequently, more rapidly, with greater duration, and / or with greater affinity with a particular cell or substance than it does with alternative cells or substances. For example, an aptamer that specifically binds to a target protein such as MINCLE binds that protein or an epitope or immunogenic fragment thereof with greater affinity, avidity, more readily, and / or with greater duration than it binds to unrelated protein and / or epitopes or immunogenic fragments thereof. Although "specific binding" does not necessarily require exclusive binding or non-detectable binding of another molecule, this term is defined by the comparative dissociation constants (Kd) of the aptamer for its intended target as compared to the dissociation constant with respect to the aptamer and other materials in the environment or unrelated molecules in general. Typically, the Kd for the aptamer with respect to the target will be less than 1 / 100, such as less than 1 / 200 or 1 / 500 or 1 / 1000 of the Kd with respect to the target and the unrelated material or accompanying material in the environment. In some cases, the Kd may be 1 / 10,000, 1 / 100,000 or 1 / 1,000,000 or less.

[0030] The term "inhibiting" or "inhibition, " as used herein, refers to any detectable negative effect on a target biological process, such as protein phosphorylation, cellular signal transduction, protein synthesis, cell proliferation, tumorigenicity, and metastatic potential etc. Typically, an inhibition is reflected in a decrease of at least 10%, 20%, 30%, 40%, or 50%in the target process (e.g., target cell proliferation / survival, or target gene expression) , or any one of the downstream parameters mentioned above, when compared to a control value. In a similar fashion, the term “increasing” or “increase” is used to describe any detectable positive effect on a target biological process, such as a positive change of at least 25%, 50%, 75%, 100%, or as high as 2, 3, 4, 5 or up to 10 or 20-fold, when compared to a control value. In contrast, the term "substantially the same" or "substantial lack of change" indicates little to no change in quantity, typically within ± 10%of a control value, or within ± 5%, 2%, or even less variation from the control value.

[0031] The term "treat" or "treating, " as used in this application, describes an act that leads to the elimination, reduction, alleviation, reversal, prevention and / or delay of onset or recurrence of any symptom of a predetermined medical condition. In other words, "treating" a condition encompasses both therapeutic and prophylactic intervention against the condition, including facilitation of patient recovery from the condition. In the context of the present invention, the term "treat" or "treatment" or "treating" is understood to mean administering a therapeutically effective amount of the aptamer or pharmaceutical composition as disclosed herein and reducing at least one symptom of a clinical condition caused by, associated with, or exacerbated by MINCLE expression or activation.

[0032] The term “effective amount, ” as used herein, refers to an amount of a substance that produces a desired effect (e.g., an detectable imaging signal or an inhibitory or suppressive effect on the proliferation or survival or metastasis of target cells) for which the substance (e.g., an aptamer of this invention) is used or administered. In some cases, the effects include the prevention, inhibition, or delaying of any pertinent biological process to any detectable extent. The exact amount will depend on the nature of the substance (the active agent) , the manner of use / administration, and the purpose of the application, and will be ascertainable by one skilled in the art using known techniques as well as those described herein.

[0033] A “subject, ” or "subject in need of treatment, " as used herein, refers to an individual who seeks medical attention due to risk of, or actual sufferance from, a condition involving, caused by, or exacerbated by an aberrant cellular event, for example, improper or undesirable MINCLE-mediated cellular signaling. The term “subject” can include both animals, especially mammals and primates, and humans. Subjects or individuals in need of treatment include those that demonstrate symptoms of inflammation and / or undesirable or inappropriate cell proliferation such as tumor and especially malignant tumor / cancer or are at risk of later developing these conditions and / or related symptoms.

[0034] A “checkpoint inhibitor” is a molecule that is capable of specifically recognizing and binding to, with high affinity, a checkpoint protein or its corresponding ligand so as to prevent the binding between the checkpoint protein and its ligand, thus blocking the checkpoint pathway and its effects. Immune checkpoint pathways are a normal part of the immune system and play an important role in regulating immune response-when they engage, the checkpoint pathways typically inhibit an immune response. In the example of the Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1) and Programmed Cell Death-Ligand 1 (PD-L1) pathway, when PD-1 (expressed on T cells) binds to PD-L1 (expressed on certain tumor cells) , the T cells are suppressed from killing the tumor cells. Conversely, an inhibitor of the PD-1 / PD-L1 binding, or a so-called checkpoint inhibitor / blocker, can effectively remove the suppression and allow the T cells to kill the tumor cells. A “checkpoint blocker or inhibitor, ” for example, capable of specifically binding a PD-1 or PD-L1 protein and therefore interfering with, inhibiting, or preventing PD-1 / PD-L1 binding, thus can serve as an immunotherapeutic agent in cancer treatment.

[0035] A composition "consisting essentially of " an active ingredient is a composition that includes the active ingredient having a predetermined and desired biological activity or efficacy (for example, the expression of a protein of interest or cellular proliferation rate) but no other compounds that contribute to or affect in any detectable manner the predetermined biological activity or efficacy of the active ingredient. Such a composition may include inactive excipients, e.g., for formulation or stability of a pharmaceutical composition, and / or additional active ingredients that have unrelated activity but do not detectably contribute to or affect the predetermined biological activity or efficacy.

[0036] A "pharmaceutically acceptable" or "pharmacologically acceptable" excipient is a substance that is not biologically harmful or otherwise undesirable, i.e., the excipient may be administered to an individual along with a bioactive agent without causing any undesirable biological effects. Neither would the excipient interact in a deleterious manner with any of the components of the composition in which it is contained.

[0037] The term "excipient" refers to any essentially accessory substance that may be present in the finished dosage form of the composition of this invention. For example, the term "excipient" includes vehicles, binders, disintegrants, fillers (diluents) , lubricants, glidants (flow enhancers) , compression aids, colors, sweeteners, preservatives, suspending / dispersing agents, film formers / coatings, flavors and printing inks.

[0038] As used herein, the term “about” denotes a range of value that is + / -10%of a specified value. For instance, “about 10” denotes the value range of 9 to 11 (10 + / -1) .DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIONI. GENERAL INFORMATION AND INTRODUCTION

[0039] Basic texts disclosing general methods and techniques in the field of recombinant genetics include Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001) ; Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990) ; and Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994) .

[0040] For nucleic acids, sizes are given in either kilobases (kb) or base pairs (bp) . These are estimates derived from agarose or acrylamide gel electrophoresis, from sequenced nucleic acids, or from published DNA sequences. For proteins, sizes are given in kilodaltons (kDa) or amino acid residue numbers. Proteins sizes are estimated from gel electrophoresis, from sequenced proteins, from derived amino acid sequences, or from published protein sequences.

[0041] Oligonucleotides that are not commercially available can be chemically synthesized, e.g., according to the solid phase phosphoramidite triester method first described by Beaucage &Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981) , using an automated synthesizer, as described in Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984) . Purification of oligonucleotides is performed using any art-recognized strategy, e.g., native acrylamide gel electrophoresis or anion-exchange HPLC as described in Pearson &Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983) . Polynucleotide sequences such as synthetic oligonucleotides can be verified using well-established methodologies, e.g., the chain termination method for sequencing double-stranded templates of Wallace et al., Gene 16: 21-26 (1981) .

[0042] The present invention introduces a groundbreaking platform for achieving ex vivo and in vitro genetic cell engineering devoid of viruses. With the anti-Mincle aptamer integrated, the system of this invention not only facilitates efficient anti-cancer effect but also addresses anti-PD-1 resistance in lung cancer. Through SELEX screening system, a novel anti-Mincle aptamer is successfully obtained that shows anticancer effects in vivo that effectively inhibits the Mincle / Syk / NF-kB protumoral circuit in macrophages. With its superior DNA-based therapeutic approach, the anti-Mincle aptamer emerges as a highly versatile, virus-free cell engineering platform poised to revolutionize cancer therapy and beyond. Crucially, this DNA-based drug can enhance the anti-cancer effect of anti-PD-1 / PDL-1, a notable advantage over conventional immune checkpoint methods. II. APTAMERS

[0043] Aptamers are molecules that have been known for the past two decades. Several unique properties of aptamers make them attractive tools for use in a wide array of molecular biology applications and as potential pharmaceutical agents. First, most aptamers bind to targets with high affinity, demonstrating typical dissociation constants in the pico-to nanomolar range. Binding sites for aptamers include clefts and grooves of target molecules resulting in antagonistic activity very similar to many currently available pharmaceutical agents. Second, aptamers are structurally stable across a wide range of temperatures and storage conditions, maintaining the ability to form their unique tertiary structures. Third, aptamers can be chemically synthesized, in contrast to the expensive and work-intensive biological systems needed to produce monoclonal antibodies.

[0044] Disclosed herein are aptamer molecules that specifically bind to the MINCLE protein and therefore can effectively modulate cellular signaling mediated by MINCLE. MINCLE acts as a pattern recognition receptor (PRR) that recognizes pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) of pathogens (e.g., bacteria and fungi) , mainly glycolipids, and induces an acquired immune response against microbial infection. Further, MINCLE is able to recognize damage-associated molecular patterns (DAMPs) , especially lipid damage-associated molecules released by injured cells, and induces sterile inflammation and ultimately accelerates the progression of a variety of diseases and conditions including stroke, obesity, hepatitis, kidney injury, autoimmune disorders, and tumors by promoting tissue inflammation. Moreover, MINCLE can activate the tumor-promoting phenotype of tumor-associated macrophages, participating in the regulation of immune response in tumor microenvironment and promoting tumor development. The MINCLE signaling pathway has been recognized as a potential intervention target for immunomodulatory therapy of sterile inflammation-related diseases and various types of cancer. The aptamer molecules of the present disclosure are particular useful diagnostic and therapeutic agents. They also can be used as detection agents for MINCLE-expressing cells and tissues.

[0045] Aptamers are single stranded oligonucleotides or oligonucleotide analogs that bind to a particular target molecule, such as a protein or a small molecule. Thus, aptamers are the oligonucleotide analogy to antibodies. In general, aptamers comprise about 15 to about 100 nucleotides, or about 15 to about 50 nucleotides, or about 20 to about 40 nucleotides, in that oligonucleotides of a length that falls within these ranges can be prepared by conventional techniques.

[0046] Aptamer binding is highly dependent on the secondary structure formed by the aptamer oligonucleotide. Both RNA and single stranded DNA (or analog) aptamers are known. See, for example, Burke et al. (1996) . J. Mol. Biol. 264: 650-666; Ellington and Szostak (1990) . Nature 346: 818-22; Hirao et al. (1998) . Mol Divers. 4: 75-89; Jaeger et al. (1998) . EMBO Journal 17: 4535; Kensch et al. (2000) . J. Biol. Chem 275: 18271-8; Schneider et al. (1995) . Biochemistry 34: 9599-9610; and U.S. Pat. Nos. 5,773,598; 6,028,186;6,110,900; 6,127,119; and 6,171,795.

[0047] Various methods for preparing aptamers according to the present disclosure will be familiar to persons skilled in the art. Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, "SELEXTM" is a method for making a nucleic acid ligand for any desired target, as described, e.g., in U.S. Pat. Nos. 5,475,096 and 5,270,163, and WO91 / 19813. SELEXTM technology is based on the fact that nucleic acids have sufficient capacity for forming a variety of two-and three-dimensional structures and sufficient chemical versatility available within their monomers to act as ligands (i.e., form specific binding pairs) with virtually any chemical compound, whether large or small in size.

[0048] The method involves selection from a mixture of candidates and step-wise iterations of structural improvement, using the same general selection theme, to achieve virtually any desired criterion of binding affinity and selectivity. Starting from a mixture of nucleic acids, preferably comprising a segment of randomized sequence, the SELEXTM method includes steps of contacting the mixture with the target under conditions favorable for binding, partitioning unbound nucleic acids from those nucleic acids which have bound to target molecules, dissociating the nucleic acid-target pairs, amplifying the nucleic acids dissociated from the nucleic acid-target pairs to yield a ligand-enriched mixture of nucleic acids, then reiterating the steps of binding, partitioning, dissociating and amplifying through as many cycles as desired.

[0049] Within a nucleic acid mixture containing a large number of possible sequences and structures, there is a wide range of binding affinities for a given target. A nucleic acid mixture comprising, for example, a 20-nucleotide randomized segment can have 420 candidate possibilities. Those which have the higher affinity constants for the target are most likely to bind to the target. After partitioning, dissociation and amplification, a second nucleic acid mixture is generated, enriched for the higher binding affinity candidates. Additional rounds of selection progressively favor the best ligands until the resulting nucleic acid mixture is predominantly composed of only one or a few sequences. These can then be cloned, sequenced and individually tested for binding affinity as pure ligands.

[0050] Cycles of selection and amplification are repeated until a desired goal is achieved. In the most general case, selection / amplification is continued until no significant improvement in binding strength is achieved on repetition of the cycle. The method may be used to sample as many as about 1018 different nucleic acid species. The nucleic acids of the test mixture preferably include a randomized sequence portion as well as conserved sequences necessary for efficient amplification. Nucleic acid sequence variants can be produced in a number of ways including synthesis of randomized nucleic acid sequences and size selection from randomly cleaved cellular nucleic acids. The variable sequence portion may contain fully or partially random sequence; it may also contain subportions of conserved sequence incorporated with randomized sequence. Sequence variation in test nucleic acids can be introduced or increased by mutagenesis before or during the selection / amplification iterations.

[0051] Enrichment of aptamer candidates during selection may be monitored using restriction fragment length polymorphism (RFLP) and flow cytometry as described in Shigdar S et al. (2013) Cancer Letters 330: 84-95. III. APTAMER CHARACTERISTICS AND MODIFICATION

[0052] The binding affinity describes the measure of the strength of the binding or affinity of molecules to each other. Binding affinity of the aptamer herein with respect to targets and other molecules is defined in terms of Kd. The dissociation constant can be determined by methods known in the art and can be computed even for complex mixtures by methods such as those, for example, set forth in Caceci, M., et al., Byte (1984) 9: 340-362. Examples of measuring dissociation constants are described for example in U.S. Pat. No. 7,602,495 which describes surface Plasmon resonance analysis, and in U.S. Pat. No. 6,562,627, and US 2012 / 00445849. In another example, the Kd is established using a double-filter nitrocellulose filter binding assay such as that disclosed by Wong and Lohman, (1993) . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432. Methods for determining binding affinity of aptamers is also described in for example, Stoltenburg R et al. (2005) Anal Bioanal Chem 383: 83-91, Tran D T et al (2010) Molecules 15, 1127-1140, and Cho M. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (46) : 18460-18465.

[0053] It has been observed that for some small oligonucleotides, direct determination of Kd is difficult, and can lead to misleadingly high results. Under these circumstances, a competitive binding assay for the target molecule or other candidate substance can be conducted with respect to substances known to bind the target or candidate. The value of the concentration at which 50%inhibition occurs (Ki) is, under ideal conditions, equivalent to Kd. However, in no event will a Ki be less than Kd. Thus, determination of Ki, in the alternative, sets a maximal value for the value of Kd. Under those circumstances where technical difficulties preclude accurate measurement of Kd, measurement of Ki can conveniently be substituted to provide an upper limit for Kd. A Ki value can also be used to confirm that an aptamer of the present disclosure binds MINCLE.

[0054] One potential problem encountered in the use of nucleic acids as therapeutics in that oligonucleotides in their phosphodiester form may be quickly degraded in body fluids by intracellular and extracellular enzymes such as endonucleases and exonucleases before the desired effect is manifest. The present disclosure also includes analogs as described herein and / or additional modifications designed to improve one or more characteristics of the aptamers such as protection from nuclease digestion.

[0055] Oligonucleotide aptamer modifications contemplated in the present disclosure include, but are not limited to, those which provide other chemical groups that incorporate additional charge, polarizability, hydrophobicity, hydrogen bonding, electrostatic interaction, and fluxionality to the nucleic acid ligand bases or to the nucleic acid ligand as a whole.

[0056] Modifications to generate oligonucleotide aptamers that are resistant to nucleases can also include one or more substitute internucleotide linkages, altered sugars, altered bases, or combinations thereof. Such modifications include 2'-position sugar modifications, 5-position pyrimidine modifications, 8-position purine modifications, modifications at exocyclic amines, substitution of 4-thiouridine, substitution of 5-bromo or 5-iodo-uracil, backbone modifications, phosphorothioate or alkyl phosphate modifications, methylations, and unusual base-pairing combinations such as the isobases isocytidine and isoguanosine; 3'and 5'modifications such as capping; conjugation to a high molecular weight, non-immunogenic compound; conjugation to a lipophilic compound; and phosphate backbone modification.

[0057] In one example, the non-immunogenic, high molecular weight compound conjugated to the aptamer of the present disclosure is polyalkylene glycol, preferably polyethylene glycol. In one example, the backbone modification comprises incorporation of one or more phosphorothioates into the phosphate backbone. In another example, the aptamer of the present disclosure comprises the incorporation of fewer than 10, fewer than 6, or fewer than 3 phosphorothioates in the phosphate backbone.

[0058] Where appropriate, additional modification may include at least one of the following, 2'-deoxy, 2'-halo (including 2'-fluoro) , 2'-amino (preferably not substituted or mono-or disubstituted) , 2'-mono-, di-or tri-halomethyl, 2'-O-alkyl, 2'-O-halo-substituted alkyl, 2'-alkyl, azido, phosphorothioate, sulfhydryl, methylphosphonate, fluorescein, rhodamine, pyrene, biotin, xanthine, hypoxanthine, 2, 6-diamino purine, 2-hydroxy-6-mercaptopurine and pyrimidine bases substituted at the 6-position with sulfur or 5 position with halo or C15 alkyl groups, abasic linkers, 3'-deoxy-adenosine as well as other available "chain terminator" or "non-extendible" analogs (at the 3'-end of the RNA) , or labels such as 32P, 33P and the like. All of the foregoing can be incorporated into an aptamer using the standard synthesis techniques disclosed herein. IV. USE OF APTAMERS

[0059] Solid tumors are composed of mutually interacting cancer cells and tumor microenvironment. Many environmental components, such as extracellular matrix (ECM) , mesenchymal stem cells, endothelial and immune cells, and various growth factors and cytokines, provide signals, either stimulatory or inhibitory, to cancer cells and determine their fates. Meanwhile, cancer cells can also educate surrounding cells or tissues to undergo changes that are in favorable of tumor progression. MINCLE, a cell surface C-type lectin, is known to be expressed on the surface of inflammatory or tumor-associated macrophages and directly involved in inflammatory processes and in the establishment of a pro-tumor microenvironment to prevent host immune surveillance so as to facilitate cancer cell survival, proliferation, extracellular matrix integrity, invasion, angiogenesis and metastasis in the tumor microenvironment (TME) via direct or indirect crosstalk between these so-called tumor-associated cells with the cancer cells. In light of the evidence that MINCLE mediates multiple cellular signaling pathways and is directly involved in various processes including inflammation, tumor initiation, and metastasis, the aptamer molecules of this invention may be used directly as therapeutic agents, bind to a specific target MINCLE, and block cellular signaling mediated by MINCLE as well as its downstream biological events. The aptamer molecules can also be used as affinity ligands to separate and purify target entities (e.g., MINCLE or MINCLE-expressing cells) , as probes to trace, monitor, detect and quantitate target entities (e.g., MINCLE or MINCLE-expressing cells) , or to block, allow, activate or catalyze reactions that are physiologically relevant to achieve therapeutic effect.

[0060] The aptamer molecules of the present disclosure can be used in in vitro processes, for example, affinity purification mixtures to purify target entities (e.g., MINCLE or MINCLE-expressing cells) . The aptamers are useful for chromatographic separations of target entities (e.g., MINCLE or MINCLE-expressing cells) from contaminants and for purifying target molecules from cell cultures or cell extracts.

[0061] In one example, the aptamer molecules of the present disclosure can be used as a capture agent to bind or immobilize a target (e.g., MINCLE or MINCLE-expressing cells) to a solid support or substrate. The solid support can be comprised of substrates having the structure and composition commonly associated with filters, wafers, wafer chips, membranes, and thin films. It is further contemplated that the solid support may comprise any material depending of the desired use, including but not limited to resins, affinity resins, glass, metal surfaces and materials such as steel, ceramic or polymeric materials (e.g., polyethylene, polypropylene, polyamide, and polyvinylidenefluoride etc. or combinations thereof) , magnetic or polymer beads, or any diagnostic detection reagent, to capture or immobilize reagents for diagnostic, detection or quantitative studies.

[0062] The aptamers of the present disclosure can be used in vitro for diagnostic and / or detection purposes to determine the presence of cells expressing MINCLE on their surface, for example, MINCLE-bearing cells in malignant tissue. The method involves examining a biological sample for the presence of MINCLE+ cancer-associated cells. For example, the biological sample can be contacted with a labelled aptamer of the present disclosure and the ability of the aptamer to specifically bind to the cells in the sample is determined. Binding indicates the presence of MINCLE-bearing cancer-associated cells. The aptamer of the present disclosure can also be used to localize a tumor in vivo by administering to a subject an aptamer of the present invention, labelled with a reporter group giving off a detectable signal. Bound aptamers can then be detected using flow cytometry, microscopy, external scintigraphy, emission tomography, optical imaging or radionuclear scanning. The method can be used to stage a cancer in a subject with respect to the extent of the disease and to monitor changes in response to therapy.

[0063] Detection of cancer-associated cells can be facilitated by coupling the aptamer to a detectable label or moiety. Examples of detectable labels include various enzymes, prosthetic groups, fluorescent materials, luminescent materials, bioluminescent materials, electron dense labels, labels for MRI, and radioactive materials. Examples of suitable enzymes include horseradish peroxidise, alkaline phosphatise, β-galactosidase, or acetylcholinesterase. Examples of suitable prosthetic group complexes include streptavidin / biotin and avidin / biotin. Examples of suitable fluorescent materials include umbellifone, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dischlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or phycoerythrin. An example of a luminescent material includes luminol. Examples of bioluminescent materials include luciferase, luciferin, and aequorin, and examples of suitable radioactive material include 125I, 131I, 35S, 18F, 64Cu, 94mTc, 124I, 11C, 13N, 15O, 68Ga, 86Y, 82Rb or 3H.

[0064] Labelling at the 3'end of the aptamer can be achieved, for example, by templated extension using Klenow polymerase, by T4 ligase-mediated ligation, and by terminal deoxynucleotidyl transferase. Labelling at the 5'end can be achieved by the supplementation of the in vitro transcription mix with an excess of GTP-β-S, the thiol of which can then be used to attach biotin. In addition, direct chemical conjugation of a suitable group (s) to either 5'-or 3'-end can be used to label the aptamers.

[0065] The oligonucleotide sequence of the aptamers of the present disclosure can be linked to a moiety and direct the moiety to MINCLE+ cells, such as MINCLE+ cancer-associated cells. Examples of moieties include toxins, radionuclides, or chemotherapeutic agents, which can be used to kill cancer-associated cells thus disrupting the tumor microenvironment that fosters and promotes cancer growth and / or metastasis.

[0066] The aptamer can be fused to the moiety, e.g., the toxin, either by virtue of the moiety and aptamer being chemically synthesized, or by means of conjugation, e.g., a non-peptide covalent bond, or a non-amide bond, which is used to join separately produced aptamer and the moiety. Alternatively, the aptamer and moiety may be joined by virtue of a suitable linker molecule including but not limited to a peptide.

[0067] Useful toxin molecules include peptide toxins, which are significantly cytotoxic when present intracellularly. Examples of toxins include cytotoxins, metabolic disrupters (inhibitors and activators) that disrupt enzymatic activity and thereby kill cancer stem cells, and radioactive molecules that kill all cells within a defined radius of the effector portion. A metabolic disrupter is a molecule, e.g., an enzyme or a cytokine that changes the metabolism of a cell such that is normal function is altered. Broadly, the term toxin includes any effector that causes death to a tumor-associated cell (e.g., a MINCLE+ tumor-associated cell) .

[0068] Many peptide toxins have a generalized eukaryotic receptor binding domain; in these instances the toxin must be modified to prevent killing cells not bearing MINCLE (e.g., to prevent killing cells not bearing MINCLE but having a receptor for the unmodified toxin) . Such modifications must be made in a manner that preserves the cytotoxic function of the molecule. Potentially useful toxins include, but are not limited to diphtheria toxin, cholera toxin, ricin, 0-Shiga-like toxin (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV) , LT toxin, C3 toxin, Shiga toxin pertussis toxin, tetanus toxin, Pseudomonas exotoxin, alorin, saponin, modeccin and gelanin. Other toxins include tumor necrosis actor alpha (TNF-alpha) and lymphotoxin (LT) . Another toxin having antitumor activity is calicheamicin gamma 1, a diyne-ene containing antitumor antibiotic with considerable potency against tumors, see, e.g., Zein N. et al (1988) . Science 240: 1198-1201.

[0069] The aptamer and the toxin moiety can be linked in any of several ways known to those of skill in the art. For example, a method of conjugating an aptamer to a toxin (gelonin) is described in Chu T C et al. (2006) Cancer Res 6 (12) 5989-5992. The moiety coupled to the oligonucleotide sequence can also be a modulator of the immune system that either activates or inhibits the body's immune system at the local level. For example, cytokines (e.g., lymphokines such as IL-2) delivered to a tumor can cause the proliferation of cytotoxic T-lymphocytes or natural killer cells in the vicinity of the tumor.

[0070] The moiety or reporter group can also be a radioactive molecule, for example, a radionucleotide, or a so-called sensitizer, e.g., a precursor molecule that becomes radioactive under specific conditions, e.g., boron when exposed to a bean of low-energy neutrons, in the so-called "boron neutron capture therapy" (BNCT) as described in Barth et al., (1990) . Scientific American Oct 1990: 100-107. Compounds with such radioactive effector portions can be used both to inhibit proliferation of cancer stem cells in the tumor and to label the cancer stem cells for imaging purposes.

[0071] Radionucleotides are single atom radioactive molecules that can emit either α, β, or γ particles. α particle emitters are preferred to β or γ particle emitters, because they release far higher energy emissions over a shorter distance, and are therefore efficient without significantly penetrating, and harming, normal tissues. Suitable α particle-emitting radionuclides include 211At, 212Pb, and 212Bi. The radioactive molecule may be tightly linked to the aptamer either directly or by a bifunctional chelate. This chelate must not allow elution and thus premature release of the radioactive molecule in vivo, see. Waldmann, Science, 252: 1657-62 (1991) .

[0072] Suitable chemotherapeutic agents that may be attached to the aptamer of the present disclosure may be selected from doxorubicin, taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxy anthracin dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1 de-hydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, and puromycin, antimetabolites (such as methotrexate, 6-mercaptopurine, 6 thioguanine, cytarabine, fludarabin, 5-fluorouracil, decarbazine, hydroxyurea, asparaginase, gemcitabine, cladribine) , alkylating agents (such as mechlorethamine, thioepa, chlorambucil, melphalan, carmustine (BSNU) , lomustine (CCNU) , cyclophosphamide, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, dacarbazine (DTIC) , procarbazine, mitomycin C, cisplatin and other platinum derivatives, such as carboplatin) , antibiotics (such as dactinomycin (formerly actinomycin) , bleomycin, daunorubicin (formerly daunomycin) , idarubicin, mithramycin, mitomycin, mitoxantrone, plicamycin, anthramycin (AMC)) .

[0073] Alternatively, the moiety is a chemotherapeutic molecule or other molecule that is capable of intercalating into the stem region sequence of the aptamer. For example, where the chemotherapeutic molecule is doxorubicin, the molecule is capable of intercalating at CpG sites in the DNA of the aptamer stem. Chemotherapeutic agents such as doxorubicin are intrinsically fluorescent which makes them convenient for probing and visualizing their location with various imaging technologies. The therapeutic and imaging capabilities combined in a DOX molecule make it suitable for use as a theranostic agent. Accordingly, the aptamers of the present disclosure can be used as theranostic agents to deliver doxorubin to cancer-associated cells. In order to increase aqueous solubility, the amino group of the sugar in doxorubicin can be protonated by forming a DOX hydrochloride.

[0074] Moieties that are capable of intercalating into the aptamers of the present disclosure include, doxorubicin, adriamycine, berberine, provflavine, mitoxantrone, daunorubicin, thalidomide, dactinomycin, danomycin, actinomycin D, 9-aminoacridine, amrubicin, amsacrine, anthramycine, berbine, bleomycin, elliplicine, epirubicin, idarubicin, methpyrillo, mithramycin, mitomycin, mitomycin C, mitoxantrone, mitoxantrone, pirarubicin, pixantrone, plicamycin, proflavine, prodigiosin, thalidomide, voreloxin, valrubicin, zorubicin. chlorpheniramine, prodisiosin, methapyrillino, mitomycin, distamycin, dantinomycin, distamycin, carboplatin, cisplatin and other platinum derivatives, Hoechst 33258, berenil, DAPI or carcinogenic agents (including the exo 8, 9 epoxide of aflatoxin B1, acridines such as proflavine or quinacrine or ethidium bromide) . Other GC intercalating agents will be familiar to a person skilled in the art of the present invention and are intended to be included within the scope of the present disclosure.

[0075] The aptamer of the present disclosure can also be used for siRNA, ribozyme, or DNAzyme delivery into cells. Specific choices of suitable siRNA, ribozyme or therapeutic agent will depend upon the circumstances. Examples of siRNAs or ribozymes that are suitable for use according to the present disclosure include those which target ATP binding cassette membrane transporters, stemness genes (Bmi-1, Notch 1, Sox 2, Oct-4, Nanog, . beta. -catenin, Smo, nestin, ABCG2, Wnt2 and SCF, etc) , GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) , and survivin.

[0076] The aptamers of the present invention can also be used to deliver cargo into MINCLE+ cancer-associated cells in a variety of solid tumors. Gelonin is a ribosomal toxin that can inhibit the process of protein synthesis and is cytotoxic. However, it is membrane impermeable and needs an usher for its cellular entry. Thus, the aptamers of this invention can be utilized to deliver membrane impermeable toxic payload to cancer stem cells. In another embodiment the aptamers of the present invention can be used to deliver Doxorubicin (DOX) , a DNA intercalating chemotherapeutic agent that is unable to target cancer stem cells on its own, to MINCLE+ cancer-associated cells.

[0077] The present invention also extends to the use of the aptamer molecules as the so-called theranostics, or simultaneous drug delivery and imaging agents. This can be achieved by conjugating the aptamer to the surface of a fluorescent quantum dot (QD) . Next, the QD-aptamer conjugate is incubated with Dox to form the QD-aptamer-Dox nanoparticle. Both Dox and QD are fluorescent molecules. Due to their proximity in the QD-aptamer-Dox nanoparticle, however, they quench each other's fluorescence by a bi-fluorescence resonance energy transfer (FRET) mechanism. Thus, the QD-aptamer-Dox nanoparticle is non-fluorescent. Upon internalization of the QD-aptamer-Dox nanoparticle via PSMA-mediated endocytosis in prostate cancer cells, Dox is released from the QD-aptamer-Dox nanoparticles, resulting in the recovery of fluorescence by both Dox and QD. V. PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS

[0078] The present disclosure further provides a pharmaceutical composition comprising the aptamer, which may be optionally conjugated with a detectable moiety, a diagnostic or therapeutic agent as described herein. A pharmaceutical composition of the present disclosure includes composition prepared for storage or administration that include a pharmaceutically effective amount of the aptamer in a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient. The choice of excipient or other elements of the composition can be adapted in accordance with the route and device used for administration.

[0079] Suitable carriers for use in practicing the present invention may include those conventionally used, for example, water, saline, aqueous dextrose, lactose, Ringer's solution a buffered solution, hyaluronan and glycols are exemplary liquid carriers, particularly (when isotonic) for solutions. Suitable pharmaceutical carriers and excipients include starch, cellulose, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, magnesium stearate, sodium stearate, glycerol monostearate, sodium chloride, glycerol, propylene glycol, water, ethanol, and the like. Other general additives such as anti-oxidative agent, buffer solution, bacteriostatic agent etc. can be added. In order to prepare injectable solutions, pills, capsules, granules, or tablets, diluents, dispersing agents, surfactants, binders and lubricants can be additionally added.

[0080] The aptamers of the disclosure and formulations thereof may be administered systemically (e.g., by oral ingestion or by injection intravenously, intramuscularly, or subcutaneously) or administered directly or topically (e.g., locally, such as by nasal inhalation) to the patient or target tissue or organ as is generally known in the art. For example, a composition can comprise a delivery vehicle, including liposomes, for administration to a subject. Nucleic acid molecules can be administered to cells by a variety of methods known to those of skill in the art, including, but not restricted to, encapsulation in liposomes, by iontophoresis, or by incorporation into other vehicles, such as biodegradable polymers, hydrogels, cyclodextrins poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) and PLCA microspheres, biodegradable nanocapsules, and bioadhesive microspheres, by microbubbles with ultrasound application, or by proteinaceous vectors.

[0081] Delivery systems to be used with the aptamers of the present disclosure include, for example, aqueous and non-aqueous gels, creams, multiple emulsions, microemulsions, liposomes, ointments, aqueous and non-aqueous solutions, lotions, aerosols, hydrocarbon bases and powders, and can contain excipients such as solubilizers, permeation enhancers (e.g., fatty acids, fatty acid esters, fatty alcohols and amino acids) , hydrophilic polymers (e.g., polycarbophil and polyvinylpyrolidone) , and the like. In some cases, the pharmaceutically acceptable carrier is a liposome or a transdermal enhancer.

[0082] A pharmaceutical composition of the disclosure is in a form suitable for administration, e.g., systemic or local administration, into a cell or subject, including a mammal such as a human being. Suitable forms, in part, depend upon the use or the route of entry, for example, oral, nasal, transdermal, or by injection (for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intraperitoneally, intracranially, or intratumorally) . Other factors are known in the art, and include considerations such as toxicity and forms that prevent the composition from exerting its effect.

[0083] The aptamer or composition comprising the aptamer of this invention can be administered parenterally (for example, intravenous, hypodermic, local or peritoneal injection) . The effective dosage of the aptamer can be determined according to weight, age, gender, health condition, diet, administration frequency, administration method, excretion and severity of a disease. Generally, an amount between 0.1 mg / kg and 100 mg / kg body weight / day of the aptamer is administered.

[0084] Formulations for oral use can also be presented as hard gelatin capsules wherein the active ingredient is mixed with an inert solid diluent, for example, calcium carbonate, calcium phosphate or kaolin, or as soft gelatin capsules wherein the active ingredient is mixed with water or an oil medium, for example, peanut oil, liquid paraffin, or olive oil.

[0085] Aqueous suspensions contain the aptamer in a mixture with excipients suitable for the manufacture of aqueous suspensions. Such excipients are suspending agents, for example, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydropropyl-methylcellulose, sodium alginate, polyvinylpyrrolidone, gum tragacanth and gum acacia; dispersing or wetting agents can be a naturally-occurring phosphatide, for example, lecithin, or condensation products of an alkylene oxide with fatty acids, for example, polyoxyethylene stearate, or condensation products of ethylene oxide with long chain aliphatic alcohols, for example, heptadecaethyleneoxycetanol, or condensation products of ethylene oxide with partial esters derived from fatty acids and a hexitol such as polyoxyethylene sorbitol monooleate, or condensation products of ethylene oxide with partial esters derived from fatty acids and hexitol anhydrides, for example, polyethylene sorbitan monooleate. The aqueous suspensions can also contain one or more preservatives, for example, ethyl, or n-propyl p-hydroxybenzoate, one or more colouring agents, one or more flavouring agents, and one or more sweetening agents, such as sucrose or saccharin.

[0086] Oily suspensions can be formulated by suspending the aptamer in a vegetable oil, for example, arachis oil, olive oil, sesame oil or coconut oil, or in a mineral oil such as liquid paraffin. The oily suspensions can contain a thickening agent, for example, beeswax, hard paraffin or cetyl alcohol. Sweetening agents and flavoring agents can be added to provide palatable oral preparations. These compositions can be preserved by the addition of an anti-oxidant such as ascorbic acid.

[0087] Dispersible powders and granules suitable for preparation of an aqueous suspension by the addition of water provide the aptamer in admixture with a dispersing or wetting agent, suspending agent and one or more preservatives. Suitable dispersing or wetting agents or suspending agents are exemplified by those already mentioned above. Additional excipients such as sweetening, flavoring and coloring agents can also be present.

[0088] Pharmaceutical compositions of the invention can also be in the form of oil-in-water emulsions. The oily phase can be a vegetable oil or a mineral oil or mixtures of these. Suitable emulsifying agents can be naturally-occurring gums, for example, gum acacia or gum tragacanth, naturally-occurring phosphatides, for example, soy bean, lecithin, and esters or partial esters derived from fatty acids and hexitol, anhydrides, for example, sorbitan monooleate, and condensation products of the partial esters with ethylene oxide, for example, polyoxyethylene sorbitan monooleate. The emulsions can also contain sweetening and flavoring agents.

[0089] A sterile injectable preparation can also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent, for example, as a solution in 1, 3-butanediol. Among the acceptable vehicles and solvents that can be employed are water, Ringer's solution, isotonic sodium chloride solution, and an isotonic salt solution containing sodium and potassium chloride. In addition, sterile, fixed oils are conventionally employed as a solvent or suspending medium. For this purpose, any bland fixed oil can be employed including synthetic mono-or diglycerides. In addition, fatty acids such as oleic acid find use in the preparation of injectables.

[0090] It is understood that the specific dose level for any particular subject depends upon a variety of factors including the activity of the specific compound employed, the age, body weight, general health, sex, diet, time of administration, route of administration, and rate of excretion, drug combination and the severity of the particular disease undergoing therapy. The administration frequency may be one to several times a day, weekly, or monthly. VI. ADDITIONAL THERAPEUTIC AGENTS

[0091] As the aptamer of this invention can be used as a therapeutic agent for treating conditions caused or exacerbated by cellular signaling mediated by MINCEL, including inflammatory diseases and various malignancies, additional therapeutic agents with anti-inflammatory or anti-cancer efficacy can be administered concurrently with the aptamer, either in one single composition or in two or more separate compositions.

[0092] In connection with the use of treatment methods of this invention as disclosed herein, one or more of these previously known effective anti-cancer therapeutic agents, including those named in this application, can be administered to subjects in need of anti-cancer treatment. Optionally, the agent (s) may be used in combination with the active agent of the present invention (e.g., a genetically modified recombinant phage loaded with a checkpoint-blocking peptide such as a PD-1 binding peptide) to suppress cancer growth, inhibit cancer metastasis, and facilitate remission from the disease. In the case of combination therapy, the active agents may be administered concurrently each in an effective amount, either together in a single composition or separately in two or more different compositions.

[0093] For example, various chemotherapeutic agents known to be effective for use to treat various cancers may be co-administered concurrently. As used herein, a “chemotherapeutic agent” encompasses any chemical compound exhibiting suppressive effect against cancer cells, thus useful in the treatment of cancer. Classes of chemotherapeutic agents include, but are not limited to: alkylating agents, antimetabolites, kinase inhibitors, spindle poison plant alkaloids, cytoxic / antitumor antibiotics, topisomerase inhibitors, photosensitizers, anti-estrogens and selective estrogen receptor modulators (SERMs) , anti-progesterones, estrogen receptor down-regulators (ERDs) , estrogen receptor antagonists, leutinizing hormone-releasing hormone agonists, anti-androgens, aromatase inhibitors, EGFR inhibitors, VEGF inhibitors, and anti-sense oligonucleotides that inhibit expression of genes implicated in abnormal cell proliferation or tumor growth. Chemotherapeutic agents useful in the treatment methods disclosed herein also include cytostatic and / or cytotoxic agents.

[0094] Exemplary anti-cancer therapeutic agents include alkylating agents such as altretamine, bendamustine, busulfan, carboquone, carmustine, chlorambucil, chlormethine, chlorozotocin, cyclophosphamide, dacarbazine, fotemustine, ifosfamide, lomustine, melphalan, melphalan flufenamide, mitobronitol, nimustine, nitrosoureas, pipobroman, ranimustine, semustine, streptozotocin, temozolomide, thiotepa, treosulfan, triaziquone, triethylenemelamine, trofosfamide, and uramustine; anthracyclines such as aclarubicin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoxantrone, pirarubicin, valrubicin, and zorubicin; cytoskeletal disruptors (taxanes) such as abraxane, cabazitaxel, docetaxel, larotaxel, paclitaxel, taxotere, and tesetaxel; epothilones such as ixabepilone; histone deacetylase inhibitors such as vorinostat, romidepsin, and inhibitors of topoisomerase I such as belotecan, camptothecin, exatecan, gimatecan, irinotecan, and topotecan; inhibitors of topoisomerase II such as etoposide, teniposide, and tafluposide; kinase inhibitors such as bortezomib, erlotinib, gefitinib, imatinib, vemurafenib, and vismodegib; nucleotide analogs and precursor analogs such as azacitidine, azathioprine, capecitabine, cytarabine, doxifluridine, fluorouracil, gemcitabine, hydroxyurea, mercaptopurine, methotrexate, and tioguanine (formerly thioguanine) ; peptide antibiotics such as actinomycin and bleomycin; platinum-based agents such as carboplatin, cisplatin, dicycloplatin, oxaliplatin, nedaplatin, and satraplatin; retinoids such as alitretinoin, bexarotene, and tretinoin; and vinca alkaloids and derivatives such as vinblastine, vincristine, vindesine, and vinorelbine.

[0095] Immunotherapeutic agents useful for cancer treatment can also be co-administered with the aptamer of this invention. Known immunotherapeutic anti-cancer approaches include (1) active immunotherapy, which directs the immune system to specifically target the cancer cells, e.g., targeted antibody therapy and cell-based immunotherapy such as CAR T cell therapy; and (2) passive immunotherapy, e.g., using checkpoint inhibitors and cytokines to stimulate the immune system without specifically targeting cancer cells. Various monoclonal antibodies are used in targeted antibody therapy. Examples of such antibodies and their conjugates include adotrastuzumab (HER2) , alemtuzumab (CD52) , bevaclzumab (VEGF) , brentuximab (CD30) , capromab (PSMA) , cetuximab (EGFR) , elotuzumab (SLAMF7) , ibritumomab (CD20) , necitumumab (EGFR) , obinutumab (CD20) , ofatumumab (CD20) , olaratumab (PDGFRA) , panitumumab (EGFR) , pertuzumab (HER2) , ramucirumab (VEGFR2) , rituximab (CD-20) , trastuzumab (HER-2) , inotuzumab-ozogamicin (CD22) , gemtuzumab-ozogamicin (CD33) , and bevacizumab-awwb (VEGF) . Currently approved checkpoint inhibitors target molecules CTLA4, PD-1, and PD-L1, including ipilimumab (CTLA4) , nivolumab, pembrolizumab, cemiplimab, spartalizumab (PD-1) , atezolizumab, avelumab, and durvalumab (PD-L1) . Cytokines for use in the treatment of cancer and associated conditions include granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) , granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) , interleukin-2 (IL-2) , and interleukin-11 (IL-11) . VII. KITS

[0096] The invention also provides kits for inhibiting cellular signaling mediated by MINCLE and therefore for treating a proliferative disease (such as cancer, e.g., various types of blood cancers and solid tumors) or an inflammatory disease according to the method of the present invention. The kits typically include a first container containing a pharmaceutical composition comprising an effective amount of a MINCLE aptamer (for instance, an oligonucleotide comprising SEQ ID NO: 1, optionally with one or more modifications) and optionally a second container containing another pharmaceutical composition comprising an effective amount of another therapeutic agent such as one possessing anti-inflammatory or anti-cancer properties, including any one of those known in the medical field or named in a previous section. For use in the cancer treatment context, the anti-cancer therapeutic agent (s) in the second pharmaceutical composition may be one or more chemotherapeutic agents or immunotherapeutic agents, for example, one or more checkpoint inhibitors that specifically block PD-1 / PD-L1 binding.

[0097] The kits may further include informational material providing instructions on how to dispense the pharmaceutical compositions, including description of the type of patients who may be treated (e.g., human patients suffering from a condition involving undesirable cellular proliferation or excessive inflammatory response) , the schedule (e.g., dose and frequency) and route of administration, and the like. EXAMPLES

[0098] The following examples are provided by way of illustration only and not by way of limitation. Those of skill in the art will readily recognize a variety of non-critical parameters that could be changed or modified to yield essentially the same or similar results. INTRODUCTION

[0099] This invention relates to the development of a Mincle-specific aptamer using single-stranded oligonucleotides that fold into specific structures to target the Mincle protein. This aptamer is designed to inhibit the Mincle / Syk / NF-kB pro-tumoral circuit in macrophages. The selection of this Mincle-specific aptamer was carried out using a cell-free screening method known as SELEX. The SELEX process generally involves the following steps: (1) Designing a Random Oligonucleotide Library: An initial library with a sequence diversity of approximately 1013 to 1015 is created and incubated with Mincle under specific conditions. (2) Isolating the Nucleic Acid-Target Complex: The nucleic acid-target complex is isolated, followed by amplification and purification to prepare a sub-library, completing one round of screening. (3) Sequential Screening Cycles: The above steps are repeated in a series of cycles, sequentially using the sub-library with the target until an affinity-enriched library is obtained. (4) Sequencing and Selection: The affinity-enriched library is sequenced, and sequences that demonstrate strong binding to the target are selected as aptamers. After conducting 20 rounds of SELEX screening with a library of 25, 000 aptamers, a novel DNA aptamer was identified with strong binding affinity to the human Mincle protein. The Mincle-specific aptamer demonstrated superior binding affinity to Mincle at the molecular level, as confirmed by 3D docking studies, and showed specificity for the human Mincle protein in MST assays. This new DNA drug offers rapid delivery, small size, and specific protein-ligand binding in a single application, making it a flexible and cost-effective option for immunotherapy. METHODS AND RESULTS

[0100] Figures 1A-1E illustrate the screening process, generation, and efficacy of the Anti-Mincle DNA aptamer, designed to specifically target and inhibit tumor-associated macrophages (TAMs) . To develop a Mincle-specific inhibitor aimed at preventing pro-tumor M2 macrophage formation in tumors, we employed Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) . A starting library of 25, 000 aptamers was subjected to 20 rounds of selection against human Mincle protein in vitro, leading to the identification of a novel DNA aptamer, termed "Anti-Mincle, " with strong binding affinity. Mincle-specific ssDNA aptamers were isolated using a nitrocellulose filter-based SELEX approach. The initial library consisted of 42-nucleotide-long ssDNAs with a random 30-base sequence region (RND42) , flanked by conserved primer binding sites at both ends for subsequent amplification by PCR (SEQ ID NO: 2) : 5’ -AACACGAC- [N] 30-CGTG 3’ , N = A / T / C / G. The library was incubated with the Mincle protein, and sequences with weak or no binding were discarded. The SELEX process progressively enriched the library for high-affinity binders over 20 selection cycles. Top panel of Figure 1A: The sequences of the top 10 enriched aptamers with the strongest binding affinity for Mincle are shown, alongside their occurrence and relative enrichment. The sequence diversity progressively reduced as SELEX rounds progressed, focusing the library on high-affinity aptamers. Bottom panel of Figure 1A: The enrichment level of these top 10 aptamers was quantified, demonstrating a significant enrichment for aptamers with strong Mincle-binding capabilities. The final sequence of Anti-Mincle aptamer is provided below (SEQ ID NO: 1, N = A / T / C / G) :

[0101] This sequence includes a 30-base internal randomized region critical for binding specificity, flanked by two fixed regions that facilitate PCR amplification during SELEX. This process ensured the isolation of aptamers with the highest potential for inhibiting Mincle-mediated pro-tumor activities.

[0102] As shown in Figure 1B, using RNA and DNA tertiary structure prediction tools (website: biophy. hust. edu. cn / new / 3dRNA / create) and HDOCK SERVER (website: hdock. phys. hust. edu. cn / ) , we performed molecular docking studies to assess the binding affinity of our novel aptamer, "Anti-Mincle, " to the Mincle protein. The results demonstrate that Anti-Mincle exhibits superior binding affinity, reflected by a more favorable docking score and higher confidence score, compared to the previously reported Mincle aptamer by Stephens et al. (Mol Ther Nucleic Acids. 2022 Jun 2; 28: 935-947) . Additionally, the root mean square deviation (rmsd) of the ligand indicates a closer alignment and better structural fit of Anti-Mincle to the Mincle protein, underscoring its potential as a more effective Mincle inhibitor.

[0103] Immunofluorescence analysis was conducted to assess the binding specificity of our Cy3-conjugated Anti-Mincle aptamer in murine tumor tissues. Tumor tissues were embedded in OCT compound, sectioned into 5 μm slices, and subjected to immunohistochemical staining. The sections were incubated overnight at 4℃ with FITC-conjugated Mincle antibody and Cy3-conjugated Anti-Mincle aptamer, followed by a 30-minute wash with PBST before mounting with PermaFluor medium. The top row of Figure 1C shows the control with a nonsense aptamer, which did not colocalize with the Mincle antibody, indicating a lack of specific binding. The middle row displays the previously reported aptamer by Stephens et al., showing some degree of colocalization with the Mincle antibody. The bottom row of Figure 1C illustrates our Anti-Mincle aptamer, which exhibits strong colocalization with the Mincle antibody, confirming its specific binding to the Mincle protein in the tumor tissue. Images were captured using the LSM 880 fluorescence microscope and analyzed with ZEN lite image analysis software.

[0104] To confirm that the activity of Anti-Mincle is due to specific and direct binding to Mincle, and to determine the dissociation constant (Kd) of this interaction, we performed a MicroScale Thermophoresis (MST) assay. In this assay, the Cy3-labeled Anti-Mincle aptamer was incubated with varying concentrations of Mincle protein. The MST analysis was then carried out using a Monolith NT. 115 Pico instrument. The fluorescence changes were monitored as the temperature gradient was applied, and the binding affinity was quantified. The results are shown in Figure 1D and indicate that Anti-Mincle exhibits high binding affinity for Mincle, with a calculated Kd value in the nanomolar range, further confirming the specificity of the aptamer to its target. Western blot analysis results are shown in Figure 1E.

[0105] BMDM Culture: Bone marrow cells were isolated from the femurs and tibias of mice. Red blood cells were lysed, and the remaining bone marrow cells were cultured in DMEM / F12 medium supplemented with 10%heat-inactivated FBS, 1%penicillin-streptomycin, and 50 ng / mL M-CSF (Invitrogen) at 37℃ with 5%CO2 to promote macrophage differentiation.

[0106] Stimulation: BMDMs were treated with DMEM / F12 (negative control) , 10%LLC-CM in DMEM / F12 (LLC-CM group) , and varying concentrations of Anti-Mincle aptamer for 24 hours.

[0107] Protein Extraction and Western Blotting: Following treatment, protein lysates were extracted from BMDMs, mixed with 4× loading buffer, and boiled for 10 minutes. Proteins were separated on 10%Tris-glycine SDS-PAGE gels and transferred to PVDF membranes using a Semi-Dry and Rapid Blotting System for 30 minutes. The membranes were blocked with 5%non-fat milk in TBST (0.1%Tween 20) for 1 hour at room temperature and incubated overnight at 4℃ with primary antibodies specific to Mincle, p-p65, and GAPDH (as a loading control) . After washing, the membranes were incubated with DyLightTM 800-conjugated secondary antibodies (Invitrogen) for 2 hours at room temperature. Protein bands were visualized using a Bio-Rad ChemiDoc MP imaging system.

[0108] Results: The blot shows a dose-dependent reduction in Mincle and p-p65 protein levels upon treatment with increasing concentrations of Anti-Mincle aptamer, indicating that the aptamer effectively disrupts Mincle-mediated signaling in BMDMs stimulated with LLC-CM.

[0109] Figure 2 demonstrates the effectiveness of Anti-Mincle in treating solid cancers through enhancing anti-cancer M1 macrophage. Figure 2A: Treatment with Anti-Mincle significantly reduces tumor growth rate, tumor size, and tumor weight in LLC-bearing mice compared to the control group (n=5) . Anti-Mincle (administered via intravenous injection, every 2 days) was administered to mice after tumor establishment. Tumor volume was measured every 2 days using a Vernier caliper and calculated using the equation: Volume (mm3) = 0.5 × (long diameter × square of short diameter) . Mice were euthanized on day 20. Figure 2B: Immunofluorescence analysis of tumor tissues from treated mice reveals a marked increase in anti-tumor M1 macrophages and a reduction in pro-tumor M2 macrophages in LLC tumors treated with Anti-Mincle therapy (n=5) . This indicates that Anti-Mincle effectively targets Mincle and M2 tumor-associated macrophages (TAMs) and inhibits solid tumor growth more effectively. Notably, the LLC tumor model is a well-documented syngeneic lung cancer mouse model that is primarily resistant to PD-1 / PD-L1 immunotherapy. This indicates that Anti-Mincle has the clinical potential for enhancing T-cell-based immunotherapy by targeting immunosuppressive M2 TAMs in the tumor microenvironment (TME) of non-small cell lung cancer (NSCLC) in clinical settings.

[0110] For immunofluorescence, tumor tissues from different treatment groups were embedded in OCT compound, cut to a thickness of 5 μm, and stained using immunohistochemical techniques. Sections were incubated with PE-conjugated antibodies against Mincle, iNOS, and CD206, as well as FITC-conjugated F4 / 80 antibody, overnight at 4℃. Nuclei were stained with Hoechst 33342 for 5 minutes in PBS, followed by mounting with PermaFluor medium. Images were acquired using an LSM 880 fluorescence microscope and analyzed with ZEN lite image analysis software.

[0111] Figure 2C shows anti-Mincle aptamer distribution. Main organs (lung, heart, spleen, liver, and kidney) and tumor tissue were collected from mice received Cy3-labeled Anti-Mincle treatment one hour before scarification. The orange-red fluorescence signal from the Cy3-conjugated Anti-Mincle, and auto fluorescent signal overlapped into Cy5 were detected by Bio-Rad ChemiDoc MP imaging system. The analysis revealed a pronounced accumulation of the Cy3-conjugated Anti-Mincle in the tumor tissue, with minimal to no detectable signal in the vital organs. This indicates that Anti-Mincle specifically targets the tumor microenvironment in LLC-bearing mice.

[0112] Fluorescence intensity was quantified using image analysis software, and the normalized signal (Cy3 / Cy5 ratio) was plotted to compare the distribution of Anti-Mincle between the tumor and various organs. The highest fluorescence signal in the tumor tissue compared to the organs indicates the selective accumulation of Anti-Mincle in the tumor site.

[0113] Figure 3 demonstrates the effectiveness of Anti-Mincle therapy through overcome the PD-1 / PD-L1resistance in solid cancer. Figures 3B-C show that treatment of Anti-Mincle / Anti-PD-1 combined therapy results in a significant reduction in tumor growth rate, tumor size, and tumor weight in LLC-bearing mice compared to groups that received either Anti-Mincle or Anti-PD-1 / PD-L1 (n=5) . Anti-Mincle (administered via intravenous injection, every 2 days) and Anti-PD-1 / PD-L1 (administered via intravenous injection, every 3 days) were injected into mice after tumor establishment. Tumor weight was measured when mice were euthanized on day 20. Figure 3D: immunofluorescence analysis of tumor tissues from treated mice reveals a marked increase in anti-tumor M1 macrophages, cytotoxic T cell and a reduction in pro-tumor M2 macrophages in LLC tumors treated with Anti-Mincle / Anti-PD-1 combined therapy (n=5) . This indicates that Anti-Mincle effectively targets Mincle and enhancing T-cell cancer killing and inhibits solid tumor growth more effectively. The LLC tumor model is a well-documented syngeneic lung cancer mouse model that is primarily resistant to Anti-PD-1 / PD-L1 immunotherapy. This indicates that Anti-Mincle have clinical potential for enhancing T-cell-based immunotherapy.

[0114] For immunofluorescence, tumor tissues from different treatment groups embedded in OCT compound, cut to a thickness of 5 μm, were employed for immunohistochemical staining. These sections were incubated with PE-conjugated CD3, PE-conjugated iNOS, PE-conjugated CD206, FITC-conjugated CD8 and FITC-conjugated F4 / 80 antibodies overnight at 4℃. Nuclei were stained with Hoechst 33342 for 5 minutes in PBS, then mounted with PermaFluor medium. Images were acquired by LSM 880 fluorescence microscopes and analyzed with ZEN lite image analysis software.SUMMARY

[0115] This invention offers a novel Mincle-specific DNA drug for targeting Mincle / Syk / NF-kB circuit in the cancer stimulated macrophages and inhibiting M2 TAM formation, where the DNA drug only accumulated in the tumor but not normal tissues, representing a novel DNA drug for targeting M2 TAM in lung cancer TME. This markedly enhances the comprehensiveness and specificity for detecting the target protein within the microenvironment for advanced immunotherapy. This invention is generated from a highly modifiable process SELEX, therefore obviates the need for biological organisms for aptamer maturation. There is no issue with batch-to-batch variation issues as the aptamers can be synthesized at high fidelity via oligonucleotide synthesis processes. This would also mean that more rigorous tests to ensure aptamer specificity and performance could be executed at a lower cost. Solid cancer such as lung cancer often develops resistance to traditional chemotherapeutic agents through various mechanisms, such as drug efflux pumps and genetic mutations. Surprisingly, it was discovered upon testing that the anti-Mincle aptamer of this invention can enhance the anti-cancer effect of anti-PD-1 / PDL-1, thus allowing for combination therapies that overcome resistance mechanisms and restore drug sensitivity in resistant tumors. This invention has the additional benefit in that it does not cause significant side effects to both body organ and healthy cells. Anti-Mincle aptamer can help minimize off-target effects, thereby reducing the severity of side effects.

[0116] The contents of all patents, patent applications, and other publications, including GenBank Accession Numbers or equivalents, cited in this application are incorporated by reference in the entirety for all purposes.

Claims

1.An aptamer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and specifically binds MINCLE, optionally further comprising a heterologous moiety.2.The aptamer of claim 1, which consists essentially of or consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, optionally further comprising a heterologous moiety.3.The aptamer of claim 1 or 2, wherein the heterologous moiety is a detectable moiety, a therapeutic agent, or a solid support.4.A composition comprising the aptamer of any one of claims 1-3 and at least one pharmaceutically acceptable excipient.5.The composition of claim 4, further comprising an anti-inflammatory therapeutic agent or anti-cancer therapeutic agent.6.The composition of claim 4 or 5, which is formulated for injection.7.A method for modulating MINCLE-mediated cellular signaling, comprising contacting MINCLE-expressing cells with an effective amount of the aptamer of claim 1 under conditions permissible for specific binding between the aptamer and MINCLE, thereby blocking MINCLE-mediated cellular signaling.8.The method of claim 7, wherein the MINCLE-expressing cells are located within a patient’s body and the aptamer is administered to the patient by injection.9.The method of claim 8, wherein the patient has an inflammatory condition or has cancer.10.The method of claim 9, wherein the patient is further administered an anti-inflammatory therapeutic agent or an anti-cancer therapeutic agent.11.A method for detecting the presence of MINCLE-expressing cells, comprising:(1) contacting a plurality of cells potentially comprising MINCLE-expressing cells with the aptamer of claim 1 under conditions permissible for specific binding between the aptamer and MINCLE; and(2) detecting cells specifically bound to the aptamer, thereby detecting MINCLE-expressing cells.12.The method of claim 11, wherein the plurality of cells are present in a biological sample taken from a person.13.The method of claim 11, wherein the plurality of cells are present in a person’s body.14.The method of any one of claims 11-13, wherein the aptamer comprises a detectable moiety.15.The method of any one of claims 11-14, wherein the aptamer is immobilized to a solid substrate.16.The method of any one of claim 11-15, further comprising, subsequent to step (2) , isolating the cells specifically bound to the aptamer.17.A method for targeted delivery to MINCLE-expressing cells, comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of the aptamer of claim 1, wherein the aptamer comprises an imaging or therapeutic agent.18.The method of claim 17, wherein the aptamer is administered systemically.19.The method of claim 17, wherein the aptamer is administered locally.20.The method of any one of claims 17-19, wherein the aptamer consists essentially of SEQ ID NO: 1 and the imaging or therapeutic agent.21.The method of claim 20, wherein the therapeutic agent is an anti-inflammatory therapeutic agent or anti-cancer therapeutic agent.22.A kit for modulating MINCLE-mediated cellular signaling, comprising a first container containing a first composition comprising an effective amount of the aptamer of claim 1.23.The kit of claim 22, further comprising a second container containing a second composition comprising an anti-inflammation therapeutic agent or an anti-cancer therapeutic agent.24.The kit of claim 23, wherein the anti-cancer therapeutic agent comprises one or more checkpoint inhibitors.25.The method of claim 20, further comprising an instruction manual.

Images