Multispecific antigen binding proteins and uses thereof

Abstract

Provided are multispecific antigen binding proteins (e.g. bispecific antibodies or trispecific antibodies) or antigen binding fragments thereof. The multispecific antigen binding protein comprises a first antigen binding domain (B1), a first mask peptide (Ml), a second antigen binding domain (B2), a second mask peptide (M2), and an immune modulator. The M1 is linked to the B1 and impairs the binding of the B1 to the target of the B1. The M2 is linked to the B2 and impairs the binding of the B2 to the target of the B2. The immune modulator is linked to the N-terminus of the M1.

Description

MULTISPECIFIC ANTIGEN BINDING PROTEINS AND USES THEREOF

[0001] CLAIM OF PRIORITY

[0002] This application claims the benefit of International Patent Application App. No. PCT / CN2024 / 082070, filed on March 16, 2024, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.TECHNICAL FIELD

[0003] This disclosure relates to multispecific antigen binding proteins (e.g., multispecific antibodies) that can target both a T cell antigen and a tumor-associated antigen.BACKGROUND

[0004] Naturally occurring antibodies typically only target one antigen. A multispecific antibody can be manufactured in different structural formats, so that they can simultaneously bind to two or more different epitopes. These epitopes can be in the same antigen or in different antigen. This opens up a wide range of applications, including redirecting T cells to tumor cells, blocking two different signaling pathways simultaneously, dual targeting of different disease mediators, and delivering payloads to targeted sites.

[0005] Multispecific antibodies have various applications. However, in some cases, a multispecific antibody may not have the desired efficacy and it can be difficult to express and purify. There is a need to continue to develop various therapeutics based on multispecific antigen binding proteins.SUMMARY

[0006] This disclosure relates to multispecific antibodies or antigen binding proteins, wherein the multispecific antibodies or antigen binding proteins specifically bind to a T cell antigen (e.g., CD3) and / or one or more tumor-associated antigens, or a combination thereof.

[0007] In one aspect, the disclosure is related to an antigen binding protein, comprising (a) a Fab fragment (Fab) comprising a first heavy variable region (VH1) , a first light chain variable region (VL1) , a CH1 domain, and a CL domain; (b) a single chain variable fragment (scFv) comprising a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) ; (c) an immune modulator; wherein a first mask peptide is linked to the Fab and impairs the binding of the Fab to the target of the Fab, and wherein a second mask peptide is linked to the scFv and impairs the binding of the scFv to the target of scFv; wherein the immune modulator is linked to the N-terminus of the first mask peptide or the second mask peptide.

[0008] In some embodiments, the antigen binding protein is a multispecific antigen binding protein (e.g., a bispecific antigen binding protein or a trispecific antigen binding protein) .

[0009] In some embodiments, the first mask peptide is linked to the Fab through a cleavable linker.

[0010] In some embodiments, the second mask peptide is linked to the scFv through a cleavable linker.

[0011] In some embodiments, the scFv specifically binds to a tumor antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, GUCY2C, MUC16, CDH17, SEZ6, CD54, B7H4, CEACAM6 , BAFFR, TROP2, or PVRL4) , and the Fab specifically binds to an immune cell receptor antigen (e.g., CD3) .

[0012] In some embodiments, the scFv specifically binds to an immune cell receptor antigen (e.g., CD3) , and the Fab specifically binds to a tumor antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, GUCY2C, MUC16, CDH17, SEZ6, CD54, B7H4, CEACAM6, BAFFR, TROP2, or PVRL4) .

[0013] In some embodiments, the VH2 in the scFv is linked to N-terminus of VH1 of the Fab.

[0014] In some embodiments, the VL2 in the scFv is linked to N-terminus of VH1 of the Fab.

[0015] In some embodiments, the VH2 in the scFv is linked to N-terminus of VL1 of the Fab.

[0016] In some embodiments, the VL2 in the scFv is linked to N-terminus of VL1 of the Fab.

[0017] In some embodiments, the VL1 in the Fab is linked to the CL domain in the Fab and the VH1 in the Fab is linked to the CH1 domain in the Fab.

[0018] In some embodiments, the VL1 in the Fab is linked to the CH1 domain in the Fab and the VH1 in the Fab is linked to the CL domain in the Fab.

[0019] In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a first single-domain antibody variable domain (VHH1) .

[0020] In some embodiments, the VHH1 specifically binds to human serum albumin (HSA) , optionally the VHH1 is linked to the antigen binding protein through a cleavable linker.

[0021] In some embodiments, the VHH1 is linked to the second mask peptide through an immune modulator, optionally with a cleavable linker.

[0022] In some embodiments, the immune modulator is a VHH or a scFv or a protein fragment that specifically binds to a checkpoint inhibitor or an immune costimulator (e.g., PD-1, CD28, CD2, CD137, or 4-1BB) .

[0023] In some embodiments, the immune modulator is a cytokine (e.g., IL2, IL7, IL15, or IL21) .

[0024] In some embodiments, the VHH1 is directly linked to the second mask peptide, optionally with a cleavable linker.

[0025] In some embodiments, the VHH1 is linked to the first mask peptide, optionally through an immune modulator.

[0026] In some embodiments, the immune modulator is a VHH that specifically binds to a checkpoint inhibitor or an immune costimulator (e.g., PD-1, CD28, CD2, CD137, 4-1BB) .

[0027] In some embodiments, the immune modulator is a cytokine (e.g., IL2, IL7, IL15, IL21) .

[0028] In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a first antigen binding domain.

[0029] In some embodiments, the first antigen binding domain specifically binds to a tumor antigen (e.g., CAIX) .

[0030] In some embodiments, the first antigen binding domain is a VHH.

[0031] In some embodiments, the first antigen binding domain is a scFv.

[0032] In some embodiments, the first antigen binding domain is linked to C-terminus of the CH1 domain.

[0033] In some embodiments, the first antigen binding domain is linked to C-terminus of the CL domain.

[0034] In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a second antigen binding domain.

[0035] In some embodiments, the second antigen binding domain specifically binds to a tumor antigen (e.g., CAIX) .

[0036] In some embodiments, the second antigen binding domain is a VHH.

[0037] In some embodiments, the second antigen binding domain is a scFv.

[0038] In some embodiments, the second antigen binding domain is linked to C-terminus of the CH1 domain.

[0039] In some embodiments, the second antigen binding domain is linked to C-terminus of the first antigen binding domain.

[0040] In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a Fc comprising two CH2 domains and two CH3 domains.

[0041] In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a first antigen binding domain.

[0042] In some embodiments, the first antigen binding domain specifically binds to a tumor antigen (e.g., CAIX) .

[0043] In some embodiments, the first antigen binding domain is a VHH.

[0044] In some embodiments, the first antigen binding domain is a scFv.

[0045] In some embodiments, the first antigen binding domain is linked to C-terminus of the CH3 domain in the Fc or C-terminus of the Fab.

[0046] In some embodiments, the first antigen binding domain is linked to N-terminus of the CH2 domain in the Fc.

[0047] In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a second antigen binding domain.

[0048] In some embodiments, the second antigen binding domain specifically binds to a tumor antigen (e.g., CAIX) .

[0049] In some embodiments, the second antigen binding domain is a VHH.

[0050] In some embodiments, the second antigen binding domain is a scFv.

[0051] In some embodiments, the second antigen binding domain is linked to C-terminus of the CH3 domain.

[0052] In some embodiments, the second antigen binding domain is linked to C-terminus of the first antigen binding domain.

[0053] In one aspect, the disclosure is related to an antigen binding protein, comprising (a) a first antigen binding domain and a first mask peptide (M1) , wherein the first mask peptide impairs the binding of the first antigen binding domain to the target of the first antigen binding domain; (b) a second antigen binding domain; and (c) an immune modulator, wherein the immune modulator is linked to the N-terminus of the first mask peptide.

[0054] In some embodiments, the first antigen binding domain specifically binds to a T cell receptor antigen (e.g., CD3) .

[0055] In some embodiments, the second antigen binding domain specifically binds to a first tumor antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, BAFFR, TROP2, or PVRL4) .

[0056] In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a third antigen binding domain.

[0057] In some embodiments, the third antigen binding domain specifically binds to a second tumor antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, GUCY2C, MUC16, CDH17, SEZ6, CD54, B7H4, CEACAM6, BAFFR, TROP2, or PVRL4) , wherein the second and the third tumor antigens can be the same or different.

[0058] In some embodiments, the first mask peptide is linked to the antigen binding domain through a cleavable linker.

[0059] In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a second mask peptide that impairs the binding of the second antigen binding domain to the target of the second antigen binding domain.

[0060] In some embodiments, the second mask peptide is linked to the second antigen binding domain through a cleavable linker.

[0061] In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a third mask peptide.

[0062] In some embodiments, the third mask peptide is linked to the third antigen binding domain through a cleavable linker.

[0063] In some embodiments, the first antigen binding domain is a Fab, and the second antigen binding domain is a scFv.

[0064] In some embodiments, the first antigen binding domain is a scFv, and the second antigen binding domain is a Fab.

[0065] In some embodiments, the first antigen binding domain is a Fab, and the second antigen binding domain is a VHH.

[0066] In some embodiments, the first antigen binding domain is a VHH, and the second antigen binding domain is a Fab.

[0067] In some embodiments, the first antigen binding domain is a scFv, and the second antigen binding domain is a scFv.

[0068] In some embodiments, the third antigen binding domain is a VHH.

[0069] In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a VHH that targets HSA.

[0070] In some embodiments, the VHH that targets HSA is linked to the antigen binding protein through an immune modulator.

[0071] In some embodiments, the immune modulator is a VHH that targets an immune checkpoint inhibitor (e.g., PD-1) .

[0072] In some embodiments, the immune modulator is a cytokine.

[0073] In some embodiments, the VHH that targets HSA is linked to the antigen binding protein through a cleavable linker.

[0074] In one aspect, the disclosure is related to an antigen-binding protein, comprising: (a)

[0075] a first peptide comprising, from the N-terminus to the C-terminus, a half-life extension unit (E) , an immune modulator, a first mask peptide (M1) , a first cleavable linker (L1) , a scFv that specifically binds to a first antigen, a VH1, a CH1; and (b) a second peptide comprising, from the N-terminus to the C-terminus, a VL1, and a CL, wherein the VH1 and VL1 form a Fab that specifically binds to a second antigen, and the first mask peptide (M1) impairs the binding of the scFv to the first antigen, wherein the scFv comprises a VH2 and a VL2.

[0076] In some embodiments, the second peptide further comprises a second mask peptide (M2) that impairs the binding of the Fab to the second antigen and the second mask peptide is linked to the Fab via a second cleavable linker (L2) .

[0077] In some embodiments, the first antigen is a T cell antigen (e.g., CD3) and the second antigen is a tumor-associated antigen (e.g., EGFR) .

[0078] In some embodiments, the first antigen is CD3 and the second antigen is EGFR.

[0079] In some embodiments, the VH2 comprises any one of the combinations of the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 sequences in Tables 1, 3, and 5, and the VL2 comprises any one of the combinations of the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 sequences in Tables 2, 4, and 6.

[0080] In some embodiments, the VH1 comprises any one of the combinations of the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 sequences in Tables 12, 14, and 16, and the VL1 comprises any one of the combinations of the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 sequences in Tables 13, 15, and 17.

[0081] In some embodiments, the immune modulator is a cytokine.

[0082] In some embodiments, the immune modulator is IL2.

[0083] In some embodiments, the half-life extending unit (E) comprises a VHH that specifically binds to human serum albumin (HSA) .

[0084] In some embodiments, the first mask peptide (M1) comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 144-160.

[0085] In some embodiments, the first cleavable linker (L1) comprises a first cleavable peptide (C1) , wherein the first cleavable peptide (C1) comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 231-240.

[0086] In some embodiments, the second mask peptide (M2) comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 220-230.

[0087] In some embodiments, the second cleavable linker (L2) comprises a second cleavable peptide (C1) , wherein the second cleavable peptide (C1) comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 231-240.

[0088] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the antigen binding protein described herein.

[0089] In some embodiments, the nucleic acid is a DNA (e.g., cDNA) or RNA (e.g., mRNA) .

[0090] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising one or more of the nucleic acids described herein.

[0091] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising the vector described herein.

[0092] In some embodiments, the cell is a CHO cell.

[0093] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising one or more of the nucleic acids described herein.

[0094] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing an antigen binding protein, the method comprising (a) culturing the cell described herein under conditions sufficient for the cell to produce the antigen binding protein; and (b) collecting the antigen binding protein produced by the cell.

[0095] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the antigen binding protein described herein, to the subject.

[0096] In one aspect, the disclosure is related to a method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antigen binding protein described herein.

[0097] In one aspect, the disclosure is related to a method of killing a tumor cell, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antigen binding protein described herein.

[0098] In one aspect, the disclosure is related to an pharmaceutical composition comprising the antigen binding protein described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0099] As used herein, the term “antibody” refers to any antigen binding molecule that contains at least one (e.g., one, two, three, four, five, or six) complementary determining region (CDR) (e.g., any of the three CDRs from an immunoglobulin light chain or any of the three CDRs from an immunoglobulin heavy chain) and is capable of specifically binding to an epitope in an antigen. Non-limiting examples of antibodies include: monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multi-specific antibodies (e.g., bi-specific antibodies) , single-chain antibodies, single variable domain (VHH) antibodies, chimeric antibodies, human antibodies, and humanized antibodies. In some embodiments, an antibody can contain an Fc region of a human antibody. The term antibody also includes derivatives, e.g., multispecific antibodies, bispecific antibodies, trispecific antibodies, single-chain antibodies, diabodies, linear antibodies formed from these antibodies or antibody fragments, and antigen binding protein constructs.

[0100] As used herein, the term “antigen binding fragment” refers to a portion of a full-length antibody, wherein the portion of the antibody is capable of specifically binding to an antigen. In some embodiments, the antigen binding fragment contains at least one variable domain (e.g., a variable domain of a heavy chain, a variable domain of light chain or a VHH) . Non-limiting examples of antibody fragments include, e.g., Fab, Fab’, F (ab’) 2, and Fv fragments, scFv, and VHH.

[0101] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present invention is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated in the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0102] As used herein, when referring to an antibody or an antigen binding fragment, the phrases “specifically binding” and “specifically binds” mean that the antibody or an antigen binding fragment interacts with its target molecule preferably to other molecules, because the interaction is dependent upon the presence of a particular structure (i.e., the antigenic determinant or epitope) on the target molecule; in other words, the reagent is recognizing and binding to molecules that include a specific structure rather than to all molecules in general. An antibody that specifically binds to the target molecule may be referred to as a target-specific antibody. For example, an antibody that specifically binds to CD3 may be referred to as CD3-specific antibody or an anti-CD3 antibody.

[0103] As used herein, the term “bispecific antibody” refers to an antibody that binds to two different epitopes. The epitopes can be on the same antigen or on different antigens.

[0104] As used herein, the term “trispecific antibody” refers to an antibody that binds to three different epitopes. The epitopes can be on the same antigen or on different antigens.

[0105] As used herein, the term “multispecific antibody” refers to an antibody that binds to two or more different epitopes. The epitopes can be on the same antigen or on different antigens. A multispecific antibody can be e.g., a bispecific antibody or a trispecific antibody. In some embodiments, the multispecific antibody binds to two, three, four, five, or six different epitopes.

[0106] As used herein, a “VHH” refers to the variable domain of a heavy chain antibody. In some embodiments, the VHH is a humanized VHH. In some embodiments, the VHH is a single-domain antibody (sdAb) .

[0107] As used herein, the terms “polypeptide, ” “peptide, ” and “protein” are used interchangeably to refer to polymers of amino acids of any length of at least two amino acids.

[0108] As used herein, the terms “polynucleotide, ” “nucleic acid molecule, ” and “nucleic acid sequence” are used interchangeably herein to refer to polymers of nucleotides of any length of at least two nucleotides, and include, without limitation, DNA, RNA, DNA / RNA hybrids, and modifications thereof.

[0109] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Methods and materials are described herein for use in the present invention; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0110] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0111] FIGS. 1-14 show representative structures of multispecific antigen binding proteins comprising the core format: E1-B1-M1-L1-B2-B3, and optionally with additional variations.

[0112] FIGS. 15-28 show representative structures of multispecific antigen binding proteins comprising the core format: E1-B1-M1-L1-B3-B2, and optionally with additional variations.

[0113] FIG. 29 shows representative structures of multispecific antigen binding proteins comprising the core format: scFv-Fab.

[0114] FIG. 30 shows luciferase (RLU) results of T cell activation levels by mask CD3 / EGFR bispecific antibody drugs.DETAILED DESCRIPTION

[0115] This disclosure relates to multispecific antigen binding proteins. In one aspect, the multispecific antigen binding proteins can bind to a T cell antigen (e.g., CD3) and / or one or more tumor-associated antigens (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, GUCY2C, MUC16, CDH17, SEZ6, CD54, B7H4, CEACAM6, BAFFR, TROP2, or PVRL4, or a combination thereof) .

[0116] In general, multispecific antigen binding proteins (e.g., bispecific antibodies and trispecific antibodies, or bispecific antibodies and trispecific antigen binding constructs) include two or more antigen binding domains targeting different antigens or different epitopes of the same antigen. Thus, multispecific antigen binding proteins can have more functions than a monospecific antibody. For example, these functions include, but not limited to, stronger binding to an antigen through an avidity effect; co-localization of bound antigens on the cell surface and the effect therefrom; increasing the serum half-life of an antibody fragment by linking it to a protein with a long serum half-life, e.g., albumin or transferrin; and bringing two cells into proximity by binding to an antigen on each of the cells.

[0117] Among the purposes of multispecific antigen binding proteins, one class of molecules, T cell engagers (TCE) , has gained more attention. A TCE is a multispecific antibody (e.g., bispecific antibodies) which binds to an antigen on a T cell and an antigen on another cell simultaneously. CD3 is usually selected as the antigen on the T cell. A cancer or tumor cell is usually selected as the other cell type as discussed above. Through binding to CD3 on T cells and a tumor associated antigen (TAA) on cancer cells, the TCE can induce activation of T cells upon binding to cancer cells and cause the killing of the latter.

[0118] Nevertheless, there are some hurdles to overcome in order to generate desirable homogeneous multispecific antigen binding proteins (e.g., trispecific antibodies) . The first hurdle is mismatch of heavy chains that bind to the same target (e.g., antigen or epitope) . For example, to generate multispecific antigen binding proteins with a desired format, the heavy chains targeting different targets should ideally form a heterodimer. However, the percentage of the desired multispecific antigen binding proteins varies greatly in different constructs. Mutations to induce the formation of knobs-into-holes between two heavy chains can be employed to reduce the formation of homodimers of the heavy chains that bind to the same target.

[0119] The second hurdle to overcome is the mismatch between heavy chain variable regions (VHs) and light chain variable regions (VLs) . A monoclonal antibody has two identical Fab fragments, each having a paired VH and VL. By contrast, a multispecific antibody usually has several different heavy chain variable regions and several different light chain variable regions. Therefore, there is a possibility that each VH can bind to multiple VLs and each VL can bind to multiple VHs. As a result, only some of the formed multispecific antigen binding proteins are functional without addressing this mismatch issue.

[0120] Several strategies have been designed to disable this mismatch. One solution is to design an antibody with a common light chain. Specifically, a light chain variable region, or more precisely a VL, is selected which can form a dimer with all VHs. This design abrogated the necessity of matching VH and VL with the same target-binding specificity. The shortcoming of this strategy is that the contribution of VL in target binding is greatly reduced, leading to difficulty finding an optimal VH as the VH will be greatly if not entirely responsible for target binding.

[0121] The present disclosure also provides different strategies. In this disclosure, a Fab that can bind to human CD3, and a VHH or a scFv that can bind to one or more tumor associated antigens (e.g., CAIX or EGFR) are provided.

[0122] The multispecific antigen binding protein described herein may or may not contain a Fc region. In order to extend the serum half-life of the multispecific antibody, the multispecific antibody can contain a half-life extending molecule (E1) , e.g., a anti-HSA VHH.

[0123] The multispecific antigen binding protein described herein may contain any combination of a first binder (B1) , a second binder (B2) , a third binder (B3) , and a fourth binder (B4) . As used herein, the term “first binder” or “B1” refers to an immune modulator (IM) . For example, the first binder can be an immune cell activator molecule (e.g., anti-PD-1 VHH or a cytokine) . In some embodiments, B1 comprises a VHH that specifically binds to an immuno-modulatory molecule (e.g., PD-1, CD28, CD2, CD137, 4-1BB) . In some embodiments, B1 comprises a scFv that specifically binds to an immune-modulatory molecule (e.g., PD-1, CD28, CD2, CD137, 4-1BB) . In some embodiments, B1 comprises a cytokine (e.g., IL2, IL7, IL15, IL21) . In some embodiments, B2 comprises a scFv that can specifically bind to a tumor-associated antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3,TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, GUCY2C, MUC16, CDH17, SEZ6, CD54, B7H4, CEACAM6, BAFFR, TROP2, or PVRL4) . In some embodiments, B2 comprises a scFv that can specifically bind to a T cell antigen (e.g., CD3) . In some embodiments, B3 comprises a Fab that can specifically bind to a tumor-associated antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, GUCY2C, MUC16, CDH17, SEZ6, CD54, B7H4, CEACAM6, BAFFR, TROP2, or PVRL4) . In some embodiments, B3 comprises a Fab that can specifically bind to a T cell antigen (e.g., CD3) . In some embodiments, B4 can specifically bind to a tumor-associated antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, GUCY2C, MUC16, CDH17, SEZ6, CD54, B7H4, CEACAM6, BAFFR, TROP2, or PVRL4) .

[0124] In some embodiments, B2 can specifically bind to a tumor-associated antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3,TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, GUCY2C, MUC16, CDH17, SEZ6, CD54, B7H4, CEACAM6, BAFFR, TROP2, or PVRL4) and B3 can specifically bind to a T cell antigen (e.g., CD3) . In some embodiments, B3 can specifically bind to a tumor-associated antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, GUCY2C, MUC16, CDH17, SEZ6, CD54, B7H4, CEACAM6, BAFFR, TROP2, or PVRL4) and B2 can specifically bind to a T cell antigen (e.g., CD3) .

[0125] In some embodiments, the multispecific antigen binding proteins can specifically bind to epidermal growth factor receptor (EGFR) . In some embodiments, the multispecific antigen binding proteins can specifically bind to carbonic anhydrase IX (CAIX) .

[0126] In some embodiments, B2 can specifically bind to epidermal growth factor receptor (EGFR) , and B3 can specifically bind to CD3. In some embodiments, B2 can specifically bind to CD3, and B3 can specifically bind to EGFR.

[0127] In some embodiments, B2 can specifically bind to CD3, and B3 can specifically bind to EGFR. In some embodiments, B2 can specifically bind to CD3, and B3 can specifically bind to Trop2. In some embodiments, B2 can specifically bind to CD3, and B3 can specifically bind to Her2.

[0128] In some embodiments, B2 can specifically bind to CD3, and B3 can specifically bind to GPC3. In some embodiments, B2 can specifically bind to CD3, and B3 can specifically bind to PSMA. In some embodiments, B2 can specifically bind to CD3, and B3 can specifically bind to DLL3.

[0129] In some embodiments, B2 can specifically bind to epidermal growth factor receptor (EGFR) , B3 can specifically bind to CD3, and B4 can specifically bind to carbonic anhydrase IX (CAIX) . In some embodiments, B2 can specifically bind to CD3, B3 can specifically bind to EGFR, and B4 can specifically bind to carbonic anhydrase IX (CAIX) .

[0130] In some embodiments, the multispecific antigen binding proteins can have one or more mask peptides, which can impair the binding of the antigen binding domains with its targets.

[0131] Structures of multispecific antigen binding proteins

[0132] The present disclosure provides an antigen binding protein, comprising (a) a first antigen binding domain, (b) a second antigen binding domain; and (c) an immune modulator. In some embodiments, the antigen binding protein comprises a first mask peptide that impairs the binding of the first antigen binding domain to the target of the first antigen binding domain. In some embodiments, the antigen binding protein comprises a second mask peptide that impairs the binding of the second antigen binding domain to the target of the second antigen binding domain. In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a third antigen binding domain.

[0133] The mask peptide as described herein can block the antigen-antibody binding of an antigen binding domain. In some embodiments, the mask peptide is linked to the multispecific antibody via a cleavable linker.

[0134] In the multispecific antibody described herein, a cleavable linker may be used to couple a mask peptide to an antigen binding domain. A cleavable linker can have a cleavable site and optionally two linkers, e.g., before and after the cleavable site. The cleavable linker can be any segments of amino acids conventionally used as a cleavable linker for joining peptide domains. Suitable cleavable likers can vary in length, such as 1-20, 2-15, 3-12, 4-10, 6-20, 6-10, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 amino acids long. In some embodiments, the cleavable linker has at least 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 amino acids. In some embodiments, the cleavable linker has no more than 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 amino acids. In some embodiments, the cleavable linker has about 14～30 amino acids. In some embodiments, the cleavable linker has about 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 amino acids. In some embodiments, the cleavable site has about 6-10 amino acids. In some embodiments, the cleavable site in the cleavable linker has about 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids.

[0135] A cleavable site may be recognized and cleaved by a protease expressed extracellularly so it contacts a masked antigen binding construct (e.g., an antigen binding domain) , releasing the masked antigen binding construct and allowing it to contact its target, such as a receptor extracellular domain or soluble ligand. Several matrix metalloproteinase sites (MMP1-28) may be suitable. MMPs play a role in tissue remodeling and are implicated in neoplastic processes such as morphogenesis, angiogenesis and metastasis. Examples of MMPs are provided in US 2013 / 0309230, WO 2009 / 025846, WO 2010 / 081173, WO 2014 / 107599, WO 2015 / 048329, US 20160160263, and Ratnikov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111: E4148-E4155 (2014) ; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0136] The cleavable site may be cleaved in the tumor microenvironment. The cleavable site may be a matrix metalloprotease (MMP) cleavage site. The MMP cleavage site may be selected from an MMP2 cleavage site, an MMP7 cleavage site, an MMP9 cleavage site and an MMP13 cleavage site. Following cleavage by an MMP, the heavy chain and / or light chain of the masked antigen binding construct may comprise a stub amino acid remnant of the MMP cleavage site. The stub amino acid remnant may contain the sequence LRSG, SG, VR, R, or K at the N terminus of the antigen binding portion of the masked antigen binding construct.

[0137] A cleavable site may also be cleaved at dibasic sites (e.g., an Arginine-Arginine, Lysine-Arginine, or Lysine-Lysine site) . Enzymes that cleave at dibasic sites are known in the art and include, for example, N-arginine dibasic convertase (Chow et al., JBC 275: 19545-19551 (2000) ) and subtilisin-like proprotein convertases such as Furin (PCI) , PC2, and PC3 (Steiner (1991) in Peptide Biosynthesis and Processing (Fricker ed. ) pp. 1-16, CRC Press, Boca Raton, FL; Muller et al., JBC 275: 39213-39222, (2000) ) .

[0138] In addition, one or more linkers can be used to couple a mask peptide to an antigen binding domain. Glycine and glycine-serine polymers are relatively unstructured, and therefore may be able to serve as a neutral linker between components. Glycine accesses significantly more phi-psi space than even alanine, and is much less restricted than residues with longer side chains (see Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992) ) . Some exemplary linkers are in the form S (G) nS, wherein n is from 5-20. Other exemplary linkers are (G) n, glycine-serine polymers (including, for example, (GS) n, glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers, and other flexible linkers.

[0139] The multispecific antigen binding proteins can be designed to include one or more antigen binding domains that target T cell antigens (e.g., CD3) , and include one or more antigen binding domains that target a tumor-associated antigen (e.g., EGFR, CAIX, TROP2, Her2, GPC3, PSMA, or DLL3) . The antigen binding domain can comprise, e.g., a Fab, a scFv, or a VHH. In some embodiments, the one or more antigen binding domains that target a T cell antigen (e.g., CD3) can comprise a Fab. In some embodiments, the one or more antigen binding domains that target the tumor-associated antigen can comprise a scFv or a VHH. The tumor-associated antigen refers to an antigen that is specifically expressed on tumor cell surfaces. These antigens can be used to identify tumor cells. Normal cells rarely express these tumor associated antigens. Some exemplary tumor-associated antigens include, e.g., EGFR, CAIX, TROP2, Her2, GPC3, PSMA, or DLL3.

[0140] In some embodiments, a multispecific antigen binding described herein includes a scFv that specifically binds to a T cell antigen. In some embodiments, the T cell antigen is CD3 (e.g., human CD3) . In some embodiments, the multispecific antigen binding protein or antigen binding fragment thereof can activate T cells upon binding to the T cell antigen. In some embodiments, the scFv has a mask peptide. In some embodiments, the mask peptide is linked to the scFv by a cleavable linker.

[0141] In some embodiments, a multispecific antigen binding protein includes a Fab that specifically binds to a tumor-associated antigen. In some embodiments, the tumor-associated antigen is EGFR, CAIX, TROP2, Her2, GPC3, PSMA, or DLL3. In some embodiments, the tumor-associated antigen is EGFR. In some embodiments, the Fab has a mask peptide. In some embodiments, the mask peptide is linked to the Fab by a cleavable linker.

[0142] In some embodiments, a multispecific antigen binding protein includes a VHH that specifically binds to a tumor-associated antigen. In some embodiments, the tumor-associated antigen is EGFR, CAIX, TROP2, Her2, GPC3, PSMA, or DLL3, preferably CAIX. In some embodiments, the tumor-associated antigen is CAIX.

[0143] The present disclosure provides antigen binding proteins with various formats as described herein. While not intending to be bound by any theory, it is hypothesized that the in the presence of the target cells (e.g., cancer cells) and T cells, the protein constructs can effectively activate T cells.

[0144] The multispecific antigen binding proteins can be used to treat tumor associated antigen positive cancers in a subject (e.g., a human patient) . In some embodiments, the tumor associated antigen positive cancer is CAIX-positive or EGFR-positive cancer.

[0145] In some embodiments, the multispecific antigen binding protein described herein can include a Fc, which includes (a) a first polypeptide including a first Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) ; and (b) a second polypeptide including a second Fc region (e.g., CH2 domain and CH3 domain) . In some embodiments, the first Fc region and / or the second Fc region include one or more knobs-into-holes mutations. For example, the first Fc region (e.g., the CH3 domain in the Fc region) can include a tryptophan (Trp) at position 366 according to EU numbering; and the second Fc region (e.g., the CH3 domain in the Fc region) can include one or more of the following a serine (Ser) at position 366, an alanine (Ala) at position 368, and / or a valine (Val) at position 407 according to EU numbering.

[0146] In some embodiments, the Fc region is derived from the Fc of any antibody as described herein (e.g.., IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) . In some embodiments, the Fc region is a human IgG1, IgG2, or IgG4 (e.g., a human IgG4) . In some embodiments, the first Fc region and / or the second Fc region include additional mutations relative to the Fc region of a wild-type human IgG. For example, the first Fc region and / or the second Fc region can include a proline (Pro) at position 228 according to EU numbering, to reduce chain exchange of the multispecific antibodies. The first Fc region and / or the second Fc region can also include an alanine (Ala) at positions 234 according to EU numbering, to reduce ADCC effect of the multispecific antibodies. The first Fc region can include a cysteine (Cys) at position 354 and the second Fc region can further include a cysteine (Cys) at position 349 according to EU numbering, to stabilize the multispecific antibodies. The second Fc region can include a lysine (Lys) at position 435 and / or a phenylalanine (Phe) at position 436 according to EU numbering, to reduce binding of the second polypeptide to Protein A. In addition, to improve antibody stability, a glycine (Gly) at position 446 and / or a lysine (Lys) at position 447 of the first Fc region and / or the second Fc region can be deleted. While not intending to be bound by any theory, it is understood by a person skilled in the art that the mutations and deletions described herein can be introduced in either the first Fc region or the second Fc region.

[0147] In one aspect, the disclosure is related to an antigen binding protein, comprising (a) a Fc; (b) a first antigen binding domain comprising a scFv that specifically binds to CD3; and (c) a second antigen binding domain comprising a Fab that specifically binds to a tumor associated antigen. In some embodiments, the first antigen binding domain and the second antigen binding domain are linked to the Fc.

[0148] In some embodiments, the second antigen binding domain comprises a Fab fragment (Fab) that contains a variable and constant domain of the light chain and a variable domain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. In some embodiments, the Fab can activate T cells upon binding to a TAA.

[0149] In some embodiments, the Fab is linked to a CH2 domain in the Fc, optionally via a hinge region. In some embodiments, the hinge region is a human IgG4 hinge region optionally with S228P mutation according to EU numbering.

[0150] In some embodiments, the Fc comprises a first polypeptide chain and a second polypeptide chain. In some embodiments, each chain comprises one or more knobs-into-holes mutations.

[0151] The multispecific antigen binding protein described herein may or may not contain a Fc region. In order to extend the serum half-life of the multispecific antigen binding protein, the multispecific antigen binding protein can contain a half-life extending molecule (E1) . In some embodiments, E1 can be a VHH that specifically binds to human serum albumin (HSA) . In some embodiments, the amino acid sequence of the VHH is set forth in SEQ ID NO: 262 (EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTL YADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS) . In some embodiments, the VHH has an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 262.

[0152] The multispecific antigen binding protein described herein may contain any combination of a first binder (B1) , a second binder (B2) , a third binder (B3) , and a fourth binder (B4) . In some embodiments, B1 contains an immune cell activator molecule (e.g., anti-PD-1 VHH or a cytokine) . In some embodiments, B1 comprises a VHH that specifically binds to an immuno-modulatory molecule (e.g., PD-1) . In some embodiments, B1 comprises a cytokine (e.g., IL2) . In some embodiments, B2 comprises a scFv that can specifically bind to a tumor-associated antigen (e.g., EGFR) . In some embodiments, B2 comprises a scFv that can specifically bind to a T cell antigen (e.g., CD3) . In some embodiments, B3 comprises a Fab that can specifically bind to a tumor-associated antigen (e.g., EGFR) . In some embodiments, B3 comprises a Fab that can specifically bind to a T cell antigen (e.g., CD3) . In some embodiments, B4 can specifically bind to a tumor-associated antigen (e.g., CAIX) .

[0153] In some embodiments, the multispecific antigen binding protein described herein may contain an antigen binding domain that is connected to a mask peptide via a cleavable linker. In some embodiments, the multispecific antigen binding protein described herein may contain a first mask (M1) that is linked to B2 via a first cleavable linker (L1) . In some embodiments, the multispecific antigen binding protein described herein may contain a second mask (M2) that is linked to B3 via a second cleavable linker (L2) .

[0154] The multispecific antigen binding proteins with various structures are described below.

[0155] 1. E1-B1-M1-L1-B2-B3

[0156] As shown in FIGs. 1-14, a multispecific antigen binding protein can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a half-life extending molecule (E1) , a first binder (B1) (labeled as IM in FIGs. 1-14) , a first mask peptide (M1) , a first cleavable linker (L1) , a second binder (B2) (labeled as anti-CD3 scFv in FIGs. 1-14) , and a first part of a Fab (B3) (labeled as anti-TAA1 Fab in FIGs. 1-14) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a second mask peptide (M2) , a second cleavable linker (L2) , and a second part of a Fab (B3) .

[0157] In some embodiments, M1 impairs the binding of B2 with its target. In some embodiments, M2 impairs the binding of B3 with its target.

[0158] In some embodiments, the half-life extending molecule (E1) comprises a VHH that specifically binds to human serum albumin (HSA) .

[0159] In some embodiments, the first binder (B1) comprises an immune cell activator molecule. In some embodiments, the first binder comprises a VHH that specifically binds to an immuno-modulatory molecule (e.g., PD-1) . In some embodiments, the first binder (B1) comprises a cytokine (e.g., IL2) .

[0160] In some embodiments, the second binder (B2) comprises a scFv that specifically binds to a T cell antigen (e.g., CD3) . In some embodiments, the VH in the scFv is linked to B3 and the VL in the scFv is linked to L1. In some embodiments, the VH in the scFv is linked to L1 and the VL in the scFv is linked to B3.

[0161] In some embodiments, the first part of a Fab (B3) and the second part of a Fab (B3) associate with each other, forming a Fab (B3) that specifically binds to an antigen (e.g., EGFR) . In some embodiments, the first part of a Fab comprises a VH domain and a CH1 domain and the second part of a Fab comprises a VL domain and a CL domain. In some embodiments, the first part of a Fab comprises a VL domain and a CL domain and the second part of a Fab comprises a VH domain and a CH1 domain. In some embodiments, the first part of a Fab comprises a VH domain and a CL domain and the second part of a Fab comprises a VL domain and a CH1 domain. In some embodiments, the first part of a Fab comprises a VL domain and a CH1 domain and the second part of a Fab comprises a VH domain and a CL domain.

[0162] In some embodiments, B2 specifically binds to a T cell antigen, and B3 specifically binds to a tumor-associated antigen. In some embodiments, B2 specifically binds to a tumor-associated antigen, and B3 specifically binds to a T cell antigen.

[0163] In some embodiments, the C-terminus of the first polypeptide is further linked to a fourth binder (B4) (labeled as anti-TAA2 VHH in FIGs. 1-14) . In some embodiments, the C-terminus of the second polypeptide is further linked to a fourth binder (B4) .

[0164] In some embodiments, B4 is a VHH or a scFv. In some embodiments, the VH in the scFv is linked to B3. In some embodiments, the VL in the scFv is linked to B3.

[0165] In some embodiments, the C-terminus of each of the first polypeptide and the second polypeptide is linked to B4.

[0166] In some embodiments, the C-terminus of the first polypeptide or the second polypeptide is linked to two B4 that are linked in tandem.

[0167] In some embodiments, B4 specifically binds to a tumor associated antigen (e.g., CAIX) .

[0168] In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a fifth binder (B5) . In some embodiments, B5 specifically binds to a tumor associated antigen (e.g., CAIX) . In some embodiments, B4 is a scFv, and B5 is a VHH. In some embodiments, B4 is linked to the C-terminus of the first polypeptide, and B5 is linked to the C-terminus of the second polypeptide. In some embodiments, B5 is linked to the C-terminus of the first polypeptide, and B4 is linked to the C-terminus of the second polypeptide.

[0169] In some embodiments, both B4 and B5 are scFv.

[0170] 2. E1-B1-M1-L1-B3-B2

[0171] As shown in FIGs. 15-28, a multispecific antigen binding protein can be prepared, which includes (a) a first polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a half-life extending molecule (E1) , a first binder (B1) (labeled as IM in FIGs. 15-28) , a first mask (M1) , a first cleavable linker (L1) , and a first part of a Fab (B3) (labeled as anti-TAA1 Fab in FIGs. 15-28) ; (b) a second polypeptide including, preferably from N-terminus to C-terminus: a second mask (M2) , a second cleavable linker (L2) , a second binder (B2) (labeled as anti-CD3 scFv in FIGs. 15-28) , and a second part of a Fab (B3) .

[0172] In some embodiments, M1 impairs the binding of B3 with its target. In some embodiments, M2 impairs the binding of B2 with its target.

[0173] In some embodiments, the half-life extending molecule (E1) comprises a VHH that specifically binds to human serum albumin (HSA) .

[0174] In some embodiments, the first binder (B1) comprises an immune cell activator molecule. In some embodiments, the first binder comprises a VHH that specifically binds to an immuno-modulatory molecule (e.g., PD-1) . In some embodiments, the first binder (B1) comprises a cytokine (e.g., IL2) .

[0175] In some embodiments, the second binder (B2) comprises a scFv that specifically binds to a T cell antigen (e.g., CD3) .

[0176] In some embodiments, the first part of a Fab (B3) and the second part of a Fab (B3) associate with each other, forming a Fab (B3) that specifically binds to an antigen, such as a tumor-associated antigen (e.g., EGFR) . In some embodiments, the Fab can target EGFR (e.g., human EGFR) . In some embodiments, the first part of a Fab comprises a VH domain and a CH1 domain and the second part of a Fab comprises a VL domain and a CL domain. In some embodiments, the first part of a Fab comprises a VL domain and a CL domain and the second part of a Fab comprises a VH domain and a CH1 domain. In some embodiments, the first part of a Fab comprises a VH domain and a CL domain and the second part of a Fab comprises a VL domain and a CH1 domain. In some embodiments, the first part of a Fab comprises a VL domain and a CH1 domain and the second part of a Fab comprises a VH domain and a CL domain.

[0177] In some embodiments, B2 specifically binds to a T cell antigen, and B3 specifically binds to a tumor-associated antigen. In some embodiments, B2 specifically binds to a tumor-associated antigen, and B3 specifically binds to a T cell antigen.

[0178] In some embodiments, the C-terminus of the first polypeptide is further linked to a fourth binder (B4) (labeled as anti-TAA2 VHH in FIGs. 15-28) . In some embodiments, the C-terminus of the second polypeptide is further linked to a fourth binder (B4) .

[0179] In some embodiments, B4 is a VHH or a scFv. In some embodiments, the VH in the scFv is linked to B3. In some embodiments, the VL in the scFv is linked to B3.

[0180] In some embodiments, the C-terminus of each of the first polypeptide and the second polypeptide is linked to B4.

[0181] In some embodiments, the C-terminus of the first polypeptide or the second polypeptide is linked to two B4 that are linked in tandem.

[0182] In some embodiments, B4 specifically binds to a tumor associated antigen (e.g., CAIX) .

[0183] In some embodiments, the antigen binding protein further comprises a fifth binder (B5) . In some embodiments, B5 specifically binds to a tumor associated antigen (e.g., CAIX) . In some embodiments, B4 is a scFv, and B5 is a VHH. In some embodiments, B4 is linked to the C-terminus of the first polypeptide, and B5 is linked to the C-terminus of the second polypeptide. In some embodiments, B5 is linked to the C-terminus of the first polypeptide, and B4 is linked to the C-terminus of the second polypeptide.

[0184] In some embodiments, both B4 and B5 are scFv.

[0185] In one aspect, the disclosure is related to an antigen-binding protein, comprising: a first peptide comprising, from the N-terminus to the C-terminus, a half-life extension unit (E) , an immune modulator (IM) , a first mask peptide (M1) , a first cleavable linker (L1) , a scFv that specifically binds to a first antigen, a VH1, a CH1; and a second peptide comprising, from the N-terminus to the C-terminus, a VL1, and a CL. In some embodiments, the VH1 and VL1 form a Fab that specifically binds to a second antigen, and the first mask peptide (M1) impairs the binding of the scFv to the first antigen. In some embodiments, the scFv comprises a VH2 and a VL2.

[0186] In some embodiments, the second peptide further comprises a second mask peptide (M2) that impairs the binding of the Fab to the second antigen and the second mask peptide is linked to the Fab via a second cleavable linker (L2) .

[0187] In some embodiments, the first antigen is a T cell antigen (e.g., CD3) and the second antigen is a tumor-associated antigen (e.g., EGFR) .

[0188] In some embodiments, the first antigen is CD3 and the second antigen is EGFR.

[0189] In some embodiments, the VH2 comprises any one of the combinations of the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 sequences in Tables 1, 3, and 5, and the VL2 comprises any one of the combinations of the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 sequences in Tables 2, 4, and 6.

[0190] In some embodiments, the VH2 comprises any one of the amino acid sequences in Table 7, and the VL2 comprise any one of the amino sequences in Table 8.

[0191] In some embodiments, the VH1 comprises any one of the combinations of the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 sequences in Tables 12, 14, and 16, and the VL1 comprises any one of the combinations of the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 sequences in Tables 13, 15, and 17.

[0192] In some embodiments, the VH1 comprises any one of the amino acid sequences in Table 18, and the VL1 comprise any one of the amino sequences in Table 19.

[0193] In some embodiments, the half-life extending unit (E) comprises a VHH that specifically binds to human serum albumin (HSA) .

[0194] In some embodiments, the first mask peptide (M1) comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 144-160.

[0195] In some embodiments, the first cleavable linker (L1) comprises a first cleavable peptide (C1) , wherein the first cleavable peptide (C1) comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 231-240.

[0196] In some embodiments, the second mask peptide (M2) comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 220-230.

[0197] In some embodiments, the second cleavable linker (L2) comprises a second cleavable peptide (C2) , wherein the second cleavable peptide (C2) comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 231-240.

[0198] Immune modulator (IM)

[0199] The term “immune modulator” or “IM” refers to a substance that interacts with or binds to a receptor on an immune cell, and is capable of altering (e.g., inhibiting, decreasing, increasing, enhancing or stimulating) the activity of the immune cell. As used herein, the term “immune modulator” or “IM” does not include an antibody or antigen binding fragment that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) . The immune modulator may adjust the immune response to a desired level, as in immunopotentiation, immunosuppression, immune costimulation, or induction of immunologic tolerance. Immune modulators include, but are not limited to, proteins, peptides, antibodies, antibody fragments, small molecules, cytokines, hormones, enzymes, nucleic acids, antisense oligonucleotides such as siRNA, toxins, anti-angiogenic agents, cytotoxic agents, pro-apoptotic agents and other known therapeutic agents. Preferred immune modulators include small molecules (for example, R848, Loxoribine, Stat-3 inhibitors, TGFβ inhibitors, Rapamycin / FK506) , cytokines (for example, IL-2, TGFβ) , antibody fragments (for example, CTLA-4 agonist scFv) , protein fragment (for example, CD58) , nucleic acids (for example, CpG, siRNA) .

[0200] The immune modulator (IM) can be selected from the group consisting of an inhibitor to an inhibitory checkpoint molecule, an activator of a stimulatory checkpoint molecule, an immune costimulator, a chemokine inhibitor, an inhibitor of macrophage migration inhibitory factor (MIF) , a growth factor, a cytokine, an interleukin, an interferon, an antibody that binds to an immune system cell, a protein fragment that binds to an immune system cell, a cellular immune modulator, a vaccine, an oncolytic virus, and any combination thereof. Examples of immune modulators include eicosanoids, cytokines, prostaglandins, interleukins, chemokines, checkpoint regulators, TNF superfamily members, TNF receptor superfamily members and interferons. Specific examples of immune modulators include PGI2, PGE2, PGF2, CCL14, CCL19, CCL20, CCL21, CCL25, CCL27, CXCL12, CXCL13, CXCL-8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11, CXCL10, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL15, IL17, IL17, INF-α, INF-β, INF-ε, INF-γ, TGF-α, TGF-β, G-CSF, TNF-α, CTLA, CD20, PD1, PD1L1, PD1L2, ICOS, CD200, CD52, CD58, LTα, LTαε, LIGHT, CD27L, 41BBL, FasL, Ox40L, April, TL1A, CD30L, TRAIL, RANKL, BAFF, TWEAK, CD40L, EDA1, EDA2, APP, NGF, TNFR1, TNFR2, LTβR, HVEM, CD58, CD27, CD28, 4-1BB, Fas, Ox40, AITR, DR3, CD30, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, BAFFR, TACI, , Fn14, CD40, EDAR XEDAR, DR6, DcR3, NGFR-p75, and Taj. Other examples of immune modulators include tocilizumab (Actemra) , CDP870 (Cimzia) , enteracept (Enbrel) , adalimumab (Humira) , Kineret, abatacept (Orencia) , infliximab (Remicade) , rituzimab (Rituxan) , golimumab (Simponi) , Avonex, Rebif, ReciGen, Plegridy, Betaseron, Copaxone, Novatrone, natalizumab (Tysabri) , fingolimod (Gilenya) , teriflunomide (Aubagio) , BG12, Tecfidera, and alemtuzumab (Campath, Lemtrada) .

[0201] In some embodiments, the inhibitor to the inhibitory checkpoint molecule is a small molecule drug, or an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the inhibitory checkpoint molecule and inhibits its activity, wherein the inhibitory checkpoint molecule is selected from the group consisting of PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, BTLA, A2aR, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, CD47, CD48, CD160, CD244 (2B4) , CHK1, CHK2, CGEN-15049, ILT-2, ILT-4, LAG-3, VISTA, gp49B, PIR-B, TIGIT, TIM1, TIM2, TIM3, TIM4, and KIR, and ligands thereof. In some embodiments, the activator of the stimulatory checkpoint molecule is a small molecule drug, polypeptide-based activator, or polynucleotide-based activator that specifically binds to the stimulatory checkpoint molecule and increases its activity, wherein the stimulatory checkpoint molecule is selected from the group consisting of B7-1 (CD80) , B7-2 (CD86) , 4-1BB (CD137) , OX40 (CD134) , HVEM, inducible costimulator (ICOS) , glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR) , CD27, CD28, CD40, CD58 and ligands thereof. In some instances, the chemokine inhibitor is a small molecule drug, or antibody or fragment thereof that specifically binds to the chemokine (or its receptor) and inhibits chemokine activity. In some embodiments, the chemokine is selected from the group consisting of CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL5, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL5, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL5, and CXCL16. In some embodiments, the chemokine inhibitor binds to a chemokine receptor selected from the group consisting of CCR1, CCR2, CCR3, CCR, 4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, and CXCR7.

[0202] In some embodiments, the immune modulator (IM) comprises an immune cell activator molecule (e.g., anti-PD-1 VHH or a cytokine) . In some embodiments, the immune cell activator molecule comprises a VHH that specifically binds to an immuno-modulatory molecule (e.g., PD-1, CD28, CD2, CD137, 4-1BB) . In some embodiments, the immune cell activator molecule comprises a scFv that specifically binds to an immune-modulatory molecule (e.g., PD-1, CD28, CD2, CD137, 4-1BB) . In some embodiments, B1 comprises a cytokine (e.g., IL2, IL7, IL15, IL21) . In some embodiments, the cytokine is IL2. In some embodiments, the amino acid sequence of the IL2 is set forth in SEQ ID NO: 245 (APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT) . In some embodiments, amino acid sequence of IL-2 that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 245.

[0203] Without being bound by theory, the immune modulator (e.g., IL-2) can help activate T cells, leading to stronger T cell mediated tumor inhibition. In some embodiments, T cell activation can be measured by the methods described in Example 2. In some embodiments, the immune activator described herein can increase T cell activation by more than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%or 2000%. In some embodiments, the immune activator described herein can increase T cell activation by 5-50 times. In some embodiments, the immune activator described herein can increase T cell activation by about 10 times. In some embodiments, comparing to a multispecific antigen binding protein without the immune modulator, the inclusion of the immune modulator can increase T cell activation by more than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%or 2000%. In some embodiments, comparing to a multispecific antigen binding protein without the immune modulator, the inclusion of the immune modulator can increase T cell activation by 5-100 times. In some embodiments, comparing to a multispecific antigen binding protein without the immune modulator, the inclusion of the immune modulator can increase T cell activation by about 10 times.

[0204] In some embodiments, T cell mediated tumor inhibition can be measured by the methods described in Example 3. In some embodiments, the immune activator described herein can increase T cell mediated tumor inhibition by more than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, or 300%. In some embodiments, the immune activator described herein can increase T cell mediated tumor inhibition by about 50%to 150%. In some embodiments, the immune activator described herein can increase T cell mediated tumor inhibition by about 100%. In some embodiments, comparing to a multispecific antigen binding protein without the immune modulator, the inclusion of the immune modulator can increase T cell mediated tumor inhibition by more than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, or 500%. In some embodiments, comparing to a multispecific antigen binding protein without the immune modulator, the inclusion of the immune modulator can increase T cell mediated tumor inhibition by about 50%-150%. In some embodiments, comparing to n multispecific antigen binding protein without the immune modulator, the inclusion of the immune modulator can increase T cell mediated tumor inhibition by about 100%.

[0205] Without wishing to be bound by theory, comparing to separately administering the immune modulator (e.g., IL2) , administering the multispecific antigen binding protein containing the immune modulator is advantageous because it avoids unwanted non-specific immune cell activation and / or cytokine storm. In some embodiments, comparing to separately administering the immune modulator, administering the multispecific antigen binding protein containing the immune modulator is advantageous because it simplifies the treatment method.

[0206] Anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof

[0207] In some embodiments, the multispecific antigen-binding proteins or multispecific antibodies (MABs) comprise antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to CD3. Provided herein are antibodies or antigen-binding fragments (e.g., scFv) thereof that specifically bind to the epsilon chain of CD3 (CD3ε, referred to herein throughout as CD3) . Exemplary CDR sequences of anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof are provided in Tables 1-6.

[0208] The disclosure provides anti-CD3 antibodies, and antigen binding fragments (e.g., scFv) thereof, comprising a set of the CDR sequences in Tables 1-6, any one of the VH and VL pairs in Tables 7-8, . In some embodiments, the antigen binding fragments described herein are anti-CD3 scFvs in Table 9.

[0209] Table 1. CDR sequences of the heavy chain of anti-CD3 antibodies according to the Kabat definition

[0210] Table 2. CDR sequences of the light chain of anti-CD3 antibodies according to the Kabat definition

[0211] Table 3. CDR sequences of the heavy chain of anti-CD3 antibodies according to the Chothia definition

[0212] Table 4. CDR sequences of the light chain of anti-CD3 antibodies according to the Chothia definition

[0213] Table 5. CDR sequences of the heavy chain of anti-CD3 antibodies according to the IMGT definition

[0214] Table 6. CDR sequences of the light chain of anti-CD3 antibodies according to the IMGT definition

[0215] As provided herein, the anti-CD3 antibodies and antigen binding fragments thereof described herein can comprise at least one set of the CDR 1, 2, and 3 sequences provided in Tables 1-6.

[0216] Exemplary VH and VL sequences of anti-CD3 antibodies and antigen binding fragments thereof are provided in Tables 7-8. As provided herein, the anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof described herein can comprise at least one pair of the VH and VL sequences provided in Tables 7-8.

[0217] Table 7. VH sequences of anti-CD3 antibodies

[0218] Table 8. VL sequences of anti-CD3 antibodies

[0219] In some embodiments, the term “153-Ab” described herein may represent any one of the anti-CD3 scFvs.

[0220] Exemplary scFvs comprise a VH (e.g., any of the VH described in Table 7) , and a VL (e.g., any of the VL described in Table 8) . Exemplary scFvs are shown in Table 9.

[0221] Table 9

[0222] Activatable anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof

[0223] In some embodiments, the multispecific antigen-binding proteins or multispecific antibodies (MABs) comprise activatable antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to CD3. In some embodiments, any one of the anti-CD3 antibodies or antigen-binding fragments thereof provided herein can be in an activatable antibody format.

[0224] As generally provided herein, the anti-CD3 antibodies, antigen binding fragments thereof, multispecific antigen binding proteins, or multispecific antibodies (MABs) of the disclosure can comprise a masking moiety or masking peptide (e.g., M1 as described herein) . As used herein, the term “prodomain” refers to a polypeptide comprising a masking peptide (e.g., M1 as described herein) and a cleavable linker (e.g., L1 as described herein) . In certain embodiments, a prodomain comprises one of the following formulas (where the formula below represents an amino acid sequence in either a N-to C-terminal direction or a C-to N-terminal direction) : M1-L1-MAB.

[0225] In exemplary embodiments, a prodomain comprises a CD3ε mask peptide M1 and a cleavable linker L1 that is cleavable by a matriptase or MMP. In some embodiments, provided herein are activatable multispecific antibodies (MABs) comprising a prodomain. Also provided herein are nucleotides encoding any of the prodomains described herein.

[0226] In some embodiments, a masking moiety (M1) or a mask peptide of the anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof comprises any one of the sequences set forth in Table 10.

[0227] Table 10 Exemplary mask peptide sequences of anti-CD3 antibodies

[0228] In some embodiments, the masking moiety (M1) or the mask peptide of the anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof may be screened using any of the anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof described herein. In some embodiments, the masking moiety (M1) or the mask peptide of the anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof can reduce or inhibit the binding of the anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof (e.g., any of the anti-CD3 scFvs described herein) to CD3. In some embodiments, the masking moiety (M1) or the mask peptide of the anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof can reduce or inhibit the binding of CD3 antibodies having the same heavy chain CDR sequences and / or the same light chain CDR sequences of any one of the anti-CD3 scFvs described herein. In some embodiments, the masking moiety (M1) or the mask peptide of the anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof can reduce or inhibit the binding of CD3 antibodies having the same heavy chain CDR sequences of any one of 153-Ab18, 153-Ab19, 153-Ab21～153-Ab28, 153-Ab33, and 153-Ab34. In some embodiments, the masking moiety (M1) or the mask peptide of the anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof can reduce or inhibit the binding of CD3 antibodies having the same light chain CDR sequences of any one of 153-Ab11, 153-Ab12, 153-Ab14, 153-Ab15, 153-Ab16, 153-Ab17, 153-Ab18, 153-Ab21, 153-Ab22, 153-Ab25, 153-Ab26, 153-Ab29, 153-Ab30, 153-Ab31, 153-Ab32, 153-Ab33, 153-Ab34, 153-Ab35, and 153-Ab36. In some embodiments, the masking moiety (M1) or the mask peptide of the anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof can reduce or inhibit the binding of CD3 antibodies having the same heavy chain CDR sequences and the same light chain CDR sequences of any one of 153-Ab18, 153-Ab21, 153-Ab22, 153-Ab25, 153-Ab26, 153-Ab33, and 153-Ab34.

[0229] In some embodiments, the cleavable linker described herein (e.g., L1) comprises any one of the sequences set forth in Table 11. In some embodiments, the cleavable linker (e.g., L1 ) of an activatable multispecific antibodies (MABs) of the disclosure comprises any one of the sequences set forth in Table 11.

[0230] Table 11 Exemplary cleavable linker sequences

[0231] Anti-EGFR antibodies or antigen binding fragments thereof

[0232] In some embodiments, the multispecific antigen-binding proteins or multispecific antibodies (MABs) comprise antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to EGFR. Provided herein are antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to EGFR. In some embodiments, the anti-EGFR antibodies or antibody fragments thereof comprise a Fab comprising a VH and a VL. Exemplary CDR sequences of anti-EGFR antibodies or antigen binding fragments thereof are provided in Tables 12-17. Exemplary VH and VL sequences are provided in Tables 18-19.

[0233] Table 12. CDR sequences of the heavy chain of anti-EGFR antibodies according to the kabat definition

[0234] Table 13. CDR sequences of the light chain of anti-EGFR antibodies according to the kabat definition

[0235] Table 14. CDR sequences of the heavy chain of anti-EGFR antibodies according to the chothia definition

[0236] Table 15. CDR sequences of the light chain of anti-EGFR antibodies according to the chothia definition

[0237] Table 16. CDR sequences of the heavy chain of anti-EGFR antibodies according to the IMGT definition

[0238] Table 17. CDR sequences of the light chain of anti-EGFR antibodies according to the IMGT definition

[0239] Table 18. Exemplary VH sequences of anti-EGFR antibodies

[0240] Table 19. Exemplary VL sequences of anti-EGFR antibodies

[0241] In some embodiments, the anti-EGFR antibodies comprise a Fab. In some embodiments, the term “305-Ab” described herein may represent any one of the anti-EGFR Fabs.

[0242] Exemplary Fabs comprise a VH (e.g., any of the VH described in Table 18) , a VL (e.g., any of the VL described in Table 19) , a CH1 (e.g., CH1 described in Table 20) , and a CL (e.g., CL described in Table 20) .

[0243] Table 20 Exemplary CH1 and CL sequences

[0244] Activatable anti-EGFR antibodies or antigen binding fragments thereof

[0245] In some embodiments, the multispecific antigen-binding proteins or multispecific antibodies (MABs) comprise activatable antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to EGFR. In some embodiments, any one of the anti-EGFR antibodies or antigen binding fragments thereof provided herein can be in an activatable antibody format.

[0246] As generally provided herein, the multispecific antigen binding proteins or multispecific antibodies (MABs) of the disclosure can comprise a masking moiety or mask peptide (M2) . Accordingly, as used herein, the term “prodomain” refers to a polypeptide comprising a masking peptide (e.g., M2 as described herein) and a cleavable linker (e.g., L2 as described herein) . In certain embodiments, a prodomain comprises one of the following formulas (where the formula below represents an amino acid sequence in either a N-to C-terminal direction or a C-to N-terminal direction) : M2-L2-MAB.

[0247] In exemplary embodiments, a prodomain comprises a EGFR mask peptide M2 and a cleavable linker L2 that is cleavable by a matriptase or MMP. In some embodiments, provided herein are activatable multispecific antibodies (MABs) comprising a prodomain. Also provided herein are nucleotides encoding any of the prodomains described herein.

[0248] In some embodiments, a masking moiety (M2) or a mask peptide of the EGFR antibodies comprises any one of the sequences set forth in Table 21.

[0249] Table 21 exemplary mask sequences of anti-EGFR antibodies

[0250] In some embodiments, the masking moiety (MM) or the mask peptide of the EGFR antibodies may be screened using any of the EGFR antibodies described herein. In some embodiments, the masking moiety (MM) or the mask peptide of the anti-CD3 antibodies or antigen binding fragments thereof can reduce or inhibit the binding of the EGFR antibodies (e.g., any of the anti-EGFR Fabs described herein) to EGFR. In some embodiments, the masking moiety (MM) or the mask peptide of the EGFR antibodies can reduce or inhibit the binding of EGFR antibodies having the same heavy chain CDR sequences and / or the same light chain CDR sequences of any one of the anti-EGFR Fabs described herein. In some embodiments, the masking moiety (MM) or the mask peptide of the EGFR antibodies can reduce or inhibit the binding of EGFR antibodies having the same heavy chain CDR sequences of any one of 305-Ab1～305-Ab16. In some embodiments, the masking moiety (MM) or the mask peptide of the EGFR antibodies can reduce or inhibit the binding of EGFR antibodies having the same light chain CDR sequences of any one of 305-Ab1～305-Ab17.

[0251] In some embodiments, the masking moiety (MM) or the mask peptide of the EGFR antibodies can reduce or inhibit the binding of EGFR antibodies having the same light chain CDR and the same heavy chain CDR sequences of any one of 305-Ab1～305-Ab16.

[0252] In some embodiments, the cleavable linker described herein (e.g., L2) comprises any one of the sequences set forth in Table 11. In some embodiments, the cleavable linker (e.g., L2 ) of an activatable multispecific antigen binding proteins or multispecific antibodies (MABs) of the disclosure comprises any one of the sequences set forth in Table 11. In some embodiments, the cleavable linker described herein (e.g., L2) further comprises a (GXSy) z linker, wherein x is from 1-5, y is from 1-5, z is from1-10. In some embodiments, the cleavable linker of L1 is the same as L2.

[0253] Cleavable linkers

[0254] Both the monospecific antibodies and the multispecific antibodies (MABs) of the disclosure can comprise at least one cleavable linker (provided in Table 11) , when masked and / or not activated. In some embodiments, the terms "cleavable linker" and "cleavable substrate" are interchangeable.

[0255] In some embodiments, the cleavable linker (e.g., L1 described herein) of monospecific antibodies or the multispecific antibodies (MABs) includes an amino acid sequence that can serve as a substrate for at least one protease, usually an extracellular protease. A cleavable linker (e.g., L1 described herein) can serve as a substrate for multiple proteases, e.g., a substrate for a serine protease and a second different protease, e.g., an MMP. In some embodiments, a cleavable linker (e.g., L1 described herein) can serve as a substrate for more than one serine protease, e.g., a matriptase and uPA (urokinase) . In some embodiments, a cleavable linker (e.g., L1 described herein) can serve as a substrate for more than one MMPs, e.g., MMP9 and MMP14. In the case of multispecific antibodies (MABs) , the cleavable linker (e.g., L1 described herein) may be selected based on a protease that is co-localized in a tissue with the desired target of at least one AB of the cleavable linker (e.g., L1 described herein) .

[0256] A variety of different conditions are known in which a target of interest is co-localized with a protease, where the substrate of the protease is known in the art. In the example of cancer, the target tissue can be a cancerous tissue, particularly the cancerous tissue of a solid tumor. There are reports in the literature of increased levels of proteases in a number of cancers, e.g., liquid tumors (e.g., leukemia, lymphoma, and myeloma) or solid tumors. See, e.g., La Rocca et al, (2004) British J. of Cancer 90 (7) : 1414-1421. Non-limiting examples of diseases include: all types of cancers, (such as, but not limited to breast, lung, colorectal, gastric, glioblastoma, ovarian, endometrial, renal, sarcoma, skin cancer, cervical, liver, bladder, cholangiocarcinoma, prostate, melanomas, head and neck cancer (e.g., head and neck squamous cell cancer, pancreatic, etc. ) , rheumatoid arthritis, Crohn's disease, SLE, cardiovascular damage, ischemia, etc. For example, indications would include leukemias, including T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) , lymphoblastic diseases including multiple myeloma, and solid tumors, including lung, colorectal, prostate, pancreatic and breast, including triple negative breast cancer. For example, indications include bone disease or metastasis in cancer, regardless of primary tumor origin; breast cancer, including by way of non-limiting example, ER / PR+ breast cancer, Her2+ breast cancer, triple-negative breast cancer; colorectal cancer; endometrial cancer; gastric cancer; glioblastoma; head and neck cancer, such as head and neck squamous cell cancer; esophageal cancer; lung cancer, such as by way of non-limiting example, non-small cell lung cancer; multiple myeloma ovarian cancer; pancreatic cancer; prostate cancer; sarcoma, such as osteosarcoma; renal cancer, such as by way of non-limiting example, renal cell carcinoma; and / or skin cancer, such as by way of non-limiting example, squamous cell cancer, basal cell carcinoma, or melanoma. In some embodiments, the cancer is a squamous cell cancer. In some embodiments, the cancer is a skin squamous cell carcinoma. In some embodiments, the cancer is an esophageal squamous cell carcinoma. In some embodiments, the cancer is a head and neck squamous cell carcinoma. In some embodiments, the cancer is a lung squamous cell carcinoma.

[0257] For specific cleavage by an enzyme, contact between the enzyme and the cleavable linker (e.g., L1) is made. When the monospecific antibodies or the multispecific antibodies (MABs) comprise at least a first AB coupled to a mask peptide and a cleavable linker, e.g., the monospecific antibodies comprises an AB coupled to a mask peptide via a cleavable linker, is in the presence of target and sufficient enzyme activity, the cleavable linker can be cleaved. Sufficient enzyme activity can refer to the ability of the enzyme to make contact with the cleavable linker and effect cleavage. It can readily be envisioned that an enzyme may be in the vicinity of the cleavable linker but is unable to cleave because of other cellular factors or protein modification of the enzyme.

[0258] Exemplary cleavable linkers of the disclosure are provided in Table 11 above. In some embodiments, the cleavable linker has a length of up to 15 amino acids, a length of up to 20 amino acids, a length of up to 25 amino acids, a length of up to 30 amino acids, a length of up to 35 amino acids, a length of up to 40 amino acids, a length of up to 45 amino acids, a length of up to 50 amino acids, a length of up to 60 amino acids, a length in the range of 10-60 amino acids, a length in the range of 15-60 amino acids, a length in the range of 20-60 amino acids, a length in the range of 25-60 amino acids, a length in the range of 30-60 amino acids, a length in the range of 35-60 amino acids, a length in the range of 40-50 amino acids, a length in the range of 45-60 amino acids, a length in the range of 10-40 amino acids, a length in the range of 15-40 amino acids, a length in the range of 20-40 amino acids, a length in the range of 25-40 amino acids, a length in the range of 30-40 amino acids, a length in the range of 35-40 amino acids, a length in the range of 10-30 amino acids, a length in the range of 15-30 amino acids, a length in the range of 20-30 amino acids, a length in the range of 25-30 amino acids, a length in the range of 10-20 amino acids, or a length in the range of 10-15 amino acids.

[0259] Mask peptides

[0260] In both the activatable monospecific anti-CD3 and anti-EGFR monospecific antibodies, or the multispecific antibodies (MABs) described above, the monospecific antibodies or the multispecific antibodies (MABs) can contain a mask peptide. As described herein, the monospecific antibodies (AB) or the multispecific antibodies (MABs) of the disclosure can comprise a prodomain (e.g., any of the prodomains described herein) , which comprises a mask peptide.

[0261] In some embodiments, the mask peptide is selected for use with a specific antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., the anti-CD3 or anti-EGFR antibodies or antigen-binding fragments thereof) .

[0262] In some embodiments, the first mask peptide of anti-CD3 antibody is selected from Table 10. In some embodiments, the second mask peptide of anti-EGFR antibody is selected from Table 21.

[0263] In certain embodiments, the mask peptide is not a natural binding partner of the AB. In some embodiments, the mask peptide contains no or substantially no homology to any natural binding partner of the AB. In other embodiments the mask peptide is no more than 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, or 80%similar (e.g., in terms of sequence identity or homology) to any natural binding partners of the AB. In some embodiments, the mask peptide is no more than 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, or 80%identical to any natural binding partners of the AB.In some embodiments, the mask peptide is no more than 50%identical to any natural binding partners of the AB. In some embodiments, the mask peptide is no more than 25%identical to any natural binding partners of the AB. In some embodiments, the mask peptide is no more than 20%identical to any natural binding partners of the AB. In some embodiments, the mask peptide is no more than 10%identical to any natural binding partners of the AB.

[0264] An example of a spacer joined directly to the N-terminus of the mask peptide of the activatable antibody is selected from the group consisting of QGQSGS (SEQ ID NO: 246) , GQSGS (SEQ ID NO: 247) ; QSGS (SEQ ID NO: 248) ; SGS (SEQ ID NO: 249) ; GS (SEQ ID NO: 250) ; S; QGQSGQG (SEQ ID NO: 251) ; GQSGQG (SEQ ID NO: 252) ; QSGQG (SEQ ID NO: 253) ; SGQG (SEQ ID NO: 254) ; GQG (SEQ ID NO: 255) ; QG (SEQ ID NO: 256) ; G; QGQSGQ (SEQ ID NO: 257) ; GQSGQ (SEQ ID NO: 258) ; QSGQ (SEQ ID NO: 259) ; SGQ (SEQ ID NO: 260) ; GQ (SEQ ID NO: 261) ; and Q.

[0265] Exemplary mask peptides of the disclosure can have a length of up to 15 amino acids, a length of up to 20 amino acids, a length of up to 25 amino acids, a length of up to 30 amino acids, a length of up to 35 amino acids, a length of up to 40 amino acids, a length of up to 45 amino acids, a length of up to 50 amino acids, a length of up to 60 amino acids, a length in the range of 10-60 amino acids, a length in the range of 15-60 amino acids, a length in the range of 20-60 amino acids, a length in the range of 25-60 amino acids, a length in the range of 30-60 amino acids, a length in the range of 35-60 amino acids, a length in the range of 40-50 amino acids, a length in the range of 45-60 amino acids, a length in the range of 10-40 amino acids, a length in the range of 15-40 amino acids, a length in the range of 20-40 amino acids, a length in the range of 25-40 amino acids, a length in the range of 30-40 amino acids, a length in the range of 35-40 amino acids, a length in the range of 10-30 amino acids, a length in the range of 15-30 amino acids, a length in the range of 20-30 amino acids, a length in the range of 25-30 amino acids, a length in the range of 10-20 amino acids, a length in the range of 10-15 amino acids, or a length of 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 amino acids.

[0266] As provided herein, the mask peptide inhibits the binding of the AB to the target. The mask peptide binds to the antigen-binding domain of the AB and inhibits binding of the AB to the target. In some embodiments, the mask peptide can sterically inhibit the binding of the AB to the target. In some embodiments, the mask peptide can allosterically inhibit the binding of the AB to its target. In these embodiments when the AB is modified by or coupled to a mask peptide and in the presence of target, there is no binding or substantially no binding of the AB to the target, or no more than 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, or 50%binding of the AB to the target, as compared to the binding of the AB not modified by or coupled to a mask peptide, the parental AB, or the AB not coupled to a mask peptide to the target, for at least 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, or 96 hours, or 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, or 180 days, or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 months or longer when measured in vivo or in an in vitro assay.

[0267] When an AB is coupled to or modified with a mask peptide, the mask peptide "masks" or reduces or otherwise inhibits the specific binding of the AB to the target. When an AB is coupled to or modified by a mask peptide, such coupling or modification can lead to a structural change that reduces or inhibits the ability of the AB to specifically bind to its target.

[0268] Anti-CD3 Antibodies and Antigen-Binding Fragments

[0269] The disclosure provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind to CD3. The antibodies and antigen-binding fragments described herein are capable of binding to CD3 and can promote CD3-associated signaling pathways.

[0270] The amino acid sequences for heavy chain variable regions and light variable regions are also provided. Any of the heavy chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 62-81) can be paired with any of the light chain variable region sequences (SEQ ID NO: 82-107) . Any of the heavy chain variable region sequences shown in Table 7 can be paired with any of the light chain variable region sequences shown in Table 8.

[0271] In some embodiments, the antibodies can have a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR3 amino acid sequence, and a light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR3 amino acid sequence. The selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences and the selected VL CDRs, 1, 2, 3 amino acid sequences are shown in Tables 1-2 (Kabat CDR) , Tables 3-4 (Chothia CDR) and Table 5-6 (IMGT CDR) .

[0272] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment described herein comprises VH CDRs 1, 2, 3, and VL CDRs 1, 2, 3. In some embodiments, the VH CDRs 1, 2, 3 are any VH CDRs 1, 2, 3 shown in Table 1 (Kabat CDR) , Table 3 (Chothia CDR) or Table 5 (IMGT CDR) . In some embodiments, the VL CDRs 1, 2, 3 are any VL CDRs 1, 2, 3 shown in Table 2 (Kabat CDR) , Table 4 (Chothia CDR) or Table 6 (IMGT CDR) . The In some embodiments, the CDRs are defined by IMGT, Kabat, Chothia, Contact, or AbM definition.

[0273] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the VH CDR 1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VH CDR 2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VH CDR 3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions. The VH CDRs 1, 2, 3 can be selected from Table 1, Table 3, or Table 5.

[0274] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a light chain variable domain containing one, two, or three of the VL CDR 1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VL CDR 2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VL CDR3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions. The VL CDRs 1, 2, 3 can be selected from Table 2, Table 4, and Table 6.

[0275] The insertions, deletions, and substitutions can be within the CDR sequence, or at one or both terminal ends of the CDR sequence.

[0276] The disclosure also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to CD3. The antibodies or antigen-binding fragments thereof contain a heavy chain variable region (VH) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL sequence. In some embodiments, the selected VH sequence is any one of SEQ ID NOs: 62-81, and the selected VL sequence is any one of SEQ ID NOs: 82-107.

[0277] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For purposes of the present disclosure, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0278] The disclosure also provides nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy chain or an immunoglobulin light chain. The immunoglobulin heavy chain or immunoglobulin light chain comprises CDRs as shown in Tables 1-6, or have sequences as shown in Tables 7-8. When the polypeptides are paired with corresponding polypeptide (e.g., a corresponding heavy chain variable region or a corresponding light chain variable region) , the paired polypeptides bind to CD3 (e.g., human CD3) .

[0279] The anti-CD3 antibodies and antigen-binding fragments can also be antibody variants (including derivatives and conjugates) of antibodies or antibody fragments and multi-specific (e.g., bi-specific) antibodies or antibody fragments. Additional antibodies provided herein are polyclonal, monoclonal, multi-specific (multimeric, e.g., bi-specific) , human antibodies, chimeric antibodies (e.g., human-mouse chimera) , single-chain antibodies, intracellularly-made antibodies (i.e., intrabodies) , and antigen-binding fragments thereof. The antibodies or antigen-binding fragments thereof can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) , or subclass. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is an IgG antibody or antigen-binding fragment thereof.

[0280] Fragments of antibodies are suitable for use in the methods provided so long as they retain the desired affinity and specificity of the full-length antibody. Thus, a fragment of an antibody that binds to CD3 will retain an ability to bind to CD3. An Fv fragment is an antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy and one light chain variable domain in tight association, which can be covalent in nature, for example in scFv. It is in this configuration that the three CDRs of each variable domain interact to define an antigen-binding site on the surface of the VH-VL dimer. Collectively, the six CDRs or a subset thereof confer antigen-binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for an antigen) can have the ability to recognize and bind antigen, although usually at a lower affinity than the entire binding site.

[0281] Single-chain Fv or (scFv) antibody fragments comprise the VH and VL domains (or regions) of antibody, wherein these domains are present in a single polypeptide chain. Generally, the scFv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains, which enables the scFv to form the desired structure for antigen binding. In some embodiments, the linker described herein is a flexible linker (e.g., a GS linker) . Details of flexible linkers can be found, e.g., in Chen, X. et al. "Fusion protein linkers: property, design and functionality. " Advanced Drug Delivery Reviews 65.10 (2013) : 1357-1369, which is incorporated herein by reference in its entirety. In some embodiments, the polypeptide linker between the VH and VL domains is SEQ ID NO: 243 (GGGGSGGGGS) . In some embodiments, the polypeptide linker between the VH and VL domains is SEQ ID NO: 244 (GGGGSGGGGSGGGGS) .

[0282] The Fab fragment contains a variable and constant domain of the light chain and a variable domain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. F (ab') 2 antibody fragments comprise a pair of Fab fragments which are generally covalently linked near their carboxy termini by hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known in the art.

[0283] Multimerization of antibodies may be accomplished through natural aggregation of antibodies or through chemical or recombinant linking techniques known in the art. For example, some percentage of purified antibody preparations (e.g., purified IgG1 molecules) spontaneously form protein aggregates containing antibody homodimers and other higher-order antibody multimers.

[0284] Alternatively, antibody homodimers may be formed through chemical linkage techniques known in the art. For example, heterobifunctional crosslinking agents including, but not limited to SMCC (succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate) and SATA (N-succinimidyl S-acethylthio-acetate) can be used to form antibody multimers. An exemplary protocol for the formation of antibody homodimers is described in Ghetie et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 7509-7514, 1997) . Antibody homodimers can be converted to Fab’2 homodimers through digestion with pepsin. Another way to form antibody homodimers is through the use of the autophilic T15 peptide described in Zhao et al. (J. Immunol. 25: 396-404, 2002) .

[0285] In some embodiments, the multi-specific antibody is a bi-specific antibody. Bi-specific antibodies can be made by engineering the interface between a pair of antibody molecules to maximize the percentage of heterodimers that are recovered from recombinant cell culture. For example, the interface can contain at least a part of the CH3 domain of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (e.g., tyrosine or tryptophan) . Compensatory “cavities” of identical or similar size to the large side chain (s) are created on the interface of the second antibody molecule by replacing large amino acid side chains with smaller ones (e.g., alanine or threonine) . This provides a mechanism for increasing the yield of the heterodimer over other unwanted end-products such as homodimers. This method is described, e.g., in WO 96 / 27011, which is incorporated by reference in its entirety.

[0286] Bi-specific antibodies include cross-linked or “heteroconjugate” antibodies. For example, one of the antibodies in the heteroconjugate can be coupled to avidin and the other to biotin. Heteroconjugate antibodies can also be made using any convenient cross-linking methods. Suitable cross-linking agents and cross-linking techniques are well known in the art and are disclosed in U.S. Patent No. 4,676,980, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0287] Methods for generating bi-specific antibodies from antibody fragments are also known in the art. For example, bi-specific antibodies can be prepared using chemical linkage. Brennan et al. (Science 229: 81, 1985) describes a procedure where intact antibodies are proteolytically cleaved to generate F (ab’) 2 fragments. These fragments are reduced in the presence of the dithiol complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. The Fab’ fragments generated are then converted to thionitrobenzoate (TNB) derivatives. One of the Fab’ TNB derivatives is then reconverted to the Fab’ thiol by reduction with mercaptoethylamine, and is mixed with an equimolar amount of another Fab’ TNB derivative to form the bi-specific antibody.

[0288] Any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein may be conjugated to a stabilizing molecule (e.g., a molecule that increases the half-life of the antibody or antigen-binding fragment thereof in a subject or in solution) . Non-limiting examples of stabilizing molecules include: a polymer (e.g., a polyethylene glycol) or a protein (e.g., serum albumin, such as human serum albumin) . The conjugation of a stabilizing molecule can increase the half-life or extend the biological activity of an antibody or an antigen-binding fragment in vitro (e.g., in tissue culture or when stored as a pharmaceutical composition) or in vivo (e.g., in a human) .

[0289] In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be conjugated to a therapeutic agent. The antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof can covalently or non-covalently bind to a therapeutic agent. In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent (e.g., cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxy anthracin, maytansinoids such as DM-1 and DM-4, dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, epirubicin, and cyclophosphamide and analogs) .

[0290] Anti-EGFR Antibodies and Antigen-Binding Fragments

[0291] The disclosure provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind to EGFR. The antibodies and antigen-binding fragments described herein are capable of binding to EGFR and can promote EGFR-associated signaling pathways.

[0292] The amino acid sequences for heavy chain variable regions and light variable regions are also provided. Any of the heavy chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 182-192) can be paired with any of the light chain variable region sequences (SEQ ID NO: 193-200) . Any of the heavy chain variable region sequences shown in Table 18 can be paired with any of the light chain variable region sequences shown in Table 19.

[0293] In some embodiments, the antibodies can have a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH CDR3 amino acid sequence, and a light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL CDR3 amino acid sequence. The selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences and the selected VL CDRs, 1, 2, 3 amino acid sequences are shown in Tables 12-13 (Kabat CDR) , Tables 14-15 (Chothia CDR) or Table 16-17 (IMGT CDR) .

[0294] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment described herein comprises VH CDRs 1, 2, 3, and VL CDRs 1, 2, 3. In some embodiments, the VH CDRs 1, 2, 3 are any VH CDRs 1, 2, 3 shown in Table 12 (Kabat CDR) , Table 14 (Chothia CDR) , or Table 16 (IMGT CDR) . In some embodiments, the VL CDRs 1, 2, 3 are any VL CDRs 1, 2, 3 shown in Table 13 (Kabat CDR) , Table 15 (Chothia CDR) , or Table 17 (IMGT CDR) . In some embodiments, the CDRs are defined by IMGT, Kabat, Chothia, Contact, or AbM definition.

[0295] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the VH CDR 1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VH CDR 2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VH CDR 3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions. The VH CDRs 1, 2, 3 can be selected from Table 12, Table 14 and Table 16.

[0296] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a light chain variable domain containing one, two, or three of the VL CDR 1 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VL CDR 2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; VL CDR3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions. The VL CDRs 1, 2, 3 can be selected from Table 13, Table 15 and Table 17.

[0297] The insertions, deletions, and substitutions can be within the CDR sequence, or at one or both terminal ends of the CDR sequence.

[0298] The disclosure also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to EGFR. The antibodies or antigen-binding fragments thereof contain a heavy chain variable region (VH) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95%identical to a selected VL sequence. In some embodiments, the selected VH sequence is any one of SEQ ID NOs: 182-192, and the selected VL sequence is any one of SEQ ID NOs: 193-200.

[0299] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For purposes of the present disclosure, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0300] The disclosure also provides nucleic acid comprising a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy chain or an immunoglobulin light chain. The immunoglobulin heavy chain or immunoglobulin light chain comprises CDRs as shown in Tables 12-17, or have sequences as shown in Tables 18-19. When the polypeptides are paired with corresponding polypeptide (e.g., a corresponding heavy chain variable region or a corresponding light chain variable region) , the paired polypeptides bind to EGFR.

[0301] The anti-EGFR antibodies and antigen-binding fragments can also be antibody variants (including derivatives and conjugates) of antibodies or antibody fragments and multi-specific (e.g., bi-specific) antibodies or antibody fragments. Additional antibodies provided herein are polyclonal, monoclonal, multi-specific (multimeric, e.g., bi-specific) , human antibodies, chimeric antibodies (e.g., human-mouse chimera) , single-chain antibodies, intracellularly-made antibodies (i.e., intrabodies) , and antigen-binding fragments thereof. The antibodies or antigen-binding fragments thereof can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) , or subclass. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is an IgG antibody or antigen-binding fragment thereof.

[0302] Fragments of antibodies are suitable for use in the methods provided so long as they retain the desired affinity and specificity of the full-length antibody. Thus, a fragment of an antibody that binds to EGFR will retain an ability to bind to EGFR. An Fv fragment is an antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy and one light chain variable domain in tight association, which can be covalent in nature, for example in scFv. It is in this configuration that the three CDRs of each variable domain interact to define an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer. Collectively, the six CDRs or a subset thereof confer antigen binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for an antigen) can have the ability to recognize and bind antigen, although usually at a lower affinity than the entire binding site.

[0303] Single-chain Fv or (scFv) antibody fragments comprise the VH and VL domains (or regions) of antibody, wherein these domains are present in a single polypeptide chain. Generally, the scFv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains, which enables the scFv to form the desired structure for antigen binding. In some embodiments, the linker described herein is a flexible linker (e.g., a GS linker) . Details of flexible linkers can be found, e.g., in Chen, X. et al. "Fusion protein linkers: property, design and functionality. " Advanced Drug Delivery Reviews 65.10 (2013) : 1357-1369, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0304] The Fab fragment contains a variable and constant domain of the light chain and a variable domain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. F (ab') 2 antibody fragments comprise a pair of Fab fragments which are generally covalently linked near their carboxy termini by hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known in the art. In some embodiments, the first chain of the Fab comprises a heavy chain variable region (VH) and a CH1 domain and the second chain of the Fab comprises a light chain variable region (VL) and a CL domain. In some embodiments, the first chain of the Fab comprises a VL and a CL domain and the second chain of the Fab comprises a VH and a CH1 domain. In some embodiments, the first chain of the Fab comprises a VH and a CL domain and the second chain of the Fab comprises a VL and a CH1 domain. In some embodiments, the first chain of the Fab comprises a VL and a CH1 domain and the second chain of the Fab comprises a VH and a CL domain. In some embodiments, the first chain of the Fab have the sequences as shown in Tables 22; the second chain of the Fab have the sequences as shown in Tables 23. In some embodiments, any of the first chain of the anti-EGFR Fab sequences shown in Table 22 can be paired with any of the second chain of the anti-EGFR Fab shown in Table 23.

[0305] Table 22 The first chain of the anti-EGFR Fab

[0306] Table 23 The second chain of the anti-EGFR Fab

[0307] Diabodies are small antibody fragments with two antigen-binding sites, which fragments comprise a VH connected to a VL in the same polypeptide chain (VH and VL) . By using a linker that is too short to allow pairing between the two domains on the same chain, the domains are forced to pair with the complementary domains of another chain and create two antigen-binding sites.

[0308] Linear antibodies comprise a pair of tandem Fd segments (VH-CH1-VH-CH1) which, together with complementary light chain polypeptides, form a pair of antigen binding regions. Linear antibodies can be bispecific or monospecific.

[0309] Antibodies and antibody fragments of the present disclosure can be modified in the Fc region to provide desired effector functions or serum half-life.

[0310] Multimerization of antibodies may be accomplished through natural aggregation of antibodies or through chemical or recombinant linking techniques known in the art. For example, some percentage of purified antibody preparations (e.g., purified IgG1 molecules) spontaneously form protein aggregates containing antibody homodimers and other higher-order antibody multimers.

[0311] Alternatively, antibody homodimers may be formed through chemical linkage techniques known in the art. For example, heterobifunctional crosslinking agents including, but not limited to SMCC (succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate) and SATA (N-succinimidyl S-acethylthio-acetate) can be used to form antibody multimers. An exemplary protocol for the formation of antibody homodimers is described in Ghetie et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 7509-7514, 1997) . Antibody homodimers can be converted to Fab’2 homodimers through digestion with pepsin. Another way to form antibody homodimers is through the use of the autophilic T15 peptide described in Zhao et al. (J. Immunol. 25: 396-404, 2002) .

[0312] In some embodiments, the multi-specific antibody is a bi-specific antibody. Bi-specific antibodies can be made by engineering the interface between a pair of antibody molecules to maximize the percentage of heterodimers that are recovered from recombinant cell culture. For example, the interface can contain at least a part of the CH3 domain of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (e.g., tyrosine or tryptophan) . Compensatory “cavities” of identical or similar size to the large side chain (s) are created on the interface of the second antibody molecule by replacing large amino acid side chains with smaller ones (e.g., alanine or threonine) . This provides a mechanism for increasing the yield of the heterodimer over other unwanted end-products such as homodimers. This method is described, e.g., in WO 96 / 27011, which is incorporated by reference in its entirety.

[0313] Bi-specific antibodies include cross-linked or “heteroconjugate” antibodies. For example, one of the antibodies in the heteroconjugate can be coupled to avidin and the other to biotin. Heteroconjugate antibodies can also be made using any convenient cross-linking methods. Suitable cross-linking agents and cross-linking techniques are well known in the art and are disclosed in U.S. Patent No. 4,676,980, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0314] Methods for generating bi-specific antibodies from antibody fragments are also known in the art. For example, bi-specific antibodies can be prepared using chemical linkage. Brennan et al. (Science 229: 81, 1985) describes a procedure where intact antibodies are proteolytically cleaved to generate F (ab’) 2 fragments. These fragments are reduced in the presence of the dithiol complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. The Fab’ fragments generated are then converted to thionitrobenzoate (TNB) derivatives. One of the Fab’ TNB derivatives is then reconverted to the Fab’ thiol by reduction with mercaptoethylamine, and is mixed with an equimolar amount of another Fab’ TNB derivative to form the bi-specific antibody.

[0315] Any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein may be conjugated to a stabilizing molecule (e.g., a molecule that increases the half-life of the antibody or antigen-binding fragment thereof in a subject or in solution) . Non-limiting examples of stabilizing molecules include: a polymer (e.g., a polyethylene glycol) or a protein (e.g., serum albumin, such as human serum albumin) . The conjugation of a stabilizing molecule can increase the half-life or extend the biological activity of an antibody or an antigen-binding fragment in vitro (e.g., in tissue culture or when stored as a pharmaceutical composition) or in vivo (e.g., in a human) .

[0316] In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be conjugated to a therapeutic agent. The antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof can covalently or non-covalently bind to a therapeutic agent. In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent (e.g., cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxy anthracin, maytansinoids such as DM-1 and DM-4, dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, epirubicin, and cyclophosphamide and analogs) .

[0317] Antibodies and antigen binding proteins

[0318] In general, wildtype antibodies (also called immunoglobulins) are made up of two classes of polypeptide chains, light chains and heavy chains. A non-limiting antibody of the present disclosure can be an intact, four immunoglobulin chain antibody comprising two heavy chains and two light chains. The heavy chain of the antibody can be of any isotype including IgM, IgG, IgE, IgA, or IgD or sub-isotype including IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2, etc. The light chain can be a kappa light chain or a lambda light chain. An antibody can comprise two identical copies of a light chain and / or two identical copies of a heavy chain. The heavy chains, which each contain one variable domain (or variable region, VH) and multiple constant domains (or constant regions) , bind to one another via disulfide bonding within their constant domains to form the “stem” of the antibody. The light chains, which each contain one variable domain (or variable region, VL) and one constant domain (or constant region) , each bind to one heavy chain via disulfide binding. The variable region of each light chain is aligned with the variable region of the heavy chain to which it is bound. The variable regions of both the light chains and heavy chains contain three hypervariable regions sandwiched between more conserved framework regions (FR) .

[0319] These hypervariable regions, known as the complementary determining regions (CDRs) , form loops that comprise the principle antigen binding surface of the antibody. The four framework regions largely adopt a beta-sheet conformation and the CDRs form loops connecting, and in some cases forming part of, the beta-sheet structure. The CDRs in each chain are held in close proximity by the framework regions and, with the CDRs from the other chain, contribute to the formation of the antigen binding region.

[0320] Methods for identifying the CDR regions of an antibody by analyzing the amino acid sequence of the antibody are well known, and a number of definitions of the CDRs are commonly used. The Kabat definition is based on sequence variability, and the Chothia definition is based on the location of the structural loop regions. These methods and definitions are described in, e.g., Martin, “Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains, ” Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. “Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains, ” Molecular immunology 45.14 (2008) : 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203: 121-53 (1991) ; Morea et al., Biophys Chem. 68 (1-3) : 9-16 (Oct. 1997) ; Morea et al., J Mol Biol. 275 (2) : 269-94 (Jan . 1998) ; Chothia et al., Nature 342 (6252) : 877-83 (Dec. 1989) ; Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7: 64 (2007) ; Kontermann, R., &Dübel, S. (Eds. ) . (2010) . Antibody engineering: Volume 2. Springer; each of which is incorporated herein by reference in its entirety. In some embodiments, the CDRs are based on Kabat definition. In some embodiments, the CDRs are based on the Chothia definition. In some embodiments, the CDRs are the longest CDR sequences as determined by Kabat, Chothia, AbM, IMGT, or contact definitions.

[0321] The CDRs are important for recognizing an epitope of an antigen. As used herein, an “epitope” is the smallest portion of a target molecule capable of being specifically bound by the antigen binding domain of an antibody. The minimal size of an epitope may be about three, four, five, six, or seven amino acids, but these amino acids need not be in a consecutive linear sequence of the antigen’s primary structure, as the epitope may depend on an antigen’s three-dimensional configuration based on the antigen’s secondary and tertiary structure.

[0322] In some embodiments, the antibody or antigen binding protein can include an intact immunoglobulin molecule (e.g., IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA) or fragments thereof. The IgG subclasses (IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) are highly conserved, differ in their constant region, particularly in their hinges and upper CH2 domains. The sequences and differences of the IgG subclasses are known in the art, and are described, e.g., in Vidarsson, et al, “IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. ” Frontiers in immunology 5 (2014) ; Irani, et al. “Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases. ” Molecular immunology 67.2 (2015) : 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0323] The antibody or antigen binding protein can also be an immunoglobulin molecule that is derived from any species (e.g., human, rodent, mouse, rat, camelid) . Antibodies disclosed herein also include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, monospecific, multispecific antibodies, and chimeric antibodies that include an immunoglobulin binding domain fused to another polypeptide. The term “antigen binding domain” or “antigen binding fragment” is a portion of an antibody that retains specific binding activity of the intact antibody, i.e., any portion of an antibody that is capable of specific binding to an epitope on the intact antibody’s target molecule. It includes, e.g., Fab, Fab', F (ab') 2, and variants of these fragments. Thus, in some embodiments, an antibody or an antigen binding fragment thereof can be, e.g., a scFv, a Fv, a Fd, a dAb, a bispecific antibody, a trispecific antibody, a bispecific scFv, a diabody, a linear antibody, a single-chain antibody molecule, a multi-specific antibody formed from antibody fragments, and any polypeptide that includes a binding domain which is, or is homologous to, an antibody binding domain. Non-limiting examples of antigen binding domains include, e.g., the heavy chain and / or light chain CDRs of an intact antibody, the heavy and / or light chain variable regions of an intact antibody, full length heavy or light chains of an intact antibody, or an individual CDR from either the heavy chain or the light chain of an intact antibody.

[0324] In some embodiments, the antibodies or antigen binding proteins thereof can bind to two different antigens or two different epitopes. In some embodiments, the antibodies or antigen binding proteins thereof can bind to three different antigens or three different epitopes.

[0325] The Fab fragment contains a variable and constant domain of the light chain and a variable domain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. F (ab') 2 antibody fragments comprise a pair of Fab fragments which are generally covalently linked near their carboxy termini by hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known in the art.

[0326] In some embodiments, the Fc region can be further modified to increase or decrease effector functions as well as serum half-life.

[0327] Any of the antibodies, antigen binding fragments, or antigen binding proteins described herein can be conjugated to a stabilizing molecule (e.g., a molecule that increases the half-life of the antibody or antigen binding fragment thereof in a subject or in solution) . Non-limiting examples of stabilizing molecules include: a polymer (e.g., a polyethylene glycol) or a protein (e.g., serum albumin, such as human serum albumin) . The conjugation of a stabilizing molecule can increase the half-life or extend the biological activity of the antibodies, antigen binding fragments thereof, or antigen binding proteins in vitro (e.g., in tissue culture or when stored as a pharmaceutical composition) or in vivo (e.g., in a human) .

[0328] In some embodiments, the antibodies, antigen binding fragments thereof, or antigen binding proteins (e.g., multispecific antibodies) described herein can be conjugated to a therapeutic agent. The antibody-drug conjugate comprising the antibodies, antigen binding fragments thereof, or antigen binding proteins can covalently or non-covalently bind to a therapeutic agent. In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent (e.g., cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxy anthracin, maytansinoids such as DM-1 and DM-4, dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, epirubicin, and cyclophosphamide and analogs) .

[0329] Recombinant Vectors

[0330] The present disclosure also provides recombinant vectors (e.g., an expression vectors) that include an isolated polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) , host cells into which are introduced the recombinant vectors (i.e., such that the host cells contain the polynucleotide and / or a vector comprising the polynucleotide) , and the production of recombinant antibody polypeptides or fragments thereof or the antigen binding protein constructs by recombinant techniques.

[0331] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more polynucleotide (s) of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more polynucleotide (s) of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-A tail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector.

[0332] A vector can be introduced into the host cell by methods known in the art, e.g., electroporation, chemical transfection (e.g., DEAE-dextran) , transformation, transfection, and infection and / or transduction (e.g., with recombinant virus) . Thus, non-limiting examples of vectors include viral vectors (which can be used to generate recombinant virus) , naked DNA or RNA, plasmids, cosmids, phage vectors, and DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents.

[0333] In some implementations, a polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) is introduced using a viral expression system (e.g., vaccinia or other pox virus, retrovirus, or adenovirus) , which may involve the use of a non-pathogenic (defective) , replication competent virus, or may use a replication defective virus. In the latter case, viral propagation generally will occur only in complementing virus packaging cells.

[0334] For expression, the DNA insert comprising an antibody-encoding or polypeptide-encoding polynucleotide disclosed herein can be operatively linked to an appropriate promoter (e.g., a heterologous promoter) , such as the phage lambda PL promoter, the E. coli lac, trp and tac promoters, the SV40 early and late promoters and promoters of retroviral LTRs, to name a few. Other suitable promoters are known to the skilled artisan. The expression constructs can further contain sites for transcription initiation, termination and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the mature transcripts expressed by the constructs may include a translation initiating at the beginning and a termination codon (UAA, UGA, or UAG) appropriately positioned at the end of the polypeptide to be translated.

[0335] Representative examples of appropriate hosts include, but are not limited to, bacterial cells, such as E. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium cells; fungal cells, such as yeast cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells such as CHO, COS, Bowes melanoma, and HEK293 cells; and plant cells. Appropriate culture mediums and conditions for the host cells described herein are known in the art.

[0336] Introduction of the construct into the host cell can be effected by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals, such as Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) , which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0337] For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space or into the extracellular environment, appropriate secretion signals may be incorporated into the expressed polypeptide. The signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous signals.

[0338] The polypeptide (e.g., antibody) can be expressed in a modified form, such as a fusion protein (e.g., a GST-fusion) or with a histidine-tag, and may include not only secretion signals, but also additional heterologous functional regions. For instance, a region of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be added to the N-terminus of the polypeptide to improve stability and persistence in the host cell, during purification, or during subsequent handling and storage. Also, peptide moieties can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. The addition of peptide moieties to polypeptides to engender secretion or excretion, to improve stability and to facilitate purification, among others, are familiar and routine techniques in the art.

[0339] Methods of Treatment

[0340] The methods described herein include methods for the treatment of disorders associated with cancer. Generally, the methods include administering a therapeutically effective amount of multispecific antigen binding proteins as described herein, to a subject who is in need of, or who has been determined to be in need of, such treatment.

[0341] As used in this context, to “treat” means to ameliorate at least one symptom of the disorder associated with cancer. Often, cancer results in death; thus, a treatment can result in an increased life expectancy (e.g., by at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 months, or by at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 years) . Administration of a therapeutically effective amount of an agent described herein (e.g., antigen binding proteins) for the treatment of a condition associated with cancer will result in decreased number of cancer cells and / or alleviated symptoms.

[0342] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for autonomous growth, i.e., an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth.

[0343] The term is meant to include all types of cancerous growths or oncogenic processes, metastatic tissues or malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. The term “tumor” as used herein refers to cancerous cells, e.g., a mass of cancerous cells. Cancers that can be treated or diagnosed using the methods described herein include malignancies of the various organ systems, such as affecting lung, breast, thyroid, lymphoid, gastrointestinal, and genito-urinary tract, as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, non-small cell carcinoma of the lung, cancer of the small intestine and cancer of the esophagus. In some embodiments, the agents described herein are designed for treating or diagnosing a carcinoma in a subject. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues including respiratory system carcinomas, gastrointestinal system carcinomas, genitourinary system carcinomas, testicular carcinomas, breast carcinomas, prostatic carcinomas, endocrine system carcinomas, and melanomas. In some embodiments, the cancer is renal carcinoma or melanoma. Exemplary carcinomas include those forming from tissue of the cervix, lung, prostate, breast, head and neck, colon and ovary. The term also includes carcinosarcomas, e.g., which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation.

[0344] In one aspect, the disclosure also provides methods for treating a cancer in a subject, methods of reducing the rate of the increase of volume of a tumor in a subject over time, methods of reducing the risk of developing a metastasis, or methods of reducing the risk of developing an additional metastasis in a subject. In some embodiments, the treatment can halt, slow, retard, or inhibit progression of a cancer. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of in the number, severity, and / or duration of one or more symptoms of the cancer in a subject.

[0345] In one aspect, the disclosure features methods that include administering a therapeutically effective amount of an antibody or antigen binding fragment thereof, antigen binding proteins, or an antibody drug conjugate disclosed herein to a subject in need thereof, e.g., a subject having, or identified or diagnosed as having, a cancer, e.g., breast cancer (e.g., triple-negative breast cancer) , carcinoid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, renal cancer, colorectal cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, urethral cancer, or hematologic malignancy.

[0346] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present invention is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated by the present invention. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0347] In some embodiments, the cancer is a cancer expressing CAIX.

[0348] In some embodiments, the cancer is a cancer expressing EGFR.

[0349] In some embodiments, the cancer is a cancer expressing EGFR and CAIX.

[0350] In some embodiments, the cancers are lung cancers, colorectal cancer, head and neck cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, urothelial cancer, breast cancer, cervical cancer, or endometrial cancer.

[0351] In some embodiments, the cancer cells have an elevated CAIX level, e.g., at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%higher than non-cancerous cells. In some embodiments, the cancer cells have an elevated EGFR level, e.g., at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%higher than non-cancerous cells.

[0352] In some embodiments, the compositions and methods disclosed herein can be used for treatment of patients at risk for a cancer. Patients with cancer can be identified with various methods known in the art.

[0353] As used herein, by an “effective amount” is meant an amount or dosage sufficient to effect beneficial or desired results including halting, slowing, retarding, or inhibiting progression of a disease, e.g., a cancer. An effective amount will vary depending upon, e.g., an age and a body weight of a subject to which the antibody, antigen binding fragment, antigen binding protein c, antibody-drug conjugates, antibody-encoding polynucleotide, vector comprising the polynucleotide, and / or compositions thereof is to be administered, a severity of symptoms and a route of administration, and thus administration can be determined on an individual basis.

[0354] An effective amount can be administered in one or more administrations. By way of example, an effective amount of an antibody, an antigen binding fragment, an antigen binding protein, or an antibody-drug conjugate is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, inhibit, slow and / or delay progression of a cancer in a patient or is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, slow and / or delay proliferation of a cell (e.g., a biopsied cell, any of the cancer cells described herein, or cell line (e.g., a cancer cell line) ) in vitro. As is understood in the art, an effective amount may vary, depending on, inter alia, patient history as well as other factors such as the type (and / or dosage) of the agent used.

[0355] Effective amounts and schedules for administering the antibodies, antigen binding proteins, antibody-encoding polynucleotides, antibody-drug conjugates, and / or compositions disclosed herein may be determined empirically, and making such determinations is within the skill in the art.

[0356] A typical dosage of an effective amount of an antibody or antigen binding protein is 0.01 μg / kg to 100 mg / kg. In some embodiments, the dosage is 0.01 μg / kg to 10 mg / kg. In some embodiments, the dosage is 0.1 μg / kg to 1 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be less than 100 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be greater than 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, 0.1 mg / kg, 0.05 mg / kg, or 0.01 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.9 mg / kg, 0.8 mg / kg, 0.7 mg / kg, 0.6 mg / kg, 0.5 mg / kg, 0.4 mg / kg, 0.3 mg / kg, 0.2 mg / kg, or 0.1 mg / kg.

[0357] In any of the methods described herein, the at least one antibody, antigen binding fragment thereof, antigen binding proteins, antibody-drug conjugates, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen binding proteins, antigen binding protein constructs, antibody-drug conjugates, or pharmaceutical compositions described herein) and, optionally, at least one additional therapeutic agent can be administered to the subject at least once a week (e.g., once a week, twice a week, three times a week, four times a week, once a day, twice a day, or three times a day) .

[0358] Pharmaceutical Compositions and Routes of Administration

[0359] Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) . The compositions can include a sterile diluent (e.g., sterile water or saline) , a fixed oil, polyethylene glycol, glycerine, propylene glycol or other synthetic solvents, antibacterial or antifungal agents, such as benzyl alcohol or methyl parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like, antioxidants, such as ascorbic acid or sodium bisulfite, chelating agents, such as ethylenediaminetetraacetic acid, buffers, such as acetates, citrates, or phosphates, and isotonic agents, such as sugars (e.g., dextrose) , polyalcohols (e.g., mannitol or sorbitol) , or salts (e.g., sodium chloride) , or any combination thereof. Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers (see, e.g., U.S. Patent No. 4,522,811) . Preparations of the compositions can be formulated and enclosed in ampules, disposable syringes, or multiple dose vials. Where required (as in, for example, injectable formulations) , proper fluidity can be maintained by, for example, the use of a coating, such as lecithin, or a surfactant. Absorption of the antibody, antigen binding fragment thereof, or the antigen binding protein can be prolonged by including an agent that delays absorption (e.g., aluminum monostearate and gelatin) . Alternatively, controlled release can be achieved by implants and microencapsulated delivery systems, which can include biodegradable, biocompatible polymers (e.g., ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid; Alza Corporation and Nova Pharmaceutical, Inc. ) .

[0360] Compositions containing one or more of any of the antibodies, antigen binding proteins, antibody-drug conjugates described herein can be formulated for parenteral (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in dosage unit form (i.e., physically discrete units containing a predetermined quantity of active compound for ease of administration and uniformity of dosage) .

[0361] Toxicity and therapeutic efficacy of compositions can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals (e.g., monkeys) . One can determine the LD50 (the dose lethal to 50%of the population) and the ED50 (the dose therapeutically effective in 50%of the population) : the therapeutic index being the ratio of LD50: ED50. Agents that exhibit high therapeutic indices are preferred. Where an agent exhibits an undesirable side effect, care should be taken to minimize potential damage (i.e., reduce unwanted side effects) . Toxicity and therapeutic efficacy can be determined by other standard pharmaceutical procedures.

[0362] Data obtained from cell culture assays and animal studies can be used in formulating an appropriate dosage of any given agent for use in a subject (e.g., a human) . A therapeutically effective amount of the one or more (e.g., one, two, three, or four) antibodies, antigen binding proteins, or antigen binding protein constructs (e.g., any of the antibodies, antibody fragments, or antigen binding proteins described herein) will be an amount that treats the disease in a subject (e.g., kills cancer cells ) in a subject (e.g., a human subject identified as having cancer) , or a subject identified as being at risk of developing the disease (e.g., a subject who has previously developed cancer but now has been cured) , decreases the severity, frequency, and / or duration of one or more symptoms of a disease in a subject (e.g., a human) . The effectiveness and dosing of any of the antibodies, antigen binding proteins, or antigen binding protein constructs described herein can be determined by a health care professional or veterinary professional using methods known in the art, as well as by the observation of one or more symptoms of disease in a subject (e.g., a human) . Certain factors may influence the dosage and timing required to effectively treat a subject (e.g., the severity of the disease or disorder, previous treatments, the general health and / or age of the subject, and the presence of other diseases) .

[0363] Exemplary doses include milligram or microgram amounts of any of the antibodies or antigen binding proteins, antigen binding protein constructs, or antibody-drug conjugates described herein per kilogram of the subject’s weight (e.g., about 1 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 50 mg / kg; about 10 μg / kg to about 5 mg / kg; about 10 μg / kg to about 0.5 mg / kg; or about 1 μg / kg to about 50 μg / kg) . While these doses cover a broad range, one of ordinary skill in the art will understand that therapeutic agents, including antibodies and antigen binding proteins, vary in their potency, and effective amounts can be determined by methods known in the art. Typically, relatively low doses are administered at first, and the attending health care professional or veterinary professional (in the case of therapeutic application) or a researcher (when still working at the development stage) can subsequently and gradually increase the dose until an appropriate response is obtained. In addition, it is understood that the specific dose level for any particular subject will depend upon a variety of factors including the activity of the specific compound employed, the age, body weight, general health, gender, and diet of the subject, the time of administration, the route of administration, the rate of excretion, and the half-life of the antibody, antibody fragment, or antigen binding proteins in vivo.

[0364] The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration. The disclosure also provides methods of manufacturing the antibodies, antigen binding proteins, or antigen binding protein constructs for various uses as described herein.

[0365] EXAMPLES

[0366] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0367] Unless otherwise stated, temperatures are in degrees Celsius, and pressures are atmospheric or near atmospheric. Standard abbreviations may be used, such as bp for base pairs; kb for kilobase pairs; pL for picoliters; s or sec for seconds; min for minutes; h or hr for hours; aa for amino acids; nt for nucleotides; i. m. for intramuscular, etc.

[0368] Materials and Methods

[0369] DNA Sequencing and synthesis

[0370] The DNA sequence was determined by double-stranded DNA sequencing, and the sequencing was performed by GENEWIZ (Suzhou Jinweizhi Biotechnology Co., Ltd. ) .

[0371] Isolation of human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) .

[0372] Density gradient centrifugation was used to prepare PBMCs. Blood samples were obtained from a blood bank or healthy donors. The blood samples were stored in EDTA-containing anticoagulant tubes for 10 minutes. An equal volume of PBS solution containing 2%FBS (pH 7.4) was added and mixed well. 15 mL of Ficoll Paque PLUS density gradient medium (GE) was added to a 50 mL Falcon tube, and 30 mL of diluted fresh blood from the anticoagulant tube was gently added (along the tube wall) onto the density gradient medium in the Falcon tube. The centrifuge was set to brake-off mode. The tube was gently placed in the centrifuge, and centrifuged at 1450 rpm at room temperature for 45 minutes. The tube was carefully removed. The tube contained three layers: the upper serum layer, the middle white layer of PBMCs, and the bottom red blood cell layer. The upper yellow transparent serum layer was discarded and the middle layer was carefully transferred to a new 15 mL centrifuge tube. An equal volume of gradient medium was added and the tube was centrifuged at 1450 rpm at room temperature for 30 minutes. The upper supernatant was discarded and the cell pellet at the bottom was collected. The cells were resuspended and washed three times until the supernatant is clear. 1 mL of 2%FBS-PBS buffer was used to resuspend the cells. After counting the PBMCs, the cells were resuspended in RPMI 1640 medium containing 10%FBS (GIBCO) and 1%L-glutamine (GIBCO) , and cultured in a CO2 incubator at 37℃ with 5%CO2.

[0373] Example 1: Preparation of Masked CD3 / EGFR Bispecific Antibody with Different Structures Containing Cytokine IL-2

[0374] Based on the murine CD3 antibody SP-34, humanized CD3 antibodies were obtained through mutation, library construction, humanization modification, and multiple screenings. Similarly, based on the murine EGFR antibody 7906, humanized EGFR antibodies were obtained through mutation, library construction, humanization modification, and multiple screenings.

[0375] Based on FIG. 29, the structure of the bispecific antibody EGFR-BsAb based on CD3-ScFv (monovalent) and EGFR-Fab (monovalent) was designed. In FIG. 29, “Anti-EGFR Fab” represents any one of the anti-EGFR Fabs described herein, including the anti-EGFR Fabs (from 305-Ab1 to 305-Ab17) in Tables 22-23; “Anti-CD3 ScFv” represents any one of the anti-CD3 scFvs described herein, including the anti-CD3 scFvs (from 153-Ab1 to 153-Ab36) in Tables 7-9.

[0376] CD3-ScFv is located at the N-terminus of EGFR-VH, and EGFR-VL is located at the N-terminus of the light chian constant region CL. A cleavable polypeptide is used as a linker to tether a CD3 mask to the N-terminus of CD3 ScFv. Another cleavable polypeptide is used as a linker to tether a EGFR mask to the N-terminus of EGFR-VL. The cytokine IL-2 is placed at either the N-terminus or C-terminus of the heavy chain of the EGFR-Fab. When the cytokine IL-2 is at the N-terminus of the heavy chain, the full-length structure from N-terminus to C-terminus is:anti-HSA VHH + cytokine IL-2 + CD3 mask + linker + CD3 ScFv + 7906-VH + CH1. When the cytokine IL-2 is at the C-terminus of the heavy chain, the full-length structure from N-terminus to C-terminus is: anti-HSA VHH + CD3 mask + linker+ CD3 ScFv + 7906-VH + CH1 + cytokine IL-2. The structural diagram is shown in FIG. 29. In the implementation, CD3-ScFv represents the ScFv of an anti-CD3 antibody. The CD3-ScFv is connected to EGFR-VH-CH1, and EGFR-VL is connected to CL (kappa) . The light chain is a common kappa light chain, and CH1 is derived from IgG4.

[0377] The CD3-scFv sequence can be selected from any one of the anti-CD3 antibodies and antigen binding fragments thereof described herein, including those described in Tables 1-9 (from 153-Ab1 to 153-Ab36) .

[0378] The EGFR-Fab sequence can be selected from any one of the anti-EGFR antibodies and antigen binding fragments thereof described herein, including those described in Tables 12-20 or Tables 22-23 (from 305Ab-1 to 305Ab-17) .

[0379] In some embodiments, the bispecific antibodies adopt the above-mentioned design based on the EGFR-Fab framework (FIG. 29) . Plasmids were constructed and co-transfected into 293F cells via PEI-mediated transfection. After protein expression and purification, CD3 / EGFR bispecific antibodies with a purity of ≥90%were obtained.

[0380] Example 2: Detection of T Cell Activation Levels by Antibody Drugs

[0381] The scheme provided by Genomeditech was used to measure the activation of T cells by antibody drugs, following the below steps:

[0382] 1. Preparing Cells: the cell density of Jurkat-NFAT-Luc (Genomeditech, GM-C01459) cells was adjusted to 1×106 / mL using 1640 complete medium.

[0383] 2. Diluting Antibodies: the antibodies were diluted in 1640 complete medium to concentrations of 300nM, 30nM, 3nM, 0.3nM, 0.03nM, 0.003nM, 0.0003nM, and 0nM (3x) (10-fold serial dilutions) , resulting in 8 different concentrations.

[0384] 3. Incubating: In a 96-well plate, 50 μL of Jurkat-NFAT-Luc cell suspension and 25 μL of the diluted antibodies (3x) were sequentially added to each well, and the cells were incubated in a cell culture incubator for 5 hours.

[0385] 4. Preparing Luciferase Substrate: the luciferase substrate from the -20℃ freezer was thawed and equilibrated to room temperature in advance.

[0386] 5. Adding Substrate: After incubation, 50 μL of the equilibrated substrate (Cat: DD1201-03-AA, Lot: 7E0502K4, Novizan) was added to each well of the 96-well plate.

[0387] 6. Reading Luminescence: After 10 minutes, the luminescence was read using a microplate reader with chemiluminescence detection (gain: 255; integration time: 1 second) .

[0388] 7. Data Analysis: The data was fitted to a curve using GraphPad Prism software.

[0389] The experimental results showed that when the cytokine IL-2 is at the C-terminus of the heavy chain (structure shown in FIG. 29B) , it can non-specifically activate T cells at a high concentration of 100nM (final concentration) . When the cytokine IL-2 is at the N-terminus of the heavy chain (structure shown in FIG. 29A) , the T cell activation was at the same level as the negative control, indicating the structure shown in FIG. 29A provides added safety. The experimental results are shown in FIG. 30 and the table below. 29A and 29B have the same anti-CD3 scFv and anti-EGFR Fab sequences, and the only difference between 29A and 29B is the location of the IL2.

[0390] Table 24: Luciferase (RLU) Results of T Cell Activation Levels by Mask CD3 / EGFR Bispecific Antibody Drugs

[0391] Example 3: Long Term T Cell Exhaustion Analysis

[0392] Long term tumor inhibition mediated by T cells and the antibody drugs were analyzed following the below steps:

[0393] Day 1: a) 5×106 frozen CD3+ T cells were thawed and resuspend in 5 mL complete medium, and counted. The cell concentration was adjusted to 5×10^5 / mL using complete medium containing 30U / mL IL-2. b) 1 mL of the cell suspension was seeded into a 24-well plate as an unactivated control. CD3 / CD28 activation beads (Miltenyi, 10 μL per 1×106 cells) were added to the remaining cell suspension, mixed well, and the cells were evenly distributed into 8 wells of a 24-well plate. c) The cells were incubated in a normoxic incubator for 24 hours.

[0394] Day 2: a) The unactivated T cells were collected, centrifuged to remove the supernatant, resuspended in 1 mL complete medium, and counted. The cell concentration was adjusted to 1×10^5 / mL. b) The CD3 / CD28-activated T cells were collected into one tube, centrifuged to remove the supernatant, washed once with 10 mL complete medium, resuspended in complete medium, and counted. The cell concentration was adjusted to 1×105 / mL. c) 50,000 cells (500 μL) from the activated group and 50,000 cells (500 μL) from the unactivated groups were taken to measure cell killing. d) In a 96-well plate, 5,000 HT-29 cells (100 μL) were seeded into each well; 50 μL of T cell suspension (E: T ratio of 1: 1) was added to each well; and then 50 μL of 4X drug was added to each well. e) The cells were incubated in a normoxic incubator. On the fourth and tenth days, the T cells were removed for flow cytometry, and target cell viability was detected using the CTG method (Vazyme, DD1101-03) .

[0395] Finally, a multifunctional microplate reader was used to detect the luminescence of each well on the plate for 0.5 seconds (gain = 135) to calculate the percentage of tumor cell viability.

[0396] The experimental results showed that when the cytokine IL-2 is at the N-terminus of the heavy chain (structure shown in FIG. 29A) , the tumor inhibition rate is comparable to that of combination of (1) the masked CD3 / EGFR bispecific antibody without cytokine IL-2 (structure shown in FIG. 29C) , and (2) the addition of 0.1nM IL-2. In contrast, the masked CD3 / EGFR bispecific antibody without cytokine IL-2 alone showed a relatively weaker tumor inhibition rate. The experimental results are shown in the table below.

[0397] Table 25: Effects of Different Structures of Mask CD3 / EGFR Bispecific Antibodies on Tumor Cells (%)

[0398] OTHER EMBODIMENTS

[0399] It is to be understood that while the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.An antigen binding protein, comprising(a) a Fab fragment (Fab) comprising a first heavy variable region (VH1) , a first light chain variable region (VL1) , a CH1 domain, and a CL domain;(b) a single chain variable fragment (scFv) comprising a second heavy chain variable region (VH2) and a second light chain variable region (VL2) ;(c) an immune modulator;wherein a first mask peptide is linked to the Fab and impairs the binding of the Fab to the target of the Fab, andwherein a second mask peptide is linked to the scFv and impairs the binding of the scFv to the target of scFv;wherein the immune modulator is linked to the N-terminus of the first mask peptide or the second mask peptide.2.The antigen binding protein of claim 1, wherein the antigen binding protein is a multispecific antigen binding protein (e.g., a bispecific antigen binding protein or a trispecific antigen binding protein) .3.The antigen binding protein of claim 1 or 2, wherein the first mask peptide is linked to the Fab through a cleavable linker.4.The antigen binding protein of any one of claims 1-3, wherein the second mask peptide is linked to the scFv through a cleavable linker.5.The antigen binding protein of any one of claims 1-4, wherein the scFv specifically binds to a tumor antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BAFFR, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, GUCY2C, MUC16, CDH17, SEZ6, CD54, B7H4, CEACAM6, TROP2, or PVRL4) , and the Fab specifically binds to an immune cell receptor antigen (e.g., CD3) .6.The antigen binding protein of any one of claims 1-4, wherein the scFv specifically binds to an immune cell receptor antigen (e.g., CD3) , and the Fab specifically binds to a tumor antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, GUCY2C, MUC16, CDH17, SEZ6, CD54, B7H4, CEACAM6, BAFFR, TROP2, or PVRL4) .7.The antigen binding protein of any one of claims 1-6, wherein the VH2 in the scFv is linked to N-terminus of VH1 of the Fab.8.The antigen binding protein of any one of claims 1-6, wherein the VL2 in the scFv is linked to N-terminus of VH1 of the Fab.9.The antigen binding protein of any one of claims 1-6, wherein the VH2 in the scFv is linked to N-terminus of VL1 of the Fab.10.The antigen binding protein of any one of claims 1-6, wherein the VL2 in the scFv is linked to N-terminus of VL1 of the Fab.11.The antigen binding protein of any one of claims 1-10, wherein the VL1 in the Fab is linked to the CL domain in the Fab and the VH1 in the Fab is linked to the CH1 domain in the Fab.12.The antigen binding protein of any one of claims 1-10, wherein the VL1 in the Fab is linked to the CH1 domain in the Fab and the VH1 in the Fab is linked to the CL domain in the Fab.13.The antigen binding protein of any one of claims 1-12, wherein the antigen binding protein further comprises a first single-domain antibody variable domain (VHH1) .14.The antigen binding protein of claim 13, wherein the VHH1 specifically binds to human serum albumin (HSA) , optionally the VHH1 is linked to the antigen binding protein through a cleavable linker.15.The antigen binding protein of claim 13 or 14, wherein the VHH1 is linked to the second mask peptide through an immune modulator, optionally with a cleavable linker.16.The antigen binding protein of claim 15, wherein the immune modulator is a VHH or a scFv or a protein fragment that specifically binds to a checkpoint inhibitor or an immune costimulator (e.g., PD-1, CD28, CD2, CD137, or 4-1BB) .17.The antigen binding protein of claim 15, wherein the immune modulator is a cytokine (e.g., IL2, IL7, IL15, or IL21) .18.The antigen binding protein of claim 13 or 14, wherein the VHH1 is directly linked to the second mask peptide, optionally with a cleavable linker.19.The antigen binding protein of claim 13 or 14, wherein the VHH1 is linked to the first mask peptide, optionally through an immune modulator.20.The antigen binding protein of claim 19, wherein the immune modulator is a VHH that specifically binds to a checkpoint inhibitor or an immune costimulator (e.g., PD-1, CD28, CD2, CD137, 4-1BB) .21.The antigen binding protein of claim 19, wherein the immune modulator is a cytokine (e.g., IL2, IL7, IL15, IL21) .22.The antigen binding protein of any one of claims 1-21, wherein the antigen binding protein further comprises a first antigen binding domain.23.The antigen binding protein of claim 22, wherein the first antigen binding domain specifically binds to a tumor antigen (e.g., CAIX) .24.The antigen binding protein of claim 22 or 23, wherein the first antigen binding domain is a VHH.25.The antigen binding protein of claim 22 or 23, wherein the first antigen binding domain is a scFv.26.The antigen binding protein of claim 24 or 25, wherein the first antigen binding domain is linked to C-terminus of the CH1 domain.27.The antigen binding protein of claim 24 or 25, wherein the first antigen binding domain is linked to C-terminus of the CL domain.28.The antigen binding protein of any one of claims 22-27, wherein the antigen binding protein further comprises a second antigen binding domain.29.The antigen binding protein of claim 28, wherein the second antigen binding domain specifically binds to a tumor antigen (e.g., CAIX) .30.The antigen binding protein of claim 28 or 29, wherein the second antigen binding domain is a VHH.31.The antigen binding protein of claim 28 or 29, wherein the second antigen binding domain is a scFv.32.The antigen binding protein of claim 30 or 31, wherein the second antigen binding domain is linked to C-terminus of the CH1 domain.33.The antigen binding protein of claim 30 or 31, wherein the second antigen binding domain is linked to C-terminus of the first antigen binding domain.34.The antigen binding protein of any one of claims 1-21, wherein the antigen binding protein further comprises a Fc comprising two CH2 domains and two CH3 domains.35.The antigen binding protein of claim 34, wherein the antigen binding protein further comprises a first antigen binding domain.36.The antigen binding protein of claim 35, wherein the first antigen binding domain specifically binds to a tumor antigen (e.g., CAIX) .37.The antigen binding protein of claim 35 or 36, wherein the first antigen binding domain is a VHH.38.The antigen binding protein of claim 35 or 36, wherein the first antigen binding domain is a scFv.39.The antigen binding protein of claim 37 or 38, wherein the first antigen binding domain is linked to C-terminus of the CH3 domain in the Fc or C-terminus of the Fab.40.The antigen binding protein of claim 37 or 38, wherein the first antigen binding domain is linked to N-terminus of the CH2 domain in the Fc.41.The antigen binding protein of any one of claims 35-40, wherein the antigen binding protein further comprises a second antigen binding domain.42.The antigen binding protein of claim 41, wherein the second antigen binding domain specifically binds to a tumor antigen (e.g., CAIX) .43.The antigen binding protein of claim 41 or 42, wherein the second antigen binding domain is a VHH.44.The antigen binding protein of claim 41 or 42, wherein the second antigen binding domain is a scFv.45.The antigen binding protein of claim 43 or 44, wherein the second antigen binding domain is linked to C-terminus of the CH3 domain.46.The antigen binding protein of claim 43 or 44, wherein the second antigen binding domain is linked to C-terminus of the first antigen binding domain.47.An antigen binding protein, comprising(a) a first antigen binding domain and a first mask peptide (M1) , wherein the first mask peptide impairs the binding of the first antigen binding domain to the target of the first antigen binding domain;(b) a second antigen binding domain; and(c) an immune modulator, wherein the immune modulator is linked to the N-terminus of the first mask peptide.48.The antigen binding protein of claim 47, wherein the first antigen binding domain specifically binds to a T cell receptor antigen (e.g., CD3) .49.The antigen binding protein of any one of claims 47-48, wherein the second antigen binding domain specifically binds to a first tumor antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, BAFFR, TROP2, or PVRL4) .50.The antigen binding protein of any one of claims 47-49, wherein the antigen binding protein further comprises a third antigen binding domain.51.The antigen binding protein of claim 50, wherein the third antigen binding domain specifically binds to a second tumor antigen (e.g., EGFR, CAIX, MET, TSHR, CD171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn Ag, FLT3, DLL3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, B7-H6, CD24, PDGFR-beta, SSEA-4, MUC1, EGFRVIII, NCAM, LMP2, EphA2, Lago GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetyl-GD2, GD2, folate receptor alpha, folate receptor beta, B7-H3, TEM1 / CD248, TEM7R, B7-H4, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, polysialic acid, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, ENPPS, LY6K, OR51E2, TAARP, WT1, KLK2, ETV6-AML, sperm protein 17, XAGE1, Tie 2, TMEFF2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-associated antigen 1, p53 mutant, hTERT, sarcoma translocation breakpoint, ML-IAP, CDHR3, ERG (TMPRSS2ETS fusion gene) , NA17, PAX3, male hormone receptor, Cyclin B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, Boris, MSLN, SART3, PAX5, Oy-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, Claudin-6, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, Claudin-18.2, IGLL1, CD19, CD20, CD30, ERBB2, FOLH1, ROR1, FLT3, TAAG72, CD22, CD33, GD2, BCMA, gp100Tn, STEAP1, FAP, EPCAM, CEA, Igf-I receptors, calcium mucins 17, PSMA, CD32b, GPNMB, GPR64, HER3, LRP6, LYPD8, NKG2D, SLC34A2, SLC39A6, SLITRK6, TACSTD2, EphB2, Her2, TPBG, EPHA2, HHLA2, FOLR1, CDH3, CEACAM5, GUCY2C, MUC16, CDH17, SEZ6, CD54, B7H4, CEACAM6, BAFFR, TROP2, or PVRL4) , wherein the second and the third tumor antigens can be the same or different.52.The antigen binding protein of any one of claims 47-51, wherein the first mask peptide is linked to the antigen binding domain through a cleavable linker.53.The antigen binding protein of any one of claims 47-52, wherein the antigen binding protein further comprises a second mask peptide that impairs the binding of the second antigen binding domain to the target of the second antigen binding domain.54.The antigen binding protein of claim 53, wherein the second mask peptide is linked to the second antigen binding domain through a cleavable linker.55.The antigen binding protein of any one of claims 50-54, wherein the antigen binding protein further comprises a third mask peptide.56.The antigen binding protein of claim 55, wherein the third mask peptide is linked to the third antigen binding domain through a cleavable linker.57.The antigen binding protein of any one of claims 47-56, wherein the first antigen binding domain is a Fab, and the second antigen binding domain is a scFv.58.The antigen binding protein of any one of claims 47-56, wherein the first antigen binding domain is a scFv, and the second antigen binding domain is a Fab.59.The antigen binding protein of any one of claims 47-56, wherein the first antigen binding domain is a Fab, and the second antigen binding domain is a VHH.60.The antigen binding protein of any one of claims 47-56, wherein the first antigen binding domain is a VHH, and the second antigen binding domain is a Fab.61.The antigen binding protein of any one of claims 47-56, wherein the first antigen binding domain is a scFv, and the second antigen binding domain is a scFv.62.The antigen binding protein of any one of claims 50-61, wherein the third antigen binding domain is a VHH.63.The antigen binding protein of any one of claims 47-62, wherein the antigen binding protein further comprises a VHH that targets HSA.64.The antigen binding protein of any one of claims 47-63, wherein the VHH that targets HSA is linked to the antigen binding protein through an immune modulator.65.The antigen binding protein of claim 64, wherein the immune modulator is a VHH that targets an immune checkpoint inhibitor (e.g., PD-1) .66.The antigen binding protein of any one of claims 47-65, wherein the immune modulator is a cytokine.67.The antigen binding protein of any one of claims 64-66, wherein the VHH that targets HSA is linked to the antigen binding protein through a cleavable linker.68.An antigen-binding protein, comprising:(a) a first peptide comprising, from the N-terminus to the C-terminus, a half-life extension unit (E) , an immune modulator, a first mask peptide (M1) , a first cleavable linker (L1) , a scFv that specifically binds to a first antigen, a VH1, a CH1; and(b) a second peptide comprising, from the N-terminus to the C-terminus, a VL1, and a CL,wherein the VH1 and VL1 form a Fab that specifically binds to a second antigen, and the first mask peptide (M1) impairs the binding of the scFv to the first antigen, wherein the scFv comprises a VH2 and a VL2.69.The antigen binding protein of claim 68, wherein the second peptide further comprises a second mask peptide (M2) that impairs the binding of the Fab to the second antigen and the second mask peptide is linked to the Fab via a second cleavable linker (L2) .70.The antigen-binding protein of claim 68 or claim 69, wherein the first antigen is a T cell antigen (e.g., CD3) and the second antigen is a tumor-associated antigen (e.g., EGFR) .71.The antigen binding protein any one of claims 68-70, wherein the first antigen is CD3 and the second antigen is EGFR.72.The antigen binding protein any one of claims 68-71, wherein the VH2 comprises any one of the combinations of the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 sequences in Tables 1, 3, and 5, and the VL2 comprises any one of the combinations of the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 sequences in Tables 2, 4, and 6.73.The antigen binding protein any one of claims 68-72, wherein the VH1 comprises any one of the combinations of the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 sequences in Tables 12, 14, and 16, and the VL1 comprises any one of the combinations of the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 sequences in Tables 13, 15, and 17.74.The antigen binding protein any one of claims 68-73, wherein the immune modulator is a cytokine.75.The antigen binding protein any one of claims 68-74, wherein the immune modulator is IL2.76.The antigen binding protein any one of claims 68-75, wherein the half-life extending unit (E) comprises a VHH that specifically binds to human serum albumin (HSA) .77.The antigen binding protein any one of claims 68-76, wherein the first mask peptide (M1) comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 144-160.78.The antigen binding protein any one of claims 68-77, wherein the first cleavable linker (L1) comprises a first cleavable peptide (C1) , wherein the first cleavable peptide (C1) comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 231-240.79.The antigen binding protein any one of claims 69-78, wherein the second mask peptide (M2) comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 220-230.80.The antigen binding protein any one of claims 69-79, wherein the second cleavable linker (L2) comprises a second cleavable peptide (C1) , wherein the second cleavable peptide (C1) comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 231-240.81.A nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the antigen binding protein of any one of claims 1-80.82.The nucleic acid of claim 81, wherein the nucleic acid is a DNA (e.g., cDNA) or RNA (e.g., mRNA) .83.A vector comprising one or more of the nucleic acids of claim 81 or 82.84.A cell comprising the vector of claim 83.85.The cell of claim 84, wherein the cell is a CHO cell.86.A cell comprising one or more of the nucleic acids of claim 81 or 82.87.A method of producing an antigen binding protein, the method comprising(a) culturing the cell of any one of claims 84-86 under conditions sufficient for the cell to produce the antigen binding protein; and(b) collecting the antigen binding protein produced by the cell.88.A method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the antigen binding protein of any one of claims 1-80, to the subject.89.A method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antigen binding protein of any one of claims 1-80.90.A method of killing a tumor cell, the method comprisingcontacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the antigen binding protein of any one of claims 1-80.91.A pharmaceutical composition comprising the antigen binding protein of any one of claims 1-80, and a pharmaceutically acceptable carrier.

Images