Method for training a system adapted for classifying a biosensor signal corresponding to a cell, and system trained by thereof

Abstract

The invention is a method for training a system adapted for classifying biosensor signal corresponding to cell, wherein o the system comprises a machine learning-based classification module, and o sensor-surface time-dependent biosensor signals (26) obtained by contacting a sample with cell(s) (32) with functionalised surface of an optical biosensor (24) for detecting refractive index change, representing activation kinetics and defined on pixels (30) of the biosensor (24) are applied, the method comprising, for the sensor-surface time-dependent biosensor signals (26), - a training time-dependent biosensor signal portion comprising a pixel of the given sensor-surface time-dependent biosensor signal (26) corresponding to a cell (32) is determined, and - the classification module is trained with the training time-dependent biosensor signal portion, classification of activation kinetics of the cell (32) is specified. Furthermore, the invention is a system and an evaluation method for classifying biosensor signal corresponding to cell.

Description

[0001]- 1 - ELJÁRÁS BIOSZENZOR SEJTHEZ TARTOZÓ JELÉNEK OSZTÁLYOZÁSÁRA SZOLGÁLÓ RENDSZER TANÍTÁSÁRA, VALAMINT AZZAL TANÍTOTT RENDSZER MŰSZAKI TERÜLET 5 A találmány bioszenzor sejthez tartozó jelének osztályozására szolgáló rendszerre és a rendszer tanítására szolgáló tanítási eljárásra, valamint bioszenzor sejthez tartozó jelének osztályozására szolgáló kiértékelési eljárásra vonatkozik. A KORÁBBI TECHNIKA Az evolúció során az eukarióták a különböző funkciók ellátására térben elkülönülő 10 szervsejteket alakítottak ki, és ugyanígy a többsejtű szervezetek a speciális sejttípusokat szövetekbe és szervekbe rendezték, rendkívül szervezett módon. Ezen összetett struktúrák kialakításához a sejteknek kapcsolódniuk kell egymáshoz, mégpedig úgy, hogy a különböző szövettípusok igényeit kielégítsék. A sejtadhézió és sejt-sejt kapcsolódások alapvető biológiai folyamatok, amelyek a 15 szövetek és szervek kialakulásához és fenntartásához elengedhetetlenek a többsejtű szervezetekben. Ez magában foglalja a sejtek egymáshoz vagy az extracelluláris mátrixhoz való kapcsolódását specifikus – sokszor ma még feltáratlan – molekuláris kölcsönhatások révén (Giancotti, F. G., and E. Ruoslahti. 1999. “Integrin Signaling.” Science 285 (5430): 1028–32.). 20 A különböző sejtkapcsolatokat a sejtadhéziós molekulák négy fő csoportja valósítja meg: az integrinek családja, kadherinek, az immunglobulinok és a szelektinek. A sejt-mátrix adhézióban pl. a domináns szerep az integrineké. Ez a heterodimer transzmembrán receptor azáltal rögzíti a sejtet az extracelluláris mátrixhoz (ECM), hogy az intracelluláris végponton az aktin citoszkeletonhoz 25 kötődik. Az integrinek nemcsak az ECM-hez való kötődésre képesek, hanem jelátviteli tulajdonságokkal is rendelkeznek. Minden integrin egy alfa- és egy béta-alegységből áll, és összetételükben jelentős eltéréseket mutatnak (Hynes, Richard O.2002. “Integrins: Bidirectional, Allosteric Signaling Machines.” Cell 110 (6): 673–87.). Mesterséges felületekkel ezen biológiai felületeket modellezni 30 tudunk a laboratóriumunkban. - 2 - A sejtadhézió monitorozásához számos technika áll rendelkezésre, melyek között kiemelkedő szerepet kapnak az optikai, mechanikai, elektronikai, elektrokémiai szenzorok. Ezek a technológiák, pl. az optikai eljárásokat tekintve, mint az optikai 5 hullámvezető fénymódus (fénymód) spektroszkópia (OWLS – Optical Waveguide Lightmode Spectroscopy), felületi plazmon rezonancia (SPR – Surface Plasmon Resonance), rezonáns hullámvezető rács (RWG – Resonant Waveguide Grating), és a rács-hoz kapcsolt (csatolt) interferometria (GCI – Grating-coupled interferometry), a törésmutató változásainak pontos mérésével adnak betekintést 10 a sejtadhéziós folyamatokba (Fang, Ye.2006. “Label-Free Cell-Based Assays with Optical Biosensors in Drug Discovery.” Assay and Drug Development Technologies 4 (5): 583–95. Fang, Ye.2010. “Live Cell Optical Sensing for High Throughput Applications.” Advances in Biochemical Engineering / biotechnology 118: 153–63., az RWG optikai bioszenzorhoz ld. Milan Sztilkovics, Tamas 15 Gerecsei, Beatrix Peter, Andras Saftics, Sandor Kurunczi, Inna Szekacs, Balint Szabo, and Robert Horvath. 2020. “Single-Cell Adhesion Force Kinetics of Cell Populations from Combined Label-Free Optical Biosensor and Robotic Fluidic Force Microscopy.” Scientific Reports 10 (1): 1–13.), tipikusan nem inhomogén jeleket mérnek. 20 Az új generációs molekuláris technológiák, mint a molekuláris olvasók (MoloReader, ld. Gatterdam, V., Frutiger, A., Stengele, KP. et al. Focal molography is a new method for the in situ analysis of molecular interactions in biological samples. Nature Nanotech 12, 1089–1095 (2017).), jelentős előrelépést jelentenek a sejtadhézió és sejtaktiváció vizsgálatában. Ezek a technológiák 25 lehetővé teszik a sejtek állapotának változásait befolyásoló külső beavatkozások minimalizálását, így a sejtek kvázi-natív állapotban történő vizsgálatát (Milan Sztilkovics, Tamas Gerecsei, Beatrix Peter, Andras Saftics, Sandor Kurunczi, Inna Szekacs, Balint Szabo, and Robert Horvath.2020. “Single-Cell Adhesion Force Kinetics of Cell Populations from Combined Label-Free Optical Biosensor and 30 Robotic Fluidic Force Microscopy.” Scientific Reports 10 (1): 1–13.; Gatterdam, Volker, Andreas Frutiger, Klaus-Peter Stengele, Dieter Heindl, Thomas Lübbers, Janos Vörös, and Christof Fattinger.2021. “Author Correction: Focal Molography - 3 - Is a New Method for the in Situ Analysis of Molecular Interactions in Biological Samples.” Nature Nanotechnology 16 (5): 606.). A deep-learning algoritmusok kulcsfontosságúak a rák korai felismerésében és a terápiás beavatkozások célzott kialakításában. Az integrinexpresszió változása 5 rákos sejtekben, a sejtek közötti heterogenitás és a glikokálix szerepe további fontos faktorokká válhatnak, kiemelve az adhéziós mechanizmusok és a sejtek viselkedésének bonyolultságát (Gawad, Charles, Winston Koh, and Stephen R. Quake. 2016. “Single-Cell Genome Sequencing: Current State of the Science.” Nature Reviews. Genetics 17 (3): 175–88.; Lee, Jeongwoo, Do Young Hyeon, and 10 Daehee Hwang.2020. “Single-Cell Multiomics: Technologies and Data Analysis Methods.” Experimental & Molecular Medicine 52 (9): 1428–42.; Kanyo, Nicolett, Kinga Dora Kovacs, Andras Saftics, Inna Szekacs, Beatrix Peter, Ana R. Santa- Maria, Fruzsina R. Walter, András Dér, Mária A. Deli, and Robert Horvath.2020. “Glycocalyx Regulates the Strength and Kinetics of Cancer Cell Adhesion 15 Revealed by Biophysical Models Based on High Resolution Label-Free Optical Data.” Scientific Reports 10 (1): 22422.). A technológiák nem csupán a rák kutatásában játszanak kulcsszerepet, hanem a véraktivitás (amely alatt a mintában megtalálható egyedi fehérvérsejtek aktivációját értjük adott funkcionalizált felületen) vizsgálatokra is alkalmazhatókká 20 tehetők, lehetővé téve a munkánk során a vérsejtek adhéziós tulajdonságainak és funkcionális állapotának elemzését. Ez fontos lépés a betegségek korai diagnosztizálásában és a hatékony kezelési stratégiák kifejlesztésében. A sejtek heterogenitása az egészséges szövetek jellemzője, és egyben kritikus tényező a különböző biológiai jelenségek és betegségállapotok megértésében 25 (Altschuler, Steven J., and Lani F. Wu. 2010. “Cellular Heterogeneity: Do Differences Make a Difference?” Cell 141 (4): 559–63.). A betegségek, például a rák esetében a sejtek heterogenitása különösen hangsúlyossá válik, mivel a sejtek alpopulációi eltérő genetikai, epigenetikai és fenotípusos profilokat mutathatnak (Cha, Junha, and Insuk Lee. 2020. “Single-Cell Network Biology for Resolving 30 Cellular Heterogeneity in Human Diseases.” Experimental & Molecular Medicine 52 (11): 1798– 1808.). Ez a heterogenitás kihívást jelent a hatékony terápiás stratégiák kifejlesztésében, mivel a kezelések bizonyos sejtpopulációk ellen - 4 - kevésbé hatékonyak lehetnek. A sejtek jelölésmentes klasszifikációjának területén számos klasszifikációs módszer került alkalmazásra az évek során, amelyek célja a sejtek vagy sejtcsoportok azonosítása és megkülönböztetése volt különböző biológiai és 5 orvosi alkalmazásokban. Ezek a módszerek különféle adatfeldolgozási és gépi tanulási technikákat alkalmaznak a sejtek viselkedésének, morfológiájának és más jellemzőinek elemzésére. Az alábbiakban néhány fontosabb klasszifikációs módszerrel kapcsolatban nyújtunk rövid áttekintést: A klasszifikáció korai formái statisztikai módszereken alapultak a hagyományos 10 statisztikai módszerek, mint például a lineáris diszkriminancia analízis (LDA – Linear Discriminant Analysis; Adebiyi, Marion Olubunmi, Micheal Olaolu Arowolo, Moses Damilola Mshelia, and Oludayo O. Olugbara.2022. “A Linear Discriminant Analysis and Classification Model for Breast Cancer Diagnosis.” NATO Advanced Science Institutes Series E: Applied Sciences 12 (22): 11455.) vagy a logisztikus 15 regresszió (Le, Huy, Beverly Peng, Janelle Uy, Daniel Carrillo, Yun Zhang, Brian D. Aevermann, and Richard H. Scheuermann.2022. “Machine Learning for Cell Type Classification from Single Nucleus RNA Sequencing Data.” PloS One 17 (9): e0275070.). Ezek a módszerek jól működtek egyszerűbb klasszifikációs problémáknál, ahol a sejtek vagy biomolekulák jellemzői jól elkülönültek. 20 Egy másik módszer a döntési fák algoritmusok alkalmazása. A döntési fák és a random erdő algoritmusokat a sejtek osztályozására használják, különösen akkor, amikor a sejtpopulációk jellemzői között komplex összefüggések vannak. Ezek a módszerek képesek megbirkózni a nagy dimenziós adathalmazokkal és kiemelik azokat a jellemzőket, amelyek a legjobban megkülönböztetik a sejtcsoportokat. 25 Az SVM (Support Vector Machine – tartóvektor-gép) egy erős gépi tanulási algoritmus, amelyet széles körben alkalmaznak a sejtek osztályozására. Ez a módszer optimális határvonalat hoz létre a különböző sejtcsoportok között, maximális margót biztosítva közöttük. A mélytanuláson alapuló módszerek, mint a konvolúciós neurális hálózatok (CNN 30 – Convolutional Neural Network) (Hatami, Nima, Tae-Hee Cho, Laura Mechtouff, - 5 - Omer Faruk Eker, David Rousseau, and Carole Frindel.2022. “CNN-LSTM Based Multimodal MRI and Clinical Data Fusion for Predicting Functional Outcome in Stroke Patients.” Conference Proceedings: Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine 5 and Biology Society. Conference 2022 (July): 3430–34.; Yuan, Peng, Yiwen Jiao, Jiaxue Li, and Yan Xia.2024. “A Densely Connected Causal Convolutional Network Separating Past and Future Data for Filling Missing PM Time Series Data.” Heliyon 10 (2): e24738.) forradalmasították a sejtek és szövetek képből történő klasszifikációját. A CNN képes a képi adatokból közvetlenül, emberi beavatkozás 10 nélkül kinyerni a szükséges jellemzőket, lehetővé téve a sejtek és szövetek pontos osztályozását még összetett vagy homályos minták esetén is. A genetikai és epigenetikai adatok, mint a DNS- vagy RNS- szekvenciák elemzése új utakat nyitottak a sejtek klasszifikációjában. A szekvencia-alapú klasszifikációs módszerek lehetővé teszik a sejtek genetikai alapú azonosítását és15 csoportosítását (Frauhammer, Felix. 2021*. Cell Type Classification for Multi- Sample Multi-Condition Comparisons in Single-Cell RNA Sequencing Data.; Le, Huy, Beverly Peng, Janelle Uy, Daniel Carrillo, Yun Zhang, Brian D. Aevermann, and Richard H. Scheuermann. 2022. “Machine Learning for Cell Type Classification from Single Nucleus RNA Sequencing Data.” PloS One 17 (9): 20 e0275070.; Cho, Hyun Jae, Zhenjia Wang, Yidan Cong, Stefan Bekiranov, Aidong Zhang, and Chongzhi Zang.2024. “DARDN: A Deep-Learning Approach for CTCF Binding Sequence Classification and Oncogenic Regulatory Feature Discovery.” Genes 15 (2).). A nagy áteresztőképességű, jelölésmentes mérési technikák kifejlesztése 25 szükségessé teszi az adatfeldolgozó pipeline-ok teljesítményének javítását az orvosi alkalmazásokhoz, hogy széles körű kereskedelmi felhasználást érjenek el. A mélytanuláson alapuló modellek nagyobb teljesítményt nyújtanak a reprezentációs tanuláshoz számos különböző orvosi területen. A szegmentációs architektúrák, például az U-Net (Rezaeitaleshmahalleh, Mostafa, 30 Zonghan Lyu, Nan Mu, and Jingfeng Jiang. 2023. “USING CONVOLUTIONAL NEURAL NETWORK-BASED SEGMENTATION FOR IMAGE- BASED COMPUTATIONAL FLUID DYNAMICS SIMULATIONS OF BRAIN ANEURYSMS: - 6 - INITIAL EXPERIENCE IN AUTOMATED MODEL CREATION.” Journal of Mechanics in Medicine and Biology 23 (4).), a V-Net (Ozturk, Saban. 2022. Convolutional Neural Networks for Medical Image Processing Applications. CRC Press.; Jafari, Esmail, Amin Zarei, Habibollah Dadgar, Ahmad Keshavarz, 5 Reyhaneh Manafi-Farid, Habib Rostami, and Majid Assadi.2024. “A Convolutional Neural Network-Based System for Fully Automatic Segmentation of Whole-Body [Ga]Ga-PSMA PET Images in Prostate Cancer.” European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 51 (5): 1476–87.) vagy a konvolúciós neurális hálózat (CNN) - és rekurrens neurális hálózat (RNN) alapú modellek közzététele 10 az osztályozáshoz nagy hasznát vették az orvosi képfeldolgozásban vagy diagnosztikában. A mögöttes felépítésük lehetővé teszi, hogy a modellek különböző absztrakciós szinteken megtanulják egy adott adatkészlet látens reprezentációit és jellemzőit, és a gépi tanulás alkalmazásaiban konkrét problémákra alkalmazzák. 15 Ez a megközelítés jelentősen javítja a sejtek azonosításának és különválasztásának pontosságát, miközben minimalizálja a sejtekre gyakorolt invazív hatást. Egy tanulmányban (Zoltán Szittner, Beatrix Péter, Sándor Kurunczi, Inna Székács, Róbert Horváth: Functional blood cell analysis by label-free biosensors and single- cell technologies, Adv Colloid Interface Sci.2022 Oct, 308, 102727) részben a jelen20 bejelentés feltalálói összefoglalást adnak a találmány tágabb szakterületének 2022- es állásáról. A tanulmányban a sejtek méret alapján való megkülönböztetése jelenik meg a refraktív index vizsgálata alapján (ld. a tanulmányon belül a jelen leírásban máshol is hivatkozott Milan Sztilkovics, Tamas Gerecsei, Beatrix Peter, Andras Saftics,25 Sandor Kurunczi, Inna Szekacs, Balint Szabo, and Robert Horvath.2020. “Single- Cell Adhesion Force Kinetics of Cell Populations from Combined Label-Free Optical Biosensor and Robotic Fluidic Force Microscopy.” Scientific Reports 10 (1): 1–13. cikket), valamint a sejtek által termelt ellenanyagok mérését végzik. A tanulmányban kitérnek a sejtek fizikai elkülönítésére, kiválasztására szolgáló technikákra is. 30 Az ismert megoldások fényében fennáll az igény a sejtek meghatározásának, elkülönítésének minél hatékonyabb módszerei iránt. - 7 - A TALÁLMÁNY ISMERTETÉSE A találmány elsődleges célja olyan tanítási eljárás és azzal tanított rendszer megalkotása, amelyek a lehető legnagyobb mértékben mentesek a technika állása szerinti megoldások hátrányaitól. 5 Az alábbiakban megjelöljük a találmánnyal megoldandó feladatot. A sejtek sokfélesége jelentős szerepet játszik mind az egészséges szövetekben, mind pedig a biológiai folyamatok és kórképek megértésében. Különösen fontos ez a rákhoz hasonló betegségeknél, ahol a sejtek heterogenitása kiemelkedő, mivel azok különböző genetikai, epigenetikai, és fenotípusos sajátosságokat mutathatnak 10 (Brase, Logan, Shih-Feng You, Ricardo D’oliveira Albanus, Jorge L. Del-Aguila, Yaoyi Dai, Brenna C. Novotny, Carolina Soriano-Tarraga, et al.2021. “A Landscape of the Genetic and Cellular Heterogeneity in Alzheimer Disease.” bioRxiv, medRxiv 2021.11.30.21267072). Ez a sokféleség akadályozhatja a hatásos terápiás megközelítések kidolgozását, mivel egyes sejtcsoportok kevésbé lehetnek 15 fogékonyak a kezelésekre. Hasonló problémák merülnek fel az immunsejtek esetében is. A jelölésmentes mérési technikák, amelyek a fluoreszcens vagy radioaktív jelzések nélküli biomolekuláris interakciók közvetlen megfigyelését és elemzését teszik lehetővé, jelentős előrelépést jelentenek a biológiai folyamatok tanulmányozásában. Ezek a módszerek pontosabb betekintést nyújthatnak a 20 biológiai eseményekbe és széles körben használhatók a gyógyszerfejlesztésben, proteomikában és a sejtjelátviteli utak vizsgálatában, elősegítve ezzel a biológiai jelenségek összetettségének alaposabb megértését. Az ilyen jellegű információ felhasználása diagnosztikai eljárásokban napjainkban még nem elterjedten alkalmazott. Különös tekintettel az egyedi sejtszintű inhomogén jelekre nem 25 léteznek eljárások. A találmány kiemelt célja olyan sejtkarakterizációs eljárás megalkotása (fejlesztése), amelynek alkalmazásával sejtek aktivációs mintázatainak elemzésével a különböző biológiai forrásból származó egyedi sejtek és azok aktivációs mintázatai hatékonyan elkülöníthetők. 30 A találmány vonatkozásában kitűzött célokat az 1. igénypont szerinti tanítási eljárással, a 8. igénypont szerinti rendszerrel és a 9. igénypont szerinti kiértékelési - 8 - eljárással értük el. A találmány előnyös kiviteli alakjai az aligénypontokban vannak meghatározva. A találmány azon a felismerésen alapul (ld. még alább a további felismeréseket is), hogy az egyes sejtek különböző célirányosan speciálisan előkészített bevonatokon 5 mért aktivációs jelének, különös tekintettel az újszerű inhomogén kinetikai jeleinek (azaz bioszenzor funkcionalizált szenzorfelületéhez sejtmintát érintkeztetéssel kölcsönhatásba hozva kapott szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jel; ezt többféleképpen is nevezzük a leírásban), és előnyösen kiegészítésképp más, az adott sejt vizsgálatából származó például mikroszkópos képének gépi tanuláson 10 alapuló klasszifikációs algoritmussal történő elemzése lehetővé teszi az egyes sejtek részletes karakterizációját, amely jelek alapján az egyes sejtek közötti különbségek megismerhetők. A találmány fontos eleme a sejtek és a felület érintkezésbe hozásának speciális eljárása is. A fentebb ismertetett korábbi dokumentumokban nem jelenik meg a sejtek 15 találmány szerinti módon kapott aktivációs jelének a találmány ezen fő felismerésének megfelelő, gépi tanuláson alapuló klasszifikációs algoritmussal történő karakterizációja. Kiemeljük, hogy a találmány nem irányul a sejtek fizikai elkülönítésére, hanem a találmány szerint az egyes letapadt sejteket kifejezetten úgy vizsgáljuk, hogy 20 azoknak a bioszenzorhoz való érintkeztetését követően rögzítjük a bioszenzor időfüggő jelét (megjegyzendő, hogy ebben a jelben az időfüggés fennmarad, amint a jel elnevezése is mutatja, ld. még a találmány definícióját alább), majd adott esetben a mikroszkópos képet is ezt az állapotot megőrizve készítjük. A technika állása szerint számos esetben több sejt együttes viselkedését vizsgálják. 25 A találmány ezzel szemben megoldást ad arra, hogy a bioszenzor jelében szegmentációval beazonosítsuk az egyes sejtekhez tartozó területeket. Ennek köszönhetően a találmányban alkalmazott megközelítésben lehetővé válik az egyedi sejtek egyértelmű beazonosítása, jellemzése. A bioszenzor jelének ilyen feldolgozása nem jelenik meg a technika állása szerinti dokumentumokban. - 9 - Fontos kiemelni a találmánnyal kapcsolatosan, hogy a technika állása szerinti más egysejtes módszerek esetében (lásd például Yanase et al: Detection of refractive index changes in individual living cells by means of surface plasmon resonance imaging, Biosensors and Bioelectronics Volume 26, Issue 2, 15 October 2010, 5 Pages 674-681), a sejtek már a felszínen rögzülve, a szenzoron történő tenyésztést követően vannak stimulálva a különböző reagensek hozzáadásával, nem pedig mint a találmányban, fordítva, a funkcionalizált felszínnel kiváltva (a sejteknek a bioszenzorhoz való érintkeztetését követően, azaz a találmány ebben kezdeti fázisban való időfüggés vizsgálatára alapszik). 10 Kiemeljük továbbá, hogy önmagában abból az állításból, hogy a sejtek karakterizációjára lehetőség van jelölésmentes módszerekkel, nem következik a találmány felismerése, hogy a bioszenzor időfüggő jelének segítségével, azaz a törésmutató változás alapján megállapított aktivációs kinetika osztályozásával, mint sejtek bioszenzor felületen történő aktivációja során azok elkülönítésére alkalmas 15 módszert adjunk. Egyes technika állása szerinti dokumentumokban felmerül a mesterséges intelligencia alkalmazása (jellemzően, mint aktuális trend), ugyanakkor a technika állása szerinti dokumentumok nem adnak kitanítást gépi tanuláson alapuló osztályozásnak a találmány definíciójának megfelelő betanítására és az 20 osztályozásnak a fenti felismeréssel kapcsolatban történő alkalmazására. A találmány vonatkozásában továbbá a következő felismeréseket tettük. Felismertük, hogy a sejtek célirányosan előkészített funkcionalizált felülettel megfelelő módon történő érintkeztetése, és az így potenciálisan kiváltott biológiai folyamat eredményeként szenzorral mért laterálisan inhomogén kinetikai válasz jel 25 (azaz a bioszenzor jele) alkalmas a sejtek aktivációjának pontosabb megállapítására, a sejtek, sejtpopulációk elkülönítésére. Összefoglalóan, felismertük tehát, hogy a bioszenzor jele alkalmas a sejtek osztályozást lehetővé tevő egymástól való megkülönböztetésére az aktivációs kinetika alapján (ld. még alább ezzel kapcsolatosan az osztályozást befolyásoló, finomítására lehetőséget 30 adó aspektusokat). - 10 - Ehhez kapcsolódóan felismertük azt is, hogy a gépi tanuláson alapuló (pl. deep- learning) algoritmusok alkalmazása az optikai bioszenzorok által generált adatok elemzésére új dimenziókat nyithat a sejtklasszifikáció, különösen a rákos sejtek azonosítása és a tumoros folyamatok megértése terén. 5 Felismertük, hogy az egyedi sejtek aktiváló felszínnel történő érintkeztetése során mért jel (azaz a bioszenzor jele) jellemző a sejttípusra. Felismertük, hogy az aktiválódó sejtek fixálhatóak a speciálisan előkészített bioszenzor felszínén, lehetővé téve azok további vizsgálatát, így az egyes egyedi sejtekhez tartozó további jelek vizsgálatát és további összevetését mikroszkópos 10 képekkel. Felismertük, hogy a fixálás során az aktiválódott sejtek megőrzik térbeli pozíciójukat fixálási eljárás során, így további egyedi sejtes információk nagy pontosságú hozzárendelését lehetővé téve (ezen és az előző felismerés támasztja alá, hogy egy kiviteli alakban megfelelően alkalmazható mikroszkópos kép a bioszenzor jelével való 15 összevetésben, ld. a következő felismerést). Felismertük, hogy a mért inhomogén válasz jel kinetikájának más – például mikroszkópos – jelekhez történő hozzárendelése megvalósítható és így hozzájárulhat a sejtekhez tartozó jelek besorolásához és értelmezéséhez. Felismertük, hogy az érintkeztetés és így az aktivációs szignál során mért válasz 20 jellegét nagyban befolyásolja a felszín funkcionalizálása, megfelelő módon történő előkészítése. Felismertük, hogy az egyedi sejtekhez tartozó inhomogén jelek integrálása (ezzel kapcsolatosan ld. még alább) és neurális hálókkal populáció szinten történő elemzése lehetővé teszi a sejtek karakterizációja mellett azok megkülönböztetését is (ezzel 25 kapcsolatosan utalunk még fentebb a megkülönböztetésről írtakra). Felismertük, hogy a sejtek karakterizációjának kritikus eleme a sejtek megfelelő érintkeztetése során történő folyamatos jelrögzítés (azaz a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jel ilyen rögzítése), amennyiben legtöbb esetben maga a teljes adhéziós folyamat során mért válasz jellegzetességei teszik lehetővé az aktivációs válasz - 11 - karakterizációját. Felismertük, hogy a sejtek érintkeztetését megelőző mérési szakasz során mért jelek alkalmasak a sejtek érintkeztetését követő mérési eredmények korrekciójára is. 5 Felismertük, hogy a sejtekkel történő érintkeztetés során sejtekkel nem érintkező felületen mért válasz mint negatív kontroll, referenciaként felhasználható. Felismertük, hogy a neurális háló betanításához elengedhetetlen klasszifikáció paraméter kinyerhető például fáziskontraszt mikroszkóppal vagy fluoreszcens mikroszkóppal (fluoreszcens, vagy hematológiai festések felhasználást követően 10 vagy azok nélkül). Felismertük, hogy a vérből izolált leukociták különböző stimulusok hatására eltérő effektor funkciókkal reagálnak. Így például a leukocita szubpopulációk válasza, különös tekintettel az inhomogén válaszukra, eltér az immunglobulin és a TLR (Toll- like receptor – Toll-szerű receptor) ligandumok, illetve patogén asszociált 15 molekuláris mintázatokra adott válasz esetében. Felismertük, hogy az érintkeztetés és így a sejt aktiválás során a funkcionalizált felszín által kiváltott specifikus válaszjel megállapításához különösen előnyös a szenzor felszín megfelelő módon történő blokkolása még a sejtek érintkeztetése előtt vagy a közben, vagy azzal egyidőben (ezzel kapcsolatosan hivatkozunk a 20 leírásban a blokkolásról írtakra). Felismertük, hogy az egyedi sejt szinten történő általunk kifejlesztett karakterizáció alkalmas a vérben megtalálható leukocita szubpopulációk elkülönítésére és azok karakterizációjára immunglobulinnak funkcionalizált felszíneken is. Felismertük, hogy az egyedi sejt szinten történő karakterizáció alkalmas a vérben 25 megtalálható leukocita szubpopulációk elkülönítésére is. A fentiekben részletezett felismerések alapján új diagnosztikai eljárásokat is kifejlesztettünk, amely eljárások alkalmasak diagnosztikai feladatok – előnyösen gyors – kivitelezésére. Ezek az új eljárások lehetnek olyan klinikai diagnosztikai eljárások, melyek hiánypótlóan a sejtfunkciót mérik a molekuláris információk - 12 - kiegészítéseként. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli alakja szerint a sejtek rákos elváltozásának vizsgálatára irányul, a bioszenzorhoz alkalmazott mintában ilyeneket alkalmazva. 5 Megjegyezzük, hogy az alábbiakban érintett egyes lépéseket vagy azokkal ekvivalenseket elvégzünk vagy opcionálisan elvégzünk a találmány szerinti betanítási eljáráshoz is, az alábbiak tehát arra is vonatkoztathatók. A találmány egy aspektusa szerint továbbá kiterjedhet egy olyan eljárásra immunológiai reaktivitás antigénen történő vizsgálatára, amelynek során az immunkomplexeket sejtekkel 10 érintkeztetjük, ahol a sejtekkel történő érintkeztetéshez a minta szolgál sejtforrásként vagy a sejtek a mintától eltérő forrásból származnak, kimutatjuk a szenzor bevonaton aktiválódó sejteket, és laterálisan inhomogén jel alapján meghatározzuk az egyes pixeleken mért jelváltozás kinetikai paramétereit. Ezt követően a sejteket eljárásunk szerint fixáljuk megőrizve azok 15 összeegyeztethetőségét további mikroszkópos vizsgálatokkal. Ezt követően az egyedi sejtekhez tartozó szenzoros és előnyösen képi információkat klasszifikációs algoritmus betanításával vizsgálva azonosítjuk az eltérő sejtaktivációs eloszlásokat egy mintában. Ez utóbbit kiemeljük felhívva arra a találmánnyal kapcsolatosan a figyelmet, azzal 20 kapcsolatosan számos szemléltetést és példát adunk a találmányra vonatkozóan a leírásban lejjebb. Az eloszlások további, különböző célirányosan kifejlesztett bevonatokon történő elemzése lehetővé teszi a sejtek forrásának elkülönítését, így például akár egy sejt minta érintettségét egy adott megbetegedésben. A fentieknek is megfelelően a találmány tehát előnyösen az élő sejtekkel végzett 25 vizsgálatok területéhez tartozhat, különösen azon módszerekhez és eszközökhöz, amelyek a sejtek működésbeli (funkcionális) jellemzőinek észlelésére és analízisére szolgálnak. A találmány magában foglalja egy speciálisan és célirányosan előkészített (funkcionalizált) szenzorfelülettel történő sejtminták érintkeztetését, ahol a szenzorfelület kölcsönhatásba lép a sejtekkel. A kölcsönhatás során 30 bekövetkező sejtaktiváció és az azt követő fiziológiai változások azonosításra kerülnek, akár egyedi sejtszintű részletességgel (felbontással). - 13 - Ezt a folyamatot a találmányban előnyösen jelölésmentes, jellemzően biofizikai (pl. optikai) módszerekkel – konkrétan a felületközeli fizikai, kémiai, biológiai sejttulajdonságok (pl. törésmutató változások folyamatos mérése alapján) – végezzük kiváló időfelbontással, amely lehetővé teszi az egyedi sejtek időbeli 5 változásának részletes követését. A találmány további előnye, hogy az előnyösen a kapott kinetikai adatok és mért inhomogén jelek integrációjával, mesterséges intelligencia, különösen neurális hálózatok alkalmazásával, pontosan azonosítja és kategorizálja a különböző sejttípusokat vagy sejt altípusokat, alpopulációkat a vizsgált mintában. 10 A találmányban – adott esetben opcionálisan, egy kiviteli alakban vagy egy szemléltető példa vonatkozásában – alkalmazott eszközökkel kapcsolatosan a következő megállapításokat tesszük. Ezeket a leírás későbbi részében is érintjük. Az itt tárgyalt találmány a sejtek azonosítására és különválasztására irányuló módszerek területén jelent újítást, különösen az egyedi sejtszintű azonosítás és 15 a sejttípusok megkülönböztetése és hatékony elkülönítése, kiválogatása terén. A technika jelenlegi állása szerint a sejtek azonosítása és különválasztása gyakran biomolekuláris jelöléseket vagy más invazív módszereket igényel, amelyek nagymértékben befolyásolhatják a sejtek működését vagy károsíthatják azokat. Ezzel szemben a találmánnyal kapcsolatosan bemutatott módszer egy 20 olyan eljárást eredményez, amely egy funkcionalizált érzékelő megfelelően és célirányosan előkészített felületével történő érintkeztetés során, jelölésmentes módon képes detektálni a sejtek biokémiai és sejtélettani változásait az érintkeztetés során bekövetkező sejtaktiváció és / vagy az általuk kiváltott inhomogén kinetikai jelek alapján. Az érintkeztetés során bekövetkező lokális 25 fizikai, kémiai, és / vagy biológiai sejttulajdonságok pl. konkrétan törésmutató változások folyamatos mérésével, valamint potenciálisan (opcionálisan) a sejtekhez tartozó mikroszkópos jelek és a kinetikai adatok integrálásával, neurális hálózatok segítségével történik a különböző sejttípusok megkülönböztetése a speciálisan előkészített felületen mért inhomogén kinetikai adatokból. 30 Az optikai bioérzékelők pl. a törésmutató változását az érzékelő felületétől 100- - 14 - 150 nm-es tartományban mérik, a rezonanciacsúcsot követve a beesési szög függvényében (optikai hullámvezető fénymódus spektroszkópia, felületi plazmon rezonancia vagy rezonáns hullámhossz / fáziseltolódás, rezonáns hullámvezető rács és rács-csatolt interferometria alkalmazásával) tipikusan nem inhomogén 5 jelekből. Az optikai hullámvezető fénymódus spektroszkópia (OWLS – Optical Waveguide Lightmode Spectroscopy) egy olyan technológia, amely képes az érzékelő felület közelében lévő törésmutató változásainak észlelésére. Ezáltal megfigyelhetőek a sejtek adhéziós folyamatai és a biomolekulák kölcsönhatásai az érzékelő 10 felületével. Az OWLS technológia alkalmazása lehetővé teszi a sejtek és molekulák dinamikus viselkedésének követését valós időben, nagy érzékenységgel (Székács, András, Nóra Adányi, Inna Székács, Krisztina Majer- Baranyi, and István Szendrő.2009. “Optical Waveguide Light-Mode Spectroscopy Immunosensors for Environmental Monitoring.” Applied Optics 48 (4): B151–58.). 15 A felületi plazmon rezonancia (SPR – Surface Plasmon Resonance) egy másik kulcsfontosságú technika, amely az arany vagy ezüst felületek elektronjainak rezonanciáját használja a törésmutató változásainak detektálására. Az SPR képes az érzékelő felületén történő biomolekulák kötődésének nyomonkövetésére, így információt szolgáltatva a molekulák közötti kölcsönhatásokról és kinetikáról. Ez a 20 technika széles körben alkalmazható a gyógyszerkutatásban, a diagnosztikában és a biológiai kutatásokban (Piliarik, Marek, Hana Vaisocherová, and Jiří Homola. 2009. “Surface Plasmon Resonance Biosensing.” Biosensors and Biodetection, 65–88.). A rezonáns hullámvezető rács (RWG – Resonant Waveguide Grating) technológia 25 hasonlóan az OWLS-hez és az SPR-hez, a törésmutató változásait érzékeli, de egy integrált hullámvezető rendszeren keresztül. Az RWG különösen alkalmas a sejtek adhéziós és morfológiai változásainak észlelésére, mivel az érzékelő felület és a sejtek közötti kölcsönhatások finom változásait is képes detektálni (Norbert Orgovan, Boglarka Kovacs, Eniko Farkas, Bálint Szabó, Natalya Zaytseva, Ye 30 Fang, and Robert Horvath. 2014. “Bulk and Surface Sensitivity of a Resonant Waveguide Grating Imager.” Applied Physics Letters 104 (8): 083506.). - 15 - A rács-csatolt interferometria (GCI – Grating-Coupled Interferometry) egy újabb módszer, amely a fény interferencia jelenségét használja a biomolekulák érzékelőfelülethez való kötődésének és leválásának mérésére. A GCI technológia kiváló érzékenységet és specificitást nyújt a molekulák közötti kölcsönhatások 5 tanulmányozásában (Peter Kozma, Andras Hamori, Kaspar Cottier, Sandor Kurunczi, and Robert Horvath.2009. “Grating Coupled Interferometry for Optical Sensing.” Applied Physics. B, Lasers and Optics 97 (1): 5–8.). A fenti módszerek általában átlagolt jeleket mérnek, nem inhomogén jeleken alapulnak. Mindezen technológiák közös jellemzője, hogy jelölésmentes módszerek, amelyek 10 nem igényelnek kémiai vagy biológiai módosításokat a vizsgált mintákon. Ennek köszönhetően a sejtek és molekulák természetes állapotukban, zavartalanul tanulmányozhatók, ami hozzájárulhat a biológiai folyamatok pontosabb megértéséhez és a betegségek hatékonyabb, pontosabb diagnosztizálásához és kezeléséhez. 15 Az ezekre alapuló optikai bioszenzorok alkalmazása így kulcsfontosságú a jelen találmányhoz, amely a sejtek azonosítására és klasszifikációjára irányuló új módszert kínál, különös tekintettel a sejtek érintkeztetésére egy speciálisan előkészített funkcionalizált szenzor felületével és az érintkezés során bekövetkező változások detektálására és a mért inhomogén jelek felhasználására. 20 Az RWG bioszenzorok lehetővé teszik a kutatók számára, hogy nyomon kövessék a sejteknek a szenzor felületéhez való kapcsolódását és leválását (Norbert Orgovan, Beatrix Peter, Szilvia Bősze, Jeremy J. Ramsden, Bálint Szabó, and Robert Horvath.2014. “Dependence of Cancer Cell Adhesion Kinetics on Integrin Ligand Surface Density Measured by a High-Throughput Label-Free Resonant 25 Waveguide Grating Biosensor.” Scientific Reports 4 (1): 1–8.). Ahogy a sejtek megtapadnak, megváltoztatják morfológiájukat vagy biokémiai változásokon mennek keresztül, ezek a tömeg és törésmutató változások pontosan kimutathatók az RWG-vel (Fang, Ye, Ann M. Ferrie, Norman H. Fontaine, John Mauro, and Jitendra Balakrishnan.2006. “Resonant Waveguide Grating Biosensor 30 for Living Cell Sensing.” Biophysical Journal 91 (5): 1925–40.). Ez a technológia akár lehetővé teheti a sejtek adhéziós kinetikájának kvantitatív elemzését is. - 16 - A technika állása szerint alkalmazott módszerek és technológiák jelentősen hozzájárulhatnak a sejtek mélyebb megértéséhez, a betegségek korai diagnosztizálásához és a célzott terápiák fejlesztéséhez. A jelenlegi találmány, amely egy új (előnyösen jelölésmentes) sejtklasszifikációs és sejt-elkülönítő 5 eljárást mutat be, kiegészíti ezeket a meglévő módszereket, lehetővé téve a kutatók és orvosok számára az egyedi sejtek aktivációjának vizsgálatát. Összefoglalóan, a találmány (a tanítási és a kiértékelési eljárás, így a rendszer) alkalmazása hasznos lehet immunterápiás, regeneratív gyógyászati alkalmazásokban és a rákdiagnosztikában, ahol a sejtek további feldolgozása és 10 felhasználása szükséges lehet. Ennek megfelelően előnyösen elérhető a találmánnyal sejt felismerés és funkcionális karakterizáció inhomogén időfüggő jelekből, illetve értelemszerűen előnyösen alkalmazható erre. A RAJZOK RÖVID LEÍRÁSA A továbbiakban a találmány példaképpeni előnyös kiviteli alakjait rajzokkal 15 ismertetjük, ahol az 1A ábra bal oldalán sejt adhéziót szemléltet egy előkészített szenzor felületen, jobb oldalán a sejt és a felület közötti adhéziós pontok mikroszkopikus szerkezetét szemlélteti, az 1B ábra a találmány szerinti tanítási eljárás egy kiviteli alakjának folyamatábrája, 20 a 2. ábra a találmány szerint alkalmazott munkafolyamatok sematikus ábrázolását adja egy kiviteli alakban, a 3A-3B ábrák a találmány szerint alkalmazott munkafolyamatokból a szegmentálás és osztályozás különböző fázisait ábrázolja sematikusan, a 25 4. ábra vetített adhéziós képet és egy sejtes szegmentációs stratégiákat illusztrál, az 5A, 5B és 5C ábrák különböző sejttípusok térbeli és időbeli kinetikáját szemlélteti, a 6A-6C, 7A-7C és 8A-8C ábrák egyedi sejtek bioszenzoros sejtaktivációját 30 szemléltetik B-limfociták, monociták, természetes ölő sejtek esetében, a 9A-9B ábrák egyedi sejtes bioszenzoros sejtaktivációt szemléltet eozinofil granulociták és neutrofil granulociták esetében, a - 17 - 10. ábra intravénás immunglobulinnal (IVIG), majd 10% fötális borjú szérummal kiegészített Rosewall Park Memorial Institute médium (RPMI 1640) blokkoló reagens és sejtes közeg esetén tapasztalható szenzorfelület funkcionalizáció során detektált biomolekuláris rétegfelépülést jellemző hullámhossz eltolódási 5 görbe, a 11. ábra neutravidinen keresztül rögzített citrullinált peptiddel kivitelezett, reumatoid artritiszre pozitív szérummal végzett inkubáció által eredményezett immunkomplex képződés során mért rétegfelépülésre jellemző hullámhossz eltolódási görbe, a 10 12. ábra poliklonális anti-Ig ellenanyagokkal történő funkcionalizáció, majd 0,3% BSA tartalmú PBS-sel Rosewall Park Memorial Institute médium (RPMI 1640) blokkoló reagens hozzáadása során detektált biomolekuláris rétegfelépülést jellemző hullámhossz eltolódási görbe, a 13. ábra Anti-CD3 (klón: SK7) felületi rögzítése (5 µg / ml), majd 0,3%-os, PBS- 15 sel hígított BSA oldat használata felületi blokkolóként. 10% FCS tartalmú Rosewall Park Memorial Institute médium (RPMI 1640) használata a leukocita szuszpenzió sejtes alapvonalának beállításakor, a 14A-14E ábrák egyedi sejtes bioszenzoros sejtaktivációt szemléltet leukociták esetében hat donorból származó vérmintákból, a 20 15A-15L ábrák egyedi sejtes bioszenzoros sejtaktivációt szemléltet leukociták esetében TLR-ligandumok jelenlétében, és a 16A-16B ábrák ChrABC enzim (stimulus) hatása a HeLa sejtek kinetikai görbéire 50% RGD motívumot tartalmazó PLL-PEG bevonaton (50% PPR). A TALÁLMÁNY MEGVALÓSÍTÁSI MÓDJAI 25 A találmány tanítási eljárás bioszenzor sejthez tartozó jelének osztályozására szolgáló rendszer tanítására, amelynél o a rendszer tartalmaz gépi tanuláson alapuló osztályozó modult (a rendszer betanítását, azaz annak osztályozó modulja betanítását végezzük, példaképpen ld.55 osztályozó modult 3B ábrán), 30 o törésmutató-változás meghatározására szolgáló optikai bioszenzor funkcionalizált szenzorfelületével rendre egy vagy több sejtet tartalmazó mintát érintkeztetéssel kölcsönhatásba hozva kapott, aktivációs kinetikát reprezentáló (a minta érintkeztetése tehát ezt az aktivációs kinetikát váltja ki), a bioszenzor - 18 - pixelein meghatározott több szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet alkalmazunk (azaz több minta érintkeztetésével az egyes mintákhoz egy-egy szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet veszünk fel). A bioszenzor jellemzőivel kapcsolatosan megjegyezzük a következőket. A 5 bioszenzorral kapcsolatosan ld. például a 2. ábra felső ágát, amelyben több párhuzamosan mérő 24 bioszenzor van szemléltetve, ugyanakkor az 1A ábrán látható 10 szenzorfelület, valamint az ahhoz érintkeztetett 12 minta is. A minták jellemzően több sejtet tartalmaznak, a sejtek számos ábrán szemléltetve vannak, például szemléltetésképpen a 2. ábra két ágában 32 és 40 sejtek, valamint a 4. ábra 10 bal oldalán 70-76 sejtek. A 2. ábra 28 képén a bioszenzor egy 30 pixele is szemléltetve van. A szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jellel kapcsolatosan ld. a 2. és 3A ábrákon 26 és 42 szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jeleket. A bioszenzor előnyösen felületközeli rétegben törésmutató-változás meghatározására szolgáló optikai bioszenzor (vö. az ilyen szenzorok 15 ismertetésével). A törésmutató-változás meghatározható például a hullámhosszeltolódásból (a törésmutató-változás egyenesen arányos a hullámhosszeltolódással), azaz például ezt a mennyiséget mérjük ehhez, vagy állandó hullámhossz mellett a rezonanciaszög (azaz a rezonanciához tartozó beesési szög) megváltozásából (más módszer is elképzelhető). A találmányban 20 alkalmazott bioszenzort egyes helyeken egyszerűen szenzornak nevezzük. A találmány szerinti tanítási eljárás során a több szenzorfelületi bioszenzor időfüggő jelre, - egy adott szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelben egy vagy több sejthez rendre egy vagy több, az adott szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelnek sejthez 25 tartozó legalább egy (azaz egy vagy több) pixelét tartalmazó tanítási időfüggő bioszenzor jelrészt határozunk meg (a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelben az időfüggő bioszenzor jelrész meghatározását szegmentációnak nevezzük, azaz ezt a meghatározást szegmentációval végezzük; 50, 56b-62b, 56c-62c, 56d-62d, 80b-86b, 80c-86c, 80d-86d tanítási időfüggő bioszenzor 30 jelrészek szemléltetve vannak a 3A és 4. ábrák jobb oldalán és a 3B ábrán bemenetként; valamint ld. ezen lépéshez kapcsolódóan az 1B ábra folyamatábrájának S100 műveleti lépését), és - 19 - - az osztályozó modult az egy vagy több tanítási időfüggő bioszenzor jelrész legalább egyikével (legalább eggyel tanítjuk, egyetlen esetén tehát azzal az eggyel; értelemszerűen lehet olyan tanítási időfüggő bioszenzor jelrész, amit nem viszünk tovább), az adott sejthez tartozó aktivációs kinetika osztályozását 5 tanításhoz rendre megadva (definiálva; ezen azt értjük, hogy az éppen vizsgált sejthez a tanítás során megadjuk az osztályozó modul részére, hogy a sejttel kapcsolatosan tapasztalható aktivációs kinetika alapján milyen osztályozás tartozik ahhoz; betanításkor a tanításhoz az osztályozás, azaz lényegében egy osztályozási adat a sejthez tartozó aktivációs kinetikához természetszerűleg 10 meg van határozva, mivel betanításkor tudatában vagyunk annak, hogy milyen tartalmú tanítóadattal tanítunk), tanítjuk (ld. ehhez kapcsolódóan az 1B ábra folyamatábrájának S110 műveleti lépését). Megjegyezzük, hogy az osztályok – amelyek természetszerűleg minden egyes vizsgálatra mások és mások lehetnek – meg vannak határozva a tanítási eljáráshoz 15 (az osztályozó modul részére, hogy azokat alkalmazhassa), és ezekre tekintettel adjuk meg a tanításhoz az adott sejthez tartozó aktivációs kinetika osztályozását. Az osztályoknak erre a csoportjára lesz a rendszer rátanítva és ezáltal olyan minták kiértékelésére lesz alkalmas (úgyis ilyeneket célszerű a kiértékeléshez beadni annak), amelyek a tanításnak megfelelő sejteket tartalmaznak (olyanokat, 20 amelyeket be tud osztályozni). A fentiekkel kapcsolatban megjegyezzük még, a szenzorfelület mérete egyidejűleg több száz – több ezer sejt vizsgálatát teszi lehetővé – így a betanításhoz előnyösen több tanítási időfüggő bioszenzor jelrészt is felhasználhatunk, a kiértékelésnél (ld. alább) pedig előnyösen akár a populáció eloszlás is vizsgálható, ami a minta 25 szempontjából egy fontos jellemző. A találmány fenti definíciója adja meg tehát a legáltalánosabb kiviteli alakot. A jelen bejelentésben az itt megadott jellemzőket tekintjük megkövetelt találmányi jellemzőknek, számos egyéb helyen érintett jellemzőt, amelyek ezektől elkülönülnek, értelemszerű módon opcionálisnak tekintünk. - 20 - A találmány kiterjed bioszenzor sejthez tartozó jelének osztályozására szolgáló rendszerre is, amely rendszer a találmány egy kiviteli alakja szerinti tanítási eljárással van tanítva és tartalmazza az osztályozó modult. A találmány szerinti betanítási eljárást alkalmazva tehát betanított rendszert kapunk 5 bioszenzor jelének osztályozására. Ez a betanított rendszer tehát alkalmazható osztályozásra. Értelemszerűen a betanítás olyan tanítóadatokkal, olyan osztályokkal zajlik, amelyekre a betanítást követően a betanított rendszert alkalmazni kívánjuk. Erre számos példát ismertetünk a jelen leírásban. A betanított rendszerrel tehát bioszenzor sejthez tartozó jelének osztályozása 10 végezhető, célszerűen tehát egy bioszenzor jelének osztályozására szolgáló eljárással (ezek alkalmazásával kapcsolatosan ld. még a 3A-4. ábrák ismertetésénél írtakat). A találmány egy kiviteli alakjában továbbá a bioszenzor szenzorfelületéről mikroszkóppal felvett, rendre a több szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelhez 15 tartozó több szenzorfelületi mikroszkópos képet alkalmazunk (mindegyik szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelhez tartozik tehát egy-egy szenzorfelületi mikroszkópos kép, ezek az összetartozó párok tehát ugyanarról a tartalomról készülnek, például egy bioszenzorról először felvesszük a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet, majd ugyanarról a bioszenzorról a szenzorfelületi mikroszkópos 20 képet). Ebben a kiviteli alakban tehát mikroszkóppal készített képet is alkalmazunk, ennek szemléltetésére összetartozó párok láthatók a 2. és 3A ábrákon, 26 és 42 szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelek és a rendre hozzájuk tartozó 36 és 44 szenzorfelületi mikroszkópos képek. A jelen kiviteli alakban az egy vagy több tanítási időfüggő bioszenzor jelrészt a 25 következő lépésekben határozzuk meg (ez az 1B ábra szerinti folyamatábra S100 műveleti lépésének kibontása) rendre a több szenzorfelületi mikroszkópos képre (egy-egy szenzorfelületi mikroszkópos képhez tehát egy vagy több tanítási időfüggő bioszenzor jelrész tartozhat, ahogy egy adott szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelhez is): 30 - egy adott szenzorfelületi mikroszkópos képen egy vagy több sejthez rendre tartozó egy vagy több mikroszkópos képrészt határozunk meg (vö. a 3A ábra - 21 - jobb oldalán megjelölt 56a-62a, 80a-86a mikroszkópos képrészekkel, valamint ld. az 1B ábra szerinti folyamatábrán S102 műveleti lépést), - az adott szenzorfelületi mikroszkópos képet és a hozzá tartozó szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet egymásra vetítjük (ld. alább a 3A ábrán az adatok 5 egyesítését, valamint az 1B ábra szerinti folyamatábrán S104 műveleti lépést), és - az egy vagy több mikroszkópos képrész legalább egyikére (értelemszerűen itt is lehet olyan mikroszkópos képrész, amelyet valamilyen okból nem viszünk tovább), az egy vagy több tanítási időfüggő bioszenzor jelrész közül rendre egy 10 adott tanítási időfüggő bioszenzor jelrészhez az egymásra vetítés alapján a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelnek a hozzá tartozó mikroszkópos képrészhez tartozó legalább egy pixelét rendeljük (vö. a 3A ábrával, valamint a 4. ábrával kapcsolatban a fedőpixel alapú szegmentálásról írtakkal, amelynél a 56c-62c, 80c-86c tanítási időfüggő bioszenzor jelrészekhez tartozó pixelek 15 vannak rendelve – amint előbbinek a pixelekhez igazodó körvonala is szemlélteti – az 56a-62a, 80a-86a mikroszkópos képrészekhez, valamint ld. az 1B ábra szerinti folyamatábrán S106 műveleti lépést). A fenti megfogalmazás szerint azokat a mikroszkópos képrészeket, amelyeket felhasználunk, összepárosítjuk az egymásra vetítés alapján hozzájuk tartozó 20 tanítási időfüggő bioszenzor jelrésszel. A legáltalánosabb kiviteli alakban tehát nincs kikötve a szegmentálás módja, azaz például a mikroszkópos kép segítségével végzett szegmentálás (ld. a 3A-4. ábrákon a példaképpen szemléltetett szegmentálási stratégiákat). Felismertük ugyanakkor, hogy szegmentálás során előnyösen lehet mikroszkópos felvételről származó 25 járulékos információt alkalmazni (amint azt érintjük, ezt az információt is rögzíteni lehet, például az időfüggő bioszenzor jel rögzítését követően). Ebben a kiviteli alakban tehát a tanítóadatokat kétféle független input alapján határozzuk meg. Az érintkeztetéssel a funkcionalizált szenzorfelülettel kölcsönhatásba hozott sejtminták sejtjei sok esetben letapadnak a szenzorfelületre, azonban lehetnek 30 olyan sejtek is, amelyek a kölcsönhatás létrejötte ellenére nem tapadnak meg. Ezzel kapcsolatban kiemeljük, hogy a találmány legáltalánosabb formájában, amikor az osztályozáshoz (tehát a tanítóadathoz és utána a rendszer alkalmazása során) csak - 22 - a bioszenzor jelét alkalmazzuk, akkor abban ezek a nem megtapadó sejtek is megjelenhetnek. Az is megjegyzendő, hogy ha nem is tapadnak egyes sejtek le, az opcionálisan alkalmazott fixálással biztosítható, hogy helyükön maradjanak és az opcionális mikroszkópos képen is megjelenjenek. 5 Megjegyezzük, hogy mind a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jel és a szenzorfelületi mikroszkópos kép nevében benne van a „szenzorfelületi” jelző, amely azt mutatja, hogy egyaránt a bioszenzor felületéről készülnek. Ezenkívül a bioszenzor jelét időfüggő bioszenzor jelnek nevezzük, amely – mivel ez a jel is megjeleníthető, ugyanakkor időfüggő – célszerűen egy videojel (azaz képekből álló 10 időfüggő jel, ld. még alább) mint képi megjelenítés. A mikroszkóp emellett egy statikus képet szolgáltat. Ezáltal lesznek ezek képi szinten is egymásra vetítve. A találmány szerinti tanítási eljárás szenzorfelületi mikroszkópos képeket alkalmazó kiviteli alakjában előnyösen: - az alkalmazott több szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet a bioszenzor 15 szenzorfelületéről első előre meghatározott időtartam alatt van rögzítve, és az alkalmazott, rendre a több szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelhez tartozó több szenzorfelületi mikroszkópos kép az első előre meghatározott időtartam leteltét követően van rögzítve; - az előző kiviteli alakban továbbá előnyösen a több szenzorfelületi 20 mikroszkópos kép úgy van rögzítve, hogy az első előre meghatározott időtartam leteltét követően a bioszenzor szenzorfelületén fixálás van végezve; - a több szenzorfelületi mikroszkópos kép a bioszenzor szenzorfelületéről fáziskontraszt mikroszkóppal vagy fluoreszcens mikroszkóppal van rögzítve, 25 vagy a fáziskontraszt mikroszkóppal és a fluoreszcens mikroszkóppal rögzített képek kombinációja. A találmány valamely kiviteli alakja szerinti tanítási eljárásban továbbá az alkalmazott több szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jel úgy van rögzítve, hogy a bioszenzor szenzorfelülete blokkolva van a minta érintkeztetése előtt vagy azzal 30 egyidőben. - 23 - Az alkalmazott szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jel előnyösen jelölésmentes szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jel (értelemszerűen ez esetben a betanításhoz használatos ilyen jelek célszerűen mindegyike). Ezzel kapcsolatosan utalunk a jelölésmentes technikák bemutatására (ennek a megközelítésnek köszönhetően a 5 sejtek és molekulák természetes állapotukban, zavartalanul tanulmányozhatók), amelyek alapján egyértelmű, hogy a „jelölésmentes” fogalomnak a szakterületen pontos jelentése van, arra utal, hogy a jelben a sejtek megkülönböztetésére nem alkalmazunk jelöléseket (pl. festést vagy ellenanyaggal jelölést). Megállapítható, hogy van-e alkalmazva jelölés (azaz ha volt alkalmazva, így az is, hogy 10 jelölésmentes), azaz, hogy egy szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jel jelölésmentes-e, illetve ezek elválaszthatók a jelölést alkalmazó ilyen jelektől. Amennyiben jelölésmentes megközelítést alkalmazunk, nem avatkozunk bele a bioszenzor jelbe. Amennyiben beavatkoznánk, az befolyásolná – akár nem kontrollált módon – a jelet, így a gépi tanuláson alapuló osztályozó modul 15 alkalmazása szempontjából kedvezőbb, ha jelölésmentes szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet alkalmazunk. A találmány továbbá kiterjed bioszenzor sejthez tartozó jelének osztályozására szolgáló kiértékelési eljárásra is, amelynél a találmány szerinti tanítási eljárással tanított (betanított) rendszert alkalmazzuk törésmutató-változás detektálására 20 szolgáló optikai bioszenzor funkcionalizált szenzorfelületével rendre egy vagy több sejtet tartalmazó sejtmintát érintkeztetéssel kölcsönhatásba hozva kapott szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelre (azaz a rendszert alkalmazzuk egy kiértékelésre váró ilyen jelre), amelynek során - a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelben egy vagy több sejthez rendre egy 25 vagy több, a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelnek adott sejthez tartozó legalább egy pixelét tartalmazó időfüggő bioszenzor jelrészt határozunk meg (azaz a kiértékelési eljárás során is meghatározzuk a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelben az egy vagy több időfüggő bioszenzor jelrészt), és - az osztályozó modullal az egy vagy több időfüggő bioszenzor jelrész legalább 30 egyikét osztályozzuk (a fentieknek megfelelően például populáció vizsgálatára kiértékelésnél célszerűen az egy vagy több időfüggő bioszenzor jelrész - 24 - mindegyikét is osztályozhatjuk, azaz a beazonosítható összes sejtet beazonosítjuk). A kiértékelési eljárás egy kiviteli alakjában a rendszer a tanítási eljárásnak a mikroszkópos képeket alkalmazó kiviteli alakjával van tanítva (ez az alábbiak 5 alapján is beazonosítható, mert a kiértékelésnél a tanítási eljárással analóg lépéseket hajtunk végre a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelen és a szenzorfelületi mikroszkópos képen), és alkalmazunk a bioszenzor szenzorfelületéről mikroszkóppal felvett, a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelhez tartozó szenzorfelületi mikroszkópos képet (tehát a kiértékeléshez 10 alkalmazzuk a kiértékelésre váró jelhez a hozzá tartozó szenzorfelületi mikroszkópos képet), valamint az egy vagy több időfüggő bioszenzor jelrészt a következő lépésekben határozzuk meg a szenzorfelületi mikroszkópos képre: - egy adott szenzorfelületi mikroszkópos képen egy vagy több sejthez rendre tartozó egy vagy több mikroszkópos képrészt határozunk meg, 15 - az adott szenzorfelületi mikroszkópos képet és a hozzá tartozó szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet egymásra vetítjük, és - az egy vagy több mikroszkópos képrész legalább egyikére, az egy vagy több időfüggő bioszenzor jelrész közül egy adott időfüggő bioszenzor jelrészhez az egymásra vetítés alapján a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelnek a hozzá 20 tartozó mikroszkópos képrészhez tartozó legalább egy pixelét rendeljük. A következőkben a találmányban alkalmazott egysejtes szegmentálás és osztályozási munkafolyamat egyes előnyös aspektusait adjuk meg, hivatkozva a találmány fentebb adott definíciójára. A találmány definíciójánál a tanítóadat előkészítése kerül előtérbe, ugyanakkor az alábbiakkal kapcsolatosan is kiemeljük, 25 hogy a tanítóadat, majd a betanított osztályozó modullal osztályozandó adat célszerűen hasonló módon kerül előkészítésre az osztályozó modul minél hatékonyabb működése érdekében (célszerűen minél inkább olyan jellegű adatokat kapjon kiértékelésre, mint amilyeneket a betanításhoz alkalmaztunk). A fentebb szemléltetett 50, 56b-62b, 56c-62c, 56d-62d, 80b-86b, 80c-86c, 80d-86d tanítási 30 időfüggő bioszenzor jelrészekkel kapcsolatban megjegyezzük, hogy ezek (ugyanilyenek) a kiértékeléshez is tartozhatnak, azaz a számokhoz tartozhatna az időfüggő bioszenzor jelrész megnevezés. - 25 - A találmányban egy tehát olyan egysejtes kiértékelési munkafolyamatot dolgoztunk ki, amely képes mind a sejtek pontos szegmentálására, mind a különböző sejttípusok pontos osztályozására (ld. az alábbi 5. példát, ahol hét különböző sejttípust osztályozunk, azaz hét különböző osztályba soroljuk azokat). 5 Ezt egy RWG-alapú (Resonant Waveguide Grating – rezonáns hullámvezető rács; ld. másutt is a leírásban) bioszenzor – és előnyösen például fáziskontraszt- mikroszkóp segítségével –, valamint sejtszegmentáló algoritmusok és gépi tanulás használatával és implementálásával valósítottuk meg. A következőkben a találmány egy kiviteli alakjához ismertetünk részleteket, ahhoz, 10 amelyben szenzorfelületi mikroszkópos képeket is alkalmazunk, egyes aspektusokban konkrét részleteket is ismertetve. A következőkkel kapcsolatban hivatkozunk a 2. ábra alábbi ismertetésére is. A munkafolyamatban először a speciális felületérzékeny szenzorral nyert sejtadhéziós kinetikai adatokat vesszük be (ezek a szenzorfelületi időfüggő 15 bioszenzor jelek). Egy példában ez a 2. ábrán is látható 384 lyukú mikrolemezzel történik, amelyen jelenleg tizenkét lyuk párhuzamos mérését tudjuk megoldani; a példa szerinti elrendezésben minden egyes lyukban egy 2 x 2 mm széles, 25 µm térbeli felbontású érzékelő található. Másodszor, az adhéziós méréseket követően előnyösen a lyukakról mikroszkóppal 20 készítünk képeket, egy példában 20x-os optikai nagyítással, Zeiss fáziskontraszt mikroszkóppal. A méréshez alkalmazott lemezt a mikroszkóp alá helyezzük az adhéziós mérést követően, a kísérleti elrendezés módosítása nélkül. A két mintakészlet (adhéziós, tehát a bioszenzor jel és mikroszkópos mérés) kombinálásával rendkívül pontos egysejtes szegmentálást érhetünk el, feltéve, 25 hogy a sejtek a két adatrögzítési folyamat között mozdulatlanok maradnak (ennek teljesülését az irodalmi adatok alátámasztják, mely szerinti a sejtek elmozdulása ilyen időintervallumban nem jelentős; alkalmazható fixálás is, illetve más módon is elérhető ez a feltétel). A fentieknek megfelelően összefoglalóan, a munkafolyamat első részében a 30 mérés során a felületérzékeny szenzorral egysejtes adatokat gyűjtünk, amelyekkel tér-időbeli sejtadhéziós kinetikai adatokat rögzítünk (célszerűen legfeljebb 150 - 26 - percig). A munkafolyamat második részében, ezen adhéziós mérést követően pedig például fáziskontraszt mikroszkópot alkalmazunk a sejtek pontos térbeli adatainak rögzítésére. A mérési fázis befejezése után a sejtadhéziós adatkészlet célszerűen 5 automatikus globális háttérkorrekción megy keresztül (ezzel kapcsolatosan utalunk a felismeréseknél írtak közül arra, hogy a sejtek érintkeztetését megelőző mérési szakasz során mért jelek alkalmasak a sejtek érintkeztetését követő mérési eredmények korrekciójára is, azaz felhasználható ehhez). Ezt követően a mikroszkópos adatokon folytatjuk a sejtek lokalizációját és 10 szegmentálását. Egy sejtmaszkot generálunk, amelyben minden egyes sejt egyedi azonosítót kap a maszkon belül (vö. a 4. ábrával, amelyen négy sejt van kijelölve, előnyösen tehát sejtmaszk segítségével, a sejtmaszkot tehát erre értjük, ami kijelöli a szenzorfelületen lévő sejteket, azaz a sejtek összességét). Ezt követően a két adatkészletet – azaz a sejtadhéziós adatkészletet és a mikroszkópos adatokat 15 – ugyanarra a síkba vetítjük a pontos igazítás érdekében (ezzel kapcsolatosan a 3A ábrának az adatok egyesítésére vonatkozó részére utalunk). Ebben az előnyösen félig automatizált folyamatban a vetítés méretezési tényezőjét a két eszköz dokumentált felbontása alapján határozzuk meg. Ezután a fordítási tulajdonságok például manuálisan kerülnek beállításra, és a méretezési hibák 20 kijavításra kerülnek. Esetlegesen az illesztéshez előnyösen alkalmazhatunk maximális pixel keresést (csúcsdetekciót) a bioszenzor jelén az egyedi sejtek megtalálására, ezek illeszthetők a Cellpose-al kapott szegmentációs maszkkal. Megjegyezzük továbbá, hogy a szenzorfelszínen megjelenő sejtek referenciájaként előnyösen a szenzor sejtekkel nem érintkező vagy jelet nem 25 eredményező felülete szolgálhat. Ennek a folyamatnak a kimenete a vetítési tulajdonságok, amelyeket a következő kiértékelési fázisban dinamikusan alkalmazunk. A vetítést követően az egyes sejtek értékelésre kerülnek. Kezdetben a sejteket egyéni tulajdonságaik alapján szűrjük, majd egy előre meghatározott stratégia 30 szerint szegmentáljuk (ezzel kapcsolatosan a 3A-3B és 4. ábrákkal kapcsolatban leírtakra hivatkozunk). Előnyösen három szegmentálási stratégiát vizsgáltunk (ld. - 27 - a 3A-3B és 4. ábrák leírását): két (Cellpose, manuális), mikroszkópos képekből generált maszkokat tartalmazó stratégiát és egy standard vízválasztószegmentálást, amelyet széles körben alkalmaznak szegmentálásifeladatokhoz. Végül a sejteket egyedi videomintaként – ezek célszerűen a tanítási 5 időfüggő bioszenzor jelrészek, az időfüggésnek megfelelően video, tehát időben változó minták – exportáljuk az osztályozási fázishoz. Amint fentebb érintettünk, előnyösen hasonló módon készítjük elő a betanításhoz az adatokat, majd később a betanított osztályozó működtetése közben. A betanításkor tudatában vagyunk annak, hogy a bioszenzorra milyen sejtet 10 helyezünk (annak megfelelően, hogy éppen tanítást végzünk), így a betanításhoz ez az információ is rendelkezésre áll (más módon is rendelkezésre állhat, amint máshol érintjük is). Az osztályozó működtetése közben pedig értelemszerűen nem ismert, mivel éppen azt kívánjuk megállapítani. Az osztályozási fázisban a minták például CNN-alapú osztályozón / osztályozókon 15 mennek keresztül (akár többfélét is betaníthatunk annak versenyeztetésére, hogy az egyes típusú osztályozók hogyan teljesítenek), amely(ek) az egyes sejttípusok valószínűségeit adják ki (vö. 3B ábrával, amelynél az azon megjelenő a valószínűségi vektort tárgyaljuk). Kísérleteinkben ezzel összefüggésben négy különböző mélytanulás-alapú modellt alkalmaztunk a sejttípusok osztályozási 20 folyamatában. A modellek teljesítményét a szegmentálási stratégia és a mérési idő alapján hét sejttípus adathalmazán mértük és értékeltük két különböző funkcionalizált felületen. A találmány megvalósítási módjaival kapcsolatosan a következőket jelezzük még. A bioszenzor felületének speciális bevonattal történő kialakítása után 25 érintkeztetjük a szenzort a vizsgálandó vagy feldolgozandó mintával és hagyjuk kialakulni a kölcsönhatást a minta és szenzor között. A kölcsönhatás kialakulása során a szenzor rögzít egy időbeli és térbeli jelet (azaz szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet). Az utóbbi jel másnéven egy felületközeli inhomogén jel. A jel rögzítése után a mérési folyamat előnyösen kiegészíthető valamilyen 30 (mikroszkópos) képalkotó technikával, amikor mintát a szenzorból kivéve áthelyezzük egy képalkotásra képes eszközbe majd felvételeket készítünk a - 28 - mintáról. A szenzor által rögzített adatokat és az esetlegesen készült képeket a mintáról adatfeldolgozási módszerekkel kombináljuk. Az így feldolgozott adatokat – a találmány szerinti rendszerben alkalmazott osztályozó modullal implementált – karakterizáló algoritmusba tápláljuk, ami 5 megkülönbözteti a minta alkotóit valamely egyedi / karakterisztikus tulajdonságuk alapján. A minta sejtes alkotói lehetnek kevertek, nagyszámúak mivel a vizsgált felületünk jelentősen kiterjedt, mm-es, cm-es méretű. A találmányban alkalmazott bioszenzor (ld. a következő két bekezdést is) tehát felületközeli jel rögzítésére alkalmas szenzor, amely időben – előnyösen legalább 10 300 másodperces mintavétellel – képes monitorozni a felület feletti előnyösen legalább 150 nm-es távolság által meghatározott térfogatban létrejövő változásokat (legalább ez alatt a távolság / vastagság alatt lévőt biztosan), előnyösen legalább 25 µm-es laterális felbontással. Célszerűen nagy felülettel rendelkezik, mm-es, cm- es méretű, akár összefüggő vagy több párhuzamos elemből áll. 15 A találmányban alkalmazott szenzor előnyösen felületi plazmon rezonancián (SPR – Surface Plasmon Resonance), azaz egy olyan jelenségen alapul, amely akkor következik be, amikor az elektronok egy vékony fémlemezen megfelelő beesési szögű fény hatására gerjesztetté válnak, majd az indukált hideg elektron plazmonok párhuzamosan haladnak a lemezzel. Feltéve, hogy a fényforrás 20 hullámhossza állandó, és hogy a fémlemez vékony, az SPR-t kiváltó beesési szög kapcsolatban áll az anyag törésmutatójával, és még a törésmutató kis változása is azt eredményezi, hogy az SPR megszűnik. Az ezen a technikán alapuló szenzorok tehát képesek a felület közeli rétegben történő törésmutató-változások detektálására. A törésmutató változása arányos a felület közeli térfogat 25 sűrűségének változásával. A rezonáns hullámvezető rácsok (ld. fentebb RWG – Resonant Waveguide Grating) olyan szubhullám hosszúságú struktúrák, amelyek a hullámhossz, a beesési szög és a polarizációs állapot tekintetében szelektíven visszaverik vagy továbbítják a fényt. Ezek a struktúrákon alapuló szenzorok a felület közeli réteg 30 törésmutatójától függően egy széleshullámhosszú fényforrásból csak egy bizonyos hullámhosszt vernek vissza, így a visszavert fény hullámhossz - 29 - változásából következtetni lehet a felület feletti 150 nm vastag rétegben történő sűrűségváltozásra (vö. az 1A ábra bal oldali részével, valamint a 2. ábrával). A találmányhoz alkalmazott bioszenzor egy kiviteli alakban, előnyösen az iméntieknek is megfelelően a következők egyike: 5 - optikai hullámvezető fénymódus spektroszkópia alapú bioszenzor, - felületi plazmon rezonancia alapú bioszenzor, - rács-csatolt interferometria alapú bioszenzor, - rezonáns hullámvezető rács alapú bioszenzor. A (sejt)minta sokféle típusú és / vagy eredetű biológiai mintát jelenthet, így például 10 vért, vagy bármilyen más egyedi sejteket tartalmazó folyadékot, testfolyadékot. A biológiai minta fogalmába beleértjük a biológiai eredetű mintákat is. A minta jellemzően tartalmaz olyan sejteket, amik a felületi bevonattal képesek kölcsönhatásba lépni. A „minta” kifejezés klinikai mintát is jelenthet, továbbá teljes vért, sejtfelülúszókat, 15 szérumot, plazmát, biopsziával nyert sejteket, tenyésztett sejteket és más biológiai folyadékokat, és ezek bármelyikéből nyert tisztított (tiszta) vagy dúsított mintát. A minta származhat állatokból, pl. emlősből, így például emberből. Ezek a minták a szakmában ismert eljárásokkal állíthatók elő, így például lízissel, frakcionálással, tisztítással, pl. affinitástisztítással, FACS-szal (Fluorescence-activated Cell 20 Sorting – fluoreszcencia-aktivált sejtválogatás), lézeres mikrodisszekcióval vagy preparatív centrifugálással. A leírás szerinti értelemben a „teljes vér” alvadásgátlót nem tartalmazó vagy alvadásgátolt vér, forrását illetően lehet pl. vénás vér vagy előnyösen ujjbegyből vett kapilláris vér. 25 A leírás szerinti értelemben a „sejtek” az élet alapvető egységeit jelentik, biológiai értelemben. A sejtek mint a legegyszerűbb biológiai egységek, rendelkeznek mechanizmusokkal a külvilágból érkező ingerek dekódolására és az ingerekre történő reagálásra. Jelenlegi tudományos és technológiai ismereteink lehetővé teszik a sejtek módosítását, amely módosítások a félszintetikus sejtformáktól a 30 genetikai módosításokon át, anyagcsere módosításokig és kémiai módosításokig - 30 - terjednek. Minden ilyen módosított sejt vagy sejtforma is beleértendő a találmány körébe. A "mesterséges sejt" olyan sejt, vagy sejtszerű entitás, amelyet mesterségesen, laboratóriumi vagy technológiai módszerekkel hoznak létre azzal a céllal, hogy 5 utánozzák, helyettesítsenek, vagy kiegészítsenek természetes sejtfunkciókat. Ezek a mesterséges sejtek lehetnek teljesen szintetikusak, ami azt jelenti, hogy nem biológiai anyagokból készülnek, vagy félszintetikusak, amikor valós sejtek módosításával jönnek létre. A mesterséges sejtek tervezése és létrehozása magában foglalhat genetikai módosításokat, anyagcsere módosításokat, valamint 10 a sejtmembrán vagy más sejtkomponensek kémiai módosításait. Céljuk lehet tudományos kutatás, betegségek kezelésének fejlesztése, biotechnológiai alkalmazások, vagy akár szennyező anyagok lebontásának elősegítése. Mesterséges sejtek felhasználhatók a biológiai folyamatok alaposabb megértésére, új terápiás módszerek kifejlesztésére, vagy akár életmimikri 15 alkalmazásokra is, ahol az élet jellemzőit utánozzák vagy szimulálják mesterséges környezetben. A találmány szerint alkalmazott szenzor felületi bevonattal van ellátva, azaz szenzorfelülete funkcionalizálva van. A felületi bevonat célszerűen bármely olyan biológiai aktív anyag lehet, ami 20 monoréteget vagy multiréteget tud képezni a szenzor felületén és előnyösen nem vastagabb, mint 1000 nm. A letapadó sejteken lévő integrineken keresztül kiváltott sejtadhézió detektáláshoz sejtfelszíni receptorhoz specifikus ligandumok (pl. RGD (arginil-glicil-aszparaginsav) motívum). A letapadó sejtek szélesebb körű vizsgálatához bármely extracelluláris fehérje vagy aptamerek, szintetikus 25 receptorok is alkalmazhatóak. Immunológiai reaktivitás vizsgálata során direkt vagy indirekt módon ellenanyagokat vagy antigéneket rögzítünk a felszínhez vagy a felszíni réteghez. Antigének esetében azokat vérszérum vagy vérplazma mintákkal inkubálva immunkomplexeket hozunk létre (például biotinilált citrullinált peptidek 30 neutravidinnal funkcionalizált felületekre történő rögzítésével) és az ezeken mutatott leukocita aktiváció alapján jellemezzük a szérummintákat (ezzel - 31 - kapcsolatosan hivatkozunk a 11.ábrára). Ellenanyagok rögzítése esetében vagy valamely leukocita alpopulációkra specifikus ellenanyagokat rögzítünk a felszínhez (pl. CD3, CD4, CD8, CD19 (CD mint Cluster of differentiation, azaz megkülönböztetési klaszter) vagy sejtfelszíni 5 Immunglobulin specifikus ellenanyagok, ld.12-13. ábrák),vizsgálva az azok által kiváltott specifikus sejtes aktiváció során mért jeleket. Egy másik megvalósításban a rögzített ellenanyagok specificitása irreleváns, és azok Fc – fragment crystallizable, azaz kristályosítható fragmentum – régiója által kiváltott effektor funkciók megállapításának céljából vizsgáljuk a sejtek (ld.6A-10. 10 ábrák és 14A-14E ábrák). Egy másik elrendezésben egyéb biológiailag potenciálisan aktív hatóanyagok jelenlétében vizsgáljuk a hatóanyagok (például TLR (Toll-like receptor – Toll-szerű receptor) ligandumok) effektor funkciókra gyakorolt hatását (ld.15A-15L ábrák). Az aspecifikus jelek elkerülésének érdekében a felszínt annak elkészítését 15 követően, illetve annak során például biológiailag inert fehérjékkel vagy polimerekkel, aptamerekkel blokkoljuk. Az RGD, arginin, glicin és aszparaginsavból aminosavakból felépülő tripeptid. Képes hozzákötődni a letapadó sejtek felületén található integrin transzmembrán fehérjékhez. (ld. 1A ábra jobboldali rész, valamint 16A-16B ábrák) Az integrin 20 transzmembrán fehérjék az extracelluláris térben található molekulákhoz, például az extracelluláris mátrixhoz vagy más sejtekhez kötődnek, míg az intracelluláris térben jelátviteli útvonalakat aktiválnak. Az extracelluláris fehérjék olyan fehérjemolekulák, amelyek a sejtek közötti térben találhatók és fontos szerepet játszanak a sejtek közötti kötődésben, 25 kommunikációban és strukturális támogatásban. A fibronektin és laminin olyan extracelluláris mátrix fehérjék, amik a sejtek közötti kötődésben játszanak fontos szerepet, felületi bevonatként való alkalmazásuk során a letapadó sejtek képesek kölcsönhatásba lépni velük integrin, stb.receptorainkon keresztül. A találmány egy kiviteli alakjában előnyösen alkalmazott képalkotó technikán 30 bármely olyan (a következőknek megfelelően tehát előnyösen mikroszkópos) - 32 - képalkotó technikát értünk, amelynek elégséges a felbontása és látótere, hogy az egész szenzorral mért felületről képes legyen felvételt készíteni miközben a minta egyes alkotóit is felbontja. A fáziskontraszt, fluoreszcens és egyéb mikroszkópos technikák ajánlottak a sejtes mintákhoz. 5 A fáziskontraszt mikroszkópia egy olyan képalkotási technika, amely lehetővé teszi a fáziskülönbségek vizsgálatát az élő sejtekben vagy más optikailag átlátszó mintákban. Ezt a módszert általában fénytörési különbségek kihasználásával valósítják meg, amelyek akkor jelennek meg, amikor a fény áthalad egy mintán, és a minta különböző részeiben eltérő sebességgel terjed (a 2. ábrán az alsó 10 sorban egy ilyen módon rögzített kép látható). A fluoreszcens mikroszkópia olyan vizsgálati technika, amelyben a minta fluoreszcens jelölőkkel van ellátva, és a mikroszkóp kifejezetten ezen jelölők fényének vizsgálatára van tervezve. A fluoreszcens mikroszkópiában a mintát olyan anyagokkal jelölik meg, amelyek képesek az abszorbeált fotonokat másik 15 hullámhosszúságú fotonokká alakítva kibocsátani. A technika lényege, hogy a mintára irányított specifikus hullámhosszúságú fény gerjeszti a jelölő molekulákat, amelyek ezt követően fluoreszcens fényt bocsátanak ki. A mikroszkóp a minta fluoreszcens fényét rögzíti, miközben a háttérfényt kiszűri. Ezáltal a vizsgált terület csak a fluoreszcens jelek fényét mutatja, ami kiemeli a jelölt elemeket vagy 20 struktúrákat a háttérszennyeződéstől. A találmányban alkalmazott adatfeldolgozási rendszer előnyösen a szenzor által rögzített jelet és a képalkotó technika által készített felvételt kombináló adatfeldolgozó módszer. Sejtszegmentáló algoritmusokat használ (ld. alább a példaképpen alkalmazott ilyen algoritmusokat, valamint a 3A és 4. ábrák leírását, 25 amelynél ezek példaképpeni alkalmazása van szemléltetve), hogy a képalkotó technika által készített felvételen kijelölje az egyedi sejteket, amelyeket így a szenzor által rögzített 2D-s jelre lehet vetíteni (vö.3A ábra adatok egyesítésére vonatkozó részével). A sejtszegmentáló algoritmusok olyan szoftveres megoldások, amelyek a 30 képfeldolgozás és a gépi tanulás módszereit alkalmazzák sejtek felismerésére és szegmentálására. A sejtszegmentáló algoritmusok lehetnek egyszerűbb kézi - 33 - beavatkozással támogatott megoldások vagy teljesen automatizált rendszerek, amelyek nagy pontossággal és hatékonysággal képesek azonosítani és szegmentálni a sejteket a képeken, mint például a kézi szegmentáció, a watershed algoritmus és a Cellpose algoritmus. 5 A kézi szegmentációnál kézzel körül rajzoljuk a minta alkotóinak körvonalát. Ez a technika a legpontosabb, de a legidő- és ember igényesebb is (ez 4. ábra jobb oldalának felső sorához nagyon hasonló lenne, ld. még 5A-5C ábrák). A watershed algoritmus (azaz vízgyűjtő algoritmus, ld. Rogowska, J. (2000). Overview and fundamentals of Medical Image segmentation. Handbook of Medical 10 Imaging, 69–85.) egy képfeldolgozási eljárás, amelyet általában objektumok vagy régiók szegmentálására alkalmaznak digitális képeken. Az eljárás az intenzitásokat használja úgy, mintha azokat egy topográfiai térképen lennének, és a kép "vízmosásával" a "medencékbe" kerülő vízmennyiségek alapján határozza meg az egyes objektumok vagy régiók határait. A watershed algoritmus lépései 15 között szerepelnek a képen található minimális pontok azonosítása, majd ezekből kiindulva a vízszint emelése és a "medencék" kialakítása, amelyek a végső szegmentáció határait jelentik (ld. 3A-3B ábrákon más megközelítésekkel összevetésben, valamint a 4. és 5A-5C ábrákon). A Cellpose egy olyan mélytanuláson alapuló szoftveres eszköz, amelyet a sejtek 20 automatikus felismerésére és szegmentálására fejlesztettek ki mikroszkópos képeken (ld. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., & Pachitariu, M. (2021). Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature methods, 18, January 2021, pp.100-106; Pachitariu, M. & Stringer, C. (2022). Cellpose 2.0: how to train your own model. Nature methods, 19, December 2022, pp.1634-1641). 25 Az algoritmus képes azonosítani és elkülöníteni a sejteket a háttértől, valamint meghatározni a sejtek körvonalát és méretét. A Cellpose képes kezelni különféle sejttípusokat és alakokat, és hatékonyan működik akár nagy mennyiségű képen is. A módszer hátterében mélytanulási technikák állnak, amelyek segítségével az algoritmus tanul a nagy mennyiségű annotált adatbázisokból, és képes a képek 30 közötti mintázatokat és jellemzőket felismerni és megfelelően szegmentálni (vö. 3A-5C ábrákkal). - 34 - A fentieket a következőképpen összegezhetjük. A karakterizáló algoritmus előnyösen a szenzor (bioszenzor) által mért adatok és a képalkotó technikával készült felvételeket (mikroszkópos képet) kombináltan felhasználva a mintában lévő alkotók valamilyen tulajdonsága (például rákos / egészséges, milyen típusú 5 rákos) alapján csoportosítja, illetve megkülönbözteti azokat (ld. a 3A-3B ábrákon szemléltetett működést). A találmányban a karakterizáló algoritmus gépi tanuláson alapuló osztályozó modul alkalmazásával látja el ezt a feladatot. Az osztályozó modul tanítóadatait a találmány definíciójának megfelelően kizárólag a bioszenzor által mért adatokból vagy előnyösen az imént említett kombináció alapján állítjuk 10 elő. Ennek egyes kiviteli alakok szerinti szemléltetését is adjuk az alább ismertetett ábrákkal kapcsolatosan. Alább tehát a szemléltető ábrák részletesebb leírását adjuk meg. Hivatkozunk itt is a találmány definíciójára; a találmány egyes aspektusainak megértésében segítséget jelentenek az alább ismertetésre kerülő ábrák. 15 Az 1A ábra a sejtadhéziót szemlélteti egy előkészített 10 szenzorfelületen. Az 1A ábra bal oldalán egy tipikus letapadt 12 minta (a szemléltetésben: egyetlen sejt) látható, amely egy bioszenzor (a leírásban számos helyen röviden: szenzor) felületére, azaz a 10 szenzorfelületre tapad. A szenzor felületén a sejt jelenlétéből és állapotából származó jel detektálható. Az 1A ábra ezen baloldali részén 20 szemléltetve van még a 10 szenzorfelület mentén 14 evaneszcens tér. Az 1A ábrán a 10 szenzorfelület alatt szemléltetve van 16 nyilakkal a fényforrás fénye, valamint 18 nyíllal a szenzorfelületi jel. Az 1A ábra jobboldali része a sejt és a felület közötti adhéziós pontok mikroszkopikus szerkezetét mutatja be a jelölés szerinti nagyított rajzon (fokális 25 adhézió). A fokális adhéziós komplexumok kulcsfontosságú fehérjéket tartalmaznak, amelyeket a nagyított rajz mellett, annak jobb oldalánál feltüntettünk, mint például paxillin, talin, vinculin, és fokális adhéziós kináz (röviden FAK – Focal Adhesion Kinase), valamint az integrin alfa és béta egységeit, amelyek összekapcsolják a sejt vázát a felülethez kötő molekulákkal, mint a poli- 30 L-lizin (PLL – Poly-L-Lysine), polietilén-glikol (PEG – Poly(ethylene glycol) és az RGD szekvencia (ezek beazonosíthatók a nagyított rajzon alakjuk és színárnyalatuk alapján). - 35 - A 2. ábra a mérési munkafolyamat sematikus ábrázolása. Ez részletezi működési folyamatokat és a mért adhéziós komplexeket. Az adatok rögzítése két fázisban történik, ezt szemlélteti a 2. ábra felső és alsó ága. Először felületérzékeny szenzorral rögzítjük az adhéziós kinetikai adatokat (felső ág), majd ezt követően 5 fáziskontraszt mikroszkóppal rögzítjük az egyes lyukakat a rendkívül pontos térbeli adatokhoz (alsó ág). A 2. ábra a bal oldalon a példaképpen alkalmazott 20 lemez, amely egy példában egy 384 lyukú plate (azaz lemez). A 2. ábrán a felső ágban ennek nagyítva látható egy részlete, amely tizenkét párhuzamosan mérő szenzort szemléltet, láthatók a 20 10 lemez 22 lyukai és azokban 24 bioszenzorok. Az egyik 24 bioszenzorhoz tartozó példaképpeni (szemléltető) kép ki van nagyítva a 2. ábrán jobbra haladva, ami egy egyedi sejt hullámhosszeltolódási (WS – wavelength shift) térkép, azaz 26 szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jel. Amint a 2. ábrán is fel van tüntetve, hogy a példaképpeni kinagyított terület 2 x 2 mm-es. 15 A 2. ábra szemlélteti azt is, hogy ennek egy további, 28 képet alkotó részlete meg van jelenítve nagyítva. A 2. ábrán fel van tüntetve, hogy a 28 kép, 150 µm (6 pixel) széles. A 28 képen szemléltetésként egy példaképpeni 30 pixel és 32 sejt fel van tüntetve. A 2. ábra alsó ágán képalkotó technikaként 34 mikroszkópot (ez egy sematikus, 20 példaképpeni mikroszkóp) feltüntetve az van szemléltetve, hogy a 34 mikroszkóppal is készítünk képet a szenzorról. Az alsó ágban jobbra haladva egy példaképpeni (szemléltető) 36 szenzorfelületi mikroszkópos kép látható, amelyen látható az adott 22 lyuk széle is és be van rajta jelölve a 2 x 2 mm-es rész, ami illeszthető a 24 bioszenzorból kapott, 26 szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelen 25 megjelölt ugyanekkora területtel (ld. még alább). A 36 szenzorfelületi mikroszkópos képből szintén ki van nagyítva szemléltetésként 38 kép, amely egy példaképpeni 40 sejtet ábrázol. A 3A-3B ábrák az egysejtes szegmentálás és osztályozás munkafolyamatának különböző fázisainak sematikus ábrázolását adják. - 36 - A 3A-3B ábrákon látható folyamatok a következőképpen foglalhatók össze. A 3A- 3B ábrákon a képeken ábrázol tartalmi részletek természetesen minden esetben csak példaképpeni tartalmak, a szemléltetést szolgálják. Először az előfeldolgozási fázis történik, ahol mind a mikroszkópos, mind a 5 szenzoros inhomogén jel minták előfeldolgozásra kerülnek. Ezzel kapcsolatosan a 3A ábrán amint 42 szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelből – azaz bioszenzor képsorozatból – adatfeldolgozással feldolgozott 46 szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet, 44 szenzorfelületi mikroszkópos képből – azaz a szenzorról alkotott képből – adatfeldolgozással feldolgozott 48 szenzorfelületi mikroszkópos 10 képet kapunk. A 42 szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jel és a 44 szenzorfelületi mikroszkópos kép bemeneti adatok, amelyek a 2. ábra 24 bioszenzorával, illetve a 34 mikroszkóppal való mérés során kerültek rögzítésre. A feldolgozott 46 szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet úgy kapjuk, hogy a bioszenzor adatoknál megtörténik a globális háttérkorrekció, ahol a jelben hordozott zaj- és offset- 15 komponenseket eltávolítjuk, célszerűen háttérpixelek kiválasztásával, és azzal való korrekcióval. A feldolgozott 48 szenzorfelületi mikroszkópos képen pedig a már betanított Cellpose szegmentációs modell segítségével szegmentációs maszkot van generálva a fáziskontraszt mikroszkópos képhez. Továbbá a mikroszkópos képek alapján szegmentálási maszkot generálunk 20 (célszerűen így generálhatók a mikroszkópos képeken sejthez tartozó mikroszkópos képrészek, ld. a 3A ábra jobb oldalán 56a, 58a, 60a, 62a mikroszkópos képrészeket). Ezt követően a két mintát egymásra vetítjük, a képeket méretre vágjuk (vö. első 52 és második 54 köztes képpel, amelyek az adatok egyesítéséhez tartoznak), és 25 az egyes sejteket különböző szegmentálási stratégiák segítségével elkülönítjük (ez van szemléltetve a 3A ábra jobb oldalán az egyedi sejt kiértékeléshez tartozó, szaggatott vonallal jelölt 51 blokkban, szemléltetve a különböző szegmentálási stratégiákkal kapott 56b-62b, 56c-62c és 56d-62d tanítási időfüggő bioszenzor jelrészeket). 30 Amint a 3B ábra szemlélteti, végül a minták (vö. a 3B ábrán szemléltetett, az egyedi sejt mintákhoz tartozó 50 tanítási időfüggő bioszenzor jelrésszel, ezek az - 37 - időfüggésnek megfelelően sorozattal vannak szemléltetve) osztályozása gépi tanuláson osztályozó modul (pl. CNN-alapú osztályozók, ld. az ábrán 55 osztályozó modult, amely az azt példaképpen megvalósító neurális háló vázlatos rajzával van szemléltetve; ez tehát egyedi sejt klasszifikációt végez) segítségével 5 történik, amelyek egy sejttípus valószínűségi vektort adnak ki (ez alapján lehet a betanítás során az osztályozás helyességét is visszaellenőrizni; jelentéséből természetszerűleg adódóan a valószínűségi vektor tanításkor, az osztályozás eredményének tudatában egyértelműen kiadja a meghatározott osztályt – abban van véges értéke, mindenütt máshol zérus –, ez használható a betanítás során). 10 Ez egy sejttípus valószínűségi pontszám arra vonatkozóan, hogy az aktuálisan vizsgált minta az osztályozó modul megállapítása szerint a betanítás során alkalmazott osztályok közül mely osztályba milyen valószínűséggel tartozik (vö.65 valószínűségi vektorral – ennek színei a szemléltetéshez tartoznak –, illetve 67 valószínűségi görbével, amely a 65 valószínűségi vektor egyes komponenseinek 15 amplitúdóját illusztrálja – ennek a lefutása is pusztán a szemléltetést szolgálja). A valószínűségi vektornak megfelelően tehát azt, hogy a találmány a bioszenzor jelének osztályozására irányul, úgy is vehetjük, hogy a rendszer a valószínűségi vektor segítségével az osztályozást segíti, azaz támpontot szolgáltat a sejt besorolására. 20 Megjegyezzük, hogy az időfüggő bioszenzor jelrész az adott sejthez tartozó legalább egy pixelt tartalmaz (tehát adott sejthez tartozó pixelt, ami legalább egy, azaz egy vagy több). Az ilyen időfüggő bioszenzor jelrészek szemléltetve is vannak a 3A és 4. ábrákon. Az időfüggő bioszenzor jelrész ugyanakkor tartalmazhatja a sejt környezetét (mintegy háttérként), amelyre lehetett 25 alkalmazva háttérkorrekció, de a szegmentáláshoz képest (azaz a 3A és 4. ábrákon szemléltetett jelrészekhez képest) kívül lévő rész értelemszerűen akár ki is nullázható, mivel ismerjük a szegmentált részt. Az 50 tanítási időfüggő bioszenzor jelrész – a rajta látható információ csak szemléltetés – tehát tekinthető úgy, hogy tartalmaz hátteret vagy kinullázott részeket is (ezekkel lett négyzet 30 alakúra hozva). - 38 - A fenti összefoglalás után a 3A-3B ábrák segítségével egyes folyamatokról részletesebb ismertetést adunk. A 3A és 3B ábrák szerkezete tehát a folyamatot szemlélteti (először a 3A ábra szerinti lépések, majd a 3B ábra szerinti lépések). 5 A 3A ábrán – a szaggatott vonaltól balra lévő bemeneti és adatfeldolgozáshoz tartozó részek után – az első 52 köztes képen tehát az adatok egymásra illesztése van szemléltetve, ezt mutatja a szaggatott vonalra tett egybefogó nyíl is. Az első 52 köztes képen látható a 44 szenzorfelületi mikroszkópos képből származóan a mért tartalom körül a méréshez tartozó lyuk széle, valamint azzal körülvéve az erre az 10 adatra ráillesztett, a 42 szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelből származó 53 belső kép. A második 54 köztes képen a méretre vágással kapott kép látható, amely az 53 belső képhez tartozik. A 3A ábrán az 51 blokkban szemléltetett egyedi sejt kiértékelés, azaz az 56a, 58a, 60a, 62a mikroszkópos képrészek, illetve 56b-62b és 56c-62c tanítási időfüggő 15 bioszenzor jelrészek kijelölése van szemléltetve. A 3B ábrával összefüggésben: az 50 tanítási időfüggő bioszenzor jelrészt úgy kapjuk, hogy a különböző szegmentálási stratégiákkal kapott egyes 56b-62b és 56c-62c tanítási időfüggő bioszenzor jelrészeket – attól függően, hogy melyeket szándékozzuk tanítóadatként felhasználni – továbbvisszük a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor 20 jelből, amelyből származnak (ld. ezzel kapcsolatosan még az 50 tanítási időfüggő bioszenzor jelrészről írtakat). Ennek megfelelően a 3B ábra szemléltetheti az 55 osztályozó modul tanítását (ekkor a tanítóadattal megkapja azt is, hogy az milyen sejthez, tartalomhoz tartozik – ezt az információt vagy eleve ismerjük a megfelelő sejteket tartalmazó minta 25 alkalmazásának megfelelően vagy utólagos vizsgálattal is megállapíthatjuk –, ld. még fentebb a találmány definíciójánál), ugyanakkor szemléltetheti a betanított 55 osztályozó modul működését is, amelynek működés közben is célszerűen szegmentálással kapott időfüggő bioszenzor jelrészt adunk és az – előnyösen meghatározva a valószínűségi vektort – elvégzi a kapott időfüggő bioszenzor 30 jelrész osztályozását is. - 39 - A 4. ábra a vetített adhéziós kép (ld. fentebb az adhézióról írtakat) és az egysejtes szegmentációs stratégiák illusztrációját adja (tartalma tehát csak a szemléltetést szolgálja). A szegmentáláshoz három stratégiát alkalmaztunk (a 4. ábra bal oldali 75 képén 5 fehér körvonallal megjelölt 70, 72, 74, 76 sejtekhez tartoznak a 4. ábra jobb oldalán látható négyszer négy négyzet képei; a szemléltetett sejtek az egyes oszlopokon belül ugyanazok és a különböző oszlopok rendelhetők a 75 képen fehér körvonallal megjelölt 70, 72, 74, 76 sejtekhez). A 4. ábra jobb oldalán a harmadik sorban látható sötétebb (eredetileg kék) körvonalak 10 a fedőpixel-alapú szegmentálást (M) szemléltetik, ahol a pixelek akkor kerülnek kiválasztásra, ha a mikroszkóp által szegmentált – vö. ezeket az első sorban látható (eredetileg piros) körvonallal – felületet metszik. Ezt használjuk a Cellpose prediktált maszk (P) szegmentálására (tehát az első sorban kapott, sejthez tartozó 80a-86a mikroszkópos képrészek segítségével meghatározzuk a harmadik sornak 15 megfelelően, hogy bioszenzornak mely egy vagy több pixele tartozik a mikroszkópos képrészhez – azaz a prediktált maszk egy eleméhez, mivel a prediktált maszkban több is lehet, ezek a különálló részeket (ld.4. ábra jobb oldala) aztán egyesével tekintjük –, ezek lesznek 80c-86c tanítási időfüggő bioszenzor jelrészek; vö. a Cellpose-ról fentebb írtakkal). A jobb oldalon az utolsó sorban 20 látható világosabb (eredetileg sárga) körvonal a vízgyűjtő-alapú szegmentálási stratégiát (W) szemlélteti (80d-86d tanítási időfüggő bioszenzor jelrészek; ld. fentebb a watershed algoritmusról leírtakat). A maximális pixel a második sorban világosabb (eredetileg zöld) egyetlen kijelölt pixel képenként, azaz 80b-86b tanítási időfüggő bioszenzor jelrészek. 25 A fedőpixel-alapú szegmentálásnál tehát a sejthez a mikroszkópos kép alapján prediktált maszkot használjuk fel (a prediktáláshoz például a fentiekben is említett Cellpose algoritmust alkalmazzuk – a fentieknek megfelelően ez a szenzorfelületi mikroszkópos képre van hattatva –, a maszk prediktálására, azaz a sejthez tartozó mikroszkópos képrész meghatározására más algoritmus is alkalmazható). Ezt 30 szemlélteti a 3A ábra jobb oldali részén az 51 blokkban egymásra helyezett, mikroszkópos képrészekhez és tanítási időfüggő bioszenzor jelrészekhez tartozó körvonalak egymáshoz viszonyított helyzete: például 56a mikroszkópos képrész és - 40 - az 56c tanítási időfüggő bioszenzor jelrész, azaz ezek körvonalainak összevetésével látható, hogy olyan pixelekre terjed ki az 56c tanítási időfüggő bioszenzor jelrész, amelyekbe belelóg az 56a mikroszkópos képrész. Az 51 blokk többi képén is megfigyelhető ez rendre 58a, 60a, 62a mikroszkópos képrészek és 5 58c, 60c, 62c tanítási időfüggő bioszenzor jelrészek összevetésével. A maximális pixel kiválasztásával lehetőség van a bioszenzor adatok idősor alapú kiértékelésére, azaz ezen megközelítésben pusztán a bioszenzor szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelére támaszkodunk, azaz ekkor mikroszkópos adatot nem használunk fel (a 4. ábrán az ehhez tartozó második sorban látható, hogy egyetlen 10 pixel van kijelölve a bioszenzor jelének pixelei közül, a csak szemléltetésként itt is feltüntetett sejtet mikroszkópos adatait nem használjuk, nem jön onnan maszk, stb; hasonlóan nem használjuk fel a mikroszkópból származó adatokat a watershed algoritmus alkalmazása esetén sem, ld. alább). Ezen kiválasztásban azt a pixelt rendeljük a sejthez, amely az vizsgált időfüggés 15 során a legnagyobb értéket veszi fel (ezt meghatározhatjuk az egyes pixelekhez tartozó jelek kiintegrálásával, majd ezek közül a legnagyobb választásával, azaz az integrálértékek közül választjuk a maximálist; ezzel kapcsolatban hivatkozunk fentebb, az inhomogén jelek, kinetikai adatok integrálásáról írtakra). Ezeket értelemszerűen egy adott sejthez tartozóan kell érteni (például adott 20 pixeltávolságon belül és egy adott minimális aktiváció érték felett), ugyanakkor természetesen az így kapott tanítási időfüggő bioszenzor jelrészben megmarad az időfüggés, azaz ekkor is időfüggő tanítóadatot alkalmazunk. Megjegyezzük, hogy a 6A ábrától kezdődően több ábrán előkerül a sejthez hozzárendelhető maximális szenzor (azaz pixel) jel kinetikájának szemléltetése; 25 ezek a fentiek szerint megkapott pixelhez tartozó bioszenzor jelet szemléltetik. A watershed algoritmus alkalmazása is tehát a bioszenzor szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelét használja fel, így határozzuk meg azzal a tanítási időfüggő bioszenzor jelrészt, azaz ezen a területen hagyjuk meg az időfüggő jelet, vö. a watershed algoritmussal leírtakkal. A watershed algoritmuson alapuló 30 szegmentációhoz felhasználásra kerül a maximum pixel megállapítása során alkalmazott csúcsdetekció, amely megadja a kiválasztott sejtszegmensek - 41 - középpontját, valamint az alkalmazott minimális aktivációs határérték segítségével meghatározásra kerül egy szenzormaszk ahol a sejtek elhelyezkedhetnek. A watershed algoritmus a csúcsdetekció során megállapított pontok között fogja felosztani a szenzorpixeleket úgy, hogy a lehetséges szenzorok a minimális 5 határértéket túllépő pixelekből kerülhetnek ki. (A watershed algoritmus futása során a feltöltött medencék a sejtcsúcsok körüli magasabb aktivációs régiókba tartozó pixelekkel egyenértékűek.) A fentebb, a 3A-4. ábrákon szemléltetett mikroszkópos képrésszel és tanítási időfüggő bioszenzor jelrészekkel kapcsolatosan megjegyezzük, hogy annak 10 megfelelően, hogy a betanításhoz ilyen módon előkészített képeket, adatokat alkalmazunk, az adatokra az előkészítési lépések (szegmentálás, akár a mikroszkópos képrész felhasználása az egyes sejtek beazonosításához) előnyösen alkalmazhatók a betanított, bioszenzor jelének osztályozására szolgáló rendszer használata során is, azaz, amikor a betanított rendszerrel bioszenzor jelének 15 osztályozására vonatkozó eljárást végzünk (így tehát betanítási eljárás lépései előnyösen ez utóbbi esetben is végezhetők, ezen felhasználáskor a ’betanítási’ jelző elhagyható a tanítási időfüggő bioszenzor jelrész nevéből). Ezt a szemléltetések, az azokhoz fűzött magyarázatok is érzékeltetik. Az 5A-5C ábrák különböző sejttípusok térbeli és időbeli kinetikáját mutatják. A 20 térbeli esetében az időbeli tartomány kinetikai átlagát 90 perces mérési hosszra vettük. Hasonlóképpen az időbeli tartományok esetében a térbeli tartományokat átlagoltuk, hogy megmutassuk az adott sejttípus időbeli kinetikáját. Az 5A ábrán már a szegmentáció során kinyert egyedi sejt minták vannak. A manuális es jósolt minták Cellpose-os maszk alapján lettek kivágva, viszont az 5A ábrán már csak a 25 bioszenzoros adatok vannak. A különböző bevonatfelületek hatását a különböző sejttípusok tapadására mind térbeli, mind időbeli dimenzióban az 5A-5C ábrák szemléltetik. Az 5A ábra felső három sora a fibronektinnel bevont felület hatását mutatja be a H838, HeLa, HEPG2, LCLC-103H, MCF-7, MDA-MB-231, MC3T3-E1 sejttípusok esetén, az 5A 30 ábra alsó három sora a bevonat nélküli felület hatását mutatja be a H838, HeLa, HEPG2, LCLC-103H, MCF-7, MDA-MB-231 sejttípusok esetén. - 42 - A fibronektinnel bevont és a bevonat nélküli felületek három szegmentálási stratégiát szemléltetnek – a felső sorban a manuális, középen a jósolt, alul a watershed algoritmus által jósolt szegmentálási eredmények illusztrációk (tartalma tehát csak a szemléltetést szolgálja). A fibronektin felület a HeLa és LCLC-103H 5 sejtvonalak esetében fokozott adhéziós erőt mutat, míg a bevonat nélküli felület pozitívan befolyásolja a HepG2, H838 és LCLC-103H sejttípusokat. Emellett a nem bevont felületen a sejtek szabályosabb alakúnak tűnnek, mint a fibronektinnel bevont felületen. Ez a hatás annak eredményeként következik be, hogy a sejtek a nem bevont felülethez passzív folyamat révén tapadnak, általában félgömb alakot 10 vesznek fel, míg a sejtek a fibronektinnel bevont felülethez aktív folyamatok révén tapadhatnak, adhéziós komplexeket képezve, ami az adott sejttípusra jellemző alakot eredményez. Az ábra a szegmentálási stratégiák közötti eltéréseket is kiemeli. Az 5A ábra alapján nem a karakterizálhatóság lényeges, hanem hogy a térbeli kiterjedés és az átlag intenzitás közötti különbségek látszódjanak ugyanazon 15 mintán a fibronektines és a bevonat nélküli változat közötti. A bevonat nélküli változat Nb2O5 biokompatibilis réteggel van funkcionalizálva, az értjük a bevonat nélküli jellegen, hogy nincs rajta további funkcionálás. Az 5B ábra a fibronektinnel bevont, az 5C ábra a bevonat nélküli felületek hatását illusztrálja időbeli dimenzióban a H838, HeLa, HEPG2, LCLC-103H, MCF-7, MDA- 20 MB-231, MC3T3-E1 sejttípusok esetén. A manuális, a jósolt és a watershed algoritmus által jósolt szegmentálási stratégiákat grafikonon szemléltetik. A 6A-6C ábrák egyedi sejtes bioszenzoros sejtaktivációt illusztrálnak B-limfociták esetében. B-sejt esetében a sejthez hozzárendelhető maximális szenzor jel kinetikája egyedi ellenanyaggal funkcionalizált felületen. A B-sejtek szubpopuláció 25 specifikus felületi markarének, CD19-nek jelölését anti-CD19-AF546 (klón: HIB19) monoklonális antitestekkel végezzük. A konjugátumra jellemző fluoreszcens emissziós maximum vizsgálatát a 43HE fluoreszcens filter apparátussal és a Carl Zeiss Axio Observer Z1 típusú fluoreszcens mikroszkóppal végezzük. A 6A ábra szemlélteti a 100 felvételen látható fáziskontraszt és fluoreszcens 30 felvételek illesztését. A 102f kép a 102a felvételen szereplő fáziskontraszt és az egyedi fluoreszcens csatornák 102b-102e felvételeinek illesztéséből származik. A 102f képen látszik, hogy a konjugátum az analízisre használt 43HE fluoreszcens - 43 - filter apparátus beiktatásával 102d felvételen látható fluoreszcens emissziót mutatott, 102b felvételen a 49-es, 102c felvételen a 38HE és 102e felvételen az 50- es fluoreszcens filter apparátus beiktatásával nem mutatott fluoreszcens emissziót. A 6B ábra a 102f kép fluoreszcens festődés alapján azonosított sejt mikroszkópos 5 és szenzoros képének illesztését szemlélteti (ebben az esetben tehát – ld. még 7A- 7C és 8A-8C ábrák – a bioszenzor jelére olyan képet illesztünk, amelyet két mikroszkóp, a fáziskontraszt és a fluoreszcens mikroszkópok képének illesztésével kapunk). A mérés felületérzékeny szenzorral végzett, előnyösen jelölésmentes, egyedi sejtes aktivációs kinetikáját reprezentáló laterális inhomogén jeleinek képe 10 ráilleszthető a mikroszkópos felvételekre. A 6C ábra bal oldala a szemléltető mikroszkópos képet, a 6C ábra jobb oldala az azonosított B-limfocitához rendelhető aktivációs hullámhossz eltolódási görbét tartalmazza. A szelektív jelöléssel azonosított sejtekhez aktivációs hullámhossz eltolódási görbék rendelhetőek, amelyek karakterisztikája reprezentatív a B- 15 limfociták szubpopulációjára. A 7A-7C ábrák egyedi sejtes bioszenzoros sejtaktivációt illusztrálnak monociták esetében. Monociták esetében a sejthez hozzárendelhető maximális szenzor jel kinetikája egyedi ellenanyaggal funkcionalizált felületen. A monociták szubpopuláció specifikus felületi markarének, CD14-nek jelölését anti-CD14-Alexa 20 488 (klón: 5A3B11B5) monoklonális antitestekkel végezzük. A konjugátumra jellemző fluoreszcens emissziós maximum vizsgálata a 38HE fluoreszcens filter apparátussal és a Carl Zeiss Axio Observer Z1 típusú fluoreszcens mikroszkóppal végezzük. A 7A ábra szemlélteti 110 felvételen látható fáziskontraszt és fluoreszcens 25 felvételek illesztését. A 112f kép a 112a felvételen szereplő fáziskontraszt és az egyedi fluoreszcens csatornák 112b-112e felvételeinek illesztéséből származik. A 112f képen látszik, hogy a konjugátum az analízisre használt 38HE fluoreszcens filter apparátus beiktatásával 112c felvételen látható fluoreszcens emissziót mutatott, 112b felvételen a 49-es, 112d felvételen a 43HE és 112e felvételen az 50- 30 es fluoreszcens filter apparátus beiktatásával nem mutatott fluoreszcens emissziót. - 44 - A 7B ábra a 112f felvétel fluoreszcens festődés alapján azonosított sejt mikroszkópos és szenzoros képének illesztését szemlélteti. A mérés bioszenzorral végzett, jelölésmentes, egyedi sejtes aktivációs kinetikáját reprezentáló laterális inhomogén jeleinek képe ráilleszthető a mikroszkópos felvételekre. 5 A 7C ábra bal oldala a szemléltető mikroszkópos képet és a 7C ábra jobb oldala az azonosított monocitához rendelhető aktivációs hullámhossz eltolódási görbét tartalmazza. A szelektív jelöléssel azonosított sejtekhez aktivációs hullámhossz eltolódási görbék rendelhetőek, amelyek karakterisztikája reprezentatív a monociták szubpopulációjára. 10 A 8A-8C ábrák egyedi sejtes bioszenzoros sejtaktivációt illusztrálnak természetes ölő (NK – Natural Killer) sejtek esetében. Természetes ölő sejtek esetében a sejthez hozzárendelhető maximális szenzor jel kinetikája egyedi természetes ölő sejtek esetében ellenanyaggal funkcionalizált felületen. A monociták szubpopuláció specifikus felületi markarének, CD56-nak jelölését anti-CD56-Alexa 647 (klón: 15 123C3) monoklonális antitestekkel végezzük. A konjugátumra jellemző fluoreszcens emissziós maximum vizsgálata a 50-es fluoreszcens filter apparátussal és a Carl Zeiss Axio Observer Z1 típusú fluoreszcens mikroszkóppal végezzük. A 8A ábra szemlélteti 120 felvételen látható fáziskontraszt és fluoreszcens felvételek illesztését. A 122f kép 122a felvételen szereplő 20 fáziskontraszt és az egyedi fluoreszcens csatornák 122b-122e felvételeinek illesztéséből származik. A 122f képen látszik, hogy a konjugátum az analízisre használt az 50-es fluoreszcens filter apparátus beiktatásával 122e felvételen látható fluoreszcens emissziót mutatott, 122b felvételen a 49-es, 122c felvételen a 38HE és 122d felvételen a 43HE fluoreszcens filter apparátus beiktatásával nem mutatott 25 fluoreszcens emissziót. A 8B ábra a 122f felvétel fluoreszcens festődés alapján azonosított sejt mikroszkópos és szenzoros képének illesztését szemlélteti. A mérés bioszenzorral végzett, jelölésmentes, egyedi sejtes aktivációs kinetikáját reprezentáló laterális inhomogén jeleinek képe ráilleszthető a mikroszkópos felvételekre. 30 A 8C ábra bal oldalán a szemléltető mikroszkópos képet és a 8C ábra jobb oldalán az azonosított NK-sejthez rendelhető bioszenzorhoz tartozó aktivációs hullámhossz - 45 - eltolódási görbét tartalmazza. A szelektív jelöléssel azonosított sejtekhez aktivációs hullámhossz eltolódási görbék rendelhetőek, amelyek karakterisztikája reprezentatív a természetes ölő sejtek szubpopulációjára. A 9A-9B ábrák egyedi sejtes bioszenzoros sejtaktivációt szemléltet eozinofil 5 granulociták és neutrofil granulociták esetében. Eozinofil és neutrofil granulociták esetében a sejtekhez hozzárendelhető maximális szenzor jel kinetikája egyedi ellenanyaggal funkcionalizált felületen. Wright-Giemsa hematológiai festéssel fáziskontraszt mikroszkópos felvétel készíthető az AxioCam ERc 5s kamera használatával. Wright-Giemsa festéssel azonosítható további leukocita 10 szubpopulációk, 130 felvételen eozinofil granulocita, 140 képen neutrofil granulocita látható. A mérés bioszenzorral végzett, jelölésmentes, egyedi sejtes aktivációs kinetikáját reprezentáló laterális inhomogén jeleinek képe ráilleszthető a mikroszkópos felvételekre. 132 és 142 felvételek a képi illesztést szemléltetik. A hematológiai festéssel megkülönböztetett sejtekhez aktivációs hullámhossz 15 eltolódási görbék rendelhetőek, a 9A ábra / 2 részén és 9B ábra / 2 részén illusztrált módon az egyedi sejtes hullámhossz eltolódási görbék karakterisztikája reprezentatív az eozinofil és neutrofil granulociták szubpopulációjára (az alapvonal a pufferel kapott jel, ehhez képest értelmezzük a sejaktivációt), a jobb oldala az ábráknak a bal oldalon megjelölt keretes rész maximális pixel pontjához tartozó 20 időfejlődéshez tartozik. A görbék tehát itt is jól kivehető karakterisztikával rendelkeznek, ami szemlélteti, hogy ennek megfelelően a sejthez tartozó tanítási időfüggő bioszenzor jelrész várhatóan a gépi tanulás alapú osztályozó modullal betanítás után jól elkülöníthető lesz. A 10. ábra / 1 része illusztrálja az intravénás immunglobulinnal (IVIG – Intravenous 25 immunoglobulin) funkcionalizált felület kialakítását. Az intravénás immunglobulinnal, majd 10% fötális borjú szérummal kiegészített Rosewall Park Memorial Institute médium (RPMI 1640) blokkoló reagens és sejtes közeg esetén tapasztalható szenzorfelület funkcionalizáció során detektált biomolekuláris rétegfelépülést jellemző hullámhossz eltolódási görbe látható. A sejtes alapvonal, 30 melyhez viszonyítható a sejtaktiváció során mért hullámhossz eltolódás (vö. 10. ábra / 3 részén látható görbe alapvonalával). Az egyes szakaszoknál (arra a - 46 - szakaszra) specifikusak a jelalakok, jelszintek. Ezzel mutatjuk be a funkcionalizálás lépéseit. A 10. ábra / 2 része mutatja be 154 nyíllal jelölt egyedi sejtes képfeldolgozási lépés során a bioszenzorral végzett, jelölésmentes, egyedi sejtes aktivációs kinetikáját 5 reprezentáló laterális inhomogén jeleinek képe ráilleszthető a mikroszkópos felvételekre (ezzel kapcsolatosan utalunk a 3A ábra illesztésre vonatkozó részére). Az illesztett 150 képen és annak nagyításán, 152 képen azonosíthatók az aktiválódott akut mieloid leukémiás egyedi monocita THP-1 sejtek. A 156 nyíllal jelölt, illesztés után azonosított sejthez tartozó görbe karakterisztika analízisével a 10 10. ábra / 3 részén láthatóan a sejtekhez hozzárendelhető a maximális szenzor jel kinetikája egyedi THP-1 sejtek esetében, az IVIG-gel funkcionalizált felületen. A 10. ábra / 1 részén látható a sejtes alapvonal teljes egészében, az egész szenzor területen mért átlagos hullámhossz eltolódást mutatva, itt a sejtes szakasz nem szerepel. A 10. ábra / 3 részén ennek az alapvonalnak a végét és a sejtes aktivációt 15 együtt mutatja egy sejt esetében. A10. ábra / 2 része a teljes szenzort mutatja az illesztett mikroszkópos képpel, illetve a bioszenzor jel alapján azonosított (számozott) csúcsokkal 150 képen. A 10. ábra / 3 bal oldalán a hullámhossz eltolódás alapján kapott jelek láthatóak a jobb oldalon pedig a jelölt sejthez tartozó maximális pixel görbéje. 20 A 11. ábra / 1 része szemlélteti a neutravidinen keresztül rögzített citrullinált peptiddel kivitelezett szériuminkubációt kísérő immunkomplex képződési mechanizmusát. A neutravidinen keresztül rögzített citrullinált peptiddel kivitelezett, reumatoid artritiszre pozitív szérummal végzett inkubáció által eredményezett immunkomplex képződés során mért rétegfelépülésre jellemző hullámhossz 25 eltolódási görbe látható. A sejtes alapvonal 10% fötális borjú szérummal kiegészített Rosewall Park Memorial Institute médiummal (RPMI 1640) lett beállítva. A sejtes alapvonalhoz viszonyítható a sejtaktiváció során mért hullámhossz eltolódás. A 11. ábra / 2 részén látható, hogy 164 nyíllal jelölt egyedi sejtes képfeldolgozási lépés során az immunkomplexek hatására megjelenő leukociták egyedi sejtes 30 aktivációs kinetikáját reprezentáló laterális inhomogén jeleinek képe ráilleszthető a mikroszkópos felvételekre, ezzel kapcsolatosan utalunk a 3A ábra illesztésre - 47 - vonatkozó részére. Az illesztett 160 képen és annak nagyításán, 162 képen azonosíthatók az aktiválódott leukociták. A 166 nyíllal jelölt, illesztés után azonosított sejthez tartozó görbe 166 karakterisztika analízisével a 11. ábra / 3 része szerint hozzájuk rendelhető maximális szenzor jel kinetikája (vö. a 11. ábra / 1 5 részével az alapvonalat). A 12. ábra / 1 része mutatja be a poliklonális anti-Ig ellenanyagokkal történő funkcionalizáció, majd 0,3% BSA (Bovine Serum Albumin – marha szérum albumin) tartalmú PBS (Phosphate-Buffered Saline – foszfát pufferelt sóoldat) -sel Rosewall Park Memorial Institute médium (RPMI 1640) blokkoló reagens hozzáadása során 10 detektált biomolekuláris rétegfelépülést jellemző hullámhossz eltolódási görbét. A 12. ábra / 2 része szemlélteti az anti-Ig (IgG, IgM, IgA F(ab’)2 fragmens) felületi funkcionalizációt követően a 174 nyíllal jelölt egyedi sejtes képfeldolgozási lépés során a bioszenzorral végzett, jelölésmentes, egyedi sejtes aktivációs kinetikáját reprezentáló laterális inhomogén jeleinek képe ráilleszthető a 170 mikroszkópos 15 felvételekre, ezzel kapcsolatosan utalunk a 3A ábra illesztésre vonatkozó részére. Az illesztett 170 képen és annak nagyításán, 172 képen azonosíthatók az aktiválódott B-sejtek. Az illesztés után azonosított sejthez tartozó görbe 176 karakterisztika analízisével a 12. ábra / 3 részén láthatóan a sejtekhez hozzárendelhető maximális szenzor jel kinetikája egy B-sejt esetében a poliklonális 20 anti-Ig ellenanyagokkal funkcionalizált felszínen, majd CD19 specifikus ellenanyag (H1(FB1)) hozzáadását követően. A 13. ábra / 1 része szemlélteti az anti-CD3 (klón: SK7) felületi rögzítését (5 µg / ml), majd 0,3%-os, PBS-sel hígított BSA oldat használatát felületi blokkolóként az anti- CD3 felületi funkcionalizáció során T-limfocita aktiváció kiváltásához. 10% FCS 25 tartalmú Rosewall Park Memorial Institute médium (RPMI 1640) használata a leukocita szuszpenzió sejtes alapvonalának beállításakor. A felületrögzített, immobilizált antitest a T-limfociták specifikus aktiválódását váltja ki. A 13. ábra / 3 része mutatja be az anti-CD3 monoklonális antitesttel végzett felületfunkcionalizálás hatására bekövetkező T-limfocita aktivációt kísérő 30 hullámhossz eltolódási karakterisztikát. Az aktiválódott sejtek jelölése anti-CD4 - 48 - (klón: SK3) és anti-CD8 (klón: RPA-T8) monoklonális antitestek alkalmazásával történik. A 13. ábra / 4 része az anti-CD4 és anti-CD8 monoklonális antitestek T-helper és citotoxikus T-sejtekhez történő bekötődése során tapasztalható hullámhossz 5 eltolódási jelenséget ábrázolja. Az aktiválódott sejtekhez történő ellenanyag bekötődést kísérő hullámhossz eltolódási jelenség jelenik meg. A 13. ábra / 6 része együttesen ábrázolja a szenzoros mérés sejtes és monoklonális antitestekkel végzett jelölésmentes szakaszait, mely illusztrálja az azonosított T- limfocita felületi aktivációját és a jelölt antitest CD4 / CD8 membránfehérjékhez 10 történő bekötődésre jellemző hullámhossz eltolódási jelenséget. A T-limfociták szubpopuláció specifikus felületi markerének, CD3-nak jelölése anti- CD3-AF405 (klón: PC3 / 188A) monoklonális antitestekkel történik. A 13. ábra / 2 része jeleníti meg az aktiválódott T-limfocitáról készített 180 fáziskontraszt és 182 fluoreszcens mikroszkópos felvételeket. A konjugátumra jellemző fluoreszcens 15 emissziós maximum vizsgálata a 49-es fluoreszcens filter apparátus és a Carl Zeiss Axio Observer Z1 típusú fluoreszcens mikroszkóp használatával. A 13. ábra / 5 része mutatja be a szenzoros és a fáziskontraszt mikroszkópos felvételek képi illesztését. A mérés, jelölésmentes, szenzoros szakasza során hullámhossz eltolódási jelenséget generáló, felületre kitapadó T-limfociták 20 specifikus jelölése fluoreszcensen konjugált monoklonális antitest használatával történt. Összefoglalóan, a 13. ábra / 1 része a funkcionalizálás lépéseit mutatja be, a / 2 része a mérést követően készült mikroszkópos képeket, a / 3 része a bioszenzoros jelet adott sejt esetében, a / 4 része pedig a sejtekhez hozzáadott ellenanyag hatását 25 a sejtekre, a / 5 része a bioszenzoros jelre illesztett mikroszkópos képet mutatja, itt a jobb oldali sejt jele szerepel a grafikonokon, és a / 6 rész mutatja a / 3 és / 4 részen bemutatott sejt teljes aktivációs jelét együtt. A 14A-E ábrák azegyedi sejtes bioszenzoros sejt aktivációt szemléltetik leukociták esetében hat donorból származó sorszámmal jelzett vérmintákból (a sorszámok az 30 ábrák / 1 részein láthatók). A leukociták aktivációját ellenanyaggal funkcionalizált - 49 - felületen vizsgáltuk, az aktiválódott egyedi sejtes hullámhossz eltolódási görbéket az egyes donoroktól származó leukociták esetén a 14A ábra / 1 része, a 14B ábra / 1 része és a 14C ábra / 1 része mutatják be. A sejtek 500 sejt / mikroliter tálca lyuk tervezett sűrűséggel lettek alkalmazva. 5 A 14A ábra / 2 része, a 14B ábra / 2 része és a 14C ábra / 2 része illusztrálják az ábrák bal oldalán a fáziskontraszt felvételek és szenzoros felvételek illesztését, jobb oldalon (nagyításban) a Wright-Giemsa festéssel azonosított leukocitákat. A 14A ábra / 2 része, a 14B ábra / 2 része és a 14C ábra / 2 része középső képei a Wright- Giemsa festés mikroszkópos képeinek és a szenzoros felvételek illesztését 10 ábrázolja. A 14D és a 14E ábrákon látható, hogy az egyedi sejtes hullámhossz eltolódási görbék karakterisztikája a Wright-Giemsa festéssel azonosított eltérő szubpopulációk tekintetében eltérő karakterisztikát mutat (a 14D ábrán az 1. donorhoz tartozó három eredmény, míg a 14E ábrán a 4. és 6. donorhoz tartozó 15 eredmény látható a 14A ábra / 2 részéhez, valamint a 14B és 14C ábrák / 2 részéhez tartozó nagyítások alapján). A 15A-15L ábrák mutatják be az egyedi sejtes bioszenzoros sejtaktivációt leukociták esetében TLR ligandumok jelenlétében. A sejtekhez hozzárendelhető maximális szenzor jel kinetikája egyedi leukociták esetében ellenanyaggal funkcionalizált vagy 20 csak blokkolt felületen lipopoliszacharid (LPS – lipopolysaccharide), zymosan, flagellin, peptidoglikán (PGN – peptidoglycan) vagy poliinozin-policidillisav (Poly(I:C) – polyinosinic:polycytidylic acid) jelenlétében, illetve puffer kontroll, ellenanyaggal (IVIG) bevont és funkcionalizálatlan szenzorfelszínen. A 15A ábrán az LPS, a 15B ábrán a zymosan, a 15C ábrán a flagellin, a 15G ábrán 25 a PGN és a 15H ábrán a Poly(I:C) által csak blokkolt felületen detektált bioszenzoros jel kinetikája látható. A 15D ábra az LPS, a 15E ábra a zymosan, a 15F ábra a flagellin, a 15J ábra a PGN és a 15K ábra a Poly(I:C) jelentében blokkolt és az ellenanyaggal (IVIG) bevont, funkcionalizált szenzorfelszínen végzett egyedi sejtes bioszenzoros 30 sejtaktivációt mutat be leukociták esetében TLR ligandumok jelenlétében. - 50 - Megjegyezzük, hogy a TLR ligandumok önmagukban nem váltanak ki az ellenanyagok által kiváltotthoz hasonló aktivációt a vizsgált időintervallumban. A PBS kontroll során funkcionalizálatlan (csak blokkolt) szenzorfelszínen történt bioszenzoros detektálás, a szenzor jel kinetikája a 15I ábrán látható. 5 Az IVIG kontroll esetén csak ellenanyaggal (IVIG) bevont és funkcionalizált szenzorfelszínen történt blokkolási lépés nélkül. A sejtekhez hozzárendelhető maximális szenzor jel kinetikáját egyedi leukociták esetében a 15L ábra mutatja be. A 16A-B ábrák a ChrABC (chondroitinase ABC – kondroitináz ABC) enzim (stimulus) hatását szemléltetik a HeLa sejtek kinetikai görbéire 50% RGD10 motívumot tartalmazó PLL-PEG (poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) – poli-L- lizin graft polietilén-glikol) bevonaton (50% PPR – RGD motívumot tartalmazó PLL- PEG). A kezelés koncentrációtól függő mértékben csökkentette a kinetikai jel meredekségét. A 16A ábrán 3-3 darab egyedi sejt kinetikai görbéje látható, a 16B ábrán a vizsgált 3-3 egyedi sejtnek az átlaga és szórása. 15 PÉLDÁK A következő példákat a találmány illusztrálására mutatjuk be, ezek a technológia alkalmazási területét és hatékonyságát szemléltetik, és semmiképpen sem értelmezendők a találmány körének korlátozásaképpen. A 6A-16B ábrákra hivatkozunk az alábbi ábrákkal kapcsolatban is, azok egyes részleteinek 20 megértésében tehát az alábbi példák is segíthetnek. 1. példa: Egysejt-adhéziós kinetika alapú klasszifikáció A módszer egy optikai bioszenzort használ az egyes sejtek adhéziós kinetikájának mérésére, és deep learning algoritmust alkalmaz az adatokból egészséges és rákos sejtek osztályozására. Ezt a megvalósítást olyan sejtvonalak, mint a HeLa, MC3T3- 25 E1, LCLC-103H, MDA-MB-231, és MCF-7 egészséges és rákos sejtvonalakon mutatjuk be, ahol az osztályozási pontosság 70-83% közötti volt. 2. példa: Multimodális osztályozás 3D mintára - 51 - A második módszer a sejtkultúrák tér-időbeli optikai bioszenzor alapú jellemzőit kombinálja deep learning modellekkel, hogy pontosabban klasszifikálja a sejteket (ebben tehát kombináljuk az optikai jellemzőket, azaz a bioszenzor és a mikroszkóp adatait), ezzel 90% pontosság feletti eredményt értünk el. Ez a megközelítés 5 különösen előnyös lehet a többrétegű szövetek vagy tumorok analízisében, ahol az időbeli változáson kívül a minta teljes felületén végbemenő jelváltozás is fontos szerepet játszik a sejtek viselkedésének karakterizálásában. Mindkét megvalósítási mód kiemeli a technológia rugalmasságát és adaptálhatóságát különböző kutatási és diagnosztikai környezetben, biztosítva 10 ezzel az igénypontok által meghatározott oltalom határait. Az 1. és 2. példában a következőket alkalmaztuk: I. Sejtkultúrák és sejtpasszálási technikák A HeLa méhnyakráksejteket (ECACC 9302113) 10% magzati szarvasmarha szérummal (FBS, Biowest SAS, Franciaország), 4 mM L-glutaminnal, 100 U / ml 15 penicillinnel és 100 μg / ml sztreptomicin oldattal kiegészített Dulbecco's modified Eagle's mediumban (DMEM, Gibco) tenyésztettük. Az MC3T3-E1 oszteoblasztikus sejteket (ECACC 99072810) 10% FBS (Biowest SAS, Franciaország), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin és 100 μg / ml sztreptomicin oldattal kiegészített α-módosított minimális esszenciális táptalajban 20 tenyésztették. Az LCLC-103H humán tüdő nagysejtes karcinómát (ACC 384), a H838 humán tüdő adenokarcinómát (ATCC CRL-5844), valamint az MDA-MB-231 és MCF-7 emlőráksejteket 10% FBS-szel (Biowest SAS, Franciaország), 1% nem esszenciális aminosavval, 1 mM nátrium-piruváttal, valamint 100 U / ml penicillin és 100 μg / ml 25 sztreptomicin oldattal kiegészített DMEM-ben tenyésztették. A HepG2 humán hepatocelluláris karcinóma sejteket (ATCC HB-8065) 10% FBS-t (Biowest SAS, Franciaország) tartalmazó RPMI-1640 tápfolyadékban (Gibco) tenyésztettük, amelyet 2 mM L-glutaminnal, valamint 100 U / ml penicillin és 100 μg / ml sztreptomicin oldattal egészítettünk ki. - 52 - A tenyészeteket 37°C-on, 5% CO2-t tartalmazó párásított légkörben tartottuk. A kísérletekhez a sejteket 0,05%-os (w / v) tripszin és 0,02%-os (w / v) EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid – etilén-diamin-tetraecetsav) oldat segítségével távolítottuk el a szövettenyésztő edényekből. A leszedett sejteket 5 percig 200×g- 5 nél centrifugáltuk, majd a sejtpelletet újra szuszpendáltuk vizsgálati pufferben (20 mM 2-[4-(2-hidroxietil)p szulfonsav (HEPES – hydroxyethyl- piperazineethane-sulfonic acid) Hank kiegyensúlyozott sóoldatában (HBSS – Hanks' Balanced Salt Solution), pH 7,4). A centrifugálást kétszer megismételtük a sejttenyésztő közeg teljes eltávolítása érdekében. 10 Ezután a sejteket hemocitométeren megszámoltuk, és 25 µl HEPES-HBSS oldatban 200 sejt végső sejtsűrűségűre hígítottuk. II. Humán fibronektin bevonat készítése A mikrolemezt úgy vontuk be, hogy lyukanként 10 μl PBS-szel hígított fibronektin- oldatot (31,0 μg / ml) adtunk hozzá. Ezt 10 másodpercig 100 x g-n centrifugáltuk, 15 majd 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Háromszor öblítettük (50 μL / lyuk) és kiszárítottuk, amíg nem mértünk vele. A méréseket szobahőmérsékleten végeztük két bevonat alkalmazásával. 25 µl vizsgálati puffert adtunk 12 lyukba egy fibronektinnel bevont vagy nem bevont Epic 384 lyukú sejtvizsgálati mikrolemezben. Az alapvonalat 90 percig rögzítettük, majd 20 minden egyes lyukba 25 µl sejtszuszpenziót adtunk. 3. példa: Leukociták effektor funkcióinak detektálása ellenanyaggal bevont felszínen (vö.6A-10. ábrákkal és 14A-14E ábrákkal) 1. A felület elkészítése a. Felület bevonása IVIG (Intravénás Immunoglobulin) oldattal: Az 25 alapvonalat 50-50 µl PBS segítségével állítottuk be 30 percen keresztül. Ezután a felületet IVIG réteggel vontuk be 100 µg / ml koncentrációban, 50 µl térfogatban PBS-ben hígítva használtuk, melyet körülbelül egy órán át szobahőn inkubáltunk. A szakasz végén minden lyukat háromszor mostunk 50- 50 µl PBS-sel. - 53 - b. Blokkolás: A blokkolást 10% FCS-t tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékkal végezzük. Az oldatot 0,5 ml FCS-oldat és 4,5 ml RPMI 1640 tápfolyadék felhasználásával készítettük el. Az oldatokat 50 µl térfogatban alkalmaztuk, és a blokkolási eljárást 60 percig végeztük. Az eljárás után mostunk minden 5 lyukat háromszor 50 µl PBS-sel. 2. A leukociták ellenanyag közvetített effektor funkcióinak kimutatása. a. Sejtes puffer alapvonal fázis: A sejtek hozzáadása előtt 10% FCS-t tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékot 25-25 µl térfogatban adtunk a lyukakba. Majd 30 percig inkubáljuk. 10 b. A leukocita-preparátum elkészítésének lépései: i. Pipettázzon 50-100 µL perifériás vért egy Eppendorf-csőbe ujjbegyes lándzsával. ii. A vér azonnali véralvadásgátlása 20 µL 0,5 mM tetranatrium- etiléndiamin-tetraacetáttal (Na4EDTA – tetrasodium 15 ethylenediaminetetraacetate), PBS-sel hígítva (Sigma Aldrich). iii. 200 µL RBC (vörösvérsejt) lízispuffer hozzáadása az antikoagulált vérhez. iv. A vért és a hozzáadott reagenseket tartalmazó Eppendorf-csövet 10 percig folyamatosan forgassa. 20 v. Centrifugálás: 3000 RPM (500 x g), 5 perc, szobahőmérsékleten. vi. A lizált vörösvérsejteket tartalmazó felülúszó eltávolítása és a leukocitákat tartalmazó pellet fellazítása után ismételje meg a lízislépést még kétszer. vii. Centrifugálás: 2500 RPM (350 x g), , 5 perc, szobahőmérsékleten (RT 25 – room temperature). viii. Távolítsuk el a lízált vörösvértesteket tartalmazó felülúszót, majd lazítsuk fel a leukocitákat tartalmazó pelletet. - 54 - ix. Hígítsa a leukocita preparátumot 10%-os FCS + RPMI oldattal, a bioszenzoros méréshez szükséges sejtszámtól függően a preparátum elkészítése után. c. A sejt szuszpenzió hozzáadása: A szuszpenziót 40 sejt / µl (1000 sejt / 25 µl) 5 sűrűségű beállítással adjuk minden egyes lyukba, 25 ul szuszpenziós térfogatot használva. Sejtes bioszenzoros méréseket legalább egy órán át, percenként 5 mérési pont felvételével végeztük. 3. A bioszenzorral végzett jelölésmentes mérést követően a sejteket 25 µl PBS- sel hígított 4%-os PFA (paraformaldehyde – paraformaldehid) -oldattal fixáltuk. 10 A fixálást 30 percig végeztük, majd minden egyes lyukat három ciklusban (5 perc / 15 perc / 5 perc) 50 mM glicint tartalmazó PBS-oldattal mostunk. 4. Jelölés fluoreszcens festékkel konjugált monoklonális antitestekkel: A fixált sejteket 50-50 µl 1%-os w / v BSA oldattal blokkoltuk PBS-ben, majd háromszor mostuk 50-50 µl PBS-sel, egyenként 5 percig. A Santa Cruz antitesteket 1:20- 15 as hígításban alkalmaztuk, amit szintén 1%-os w / v BSA oldattal végeztünk. A négy fő leukocita szubpopulációt a következő antitestklónok használatával jelöltük: CD3-Alexa 405 (klón: PC3 / 188A) 0,05 mg / μl koncentrációban, CD14- Alexa 488 (klón: 5A3B11B5) 0,2 mg / μl koncentrációban, CD19-Alexa 546 (klón: HIB19) 0,2 mg / μL koncentrációban és CD56-Alexa 647 (klón: 123C3) 0,2 20 mg / μL koncentrációban. A jelölést 25-25 μl oldatokkal végeztük 2 órán keresztül 4°C-on. A festés befejezése után minden lyukat háromszor mostunk 50-50 µl PBS-sel. 5. Epifluoreszcens képalkotás: A fluoreszcens vizsgálat elvégzése FL (fluorescent lamp – fluoreszcens lámpa) üzemmódban történt Axio Observer Z1 típusú 25 fluoreszcens mikroszkóppal 20x-os nagyításon, csatornánkként különböző expozíciós időkkel (a csatornák és az expozíciós idők a következők: DAPI (4′,6- diamidino-2-phenylindole – 4', 6-diamidino-2-fenilindol): 360 ms; GFP (Green Fluorescent Protein – zöld fluoreszcens fehérje): 2100 ms; DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein– Discosoma sp. vörös fluoreszcens fehérje): 200 ms; 30 Cy5 (Cyanine5 far-red-fluorescent dye – cianin 5 fluoreszcens festék): 3200 ms). - 55 - 6. Hematológiai festési protokoll: A fluoreszcens mikroszkópia után a sejtekről a PBS felülúszót eltávolítottuk, a rögzített sejtekhez koncentráltan 25-25 µl Wright- Giemsa oldatot adtunk. A festést 5 percig végeztük szobahőmérsékleten, enyhe rázatás mellett. A festéket alaposan kimostuk, 5 majd a sejteket legalább 3-szor 50-50 µl MQ (Milli-Q) vízzel mostuk. A Wright- Giemsa festés után transzmissziós megvilágítás mellett Axiocam ERc 5s kamerával, és 20x objektív nagyítással készítettünk felvételeket. Az alkalmazott feszültség 2,60 V volt, az expozíciós időt pedig 10 ms-ra állítottuk be. 4. példa: ACPA (Anti-Citrullinated Peptide Antibody – citrullinált peptidek elleni 10 autoantitest) kimutatása RA-s (Rheumatoid Arthritis) betegek szérumában leukociták aktivációja alapján (vö.11. ábrával) 1. A felület elkészítése a. Felület bevonása neutravidin oldattal: Az alapvonalat 50-50 µl PBS segítségével állítottuk be 30 percen keresztül. Ezután a felületet 15 neutravidin réteggel vontuk be 50 µg / ml koncentrációban 50 µl térfogatban PBS-ben hígítva használtunk, melyet körülbelül egy órán át szobahőn inkubáltunk. A szakasz végén minden lyukat háromszor mostunk 50-50 µl PBS-sel. b. Biotinált peptidek rögzítése: A kísérleteinkben használt RA-specifikus 20 multiepitop peptidnek két típusa van: egy citrullinált (741 CsX) és egy arginilált (741 CsR) formátum. Ezek a peptidek, biotiniláltak. A 20 µg / ml-es oldatokból 50 µl-t adtunk lyukanként, melyet körülbelül egy órán át szobahőn inkubáltunk. A szakasz végén minden lyukat háromszor mostunk 50-50 µl PBS- sel. 25 c. Blokkolás: A blokkolást 10% FCS-t tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékkal ml FCS-oldat é , 40 tápfolyadék ttük el. Az rzsoldat már tartalmaz 100 IU / ml penicillint és 100 µg / ml sztreptomicint a fertőzések megelőzésére. Az oldatokat 50 µl térfogatban alkalmazzuk, és a blokkolási eljárást 40 percig - 56 - végezzük. Az eljárás után mossuk át minden lyukat háromszor 50 µl PBS- sel. d. Széruminkubáció: RA-ra pozitív (624) és negatív (606) szérummintákat használtunk. A szérumokat 1:10 arányban hígítottuk 0,05% w / v BSA-t 5 tartalmazó PBS-oldattal. Minden lyukba 50 µl szérummintát adtunk. A kísérleti lépést legalább 1 órán keresztül kell elvégezni. e. Sejtes puffer alapvonal fázis: A sejtek hozzáadása előtt 10% FCS-t tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékot 25-25 µl térfogatban adtunk a lyukakba. Majd 30 percig inkubáljuk. 10 f. A leukocita-preparátum elkészítése g. A sejt szuszpenzió hozzáadása: A szuszpenziót 40 sejt / µl (1000 sejt / 25 µl) sűrűségű beállítással adjuk minden egyes lyukba, 25 µl szuszpenziós térfogatot használva. Sejtes bioszenzoros méréseket legalább egy órán át, percenként 5 mérési pont felvételével végeztük. 15 A mérés további lépései megegyeznek a 3. példában bemutatottakkal. 5. példa: Limfocita szubpopulációk (B és T-sejtek) azonosítása anti-CD3, anti-CD4, anti- CD8 és anti-Ig bevonatokon (vö.12-14E ábrákkal) 1. A felület elkészítése a. Az alapvonalat 50-50 µl PBS segítségével állítottuk be 30 percen keresztül. 20 Ezután az egyes lyukakat monoklonális CD19 (H1(FB1)), CD3 (SK7), CD4 (SK3), CD8 (RPA-T8) specifikus ellenanyagokkal vagy poliklonális anti-Ig ellenanyagokkal vontuk be 10 µg / ml koncentrációban, 50 µl térfogatban PBS-ben hígítva, melyet körülbelül egy órán át szobahőn inkubáltunk. A szakasz végén minden lyukat-t háromszor mostunk 50-50 µl PBS-sel. 25 b. Blokkolás: A blokkolást 0,3 % (w / v%) BSA-t tartalmazó PBS-sel végeztük. Az oldatokat 50 µl térfogatban alkalmaztuk, és a blokkolási eljárást legalább 30 percig végeztük. Az eljárás után mostunk minden lyukat háromszor 50 µl PBS-sel. - 57 - A mérés további lépései megegyeznek a 3. példában bemutatottakkal. Azzal a kiegészítéssel, hogy a sejtes mérés során a sejtekhez adtunk CD3 (SK7), CD4 (SK3), CD19 (H1(FB1)), poliklonális anti-Ig vagy CD8 (RPA-T8) specifikus ellenanyagokat adtunk 25 µl-ben 10% FCS-t tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékban 5 hígítva a sejtekhez 10 µg / ml koncentrációban a fixálást megelőzően és legalább 30 percig folytattuk a mérését az ellenanyagok hozzáadását követően. 6. példa: Leukociták effektor funkcióinak detektálása TLR ligandumok jelenlétében ellenanyaggal bevont felszínen, illetve ellenanyag bevonat nélkül (vö. 15A-15L ábrával) 10 A mérés lépései megegyeznek a 3. példában bemutatottakkal a következő két kiegészítéssel: 1. A szenzor felületet nem minden esteben funkcionalizáltuk IVIG-gel, ha nem helyette csak a hígításhoz használt PBS-t alkalmaztuk néhány esetben. 2. A sejteket a szenzorral történő érintkeztetést megelőzően közevetlenül a 15 következő TLR ligandumokat tartalmazó Lipopoliszacharidot (LPS) (100 ng / ml) vagy Zymosant (10 μg / ml) vagy Flagellint (100 ng / ml) vagy Peptidoglikánt (PGN) (50 μg / ml) vagy Poliinozin-policidillisavat (Poly(I:C)) (20 μg / ml) (vagy kontrollként TLR ligandum-mentes) RPMI + 10% FCS-ben hígítottuk és adtuk az egyes lyukakba. 20 7. példa: Nanorészecskék, hatóanyagok, stimulusok (pl. enzimek) hatásának vizsgálata az egyedi sejtek inhomogén kinetikai jelére (vö.16A és 16B ábrákkal) A méréseknél többféle sejtvonalat, primer sejteket is használhatunk, illetve többféle bevonatot is, vagy éppen bevonat nélkül is használhatjuk a szenzor felületet. A sejtek előkészítése a méréshez, illetve a bevonat elkészítése a 2. példában leírt 25 lépések szerint valósíthatók meg. A hatóanyagokat, stimulusokat, nanorészecskéket oldatban adjuk a sejtekhez különféle koncentrációkban. Az egyedi sejt kinetikából következtethetünk a nanorészecskék bejutására, illetve a hatóanyagok sejtfunkciókat gátló vagy serkentő hatására, illetve az egyéb stimulusok sejtekre gyakorolt hatására, így a kapott adatok különféle új gyógyászati 30 termékek kifejlesztésénél használhatóak. Pl. Arany vagy más magas - 58 - polarizálhatóságú nanorészecskéket alkalmazva a részecskéket bevonó külső rétegek tesztelhetőek, a bejutásban betöltött szerepük mérhető és kvantifikálható nagyszámú egyedi sejten, jelölés nélkül. Ez az eljárás akár génterápiás, vakcinálási eljárásokban is alkalmazható, akár az adott páciens saját sejtjein. 5 A találmányhoz, illetve annak egyes kiviteli alakjai előnyös hatásaival kapcsolatosan összefoglalóan megadjuk még a következőket. A gépi tanulás (például deep learning) alapú elemzés lehetővé teszi a komplex mintázatok azonosítását az optikai bioszenzor által gyűjtött adatokban, javítva ezzel a diagnosztikai pontosságot és csökkentve a hamis pozitív vagy negatív 10 eredmények számát. Az optikai bioszenzorok real-time adatgyűjtése, kombinálva a deep learning gyors adatelemzési képességével lehetővé teheti a gyors és hatékony diagnosztikát, amely kulcsfontosságú a rákkezelés sikerességében. Ez egy nem invazív mérési módszer, ami kevésbé terhelő a betegek számára, ellentétben a hagyományos biopsziával vagy egyéb invazív diagnosztikai 15 eljárásokkal. Az eljárás előnyösen alkalmazható különféle típusú rákos sejtek azonosítására és osztályozására is, növelve a diagnosztikai módszerek univerzalitását. Ezen felül kijelenthetjük, hogy költséghatékony rákdiagnosztikai módszerről beszélünk ez esetben, amely csökkentheti a kezelési költségeket és növelheti az egészségügyi 20 rendszerek hatékonyságát. Ehhez hasonlóan az egyes leukocita alpopulációk aktivációs mintázatának azonosítása és különböző bevonatokkal szembeni reaktivitásának meghatározása előnyösen egy újfajta személyre szabott diagnosztikai eljárást tesz lehetővé. 25 A találmány további jellemzésére megadjuk az alábbi pontokat, amelyek előnyösen a találmányról további részleteket adnak meg. Az alábbi 1. bekezdés jelenthet a találmányhoz további opcionális jellemzőket, továbbá az 1. bekezdésben megadott egyes jellemzők megfeleltethetők bizonyos találmányi jellemzőkkel. A további alpontok újabb opcionális jellemzőket adnak a kiviteli alakokhoz a bekezdések 30 egymásra hivatkozásainak megfelelően, illetve adott esetben – amikor nem áll fenn - 59 - inkompatibilitás – az alpontokban lévő jellemzők akár önálló találmányi jellemzőként is értelmezhetők. 1. Eljárás sejt karakterizáció kivitelezésére amelynek során sejteket tartalmazó mintát érintkeztetünk egy funkcionalizált pl. (optikai) szenzor felszínével ,azzal 5 jellemezve, hogy az érintkeztetés során az annak hatására bekövetkező sejt aktiváció során a funkcionalizált felszín biokémiai tulajdonságaitól függően bekövetkező sejtélettani változásokat detektáljuk egyedi sejt szinten a sejtminta hozzáadását követően és azt megelőzően a felületközeli lokális törésmutató változás folyamatos mérésével (legalább, szub-) celluláris egy sejt 10 per pixel felbontással megállapítjuk az egyedi sejtekhez tartozó fizikai, kémiai, és / vagy biológiai jelváltozás (pl. törésmutató változás) inhomogén jelének időbeli kinetikáját jelölésmentes módon, majd az így rögzített kinetikai adatok és potenciálisan (opcionálisan) a sejtekhez tartozó mikroszkópos jelek integrálása alapján, neurális háló segítségével különböztetjük meg az adott 15 felszínen aktiválódott (detektált) sejttípusokat. 2. 1. pont szerinti eljárás, amely során az egyedi sejtek bioszenzoros jelének klasszifikálása során a (mikroszkópos) jel csak a neurális háló betanítása során kerül alkalmazásra, amelynek eredményeként a betanítást követően a klasszifikáció az egyedi sejtek bioszenzoros jele alapján önmagában is 20 elvégezhető. 3. 1. pont szerinti eljárás, amely során az egyedi sejtek bioszenzoros jelének klasszifikálása során a (mikroszkópos) jelölés során fluoreszcensen jelölt reagensek segítik a betanítást. 4. 1. pont szerinti eljárás, amelyben az egyedi sejtek bioszenzoros vizsgálata 25 során a sejtek szuszpenzióban történő érintkeztetése a szenzorfelülettel a mérés részét képezi. 5. 1. pont szerinti eljárás, ahol a szenzorfelszínen megjelenő sejtek referenciájaként a szenzor sejtekkel nem érintkező vagy jelet nem eredményező felülete szolgál. 30 6. 1. pont szerinti eljárás, amely során az egyedi sejtek bioszenzoros jelének - 60 - klasszifikálása diagnosztikai célból történik. 7. 1. pont szerinti eljárás, amely során a diagnosztika célja rákos sejtek azonosítása. 8. 1. pont szerinti eljárás, amely során a diagnosztika célja immunsejtek 5 aktivációjának azonosítása. 9. 1. pont szerinti eljárás, amely alapján az immunsejtek aktivációja egy adott páciensből származó szérumminta szenzorfelületre rögzített antigénnel történő reakciója során képződött immunkomplexeken történik. 10.1. pont szerinti eljárás, amelynek célja hatóanyagok hatásának vizsgálata az 10 egyes időbeli jelekre. 11.1. pont szerinti eljárás, ahol a klasszifikálandó sejtek forrása perifériás humán vér, szövetminta, vagy azok válogatott alpopulációi. 12.1. pont szerinti eljárás, amely során adott, a jelet generáló sejt a szenzorról nem destruktív módon fizikai módszerekkel eltávolítható további, például: 15 genetikai, proteomikai, lipidomikai, glikomikai vagy metobolomikai vizsgálatok céljából. 13. 1. pont szerinti eljárás, amely során a szenzorfelület funkcionalizálása a vizsgálat szempontjából releváns például a detektálni kívánt sejtek által expresszált receptorok ligandumait tartalmazó bevonatokon történik, 20 amelyeken a sejt aktivációjának bekövetkezése elvárható. 14.1. pont szerinti eljárás, amely során a szenzoron aktiválódó sejtek helyzete pontosan azonosítható lehetővé téve annak más, például optikai információval történő egyeztetését. 15.1. pont szerinti eljárás, amely során a szenzor laterális felbontása és / vagy az 25 azokon mért jel értékelése lehetővé teszi a sejtek aktivációja során bekövetkező szenzoros jelek egy adott sejthez történő hozzárendelését. 16.1. pont szerinti eljárás, amely során a szenzor időbeli felbontása kedvezően legalább 1sec. - 61 - 17.1. pont szerinti eljárás, amely során a sejtek aktivációjának, és az így bekövetkező lokális mért jel megváltozásának követése egy adott időtartományban történik. 18.1. pont szerinti eljárás, amely során a sejtek aktivációja során mért laterálisan 5 inhomogén jel feldolgozása során megállapított időbeli jel szolgál a sejtek jellemzésének alapjául. 19.1. pont szerinti eljárás, amely során az egyidejűleg vizsgált sejtek sűrűsége lehetővé teszi az azokból származó jelek elkülönítését. 20.1. pont szerinti eljárás, amelynek során az egyidejűleg vizsgált egyedi sejtek 10 aktivációja során mért kinetikai paramétereinek eloszlása szolgál a sejtek megkülönböztetésének alapjául. 21.1. pont szerinti eljárás, amelyben kevert sejtszuszpenziók alkalmazása során az egyidejűleg vizsgált egyedi sejtek aktivációja során mért kinetikai paraméterek alapján történik az aktiválódott sejtek megkülönböztetése. 15 22.1. pont szerinti eljárás, amelyben kevert sejtszuszpenziók alkalmazása során az egyidejűleg vizsgált egyedi sejtek aktivációja során mért törésmutató változás kinetikai paraméterei alapján azonosított sejtféleségek arányai kerülnek megállapításra diagnosztikai célból. A találmány ipari alkalmazhatóságának módjával kapcsolatosan megjegyezzük a 20 következőket. A találmánnyal kapcsolatosan fentebb ismertetett technológia integrálható orvostechnikai hordozható vagy laboratóriumi eszközökbe, amelyeket kórházakban, klinikákon vagy kutatóintézetekben használnak. Továbbá lehetővé teszi az adatelemzési módszer a beteg-specifikus diagnosztikai információk gyors generálását, elősegítve a személyre szabott kezelési terv kidolgozását. A találmány 25 segítségével megvalósítható, osztályozásra szolgáló eljárás alkalmazható a későbbiekben nagyszabású szűrőprogramokban, amelyek célja a rákos, illetve immunrendszer aktivitásához kapcsolódó megbetegedések korai felismerése a lakosság széles körében. Ezenkívül a kutatás és fejlesztés számára is kiváló lehetőséget nyújt új diagnosztikai és terápiás módszerek kutatásában, mint például 30 a különböző lehetséges hatóanyagok tesztelése gyógyszerfejlesztés során. - 62 - Összefoglalóan, a találmány a sejtekkel végzett vizsgálatok területén újít, különösen azon módszerek és eszközök terén, amelyek a sejtek funkcionális jellemzőinek detektálására és elemzésére irányulnak. A találmány lényege egy speciálisan funkcionális szenzorfelülettel való sejtminták érintkeztetésén alapul, 5 ahol a szenzorfelület és a sejtek közötti kölcsönhatás során bekövetkező sejtaktiváció és az azt követő fiziológiai változások egyedi sejtszintű részletességgel kerülnek azonosításra a rögzített inhomogén jelekből. A folyamatot jelölés nélküli pl. optikai módszerekkel – a felületközeli törésmutató változások folyamatos mérése alapján – végezzük, amely lehetővé teszi az egyedi 10 sejtek időbeli változásainak követését. A módszer további innovációja, hogy a kapott kinetikai adatok és előnyösen mikroszkópos jelek integrálásával, mesterséges intelligencia (gépi tanuláson alapuló osztályozó modul) – különösen neurális hálózatok – segítségével történik a különböző sejttípusok azonosítása és kategorizálása a mintában. 15 A találmány a fentieknek is megfelelően nemcsak a rák kutatásában nyújt új lehetőségeket a rákos sejtek azonosítására és a tumoros folyamatok megértésére, hanem a véraktivitás (amely alatt a mintában megtalálható egyedi fehérvérsejtek aktivációját értjük adott funkcionalizált felületen) vizsgálatokban is alkalmazható, elősegítve a vérsejtek adhéziós tulajdonságainak és funkcionális 20 állapotának elemzését. Ez fontos lépés a betegségek korai diagnosztizálásában és hatékony kezelési stratégiák kifejlesztésében. A találmány természetesen nem korlátozódik a részletesen bemutatott előnyös kiviteli alakokra, hanem további változatok, módosítások és továbbfejlesztések is lehetségesek az igénypontok által meghatározott oltalmi körben. 25 - 63 - SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Tanítási eljárás bioszenzor sejthez tartozó jelének osztályozására szolgáló rendszer tanítására, amelynél o a rendszer tartalmaz gépi tanuláson alapuló osztályozó modult (55), 5 o törésmutató-változás meghatározására szolgáló optikai bioszenzor (24) funkcionalizált szenzorfelületével (10) rendre egy vagy több sejtet (32, 40, 70, 72, 74, 76) tartalmazó sejtmintát (12) érintkeztetéssel kölcsönhatásba hozva kapott, aktivációs kinetikát reprezentáló, a bioszenzor (24) pixelein (30) meghatározott több szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet (26, 42) 10 alkalmazunk, a tanítási eljárás során a több szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelre (26, 42), - egy adott szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelben (26, 42) egy vagy több sejthez (32, 40, 70, 72, 74, 76) rendre egy vagy több, az adott 15 szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelnek (26, 42) az adott sejthez (32, 40, 70, 72, 74, 76) tartozó legalább egy pixelét tartalmazó tanítási időfüggő bioszenzor jelrészt (50, 56b-62b, 56c-62c, 56d-62d, 80b-86b, 80c-86c, 80d-86d) határozunk meg (S100), és - az osztályozó modult (55) az egy vagy több tanítási időfüggő bioszenzor 20 jelrész (50, 56b-62b, 56c-62c, 56d-62d, 80b-86b, 80c-86c, 80d-86d) legalább egyikével, az adott sejthez (32, 40, 70, 72, 74, 76) tartozó aktivációs kinetika osztályozását tanításhoz rendre megadva, tanítjuk (S110). 2. Az 1. igénypont szerinti tanítási eljárás, azzal jellemezve, hogy továbbá a 25 bioszenzor (24) szenzorfelületéről (10) mikroszkóppal (34) felvett, rendre a több szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelhez (26, 42) tartozó több szenzorfelületi mikroszkópos képet (36, 44) alkalmazunk, és az egy vagy több tanítási időfüggő bioszenzor jelrészt (50, 56c-62c, 80c-86c) a következő lépésekben határozzuk meg (S100) rendre a több szenzorfelületi 30 mikroszkópos képre (36, 44):

Claims

- 64 - - egy adott szenzorfelületi mikroszkópos képen (36, 44) egy vagy több sejthez (32, 40, 70, 72, 74, 76) rendre tartozó egy vagy több mikroszkópos képrészt (56a-62a, 80a-86a) határozunk meg (S102), - az adott szenzorfelületi mikroszkópos képet (36, 44) és a hozzá tartozó 5 szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet (26, 42) egymásra vetítjük (S104), és - az egy vagy több mikroszkópos képrész (56a-62a, 80a-86a) legalább egyikére, az egy vagy több tanítási időfüggő bioszenzor jelrész (50, 56c- 62c, 80c-86c) közül rendre egy adott tanítási időfüggő bioszenzor 10 jelrészhez (50, 56c-62c, 80c-86c) az egymásra vetítés alapján a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelnek (26, 42) a hozzá tartozó mikroszkópos képrészhez (56a-62a, 80a-86a) tartozó legalább egy pixelét rendeljük (S106).

3. A 2. igénypont szerinti tanítási eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott 15 több szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet (26, 42) a bioszenzor (24) szenzorfelületéről (10) első előre meghatározott időtartam alatt van rögzítve, és az alkalmazott, rendre a több szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelhez (26, 42) tartozó több szenzorfelületi mikroszkópos kép (36, 44) az első előre meghatározott időtartam leteltét követően van rögzítve. 20 4. A 3. igénypont szerinti tanítási eljárás, azzal jellemezve, hogy a több szenzorfelületi mikroszkópos kép (36, 44) úgy van rögzítve, hogy az első előre meghatározott időtartam leteltét követően a bioszenzor (24) szenzorfelületén (10) fixálás van végezve.

5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti tanítási eljárás, azzal jellemezve, hogy 25 a több szenzorfelületi mikroszkópos kép (36, 44) a bioszenzor (24) szenzorfelületéről (10) fáziskontraszt mikroszkóppal vagy fluoreszcens mikroszkóppal van rögzítve, vagy a fáziskontraszt mikroszkóppal és a fluoreszcens mikroszkóppal rögzített képek kombinációja.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti tanítási eljárás, azzal jellemezve, 30 hogy az alkalmazott több szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jel (26, 42) úgy- 65 - van rögzítve, hogy a bioszenzor (24) szenzorfelülete (10) blokkolva van a minta (12) érintkeztetése előtt vagy azzal egyidőben.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti tanítási eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jel (26, 42) 5 jelölésmentes szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jel.

8. Rendszer bioszenzor sejthez tartozó jelének osztályozására, amely rendszer az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti tanítási eljárással van tanítva és tartalmazza az osztályozó modult (55).

9. Kiértékelési eljárás bioszenzor sejthez tartozó jelének osztályozására, 10 amelynél a 8. igénypont szerinti rendszert alkalmazzuk törésmutató-változás meghatározására szolgáló optikai bioszenzor (24) funkcionalizált szenzorfelületével (10) rendre egy vagy több sejtet (32, 40, 70, 72, 74, 76) tartalmazó sejtmintát (12) érintkeztetéssel kölcsönhatásba hozva kapott szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelre (26, 42), amelynek során 15 - a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelben (26, 42) egy vagy több sejthez (32, 40, 70, 72, 74, 76) rendre egy vagy több, a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelnek (26, 42) adott sejthez (32, 40, 70, 72, 74, 76) tartozó legalább egy pixelét tartalmazó időfüggő bioszenzor jelrészt határozunk meg, és 20 - az osztályozó modullal (55) az egy vagy több időfüggő bioszenzor jelrész legalább egyikét osztályozzuk.

10. A 9. igénypont szerinti kiértékelési eljárás, azzal jellemezve, hogy a rendszer a 2. igénypont szerinti tanítási eljárással van tanítva, és alkalmazunk a bioszenzor (24) szenzorfelületéről (10) mikroszkóppal (34) felvett, a 25 szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelhez (26, 42) tartozó szenzorfelületi mikroszkópos képet (36, 44), valamint az egy vagy több időfüggő bioszenzor jelrészt a következő lépésekben határozzuk meg a szenzorfelületi mikroszkópos képre (36, 44): - egy adott szenzorfelületi mikroszkópos képen (36, 44) egy vagy több 30 sejthez (32, 40, 70, 72, 74, 76) rendre tartozó egy vagy több mikroszkópos képrészt (56a-62a, 80a-86a) határozunk meg,- 66 - - az adott szenzorfelületi mikroszkópos képet (36, 44) és a hozzá tartozó szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet (26, 42) egymásra vetítjük, és - az egy vagy több mikroszkópos képrész (56a-62a, 80a-86a) legalább egyikére, az egy vagy több időfüggő bioszenzor jelrész közül egy adott 5 időfüggő bioszenzor jelrészhez az egymásra vetítés alapján a szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelnek (26, 42) a hozzá tartozó mikroszkópos képrészhez (56a-62a, 80a-86a) tartozó legalább egy pixelét rendeljük.- 67 - KIVONAT A találmány tanítási eljárás bioszenzor sejthez tartozó jelének osztályozására szolgáló rendszer tanítására, amelynél o a rendszer tartalmaz gépi tanuláson alapuló osztályozó modult, 5 o törésmutató-változás meghatározására szolgáló optikai bioszenzor (24) funkcionalizált szenzorfelületével rendre egy vagy több sejtet (32) tartalmazó mintát érintkeztetéssel kölcsönhatásba hozva kapott, aktivációs kinetikát reprezentáló, a bioszenzor (24) pixelein (30) meghatározott több szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelet (26) alkalmaznak, 10 a tanítási eljárás során a több szenzorfelületi bioszenzor időfüggő jelre (26), - egy adott szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelben (26) az adott szenzorfelületi időfüggő bioszenzor jelnek (26) sejthez (32) tartozó legalább egy pixelét tartalmazó tanítási időfüggő bioszenzor jelrészt határoznak meg, és - az osztályozó modult a tanítási időfüggő bioszenzor jelrésszel, a sejthez (32) 15 tartozó aktivációs kinetika osztályozását tanításhoz megadva, tanítják. A találmány továbbá rendszer és kiértékelési eljárás bioszenzor sejthez tartozó jelének osztályozására. (2. ábra)

Images