Methods for treating diseases caused by HIV infection

Abstract

It discloses a method for the treatment of disease caused by HIV infection in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a compound (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Description

Methods for Treating Diseases Caused by HIV Infection

[0001] The present invention claims the priority of the PCT / CN2024 / 100117, filed on June 19, 2024, the contents of which are incorporated herein by its entirety.Field of invention

[0002] The present invention relates to methods for treating diseases caused by HIV Infection.

[0003] Prior arts

[0004] Antiretroviral therapy (ART) has been highly effective at suppressing human immunodeficiency virus (HIV) replication, thus significantly reducing disease progression and mortality in infected individuals. However, ART is not curative and does not meaningfully impact persistent viral reservoirs (VRs) of latently infected cells that comprise CD4+ T cells and myeloid cells. Indeed, upon ART interruption, the virus quickly rebounds after several weeks, highlighting how the presence of VRs obviates an HIV cure. Therefore, eliminating or controlling VRs remains an unwavering priority for HIV cure research. In this context, the aim of the “shock-and-kill” strategy is to reactivate latently infected cells with latency reversal agents (LRA) and render them vulnerable to cell death or clearance by the immune system.

[0005] Previously reported approaches to HIV reactivation, including protein kinase C (PKC) agonists, histone deacetylase inhibitors (HDACi) , and Toll-like receptor (TLR) agonists, have been highly effective in in vitro models of latency, but their efficacy is only moderate when tested in vivo. Moreover, by broadly activating cellular pathways, these compounds elicit significant proinflammatory effects or alter the function and fate of specific immune effector cells, hence limiting their use in clinical settings. Similarly, promising candidates such as bryostatin-1 and analogs, phorbol esters, and phosphatidylethanolamine binding protein-1 (PEBP-1) agonists reactivate HIV via activation of the canonical (c) -NF-κB pathway, inadvertently leading to uncontrolled cytokine release and overt T cell activation.

[0006] Consequently, there is a need to develop alternative approach (es) that can reactivate latent reservoirs and eliminate infected cells without triggering systemic activation, inflammation, or impairment of immune clearance mechanisms.

[0007] Content of the present invention

[0008] In one aspect, the present disclosure provides a method for the treatment of disease caused by HIV infection in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof;

[0009] In another aspect, the present disclosure provides theuse of compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the manufacture of a medicament for the treatment of disease caused by HIV infection.

[0010] In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition for the treatment of disease caused by HIV infection, comprising compound 1 orapharmaceutically acceptable salt thereof and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0011] In some embodiments, the HIV is HIV-1: preferably HIV-1, group M; more preferably HIV-1, group M, subtype B.

[0012] In some embodiments, the disease caused by HIV infection is AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) .

[0013] In another aspect, the present disclosure provides a method for reversing HIV latency in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[0014] In another aspect, the present disclosure provides a method for decreasing HIV viral reservoirs in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[0015] In another aspect, the present disclosure provides a method for decreasing HIV viral rebound in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[0016] In some embodiments, compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is capable of efficiently reactivating HIV via the nc-NF-κB pathway and enhancing the expression of active caspase-3 in CD4+T cell models of viral latency.

[0017] In some embodiments, compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof reverses HIV latency.

[0018] In some embodiments, compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof decreases latently infected cells without a notable effect on the productively infected pool.

[0019] In some embodiments, compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof more potently reduces HIV DNA-containing cells than augments cell-associated viral RNA with no overt modulation of T-cell activation or proliferation.

[0020] In some embodiments, compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof decreases HIV rebound by 66-fold and maintains viremia at levels lower than that of pre-ART, further suggesting a VR reduction.

[0021] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs.

[0022] The term "comprises" refers to “includes, but is not limited to" .

[0023] As used herein, the term “treating” , "treatment" refers to therapeutic therapy. When referring to a particular condition, the treatment refers to: (1) alleviating one or more of the biological manifestations of a disease or a condition, (2) interfering with (a) one or more points in the biological cascade that leads to a condition or (b) one or more of the biological manifestations of a condition, (3) improving one or more of the symptoms, effects or side effects associated with a condition or one or more of the symptoms, effects or side effects associated with a condition or treatment thereof, or (4) slowing the progression of one or more of the biological manifestations of a disorder or a condition.

[0024] As used herein, the term "therapeutically effective amount" refers to an amount that is effective to elicit the desired biological or medical response, including the amount of a compound that, when administered to a subject for treating a disorder, is sufficient to effect such a treatment of the disorder. The therapeutically effective amount will vary depending on the disorder, and its severity, and the age, weight, etc. of the subject to be treated. The therapeutically effective amount may be in one or more doses (for example, a single dose or multiple doses may be required to achieve the desired treatment endpoint) . A therapeutically effective amount may be given in an effective amount if, in conjunction with one or more other agents, a desirable or beneficial result is achieved. Suitable doses of any co-administered compounds may optionally be lowered due to a combined effect, additive or synergistic, of the compound.

[0025] As used herein, the term "subject" to which administration is contemplated includes any animal (e.g., humans) .

[0026] As used herein, the term "pharmaceutically acceptable" refer to compounds, salts, compositions, dosage forms and other materials which are used in preparing a pharmaceutical composition that is suitable for veterinary or human pharmaceutical use.

[0027] As used herein, the term "pharmaceutically acceptable salt" refers to those salts which are, within the scope of sound medical judgment, suitable for use in contact with the tissues of humans and lower animals without undue toxicity, irritation, allergic response and the like, and are commensurate with a reasonable benefit / risk ratio. Pharmaceutically acceptable salts are well known in the art. For example, S. M. Berge et al., describe pharmaceutically acceptable salts in detail in J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1–19. Pharmaceutically acceptable salts of compound 1 include those derived from suitable inorganic and organic acids and bases.

[0028] As used herein, the use of the terms "a" , "an" , "the" , and similar referents in the context of describing the present disclosure (especially in the context of the claims) are to be construed to cover both the singular and the plural, unless otherwise indicated. The use of any and all examples, or exemplary language (including “e.g. ” , "such as" and “for example” ) provided herein, is intended to better illustrate the present disclosure and is not a limitation on the scope of the present disclosure, unless otherwise claimed. No language in the specification should be construed as indicating any non-claimed element as essential to the practice of the present disclosure.

[0029] As used herein, the term "dose" is an amount of the certain substance to be taken at one time.Brief description of the drawings

[0030] Figure 1. SMs reactivate HIV-latently infected model T cells via activation of the non-canonical (nc) NF-κB pathway and lead to degradation of IAPs. HIV reactivation in latently infected 2D10 cells, as measured by the percentage of cells expressing GFP, 48 hours after treatment with increasing concentrations of monovalent and bivalent SMs. Shown are results from two experiments (mean ± SD) . The dotted line is the level of reactivation in vehicle control-treated cells.

[0031] Figure 2. SMs reactivate HIV and lead to activation of specifically the non-canonical NF-κB pathway. 2D10 is Jurkat-based cell line containing an integrated human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) genome that expresses GFP upon activation. Its shows representative pseudo color flow plots, depicting the frequency of reactivated 2D10 cells (GFP+) 48 hours after treatment with monovalent and bivalent SM (10 μM) .

[0032] Figure 3. SMs reactivate HIV and lead to activation of specifically the non-canonical NF-κB pathway. J-lat 10.6 is Jurkat-based cell line containing an integrated human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) genome that expresses GFP upon activation. It summarizes reactivation data in J-lat 10.6 cells 48h post stimulation.

[0033] Figure 4. SMs reactivate HIV-latently infected model T cells via activation of the non-canonical (nc) NF-κB pathway and lead to degradation of IAPs. Immunoblots for 2D10 cells treated with vehicle, TNFα (c-NF-κB activator control) , or different concentrations of compound 1. Expression of the indicated markers of nc-NF-κB (p100 and p52) and c-NF-κB (IκBα) pathways was determined. Shown is a representative blot of three experiments. Numbers shown underneath the blots were obtained from densitometry analysis of immunoblot bands of protein of interest. Quantification was done separately for p100, p52, and IκB by normalizing to loading control (actin) .

[0034] Figure 5. SMs reactivate HIV-latently infected model T cells via activation of the non-canonical (nc) NF-κB pathway and lead to degradation of IAPs. Immunoblots of 2D10 cells treated with vehicle control, TNF-α, or compound 1 probed for the expression of cIAP-1. Shown is a representative blot from two independent experiments.

[0035] Figure 6. SMs reactivate HIV-latently infected model T cells via activation of the non-canonical (nc) NF-κB pathway and lead to degradation of IAPs. Evaluation of HIV reactivation in NIK-knockout 2D10 cells treated with compound 1. A line graph represents results from three independent experiments (mean ± SD) .

[0036] Figure 7. SMs reactivate HIV-latently infected model T cells via activation of the non-canonical (nc) NF-κB pathway and lead to degradation of IAPs. Flow cytometry analysis showing the frequency of 2D10 cells expressing active caspase-3 after 24-hour treatment with compound 1. Vehicle (DMSO only) was used as a negative control.

[0037] Figure 8. SMs reactivate HIV and lead to activation of specifically the non-canonical NF-κB pathway. Flow cytometry analysis showing the level of J-lat 10.6 cells expressing active caspase-3 after 24-hour treatment with compound 1. Vehicle (DMSO only) was used as a negative control.

[0038] Figure 9. SMs reactivate HIV and lead to activation of specifically the non-canonical NF-κB pathway. Primary CD4+ T cells were treated with vehicle (VC, DMSO) , TNF-α, or compound 1 (1 μg) for 24 hours, and whole-cell protein lysates were then analyzed for target engagement by immunoblotting. Depicted is analysis of two separate donors, showing the components of c-NF-κB (IκB) and nc-NF-κB (p52) pathways along with cIAP-1 and cIAP-2.

[0039] Figure 10. compound 1 reduces the frequency of latently infected primary CD4+T cells in cellulo. Flow cytometry analysis of CD4+ T cells infected with the HI. fate. E dual‐fluorescent reporter virus, which identifies productively and latently infected cell populations. HI. fate. E construct contains an E2 Crimson (E2-CRMZ) reporter under the control of the HIV LTR that serves as a marker for cells undergoing productive proviral expression (E2-CRMZ-positive) and an EF1α promoter driving constitutive expression of a green fluorescent protein (ZS-Green) reporter. Cells harbouring a latent provirus are identified as ZS-Green-positive / E2-CRMZ-negative cells while productively infected cells are positive for E2-CRMZ and ZS-Green. Primary CD4+ T cells were transduced with HI. fate. E virus for 3 days and treated with DMSO, PMA / ionomycin (positive control) , and compound 1 for 24 hours. Frequencies of productively infected HIV and latently infected cells were determined by flow cytometry. Efavirenz (EFV) was used to confirm the authenticity of infection.

[0040] Figure 11. Compound 1 reduces the frequency of latently infected primary CD4+T cells in cellulo. Fold change over vehicle control (VC) in the productively and latently infected cell populations. Each symbol represents a donor (n = 6 donors) . Results are shown at 24 hours post-compound 1 treatment. Statistical analysis: two-tailed Mann-Whitney tests; *P < 0.05, ** P < 0.01, ***P < 0.001.

[0041] Figure 12. Compound 1 does not cause overt immunotoxicity in hu-BLT mice. Experimental setup to assess effects of compound 1 in hu-BLT mice. Uninfected mice were administered with either vehicle control or compound 1 for 4 weeks. Untreated mice (UN) were used to gauge the effect of the vehicle control.

[0042] Figure 13. Compound 1 does not cause overt immunotoxicity in hu-BLT mice. Shown are frequencies of HLA-DR+ cells among CD4+ and CD8+ T cells (gated on human CD45+ cells) before and after compound 1 treatment. Data are represented as median with range. Untreated (UN) represented in green, vehicle control in red, and compound 1 (SM) in blue.

[0043] Figure 14. compound 1 treatment does not alter frequency or activation of T cells. Analysis of T cell populations and corresponding HLA-DR expression in the lungs and bone marrow reveals no notable changes after compound 1 treatment. Shown are frequencies of HLA-DR+ cells among CD4+ T cells and CD8+ T cells (within human CD45+ cells) before and after compound 1 treatment. Data are expressed as median with range; each dot represents a mouse. Statistical analysis: two-tailed Mann-Whitney tests; ns-not significant, *P < 0.05. Untreated (UN) is represented in green, vehicle control (VC) represented in red, and compound 1 (SM) represented in blue.

[0044] Figure 15. Compound 1 does not cause overt immunotoxicity in hu-BLT mice. Plasma from untreated mice or those treated with vehicle control (VC) or compound 1 was analyzed by ELISA for TNF-α and IL-6. In all panels, there were 4 mice per experimental group. Statistical analysis: two-tailed Mann-Whitney tests; all analyses were statistically insignificant (ns) .

[0045] Figure 16. Compound 1 reduces the frequency of latently infected cells and modestly increases HIV RNA detection in ART-suppressed hu-BLT mice. Hu-BLT mice were infected with NL4.3-ADA-GFP virus and virally suppressed with ART for 6 weeks. Thereafter, mice received four doses of either vehicle control (VC) or compound 1 in the presence of ART.

[0046] Figure 17. Compound 1 reduces the frequency of latently infected cells and modestly increases HIV RNA detection in ART-suppressed hu-BLT mice. Plasma viral load in mice receiving vehicle (n = 6, blue lines) or compound 1 (n = 7, red lines) . Pink shading depicts the period of ART administration. The dotted line represents the limit of detection (LOD) of the assay.

[0047] Figure 18. Compound 1 reduces the frequency of latently infected cells and modestly increases HIV RNA detection in ART-suppressed hu-BLT mice. HIV-RNA and integrated HIV-DNA were analyzed in different tissues by RT-qPCR or qPCR, respectively. Box and whiskers graph indicates min-max values. Numbers indicated on the graphs depict fold change in the median levels of HIV RNA in compound 1-treated mice over vehicle-treated mice. Samples were analyzed in technical duplicates and there were five to seven mice per group.

[0048] Figure 19. Compound 1 reduces the frequency of latently infected cells and modestly increases HIV RNA detection in ART-suppressed hu-BLT mice. HIV-RNA and integrated HIV-DNA were analyzed in different tissues by RT-qPCR or qPCR, respectively. Box and whiskers graph indicates min-max values. Numbers indicated on the graphs depict fold change in the median levels of HIV DNA in compound 1-treated mice over vehicle-treated mice. Samples were analyzed in technical duplicates and there were five to seven mice per group.

[0049] Figure 20. Sequential treatment of HIV-infected, ART-suppressed hu-BLT mice with compound 1 does not induce generalized T cell activation. Gating strategy for the analysis of CD8+ T cells (top) and CD8-T cells (bottom) .

[0050] Figure 21. Sequential treatment of HIV-infected, ART-suppressed hu-BLT mice with compound 1 does not induce generalized T cell activation. Expression levels of proliferation marker (Ki67) and activation markers (CD69 and HLA-DR) in CD8-T and CD8+ T cells in various lymphoid and nonlymphoid organs from virally-suppressed mice treated with either VC (blue dots) or compound 1 (red dots) . Each dot represents a mouse.

[0051] Figure 22. Sequential treatment of HIV-infected, ART-suppressed hu-BLT mice with compound 1 does not induce generalized T cell activation. TNF-α and IL-6 in plasma of virally-suppressed hu-mice treated with vehicle or compound 1. Shown are median and range.

[0052] Figure 23. Sequential treatment of HIV-infected, ART-suppressed hu-BLT mice with compound 1 does not induce generalized T cell activation. Frequency of Bcl-2+ (left panel) or active caspase-3+ (right panel) CD8-T cells in lymphoid and nonlymphoid organs of virally-suppressed mice treated with either vehicle (blue dots) or compound 1 (red dots) . Statistical analysis: two-tailed Mann-Whitney tests; ns: not significant. In all relevant panels, each dot represents a mouse (n = 5 for vehicle and n = 4 for compound 1)

[0053] Figure 24. Effects of compound 1 on Th17-like expressing CD4+T cells in vivo and ex vivo. Spleen cells from virally suppressed, vehicle-treated (VC) or compound 1-treated hu-mice were stimulated ex vivo with PMA / ionomycin (Stim) and analyzed for IL17a-producing (Th17-like) expressing CD4+ T cells. Representative flow graphs depicting the two cell subsets (gated on human CD45+ CD19-CD14-CD3+populations) are shown on the top. Bottom panels are summary graphs showing results from multiple mice of each group. Statistical analysis: two-tailed Mann-Whitney tests; ns, not significant. In all relevant panels, each dot is one mouse (n = 5 for vehicle and n = 4 or 5 for compound 1) .

[0054] Figure 25. Effects of compound 1 on Th17-like expressing CD4+T cells in vivo and ex vivo. Effects of compound 1 on FoxP3-expressing CD4+T cells in vivo and ex vivo. (A and B) Spleen cells from virally suppressed, vehicle-treated (VC) or compound 1-treated hu-mice were stimulated ex vivo with PMA / ionomycin (Stim) and analyzed for FoxP3-expressing CD4+ T cells. Representative flow graphs depicting the two cell subsets (gated on human CD45+ CD19-CD14-CD3+ populations) are shown on the top. Bottom panels are summary graphs showing results from multiple mice of each group. Statistical analysis: two-tailed Mann-Whitney tests; ns, not significant. In all relevant panels, each dot is one mouse (n = 5 for vehicle and n = 4 or 5 for compound 1) .

[0055] Figure 26. Effects of compound 1 on Th17-like expressing CD4+T cells in vivo and ex vivo. Splenocytes from HIV-infected,  mice were analyzed by flow cytometry for viral Gag p24 in Th-17-like and FoxP3-expressing CD4+ T cells. The dot plot flow graphs show the gating strategy to identify Th-17-like (CD3+CD8-IL-17A+) or FoxP3-expressing (CD3+CD8-FoxP3+) from human CD45+ CD19-CD14-cells. The bottom graphs illustrate p24-positive IL17A+ CD8-T cells or p24-positive FoxP3+ CD8-T cells expressing dim or no CD4.

[0056] Figure 27. Effects of compound 1 on Th17-like expressing CD4+T cells in vivo and ex vivo. Splenocytes isolated from HIV-infected, ART-naive mice (n = 5) were treated with compound 1 ex vivo and stained for HIV-1 Gag p24. Splenocytes treated with vehicle control (VC) DMSO were used as a negative control. Depicted is the p24+ cell count in total CD4+ T cells, Th17-like and FoxP3-expressing T cells following a 48-hour treatment.

[0057] Figure 28. Sequential treatment of virally suppressed hu-BLT mice with compound 1 reduced the level of viral rebound upon ART interruption. Hu-BLT mice were infected with NL4.3-ADA-GFP and viral replication was suppressed by ART for 6 weeks. Mice were then treated with either compound 1 or vehicle control (VC) for 2 weeks (4 doses) in the presence of ART. These mice were then subjected to a 4-week antiviral treatment interruption (ATI) .

[0058] Figure 29. Sequential treatment of virally suppressed hu-BLT mice with compound 1 reduced the level of viral rebound upon ART interruption. Viremia of virally suppressed mice treated with VC (n = 3, blue lines) or compound 1 (n = 3; red lines) was analyzed at regular intervals. The orange background denotes the period of ART administration. The dotted line represents the limit of detection (LOD) .

[0059] Figure 30. A single dose of compound 1 induces HIV RNA detection in plasma of ART-suppressed hu-BLT mice. Hu-BLT mice were infected with NL4.3-ADA-GFP virus and treated daily for 6 weeks with ART (FTC, emtricitabine; RAL, raltegravir; TDF, tenofovir) at the peak of infection. Mice there-after received either a single dose of vehicle control or compound 1 and euthanized 48 hours later.

[0060] Figure 31. A single dose of compound 1 induces HIV RNA detection in plasma of ART-suppressed hu-BLT mice. Plasma viral loads of BLT mice treated with VC (n = 5; blue lines) or compound 1 (n = 6; red lines) over the course of the experiment. Pink shading denotes the period of ART administration. The dotted line represents the limit of detection (LOD) of the assay.

[0061] Detailed description of the preferred embodiment

[0062] The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited thereto.

[0063] Below presents preferred embodiments of the present invention based on the drawings in order to illustrate the technical schemes of the present invention in detail.

[0064] The following Embodiments were carried based on the following experimental model and subject details.

[0065] EXPERIMENTAL MODEL AND SUBJECT DETAILS

[0066] Mice: BLT humanized mice were generated as previously reported. Mice were used at 8 to 10 weeks post humanization. Variations in frequencies of human cells between mice were evenly distributed among experimental groups. Characteristics of humanized mice used in this study can be found in Table S1. The Table also provides information related to the sex of the mice used in different experiments. The use of BLT mice as a model to study HIV persistence and test therapeutic interventions was approved by the Centre Hospitalier Universitaire (CHU) Sainte-Justine institutional (CER#2126) and the CSSS Jeanne-Mance review boards (Montreal, Canada) , and was performed in accordance with federal and provincial laws. Human tissues were obtained following written informed consent to participate in this study. All animal experiments were performed in accordance with protocols approved by each institution’s Institutional Animal Care and Use Committee (IRCM 2018-11 and CIBPA#582&593) following Good Laboratory Practices for Animal Research. The studies were carried out in Biosafety Level 3 (BSL-3) at the Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM) .

[0067] Human: For experiments involving the use of human blood cells, all participants had given written inform consent in accordance with the Declaration of Helsinki under research protocols approved by the human research ethics review board of the IRCM (IRCM 2012-16) .

[0068] METHOD DETAILS

[0069] Pharmacological and toxicity analysis of compound 1 in mice. Hu-BLT mice were left untreated or treated with either vehicle (10%sterile Cremophor dissolved in 5%PEG-400 and 85%phosphate-buffered saline [PBS] ) or compound 1 for 4 weeks. Plasma was collected at different intervals and white blood cells isolated by treating whole blood with red blood cell lysis buffer (Invitrogen) . Flow cytometry was used to analyze cells isolated from various tissues for toxicity and activation profile. Proinflammatory cytokines were evaluated in plasma of compound 1-and vehicle-treated healthy hu-mice and healthy untreated hu-mice using Legend Max enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits for human-TNF-α and IL-6 (both from BioLegend) as per the manufacturer’s protocol. Data analysis was performed using GraphPad Prism software (Version 8.0) .

[0070] HIV infection, ART, and compound 1 treatment of hu-BLT mice and quantitation of viral load. Stocks of HIV-1 NL4.3-ADA-GFP were prepared and titered as previously reported. BLT mice were infected, and plasma viral load quantitated using previously published protocols. Once viral peak was reached (6-8 weeks post infection) , mice were subjected to a daily ART regimen (emtricitabine (100 mg / kg) , tenofovir disoproxil fumarate (50 mg / kg) , and raltegravir (68 mg / kg) via subcutaneous injections. The compounds were obtained from APIChem Technology (Zhejiang, China) . Subsequently, virally suppressed mice were treated for up to 2 weeks with compound 1 (20 mg / kg, every third day) or vehicle intraperitoneally. ART was maintained when mice received more than one dose of compound 1. In some cases, mice were subjected to a 4-week ATI after compound 1 treatment. HIV viral load in plasma of hu-mice was determined weekly using the quantitative  AmpliPrep / COBAS HIV-1 test, Version 2.0 (detection limit, <20 copies / ml; Roche Diagnostics, Florham Park, NJ) .

[0071] Cell isolation from peripheral blood and tissues. Infected mice were sacrificed by gas anesthesia overdose and intracardiac puncture. Cardiac perfusion was performed before tissues were harvested using PBS containing 20 IU / ml heparin. Bone marrow cells were isolated as described. Cells from the spleen, lung and liver were isolated as reported previously.

[0072] HIV-dual reporter virus production, characterization, and infection. HEK293T cells (obtained from American Type Culture Collection [ATCC] , 5×106) were transfected with 20 μg of HI. fate. E dual reporter proviral DNA and pseudotyped with 8 μg pCMV-VSV-G, using LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent as per manufacturer’s instructions (Thermo Fisher) . The HI. fate. E dual reporter lentiviral vectors were concentrated by ultracentrifugation over a 20%sucrose cushion and tittered in Jurkat E6.1 cells. The proportion of productively infected cells (E2-CRMZ-positive cells) was used to estimate infectious units.

[0073] CD4+ T cells were isolated from peripheral blood mononuclear cells and activated with phytohemagglutinin (10 μg / ml) in the presence of IL-2 (100 U / ml) . Thereafter, cells were transduced with HI.fate. E dual reporter virus at multiplicity of infection-1 (MOI-1) and at 48 hours post transduction, they were treated with varying concentrations of compound 1 (0.1-10 μM) for 24 hours. Frequencies of productively and latently infected CD4+ T cells were expressed as fold changes over DMSO (vehicle control) . Cells treated with PMA / ionomycin were used as positive controls.

[0074] HIV reactivation from latent HIV-1-infected cells. Jurkat-based cell lines J-Lat 10.6, 2D10 and 2D10 NIK knock-out contain a HIV-1 genome that expresses GFP upon activation. Reactivation of CD4+ T cell models of latency was determined by measuring the percentage of GFP+ cells after SM treatment (0.01 pM-10 μM) . In brief, cells (20,000 per well seeded in a 96-well plate) were treated with different concentrations of SM for up to 48 hours. Dead cells were excluded using a LIVE / DEADTM Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit (L34966, Thermo Fisher Scientific) . Samples were fixed and acquired using SA3800 Spectral Analyzer (Sony Biotechnology) ; results were analyzed using FlowJoTM (Versions 9.9.3 and 10.1; FlowJo LLC, BD Life Sciences) and expressed as percentage of GFP+ cells. Precision counting beads (BioLegend) were used to determine the exact cell number. All experiments were done three times in triplicates.

[0075] Flow cytometry. Cells from blood and tissues were stained with fluorescently labeled antibodies as indicated (see antibody list in Star Methods) . When appropriate, surface-stained cells were fixed and permeabilized using the Cytofix / Cytoperm kit (BD Biosciences) as per the manufacturer’s instructions and intracellularly stained for HIV-p24 (Beckman Coulter) , various cytoplasmic proteins, and cytokines. In some cases, permeabilization was done using a FoxP3  / Transcription Factor Staining kit (eBioscience) to detect FoxP3 and retinoic acid receptor-related orphan receptor C2 (RORC2) . Precision counting beads were run with each sample to determine absolute numbers. Samples were acquired on a BD LSRFortessaTM Cell Analyzer (BD Bioscience) and analyzed by FlowJo (Versions 9.9.3 and 10.1) .

[0076] Western Blotting. Cells were washed with PBS and then lysed using radioimmunoprecipitation assay RIPA buffer (1%Triton X-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, and 50 mM Tris, pH 7.5) for 30 minutes at 4℃. Immunoblotting was performed according to standard protocols. Primary antibodies were added and incubated overnight at 4℃ and detected with appropriate secondary antibodies (see antibody list in Star Methods) . The cell membrane was then covered with sufficient ECL reagent and imaged on a ChemiDocTM MP Imaging System with Image LabTM Software (Image Lab 6.1; Bio-Rad Laboratories, Inc) . Expression of proteins of interest was normalized to that of housekeeping protein β-actin (ab49900, Abcam) .

[0077] Nucleic-acid extraction and quantitation of HIV DNA and human genes by quantitative real-time PCR. RNA from all lymphoid and nonlymphoid tissues were extracted using QIAzol Lysis Reagent (QIAGEN) according to manufacturer’s instructions and analyzed using previously published protocols. Total DNA from tissue-derived cells was extracted using the QIAamp DNA mini kit (QIAGEN) according to manufacturer’s instructions. HIV DNA was quantitated as described previously. DNA from serially diluted ACH-2 cells (NIH HIV Reagent Program) was extracted and amplified in parallel to generate a standard curve from which unknown samples were enumerated. The human CD3 gene (2 copies per cell) was used to determine the exact number of cells in the reaction. Results are expressed as fold change over vehicle control.

[0078] Embodiment 1

[0079] Compound 1 induces HIV reactivation and enhances expression of active caspase-3 in CD4+T cell models of latency.

[0080] We first assessed HIV reactivation by compound 1 in 2D10 cells, a latently infected Jurkat T-cell line carrying a lentiviral vector that expresses Tat and Rev in cis and a short-lived green fluorescent protein in place of Nef (33) , and compared it to that of other SMs known to have latency-reversing activity. Indeed, bivalent SMs compound 1 and Bbirinapant were more effective at inducing viral reactivation in 2D10 cells compared to monovalent SMs GDC-0152, AT-406, and LCL-161 (Figures 1 and 2) . Similarly, in J-Lat 10.6 cells treated with the same SMs, we observed a similar pattern of viral reactivation (Figure 3) , thus extending the reactivation potential of these molecules to another CD4+ T cell line model of HIV latency (34) .

[0081] Further, compound 1 treatment led to an accumulation of p52 and simultaneous reduction of its precursor p100 (Figure 4) , strongly indicating that the nc-NF-κB pathway was activated. Unsurprisingly, stimulation with tumor necrosis factor-α (TNFα) , a quintessential activator of the c-NF-κB pathway, led to a near complete disappearance of total levels of the NF-κB transcription factor inhibitor, IκBα, when compared to the untreated controls. However, no changes were noted in response to compound 1 treatment, suggesting that the c-NF-κB pathway was not affected (Figure 4 and quantitative analysis of IκBα levels) . To further confirm engagement of the nc-NF-κB pathway by compound 1, we examined expression levels of host factors known to be downregulated upon activation of the nc-NF-κB signaling cascade. As shown, the inhibitor of apoptosis protein 1 (cIAP1) was robustly depleted in compound 1-treated cells in a concentration-dependent manner (Figure 5, upper panel) . Activation of the nc-NF-κB pathway hinges on the stability of the NF-κB-inducing kinase (NIK) , which is downregulated by cIAP1 / 2. The fact that treatment of NIK-knock-out 2D10 cells with compound 1 did not lead to measurable viral reactivation highlights the importance of the nc-NF-κB pathway in latency reversal induced by SMs (Figure 6) .

[0082] Given that SMAC are activators of caspases, it is not surprising that SMs can induce apoptosis in cancer cells. In the context of our study, we assessed whether compound 1 could sensitize latently infected cells to apoptosis. Indeed, compound 1 treatment led a dose-dependent increase in the level of active caspase-3 in both 2D10 (Figure 7) and J-Lat 10.6 (Figure 8) , signifying potential activation of apoptosis pathway (s) . Taken together, compound 1 is a novel bivalent SM, capable of efficiently reactivating HIV via the nc-NF-κB pathway and enhancing the expression of active caspase-3 in CD4+T cell models of viral latency.

[0083] Embodiment 2

[0084] Compound 1 reduces the frequency of latent cells without viral reactivation in a primary cell model of HIV latency.

[0085] We next assessed whether the findings obtained in the cell lines could also be replicated in primary CD4+T cells. In uninfected cells, compound 1 indeed significantly degraded cIAP-1 and cIAP-2, enhanced p100 processing into p52 while keeping IκBα at comparable levels, indicating a primary activation of the nc-NF-κB pathway (Figure 9) . To study whether compound 1 could reactivate latent virus in primary CD4+ T cells and / or sensitize them to death, we took advantage of the single-cycle HI. fate. E dual reporter virus whereby latent cells (i.e., not expressing viral genes) or productively infected cells could be readily identified by flow cytometry (Figure 10) as only ZS-Green-positive or E2-Crimson and ZS-Green -positive cells, respectively. As expected, the reverse transcriptase inhibitor efavirenz blocked infection, whereas phorbol 12-myristate 13-acetate / ionomycin, which activates the c-NF-κB pathway, reduced the frequency of latently infected cells, and increased the level of productively infected cells. At 10 μM compound 1, the latently infected cell population was decreased by at most ～ 2-fold but the productively infected pool was insignificantly affected (Figures 10 and 11) . In fact, at the lower concentrations of compound 1, we observed mostly a reduction in the percentage of latently infected cells, implying that compound 1 might be more effective at targeting the latent cell population in this primary cell model. In this context, our finding is consistent with other reports which have shown that SMs can selectively eliminate latently infected primary cells or latent reservoirs from T cells of HIV-infected, ART-suppressed individuals without inducing detectable viral reactivation. Taken together, our data demonstrate that compound 1 is an effective LRA in T cell lines but in primary CD4+T cells, this SM tends to decrease the frequency of latently infected cells without noticeably causing an increase in the level of cells undergoing LTR-directed gene expression.

[0086] Embodiment 3

[0087] Compound 1 is nontoxic in uninfected hu-BLT mice.

[0088] To assess whether compound 1 could be a potential LRA in vivo, we first performed a pharmacological analysis in uninfected hu-BLT mice to gauge any off-target effects or immune-mediated toxicity. In brief, mice were administered with compound 1 (20 mg / kg) or vehicle control every third day for 4 weeks (Figure 12) . This dosage was chosen because of compound 1 anti-tumor activity in a xenograft mouse model. T cell frequency along with their activation status were monitored in the blood and other tissues before and after treatment (Figure 13 and Figure 14) . As indicated, compound 1 treatment did not lead to notable changes in frequencies of CD4+ or CD8+ T cell subsets. Cell-surface expression of the activation marker HLA-DR was also not affected by compound 1. Importantly, compound 1 treatment did not increase the levels of inflammatory cytokines TNF-α or interleukin-6 (IL-6) (Figure 15) . Taken together, these results demonstrate that compound 1 treatment does not result in overt immunotoxicity in vivo.

[0089] Embodiment 4

[0090] Compound 1 reduces the frequency of latently infected cells and modestly increases HIV RNA detection in ART-suppressed hu-BLT mice.

[0091] Hu-mice were inoculated with HIV-1 NL4.3-ADA-GFP and at peak viremia, infected mice were treated with subcutaneous ART daily for 6 weeks. To gauge the effect of repeated administration of compound 1 on HIV RNA and DNA levels in the context of uninterrupted ART, we treated ART-suppressed mice with at least four doses of compound 1 (or vehicle control) over the course of two weeks (Figure 16) . In this experimental setting, one mouse in the compound 1-treated group had a viremia level above the background while the rest remained aviremic throughout the follow-up, regardless of the compound 1 treatment (Figure 17) . We observed that compound 1 modestly increased the level of cell-associated HIV RNA transcripts in the lung and spleen by up to 2.2-fold but had no effects on the bone marrow and liver (Figure 18) . Analysis of the integrated HIV DNA abundance showed that it was meaningfully reduced in the spleen, liver, and lung of compound 1-treated mice (Figure 19) . We have shown that compound 1 does not affect T cells in uninfected mice (Figure 13 and Figure 14) but augments the level of active caspase-3 in latent T cell lines (Figures 7-8) and preferentially targets latently infected primary CD4+ T cells in a dual reporter virus system (Figures 10-11) . Thus, it is tempting to hypothesize that the decrease in integrated HIV DNA-containing cells suggests a potential reduction in the frequency of latently infected cells or presumably persistent VRs.

[0092] Embodiment 5

[0093] Compound 1 does not exert overt T cell activation in ART-suppressed hu-BLT mice. Previously, it was reported that SM AZD5582 might induce activation and proliferation of T cells. Thus, we evaluated whether compound 1 altered the expression of proliferation marker Ki67 or activation markers HLA-DR and CD69 on T cells. Here, we found no significant changes in any of the tissues tested (Figures 20 and 21) , and plasma levels of proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-α were comparable between the two groups (Figure 22) . We found no clear differences in the frequency of Bcl-2+ CD3+CD8-T cells (i.e., CD4+ T lymphocytes) in tissues of mice treated with compound 1 (vs. vehicle control) but observed a trend towards higher expression of the active caspase-3 among CD8-T cells (Figure 23) , consistent with the data in the latent T cell lines (Figure 7, Figure 8) .

[0094] Embodiment 6

[0095] Effect of compound 1 on CD4+ T cell subsets in vivo and ex vivo. Having observed that compound 1 reduced the frequency of HIV DNA-containing cells in several tissues in ART-suppressed hu-BLT mice, we next explored how compound 1 might have affected different immune cell subsets. Various SMs have been shown to inhibit Th17 function or decrease Treg differentiation. Because both Th17 and Tregs are known to be affected during HIV infection, we assessed whether compound 1 could affect these populations. Here, we found that PMA / ionomycin stimulation enhanced the detection of IL-17A-producing CD4+T (Th-17-like cells) (Figure 24) but did not affect the identification of forkhead box P3 (FoxP3) -expressing CD4+T cells (Figure 25) . In vivo treatment with compound 1 modestly decreased the frequency of splenic Th17-like cells in ART-suppressed mice by 45% (mean 4.5 ± 1.8%in VC-treated group vs. 2.5 ± 1.3%in compound 1-treated group) but the difference was not statistically meaningful, given the small number of mice and variations between them (Figure 24) . Similarly, in the case of FoxP3-expressing CD4+T cells, we observed an insignificant increase in the proportion of these cells in the compound 1 treated group (mean 7.3 ± 1.1%in VC-treated vs. 10.7 ± 4.5%in compound 1 group) (Figure 25) .

[0096] To assess whether compound 1 targets specifically infected (virus-expressing, p24+) cells, we performed a complementary experiment in which splenocytes from HIV-infected,  mice were stimulated with compound 1 ex vivo. In this context, we found that the stimulation led to a moderate decrease in the number of p24-expressing total CD4+ T cells as well as Th17-like and FoxP3+ CD4+ T cell subsets (Figure 26 and 27) . Taken together, our data suggest that compound 1 has the capability to reduce the proportion of infected CD4+T cells including Th17-like cells or FoxP3+CD4+ T cells that are actively producing viral protein (s) . These findings also imply that the modest effects of compound 1 on these T cell subsets in ART-suppressed mice (Figure 24 and 25) could have been due to inherent differences related to productive vs. latent infections, in vivo vs. ex vivo treatment of compound 1, and / or concentration of compound 1 exposed to cells.

[0097] Embodiment 7

[0098] Compound 1 reduces viral rebound after ART treatment interruption. Given the varying effect of compound 1 on the pool of latently infected cells, we sought to perform an ART-treatment interruption (ATI) to assess the impact of the agent on the VRs. To test our hypothesis that mice treated with compound 1 would display a slower viral rebound upon ATI we administered four doses of compound 1 (or vehicle control) alongside ART to virally suppressed mice. Two weeks thereafter, ART was removed, and the mice were sacrificed after 4 weeks off ART (Figure 28) . As shown in Figure 29, plasma viral loads in compound 1-treated mice were at least 66-fold lower than in the control group two weeks after ART cessation. At the end of the experiment (4 weeks post ATI) , the plasma viral loads remained lower in compound 1-treated mice by more than 6-fold. Importantly, a longitudinal analysis of the viremia showed that in compound 1-treated mice, the reduced viral rebound plateaued at a level notably lower than that detected pre-ART suggesting that the size of the reservoir was affected. On this note, the data overall support the notion that compound 1 reduces viral rebound in HIV-infected humanized mice upon ART interruption by decreasing the pool of latently infected cells that persist during ART. As well, when virally suppressed mice received a single dose of compound 1 upon cessation of ART, plasma viral load became detectable in three out of six animals (Figure 30 and 31) , suggesting that the role of compound 1 as a latency reversal agent is more apparent in this context.

[0099] It is to be understood that the foregoing description of two preferred embodiments is intended to be purely illustrative of the principles of the invention, rather than exhaustive thereof, and that changes and variations will be apparent to those skilled in the art, and that the present invention is not intended to be limited other than expressly set forth in the following claims.

Claims

1.A method for the treatment of disease caused by HIV infection in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof; 2.The method of claim 1, wherein the disease caused by HIV infection is AIDS.3.A use of the compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 1 in the manufacture of a medicament for the treatment of disease caused by HIV infection.4.The use of claim 3, wherein the disease caused by HIV infection is AIDS.5.A pharmaceutical composition for the treatment of disease caused by HIV infection, comprising the compound 1 or the pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 1 and a pharmaceutical acceptable excipient.6.The pharmaceutical composition of claim 5, wherein the disease caused by HIV infection is AIDS.7.A method for reversing HIV latency in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 1.8.A method for decreasing HIV viral reservoirs in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 1.9.A method for decreasing HIV viral rebound in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a compound 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof of claim 1.

Images