Method for diagnosing a cancer and associated kit

Abstract

The invention concerns a method for diagnosing a cancer in a subject, comprising a step of RT-MLPA on a biological sample obtained from the subject, in which the RT-MLPA step is carried out using at least one pair of probes comprising at least one probe chosen among the probes with SEQ ID NO: 1 to 13, and / or the probes with SEQ ID NO: 96 to 99, and / or the probes with SEQ ID NO: 866 to 938, and / or the probes with SEQ ID NO: 940 to 1104, and / or SEQ ID NO: 211 to 1312, and / or the probes with SEQ ID NO: 96 to 99, and / or the probes with SEQ ID NO: 1105 to 1107 and / or the probe with SEQ ID NO: 939 and / or the probes with SEQ ID NO: 1108 to 1123, each of the probes being fused, at at least one end, with a priming sequence, and at least one of the probes of the pair comprising a molecular barcode sequence.

Description

1 Description Titre: METHODE DE DIAGNOSTIC D'UN CANCER ET KIT ASSOCIE

[0001] La présente invention concerne une méthode de diagnostic d'un cancer et un kit utile pour la mise en œuvre d'une telle méthode. La présente invention concerne également une méthode mise en œuvre par ordinateur afin d'analyser les résultats obtenus suite à la mise en œuvre de cette méthode, notamment effectuée dans le cadre d'un diagnostic de cancer. Contexte de l'invention

[0002] Les cancers sont dus à une accumulation d'anomalies génétiques par les cellules tumorales. Parmi ces anomalies figurent de nombreux réarrangements chromosomiques (translocations, délétions et inversions) qui entraînent la formation de gènes de fusion qui codent des protéines anormales. Ces réarrangements entraînent également des déséquilibres entre l'expression des exons situés en 5' et en 3' des points de cassure génomiques (déséquilibres d'expression 5'-3'), l'expression des premiers restant sous le contrôle des régions régulatrices de transcription naturelles du gène tandis que celle des seconds passent sous le contrôle des régions régulatrices de transcription du gène partenaire. Parmi ces anomalies figurent également des mutations sur des sites d'épissage qui perturbent la maturation normale des ARN, entraînant notamment des sauts d'exon. Les gènes de fusion, les sauts d'exon et les déséquilibres d'expression 5'-3', qui constituent des marqueurs diagnostics importants, sont usuellement recherchés par des techniques différentes. Certaines de ces anomalies génétiques sont très difficiles à détecter / analyser, notamment celles impliquées dans le développement des sarcomes, qui sont très hétérogènes et peuvent impliquer un très grand nombre de gènes. De plus, les quantités d'ARN obtenues à partir des biopsies de sarcomes est souvent très faible, de qualité médiocre. Les réarrangements chromosomiques dans le cadre des sarcomes sont notamment discutés dans l'article Nakano et Takahashi (Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 3784; doi:10.3390 / ijms19123784).

[0003] Les gènes de fusions sont souvent associés à des formes particulières de tumeur, et leur mise en évidence peut contribuer de façon significative à poser le diagnostic et à choisir le traitement le plus adapté (The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Mitelman F, Johansson B, Mertens F., Nat Rev Cancer. 2007 Apr;7(4):233-45.). Ils sont aussi souvent utilisés comme marqueurs moléculaires pour contrôler l'efficacité des traitements et suivre l'évolution de la maladie, comme par exemple dans les leucémies aiguës (Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, Delabesse E, Rossi V, Saglio G, Gottardi E, Rambaldi A, Dotti G, Griesinger F, Parreira A, Gameiro P, Diáz MG, Malec M, Langerak AW, San Miguel JF, Biondi A. Leukemia. 1999 Dec;13(12):1901-28). 2

[0004] Les quatre principales techniques qui sont couramment utilisées pour rechercher les gènes de fusion sont la cytogénétique conventionnelle, la cytogénétique moléculaire (hybridation in situ fluorescente), l'immunohistochimie, et la génétique moléculaire (RT-PCR, RNAseq ou RACE).

[0005] La cytogénétique conventionnelle consiste à établir le caryotype des cellules cancéreuses pour rechercher d'éventuelles anomalies de nombre et / ou de structure des chromosomes. Elle possède l'avantage de fournir une vision globale de l'ensemble du génome. Elle est cependant relativement peu sensible, son efficacité dépendant fortement du pourcentage de cellules tumorales dans l'échantillon à analyser et de la possibilité d'obtenir des cultures cellulaires viables. Un autre de ses inconvénients est sa faible résolution qui ne permet pas de détecter certains réarrangements (en particulier des inversions et délétions de petite taille). Enfin, certaines tumeurs sont associées à une instabilité génomique majeure qui masque les anomalies génétiques pathognomoniques. Cela est par exemple le cas dans les tumeurs solides telles que le cancer du poumon. L'analyse des caryotypes, quand elle est possible, est donc difficile et ne peut être réalisée que par du personnel possédant une excellente expertise, ce qui induit des coûts importants.

[0006] La cytogénétique moléculaire, ou FISH (Fluorescent In Situ Hybridization), consiste à hybrider des sondes fluorescentes sur les chromosomes des cellules tumorales afin de visualiser leurs anomalies de structure. Elle permet de détecter les réarrangements chromosomiques avec une meilleure résolution que la cytogénétique conventionnelle, et donc de détecter des réarrangements de plus petite taille. Elle permet aussi de mettre en évidence des anomalies dans des tumeurs à forte instabilité génomique, en ciblant précisément les gènes susceptibles d'être impliqués. Son inconvénient majeur est que chaque anomalie doit être recherchée individuellement, à l'aide de sondes spécifiques. Elle induit donc des coûts importants et, du fait de la grande diversité des anomalies qui ont été décrites et de la faible quantité de matériel tumoral disponible au diagnostic, seules quelques anomalies peuvent être recherchées. Par exemple, en pratique, dans le contexte du diagnostic d'un carcinome pulmonaire, seul le réarrangement du gène ALK est recherché de façon courante par cette méthode, la recherche des autres réarrangements récurrents dans ces tumeurs restant très exceptionnelle.

[0007] L'immunohistochimie (ou IHC) consiste à rechercher, à l'aide d'anticorps, la surexpression d'une protéine anormale. Il s'agit d'une méthode simple et rapide, mais qui nécessite également de rechercher chaque anomalie de façon individuelle et dont la spécificité est souvent faible, certains gènes pouvant être surexprimés dans une tumeur en absence de tout réarrangement.

[0008] La RT-PCR, le RNAseq et la RACE, sont des méthodes de génétique moléculaire réalisées à partir de l'ARN extrait des cellules tumorales. La RT-PCR possède une excellente sensibilité, bien supérieure à la cytogénétique. Cette sensibilité en fait la technique de référence pour analyser des échantillons biologiques où le pourcentage de cellules tumorales est faible, par exemple pour contrôler l'efficacité des traitements ou pour anticiper très précocement d'éventuelles rechutes. Sa limite principale est liée au fait qu'il est extrêmement difficile de multiplexer ce type d'analyse. Comme pour la cytogénétique moléculaire, chaque translocation doit en général être recherchée par un test spécifique, et seules quelques fusions récurrentes parmi les très nombreuses qui sont aujourd'hui connues sont donc aujourd'hui recherchées dans les laboratoires de diagnostic de routine. La RT-PCR nécessite également de pouvoir disposer d'ARNs de bonne qualité, ce qui est rarement le cas pour les tumeurs solides où, pour faciliter le diagnostic anatomo- pathologique, les prélèvements sont fixés au formol et inclus en paraffine dès l'obtention de la biopsie. Cette technique très sensible peut être très utile pour diagnostiquer un sarcome. Il est néanmoins nécessaire de réaliser de nombreux tests indépendants recherchant au minimum les gènes de fusions récurrents les plus fréquents, ce qui entraine des coûts supplémentaires et allonge le délai. Le RNAseq, qui consiste à analyser l'ensemble des ARNs exprimés par la tumeur par séquençage de nouvelle génération (NGS), permet théoriquement de détecter tous les transcrits de fusion anormaux exprimés. Il nécessite cependant également de disposer d'ARNs de bonne qualité et est donc difficile à mettre en œuvre à partir de biopsies fixées au formol. Son application est également très complexe puisque de nombreuses étapes sont nécessaires pour générer les librairies de séquençage. De plus, le séquençage génère une quantité très importante de données (puisque l'ensemble des gènes sont étudiés) ce qui rend l'analyse particulièrement complexe. La RACE, qui a récemment été adaptée au NGS, est une simplification de la technique de RNAseq qui permet de cibler des panels restreints de gènes susceptibles d'être impliqués dans des fusions. Elle présente l'avantage de pouvoir être appliquée sur des biopsies fixées au formol. Cependant, si la quantité de données générées est limitée par rapport au RNAseq, elle reste importante. Contrairement à la méthode décrite dans la présente invention qui ne détecte que les ARNs anormaux, la RACE conduit à l'obtention de séquences qui correspondent à l'ensemble des gènes ciblés dans le panel, même lorsqu'ils sont en configuration germinale. La grande majorité des séquences qui sont obtenues correspond donc à des transcrits normaux, exprimés naturellement par les cellules tumorales et par les cellules de leur environnement. Les fichiers de séquences doivent donc être filtrés pour identifier les transcrits de fusion. Enfin, comme le RNAseq, la RACE est une technique longue et complexe à mettre en œuvre, où de nombreuses étapes sont nécessaires pour obtenir les librairies de séquençage, ce qui allonge les délais de rendu des résultats.

[0009] Les sauts d'exon entraînent généralement l'expression d'une protéine anormalement courte qui est impliquée dans le processus tumoral. Par exemple, le saut de l'exon 14 du gène MET est impliqué dans le développement du carcinome pulmonaire, et les sauts des exons 2 à 7 du gène EGFR sont impliqués dans le développement de certaines tumeurs cérébrales, notamment les glioblastomes. Ils sont souvent dus à des mutations ponctuelles qui touchent les sites d'épissage des exons (sites donneurs en 3', accepteurs en 5', ainsi que les enhancers introniques ou exoniques), ou à des délétions internes des gènes. Il est aujourd'hui particulièrement difficile de mettre ces anomalies en évidence pour le diagnostic des cancers, puisque ni la cytogénétique ni la FISH ne sont informatives. La RT-PCR pourrait constituer une 4 alternative, mais elle est fortement limitée du fait de la fixation des biopsies tumorales au formol nécessaire pour le diagnostic anatomo-pathologique. Ces anomalies sont donc aujourd'hui principalement recherchées par séquençage de nouvelle génération de l'ADN génomique ou de l'ARN qui sont des techniques onéreuses et complexes.

[0010] Les déséquilibres d'expression 5'-3, qui nécessitent d'évaluer l'expression des exons de façon quantitative, ne sont que très rarement recherchés lors du diagnostic d'un cancer. Ils peuvent être analysés soit par RNAseq, soit par des kits dédiés comme ceux proposés par la société Nanostring (par exemple le test « nCounter® Lung Fusion Panel »).

[0011] La demande internationale PCT / FR2014 / 052255 décrit une méthode de diagnostic d'un cancer par la détection des gènes de fusion. Ladite méthode comprend une étape de RT-MLPA à l'aide de sondes fusionnées à au moins une extrémité avec une séquence d'amorçage.

[0012] L'article de Ruminy et al. décrit par ailleurs la détection par RT-MLPA de gènes de fusion dans le contexte des leucémies aigues (Multiplexed targeted sequencing of recurrent fusion genes in acute leukaemia.; Leukemia, 2016 Mar;30(3):757-60).

[0013] L'article de Piton et al. décrit par ailleurs la détection par RT-MLPA de réarrangement liés aux gènes ALK, ROS et RET dans le contexte des adénocarcinomes pulmonaires (Ligation- dependant-RT-PCR: a new specific and low-cost technique to detect ALK, ROS and RET rearrangements in lung adenocarcinoma; Lab Invest. 2018 Mar;98(3):371-379).

[0014] Des techniques permettant aujourd'hui de détecter des gènes de fusion, des sauts d'exon ou des déséquilibres d'expression 5'-3' sont donc connues, mais présentent des inconvénients.

[0015] Les limites des méthodes existantes sont essentiellement liées : (i) à la multiplicité des anomalies à rechercher (il s'agit d'une des limites la plus importante des techniques d'IHC, de FISH et de RT-PCR) ; (ii) à la sensibilité requise pour détecter des anomalies génétiques à partir de biopsies tumorales de petites tailles, fixées et incluses en paraffine (il s'agit d'une des limites les plus importantes des techniques de séquençage de nouvelle génération) ; (iii) à l'interprétation des résultats (il est nécessaire de définir des seuils pour l'IHC, il existe des artéfacts importants pour la FISH, le RNAseq et la RACE génèrent une quantité de données très importante, dont l'analyse est difficile) ; (iv) à la complexité de mise en œuvre (la multiplicité des étapes à réaliser augmente le risque d'erreur, le temps technique nécessaire, augmente les coûts opérateurs et impacte fortement la qualité des résultats générés et les délais de rendu).

[0016] La méthode décrite dans la demande internationale PCT / FR2014 / 052255 est plus spécifique, simple et rapide à mettre en œuvre par rapport aux techniques existantes pour détecter les gènes de fusion.

[0017] Cependant, il existe toujours un besoin pour des techniques de diagnostic de gènes de fusion capables de détecter une très grande variété d'anomalies de façons spécifiques, sensibles, fiables, tout en restant simples et rapides à mettre en œuvre. 5

[0018] La demande internationale PCT / FR2014 / 052255 décrit également des sondes spécifiques pour des types de translocation observée dans des cancers. Cependant, de nouvelles anomalies génétiques ont depuis lors été mises en évidence et ne peuvent pas être détectées par la méthode décrite dans la demande internationale ci-dessus référencée.

[0019] Il existe ainsi un besoin pour une méthode de diagnostic permettant de détecter de nouvelles anomalies génétiques.

[0020] Par ailleurs, les techniques permettant aujourd'hui de détecter des sauts d'exon nécessitent de réaliser des tests complémentaires complexes. Ces techniques sont donc coûteuses, longues à mettre en œuvre, et d'interprétation difficile.

[0021] Il existe ainsi un besoin pour une technique permettant de détecter des sauts d'exon qui soit sensible, fiable, simple, économique et rapide à mettre en œuvre.

[0022] Il existe également un besoin pour une technique permettant de détecter des déséquilibres d'expression 5'-3' qui soit sensible, fiable, simple, économique et rapide à mettre en œuvre.

[0023] Les techniques permettant de détecter les gènes de fusion, les sauts d'exon et les déséquilibres d'expression 5'-3' étant par ailleurs différentes, il existe également un besoin pour une méthode permettant de détecter ces trois types d'anomalies génétiques de façon simultanée.

[0024] Enfin, les biopsies chirurgicales tumorales disponibles au diagnostic des cancers solides étant souvent de très petites tailles, fixées au formol et incluses en paraffine, il existe un besoin pour une méthode permettant de détecter un grand nombre d'anomalies de façon simultanée à partir de matériel génétique en faible quantité et de mauvaise qualité.

[0025] La présente invention vise ainsi à répondre à ces différents besoins. La présente invention repose en effet sur les résultats des inventeurs qui (i) ont identifié de nouvelles anomalies génétiques liées aux gènes RET, MET, ALK et / ou ROS dans les carcinomes (à la fois des gènes de fusion et des sauts d'exon), et (ii) ont développé une technique permettant de les identifier. La présente invention repose également sur (iii) les résultats des inventeurs qui ont identifié de nouvelles sondes, notamment permettant de diagnostiquer des sarcomes, des tumeurs cérébrales, des tumeurs gynécologiques ou encore des tumeurs ORL, ou (iv) des déséquilibres 5'-3' (par exemple des déséquilibres 5'-3' du gène ALK). La présente invention repose également sur (v) l'utilisation de sondes comprenant au moins un barcode moléculaire qui permet d'améliorer de façon significative la sensibilité et la spécificité de la détection.

[0026] La présente invention fournit ainsi une méthode qui permet de détecter simultanément des gènes de fusion, des sauts d'exon et des déséquilibres d'expression 5'-3'. La présente invention présente également l'avantage d'être spécifique, sensible, fiable, mais également simple, économique et rapide à mettre en œuvre. Typiquement, grâce à la technique selon l'invention, les résultats peuvent être obtenus en deux ou trois jours après réception de l'échantillon par le laboratoire d'analyse, contre plusieurs semaines pour des techniques habituelles. Elle présente 6 également comme avantage d'être applicable sur les tissus fixés, tels qu'ils sont utilisés dans les laboratoires d'anatomo-pathologie. La présente invention permet ainsi d'identifier les anomalies génétiques à partir de matériel génétique en faible quantité et de mauvaise qualité. Enfin, sa très grande sensibilité (elle permet de détecter moins d'une dizaine de molécules anormales dans un échantillon), couplé à sa très grande spécificité (les résultats obtenus sont des séquences d'ADN, c'est-à-dire des données qualitatives, ce qui n'induit pas de biais d'interprétation comme pour les méthodes quantitatives de type IHC) en font une méthode très efficace. La présente invention permet ainsi une prise en charge thérapeutique adaptée à chaque patient. En effet, la présente invention permet de poser le diagnostic avec précision et de guider le choix thérapeutique en identifiant les patients éligibles à des thérapies ciblées. Exposé de l'invention

[0027] Dans un premier aspect, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'un cancer chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet, dans laquelle l'étape de RT-MLPA est réalisée à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi : - les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et / ou - les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0028] Dans ce premier aspect, l'invention concerne également une méthode de diagnostic d'un cancer chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet, dans laquelle l'étape de RT-MLPA est réalisée à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi : - les sondes SEQ ID NO : 866 à 938, et / ou SEQ ID NO : 940 à 1104, et / ou - les sondes SEQ ID NO : 1105 à 1107, et / ou SEQ ID NO : 939, et / ou - les sondes SEQ ID NO : 1108 à 1123, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0029] Dans ce premier aspect, l'invention concerne également une méthode de diagnostic d'un cancer chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet, dans laquelle l'étape de RT-MLPA est réalisée à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 1211 à 1312, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0030] Dans un premier aspect, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'un cancer chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet, dans laquelle l'étape de RT-MLPA est réalisée à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi : - les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et / ou 866 à 938, et / ou SEQ ID NO : 940 à 1104, et / ou SEQ ID NO: 1211 à 1312, et / ou - les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, et / ou SEQ ID NO : 1105 à 1107, et / ou SEQ ID NO : 939, et / ou - les sondes SEQ ID NO : 1108 à 1123, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0031] Selon l'invention, le terme « MLPA » signifie Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification, qui permet l'amplification simultanée de plusieurs cibles d'intérêt contiguës l'une de l'autre, en utilisant une ou plusieurs sondes spécifiques. Cette technique est très avantageuse, dans le cadre de la présente invention, pour déterminer la présence de translocations, qui sont fréquentes dans les tumeurs malignes.

[0032] Selon l'invention, le terme « RT-MLPA » signifie Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification précédée d'une Transcription Inverse (Reverse transcription, RT), qui permet, dans le cadre de la présente invention, de partir de l'ARN d'un sujet pour amplifier et caractériser les gènes de fusion, les sauts d'exon d'intérêt et / ou des déséquilibres d'expression 5'-3'. Selon l'invention, l'étape de RT-MLPA est réalisée en mode multiplex. Le mode multiplex permet un gain de temps, car il est plus rapide que plusieurs monoplex, et est économiquement avantageux. Il permet également de rechercher simultanément un nombre beaucoup plus élevé d'anomalies que les autres techniques actuellement disponibles. L'étape de RT-MLPA est dérivée de la MLPA, décrite notamment dans le brevet US 6,955,901. Elle permet la détection et le dosage simultané d'un grand nombre de séquences oligonucléotidiques différentes. Le principe est le suivant (voir la Figure 1 qui expose le principe avec un gène de fusion) : l'ARN extrait du tissu tumoral est d'abord converti en ADN complémentaire (ADNc) par transcription inverse. Cet ADNc est ensuite incubé avec le mélange de sondes adéquates, chacune pouvant alors s'hybrider sur les séquences des exons auxquels elles correspondent. Si un des transcrits de fusion ou un des transcrits correspondant à un saut d'exon recherché est présent dans l'échantillon, deux sondes viennent se fixer côte à côte sur l'ADNc correspondant. Une réaction de ligation est alors réalisée à l'aide d'une enzyme à activité ADN ligase, qui établit une liaison covalente entre les deux sondes contiguës. Une réaction de PCR (Polymérase Chain Reaction) est ensuite réalisée, en utilisant des amorces correspondant aux séquences d'amorçage, qui permet d'amplifier spécifiquement les deux sondes liguées. L'obtention d'un produit d'amplification après l'étape de RT-MLPA indique que l'une des translocations ou un saut d'exon recherché est présente dans l'échantillon analysé. Le séquençage de ce produit d'amplification permet d'identifier les gènes impliqués.

[0033] Selon l'invention, le terme « sujet » signifie un individu sain ou susceptible d'être atteint d'un cancer ou en quête de dépistage, de diagnostic ou de suivi.

[0034] Selon l'invention, le terme « échantillon biologique » signifie un échantillon contenant de la matière biologique. Plus préférentiellement, cela signifie tout échantillon contenant de l'ARN. Cet échantillon peut provenir d'un prélèvement biologique effectué chez un être vivant (patient humain, animal). Préférentiellement, les échantillons biologiques selon l'invention sont choisis parmi le sang et une biopsie, obtenus à partir d'un sujet, notamment humain. La biopsie est notamment tumorale, notamment issue d'une coupe de tissu fixé (par exemple fixée au formol et / ou incluse en paraffine) ou d'un échantillon congelé.

[0035] Selon l'invention, le terme « cancer » signifie une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormalement importante au sein d'un tissu normal de l'organisme, de telle manière que la survie de ce dernier est menacée. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer est lié à une anomalie génétique, de préférence la formation d'un gène de fusion et / ou d'un saut d'exon et / ou d'un déséquilibre 5'-3'. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer est lié à une anomalie génétique, de préférence un gène de fusion ou un saut d'exon. Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer implique au moins un gène choisi parmi RET, MET, ALK et / ou ROS, et est notamment associé à la formation d'un gène de fusion et / ou à un saut d'exon, plus particulièrement un saut d'exon du gène MET et / ou d'un déséquilibre 5'-3', plus particulièrement un déséquilibre 5'-3' du gène ALK. Selon l'invention, et dans un premier aspect, le cancer est de préférence un carcinome. Les carcinomes sont des tumeurs malignes développées aux dépens d'un tissu épithélial. Plus particulièrement le cancer est un carcinome pulmonaire, plus particulièrement un carcinome broncho-pulmonaire, encore plus particulièrement un carcinome pulmonaire associé à une anomalie génétique des gènes RET, MET, ALK et / ou ROS. Dans un autre mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le déséquilibre d'expression 5'-3' s'entend plus particulièrement d'un déséquilibre d'expression du gène ALK. Selon un autre aspect de l'invention, et dans un deuxième aspect, le cancer est de préférence un sarcome, une tumeur cérébrale, une tumeur gynécologique ou encore une tumeur ORL. Les sarcomes sont des tumeurs des tissus mous et des os. Les tumeurs cérébrales sont les tumeurs qui se développent dans le cerveau, telles que les gliomes ou les médulloblastomes. Les tumeurs gynécologiques sont les tumeurs de l'appareil génital féminin, telles que le cancer du col de l'utérus, le cancer de l'endomètre et le cancer de l'ovaire. Les cancers ORL (oto-rhino-laryngologique) sont les cancers des voies aérodigestives supérieures, tels que les carcinomes épidermoïdes de la gorge (larynx, pharynx) et de la bouche, le cancer du cavum (ou nasopharynx), le cancer des glandes salivaires (parotide, palais), ou le cancer de la glande thyroïde. Dans un autre mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le saut d'exon s'entend également d'un saut d'exon du gène EGFR, et plus particulièrement un saut des exons 2 à 7 du gène EGFR. Ainsi, selon l'invention, le saut d'exon s'entend d'un saut d'exon du gène MET et / ou EGFR. Selon l'invention, le terme « sonde » signifie une séquence d'acide nucléique de longueur comprise entre 15 et 55 nucléotides, de préférence comprise entre 15 et 45 nucléotides, et complémentaire d'une séquence d'ADNc issue d'un ARN du sujet (endogène). Elle est donc capable de s'hybrider avec ladite séquence d'ADNc issue d'un ARN du sujet. Le terme « couple de sondes » s'entend d'un ensemble de deux sondes (i.e. une sonde « Gauche » et une sonde « Droite ») ; l'une étant située en 5' (voir notamment « G » dans le Tableau 1) de la translocation du gène de fusion, du saut d'exon ou des exons dont l'expression est évaluée afin de détecter un 9 déséquilibre d'expression 5'-3', l'autre étant située en 3' (voir notamment « D » dans le Tableau 1) de la translocation du gène de fusion, du saut d'exon ou des exons dont l'expression est évaluée afin de détecter un déséquilibre d'expression 5'-3'. De préférence, ledit couple de sondes est constitué de deux sondes s'hybridant côte à côte pendant l'étape de RT-MLPA. De préférence, un couple de sondes selon l'invention est formé a minima des sondes de SEQ ID NO : 1 à 13, et / ou les sondes de SEQ ID NO: 96 à 99 et / ou les sondes SEQ ID NO: 14 à 91. Encore plus particulièrement, un couple de sondes selon l'invention est formé a minima des sondes de SEQ ID NO: 1 à 13, des sondes de SEQ ID NO: 96 à 99 et des sondes de SEQ ID NO: 14 à 91. De préférence, un couple de sondes selon l'invention est formé a minima des sondes de SEQ ID NO : 866 à 938, et / ou les sondes de SEQ ID NO : 940 à 1104, et / ou les sondes de SEQ ID NO : 1105 à 1107, et / ou SEQ ID NO: 939, et / ou les sondes SEQ ID NO: 1108 à 1123. Encore plus particulièrement, un couple de sondes selon l'invention est formé a minima des sondes de SEQ ID NO: 866 à 938, des sondes de SEQ ID NO: 940 à 1104, des sondes de SEQ ID NO: 1105 à 1107, de la sonde de SEQ ID NO : 939 et des sondes SEQ ID NO : 1108 à 1123. De préférence, un couple de sondes selon l'invention est formé a minima des sondes de SEQ ID NO : 1211 à 1312. Encore plus particulièrement, un couple de sondes selon l'invention est formé a minima des sondes de SEQ ID NO : 1 à 13, des sondes de SEQ ID NO : 96 à 99, des sondes de SEQ ID NO : 14 à 91, des sondes de SEQ ID NO : 866 à 938, des sondes de SEQ ID NO : 940 à 1104, des sondes de SEQ ID NO : 1105 à 1107, de la sonde de SEQ ID NO : 939, et des sondes de SEQ ID NO : 1108 à 1123. Encore plus particulièrement, un couple de sondes selon l'invention est formé a minima des sondes de SEQ ID NO : 1 à 13, des sondes de SEQ ID NO : 96 à 99, des sondes de SEQ ID NO: 14 à 91, des sondes de SEQ ID NO: 866 à 938, des sondes de SEQ ID NO: 940 à 1104, des sondes de SEQ ID NO : 1105 à 1107, de la sonde de SEQ ID NO : 939, et des sondes de SEQ ID NO: 1108 à 1123 et des sondes de SEQ ID NO: 1211 à 1312.

[0036] Selon l'invention, le terme « séquence d'amorçage » signifie une séquence d'acide nucléique de longueur comprise entre 15 et 30 nucléotides, de préférence comprise entre 19 et 25 nucléotides, et non complémentaire des séquences d'ADNc issues d'ARN du sujet. Elle n'est donc pas complémentaire de l'ADNc correspondant à l'ARN endogène. Elle ne peut donc pas s'hybrider avec lesdites séquences d'ADNc. De préférence, dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention la séquence d'amorçage est choisie parmi les (couples de) séquences SEQ ID NO: 92 et SEQ ID NO: 93 ou SEQ ID NO: 94 et SEQ ID NO: 95.

[0037] Selon l'invention, le terme « séquence index » signifie une séquence d'acide nucléique de longueur comprise entre 5 et 10 nucléotides, de préférence comprise entre 6 et 8 nucléotides, notamment 8 nucléotides, et non complémentaire des séquences d'ADNc issues d'ARN du sujet. Elle n'est donc pas complémentaire de l'ADNc correspondant à l'ARN endogène. Elle ne peut donc pas s'hybrider avec lesdites séquences d'ADNc. De préférence, la séquence index est représentée par la séquence SEQ ID NO : 836. Ladite séquence index est une constituée de bases (A, T, G ou C). Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, ladite séquence index peut être fusionnée à une séquence d'amorçage, notamment à l'extrémité 3' de la séquence 10 d'amorçage. La séquence index est propre à chaque sujet / patient dont l'échantillon est testé. Chaque couple de sondes utilisé dans l'étape de PCR comprend une séquence index différente qui permet d'identifier les séquences liées à chacun des patients analysés.

[0038] Selon l'invention, le terme « barcode moléculaire » signifie une séquence d'acide nucléique de longueur comprise entre 5 et 10 nucléotides, de préférence comprise entre 6 et 8 nucléotides, notamment 7 nucléotides, et non complémentaire des séquences d'ADNc issues d'ARN du sujet. Elle n'est donc pas complémentaire de l'ADNc correspondant à l'ARN endogène. Elle ne peut donc pas s'hybrider avec lesdites séquences d'ADNc. De préférence, la séquence de barcode moléculaire est représentée par la séquence SEQ ID NO : 100. Ladite séquence de barcode moléculaire est une séquence aléatoire, constituée de bases aléatoires (A, T, G ou C). L'utilisation de cette séquence permet de renseigner sur le nombre exact de molécules d'ADNc détectées par ligation, en s'abstenant du biais lié à l'amplification par PCR. Selon l'invention, au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire. En d'autres termes, au moins une des sondes dudit couple est fusionnée à une extrémité avec une séquence de barcode moléculaire Dans un mode de réalisation préféré, et particulièrement préféré, une séquence de barcode moléculaire est ajoutée en 5' de la sonde « F » ou « Forward », appelées aussi « G » ou « Gauche ». Dans un mode de réalisation préféré, chacune des sondes peut comprendre une séquence de barcode moléculaire, en particulier les sondes SEQ ID NO : 14 à 91 et les sondes SEQ ID NO : 96 et 98, de préférence les sondes SEQ ID NO : 14 à 91.

[0039] Selon l'invention, le terme « séquence d'extension » fait référence aux séquences qui peuvent être présentes aux extrémités des amorces utilisées pendant l'étape de PCR, et qui permet l'analyse des produits de PCR sur un séquenceur de nouvelle génération de type Illumina. Une séquence dite 'extension' correspond à toute séquence appropriée permettant l'analyse des produits de PCR sur un séquenceur de nouvelle génération. Une séquence d'extension est une séquence d'acide nucléique de longueur comprise entre 5 et 20 nucléotides, de préférence comprise entre 5 et 15 nucléotides, et non complémentaire des séquences d'ADNc issues d'ARN du sujet. Elle n'est donc pas complémentaire de l'ADNc correspondant à l'ARN endogène. Elle ne peut donc pas s'hybrider avec lesdites séquences d'ADNc. Elle est notamment représentée par la SEQ ID NO : 865. Les connaissances de l'homme du métier lui permettent aisément d'adapter ces séquences d'extension.

[0040] Selon l'invention, le terme « sensibilité » signifie la proportion de tests positifs chez les sujets atteints de cancers et réellement porteurs des anomalies recherchées (calculée par la formule suivante : nombre de vrais positifs / (nombre de vrais positifs plus nombre de faux négatifs)).

[0041] Selon l'invention, le terme « spécificité » signifie la proportion de tests négatifs chez les sujets non atteints de cancers et non porteurs des anomalies recherchées (calculée par la formule suivante : nombre de vrais négatifs / (nombre de vrais négatifs plus nombre de faux positifs)).

[0042] Les inventeurs de la présente invention ont identifié des sondes spécifiques pour de nouvelles anomalies génétiques observées dans certains cancers. Cette identification repose sur l'analyse de la structure intron-exon des gènes impliqués dans les translocations, comme cela est montré en Figure 1, ou les sauts d'exon, comme cela est montré en Figure 2 ou Figure 9, ou encore les déséquilibres d'expression 5'-3' comme cela est montré en Figure 13. En particulier, s'agissant de la Figure 1, les points de cassures susceptibles de conduire à l'expression de protéines chimériques fonctionnelles sont recherchés (Figure 1A). A partir de ces résultats, des séquences d'ADN de 25 à 50 paires de bases sont définies, correspondant précisément aux extrémités 5' et 3' des exons des deux gènes juxtaposés après épissage des transcrits hybrides (Figure 1A). Un ensemble de sondes est ensuite défini de la façon suivante : une séquence d'amorçage (SA sur la Figure 1B) d'une vingtaine de paires de bases, est ajoutée en 5' de toutes les sondes complémentaires des exons des gènes formant la partie 5' des transcrits de fusion (S1 sur la Figure 1B). Une deuxième séquence d'amorçage (SB sur la Figure 1B), également d'une vingtaine de paires de bases mais différente de SA, est ajoutée aux extrémités 3' de toutes les sondes complémentaires des exons des gènes formant la partie 3' des transcrits de fusion (S2 sur la Figure 1B). Au moins une séquence de barcode moléculaire (SA, sur la Figure 1B) est ajoutée, par exemple en 5' de la sonde complémentaire des exons des gènes formant la partie 5' des transcrits de fusion. Ces sondes sont ensuite regroupées dans un mélange, et contiennent tous les éléments nécessaires à la détection d'un ou de plusieurs transcrits de fusion, produits par une ou plusieurs translocations. Les sondes utilisées dans l'invention sont donc capables de s'hybrider soit avec les derniers nucléotides du dernier exon en 5' de la translocation, soit avec les premiers nucléotides du premier exon en 3' de la translocation. De préférence, les sondes utilisées dans l'invention, capables de s'hybrider avec les premiers nucléotides du premier exon en 3' de la translocation, sont phosphorylées en 5' avant leur utilisation. Le même principe s'applique lorsque l'anomalie génétique est un saut d'exon. La Figure 2 représente la stratégie qui permet de détecter un saut de l'exon 14 du gène MET grâce à la présente invention. La Figure 2A montre qu'en situation normale, l'épissage des transcrits du gène MET induit des jonctions entre les exons 13 et 14, et 14 et 15. En situation pathologique, par exemple si une mutation vient détruire le site donneur d'épissage de l'exon 14, les cellules tumorales expriment un transcrit anormal, résultant de la jonction des exons 13 et 15. Un ensemble de sondes est ainsi défini de la façon suivante : une séquence d'amorçage (SA sur la Figure 2B) d'une vingtaine de paires de bases, est ajoutée en 5' de toutes les sondes complémentaires de l'exon 13 formant la partie 5' des transcrits de fusion (<semantics>S13G<annotation encoding="application / x-tex">S_{13G}< / annotation>< / semantics> sur la Figure 2B). Une deuxième séquence d'amorçage (<semantics>SB<annotation encoding="application / x-tex">S_B< / annotation>< / semantics> sur la Figure 2B), également d'une vingtaine de paires de bases mais différente de SA, est ajoutée aux extrémités 3' de toutes les sondes complémentaires de l'exon 15 formant la partie 3' des transcrits de fusion (S15D sur la Figure 2B). Au moins une séquence de barcode moléculaire (SA' sur la Figure 2B) est ajoutée, par exemple en 5' de la sonde complémentaire des exons formant la partie 5' du saut d'exon, notamment l'exon 13 du gène MET. Le même principe s'applique pour le saut des exons 2 à 7 du gène EGFR, qui est souvent dû à une délétion interne du gène au niveau de l'ADN génomique et qui entraine la perte de ces exons.

[0043] Selon l'invention, au moins une des sondes d'un couple utilisé comprend une séquence de barcode moléculaire, notamment la sonde « G ». Cela signifie que la séquence de barcode moléculaire est fusionnée à la séquence de la sonde, à l'une de ses extrémités, de préférence en 5'. Lorsqu'elle est présente, ladite séquence de barcode moléculaire est préférentiellement insérée entre la séquence d'amorçage et la sonde complémentaire des exons des gènes. Selon l'invention, un mode de réalisation préféré peut aussi comprendre une séquence d'amorçage en 5' d'une séquence de barcode moléculaire, ladite séquence de barcode étant elle-même ajoutée en 5' de la sonde complémentaire de l'exon du gène formant la partie 5' des transcrits de fusion ou du transcrit correspondant à un saut d'exon, optionnellement des déséquilibres d'expression 5'-3'. Selon l'invention un mode de réalisation alternatif peut aussi comprendre une séquence d'amorçage ajoutée à l'extrémité 3' d'une séquence de barcode moléculaire, ladite séquence de barcode étant elle-même ajoutée en 3' de la sonde complémentaire de l'exon du gène formant la partie 3' des transcrits de fusion ou du transcrit correspondant à un saut d'exon, optionnellement des déséquilibres d'expression 5'-3'. Selon l'invention, un mode de réalisation particulier peut ainsi comprendre une séquence d'amorçage en 5' d'une séquence de barcode moléculaire, ladite séquence de barcode étant elle-même ajoutée en 5' de la sonde complémentaire de l'exon du gène formant la partie 5' des transcrits de fusion ou du transcrit correspondant à un saut d'exon optionnellement des déséquilibres d'expression 5'-3', ainsi qu'une séquence d'amorçage ajoutée à l'extrémité 3' d'une séquence de barcode moléculaire, ladite séquence de barcode étant elle-même ajoutée en 3' de la sonde complémentaire de l'exon du gène formant la partie 3' des transcrits de fusion ou du transcrit correspondant à un saut d'exon, optionnellement des déséquilibres d'expression 5'-3'.

[0044] Un exemple des différentes translocations (gènes de fusion) identifiées selon la présente invention est illustré dans la Figure 4. Un exemple de sauts d'exon identifiés selon la présente invention est illustré dans la Figure 2 ou Figure 9. Un exemple de déséquilibre 5'-3' est illustré en Figure 13. L'Exemple 6 illustre également des fusions associées à des pathologies.

[0045] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, les sondes SEQ ID NO : 14 à 91 sont également utilisées pour l'étape de RT-MLPA. Dans cet aspect, chacune des sondes est également fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes comprend de préférence une séquence de barcode moléculaire. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, chacune des sondes « G » du couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0046] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant chacun une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO: 1 à 13, optionnellement les sondes SEQ ID NO: 14 à 91, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0047] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant chacun une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0048] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant chacun une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO: 1 à 13 et les sondes SEQ ID NO: 96 à 99, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0049] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant les sondes choisies parmi les sondes SEQ ID NO: 1 à 13, les sondes SEQ ID NO: 96 à 99, et les sondes SEQ ID NO: 14 à 91, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire, en particulier les sondes SEQ ID NO : 14 à 91 et optionnellement les sondes SEQ ID NO : 96 et 98.

[0050] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant les sondes choisies parmi les sondes SEQ ID NO : 866 à 938 et SEQ ID NO : 940 à 1104, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0051] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant les sondes choisies parmi les sondes SEQ ID NO : 1211 à 1312, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0052] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant les sondes choisies parmi les sondes SEQ ID NO : 1105 à 1107 et SEQ ID NO : 939, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0053] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant les sondes choisies parmi les sondes SEQ ID NO: 1108 à 1123, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0054] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant les sondes choisies parmi les sondes SEQ ID NO: 866 à 938, et / ou SEQ ID NO: 940 à 1104, et / ou les sondes SEQ ID NO: 1105 à 1107, et / ou SEQ ID NO: 939, et / ou SEQ ID NO: 1108 à 1123, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0055] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant les sondes choisies parmi les sondes SEQ ID NO: 866 à 938, SEQ ID NO: 940 à 1104, SEQ ID NO: 1105 à 1107, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO : 1108 à 1123, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0056] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant chacun les sondes choisies parmi les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, SEQ ID NO : 14 à 91, SEQ ID NO : 96 à 99, SEQ ID NO : 103 à 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 à 137, SEQ ID NO: 138 à 168, SEQ ID NO : 169 à 194, SEQ ID NO : 826 à 835, SEQ ID NO : 195 à 198, SEQ ID NO : 199 à 245, SEQ ID NO : 246 à 344, SEQ ID NO : 345 à 403, SEQ ID NO : 404 à 428, SEQ ID NO : 429 à 436, SEQ ID NO: 437 à 479, SEQ ID NO: 480 à 504, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507 à 514, SEQ ID NO: 515 à 546, SEQ ID NO: 547 à 582, SEQ ID NO: 583 à 586, SEQ ID NO: 587 à 633, SEQ ID NO: 634 à 732, SEQ ID NO: 733 à 791, SEQ ID NO: 792 à 816, SEQ ID NO: 817 à 824 et SEQ ID NO : 825, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0057] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant chacun les sondes choisies parmi les sondes SEQ ID NO: 1 à 13, SEQ ID NO: 14 à 91, SEQ ID NO: 96 à 99, SEQ ID NO: 103 à 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 à 137, SEQ ID NO: 138 à 168, SEQ ID NO: 169 à 194, SEQ ID NO: 826 à 835, SEQ ID NO: 195 à 198, SEQ ID NO: 199 à 245, SEQ ID NO: 246 à 344, SEQ ID NO: 345 à 403, SEQ ID NO: 404 à 428, SEQ ID NO: 429 à 436, SEQ ID NO: 437 à 479, SEQ ID NO: 480 à 504, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507 à 514, SEQ ID NO : 515 à 546, SEQ ID NO : 547 à 582, SEQ ID NO : 583 à 586, SEQ ID NO : 587 à 633, SEQ ID NO : 634 à 732, SEQ ID NO : 733 à 791, SEQ ID NO : 792 à 816, SEQ ID NO : 817 à 824, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 866 à 938, SEQ ID NO: 940 à 1104, SEQ ID NO: 1105 à 1107, SEQ ID NO : 939, et SEQ ID NO : 1108 à 1123, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0058] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA est réalisée à l'aide de couples de sondes comprenant chacun les sondes choisies parmi les sondes SEQ ID NO: 1 à 13, SEQ ID NO: 14 à 91, SEQ ID NO: 96 à 99, SEQ ID NO: 103 à 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 à 137, SEQ ID NO: 138 à 168, SEQ ID NO : 169 à 194, SEQ ID NO : 826 à 835, SEQ ID NO : 195 à 198, SEQ ID NO : 199 à 245, SEQ ID NO: 246 à 344, SEQ ID NO: 345 à 403, SEQ ID NO: 404 à 428, SEQ ID NO: 429 à 436, SEQ ID NO: 437 à 479, SEQ ID NO: 480 à 504, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507 à 514, SEQ ID NO: 515 à 546, SEQ ID NO: 547 à 582, SEQ ID NO: 583 à 586, SEQ ID NO: 587 à 633, SEQ ID NO: 634 à 732, SEQ ID NO: 733 à 791, SEQ ID NO: 792 à 816, SEQ ID NO: 817 à 824, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 866 à 938, SEQ ID NO: 940 à 1104, SEQ ID NO: 1105 à 1107, SEQ ID NO : 939, SEQ ID NO : 1108 à 1123, et SEQ ID NO :1211 à 1312, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire.

[0059] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer associé à la formation d'un gène de fusion est diagnostiqué à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, optionnellement les sondes SEQ ID NO : 14 à 91, et chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0060] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer associé à la formation d'un gène de fusion est diagnostiqué à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 866 à 938 et / ou SEQ ID NO: 940 à 1104, et chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO: 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0061] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer associé à la formation d'un gène de fusion est diagnostiqué à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 1211 à 1312, et chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0062] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer associé à la formation d'un gène de fusion est diagnostiqué à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et / ou SEQ ID NO : 16 14 à 91, et / ou SEQ ID NO : 866 à 938 et / ou SEQ ID NO : 940 à 1104, et chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire. De préférence, toutes les sondes de SEQ ID NO: 1 à 13, SEQ ID NO: 14 à 91, SEQ ID NO: 868 à 938, et SEQ ID NO: 940 à 1104 sont utilisées.

[0063] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer associé à la formation d'un gène de fusion est diagnostiqué à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et / ou SEQ ID NO : 14 à 91, et / ou SEQ ID NO : 866 à 938 et / ou SEQ ID NO : 940 à 1104, et / ou SEQ ID NO : 1211 à 1312, et chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire. De préférence, toutes les sondes de SEQ ID NO : 1 à 13, SEQ ID NO : 14 à 91, SEQ ID NO : 868 à 938, SEQ ID NO: 940 à 1104 et SEQ ID NO: 1211 à 1312 sont utilisées.

[0064] Alternativement, et dans un autre mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer associé à un saut d'exon est diagnostiqué à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, et chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 94 et SEQ ID NO : 95, et optionnellement au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire. Plus particulièrement selon ce mode de réalisation, le cancer est associé à un saut d'exon du gène MET, plus particulièrement un saut de l'exon 14 du gène MET.

[0065] Alternativement, et dans un autre mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer associé à un saut d'exon est diagnostiqué à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 1105 à 1107 et / ou SEQ ID NO: 939, et chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 94 et SEQ ID NO : 95, et optionnellement au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire. Plus particulièrement selon ce mode de réalisation, le cancer est associé à un saut d'exon du gène EGFR, plus particulièrement un saut des exons 2 à 7 du gène EGFR.

[0066] Alternativement, et dans un autre mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer associé à un saut d'exon est diagnostiqué à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, et / ou SEQ ID NO : 1105 à 1107 et / ou SEQ ID NO : 939, et chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 94 et SEQ ID NO : 95, et optionnellement au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire. De préférence, toutes les sondes SEQ ID NO: 96 à 99, SEQ ID NO: 1105 à 1107 et SEQ ID NO: 939 sont utilisées.

[0067] Alternativement, et dans un autre mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, le cancer associé à un déséquilibre 5'-3' est diagnostiqué à l'aide d'au moins un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 1108 à 1123 et chacune des sondes est fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 94 et SEQ ID NO : 95, et optionnellement au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire. De préférence, toutes les sondes SEQ ID NO : 1108 à 1123 sont utilisées.

[0068] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'un carcinome chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, optionnellement les sondes SEQ ID NO : 14 à 91, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0069] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'un carcinome chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 1294 à 1312, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0070] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'un carcinome chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et les sondes SEQ ID NO: 1294 à 1312, optionnellement les sondes SEQ ID NO: 14 à 91, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0071] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'un sarcome chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 866 à 938 et les sondes SEQ ID NO: 940 à 1054, optionnellement SEQ ID NO: 1148, et / ou SEQ ID NO: 1149, et / ou SEQ ID NO : 1178 et / ou SEQ ID NO : 1179, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0072] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'un sarcome chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 1228 à 1291, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0073] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'un sarcome chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 866 à 938 et les sondes SEQ ID NO: 940 à 1054, et les sondes SEQ ID NO: 1228 à 1291, optionnellement SEQ ID NO: 1148, et / ou SEQ ID NO: 1149, et / ou SEQ ID NO: 1178 et / ou SEQ ID NO: 1179, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0074] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'une tumeur ORL chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 866 à 938 et les sondes SEQ ID NO : 940 à 1054, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0075] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'une tumeur ORL chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 1211 à 1227, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0076] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'une tumeur ORL chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 866 à 938 et les sondes SEQ ID NO : 940 à 1054 et les sondes SEQ ID NO : 1211 à 1227, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0077] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'une tumeur gynécologique chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 866 à 938 et les sondes SEQ ID NO : 940 à 1054, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une 19 extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0078] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'une tumeur cérébrale chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 1040 à 1104, optionnellement les sondes de SEQ ID NO : 124-125, SEQ ID NO : 456, SEQ ID NO : 1209- 1210, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0079] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'une tumeur cérébrale chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 1292 à 1293, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 92 et SEQ ID NO : 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0800] Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne ainsi une méthode de diagnostic d'une tumeur cérébrale chez un sujet, comprenant une étape de RT-MLPA sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet avec au moins les sondes SEQ ID NO : 1040 à 1104 et les sondes SEQ ID NO: 1292 à 1293, optionnellement les sondes de SEQ ID NO: 124- 125, SEQ ID NO : 456, SEQ ID NO : 1209-1210, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, de préférence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO: 92 et SEQ ID NO: 93, et au moins une des sondes dudit couple comprend une séquence de barcode moléculaire.

[0081] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, ladite étape de RT- MLPA comprend au moins les étapes suivantes : a) extraction de l'ARN de l'échantillon biologique du sujet, b) conversion de l'ARN extrait en a) en ADNc par transcription inverse, c) incubation de l'ADNc obtenu en b) avec un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi : - les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et / ou - les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire, d) addition d'une ADN ligase dans le mélange obtenu en c), afin d'établir une liaison covalente entre deux sondes contiguës, e) amplification par PCR des sondes contiguës liées de manière covalente obtenues en d), afin d'obtenir des amplicons. 20

[0082] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, ladite étape de RT- MLPA comprend également au moins les étapes suivantes : a) extraction de l'ARN de l'échantillon biologique du sujet, b) conversion de l'ARN extrait en a) en ADNc par transcription inverse, c) incubation de l'ADNc obtenu en b) avec un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi : - les sondes SEQ ID NO : 866 à 938, et / ou SEQ ID NO : 940 à 1104, et / ou - les sondes SEQ ID NO: 1105 à 1107 et / ou SEQ ID NO: 939, et / ou les sondes SEQ ID NO : 1108 à 1123, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire, d) addition d'une ADN ligase dans le mélange obtenu en c), afin d'établir une liaison covalente entre deux sondes contiguës, e) amplification par PCR des sondes contiguës liées de manière covalente obtenues en d), afin d'obtenir des amplicons.

[0083] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, ladite étape de RT- MLPA comprend également au moins les étapes suivantes : a) extraction de l'ARN de l'échantillon biologique du sujet, b) conversion de l'ARN extrait en a) en ADNc par transcription inverse, c) incubation de l'ADNc obtenu en b) avec un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi les sondes SEQ ID NO : 1211 à 1312, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire, d) addition d'une ADN ligase dans le mélange obtenu en c), afin d'établir une liaison covalente entre deux sondes contiguës, e) amplification par PCR des sondes contiguës liées de manière covalente obtenues en d), afin d'obtenir des amplicons.

[0084] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, ladite étape de RT- MLPA comprend au moins les étapes suivantes : a) extraction de l'ARN de l'échantillon biologique du sujet, b) conversion de l'ARN extrait en a) en ADNc par transcription inverse, c) incubation de l'ADNc obtenu en b) avec un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi : - les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et / ou SEQ ID NO : 866 à 938, et / ou SEQ ID NO : 940 à 1104, et / ou les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, et / ou SEQ ID NO : 1105 à 1107 et / ou SEQ ID NO : 939, - les sondes SEQ ID NO : 1108 à 1123, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire, 21 d) addition d'une ADN ligase dans le mélange obtenu en c), afin d'établir une liaison covalente entre deux sondes contiguës, e) amplification par PCR des sondes contiguës liées de manière covalente obtenues en d), afin d'obtenir des amplicons.

[0085] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, ladite étape de RT- MLPA comprend au moins les étapes suivantes : a) extraction de l'ARN de l'échantillon biologique du sujet, b) conversion de l'ARN extrait en a) en ADNc par transcription inverse, c) incubation de l'ADNc obtenu en b) avec un couple de sondes comprenant au moins une sonde choisie parmi : - les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et / ou SEQ ID NO : 866 à 938, et / ou SEQ ID NO : 940 à 1104, et / ou SEQ ID NO : 1211 à 1312, et / ou - les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, et / ou SEQ ID NO : 1105 à 1107 et / ou SEQ ID NO : 939, - les sondes SEQ ID NO : 1108 à 1123, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire, d) addition d'une ADN ligase dans le mélange obtenu en c), afin d'établir une liaison covalente entre deux sondes contiguës, e) amplification par PCR des sondes contiguës liées de manière covalente obtenues en d), afin d'obtenir des amplicons.

[0086] Typiquement, l'extraction d'ARN de l'échantillon biologique selon l'étape a) s'effectue selon les techniques classiques, bien connues de l'homme du métier. Par exemple, cette extraction peut être effectuée par lyse cellulaire des cellules issues de l'échantillon biologique. Cette lyse peut être de nature chimique, physique ou thermique. Cette lyse cellulaire est généralement suivie d'une étape de purification permettant de séparer et concentrer les acides nucléiques d'autres débris cellulaires. Pour la mise en œuvre de l'étape a), les kits commerciaux de type QIAGEN et Zymo Research, ou encore ceux commercialisés par Invitrogen, peuvent être utilisés. Bien entendu, les techniques pertinentes diffèrent en fonction de la nature de l'échantillon biologique testé. Les connaissances de l'homme du métier lui permettent aisément d'adapter ces étapes de lyse et de purification audit échantillon biologique testé.

[0087] De préférence, l'ARN extrait à l'étape a) est alors converti par transcription inverse en ADNc ; c'est l'étape b) (voir Figure 1B). Cette étape b) peut être effectuée à l'aide de toute technique de transcription inverse connue de l'art antérieur. Elle peut notamment se faire à l'aide de la transcriptase inverse commercialisée par Qiagen, Promega ou Ambion, selon les conditions classiques d'utilisation, ou encore à l'aide de M-MLV Reverse Transcriptase de chez Invitrogen.

[8800] De préférence, l'ADNc obtenu à l'étape b) est ensuite incubé avec au moins les sondes SEQ ID NO: 1 à 13 et / ou SEQ ID NO: 96 à 99, préférentiellement également les sondes SEQ ID NO : 14 à 91, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire, de préférence les sondes de SEQ ID NO : 14 à 91 et optionnellement les sondes de SEQ ID NO: 96 et 98. C'est l'étape c) d'hybridation des sondes (voir Figure 1B). En effet, les sondes qui sont complémentaires d'une portion d'ADNc vont venir s'hybrider avec cette portion si celle-ci est présente dans l'ADNc. Comme cela est montré dans la Figure 1B, en raison de leur séquence, les sondes vont donc s'hybrider : - soit avec la portion d'ADNc correspondant aux derniers nucléotides du dernier exon en 5' de la translocation. Il s'agit alors de sondes appelées aussi « G » ou « Gauche » ; - soit avec la portion d'ADNc correspondant aux premiers nucléotides du premier exon en 3' de la translocation. Il s'agit alors de sondes appelées aussi « D » ou « Droite ».

[0089] De préférence, l'ADNc obtenu à l'étape b) est ensuite incubé avec au moins les sondes SEQ ID NO: 866 à 938 et / ou SEQ ID NO: 940 à 1104 et / ou SEQ ID NO: 1105 à 1107 et / ou SEQ ID NO : 939 et / ou SEQ ID NO : 1108 à 1123, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire. C'est l'étape c) d'hybridation des sondes (voir Figure 1B). En effet, les sondes qui sont complémentaires d'une portion d'ADNc vont venir s'hybrider avec cette portion si celle-ci est présente dans l'ADNc. Comme cela est montré dans la Figure 1B, en raison de leur séquence, les sondes vont donc s'hybrider : - soit avec la portion d'ADNc correspondant aux derniers nucléotides du dernier exon en 5' de la translocation. Il s'agit alors de sondes « G » ou « Gauche » ; - soit avec la portion d'ADNc correspondant aux premiers nucléotides du premier exon en 3' de la translocation. Il s'agit alors de sondes aussi « D » ou « Droite ».

[0090] De préférence, l'ADNc obtenu à l'étape b) est ensuite incubé avec au moins les sondes SEQ ID NO : 1211 à 1312, chacune des sondes étant fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant une séquence de barcode moléculaire. C'est l'étape c) d'hybridation des sondes (voir Figure 1B). En effet, les sondes qui sont complémentaires d'une portion d'ADNc vont venir s'hybrider avec cette portion si celle-ci est présente dans l'ADNc. Comme cela est montré dans la Figure 1B, en raison de leur séquence, les sondes vont donc s'hybrider : - soit avec la portion d'ADNc correspondant aux derniers nucléotides du dernier exon en 5' de la translocation. Il s'agit alors de sondes « G » ou « Gauche » ; - soit avec la portion d'ADNc correspondant aux premiers nucléotides du premier exon en 3' de la translocation. Il s'agit alors de sondes aussi « D » ou « Droite ».

[0091] De préférence, les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, 97 et 99 sont des sondes « D » et les sondes SEQ ID NO: 96 et 98 sont des sondes « G », de même que les sondes SEQ ID NO: 14 à 91.

[0092] De préférence, les sondes SEQ ID NO: 870-873, 877-878, 882, 889-892, 894-895, 901- 902, 912-914, 920-921, 924-926, 930, 937, 939, 943, 946, 950-968, 970-971, 973-983, 988, 991- 994, 997-998, 1000, 1002-1004, 1007, 1009-1010, 1017, 1021, 1022, 1035-1040, 1042-1043, 1048-1054, 1056-1059, 1063, 1065, 1067-1068, 1070, 1079-1081, 1088-1089, 1092, 1094, 1096, 1099-1102, 1104, 1106, 1109, 1111, 1113, 1115, 1117, 1119, 1121, 1123 sont des sondes « D » et les sondes SEQ ID NO: 866-869, 874-876, 879-881, 883-888, 893, 896-900, 903-911, 915-919, 922-923, 927-929, 931-936, 938, 940-942, 944-945, 947-949, 969, 972, 984-987, 989-990, 995- 996, 999, 1001, 1005-1006, 1008, 1011-1016, 1018-1020, 1023-1034, 1041, 1044-1047, 1055, 1060-1062, 1064, 1066, 1069, 1071-1078, 1082-1087, 1090-1091, 1093, 1095, 1097-1098, 1103, 1105, 1107-1108, 1110, 1112, 1114, 1116, 1118,1120, 1122 sont des sondes « G ».

[0093] De préférence, les sondes SEQ ID NO : 1211, 1214, 1215, 1216, 1217, 1222, 1224, 1227, 1230, 1235, 1237, 1239, 1242, 1245, 1248-1249, 1251, 1253, 1260-1265, 1269-1270, 1272, 1273, 1278, 1280, 1282, 1284-1288, 1290, 1295, 1299, 1303-1305, 1310-1312 sont des sondes « D » et les sondes SEQ ID NO: 1212, 1213, 1218-1221, 1223, 1225-1226, 1228-1229, 1231-1234, 1236, 1238, 1240-1241, 1243-1244, 1246-1247, 1250, 1252, 1254-1259, 1266-1268, 1271, 1274-1277, 127, 1281, 1283, 128, 1291-1294, 1296-1298, 1300-1302, 1306-1309 sont des sondes « G ».

[0094] A la fin de l'étape c), les sondes hybridées à l'ADNc sont contiguës, si et seulement si la translocation (gène de fusion) ou le saut d'exon a eu lieu. Cette étape c) est typiquement réalisée en incubant l'ADNc et le mélange de sondes à une température comprise entre 90°C et 100°C afin dénaturer les structures secondaires des acides nucléiques, pendant une durée de 1 à 5 minutes, puis en laissant incuber pendant une durée d'au moins 30 minutes, de préférence 1h, à une température d'environ 60°C pour permettre l'hybridation des sondes. Elle peut être réalisée à l'aide du kit commercial, vendu par la société MRC-Holland (SALSA MLPA Buffer) ou à l'aide d'un tampon commercialisé par la société NEB (Buffer U).

[0095] A la fin de l'étape c), une ADN ligase est typiquement ajoutée pour lier de manière covalente uniquement les sondes contiguës ; c'est l'étape d) (voir Figures 1B et 2B). L'ADN ligase est notamment la ligase 65, vendue par MRC-Holland, Amsterdam, Netherlands (SALSA Ligase- 65) ou les ligases thermostables (Hifi Taq DNA Ligase ou Taq DNA ligase) commercialisées par la société NEB. Elle est typiquement réalisée à une température comprise entre 50°C et 60°C, pendant une durée de 10 à 20 minutes, puis pendant une durée de 2 à 10 minutes à une température comprise entre 95°C et 100°C.

[0096] A la fin de l'étape d), chaque couple de sondes contiguës G et D est lié de manière covalente, et la séquence d'amorçage de chaque sonde est toujours présente en 5' et en 3', de même que la séquence de barcode moléculaire.

[0097] De préférence, la méthode comprend également une étape e) d'amplification par PCR des sondes contiguës liées de manière covalente obtenues en d) (voir Figures 1B et 2B). Cette étape de PCR se fait à l'aide d'un couple d'amorces, l'une des amorces étant identique à la séquence d'amorçage en 5', l'autre amorce étant complémentaire de la séquence d'amorçage en 3'. De préférence, l'amplification par PCR de l'étape e) se fait à l'aide du couple d'amorces SEQ ID NO : 101 et 92 pour détecter les gènes de fusion ou du couple d'amorces SEQ ID NO : 102 et 94 pour détecter les sauts d'exon des gènes MET et EGFR. 24

[0098] La PCR est typiquement réalisée à l'aide de kits commerciaux, tels que les kits prêts à l'emploi vendus par Eurogentec (Red'y'Star Mix) ou NEB (Q5 High fidelity DNA polymerase). Typiquement, la PCR se déroule en une première phase de dénaturation initiale à une température comprise entre 90°C et 100°C, typiquement d'environ 94°C, pendant un temps de 5 à 8 minutes ; puis une seconde phase d'amplification comprenant plusieurs cycles, typiquement 35 cycles, chaque cycle comprenant 30 secondes à 94°C, puis 30 secondes à 58°C, puis 30 secondes à 72°C; et une dernière phase de retour à 72°C pendant 4 minutes environ. A la fin de la PCR, les amplicons sont conservés de préférence à -20°C. Selon l'invention, les amplicons correspondent aux transcrits de fusion ou au transcrits correspondant à un saut d'exon présent dans l'échantillon du patient / sujet à tester, ou éventuellement à un déséquilibre 5'-3'.

[0099] Selon l'invention, dans un mode de réalisation particulier, et lorsqu'elle est présente, la séquence index est notamment introduite, au cours de l'étape de PCR à l'extrémité 3' d'une séquence d'amorçage, notamment la séquence d'amorçage « R (ou D) ».

[0100] Selon l'invention, dans un mode de réalisation particulier, une première séquence d'extension peut être introduite en 5' d'une séquence d'amorçage, et une deuxième séquence d'extension peut être introduite en 3' de la séquence index.

[0101] Selon l'invention, dans un mode de réalisation particulier, chaque couple de sondes utilisé dans l'étape de PCR comprend une séquence index différente qui permet d'identifier les patients. La PCR est typiquement réalisée à l'aide de kits commerciaux, tels que les kits prêts à l'emploi vendus par Eurogentec (Red'y'Star Mix) ou NEB (Q5 High fidelity DNA polymerase). Typiquement, la PCR se déroule en une première phase de dénaturation initiale à une température comprise entre 90°C et 100°C, typiquement d'environ 94°C, pendant un temps de 5 à 8 minutes ; puis une seconde phase d'amplification comprenant plusieurs cycles, typiquement 35 cycles, chaque cycle comprenant 30 secondes à 94°C, puis 30 secondes à 58°C, puis 30 secondes à 72°C; et une dernière phase de retour à 72°C pendant 4 minutes environ. A la fin de la PCR, les amplicons sont conservés de préférence à -20°C.

[0102] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA comprend également une étape f) d'analyse des résultats de la PCR de l'étape e), de préférence par séquençage. Selon l'invention, l'étape de séquençage est de préférence une étape de séquençage capillaire ou de séquençage de nouvelle génération. A cette fin, il est possible d'utiliser un séquenceur capillaire (par exemple de type ABI3130 Genetic Analyser, Thermo Fisher) ou un séquenceur de nouvelle génération (par exemple MiSeq System, Illumina, ou ion S5 System, Thermo Fisher). Plusieurs séquences sont analysées simultanément, la séquence index permet ainsi d'associer l'anomalie génétique éventuellement identifiée à un sujet testé.

[0103] Cette étape d'analyse permet une lecture immédiate du résultat, et indique directement si l'échantillon du sujet est porteur d'une translocation spécifique identifiée ou non et / ou d'un saut d'exon tel que le saut de l'exon 14 du gène MET ou les sauts d'exons du gène EGFR, ou éventuellement d'un déséquilibre 5'-3'.

[0104] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'étape de RT- MLPA comprend également une étape g) de détermination du niveau d'expression des amplicons obtenus à la fin de l'étape de PCR. La détermination du niveau d'expression des amplicons permet notamment de s'assurer que les ligations obtenues sont bien représentatives d'un transcrit de fusion ou d'un transcrit correspondant à un saut d'exon, et ne correspondent pas à un artefact de ligation. Selon l'invention, cette étape g) est notamment mise en œuvre par ordinateur. Cette détermination du niveau d'expression est mise en œuvre par les étapes suivantes : (1) démultiplexage des résultats obtenus à l'issue de l'étape de PCR (i.e. l'étape e)) afin d'isoler les séquences obtenues pour un sujet donné grâce aux séquences index, (2) détermination du nombre de fragments d'ADN ou d'ARN présents dans l'échantillon du patient à tester (avant amplification) grâce aux barcodes moléculaires, et optionnellement (3) fourniture d'une matrice d'expression pour chaque transcrit de fusion ou transcrit correspondant à un saut d'exon ou à un déséquilibre 5'-3' identifié pour le sujet testé. Cette détermination du niveau d'expression des amplicons obtenus à la fin d'une étape de PCR permet d'apporter plus de précision aux résultats de l'étape de PCR, et notamment aux erreurs de séquençage pouvant survenir (cf l'étape f) indiquée ci-dessus). In fine la détermination du niveau d'expression des amplicons obtenus à la fin d'une étape de PCR permet d'apporter plus de précision au diagnostic du cancer selon la présente invention.

[0105] Selon un mode de réalisation encore plus particulier, l'étape g) est une étape d'analyse des amplicons obtenus à la fin de l'étape de PCR qui est mise en œuvre par ordinateur, notamment par une composition d'algorithmes bioinformatiques. Plus particulièrement, cette étape g) comprend les étapes suivantes : (1) une étape de démultiplexage basée sur l'identification des index, (2) une étape d'identification des couples de sondes, (3) une étape de comptage des lectures (résultats) et des séquences de barcode moléculaire (Barcodes : séquence UMI, Unique Molecular Index), et optionnellement (4) une étape d'évaluation de la qualité de séquençage de l'échantillon. Les séquences telles qu'analysées par le logiciel sont représentées en Figure 7.

[0106] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, si, pour un échantillon biologique d'un sujet, une amplification par PCR est obtenue à l'étape e) suite à l'hybridation avec un couple de sondes ciblant les gènes de fusion et / ou les sauts d'exon, alors le sujet est porteur du cancer lié à l'anomalie génétique correspondant au couple de sondes identifiées. De préférence, cette anomalie est typiquement analysée dans l'étape f) et / ou g) telle que mentionnée ci-dessus.

[0107] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, l'amplification par PCR de l'étape e) se fait à l'aide du couple d'amorces SEQ ID NO : 101 et 92 ou SEQ ID NO : 102 et 94.

[0108] Dans un mode de réalisation préféré de la méthode selon l'invention, un cancer est ainsi identifié et permet au patient (c'est-à-dire le sujet à qui appartient l'échantillon biologique testé) de bénéficier d'une thérapie ciblée. Selon l'invention, la « thérapie ciblée » s'entend de toute thérapie 26 anticancéreuse, telle que la chimiothérapie, la radiothérapie ou l'immunothérapie, mais de préférence s'entend des inhibiteurs pharmacologiques des protéines ALK, ROS, RET, EGFR et MET.

[0109] L'invention concerne également un kit comprenant au moins les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et / ou les sondes SEQ ID NO : 96 à 99, de préférence comprenant en outre les sondes SEQ ID NO : 14 à 91, chacune des sondes étant de préférence fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire, notamment les sondes SEQ ID NO: 14 à 91 et optionnellement SEQS ID NO: 96 et 98.

[0110] L'invention concerne également un kit comprenant au moins les sondes SEQ ID NO : 868 à 938 et / ou les sondes SEQ ID NO : 940 à 1104 et / ou les sondes SEQ ID NO : 1105 à 1107 et / ou la sonde SEQ ID NO : 939 et / ou les sondes SEQ ID NO : 1108 à 1123, chacune des sondes étant de préférence fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire.

[0111] L'invention concerne également un kit comprenant au moins les sondes SEQ ID NO : 1211 à 1312, chacune des sondes étant de préférence fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire.

[0112] L'invention concerne également un kit comprenant au moins les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et / ou les sondes SEQ ID NO: 96 à 99 et / ou les sondes SEQ ID NO: 866 à 938 et / ou les sondes SEQ ID NO : 940 à 1104 et / ou les sondes SEQ ID NO : 1105 à 1107 et / ou la sonde SEQ ID NO: 939 et / ou les sondes SEQ ID NO: 1108 à 1123, chacune des sondes étant de préférence fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire.

[0113] L'invention concerne également un kit comprenant au moins les sondes SEQ ID NO : 1 à 13, et / ou les sondes SEQ ID NO: 96 à 99 et / ou les sondes SEQ ID NO: 866 à 938 et / ou les sondes SEQ ID NO: 940 à 1104 et / ou les sondes SEQ ID NO: 1105 à 1107 et / ou la sonde SEQ ID NO: 939 et / ou les sondes SEQ ID NO: 1108 à 1123, et / ou les sondes SEQ ID NO: 1211 à 1312, optionnellement les sondes SEQ ID NO : 1148, 1149, 1178, 1179, 1209 et / ou 1210, chacune des sondes étant de préférence fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire.

[0114] L'invention concerne également un kit comprenant au moins les sondes suivantes : SEQ ID NO : 1 à 13, SEQ ID NO : 14 à 91, SEQ ID NO : 96 à 99, SEQ ID NO : 103 à 127, SEQ ID NO : 128, SEQ ID NO : 129, SEQ ID NO : 130 à 137, SEQ ID NO : 138 à 168, SEQ ID NO : 169 à 194, SEQ ID NO: 826 à 835, SEQ ID NO: 195 à 198, SEQ ID NO: 199 à 245, SEQ ID NO: 246 à 344, SEQ ID NO: 345 à 403, SEQ ID NO: 404 à 428, SEQ ID NO: 429 à 436, SEQ ID NO: 437 à 479, SEQ ID NO: 480 à 504, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507 à 514, SEQ ID NO: 515 à 546, SEQ ID NO: 547 à 582, SEQ ID NO: 583 à 586, SEQ ID NO: 587 à 633, SEQ ID NO: 634 à 732, SEQ ID NO: 733 à 791, SEQ ID NO: 792 à 816, SEQ ID NO: 817 à 824 et SEQ ID NO : 825, chacune des sondes étant de préférence fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire.

[0115] L'invention concerne également un kit comprenant au moins les sondes suivantes : SEQ ID NO: 1 à 13, SEQ ID NO: 14 à 91, SEQ ID NO: 96 à 99, SEQ ID NO: 103 à 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO : 129, SEQ ID NO : 130 à 137, SEQ ID NO : 138 à 168, SEQ ID NO : 169 à 194, SEQ ID NO: 826 à 835, SEQ ID NO: 195 à 198, SEQ ID NO: 199 à 245, SEQ ID NO: 246 à 344, SEQ ID NO: 345 à 403, SEQ ID NO: 404 à 428, SEQ ID NO: 429 à 436, SEQ ID NO: 437 à 479, SEQ ID NO: 480 à 504, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507 à 514, SEQ ID NO: 515 à 546, SEQ ID NO: 547 à 582, SEQ ID NO: 583 à 586, SEQ ID NO: 587 à 633, SEQ ID NO : 634 à 732, SEQ ID NO : 733 à 791, SEQ ID NO : 792 à 816, SEQ ID NO : 817 à 824, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 866 à 938, SEQ ID NO: 940 à 1104, SEQ ID NO: 1105 à 1107, SEQ ID NO: 939 et SEQ ID NO: 1108 à 1123, chacune des sondes étant de préférence fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire.

[0116] L'invention concerne également un kit comprenant au moins les sondes suivantes : SEQ ID NO : 1 à 13, SEQ ID NO : 14 à 91, SEQ ID NO : 96 à 99, SEQ ID NO : 103 à 127, SEQ ID NO : 128, SEQ ID NO : 129, SEQ ID NO : 130 à 137, SEQ ID NO : 138 à 168, SEQ ID NO : 169 à 194, SEQ ID NO: 826 à 835, SEQ ID NO: 195 à 198, SEQ ID NO: 199 à 245, SEQ ID NO: 246 à 344, SEQ ID NO: 345 à 403, SEQ ID NO: 404 à 428, SEQ ID NO: 429 à 436, SEQ ID NO: 437 à 479, SEQ ID NO: 480 à 504, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507 à 514, SEQ ID NO: 515 à 546, SEQ ID NO: 547 à 582, SEQ ID NO: 583 à 586, SEQ ID NO: 587 à 633, SEQ ID NO: 634 à 732, SEQ ID NO: 733 à 791, SEQ ID NO: 792 à 816, SEQ ID NO: 817 à 824, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 866 à 938, SEQ ID NO: 940 à 1104, SEQ ID NO: 1105 à 1107, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 1108 à 1123, et SEQ ID NO: 1211 à 1312, optionnellement les sondes SEQ ID NO : 1148, 1149, 1178, 1179, 1209 et / ou 1210, chacune des sondes étant de préférence fusionnée, à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage, et au moins une des sondes dudit couple comprenant de préférence une séquence de barcode moléculaire.

[0117] La détermination du niveau d'expression des amplicons obtenus à la fin d'une étape de PCR (par exemple celle réalisée selon l'étape e) ci-dessus) est très avantageuse car elle permet de s'assurer que les résultats obtenus sont fiables. Elle permet notamment de déterminer le nombre de molécules d'ARN (notamment les transcrits de fusion ou les transcrits correspondant à un saut d'exon ou les transcrits des gènes dont on veut analyser le déséquilibre 5'-3') présents dans l'échantillon à tester. Ceci confère plus de précision au diagnostic effectué. 28

[0118] Dans cet aspect, l'invention concerne ainsi une méthode de détermination du niveau d'expression des amplicons obtenus à la fin d'une étape de PCR, ladite méthode étant mise en œuvre par ordinateur et comprenant les étapes suivantes : (a) la fourniture d'un échantillon à tester, ledit échantillon comprenant des amplicons obtenus à l'issue d'une étape de PCR, et (b) la détermination du niveau d'expression des amplicons.

[0119] Dans un mode de réalisation particulier de la méthode mise en œuvre par ordinateur selon l'invention, la détermination du niveau d'expression des amplicons vise notamment à : (1) démultiplexer les résultats d'amplicons obtenus à l'issue d'une étape de PCR, (2) déterminer le nombre de fragments d'ADN ou d'ARN présents dans l'échantillon du patient à tester (avant amplification), et optionnellement (3) fournir une matrice d'expression pour chaque transcrit de fusion ou transcrit correspondant à un saut d'exon identifié pour le patient testé.

[0120] Cette détermination du niveau d'expression des amplicons obtenus à la fin d'une étape de PCR permet d'apporter plus de précision aux résultats. L'analyse des amplicons et leur quantification peuvent en outre être réalisées très rapidement.

[0121] Dans un mode de réalisation particulier, la méthode mise en œuvre par ordinateur comprend les étapes suivantes : (1) une étape de démultiplexage des résultats d'amplicons obtenus à l'issue d'une étape de PCR, (2) une étape de recherche des couples de sondes utilisés pendant l'étape de PCR, (3) une étape de comptage des lectures (résultats, i.e. transcrits de fusion ou sauts d'exon) et des séquences de barcode moléculaire (séquence UMI, Unique Molecular Index), éventuellement de la séquence index, et optionnellement (4) une étape d'évaluation de la qualité de séquençage de l'échantillon.

[0122] Le logiciel selon l'invention requiert 3 fichiers pour son exécution : un FASTQ, un fichier d'index et un fichier de marqueurs.

[0123] FASTQ: Lors d'une expérimentation de séquençage, les données brutes sont générées sous la forme d'un fichier standard appelé FASTQ. Ce format FASTQ va rassembler pour chaque lecture séquencée par l'appareil avec : (1) un identifiant unique de séquence, (2) la séquence de la lecture, (3) le sens de lecture, (4) une séquence ASCII rassemblant les scores de qualité par base de chaque base lue. Un exemple de lecture au format FASTQ est représenté en Figure 8. Un fichier FASTQ est donc composé de cette répétition de 4 lignes, pour chaque lecture séquencée. Une expérimentation de séquençage haut-débit génère plusieurs centaines de millions de séquences. Le fichier FASTQ est le fichier brut nécessaire pour le lancement du logiciel selon l'invention.

[0124] Fichier de marqueurs : Ce fichier rassemble l'ensemble des séquences de chaque sonde ainsi que leur nom. Il regroupe l'ensemble des couples de sondes utilisés lors d'un diagnostic. Il est propre à chaque kit (mesure d'expression, recherche de transcrits de fusion, de saut d'exon, de déséquilibre ...). 29

[0125] Fichier d'index : Ce fichier rassemble la liste des séquences permet d'identifier les sujets testés. Il regroupe l'ensemble des séquences index utilisé lors d'un diagnostic. Chaque séquence va correspondre à un sujet testé et va permettre la réattribution des lectures séquencées. Ce fichier est propre à chaque expérimentation.

[0126] Selon l'invention, le terme « étape de démultiplexage » signifie l'étape qui vise à identifier les différentes séquences index utilisées lors de la construction de la librairie pour identifier les lectures de chacun des sujets testés. Cette recherche est effectuée par un algorithme de comparaison de séquences exacte et inexacte permettant de prendre en compte les erreurs de séquençage liées à la méthode d'acquisition par séquençage haut-débit. Selon l'invention, une « librairie » s'entend de la construction comprenant au moins une séquence index, une sonde gauche et une sonde droite caractéristiques d'une anomalie génétique, et éventuellement une séquence de barcode moléculaire.

[0127] Selon l'invention, le terme « étape de recherche des couples de sondes » signifie l'étape qui vise à identifier, pour chaque séquence du fichier FASTQ, s'il existe un couple de sondes dans le fichier des marqueurs permettant son attribution à une entité que l'on souhaitait mesurer (transcrits de fusion, saut d'exon...). Une structure de données dans l'algorithme permet d'associer à chaque séquence une étiquette portant le nom des deux sondes gauche (« G ») et droite (« D »). Cette recherche est conduite de manière exacte par comparaison de séquences (e.g. le calcul de distance de Hamming et de Levenshtein) et par une méthode approchée permettant de tolérer 'k' erreurs. Ce paramètre 'k' peut être modifié lors du lancement de l'outil. Pour la mesure d'expression, chaque couple de sondes (droite et gauche) est spécifique d'une entité dont on souhaite mesurer l'expression. Pour mesurer l'expression d'un gène, deux sondes venant s'hybrider strictement l'une derrière l'autre sur ce gène sont utilisées. Ces sondes seront ensuite assemblées lors de l'étape de ligation puis amplifiées et lues. Les séquences n'ayant aucune étiquette logique lors de la recherche des sondes sont stockées afin de procéder à une recherche de chimères. En effet, il est possible que certaines sondes croisent lors des étapes d'hybridation, de ligation et d'amplification lors de la construction de la librairie conduisant à l'apparition de séquences hybrides (par exemple une sonde droite d'un gène A avec une sonde gauche d'un gène B). Ces séquences sont là encore détectées par comparaison exacte et inexacte de séquences. Pour la recherche de transcrits de fusion, on ne sait pas quelles sondes vont s'hybrider ensemble et être amplifiées. La recherche des sondes est donc effectuée sans a priori par comparaison de tous les couples de séquences droite / gauche possibles.

[0128] Selon l'invention, le terme « une étape de comptage des lectures (résultats) et des séquences de barcode moléculaire » signifie l'étape se produisant lorsque le fichier FASTQ est parcouru et les couples de sondes identifiés (marqueurs et chimères). L'algorithme va procéder à leur comptage. Ces comptages sont de deux natures : (1) la quantification du nombre de séquences lues par le séquenceur d'une part, et (2) le nombre de séquence de barcode moléculaire unique (UMI) attribué au marqueur d'autre part. Le comptage des séquences est réalisé à partir de la structure de données précédemment décrites lors de l'identification des marqueurs. Le nombre d'étiquettes attribuées pour chaque marqueur sera déterminé par parcourt de la structure de données. Le comptage des UMI est plus complexe. Il passe par une étape d'extraction de l'UMI de chaque séquence et par une étape de correction des erreurs de séquençage dans les UMI. La combinatoire importante de ces séquences aléatoires, leur comptage et le facteur d'amplification de l'échantillon vont permettre d'identifier les UMI porteurs d'erreurs de séquençage pour corriger les données de comptage. Cette correction des UMI passe par la création d'une structure de graphe associant un compteur à chaque UMI unique. Les UMI sont ensuite regroupés par comptage croissant à k erreurs tolérées. Les UMI permettent d'identifier le nombre de séquences uniques lues par le séquenceur avant l'étape d'amplification lors de la préparation de la librairie. Ils renseignent donc sur le nombre de transcrits lus réellement et non sur le nombre de transcrits lus après amplification.

[0129] Selon l'invention, le terme « une étape d'évaluation de la qualité de séquençage de l'échantillon » signifie l'étape qui vise à déterminer les séquences analysées qui ne sont pas significatives. Un score de qualité témoignant de la diversité des librairies, c'est à dire le nombre de transcrits uniques lus, a été implémenté dans l'algorithme de sorte à témoigner de la richesse de l'échantillon analysé et à éliminer des échantillons qui seraient considérés en échec (c'est-à-dire ayant un score < 5000).

[0130] Préférentiellement, la méthode mise en œuvre par ordinateur selon l'invention permet de calculer le niveau d'expression d'un grand nombre de transcrits de fusion ou transcrits correspondant à un saut d'exon (notamment supérieur à 1000) pour un grand nombre d'échantillons (notamment supérieur à 40), et ce dans un temps très court (notamment de 5 à 10 minutes).

[0131] Selon un mode de réalisation particulier, la méthode mise en œuvre par ordinateur peut permettre de corriger des erreurs de séquençage qui surviennent lors du séquençage des amplicons, par exemple la correction des erreurs de séquençage dans les séquences de barcode moléculaire (UMI) (voir par exemple 'Method called Directional & Reference : Smith, T., Heger, A., & Sudbery, I. (2017). UMI-tools: modeling sequencing errors in Unique Molecular Identifiers to improve quantification accuracy. Genome Research, 27(3), 491–499. http: / / doi.org / 10.1101 / gr.209601.116))

[0132] Les Tableaux 1 et 2 ci-dessous apportent des précisions quant aux séquences de l'invention.

[0133] [Tableau 1] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document]

[0134] Description des séquences 1 à 102 et 866 à 1123 et 1209 à 1312 selon l'invention

[0135] [Tableau 2] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document]

[0136] Correspondance entre les séquences 103 à 835 et les séquences décrites dans la demande internationale PCT / FR2014 / 052255. L'information G / D des séquences 103 à 835 est indiquée sur les Figures 4-5, 7 à 9 de la demande internationale PCT / FR2014 / 052255). Brève description des Figures

[0137] D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des Figures annexées. Fig. 1

[0138] [Fig. 1] représente le schéma d'une translocation chromosomique conduisant à l'expression d'un transcrit de fusion, détectable par la présente invention. La Figure 1A (haut) représente l'obtention d'un ARNm de fusion à la suite d'une translocation chromosomique entre le gène A et le gène B. La Figure 1B (bas) représente l'étape de transcription inverse de cet ARNm de fusion, pour obtenir un ADNc. Ensuite, il y a une étape d'incubation avec les sondes et hybridation de celles-ci avec les portions complémentaires d'ADNc. La sonde S1 est constituée d'une séquence complémentaire des derniers nucléotides de l'exon 2 du gène A d'ADNc, et la sonde S2 est constituée d'une séquence complémentaire des premiers nucléotides de l'exon 2 du gène B d'ADNc. La sonde S1 est fusionnée en 5' avec une séquence de barcode SA' ainsi qu'à une séquence d'amorçage SA. La sonde S2 est fusionnée en 3' avec une séquence d'amorçage SB. De par la contiguïté entre les exons 2 du gène A et du gène B, les sondes S1 et S2 se retrouvent côte à côte. Il y a ensuite une étape de ligation par une ADN ligase. Les sondes côte à côte se retrouvent alors liées. S1 et S2 forment ainsi une séquence continue, avec SA et SB. Une PCR est ensuite réalisée. A l'aide d'amorces adéquates, les sondes liées sont amplifiées. En l'occurrence, les amorces utilisées sont la séquence SA, et la séquence complémentaire de SB (appelée B'). Les résultats obtenus sont ensuite analysés par séquençage. Fig. 2 39

[0139] [Fig. 2] représente le schéma d'un saut d'exon conduisant à l'expression d'un transcrit correspondant à un saut d'exon, détectable par la présente invention. La Figure 2A (haut) représente l'ADNc obtenu après transcription inverse dans le cas d'un épissage normal et la Figure 2A (bas) représente l'ADNc obtenu après transcription inverse dans le cas d'une anomalie d'épissage. La Figure 2B (haut) montre qu'en absence de mutation (cas normal), après hybridation des sondes, les séquences obtenues sont les suivantes : S13G-S14D et S14G-S15D. La Figure 2B (bas) montre qu'en présence d'une mutation (cas anormal d'un saut d'exon), après hybridation des sondes, la séquence obtenue est la suivante : S13G-S15D. Fig. 3

[0140] [Fig. 3] représente un exemple de construction de sondes selon la présente invention. La Figure 3A représente l'hybridation des sondes après formation d'un gène de fusion. Le numéro 1 représente la première séquence d'amorçage ; le numéro 2 représente la séquence de barcode moléculaire ; le numéro 3 représente la première sonde qui s'hybride du côté gauche de la fusion ; le numéro 4 représente la deuxième sonde qui s'hybride du côté droit de la fusion ; le numéro 5 représente la deuxième séquence d'amorçage. Les sondes 3 et 4 représentent un exemple d'un couple de sondes selon la présente invention. Chaque sonde consiste en une séquence spécifique capable de s'hybrider à l'extrémité d'un exon et possède une séquence d'amorçage à son extrémité. Ici, un barcode moléculaire de 7 bases aléatoire est ajouté entre la séquence d'amorçage et la séquence spécifique de la sonde de gauche. La Figure 3B représente un transcrit de fusion avant analyse avec un séquenceur de nouvelle génération de type Illumina®. Lorsqu'un transcrit de fusion est détecté, deux sondes s'hybrident côte à côte, permettant leur ligation. Le produit de ligation peut ensuite être amplifié par PCR à l'aide d'amorces correspondant aux séquences d'amorçage. Sur la Figure 3B, ces amorces portent elles-mêmes des extensions (P5 et P7) qui permettent l'analyse des produits de PCR sur un séquenceur de nouvelle génération de type Illumina. Fig. 4

[0141] [Fig. 4] représente les translocations identifiées à l'aide de la présente invention. Les nouveaux réarrangements spécifiquement mis en évidence grâce aux sondes de la présente invention sont indiqués en trait foncé. Les réarrangements déjà connus, notamment décrits dans la demande internationale PCT / FR2014 / 052255, sont indiqués en trait clair. Chaque trait représente une jonction génique anormale possiblement présente dans une tumeur, entre les gènes listés à la gauche de la figure et ceux listés à la droite. Le mix ici représenté permet de rechercher simultanément plus de 50 réarrangements différents récurrents dans les carcinomes. De plus, du fait de l'utilisation de plusieurs sondes pour certains gènes ciblant des exons différents, des recombinaisons capables de conduire à l'expression de plusieurs centaines de transcrits distincts sont détectables. Fig. 5 40

[0142] [Fig. 5] représente le nombre de molécule d'ARN de fusion présents dans l'échantillon de départ testé selon l'exemple 1. Ce graphique montre que 729 molécules d'ARN de fusion étaient présentes dans l'échantillon de départ, et que ce résultat a été amplifié par un facteur 135.8 lors de l'étape de PCR. 98993 séquences avaient ainsi été obtenues à l'issue de l'étape de PCR. Fig. 6

[0143] [Fig. 6] représente une des stratégies qui permet de détecter un saut de l'exon 14 du gène MET grâce à la présente invention. Sur la Figure 6A, les sondes choisies s'hybrident aux extrémités des exons 13, 14 et 15 de ce gène. En situation normale, l'épissage des transcrits de ce gène induit des jonctions entre les exons 13 et 14, et 14 et 15. En situation pathologique, par exemple si une mutation vient détruire le site donneur d'épissage de l'exon 14, les cellules tumorales expriment un transcrit anormal, résultant de la jonction des exons 13 et 15. Les différents produits d'amplification obtenus grâce à la présente invention sont visualisés en Figure 6B sur un séquenceur capillaire, après amplification à l'aide d'un couple d'amorce dont l'une est marquée par un fluorochrome. Ces produits qui diffèrent par leur séquence, peuvent aussi être facilement mis en évidence en utilisant un séquenceur de nouvelle génération. Fig. 7

[0144] [Fig. 7] représente la construction des séquences telles qu'analysées par le logiciel. Les termes « Oligo 5' » et « Oligo 3' » représentent un couple de sondes selon l'invention. Le terme « UMI » représente la séquence de barcode moléculaire. Les termes « I1 » et « I2 » représentent les séquences d'amorçage. Le terme « index » représente la séquence index. Les termes « P5 » et « P7 » correspondent aux extensions, utiles pour l'utilisation d'un séquenceur de nouvelle génération. Fig. 8

[0145] [Fig. 8] représente un exemple d'une lecture au format FASTQ. Fig. 9

[0146] [Fig. 9] représente le schéma d'un saut d'exons dans le gène EGFR conduisant à l'expression d'un transcrit correspondant à un saut d'exon, détectable par la présente invention. La Figure 9A (haut) représente l'ADNc obtenu après transcription inverse dans le cas d'un épissage normal et la Figure 9B (bas) représente l'ADNc obtenu après transcription inverse dans le cas d'une anomalie d'épissage. La Figure 9B (haut) montre qu'en absence de mutation (cas normal), après hybridation des sondes S1G, S2D, S7G et S8D, les séquences obtenues sont les suivantes : S1G-S2D et S7G-S8D. La Figure 2B (bas) montre qu'en présence d'une mutation (cas anormal en présence des sauts d'exon), après hybridation des sondes, la séquence obtenue est la suivante : S1G-S8D (il y a eu délétion des exons 2 à 7). Fig. 10

[0147] [Fig. 10] représente le nombre de molécule d'ARN de fusion présents dans l'échantillon de départ testé selon l'exemple 3. Ce graphique montre que 587 molécules d'ARN de fusion étaient présentes dans l'échantillon de départ, et que ce résultat a été amplifié par un facteur 259.3 lors de l'étape de PCR. 152227 séquences avaient ainsi été obtenues à l'issue de l'étape de PCR. Fig. 11

[0148] [Fig. 11] représente le nombre de molécule d'ARN de fusion présents dans l'échantillon de départ testé selon l'exemple 4. Ce graphique montre que 505 molécules d'ARN de fusion étaient présentes dans l'échantillon de départ, et que ce résultat a été amplifié par un facteur 123.1 lors de l'étape de PCR. 62151 séquences avaient ainsi été obtenues à l'issue de l'étape de PCR. Fig. 12

[0149] [Fig. 12] représente le nombre de molécule d'ARN de fusion présents dans l'échantillon de départ testé selon l'exemple 5. Ce graphique montre que 965 molécules d'ARN de fusion étaient présentes dans l'échantillon de départ, et que ce résultat a été amplifié par un facteur 123.5 lors de l'étape de PCR. 119161 séquences avaient ainsi été obtenues à l'issue de l'étape de PCR. Fig. 13

[0150] [Fig. 13] représente le schéma d'un déséquilibre d'expression 5'-3' conduisant à l'expression d'un transcrit correspondant à des allèles différents, détectable par la présente invention. Les niveaux d'expression dépendent des régions régulatrices de transcription des allèles réarrangés. Par exemple, l'expression des allèles I et III est (Sn_Sn+1) = (Sn+2_Sn+3), l'expression des allèles I et II est (Sn+4_Sn+5) = (Sn+6_Sn+7). Cependant, lorsque les régions régulatrices de transcription des gènes A et B ne sont pas équivalentes, alors l'expression des exons 5' (Sn_Sn+1) et (Sn+2_Sn+3) est différente de l'expression des expressions exons 3' (Sn+4_Sn+5) et (Sn+6_Sn+7). Par exemple, dans les carcinomes pulmonaires porteurs d'une fusion du gène ALK (gène B), les allèles I et III, dont l'expression est contrôlée par les régions régulatrices d'ALK, sont très faiblement exprimés, tandis que l'allèle II, contrôlé par les régions régulatrices du gène partenaire A, l'est fortement. Il en résulte donc un déséquilibre 5'-3', avec : <semantics>(Sn+4Sn+5)=(Sn+6Sn+7)>>(SnSn+1)=(Sn+2Sn+3).<annotation encoding="application / x-tex">(Sn+4 Sn+5) = (Sn+6 Sn+7) >> (Sn Sn+1) = (Sn+2 Sn+3).< / annotation>< / semantics> Fig. 14

[0151] [Fig. 14] représente un exemple des sondes pouvant être utilisées selon la présente invention, ainsi que le gène que cette sonde permet de détecter. G / D indique si la sonde est « Gauche » ou « Droite », comme indiqué ci-dessus. Fig. 15

[0152] [Fig. 15] représente un exemple des sondes pouvant être utilisées selon la présente invention, ainsi que le gène que cette sonde permet de détecter. G / D indique si la sonde est « Gauche » ou « Droite », comme indiqué ci-dessus. Fig. 16 42

[0153] [Fig. 16] représente un exemple des sondes pouvant être utilisées selon la présente invention, ainsi que le gène que cette sonde permet de détecter. G / D indique si la sonde est « Gauche » ou « Droite », comme indiqué ci-dessus. Fig. 17

[0154] [Fig. 17] représente un exemple des sondes pouvant être utilisées selon la présente invention, ainsi que le gène que cette sonde permet de détecter. G / D indique si la sonde est « Gauche » ou « Droite », comme indiqué ci-dessus. Fig. 18

[0155] [Fig. 18] représente un exemple des sondes pouvant être utilisées selon la présente invention, ainsi que le gène que cette sonde permet de détecter. G / D indique si la sonde est « Gauche » ou « Droite », comme indiqué ci-dessus. Fig. 19

[0156] [Fig. 19] représente un exemple des sondes pouvant être utilisées selon la présente invention, ainsi que le gène que cette sonde permet de détecter. G / D indique si la sonde est « Gauche » ou « Droite », comme indiqué ci-dessus. Fig. 20

[0157] [Fig. 20] représente un exemple des sondes pouvant être utilisées selon la présente invention, ainsi que le gène que cette sonde permet de détecter. G / D indique si la sonde est « Gauche » ou « Droite », comme indiqué ci-dessus. Fig. 21

[0158] [Fig. 21] représente un exemple des sondes pouvant être utilisées selon la présente invention, ainsi que le gène que cette sonde permet de détecter. G / D indique si la sonde est « Gauche » ou « Droite », comme indiqué ci-dessus. Fig. 22

[0159] [Fig. 22] représente un exemple obtenu lors de l'analyse d'une anomalie d'épissage du gène MET. Fig. 23

[0160] [Fig. 23] représente un exemple obtenu lors de l'analyse d'une anomalie d'épissage du gène MET. Fig. 24

[0161] [Fig. 24] représente un exemple obtenu lors de l'analyse d'une anomalie d'épissage du gène EGFR. Fig. 25 43

[0162] [Fig. 25] représente un exemple obtenu lors de l'analyse d'une anomalie d'épissage du gène EGFR. Fig. 26

[0163] [Fig. 26] représente un exemple obtenu lors de l'analyse d'un déséquilibre d'expression 5'-3'. Fig. 27

[0164] [Fig. 27] représente un exemple obtenu lors de l'analyse d'un déséquilibre d'expression 5'-3'. Fig. 28

[0165] [Fig. 28] représente de nouvelles sondes (SEQ ID NO: 1211 à 1312) et illustre les cancers qu'elles permettent de détecter. Les séquences dites « full » comprennent la séquence d'amorçage, la séquence de barcode moléculaire (pour les sondes dites « Gauches ») et la séquence spécifique de la sonde (dénommées SEQ ID NO : 1313 à 1414). Exemples

[0166] Exemple 1 : Diagnostic d'un carcinome

[0167] L'échantillon d'un sujet a été soumis à une étape de RT-MLPA selon la présente invention, à l'aide des sondes décrites ci-dessus (plus particulièrement au moins les sondes SEQ ID NO: 1 à 13 et 14 à 91).

[0168] A l'issue de l'étape de PCR, 98993 séquences correspondant à des produits de PCR uniques (transcrits de fusion) ont été lues par séquençage de nouvelle génération. Ces séquences portent toutes en 5' une séquence de barcode moléculaire de 7 paires de bases. Du fait de l'amplification par PCR, ces séquences de barcode moléculaire sont lues plusieurs fois (nombre de lectures). Le comptage de ces barcodes permet de déterminer de façon précise le nombre de molécule d'ARN de fusion présents dans l'échantillon de départ (dans le cas testé ici : 729, voir la Figure 5).

[0169] Le Tableau 3 présente les résultats obtenus.

[0170] [Tableau 3] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document]

[0171] Exemple de sondes utilisées et résultats obtenus lors d'un diagnostic de carcinome

[0172] L'analyse de la séquence correspondant à des produits de PCR permet d'identifier les deux gènes partenaires impliqués dans le réarrangement chromosomique, ici les gènes EML4 et ALK. Le diagnostic du carcinome a ainsi été confirmé pour le patient à tester. 5

[0173] Ce réarrangement est récurrent dans les carcinomes pulmonaires, et rend le patient éligible à certaines thérapies ciblées.

[0174] Exemple 2 : Détermination d'un saut de l'exon 14 du gène MET

[0175] L'échantillon d'un sujet est analysé afin de confirmer ou d'infirmer la présence d'un saut de l'exon 14 du gène MET. Ledit échantillon a été soumis à une étape de RT-MLPA selon la présente invention, à l'aide des sondes décrites ci-dessus (plus particulièrement au moins les sondes SEQ ID NO: 96 à 99).

[0176] En situation normale, l'épissage des transcrits de ce gène induit des jonctions entre les exons 13 et 14, et 14 et 15. En situation pathologique, par exemple si une mutation vient détruire le site donneur d'épissage de l'exon 14, les cellules tumorales expriment un transcrit anormal, résultant de la jonction des exons 13 et 15 (Figure 6A).

[0177] Les différents produits d'amplification obtenus grâce à la présente invention sont visualisés en Figure 6B sur un séquenceur capillaire, après amplification à l'aide d'un couple d'amorce dont l'une est marquée par un fluorochrome. Ces produits qui diffèrent par leur séquence, et leur taille, peuvent aussi être facilement mis en évidence en utilisant un séquenceur de nouvelle génération.

[0178] Exemple 3 : Diagnostic d'un carcinome

[0179] L'échantillon d'un sujet a été soumis à une étape de RT-MLPA selon la présente invention, à l'aide des sondes décrites ci-dessus (plus particulièrement au moins les sondes SEQ ID NO: 1 à 13 et 14 à 91).

[0180] A l'issue de l'étape de PCR, 152227 séquences correspondant à des produits de PCR uniques (transcrits de fusion) ont été lues par séquençage de nouvelle génération. Ces séquences portent toutes en 5' une séquence de barcode moléculaire de 7 paires de bases. Du fait de l'amplification par PCR, ces séquences de barcode moléculaire sont lues plusieurs fois (nombre de lectures). Le comptage de ces barcodes permet de déterminer de façon précise le nombre de molécule d'ARN de fusion présents dans l'échantillon de départ (dans le cas testé ici : 587, voir la Figure 10).

[0181] Le Tableau 4 présente les résultats obtenus.

[0182] [Tableau 4] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document]

[0183] Exemple de sondes utilisées et résultats obtenus lors d'un diagnostic de carcinome

[0184] L'analyse de la séquence correspondant à des produits de PCR permet d'identifier les deux gènes partenaires impliqués dans le réarrangement chromosomique, ici les gènes KIF5B et RET. Le diagnostic du carcinome a ainsi été confirmé pour le patient à tester.

[0185] Ce réarrangement est récurrent dans les carcinomes pulmonaires, et rend le patient éligible à certaines thérapies ciblées.

[0186] Exemple 4 : Diagnostic d'un sarcome

[0187] L'échantillon d'un sujet a été soumis à une étape de RT-MLPA selon la présente invention, à l'aide des sondes décrites ci-dessus (plus particulièrement au moins les sondes SEQ : 868 à 938 et les sondes SEQ ID NO : 940 à 1054).

[0188] A l'issue de l'étape de PCR, 62151 séquences correspondant à des produits de PCR uniques (transcrits de fusion) ont été lues par séquençage de nouvelle génération. Ces séquences portent toutes en 5' une séquence de barcode moléculaire de 7 paires de bases. Du fait de l'amplification par PCR, ces séquences de barcode moléculaire sont lues plusieurs fois (nombre de lectures). Le comptage de ces barcodes permet de déterminer de façon précise le nombre de molécule d'ARN de fusion présents dans l'échantillon de départ (dans le cas testé ici : 505, voir la Figure 11).

[0189] Le Tableau 5 présente les résultats obtenus.

[0190] [Tableau 5] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document]

[0191] Exemple de sondes utilisées et résultats obtenus lors d'un diagnostic de sarcome

[0192] L'analyse de la séquence correspondant à des produits de PCR permet d'identifier les deux gènes partenaires impliqués dans le réarrangement chromosomique, ici les gènes EWSR1 et FLI1. Le diagnostic du sarcome a ainsi été confirmé pour le patient à tester. 50

[0193] Ce réarrangement est récurrent dans les sarcomes d'Ewing, ce qui permet de poser le diagnostic.

[0194] Exemple 5 : Diagnostic d'un sarcome

[0195] L'échantillon d'un sujet a été soumis à une étape de RT-MLPA selon la présente invention, à l'aide des sondes décrites ci-dessus (plus particulièrement au moins les sondes SEQ : 868 à 938 et les sondes SEQ ID NO : 940 à 1054).

[0196] A l'issue de l'étape de PCR, 119161 séquences correspondant à des produits de PCR uniques (transcrits de fusion) ont été lues par séquençage de nouvelle génération. Ces séquences portent toutes en 5' une séquence de barcode moléculaire de 7 paires de bases. Du fait de l'amplification par PCR, ces séquences de barcode moléculaire sont lues plusieurs fois (nombre de lectures). Le comptage de ces barcodes permet de déterminer de façon précise le nombre de molécule d'ARN de fusion présents dans l'échantillon de départ (dans le cas testé ici : 960, voir la Figure 12).

[0197] Le Tableau 6 présente les résultats obtenus. 15

[0198] [Tableau 6] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document]

[0199] Exemple de sondes utilisées et résultats obtenus lors d'un diagnostic de sarcome

[0200] L'analyse de la séquence correspondant à des produits de PCR permet d'identifier les deux gènes partenaires impliqués dans le réarrangement chromosomique, ici les gènes SS18 et SSX. Le diagnostic du sarcome a ainsi été confirmé pour le patient à tester. 5

[0201] Ce réarrangement est récurrent dans les synovialosarcomes, ce qui permet de poser le diagnostic.

[0202] Exemple 6 : Exemples de fusion associés à des pathologies

[0203] Le Tableau 7 présente certains exemples.

[0204] [Tableau 7] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document] [Image disponible dans le document PDF, Image available in the PDF document]

[0205] Exemple 7 : Diagnostic d'un carcinome pulmonaire

[0206] L'échantillon d'un sujet a été soumis à une étape de RT-MLPA selon la présente invention, à l'aide des sondes décrites ci-dessus.

[0207] A l'issue de l'étape de PCR, 70571 séquences correspondant à des produits de PCR uniques (transcrits de fusion) ont été lues par séquençage de nouvelle génération. Ces séquences portent toutes en 5' une séquence de barcode moléculaire de 7 paires de bases. Du fait de l'amplification par PCR, ces séquences de barcode moléculaire sont lues plusieurs fois (nombre de lectures). Le comptage de ces barcodes permet de déterminer de façon précise le nombre de molécule d'ARN de fusion présents dans l'échantillon de départ (dans le cas testé ici : (71 jonctions entre les exons 13 et 14, 119 entre les exons 13 et 15 et 92 entre les exons 14 et 15 du gène 58 MET)). Ces résultats, et en particulier la détection des transcrits 13-15 indique la présence d'une anomalie d'épissage du gène MET, rendant ce patient éligible à une thérapie ciblée, voir la Figure 22).

[0208] La Figure 23 présente les résultats obtenus. Les résultats permettent de poser le diagnostic.

[0209] Exemple 8 : Diagnostic d'un carcinome pulmonaire

[0210] L'échantillon d'un sujet a été soumis à une étape de RT-MLPA selon la présente invention, à l'aide des sondes décrites ci-dessus.

[0211] A l'issue de l'étape de PCR, 116165 séquences correspondant à des produits de PCR uniques (transcrits de fusion) ont été lues par séquençage de nouvelle génération. Ces séquences portent toutes en 5' une séquence de barcode moléculaire de 7 paires de bases. Du fait de l'amplification par PCR, ces séquences de barcode moléculaire sont lues plusieurs fois (nombre de lectures). Le comptage de ces barcodes permet de déterminer de façon précise le nombre de molécule d'ARN de fusion présents dans l'échantillon de départ (dans le cas testé ici : (455 jonctions entre les exons 1 et 2, 332 entre les exons 1 et 8 et 349 entre les exons 7 et 8 du gène EGFR)). Ces résultats, et en particulier la détection des transcrits 1-8 indique la présence d'une délétion interne du gène EGFR, rendant ce patient éligible à une thérapie ciblée, voir la Figure 24).

[0212] La Figure 25 présente les résultats obtenus. Les résultats permettent de poser le diagnostic.

[0213] Exemple 9 : Diagnostic d'un carcinome pulmonaire

[0214] L'échantillon d'un sujet a été soumis à une étape de RT-MLPA selon la présente invention, à l'aide des sondes décrites ci-dessus.

[0215] A l'issue de l'étape de PCR, 59214 séquences correspondant à des produits de PCR uniques (transcrits de fusion) ont été lues par séquençage de nouvelle génération. Ces séquences portent toutes en 5' une séquence de barcode moléculaire de 7 paires de bases. Du fait de l'amplification par PCR, ces séquences de barcode moléculaire sont lues plusieurs fois (nombre de lectures). Le comptage de ces barcodes permet de déterminer de façon précise le nombre de molécule d'ARN de fusion présents dans l'échantillon de départ (dans le cas testé ici : (157 jonctions entre les exons 21 et 22, 75 entre les exons 22 et 23, 52 entre les exons 25 et 26 et 50 entre les exons 27 et 28 du gène ALK). Ces résultats, et en particulier la mise en évidence d'un déséquilibre d'expression entre les parties 5' et 3' du gène ALK, indique que ce gène est réarrangé, rendant ce patient éligible à une thérapie ciblée, voir la Figure 26).

[0216] La Figure 27 présente les résultats obtenus. Les résultats permettent de poser le diagnostic.

Claims

1. Un kit comprenant au moins les sondes suivantes : SEQ ID NO : 1 à 13, SEQ ID NO: 14 à 91, SEQ ID NO: 96 à 99, SEQ ID NO: 103 à 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 à 137, SEQ ID NO: 138 à 168, SEQ ID NO: 169 à 194, SEQ ID NO: 195 à 198, SEQ ID NO: 199 à 245, SEQ ID NO: 246 à 344, SEQ ID NO: 345 à 403, SEQ ID NO: 404 à 428, SEQ ID NO: 429 à 436, SEQ ID NO: 437 à 479, SEQ ID NO: 480 à 504, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507 à 514, SEQ ID NO: 515 à 546, SEQ ID NO: 547 à 582, SEQ ID NO: 583 à 586, SEQ ID NO : 587 à 633, SEQ ID NO : 634 à 732, SEQ ID NO : 733 à 791, SEQ ID NO : 792 à 816, SEQ ID NO : 817 à 824, SEQ ID NO : 825, SEQ ID NO : 826 à 835, SEQ ID NO : 866 à 938, SEQ ID NO: 940 à 1104, SEQ ID NO: 1105 à 1107, SEQ ID NO: 939, et SEQ ID NO: 1108 à 1123, et SEQ ID NO : 1211 à 1312.

2. Le kit selon la revendication 1, dans lequel chacune des sondes est fusionnée à au moins une extrémité, avec une séquence d'amorçage.

3. Le kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel au moins une des sondes comprend une séquence de barcode moléculaire.

4. Le kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour son utilisation dans une méthode de diagnostic in vitro ou ex vivo d'un cancer chez un sujet, ladite méthode comprenant une étape de Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification précédée d'une Transcription Inverse (RT-MLPA) sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet.

5. Utilisation du kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans une méthode de diagnostic in vitro ou ex vivo d'un cancer chez un sujet, ladite méthode comprenant une étape de Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification précédée d'une Transcription Inverse (RT-MLPA) sur un échantillon biologique obtenu à partir dudit sujet.