Treatment of β‐hemoglobinopathies by gene editing

Abstract

The present disclosure provides treatment of β-hemoglobinopathies with tBE system. Specifically, the present disclosure discloses engineered cells with genetic modifications in HBG genes, composition of the engineered cell, and method of treating β-hemoglobinopathies.

Description

Treatment of β‐hemoglobinopathies by Gene Editing

[0001] FIELD OF DISCLOSURE

[0002] The present disclosure provides treatment of β-hemoglobinopathies by gene editing. Specifically, the present disclosure discloses engineered cells with genetic modifications in HBG genes, composition of the engineered cells, and method of treating β-hemoglobinopathies.

[0003] SEQUENCE LISTING

[0004] This disclosure contains a Sequence Listing electronically submitted as a file entitled “sequence listing. xml” having a size of 472, 295 bytes and created on November 15, 2023. The information contained in the Sequence Listing is incorporated by reference herein.BACKGROUND

[0005] β-hemoglobinopathies, including β-thalassemia and sickle cell disease (SCD) , are the common genetic diseases caused by mutations in the hemoglobin subunit beta (HBB) gene locus. Mutations in HBB locus lead to impaired β-globin production which can be compensated via direct restoration of the pathogenic mutations in HBB locus or reactivation of γ-globin expression. While direct correction of pathogenic mutations requires individual drug development for each mutation, reactivation of γ-globin expression is a universal therapeutic strategy covering most β-hemoglobinopathy patients. Gamma globin expression is tightly regulated throughout development and is silenced shortly post-birth by repressors that bind to its promoter regions. Genome-wide association study (GWAS) has identified several transcription repressors and their binding motifs, disruption of which showed elevated γ-globin expression. BCL11A (BCL11 transcription factor A) and ZBTB7A (zinc finger and BTB domain containing 7A, also known as LRF, leukemia / lymphoma-related factor) are the two major repressors of the γ-globin gene expression, responsible for its silencing. Knocking out BCL11A or ZBTB7A protein is not tolerated due to their crucial roles in other biological processes. Alternatively, disrupting the erythroid-specific BCL11A enhancer located in chromosome 2, greatly reduced BCL11A expression in erythroid cells without affecting other lineage development. BCL11A enhancer has two binding motifs that can be recognized by GATA or KLF1 transcription factors, and mutating either motif could downregulate BCL11A expression.

[0006] Mutating BCL11A or ZBTB7A binding motif located in the regulatory region of HBG locus is another way to reactivate γ-globin expression. One key question associated with γ-globin reactivation strategy is how much fetal hemoglobin (α2γ2, HbF) is required to achieve therapeutic benefit. Studies of β-thalassemia patients with naturally reactivated γ-globin have indicated that the HbF level correlates negatively with morbidity. Therefore, it is important to evaluate the efficacy of different reactivation strategies, ensuring a potent protective level of HbF.

[0007] Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are multilineage precursor cells that can self-renew and reconstitute the entire blood system. Establishing a safe modification of HSPCs is particular important as edited HSPC cells can persist over lifetime to regenerate the blood systems. The development of a safe and efficacious treatment strategy for β-hemoglobinopathies is highly desirable.SUMMARY

[0008] Reactivating the silenced γ-globin expression is a therapeutic strategy for treating β-thalassemia and sickle cell disease. Genetic studies have identified several transcription factor binding motifs and their disruption could reactivate γ-globin expression, the level of which correlates positively with therapeutic outcome. In some embodiments of the present disclosure, transformer base editor (tBE) , a cytosine base editor with no detectable off-target mutations, is used to disrupt transcription factor binding motifs in hematopoietic stem cells. The present disclosure shows that directly disrupting BCL11A binding motif in the HBG1 / 2 promoters triggered higher γ-globin expression than disrupting other regulatory motifs. Compared to other clinical and preclinical strategies using Cas9 nuclease or conventional base editors (ABE8e and hA3A-BE3) , tBE-meditated disruption of BCL11A binding motif triggered the highest fetal hemoglobin in human hematopoietic stem / progenitor cells, meanwhile exhibiting no detectable DNA or RNA off-target mutations. Durable therapeutic editing by tBE persisted in long-term repopulating hematopoietic stem cells, demonstrating that tBE-mediated editing of BCL11A binding motif in HBG1 / 2 promoters is a safe and effective strategy for treating β-hemoglobinopathies.

[0009] In an aspect, the present disclosure provides an engineered cell comprising a genetic modification within a hemoglobin subunit gamma 1 (HBG-1) gene promoter site, wherein the genetic modification is between TSS -118 bp and TSS -113 bp, and wherein the nucleotide sequence between TSS -118 bp and TSS -113 bp at the genetic modification site is any one of SEQ ID NOs: 2-4.

[0010] In an aspect, the present disclosure provides an engineered cell comprising a genetic modification within a hemoglobin subunit gamma 3 (HBG-3) gene promoter site, wherein the genetic modification is between TSS -202 bp and TSS -194 bp, and wherein the nucleotide sequence between TSS -202 bp and TSS -194 bp at the genetic modification site is any one of SEQ ID NOs: 6-14.

[0011] In some embodiments, the engineered cell is a hematopoietic stem cell or a hematopoietic progenitor cell.

[0012] In some embodiments of the engineered cell described herein, the genetic modification is introduced by a transformer base editor (tBE) gene editing system.

[0013] In an aspect, the present disclosure provides a composition comprising the engineered cell described herein.

[0014] In some embodiments, the composition further comprises a cryopreservation medium.

[0015] In an aspect, the present disclosure provides a method for treating β-hemoglobinopathies in a subject, comprising administering the engineered cell described herein and / or the composition described herein to the subject.

[0016] In some embodiments, the engineered cell is autologous.

[0017] In some embodiments, the engineered cell is allogeneic.

[0018] In an aspect, the present disclosure provides a method for engineering a hematopoietic stem cell and / or a hematopoietic progenitor cell, comprising administering to the cell one or more transformer base editor (tBE) gene editing systems, wherein each tBE gene editing system comprises

[0019] a main guide RNA (mgRNA) and a helper guide RNA (hgRNA) , or at least one DNA polynucleotide encoding the mgRNA and / or the hgRNA, wherein the mgRNA comprises a mgRNA spacer, and wherein the hgRNA comprises a hgRNA spacer targeting a site upstream of the mgRNA spacer targeting site, wherein the mgRNA spacer targets

[0020] (1) a site within a TSS + 58kb GATA binding motif in a BCL11 transcription factor A (BCL11A) gene,

[0021] (2) a site within a TSS + 55kb KLF1 binding motif in a BCL11A gene,

[0022] (3) a site within a TSS -118 bp to -113 bp BCL11A binding site in the promoter region of an HBG-1 gene,

[0023] (4) a site within a TSS -202bp to -194bp zinc finger and BTB domain containing 7A (ZBTB7A) binding site in the promoter region of an HBG-3, or

[0024] (5) a site within a TSS + 2.5kb ZBTB7A binding site in the 3’ enhancer region of an HBG-1 gene;

[0025] a CRISPR-associated protein (Cas protein) , or a polynucleotide encoding the Cas protein; and

[0026] a nucleobase deaminase or a catalytic domain thereof, or a polynucleotide encoding the nucleobase deaminase or the catalytic domain thereof.

[0027] In some embodiments of the method described herein, in each tBE gene editing system the hgRNA further comprises a first CRISPR motif and a first protein-binding motif,

[0028] wherein the mgRNA further comprises a second CRISPR motif and optionally a second protein-binding motif,

[0029] wherein a first and a second Cas protein or a polynucleotide encoding thereof is administered, wherein the first Cas protein binds to the first CRISPR motif, and the second Cas protein binds to the second CRISPR motif,

[0030] wherein the nucleobase deaminase or a catalytic domain thereof is administered in the form of a first fusion protein comprising a nucleobase deaminase or a catalytic domain thereof and a first RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the first fusion protein, wherein the nucleobase deaminase or the catalytic domain thereof and the first RNA binding domain are  optionally connected by a linker, and wherein the first RNA binding domain binds to the first protein-binding motif.

[0031] In some embodiments of the method described herein, each tBE gene editing system further comprises:

[0032] a protease or a polynucleotide encoding thereof, and

[0033] a nucleobase deaminase inhibitor domain,

[0034] wherein the nucleobase deaminase inhibitor domain is connected to the nucleobase deaminase or the catalytic domain thereof in the first fusion protein optionally by a linker, and wherein there is a cleavage site for the protease between the nucleobase deaminase inhibitor domain and the nucleobase deaminase or the catalytic domain thereof.

[0035] In some embodiments of the method described herein, each tBE gene editing system further comprises:

[0036] a second fusion protein comprising the protease and a second RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the second fusion protein,

[0037] wherein the protease and the second RNA binding domain are optionally connected by a linker,

[0038] wherein the mgRNA comprises the second protein-binding motif,

[0039] and wherein the second RNA binding domain binds to the second protein-binding motif.

[0040] In some embodiments of the method described herein, the protease is split into a first protease fragment and a second protease fragment, wherein the first and / or second protease fragment alone is not able to cleave the cleavage site.

[0041] In some embodiments of the method described herein, each tBE gene editing system further comprises:

[0042] a second fusion protein comprising the first protease fragment and a second RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the second fusion protein, wherein the first protease fragment and the second RNA binding domain are optionally connected by a linker, and

[0043] a third fusion protein comprising the second protease fragment and a third RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the third fusion protein, wherein the second protease fragment and the third RNA binding domain are optionally connected by a linker,

[0044] wherein the mgRNA further comprises the second protein-binding motif and a third protein-binding motif,

[0045] wherein the second RNA binding domain binds to the second protein-binding motif, and

[0046] wherein the third RNA binding domain binds to the third protein-binding motif.

[0047] In some embodiments of the method described herein, the second and third RNA binding domains are the same or different, and the second and third protein-binding motifs are the same or different.

[0048] In some embodiments of the method described herein, each tBE gene editing system further comprises:

[0049] a second fusion protein comprising the first protease fragment and a second RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the second fusion protein,

[0050] wherein the first protease fragment and the second RNA binding domain are optionally connected by a linker,

[0051] wherein the mgRNA further comprises the second protein-binding motif, and

[0052] wherein the second RNA binding domain binds to the second protein-binding motif.

[0053] In some embodiments of the method described herein, the protease is a TEV protease, a TuMV protease, a PPV protease, a PVY protease, a ZIKV protease, or a WNV protease.

[0054] In some embodiments of the method described herein, the protease is a TEV protease comprising a sequence of SEQ ID NO: 25.

[0055] In some embodiments of the method described herein, the first TEV protease fragment comprises a sequence of SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27.

[0056] In some embodiments of the method described herein, the nucleobase deaminase inhibitor is an inhibitory domain of a nucleobase deaminase.

[0057] In some embodiments of the method described herein, the nucleobase deaminase inhibitor is an inhibitory domain of a cytidine deaminase or an adenosine deaminase.

[0058] In some embodiments of the method described herein, the inhibitory domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 or SEQ ID NO: 43 or any one of SEQ ID NOs: 51-138.

[0059] In some embodiments of the method described herein, the nucleotide deaminase is a cytidine deaminase.

[0060] In some embodiments of the method described herein, the cytidine deaminase is selected from the group consisting of APOBEC3B (A3B) , APOBEC3C (A3C) , APOBEC3D (A3D) , APOBEC3F (A3F) , APOBEC3G (A3G) , APOBEC3H (A3H) , APOBECI (Al) , APOBEC3 (A3) , APOBEC2 (A2) , APOBEC4 (A4) , and AICDA (AID) .

[0061] In some embodiments of the method described herein, the cytidine deaminase is a human or mouse cytidine deaminase.

[0062] In some embodiments of the method described herein, the nucleotide deaminase is an adenosine deaminase.

[0063] In some embodiments of the method described herein, the adenosine deaminase is selected from the group consisting of tRNA-specific adenosine deaminase (TadA) , adenosine  deaminase tRNA specific 1 (ADAT1) , adenosine deaminase tRNA specific 2 (ADAT2) , adenosine deaminase tRNA specific 3 (ADAT3) , adenosine deaminase RNA specific B1 (ADARB1) , adenosine deaminase RNA specific B2 (ADARB2) , adenosine monophosphate deaminase 1 (AMPD1) , adenosine monophosphate deaminase 2 (AMPD2) , adenosine monophosphate deaminase 3 (AMPD3) , adenosine deaminase (ADA) , adenosine deaminase 2 (ADA2) , adenosine deaminase like (ADAL) , adenosine deaminase domain containing 1 (ADAD1) , adenosine deaminase domain containing 2 (ADAD2) , and adenosine deaminase RNA specific (ADAR) .

[0064] In some embodiments of the method described herein, the adenosine deaminase is a human or mouse adenosine deaminase.

[0065] In some embodiments of the method described herein, the first fusion protein further comprises an uracil glycosylase inhibitor (UGI) .

[0066] In some embodiments of the method described herein, the Cas protein is a Cas9, a dead Cas9 (dCas9) , or a Cas9 nickase (nCas9) selected from the group consisting of SpCas9, FnCas9, St1Cas9, St3Cas9, NmCas9, SaCas9, AsCpfl, LbCpfl, FnCpfl, VQR Cas9, EQR Cas9, VRER Cas9, Cas9-NG, xCas9, eCas9, SpCas9-HF1, HypaCas9, HiFiCas9, sniper-Cas9, SpG, SpRY, KKH SaCas9, CjCas9, Cas9-NRRH, Cas9-NRCH, Cas9-NRTH, SsCpfl, PcCpfl, BpCpfl, LiCpfl, PmCpfl, Lb2Cpf1, PbCpfl, PbCpfl, PeCpf1, PdCpf1, MbCpf1, EeCpf1, CmtCpf1, BsCpfl, BhCasl2b, AkCasl2b, BsCasl2b, AmCasl2b, AaCasl2b, RfxCasl3d, LwaCasl3a, PspCasl3b, PguCasl3b, and RanCasl3b.

[0067] In some embodiments of the method described herein, the first protein-binding RNA motif and the first RNA binding domain, the second protein-binding RNA motif and the second RNA binding domain, and the third protein-binding RNA motif and the third RNA binding domain, are each independently selected from the group consisting of:

[0068] a MS2 phage operator stem-loop and MS2 coat protein (MCP) or an RNA-binding section thereof,

[0069] a BoxB and N22P or an RNA-binding section thereof,

[0070] a telomerase Ku binding motif and Ku protein or an RNA-binding section thereof,

[0071] a telomerase Sm7 binding motif and Sm7 protein or an RNA-binding section thereof,

[0072] a PP7 phage operator stem -loop and PP7 coat protein (PCP) or an RNA-binding section thereof,

[0073] a SfMu phage Com stem-loop and Com RNA binding protein or an RNA-binding section thereof, and

[0074] a non-natural RNA aptamer and corresponding aptamer ligand or an RNA-binding section thereof.

[0075] In some embodiments of the method described herein, the method comprises administering to the cell a first tBE gene editing system and a second tBE gene editing system,

[0076] wherein the first tBE gene editing system comprises a first mgRNA and a first hgRNA, or at least one DNA polynucleotide encoding the first mgRNA and / or the first hgRNA, wherein the first mgRNA comprises a first mgRNA spacer, and wherein the first hgRNA comprises a first hgRNA spacer targeting a site upstream of the first mgRNA spacer targeting site, wherein the first mgRNA spacer targets

[0077] (1) a site within a TSS + 58kb GATA binding motif in a BCL11 transcription factor A (BCL11A) gene,

[0078] (2) a site within a TSS + 55kb KLF1 binding motif in a BCL11A gene, or

[0079] (3) a site within a TSS -118 bp to -113 bp BCL11A binding site in the promoter region of an HBG-1 gene,

[0080] wherein the second tBE gene editing system comprises a second mgRNA and a second hgRNA, or at least one DNA polynucleotide encoding the second mgRNA and / or the second hgRNA, wherein the second mgRNA comprises a second mgRNA spacer, and wherein the second hgRNA comprises a second hgRNA spacer targeting a site upstream of the second mgRNA spacer targeting site, wherein the second mgRNA spacer targets

[0081] (1) a site within a TSS -202bp to -194bp zinc finger and BTB domain containing 7A (ZBTB7A) binding site in the promoter region of an HBG-3, or

[0082] (2) a site within a TSS + 2.5kb ZBTB7A binding site in the 3’ enhancer region of an HBG-1 gene.

[0083] In some embodiments of the method described herein, at least one RNA is codon optimized.

[0084] In some embodiments of the method described herein, the tBE gene editing system comprises an mRNA encoding the Cas protein or a DNA encoding the mRNA, wherein the percentage of uridine in the mRNA is 10%-15.5%.

[0085] In some embodiments of the method described herein, the percentage of uridine in the mRNA is 10%-12.8%.

[0086] In some embodiments of the method described herein, the Cas protein is a spCas9 D10A.

[0087] In some embodiments of the method described herein, the tBE gene editing system comprises an mRNA encoding the MS2 coat protein (MCP) or a DNA encoding the mRNA, wherein the percentage of uridine in the mRNA is 10%-18.9%.

[0088] In some embodiments of the method described herein, the tBE gene editing system comprises a Cas mRNA encoding the Cas protein, wherein the tBE gene editing system comprises an MCP mRNA encoding the MS2 coat protein (MCP) , wherein the ratio of the Cas mRNA and the MCP mRNA is between 1: 1 and 1: 2.

[0089] In some embodiments of the method described herein, the ratio of the Cas mRNA and the MCP mRNA is 1: 1.5.

[0090] In some embodiments of the method described herein, in each tBE gene editing system, the ratio of the mgRNA and the hgRNA is between 1: 0.5 and 1: 2.

[0091] In some embodiments of the method described herein, the ratio of the mgRNA and the hgRNA is 1: 1.15.

[0092] In some embodiments of the method described herein, in each tBE gene editing system, the tBE gene editing system comprises a Cas mRNA encoding the Cas protein, and the ratio of the mgRNA and the Cas mRNA is between 1: 1 and 1: 3.

[0093] In some embodiments of the method described herein, the ratio of the mgRNA and the mRNA is 1: 2.

[0094] In some embodiments of the method described herein, the tBE gene editing system further comprises at least one nuclear localization signal (NLS) or a polynucleotide encoding thereof.

[0095] In some embodiments of the method described herein, at least one NLS is a bipartite NLS (bp NLS) .

[0096] In some embodiments of the method described herein, at least one NLS is a SV40 NLS.

[0097] In some embodiments of the method described herein, at least one NLS is a c-Myc NLS.

[0098] In some embodiments of the method described herein, a c-Myc NLS is located at the N-terminus of the Cas protein consecutively, and a bipartite NLS is located at the C-terminus of the Cas protein.

[0099] In some embodiments of the method described herein, the tBE gene editing system comprises a first polynucleotide and a second polynucleotide,

[0100] wherein the first polynucleotide comprising a sequence encoding an MS2 coat protein (MCP) , a sequence encoding a UGI, a sequence encoding a nucleobase deaminase, a sequence encoding a N22p, a sequence encoding a first protease fragment, and a sequence encoding a second protease fragment,

[0101] wherein the second polynucleotide comprises a sequence encoding a Cas protein,

[0102] wherein the first polynucleotide further comprises four sequences each encoding a bipartite NLS, and the four sequences are located between the sequence encoding an MS2 coat protein (MCP) and the sequence encoding a UGI, between the sequence encoding a nucleobase deaminase and the sequence encoding a N22p, between the sequence encoding a first protease fragment and the sequence encoding a second protease fragment, and at the 3’-end of the sequence encoding the second protease fragment,

[0103] wherein the second polynucleotide further comprises a sequence encoding a c-Myc NLS at the 5’-end of the sequence encoding the Cas protein, and a sequence encoding a bipartite NLS at the 3’-end of the sequence encoding the Cas protein.

[0104] In an aspect, the present disclosure provides a method for creating a binding motif for a KLF1 activator in the HBG-3 gene in a cell, comprising genetically modifying the thymine (T) at TSS -198bp of the HBG-3 gene to a cytosine. In some embodiments, the genetic modification is carried out with the method described herein.

[0105] In an aspect, the present disclosure provides a method for activating γ-globin expression in a hematopoietic stem cell and / or a hematopoietic progenitor cell, comprising engineering the cell with the method described herein, and / or creating a binding motif for a KLF1 activator in the HBG-3 gene in the cell with the method described herein.

[0106] In an aspect, the present disclosure provides a method for treating β-hemoglobinopathies in a subject, comprising engineering the cell in the subject with the method described herein.

[0107] In an aspect, the present disclosure provides a method for treating β-hemoglobinopathies in a subject, comprising activating γ-globin expression in a hematopoietic stem cell and / or a hematopoietic progenitor cell with the method described herein.

[0108] BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0109] Fig. 1 shows base editing at transcription factor binding motifs associated with γ-globin regulation. Fig. 1 is a schematic representation of the transcription factor binding motifs associated with γ-globin regulation in chromosomes 2 and 11. The sgRNAs designed for each motif are indicated under the lines representing Chr 2 and Chr 11. TSS, transcription start site.

[0110] Fig. 2 illustrates the main sgRNAs of tBE-mediated disruption of transcription factor binding motifs. Fig. 2 is an illustration of sgRNA design for the targeted transcription factor binding motifs. (dark grey box, PAM; light grey box, sgRNA-targeted protospacer sequence; bold letter, transcription factor binding motif; grey letter, edited cytosine) .

[0111] Fig. 3 illustrates optimization of RNA delivery of tBE in HSPCs. Fig. 3A shows comparison of the ratio and dose of each RNA component of tBE. The relative ratios of RNA components are represented in keys from left to right: nCas9 (D10A) mRNA, tBE-V5-mA3 mRNA, sgRNA, hsgRNA. Fig. 3B (Top) is a schematic illustration of the original and NLS-optimized mRNA constructs of tBE. bpNLS, bipartite nuclear localization signals. Fig. 3B (Bottom) shows base editing efficiency (sum of C-to-T, C-to-G and C-to-A editing) in HSPCs induced by the original and NLS-optimized tBEs. (Data represent mean ± SD. n = 3. p values were calculated by t-test; *, p < 0.05, **, p < 0.01, ***, p < 0.001 and ns, non-significant. )

[0112] Fig. 4 shows that tBE-mediated disruption of BCL11A binding motif in HSPCs triggers high γ-globin reactivation. Fig. 4A shows comparison of editing efficiency targeting the BCL11A binding motif in the promoter of HBG1 / 2 or the BCL11A erythroid enhancer GATA motif by different genome editing tools. (Left) The sequences of sgRNA spacer regions covering the binding motifs. The underscored line highlights the transcription factor binding motif is (Right) Base editing or indel frequencies induced by different genome editing tools with the indicated sgRNAs. Fig. 4B is RT-PCR analysis of γ-globin mRNA level relative to β-like globin  after erythroid differentiation of edited HSPCs with indicated genome editors. Fig. 4C is FACS analysis of F cell percentage in edited HSPCs after erythroid differentiation. Fig. 4D is HPLC analysis of globin chains in edited HSPCs after erythroid differentiation. Fig. 4E is HPLC analysis of hemoglobin tetramer in edited HSPCs after erythroid differentiation. Fig. 4F shows comparison of engraftment efficiency of mock-treated and tBE-edited HSPCs. Fig. 4G shows percentage of engrafted human B cells (hCD45+hCD19+) , myeloid cells (hCD45+hCD33+) and T cells (hCD45+CD19-CD33-CD3+) in the bone marrow 16 weeks after transplantation. Fig. 4H shows comparison of base editing efficiency of engrafted cells collected at 16 weeks post-transplantation over input cells. In Fig. 4A-E, data represent mean ± SD, n>=3. p values were calculated by t-test; *, p < 0.05, **, p < 0.01 and ns, non-significant. In (G-H) , the mock data were from one mouse and the tBE data were from 4 mice. Data represents median + SEM.

[0113] Fig. 5 shows DNA damage analysis. Fig. 5A shows RT-qPCR measurement of CDKN1A (P21) transcription levels triggered by tBE and Cas9 nuclease in HSPCs. Fig. 5B shows fold change of edited HSPCs cell growth after the treatment of different genome editors. Counting of cell numbers was performed on day 0 after electroporation.

[0114] Fig. 6 shows editing frequency of tBE or Cas9 nuclease mediated editing in HSPCs. Fig. 6 shows base editing or indel frequency induced by tBE or Cas9 nuclease at the sgHBG-1 on-target site in HSPCs.

[0115] Fig. 7 is editing outcome of Cas9 edited CD34+ HSPCs. Fig. 7 shows the indel spectrum of editing outcomes by Cas9 nuclease.

[0116] Fig. 8 shows the results of multiplex base editing in HSPCs. Fig. 8A shows results of co-editing by sgHBG-1 and sgHBG-3. Fig. 8B-D show gamma-globin reactivation level in HSPCs that were differentiated into erythroid cells.

[0117] Fig. 9 illustrates gating strategy of xenotransplant experiment and F cell analysis. Fig. 9A is the gating strategy for animal experiments. Fig. 9B is a representative image of F cell analysis.DETAILED DESCRIPTION

[0118] Definitions

[0119] In the present disclosure, unless otherwise specified, the scientific and technical terms used herein have the meanings generally understood by a person skilled in the art. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein find use in the practice of the present disclosure, the preferred methods and materials are described herein. Accordingly, the terms defined herein are more fully described by reference to the Specification as a whole.

[0120] All publications, including but not limited to disclosures and disclosure applications, cited in this specification are herein incorporated by reference as though fully set forth. If certain content of a publication cited herein contradicts or is inconsistent with the present disclosure, the present disclosure controls.

[0121] As used herein, the singular terms “a, ” “an, ” and “the” include the plural reference unless the context clearly indicates otherwise.

[0122] As used herein, “and / or” refers to and encompasses any and all possible combinations of one or more of the associated listed items, as well as the lack of combinations when interpreted in the alternative ( “or” ) . Moreover, the present invention also contemplates that in some embodiments of the invention, any feature or combination of features set forth herein can be excluded or omitted.

[0123] Unless the context requires otherwise, the terms “comprise, ” “comprises, ” and “comprising, ” or similar terms are intended to mean a non-exclusive inclusion, such that a recited list of elements or features does not include those stated or listed elements solely but may include other elements or features that are not listed or stated.

[0124] Unless otherwise indicated, nucleic acids are written left to right in the 5' to 3' orientation, and amino acid sequences are written left to right in amino to carboxy orientation, respectively.

[0125] It is to be understood that this disclosure is not limited to the particular methodology, protocols, and reagents described, as these may vary, depending upon the context in which they are used by those skilled in the art.

[0126] As used herein, the terms “percent identity” and “%identity, ” as applied to nucleic acid or polynucleotide sequences, refer to the percentage of residue matches between at least two nucleic acid or polynucleotide sequences aligned using a standardized algorithm. Such an algorithm may insert, in a standardized and reproducible way, gaps in the sequences being compared in order to optimize alignment between two sequences, and therefore achieve a more meaningful comparison of the two sequences.

[0127] Percent identity between nucleic acid or polynucleotide sequences may be determined using a suite of commonly used and freely available sequence comparison algorithms provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, S.F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410) , which is available from several sources, including the NCBI, Bethesda, Md., and on the Internet at http:  / / www. ncbi. nlm. nih. gov / BLAST / .

[0128] Nucleic acid or polynucleotide sequences that do not show a high degree of identity may nevertheless encode similar amino acid sequences due to the degeneracy of the genetic code. It is understood that changes in a nucleic acid sequence can be made using this degeneracy to produce multiple nucleic acid sequences that all encode substantially the same protein. Specifically, degenerate codon substitutions may be achieved by generating sequences in which the third position of one or more selected (or all) codons is substituted with mixed-base and / or deoxyinosine residues (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res 19: 5081; Ohtsuka et al. (1985) J Biol Chem 260: 2605-2608; Cassol et al. (1992) ; Rossolini et al. (1994) Mol Cell Probes 8: 91-98) . The term “nucleic acid” refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides and polymers thereof in either single-or double-stranded form. Unless specifically limited, the term encompasses nucleic acids containing known analogues of natural nucleotides which have similar binding  properties as the reference nucleic acid and are metabolized in a manner similar to naturally occurring nucleotides. The term nucleic acid is used interchangeably with polynucleotide, and (in appropriate contexts) gene, cDNA, and mRNA encoded by a gene.

[0129] As used herein, “percent (%) amino acid sequence identity” with respect to a peptide, polypeptide or protein sequence is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in another peptide or polypeptide sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Percent amino acid sequence identity in the current disclosure is measured using BLAST software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared.

[0130] An amino acid substitution refers to the replacement of one amino acid in a polypeptide with another amino acid. Amino acid substitutions can be conservative or non-conservative substitutions. A conservative replacement (also called a conservative mutation or a conservative substitution) is an amino acid replacement in a protein that changes a given amino acid to a different amino acid with similar biochemical properties (e.g., charge, hydrophobicity, and size) . Exemplary substitutions are shown in Table 1. Amino acid substitutions may be introduced into a protein of interest and the products screened for a desired activity, for example, retained / improved biological activity.

[0131] Table 1 Exemplary Substitutions

[0132] Amino acids may be grouped according to common side-chain properties:

[0133] (1) hydrophobic: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

[0134] (2) neutral hydrophilic: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

[0135] (3) acidic: Asp, Glu;

[0136] (4) basic: His, Lys, Arg;

[0137] (5) residues that influence chain orientation: Gly, Pro;

[0138] (6) aromatic: Trp, Tyr, Phe.

[0139] As used herein, the term “polypeptide” is intended to encompass a singular “polypeptide” as well as plural “polypeptides, ” and refers to a molecule composed of monomers (amino acids) linearly linked by amide bonds (also known as peptide bonds) . The term “polypeptide” refers to any chain or chains of two or more amino acids, and does not refer to a specific length of the product. Thus, “peptides, ” “protein” , or any other term used to refer to a chain or chains of two or more amino acids, are included within the definition of “polypeptide, ” and the term “polypeptide” may be used instead of, or interchangeably with any of these terms. The term “polypeptide” is also intended to refer to the products of post-expression modifications of the polypeptide, including without limitation glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization by known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, or modification by non-naturally occurring amino acids. A polypeptide may be derived from a natural biological source or produced by recombinant technology, but is not necessarily translated from a designated nucleic acid sequence. It may be generated in any manner, including by chemical synthesis.

[0140] As used herein, the term “encode” or “encoding” as it is applied to polynucleotides refers to a polynucleotide which is said to “encode” a polypeptide if, in its native state or when manipulated by methods well known to those skilled in the art, it can be transcribed and / or translated to produce the mRNA for the polypeptide and / or a fragment thereof. The antisense strand is the complement of such a nucleic acid, and the encoding sequence can be deduced therefrom.

[0141] As used herein, a “single guide RNA” (sgRNA) refers to a synthetic or expressed RNA sequence that comprises a CRISPR binding motif and a spacer. A “spacer” is a DNA-targeting motif, which is a sequence that is complementary to a target specific DNA region. The CRISPR binding motif of a guide RNA can bind to a Cas enzyme and DNA-targeting motif of  the gRNA can guide the complex to a specific target location on a DNA. A guide RNA may further comprise one or more protein-binding motifs.

[0142] As used herein, a CRISPR RNA (crRNA) refers to a synthetic or expressed RNA sequence that can form a base-paired structure with a trans-activating crRNA (tracrRNA) , to which a Cas protein can bind and form an effector complex. The crRNA also comprises a spacer sequence, which is complementary to a target specific DNA region.

[0143] As used herein, a linker sequence in the context of crRNA refers to a region in the crRNA that is capable of forming a dual-RNA structure with another RNA sequence (such as a tracrRNA) . In some embodiments, the linker sequence is at the 3’-end of the spacer sequence of the crRNA.

[0144] As used herein, a trans-activating crRNA (tracrRNA) refers to a synthetic or expressed RNA sequence that can form a base-paired structure with a crRNA, to which a Cas protein can bind and form an effector complex.

[0145] As used herein, a base-paired structure refers to a structure formed by two nucleic acid sequences, wherein the two nucleic acid sequences bind to each other through multiple Watson-Crick-Franklin base pairs formed between nucleotides. When the two nucleic acid sequences are RNA sequences, base pair is formed between guanine-cytosine and adenine-uracil.

[0146] As used herein, a “fusion protein” is a protein comprising at least two domains that are encoded by separate genes that have been joined a single polypeptide. For example, a fusion protein can comprise two domains that are encoded by separate genes that have been joined so that they are transcribed and translated as a single unit, producing a single polypeptide. In some embodiments, the at least two domains are fused together directly. In some embodiments, the domains are connected by one or more linkers.

[0147] As used herein, a “protein-binding RNA motif” refers to a piece of sequence in an RNA molecule that is capable of binding to proteins. In some embodiments, the protein-binding RNA motif is capable of binding to specific protein with high affinity and specificity. In some embodiments, the protein-binding RNA motif is an RNA aptamer or a variant thereof.

[0148] As used herein, a “RNA-binding domain” refers to a domain in a protein that is capable of binding to an RNA or a subpart of the RNA molecule. In some embodiments, the RNA-binding domain is a domain recognized and bound by an RNA aptamer or a variant thereof. In some embodiments, the RNA-binding domain is an RNA-recognition motif, an hnRNP K homology domain, or a DEAD box helicase domain.

[0149] The term “genetic modification” or “genetic engineering and their grammatical equivalents as used herein can refer to one or more alterations of a nucleic acid, e.g., the nucleic acid within an organism's genome. For example, genetic modification can refer to alterations, additions, and / or deletion of genes or portions of genes or other nucleic acid sequences. A genetically modified cell can also refer to a cell with an added, deleted, and / or altered gene or portion of a gene. A genetically modified cell can also refer to a cell with an  added nucleic acid sequence that is not a gene or gene portion. Genetic modifications include, for example, both transient knock-in or knock-down mechanisms, and mechanisms that result in permanent knock-in, knock-down, or knock-out of target genes or portions of genes or nucleic acid sequences. Genetic modifications include, for example, both transient knock-in and mechanisms that result in permanent knock-in of nucleic acids sequences. Genetic modifications also include, for example, reduced or increased transcription, reduced or increased mRNA stability, reduced or increased translation, and reduced or increased protein stability.

[0150] As used herein, a composition refers to any mixture of two or more products, substances, or compounds, including cells.

[0151] As used herein, TSS refers to “transcription start site, ” which is the location where the first DNA nucleotide is transcribed into RNA. TSS location of a gene can be identified with methods known in the art, such as Rapid amplification of cDNA ends (RACE) and primer extension. TSS location can be found in the Database of Transcription Start Sites (DBTSS, https:  / / dbtss. hgc. jp / ) .

[0152] As used herein, TSS is used to indicate location of a specific nucleotide in a gene. A nucleotide at TSS + n bp means that the nucleotide is located n bp downstream of TSS. A nucleotide at TSS -n bp means that the nucleotide is located n bp upstream of TSS. For example, a nucleotide at TSS +55 kb of a BCL11A gene means that the site is located 55 kb downstream of the TSS of BCL11A gene. For example, a nucleotide at TSS -118 bp of an HBG-1 gene means that the nucleotide is 118 bp upstream of the TSS of HBG-1 gene. A site within a TSS -118bp to -113 bp of HBG-1 gene means that the site is between the nucleotide 118 bp upstream of TSS and the nucleotide 113 bp.

[0153] As used herein, a hematopoietic stem cell is the stem cell that give rise to different types of blood cells though a process called haematopoiesis. A hematopoietic progenitor cell is a descendant of hematopoietic stem cell, which is capable of further differentiate into specific type of blood cell. Hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells are also referred to as HSPCs (hematopoietic stem and progenitor cells) . HSPCs are multilineage precursor cells that can self-renew and reconstitute the entire blood system. In some embodiments, the HSPC is CD34+.

[0154] As used herein, the terms “individual” , “subject, ” “host” and “patient” are used interchangeably herein and refer to any subject for whom diagnosis, treatment or therapy is desired. In some embodiments, the subject is a mammal. In some embodiments, the subject is a human being.

[0155] As used herein, “treat” , “treating” or “treatment” of a disease or disorder means accomplishing one or more of the following: (a) reducing the severity and / or duration of the disorder; (b) limiting or preventing development of symptoms characteristic of the disorder (s) being treated; (c) inhibiting worsening of symptoms characteristic of the disorder (s) being treated; (d) limiting or preventing recurrence of the disorder (s) in patients that have previously had the disorder (s) ; and (e) limiting or preventing recurrence of symptoms in patients that were previously symptomatic for the disorder (s) .

[0156] As used herein, ratio of polynucleotide (e.g., RNA or DNA) refers to the mass ratio of the polynucleotide molecule.

[0157] Treatment of β-hemoglobinopathies

[0158] β-hemoglobinopathies include β-thalassemia and sickle cell disease (SCD) . β-thalassemia is a blood disorder that reduces the production of hemoglobin. Hemoglobin is the iron-containing protein in red blood cells that carries oxygen to cells throughout the body. A lack of β-globin leads to a reduced amount of functional hemoglobin. In a subject with β-thalassemia, low levels of hemoglobin lead to a lack of oxygen in many parts of the body. Without sufficient hemoglobin, red blood cells do not develop normally, causing a shortage of mature red blood cells. The low number of mature red blood cells leads to anemia, which can cause pale skin, weakness, fatigue, and more serious complications. People with β-thalassemia are at an increased risk of developing abnormal blood clots. β-thalassemia is classified into two types depending on the severity of symptoms: thalassemia major (also known as Cooley's anemia) and thalassemia intermedia. Of the two types, thalassemia major is more severe. The signs and symptoms of thalassemia major appear within the first two years of life. Children develop life-threatening anemia. They do not gain weight and grow at the expected rate (failure to thrive) and may develop yellowing of the skin and whites of the eyes (jaundice) . Affected individuals may have an enlarged spleen, liver, and heart, and their bones may be misshapen. Some adolescents with thalassemia major experience delayed puberty. Many people with thalassemia major have such severe symptoms that they need frequent blood transfusions to replenish their red blood cell supply. Over time, an influx of iron-containing hemoglobin from chronic blood transfusions can lead to a buildup of iron in the body, resulting in liver, heart, and hormone problems. Thalassemia intermedia is milder than thalassemia major. The signs and symptoms of thalassemia intermedia appear in early childhood or later in life. Affected individuals have mild to moderate anemia and may also have slow growth and bone abnormalities.

[0159] Mutations in the hemoglobin gene cause β-thalassemia. Some mutations in the hemoglobin gene prevent the production of any β-globin. The absence of β-globin is referred to as β-zero (β0) thalassemia. Other hemoglobin gene mutations allow some β-globin to be produced but in reduced amounts. A reduced amount of β-globin is called β-plus (β+) thalassemia. The degree of impaired HbA production, resulting from the extent of incomplete (β+) or absent (β0) β-globin expression, determines the severity of β-thalassemia. Reduction in β-globin production results in an accumulation of excess, uncomplexed α-globin in erythroblasts. The clinical implications of this α-globin / β-globin imbalance includes (1) hemolysis leading to a lack of sufficient erythrocytes and Hb to effectively transport oxygen throughout the body; (2) oxidative damage of the cell membrane, thereby resulting in apoptosis of erythrocyte precursors and therefore ineffective erythropoiesis; and (3) ineffective erythropoiesis which leads to morbidities such as splenomegaly, bone marrow expansion, concomitant bone deformities, and iron overload.

[0160] An increased HbF level is an ameliorating and protecting factor in β thalassemia in patients with non-transfusion-dependent thalassemia (NTDT) where HbF levels can be measured (Musallam, K.M. et al. 2013) .

[0161] Increased γ-globin production mitigates the pathology resulting from excess unpaired α-globin and the α / β-protein imbalance that is a hallmark of β-thalassemia. As a result, there are improvements in the ineffective erythropoiesis seen in the disease, decreased hemolysis, and increased total hemoglobin levels from the improved survival of erythrocytes containing higher levels of HbF. There appears to be no minimum threshold of HbF that is associated with lower morbidity in patients with β thalassemia, as any amount of HbF appeared to be beneficial in non-transfusion-dependent patients with β-thalassemia intermedia (Musallam, K.M. et al. 2013) . Resultant decrease in ineffective erythropoiesis due to increased HbF levels may also have a positive effect on iron overload and end-organ damage.

[0162] Sickle cell disease (SCD) is a group of disorders that affects hemoglobin, the molecule in red blood cells that delivers oxygen to cells throughout the body. Subjects with this disorder have atypical hemoglobin molecules called hemoglobin S, which can distort red blood cells into a sickle, or crescent, shape.

[0163] Signs and symptoms of SCD usually begin in early childhood. Characteristic features of this disorder include a low number of red blood cells (anemia) , repeated infections, and periodic episodes of pain. The severity of symptoms varies from person to person. Some subjects have mild symptoms, while others are frequently hospitalized for more serious complications.

[0164] SCD is a chronic disease, characterized by recurrent acute vaso-occlusive crisis that lead to acute pain, chronic hemolysis, anemia, progressive tissue injury, and organ dysfunction. The disease affects multiple organs causing acute and chronic complications such as acute chest syndrome, stroke, priapism, splenic sequestration, osteonecrosis, renal failure, pulmonary hypertension, liver disease, bone damage, limited growth, increased susceptibility to infections, fatigue, and progressive cognitive decline.

[0165] The signs and symptoms of SCD are caused by the sickling of red blood cells. When red blood cells sickle, they break down prematurely, which can lead to anemia. Anemia can cause shortness of breath, fatigue, and delayed growth and development in children. The rapid breakdown of red blood cells may also cause yellowing of the eyes and skin, which are signs of jaundice. Painful episodes can occur when sickled red blood cells, which are stiff and inflexible, get stuck in small blood vessels. These episodes deprive tissues and organs of oxygen-rich blood and can lead to organ damage, especially in the lungs, kidneys, spleen, and brain. A particularly serious complication of SCD is high blood pressure in the blood vessels that supply the lungs (pulmonary hypertension) . Pulmonary hypertension occurs in about one-third of adults with SCD and can lead to heart failure.

[0166] Mutations in the hemoglobin gene cause SCD. Hemoglobin consists of four protein subunits, typically, two subunits called alpha-globin and two subunits called beta-globin. The hemoglobin gene provides instructions for making beta-globin. Beta-globin is a component (subunit) of hemoglobin. Hemoglobin consists of four protein subunits, typically two subunits of  beta-globin and two subunits of another protein called alpha-globin. Various versions of beta-globin result from different mutations in the hemoglobin gene. One particular hemoglobin gene mutation produces an abnormal version of beta-globin known as hemoglobin S (HbS) . Other mutations in the hemoglobin gene lead to additional abnormal versions of beta-globin such as hemoglobin C (HbC) and hemoglobin E (HbE) .

[0167] β-hemoglobinopathies are the common genetic diseases caused by mutations in hemoglobin subunit beta (HBB) gene locus. Mutations in HBB locus lead to impaired β-globin production which can be compensated via direct restoration of the pathogenic mutations in HBB locus or reactivation of γ-globin expression. While direct correction of pathogenic mutations requires individual drug development for each mutation, reactivation of γ-globin expression is a universal therapeutic strategy covering most β-hemoglobinopathy patients. Gamma globin expression is tightly regulated throughout development and is silenced shortly post-birth by repressors that bind to its promoter regions. Genome-wide association study (GWAS) has identified several transcription repressors and their binding motifs, disruption of which showed elevated γ-globin expression. BCL11A (BCL11 transcription factor A) and ZBTB7A (zinc finger and BTB domain containing 7A, also known as LRF, leukemia / lymphoma-related factor) are the two major repressors of the γ-globin gene expression, responsible for its silencing. Knocking out BCL11A or ZBTB7A protein is not tolerated due to their crucial roles in other biological processes. Alternatively, disrupting the erythroid-specific BCL11A enhancer located in chromosome 2, greatly reduced BCL11A expression in erythroid cells without affecting other lineage development. BCL11A enhancer has two binding motifs that can be recognized by GATA or KLF1 transcription factors, and mutating either motifs could downregulate BCL11A expression.

[0168] Mutating BCL11A or ZBTB7A binding motif located in the regulatory region of HBG locus is another way to reactivate γ-globin expression. One key question associated with γ-globin reactivation strategy is how much fetal hemoglobin (α2γ2, HbF) is required to achieve therapeutic benefit. Studies of β-thalassemia patients with naturally reactivated γ-globin have indicated that the HbF level correlates positively with survival and when HbF levels reach 63.7%, it has 100%specificity in ensuring the absence of morbidity. Therefore, it is important to evaluate the efficacy of different reactivation strategies, ensuring a potent protective level of HbF. The present disclosure provides method to increase HbF level.

[0169] Engineered cells and compositions

[0170] The present disclosure identifies novel mutations at multiple editing sites within the BCL11A binding motif in the promoter site of HBG-1 gene or HBG-3. Cells with these identified mutations would have elevated γ-globin expression compared to other mutations.

[0171] As shown in Example 4, when using the same sgHBG-1 targeting the cis-motif but edited by ABE8e, though the editing efficiency reached over 90%, it resulted in much less γ-globin than CBE-or SpCas9 nuclease-based editing strategies. Similar observation was reported in a recent study comparing the efficacy of targeting cis-and trans-elements by ABE8e. In the  core motif TGACCA, ABE8e-generated sequence TGGCCG still retained binding affinity with BCL11A, whereas tBE-generated TGATTA completely abolished its interaction. It has been showed that mutating -116A or -113A (A5 and A8 for sgHBG-1, Figure 4A) only reduced the binding affinity by ～3.7 or 1.6 fold, whereas mutating -115C or -114C (C6 and C7 for sgHBG-1, Figure 4A) greatly decreased the affinity by ～31 or ～55 fold respectively. Together, these data indicate that not only editing efficiency is important, the mutated sequence species also play a pivotal role in determining the final level of γ-globin reactivation.

[0172] In an aspect, the present disclosure provides an engineered cell comprising a genetic modification within a hemoglobin subunit gamma 1 (HBG-1) gene promoter site, wherein the genetic modification is between TSS -118 bp and TSS -113 bp, and wherein the nucleotide sequence between TSS -118 bp and TSS -113 bp at the genetic modification site is any one of SEQ ID NOs: 1-5. In some embodiments, the nucleotide sequence between TSS -118 bp and TSS -113 bp at the genetic modification site is any one of SEQ ID NOs: 2-4.

[0173] In another aspect, the present disclosure provides an engineered cell comprising a genetic modification within a hemoglobin subunit gamma 3 (HBG-3) gene promoter site, wherein the genetic modification is between TSS -202 bp and TSS -194 bp, and wherein the nucleotide sequence between TSS -202 bp and TSS -194 bp at the genetic modification site is any one of SEQ ID NOs: 6-14.

[0174] In some embodiments, the engineered cell described herein is a hematopoietic stem cell or a hematopoietic progenitor cell.

[0175] In some embodiments, the genetic modification is introduced by a transformer base editor (tBE) gene editing system. In some embodiments, the tBE gene editing system is any one of version 1-5 of the tBE system disclosed by Wang, Lijie, et al. "Eliminating base-editor-induced genome-wide and transcriptome-wide off-target mutations. " Nature Cell Biology 23.5 (2021) : 552-563.

[0176] In another aspect, the present disclosure provides a composition comprising the engineered cell described herein.

[0177] In some embodiments, the composition described herein further comprises a cryopreservation medium. Cryopreservation is the use of very low temperatures to preserve structurally intact living cells and tissues for a long period of time. In some embodiments, the cryopreservation process is (1) slow freezing; (2) vitrification, which involves the solidification of the aqueous milieu of the cell or tissue into a noncrystalline glassy phase; or (3) subzero nonfreezing storage. In some embodiments, a cryopreservation process comprises (1) : the mixing of cryopreservation agent with cells or tissues before cooling; (2) cooling of the cells or tissues to a low temperature and its storage; (3) warming of the cells or tissues; and (4) removal of cryopreservation agent from the cells or tissues after thawing.

[0178] In some embodiments, the composition described herein is a pharmaceutically acceptable composition. In some embodiments, the composition comprises a physiologically tolerable carrier together with the cell composition. In some cases, the therapeutic composition is not substantially immunogenic when administered to a mammal or human patient for therapeutic purposes, unless so desired. In some embodiments, the composition further comprises an osmotic buffer that permits cell membrane integrity to be maintained, and optionally, nutrients to maintain cell viability or enhance engraftment upon administration. Such formulations and are known to those of skill in the art and / or can be adapted for use with the engineered cells described herein using routine experimentation.

[0179] As used herein, the term “composition” includes, but is not limited to, a pharmaceutical composition. A “pharmaceutical composition” refers to an active pharmaceutical agent formulated in pharmaceutically acceptable or physiologically acceptable solutions for administration to a cell or an animal, either alone, or in combination with one or more other modalities of therapy. It will also be understood that, if desired, the compositions of the invention may be administered in combination with other agents, such as, e.g., cytokines, growth factors, hormones, small molecules, chemotherapeutics, pro-drugs, drugs, antibodies, or other various pharmaceutically active agents. There is virtually no limit to other components that may also be included in the compositions, provided that the additional agents do not adversely affect the ability of the composition to deliver the intended therapy. The phrase “pharmaceutically acceptable” is used herein to refer to those compounds, materials, compositions, and / or dosage forms which are, within the scope of sound medical judgment, suitable for use in contact with the tissues of human beings and animals without excessive toxicity, irritation, allergic response, or other problem or complication, commensurate with a reasonable benefit / risk ratio.

[0180] The compositions may also comprise a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or excipient. As used herein “pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or excipient” includes, without limitation, any adjuvant, carrier, excipient, glidant, sweetening agent, diluent, preservative, dye / colorant, flavor enhancer, surfactant, wetting agent, dispersing agent, suspending agent, stabilizer, isotonic agent, solvent, surfactant, or emulsifier which has been approved by the United States Food and Drug Administration as being acceptable for use in humans or domestic animals. Exemplary pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, to sugars, such as lactose, glucose, and sucrose; starches, such as corn starch and potato starch; cellulose, and its derivatives, such as sodium carboxymethyl cellulose, ethyl  cellulose, and cellulose acetate; tragacanth; malt; gelatin; talc; cocoa butter; waxes; animal and vegetable fats; paraffins; silicones; bentonites; silicic acid; zinc oxide; oils, such as peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil, and soybean oil; glycols, such as propylene glycol; polyols, such as glycerin, sorbitol, mannitol, and polyethylene glycol; esters, such as ethyl oleate, and ethyl laurate; agar; buffering agents, such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide; alginic acid; pyrogen-free water; isotonic saline; Ringer's solution; ethyl alcohol; phosphate buffer solutions; and any other compatible substances employed in pharmaceutical formulations.

[0181] The liquid pharmaceutical compositions, whether they be solutions, suspensions or other like form, may include one or more of the following: sterile diluents such as water for injection, saline solution, preferably physiological saline; Ringers solution; isotonic sodium chloride; fixed oils such as synthetic mono or diglycerides which may serve as the solvent or suspending medium; polyethylene glycols; glycerin; propylene glycol or other solvents; antibacterial agents, such as benzyl alcohol or methyl paraben; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents, such as ethylenediaminetetraacetic acid; buffers such as acetates, citrates, or phosphates; and agents for the adjustment of tonicity, such as sodium chloride or dextrose. The parenteral preparation can be enclosed in ampoules, disposable syringes, or multiple dose vials made of glass or plastic. An injectable pharmaceutical composition is preferably sterile.

[0182] The composition may be suitably developed for intravenous or another route of administration.

[0183] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating β-hemoglobinopathies in a subject, comprising administering the engineered cell described herein and / or the composition described herein to the subject. In some embodiments, the engineered cell is autologous. In some embodiments, the engineered cell is allogeneic.

[0184] “Allogeneic” means that the cell is obtained from one or more different donors of the same species, where the genes at one or more loci are not identical. For example, a hematopoietic stem or progenitor cell population being administered to a subject can be derived from one or more unrelated donor subjects, or from one or more non-identical siblings. In some cases, syngeneic hematopoietic progenitor cell populations can be used, such as those obtained from genetically identical animals, or from identical twins. “Autologous” means that the cell is obtained or isolated from a subject and administered to the same subject, i.e., the donor and recipient are the same.

[0185] Modes of administration include injection, infusion, instillation, or ingestion. “Injection” includes, without limitation, intravenous, intramuscular, intra-arterial, intrathecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subcutaneous, subcuticular, intraarticular, sub capsular, subarachnoid, intraspinal, intracerebro spinal, and intrasternal injection and infusion. In some examples, the route is intravenous. For the delivery of cells, administration by injection or infusion can be made.

[0186] Genetic engineering of HSPC with tBE

[0187] Several CRISPR-based gene editing strategies have been developed to reactivate γ-globin expression for treating β-hemoglobinopathies. Among them, the earliest developed SpCas9 nuclease-mediated disruption of GATA motif in BCL11A erythroid enhancer has reached clinical trials (NCT0365567868, NCT0374528769) . Although significant progress has been made, safety concerns related to the occurrence of harmful double-stranded breaks and large genomic rearrangements in HSCs remain a crucial issue to address. In addition, a few patients still required blood transfusion after the treatment, suggesting that the efficacy of SpCas9 nuclease-mediated therapy needs to be further improved.

[0188] The present disclosure provides applying transformer base editor (tBE) systems to HSPCs to systemically dissect the cis-and trans-regulatory motifs for γ-globin reactivation and to reactivate γ-globin expression for treating β-hemoglobinopathies. tBE system avoids the generation of double-strand breaks and is designed to eliminate off-target activity. The present disclosure provides application of a recently developed CBE, transformer base editor (tBE) , whose activity is tightly regulated by a control-release deaminase inhibitor via the colocalization of an sgRNA and a helper sgRNA (hsgRNA) to eliminate off-target activity. It was found that tBE editing at BCL11A binding motif within the HBG1 / 2 promoter region triggered the highest level of γ-globin, compared to editing other regulatory motifs. More importantly, by direct comparison of tBE-mediated editing with other clinical or preclinical editing strategies using Cas9 nuclease, hA3A-CBEs or ABE8e, it was found that tBE-modified BCL11A binding motif (TGACCA to TGATTA) induced higher HbF level than others and the editing persisted in the long-term repopulated stem cells. Through biochemical analysis of BCL11A binding affinity against the mutated motifs, it was found that tBE-generated TGATTA motif completely abolished its interaction with BCL11A, whereas ABE8e-generated TGGCCG motif only partially reduced BCL11A binding and the residual binding could still contribute to the inhibition of γ-globin expression. Last, gRNA-dependent and gRNA-independent DNA and RNA off-target profiles were examined, and no detectable off-target mutations were found in tBE-edited cells. Collectively, the present disclosure provides a safer and more potent treatment strategy for β-hemoglobinopathies.

[0189] The present disclosure provides that when directly mutating the cis-BCL11A binding motif in the HBG1 / 2 promoter region, tBE-edited cells exhibited higher level of γ-globin reactivation than mutating the GATA motif within the BCL11A erythroid enhancer. When using SpCas9 nuclease targeting the GATA motif within BCL11A erythroid enhancer in HSPCs, lower level of HbF than tBE-mediated disruption of the BCL11A binding motif was observed. The difference is likely attributed to the residual BCL11A expression driven by its native promoters or other motifs within the enhancer, as highlighted by GWAS showing the existence of several loci in TSS +55, +58 and +62 of BCL11A gene.

[0190] ZBTB7A is a repressor to regulate globin silencing. Clonal analysis in HUDEP-2 cells showed that simultaneously knocking out ZBTB7A and BCL11A genes exhibited a significantly greater HbF than did the single knockout. In HSPCs, tBE-based dual editing of the  ZBTB7A and BCL11A binding motif did not induce more γ-globin than single editing. It is possible that a threshold level of editing at the ZBTB7A binding motif is required to observe additive effect. In the TSS -200 bp ZBTB7A binding motif, due to the lack of an NGG PAM, the SpG variant was used in the tBE system, resulting lower editing efficiency (～ 30%) with a NG PAM. In addition, studies using base editors to modify ZBTB7A binding motif found that when mutating -198T>C by ABE, it created a de novo binding motif for the KLF1 activator and led to a strong γ-globin reactivation.

[0191] A transformer base editor (tBE) is a CRISPR-based gene editing system which can edit a bases such as cytosine or adenosine in target regions with high specificity, preferably with no observable off-target mutations. In some embodiments, the transformer base editor (tBE) system comprises a CRISPR-associated protein (Cas protein) fused with a deaminase, a deaminase inhibitor domain, and a split-TEV protease. Thus, tBE remains inactive at off-target sites with a cleavable fusion of the deaminase inhibitor domain and eliminates unintended off-target mutations. Only when binding at on-target sites, tBE is transformed to cleave off the deaminase inhibitor domain and catalyzes targeted deamination for precise editing. A tBE system described by Wang et al. uses one main gRNA (mgRNA) to bind at the target genomic site and one helper gRNA (hgRNA) to bind at a nearby region (preferably upstream to the target genomic site) . The binding of the two gRNAs can guide the components of tBE system to correctly assemble at the target genomic site for base editing. Some embodiments of the tBE system have been described in Wang, Lijie, et al. "Eliminating base-editor-induced genome-wide and transcriptome-wide off-target mutations. " Nature Cell Biology 23.5 (2021) : 552-563, as well as in international applications PCT / CN2023 / 096482, PCT / CN2022 / 133324, and PCT / CN2023 / 113793, the contents of which are incorporated herein by their entireties.

[0192] In an aspect, the present disclosure provides a method for engineering a hematopoietic stem cell and / or a hematopoietic progenitor cell, comprising administering to the cell one or more transformer base editor (tBE) gene editing systems, wherein each tBE gene editing system comprises

[0193] a main guide RNA (mgRNA) and a helper guide RNA (hgRNA) , or at least one DNA polynucleotide encoding the mgRNA and / or the hgRNA, wherein the mgRNA comprises a mgRNA spacer, and wherein the hgRNA comprises a hgRNA spacer targeting a site upstream of the mgRNA spacer targeting site, wherein the mgRNA spacer targets

[0194] (1) a site within a TSS + 58kb GATA binding motif in a BCL11 transcription factor A (BCL11A) gene,

[0195] (2) a site within a TSS + 55kb KLF1 binding motif in a BCL11A gene,

[0196] (3) a site within a TSS -118 bp to -113 bp BCL11A binding site in the promoter region of an HBG-1 gene,

[0197] (4) a site within a TSS -202bp to -194bp zinc finger and BTB domain containing 7A (ZBTB7A) binding site in the promoter region of an HBG-3, or

[0198] (5) a site within a TSS + 2.5kb ZBTB7A binding site in the 3’ enhancer region of an HBG-1 gene;

[0199] a CRISPR-associated protein (Cas protein) , or a polynucleotide encoding the Cas protein; and

[0200] a nucleobase deaminase or a catalytic domain thereof, or a polynucleotide encoding the nucleobase deaminase or the catalytic domain thereof.

[0201] BCL11A is a transcriptional silencer of γ globin gene expression and hence a negative modulator of HbF. BCL11A is located on Chromosome 2 and ranges from 60, 451, 167-60, 553, 567 base pairs (bp) (GRCh38) . This gene encodes a zinc finger transcription factor that represses fetal hemoglobin (HbF) and downregulates HbF expression starting at about 6 weeks after birth. The BCL11A gene contains four exons, spanning 102.4 kb of genomic DNA and includes a binding domain in intron 2 for the transcription factor GATA-1. GATA-1 binding enhances BCL11A expression which, in turn, represses HbF expression. Intron 2 contains multiple DNase I hypersensitive sites (DHS) , including sites referred to as +55, +58, and +62 based on the distance in kilobases from the transcriptional start site. Of the three regions, the +58 DHS region, appears to be the key region associated with increased fetal Hb levels and also harbors a GATA1 transcriptional control region. GATA transcription factors are a family of transcription factors characterized by their ability to bind to the GATA DNA binding sequence. A GATA binding sequence is located in the +58kb DNA hypersensitive site (DHS) of the BCL11A gene.

[0202] Krueppel-like factor 1 is a protein that in humans is encoded by the KLF1 gene. The gene for KLF1 is on the human chromosome 19 and on mouse chromosome 8. Krueppel-like factor 1 is a transcription factor that is necessary for the proper maturation of erythroid (red blood) cells. KLF1 binds specifically to the "CACCC" motif of the β-globin gene promoter.

[0203] In some embodiments of the method described herein, in each tBE gene editing system the hgRNA further comprises a first CRISPR motif and a first protein-binding motif,

[0204] wherein the mgRNA further comprises a second CRISPR motif and optionally a second protein-binding motif,

[0205] wherein a first and a second Cas protein or a polynucleotide encoding thereof is administered, wherein the first Cas protein binds to the first CRISPR motif, and the second Cas protein binds to the second CRISPR motif,

[0206] wherein the nucleobase deaminase or a catalytic domain thereof is administered in the form of a first fusion protein comprising a nucleobase deaminase or a catalytic domain thereof and a first RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the first fusion protein, wherein the nucleobase deaminase or the catalytic domain thereof and the first RNA binding domain are optionally connected by a linker, and wherein the first RNA binding domain binds to the first protein-binding motif.

[0207] In some embodiments of the method described herein, each tBE gene editing system further comprises

[0208] a protease or a polynucleotide encoding thereof, and

[0209] a nucleobase deaminase inhibitor domain,

[0210] wherein the nucleobase deaminase inhibitor domain is connected to the nucleobase deaminase or the catalytic domain thereof in the first fusion protein optionally by a linker, and wherein there is a cleavage site for the protease between the nucleobase deaminase inhibitor domain and the nucleobase deaminase or the catalytic domain thereof.

[0211] In some embodiments of the method described herein, each tBE gene editing system further comprises

[0212] a second fusion protein comprising the protease and a second RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the second fusion protein,

[0213] wherein the protease and the second RNA binding domain are optionally connected by a linker,

[0214] wherein the mgRNA comprises the second protein-binding motif,

[0215] and wherein the second RNA binding domain binds to the second protein-binding motif.

[0216] In some embodiments of the method described herein, the protease is split into a first protease fragment and a second protease fragment, wherein the first and / or second protease fragment alone is not able to cleave the cleavage site.

[0217] In some embodiments of the method described herein, each tBE gene editing system further comprises

[0218] a second fusion protein comprising the first protease fragment and a second RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the second fusion protein, wherein the first protease fragment and the second RNA binding domain are optionally connected by a linker, and

[0219] a third fusion protein comprising the second protease fragment and a third RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the third fusion protein, wherein the second protease fragment and the third RNA binding domain are optionally connected by a linker,

[0220] wherein the mgRNA further comprises the second protein-binding motif and a third protein-binding motif,

[0221] wherein the second RNA binding domain binds to the second protein-binding motif, and

[0222] wherein the third RNA binding domain binds to the third protein-binding motif.

[0223] In some embodiments of the method described herein, the second and third RNA binding domains are the same or different, and the second and third protein-binding motifs are the same or different.

[0224] In some embodiments of the method described herein, each tBE gene editing system further comprises

[0225] a second fusion protein comprising the first protease fragment and a second RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the second fusion protein,

[0226] wherein the first protease fragment and the second RNA binding domain are optionally connected by a linker,

[0227] wherein the mgRNA further comprises the second protein-binding motif, and

[0228] wherein the second RNA binding domain binds to the second protein-binding motif.

[0229] In some embodiments of the method described herein, the protease is a TEV protease, a TuMV protease, a PPV protease, a PVY protease, a ZIKV protease, or a WNV protease.

[0230] In some embodiments of the method described herein, the protease is a TEV protease comprising a sequence of SEQ ID NO: 25.

[0231] In some embodiments of the method described herein, the first TEV protease fragment comprises a sequence of SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27.

[0232] A “protease” refers to an enzyme that catalyzes proteolysis. A “cleavage site for a protease” refers to a short peptide that the protease recognizes, and within the short peptide creates a proteolytic cleavage. Non-limiting examples of proteases include TEV protease, TuMV protease, PPV protease, PVY protease, ZIKV protease, and WNV protease. The protein sequences of example proteases and their corresponding cleavage sites are provided in Table 2.

[0233] Table 2 Exemplary proteases and their cleavage sites

[0234] In some embodiments, the protease cleavage site is a self-cleaving peptide, such as the 2A peptides. “2A peptides” are 18-22 amino-acid-long viral oligopeptides that mediate “cleavage” of polypeptides during translation in eukaryotic cells. The designation “2A” refers to a specific region of the viral genome and different viral 2As have generally been named after the virus they were derived from. The first discovered 2A was F2A (foot-and-mouth disease virus) , after which E2A (equine rhinitis A virus) , P2A (porcine teschovirus-1 2A) , and T2A (thosea  asigna virus 2A) were also identified. A few non-limiting examples of 2A peptides are provided in SEQ ID NOs: 39-41.

[0235] In some embodiments, the first and / or the second TEV protease fragment is not able to cleave the TEV cleavage site on its own. However, in the presence of the remaining portion of the TEV protease, this fragment will be able to effectuate the cleavage. The TEV fragment may be the TEV N-terminal domain (e.g., SEQ ID NO: 26) or the TEV C-terminal domain (e.g., SEQ ID NO: 27) . In some embodiments, the first TEV protease fragment comprises a sequence of SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the first TEV protease fragment comprises a sequence of SEQ ID NO: 27.

[0236] In some embodiments of the method described herein, the nucleobase deaminase inhibitor is an inhibitory domain of a nucleobase deaminase. A “nucleobase deaminase inhibitor” or an “inhibitory domain” refers to a protein or a protein domain that inhibits the deaminase activity of a nucleobase deaminase.

[0237] In some embodiments of the method described herein, the nucleobase deaminase inhibitor is an inhibitory domain of a cytidine deaminase or an adenosine deaminase.

[0238] In some embodiments of the method described herein, the inhibitory domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 or SEQ ID NO: 43 or any one of SEQ ID NOs: 51-138.

[0239] In some embodiments of the method described herein, the nucleotide deaminase is a cytidine deaminase.

[0240] “Cytidine deaminase” refers to enzymes that catalyze the hydrolytic deamination of cytidine and deoxycytidine to uridine and deoxyuridine, respectively. Cytidine deaminases maintain the cellular pyrimidine pool. A family of cytidine deaminases is APOBEC ( “apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like” ) . Members of this family are C-to-U editing enzymes. Some APOBEC family members have two domains, one domain of APOBEC like proteins is the catalytic domain, while the other domain is a pseudocatalytic domain. More specifically, the catalytic domain is a zinc dependent cytidine deaminase domain and is important for cytidine deamination. RNA editing by APOBEC-1 requires homodimerisation and this complex interacts with RNA binding proteins to form the editosome.

[0241] Non-limiting examples of APOBEC proteins include APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G, APOBEC3H, APOBEC4, and activation-induced (cytidine) deaminase (AID) .

[0242] Various mutants of the APOBEC proteins are also known that have brought about different editing characteristics for base editors. For instance, for human APOBEC3A, certain mutants (e.g., W98Y, Y130F, Y132D, W104A, D131Y and P134Y) even outperform the wildtype human APOBEC3A in terms of editing efficiency or editing window. Accordingly, the term APOBEC and each of its family member also encompasses variants and mutants that have certain level (e.g., 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%) of sequence identity to the corresponding wildtype APOBEC protein or the catalytic domain and retain the cytidine  deaminating activity. The variants and mutants can be derived with amino acid additions, deletions and / or substitutions. Such substitutions, in some embodiments, are conservative substitutions.

[0243] In some embodiments of the method described herein, the cytidine deaminase is selected from the group consisting of APOBEC3B (A3B) , APOBEC3C (A3C) , APOBEC3D (A3D) , APOBEC3F (A3F) , APOBEC3G (A3G) , APOBEC3H (A3H) , APOBECI (Al) , APOBEC3 (A3) , APOBEC2 (A2) , APOBEC4 (A4) , and AICDA (AID) .

[0244] In some embodiments of the method described herein, the cytidine deaminase is a human or mouse cytidine deaminase.

[0245] In some embodiments, the cytidine deaminase comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 252-287.

[0246] In some embodiments, the cytidine deaminase is a naturally occurring cytidine deaminase, an engineered cytidine deaminase, an evolved cytidine deaminase, or an adenosine deaminase that possesses cytidine deaminase activity.

[0247] In some embodiments, the catalytic domain of the cytidine deaminase is a mouse A3 cytidine deaminase domain 1 (mA3-CDAl) or human A3B cytidine deaminase domain 2 (hA3B-CDA2) .

[0248] Table 3 shows 44 proteins / domains that have significant sequence homology to mA3-CDA2 core sequence and Table 4 shows 43 proteins / domains that have significant sequence homology to hA3B-CDA1. All of these proteins and domains, as well as their variants and equivalents, are contemplated to have nucleobase deaminase inhibition activities.

[0249] Table 3

[0250] Table 4

[0251] The term "nucleobase deaminase" as used herein, refers to a group of enzymes that catalyze the hydrolytic deamination of nucleobases such as cytidine, deoxycytidine, adenosine and deoxyadenosine. Non-limiting examples of nucleobase deaminases include cytidine deaminases and adenosine deaminases.

[0252] Some of the nucleobase deaminases have a single, catalytic domain, while others also have other domains, such as an inhibitory domain as described in WO2020156575A1. In some embodiments, therefore, the gene editing system disclosed herein only includes the catalytic domain, such as mouse A3 cytidine deaminase domain 1 (mA3-CDA1, SEQ ID NO: 44) and human A3B cytidine deaminase domain 2 (hA3B-CDA2, SEQ ID NO: 45) . In some embodiments, the gene editing system disclosed herein includes at least a catalytic core of the catalytic domain. For instance, when mA3-CDA1 was truncated at residues 196 / 197 the CDA1 domain still retained substantial editing efficiencies.

[0253] Table 5

[0254] In some embodiments of the method described herein, the nucleotide deaminase is an adenosine deaminase. “Adenosine deaminase” refers to an enzyme of the purine metabolism which catalyzes the irreversible deamination of adenosine and deoxyadenosine to inosine and deoxyinosine, respectively.

[0255] In some embodiments of the method described herein, the adenosine deaminase is selected from the group consisting of tRNA-specific adenosine deaminase (TadA) , adenosine deaminase tRNA specific 1 (ADAT1) , adenosine deaminase tRNA specific 2 (ADAT2) , adenosine deaminase tRNA specific 3 (ADAT3) , adenosine deaminase RNA specific B1 (ADARB1) , adenosine deaminase RNA specific B2 (ADARB2) , adenosine monophosphate deaminase 1 (AMPD1) , adenosine monophosphate deaminase 2 (AMPD2) , adenosine monophosphate deaminase 3 (AMPD3) , adenosine deaminase (ADA) , adenosine deaminase 2 (ADA2) , adenosine deaminase like (ADAL) , adenosine deaminase domain containing 1 (ADAD1) , adenosine deaminase domain containing 2 (ADAD2) , and adenosine deaminase RNA specific (ADAR) .

[0256] In some embodiments of the method described herein, the adenosine deaminase is a human or mouse adenosine deaminase.

[0257] In some embodiments, the adenosine deaminase comprises an amino acid sequence any one of SEQ ID NOs: 159-251.

[0258] In some embodiments, the adenosine deaminase is a naturally occurring adenosine deaminase, an engineered adenosine deaminase, an evolved adenosine deaminase, or a cytidine deaminase that possesses adenosine deaminase activity.

[0259] In some embodiments, the adenosine deaminase is a human or mouse adenosine deaminase.

[0260] In some embodiments, the first fusion protein comprises one or more nucleotide deaminase, and the one or more nucleotide deaminase are the same or different.

[0261] In some embodiments, each of the one or more nucleotide deaminase is a cytidine deaminase or an adenosine deaminase.

[0262] In some embodiments, the nucleotide deaminase is a fusion of at least one cytidine deaminase and at least one adenosine deaminase.

[0263] In some embodiments of the method described herein, the first fusion protein further comprises an uracil glycosylase inhibitor (UGI) .

[0264] The “Uracil Glycosylase Inhibitor” (UGI) , which can be prepared from Bacillus subtilis bacteriophage PBS1, is a small protein (9.5 kDa) which inhibits E. coli uracil-DNA glycosylase (UDG) as well as UDG from other species. Inhibition of UDG occurs by reversible protein binding with a 1: 1 UDG: UGI stoichiometry. UGI is capable of dissociating UDG-DNA complexes. A non-limiting example of UGI is found in Bacillus phage AR9 (YP_009283008.1) . In some embodiments, the UGI comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 or has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%or 95%sequence identity to SEQ ID NO: 46 and retains the uracil glycosylase inhibition activity.

[0265] In some embodiments of the method described herein, the Cas protein is a Cas9, a dead Cas9 (dCas9) , or a Cas9 nickase (nCas9) selected from the group consisting of SpCas9, FnCas9, St1Cas9, St3Cas9, NmCas9, SaCas9, AsCpfl, LbCpfl, FnCpfl, VQR Cas9, EQR Cas9, VRER Cas9, Cas9-NG, xCas9, eCas9, SpCas9-HF1, HypaCas9, HiFiCas9, sniper-Cas9, SpG, SpRY, KKH SaCas9, CjCas9, Cas9-NRRH, Cas9-NRCH, Cas9-NRTH, SsCpfl, PcCpfl, BpCpfl, LiCpfl, PmCpfl, Lb2Cpf1, PbCpfl, PbCpfl, PeCpf1, PdCpf1, MbCpf1, EeCpf1, CmtCpf1, BsCpfl, BhCasl2b, AkCasl2b, BsCasl2b, AmCasl2b, AaCasl2b, RfxCasl3d, LwaCasl3a, PspCasl3b, PguCasl3b, and RanCasl3b. Certain sequences of Cas proteins are provided in SEQ ID NOs: 367-416.

[0266] The term “Cas protein” or “clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) -associated (Cas) protein” refers to RNA-guided DNA endonuclease enzymes associated with the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) adaptive immunity system in Streptococcus pyogenes, as well as other bacteria. Cas proteins include Cas9 proteins, Cas12a (Cpf1) proteins, Cas12b (formerly known as C2c1) proteins, Cas13 proteins and various engineered counterparts. Example Cas proteins include SpCas9, FnCas9, St1Cas9, St3Cas9, NmCas9, SaCas9, AsCpfl, LbCpfl, FnCpfl, VQR Cas9, EQR Cas9, VRER Cas9, Cas9-NG, xCas9, eCas9, SpCas9-HF1, HypaCas9, HiFiCas9, sniper-Cas9, SpG, SpRY, KKH SaCas9, CjCas9, Cas9-NRRH, Cas9-NRCH, Cas9-NRTH, SsCpfl, PcCpfl, BpCpfl, LiCpfl, PmCpfl, Lb2Cpf1, PbCpfl, PbCpfl, PeCpf1, PdCpf1, MbCpf1, EeCpf1, CmtCpf1, BsCpfl, BhCasl2b, AkCasl2b, BsCasl2b, AmCasl2b, AaCasl2b, RfxCasl3d, LwaCasl3a, PspCasl3b, PguCasl3b, RanCasl3b, and those provided in Table 6 below.

[0267] Table 6 Exemplary Cas Proteins

[0268] In some embodiments, the Cas protein is a Cas9, a dead Cas9 (dCas9) , or a Cas9 nickase (nCas9) .

[0269] In some embodiments of the method described herein, the Cas protein is a spCas9 D10A. In some embodiments, the Cas protein is a nCas9. In some embodiments, the nCas9 protein is a nCas9-D10A protein. In some embodiments, the nCas9-D10A protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 47.

[0270] In some embodiments of the method described herein, the first protein-binding RNA motif and the first RNA binding domain, the second protein-binding RNA motif and the second RNA binding domain, and the third protein-binding RNA motif and the third RNA binding domain, are each independently selected from the group consisting of

[0271] a MS2 phage operator stem-loop and MS2 coat protein (MCP) or an RNA-binding section thereof,

[0272] a BoxB and N22P or an RNA-binding section thereof,

[0273] a telomerase Ku binding motif and Ku protein or an RNA-binding section thereof,

[0274] a telomerase Sm7 binding motif and Sm7 protein or an RNA-binding section thereof,

[0275] a PP7 phage operator stem -loop and PP7 coat protein (PCP) or an RNA-binding section thereof,

[0276] a SfMu phage Com stem-loop and Com RNA binding protein or an RNA-binding section thereof, and

[0277] a non-natural RNA aptamer and corresponding aptamer ligand or an RNA-binding section thereof.

[0278] Table 7

[0279] For any protein of the present disclosure, biological equivalents thereof are also provided. In some embodiments, the biological equivalents have at least about 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%sequence identity with the reference protein. Preferably, the biological equivalents retain the desired activity of the reference protein. In some embodiments, the biological equivalents are derived by including one, two, three, four, five, or more amino acid additions, deletions, substitutions, or the combinations thereof. In some embodiments, the substitution is a conservative amino acid substitution.

[0280] In some embodiments of the method described herein, the method comprises administering to the cell a first tBE gene editing system and a second tBE gene editing system,

[0281] wherein the first tBE gene editing system comprises a first mgRNA and a first hgRNA, or at least one DNA polynucleotide encoding the first mgRNA and / or the first hgRNA, wherein the first mgRNA comprises a first mgRNA spacer, and wherein the first hgRNA comprises a first hgRNA spacer targeting a site upstream of the first mgRNA spacer targeting site, wherein the first mgRNA spacer targets

[0282] (1) a site within a TSS + 58kb GATA binding motif in a BCL11 transcription factor A (BCL11A) gene,

[0283] (2) a site within a TSS + 55kb KLF1 binding motif in a BCL11A gene, or

[0284] (3) a site within a TSS -118 bp to -113 bp BCL11A binding site in the promoter region of an HBG-1 gene,

[0285] wherein the second tBE gene editing system comprises a second mgRNA and a second hgRNA, or at least one DNA polynucleotide encoding the second mgRNA and / or the second hgRNA, wherein the second mgRNA comprises a second mgRNA spacer, and wherein the second hgRNA comprises a second hgRNA spacer targeting a site upstream of the second mgRNA spacer targeting site, wherein the second mgRNA spacer targets

[0286] (1) a site within a TSS -202bp to -194bp zinc finger and BTB domain containing 7A (ZBTB7A) binding site in the promoter region of an HBG-3, or

[0287] (2) a site within a TSS + 2.5kb ZBTB7A binding site in the 3’ enhancer region of an HBG-1 gene.

[0288] In some embodiments of the method described herein, at least one RNA is codon optimized. In some embodiments, the RNA is codon-optimized to increase GC content. In some embodiments, the RNA is codon-optimized by replacing rare codons with frequent codons.

[0289] In some embodiments of the method described herein, the tBE gene editing system comprises an mRNA encoding the Cas protein or a DNA encoding the mRNA, wherein the percentage of uridine in the mRNA is 10%-15.5%. In some embodiments of the method described herein, the percentage of uridine in the mRNA is 10%-12.8%.

[0290] In some embodiments of the method described herein, the tBE gene editing system comprises an mRNA encoding the MS2 coat protein (MCP) or a DNA encoding the mRNA, wherein the percentage of uridine in the mRNA is 10%-18.9%.

[0291] In some embodiments, the RNA comprises modified nucleotide. For example, modifications can comprise one or more nucleotides modified at the 2’ position of the sugar, in some aspects a 2’-O-alkyl, 2’-O-alkyl-O-alkyl, or 2’-fluoro-modified nucleotide. In some examples, RNA modifications can comprise 2’-fluoro, 2’-amino or 2’ O-methyl modifications on the ribose of pyrimidines, abasic residues, or an inverted base at the 3’ end of the RNA.

[0292] In some embodiments of the method described herein, the tBE gene editing system comprises a Cas mRNA encoding the Cas protein, and the tBE gene editing system comprises an MCP mRNA encoding the MS2 coat protein (MCP) , wherein the ratio of the Cas mRNA and the MCP mRNA is between 1: 1 and 1: 2. In some embodiments, in the tBE gene editing system, the  ratio of the DNA encoding the Cas mRNA and the DNA encoding the MCP mRNA is between 1: 1 and 1: 2.

[0293] In some embodiments of the method described herein, the ratio of the Cas mRNA and the MCP mRNA is 1: 1.5. In some embodiments, in the tBE gene editing system, the ratio of the DNA encoding the Cas mRNA and the DNA encoding the MCP mRNA is between 1: 1.5.

[0294] In some embodiments of the method described herein, in each tBE gene editing system, the ratio of the mgRNA and the hgRNA is between 1: 0.5 and 1: 2. In some embodiments, the ratio of the DNA encoding the mgRNA and the DNA encoding the hgRNA is between 1: 0.5 and 1: 2.

[0295] In some embodiments of the method described herein, the ratio of the mgRNA and the hgRNA is 1: 1.15. In some embodiments, the ratio of the DNA encoding the mgRNA and the DNA encoding the hgRNA is 1: 1.15.

[0296] In some embodiments of the method described herein, in each tBE gene editing system, the tBE gene editing system comprises a Cas mRNA encoding the Cas protein, and the ratio of the mgRNA and the Cas mRNA is between 1: 1 and 1: 3. In some embodiments of the method described herein, the ratio of the mgRNA and the Cas mRNA is 1: 2.

[0297] In some embodiments of the method described herein, the tBE gene editing system further comprises at least one nuclear localization signal (NLS) or a polynucleotide encoding thereof. In some embodiments, the NLS is located at the 3’-end and / or 5’-end of a protein-coding sequence.

[0298] A “nuclear localization signal or sequence” (NLS) is an amino acid sequence that tags a protein for import into the cell nucleus by nuclear transport. Typically, this signal consists of one or more short sequences of positively charged lysines or arginines exposed on the protein surface. Different nuclear localized proteins may share the same NLS. A non-limiting example of NLS is the internal SV40 nuclear localization sequence (iNLS) . NLSs can be further classified as either monopartite or bipartite. The major structural differences between the two are that the two basic amino acid clusters in bipartite NLSs are separated by a relatively short spacer sequence (hence bipartite -2 parts) , while monopartite NLSs are not.

[0299] In some embodiments of the method described herein, at least one NLS is a bipartite NLS (bp NLS) .

[0300] In some embodiments of the method described herein, at least one NLS is a SV40 NLS. In some embodiments, the NLS has a sequence of SEQ ID NO: 288.

[0301] In some embodiments of the method described herein, at least one NLS is a c-Myc NLS. In some embodiments, the NLS has a sequence of SEQ ID NO: 289.

[0302] In some embodiments of the method described herein, a c-Myc NLS is located at the N-terminus of the Cas protein consecutively, and a bipartite NLS is located at the C-terminus of the Cas protein.

[0303] In some embodiments of the method described herein, the tBE gene editing system comprises a first polynucleotide and a second polynucleotide,

[0304] wherein the first polynucleotide comprising a sequence encoding an MS2 coat protein (MCP) , a sequence encoding a UGI, a sequence encoding a nucleobase deaminase, a sequence encoding a N22p, a sequence encoding a first protease fragment, and a sequence encoding a second protease fragment,

[0305] wherein the second polynucleotide comprises a sequence encoding a Cas protein,

[0306] wherein the first polynucleotide further comprises four sequences each encoding a bipartite NLS, and the four sequences are located between the sequence encoding an MS2 coat protein (MCP) and the sequence encoding a UGI, between the sequence encoding a nucleobase deaminase and the sequence encoding a N22p, between the sequence encoding a first protease fragment and the sequence encoding a second protease fragment, and at the 3’-end of the sequence encoding the second protease fragment,

[0307] wherein the second polynucleotide further comprises a sequence encoding a c-Myc NLS at the 5’-end of the sequence encoding the Cas protein, and a sequence encoding a bipartite NLS at the 3’-end of the sequence encoding the Cas protein.

[0308] In some embodiments, a peptide linker is optionally provided between each of the fragments in any of the fusion proteins. In some embodiments, the peptide linker has from 1 to 100 amino acid residues (or 3-20, 4-15, without limitation) . In some embodiments, at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%or 90%of the amino acid residues of peptide linker are amino acid residues selected from the group consisting of alanine, glycine, cysteine, and serine.

[0309] In an aspect, the present disclosure provides a method for creating a binding motif for a KLF1 activator in the HBG-3 gene in a cell, comprising genetically modifying the thymine (T) at TSS -198bp of the HBG-3 gene to a cytosine. In some embodiments, the genetic modification is carried out with the method described herein.

[0310] In an aspect, the present disclosure provides a method for activating γ-globin expression in a hematopoietic stem cell and / or a hematopoietic progenitor cell, comprising engineering the cell with the method described herein, and / or creating a binding motif for a KLF1 activator in the HBG-3 gene in the cell with the method described herein. As used herein, “activating γ-globin expression” means that the γ-globin expression level is increased after the cell is treated with the method described herein, compared to the γ-globin expression level before the treatment.

[0311] In an aspect, the present disclosure provides a method for treating β-hemoglobinopathies in a subject, comprising engineering the cell in the subject with the method described herein.

[0312] In an aspect, the present disclosure provides a method for treating β-hemoglobinopathies in a subject, comprising activating γ-globin expression in a hematopoietic stem cell and / or a hematopoietic progenitor cell with the method described herein.

[0313] EXAMPLES

[0314] Example 1 Design of tBE gRNAs for efficient base editing across six different regulatory motifs for inducing the highest γ-globin expression.

[0315] Gamma globin expression is a highly orchestrated and complicated process, involving cis-or trans-regulatory motifs to precisely turn on / off its expression. To activate γ-globin expression, several preclinical and clinical studies have been carried out by either disrupting the erythroid enhancer of BCL11A, a transcription repressor for HBG1 / 2, or directly disrupting the repressor binding sites on the promoter region of HBG1 / 2. In the BCL11A enhancer region located at chromosome 2, there are three transcription factor binding motifs (two motifs for KLF1 and one motif for GATA) (TSS +55 kb and TSS +58 kb, Figure 1) , whose binding could substantially increase BCL11A expression in erythroid lineage. In the HBG1 / 2 locus, there are three motifs located in the promoter region or in the 3’ enhancer of HBG1 (TSS -200 bp, TSS -115 bp and TSS +2.5 kb, Figure 1) , which can be recognized by BCL11A or ZBTB7A. sgRNAs targeting these six regulatory motifs were designed (sgBCL11A-1, sgBCL11A-2, sgBCL11A-3, sgHBG-1, sgHBG-2, and sgHBG-3) (Fig. 2) . For each sgRNA, three hsgRNAs were tested based on C-to-T editing efficiency to select the optimal sgRNA / hsgRNA pairs. The selected optimal sgRNA / hsgRNA pairs for the six motifs are respectively: sgBCL11A-1 (SEQ ID NO: 338)  / hsgBCL11A-1_1 (SEQ ID NO: 339) ; sgBCL11A-2 (SEQ ID NO: 340)  / hsgBCL11A-2_3 (SEQ ID NO: 341) ; sgBCL11A-3 (SEQ ID NO: 342)  / hsgBCL11A-3_2 (SEQ ID NO: 343) ; sgHBG-1 (SEQ ID NO: 344)  / hsgHBG-1 (SEQ ID NO: 345) ; sgHBG-2 (SEQ ID NO: 346)  / hsgHBG-2_1 (SEQ ID NO: 347) ; sgHBG-3 (SEQ ID NO: 348)  / hsgHBG-3_2 (SEQ ID NO: 349) . These selected pairs of sgRNA / hsgRNA are used in the following examples.

[0316] In the BCL11A enhancer region, tBE with sgBCL11A-1 converted cytidine (C) at spacer position 6 and 8 (i.e., C6 and C8 sites) respectively. The C8 editing site was not within the GATA binding motif. tBE with sgBCL11A-2 edited KLF1 binding site at C4 and C7 sites respectively. tBE with sgBLC11A-3 also edits KLF1 binding site. In the HBG1 / 2 promoter region, tBE with sgHBG-1 effectively converted C6 and C7 respectively, wherein both sites were within the BCL11A binding motif (TGACCA box) . In the TSS +2.5 kb ZBTB7A binding site, tBE with sgHBG-2 edited at C5 site, locating within the motif. In the TSS -200 bp ZBTB7A binding site, due to the lack of NGG PAM, a SpCas9 variant SpG paired with sgHBG-3 was used in the tBE system to convert four tandem C within the motif (Figure 2) .

[0317] Example 2 RNA delivery of tBE in HSPCs.

[0318] To develop a clinically relevant system for delivering the tBE machinery in HSPCs without enrichment, the RNA expression construct was first codon-optimized and uridine depletion was used to increase base-editing efficiency and reduce genome toxicity. Increasing the mRNA dosage of tBE and its associated sgRNA / hsgRNA ratios could also enhance editing efficiency (Figure 3A) . The tBE system is composed of two messenger RNAs, one encoding a SpCas9 nickase and the other encoding a control-release cytosine deaminase, named as tBE-V5-mA3 (Figure 3B) . When translating into protein, both SpCas9 and tBE-V5-mA3 are required to simultaneously enter nucleus for successful genome editing. Next, several nuclear localization  signals (NLS) were compared, and it was found that when SpCas9 bearing a N-terminal SV40 NLS and a C-terminal bipartite NLS co-delivered with tBE-V5-mA3 bearing 4× bipartite NLS could substantially increase the editing efficiency from 31.2%to 63.0%at C6 and from 46.2%to 81.3%at C7 site, respectively (Figure 3B) . To now, an RNA system has been optimized to successfully deliver tBE into CD34+ HSPCs with high efficiency.

[0319] Example 3 Comparison of tBE-based editing efficiency and γ-globin reactivation with other CRISPR tools in CD34+ HSPCs.

[0320] Several strategies have been developed to reactivate γ-globin, including disrupting BCL11A erythroid enhancer or HBG promoter regions by SpCas9 nuclease or base editors. To compare the currently disclosed strategy with other preclinical and clinical method, a side-by-side experiment was performed including a therapeutic lead gRNA targeting BCL11A erythroid enhancer that has been tested in clinical trials i.e., sgBCL11A-1617. When targeting the BCL11A erythroid enhancer, tBE-based editing exhibited 88.3%on C6 site within the GATA motif, a level comparable to SpCas9 nuclease-induced total indel frequency but with relative purer product (Figure 4A, 6, and 7) . When targeting the BCL11A binding motif in the promoter region of HBG1 / 2, tBE-based editing achieved similar efficiency compared with another CBE, hA3A-BE3, reaching ～80%on C6 and C7 sites but with 3.5 fold lower of indel rate (Figure 4A) . Edited HSPCs were then in vitro differentiated into erythroid cells to measure the γ-globin mRNA and protein expression levels. By using sgHBG-1, CBEs (i.e., tBE and hA3A-BE3) -modified BCL11A binding motif produced significantly more γ-globin mRNA and protein monomer than SpCas9 nuclease-modified BCL11A erythroid enhancer strategy in all four donors tested (Figure 4B-D and 8B) . Analysis of tetramer formation by high performance liquid chromatography (HPLC) also confirmed that tBE-meditated disruption of BCL11A binding motif showed 30.1%more of HbF tetramer than the Cas9 nuclease strategy targeting the BCL11A enhancer, a trans-motif of γ-globin regulation (Figure 4E) . Noted that ABE8e-mediated editing of BCL11A binding motif, although achieved up to 94.2%editing efficiency, it produced the lowest γ-globin expression. The different levels of γ-globin expression triggered by CBE and ABE suggest that the altered motif sequence impact the binding affinity to its repressor.

[0321] Since the HbF level positively correlates with β-thalassemia patients’ survival, the next question to answer is whether mutating two motifs simultaneously could promote more robust γ-globin activation than single editing. While manipulating BCL11A enhancer or directly mutating the binding site of BCL11A in HBG1 / 2 promoter functions in the same pathway, the binding motifs recognized by BCL11A and ZBTB7A in HBG1 / 2 promoter were simultaneously mutated. Though co-editing by sgHBG-1 and sgHBG-3 showed comparable editing efficiency with the single editing control (Figure 8A) , the dual editing strategy did not produce more γ-globin than the single editing as evidenced by comparable mRNA and protein levels (Figure 8B-D) .

[0322] To evaluate whether tBE-edited HSPCs retained repopulation ability and whether the editing persisted over the differentiation process, tBE-edited HSPCs were xenotransplanted into immunodeficient NBSGW mice. After 16 weeks, no significant differences were observed between the edited and the mock-treated HSPCs in terms of engraftment and differentiation  potential (Figure 4F-G and 9) . Moreover, the base-editing efficiency in the engrafted human bone marrow cells was similar to the one in input cells, suggesting that tBE is able to edit repopulating hematopoietic stem cells (HSCs) (Figure 4H) .

[0323] Example 4 Evaluation of DNA damage response and DNA off-target mutation by tBE

[0324] HSCs are highly sensitive to DNA damage such as DSB triggered by SpCas9 nuclease. In response, edited cells initiate p53 pathway as a safeguard to protect against DSBs. As a consequence, cells may undergo cell cycle arrest and apoptosis. When measuring the expression of p21 mRNA, a readout of p53-induced DNA damage response, it was found that SpCas9 nuclease-edited cells induced 6.7 fold upregulation of p21, indicating a strong activation of DNA damage response (Figure 5A) . In sharp contrast, tBE-edited HSPCs exhibited comparable level of p21 to control cells (Figure 5A) . When monitoring cell growth over time, tBE-edited cells also exhibited higher growth rate than the nuclease-edited cells or hA3A-BE3-edited cells (Figure 5B) .

[0325] Protocols and Materials

[0326] CD34+ HSPC culture and in vitro erythroid differentiation

[0327] Purified human CD34+ HSPCs from mobilized peripheral blood were thawed and cultured in SFEM supplemented with 100 ng mL-1 human SCF, 100 ng mL-1 human TPO and 100 ng mL-1 human Flt3-L. HSPCs were seeded and maintained at the density of 5 × 105 mL-1. In vitro erythroid differentiation HSPCs was performed at 24 h post electroporation following the three-step culture protocol. In brief, cells were transferred to erythroid differentiation medium composed of IMDM supplemented with 5%human solvent detergent pooled plasma AB, 1%penicillin-streptomycin, 10 μg mL-1 recombinant human insulin, 3 IU mL-1 heparin, 3 IU mL-1 EPO. In the first step (days 1-7) , additional supplements including 200 μg mL-1 holo-transferrin human, 10 ng mL-1 human SCF, 1 ng mL-1 human IL-3 and 10-6 M hydrocortisone was added to the differentiation medium. In the second step (days 7-11) , the same supplements as in step 1 were added, except that human IL-3 was withdrawn. In the third step (days 11-21) , the concentration of human holo-transferrin was increased to 1 mg mL-1 and human SCF was removed compared with the medium in step 2. The density of cell culture varies with different stages of erythroid differentiation from 1 × 105 to 5 × 106 cells per milliliter.

[0328] gRNA, mRNA preparation and electroporation

[0329] Chemically modified sgRNA (2’-O-methyl 3’ phosphorothioate modifications in the first and last three nucleotides) was synthesized from GenScript. The gDNA sequences used in this study were listed in Table 10. All mRNAs were transcribed in vitro using T7 RNA polymerase. The transcription template was amplified by PCR and a 110-base poly A tail was included in the transcribed PCR product. RQ1 RNase-Free DNase was used to remove the DNA template, and the resulting mRNA was purified using Monarch RNA Cleanup Kit. The mRNA was heat-denatured at 65 ℃ for 5 min before capping with a Cap-1 structure using vaccinia capping system and mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase. The mRNA was purified by cellulose  purification, as described. Purified mRNA was analyzed by agarose gel electrophoresis and was stored at -80℃.

[0330] CD34+ HSPCs were electroporated with mRNA or RNP 24 h post-thaw. Electroporation was performed using Lonza 4D Nucleofector. For 20 μL Nucleocuvette Strips, 0.2 million HSPCs were resuspended in 20 μL B1mix buffer and RNP complex (6 μg SpCas9 protein and 6 μg sgRNA) were added. For mRNA electroporation, unless elsewhere mentioned, mRNA and sgRNA were mixed at the following ratios to the cell suspensions: tBE (3 μg D10A, 4.5 μg tBE-V5-mA3, 6 μg sgRNA, 9 μg hsgRNA) , hA3A-BE3 (4.4 μg hA3A -BE3, 4.8 μg sgRNA) and ABE8e (4.4 μg ABE8e, 4.8 μg sgRNA) .

[0331] RT-qPCR of globin expression

[0332] Total RNA was isolated using TransZol Up Plus RNA Kit and reverse transcribed using HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR. The qPCR reactions were performed in QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System with ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix, cDNA and individual primers. CAT was employed as an internal reference as described previously. GAPDH was used as a reference transcript when measuring p21 mRNA. Primer sequences are provided in Table 11.

[0333] HPLC analysis of globin chains and hemoglobin tetramers

[0334] Globin chains of in vitro differentiated erythroid cells were analyzed via Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) method following established protocol (Chalumeau 2021) . Briefly, at least 250,000 in vitro differentiated erythroid cells were lysed in ice-cold MilliQ deionized water, and HPLC samples prepared from the lysate were separated with a 250 × 4.6-mm, 3.6-μm Aeris Widepore column (Phenomenex) over a 95 min gradient on a NexeraX2 HPLC System. The HPLC system was extensively cleaned with blank injections between samples to minimize any carryover. The relative abundance of individual globin chains was monitored by light absorbance at 220 nm and calculated as the area under the curve (AUC) . Hemoglobin tetramers were separated and analyzed with D-10TM Hemoglobin Analyzer following manufacturer’s manual.

[0335] Xenotransplantation in NBSGW mice

[0336] NOD. Cg-KitW-41J Tyr+ Prkdcscid Il2rgtm1Wjl (NBSGW) mice were purchased from Jackson Laboratory (Stock 026622) . Female NBSGW mice (7-8 weeks) were intravenously injected with 0.5-0.8 million CD34+ HSPCs. After 16 weeks of engraftment, bone marrow was collected from NBSGW mice. For flow cytometry analysis, bone marrow cells were incubated with Human TruStain FcXTM (Fc Receptor Blocking Solution) (BioLegend, 1: 20) and TruStain FcXTM (anti-mouse CD16 / 32, 1: 50) antibody for 10 min on ice. After Fc receptor blocking, bone marrow cells were stained with APC / Cyanine7 anti-human CD45 Antibody (Biolegend, 1: 20) , APC anti-mouse CD45 Antibody (Biolegend, 1: 100) , Pacific BlueTM anti-human CD34 Antibody (Biolegend, 1: 50) , FITC anti-human CD235ab Antibody (Biolegend, 1: 50) , PerCP / Cyanine5.5 anti-human CD33 Antibody (Biolegend, 1: 200) , PE / Cyanine7 anti-human CD19 Antibody (Biolegend, 1: 100) and PE anti-human CD3 Antibody (Biolegend, 1: 50) on ice for 15 minutes in the dark. After washing with 1%BSA dPBS, cells were analyzed by Novocyte.

[0337] Flow cytometry for F-cell

[0338] During in vitro erythroid differentiation, cells collected on day 11 were analyzed for their expression of fetal hemoglobin by FACS. Cells were fixed in 0.05%Glutaraldehyde for 10 min at room temperature (16-25℃) and then permeabilized in 0.1%Triton X-100 for 5 min at room temperature. Cells were stained with anti-human Fetal Hemoglobin Monoclonal Antibody (1: 20) and analyzed by Novocyte.

[0339] Protein expression and purification

[0340] The recombinant plasmid pET28a-SpCas9 was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) cells for protein expression. The cells were cultured in Luria-Bertani (LB) medium at 37 ℃ until the OD600 reached 0.6～0.8. The cultures were then incubated for 16-20 h at 16 ℃in the presence of 0.2 mM IPTG before being harvested by centrifugation at 5,000 g for 5 min. The cells were then re-suspended in buffer A (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM TCEP) and lysed by sonication. After centrifugation, the clarified cell lysate was loaded onto a Ni-NTA column (Cytiva) pre-equilibrated with buffer A. The column was then extensively washed with buffer A and eluted with buffer B (20 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM TCEP, 10%glycerol, 200 mM Imidazole) . Elution fractions were then further purified on a HiTrap SP Sepharose column (Cytiva) before being loaded onto a Superdex 200 increase 10 / 300 GL column (Cytiva) in buffer C (20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM KCl and 1 mM TCEP) . The purified protein was then concentrated, aliquoted and stored at -80℃ until further use.

[0341] The DNA fragment encoding Znf4-6 (residues 731-835) of B-cell lymphoma / leukemia 11A (BCL11A) (UniProt ID: Q9H165) was synthesized (GenScript) and cloned into a modified pGEX-4T1 vector (Cytiva) wherein the thrombin protease site was replaced with a HRV 3C protease site. The recombinant plasmid was then transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) cells for protein expression. The cells were cultured in LB medium supplemented with 100 μM ZnSO4 at 37 ℃ until the OD600 reached 1.2. The cultures were then incubated for another 24 h at 16 ℃ in the presence of 0.2 mM IPTG before being harvested by centrifugation at 5,000 g for 5 min. The cells were then re-suspended in buffer D (20 mM Tris, pH 7.5, 1 M NaCl) and lysed with a NANO homogenizer (ATS Engineering Limited) at 800 bar, 4 ℃. After centrifugation, the clarified cell lysate was incubated with glutathione Sepharose resin (Cytiva) pre-equilibrated with buffer D, and the GST-tagged proteins were eluted by buffer D supplemented with 30 mM reduced glutathione. Elution fractions were then pooled and treated with HRV 3C protease to remove the N-terminal GST tag. The cleaved protein was further purified via size-exclusion chromatography on a HiLoad 16 / 60 Superdex 75 column (GE Healthcare) in buffer D. The purified protein was concentrated, dialyzed against buffer E (20 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl) , and stored at -80℃ until further use.

[0342] DNA library preparation and amplicon sequencing

[0343] To quantify the base editing efficiency,  HS DNA Polymerase was used to amplify the sequence of target site from the genomic DNA. The PCR primers used are listed in Tables 8-9. PCR product was gel purified using FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit. DNA library was prepared following the manufacturer’s instruction manual (NEBNext Ultra II FS  DNA Library Prep Kit, NEB) . The amplicon-containing library was quantified using the iQuantTM dsDNA HS Assay Kit, and the library was sequenced with the Illumina NovaSeq 6000 Sequencing System (2×150) .

[0344] Amplicon sequencing data analysis

[0345] FastQC (v0.11.8, http:  / / www. bioinformatics. babraham. ac. uk / projects / fastqc / , parameters: default) was used to evaluate the raw read qualities. For paired-end sequencing, only R1 reads were used. Adaptor sequences and read sequences with Phred quality score lower than 30 were trimmed. Trimmed reads were then mapped to target sequences using the BWA-MEM algorithm (BWA v0.7.17) . Base substitution and indel frequencies at on-target sites were calculated using methods reported in previously published literature (Li et al., 2018; Wang et al., 2021; Wang et al., 2018) . In brief, base substitutions at every position of the target sites were counted using at least 1000 independent reads. Base substitution frequencies were calculated using the published CFBI pipeline as: count of reads with substitution at the target base  / count of reads covering the target base. In Figure 4, base substitutions were measured by CRISPResso2 (--quantification_window_size 50 --quantification_window_center -10 -q 30 -s25) . The windows used to analysis indels was set as ±50bp of the cleavage site. The bar plot of base editing efficiency was draw by ggplot2.

[0346] To measure unintended indel frequency, reads aligned in the region spanning from 5 nucleotides upstream and downstream to the nicking site (total 10 nt) were selected as the estimated region. Unintended indel frequencies for base substitution were calculated as: count of reads containing at least one unintended inserted and / or deleted nucleotide  / count of total reads aligned in the estimated region.

[0347] Statistical tests

[0348] Statistical analyses were done with GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc. ) . In Figures 2, 6, two-tailed Student’s t-tests was used to analyze statistical significance. In Figures 3 and 4, p values were calculated by paired t test. p value < 0.05 was considered statistically significant.

[0349] Oligo and primer sequences used in this the Examples

[0350] Table 8

[0351] Table 9

[0352] Table 10

[0353] Table 11

[0354] Table 12

[0355] References

[0356] 1. Qiu, H. -Y., Ji, R. -J., and Zhang, Y. (2022) . Current advances of CRISPR-Cas technology in cell therapy. Cell Insight 1.10.1016 / j. cellin. 2022.100067.

[0357] 2. Ferrari, G., Thrasher, A.J., and Aiuti, A. (2021) . Gene therapy using haematopoietic stem and progenitor cells. Nat Rev Genet 22, 216-234.10.1038 / s41576-020-00298-5.

[0358] 3. Ernst, M.P.T., Broeders, M., Herrero-Hernandez, P., Oussoren, E., van der Ploeg, A.T., and Pijnappel, W. (2020) . Ready for Repair? Gene Editing Enters the Clinic for the Treatment of Human Disease. Mol Ther Methods Clin Dev 18, 532-557. 10.1016 / j. omtm. 2020.06.022.

[0359] 4. Wienert, B., Martyn, G.E., Funnell, A.P.W., Quinlan, K.G.R., and Crossley, M. (2018) . Wake-up Sleepy Gene: Reactivating Fetal Globin for beta-Hemoglobinopathies. Trends Genet 34, 927-940.10.1016 / j. tig. 2018.09.004.

[0360] 5. Wilber, A., Nienhuis, A.W., and Persons, D.A. (2011) . Transcriptional regulation of fetal to adult hemoglobin switching: new therapeutic opportunities. Blood 117, 3945-3953. 10.1182 / blood-2010-11-316893.

[0361] 6. Romero, Z., Urbinati, F., Geiger, S., Cooper, A.R., Wherley, J., Kaufman, M.L., Hollis, R.P., de Assin, R.R., Senadheera, S., Sahagian, A., et al. (2013) . beta-globin gene transfer to human bone marrow for sickle cell disease. J Clin Invest 123, 3317-3330. 10.1172 / JCI67930.

[0362] 7. Frangoul, H., Altshuler, D., Cappellini, M.D., Chen, Y.S., Domm, J., Eustace, B.K., Foell, J., de la Fuente, J., Grupp, S., Handgretinger, R., et al. (2021) . CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and beta-Thalassemia. N Engl J Med 384, 252-260. 10.1056 / NEJMoa2031054.

[0363] 8. Bauer, D.E., Kamran, S.C., and Orkin, S.H. (2012) . Reawakening fetal hemoglobin: prospects for new therapies for the beta-globin disorders. Blood 120, 2945-2953. 10.1182 / blood-2012-06-292078.

[0364] 9. Hoban, M.D., Orkin, S.H., and Bauer, D.E. (2016) . Genetic treatment of a molecular disorder: gene therapy approaches to sickle cell disease. Blood 127, 839-848. 10.1182 / blood-2015-09-618587.

[0365] 10. Oneal, P.A., Gantt, N.M., Schwartz, J.D., Bhanu, N.V., Lee, Y.T., Moroney, J.W., Reed, C.H., Schechter, A.N., Luban, N.L., and Miller, J.L. (2006) . Fetal hemoglobin silencing in humans. Blood 108, 2081-2086.10.1182 / blood-2006-04-015859.

[0366] 11. Stamatoyannopoulos, G. (2005) . Control of globin gene expression during development and erythroid differentiation. Exp Hematol 33, 259-271.10.1016 / j. exphem. 2004.11.007.

[0367] 12. Higgs, D.R., Engel, J.D., and Stamatoyannopoulos, G. (2012) . Thalassaemia. Lancet 379, 373-383.10.1016 / S0140-6736 (11) 60283-3.

[0368] 13. Uda, M., Galanello, R., Sanna, S., Lettre, G., Sankaran, V.G., Chen, W., Usala, G., Busonero, F., Maschio, A., Albai, G., et al. (2008) . Genome-wide association study shows BCL11A associated with persistent fetal hemoglobin and amelioration of the phenotype of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 1620-1625. 10.1073 / pnas. 0711566105.

[0369] 14. Smith, E.C., and Orkin, S.H. (2016) . Hemoglobin genetics: recent contributions of GWAS and gene editing. Hum Mol Genet 25, R99-R105.10.1093 / hmg / ddw170.

[0370] 15. Bauer, D.E., Kamran, S.C., Lessard, S., Xu, J., Fujiwara, Y., Lin, C., Shao, Z., Canver, M.C., Smith, E.C., Pinello, L., et al. (2013) . An erythroid enhancer of BCL11A subject to genetic variation determines fetal hemoglobin level. Science 342, 253-257. 10.1126 / science. 1242088.

[0371] 16. Martyn, G.E., Wienert, B., Yang, L., Shah, M., Norton, L.J., Burdach, J., Kurita, R., Nakamura, Y., Pearson, R.C.M., Funnell, A.P.W., et al. (2018) . Natural regulatory mutations elevate the fetal globin gene via disruption of BCL11A or ZBTB7A binding. Nat Genet 50, 498-503.10.1038 / s41588-018-0085-0.

[0372] 17. Cheng, L., Li, Y., Qi, Q., Xu, P., Feng, R., Palmer, L., Chen, J., Wu, R., Yee, T., Zhang, J., et al. (2021) . Single-nucleotide-level mapping of DNA regulatory elements that control fetal hemoglobin expression. Nat Genet 53, 869-880.10.1038 / s41588-021-00861-8.

[0373] 18. Doerfler, P.A., Feng, R., Li, Y., Palmer, L.E., Porter, S.N., Bell, H.W., Crossley, M., Pruett-Miller, S.M., Cheng, Y., and Weiss, M.J. (2021) . Activation of gamma-globin gene expression by GATA1 and NF-Y in hereditary persistence of fetal hemoglobin. Nat Genet 53, 1177-1186.10.1038 / s41588-021-00904-0.

[0374] 19. Liu, N., Hargreaves, V.V., Zhu, Q., Kurland, J.V., Hong, J., Kim, W., Sher, F., Macias-Trevino, C., Rogers, J.M., Kurita, R., et al. (2018) . Direct Promoter Repression by BCL11A Controls the Fetal to Adult Hemoglobin Switch. Cell 173, 430-442 e417. 10.1016 / j. cell. 2018.03.016.

[0375] 20. Masuda, T., Wang, X., Maeda, M., Canver, M.C., Sher, F., Funnell, A.P., Fisher, C., Suciu, M., Martyn, G.E., Norton, L.J., et al. (2016) . Transcription factors LRF and BCL11A independently repress expression of fetal hemoglobin. Science 351, 285-289. 10.1126 / science. aad3312.

[0376] 21. Sankaran, V.G., Menne, T.F., Xu, J., Akie, T.E., Lettre, G., Van Handel, B., Mikkola, H.K., Hirschhorn, J.N., Cantor, A.B., and Orkin, S.H. (2008) . Human fetal hemoglobin expression is regulated by the developmental stage-specific repressor BCL11A. Science 322, 1839-1842.10.1126 / science. 1165409.

[0377] 22. Liu, N., Xu, S., Yao, Q., Zhu, Q., Kai, Y., Hsu, J.Y., Sakon, P., Pinello, L., Yuan, G.C., Bauer, D.E., and Orkin, S.H. (2021) . Transcription factor competition at the gamma-globin promoters controls hemoglobin switching. Nat Genet 53, 511-520. 10.1038 / s41588-021-00798-y.

[0378] 23. Liu, P., Keller, J.R., Ortiz, M., Tessarollo, L., Rachel, R.A., Nakamura, T., Jenkins, N.A.,  and Copeland, N.G. (2003) . Bcl11a is essential for normal lymphoid development. Nat Immunol 4, 525-532.10.1038 / ni925.

[0379] 24. He, X., He, X., Dave, V.P., Zhang, Y., Hua, X., Nicolas, E., Xu, W., Roe, B.A., and Kappes, D.J. (2005) . The zinc finger transcription factor Th-POK regulates CD4 versus CD8 T-cell lineage commitment. Nature 433, 826-833.10.1038 / nature03338.

[0380] 25. Sakaguchi, S., Hombauer, M., Bilic, I., Naoe, Y., Schebesta, A., Taniuchi, I., and Ellmeier, W. (2010) . The zinc-finger protein MAZR is part of the transcription factor network that controls the CD4 versus CD8 lineage fate of double-positive thymocytes. Nat Immunol 11, 442-448.10.1038 / ni. 1860.

[0381] 26. Yu, Y., Wang, J., Khaled, W., Burke, S., Li, P., Chen, X., Yang, W., Jenkins, N.A., Copeland, N.G., Zhang, S., and Liu, P. (2012) . Bcl11a is essential for lymphoid development and negatively regulates p53. J Exp Med 209, 2467-2483. 10.1084 / jem. 20121846.

[0382] 27. Wu, Y., Zeng, J., Roscoe, B.P., Liu, P., Yao, Q., Lazzarotto, C.R., Clement, K., Cole, M.A., Luk, K., Baricordi, C., et al. (2019) . Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells. Nat Med 25, 776-783.10.1038 / s41591-019-0401-y.

[0383] 28. Zeng, J., Wu, Y., Ren, C., Bonanno, J., Shen, A.H., Shea, D., Gehrke, J.M., Clement, K., Luk, K., Yao, Q., et al. (2020) . Therapeutic base editing of human hematopoietic stem cells. Nat Med 26, 535-541.10.1038 / s41591-020-0790-y.

[0384] 29. Antoniou, P., Hardouin, G., Martinucci, P., Frati, G., Felix, T., Chalumeau, A., Fontana, L., Martin, J., Masson, C., Brusson, M., et al. (2022) . Base-editing-mediated dissection of a gamma-globin cis-regulatory element for the therapeutic reactivation of fetal hemoglobin expression. Nat Commun 13, 6618.10.1038 / s41467-022-34493-1.

[0385] 30. Musallam, K.M., Sankaran, V.G., Cappellini, M.D., Duca, L., Nathan, D.G., and Taher, A.T. (2012) . Fetal hemoglobin levels and morbidity in untransfused patients with beta-thalassemia intermedia. Blood 119, 364-367.10.1182 / blood-2011-09-382408.

[0386] 31. Urbinati, F., Hargrove, P.W., Geiger, S., Romero, Z., Wherley, J., Kaufman, M.L., Hollis, R.P., Chambers, C.B., Persons, D.A., Kohn, D.B., and Wilber, A. (2015) . Potentially therapeutic levels of anti-sickling globin gene expression following lentivirus-mediated gene transfer in sickle cell disease bone marrow CD34+ cells. Exp Hematol 43, 346-351. 10.1016 / j. exphem. 2015.01.009.

[0387] 32. Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B., and Taipale, J. (2018) . CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med 24, 927-930.10.1038 / s41591-018-0049-z.

[0388] 33. Kosicki, M., Tomberg, K., and Bradley, A. (2018) . Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol 36, 765-771.10.1038 / nbt. 4192.

[0389] 34. Schiroli, G., Conti, A., Ferrari, S., Della Volpe, L., Jacob, A., Albano, L., Beretta, S., Calabria, A., Vavassori, V., Gasparini, P., et al. (2019) . Precise Gene Editing Preserves Hematopoietic Stem Cell Function following Transient p53-Mediated DNA Damage Response. Cell Stem Cell 24, 551-565 e558.10.1016 / j. stem. 2019.02.019.

[0390] 35. Boutin, J., Rosier, J., Cappellen, D., Prat, F., Toutain, J., Pennamen, P., Bouron, J., Rooryck, C., Merlio, J.P., Lamrissi-Garcia, I., et al. (2021) . CRISPR-Cas9 globin editing can induce megabase-scale copy-neutral losses of heterozygosity in hematopoietic cells. Nat Commun 12, 4922.10.1038 / s41467-021-25190-6.

[0391] 36. Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A., and Liu, D.R. (2016) . Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424.10.1038 / nature17946.

[0392] 37. Li, X., Wang, Y., Liu, Y., Yang, B., Wang, X., Wei, J., Lu, Z., Zhang, Y., Wu, J., Huang, X., et al. (2018) . Base editing with a Cpf1-cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol 36, 324-327.10.1038 / nbt. 4102.

[0393] 38. Matsoukas, I.G. (2018) . Commentary: Programmable base editing of A.T to G.C in  genomic DNA without DNA cleavage. Front Genet 9, 21.10.3389 / fgene. 2018.00021.

[0394] 39. Wang, X., Ding, C., Yu, W., Wang, Y., He, S., Yang, B., Xiong, Y.C., Wei, J., Li, J., Liang, J., et al. (2020) . Cas12a Base Editors Induce Efficient and Specific Editing with Low DNA Damage Response. Cell Rep 31, 107723.10.1016 / j. celrep. 2020.107723.

[0395] 40. Yang, L., and Chen, J. (2020) . A Tale of Two Moieties: Rapidly Evolving CRISPR / Cas-Based Genome Editing. Trends Biochem Sci 45, 874-888.10.1016 / j. tibs. 2020.06.003.

[0396] 41. Chen, J., Yang, B., and Yang, L. (2019) . To BE or not to BE, that is the question. Nat Biotechnol 37, 520-522.10.1038 / s41587-019-0119-x.

[0397] 42. Grunewald, J., Zhou, R., Garcia, S.P., Iyer, S., Lareau, C.A., Aryee, M.J., and Joung, J.K. (2019) . Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature 569, 433-437.10.1038 / s41586-019-1161-z.

[0398] 43. Jin, S., Zong, Y., Gao, Q., Zhu, Z., Wang, Y., Qin, P., Liang, C., Wang, D., Qiu, J.L., Zhang, F., and Gao, C. (2019) . Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science 364, 292-295.10.1126 / science. aaw7166.

[0399] 44. Zhou, C., Sun, Y., Yan, R., Liu, Y., Zuo, E., Gu, C., Han, L., Wei, Y., Hu, X., Zeng, R., et al. (2019) . Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature 571, 275-278.10.1038 / s41586-019-1314-0.

[0400] 45. Zuo, E., Sun, Y., Wei, W., Yuan, T., Ying, W., Sun, H., Yuan, L., Steinmetz, L.M., Li, Y., and Yang, H. (2019) . Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science 364, 289-292.10.1126 / science. aav9973.

[0401] 46. Wang, L., Xue, W., Zhang, H., Gao, R., Qiu, H., Wei, J., Zhou, L., Lei, Y.N., Wu, X., Li, X., et al. (2021) . Eliminating base-editor-induced genome-wide and transcriptome-wide off-target mutations. Nat Cell Biol 23, 552-563.10.1038 / s41556-021-00671-4.

[0402] 47. Sankaran, V.G., Xu, J., Byron, R., Greisman, H.A., Fisher, C., Weatherall, D.J., Sabath, D.E., Groudine, M., Orkin, S.H., Premawardhena, A., and Bender, M.A. (2011) . A functional element necessary for fetal hemoglobin silencing. N Engl J Med 365, 807-814. 10.1056 / NEJMoa1103070.

[0403] 48. Ghedira, E.S., Lecerf, L., Faubert, E., Costes, B., Moradkhani, K., Bachir, D., Galacteros, F., and Pissard, S. (2013) . Estimation of the difference in HbF expression due to loss of the 5' delta-globin BCL11A binding region. Haematologica 98, 305-308. 10.3324 / haematol. 2012.061994.

[0404] 49. Ginder, G.D. (2015) . Epigenetic regulation of fetal globin gene expression in adult erythroid cells. Transl Res 165, 115-125.10.1016 / j. trsl. 2014.05.002.

[0405] 50. Traxler, E.A., Yao, Y., Wang, Y.D., Woodard, K.J., Kurita, R., Nakamura, Y., Hughes, J.R., Hardison, R.C., Blobel, G.A., Li, C., and Weiss, M.J. (2016) . A genome-editing strategy to treat beta-hemoglobinopathies that recapitulates a mutation associated with a benign genetic condition. Nat Med 22, 987-990.10.1038 / nm. 4170.

[0406] 51. Metais, J.Y., Doerfler, P.A., Mayuranathan, T., Bauer, D.E., Fowler, S.C., Hsieh, M.M., Katta, V., Keriwala, S., Lazzarotto, C.R., Luk, K., et al. (2019) . Genome editing of HBG1 and HBG2 to induce fetal hemoglobin. Blood Adv 3, 3379-3392. 10.1182 / bloodadvances. 2019000820.

[0407] 52. Koblan, L.W., Doman, J.L., Wilson, C., Levy, J.M., Tay, T., Newby, G.A., Maianti, J.P., Raguram, A., and Liu, D.R. (2018) . Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction. Nat Biotechnol 36, 843-846. 10.1038 / nbt. 4172.

[0408] 53. Wang, X., Li, J., Wang, Y., Yang, B., Wei, J., Wu, J., Wang, R., Huang, X., Chen, J., and Yang, L. (2018) . Efficient base editing in methylated regions with a human APOBEC3A-Cas9 fusion. Nat Biotechnol 36, 946-949.10.1038 / nbt. 4198.

[0409] 54. Grunewald, J., Zhou, R., Iyer, S., Lareau, C.A., Garcia, S.P., Aryee, M.J., and Joung, J.K. (2019) . CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nat Biotechnol 37, 1041-1048.10.1038 / s41587-019-0236-6.

[0410] 55. Liu, Y., Zhou, C., Huang, S., Dang, L., Wei, Y., He, J., Zhou, Y., Mao, S., Tao, W., Zhang,  Y., et al. (2020) . A Cas-embedding strategy for minimizing off-target effects of DNA base editors. Nat Commun 11, 6073.10.1038 / s41467-020-19690-0.

[0411] 56. Walton, R.T., Christie, K.A., Whittaker, M.N., and Kleinstiver, B.P. (2020) . Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science 368, 290-296.10.1126 / science. aba8853.

[0412] 57. Kurita, R., Suda, N., Sudo, K., Miharada, K., Hiroyama, T., Miyoshi, H., Tani, K., and Nakamura, Y. (2013) . Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One 8, e59890. 10.1371 / journal. pone. 0059890.

[0413] 58. Weber, L., Frati, G., Felix, T., Hardouin, G., Casini, A., Wollenschlaeger, C., Meneghini, V., Masson, C., De Cian, A., Chalumeau, A., et al. (2020) . Editing a gamma-globin repressor binding site restores fetal hemoglobin synthesis and corrects the sickle cell disease phenotype. Sci Adv 6.10.1126 / sciadv. aay9392.

[0414] 59. Ravi, N.S., Wienert, B., Wyman, S.K., Bell, H.W., George, A., Mahalingam, G., Vu, J.T., Prasad, K., Bandlamudi, B.P., Devaraju, N., et al. (2022) . Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevate the expression of fetal hemoglobin. Elife 11.10.7554 / eLife. 65421.

[0415] 60. Liao, J., Chen, S., Hsiao, S., Jiang, Y., Yang, Y., Zhang, Y., Wang, X., Lai, Y., Bauer, D.E., and Wu, Y. (2023) . Therapeutic adenine base editing of human hematopoietic stem cells. Nat Commun 14, 207.10.1038 / s41467-022-35508-7.

[0416] 61. Ihry, R.J., Worringer, K.A., Salick, M.R., Frias, E., Ho, D., Theriault, K., Kommineni, S., Chen, J., Sondey, M., Ye, C., et al. (2018) . p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med 24, 939-946.10.1038 / s41591-018-0050-6.

[0417] 62. Vousden, K.H., and Prives, C. (2009) . Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell 137, 413-431.10.1016 / j. cell. 2009.04.037.

[0418] 63. Karimian, A., Ahmadi, Y., and Yousefi, B. (2016) . Multiple functions of p21 in cell cycle, apoptosis and transcriptional regulation after DNA damage. DNA Repair (Amst) 42, 63-71.10.1016 / j. dnarep. 2016.04.008.

[0419] 64. Kim, D., Lim, K., Kim, S.T., Yoon, S.H., Kim, K., Ryu, S.M., and Kim, J.S. (2017) . Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nat Biotechnol 35, 475-480.10.1038 / nbt. 3852.

[0420] 65. Bae, S., Park, J., and Kim, J.S. (2014) . Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475.10.1093 / bioinformatics / btu048.

[0421] 66. Gao, R., Fu, Z.C., Li, X., Wang, Y., Wei, J., Li, G., Wang, L., Wu, J., Huang, X., Yang, L., and Chen, J. (2022) . Genomic and Transcriptomic Analyses of Prime Editing Guide RNA-Independent Off-Target Effects by Prime Editors. CRISPR J 5, 276-293. 10.1089 / crispr. 2021.0080.

[0422] 67. Canver, M.C., Smith, E.C., Sher, F., Pinello, L., Sanjana, N.E., Shalem, O., Chen, D.D., Schupp, P.G., Vinjamur, D.S., Garcia, S.P., et al. (2015) . BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis. Nature 527, 192-197. 10.1038 / nature15521.

[0423] 68. A Safety and Efficacy Study Evaluating CTX001 in Subjects With Transfusion-Dependent β-Thalassemia. https:  / / ClinicalTrials. gov / show / NCT03655678.

[0424] 69. A Safety and Efficacy Study Evaluating CTX001 in Subjects With Severe Sickle Cell Disease. https:  / / ClinicalTrials. gov / show / NCT03745287.

[0425] 70. Leibowitz, M.L., Papathanasiou, S., Doerfler, P.A., Blaine, L.J., Sun, L., Yao, Y., Zhang, C.Z., Weiss, M.J., and Pellman, D. (2021) . Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Genet 53, 895-905.10.1038 / s41588-021-00838-7.

[0426] 71. CRISPR Therapeutics. Efficacy and Safety of a Single Dose of Exagamglogene Autotemcel for Transfusion-Dependent β-Thalassemia and Severe Sickle Cell Disease. http:  / / ir. crisprtx. com / static-files / c85bb519-0d4a-43e6-9b38-1176f547364b.

[0427] 72. Yang, Y., Xu, Z., He, C., Zhang, B., Shi, Y., and Li, F. (2019) . Structural insights into the recognition of gamma-globin gene promoter by BCL11A. Cell Res 29, 960-963. 10.1038 / s41422-019-0221-0.

[0428] 73. Li, C., Georgakopoulou, A., Newby, G.A., Chen, P.J., Everette, K.A., Paschoudi, K., Vlachaki, E., Gil, S., Anderson, A.K., Koob, T., et al. (2023) . In vivo HSC prime editing rescues Sickle Cell Disease in a mouse model. Blood. 10.1182 / blood. 2022018252.

[0429] 74. Ferrari, S., Jacob, A., Beretta, S., Unali, G., Albano, L., Vavassori, V., Cittaro, D., Lazarevic, D., Brombin, C., Cugnata, F., et al. (2020) . Efficient gene editing of human long-term hematopoietic stem cells validated by clonal tracking. Nat Biotechnol 38, 1298-1308.10.1038 / s41587-020-0551-y.

[0430] 75. Baiersdorfer, M., Boros, G., Muramatsu, H., Mahiny, A., Vlatkovic, I., Sahin, U., and Kariko, K. (2019) . A Facile Method for the Removal of dsRNA Contaminant from In Vitro-Transcribed mRNA. Mol Ther Nucleic Acids 15, 26-35. 10.1016 / j. omtn. 2019.02.018.

[0431] 76. Chalumeau, A., Frati, G., Magrin, E., and Miccio, A. (2021) . Reverse Phase-high-performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) Analysis of Globin Chains from Human Erythroid Cells. Bio Protoc 11, e3899.10.21769 / BioProtoc. 3899.

[0432] 77. Shi, Y.J., Duan, M., Ding, J.M., Wang, F.Q., Bi, L.L., Zhang, C.X., Zhang, Y.Z., Duan, J.Y., Huang, A.H., Lei, X.L., et al. (2022) . DNA topology regulates PAM-Cas9 interaction and DNA unwinding to enable near-PAMless cleavage by thermophilic Cas9. Mol Cell 82, 4160-4175 e4166.10.1016 / j. molcel. 2022.09.032.

[0433] 78. McKenna, A., Hanna, M., Banks, E., Sivachenko, A., Cibulskis, K., Kernytsky, A., Garimella, K., Altshuler, D., Gabriel, S., Daly, M., and DePristo, M.A. (2010) . The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res 20, 1297-1303.10.1101 / gr. 107524.110.

[0434] 79. Wilm, A., Aw, P.P., Bertrand, D., Yeo, G.H., Ong, S.H., Wong, C.H., Khor, C.C., Petric, R., Hibberd, M.L., and Nagarajan, N. (2012) . LoFreq: a sequence-quality aware, ultra-sensitive variant caller for uncovering cell-population heterogeneity from high-throughput sequencing datasets. Nucleic Acids Res 40, 11189-11201. 10.1093 / nar / gks918.

[0435] 80. Kim, S., Scheffler, K., Halpern, A.L., Bekritsky, M.A., Noh, E., Kallberg, M., Chen, X., Kim, Y., Beyter, D., Krusche, P., and Saunders, C.T. (2018) . Strelka2: fast and accurate calling of germline and somatic variants. Nat Methods 15, 591-594.10.1038 / s41592-018-0051-x.

[0436] 81. Bolger, A.M., Lohse, M., and Usadel, B. (2014) . Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 30, 2114-2120.10.1093 / bioinformatics / btu170.

[0437] 82. Narzisi, G., O'Rawe, J.A., Iossifov, I., Fang, H., Lee, Y.H., Wang, Z., Wu, Y., Lyon, G.J., Wigler, M., and Schatz, M.C. (2014) . Accurate de novo and transmitted indel detection in exome-capture data using microassembly. Nat Methods 11, 1033-1036. 10.1038 / nmeth. 3069.

[0438] 83. Wang, Lijie, et al. "Eliminating base-editor-induced genome-wide and transcriptome-wide off-target mutations. " Nature Cell Biology 23.5 (2021) : 552-563.

[0439] 84. Musallam, Khaled M., et al. "Fetal hemoglobin levels and morbidity in untransfused patients with β-thalassemia intermedia. " Blood, The Journal of the American Society of Hematology 119.2 (2012) : 364-367.

Claims

1.An engineered cell comprising a genetic modification within a hemoglobin subunit gamma 1 (HBG-1) gene promoter site, wherein the genetic modification is between TSS -118 bp and TSS -113 bp, and wherein the nucleotide sequence between TSS -118 bp and TSS -113 bp at the genetic modification site is any one of SEQ ID NOs: 2-4.2.An engineered cell comprising a genetic modification within a hemoglobin subunit gamma 3 (HBG-3) gene promoter site, wherein the genetic modification is between TSS -202 bp and TSS -194 bp, and wherein the nucleotide sequence between TSS -202 bp and TSS -194 bp at the genetic modification site is any one of SEQ ID NOs: 6-14.3.The engineered cell in any one of claims 1-2, wherein the cell is a hematopoietic stem cell or a hematopoietic progenitor cell.4.The engineered cell in any one of claims 1-3, wherein the genetic modification is introduced by a transformer base editor (tBE) gene editing system.5.A composition comprising the engineered cell in any one of claims 1-4.6.The composition of claim 5, further comprising a cryopreservation medium.7.A method for treating β-hemoglobinopathies in a subject, comprising administering the engineered cell in any one of claims 1-4 and / or the composition in any one of claims 5-6 to the subject.8.The method of claim 7, wherein the engineered cell is autologous.9.The method of claim 7, wherein the engineered cell is allogeneic.10.A method for engineering a hematopoietic stem cell and / or a hematopoietic progenitor cell, comprising administering to the cell one or more transformer base editor (tBE) gene editing systems, wherein each tBE gene editing system comprisesa. a main guide RNA (mgRNA) and a helper guide RNA (hgRNA) , or at least one DNA polynucleotide encoding the mgRNA and / or the hgRNA, wherein the mgRNA comprises a mgRNA spacer, and wherein the hgRNA comprises a hgRNA spacer targeting a site upstream of the mgRNA spacer targeting site, wherein the mgRNA spacer targets(1) a site within a TSS + 58kb GATA binding motif in a BCL11 transcription factor A (BCL11A) gene,(2) a site within a TSS + 55kb KLF1 binding motif in a BCL11A gene,(3) a site within a TSS -118 bp to -113 bp BCL11A binding site in the promoter region of an HBG-1 gene,(4) a site within a TSS -202bp to -194bp zinc finger and BTB domain containing 7A (ZBTB7A) binding site in the promoter region of an HBG-3, or(5) a site within a TSS + 2.5kb ZBTB7A binding site in the 3’ enhancer region of an HBG-1 gene;b. a CRISPR-associated protein (Cas protein) , or a polynucleotide encoding the Cas protein; andc. a nucleobase deaminase or a catalytic domain thereof, or a polynucleotide encoding the nucleobase deaminase or the catalytic domain thereof.11.The method of claim 10, wherein in each tBE gene editing system the hgRNA further comprises a first CRISPR motif and a first protein-binding motif,wherein the mgRNA further comprises a second CRISPR motif and optionally a second protein-binding motif,wherein a first and a second Cas protein or a polynucleotide encoding thereof is administered, wherein the first Cas protein binds to the first CRISPR motif, and the second Cas protein binds to the second CRISPR motif,wherein the nucleobase deaminase or a catalytic domain thereof is administered in the form of a first fusion protein comprising a nucleobase deaminase or a catalytic domain thereof and a first RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the first fusion protein, wherein the nucleobase deaminase or the catalytic domain thereof and the first RNA binding domain are optionally connected by a linker, and wherein the first RNA binding domain binds to the first protein-binding motif.12.The method of claim 11, each tBE gene editing system further comprisesa protease or a polynucleotide encoding thereof, anda nucleobase deaminase inhibitor domain,wherein the nucleobase deaminase inhibitor domain is connected to the nucleobase deaminase or the catalytic domain thereof in the first fusion protein optionally by a linker, and wherein there is a cleavage site for the protease between the nucleobase deaminase inhibitor domain and the nucleobase deaminase or the catalytic domain thereof.13.The method of claim 12, each tBE gene editing system further comprisesa second fusion protein comprising the protease and a second RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the second fusion protein,wherein the protease and the second RNA binding domain are optionally connected by a linker,wherein the mgRNA comprises the second protein-binding motif,and wherein the second RNA binding domain binds to the second protein-binding motif.14.The method of claim 12, wherein the protease is split into a first protease fragment and a second protease fragment, wherein the first and / or second protease fragment alone is not able to cleave the cleavage site.15.The method of claim 14, each tBE gene editing system further comprisesa. a second fusion protein comprising the first protease fragment and a second RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the second fusion protein, wherein the first protease fragment and the second RNA binding domain are optionally connected by a linker, andb. a third fusion protein comprising the second protease fragment and a third RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the third fusion protein, wherein the second protease fragment and the third RNA binding domain are optionally connected by a linker,wherein the mgRNA further comprises the second protein-binding motif and a third protein-binding motif,wherein the second RNA binding domain binds to the second protein-binding motif, andwherein the third RNA binding domain binds to the third protein-binding motif.16.The method of claim 15, wherein the second and third RNA binding domains are the same or different, and the second and third protein-binding motifs are the same or different.17.The method of claim 14, each tBE gene editing system further comprisesa second fusion protein comprising the first protease fragment and a second RNA binding domain, or a polynucleotide encoding the second fusion protein,wherein the first protease fragment and the second RNA binding domain are optionally connected by a linker,wherein the mgRNA further comprises the second protein-binding motif, andwherein the second RNA binding domain binds to the second protein-binding motif.18.The method of claim any one of claims 12-17, wherein the protease is a TEV protease, a TuMV protease, a PPV protease, a PVY protease, a ZIKV protease, or a WNV protease.19.The method of claim 18, wherein the protease is a TEV protease comprising a sequence of SEQ ID NO: 25.20.The method of claim 19, wherein the first TEV protease fragment comprises a sequence of SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27.21.The method of any one of claims 12-20, wherein the nucleobase deaminase inhibitor is an inhibitory domain of a nucleobase deaminase.22.The method of any one of claims 12-21, wherein the nucleobase deaminase inhibitor is an inhibitory domain of a cytidine deaminase or an adenosine deaminase.23.The method of claim 22, wherein the inhibitory domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 or SEQ ID NO: 43 or any one of SEQ ID NOs: 51-138.24.The method of any one of claims 11-23, wherein the nucleotide deaminase is a cytidine deaminase.25.The method of claim 24, wherein the cytidine deaminase is selected from the group consisting of APOBEC3B (A3B) , APOBEC3C (A3C) , APOBEC3D (A3D) , APOBEC3F (A3F) , APOBEC3G (A3G) , APOBEC3H (A3H) , APOBECI (Al) , APOBEC3 (A3) , APOBEC2 (A2) , APOBEC4 (A4) , and AICDA (AID) .26.The method of claim 24, wherein the cytidine deaminase is a human or mouse cytidine deaminase.27.The method of any one of claims 11-23, wherein the nucleotide deaminase is an adenosine deaminase.28.The method of claim 27, wherein the adenosine deaminase is selected from the group consisting of tRNA-specific adenosine deaminase (TadA) , adenosine deaminase tRNA specific 1 (ADAT1) , adenosine deaminase tRNA specific 2 (ADAT2) , adenosine deaminase tRNA specific 3 (ADAT3) , adenosine deaminase RNA specific B1 (ADARB1) , adenosine deaminase RNA specific B2 (ADARB2) , adenosine monophosphate deaminase 1 (AMPD1) , adenosine monophosphate deaminase 2 (AMPD2) , adenosine monophosphate deaminase 3 (AMPD3) , adenosine deaminase (ADA) , adenosine deaminase 2 (ADA2) , adenosine deaminase like (ADAL) , adenosine deaminase domain containing 1 (ADAD1) , adenosine deaminase domain containing 2 (ADAD2) , and adenosine deaminase RNA specific (ADAR) .29.The method of claim 24, wherein the adenosine deaminase is a human or mouse adenosine deaminase.30.The method of any one of claims 11-29, wherein the first fusion protein further comprises an uracil glycosylase inhibitor (UGI) .31.The method of any one of claims 11-30, wherein the Cas protein is a Cas9, a dead Cas9 (dCas9) , or a Cas9 nickase (nCas9) selected from the group consisting of SpCas9, FnCas9, St1Cas9, St3Cas9, NmCas9, SaCas9, AsCpfl, LbCpfl, FnCpfl, VQR Cas9, EQR Cas9, VRER Cas9, Cas9-NG, xCas9, eCas9, SpCas9-HF1, HypaCas9, HiFiCas9, sniper-Cas9, SpG, SpRY, KKH SaCas9, CjCas9, Cas9-NRRH, Cas9-NRCH, Cas9-NRTH, SsCpfl, PcCpfl, BpCpfl, LiCpfl, PmCpfl, Lb2Cpf1, PbCpfl, PbCpfl, PeCpf1, PdCpf1, MbCpf1, EeCpf1, CmtCpf1, BsCpfl, BhCasl2b, AkCasl2b, BsCasl2b, AmCasl2b, AaCasl2b, RfxCasl3d, LwaCasl3a, PspCasl3b, PguCasl3b, and RanCasl3b.32.The method of any one of claims 11-31, wherein the first protein-binding RNA motif and the first RNA binding domain, the second protein-binding RNA motif and the second RNA binding domain, and the third protein-binding RNA motif and the third RNA binding domain, are each independently selected from the group consisting ofa MS2 phage operator stem-loop and MS2 coat protein (MCP) or an RNA-binding section thereof,a BoxB and N22P or an RNA-binding section thereof,a telomerase Ku binding motif and Ku protein or an RNA-binding section thereof,a telomerase Sm7 binding motif and Sm7 protein or an RNA-binding section thereof,a PP7 phage operator stem -loop and PP7 coat protein (PCP) or an RNA-binding section thereof,a SfMu phage Com stem-loop and Com RNA binding protein or an RNA-binding section thereof, anda non-natural RNA aptamer and corresponding aptamer ligand or an RNA-binding section thereof.33.The method of any one of claims 10-32 comprising administering to the cell a first tBE gene editing system and a second tBE gene editing system,wherein the first tBE gene editing system comprises a first mgRNA and a first hgRNA, or at least one DNA polynucleotide encoding the first mgRNA and / or the first hgRNA, wherein the first mgRNA comprises a first mgRNA spacer, and wherein the first hgRNA comprises a first hgRNA spacer targeting a site upstream of the first mgRNA spacer targeting site, wherein the first mgRNA spacer targets(1) a site within a TSS + 58kb GATA binding motif in a BCL11 transcription factor A (BCL11A) gene,(2) a site within a TSS + 55kb KLF1 binding motif in a BCL11A gene, or(3) a site within a TSS -118 bp to -113 bp BCL11A binding site in the promoter region of an HBG-1 gene,wherein the second tBE gene editing system comprises a second mgRNA and a second hgRNA, or at least one DNA polynucleotide encoding the second mgRNA and / or the second hgRNA, wherein the second mgRNA comprises a second mgRNA spacer, and wherein the second hgRNA comprises a second hgRNA spacer targeting a site upstream of the second mgRNA spacer targeting site, wherein the second mgRNA spacer targets(1) a site within a TSS -202bp to -194bp zinc finger and BTB domain containing 7A (ZBTB7A) binding site in the promoter region of an HBG-3, or(2) a site within a TSS + 2.5kb ZBTB7A binding site in the 3’ enhancer region of an HBG-1 gene.34.The method of any one of claims 10-33, wherein at least one RNA is codon optimized.35.The method of any one of claims 10-34, wherein the tBE gene editing system comprises an mRNA encoding the Cas protein or a DNA encoding the mRNA, wherein the percentage of uridine in the mRNA is 10%-15.5%.36.The method of claim 35, wherein the percentage of uridine in the mRNA is 10%-12.8%.37.The method of any one of claims 35-36, wherein the Cas protein is a spCas9 D10A.38.The method of any one of claims 10-37, wherein the tBE gene editing system comprises an mRNA encoding the MS2 coat protein (MCP) or a DNA encoding the mRNA, wherein the percentage of uridine in the mRNA is 10%-18.9%.39.The method of any one of claims 10-38, wherein the tBE gene editing system comprises a Cas mRNA encoding the Cas protein, wherein the tBE gene editing system comprises an MCP mRNA encoding the MS2 coat protein (MCP) , wherein the ratio of the Cas mRNA and the MCP mRNA is between 1: 1 and 1: 2.40.The method of claim 39, wherein the ratio of the Cas mRNA and the MCP mRNA is 1: 1.5.41.The method of any one of claims 10-40, wherein in each tBE gene editing system, the ratio of the mgRNA and the hgRNA is between 1: 0.5 and 1: 2.42.The method of claim 41, wherein the ratio of the mgRNA and the hgRNA is 1: 1.15.43.The method of any one of claims 10-42, wherein the tBE gene editing system comprises a Cas mRNA encoding the Cas protein, wherein in each tBE gene editing system, the ratio of the mgRNA and the Cas mRNA is between 1: 1 and 1: 3.44.The method of claim 43, wherein the ratio of the mgRNA and the mRNA is 1: 2.45.The method of any one of claims 10-44, wherein the tBE gene editing system further comprises at least one nuclear localization signal (NLS) or a polynucleotide encoding thereof.46.The method of claim 45, wherein at least one NLS is a bipartite NLS (bp NLS) .47.The method of any one of claims 45-46, wherein at least one NLS is a SV40 NLS.48.The method of any one of claims 45-47, wherein at least one NLS is a c-Myc NLS.49.The method of any one of claims 45-47, wherein a c-Myc NLS is located at the N-terminus of the Cas protein consecutively, and a bipartite NLS is located at the C-terminus of the Cas protein.50.The method of any one of claims 45-49, wherein the tBE gene editing system comprises a first polynucleotide and a second polynucleotide,wherein the first polynucleotide comprising a sequence encoding an MS2 coat protein (MCP) , a sequence encoding a UGI, a sequence encoding a nucleobase deaminase, a sequence encoding a N22p, a sequence encoding a first protease fragment, and a sequence encoding a second protease fragment,wherein the second polynucleotide comprises a sequence encoding a Cas protein,wherein the first polynucleotide further comprises four sequences each encoding a bipartite NLS, and the four sequences are located between the sequence encoding an MS2 coat protein (MCP) and the sequence encoding a UGI, between the sequence encoding a nucleobase deaminase and the sequence encoding a N22p, between the sequence encoding a first protease fragment and the sequence encoding a second protease fragment, and at the 3’-end of the sequence encoding the second protease fragment,wherein the second polynucleotide further comprises a sequence encoding a c-Myc NLS at the 5’-end of the sequence encoding the Cas protein, and a sequence encoding a bipartite NLS at the 3’-end of the sequence encoding the Cas protein.51.A method for creating a binding motif for a KLF1 activator in the HBG-3 gene in a cell, comprising genetically modifying the thymine (T) at TSS -198bp of the HBG-3 gene to a cytosine.52.The method of claim 51, wherein the genetic modification is carried out with the method of any one of claims 10-50.53.A method for activating γ-globin expression in a hematopoietic stem cell and / or a hematopoietic progenitor cell, comprising engineering the cell with the method of any one of claims 10-50, and / or creating a binding motif for a KLF1 activator in the HBG-3 gene in the cell with the method of any one of claims 51-52.54.A method for treating β-hemoglobinopathies in a subject, comprising engineering the cell in the subject with the method of any one of claims 10-50.55.A method for treating β-hemoglobinopathies in a subject, comprising activating γ-globin expression in a hematopoietic stem cell and / or a hematopoietic progenitor cell with the method of claim 53.

Images