Heterodimeric proteins against il-12 receptor

Abstract

Provided are heterodimeric proteins against IL-12 receptor and nonabodies against IL12p40. In some aspects, provided are novel IL-12 cytokines which are truncated or masked. The p40 subunit of IL-12 is masked by the nanobody. By reducing the potency of IL-12, the toxicity and receptor-mediated clearance will be significantly decreased.

Description

HETERODIMERIC PROTEINS AGAINST IL-12 RECEPTORFIELD OF THE INVENTION

[0001] This application generally relates to heterodimeric protein. More specifically, the application relates to a truncated IL-12 cytokine against IL-12 receptor and uses thereof, a masked IL-12 cytokines against IL-12 receptor and uses thereof and a nanobody binding to IL-12 cytokine and uses thereof.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Interleukin-12 (IL-12) is a pro-inflammatory cytokine that plays an important role in innate and adaptive immunity. IL-12 is a heterodimeric cytokine composing an alpha subunit, IL-12p35, and a beta subunit, IL-12p40. The IL-12 receptor is composed of IL-12Rβ1, which mainly interacts with IL-12p40 subunit, and IL-12Rβ2, which mainly interacts with IL-12p35 subunit.

[0003] IL-12 promotes Th1 polarization of CD4+ T cells and potentiates cytotoxicity of NK and CD8+ T cells. IL-12 induces master transcription factor Tbet to drive IFNγ-dependent anti-tumor immunity. Systemic administration of IL-12 has shown overwhelming efficacy in animal models of tumor. Therefore, IL-12 protein has been studied as a promising anti-cancer therapeutic. However, despite high expectations, early clinical studies did not yield satisfactory results [1] . Severe toxicity was observed in clinical trials with recombinant IL-12 administration.

[0004] Jung et al. constructed heterodimeric Fc-fused IL-12 which exhibited longer plasma half-life and enhanced anti-tumor immunity [2] . However, there is no evidence showing that the IL-12-Fc fusion protein is less toxic.

[0005] One strategy to improve the therapeutic window of IL-12 is to deliver it to tumor tissue via fusing IL-12 with tumor-targeting antibodies [3] . However, there is still a very large portion in the periphery tissues due to the high binding affinity of IL-12 to its receptors.

[0006] Another strategy is to mask IL-12 with its receptor or blocking antibodies [4] . The masking moiety is usually fused to IL-12 through a cleavable linker which is sensitive to proteases that are highly expressed in tumor tissue. The masked IL-12 could remain unreactive in peripheral tissues but become effective in tumor microenvironment. Nevertheless, their anti-tumor efficacy is dependent on the expression profile of tumor-specific proteases, which is generally heterogeneous in patients.

[0007] Glassman et al. constructed potency reduced IL-12 via introducing amino acid mutations to IL-12p40 subunit which interacts with IL-12Rβ1 [5] . It showed decreased toxicity in mouse models. However, introducing amino acid mutations may increase the risk of immunogenicity.

[0008] Thus, there is a need in the art for an improved therapeutic approach for using IL-12 to treat tumors.SUMMARY OF THE INVENTION

[0009] Cytokines can provide powerful therapy, but are accompanied by undesired effects that are difficult to control clinically and which have limited the clinical use of cytokines. IL-12 has been shown to have potent anti-tumor activity, however, its clinical application is limited by severe systemic toxicity. This disclosure relates to new forms of IL-12 cytokines that can be used in patients with reduced or eliminated undesired effects.

[0010] The present disclosure is directed to a method to decrease the toxicity of IL-12 via reducing binding affinity of IL-12p40 subunit with IL-12Rβ1. In some aspect, the method comprises deleting amino acids interacting with IL-12Rβ1 to decrease the binding affinity of IL-12 to its receptors. In some aspect, the method comprises truncating part of N-terminal, C-terminal or middle amino acids of IL-12p40 subunit to decrease the binding affinity of IL-12 to its receptors. In some aspect, the method comprises masking the p40 subunit of IL-12 by a masking moiety to decrease the binding affinity of IL-12 to its receptors. In some aspect, the method comprises masking the p40 subunit of IL-12 by a nanobody to decrease the binding affinity of IL-12 to its receptors. By using a masking moiety or truncated IL-12p40 subunit, the systemic side effects of an administered IL-12 cytokine or functional fragment thereof can be reduced by interfering with the binding capability of the IL-12 cytokine or functional fragment thereof to its cognate receptor.

[0011] In some aspect, the disclosure provides novel IL-12 cytokines which is truncated or masked. In some aspect, the disclosure provides novel nanobody binding to p40 subunit of IL-12. By reducing the potency of IL-12, the toxicity and receptor-mediated clearance will be significantly decreased.

[0012] I. Truncated IL-12 cytokines

[0013] The present invention provides novel truncated IL12-Fc fusion proteins with decreased toxicity, longer half-life and lower immunogenicity.

[0014] In some aspect, the present invention provides a method to decrease the toxicity of IL-12 via reducing binding affinity of IL-12p40 subunit with IL-12Rβ1. Part of N-terminal, C-terminal or middle amino acids of IL-12p40 subunit were truncated. Amino acids interacting with IL-12Rβ1 is possibly removed which may decrease the binding affinity of IL-12 to its receptors. In addition, the structure of IL-12p40 subunit might be slightly changed leading to decreased interaction of IL-12p40 with IL-12Rβ1. By reducing the potency of IL-12, the toxicity and receptor-mediated clearance will be significantly decreased.

[0015] In some aspect, the invention provides a heterodimeric truncated IL-12-Fc fusion protein comprising a) a first fusion protein comprising a truncated IL-12p40 subunit and a first Fc domain; wherein the truncated IL-12p40 subunit domain is covalently fused to the N-terminus of first Fc domain, and b) a second fusion protein comprising IL-12p35 and a second Fc domain; where the IL-12p35 subunit is covalently fused to the N-terminus of second Fc domain. In some embodiments, IL-12p40 subunit is truncated from N-terminus. In some embodiments, IL-12p40 subunit is truncated from C-terminus. In some embodiments, IL-12p40 subunit is truncated from middle domain.

[0016] In one aspect, the invention provides a heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof, the heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof comprising a first fusion protein and a second fusion protein,

[0017] wherein the first fusion protein comprising from N-terminal to C-terminal:

[0018] (i) a truncated IL-12p40 subunit, and

[0019] (ii) a first Fc domain,

[0020] wherein the second fusion protein comprising from N-terminal to C-terminal:

[0021] (i) a IL-12p35 subunit, and

[0022] (ii) a second Fc domain.

[0023] In some embodiments, compared to the intact IL-12p40 subunit (SEQ ID NO: 4) , the truncated IL-12p40 subunit is truncated from N-terminus, middle domain or C-terminus.

[0024] In some embodiments, compared to the intact IL-12p40 subunit, the truncated IL-12p40 subunit is truncated from N-terminus of IL-12p40 subunit. In some embodiments, compared to the intact IL-12p40 subunit, the truncated IL-12p40 subunit is lack of one or more amino acids from position 1 to position 107 at N-terminus of IL-12p40 subunit.

[0025] In a specific embodiment, compared to the intact IL-12p40 subunit, the truncated IL-12p40 subunit is truncated from N-terminus of IL-12p40 subunit from the following positions: 1) : I1-H77, 2) : I1-K85, 3) : I1-E86, 4) : I1-D87, 5) : W90, 6) : I1-T92, 7) : I1-K96, 8) : I1-K99, 9) : I1-K102, 10) : I1-T105, 11) : I1-L107, 12) : I1-L13, 13) : I1-P20, 14) : I1-L26, 15) : I1-D34, 16) : I1-S44, 17) : I1-LS49, 18) : I1-L53, 19) : I1-K58, 20) : I1-A63, 21) : I1-K70, 22) : I1-W2, 23) : I1-E3, 24) : I1-L4, 25) : I1-K5, 26) : I1-K6, 27) : I1-V8, 28) : I1-Y9, 29) : I1-V11, 30) : I1-W15, 31) : I1-P17, or 32) : I1-D18.

[0026] In some embodiments, compared to the intact IL-12p40 subunit (SEQ ID NO: 4) , the truncated IL-12p40 subunit is truncated from middle domain of IL-12p40 subunit. In some embodiments, compared to the intact IL-12p40 subunit, the truncated IL-12p40 subunit is lack of one or more amino acids from position 34 to position 105 in the middle domain of IL-12p40 subunit.

[0027] In a specific embodiment, compared to the intact IL-12p40 subunit, the truncated IL-12p40 subunit is truncated from middle domain of IL-12p40 subunit from the following positions: 1) : G34-S49, 2) : D87-S91, 3) : Q98-T105, 4) : D87-K96, 5) : L95-T105, or 6) : D93-T105.

[0028] In some embodiments, compared to the intact IL-12p40 subunit (SEQ ID NO: 4) , the truncated IL-12p40 subunit is truncated from C-terminus of IL-12p40 subunit. In some embodiments, compared to the intact IL-12p40 subunit, the truncated IL-12p40 subunit is lack of one or more amino acids from position 295 to position 306 at C-terminus of IL-12p40 subunit.

[0029] In a specific embodiment, compared to the intact IL-12p40 subunit, the truncated IL-12p40 subunit is truncated from C-terminus of IL-12p40 subunit from the following position: S295-S306.

[0030] In a particular embodiment, the truncated IL-12p40 subunit comprising an amino acid sequence with at least 80%identity to a sequence selected from the group consisting of:

[0031] SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43.

[0032] In a particular embodiment, the truncated IL-12p40 subunit comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to a sequence selected from the group consisting of:

[0033] SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43.

[0034] In a particular embodiment, the truncated IL-12p40 subunit comprising an amino acid sequence with at least 90%identity to a sequence selected from the group consisting of:

[0035] SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43.

[0036] In a particular embodiment, the truncated IL-12p40 subunit comprising an amino acid sequence with at least 95%identity to a sequence selected from the group consisting of:

[0037] SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43.

[0038] In a particular embodiment, the truncated IL-12p40 subunit comprising an amino acid sequence with at least 98%identity to a sequence selected from the group consisting of:

[0039] SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43.

[0040] In a particular embodiment, the truncated IL-12p40 subunit comprising a sequence selected from the group consisting of:

[0041] SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43.

[0042] In a particular embodiment, the truncated IL-12p40 subunit consisting of a sequence selected from the group consisting of:

[0043] SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43.

[0044] In some aspect, the truncated IL-12p40 subunit is covalently fused to the N-terminus of the first Fc domain, and the IL-12p35 subunit is covalently fused to the N-terminus of the second Fc domain.

[0045] In some aspect, the first Fc domain and / or second Fc domain comprising a hinge domain and a constant region of CH2-CH3. In a specific embodiment, the Fc domain is IgG Fc domain. In a specific embodiment, the Fc domain is human IgG Fc domain. In a particular embodiment, the Fc domain is IgG1 Fc domain. In a particular embodiment, the Fc domain is human IgG1 Fc domain.

[0046] In some aspect, the Fc domain comprising mutations. In a specific embodiment, the hinge domain of the first Fc domain and / or second Fc domain comprising mutations. In a specific embodiment, the hinge domain of the first Fc domain and / or second Fc domain comprising C220S mutation.

[0047] In some aspect, the first Fc domain comprising L234A-L235A-S354C-T366W mutations, and the second Fc domain comprising L234A-L235A-T366S-L368A-Y407V mutations. In some aspect, the first Fc domain comprising L234A-L235A-T366S-L368A-Y407V mutations, and the second Fc domain comprising L234A-L235A-S354C-T366W mutations; or wherein the first Fc domain comprising L234A-L235A-M252Y-S254T-T256E-T366S-L368A-Y407V mutations, and the second Fc domain comprising L234A-L235A-M252Y-S254T-T256E-S354C-T366W mutations, or wherein the first Fc domain comprising L234A-L235A-M252Y-S254T-T256E-S354C-T366W mutations, and the second Fc domain comprising L234A-L235A-M252Y-S254T-T256E-T366S-L368A-Y407V mutations.

[0048] In a specific embodiment, the first Fc domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. In a specific embodiment, the second Fc domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.

[0049] In some aspect, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule, the isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding the heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined above. In some aspect, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule, the isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding the truncated IL12-Fc fusion protein as defined in the present invention.

[0050] In some aspect, the present invention provides an expression vector, the expression vector comprising the nucleic acid molecule as defined above.

[0051] In some aspect, the present invention provides a host cell, the host cell comprising the expression vector as defined above.

[0052] In some aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition comprising the heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined above or the truncated IL12-Fc fusion protein as defined in the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0053] In some aspect, the pharmaceutical composition comprising a nucleic acid sequence encoding the heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined above or the truncated IL12-Fc fusion protein as defined in the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0054] In some aspect, the pharmaceutical composition comprising the expression vector as defined above, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0055] In some aspect, the pharmaceutical composition comprising the host cell as defined above, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0056] In some aspect, the present invention provides a method for treating a cancer, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined above or a truncated IL12-Fc fusion protein as defined in the present invention, or the nucleic acid molecule, the expression vector, the host cell or the pharmaceutical composition as defined above. The cancer is selected from the group consisting of breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, melanoma, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, and stomach cancer.

[0057] In some aspect, the present invention provides a method for treating a disease, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined above or a truncated IL12-Fc fusion protein as defined in the present invention, or the nucleic acid molecule, the expression vector, the host cell or the pharmaceutical composition as defined above. Typically, the subject has, or is at risk of developing, a proliferative disease, a tumorous disease, an inflammatory disease, an immunological disorder, an autoimmune disease, an infectious disease, a viral disease, an allergic reaction, a parasitic reaction, a graft-versus-host disease or a host-versus-graft disease.

[0058] In some aspect, the present invention provides a kit for treating tumor, the kit comprising a heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined above or a truncated IL12-Fc fusion protein as defined in the present invention.

[0059] II. Nanobody binding to IL-12p40

[0060] The present invention provides nanobody binding to IL-12 cytokine, the nanobody comprising complementarity determining region 1 (CDR1) , CDR2 and CDR3 selected from the group consisting of:

[0061] (a) SEQ ID NOs: 51, 53 and 55, respectively;

[0062] (b) SEQ ID NOs: 59, 61 and 63, respectively;

[0063] (c) SEQ ID NOs: 67, 69 and 71, respectively;

[0064] (d) SEQ ID NOs: 75, 77 and 79, respectively;

[0065] (e) SEQ ID NOs: 83, 85 and 87, respectively;

[0066] (f) SEQ ID NOs: 91, 93 and 95, respectively;

[0067] (g) SEQ ID NOs: 99, 101 and 103, respectively;

[0068] (h) SEQ ID NOs: 107, 109 and 111, respectively; and

[0069] (i) SEQ ID NOs: 115, 117 and 119, respectively.

[0070] In some aspect, the nanobody comprising from N-terminus to C-terminus: a first framework domain; CDR1; a second framework domain; CDR2; a third framework domain; CDR3; a fourth framework domain.

[0071] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0072] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence with at least 85%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence with at least 85%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence with at least 85%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence with at least 85%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0073] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence with at least 90%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence with at least 90%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence with at least 90%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence with at least 90%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0074] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence with at least 95%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence with at least 95%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence with at least 95%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence with at least 95%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0075] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence with at least 98%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence with at least 98%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence with at least 98%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence with at least 98%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0076] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0077] In a specific embodiment, the first framework domain consisting of a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain consisting of a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain consisting of a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain consisting of a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0078] In some aspect, the nanobody comprising an amino acid sequence with at least 80%identity to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0079] In some aspect, the nanobody comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0080] In some aspect, the nanobody comprising an amino acid sequence with at least 90%identity to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0081] In some aspect, the nanobody comprising an amino acid sequence with at least 95%identity to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0082] In some aspect, the nanobody comprising an amino acid sequence with at least 98%identity to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0083] In some aspect, the nanobody comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0084] In some aspect, the nanobody consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0085] III. Masked IL-12 cytokines

[0086] The present invention provides novel masked IL12-Fc fusion proteins. Binding of the masking moiety to IL-12p40 subunit partially prevents its interaction with IL-12Rβ1, and decreases the IL-12 signaling as a result.

[0087] In some aspects, the invention provides a method to decrease the toxicity of IL-12 via reducing binding affinity of IL-12p40 subunit with IL-12Rβ1. The p40 subunit of IL-12 is masked by a nanobody. The linker between the masking moiety and IL-12p40 subunit is uncleavable. Binding of the masking moiety to IL-12p40 subunit partially prevents its interaction with IL-12Rβ1, and decreases the IL-12 signaling as a result. By reducing the potency of IL-12, the toxicity and receptor-mediated clearance will be decreased.

[0088] In some aspects, the invention provides a heterodimeric IL-12-Fc fusion protein comprising a) a first fusion protein comprising a masking moiety, a IL-12p40 subunit and a first Fc polypeptide; wherein the masking moiety is fused to N-terminus of IL-12p40 subunit through an uncleavable linker, and the IL-12p40 subunit is fused to the N-terminus of the first Fc polypeptide; and b) a second fusion protein comprising IL-12p35 and a second Fc domain; where the IL-12p35 subunit is covalently fused to the N-terminus of second Fc domain.

[0089] In one aspect, the invention provides a heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof, wherein the heterodimeric protein or the antigen-binding portion thereof comprises a first fusion protein and a second fusion protein,

[0090] wherein the first fusion protein comprising from N-terminal to C-terminal:

[0091] (i) a masking moiety,

[0092] (ii) a IL-12p40 subunit, and

[0093] (iii) a first Fc domain,

[0094] wherein the second fusion protein comprising from N-terminal to C-terminal:

[0095] (i) a IL-12p35 subunit; and

[0096] (ii) a second Fc domain.

[0097] In some embodiments, the masking moiety is fused to N-terminus of IL-12p40 subunit through an uncleavable linker.

[0098] In some embodiments, the masking moiety is a nanobody binding to IL-12 cytokine.

[0099] In some embodiments, the nanobody comprising complementarity determining region 1 (CDR1) , CDR2 and CDR3 selected from the group consisting of:

[0100] (a) SEQ ID NOs: 51, 53 and 55, respectively;

[0101] (b) SEQ ID NOs: 59, 61 and 63, respectively;

[0102] (c) SEQ ID NOs: 67, 69 and 71, respectively;

[0103] (d) SEQ ID NOs: 75, 77 and 79, respectively;

[0104] (e) SEQ ID NOs: 83, 85 and 87, respectively;

[0105] (f) SEQ ID NOs: 91, 93 and 95, respectively;

[0106] (g) SEQ ID NOs: 99, 101 and 103, respectively;

[0107] (h) SEQ ID NOs: 107, 109 and 111, respectively; and

[0108] (i) SEQ ID NOs: 115, 117 and 119, respectively.

[0109] In some embodiments, the nanobody comprising from N-terminus to C-terminus: a first framework domain; CDR1; a second framework domain; CDR2; a third framework domain; CDR3; a fourth framework domain.

[0110] In some aspect, the nanobody comprising from N-terminus to C-terminus: a first framework domain; CDR1; a second framework domain; CDR2; a third framework domain; CDR3; a fourth framework domain.

[0111] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0112] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence with at least 85%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence with at least 85%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence with at least 85%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence with at least 85%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0113] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence with at least 90%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence with at least 90%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence with at least 90%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence with at least 90%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0114] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence with at least 95%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence with at least 95%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence with at least 95%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence with at least 95%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0115] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence with at least 98%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence with at least 98%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence with at least 98%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence with at least 98%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0116] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0117] In a specific embodiment, the first framework domain consisting of a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain consisting of a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain consisting of a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain consisting of a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0118] In some embodiment, the nanobody comprising an amino acid sequence with at least 80%identity to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0119] In some embodiment, the nanobody comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0120] In some embodiment, the nanobody comprising an amino acid sequence with at least 90%identity to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0121] In some embodiment, the nanobody comprising an amino acid sequence with at least 95%identity to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0122] In some embodiment, the nanobody comprising an amino acid sequence with at least 98%identity to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0123] In some embodiment, the nanobody comprising or consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0124] In some aspect, the masked IL-12p40 subunit is covalently fused to the N-terminus of the first Fc domain, and the IL-12p35 subunit is covalently fused to the N-terminus of the second Fc domain.

[0125] In some aspect, the first Fc domain and / or second Fc domain comprising a hinge domain and a constant region of CH2-CH3. In a specific embodiment, the Fc domain is IgG Fc domain. In a specific embodiment, the Fc domain is human IgG Fc domain. In a particular embodiment, the Fc domain is IgG1 Fc domain. In a particular embodiment, the Fc domain is human IgG1 Fc domain.

[0126] In some aspect, the Fc domain comprising mutations. In a specific embodiment, the hinge domain of the first Fc domain and / or second Fc domain comprising mutations. In a specific embodiment, the hinge domain of the first Fc domain and / or second Fc domain comprising C220S mutation.

[0127] In some aspect, the first Fc domain comprising L234A-L235A-S354C-T366W mutations, and the second Fc domain comprising L234A-L235A-T366S-L368A-Y407V mutations. In some aspect, the first Fc domain comprising L234A-L235A-T366S-L368A-Y407V mutations, and the second Fc domain comprising L234A-L235A-S354C-T366W mutations; or wherein the first Fc domain comprising L234A-L235A-M252Y-S254T-T256E-T366S-L368A-Y407V mutations, and the second Fc domain comprising L234A-L235A-M252Y-S254T-T256E-S354C-T366W mutations, or wherein the first Fc domain comprising L234A-L235A-M252Y-S254T-T256E-S354C-T366W mutations, and the second Fc domain comprising L234A-L235A-M252Y-S254T-T256E-T366S-L368A-Y407V mutations.

[0128] In a specific embodiment, the first Fc domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. In a specific embodiment, the second Fc domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.

[0129] In some aspect, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule, the isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding the heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined above. In some aspect, the present invention provides an isolated nucleic acid molecule, the isolated nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding the masked IL12-Fc fusion protein as defined in the present invention.

[0130] In some aspect, the present invention provides an expression vector, the expression vector comprising the nucleic acid molecule as defined above.

[0131] In some aspect, the present invention provides a host cell, the host cell comprising the expression vector as defined above.

[0132] In some aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition comprising the heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined above or the masked IL12-Fc fusion protein as defined in the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0133] In some aspect, the pharmaceutical composition comprising a nucleic acid sequence encoding the heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined above or the masked IL12-Fc fusion protein as defined in the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0134] In some aspect, the pharmaceutical composition comprising the expression vector as defined above, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0135] In some aspect, the pharmaceutical composition comprising the host cell as defined above, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0136] In some aspect, the present invention provides a method for treating a cancer, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined above or a masked IL12-Fc fusion protein as defined in the present invention, or the nucleic acid molecule, the expression vector, the host cell or the pharmaceutical composition as defined above. The cancer is selected from the group consisting of breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, melanoma, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, and stomach cancer.

[0137] In some aspect, the present invention provides a method for treating a disease, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined above or a masked IL12-Fc fusion protein as defined in the present invention, or the nucleic acid molecule, the expression vector, the host cell or the pharmaceutical composition as defined above. Typically, the subject has, or is at risk of developing, a proliferative disease, a tumorous disease, an inflammatory disease, an immunological disorder, an autoimmune disease, an infectious disease, a viral disease, an allergic reaction, a parasitic reaction, a graft-versus-host disease or a host-versus-graft disease.

[0138] In some aspect, the present invention provides a kit for treating tumor, the kit comprising a heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined above or a masked IL12-Fc fusion protein as defined in the present invention.

[0139] In various embodiments, the linker is selected from a peptide, a protein, a sugar, or a nucleic acid. In some embodiments, the linker is a peptide linker and may include any naturally occurring amino acid. Exemplary amino acids that may be included into the linker are Gly (G) , Ser (S) , Pro (P) , Thr (T) , Glu (E) , Lys (K) , Arg (R) , Leu (L) and His (H) . Exemplary linkers that may be used are Gly rich linkers, Gly and Ser containing linkers, Gly and Ala containing linkers, Ala and Ser containing linkers, and other uncleavable linkers.

[0140] The linker may be about 10-50 amino acids long. In some embodiments, the linker is about 10-40 amino acids long. In some embodiments, the linker is about 10-35 amino acids long. In some embodiments, the linker is about 10-30 amino acids long. In some embodiments, the linker is about 10-25 amino acids long. In some embodiments, the linker is about 20-25 amino acids long. In some embodiments, the linker is 10 amino acids long. In some embodiments, the linker is 15 amino acids long. In some embodiments, the linker is 20 amino acids long. In some embodiments, the linker is 25 amino acids long. In some embodiments, the linker is 30 amino acids long. In some embodiments, the linker is 35 amino acids long. In some embodiments, the linker is 40 amino acids long. In some embodiments, the linker is 45 amino acids long. In some embodiments, the linker is 50 amino acids long.

[0141] In some embodiments, the uncleavable linker comprising glycine and serine residues. In some embodiments, the uncleavable linker is preferably a peptide linker with an amino acid sequence with a length of at least 10 amino acids, preferably with a length of 10 to 50, more preferably of 20 to 40 amino acids. In one embodiment, said peptide linker is (GxS) n or (GxS) nGm with G=glycine, S=serine, and (x=3, n=3, 4, 5 or 6, and m=0, 1, 2 or 3) or (x=4, n=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 and m=0, 1, 2 or 3) , preferably x=4 and n=4, 5, 6, 7 or 8 and m=0.

[0142] In some embodiments, the uncleavable linker comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 ( (G4S) 4) . In some embodiments, the uncleavable linker comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 ( (G4S) 5) . In some embodiments, the uncleavable linker comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 ( (G4S) 6) . In some embodiments, the uncleavable linker comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 ( (G4S) 7) . In some embodiments, the uncleavable linker comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 ( (G4S) 8) .

[0143] In some aspects, the present invention is directed to a method for preparing the truncated IL-12 cytokine against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof provided herein, the method comprises expressing the truncated IL-12 cytokine against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof in a host cell and isolating the truncated IL-12 cytokine against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof from the host cell.

[0144] In some aspects, the present invention is directed to a method for preparing the masked IL-12 cytokine against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof provided herein, the method comprises expressing the masked IL-12 cytokine against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof in a host cell and isolating the masked IL-12 cytokine against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof from the host cell.

[0145] In some aspects, the present invention is directed to a method for preparing the nanobody binding to IL-12 cytokine provided herein, the method comprises expressing the nanobody binding to IL-12 cytokine in a host cell and isolating the nanobody from the host cell.

[0146] In some aspects, the present invention is directed to a method for inhibiting growth of tumor cells in a subject, comprising administering an effective amount of the truncated IL-12 cytokine against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof provided herein or the pharmaceutical composition as disclosed herein to the subject.

[0147] In some aspects, the present invention is directed to a method for inhibiting growth of tumor cells in a subject, comprising administering an effective amount of the masked IL-12 cytokine against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof provided herein or the pharmaceutical composition as disclosed herein to the subject.

[0148] In some aspects, the invention is directed to the use of the truncated IL-12 cytokine against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as disclosed herein in the manufacture of a medicament for treating cancer.

[0149] In some aspects, the invention is directed to the use of the masked IL-12 cytokine against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as disclosed herein in the manufacture of a medicament for treating cancer.

[0150] In some aspects, the invention is directed to the use of the nanobody as disclosed herein in the manufacture of a diagnostic agent for detecting IL-12.

[0151] In some aspects, the invention is directed to kits or devices and associated methods that employ the heterodimeric protein against IL-12 receptor as disclosed herein, or pharmaceutical compositions as disclosed herein, which are useful for the treatment of cancers. To this end the present invention preferably provides an article of manufacture useful for treating cancers comprising a receptacle containing the heterodimeric protein against IL-12 receptor as disclosed herein and instructional materials for using the heterodimeric protein against IL-12 receptor as disclosed herein to treat cancer.

[0152] The foregoing is a summary and thus contains, by necessity, simplifications, generalizations, and omissions of detail; consequently, those skilled in the art will appreciate that the summary is illustrative only and is not intended to be in any way limiting. Other aspects, features, and advantages of the methods, compositions and / or devices and / or other subject matter described herein will become apparent in the teachings set forth herein. The summary is provided to introduce a selection of concepts in a simplified form that are further described below in the Detailed Description. This summary is not intended to identify key features or essential features of the claimed subject matter, nor is it intended to be used as an aid in determining the scope of the claimed subject matter. Further, the contents of all references, patents and published patent applications cited throughout this application are incorporated herein in entirety by reference.

[0153] BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0154] Figure 1. The format of truncated IL12-Fc fusion protein (A) and masked IL12-Fc fusion protein (B) .

[0155] Figure 2. The SEAP activity of HEK-Blue IL-12 cells stimulated by truncated IL12-Fc fusion protein.

[0156] Figure 3. Binding of the nanobodies to the human IL-12p40 detected by SPR.

[0157] Figure 4. Blockade of IL-12 signaling detected by RGA.

[0158] Figure 5. The SEAP activity of HEK-Blue IL-12 cells stimulated by masked IL12-Fc fusion protein.

[0159] Figure 6. IFN-γ secretion in human PBMCs stimulated by masked IL12-Fc fusion protein.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0160] While the present invention may be embodied in many different forms, disclosed herein are specific illustrative embodiments thereof that exemplify the principles of the invention. It should be emphasized that the present invention is not limited to the specific embodiments illustrated. Moreover, any section headings used herein are for organizational purposes only and are not to be construed as limiting the subject matter described.

[0161] Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. Further, unless otherwise required by context, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular. More specifically, as used in this specification and the appended claims, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “aprotein” includes a plurality of proteins; reference to “a cell” includes mixtures of cells, and the like. In this application, the use of “or” means “and / or” unless stated otherwise. Furthermore, the use of the term “comprising” , as well as other forms, such as “comprises" and “comprised” , is not limiting. In addition, ranges provided in the specification and appended claims include both end points and all points between the end points.

[0162] Definitions

[0163] In order to better understand the invention, the definitions and explanations of the relevant terms are provided as follows.

[0164] As used herein, the term “isolated” refers to a substance or entity that has been separated from at least some of the components with which it was associated (whether in nature or in an experimental setting) . Isolated substances (e.g., polynucleotides or polypeptides) can have varying levels of purity in reference to the substances from which they have been isolated. Isolated substances and / or entities can be separated from at least about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, or more of the other components with which they were initially associated. In some embodiments, isolated substances are more than about 80%, about 85%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, about 99%, or more than about 99%pure. As used herein, a substance is “pure” if it is substantially free of other components.

[0165] By “substantially isolated” is meant that the compound is substantially separated from the environment in which it was formed or detected. Partial separation can include, for example, a composition enriched in the compound of the present disclosure. Substantial separation can include compositions containing at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 97%, or at least about 99%by weight of the compound of the present disclosure, or salt thereof.

[0166] A heterodimeric protein, nanobody, polynucleotide, vector, polypeptide, cell, or any composition disclosed herein which is “isolated” is a heterodimeric protein, nanobody, polynucleotide, vector, polypeptide, cell, or composition which is in a form not found in nature. Isolated polynucleotides, vectors, polypeptides, or compositions include those which have been purified to a degree that they are no longer in a form in which they are found in nature. In some aspect, a heterodimeric protein, nanobody, polynucleotide, vector, polypeptide, or composition which is isolated is substantially pure.

[0167] The term “nucleic acid” in its broadest sense, includes any compound and / or substance that comprises a polymer of nucleotides. These polymers are often referred to as polynucleotides. Exemplary nucleic acids or polynucleotides of the disclosure include, but are not limited to, ribonucleic acids (RNAs) , deoxyribonucleic acids (DNAs) , threose nucleic acids (TNAs) , glycol nucleic acids (GNAs) , peptide nucleic acids (PNAs) , locked nucleic acids or hybrids or combinations thereof.

[0168] As used herein, the term “polypeptide” and “peptide” are used interchangeably herein to refer to polymers of amino acids of any length. The terms also encompass an amino acid polymer that has been modified naturally or by intervention. Also included within the definition are, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid (including, for example, unnatural amino acids such as homocysteine, ornithine, p-acetylphenylalanine, D-amino acids, and creatine) , as well as other modifications known in the art. Polypeptides include encoded polynucleotide products, naturally occurring polypeptides, synthetic polypeptides, homologs, orthologs, paralogs, fragments and other equivalents, variants, and analogs of the foregoing. In some embodiments, a “peptide” can be less than or equal to 500 amino acids long, e.g., about 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 360, 400, 450 or 500 amino acids long.

[0169] As used herein, “cytokine” refers to any of a class of immunoregulatory proteins (such as interleukin or interferon) that are secreted by cells especially of the immune system and that are modulators of the immune system. Cytokine polypeptides that can be used in the fusion proteins disclosed herein include, but are not limited to transforming growth factors, interferons; interleukins, such as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21 and IL-25, tumor necrosis factors, such as tumor necrosis factor alpha and lymphotoxin; chemokines, and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) , as well as fragments of such polypeptides that active the cognate receptors for the cytokine (i.e., functional fragments of the foregoing) .

[0170] Interleukin-12 (IL-12) is a disulfide-linked heterodimer of two separately encoded subunits (p35 and p40) , which are linked covalently to give rise to the so-called bioactive heterodimeric (p70) molecule (Lieschke et al, 1997; Jana et al., 2014) . Apart from forming heterodimers (IL-12 and IL-23) , the p40 subunit is also secreted as a monomer (p40) and a homodimer (p402) . It is known in the art that synthesis of the heterodimer as a single chain with a linker connecting the p35 to the p40 subunit preserves the full biological activity of the heterodimer. IL-12 plays a critical role in the early inflammatory response to infection and in the generation of Th1 cells, which favor cell-mediated immunity.

[0171] IL-12 is a pleiotropic cytokine, the actions of which create an interconnection between the innate and adaptive immunity. IL-12 also possessing potent anti-tumor activity. IL-12 was first described as a factor secreted from PMA-induced EBV-transformed B-cell lines. Based on its actions, IL-12 has been designated as cytotoxic lymphocyte maturation factor and natural killer cell stimulatory factor. Due to bridging the innate and adaptive immunity and potently stimulating the production of IFNγ, a cytokine coordinating natural mechanisms of anticancer defense, IL-12 seemed ideal candidate for tumor immunotherapy in humans. However, it has been found that overproduction of IL-12 can be dangerous to the host because it is involved in the pathogenesis of a number of autoimmune inflammatory diseases (e.g. MS, arthritis, type 1 diabetes) . In addition, its short serum half-life and high dose-related toxicities limit its clinical efficacy.

[0172] The IL-12 receptor (IL-12R) is a heterodimeric complex consisting of IL-12Rβ1 and IL-12Rβ2 chains expressed on the surface of activated T-cells and natural killer cells (Trinchieri et al., 2003) . The IL-12Rβ1 chain binds to the IL-12p40 subunit, whereas IL-12p35 in association with IL-12Rβ2 confers an intracellular signaling ability (Benson et al., 2011) . Signal transduction through IL-12R induces phosphorylation of Janus kinase (Jak2) and tyrosine kinase (Tyk2) , that phosphorylate and activate signal transducer and activator of transcription (STAT) 1, STAT3, STAT4, and STAT5. The specific cellular effects of IL-12 are due mainly to activation of STAT4. IL-12 signaling plays an important role in the proliferation and differentiation of effector CD8+ T cells. During the effector phase, both the duration and strength of IL-12 signaling determines the fates of effector CD8+ T cells, with respect to whether they differentiate into short-lived effector cells (SLECs) or memory precursor effector cells (MPECs) , by modulating the expression levels of transcription factors.

[0173] As used herein, “truncated IL-12p40 subunit” or “truncated IL-12p40 polypeptide” refers to molecules that differ in their amino acid sequence from a native or reference IL-12p40 polypeptide. The “truncated IL-12p40 subunit” or “truncated IL-12p40 polypeptide” can possess substitutions, deletions, and / or insertions at certain positions within the amino acid sequence, as compared to a native or reference IL-12p40 polypeptide. For example, the “truncated IL-12p40 subunit” or “truncated IL-12p40 polypeptide” will possess at least about 50%identity, at least about 60%identity, at least about 70%identity, at least about 80%identity, at least about 90%identity, at least about 95%identity, at least about 99%identity, at least about 99.5%identity, at least about 99.6%identity, at least about 99.7%identity, at least about 99.8%identity, at least about 99.9%identity to a native or reference IL-12p40 polypeptide. In some embodiments, they will be at least about 80%, or at least about 90%identical to a native or reference IL-12p40 polypeptide.

[0174] The term “masked” refers to a moiety (e.g., a polypeptide or antibody) that binds to a cytokine (e.g., IL-12) and thereby partially inhibiting the cytokine from binding to its receptor on the surface of a target cell and / or exerting its biological functions. Examples of a masked moiety include, without limitations, a polypeptide derived from an extracellular domain of the cytokine’s natural receptor that makes contact with the cytokine, or a scFv or Fab of an antibody or nanobody which binds to the cytokine and inhibits the binding of the cytokine to its receptor.

[0175] As used herein, the term “linker” as used herein is preferably a peptide linker with an amino acid sequence with a length of at least 10 amino acids, preferably with a length of 10 to 50, more preferably of 20 to 40 amino acids. In one embodiment, said peptide linker is (GxS) n or (GxS) nGm with G=glycine, S=serine, and (x=3, n=3, 4, 5 or 6, and m=0, 1, 2 or 3) or (x=4, n=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 and m=0, 1, 2 or 3) , preferably x=4 and n=4, 5, 6, 7 or 8 and m=0.

[0176] The term “vector” , as used herein, refers to a nucleic acid vehicle which can have a polynucleotide inserted therein. When the vector allows for the expression of the protein encoded by the polynucleotide inserted therein, the vector is called an expression vector. The vector can have the carried genetic material elements expressed in a host cell by transformation, transduction, or transfection into the host cell. Vectors are well known by a person skilled in the art, including, but not limited to plasmids, phages, cosmids, artificial chromosome such as yeast artificial chromosome (YAC) , bacterial artificial chromosome (BAC) or P1-derived artificial chromosome (PAC) ; phage such as λ phage or M13 phage and animal virus. The animal viruses that can be used as vectors, include, but are not limited to, retrovirus (including lentivirus) , adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus (such as herpes simplex virus) , pox virus, baculovirus, papillomavirus, papova virus (such as SV40) . A vector may comprise multiple elements for controlling expression, including, but not limited to, a promoter sequence, a transcription initiation sequence, an enhancer sequence, a selection element and a reporter gene. In addition, a vector may comprise origin of replication.

[0177] The term “host cell” , as used herein, refers to a cellular system which can be engineered to generate proteins, protein fragments, or peptides of interest. Host cells include but not limitating a prokaryotic cell, such as a bacterial cell; or a lower eukaryotic cell, such as a yeast cell; or a higher eukaryotic cell, such as a mammalian cell. Representative examples are: E. coli, Streptomyces; bacterial cells of salmonella typhimurium; fungal cells such as yeast; insect cells of Drosophila S2 or Sf9; animal cells of CHO, COS7, 293 cells, etc. The term encompasses not only the particular subject cell but also the progeny of such a cell. Because certain modifications may occur in succeeding generations due to either mutation or environmental influences, such progeny may not be identical to the parent cell, but are still included within the scope of the term “host cell. ”

[0178] The term “identity” , as used herein, refers to a relationship between the sequences of two or more polypeptide molecules or two or more nucleic acid molecules, as determined by aligning and comparing the sequences. “Percent identity” means the percent of identical residues between the amino acids or nucleotides in the compared molecules and is calculated based on the size of the smallest of the molecules being compared. For these calculations, gaps in alignments (if any) are preferably addressed by a particular mathematical model or computer program (i.e., an “algorithm” ) . Methods that can be used to calculate the identity of the aligned nucleic acids or polypeptides include those described in Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed. ) , 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed.) , 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds. ) , 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds. ) , 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48: 1073.

[0179] The term “cancer” , as used herein, refers to any or a tumor or a malignant cell growth, proliferation or metastasis-mediated, solid tumors and non-solid tumors such as leukemia and initiate a medical condition. In some embodiments, the cancer is a solid cancer. In some embodiments, the cancer is a blood cancer or a solid tumor. Exemplary cancers that may be treated include, but are not limited to, leukemia, lymphoma, kidney cancer, bladder cancer, urinary tract cancer, cervical cancer, brain cancer, head and neck cancer, skin cancer, uterine cancer, testicular cancer, esophageal cancer, liver cancer, colorectal cancer, stomach cancer, squamous cell carcinoma, prostate cancer, pancreatic cancer, lung cancer such as non-small cell lung cancer, cholangiocarcinoma, breast cancer, and ovarian cancer.

[0180] As used herein, the terms “treatment” , “treating” , “treated” and the like, refer to partially or completely preventing, alleviating, ameliorating, improving, relieving, delaying onset of, inhibiting progression of, reducing severity of, and / or reducing incidence of one or more symptoms or features of a disease. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or symptom thereof and / or may be therapeutic in terms of a partial or complete cure for a disease and / or adverse effect attributable to the disease. Treatment thus covers any treatment of a disease in a mammal, particularly in a human, and includes: (a) preventing the disease from occurring in a subject, i.e. a human, which may be predisposed to the disease but has not yet been diagnosed as having it; (b) inhibiting the disease, i.e., arresting its development; and (c) relieving the disease, i.e., causing regression of the disease. For cancer, “treating” may refer to dampen or slow the tumor or malignant cell growth, proliferation, or metastasis, or some combination thereof.

[0181] The term “effective amount” or “therapeutically effective amount” refers to an amount of a compound or composition sufficient to treat a specified disorder, condition, or disease, such as ameliorate, palliate, lessen, and / or delay one or more of its symptoms. In reference to a disease such as cancer, an effective amount may be an amount sufficient to delay cancer development or progression (e.g., decrease tumor growth rate, and / or delay or prevent tumor angiogenesis, metastasis, or infiltration of cancer cells into peripheral organs) , reduce the number of epithelioid cells, cause cancer regression (e.g., shrink or eradicate a tumor) , and / or prevent or delay cancer occurrence or recurrence. An effective amount can be administered in one or more administrations.

[0182] The term “subject” refers to a mammal and includes, but is not limited to, a human, a pet (e.g., a canine or a feline) , a farm animal (e.g., cattle or horse) , a rodent, or a primate.

[0183] The term “prevent” , “prevention” or “preventing” , as used herein, with reference to a certain disease condition in a mammal, refers to preventing or delaying the onset of the disease, or preventing the manifestation of clinical or subclinical symptoms thereof.

[0184] The term “pharmaceutically acceptable” , as used herein, means that the vehicle, diluent, excipient and / or salts thereof, are chemically and / or physically is compatible with other ingredients in the formulation, and the physiologically compatible with the recipient.

[0185] As used herein, the term “a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient” refers to a carrier and / or excipient pharmacologically and / or physiologically compatible with a subject and an active agent, which is well known in the art (see, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) , and includes, but is not limited to pH adjuster, surfactant, adjuvant and ionic strength enhancer. For example, the pH adjuster includes, but is not limited to, phosphate buffer; the surfactant includes, but is not limited to, cationic, anionic, or non-ionic surfactant, e.g., Tween-80; the ionic strength enhancer includes, but is not limited to, sodium chloride.

[0186] As used herein, the term “adjuvant” refers to a non-specific immunopotentiator, which can enhance immune response to an antigen or change the type of immune response in an organism when it is delivered together with the antigen to the organism or is delivered to the organism in advance. There are a variety of adjuvants, including, but not limited to, aluminium adjuvants (for example, aluminum hydroxide) , Freund’s adjuvants (for example, Freund’s complete adjuvant and Freund’s incomplete adjuvant) , coryne bacterium parvum, lipopolysaccharide, cytokines, and the like. Freund's adjuvant is the most commonly used adjuvant in animal experiments now. Aluminum hydroxide adjuvant is more commonly used in clinical trials.

[0187] Strategies of forming heterodimeric protein are well known (see, e.g., Spies et ah, Mol Imm. (2015) 67 (2) (A) : 95-106) . For example, a first fusion protein and a second fusion protein may form stable heterodimers through “knobs-into-holes” mutations. “Knobs-into-holes” mutations are made to promote the formation of the heterodimers. For example, the Fc domain of the first fusion protein may comprise a T366W mutation in the CH3 domain of the “knob chain” and T366S, L368A, and / or Y407V mutations in the CH3 domain of the “hole chain. ” An additional interchain disulfide bridge between the hinge domains can also be used, e.g., by introducing a C220S mutation. Other knobs-into-holes technologies, such as those described in EP1870459A1, can be used alternatively or additionally. Thus, another example of knobs-into-holes mutations for an antibody moiety is having R409D / K370E mutations in the CH3 domain of the “knob chain” and D399K / E357K mutations in the CH3 domain of the “hole chain” (EU numbering) .

[0188] The heterodimeric proteins and nanobody of the invention can be produced in a host cell using, for example, a combination of recombinant DNA techniques and gene transfection methods as is well known in the art (e.g., Morrison, S. (1985) Science 229: 1202) . In one embodiment, DNA encoding the heterodimeric protein or nanobody of the invention obtained by standard molecular biology techniques is inserted into one or more expression vectors such that the genes are operatively linked to transcriptional and translational regulatory sequences. In this context, the term “operatively linked” is intended to mean that a gene is ligated into a vector such that transcriptional and translational control sequences within the vector serve their intended function of regulating the transcription and translation of the protein or antibody gene.

[0189] The term “regulatory sequence” is intended to include promoters, enhancers and other expression control elements (e.g., polyadenylation signals) that control the transcription or translation of the gene. Such regulatory sequences are described, e.g., in Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) ) . Exemplary regulatory sequences for mammalian host cell expression include viral elements that direct high levels of protein expression in mammalian cells, such as promoters and / or enhancers derived from cytomegalovirus (CMV) , Simian Virus 40 (SV40) , adenovirus, (e.g., the adenovirus major late promoter (AdMLP) and polyoma. Alternatively, nonviral regulatory sequences can be used, such as the ubiquitin promoter or β-globin promoter. Still further, regulatory elements composed of sequences from different sources, such as the SRa promoter system, which contains sequences from the SV40 early promoter and the long terminal repeat of human T cell leukemia virus type 1 (Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472) . The expression vector and expression control sequences are chosen to be compatible with the expression host cell used.

[0190] In addition to the genes encoding the heterodimeric protein or nanobody of the invention and regulatory sequences, the recombinant expression vectors of the invention can carry additional sequences, such as sequences that regulate replication of the vector in host cells (e.g., origins of replication) and selectable marker genes. The selectable marker gene facilitates selection of host cells into which the vector has been introduced (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 4,399,216; 4,634,665 and 5,179,017) . For example, typically the selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, on a host cell into which the vector has been introduced. Selectable marker genes may include the dihydrofolate reductase (DHFR) gene (for use in dhfr-host cells with methotrexate selection / amplification) and the neo gene (for G418 selection) .

[0191] For expression of the heterodimeric proteins and nanobody of the invention, the expression vector (s) encoding the heterodimeric protein or nanobody is transfected into a host cell by standard techniques. The various forms of the term “transfection” are intended to encompass a wide variety of techniques commonly used for the introduction of exogenous DNA into a prokaryotic or eukaryotic host cell, e.g., electroporation, calcium-phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection and the like. It is possible to express the antibodies of the invention in either prokaryotic or eukaryotic host cells, for example, mammalian host cells, which can assemble and secrete a properly folded and immunologically active protein.

[0192] The term “transfection” , as used herein, refers to the process by which nucleic acids are introduced into eukaryotic cells, particularly mammalian cells. Protocols and techniques for transfection include but not limited to lipid transfection and chemical and physical methods such as electroporation. A number of transfection techniques are well known in the art and are disclosed herein. See, e.g., Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13: 197. In a specific embodiment of the invention, the gene encoding the heterodimeric protein or nanobody of the invention was transfected into Expi293 cells.

[0193] When recombinant expression vectors encoding the heterodimeric proteins or nanobody of the invention are introduced into mammalian host cells, the heterodimeric proteins or nanobody are produced by culturing the host cells for a period of time sufficient to allow for expression of the heterodimeric proteins or nanobody in the host cells or, secretion of the heterodimeric proteins or nanobody into the culture medium in which the host cells are grown. The heterodimeric proteins or nanobody can be recovered from the culture medium using standard protein purification methods.

[0194] I. Truncated IL-12 cytokines

[0195] The present invention provides novel truncated IL12-Fc fusion proteins with decreased toxicity, longer half-life and lower immunogenicity.

[0196] In some aspect, the present invention provides a method to decrease the toxicity of IL-12 via reducing binding affinity of IL-12p40 subunit with IL-12Rβ1. In some aspect, the present invention provides a method to decrease the toxicity of IL-12 via reducing binding affinity of IL-12p40 subunit with IL-12Rβ1, the method comprises truncating part of N-terminal, C-terminal or middle amino acids of IL-12p40 subunit.

[0197] In some aspect, the present invention provides a method to decrease the toxicity of IL-12 via reducing binding affinity of IL-12p40 subunit with IL-12Rβ1, the method comprises truncating part of N-terminal amino acids of IL-12p40 subunit, preferably, the truncated IL-12p40 subunit is lack of one or more amino acids from position 1 to position 107 at N-terminus of IL-12p40 subunit.

[0198] In a specific embodiment, compared to the intact IL-12p40 subunit, the truncated IL-12p40 subunit is truncated from N-terminus of IL-12p40 subunit from the following positions: 1) : I1-H77, 2) : I1-K85, 3) : I1-E86, 4) : I1-D87, 5) : W90, 6) : I1-T92, 7) : I1-K96, 8) : I1-K99, 9) : I1-K102, 10) : I1-T105, 11) : I1-L107, 12) : I1-L13, 13) : I1-P20, 14) : I1-L26, 15) : I1-D34, 16) : I1-S44, 17) : I1-LS49, 18) : I1-L53, 19) : I1-K58, 20) : I1-A63, 21) : I1-K70, 22) : I1-W2, 23) : I1-E3, 24) : I1-L4, 25) : I1-K5, 26) : I1-K6, 27) : I1-V8, 28) : I1-Y9, 29) : I1-V11, 30) : I1-W15, 31) : I1-P17, or 32) : I1-D18.

[0199] In some aspect, the present invention provides a method to decrease the toxicity of IL-12 via reducing binding affinity of IL-12p40 subunit with IL-12Rβ1, the method comprises truncating part of middle amino acids of IL-12p40 subunit, preferably, the truncated IL-12p40 subunit is lack of one or more amino acids from position 34 to position 105 in the middle domain of IL-12p40 subunit.

[0200] In a specific embodiment, compared to the intact IL-12p40 subunit, the truncated IL-12p40 subunit is truncated from middle domain of IL-12p40 subunit from the following positions: 1) : G34-S49, 2) : D87-S91, 3) : Q98-T105, 4) : D87-K96, 5) : L95-T105, or 6) : D93-T105.

[0201] In some aspect, the present invention provides a method to decrease the toxicity of IL-12 via reducing binding affinity of IL-12p40 subunit with IL-12Rβ1, the method comprises truncating part of C-terminus amino acids of IL-12p40 subunit, preferably, the truncated IL-12p40 subunit is lack of one or more amino acids from position 295 to position 306 at C-terminus of IL-12p40 subunit.

[0202] In a specific embodiment, compared to the intact IL-12p40 subunit, the truncated IL-12p40 subunit is truncated from C-terminus of IL-12p40 subunit from the following position: S295-S306.

[0203] In the present application, the IL-12 polypeptide may be a wildtype IL-12 polypeptide such as a wildtype human IL-12, or an IL-21 mutant such as one derived from a human IL-12.

[0204] Compared with wild type IL-12, truncated IL-12 is potency reduced and less toxic. The therapeutic window of truncated IL-12 is probably extended for clinical usage. Compared with mutated IL-12 variants, truncated IL-12 doesn’t introduce new epitope and is probably less immunogenic in future clinical development.

[0205] Nanobody binding to IL-12p40

[0206] In some aspects, the present invention relates to nanobody binding to IL-12p40. Further aspects of the invention relate to methods of making such nanobody, compositions comprising such nanobody, and their use in the treatment of diseases and detection of IL-12.

[0207] In some embodiments, the nanobody binding to IL-12 cytokine and comprising:

[0208] (a) a CDR1 having two or fewer substitutions in any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107 or 115; and / or

[0209] (b) a CDR2 having two or fewer substitutions in any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109 or 117; and / or

[0210] (c) a CDR3 having two or fewer substitutions in any of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103, 111 or 119.

[0211] In some embodiments, the nanobody comprises: (a) a CDR1 sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107 and 115; and / or (b) a CDR2 sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109 and 117; and / or (c) a CDR3 sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103, 111 and 119. In some embodiments, the nanobody comprises: (a) a CDR1 sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107 and 115; and (b) a CDR2 sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109 and 117; and (c) a CDR3 sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103, 111 and 119.

[0212] In some embodiments, the nanobody comprising CDR1, CDR2 and CDR3 selected from the group consisting of:

[0213] (a) SEQ ID NOs: 51, 53 and 55, respectively;

[0214] (b) SEQ ID NOs: 59, 61 and 63, respectively;

[0215] (c) SEQ ID NOs: 67, 69 and 71, respectively;

[0216] (d) SEQ ID NOs: 75, 77 and 79, respectively;

[0217] (e) SEQ ID NOs: 83, 85 and 87, respectively;

[0218] (f) SEQ ID NOs: 91, 93 and 95, respectively;

[0219] (g) SEQ ID NOs: 99, 101 and 103, respectively;

[0220] (h) SEQ ID NOs: 107, 109 and 111, respectively; and

[0221] (i) SEQ ID NOs: 115, 117 and 119, respectively.

[0222] In some embodiments, the nanobody further comprising framework domain. In some embodiments, the nanobody comprising from N-terminus to C-terminus: a first framework domain; CDR1; a second framework domain; CDR2; a third framework domain; CDR3; a fourth framework domain. In some embodiments, the CDR1, CDR2, and CDR3 sequences are present in a human framework. In some embodiments, the CDR1, CDR2, and CDR3 sequences are present in a non-human framework.

[0223] In some embodiments, the first framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0224] In a specific embodiment, the first framework domain comprises a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0225] In a specific embodiment, the first framework domain consisting of a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain consisting of a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain consisting of a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain consisting of a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.

[0226] In some embodiment, the nanobody comprising an amino acid sequence with at least 80%identity to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0227] In some embodiment, the nanobody comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0228] In some embodiments, the nanobody has binding affinity to IL-12. In some embodiments, the nanobody has binding affinity to IL-12p40.

[0229] In some aspects, the invention relates to polynucleotides encoding a nanobody described herein, vectors comprising such polynucleotides, and cells comprising such vectors.

[0230] In some aspects, the invention relates to pharmaceutical compositions comprising the nanobody described herein.

[0231] In some aspects, the invention relates to methods for the treatment of autoimmune diseases, including lupus, celiac disease, diabetes mellitus type 1, Graves’ disease, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, psoriasis, rheumatoid arthritis, and systemic lupus erythematosus.

[0232] In some aspects, the invention relates to methods of treatment, comprising administering to an individual in need an effective amount of a nanobody or pharmaceutical composition as described herein.

[0233] In some aspects, the invention relates to methods of producing a nanobody described herein, comprising growing a cell described herein under conditions permissive for expression of the antibody, and isolating the antibody from the cell and / or a cell culture medium in which the cell is grown.

[0234] Antibody residues herein are numbered according to the Kabat numbering system and the EU numbering system. The Kabat numbering system is generally used when referring to a residue in the variable domain (see, e.g., Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 and Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) . The “EU numbering system” or “EU index” is generally used when referring to a residue in an immunoglobulin heavy chain constant region (e.g., the EU index reported in Kabat et al., supra) . Unless stated otherwise herein, references to residue numbers in the variable domain of antibodies mean residue numbering by the Kabat numbering system. Unless stated otherwise herein, references to residue numbers in the constant domain of antibodies mean residue numbering by the EU numbering system.

[0235] In a specific embodiment, the CDRs of the antibodies described herein have been determined according to the Kabat numbering scheme. CDR boundaries for antibodies may also be defined or identified by the conventions of Chothia (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) ) or IMGT (the international ImMunoGeneTics database, http:  / / www. imgt. org) .

[0236] The variability is not evenly distributed throughout the variable domains of antibodies. It is concentrated in three segments called hypervariable regions both in the light chain and the heavy chain variable domains. The more highly conserved portions of variable domains are called the framework regions (FRs) . The variable domains of native heavy and light chains each comprise four FRs, largely adopting a β-sheet configuration, connected by three hypervariable regions, which form loops connecting, and in some cases forming part of, the β-sheet structure. The hypervariable regions in each chain are held together in close proximity by the FRs and, with the hypervariable regions from the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding site of antibodies.

[0237] As used herein, the terms “single domain” , “VHH” , “nanobody” , “heavy chain antibody” (single domain antibody, sdAb, or nanobody) have the same meaning and are used interchangeably to refer to the cloning of the variable region of an antibody heavy chain and the construction of a nanobody (VHH) consisting of only one variable region of the heavy chain, which is the smallest antigen-binding fragment with full functionality.

[0238] In general, the antigen-binding properties of antibodies can be described by three specific regions, called variable regions (CDRs) , located in the variable region of the heavy chain, spacing the segment into four framework regions (FRs) . The amino acid sequences of the four FRs are relatively conservative and are not directly involved in the binding reaction. These CDRs form a ring-like structure and are spatially structured close to each other by the β-fold formed by the FRs between them.

[0239] Nanobody of the present invention refers to polypeptide having IL-12 binding activity and comprising the CDR region as described above. The term also includes variant forms of polypeptide having the same function as the nanobody of the present invention and comprising the CDR region as described above. These variant forms include, but are not limited to, deletion, insertion and / or substitution of one or more (typically 1-50, preferably 1-30, more preferably 1-20, most preferably 1-10) amino acids, and addition of one or more (typically up to 20, preferably up to 10, more preferably up to 5) amino acids to the C-terminus and / or N-terminus. For example, in the art, substitution with amino acids of similar or close properties does not normally alter the function of the protein. For example, the addition of one or more amino acids to the C-terminus and / or N-terminus does not normally alter the function of the protein. The term also includes active fragments and active derivatives of nanobody of the present invention.

[0240] In some embodiments, the CDRs of the nanobody contain a conservative substitution of not more than 3 amino acids. The term “conservative substitution” , as used herein, refers to amino acid substitutions which would not disadvantageously affect or change the essential properties of a protein / polypeptide comprising the amino acid sequence. For example, a conservative substitution may be introduced by standard techniques known in the art such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Conservative amino acid substitutions include substitutions wherein an amino acid residue is substituted with another amino acid residue having a similar side chain, for example, a residue physically or functionally similar (such as, having similar size, shape, charge, chemical property including the capability of forming covalent bond or hydrogen bond, etc. ) to the corresponding amino acid residue. The families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids having alkaline side chains (for example, lysine, arginine and histidine) , amino acids having acidic side chains (for example, aspartic acid and glutamic acid) , amino acids having uncharged polar side chains (for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, tryptophan) , amino acids having nonpolar side chains (for example, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine) , amino acids having β-branched side chains (such as threonine, valine, isoleucine) and amino acids having aromatic side chains (for example, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . Therefore, a corresponding amino acid residue is preferably substituted with another amino acid residue from the same side-chain family. Methods for identifying amino acid conservative substitutions are well known in the art (see, for example, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993) ; Kobayashi et al., Protein Eng. 12 (10) : 879-884 (1999) ; and Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997) , which are incorporated herein by reference) .

[0241] The percent identity between two amino acid sequences can be determined using the algorithm of E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988) ) which has been incorporated into the ALIGN program (version 2.0) , using a PAM120 weight residue table, a gap length penalty of 12 and a gap penalty of 4. In addition, the percentage of identity between two amino acid sequences can be determined by the algorithm of Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970) ) which has been incorporated into the GAP program in the GCG software package (available at http:  / / www. gcg. com) , using either a Blossum 62 matrix or a PAM250 matrix, and a gap weight of 16, 14, 12, 10, 8, 6, or 4 and a length weight of 1, 2, 3, 4, 5, or 6.

[0242] III. Masked IL-12 cytokines

[0243] The present invention provides novel masked IL12-Fc fusion proteins. In some aspect, the present invention provides a method to decrease the toxicity of IL-12 via reducing binding affinity of IL-12p40 subunit with IL-12Rβ1. In some aspect, the present invention provides a method to decrease the toxicity of IL-12 via reducing binding affinity of IL-12p40 subunit with IL-12Rβ1, the method comprises masking the p40 subunit of IL-12 by a masked moiety. The masked moiety includes, without limitations, a polypeptide derived from an extracellular domain of the receptor of IL-12, or a scFv or Fab of an antibody or nanobody which binds to the IL-12 and inhibits the binding of the IL-12 to its receptor.

[0244] In some embodiments, the masked moiety comprises a peptide identified from the screening of a peptide library. In some embodiments, the masked moiety comprises an antibody or antigen-binding fragment thereof that blocks the binding of IL-12 or IL-12 mutant, leading to the reduced biological activities of the IL-12 moiety while masked. In some embodiments, the masked moiety is nanobody binding to IL-12 cytokine. In specific embodiment, the nanobody comprising or consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.

[0245] In some embodiments, the masked moiety may be linked to the N-terminus or C-terminus of the IL-12 cytokine. In some embodiments, the masked moiety may be linked to the N-terminus of the IL-12 cytokine through a uncleavable linker. In some embodiments, the masked moiety may be linked to the N-terminus of the IL-12 cytokine through a uncleavable peptide linker. Compared with IL-12 containing amino acid mutations, VHH-masked IL-12 is potentially less immunogenic.

[0246] In the present application, the IL-12 polypeptide may be a wildtype IL-12 polypeptide such as a wildtype human IL-12, or an IL-21 mutant such as one derived from a human IL-12.

[0247] Pharmaceutical Compositions

[0248] In some aspects, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0249] Pharmaceutical compositions comprising the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein may be prepared by mixing the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein with one or more optional pharmaceutically acceptable carriers (see, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition., Osol, A. Ed. (1980) ) in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. Pharmaceutically acceptable carriers (or excipients) are generally nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include, but are not limited to: buffers containing, for example, phosphate, citrate, succinate, histidine, acetate, or another inorganic or organic acid or salt thereof; antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben) ; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates including sucrose, glucose, mannose, or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counter-ions such as sodium; metal complexes (e.g. Zn-protein complexes) ; and / or non-ionic surfactants such as polyethylene glycol (PEG) .

[0250] Buffers are used to control the pH in a range, especially if stability is pH dependent. Suitable buffering agents for use with the present invention include both organic and inorganic acids and salts thereof, such as citrate, phosphate, succinate, tartrate, fumarate, gluconate, oxalate, lactate, and acetate. Additionally, buffers may comprise histidine and trimethylamine salts such as Tris.

[0251] Preservatives are added to retard microbial growth, and are typically present in a range from 0.2%-1.0% (w / v) . Suitable preservatives for use with the present invention include hexamethonium chloride; benzalkonium halides (e.g., chloride, bromide, iodide) , benzethonium chloride; thimerosal, phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol, 3-pentanol, and m-cresol.

[0252] Tonicity agents, sometimes known as “stabilizers” are present to adjust or maintain the tonicity of liquid in a composition. When used with large, charged biomolecules such as proteins and antibodies, they are often termed “stabilizers” because they can interact with the charged groups of the amino acid side chains, thereby lessening the potential for inter-and intra molecular interactions. Tonicity agents can be present in any amount between 0.1%to 25%by weight, or more preferably between 1%to 5%by weight, taking into account the relative amounts of the other ingredients. Preferred tonicity agents include polyhydric sugar alcohols, preferably trihydric or higher sugar alcohols, such as glycerin, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol and mannitol.

[0253] Non-ionic surfactants or detergents (also known as “wetting agents” ) are present to help solubilize the therapeutic agent as well as to protect the therapeutic protein against agitation-induced aggregation, which also permits the formulation to be exposed to shear surface stress without causing denaturation of the active therapeutic protein or antibody.

[0254] The choice of pharmaceutical carrier, excipient or diluent may be selected with regard to the intended route of administration and standard pharmaceutical practice. Pharmaceutical compositions may additionally comprise any suitable binder (s) , lubricant (s) , suspending agent (s) , coating agent (s) or solubilizing agent (s) .

[0255] There may be different composition / formulation requirements dependent on the different delivery systems. By way of example, pharmaceutical compositions useful in the present invention may be formulated to be administered using a mini-pump or by a mucosal route, for example, as a nasal spray or aerosol for inhalation or ingestible solution, or parenterally in which the composition is formulated by an injectable form, for delivery, by, for example, an intravenous, intramuscular or subcutaneous route.

[0256] In some embodiments, the pharmaceutical composition of the present disclosure is a lyophilized protein formulation. In other embodiments, the pharmaceutical composition may be an aqueous liquid formulation.

[0257] The pharmaceutical composition of the invention may be administered in vivo, to a subject in need thereof, by various routes, including, but not limited to, oral, intravenous, intra-arterial, subcutaneous, parenteral, intranasal, intramuscular, intracranial, intracardiac, intraventricular, intratracheal, buccal, rectal, intraperitoneal, intradermal, topical, transdermal, and intrathecal, or otherwise by implantation or inhalation.

[0258] Frequency of administration may be determined and adjusted over the course of therapy, and is based on reducing the number of proliferative or tumorigenic cells, maintaining the reduction of such neoplastic cells, reducing the proliferation of neoplastic cells, or delaying the development of metastasis. In some embodiments, the dosage administered may be adjusted or attenuated to manage potential side effects and / or toxicity. Alternatively, sustained continuous release formulations of a subject therapeutic composition may be appropriate.

[0259] It will be appreciated by one of skill in the art that appropriate dosages can vary from patient to patient. Determining the optimal dosage will generally involve the balancing of the level of therapeutic benefit against any risk or deleterious side effects. The selected dosage level will depend on a variety of factors including, but not limited to, the activity of the particular compound, the route of administration, the time of administration, the rate of excretion of the compound, the duration of the treatment, other drugs, compounds, and / or materials used in combination, the severity of the condition, and the species, sex, age, weight, condition, general health, and prior medical history of the patient. The amount of compound and route of administration will ultimately be at the discretion of the physician, veterinarian, or clinician, although generally the dosage will be selected to achieve local concentrations at the site of action that achieve the desired effect without causing substantial harmful or deleterious side-effects.

[0260] In general, the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein may be administered in various ranges. These include about 5 μg / kg body weight to about 100 mg / kg body weight per dose; about 50 μg / kg body weight to about 5 mg / kg body weight per dose; about 100 μg / kg body weight to about 10 mg / kg body weight per dose. Other ranges include about 100 μg / kg body weight to about 20 mg / kg body weight per dose and about 0.5 mg / kg body weight to about 20 mg / kg body weight per dose. In certain embodiments, the dosage is at least about 100 μg / kg body weight, at least about 250 μg / kg body weight, at least about 750 μg / kg body weight, at least about 3 mg / kg body weight, at least about 5 mg / kg body weight or at least about 10 mg / kg body weight.

[0261] In any event, the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein is preferably administered as needed to subjects in need thereof. Determination of the frequency of administration may be made by persons skilled in the art, such as an attending physician based on considerations of the condition being treated, age of the subject being treated, severity of the condition being treated, general state of health of the subject being treated and the like.

[0262] In certain preferred embodiments, the course of treatment involving the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein will comprise multiple doses of the selected drug product over a period of weeks or months. More specifically, the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein may be administered once every day, every two days, every four days, every week, every ten days, every two weeks, every three weeks, every month, every six weeks, every two months, every ten weeks or every three months. In this regard, it will be appreciated that the dosages may be altered or the interval may be adjusted based on patient response and clinical practices.

[0263] Dosages and regimens may also be determined empirically for the disclosed therapeutic compositions in individuals who have been given one or more administration (s) . For example, individuals may be given incremental dosages of a therapeutic composition produced as described herein. In selected embodiments, the dosage may be gradually increased or reduced or attenuated based respectively on empirically determined or observed side effects or toxicity. To assess efficacy of the selected composition, a marker of the specific disease, disorder or condition can be followed as described previously. It will be apparent to one of skill in the art that the dosage will vary depending on the individual, the type of neoplastic condition, the stage of neoplastic condition, whether the neoplastic condition has begun to metastasize to other location in the individual, and the past and concurrent treatments being used.

[0264] Combined use with chemotherapies

[0265] The heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein may be used in combination with an anti-cancer agent, a cytotoxic agent or chemotherapeutic agent.

[0266] The term “anti-cancer agent” or “anti-proliferative agent” means any agent that can be used to treat a cell proliferative disorder such as cancer, and includes, but is not limited to, cytotoxic agents, cytostatic agents, anti-angiogenic agents, debulking agents, chemotherapeutic agents, radiotherapy and radiotherapeutic agents, targeted anti-cancer agents, BRMs, therapeutic antibodies, cancer vaccines, cytokines, hormone therapies, radiation therapy and anti-metastatic agents and immunotherapeutic agents. It will be appreciated that, in selected embodiments as discussed above, such anti-cancer agents may comprise conjugates and may be associated with the disclosed site-specific antibodies prior to administration. More specifically, in certain embodiments selected anti-cancer agents will be linked to the unpaired cysteines of the engineered antibodies to provide engineered conjugates as set forth herein. Accordingly, such engineered conjugates are expressly contemplated as being within the scope of the instant invention. In other embodiments, the disclosed anti-cancer agents will be given in combination with site-specific conjugates comprising a different therapeutic agent as set forth above.

[0267] As used herein the term “cytotoxic agent” means a substance that is toxic to the cells and decreases or inhibits the function of cells and / or causes destruction of cells. In certain embodiments, the substance is a naturally occurring molecule derived from a living organism. Examples of cytotoxic agents include, but are not limited to, small molecule toxins or enzymatically active toxins of bacteria (e.g., Diptheria toxin, Pseudomonas endotoxin and exotoxin, Staphylococcal enterotoxin A) , fungal (e.g., α-sarcin, restrictocin) , plants (e.g., abrin, ricin, modeccin, viscumin, pokeweed anti-viral protein, saporin, gelonin, momoridin, trichosanthin, barley toxin, Aleurites fordii proteins, dianthin proteins, Phytolacca americana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S) , Momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, saponaria officinalis inhibitor, mitegellin, restrictocin, phenomycin, neomycin, and the tricothecenes) or animals, (e.g., cytotoxic RNases, such as extracellular pancreatic RNases; DNase I, including fragments and / or variants thereof) .

[0268] For the purposes of the instant invention a “chemotherapeutic agent” comprises a chemical compound that non-specifically decreases or inhibits the growth, proliferation, and / or survival of cancer cells (e.g., cytotoxic or cytostatic agents) . Such chemical agents are often directed to intracellular processes necessary for cell growth or division, and are thus particularly effective against cancerous cells, which generally grow and divide rapidly. For example, vincristine depolymerizes microtubules, and thus inhibits cells from entering mitosis. In general, chemotherapeutic agents can include any chemical agent that inhibits, or is designed to inhibit, a cancerous cell or a cell likely to become cancerous or generate tumorigenic progeny (e.g., TIC) . Such agents are often administered, and are often most effective, in combination, e.g., in regimens such as CHOP or FOLFIRI.

[0269] Combined use with radiotherapies

[0270] The present invention also provides for the combination of the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein with radiotherapy (i.e., any mechanism for inducing DNA damage locally within tumor cells such as gamma-irradiation, X-rays, UV-irradiation, microwaves, electronic emissions and the like) . Combination therapy using the directed delivery of radioisotopes to tumor cells is also contemplated, and the disclosed conjugates may be used in connection with a targeted anti-cancer agent or other targeting means. Typically, radiation therapy is administered in pulses over a period of time from about 1 to about 2 weeks. Optionally, the radiation therapy may be administered as a single dose or as multiple, sequential doses.

[0271] Pharmaceutical packs and kits

[0272] Pharmaceutical packs and kits comprising one or more containers, comprising one or more doses of the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein are also provided. In certain embodiments, a unit dosage is provided wherein the unit dosage contains a predetermined amount of a composition comprising, for example, the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein, with or without one or more additional agents. For other embodiments, such a unit dosage is supplied in single-use prefilled syringe for injection. In still other embodiments, the composition contained in the unit dosage may comprise saline, sucrose, or the like; a buffer, such as phosphate, or the like; and / or be formulated within a stable and effective pH range. Alternatively, in certain embodiments, the conjugate composition may be provided as a lyophilized powder that may be reconstituted upon addition of an appropriate liquid, for example, sterile water or saline solution. In certain preferred embodiments, the composition comprises one or more substances that inhibit protein aggregation, including, but not limited to, sucrose and arginine. Any label on, or associated with, the container (s) indicates that the enclosed conjugate composition is used for treating the neoplastic disease condition of choice.

[0273] The present invention also provides kits for producing single-dose or multi-dose administration units of site-specific conjugates and, optionally, one or more anti-cancer agents. The kit comprises a container and a label or package insert on or associated with the container. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, etc. The containers may be formed from a variety of materials such as glass or plastic and contain a pharmaceutically effective amount of the disclosed conjugates in a conjugated or unconjugated form. In other preferred embodiments, the container (s) comprise a sterile access port (for example the container may be an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle) . Such kits will generally contain in a suitable container a pharmaceutically acceptable formulation of the engineered conjugate and, optionally, one or more anti-cancer agents in the same or different containers. The kits may also contain other pharmaceutically acceptable formulations, either for diagnosis or combined therapy. For example, in addition to the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein of the invention such kits may contain any one or more of a range of anti-cancer agents such as chemotherapeutic or radiotherapeutic drugs; anti-angiogenic agents; anti-metastatic agents; targeted anti-cancer agents; cytotoxic agents; and / or other anti-cancer agents.

[0274] More specifically the kits may have a single container that contains the disclosed the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein, with or without additional components, or they may have distinct containers for each desired agent. Where combined therapeutics are provided for conjugation, a single solution may be pre-mixed, either in a molar equivalent combination, or with one component in excess of the other. Alternatively, the conjugates and any optional anti-cancer agent of the kit may be maintained separately within distinct containers prior to administration to a patient. The kits may also comprise a second / third container means for containing a sterile, pharmaceutically acceptable buffer or other diluent such as bacteriostatic water for injection (BWFI) , phosphate-buffered saline (PBS) , Ringer's solution and dextrose solution.

[0275] When the components of the kit are provided in one or more liquid solutions, the liquid solution is preferably an aqueous solution, with a sterile aqueous or saline solution being particularly preferred. However, the components of the kit may be provided as dried powder (s) . When reagents or components are provided as a dry powder, the powder can be reconstituted by the addition of a suitable solvent. It is envisioned that the solvent may also be provided in another container.

[0276] As indicated briefly above the kits may also contain a means by which to administer the heterodimeric protein or nanobody as disclosed herein and any optional components to a patient, e.g., one or more needles, I. V. bags or syringes, or even an eye dropper, pipette, or other such like apparatus, from which the formulation may be injected or introduced into the animal or applied to a diseased area of the body. The kits of the present invention will also typically include a means for containing the vials, or such like, and other component in close confinement for commercial sale, such as, e.g., injection or blow-molded plastic containers into which the desired vials and other apparatus are placed and retained.

[0277] Sequence Listing Summary

[0278] Appended to the instant application is a sequence listing comprising a number of amino acid sequences.

[0279] Table 1. Sequence Listing Summary

[0280] EXAMPLES

[0281] The present invention, thus generally described, will be understood more readily by reference to the following Examples, which are provided by way of illustration and are not intended to be limiting of the instant invention. The Examples are not intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed.

[0282] EXAMPLE 1

[0283] Truncated IL12-Fc fusion protein

[0284] 1.1 Commercial Materials

[0285] The commercial materials used in the Example 1 are listed in Table 2.

[0286] Table 2

[0287] 1.2 Control protein generation

[0288] W3XX175-C1R0. Z21-1. uIgG1V458 was the wild-type human IL12 fused with human IgG1 Fc produced as control. DNA sequences encoding the human IL12p35 and IL12p40 were synthesized in Sangon Biothech (Shanghai, China) . Then the human IL12p35 was subcloned into modified pcDNA3.4 expression vectors containing human IgG1 Fc which hinge domain with C220S mutation and constant region of CH2-CH3 with L234A-L235A-T366S-L368A-Y407V mutations. Human IL12-p40 was subcloned into modified pcDNA3.4 expression vectors containing human IgG1 Fc which hinge domain with C220S mutation and constant region of CH2-CH3 with L234A-L235A-S354C-T366W mutations.

[0289] The plasmids containing p35 and p40 gene were co-transfected into Expi293 cells. Cells were cultured for 5 days and supernatant was collected for protein purification using Protein A column (GE Healthcare, 175438) and further size exclusion chromatography (Cytiva-28990944) . The obtained antibodies were analyzed by SDS-PAGE and SEC-HPL, and then stored at -80 ℃.

[0290] 1.3 Truncated IL-12 generation

[0291] IL12p35 was inserted into a linearized vector containing human IgG1 Fc which hinge domain with C220S mutation and constant region of CH2-CH3 with L234A-L235A-T366S-L368A-Y407V mutations. The truncated IL12p40 DNA fragment was inserted into a linearized vector containing constant region of Fc which hinge domain with C220S mutation and constant region of CH2-CH3 with L234A-L235A-S354C-T366W mutations.

[0292] The expression plasmids were co-transfected into Expi293 cells using Expi293 expression system kit (ThermoFisher-A14635) according to the manufacturer’s instructions. Five days after transfection, the supernatant of Expi293 cells (Thermofisher, A14635) expressing target proteins was collected and filtered for purification using either Protein A column (GE Healthcare, Cat. 175438) and further size exclusion chromatography (Cytiva-28990944) . The concentration of purified proteins was determined by absorbance at 280 nm. The size and purity were tested by SDS-PAGE and SEC-HPLC, respectively; and then stored at -80 ℃.

[0293] 1.4 IL-12 reporter gene assay

[0294] HEK-Blue IL-12 cells express a signal transducer and activator of transcription 4 (STAT4) -inducible secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) reporter gene, which can be triggered by binding of IL-12 to IL-12R. HEK-Blue IL-12 cells were seeded onto a 96-well plate at 50,000 cells / well in DMEM complete culture medium containing 10%FBS and 1%PS and stimulated with a dilution series of IL-12 proteins (5-fold serially diluted from 1000nM to 0.0005nM) . The plates were kept in an incubator set to 37℃ and 5%CO2 for 24 hours. After incubation, SEAP concentration in supernatant was detected by the addition of Quanti-Blue as described by the manufacturer and analyzed using a Microplate spectrophotometer (SpectraMax M5e) measuring absorbance at 630 nm.

[0295] 1.5 Results

[0296] The SEAP activity in the HEK-Blue IL-12 cells was measured after IL-12 stimulation. As shown in Figure 2, W3XX175-C1R0. Z23-1. uIgG1V458 to W3XX175-C1R0. Z23-10 showed little potency. W310175-C1R0. Z23-22. uIgG1V458 to W310175-C1R0. Z23-25 do not show any reduced potency compared to W3XX175-C1R0. Z21-1. uIgG1V458 (wild type IL-12) . The remaining W3XX175 IL-12 proteins showed much lower potency than wild type IL-12.

[0297] EXAMPLE 2

[0298] Nanobody against IL12p40

[0299] Two alpacas were subcutaneously injected with human IL-12 protein (ACRO, ILB-H52W5) . Blood samples were collected from immunized alpacas for phage display library construction. VHHs that bind to IL-12p40 were screened via two rounds protein-based panning and ELISA-based binding assay. VHHs were then fused to the Fc region of IgG4 to test their binding affinity of IL-12p40 and whether they could counteract the activation of IL-12 signaling pathway.

[0300] 1. Binding to human IL-12 P40 by SPR

[0301] 1.1 Commercial materials (Table 3)

[0302] 1.2 Antigen (Table 4)

[0303] 1.3 Equipment (Table 5)

[0304] 1.4 Methods

[0305] 1.4.1 Immobilization

[0306] The activator was prepared by mixing 400 mM EDC (1-Ethyl-3- (3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide) and 100 mM NHS (N-Hydroxy Succinimide) immediately prior to injection. The CM5 sensor chip was activated for 420 s at a flow rate of 10 μL / min with the mixture. 30 μg / mL of anti-human IgG Fc antibody in 10 mM NaAc (pH 4.5) was then injected to channel 1-8 for 420 s at a flow rate of 10 μL / min. The chip was deactivated by 1 M ethanolamine-HCl (Cytiva) for 420 s at a flow rate of 10 μL / min.

[0307] 1.4.2 Capturing Ligand and Running Analyte

[0308] 0.5 μg / mL of anti-IL-12 antibodies in running buffer (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05%surfactant P20, pH 7.4) were injected to Fc2 at a flow rate of 10 μL / min for 30 s. Gradient concentrations of human IL-12 p40 protein and running buffer were injected orderly to Fc1-Fc2 at a flow rate of 30 μL / min for an association phase of 180 s, followed by 3600 s dissociation. 10 mM glycine (pH 1.5) as regeneration buffer was injected to flow cells following every dissociation phase. The results are shown in Figure 3 and Table 6.

[0309] Table 6. Binding to human IL-12 P40 by SPR

[0310] 2. Cell based functional assays (Reporter gene assay for human IL-12)

[0311] 2.1 Commercial materials (Table 7)

[0312] 2.2 Equipments (Table 8)

[0313] 2.3 Methods

[0314] To test whether anti-IL-12 antibodies can counteract the activation of IL-12 signaling pathway, we chose reporter gene assay (RGA) system as functional assay. HEK-BlueTM IL-12 cells were generated by stably introducing the human genes for the IL-12 receptor and the genes of the IL-12 signaling pathway into HEK293 cells. In addition, they express a STAT4-inducible secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) reporter gene, which can be detected and quantified by QUANTI‐BlueTM Solution according to InvivoGen Manufacture Protocol and Technical Data Sheet.

[0315] HEK-BlueTM IL-12 were resuspended in DMEM complete culture medium, mixed with human IL-12 and indicated anti-IL-12 or control antibodies. The mixture was then added into 96-well plates in a volume of 100 μL / well at a density of 5×104 cells / well and the final concentration of human IL-12 is 6.0 ng / mL. The plates were incubated overnight in an incubator set to 37℃, 5%CO2. After incubation, 180 μL pre-warm QUANTI-Blue Solution was mixed with 20 μL culture supernatant in a new plate and incubated in an incubator set to 37℃ for about 30 mins. The SEAP levels were measured by a spectrophotometer at 630 nm. Human IgG4 isotype antibody was used as the negative control in this assay. The IC50 values were calculated by four-parameter non-linear regression analysis using GraphPad Prism 7 software. The results are shown in Figure 4 and Table 9.

[0316] Table 9. Blockade of IL-12 signaling by RGA

[0317] EXAMPLE 3

[0318] Masked IL12-Fc fusion protein

[0319] 3.1 Commercial Materials

[0320] The commercial materials used in the Example 3 are listed in Table 10.

[0321] Table 10

[0322] 3.2 Control protein generation

[0323] W3XX175-C1R0. Z21-1. uIgG1V458 was the wild-type human IL12 fused with human IgG1 Fc produced as control. DNA sequences encoding the human IL12p35 and IL12p40 were synthesized in Sangon Biothech (Shanghai, China) . Then the human IL12p35 was subcloned into modified pcDNA3.4 expression vectors containing human IgG1 Fc which hinge domain with C220S mutation and constant region of CH2-CH3 with L234A-L235A-T366S-L368A-Y407V mutations. And human IL12-p40 was subcloned into modified pcDNA3.4 expression vectors containing human IgG1 Fc which hinge domain with C220S mutation and constant region of CH2-CH3 with L234A-L235A-S354C-T366W mutations.

[0324] The plasmids containing p35 and p40 gene were co-transfected into Expi293 cells. Cells were cultured for 5 days and supernatant was collected for protein purification using Protein A column (GE Healthcare, 175438) and further size exclusion chromatography (Cytiva-28990944) . The obtained antibodies were analyzed by SDS-PAGE and SEC-HPL, and then stored at -80 ℃.

[0325] 3.3 The VHH mask IL-12 Generation

[0326] W3XX175-C1R0. Z22-4. uIgG1V458 to W3XX175-C1R0. Z22-24. uIgG1V458 were constructed using Z22 format. To construct Z22 format, the IL-12-p35 was inserted into a linearized vector containing human IgG1 Fc which hinge domain with C220S mutation and constant region of CH2-CH3 with L234A-L235A-T366S-L368A-Y407V mutations. The anti-IL-12p40 VH and IL-12-p40 DNA fragment was inserted into a linearized vector containing constant region of Fc which hinge domain with C220S mutation and constant region of CH2-CH3 with L234A-L235A-S354C-T366W mutations. The linkers between VHH and IL12-p40 were 4 X (GGGS) , 5 X (GGGS) , 6 X (GGGS) , 7 X (GGGS) and 8 X (GGGS) . All the sequences were cloned into modified pcDNA3.4 expression vectors. The design of the masked IL12-Fc fusion protein is shown in Table 11.

[0327] Table 11. The design of the masked IL12-Fc fusion protein

[0328] The expression plasmids were co-transfected into Expi293 cells using Expi293 expression system kit (ThermoFisher-A14635) according to the manufacturer’s instructions. Five days after transfection, the supernatant of Expi293 cells (Thermofisher, A14635) expressing target proteins was collected and filtered for purification using either Protein A column (GE Healthcare, Cat. 175438) and further size exclusion chromatography (Cytiva-28990944) . The concentration of purified proteins was determined by absorbance at 280 nm. The size and purity were tested by SDS-PAGE and SEC-HPLC, respectively; and then stored at -80 ℃.

[0329] 3.4 IL-12 reporter gene assay

[0330] HEK-Blue IL-12 cells express a signal transducer and activator of transcription 4 (STAT4) -inducible secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) reporter gene, which can be triggered by binding of IL-12 to IL-12R. HEK-Blue IL-12 cells were seeded onto a 96-well plate at 50,000 cells / well in DMEM complete culture medium containing 10%FBS and 1%PS and stimulated with a dilution series of IL-12 proteins (5-fold serially diluted from 1000nM to 0.0005nM) . The plates were kept in an incubator set to 37℃ and 5%CO2 for 24 hours. After incubation, SEAP concentration in supernatant was detected by the addition of Quanti-Blue as described by the manufacturer and analyzed using a Microplate spectrophotometer (SpectraMax M5e) measuring absorbance at 630 nm. The SEAP activity in the HEK-Blue IL-12 cells was measured after IL-12 stimulation. As shown in Figure 5, VHH-masked IL-12 proteins showed reduced potency to induce STAT4 phosphorylation compared to WT IL-12 (W3XX175-C1R0. Z21-1. uIgG1V458) .

[0331] 3.5 PBMC activation assay

[0332] The six-well plate was pre-coated with 100 ng / ml OKT3 overnight at 4℃. PBMCs were freshly isolated from healthy donors and adjusted to 1×106 cells / mL in RPMI-1640 complete medium supplemented with 50 U / mL recombinant human IL-2. The PBMCs were then added into the OKT3-coated plate and stimulated at 37℃, 5%CO2 for 3 days. After incubation, the PBMCs were collected by centrifuging at 300g for 5 min at 25℃ and adjusted to 1×106 cells / mL in RPMI-1640 complete medium supplemented with 50 U / mL recombinant human IL-2. The PBMCS were then added into a 96-well plate at 100,000 cells / well and stimulated with a dilution series of IL-12 proteins (10-fold serially diluted from 2000nM to 1×10-6nM) . The plates were kept in an incubator set to 37℃ and 5%CO2 for 5 days. Afterward, the supernatants were harvested for IFN-γ measurement by ELISA.

[0333] Human IFN-γ release was measured by ELISA using matched antibody pairs. Recombinant human IFN-γ was used as standards. The two-fold serial concentrations from 8 ng / mL to 0.0078 ng / mL of IFN-γ were used for standard curve. The plates were pre-coated with capture antibody specific for human IFN-γ at a concentration of 0.75 μg / mL. After blocking with 1×PBS / 2%BSA for 2 hours, 50 μL of standards or samples were added into each well and incubated for 2 hours at ambient temperature. Following removal of the unbound substances by washes, the biotin-conjugated IFN-γ detecting antibody was diluted to 0.5 μg / mL in 1×PBS / 2%BSA, added into the wells (50 μL / well) and incubated for 1 hour at ambient temperature. The plates were washed 3 times after incubation. Streptavidin-HRP (1: 20000) was then added into the plates and incubated for 0.5 hour at ambient temperature. After washing 6 times, the color was developed by dispensing 50 μL of TMB substrate, and then stopped by 50 μL of 2M HCl. Absorbance was read at 450 and 540 nm using a Microplate spectrophotometer (SpectraMax M5e) , followed by four-parameter non-linear regression analysis using GraphPad Prism 5 software. The concentration of IFN-γ in supernatant was quantitated according to the standard curve.

[0334] 3.6 Results

[0335] The secretion of IFN-γ was tested after 5-day incubation with human PBMCs in the presence of IL-12 proteins. As shown in Figure 6, VHH-masked IL-12 showed significant reduced potency compared to WT IL-12.

[0336] References

[0337] 1. Lasek Witold, et al, Interleukin 12: still a promising candidate for tumor immunotherapy? . Cancer Immunol Immunother, 2014, 63: 419-35.

[0338] 2. Jung Keunok, et al, Heterodimeric Fc-fused IL12 shows potent antitumor activity by generating memory CD8 T cells. Oncoimmunology, 2018, 7: e1438800.

[0339] 3. Ongaro Tiziano, et al, A novel anti-cancer L19-interleukin-12 fusion protein with an optimized peptide linker efficiently localizes in vivo at the site of tumors. J Biotechnol, 2019, 291: 17-25.

[0340] 4. Xue Diyuan, et al, A tumor-specific pro-IL-12 activates preexisting cytotoxic T cells to control established tumors. Sci Immunol, 2022, 7: eabi6899.

[0341] 5. Glassman Caleb R, et al, Structural basis for IL-12 and IL-23 receptor sharing reveals a gateway for shaping actions on T versus NK cells.Cell, 2021, 184:983-999.e24.

Claims

1.A heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof, wherein the heterodimeric protein or the antigen-binding portion thereof comprises:a) a first fusion protein and a second fusion protein,wherein the first fusion protein comprising from N-terminal to C-terminal:(i) a truncated IL-12p40 subunit, and(ii) a first Fc domain,wherein the second fusion protein comprising from N-terminal to C-terminal:(i) a IL-12p35 subunit, and(ii) a second Fc domain,orb) a first fusion protein and a second fusion protein,wherein the first fusion protein comprising from N-terminal to C-terminal:(i) a masking moiety,(ii) a IL-12p40 subunit, and(iii) a first Fc domain,wherein the second fusion protein comprising from N-terminal to C-terminal:(i) a IL-12p35 subunit; and(ii) a second Fc domain.2.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 1, wherein compared to the intact IL-12p40 subunit (SEQ ID NO: 4) , the truncated IL-12p40 subunit is truncated from N-terminus, middle domain or C-terminus.3.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 2, wherein compared to the intact IL-12p40 subunit, the truncated IL-12p40 subunit is lack of one or more amino acids from position 1 to position 107 at N-terminus of IL-12p40 subunit, or the truncated IL-12p40 subunit is lack of one or more amino acids from position 34 to position 105 in the middle domain of IL-12p40 subunit, or the truncated IL-12p40 subunit is lack of one or more amino acids from position 295 to position 306 at C-terminus of IL-12p40 subunit.4.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 3, wherein the truncated IL-12p40 subunit comprising an amino acid sequence with at least 80%identity to a sequence selected from the group consisting of:SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43.5.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 3, wherein compared to the intact IL-12p40 subunit, the truncated IL-12p40 subunit is truncated from N-terminus of IL-12p40 subunit from the following position (s) :1): I1-H77, 2) : I1-K85, 3) : I1-E86, 4) : I1-D87, 5) : W90, 6) : I1-T92, 7) : I1-K96, 8) : I1-K99, 9) : I1-K102, 10) : I1-T105, 11) : I1-L107, 12) : I1-L13, 13) : I1-P20, 14) : I1-L26, 15) : I1-D34, 16) : I1-S44, 17) : I1-LS49, 18) : I1-L53, 19) : I1-K58, 20) : I1-A63, 21) : I1-K70, 22) : I1-W2, 23) : I1-E3, 24) : I1-L4, 25) : I1-K5, 26) : I1-K6, 27) : I1-V8, 28) : I1-Y9, 29) : I1-V11, 30) : I1-W15, 31) : I1-P17, or 32) : I1-D18; orthe truncated IL-12p40 subunit is truncated from middle domain of IL-12p40 subunit from the following positions: 1) : G34-S49, 2) : D87-S91, 3) : Q98-T105, 4) : D87-K96, 5) : L95-T105, or 6) : D93-T105; orthe truncated IL-12p40 subunit is truncated from C-terminus of IL-12p40 subunit from the following position: S295-S306.6.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 1, wherein the truncated IL-12p40 subunit is covalently fused to the N-terminus of the first Fc domain, and the IL-12p35 subunit is covalently fused to the N-terminus of the second Fc domain.7.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 1, wherein the masking moiety is fused to N-terminus of IL-12p40 subunit through an uncleavable linker.8.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 7, wherein the masking moiety is a nanobody.9.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 8, wherein the nanobody binding to IL-12 cytokine and comprising complementarity determining region 1 (CDR1) , CDR2 and CDR3 selected from the group consisting of:(a) SEQ ID NOs: 51, 53 and 55, respectively;(b) SEQ ID NOs: 59, 61 and 63, respectively;(c) SEQ ID NOs: 67, 69 and 71, respectively;(d) SEQ ID NOs: 75, 77 and 79, respectively;(e) SEQ ID NOs: 83, 85 and 87, respectively;(f) SEQ ID NOs: 91, 93 and 95, respectively;(g) SEQ ID NOs: 99, 101 and 103, respectively;(h) SEQ ID NOs: 107, 109 and 111, respectively; and(i) SEQ ID NOs: 115, 117 and 119, respectively.10.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 9, wherein the nanobody comprising from N-terminus to C-terminus: a first framework domain; CDR1; a second framework domain; CDR2; a third framework domain; CDR3; a fourth framework domain.11.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 10, wherein the first framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 50, 58, 66, 74, 82, 90, 98, 106 and 114, the second framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 52, 60, 68, 76, 84, 92, 100, 108 and 116, the third framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 54, 62, 70, 78, 86, 94, 102, 110 and 118, the fourth framework domain comprises a sequence with at least 80%identity to a sequence of any one of SEQ ID NOs: 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, 112 and 120.12.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 11, wherein the nanobody comprising an amino acid sequence with at least 80%identity to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 105 and SEQ ID NO: 113.13.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 1, wherein the first Fc domain and / or second Fc domain comprising a hinge domain and a constant region of CH2-CH3, preferably, the Fc domain is IgG Fc domain, more preferably, the Fc domain is IgG1 Fc domain.14.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 13, wherein the hinge domain of the first Fc domain and / or second Fc domain comprising C220S mutation.15.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 13 or 14, wherein the first Fc domain comprising L234A-L235A-S354C-T366W mutations, and the second Fc domain comprising L234A-L235A-T366S-L368A-Y407V mutations, or wherein the first Fc domain comprising L234A-L235A-T366S-L368A-Y407V mutations, and the second Fc domain comprising L234A-L235A-S354C-T366W mutations, or wherein the first Fc domain comprising L234A-L235A-M252Y-S254T-T256E-T366S-L368A-Y407V mutations, and the second Fc domain comprising L234A-L235A-M252Y-S254T-T256E-S354C-T366W mutations, or wherein the first Fc domain comprising L234A-L235A-M252Y-S254T-T256E-S354C-T366W mutations, and the second Fc domain comprising L234A-L235A-M252Y-S254T-T256E-T366S-L368A-Y407V mutations.16.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 15, wherein the first Fc domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.17.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 15, wherein the second Fc domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.18.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 1, wherein the uncleavable linker comprising glycine and serine residues.19.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 18, wherein the uncleavable linker comprising (G4S) n, where n is from 1 to 8.20.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 19, wherein the uncleavable linker comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 ( (G4S) 4) , SEQ ID NO: 45 ( (G4S) 5) , SEQ ID NO: 46 ( (G4S) 6) , SEQ ID NO: 47 ( (G4S) 7) or SEQ ID NO: 48 ( (G4S) 8) .21.The heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof of claim 1, wherein the IL-12p35 subunit comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.22.An isolated nucleic acid molecule, comprising a nucleic acid sequence encoding heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined in any of claims 1-21.23.An expression vector comprising the nucleic acid molecule of claim 22.24.A host cell comprising the expression vector of claim 23.25.A pharmaceutical composition comprising heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined in any of claims 1-21 and a pharmaceutically acceptable carrier.26.A method for treating a cancer, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined in any of claims 1-21, a nucleic acid molecule of claim 22, the expression vector of claim 23, the host cell of claim 24 or the pharmaceutical composition of claim 25.27.A kit for treating cancer, comprising a container comprising heterodimeric protein against IL-12 receptor or the antigen-binding portion thereof as defined in any of claims 1-21.

Images