Bioengineering of modular polyketide synthases

Abstract

The present invention provides a chimeric polyketide synthase (PKS) or polyketide synthase-non-ribosomal peptide synthetase (PKS-NRPS) and the use thereof, wherein the PKS or PKS-NRPS comprises two or more recombination units (RU) which are joined to each other, wherein each RU comprises one or two or more contiguous domains derived from a parental PKS or PKS-NRPS and the junction end of at least one RU is defined by a recombination site selected from a site at the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL motif at post AT-linker (the RYWL motif site) and a site at the RL motif at ACP helix 0 (the RL motif site); wherein the two or more RUs are not naturally joined with each other.

Description

BIOENGINEERING OF MODULAR POLYKETIDE SYNTHASES

[0001] CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims priority from PCT international application PCT / CN2023 / 142896 filed on December 28, 2023, which is incorporated herein by reference in its entirety.FIELD OF THE INVENTION

[0003] The present invention relates to engineered polyketide synthases, and particularly relates to chimeric polyketide synthases and their use for production of useful compounds.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0004] Polyketide synthases (PKSs) are multidomain megaenzymes and responsible for the synthesis of numerous natural products with remarkable structural diversity and biological activities in bacteria, fungi, and plant1. Modular polyketide synthases (PKSs) can biosynthesize various complex natural products including clinically essential drugs erythromycin, rapamycin, and epothilone. During their biosynthesis, the building blocks acetyl-CoA and malonyl-CoA are loaded by an acyltransferase (AT) domain onto an acyl carrier protein (ACP) , which undergoes Claisen condensation catalyzed by a ketosynthase (KS) domain to complete a two-carbon extension. Reductive domains of ketoreductase (KR) , dehydratase (DH) , and enoylreductase (ER) then modify the elongated β-keto-intermediate by their functional combinations to make structural variations. At the end of the synthesis, the fully extended polyketide product is released by a thioesterase (TE) domain by hydrolysis or macrocyclization. In analogy to fatty acid biosynthesis, each PKS module contains ketosynthase (KS) , acyltransferase (AT) , and acyl carieer protein (ACP) domains to elongate the carbon chain using (methyl) melonate units, but ketoreductase (KR) , dehydratase (DH) , and enoylreductase (ER) domains are optional, thus creating different degree of reduction states in each elongation cycle.

[0005] Because of its modularity and sequential, assembly-line biosynthesis mechanism, PKSs have been intensively targeted for rational bioengineering. Although earlier module reprogramming of PKS often resulted in severe decrease or complete loss of enzyme activity, recent engineering of PKS that employed the updated module definition demonstrated encouraging outcomes with minimal activity loss both in vivo and in vitro. However, these engineering efforts are mostly limited within a single pathway, and plug-and-play engineering of PKSs from different biosynthetic pathways remains challenging.

[0006] BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

[0007] In one aspect, the present invention a chimeric polyketide synthase (PKS) or polyketide synthase-non-ribosomal peptide synthetase (PKS-NRPS) comprising two or more recombination units (RU) which are joined to each other, wherein each RU comprises one or two or more contiguous domains derived from a parental PKS or PKS-NRPS and the junction end of at least one RU is defined by a recombination site selected from a site at the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif at post AT-linker (the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site) and a site at the RL motif at ACP helix 0 (the RL motif site) ; wherein the two or more RUs are not naturally joined with each other; wherein the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif corresponding to amino acid positions 890 to 902 of SEQ ID NO: 1 and the RL motif refers to a motif sequence corresponding to amino acid positions 1397 to 1398 of SEQ ID NO: 1.

[0008] In some embodiments, the junction ends of two or more RUs are defined by the site at the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif and / or the site at the RL motif. In some embodiments, all junction ends of all RUs are defined by the site at the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif and / or the site at the RL motif. In some embodiments, each RU is derived from a parental PKS or PKS-NRPS different from that of any other RU. In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises two or three RUs. In some embodiments, the ACP-KS have a native interaction in each RU.

[0009] In some embodiments, the parental PKS or PKS-NRPS is selected from filipin PKS, spiramycin PKS, meridamycin PKS, chalcomycin PKS, lavendiol PKS, coelimycin PKS, candicidin PKS, E-837 PKS, DEBS PKS, rapamycin PKS-NRPS, microtermolide PKS-NRPS, venemycin PKS, akaeolide PKS-NRPS, antimycin PKS, MlsB PKS, lipomycin PKS and phenalamide PKS-NRPS.

[0010] In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS is derived from filipin PKS LM-M1, spiramycin PKS LM-M1, meridamycin PKS LM-M1, chalcomycin PKS LM-M1, candicidin PKS LM-M1, E-837 PKS LM-M1, erythromycin (DEBS) PKS LM-M1, rapamycin PKS-NRPS LM-M1 or microtermolide PKS-NRPS LM-M1. In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises:

[0011] (1) KSQ-AT-ACP-KS-AT-KR-C-junction end derived from filipin PKS LM-M1, spiramycin PKS LM-M1, meridamycin PKS LM-M1 or chalcomycin PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RL motif site;

[0012] (2) KSQ-AT-ACP-KS-AT-C-junction end derived from filipin PKS LM-M1, spiramycin PKS LM-M1, meridamycin PKS LM-M1 or chalcomycin PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site;

[0013] (3) A-ACP-KS-AT-C-junction end derived from candicidin PKS, microtermolide PKS-NRPS or rapamycin PKS-NRPS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site;

[0014] (4) AT-ACP-KS-AT-C-junction end derived from DEBS PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site;

[0015] (5) KSQ-AT-ACP-KS-AT-C-junction end derived from E-837 PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site;

[0016] (6) AT-ACP-KS-AT-KR-C-junction end derived from DEBS PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RL motif site; or

[0017] (7) A-ACP-KS-AT-DH-ER-KR-C-junction end derived from microtermolide PKS-NRP LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RL motif site.

[0018] In some embodiments, the last RU comprise TR as the offloading domain. In some embodiments, the last RU comprise native ACP-TR didomain. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS is derived from LavC of lavendiol PKS, CpkC of coelimycin PKS, M8 and the full last module PHE of phenalamide PKS-NRPS, VemG and VemH of venemycin PKS, M6 and the last module AKA of akaeolide PKS, Ant C and AntD of antimycin PKS, or the last module of DEBS PKS. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises:

[0019] (1) N-junction end-ACP-TR derived from LavC of lavendiol PKS or CpkC of coelimycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site;

[0020] (2) N-junction end-KR-ACP-TR derived from LavC of lavendiol PKS, wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site;

[0021] (3) N-junction end-ACP derived from M8 of phenalamide PKS-NRPS and the full last module PHE of phenalamide PKS-NRPS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site;

[0022] (4) N-junction end-TR derived from CpkC of coelimycin PKS or LavC of lavendiol PKS, wherein the N-junction end is defined by a site at the C-terminal of ACP;

[0023] (5) N-junction end-ACP derived from VemG of venemycin PKS and the full VemH of venemycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site; (6) N-junction end-ACP derived from phenalamide PKS-NRPS M8 and the full last module PHE of phenalamide PKS-NRPS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site;

[0024] (7) N-junction end-ACP derived from akaeolide PKS M6 and the full last module AKA of akaeolide PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site; or

[0025] (8) N-junction end-ACP derived from AntC of antimycin PKS and the full AntD of antimycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site.

[0026] In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises at least one middle RU located between the first RU and the last RU, wherein the at least one middle RU is derived from LavC of lavendiol PKS, CpkC of coelimycin PKS, MlsB PKS M1, lipomycin PKS M1, filipin PKS M8 or antimycin PKS AntC and AntD. In some embodiments, the middle RU is selected from the group consisting of the RU comprising:

[0027] (1) N-junction end-ACP-C-junction end derived from LavC of lavendiol PKS or CpkC of coelimycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site and the C-junction end is defined by a site at the C-terminal of ACP;

[0028] (2) N-junction end-KR-C-junction end derived from MlsB PKS M1, lipomycin PKS M1 or filipin PKS M8, wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end is defined by the RL motif site; or

[0029] (3) N-junction end-ACP-KS-AT-ACP-C-junction end derived from AntC and AntD of antimycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site and the C-junction end is defined by a site at the C-terminal of ACP.

[0030] In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS and the product synthesized by chimeric PKS or PKS-NRPS are seleced from:

[0031] (1) the chimeric PKS compriseing two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (R) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Lav-2 in Example 1)

[0032] (2) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of the LM-M1 of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises KR-ACP-R of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the product is  ( (R) -1, 3-butanediol) and / or  ( (S) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Lav-4 in Example 1)

[0033] (3) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC, the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (R) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Cpk-2 in Example 1)

[0034] (4) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of spiramycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (R) -1, 3-butanediol) ; (Srm-Cpk-2 in Example 1)

[0035] (5) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of spiramycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (R) -1, 3-butanediol) ; (Srm-Lav-2 in Example 1)

[0036] (6) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, (ii) the second RU comprises ACP of LavC, the N-junction end of the second RU is defined by the RL motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the LAxxL motif site, and (ii) the last RU comprises TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the LAxxL motif site; the product is  ( (R) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Lav-Cpk-2-1 in Example 1)

[0037] (7) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises KR of MlsB PKS M1, the N-junction end of the second RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the RL motif site, and (iii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ((S) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Mls-Lav-4-2 in Example 1)

[0038] (8) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises KR of lipomycin PKS M1, the N-junction end of the second RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the RL motif site, and (iii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (S) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Lip-Lav-4-2 in Example 1)

[0039] (9) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises KR of filipin PKS M8, the N-junction end of the second RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the RL motif site, and (iii) the last RU comprises ACP-TR of LavC, the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (S) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Pte8-Lav-4-2 in Example 1)

[0040] (10) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of chalcomycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (2S, 3R) -2-methyl-1, 3-butanediol) ; (Chm-Cpk-2 in Example 1)

[0041] (11) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of chalcomycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (2S, 3R) -2-methyl-1, 3-butanediol) ; (Chm-Lav-2 in Example 1)

[0042] (12) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of meridamycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (2S, 3S) -2-methyl-1, 3-butanediol) ; (Mer-Cpk-2 in Example 1)

[0043] (13) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of meridamycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (2S, 3S) -2-methyl-1, 3-butanediol) or  ( (2R, 3S) -2-methyl-1, 3-butanediol) ; (Mer-Lav-2 in Example 1)

[0044] (14) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of candicidin PKS LM-M1and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the product is  (Can-Vem-1 and VemH in Example 2)

[0045] (15) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the product is  (MTL-Vem-1 and VemH in Example 2)

[0046] (16) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises AT-ACP-KS-AT of erythromycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the product is  (DEBS-Vem-1 and VemH in Example 2)

[0047] (17) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of E-837 PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the product is  (E-837-Vem-1 and VemH in Example 2)

[0048] (18) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of rapamycin PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the product is  (Rap-Vem-1 and VemH in Example 2)

[0049] (19) the chimeric PKS-NRPS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of phenalamide PKS-NRPS M8 and its native downstream enzyme PHE including C-A-PCP-TR, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  (MTL-Phe-1 / 4 and PHE in Example 2)

[0050] (20) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises the last ACP of AntC and KS-AT-ACP of its native downstream enzyme AntD, the N-junction end of the second RU is defined by the RL motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the LAxxL motif site site; and (iii) the last RU is TE of erythromycin PKS and the N-junction end of the last RU is defined by the LAxxL motif site site; the extender substrates are methylmalonyl-CoA, methylmalonyl-CoA and butylmalonyl-CoA, or methylmalonyl-CoA and allylmalonyl-CoA extenders, respectively, and the products are wherein R1 is methyl, R2 is butyl, R3 is allyl, respectively; (MTL-AntC-1 / 4 and AntD-DEBS (TE) in Example 2)

[0051] (21) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NPRS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of akaeolide PKS M6 and its native downstream enzyme AKA including KS-AT-ACP-TEand the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  (MTL-Aka-1 / 4 and AKA in Example 2)

[0052] (22) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises AT-ACP-KS-AT of erythromycin PKS LM-M1and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of akaeolide PKS M6 and its native downstream enzyme AKA including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  (DEBS-Aka-4 and AKA in Example 2)

[0053] (23) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises AT-ACP-KS-AT of erythromycin PKS LM-M1, the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  (DEBS-Vem-4 and VemH in Example 2)

[0054] (24) the chimeric PKS-NRPS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT-DH-ER-KR of microtermolide PKS-NRPS LM-M1, the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of phenalamide PKS-NRPS M8 and its native downstream enzyme PHE including C-A-PCP-TR, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is and / or  (MTL-Phe-4 and PHE in Example 2) ; and

[0055] (25) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT-DH-ER-KR of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is and / or  (MTL-Vem-4 and VemH in Example 2)

[0056] In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS comprising:

[0057] (1) one peptide having a sequence as set forth in SEQ ID NO: 3, 5, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 22, or 25; (2) two subunits, wherein one has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 30, 33, 36, 39, 42, 45 or 54, and the other has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 29; (3) two subunits, wherein one has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 49 or 50, and the other has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 53; (4) two subunits, wherein one has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 48, and the other has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 57; or (5) two subunits, wherein one has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 47 or 56, and the other has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 52.

[0058] In another aspect, the present invention provides a polynucleotide encoding any of the above chimeric PKS or PKS-NRPS.

[0059] In another aspect, the present invention provides a expression vector comprising the above polynucleotide.

[0060] In another aspect, the present invention provides a host cell containing the above polynucleotide or the above expression vector, wherein the host cell is able to express the chimeric PKS or PKS-NRPS encoding by the polynucleotide. In some embodiments, the host cell is E. coli or Streptomyces.

[0061] In another aspect, the present invention provides a method for producing a compound, comprising contacting any of the above chimeric PKS or PKS-NRPS with the start substrate and the extender substrate under appropriate conditions. In some embodiments, the method is performed in vivo or in vitro. In some embodiments, the method comprising culturing any of the above host cell. In some embodiments, the compound is polyketides, hybrid polyketides / non-ribosomal peptides, aldehydes or alcohols. In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS and the compound are as described above.

[0062] In another aspect, the present invention provides use of any of the above chimeric PKS or PKS-NRPS in the production of a compound. In some embodiments, the compound is polyketides, hybrid polyketides / non-ribosomal peptides, aldehydes or alcohols.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0063] Figure 1. Design of hybrid PKSs containing TR domain and cut site positions used in Example 1. Upper panel: sequence logo of each cut site, labeled with the amino acid position number of LavC; bottom panel: domain organization of hybrid Pte-Lav enzymes compared herein.

[0064] Figures 2A-2D. Comparison of 1, 3-butanediol production of various PKS hybrids. (R or S) -1, 3-BDO are colored by dark gray and light gray. Titer of 4-hydroxy-2-butanone is colored by white. Figure 2A. Pte-Lav hybrids comparison; Figure 2B. Pte-Cpk, Srm-Cpk, and Srm-Lav hybrids comparison; Figure 2C. Pte hybrids with ACP swapping comparison; Figure 2D. Pte-Lav hybrids with KR (or KR-ACP swapping) comparison

[0065] Figure 3. Production of 2-methyl-1, 3-BDO by different PKS hybrids. Each stereoisomer are colored as shown above.

[0066] Figure 4. Traditional module definition and the updated module definition.

[0067] Figure 5. The cut site used for PKSs engineering in Example 2. The positions of Cut 1 (RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site) , Cut 2 (post-GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif) , Cut 3 (EPIA (SEQ ID NO: 61) ) , Cut 4 (RL motifi site) , Cut 5 (LAxxL motif site, ) . The amino acid numbers above the sequence logo are based on the MTL PKS that contains its loading module and module 1.

[0068] Figure 6. Comparison of candicidin-venemycin PKS hybrid activity. The product 1b formation from in vitro assay of each hybrid enzyme was monitored.

[0069] Figure 7. Comparison of various hybrid PKSs activity. PKSs or PKS-NRPSs of microtermolide (MTL) , erythromycin (DEBS) , E-873, and rapamycin (Rap) were used to fuse with VemG at three different domain boundaries. The product formation from in vitro assay of each hybrid enzyme was monitored.

[0070] Figure 8. In vitro assay of MTL PKS hybrids. The product formation from in vitro assay of each hybrid enzyme was monitored. Top: MTL-phenalamide (Phe) hybrid and PHE assay; MTL-antimycin (AntC) hybrid and AntD-DEBS (TE) assay; MTL-akaeolide (Aka) hybrid and AKA assay. Bottom: MTL-AntC hybrid and AntD assay. The assays of MTL-antC hybrids were performed individually with methyl, butyl, and allyl extenders to obtain the corresponding 6a, 6b, 6c, respectively.

[0071] Figure 9. In vitro assay of DEBS-Vem or DEBS-Aka PKS hybrids that contain KR domain. The product formation from in vitro assay of each hybrid enzyme was monitored.

[0072] Figure 10. In vitro assay of MTL-Vem PKS hybrids and MTL-Phe PKS / NRPS hybrids that contain DH, ER, and KR domains. The product formation from in vitro assay of each hybrid enzyme was monitored.

[0073] Figures 11A-11G. Sequence alignments of modules and the cut sites used in Example 1 and 2, wherein Figures 11B-11G are the scaled-up version of each panel in Figure 11A.

[0074] Figure 12A-12C. Hybrid modules reconstitution in Example 2. LM indicates loading module, and domains with a cross overlaid indicate inactive domains due to mutation.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0075] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as is commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. All publications, patent applications, patents, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. In addition, the materials, methods, and examples herein are illustrative only and not intended to be limiting.

[0076] The terms “about” and “approximate, ” when used along with a numerical variable, generally means the value of the variable and all the values of the variable within a measurement or an experimental error (e.g., 95%confidence interval for the mean) or within a specified value within a broader range (e.g., ± 10%) .

[0077] As used herein, the singular forms “a” , “an” and “the” are intended to include the plural forms as well, unless the context clearly indicates otherwise.

[0078] The term “comprise” and variations thereof, such as “comprises” and “comprising” , as well as “contain” , “containing” , “have” , “having” , “include” and “including” means including the recited steps or elements, but not excluding other steps or elements. “Consisting of” means excluding any step or element not specified. “Consisting essentially of” means not excluding steps or elements that do not materially affect the basic and novel characteristics of the claimed invention. The term “comprise" and its variants also include the cases of “consisting of ......” and “consisting essentially of ......” .

[0079] Where a range of values is provided, it is understood that the upper and lower limits, and each smaller range between the upper limit (or the lower limit) and any intervening value, or between any two intervening values in that range, shall be considered to be specifically disclosed. Any intervening range and all individual value in the stated range of value may be excluded from said range of value.

[0080] The term “and / or” refers to any one, several or all of the elements connected by the term.

[0081] Unless otherwise indicated, nucleic acids are written left to right in 5’ to 3’ orientation; amino acid sequences are written left to right in N-terminus to C-terminus orientation, respectively.

[0082] The term “link” , “connect” , “join” or similar terms refer to that one element (such as a recombination unit) is either directly joined to another element (such as another recombination unit) , or else indirectly joined to another element (such as another recombination unit) through an intervening moiety or moieties, in a covalent or non-covalent manner. Examples of non-covalent association includes electrostatic forces, hydrogen bonds, hydrophobic effects, van der Waals forces, etc., e.g., the interaction between a protein and its ligand, between an aptamer and its adaptor protein, or between antigen and antibody.

[0083] The terms “first” , “second” , “third” , “fourth” etc. are used only to distinguish between elements or steps and do not imply a specific order of precedence or location relationship. It should be understood that when “second” element or step is mentioned, it is meant to be literally distinguished from other elements or steps and it is not necessary to have a corresponding “first” element or step.

[0084] Further, it should be understood that although the specification may have presented the method and / or process of the present invention as a particular sequence of steps. However, to the extent that the method or process does not rely on the particular order of steps set forth herein, the method or process should not be limited to the particular sequence of steps described. As one of ordinary skill in the art would appreciate, other sequences of steps may be possible. Therefore, the particular order of the steps set forth in the specification should not be construed as limitations on the claims.

[0085] Polyketide synthases (PKSs) are categorized into three types, namely, types I, II, and III, according to their organization and catalytic mechanisms. Among them, type I modular PKS has a hierarchical organization in which, the entire enzyme complex is composed of several subunits, each subunit is composed of several modules, and a module is composed of several domains. In the N-to C-terminus of a whole enzyme complex, loading, elongation, and termination modules are localized to catalyze the serial polyketide production. Loading module (LM) initiates the chain formation from a broad range of priming starter units by acylation to the AT domain and transacylation to the ACP domain. Elongation modules comprises KS, AT, ACP, and optionally other additional domains to serially catalyze the growth of the polyketide chain. A minimal elongation module includes three domains; (i) an acyltransferase (AT) domain for loading the chain extender unit (typically malonyl-or methylmalonyl-CoA) , (ii) an acyl carrier protein (ACP) for tethering and shuttling the extender unit or the polyketide intermediate, and (iii) a ketosynthase (KS) domain for catalyzing the condensation reaction between the extender unit of the downstream ACP domain and the polyketide intermediate attached at the KS active site which is translocated from the ACP domain of upstream module. Addition of other domains (such as KR, DH, ER, MT) to this minimal elongation module modifies a polyketide backbone. Termination module contains a thioesterase (TE) domain or thioester reductase (TR) domain as an offloading domain following the ACP domain to release the ACP-bound polyketide intermediate and complete polyketide biosynthesis. TE domain performs; (i) hydrolysis to yield the linear polyketide, or (ii) cyclization to yield the macrocyclic polyketide, or (iii) sulfonate transfer and decarboxylation with sulfotransferase (ST) domain to yield the terminal olefin. Alternatively, TR domain catalyzes NADPH dependent two-electron or four-electron reduction, yielding the aldehyde or alcohol product.

[0086] Non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs) are categorized into two types according to their organizations and catalytic mechanisms, which are type I modular NRPS and type II standalone NRPS. Type I modular NRPS resemble type I modular PKS, with a hierarchical organization of the enzyme complex-subunit-module-domain. Similar to PKS, loading, elongation, and termination module are localized to catalyze serial polypeptide production. NRPS elongation module basically comprises three core domains condensation (C) domain, adenylation (A) domain, and peptidyl carrier protein (PCP) or thiolation (T) corresponding to KS, AT, and ACP of PKS which play a role in chain elongation, substrate incorporation, and chain carrier function, respectively, and optionally epimerase (E) domain catalyzing the absolute configuration at the Cα atom, methyltransferse (MT) domain modifying the degree of C-or N-methylation, formylation (F) domain, cyclization (Cy) , redox-active domain (Ox and Red) , among others. Termination module of NRPS also contains an offloading domain such as a TE domain or reductive (R) domain after T domain to release the T-bound polypeptide intermediate for the completion of NRPS biosynthesis.

[0087] Determining the boundary for module reprogramming is of critical importance for PKS engineering. Early studies have investigated the boundaries for domain swapping within a module, for example the AT swapping boundary (starting at the GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif in KS-AT linker and ending at the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif (hereafter referred to as the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif) in post-AT linker) and reductive loop swapping boundary (starting at the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif and ending at the RL motif in ACP helix 0) appears to maintain folding of domain exchanged PKS module. Hinted by the updated module definition and domain swap boundaries, we aimed to assess and establish an modular engineering strategy to connect different PKS modules. Here, we report a general engineering method that maintains enzyme stability and catalytic efficiency of PKS hybrid modules. We identified that the cut site LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif in post-AT linker and the RL motif at ACP helix 0 region were effective in connecting PKS modules of different pathways. We consistently obtained soluble and functional chimeric PKSs using these cut sites, and further demonstrated its application for PKS-nonribosomal peptide synthetase (NRPS) engineering. These findings expand the variety of modular PKSs engineering strategy, which may open new opportunities for assemble line engineering to produce the compounds as we desired.

[0088] The termination reaction of PKS commonly employs thioesterase (TE) -catalyzed hydrolysis or macrocyclization of the ACP-tethered polyketide to release carboxylic acid or lactone, respectively. As an uncommon termination, thioester reductase (TR) domains catalyze reductive release to form aldehyde or alcohol by a two-or four-electron reduction. Both functional groups can undergo additional transformations to further diversify the structure of the final product, such as transamination, cyclisation, glycosylation and so on2. For TR domains of modular type I PKSs, only no more than 20 of PKSs2-3 were reported. These reported TRs can accept natural substrates with different reduction states at the β-position, including carbonyl group4, hydroxyl group5-9 and carbon-carbon double bonds10-12. TRs can also accept different α-substituted natural substrates9, 12. Therefore, application of TR domain in PKS engineering will significantly enrich the chemical versatility of PKS biosynthesis.

[0089] Herein, we demonstrate a strategy to incorporate TR in PKS for the production of primary alcohols. We designed various bimodular hybrid PKSs with a TR termination that produce optically pure butanediols with up to 20 mg / L titer. Our results pave the way toward bioproduction of complex alcohols.

[0090] The present invention provides suitable “recombination” sites that can be used to assemble modules and / or domains from various polyketide synthases (PKSs) and / or nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) (such as PKSs and / or NRPSs of different pathways) . These modules and / or domains can be “recombined” at said site, while maintaining enzyme stability and catalytic efficiency of hybrid PKS, to assemble various modules or domains to produce new compound. The recombination sites may be selected from: (1) a site at the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif at post-AT linker (hereafter referred to as the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site) ; and (2) a site at the RL motif at ACP helix 0 (hereafter referred to as RL motif site) .

[0091] The present invention relates to a chimeric PKS or PKS-NRPS, which comprises two or more recombination units (RUs) . The two or more RUs are joined together to form a complete PKS or PKS-NRPS that has an ability to synthesis a chemical product. The chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention is non-natural. The two or more RUs are derived from different parental PKSs, parental NRPSs, parental PKS-NRPS and / or different parts of a parental PKS, a parental NRPS or a parental PKS-NRPS. Any two contiguous RUs of the two or more RUs are non-naturally joined with each other. The combination of different RUs may produce a product that is different from the product of the existing PKS or PKS-NRPS pathway.

[0092] A RU can be regarded as a section that is cut from a parental PKS, NRPS or PKS-NRPS, with the cut site being the specific recombination site defined in the present invention. As can be understood, the terms “cut” and “join” as used in the description of the RUs do not mean that the step of cutting, joining of the RUs actually occurs, but rather that the sequence of the RUs and / or the chimeric PKS or PKS-NRPS is the same as the sequence obtained by such cutting and joining steps.

[0093] Each RU may comprise one, two or more contiguous domains together with the native flanking sequences of each domain. Any two contiguous domains contained in a RU may be covalently joined to each other or may be located on separate polypeptides and interact with each other by means of docking domains. Therefore, each RU may comprise one or two or more polypeptides that comprise one, two or more contiguous domains derived from a parental PKS, NRPS or PKS-NRPS. An RU may comprise contiguous domains that can form one or more complete modules, or, an RU may not comprise any complete module.

[0094] The flanking sequences include the linker between two contiguous domains when the two domains are covalently linked, or the docking domains linked to the two domains when the two domains are located on different subunits, respectively. The flanking sequence of a domain may comprise the complete sequence or a partial sequence of the linker between said domain and a domain adjacent to said domain.

[0095] Each RU has at least one end for joining to other RU, which is called junction end. Each RU may has one or two junction ends. A RU may has only one junction end, for example, the first RU of the assembly line of the chimeric PKS or PKS-NRPS has only one junction end at the C-terminus for joining to the downstream adjacent RU; the last RU of the assembly line of the chimeric PKS or PKS-NRPS has only one junction end at the N-terminus for joining to the upstream adjacent RU. When the assembly line of the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises three or more RUs, Each of the RUs between the first RU and the last RU has two junction ends, one of which is for joining to the upstream adjacent RU and the other for joining to the downstream adjacent RU.

[0096] In the present invention, at least one junction end of at least one RU is defined by the recombination site selected from the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the RL motif site. The present invention does not exclude that one or more junction end of the two or more RUs is defined by other recombination sites than the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the RL motif site, for example, a GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif site, a recombination site at the C-terminal of KR and / or a recombination site at the C-terminal of ACP. In some embodiments, two or more junction ends of the two or more RUs are defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and / or the RL motif site. For RUs with only one junction end (such as the first RU or the last RU on the assembly line) , the junction end can be defined by the recombination site selected from the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the RL motif site or by other recombination site. For RUs with two junction end, both junction ends can be defined by the recombination site selected from the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the RL motif site or by other recombination site, or, alternatively, one of the two junction ends is defined by the recombination site selected from the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the RL motif site and the other junction end is defined by other recombination site. In some embodiments, in the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention, all junction ends of all RUs are defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and / or the RL motif site. As can be understood, a junction end defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and a junction end defined by the RL motif site can be simultaneously present in the RUs contained in the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention, which are either present in the same RU or in separate RUs. In some embodiments, two junction ends that are joined together may be defined by the same recombination site, e.g., the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site, or may be defined by different recombination sites, e.g., one of the junction site is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the other junction end is defined by the RL motif site or by other recombination site other than the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the RL motif site , or one of the junction site is defined by the RL motif site and the other junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or by other recombination site other than the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the RL motif site.

[0097] A junction end “defined by a recombination site” means that the sequence of the junction end is identical to the sequence of the end formed by cleavage at said recombination site of the parental PKS, NRPS or PKS-NRPS.

[0098] The RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site refers to a cut site at the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif at post-AT linker. The LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif refers to a motif sequence corresponding to amino acid positions 890 to 902 of SEQ ID NO: 1. The recombination site may be at either end of the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif or within it. In some embodiments, the recombination site may be immediately adjacent to the N’ side of the first amino acid L in the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif (corresponding the site between position 889 and 890 of SEQ ID NO: 1) , immediately adjacent to the C’ side of the last amino acid L in the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif (corresponding to the site between position 902 and 903 of SEQ ID NO: 1) , immediately adjacent to the N’ side of the R in the sequence RYWL (SEQ ID NO: 59) of the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif (corresponding to the site between position 898 and 899 of SEQ ID NO: 1) , or between the L and the P in the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif (corresponding to the site between position 890 and 891 of SEQ ID NO: 1, between the P and the T in the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif (corresponding to the site between position 891 and 892 of SEQ ID NO: 1) , between the T and the Y in the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif (corresponding to the site between position 892 and 893 of SEQ ID NO: 1) , or between the R and the Y in the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif (corresponding to the site between position 899 and 900 of SEQ ID NO: 1) , between the Y and the W in the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif (corresponding to the site between position 900 and 901 of SEQ ID NO: 1) , between the W and the L in the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif (corresponding to the site between position 901 and 902 of SEQ ID NO: 1) , or any other site within the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif, such as a site corresponding to the site between position 893 and 894 of SEQ ID NO: 1, corresponding to the site between position 894 and 895 of SEQ ID NO: 1, corresponding to the site between position 895 and 896 of SEQ ID NO: 1, corresponding to the site between position 896 and 897 of SEQ ID NO: 1, corresponding to the site between position 897 and 898 of SEQ ID NO: 1, or corresponding to the site between position 898 and 899 of SEQ ID NO: 1. It should be understood that the sequence of the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif does not necessarily strictly conform to the general formula LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) , and in different modules of different polyketide synthases, the motif may differ in individual amino acids compared to the general formula of LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) . For any parental PKS, a person of skill in the art can determine the exact sequence of the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif in that parental PKS by comparing it to SEQ ID NO: 1 using a sequence aligning algorithm commonly used in the art (such as, BLAST, ALIGN, ClustalW (such as Clustal Omega) , MAFFT, GeneiousAligner, MAUVE, LastZ, MUSCLE, EMBOSS Needle, etc. with default parameters) .

[0099] The RL motif site refers to a cut site at the RL motif at ACP helix 0. Helix 0 is a short N-terminal helix in ACP. The RL motif refers to a motif sequence corresponding to amino acid positions 1397 to 1398 of SEQ ID NO: 1. The recombination site may be at either end of the RL motif or within it. In some embodiments, the recombination site may be immediately adjacent to the N’ side of the R in the RL motif (corresponding the site between position 1396 and 1397 of SEQ ID NO: 1) , immediately adjacent to the C’ side of the L (corresponding the site between position 1398 and 1399 of SEQ ID NO: 1) , or between R and L (corresponding the site between position 1397 and 1398 of SEQ ID NO: 1) . It should be understood that the RL motif at ACP helix 0 does not necessarily strictly have the sequence of RL, and in different modules of different polyketide synthases, the RL motif can also be WL, GL, etc.

[0100] The GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif site refers to a cut site within or near the GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif (such as post GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif) at C-terminal of KS. The GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif refers to a motif sequence corresponding to amino acid positions 448 to 502 of SEQ ID NO: 1. The recombination site may be at either end of the GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif or within it or after the GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif (such as immediately adjacent to the C’ side of the first, second, third, fourth, fifth, sixth, seventh, eighth, nineth, tenth amino acid after the H of the GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif) . In some embodiments, the recombination site may be immediately adjacent to the C’ side of the third amino acid after the H of the GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif (corresponding to the site between position 505 and 506 of SEQ ID NO: 1) . In some embodiments, the recombination site may be immediately adjacent to the C’ side of the tenth amino acid after the H of the GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif (corresponding to the site between position 512 and 513 of SEQ ID NO: 1) .

[0101] A recombination site at the C-terminal of ACP may be a LAxxL motif site. The LAxxL motif site refers to a cut site within or near the LAxxL motif (such as post LAxxL motif) at C-terminal of ACP. The LAxxL motif refers to a motif sequence corresponding to amino acid positions 1475 to 1479 of SEQ ID NO: 1. The recombination site may be at either end of the LAxxL motif or within it or after the LAxxL motif (such as immediately adjacent to the C’ side of the first, second, third, fourth, fifth, sixth, seventh, eighth, nineth, tenth amino acid after the last L of the LAxxL motif) . In some embodiments, the recombination site may be immediately adjacent to the C’ side of the fourth amino acid after the H of the LAxxL motif (corresponding to the site between position 1483 and 1484 of SEQ ID NO: 1) . In some embodiments, the recombination site may be immediately adjacent to the N’ side of the last L of the LAxxL motif (corresponding to the site between position 1478 and 1479 of SEQ ID NO: 1) .

[0102] In the present invention, the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif, the RL motif, the GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif, the LAxxL motif and / or the recombination site in a parent PKS or PKS-NRPS can be determined based on the amino acid sequence shown in the reference amino acid sequence SEQ ID NO: 1. The parental PKS or PKS-NRPS can be optimally aligned with SEQ ID NO: 1, for example with default parameters using the BLAST, ALIGN, ClustalW (such as Clustal Omega) , MAFFT, GeneiousAligner, MAUVE, LastZ or MUSCLE algorithm, thereby determining the positions corresponding to any of the positions in SEQ ID NO: 1 and determining the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif, the RL motif, the GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif, the LAxxL motif and / or the recombination site in the parent PKS or PKS-NRPS. It should be understood that in the alignment of the parental PKS or PKS-NRPS with SEQ ID NO: 1 to identify the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif, the RL motif, the GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif, the LAxxL motif and / or the recombination site in the parental PKS or PKS-NRPS, it is feasible to align a plurality of contiguous domains in the module of the parental PKS or PKS-NRPS, such as from KS to ACP and the flanking sequences (linkers) of these domains, with the full length of SEQ ID NO:1, and it is also feasible to align the sequences comprising the motifs and / or recombination sites in the parental PKS or PKS-NRPS with the corresponding portion of the sequence of SEQ ID NO: 1. For example, a sequence comprising AT and C-terminal flanking sequence of AT (i.e. the linker between AT and its downstream neighboring domain) can be aligned with the corresponding sequence of SEQ ID NO: 1 to identify the specific sequence of the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif in the parental PKS or PKS-NRPS. For example, a sequence comprising ACP and N-terminal flanking sequence of ACP (i.e., the linker between ACP and its upstream neighboring domains) can be aligned with the corresponding sequence in SEQ ID NO: 1 to identify the specific sequence RL motif in the parental PKS or PKS-NRPS. The LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif and the RL motif are conserved across PKSs or PKS-NRPSs, and the alignments using the full length of SEQ ID NO: 1 or a portion thereof, or using different algorithms, can give essentially the same results.

[0103] The RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site is located between the AT of the parental PKS or PKS-NRPS and its downstream neighboring domain, and cutting at the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site can yield a RU having a AT as the C-terminal domain and a RU having the downstream neighboring domain of that AT in the parental PKS or PKS-NRPS as the N-terminal domain. For example, if the parental PKS or PKS-NRPS has an AT-KR didomain, cutting at the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site located between that AT and KR yields a RU with AT as the C-terminal domain and a RU with KR as the N-terminal domain.

[0104] The RL motif site is located between the ACP of the parental PKS or PKS-NRPS and its upstream neighboring domain, and cutting at the RL motif can yield a RU having a ACP as the N-terminal domain and a RU having the upstream neighboring domain of that ACP in the parental PKS or PKS-NRPS as the C-terminal domain. For example, if the parental PKS or PKS-NRPS has a KR-ACP didomain, cutting at the RL motif site located between that KR and ACP yields a RU with ACP as the N-terminal domain and a RU with KR as the C-terminal domain.

[0105] It should be understood that if the parental PKS or PKS-NRPS has an AT-ACP didomain, both the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the RL motif site are present in AT-ACP didomain, and either cutting at the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or at the RL motif will be able to yield a RU with AT as the C-terminal domain and a RU with ACP as the N-terminal domain.

[0106] It should be understood that when two junction ends that are joined to each other are defined by the same kind of motif site (such as the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site) , the two junction ends may be defined by identical recombination sites or cut sites, i.e., the two junction ends are cut at identical positions in or near the same motif, and the junction region of the two junction ends can still be aligned with and correspond to said motif and, optionally, sequences upstream and / or downstream of said motif. Generally, the expression “defined by the same motif site” , as used herein, refers to that the junction ends are defined by the same kind of motif site. In some embodiments, when used in the description of two junction ends that are joined to each other, the expression “defined by the same motif site” may refer to that the two junction ends are defined by identical recombination sites or cut sites, i.e., they are cut at identical positions.

[0107] In some embodiments, a RU having a structure of M1-AT-M2-C-junction end (also referred to as type I RU herein, which may be the first RU on the assembly line of the chimeric PKS or PKS-NRPS) may be obtained by the use of the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site, wherein M1 and M2 are each independently one or more contiguous domains together with the native flanking sequences of each domain or absent. The C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site. The term “C-junction end” represents a junction end at the C-terminal of the RU for joining to the downstream adjacent RU. In some embodiments, M2 is absent and the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site. In some embodiments, M2 is absent and the AT adjacent to the C-junction end in this RU is adjacent to a ACP domain in a form of AT-ACP didomain in the parental PKS or PKS-NRPS, in this case, the C-junction end can be defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site. In some embodiments, M2 is one or more contiguous domains together with the native flanking sequences of each domain, such as KR, DH-ER-KR or any combination of one, two or three selected from DH, ER, MT and KR, and M2 is adjacent to a ACP domain in a form of M2-ACP in the parental PKS or PKS-NRPS, in this case, the C-junction end can be defined by the RL motif site. In some embodiments, M1 may comprise loading module (LM) .

[0108] In some embodiments, a RU having a structure of N-junction end-M1-ACP-M2 (also referred to as type II RU herein, which may be the last RU on the assembly line of the chimeric PKS or PKS-NRPS) may be obtained by the use of the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site, wherein M1 and M2 are each independently one or more contiguous domains together with the native flanking sequences of each domain or absent. The N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site. The term “N-junction end” represents a junction end at the N-terminal of the RU for joining to the upstream adjacent RU. In some embodiments, M1 is absent and the N-junction end is defined by the RL motif site. In some embodiments, M1 is absent and the ACP adjacent to the N-junction end in this RU is adjacent to a AT domain in a form of AT-ACP didomain in the parental PKS or PKS-NRPS, in this case, the N-junction end can be defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site. In some embodiments, M1 is one or more contiguous domains together with the native flanking sequences of each domain, such as KR, DH-ER-KR or any combination of one, two or three selected from DH, ER and KR, and M1 is adjacent to a AT domain in a form of AT-M1 in the parental PKS or PKS-NRPS, in this case, the N-junction end can be defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site. In some embodiments, M2 may comprise offloading domain, such as TE or TR. In some embodiments, M2 is TE or TR. In some embodiments, M1-ACP-M2 is ACP-TE or ACP-TR.

[0109] In some embodiments, a RU having a structure of N-junction end-M1-ACP-M3-AT-M2-C-junction end (also referred to as type III RU herein, which may be the RU between the first RU and the last RU on the assembly line of the chimeric PKS or PKS-NRPS) may be obtained by the use of the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site or the combination of the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the RL motif site, wherein M1, M2 and M3 are each independently one or more contiguous domains together with the native flanking sequences of each domain or absent. The N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site, and the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site. In some embodiments, M1 is absent and the N-junction end is defined by the RL motif site. In some embodiments, M1 is absent and the ACP adjacent to the N-junction end in this RU is adjacent to a AT domain in a form of AT-ACP in the parental PKS or PKS-NRPS, in this case, the N-junction end can be defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site. In some embodiments, M1 is one or more contiguous domains together with the native flanking sequences of each domain, such as KR, DH-ER-KR or any combination of one, two or three selected from DH, ER and KR, and M1 is adjacent to a AT domain in a form of AT-M1 in the parental PKS or PKS-NRPS, in this case, the N-junction end can be defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site. In some embodiments, M2 is absent and the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site. In some embodiments, M2 is absent and the AT adjacent to the C-junction end in this RU is adjacent to a ACP domain in a form of AT-ACP in the parental PKS or PKS-NRPS, in this case, the C-junction end can be defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site. In some embodiments, M2 is one or more contiguous domains together with the native flanking sequences of each domain, such as KR, DH-ER-KR, DH-KR-ER or any combination of one, two or three selected from DH, ER and KR, and M2 is adjacent to a ACP domain in a form of M2-ACP in the parental PKS or PKS-NRPS, in this case, the C-junction end can be defined by the RL motif site.

[0110] The chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention may comprise two, three, four, five or more RUs. Each RU may comprise one, two, three, four, five or more domains. The chimeric PKS or PKS-NRPS may be a single polypeptide containing all the domains or modules required for the synthesis of the product, or it may include two or more polypeptides which form a complex in which all the domains or modules required for the synthesis of the product are comprised in the two or more polypeptides (subunits) , respectively. The two or more polypeptides can interact with each other, for example, by docking domains (DDs) .

[0111] The chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention may at least comprise one type I RU and one type II RU, and optionally may comprise one or more type III RU. In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention may comprise only one type I RU and one type II RU. In some embodiments, the first RU (type I RU) and the last RU (type I RU) of the chimeric PKS or PKS-NRPS are derived from parental PKSs or PKS-NRPSs of different pathways. In some embodiments, In some embodiments, each of all RUs in the chimeric PKS or PKS-NRPS is derived from a parental PKS or PKS-NRPS of different pathway from other RUs, i.e., any two RUs in the chimeric PKS or PKS-NRPS are derived from parental PKSs of different pathways. The term “PKSs of different pathway” means that the products synthesis by these PKSs or PKS-NRPSs are different. The term “PKSs of different pathway” does not include different subnits of one PKS or PKS-NRPS. For example, VemG and VemH are two subunits of venemycin PKS and do not regarded as PKSs of different pathway. Unlike the existing domain replacement (swapping) techniques, the present invention can achieve the splicing between different PKS or PKS-NRPS modules to obtain more compounds with different structures.

[0112] It should be understood that in the present invention, the two or more RUs should be compatible with each other. The term “compatible” or “compatibility” refers to that the junction of two adjacent RUs enable the domains and modules on the resulting assembly line to properly function and finally synthesize the desired product. For example, the combination of recombinant RUs should enable the core domains KS, AT, ACP on the resulting assembly line to function properly in conjunction with each other, e.g., the AT domain can delivery the extender unit to the downstream ACP domain, the KS domain can catalyze the condensation reaction between the extender unit of the downstream ACP domain and the polyketide intermediate attached at the KS active site, and / or the ACP domain can translocate the elongated polyketide intermediate to the downstream KS domain. The combination of recombinant RUs should also enable the other domains on the resulting assembly line (such as KR, DH and / or ER) to function properly in conjunction with the ACP domain to each other to modify (such as reduce) the elongated polyketide intermediate. The combination of recombinant RUs should also enable the offloading domain (e.g., TE or TR) to accept the polyketide intermediate synthesized by the domains and modules that precede it as substrate. In some embodiments, for example, when a ACP domain and its downstream KS domain are located in two RUs respectively, the ACP domain and its downstream KS domain should be selected to ensure the proper interaction between the ACP and the KS to enable translocating the elongated polyketide intermediate from the ACP to the KS, which can be achieved by appropriate docking domains. In some embodiments, for example, when a KR domain and its downstream ACP domain are located in two RUs respectively, the KR domain and its downstream ACP domain should be selected to have a proper interaction ensure the function of KR to reduce the ketone to the OH.

[0113] A person skilled in the art should understand that RUs that are compatible with each other can be obtained through the selection of parental PKSs or PKS-NRPSs as well as different modules and different domains in the parental PKSs or PKS-NRPSs. For example, if it is known that some domains from different parental PKSs or PKS-NRPSs can be compatible with each other, these domains can be separately included in neighboring RUs so that they are arranged in a manner that allows for proper interaction in the resulting chimeric PKS or PKS-NRPS. Domains compatible with each other can also be known by PKS activity assay, e.g., domain-swapping or module-swapping or the chimeric PKS or PKS-NRPS can be used to determine whether one or more domains or one or more modules can be compatible with the domains in another PKS.

[0114] The parental PKS, NRPS or PKS-NRPS used to provide any of the RUs in the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention may be a natural or a non-natural PKS, NRPS or PKS-NRPS. The parental PKSs, NRPSs or PKS-NRPSs used to provide the different RUs in the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention may be the same or different. It should be understood, the term “chimeric” means that two RUs that are contiguous in the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention are not contiguous in their parental PKSs, NRPSs or PKS-NRPSs.

[0115] The parental PKS, NRPS or PKS-NRPS may be selected from PKSs or PKS-NRPSs of a variety of pathways and PKSs, NRPSs or PKS-NRPSs derived from a variety of organisms. In some embodiments, the parental PKS, NRPS or PKS-NRPS may derived from a wide range of organisms including streptomycetes, mycobacteria, myxobacteria, cyanobacteria, fungi, amoeba, and animals. In some embodiments, the parental PKS may be selected from an aminopolyol PKS, a filipin PKS, a spiramycin PKS, a E-837 PKS, a meridamycin PKS, a chalcomycin PKS, a venemycin PKS, a candicidin PKS, a rapamycin PKS-NRPS, a microtermolide (MTL) PKS-NRPS, an erythromycin PKS (also called DEBS PKS) , a mycolactone PKS (such as MlsA PKS or MlsB PKS) , a lipomycin PKS, a lavendiol PKS (Pait IGU, Kitani S, Roslan FW, Ulanova D, Arai M, Ikeda H, Nihira T. Discovery of a new diol-containing polyketide by heterologous expression of a silent biosynthetic gene cluster from Streptomyces lavendulae FRI-5. J Ind Microbiol Biotechnol. 2018 Feb; 45 (2) : 77-87. doi: 10.1007 / s10295-017-1997-x. ) , a coelimycin PKS, an akaeolide PKS (Zhou T, Komaki H, Ichikawa N, Hosoyama A, Sato S, Igarashi Y. Biosynthesis of akaeolide and lorneic acids and annotation of type I polyketide synthase gene clusters in the genome of Streptomyces sp. NPS554. Mar Drugs. 2015 Jan 16; 13 (1) : 581-96. doi: 10.3390 / md13010581. ) , an antimycin (Ant) PKS. In some embodiments, the parental PKS-NRPS may be selected from phenalamide PKS-NRPS (Park S, Hyun H, Lee JS, Cho K. Identification of the Phenalamide Biosynthetic Gene Cluster in Myxococcus stipitatus DSM 14675. J Microbiol Biotechnol. 2016 Sep 28; 26 (9) : 1636-42. doi: 10.4014 / jmb. 1603.03023. ) . In some embodiments, the parental PKS may be a PKS with a TR domain as a offloading domain.

[0116] In some embodiments, one or two or more or all RUs comprised in the chimeric PKS, PKS-NRPS may derived from filipin PKS LM-M1, LavC of lavendiol PKS, CpkC of coelimycin PKS, spiramycin PKS LM-M1, MlsB PKS M1, lipomycin PKS M1, filipin PKS M8, chalcomycin PKS LM-M1, meridamycin PKS LM-M1, candicidin PKS LM-M1, VemG and / or VemH of venemycin PKS, microtermolide PKS-NRPS LM-M1, erythromycin PKS LM-M1, the last module of erythromycin PKS, E-837 PKS LM-M1, rapamycin PKS-NRPS LM-M1, M8 and / or the last module PHE of phenalamide PKS-NRPS, AntC and / or AntD of antimycin PKS, M6 and / or the last module AKA of akaeolide PKS.

[0117] In some embodiments, any two or more of the RUs may be from parental PKSs or PKS-NRPSs of different pathways, or from different parts of one parental PKS or PKS-NRPS (e.g., different modules of one parental PKSs or PKS-NRPS) .

[0118] The present invention can be used for splicing two or more modules and / or domains from PKSs or PKS-NRPSs from different pathways or splicing different modules or structural domains in different modules from the same PKS, or the combination thereof. For example, in some embodiments, the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site can be use for swapping PKS modules and domains, in some cases, It is possible to cut a PKS or NRPS at two RYWL (SEQ ID NO: 59) motif sites or two RL motif sites, and replace the cut portion with a recombination unit from other PKS or PKS-NRPS (such as an PKS or PKS-NRPS of different pathway) or from other portion of the same PKS. In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises at least one RU whose N-junction end and C-junction are all defined by RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site. In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises at least one RU, wherein the N-junction end and the C-junction end of said at least one RU, and the junctions ends of the neighboring RUs for joining to said RU are all defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site. In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises at least one RU whose N-junction end and C-junction are all defined by RL motif site. In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises at least one RU, wherein the N-junction end and the C-junction end of said at least one RU, and the junctions ends of the neighboring RUs for joining to said RU are all defined by the RL motif site. In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises two RUs, and the two junction ends of the two RUs are all defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site. In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises two RUs, and the two junction ends of the two RUs are all defined by the RL motif site. In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises three RUs, and the four junction ends of the three RUs are all defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site. In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises three RUs, and the four junction ends of the three RUs are all defined by the RL motif site.

[0119] In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention does not include a chimeric PKS or PKS-NRPS obtained by swapping of single domain (such as AT or KR) . In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention does not include chimeric PKSs obtained by replacing single domain (such as AT or KR) in one PKS or PKS-NRPS with single domain from other PKS or PKS-NRPS (such as an PKS or PKS-NRPS of different pathway) or from other module of the same PKS or PKS-NRPS that has the same or similar function with the replaced domain (such as another AT or KR) .

[0120] In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention includes non-cognate KS-ACP pair, wherein KS-ACP pair refers to a KS domain and its first downstream ACP. In other words, in some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention includes at least one KS-ACP pair, wherein the ACP in said KS-ACP pair is not the first ACP downstream of that KS in the parental PKS or PKS-NRPS of said KS.

[0121] In some embodiments, in each RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention, ACP and its downstream adjacent KS have a native interaction, that is to say, ACP-KS comprised in the chimeric PKS or PKS-NRPS or any RU is a native ACP-KS to ensure a proper interaction between the ACP domain and its downstream adjacent KS domain. In some embodiments, the native ACP-KS comprises the native docking domains. In some embodiments, the KR-ACP didomain comprised in the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention or any RU is a native KR-ACP didomain. In some embodiments, the KR and ACP domains in one or more KR-ACP didomains comprised in the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention are non-cognate.

[0122] As can be understood, there may be two or more AT and / or ACP-containing modules in any one parental PKS or PKS-NRPS, and thus there may be two or more RYWL (SEQ ID NO: 59) motif sites or RL motif sites in any one parental PKS, and the recombination sites used to define the junction ends of the RUs contained in the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention may be selected from these RYWL (SEQ ID NO: 59) motif sites and RL motif sites.

[0123] In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may be derived from filipin PKS, spiramycin PKS, meridamycin PKS or chalcomycin PKS. In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may be derived from filipin PKS LM-M1, spiramycin PKS LM-M1, meridamycin PKS LM-M1 or chalcomycin PKS LM-M1.

[0124] In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise KSQ-AT-ACP-KS-AT-C-junction end derived from filipin PKS LM-M1, spiramycin PKS LM-M1, meridamycin PKS LM-M1 or chalcomycin PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site. In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise KSQ-AT-ACP-KS-AT-KR-C-junction end derived from filipin PKS LM-M1, spiramycin PKS LM-M1, meridamycin PKS LM-M1 or chalcomycin PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RL motif site.

[0125] In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may be derived from a parental PKS or PKS-NRPS with a TR domain as a offloading domain and the last RU comprise the TR derived from said parental PKS as the offloading domain of the chimeric PKS or PKS-NRPS. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise M1-TR derived from the parental PKS or PKS-NRPS with the TR domain, wherein M1 is one or more contiguous domains or absent. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-M1-TR derived from the parental PKS or PKS-NRPS with the TR domain, wherein M1 is one or more contiguous domains and wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site or other recombinant site. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise ACP-TR derived from the parental PKS or PKS-NRPS with the TR domain. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-ACP-TR derived from the parental PKS with the TR domain, wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site or other recombinant site. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise KR-ACP-TR derived from the parental PKS antimycin with the TR domain. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-KR-ACP-TR derived from the parental PKS with the TR domain, wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or other recombinant site.

[0126] In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may be derived from lavendiol PKS or coelimycin PKS. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may be derived from LavC of lavendiol PKS (which is encoded by lavC gene) . In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise ACP-TR derived from LavC of lavendiol PKS. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-ACP-TR derived from LavC of lavendiol PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise KR-ACP-TR derived from LavC of lavendiol PKS. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-KR-ACP-TR derived from LavC of lavendiol PKS, wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may be derived from CpkC of coelimycin PKS (which is encoded by cpkC gene) . In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise ACP-TR derived from CpkC of coelimycin PKS. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-ACP-TR derived from CpkC of coelimycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise the last ACP of M8 and the full last module PHE (C-A-PCP-TR) of phenalamide PKS-NRPS. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-ACP derived from M8 of phenalamide PKS-NRPS and the full last module PHE (C-A-PCP-TR) of phenalamide PKS-NRPS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site.

[0127] In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises at least three RUs. In some embodiments, the last two RUs of the chimeric PKS or PKS-NRPS comprise an ACP and a TR, respectively, and said ACP and TR are derived from two different parental PKS or PKS-NRPS (such as of different pathways) , respectively, both of which have a TR as the offloading domain and have a ACP-TR didomain at the C-terminal of the PKS, wherein the ACP comprised in the penultimate RU is the ACP that is adjacent to the TR in its parental PKS or PKS-NRPS. In some embodiments, the last RU comprise only one domain which is TR, the penultimate RU comprise one or more contiguous domains derived from a parental PKS or PKS-NRPS that comprise a TR as offloading domain, and the one or more contiguous domains of the penultimate RU comprise ACP that is adjacent to TR in its parental PKS or PKS-NRPS as the C-terminal domain. In this kind of RUs arrangement, in some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS comprise N-junction end-TR, wherein the N-junction end is defined by a site at the C-terminal of ACP; in some embodiments, the penultimate RU in the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises N-junction end-M1-ACP-C-junction end, wherein M1 is one or more contiguous domains or absent, the N-junction end may be defined by the RL motif site when M1 is absent, and the C-junction end is defined by a site at the C-terminal of ACP; in some embodiments, the penultimate RU in the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises N-junction end-KR-ACP-C-junction end, wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and the C-junction end is defined by a site at the C-terminal of ACP. In some embodiments, the penultimate RU comprises N-junction end-ACP-C-junction end or N-junction end-KR-ACP-C-junction end derived from any PKS having a TR as the offloading domain, such as LavC of lavendiol PKS or CpkC of coelimycin PKS, preferably LavC. The last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-TR derived from any PKS, such as CpkC of coelimycin PKS or LavC of lavendiol PKS, preferably CpkC. In some embodiments, the penultimate RU comprises N-junction end-ACP-C-junction end or N-junction end-KR-ACP-C-junction end derived from LavC of lavendiol PKS, and the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-TR from CpkC of coelimycin PKS .

[0128] In some embodiments, the last two RUs of the chimeric PKS or PKS-NRPS comprise an KR and a ACP-TR didomain, respectively, and said KR and ACP-TR are derived from two different parental PKS or PKS-NRPS (such as of different pathways) , respectively. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS comprise N-junction end-ACP-TR, wherein the N-junction end is defined by a RL motif site. In some embodiments, the penultimate RU in the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises N-junction end-KR-C-junction end, wherein the N-junction end may be defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end is defined by a RL motif site. In some embodiments, the penultimate RU comprises N-junction end-KR-C-junction end derived from MlsB PKS M1, lipomycin PKS M1 or filipin PKS M8. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-ACP-TR derived from any PKS, such as CpkC of coelimycin PKS or LavC of lavendiol PKS, preferably LavC.

[0129] In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises a TR derived from a parental PKS with the TR domain as a offloading domain and the TR is used as the offloading domain of the chimeric PKS or PKS-NRPS, as described above, and the RU (may be one or more RUs) other than the last RU is derived from a parental PKS or PKS-NRPS that does not use TR domain as an offloading domain.

[0130] In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may be derived from candicidin PKS, E-837 PKS, erythromycin (DEBS) PKS, rapamycin PKS-NRPS or microtermolide PKS-NRPS. In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may be derived from candicidin PKS LM-M1, E-837 PKS LM-M1, erythromycin (DEBS) PKS LM-M1, rapamycin PKS-NRPS LM-M1 or microtermolide PKS-NRPS LM-M1. In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise A-ACP-KS-AT-C-junction end derived from candicidin PKS, microtermolide PKS-NRPS or rapamycin PKS-NRPS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site. In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise AT-ACP-KS-AT-C-junction end derived from DEBS PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site. In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise KSQ-AT-ACP-KS-AT-C-junction end derived from E-837 PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site. In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise AT-ACP-KS-AT-KR-C-junction end derived from DEBS PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RL motif site. In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise AT-ACP-KS-AT-KR-ACP-KS-AT-C-junction end derived from DEBS PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site. In some embodiments, the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise A-ACP-KS-AT-DH-ER-KR-C-junction end derived from microtermolide PKS-NRP LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RL motif site.

[0131] In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may be derived from venemycin PKS, akaeolide PKS, antimycin PKS, DEBS PKS or phenalamide PKS-NRPS. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may be derived from VemG and VemH of venemycin PKS, M6 and the last module AKA of akaeolide PKS, Ant C and AntD of antimycin PKS, the last module of DEBS PKS or M8 and the last module of phenalamide PKS-NRPS. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-ACP derived from VemG and the full VemH (VemG’s native downstream enzyme, including KS-AT-ACP-TE) of venemycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-ACP derived from the penultimate module of phenalamide PKS-NRPS (phenalamide PKS-NRPS M8) and the full last module of phenalamide PKS-NRPS (PHE, which includes C-A-PCP-TR) , wherein the N-junction end is defined by the RL motif site. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-ACP derived from the penultimate module of akaeolide PKS (akaeolide PKS M6) and the full last module of akaeolide PKS (AKA, which includes KS-AT-ACP-TE) , wherein the N-junction end is defined by the RL motif site. In some embodiments, the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise N-junction end-ACP derived from the penultimate module of antimycin PKS (AntC) and the full last module of antimycin PKS (AntD, which includes KS-AT-ACP-TE) , wherein the N-junction end is defined by the RL motif site.

[0132] In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS may comprise one or more RUs between the first RU and the second RU, i.e., type III RU, which may derived from lavendiol PKS (such as LavC) , coelimycin PKS (such as CpkC) , MlsB PKS (such as M1) , lipomycin PKS (such as M1) , filipin PKS (such as M8) , antimycin PKS (such as AntC and AntD) . In some embodiments, the type III RU may comprise N-junction end-ACP-C-junction end derived from LavC of lavendiol PKS or CpkC of coelimycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site and the C-junction end is defined by a site at the C-terminal of ACP. In some embodiments, the type III RU may comprise N-junction end-KR-C-junction end derived from MlsB PKS M1, lipomycin PKS M1 or filipin PKS M8, wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end is defined by the RL motif site. In some embodiments, the type III RU may comprise N-junction end-ACP-KS-AT-ACP-C-junction end derived from AntC and AntD of antimycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site and the C-junction end is defined by a site at the C-terminal of ACP.

[0133] In some embodiments, the present invention provides the following chimeric PKS or PKS-NRPS:

[0134] (1) the chimeric PKS compriseing two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (R) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Lav-2 in Example 1)

[0135] (2) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of the LM-M1 of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises KR-ACP-R of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the product is  ( (R) -1, 3-butanediol) and / or  ( (S) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Lav-4 in Example 1)

[0136] (3) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC, the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (R) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Cpk-2 in Example 1)

[0137] (4) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of spiramycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (R) -1, 3-butanediol) ; (Srm-Cpk-2 in Example 1)

[0138] (5) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of spiramycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (R) -1, 3-butanediol) ; (Srm-Lav-2 in Example 1)

[0139] (6) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, (ii) the second RU comprises ACP of LavC, the N-junction end of the second RU is defined by the RL motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the LAxxL motif site, and (ii) the last RU comprises TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the LAxxL motif site; the product is  ( (R) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Lav-Cpk-2-1 in Example 1)

[0140] (7) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises KR of MlsB PKS M1, the N-junction end of the second RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the RL motif site, and (iii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ((S) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Mls-Lav-4-2 in Example 1)

[0141] (8) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises KR of lipomycin PKS M1, the N-junction end of the second RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the RL motif site, and (iii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (S) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Lip-Lav-4-2 in Example 1)

[0142] (9) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises KR of filipin PKS M8, the N-junction end of the second RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the RL motif site, and (iii) the last RU comprises ACP-TR of LavC, the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (S) -1, 3-butanediol) ; (Pte-Pte8-Lav-4-2 in Example 1)

[0143] (10) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of chalcomycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (2S, 3R) -2-methyl-1, 3-butanediol) ; (Chm-Cpk-2 in Example 1)

[0144] (11) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of chalcomycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (2S, 3R) -2-methyl-1, 3-butanediol) ; (Chm-Lav-2 in Example 1)

[0145] (12) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of meridamycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (2S, 3S) -2-methyl-1, 3-butanediol) ; (Mer-Cpk-2 in Example 1)

[0146] (13) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of meridamycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  ( (2S, 3S) -2-methyl-1, 3-butanediol) or  ( (2R, 3S) -2-methyl-1, 3-butanediol) ; (Mer-Lav-2 in Example 1)

[0147] (14) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of candicidin PKS LM-M1and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the product is  (Can-Vem-1 and VemH in Example 2)

[0148] (15) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the product is  (MTL-Vem-1 and VemH in Example 2)

[0149] (16) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises AT-ACP-KS-AT of erythromycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the product is  (DEBS-Vem-1 and VemH in Example 2)

[0150] (17) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of E-837 PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the product is  (E-837-Vem-1 and VemH in Example 2)

[0151] (18) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of rapamycin PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the product is  (Rap-Vem-1 and VemH in Example 2)

[0152] (19) the chimeric PKS-NRPS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of phenalamide PKS-NRPS M8 and its native downstream enzyme PHE including C-A-PCP-TR, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  (MTL-Phe-1 / 4 and PHE in Example 2)

[0153] (20) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises the last ACP of AntC and KS-AT-ACP of its native downstream enzyme AntD, the N-junction end of the second RU is defined by the RL motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the LAxxL motif site site; and (iii) the last RU is TE of erythromycin PKS and the N-junction end of the last RU is defined by the LAxxL motif site site; the extender substrates are methylmalonyl-CoA, methylmalonyl-CoA and butylmalonyl-CoA, or methylmalonyl-CoA and allylmalonyl-CoA extenders, respectively, and the products are wherein R1 is methyl, R2 is butyl, R3 is allyl, respectively; (MTL-AntC-1 / 4 and AntD-DEBS (TE) in Example 2)

[0154] (21) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NPRS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of akaeolide PKS M6 and its native downstream enzyme AKA including KS-AT-ACP-TEand the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  (MTL-Aka-1 / 4 and AKA in Example 2)

[0155] (22) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises AT-ACP-KS-AT of erythromycin PKS LM-M1and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of akaeolide PKS M6 and its native downstream enzyme AKA including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  (DEBS-Aka-4 and AKA in Example 2)

[0156] (23) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises AT-ACP-KS-AT of erythromycin PKS LM-M1, the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is  (DEBS-Vem-4 and VemH in Example 2)

[0157] (24) the chimeric PKS-NRPS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT-DH-ER-KR of microtermolide PKS-NRPS LM-M1, the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of phenalamide PKS-NRPS M8 and its native downstream enzyme PHE including C-A-PCP-TR, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is and / or  (MTL-Phe-4 and PHE in Example 2) ; and

[0158] (25) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT-DH-ER-KR of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the product is and / or  (MTL-Vem-4 and VemH in Example 2)

[0159] In some embodiments, the present invention provides chimeric PKS or PKS-NRPS that comprising a sequence as set forth in SEQ ID NO: 3, 5, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 25.

[0160] In some embodiments, the present invention provides chimeric PKS or PKS-NRPS that comprises two subunits, one has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 30, 33, 36, 39, 42, 45, 54 and the other has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 29 (VemH) .

[0161] In some embodiments, the present invention provides chimeric PKS or PKS-NRPS that comprises two subunits, one has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 49, 50, and the other has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 53 (PHE) .

[0162] In some embodiments, the present invention provides chimeric PKS or PKS-NRPS that comprises two subunits, one has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 48, and the other has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 57.

[0163] In some embodiments, the present invention provides chimeric PKS or PKS-NRPS that comprises two subunits, one has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 47, 56, and the other has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 52 (AKA) .

[0164] The present invention also provides a polynucleotide encoding the chimeric PKS or PKS-NRPS as described herein. Said polynucleotide may be DNA or RNA.

[0165] The present invention also provides a expression vector comprising said polynucleotide for expressing said chimeric PKS or PKS-NRPS. Said expression vector may be, for example, plasmid vector. The polynucleotide encoding two or more polypeptides (subunits) contained in the chimeric PKS or PKS-NRPS may be contained in a single expression vector or in separate expression vectors. As known to those of skill in the art, a expression vector typically comprise control sequences, including but not limited to, a promoter, that are operably linked to the polynucleotide to be expressed. Said control sequences are well known in the art.

[0166] The present invention also provides host cells for expressing the chimeric PKS or PKS-NRPS described herein, to produce a compound that can be synthesized by said chimeric PKS or PKS-NRPS. The host cell may comprise the polynucleotide or the expression vector described above and can express the chimeric PKS or PKS-NRPS described herein.

[0167] The host cell may be a bacteria such as an Actiobacterium. In some embodiments, In some embodiments, the host cell is E. coli. the host cell is a Streptomyces strain, such as but not limited to, Streptomyces albus, Streptomyces filipinensis, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces bikiniensis, Streptomyces venezuelae, Streptomyces griseus, Streptomyces hygroscopicus, or Streptomyces lavendulae.

[0168] Also provided herein is a method for producing a compound, comprising culturing said host cell under suitable conditions and recovering said compound from said host cell. The method of recovering the produced compound is known to those skilled in the art, e.g., the host cells can be lysed and then subjected to chromatography to isolate and purify said compound.

[0169] The present invention may also provide a in vitro method for producing a compound, which may be performed in a cell-free system, comprising incubating the chimeric PKS or PKS-NRPS with start substrate and extender substrates under appropriate conditions.

[0170] It should be understood that said compound is a compound that can be synthesized by the chimeric PKS or PKS-NRPS in vivo (i.e., in the host cell that expresss the chimeric PKS or PKS-NRPS) or in vitro (such as, in a cell-free system with specific start substrate and extender substrates) .

[0171] The present Invention enables more compounds with diverse structures that cannot be produced naturally by biological methods (e.g., cannot be produced naturally by living organisms) by splicing between different PKS or PKS-NRPS modules.

[0172] Compounds that may be produced with the chimeric PKS or PKS-NRPS or the methods of the invention include, but are not limited to, polyketides and polyketide macrolides or hybrid polyketides / non-ribosomal peptides. In some embodiments, the chimeric PKS or PKS-NRPS or the method of the present invention can be used to produce alcohols or aldehydes, such as butanediols (including 1, 3-butanediol, 2-methyl-1, 3-butanediol) , which can be obtained by recombining a RU comprising a TR domain with RUs from other PKSs, and the use of this TR domain as an offloading domain can enable the synthesized ketone to be reduced to analdehyde or alcohol and released. In some embodiments, the compounds that canproduced by the chimeric PKS or PKS-NRPS or the method of the present inventionmay a (R)-stereoisomer or (S)-stereoisomer. In some embodiments, the compoundsthat can produced by the chimeric PKS or PKS-NRPS or the method of the presentinvention may be selected from the following. In some embodiments, the compoundsthat can produced by the chimeric PKS or PKS-NRPS or the method of the presentinvention may be one or more selected from the following:

[0173] wherein R1 is methyl, R2 is butyl, R3 is allyl.

[0174] The present invention also provides use of the above-mentioned chimeric PKS or PKS-NRPS in the production of a compound, which are as described above.

[0175] Definitions:

[0176] The term “polyketide synthase” or “PKS” refers to the family of multi-modular enzymes, multi-domain enzymes, or enzyme complexes that produce polyketide intermediate products or polyketides. Substrates of polyketide synthases may comprise acetyl-CoA or analogs or derivatives thereof. PKSs may rely on protein-protein interactions within and / or between modules to function. PKS may produce one or more intermediate products between successive modules. PKSs include type I, type II and type III polyketide synthase. In some embodiments, the PKS herein is type 1 PKS.

[0177] The term “type I polyketide synthase” (or “type I PKS” ) means a polyketide synthase in which more than one module containing multiple enzymatic domains are used in the biosynthesis of a polyketide product. Type I PKSs are subdivided into iterative PKSs and assembly-line PKSs (also called modular PKSs) . An iterative PKS catalyzes multiple chain elongation cycles using the same set of enzymatic domains. In an assembly-line PKS, the nascent polyketide chain is channeled from one module (usually made up of at least KS, AT and ACP on a single polypeptide) to another such that each module typically catalyzes only one elongation cycle. In some embodiments, the PKS herein is type 1 modular PKS.

[0178] The term “polyketide” or “PK” is meant a compound comprising multiple ketyl units, which is a large family of secondary metabolites in bacteria, mycetes, plants and certain lines of animals that originate from the iterative condensation of acetyl or malonyl subunits by polyketide synthase enzymes. Polyketides also serve as starting materials for the production of a wide range of natural and semi-synthetic products.

[0179] The term “non-ribosomal peptide synthetase” or “NRPS” refers to a protein with modular enzymatic activities which can lead to production of a non-ribosomal peptide. In some embodiments, the NRPS herein refers to modular NRPS.

[0180] The term “non-ribsomal peptide” or “NRP” is meant any polypeptide not produced by a ribosome. NRPs may be linear, cyclized or branched and contain proteinogenic, natural or non-natural amino acids, or any combination thereof. NRPs include peptides produced by an assembly line.

[0181] The term “PKS-NRPS” refers to hybrid PKS-NRPS systems in which both types of assembly line are pieced together to form a coherent unit for synthesis of nonribosomal peptide-polyketide hybrids, e.g., yersiniabactin, epothilone or bleomycin.

[0182] The term “assembly line” is used in the context of type 1 modular PKS and modular NRPS, and refers to a plurality of modules of PKS and / or NRPS arranged in a particular order, which sequentially perform different reactions or modifications on the substrate to obtain the product.

[0183] The term “domain” refers to a section of a polyketide synthase or non-ribosomal peptide synthetase protein containing a single enzymatic activity, including but not limited to ketosynthase (KS) , acyl transferase (AT) and acyl carrier protein (ACP) , ketoreductase (KR) , dehydratase (DH) , enoyl reductase (ER) , methyltransferase (MT) , thioesterase (TE) , thioester reductase (TR) etc. in a type 1 modular PKS; or adenylation (A) domain, peptidyl carrier protein (PCP) , condensation (C) domain, cyclization (Cy) domain, thiolation (T) domain, thioesterase (TE) , epimerizationI) domain, methyltransferase (MT) , oxidase (Ox) , reductase (Re) , or thioester reductase (TR or R) etc. in a NRPS.

[0184] The term “module” refers to a section of a polyketide synthase or non-ribosomal peptide synthetase protein containing one or more domains, involved in at least one round (typically one round) of chain extension or chain transfer (more commonly chain extension) . PKS and NRPS usually include loading module (LM, also called initiation module) , one or more extension module (also called elongation module) and termination module (also called releasing domain) .

[0185] The term “loading module” refers to a group of contiguous domains which accomplishes the loading of the starter unit (starter substrate) onto the PKS or the NRPS and thus renders it available to the next module (the first extension module or the termination module) . The loading module may start with a loading domain (also referred to as LD herein) . In PKS, the loading domain may be a AT. The loading module may comprise a ketosynthase-like decarboxylase (KSQ) domain or an adenylation domain (A) . In NRPS, the initiation module may comprise, for example, an A (adenylation) domain and a PCP (peptidyl carrier protein) or T (thiolation) domain, and may also contain an E (epimerization) domain. The loading / initiation module is preferably at the N-terminus of the polypeptide of the first module of an assembly line, and each assembly line preferably contains one loading / initiation module.

[0186] The term “extension module” refers to a set of contiguous domains, which accomplishes one cycle of polyketide chain extension (or elongation) . Each extension module of type 1 modular PKS includes at least three domains, i.e., a KS, an AT and an ACP to catalyze polyketide acyl chain elongation, and may optionally includes additional domains to modify the newly synthesized, ACP-bound intermediate, such as KR, DH, ER and / or MT. Each extension module of modular NRPS may include a C (condensation) , Cy (heterocyclization) , E, MT (methyltransferase) , Ox (oxidase) , or Re (reductase) domain; an A domain; or a T domain, and may further comprise additional E, Re, DH (dehydration) , MT, NMet (N-methylation) , AMT (Aminotransferase) , or Cy domains.

[0187] The term “termination module” is meant a module that releases the molecule (e.g., an NRP, PK, or combination thereof) from the assembly line. The molecule may be released, for example, by hydrolysis or cyclization to release carboxylic acid or lactone (by thioesterase) , or by reduction to form aldehyde or alcohol (by thioester reductase) . A termination module may comprise a thioesterase (TE) , thioester reductase (TR or R) or C as a termination (or releasing or offloading) domain on its C-terminus. The termination module is preferably at the carboxy terminus of a polypeptide of an NRPS or PKS assembly line.

[0188] The term “chimeric PKS” or “chimeric PKS-NRPS” refers to a non-natural PKS or non-natural PKS-NRPS comprising two or more recombination units that are not contiguous in their parental PKS or PKS-NRPS and are joined together.

[0189] The term “recombination unit (RU) ” is meant to one or more contiguous domains derived from a parental PKS or PKS-NRPS. Two or more recombination units (RUs) are linked together to form the chimeric PKS or PKS-NRPS of the present invention.

[0190] The term “assembly line” , in this context, refer to a plurality of biochemical reactions or processes of product synthesis occurred in certain sequence and are catalyzed by a PKS, NRPS or PKS-NRPS.

[0191] The term “contiguous” , “adjacent” , “upstream” , “downstream” , “first” , “last” , “next” and “previous” , when used in the description of domains or modules or RUs of a PKS, NRPS or PKS-NRPS, refers to the relationship of these domains or modules or RUs to each other on the assembly line of the PKS, NRPS or PKS-NRPS. Contiguous or adjacent domains or modules may be covalently linked to each other, or not covalently linked to each other (i.e., located on separate polypeptides or subunits) but have a docking domains-mediated subunit interaction. The term “docking domains (DDs) ” refers to short amino acid regions at the N-and C-termini of each subunit of PKS or PKS-NRPS, which interact to facilitate substrate transfer and maintain pathway fidelity. See, e.g., Helen G Smith, Matthew J Beech,  R Lewandowski, Gregory L Challis, Matthew Jenner, Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth (et) ases, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, Volume 48, Issue 3-4, April 2021, kuab018, https:  / / doi. org / 10.1093 / jimb / kuab018.

[0192] The term “junction end” means one end at the N-terminal or the C-terminal of each RU for joining to other RUs.

[0193] The term “N-junction end” represents a junction end at the N-terminal of a RU for joining to the downstream adjacent RU.

[0194] The term “C-junction end” represents a junction end at the C-terminal of a RU for joining to the downstream adjacent RU

[0195] The term “parental PKS or PKS-NRPS” refers to the PKS or PKS-NRPS from which a recombinant unit is derived. The parental PKS or PKS-NRPS may be natural or non-natural PKS or PKS-NRPS.

[0196] The term “native” means that a section (such as two or more domains or the flanking sequence of a domain) maintain the same arrangement and sequence as in the parent PKS, NRPS or PKS-NRPS. The native flanking sequence of a domain means that the flanking sequence is derived from the same parental PKS, NRPS or PKS-NRPS as said domain and maintains the same sequence and junction with said domain as in the parent PKS, NRPS or PKS-NRPS.

[0197] The term “natural” PKS or PKS-NRPS means that the PKS or PKS-NRPS can be produced by a wild type organism which naturally contains PKS or PKS-NRPS genes.

[0198] The term “non-natural” or “non-naturally” means not occurring in nature. The term “non-natural” PKS or PKS-NRPS means that the PKS or PKS-NRPS cannot be produced by a wild type organism which naturally contains PKS or PKS-NRPS genes. The non-natural PKS or PKS-NRPS may be a modified PKS or PKS-NRPS or a variant of a natural PKS or PKS-NRPS, wherein the amino acid of at least domain, at least one module, at least one inter-domain linker, at least inter-module linker and / or at least docking domain is different compared with a natural PKS or PKS-NRPS.

[0199] The term “derived” or “derived from” , as used herein, generally indicates that a sequence may be isolated from, related to, based on or homologous to a reference sequence. Sequences that are “derived from” a reference sequence thus include sequences that are identical to said reference sequence (i.e. full-length sequences exhibiting 100%sequence identity to said reference sequence) , as well as variants, fragments and derivatives of said reference sequences. The definition is applicable to both amino acid sequences and nucleic acid sequences. The term “derived” or “derived from” can also indicate that a protein or a nucleic acid may be isolated from, or be produced in an organism.

[0200] The term “cognate” refers to components that function together, or have some aspect of specificity for each other. When used for two or more domains of a PKS or PKS-NRPS, the term “cognate” usually refers to two or more domains that are present in the same module, or two or more domains involved in the same reaction or in the delivery of the same extender unit or the translocation of the same elongated polyketide intermediate.

[0201] The term “host” , as used herein, refers cells or organisms (including animals, e.g., mammal animals, in particular, humans) that have been infected or at risk of being infected with coronavirus. In some embodiments, the host is a subject or a patient.

[0202] The term “variant” , in the context of peptides, refers to a peptide comprising an amino acid sequence that differs in at least one amino acid residue from a reference (or “parent” ) amino acid sequence of a reference (or “parent” ) protein or peptide. “Variant” peptide may comprise, in its amino acid sequence, at least one amino acid mutation, substitution, insertion and / or deletion as compared to its reference sequence. Substitutions may be selected from conservative or non-conservative substitutions.

[0203] The term “functional variant” , in the context of peptides, refers to a variant having the same or substantially the same function as the parental peptide.

[0204] The term “conservative substitution” , as used herein, refers to an amino acid residue in a peptide substituted with another amino acid residue having a similar side chain without substantially affecting the inhibitory functions of the peptide variant. For example, a group of amino acids having aliphatic side chains is glycine, alanine, valine, leucine, and isoleucine; a group of amino acids having aliphatic-hydroxyl side chains is serine and threonine; a group of amino acids having amide-containing side chains is asparagine and glutamine; a group of amino acids having aromatic side chains is phenylalanine, tyrosine, and tryptophan; a group of amino acids having basic side chains is lysine, arginine, and histidine; and a group of amino acids having sulfur-containing side chains is cysteine and methionine. Conservative substitution may include mutual substitution between amino acids within the same group. Preferred conservative amino acid substitution groups include: valine-leucine-isoleucine, phenylalanine-tyrosine, lysine-arginine, alanine-valine, and asparagine-glutamine.

[0205] The term “sequence identity” is used to describe the correlation between two amino acid sequences or between two nucleotide sequences. “Sequence identity” is the value of the percentage of sequence identity determined by optimally aligning (i.e., maximizing sequence identity) two sequences over a comparison window, where the two sequences being aligned can be optimally aligned by addition or deletion (i.e., gap) of amino acids or nucleotides. The percentage sequence identity can be calculated by determining the number of positions in the two sequences where the same nucleic acid base or amino acid residue occurs in the optimized alignment mode to generate a number of matching positions, dividing the number of matching positions by the total number of positions aligned, and then multiplying that result by 100 to obtain a percentage sequence identity. Sequence identity between two amino acid sequences may be determined by using an local aligning tool or a global aligning tool, such as using the numerous alignment programs available (for example, BLAST, ALIGN, ClustalW (such as Clustal Omega) , MAFFT, GeneiousAligner, MAUVE, LastZ, MUSCLE, EMBOSS Needle, etc. ) with default parameters.

[0206] The term “a sequence corresponding to” a reference sequence refers to a sequence that is determined to correspond to the reference sequence based on optimized sequence alignments (i.e., maximizing sequence identity) between the queried sequence and the reference sequence. Corresponding sequences can be determined by such alignment by one of skill in the art using manual alignments or by using the numerous alignment programs available (for example, BLAST, ALIGN, ClustalW (such as Clustal Omega) , MAFFT, GeneiousAligner, MAUVE, LastZ, MUSCLE, EMBOSS Needle, etc. ) with default parameters.

[0207] The term “a position (or site) corresponding to” refers to a position (or site) in the queried sequence that is determined to correspond to a specific position in a reference sequence based on optimized sequence alignments (i.e., maximizing sequence identity) between the queried sequence and the reference sequence. Corresponding positions can be determined by such alignment by one of skill in the art using manual alignments or by using the numerous alignment programs available (for example, BLAST, ALIGN, ClustalW (such as Clustal Omega) , MAFFT, GeneiousAligner, MAUVE, LastZ, MUSCLE, EMBOSS Needle, etc. ) with default parameters.

[0208] In the present invention, amino acids are represented by conventional single-letter or three-letter nomenclature. As is well known to those skilled in the art, the amino acid single letter designations are as follows: A is alanine; C is cysteine; D is aspartic acid; E is glutamic acid; F is phenylalanine; G is glycine; H is histidine; I isoleucine; K is lysine; L is leucine; M is methionine; N is asparagine; P is proline; Q is glutamine; R is arginine; S is serine; T is threonine ; V is valine; W is tryptophan; and Y is tyrosine.

[0209] In the present invention, references to “A-B” , “A-B-C” , “A-B-C-D” and the like denote domains A, B, C, D, which are arranged in the shown order, are adjacent to each other, and are covalently joined to each other by a linker or interact with each other by docking domains, unless otherwise explicitly stated.

[0210] The term “linker” means a molecular moiety that connects two parts of a composition.

[0211] EXAMPLES

[0212] The examples below are intended to be purely exemplary of the invention and should therefore not be considered to limit the invention in any way. The following examples and detailed description are offered by way of illustration and not by way of limitation.

[0213] Example 1 Harnessing thioester reductase for expanding the chemical versatility of modular polyketide synthases

[0214] RESULTS

[0215] Among the TR-containing PKSs, we first selected lavendiol TR (LavC-TR) as engineering template because it produces terminal alcohol, which is less toxic and unreactive than aldehyde. We started with a simple bimodular system that should produce a 1, 3-butanediol (1, 3-BDO) , an important chemical feedstock molecule, to investigate the TR engineering methods, and constructed various hybrid PKSs with the filipin PKS loading module (LM) and module 1 (LM-M1) (Figure 1) . The filipin module 1 AT and KR has identical catalytic function to the native LavC, making it an ideal donor for hybrid enzyme construction. Five cut sites at various domain boundaries were selected to assess their effect on PKS engineering, including the post GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif at C-terminal of KS (Cut site 5, Pte-Lav-5) , the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif at post-AT linker (Cut site 4, Pte-Lav-4) , the C-terminal of KR (Cut site 3, Pte-Lav-3) , the RL motif at ACP helix 0 (Cut site 2, Pte-Lav-2) , and the C-terminal of ACP (Cut site 1, Pte-Lav-1) . Throughout this Example, the hybrid enzymes were designed by cutting two parental PKSs at the same cut site (i.e. one from the above five cut sites) and connected by general molecular cloning methods and in the nomenclature of each hybrid enzyme, the names of the parental PKSs or PKS-NRPSs are shown in the order of the RUs from them and the number represents the the Cut site number used for that enzyme.

[0216] The hybrid enzymes were expressed in E. coli BAP1 and Streptomyces albus J1074 and the production of butanediols were detected at day 3 and day 4, respectively, by LC-MS analyses. The best titer was obtained by the RL motif cut site (Pte-Lav-2, 18 mg / L, Figures 2A-2D) . The hybrid Pte-Lav-4 at the RYWL (SEQ ID NO: 59) cut site produced second-highest 5 mg / L 1, 3-BDO but with less stereoselectivity. Interestingly, the hybrid Pte-Lav-3 at the C-terminal KR showed the production of 4-hydroxy-2-butanone, the product of KR skip, suggesting that the KR-ACP linker is important for proper KR function. We note that the Pte-Lav-4 and 5 showed significant improvement in S. albus expression (Figures 2A-2D) suggesting that the poor titer in E. coli does not directly mean failed PKS engineering.

[0217] Next, to test the generality of RL cut site for TR engineering, we exchanged the TR-donor from lavendiol LavC to coelimycin CpkC, which was biochemically characterized. In another construct, the filipin LM-M1 was also exchanged to spiramycin PKS SrmPKS LM-M1. The comparison of the filipin PKS and CpkTR hybrid Pte-Cpk-1 (engineered at cut site 1 of C-terminal of ACP) and Pte-Cpk-2 (engineered at the RL cut site) again showed that the RL cut site can be successfully used for 1, 3-BDO production (4 mg / L, Figure 2A) . The SrmPKS-LavTR hybrid and SrmPKS-CpkTR hybrids were only expressed In the S. albus host, but showed a consistent trend of the RL cut site in successful 1, 3-BDO production (Srm-Cpk-2 and Srm-Lav-2, 1 mg / L and 7 mg / L, Figure 2B) . These results indicate that the TR engineering should be carried out with its native ACP pair, and the RL motif can be a promising fusion site for ACP-TR engineering.

[0218] The LavTR showed consistently higher titer than the same construct with CpkTR. We constructed the ACP-swapped hybrids PteLavACP-Cpk and PteCpkACP-Lav to test their 1, 3-BDO production (Figure 2C) . Interestingly, the hybrid PteLavACP-Cpk (Pte-Lav-Cpk-2-1) outperformed the hybrid PteCpkACP-Lav (Pte-Cpk-Lav-2-1) , suggesting that it was the ACP but not the TR that affect the overall titer of 1, 3-BDO production.

[0219] Next, we used the KR from filipin PKS M8 (Pte8) , MlsB PKS M1 (Mls) , and lipomycin PKS M1 (Lip) to constructed hybrid PKSs, which could produce (S) -1, 3-BDO. They showed a consistent trend of the RL cut site (i.e. Pte-xxx-Lav-4-2 enzymes in Figure 2D) in higher (S) -1, 3-BDO production titer than the cut site 1 (i.e. Pte-xxx-Lav4-1 enzymes in Figure 2D) . (Titer as follows: Pte-Mls-Lav-4-2, Pte-Lip-Lav-4-2 and Pte-Pte8-Lav-4-2, 1.29 mg / L, 4.38 mg / L, and 3.70 mg / L in E. coli BAP1 host, respectively; 0.28 mg / L, 3.15 mg / L, and 7.13 mg / L in Streptomyces albus J1074 host, respectively. ) This result demonstrates the first de novo biosynthesis of (S) -1, 3-butanediol in a stereoselective manner.

[0220] To expand the structural diversity of the diol products, we aimed to construct hybrid PKS with different KR types. The meridamycin PKS LM-M1 (A1-type KR) and chalcomycin PKS LM-M1 (B1-type KR) were selected to construct the hybrids with Lav or Cpk TRs. Expression in S. albus showed that the hybrids with LavACP-TR (Mer-Lav-2 and Chm-Lav-2, Figure 3) produced 2-methyl-1, 3-butanediol (24 mg / L and 29 mg / L) with excellent stereoselectivity at the 3-hydroxyl stereocenter, which was determined by chemical derivatization and GC-MS analysis (Figure 3) . This suggests that TR can accept both (R) and (S) stereochemistry of the beta-hydroxyl group and is not affected by the alpha-methyl substitution. We also made a hybrid of erythromycin PKS to obtain 1, 3-pentanediol, but we failed in detecting the desired product. Instead, the compound 3c was produced at a lower titer, showing that the hybrid enzyme is still active (DEBS-Lav-2, Figure 3) .

[0221] The above results indicate that ACP-TR didomain swapping can be an effective strategy in TR engineering and the proper interaction between TR and its cognate ACP is likely more important.

[0222] Discussion

[0223] Although PKS can produce vast structural diversity with a limited set of domains, incorporation of additional domains will drastically enrich the chemical versatility of PKS assembly line. In this study, we investigated the engineering principle for TR domain incorporation, which enables the production of aldehyde and alcohol molecules. Such molecules play important roles in chemical, pharmaceutical, and cosmetic industries. We demonstrate the stereoselective bioproduction of three out of four stereoisomers of 2-methyl-1, 3-BDO, which cannot be easily achieved by usual biosynthetic pathway engineering. Because the RL cut site we used shows potential generality for diverse PKS engineering, it is likely that more screening of PKS LM-M1 combined with ACP-TR didomain such as the LavACP-TR can discover the enzyme for producing the remaining stereoisomer.

[0224] In the hybrid enzymes tested, we were able to obtain functional hybrids using four different PKSs, namely filipin, spiramycin, meridamycin, and chalcomycin PKSs, and two TRs from lavendiol and coelimycin pathways using the RL cut site at ACP helix 0. Our results suggest that the LavC-ACP is a privileged ACP that can pair with TR domains but also tolerate a wide range of upstream PKSs. The low titer of coelimycin ACP-TR might be due to the native product of coelimycin TR being an aldehyde (which is further transaminated by an aminotransferase) . Interestingly, the RL cut site we used here is also a recombination hot spot in PKS evolution in nature, further validating the utility of this cut site. Thus, we propose the LavC-ACPTR didomain ligated at the RL motif of ACP helix 0 as a “first choice” for TR incorporation in PKS engineering. Nevertheless, how general this strategy can be remains elusive and TR application for more complex compounds production needs additional investigation.

[0225] In summary, we developed an engineering strategy to harness the TR domain in PKS for the production of alcohols. Combined with recent advancement in PKS reprogramming and our accompanying work, we believe bioproduction of various alcohols by plug-and-play engineering of PKS will be a promising future for synthetic biology.

[0226] MATERIALS AND METHODS

[0227] Bioinformatic analyses

[0228] General bioinformatic analyses, including multiple sequence alignment and distance calculation were performed on Geneious Prime (https:  / / www. geneious. com) with options shown below: multiple sequence alignment was conducted using entire LavC without trimming with MAFFT 7.487 (E-INS-I) ; Scoring matrix BLOSUM62; Gap open penalty 1.53.

[0229] Plasmid construction

[0230] Streptomyces cells were grown at 28 ℃ in 25 mL of TSB broth for 2 days. A total DNA of Streptomyces was extracted from the cells using Bacterial Genomic DNA Extraction Kit (Tiangen) . The fragments of loading module-module 1 (LM-M1) were amplified by PCR using the total DNA as a template DNA. Cpk-ACP-TR and Lav-AT-KR-ACP-TR were synthetized by GENEWIZ. For in vivo reconstitution of the hybrid PKSs in E. coli host, the amplified fragments of LM-M1 and ACP-TR were cloned into the NdeI sites of pET-28a (+) . These plasmids were transformed into Escherichia coli BAP1 cells. For in vivo reconstitution of the hybrid PKSs in Streptomyces host, the amplified fragments of LM-M1 and ACP-TR were cloned into the NdeI sites of pZH2A, which was modified from pZH2 plasmid. In order to obtain pZH2A, the thiostreptolysin resistance gene of pZH2 plasmid is replaced by apramycin (apr, from pSET152 plasmid) resistance gene.

[0231] Conjugal transfer of integration vectors to Streptomyces hosts was conducted using the method described in Practical Streptomyces Genetics with slight modifications. E. coli ET12567 / pUZ8002 was transformed with a desired plasmid employing selection on LB agar containing apramycin (50 μg / mL) . A single colony was inoculated into 5 ml of LB containing kanamycin (25 μg / mL) , chloramphenicol (15 μg / mL) , and apramycin (25 μg / mL) and grown at 37 ℃, 200rpm. The overnight culture was used to seed 20 ml of LB containing the same antibiotics (inoculum size was 5 Vol%) , which was grown at 37 ℃ to an OD600 of 0.4–0.6, which usually takes 4–6 h. The E. coli cells were pelleted by centrifugation at 5000 × g for 8 min, washed twice with 10 ml of LB, and resuspended in 500 μl of LB. Fresh Streptomyces spores were collected from a MS agar plate (S. albus J1074, ) with 200 μl of 2xYT and incubated at 50 ℃ for 10 min. The spores (200 μL) and the E. coli cells (200 μL) were mixed and poured off and spread on MS agar (containing 10 mM magnesium chloride) . The plate incubated at 28 ℃ for 16–20 h. After addition of 1 ml of water containing nalidixic acid (0.5 g / L) and apramycin (1 g / L) , the plate was further incubated for 3–5 days to permit sporulation. A single colony was inoculated into 25 mL of TSB containing nalidixic acid (25 μg / mL) and apramycin (50 μg / mL) . Following 2 days incubation at 28 ℃, 200 μl of the culture was spread onto MS agar. The plate was incubated for 7 days at 28 ℃. Spores were collected and storage in 20%glycerol and stored at -80 ℃.

[0232] In vivo assay of the hybrid PKSs in E. coli host

[0233] E.coli BAP1 cells harboring each gene were grown at 37 ℃ (200rpm) in 30 mL LB broth containing apramycin (50 mg / L) . When the OD600 reached 0.4～0.6, the cultures were supplemented with IPTG at a final concentration of 0.1 mM. The cells were then cultured at 16℃ for another 20 h. The harvested cell pellets were suspended in 10 mL M9 medium containing kanamycin (50 μg / ml) and IPTG at a final concentration of 0.1 mM. The cells were then cultured for an additional 24, 48, 72, 96 and 120 h at 16 ℃. The culture broth was centrifuged at 12,000 rpm for 10 min and the supernatant was collected and subjected to UPLC-QQQ-MS analysis or GC-MS analysis.

[0234] In vivo assay of the hybrid PKSs in Streptomyces host

[0235] Metabolic analysis for the Streptomyces strains. Spore suspensions of Streptomyces strains were used to inoculate 150-mL flasks containing 25 mL of TSB medium, which were incubated with shaking for 48 h at 28 ℃. 2.5 ml samples of the seed cultures were then used to inoculate 250 mL flasks containing 50 mL of the YEME medium and these were incubated with shaking 24, 48, 72, 96 and 120 h at 28℃, 200rpm. The culture broth was centrifuged at 12,000 rpm for 20 min and the supernatant was collected and subjected to UPLC-QQQ-MS analysis or GC-MS analysis

[0236] Chirality analysis of diols by GC-MS.

[0237] For measurements of diols in the fermentation broth, filtered culture supernatants were mixed with acetonitrile (ACN) and a derivatization reagent (comprising 5 mg / mL phenylboronic acid dissolved in 2, 2-dimethoxypropane) at a ratio of 1: 2: 1 (v / v) and incubated by shaking at 200 rpm at room temperature for 10 min. For measurements of 2-Methyl-1, 3-butanediol, phenylboronic acid was replaced by p-tolylboronic acid.

[0238] The samples were analyzed by GC-MS (ThermoFisher Trace 1300-ISQ7000) . The GC column used was an Agilent CYCLOSIL-B column (30 m × 320 μm × 0.25 μm) . 2-5 μL of each sample were injected at a split ratio of 1: 20. The column oven was held at an initial temperature of 50 ℃ (hold for 1 min) , then ramping at a rate of 20 ℃ / min to 230 ℃ (hold for 3 min) . Helium was used as the carrier gas a column flow rate of 2 mL / min. The MS was operated in SIM mode. The temperatures of the MS Source and MS transfer line were set at 280 ℃ and 230 ℃, respectively. The confirmation of (R / S) -1, 3-BDO was done through the comparison of identical GC retention times by using the purchased chemical standards.

[0239] 1, 3-Butanediol production quantitative analysis.

[0240] All compounds were measured simultaneously with a UPLC-QQQ-MS was performed on Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS / Xevo TQ-Ssystem using Agilent ZORBAX SB-Aq column (3.5 μm, 3.0 × 100 mm) . 2 μL of each sample were injected and the flow rate was 0.5 mL / min. The column temperature was set at 40 ℃. The mobile phases were in water (A) and acetonitrile (B) . The gradient was as follows: 0%B from 0 to 2.5 min, 0–100%B from 2.5–3.5 min, 100%B from 3.5 to 7 min, 100–0%B from 7 to 10 min followed. The analytes confirmation of three groups was performed by using retention time and multi-reaction monitoring (MRM) in positive ionisation modes. 1, 3-BDO: Cone 26 V, Collision 6 V, Parent Ion 91.1 m / z, Daughter Ion 55.1 m / z, retention time 1.67 min. 4OH2: Cone 22 V, Collision 6 V, Parent Ion 89.1 m / z, Daughter Ion 71.1 m / z, retention time 2.01 min. All the data acquisition and analysis were operated on MassLynx software version 4.2 2-Methyl-1, 3-butanediol production quantitative analysis.

[0241] All compounds were measured simultaneously with GC-MS. Derivatisation and detection methods are the same as Chirality analysis.

[0242] Table 1: Protein ID of PKSs modules used in Example 1

[0243] Sequences used in Example 1

[0244] LavC, amino acid sequence, SEQ ID NO: 1 (including KS, AT, KR, ACP, TR) , wherein the underlined sequences are, in order, KS, AT, KR, ACP, and TR domains and the motifs of the cut sites are in bold. With reference to MIBiG, KS domain is from postions 35-459, AT domain is from positions 561-864, KR domain is from positions 921-1372, ACP domain is from positions 1393-1483, TR domain is from positions 1522-1876, the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif is from postions 890-902, the RL motif is from positions 1397-1398, the GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif is from positions 448-502, the LAxxL motif is from postions 1475-1479.

[0245] Example 2 Plug-and-Play Bioengineering of Modular Polyketide Synthases

[0246] RESULTS

[0247] A recent evolutionary analysis of aminopolyol PKSs revealed that KS and the upstream ACP and beta-processing domains co-migrate during gene recombination, which led to the proposal of the updated module definition starting from AT ending with KS (Figure 4) . Although the GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif at the end of KS has shown superior engineering effect in venemycin and pikromycin PKSs compared to traditional module boundary, the natural gene recombinations also commonly happen in other motifs such as the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif and RL motifs.

[0248] In this Example, five cut sites are used for PKSs engineering, including Cut 1 (the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif) , Cut 2 (post-GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif) , Cut 3 (EPIA (SEQ ID NO: 61) ) , Cut 4 (the RL motif) , Cut 5 (HL) , as shown in Figure 5, wherein the amino acid numbers above the sequence logo are based on the MTL PKS LM-M1. Throughout this Example, in the nomenclature of each hybrid enzyme, the names of the parental PKSs or PKS-NRPSs are shown in the order of the RUs from them and the number represents the Cut site number used for that enzyme.

[0249] To investigate the engineering effect of these evolutionary-supported recombination sites, we first selected well-studied venemycin PKSs (VemG and VemH) and swapped with candicidin PKS LM-M1 (loading module and module 1) , whose KS accepts the aromatic acid substrate and has close phylogenetic distance to vemG KS. Cut sites at various domain boundaries were selected to assess their effect on PKS engineering, including the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif at post-AT linker (Cut site 1, or Cut 1. Product hybrid enzyme as Can-Vem-1) , post GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif at C-terminal of KS (Cut 2, Can-Vem-2) , and the C-terminal of ACP (Cut 3, Can-Vem-3) (Figure 6) . The hybrid enzymes were designed by cutting two parental PKSs at the same cut site and connected by general molecular cloning methods. In vitro enzyme assays revealed that compared to the Can-Vem-3 that used traditional module boundary, the Can-Vem-1 and Can-Vem-2 that maintained the proper ACP-KS interaction between VemG and VemH showed 21-25 fold increase in the product 1b production (Figure 6) .

[0250] Next, to investigate the generality of these cut sites, we exchanged the candicidin PKS moiety with the LM-M1 of phylogenetically diverse PKSs or PKS-NRPSs, namely E-837, erythromycin (DEBS) , rapamycin (Rap) , and microtermolide (MTL) PKSs or PKS-NRPSs, and construct their hybrid PKSs. Consistent with the Can-Vem hybrid result, in vitro enzyme assays revealed that the updated boundaries (Cut 1 and / or Cut 2) outperformed traditional boundary (Cut 3) in all tested PKSs (Figure 7) . In addition, the RYWL (SEQ ID NO: 59) cut site consistently produced soluble and efficient enzymes.

[0251] The post GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif cut site was most effective in Rap-Vem hybrid system, but was ineffective for DEBS-Vem and MTL-Vem systems due to the decreased catalytic efficiency and insoluble protein expression, respectively. These results overall indicate that maintaining ACP-KS interaction is critical for successful module reprogramming of PKSs and demonstrate the robustness and feasibility of the evolution-supported cut sites LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif in connecting PKS modules of diverse origins.

[0252] Encouraged by the above results, we further tested the applicability of the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif in generating various PKS and PKS-NRPS hybrids. First, using the MTL LM-M1 (loading module and module 1) , we constructed MTL hybrids with the last two modules from akaeolide PKS, or phenylalamide (Phe) or antimycin (Ant) PKS-NRPSs. The MTL LM-M1 was cut at the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif (Cut 1) to prepare the N-terminal fragment, which was further connected with the C-terminal fragment of the Phe M8 (i.e. the second last module in the phenalamide PKS-NRPS) cut at the RL motif at ACP helix 0 (Cut 4) , to obtain MTL-Phe-1 / 4 hybrid protein. Similarly, the N-terminal MTL LM-M1 fragment was connected with the C-terminal fragment of akaeolide PKS M6 or the AntC prepared by cut 4. We then performed in vitro assay of the resulting MTL-XXX-1 / 4 hybrid enzymes together with their native downstream enzymes, namely PHE, AntD, and AKA. (Figure 8) . The result showed that these hybrid pathways demonstrated moderate to good efficiency, indicating the applicability of these cut sites for chimeric pathway construction for PKSs and even for PKS-NRPSs. The MTL-AntC-1 / 4 and AntD dimodule shows lower catalytic efficiency (Figure 8 bottom) , which may due to the tight substrate specificity of AntD-TE affecting the product release (Figure 8) . To solve this problem, we swapped the AntD-TE with DEBS-TE which is known to show broad substrate promiscuity using the LAxxL motif at the C-terminal of ACP (Cut 5) to obtain AntD-DEBS (TE) . The assays of MTL-AntC-1 / 4 and AntD-DEBS (TE) dimodule were performed individually with methylmalonyl-CoA, methylmalonyl-CoA and butylmalonyl-CoA, or methylmalonyl-CoA and allylmalonyl-CoA extenders to obtain the corresponding 6a, 6b, 6c, respectively. In vitro assay of MTL-AntC-1 / 4 and AntD-DEBS (TE) dimodule showed an improved production of compounds 6a-c at up to 42 μM. These results indicates that the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif can be a potential universal cut site for PKS and PKS-NRPS hybrid engineering. To our knowledge, this illustrates the first demonstration of PKS-NRPS hybrid construction that combined two enzymes from unrelated pathways.

[0253] To further modify the polyketide structure, we also constructed PKS hybrids with additional modification domains using evolution-supported motif RL (Cut 4) . First we used the DEBS-LM-M1 to construct hybrid PKSs because it contains a KR domain for hydroxyl group installation. Unexpectedly, we observed the compound 3a as the major product in the RL cut site hybrid, suggesting that the KR was skipped (Figure 9, DEBS-Vem-4 and VemH) . Compared to the RL cut site, the traditional engineering (Cut 5) produced the properly reduced 3c as the major product but the overall yield significantly decreased (Figure 9, DEBS-Vem-5 and VemH) . This suggested that the RL cut site can maintain functional PKS hybrid without disrupting the overall protein stability, but failed in maintaining KR-ACP interaction. In contrast, the DEBS-AKA hybrid using the RL cut site produced 3c as the major product with higher efficiency (Figure 9, DEBS-Aka-4 and AKA) . Since the original substrate for the AKA PKS is a beta-hydroxyl-polyketide, the AKA ACP might have better domain interaction with the DEBS KR. In addition, the downstream KS domain substrate specificity was also essential for the intermediate modification by reductive domains. Due to the broad substrate promiscuity and preference for beta-keto intermediate of VemH-KS, the beta-keto intermediate produced by DEBS-Vem-4 may be directly transferred to the next elongation without reduction by KR domain.

[0254] Except the DEBS module 1 containing the reductive domain, the microtermolide PKS-NRPS module 1 also contains a full DH-ER-KR tri-domains. Using the RL site, we built a hybrid MTL-Vem-4 enzyme (Figure 10, MTL-Vem-4 and VemH) and compared it with the traditional Cut 5 (Figure 10, MTL-Vem-5 and VemH) . Interestingly, we observed the 2a (beta processing domains were skipped) as the major product (Figure 10, MTL-Vem-4 and VemH) . This can be explained by the improper KR-ACP interaction and VemH-KS preference for beta-keto intermediate. In addition, due to the iterative catalytic function of VemH, beta-keto or reduced intermediate can be elongated twice to produce the compound 2d and 2c as the byproducts, respectively. In contrast, the traditional engineering produced the properly reduced product 2c and 2d, only a trace amount 2a can be detected, and the overall yield was significantly dropped, demonstrating the superiority of the RL site in maintaining overall catalytic turnover of the hybrid.

[0255] However, RL cut site hybrid MTL-Phe-4 produced 7c as the major product, 7d as the byproduct (Figure 10) . In addition, 7a and 7b can also be detected, which was consistent with the broad substrate specificity of PHE. In the native Phe pathway, the ER domain was inactive, which indicates that the PHE C domain prefer to accept the beta-alkene intermediate, it can also explain that the 7c was the major product.

[0256] Discussion

[0257] In this study, we investigated the cut site for modular PKS engineering and used distantly related PKSs to construct various hybrid enzymes. Ten combinations of hybrid PKS pathways and one PKS-NRPS hybrid pathway were constructed, and their product formation was compared with different cut site in each hybrid pathway. Our results illustrated that the evolution-supported LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif at post-AT linker and the RL motif at ACP helix0 consistently yielded functional PKS hybrids with superior turnover efficiency than PKSs with traditional engineering design, providing additional cut site choices for modular reprogramming. Together with the previously identified post-KS GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif, these cut sites expand the flexibility of hybrid PKS design, allowing different extender unit incorporation and reducing state control. Most importantly, our results indicated that these “second generation” cut sites are effective in connecting distantly related PKSs, and even an NRPS, opening the door for plug-and-play engineering of modular PKS.

[0258] Our analyses also shed light on the domain-domain interaction of PKSs. Comparison of the traditional cut site and the second generation cut sites tested here (Figure 5) suggests that KS shows strict selectivity for the upstream ACP (substrate polyketide intermediate carrier) recognition but tolerates ACP diversity for the downstream ACP (elongating malonyl unit carrier) . However, KR skipping was observed in the hybrids with non-native KR-ACP combination, suggesting the importance of KR-ACP interaction for beta-keto processing (Figure 9 and 10) . Nevertheless, the production of KR skipped triketide lactone indicated that the RL cut site we used did not disrupt the overall enzyme function.

[0259] Compared to the wild-type venemycin PKS pathway, the engineered PKSs showed 20-to 300-fold decrease in catalytic turnover (Figure 7) . This is understandable as the engineered PKSs use non-natural building blocks and cause substrate specificity issues in KS and other domains. Even slight decrease of efficiency for non-natural substrate will multiply and accumulate during each step of PKS biosynthesis, for example at substrate shuttling between ACP and KS, at condensation between KS and ACP, at TE cyclization, and at additional beta-processing steps. We believe the hybrid enzymes constructed here can serve as promising start point for further optimization by directed evolution.

[0260] In summary, we identified modular PKS cut sites for a wide range of PKSs to construct hybrid PKSs and even PKS-NRPSs. Our results show that plug-and-play engineering of PKSs, a long-awaited goal since the discovery of modular PKS, is indeed feasible and has the potential to enable designer bioproduction of complex small molecules.

[0261] METHODS

[0262] 1. Bioinformatics

[0263] The PKS sequences were curated from NCBI or MiBIG databases. Multiple sequence alignment was created using Geneious Prime 2021.2.2 (https:  / / www. geneious. com) with MAFFT 7.450 (E-INS-i option)

[0264] 2. Gene expression and protein purification

[0265] T5 exonuclease DNA assembly’ (TEDA) method was used to join fragments amplified from different gene clusters with vector. The modules of hybrid Can-Vem-1, Can-Vem-2, Can-Vem-3, DEBS-Vem-1, DEBS-Vem-2, DEBS-Vem-3, DEBS-Vem-4, DEBS-Vem-5, DEBS-Aka-4, E-837-Vem-1, E-837-Vem-2, E-837-Vem-3, Rap-Vem-1, Rap-Vem-2, Rap-Vem-3, MTL-Vem-1, MTL-Vem-2, MTL-Vem-3, MTL-Vem-4, MTL-Vem-5, MTL-Aka-1 / 4, MTL-AntC-1 / 4, MTL-Phe-1 / 4, MTL-Phe-4 and vemG were constructed into pET28a vector, while the vemH, AntD, AKA, AntD-DEBS (TE) and PHE modules were constructed into pET21a vector (-1, 2, 3, 4, 5 represent the cut site at modular different regions: Cut 1 at the post AT linker RYWL (SEQ ID NO: 59) region (LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif) ; Cut 2 at the KS-AT linker GTNAH (SEQ ID NO: 60) conserved region (post GTNAH (SEQ ID NO: 60) motif) ; Cut 3 at the beginning of KS EPIA (SEQ ID NO: 61) conserved region; Cut 4 at the ACP-helix 0 conserved RL region; Cut 5 at the end of ACP conserved HL domain; see Figure 5) . Besides, MatB and T207G / M306I mutated MatB (MMatB) were constructed into pET28a vector.

[0266] Except DEBS-Vem-2 and E-837-Vem-2 expressed in chaperone pTf16 E. coli BAP1, other modules were expressed in E. coli BAP1, MatB and MMatB were expressed in E. coli BL21 (DE3) . The transformed cells harboring plasmids were individually shaken at 200 rpm in 200 ml LB media containing either 50 μg  / mL kanamycin (pET28a) or 100 μg  / mL ampicillin (pET21a) to OD600 = 0.4 -0.6 at 37 ℃. (For the chaperone pTf16 containing E. coli BAP1, chloramphenicol (20 μg ml-1) and arabinose (1 mg ml-1) should be added for shaking) . The culture was cooled to 4 ℃, induced with 0.1 mM IPTG, and continued to cultivate at 16 ℃ for 20 h. After harvesting the cells by centrifugation at 8000 rpm for 10 min at 4 ℃, the pellet were resuspended in 12.5 mL lysis buffer (50 mM PBS, 400 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10% (v / v) glycerol, pH 7.5) , lysed on ice by sonication, After the cell debris was removed (15000 rpm for 30 min at 4 ℃) , the supernatant was applied to a Ni-NTA column (2 x 2 cm) and washed with a gradient: (1) 10 column volumes of lysis buffer containing 50 mM imidazole, (2) 5 column volumes of lysis buffer containing 100 mM imidazole, (3) 4 column volumes of elution buffer containing 500 mM imidazole. The eluted proteins were pooled and desalted by a PD10 column (GE Healthcare) and stocked in storage buffer (50 mM PBS, 150 mM NaCl, 1mM TCEP, 10%glycerol, pH 7.5) at -80℃ after concentration, each purification was assessed by SDS-PAGE. Protein concentrations were calculated at the 280 nm absorbance, which was recorded on a Nanodrop one spectrometer (Thermo Scientific) . Extinction coefficients were calculated from the modules sequence.

[0267] 3. In vitro reaction

[0268] PKS in vitro time-course assay 1: 50 μL reaction mixture containing 10 mM ATP, 5 mM TCEP, 10 mM MgCl2, 1 mM CoA, 1.6 mM extender unit (malonate, methylmalonate, n-butylmalonate or allylmalonate, based on AT substrate specificity) , 1 mM start unit (propionyl-CoA, 4-aminobenzoic acid, 3, 5-dihydroxybenzoic acid, octanoic acid, trans-4-hydroxycyclo-hexanecarboxylic acid, based on loading modules substrate specificity) , 1mM NADPH (only used for reduction reaction) , 1mM amino acid (only used for NRPS reaction) , 1 μM MatB, 1 μM MMatB (only used for unnatural extender unit reaction) , 400 mM PBS (pH 7.5) , 1 μM hybrid enyzmes (VemG, Can-Vem-1, Can-Vem-2, Can-Vem-3, DEBS-Vem-1, DEBS-Vem-2, DEBS-Vem-3, DEBS-Vem-4, DEBS-Vem-5, DEBS-Aka-4, E-837-Vem-1, E-837-Vem-2, E-837-Vem-3, Rap-Vem-1, Rap-Vem-2, Rap-Vem-3, MTL-Vem-1, MTL-Vem-2, MTL-Vem-3, MTL-Vem-4, MTL-Vem-5) with 0.2 μM downstream enzyme (VemH, AKA) or 5 μM hybrid enyzmes (MTL-Aka-1 / 4, MTL-AntC-1 / 4, MTL-Phe-1 / 4, MTL-Phe-4) with 5 μM downstream enzyme (AntD, AntD-DEBS (TE) , AKA or PHE) were incubated at 30 ℃ for 8 hours. The reaction was quenched by the rapid addition of 50 uL methanol and then centrifuged at 15000rpm for 15min.

[0269] PKS scaled-up synthesis method 2: (2.1) 5 mL reaction solution comprised of 400mM potassium phosphate, 5 mM TCEP, 10 mM MgCl2, 10 mM ATP, 10 uM vemG, 10 uM vemH, 1mM 3, 5-dihydroxybenzoic acid, 1.6 mM malonate, and 1mM CoA, at pH 7.5 was incubated at 30 ℃ for 8 hours. The reaction was quenched by the rapid addition of 5 mL methanol and then centrifuged at 15000rpm for 15min. The supernatant was applied to SHIMADZU LC-20ADXR for isolation. (2.2) 10 mL reaction solution comprised of 400mM potassium phosphate, 5 mM TCEP, 10 mM MgCl2, 10 mM ATP, 3 uM Can-Vem-3, 3 uM vemH, 1mM 4-aminobenzoic acid, 1.6 mM malonate, and 1mM CoA, at pH 7.5 was incubated at 30 ℃ for 8 hours. The reaction was quenched by the rapid addition of 10 mL methanol and then centrifuged at 15000rpm for 15min.

[0270] 4. Table 2: Protein ID of PKSs modules

[0271] 5. Table 3: Sequences used in Example 2

[0272] 6. Hybrid modules reconstitution in Example 2 are shown in Figure 12A-12C and sequence alignments of modules and the cut sites used in Example 1 and 2 are shown in Figures 11A-11G.

[0273] In view of the many possible embodiments to which the principles of the disclosed invention may be applied, it should be recognized that the illustrated embodiments are only examples of the invention and should not be taken as limiting the scope of the invention. Rather, the scope of the invention is defined by the following claims. We therefore claim as our invention all that comes within the scope and spirit of theses claims.

Claims

1.A chimeric polyketide synthase (PKS) or polyketide synthase-non-ribosomal peptide synthetase (PKS-NRPS) comprising two or more recombination units (RU) which are joined to each other, wherein each RU comprises one or two or more contiguous domains derived from a parental PKS or PKS-NRPS and the junction end of at least one RU is defined by a recombination site selected from a site at the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif at post AT-linker (the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site) and a site at the RL motif at ACP helix 0 (the RL motif site) ; wherein the two or more RUs are not naturally joined with each other; wherein the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif corresponding to amino acid positions 890 to 902 of SEQ ID NO: 1 and the RL motif refers to a motif sequence corresponding to amino acid positions 1397 to 1398 of SEQ ID NO: 1.2.The chimeric PKS or PKS-NRPS of claim 1, wherein the junction ends of two or more RUs are defined by the site at the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif and / or the site at the RL motif.3.The chimeric PKS or PKS-NRPS of claim 1 or 2, wherein all junction ends of all RUs are defined by the site at the LPTY (A / P) FQ (H / R) xRYWL (SEQ ID NO: 58) motif and / or the site at the RL motif.4.The chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-3, wherein each RU is derived from a parental PKS or PKS-NRPS different from that of any other RU.5.The chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-4, wherein the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises two or three RUs.6.The chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-5, wherein the ACP-KS have a native interaction in each RU.7.The chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-6, wherein the parental PKS or PKS-NRPS is selected from filipin PKS, spiramycin PKS, meridamycin PKS, chalcomycin PKS, lavendiol PKS, coelimycin PKS, candicidin PKS, E-837 PKS, DEBS PKS, rapamycin PKS-NRPS, microtermolide PKS-NRPS, venemycin PKS, akaeolide PKS-NRPS, antimycin PKS, MlsB PKS, lipomycin PKS and phenalamide PKS-NRPS.8.The chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-7, wherein the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS is derived from filipin PKS LM-M1, spiramycin PKS LM-M1, meridamycin PKS LM-M1, chalcomycin PKS LM-M1, candicidin PKS LM-M1, E-837 PKS LM-M1, erythromycin (DEBS) PKS LM-M1, rapamycin PKS-NRPS LM-M1 or microtermolide PKS-NRPS LM-M1.9.The chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-8, wherein the first RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises:(1) KSQ-AT-ACP-KS-AT-KR-C-junction end derived from filipin PKS LM-M1, spiramycin PKS LM-M1, meridamycin PKS LM-M1 or chalcomycin PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RL motif site;(2) KSQ-AT-ACP-KS-AT-C-junction end derived from filipin PKS LM-M1, spiramycin PKS LM-M1, meridamycin PKS LM-M1 or chalcomycin PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site;(3) A-ACP-KS-AT-C-junction end derived from candicidin PKS, microtermolide PKS-NRPS or rapamycin PKS-NRPS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site;(4) AT-ACP-KS-AT-C-junction end derived from DEBS PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site;(5) KSQ-AT-ACP-KS-AT-C-junction end derived from E-837 PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site;(6) AT-ACP-KS-AT-KR-C-junction end derived from DEBS PKS LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RL motif site; or(7) A-ACP-KS-AT-DH-ER-KR-C-junction end derived from microtermolide PKS-NRP LM-M1, wherein the C-junction end is defined by the RL motif site.10.The chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-9, wherein the last RU comprise TR as the offloading domain.11.The chimeric PKS or PKS-NRPS of claim 10, wherein the last RU comprise native ACP-TR didomain.12.The chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-11, wherein the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS is derived from LavC of lavendiol PKS, CpkC of coelimycin PKS, M8 and the full last module PHE of phenalamide PKS-NRPS, VemG and VemH of venemycin PKS, M6 and the last module AKA of akaeolide PKS, Ant C and AntD of antimycin PKS, or the last module of DEBS PKS.13.The chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-12, wherein the last RU of the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises:(1) N-junction end-ACP-TR derived from LavC of lavendiol PKS or CpkC of coelimycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site;(2) N-junction end-KR-ACP-TR derived from LavC of lavendiol PKS, wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site;(3) N-junction end-ACP derived from M8 of phenalamide PKS-NRPS and the full last module PHE of phenalamide PKS-NRPS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site;(4) N-junction end-TR derived from CpkC of coelimycin PKS or LavC of lavendiol PKS, wherein the N-junction end is defined by a site at the C-terminal of ACP;(5) N-junction end-ACP derived from VemG of venemycin PKS and the full VemH of venemycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site or the RL motif site; (6) N-junction end-ACP derived from phenalamide PKS-NRPS M8 and the full last module PHE of phenalamide PKS-NRPS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site;(7) N-junction end-ACP derived from akaeolide PKS M6 and the full last module AKA of akaeolide PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site; or(8) N-junction end-ACP derived from AntC of antimycin PKS and the full AntD of antimycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site.14.The chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-13, wherein the chimeric PKS or PKS-NRPS comprises at least one middle RU located between the first RU and the last RU, wherein the at least one middle RU is derived from LavC of lavendiol PKS, CpkC of coelimycin PKS, MlsB PKS M1, lipomycin PKS M1, filipin PKS M8 or antimycin PKS AntC and AntD.15.The chimeric PKS or PKS-NRPS of claim 14, wherein the middle RU is selected from the group consisting of the RU comprising:(1) N-junction end-ACP-C-junction end derived from LavC of lavendiol PKS or CpkC of coelimycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site and the C-junction end is defined by a site at the C-terminal of ACP;(2) N-junction end-KR-C-junction end derived from MlsB PKS M1, lipomycin PKS M1 or filipin PKS M8, wherein the N-junction end is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end is defined by the RL motif site; or(3) N-junction end-ACP-KS-AT-ACP-C-junction end derived from AntC and AntD of antimycin PKS, wherein the N-junction end is defined by the RL motif site and the C-junction end is defined by a site at the C-terminal of ACP.16.The chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-15, wherein the chimeric PKS or PKS-NRPS is seleced from:(1) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(2) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of the LM-M1 of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises KR-ACP-R of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site;(3) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC, the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(4) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of spiramycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(5) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of spiramycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(6) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, (ii) the second RU comprises ACP of LavC, the N-junction end of the second RU is defined by the RL motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the LAxxL motif site, and (ii) the last RU comprises TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the LAxxL motif site;(7) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises KR of MlsB PKS M1, the N-junction end of the second RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the RL motif site, and (iii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(8) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises KR of lipomycin PKS M1, the N-junction end of the second RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the RL motif site, and (iii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(9) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises KR of filipin PKS M8, the N-junction end of the second RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the RL motif site, and (iii) the last RU comprises ACP-TR of LavC, the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(10) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of chalcomycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(11) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of chalcomycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(12) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of meridamycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(13) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of meridamycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(14) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of candicidin PKS LM-M1and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site;(15) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site;(16) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises AT-ACP-KS-AT of erythromycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site;(17) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of E-837 PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site;(18) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of rapamycin PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site;(19) the chimeric PKS-NRPS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of phenalamide PKS-NRPS M8 and its native downstream enzyme PHE including C-A-PCP-TR, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(20) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises the last ACP of AntC and KS-AT-ACP of its native downstream enzyme AntD, the N-junction end of the second RU is defined by the RL motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the LAxxL motif site site; and (iii) the last RU is TE of erythromycin PKS and the N-junction end of the last RU is defined by the LAxxL motif site site;(21) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NPRS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of akaeolide PKS M6 and its native downstream enzyme AKA including KS-AT-ACP-TE and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(22) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of erythromycin PKS LM-M1and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of akaeolide PKS M6 and its native downstream enzyme AKA including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(23) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of erythromycin PKS LM-M1, the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site;(24) the chimeric PKS-NRPS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT-DH-ER-KR of microtermolide PKS-NRPS LM-M1, the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of phenalamide PKS-NRPS M8 and its native downstream enzyme PHE including C-A-PCP-TR, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; and(25) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT-DH-ER-KR of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site.17.The chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-16, wherein the chimeric PKS or PKS-NRPS comprising:(1) one peptide having a sequence as set forth in SEQ ID NO: 3, 5, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 20, 22, or 25;(2) two subunits, wherein one has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 30, 33, 36, 39, 42, 45 or 54, and the other has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 29;(3) two subunits, wherein one has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 49 or 50, and the other has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 53;(4) two subunits, wherein one has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 48, and the other has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 57; or(5) two subunits, wherein one has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 47 or 56, and the other has the sequence as set forth in SEQ ID NO: 52.18.A polynucleotide encoding the chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-17.19.A expression vector comprising the polynucleotide of claim 18.20.A host cell containing the polynucleotide of claim 18 or the expression vector of claim 19, wherein the host cell is able to express the chimeric PKS or PKS-NRPS encoding by the polynucleotide.21.The host cell of claim 20, wherein the host cell is E. coli or Streptomyces.22.A method for producing a compound, comprising contacting the chimeric PKS or PKS-NRPS with the start substrate and the extender substrate under appropriate conditions of any one of claims 1-17.23.The method of claim 22, wherein the method is performed in vivo or in vitro.24.The method of claim 23, wherein the method comprising culturing the host cell of claim 18 or 19.25.The method of any one of claims 22-24, wherein the compound is polyketides, hybrid polyketides / non-ribosomal peptides, aldehydes or alcohols.26.The method of any one of claims 22-25, wherein the chimeric PKS or PKS-NRPS and the compound are as following:(1) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is ( (R) -1, 3-butanediol) ;(2) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of the LM-M1 of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises KR-ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the compound is ( (R) -1, 3-butanediol) and / or ( (S) -1, 3-butanediol) ;(3) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC, the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is ( (R) -1, 3-butanediol) ;(4) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of spiramycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is ( (R) -1, 3-butanediol) ;(5) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of spiramycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is ( (R) -1, 3-butanediol) ;(6) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, (ii) the second RU comprises ACP of LavC, the N-junction end of the second RU is defined by the RL motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the LAxxL motif site, and (ii) the last RU comprises TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the LAxxL motif site; the compound is ( (R) -1, 3-butanediol) ;(7) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises KR of MlsB PKS M1, the N-junction end of the second RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the RL motif site, and (iii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is ( (S) -1, 3-butanediol) ;(8) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises KR of lipomycin PKS M1, the N-junction end of the second RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the RL motif site, and (iii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is ( (S) -1, 3-butanediol) ;(9) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of filipin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises KR of filipin PKS M8, the N-junction end of the second RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the RL motif site, and (iii) the last RU comprises ACP-TR of LavC, the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is ( (S) -1, 3-butanediol) ;(10) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of chalcomycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is ( (2S, 3R) -2-methyl-1, 3-butanediol) ;(11) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of chalcomycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is ( (2S, 3R) -2-methyl-1, 3-butanediol) ;(12) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of meridamycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of CpkC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is ( (2S, 3S) -2-methyl-1, 3-butanediol) ;(13) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT-KR of meridamycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises ACP-TR of LavC and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is ( (2S, 3S) -2-methyl-1, 3-butanediol) or ( (2R, 3S) -2-methyl-1, 3-butanediol) ;(14) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of candicidin PKS LM-M1and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the compound is(15) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the compound is(16) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises AT-ACP-KS-AT of erythromycin PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the compound is(17) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises KSQ -AT-ACP-KS-AT of E-837 PKS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the compound is(18) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of rapamycin PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site; the compound is(19) the chimeric PKS-NRPS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of phenalamide PKS-NRPS M8 and its native downstream enzyme PHE including C-A-PCP-TR, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is(20) the chimeric PKS comprising three RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, (ii) the second RU comprises the last ACP of AntC and KS-AT-ACP of its native downstream enzyme AntD, the N-junction end of the second RU is defined by the RL motif site and the C-junction end of the second RU is defined by the LAxxL motif site site; and (iii) the last RU is TE of erythromycin PKS and the N-junction end of the last RU is defined by the LAxxL motif site site; the compounds arewherein R1 is methyl, R2 is butyl, R3 is allyl, respectively, providing that the extender substrates are methylmalonyl-CoA, methylmalonyl-CoA and butylmalonyl-CoA, or methylmalonyl-CoA and allylmalonyl-CoA extenders, respectively, and;(21) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of microtermolide PKS-NPRS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RYWL (SEQ ID NO: 59) motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of akaeolide PKS M6 and its native downstream enzyme AKA including KS-AT-ACP-TEand the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is(22) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of erythromycin PKS LM-M1and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of akaeolide PKS M6 and its native downstream enzyme AKA including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is(23) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT of erythromycin PKS LM-M1, the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is(24) the chimeric PKS-NRPS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT-DH-ER-KR of microtermolide PKS-NRPS LM-M1, the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of phenalamide PKS-NRPS M8 and its native downstream enzyme PHE including C-A-PCP-TR, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound isand(25) the chimeric PKS comprising two RUs, which comprising: (i) the first RU comprises A-ACP-KS-AT-DH-ER-KR of microtermolide PKS-NRPS LM-M1 and the C-junction end of the first RU is defined by the RL motif site, and (ii) the last RU comprises the last ACP of VemG and its native downstream enzyme VemH including KS-AT-ACP-TE, and the N-junction end of the last RU is defined by the RL motif site; the compound is27.Use of the chimeric PKS or PKS-NRPS of any one of claims 1-17 in the production of a compound.28.The use of claim 27, wherein the compound is polyketides, hybrid polyketides / non-ribosomal peptides, aldehydes or alcohols.

Images