Dihydroxybenzene derivatives as covalent warhead targeting cysteine

Abstract

Disclosed herein a class of novel dihydroxybenzene derivative compounds of Formula (I), or pharmaceutical acceptable salts, or stereoisomer thereof useful as covalent probe reagents, synthesis thereof, and use thereof as covalent warheads for targeting Cys in protein labeling. This novel covalent warhead can capture a wide range of proteins with reactive Cys sites and serves as a practical tool for drug target research and development of covalent ligands with desirable reactivity.

Description

DIHYDROXYBENZENE DERIVATIVES AS COVALENT WARHEAD TARGETING CYSTEINE

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims the benefit of PCT Application PCT / CN2024 / 072103, filed January 12, 2024. The entire content of the foregoing application is incorporated herein by reference.FIELD

[0003] The present invention relates to the field of drug discovery, biological research and chemical pharmaceutical technology, specifically to novel dihydroxybenzene derivative compounds or pharmaceutical acceptable salts, or stereoisomer thereof useful as covalent probe reagents, synthesis thereof, and use thereof as covalent warheads for targeting Cys in protein labeling.BACKGROUND

[0004] With the completion of genomic decoding for many species, the next daunting challenge is how to rapidly and accurately decipher the molecular functions of the proteins and the interactions between small molecules (typically drugs) and proteins. This is also an important scientific issue currently studied in the field of proteomics. Further research on the mechanism of interaction between drugs and their targets shows that most drugs can interact with multiple protein targets, rather than a single target. This multi-target interaction mode makes it more difficult to identify the true targets of ligands like natural products. Therefore, there is an urgent need for a target identification method that can comprehensively reveal multiple targets of natural products. Hence, a method called Activity-based Protein Profiling (ABPP) that can detect the functional activity of target proteins in highly biologically complex samples, rather than just their expression levels, has emerged.

[0005] ABPP mainly includes two key steps: (1) Probe design and synthesis; (2) Target capture and protein identification. It uses the reactive groups in chemical molecular probes to covalently label the active sites of a certain class of proteins in the proteome, then enriches the labeled proteins through the enriching groups (or a handle) , and then identifies protein and amino acid site information through biomolecular mass spectrometry analysis, thereby directly obtaining the functional status information of proteins in a complex proteome system.

[0006] Chemical proteomics, as a powerful tool for exploring the target space and site space of active molecules, is widely used in scientific research and identification of drug targets. Traditionally, covalent probes that bind to cysteine can only react with cysteines when they are highly reactive. To react with cysteines in a low reactivity state, it usually requires very high concentrations of covalent probes. Currently, there are very few studies reported on small molecule warheads and covalent inhibitors for low-reactivity Cys sites. Either the reaction selectivity is poor, or they are very unstable. Therefore, developing a stable covalent warhead that can react with Cys of various activities and has strong specificity is crucial, as its unique target space is of high value for drug screening.SUMMARY

[0007] Disclosed herein are a class of dihydroxybenzene derivative compounds that can selectively modify various activity levels of cysteine. The present disclosure also provides synthesis and application of the dihydroxybenzene derivative compounds in selectively modifying protein amino acid residues. The dihydroxybenzene derivative compounds of the present disclosure are a valuable tool for selectively modifying protein Cys and serves as a practical tool for drug target research and expanding the labelling space of cysteine, which has significant value in drug discovery and disease target identification.

[0008] Accordingly, the followings are provided herein.

[0009] In one aspect, the disclosure provides a compound of Formula (I) :

[0010] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof, wherein

[0011] R1 has a structure of - (CH2) n-X- (CH2) m-Y, where

[0012] - (CH2) n-is optionally substituted with one or more substituent (s) selected from the group consisting of halo, and -OH;

[0013] X is selected from the group consisting of -CH2-, -NH-, -O-, -S-, -NHC (O) -, -N (RN) CO-, -C (O) NH-and -CON (RN) -, where RN is selected from the group consisting of C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl;

[0014] Y is selected from the group consisting of

[0015] (1) azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl,

[0016] (2) biotin, desthiobiotin, and a fluorescent group, and

[0017] (3) a group generated through click reaction of biotin, desthiobiotin, or a fluorescent group with azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, or -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl;

[0018] n is an integral of 0 to 5, or 1, 2, 3, 4, or 5; and

[0019] m is an integral of 1 to 5, or 1, 2, 3, 4, or 5;

[0020] R2 is selected from the group consisting of hydrogen, halo, -NO2, -PO (OH) 2, and a structure of -L-R2’ , where

[0021] L is a bivalent group selected from the group consisting of -CH2-, -NH-, -O-, -C (O) NH-, -NHC (O) -, -SO-and -SO2-, and

[0022] R2’ is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl.

[0023] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (I’ ) :

[0024] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0025] R1 and R2 are defined as described herein.

[0026] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ia) :

[0027] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0028] R1 and R2 are defined as described herein.

[0029] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ib) :

[0030] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0031] R1 and R2 are defined as described herein.

[0032] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ic) :

[0033] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0034] R1 and R2 are defined as described herein.

[0035] In another aspect, the disclosure provides a compound of Formula (I’ ) :

[0036] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof, wherein

[0037] R1 has a structure of - (CH2) n-X- (CH2) m-Y, where

[0038] X is selected from the group consisting of -CH2-, -NH-, -O-, -S-, -NHC (O) -, and -C (O) NH-;

[0039] Y is selected from the group consisting of

[0040] (1) azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl,

[0041] (2) biotin, desthiobiotin, and a fluorescent group, and

[0042] (3) a group generated through click reaction of biotin, desthiobiotin, or a fluorescent group with azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, or -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl;

[0043] n is an integral of 0 to 5; and

[0044] m is an integral of 1 to 5;

[0045] R2 is selected from the group consisting of hydrogen, halo, -NO2, -PO (OH) 2, and a structure of -L-R2’ , where

[0046] L is a bivalent group selected from the group consisting of -CH2, -NH-, -O-, -C (O) NH-, -NHC (O) -, -SO-and -SO2-, and

[0047] R2’ is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl. In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ia) :

[0048] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0049] R1 and R2 are defined as described herein.

[0050] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ib) :

[0051] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0052] R1 and R2 are defined as described herein.

[0053] In a further aspect, the compound of Formula (I) is selected from Table 1:

[0054] Table 1

[0055] In a further aspect, the present disclosure provides use of a compound of Formula (I) or a compound of Formula (I’ ) , or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof as provided herein in labelling protein.

[0056] In a further aspect, the present disclosure provides use of a compound of Formula (I) or a compound of Formula (I’ ) , or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof as provided herein in preparation of an agent for labeling protein.

[0057] In a further aspect, the present disclosure provides a composition comprising a compound of Formula (I) or a compound of Formula (I’ ) , or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof as provided herein, and copper ion.

[0058] In a further aspect, the present disclosure provides use of the composition as provided herein in labelling protein.

[0059] In a further aspect, the present disclosure provides use of the composition as provided herein in preparation of an agent for labeling protein.

[0060] In a further aspect, the present disclosure provides a method for labeling protein, comprising a step of contacting a compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof or a composition as provided herein with the protein.

[0061] In some embodiments, the method further comprises a step of enriching, isolating, purifying and / or identifying the labeled protein.

[0062] In some embodiments, the method further comprises a step of detecting a detectable signal emitted by the labeled protein, especially, the detectable signal is a fluorescent signal.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0063] FIG. 1A-1B: Investigation of protein labelings based on alkyne probe and fluorescent probe. The Cu2+ in click reagents is the indispensable component that activates DBA-1 and TBA labeling BSA (FL: fluorescence labeling, CBB: Coomassie brilliant blue) . a: TBA (1h) +click cocktail (1h) ; b: TBA (1h) + click cocktail (0.5h) + competitor (0.5h) ; C: TBA + X (1h) +competitor / click cocktail (1h) ; X = Competitor, TCEP, CuSO4 or TBTA.

[0064] FIG. 2A-2B: Exploration of the catalytic effect of different metal ions on probe-labeled proteins based on in-gel fluorescence analysis. FIG. 2A and 2B demonstrate the necessity of copper ions as a catalyst for protein labeling by DBA-Cy3 among magnesium chloride, calcium chloride, chromium chloride, manganese chloride, ferrous chloride, iron chloride, cobalt acetate, nickel iodide, cuprous iodide, zinc chloride, hydrogen peroxide, copper sulfate, and cuprous iodide combined with TCEP, but for TBA-Cy3 is unnecessary.

[0065] FIG. 3: Exploration of the structure-activity relationships among DBA-1 and its analog probes. The left is chemical structures of DBA-1 and its analog probes. The right shows gel-based fluorescence imaging to assess the labeling efficiency of these probes (15μM) and CuSO4 (1mM) on proteins at lysate (HeLa) levels.

[0066] FIG. 4: Screening of compounds for competitive ABPP experiments. The left side of the image depicts chemical structures of competitors NP-1, NP-2, NP-3, NP-4, FA-1, FA-2, FA-3, FA-4, FA-5 and FA-6, and the right displays screening of compounds for competitive ABPP experiments, which the concentration of DBA-1 and competitors are 10μM and 100μM, respectively. a: The competitor treatment was performed in situ.

[0067] FIG. 5A-5E: Global analysis of proteome-wide reactivity of DBA-1. FIG. 5A is an unbiased analysis of the mass shifts of peptides introduced by DBA-1 plus the light or heavy isoDTB tag, respectively. FIG. 5B shows the specific structures causing the mass shifts. PSMs, peptide spectrum matches. FIG. 5C oversaw amino acids modified by DBA-1. FIG. 5D shows the chemical structure of alkyne probe DBA-1, and the number of reactive moieties, labeled Cys (count: 5717) and proteins (count: 2415) of them. The moieties reacting with Cys was highlighted by gray circles. FIG. 5E compared Cys sites labeled by DBA-1 with IAA-labeled Cys sites using competitive ABPP, picturing half of the cysteine sites are sensitive to DBA-1.

[0068] FIG. 6A-6C: Chemical proteomics-based competitive ABPP for DBA-DTB. FIG. 6A reviewed the chemical structure of DBA-DTB, the number of reactive moieties, labeled Cys (count: 6202) and proteins (count: 2973) of them. The moieties reacting with Cys was highlighted by gray circles. FIG. 6B shows the chemical structures of NP-1, NP-2, NP-3, NP-4, FA-1, and FA-3, and the number of reactive moieties, targeted Cys and proteins of them. The moieties reacting with Cys was highlighted by gray circles. FIG. 6C is a venn graph showing the overlap of targeted Cys sites across ten compounds.DETAILED DESCRIPTION

[0069] Reference will now be made in detail to certain embodiments, examples of which are illustrated in the accompanying detailed description. While enumerated embodiments will be described, it shall be understood that they are not intended to limit the present disclosure to those embodiments. On the contrary, the present disclosure is intended to cover all alternatives, modifications, and equivalents, which may be included within the scope of the present disclosure as defined by the claims. Those skilled in the art will recognize many methods and materials similar or equivalent to those described herein, which could be used in the practice of the present disclosure. The present disclosure is in no way limited to the methods and materials as described. In the event that one or more of the incorporated literatures and similar materials differs from or contradicts this disclosure, including but not limited to defined terms, term usage, described techniques, or the like, this disclosure controls.

[0070] It is appreciated that certain features of the present disclosure, which are, for clarity, described in the context of separate embodiments, can also be provided in combination in a single embodiment. Conversely, various features of the present disclosure, which are, for brevity, described in the context of a single embodiment, can also be provided separately or in any suitable sub-combination.

[0071] PHENOLIC DERIVATIVES

[0072] (I) In one aspect, the disclosure provides a compound of Formula (I) :

[0073] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof, wherein

[0074] R1 has a structure of - (CH2) n-X- (CH2) m-Y, where

[0075] - (CH2) n-is optionally substituted with one or more substituent (s) selected from the group consisting of halo, and -OH;

[0076] X is selected from the group consisting of -CH2-, -NH-, -O-, -S-, -NHC (O) -, -N (RN) CO-, -C (O) NH-and -CON (RN) -, where RN is selected from the group consisting of C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl;

[0077] Y is selected from the group consisting of

[0078] (1) azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl,

[0079] (2) biotin, desthiobiotin, and a fluorescent group, and

[0080] (3) a group generated through click reaction of biotin, desthiobiotin, or a fluorescent group with azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, or -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl;

[0081] n is an integral of 0 to 5, or 1, 2, 3, 4, or 5; and

[0082] m is an integral of 1 to 5, or 1, 2, 3, 4, or 5;

[0083] R2 is selected from the group consisting of hydrogen, halo, -NO2, -PO (OH) 2, and a structure of -L-R2’ , where

[0084] L is a bivalent group selected from the group consisting of -CH2-, -NH-, -O-, -C (O) NH-, -NHC (O) -, -SO-and -SO2-, and

[0085] R2’ is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl.

[0086] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (I’ ) :

[0087] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0088] R1 and R2 are defined as described herein.

[0089] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ia) :

[0090] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0091] R1 and R2 are defined as described herein.

[0092] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ib) :

[0093] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0094] R1 and R2 are defined as described herein.

[0095] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ic) :

[0096] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0097] R1 and R2 are defined as described herein.

[0098] (II) The disclosure provides a compound of Formula (I’ ) :

[0099] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof, wherein

[0100] R1 has a structure of - (CH2) n-X- (CH2) m-Y, where

[0101] X is selected from the group consisting of -CH2-, -NH-, -O-, -S-, -NHC (O) -, and -C (O) NH-;

[0102] Y is selected from the group consisting of

[0103] (1) azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl,

[0104] (2) biotin, desthiobiotin, and a fluorescent group, and

[0105] (3) a group generated through click reaction of biotin, desthiobiotin, or a fluorescent group with azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, or -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl;

[0106] n is an integral of 0 to 5; and

[0107] m is an integral of 1 to 5;

[0108] R2 is selected from the group consisting of hydrogen, halo, -NO2, -PO (OH) 2, and a structure of -L-R2’ , where

[0109] L is a bivalent group selected from the group consisting of -CH2, -NH-, -O-, -C (O) NH-, -NHC (O) -, -SO-and -SO2-, and

[0110] R2’ is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl.

[0111] In the compounds of Formula (I’ ) of the present disclosure, the position of the group R1 is not particularly limited and may be located adjacent or interstitial to one of the two phenol hydroxyl groups, and the position of the group R2 is not particularly limited and may be located in any one of the three remaining unoccupied site.

[0112] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ia) :

[0113] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0114] R1 and R2 are defined as described herein.

[0115] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ib) :

[0116] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0117] R1 and R2 are defined as described herein.

[0118] The description below can be applied to both or either of the compounds of the Item (I) and Item (II) .

[0119] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ia1) :

[0120] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0121] R1 and R2 are defined as described herein for Item (I) and / or (II) .

[0122] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ia2) :

[0123] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0124] R1 and R2 are defined as described herein for Item (I) and / or (II) .

[0125] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ia3) :

[0126] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0127] R1 and R2 are defined as described herein for Item (I) and / or (II) .

[0128] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ib1) :

[0129] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0130] R1 and R2 are defined as described herein for Item (I) and / or (II) .

[0131] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ib2) :

[0132] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0133] R1 and R2 are defined as described herein for Item (I) and / or (II) .

[0134] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ib3) :

[0135] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0136] R1 and R2 are defined as described herein for Item (I) and / or (II) .

[0137] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ic1) :

[0138] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0139] R1 and R2 are defined as described herein for Item (I) .

[0140] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ic2) :

[0141] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0142] R1 and R2 are defined as described herein for Item (I) .

[0143] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ic3) :

[0144] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0145] R1 and R2 are defined as described herein for Item (I) .

[0146] In some embodiments, - (CH2) n-is optionally substituted with one or more substituent (s) selected from the group consisting of halo, and -OH, where n is an integral of 0 to 5, for example, n is 0, 1, 2, 3, 4, or 5, preferably, n is 0, 1, or 2. Preferably, for example, the group is -CH2-, - (CH2) 2-, - (CH2) 3-, or -CH (OH) -CH2-.

[0147] In some embodiments, X is selected from the group consisting of -CH2-, -NH-, -O-, -S-, -NHC (O) -, -N (RN) C (O) -, -C (O) NH-and -C (O) N (RN) -, where RN is selected from the group consisting of C1-5 alkyl, for example C1-4 alkyl, and C1-3 alkyl, specifically methyl, ethyl, propyl, butyl, or pentyl, and C1-5 haloalkyl, for example C1-4 haloalkyl, and C1-3 haloalkyl. Preferably, X is selected from the group consisting of -NHC (O) -, -N (CH3) C (O) -, -C (O) NH-and -C (O) N (CH3) -.

[0148] In some embodiments, X is selected from the group consisting of -CH2-, -NH-, -O-, -S-, -NHC (O) -, and -C (O) NH-. Preferably, X is selected from -NHC (O) -, or -C (O) NH-.

[0149] In some embodiments, Y is selected from the group consisting of azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, and -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, for example C1-4 alkyl, and C1-3 alkyl, specifically methyl, ethyl, propyl, butyl, or pentyl, C1-5 haloalkyl, for example C1-4 haloalkyl, and C1-3 haloalkyl.

[0150] The strained alkenyl is optionally substituted with one or more substituents selected from the group consisting of halo; C1-5 alkyl, for example C1-4 alkyl, and C1-3 alkyl, specifically methyl, ethyl, propyl, butyl, or pentyl; C1-5 haloalkyl, for example C1-4 haloalkyl, and C1-3 haloalkyl, C1-5 alkoxyl, for example, C1-4 alkoxyl, C1-3 alkoxyl, specifically methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy and pentoxy; and C1-5 haloalkoxyl, for example, C1-4 haloalkoxyl, C1-3 haloalkoxyl.

[0151] The strained alkynyl is optionally substituted with one or more substituents selected from the group consisting of halo; C1-5 alkyl, for example C1-4 alkyl, and C1-3 alkyl, specifically methyl, ethyl, propyl, butyl, or pentyl; C1-5 haloalkyl, for example C1-4 haloalkyl, and C1-3 haloalkyl, C1-5 alkoxyl, for example, C1-4 alkoxyl, C1-3 alkoxyl, specifically methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy and pentoxy; and C1-5 haloalkoxyl, for example, C1-4 haloalkoxyl, C1-3 haloalkoxyl.

[0152] As used herein, the term “strained alkenyl” refers to an alkenyl group whose carbon-carbon double bond is located within a ring that can usually be reacted with a reactive group such as an azide group in click chemistry, wherein the ring may be a carbocyclic or heterocyclic ring and may be a monocyclic ring, or a fused, spiro or bridged bicyclic or tricyclic ring. The name is given because the ring structure results in the presence of strain within the molecule. Non-limiting examples of optionally substituted strained alkenyl include, but are not limited to,

[0153] As used herein, the term “strained alkynyl” refers to an alkynyl group whose carbon-carbon triple bond is located within a ring that can usually be reacted with a reactive group such as an azide group in click chemistry, wherein the ring may be a carbocyclic or heterocyclic ring and may be a monocyclic ring, or a fused, spiro or bridged bicyclic or tricyclic ring. The name is given because the ring structure results in the presence of strain within the molecule. Non-limiting examples of optionally substituted strained alkynyl include, but are not limited to,

[0154] In some embodiments, Y is selected from the group consisting of biotin, desthiobiotin, and a fluorescent group.

[0155] As used herein, the term “fluorescent group” refers to a group that provides fluorescent properties to each compound. Non-limiting examples of fluorescent group include, but are not limited to, rhodamine, tetramethylrhodamine (TAMRA) , 4, 4-difiuoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacenes (BODIPY-dyes) , fluorescein, cyanine dyes (e.g. Cy3, Cy5, Cy7) , sulforhodamines (Texas red) , Alexa Fluor dyes (e.g. AF546, AF555, AF594, AF647) , and coumarin dyes. Preferably, the fluorescent group is Cy3 or TAMRA, more preferably TAMRA.

[0156] Non-limiting examples of Y from group (2) include, but are not limited to,

[0157] In some embodiments, Y is a group generated through click reaction of biotin, desthiobiotin, or a fluorescent group with azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, or -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl. A person skilled in the art can understand that biotin, desthiobiotin, and fluorescent groups carrying an azide group or an alkynyl group can be linked to a chemical moiety carrying the corresponding azide, tetrazine, or -C≡C-Ra by click chemistry. Non-limiting examples of the resulting group include, but are not limited to,

[0158] In some embodiments, n is an integral of 0 to 5, for example, n is 0, 1, 2, 3, 4, or 5. Preferably, n is 0, 1, or 2.

[0159] In some embodiments, m is an integral of 1 to 5, for example, m is 1, 2, 3, 4, or 5. Preferably, m is 2, 3, 4, or 5.

[0160] In some embodiments, R2 is selected from the group consisting of hydrogen, halo, -NO2, -PO (OH) 2, and a group of -L-R2’ , where L is a bivalent group selected from the group consisting of -CH2, -NH-, -O-, -C (O) NH-, -NHC (O) -, -SO-and -SO2-, and R2’ is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl. Non-limiting examples of the group of -L-R2’ include, but are not limited to, -OH, -O-C1-5 alkyl (e.g., methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy or pentoxy) .

[0161] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ib) :

[0162] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0163] R1 has a structure of - (CH2) n-X- (CH2) m-Y, where

[0164] X is selected from the group consisting of -NHC (O) -, and -C (O) NH-;

[0165] Y is selected from the group consisting of

[0166] (1) azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl,

[0167] (2) biotin, desthiobiotin, and a fluorescent group, and

[0168] (3) a group generated through click reaction of biotin, desthiobiotin, or a fluorescent group with azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, or -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl,

[0169] preferably, Y is selected from the group consisting of -C≡CH,

[0170] n is an integral of 0 to 5, preferably 0 to 2, for example, 0, 1, or 2; and

[0171] m is an integral of 1 to 5, preferably 2 to 5, for example, 2, 3, 4, or 5;

[0172] R2 is selected from the group consisting of hydrogen, halo, -NO2, -PO (OH) 2, and a structure of -L-R2’ , where L is a bivalent group selected from the group consisting of -CH2, -NH-, -O-, -C (O) NH-, -NHC (O) -, -SO-and -SO2-, and R2’ is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl, preferably, R2 is selected from the group consisting of -OH, and -O-C1-5 alkyl.

[0173] In a further aspect, the disclosure provides a compound of Formula (I) :

[0174] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof, wherein

[0175] R1 has a structure of - (CH2) n-X- (CH2) m-Y, where

[0176] - (CH2) n-is optionally substituted with a substituent selected from the group consisting of halo, and -OH, preferably -OH;

[0177] X is selected from the group consisting of -NHC (O) -, -N (RN) CO-, -C (O) NH-and -CON(RN) -, where RN is selected from the group consisting of C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl, preferably, X is selected from the group consisting of -NHC (O) -, -N (CH3) C (O) -, -C (O) NH-and -C (O) N (CH3) -;

[0178] Y is selected from the group consisting of

[0179] (1) -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl, for example, -CH3, -CH2CH3, preferably Ra is hydrogen,

[0180] (2) biotin, desthiobiotin, and a fluorescent group, and

[0181] (3) a group generated through click reaction of biotin, desthiobiotin, or fluorescent group with azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl;

[0182] preferably, Y is selected from the group consisting of -C≡CH,

[0183] n is an integral of 0 to 5, preferably 0 to 2, for example, 0, 1, or 2; and

[0184] m is an integral of 1 to 5, preferably 2 to 5, for example, 2, 3, 4, or 5;

[0185] R2 is selected from the group consisting of hydrogen, -OH, and -OC1-5 alkyl, for example, -OCH3, -OCH2CH3, preferably R2 is hydrogen or -OCH3.

[0186] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (I’ ) :

[0187] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0188] R1 and R2 are defined as described herein.

[0189] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ia) :

[0190] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0191] R1 and R2 are defined as described herein.

[0192] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ib) :

[0193] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0194] R1 and R2 are defined as described herein.

[0195] In some embodiments, the disclosure provides a compound of Formula (Ic) :

[0196] or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof,

[0197] R1 and R2 are defined as described herein.

[0198] In some embodiments, the compound of Formula (I) is selected from

[0199] COMPOSITION FOR LABELING PROTEIN

[0200] The present inventors have surprisingly found that the dihydroxybenzene derivative compounds of the present disclosure can selectively modify Cys including those low acitive Cys with the assistance of copper ion activation, and thus broadly capture proteins with Cys active sites.

[0201] Therefore, in one aspect, the present disclosure provides a composition comprising a compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof as provided herein, and copper ion, preferably, the copper ion is Cu (II) ion.

[0202] In some embodiments, the copper ion comes from water-soluble copper salts, such as water-soluble inorganic copper salts, including copper sulfate, copper nitrate, copper chloride, and copper phosphate; and water-soluble organic copper salts, including copper acetate.

[0203] LABELING PROTEIN

[0204] In one aspect, the present disclosure provides use of a compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof as provided herein or a composition as provided herein in labeling protein.

[0205] In another aspect, the present disclosure provides use of a compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof as provided herein or a composition as provided herein in preparation of an agent for labeling protein.

[0206] In a further aspect, the present disclosure provides a method for labeling protein, comprising a step of contacting a compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof as provided herein or a composition as provided herein with the protein.

[0207] In some embodiments, the protein is a protein in lysate or living cell.

[0208] In some embodiments, the lysate is derived from lysing microbial cell, plant cell or animal cell, especially mammal cell, for example human cell.

[0209] In some embodiments, the compound as provided herein selectively modifies Cys including those low active Cys with the assistance of copper ion activation.

[0210] The compound of the present disclosure may comprise a biotin, desthiobiotin, and the like. When Cys residues of a protein are labeled using the compounds of the present disclosure, the labeled protein can be enriched, isolated and purified using biotin, desthiobiotin or the like, and subsequent protein identification.

[0211] Therefore, in some embodiments, the method further comprises a step of enriching, isolating, purifying and / or identifying the labeled protein.

[0212] The compounds of the present disclosure may comprise a fluorescent group. When Cys residues of a protein are labeled using the compounds of the present disclosure, the protein can be detected by the fluorescence emitted by the labeled protein.

[0213] Therefore, in some embodiments, the method further comprises a step of detecting a detectable signal emitted by the labeled protein, especially, the detectable signal is a fluorescent signal.

[0214] In the method of labeling proteins of the present disclosure, when a compound of the present disclosure having an end group as a reactive group such as an azide group, a terminal alkynyl group, or the like is used, a reactant carrying a biotin, a desthiobiotin, or a fluorescent group can be added sequentially or simultaneously to the reaction system.

[0215] Thereby, in the reaction system, (1) the compound of the present disclosure is first labeled to a Cys residue of a protein, and then biotin, desthiobiotin, or a fluorescent group, etc. is attached to the compound of the present disclosure by click chemistry; (2) the compound of the present disclosure is first attached to biotin, desthiobiotin, or a fluorescent group, etc., by click chemistry, and then labeled to a Cys residue of a protein; or (3) the reaction in which the compound of the present disclosure labels a Cys residue of a protein and the reaction in which the compound of the present disclosure is attached to biotin, desulfobiotin, or a fluorescent group, etc., by click chemistry proceed simultaneously.

[0216] When a compound of the present disclosure carries a biotin, desthiobiotin, or fluorescent group is used, it can be used directly to label Cys in proteins and for subsequent enrichment, isolation, purification and / or identification without the need to add other biotin-carrying, desthiobiotin-carrying, fluorescent group-containing reactants. For example, Such kind of compounds of the present disclosure can be obtained by click chemistry of the compounds of the present disclosure carrying a reactive end group such as an azide group, a terminal alkynyl group, with a reactant carrying a biotin moiety, a desthiobiotin moiety, or a fluorescent group.

[0217] DEFINITIONS

[0218] The terms used but not defined herein have their ordinary meaning and the meaning of such terms is independent at each occurrence thereof. Nevertheless, unless otherwise stated, the following definitions apply throughout the specification and claims.

[0219] As used herein, the singular forms “a” , “an” , and “the” include plural referents unless expressly stated to the contrary.

[0220] As used herein, the terms “comprise” and “include” are intended to specify the presence of stated features, integers, components, or steps, but they do not preclude the presence or addition of one or more other features, integers, components, steps, or groups thereof.

[0221] Definitions of specific functional groups and chemical terms are described in more detail below. For purpose of this disclosure, the chemical elements are identified in accordance with the Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Edition, inside cover, and specific functional groups are generally defined as described therein. Additionally, general principles of organic chemistry, as well as specific functional moieties and reactivity, are described in Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March’s Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley &Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; Carruthers, Some Modem Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987.

[0222] All ranges cited herein are inclusive, unless expressly stated to the contrary.

[0223] When a range of values is listed, it is intended to encompass each value and sub-range within the range. For example, “C1-6” is intended to encompass, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5, and C5-6. For example, a heteroaromatic ring described as containing from “1 to 4 heteroatoms” means that the ring can contain 1, 2, 3 or 4 heteroatoms. It is also to be understood that any range cited herein includes within its scope all of the sub-ranges within that range. Thus, for example, a heterocyclic ring described as containing from “1 to 4 heteroatoms” is intended to include as aspects thereof, heterocyclic rings containing 2 to 4 heteroatoms, 3 or 4 heteroatoms, 1 to 3 heteroatoms, 2 or 3 heteroatoms, 1 or 2 heteroatoms, 1 heteroatom, 2 heteroatoms, 3 heteroatoms, or 4 heteroatoms.

[0224] When any variable occurs more than one time in any constituent or in Formula (I) or in any other formula depicting and describing the compounds of the present disclosure, its definition at each occurrence is independent of its definition at every other occurrence. Also, combinations of substituents and / or variables are permissible only if such combinations result in stable compounds.

[0225] As used herein, the term “alkyl” refers to a linear or branched chain saturated hydrocarbon group. The term “Ci-j alkyl” refers to an alkyl having i to j carbon atoms. Alkyl groups may contain 1 to 10 carbon atoms, unless otherwise stated. In certain embodiments, alkyl groups contain 1 to 6 carbon atoms (C1-6) , such as, 1 to 5 carbon atoms (C1-5) , 1 to 4 carbon atoms (C1-4) , 1 to 3 carbon atoms (C1-3) , or 1 to 2 carbon atoms (C1-2) . Non-limiting examples of alkyl groups include methyl, ethyl, n-and iso-propyl, n-, sec-, iso-, and tert-butyl, neopentyl, and the like. Alkyl groups may be optionally substituted (i.e., unsubstituted or substituted) , as valency permits, with one, two, three, or, in the case of alkyl groups of two carbons or more, four or more substituents independently selected from the group consisting of: amino; alkoxy; aryl; aryloxy; azido; cycloalkyl; cycloalkyloxy; cycloalkenyl; cycloalkynyl; halogen; heterocyclyl; (heterocyclyl) oxy; heteroaryl; hydroxy; nitro; thiol; silyl; cyano; alkylmercapto; alkylsulfonyl; alkylsulfinyl; alkylsulfenyl; =O; =S; -C (O) R or -SO2R, in which R is amino; and =NR’ , in which R’ is H, alkyl, aryl, or heterocyclyl. Each of the substituents may itself be unsubstituted or, as valency permits, substituted with unsubstituted substituent (s) defined herein for each respective group. In certain embodiments, alkyl groups may be optionally substituted with one or more substitutes selected from halogen, alkyloxy, and haloalkyloxy.

[0226] As used herein, the term “alkylene” refers to a divalent substituent that is a monovalent alkyl having one hydrogen atom replaced with a valency. Alkylene groups may be unsubstituted or substituted. An optionally substituted alkylene is an alkylene that is optionally substituted as described herein for alkyl.

[0227] As used herein, the term “alkoxy” refers to -O-alkyl and alkyl is as defined herein. Non-limiting examples of alkyl groups include methoxy, ethoxy, n-and iso-propoxy, n-, sec-, iso-, and tert-butoxy, neopentyloxy, and the like.

[0228] As used herein, the term “alkenyl” refers to a linear or branched-chain hydrocarbon radical having at least one (such as one, two, or three) carbon-carbon double bond, which may be optionally substituted (i.e., unsubstituted or substituted) independently with one or more substituents described herein, and includes radicals having “cis” and “trans” orientations, or alternatively, “E” and “Z” orientations. Alkenyl groups may contain 2 to 10 carbon atoms, unless otherwise stated. In certain embodiments, alkenyl groups may contain 2 to 6 carbon atoms, such as 2 to 5 carbon atoms, 2 to 4 carbon atoms, 2 to 3 carbon atoms. In certain embodiments, alkenyl groups contain 2 carbon atoms. Non-limiting examples of alkenyl groups include ethylenyl (vinyl) , propenyl, butenyl, pentenyl, 1-methyl-2-buten-1-yl, 5-hexenyl, etc. An optionally substituted alkenyl is an alkenyl that is optionally substituted as described herein for alkyl.

[0229] As used herein, the term “alkenylene” refers to a divalent substituent that is a monovalent alkenyl having one hydrogen atom replaced with a valency. Alkenylene groups may be unsubstituted or substituted. An optionally substituted alkenylene is an alkenylene that is optionally substituted as described herein for alkyl.

[0230] As used herein, the term “alkynyl” refers to a linear or branched hydrocarbon radical having at least one (such as one, two, or three) carbon-carbon triple bond, which may be optionally substituted (i.e., unsubstituted or substituted) independently with one or more substituents described herein. Alkynyl groups may contain 2 to 10 carbon atoms, unless otherwise stated. In certain embodiments, alkynyl groups may contain 2 to 6 carbon atoms, such as 2 to 5 carbon atoms, 2 to 4 carbon atoms, 2 to 3 carbon atoms. In certain embodiments, alkynyl groups contain 2 carbon atoms. Non-limiting examples of alkynyl groups include ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, etc. An optionally substituted alkynyl is an alkynyl that is optionally substituted as described herein for alkyl.

[0231] As used herein, the term “alkynylene” refers to a divalent substituent that is a monovalent alkynyl having one hydrogen atom replaced with a valency. Alkynylene groups may be unsubstituted or substituted. An optionally substituted alkynylene is an alkynylene that is optionally substituted as described herein for alkyl.

[0232] As used herein, the term “aryl” refers to a mono-, bicyclic, or multicyclic carbocyclic ring system having at least one aromatic rings. Aryl groups may be 6-to 10-membered, unless otherwise stated. In certain embodiments, aryl groups may contain 6 ring forming carbon atoms. All ring forming atoms within a carbocyclic aryl group are carbon atoms. Non-limiting examples of aryl groups include phenyl, naphthyl, 1, 2-dihydronaphthyl, 1, 2, 3, 4-tetrahydronaphthyl, fluorenyl, indanyl, indenyl, etc. In certain embodiments, aryl is phenyl or naphthyl. In certain embodiments, aryl is phenyl. In the context of the present specification, the terms “aryl” and “aromatic ring” may be used interchangeably. Aryl groups may be unsubstituted or substituted. An optionally substituted aryl group may be an aryl optionally substituted with one, two, three, four, or five substituents independently selected from the group consisting of: alkyl; alkenyl; alkynyl; alkoxy; alkylsulfinyl; alkylsulfenyl; alkylsulfonyl; amino; aryl; aryloxy; azido; cycloalkyl; cycloalkoxy; cycloalkenyl; cycloalkynyl; halogen; heteroalkyl; heteroalkenyl; heteroalkynyl; heterocyclyl; (heterocyclyl) oxy; heteroaryl; hydroxy; nitro; thiol; silyl; - (CH2) n-C (O) OR’ ; -C (O) R; and -SO2R, in which R is amino or alkyl, R’ is H or alkyl, and n is 0 or 1. Each of the substituents may itself be unsubstituted or substituted with unsubstituted substituent (s) defined herein for each respective group. In certain embodiments, aryl groups may be optionally substituted with one or more substitutes selected from 4-to 10-membered heterocyclyl, 6-to 10-membered aryl, and 5-to 10-membered heteroaryl.

[0233] As used herein, the term “arylene” refers to a divalent substituent that is an aryl having one hydrogen atom replaced with a valency. Arylene groups may be unsubstituted or substituted. An optionally substituted arylene is an arylene that is optionally substituted as described herein for aryl.

[0234] As used herein, the term “heteroatom” refers to nitrogen, oxygen, or sulfur, and may include any oxidized form of nitrogen or sulfur, and any quaternized form of a basic nitrogen.

[0235] As used herein, the term “oxo” refers to a divalent oxygen atom and the structure of oxo may be shown as =O.

[0236] As used herein, the term “halogen” (or “halo” ) refers to fluoride, chloride, bromide, and iodide. In certain embodiments, non-limiting examples of halogen include fluoride, chloride, and bromide. In certain embodiments, halogen is chloride or bromide. In certain embodiments, halogen is fluoride.

[0237] As used herein, the term “haloalkyl” refers to an alkyl group as described herein in which one or more of hydrogen atoms have been replaced with one or more halogen atoms independently selected from the group consisting of fluoride, chloride, bromide, and iodide. When a haloalkyl contains more than one halogen atom, the halogen atoms can be the same or be different from each other. Non-limiting examples of haloalkyl groups include -CH2F, -CHF2, -CF3, -CF2Cl, -CH2CF3, -CF2CF3, etc. In certain embodiments, haloalkyl groups may be perhaloalkyl groups, such as perfluoroalkyl.

[0238] As used herein, the term “haloalkylene” refers to a divalent substituent that is a haloalkyl having one hydrogen atom replaced with a valency. Non-limiting examples of haloalkylene groups include -CH2CHF-, -CHFCHF-, etc. In certain embodiments, haloalkylene groups may be perhaloalkylene groups, such as perfluoroalkylene.

[0239] As used herein, the term “substituted” , when refers to a chemical group, means that the chemical group has one or more hydrogen atoms that is / are removed and replaced by substituents. The term “substituent” as used herein has the ordinary meaning known in the art and refers to a chemical moiety that is covalently attached to, or if appropriate, fused to, a parent group. It is to be understood that substitution at a given atom is limited by valency. It is understood that the substituent can be further substituted.

[0240] As used herein, the term “optionally substituted” means that the chemical group may have no substituents (i.e., unsubstituted) or may have one or more substituents (i.e., substituted) . It is to be understood that substitution at a given atom is limited by valency.

[0241] The compounds provided herein are described with reference to both generic formulas and specific compounds. In addition, the compounds of the present disclosure may exist in a number of different forms or derivatives, all within the scope of the disclosure. These include, for example, pharmaceutically acceptable salts, tautomers, stereoisomers, racemic mixtures, regioisomers, prodrugs, and active metabolites, etc. In certain embodiments, the compounds of the disclosure may contain bonds with hindered rotation such that two separate rotomers, or atropisomer, may be separated and may have advantageous biological activity. It is intended that all of the possible atropisomes are included with the scope of this disclosure.

[0242] Unless explained otherwise, in the present disclosure, bonds represented by solid wedge lines and dashed wedge lines are used to indicate absolute configuration of a chiral center, bonds represented by solid lines and dashed lines are used to indicate relative configuration of a chiral center and a bond represented by a wavy line is used to indicate (a) a solid wedge line or a dashed wedge line or (b) a solid line  or a dashed line

[0243] As used herein, the term "atropisomer"refers to a stereoisomer resulting from restricted rotation about single bonds where the rotation barrier is high enough to permit isolation of the isomeric species. Typically, rotation about the single bond in the molecule is prevented, or greatly slowed, as a result of steric interactions with other parts of the molecule and the substituents at both ends of the single bond are unsymmetrical.

[0244] As used herein, the term “enriched for …an atropisomer” or “atropisomerically enriched” means that the compound, i.e., mixture of atropisomers, comprises a greater proportion or percentage of the specified atropisomers of the compound, in relative to the other atropisomers, i.e., greater than 50 mole%, such as greater than 50 mole%, 60 mole%, 70 mole%, 80 mole%, 90 mole%, 95 mole%, 98 mole%, 99 mole%, etc. In certain embodiments, atropisomers other than the specified atropisomer are undetectable. In certain embodiments, the compound may comprise nearly 100 mole%or 100 mole%of the specified atropisomer of the compound. In certain embodiments, the compound is substantially atropisomerically pure. As used herein, the term “substantially pure” means that the compound, i.e., mixture of atropisomers, comprises at least 90 mole%, optionally at least 95 mole%, more optionally at least 98 mole%, and even more optionally at least 99 mole%of one atropisomer. The term “substantially free” means that the compound comprises less than 10 mole%, optionally less than 5 mole%, more optionally less than 2 mole%, and even more optionally less than 1 mole%of one atropisomer.

[0245] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable salt” , unless otherwise stated, includes salts that retain the biological effectiveness of the free acid / base form of the specified compound and that are not biologically or otherwise undesirable. Contemplated pharmaceutically acceptable salt forms include, but are not limited to, mono, bis, tris, tetrakis, and so on. Pharmaceutically acceptable salts are non-toxic in the amounts and concentrations at which they are administered. The preparation of such salts can facilitate the pharmacological use by altering the physical characteristics of a compound without preventing it from exerting its physiological effect. Useful alterations in physical properties may include, for example, increasing the solubility to facilitate administering higher concentrations of the drug.

[0246] Pharmaceutically acceptable salts of the compounds of Formula (I) include acid addition and base salts. Suitable acid addition salts can be formed from acids which form non-toxic salts. Non-limiting examples may include the acetate, adipate, aspartate, benzoate, besylate, bicarbonate / carbonate, bisulfate / sulfate, borate, camsylate, citrate, cyclamate, edisylate, esylate, formate, fumarate, gluceptate, gluconate, glucuronate, hexafluorophosphate, hibenzate, hydrochloride / chloride, hydrobromide / bromide, hydroiodide / iodide, isethionate, lactate, malate, maleate, malonate, mesylate, methylsulfate, naphthylate, 2-napsylate, nicotinate, nitrate, orotate, oxalate, palmitate, pamoate, phosphate / hydrogen phosphate / dihydrogen phosphate, pyroglutamate, saccharate, stearate, succinate, tannate, tartrate, tosylate, trifluoroacetate, 1, 5-naphathalenedisulfonic acid and xinafoate salts. Suitable base salts are formed from bases which form non-toxic salts. Non-limiting examples may include the aluminium, arginine, benzathine, calcium, choline, diethylamine, bis (2-hydroxyethyl) amine (diolamine) , glycine, lysine, magnesium, meglumine, 2-aminoethanol (olamine) , potassium, sodium, 2-Amino-2- (hydroxymethyl) propane-1, 3-diol (tris or tromethamine) and zinc salts. Hemisalts of acids and bases may also be formed, for example, hemisulfate and hemicalcium salts. For a review on suitable salts, see, Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Wiley-VCH, 2002) .

[0247] Pharmaceutically acceptable salts of the compound of Formula (I) may be prepared by one or more of three methods: (i) by reacting the compound of Formula (I) with the desired acid or base; (ii) by removing an acid-or base-labile protecting group from a suitable precursor of the compound of Formula (I) or by ring-opening a suitable cyclic precursor, for example, a lactone or lactam, using the desired acid or base; or (iii) by converting one salt of the compound of Formula (I) to another by a reaction with an appropriate acid or base or by means of a suitable ion exchange column. The three reactions may be typically carried out in solution. The resulting salt may precipitate out and be collected by filtration or may be recovered by evaporation of the solvent. The degree of ionization in the resulting salt may vary from completely ionized to almost non-ionized.

[0248] The compounds of Formula (I) may have one or more chiral (asymmetric) centers. The present disclosure encompasses all stereoisomeric forms of the compounds of Formula (I) . Centers of asymmetry that are present in the compounds of Formula (I) can all independently of one another have (R) or (S) configuration. When bonds to a chiral carbon are depicted as straight lines in the structural formulas of the present disclosure, or when a compound name is recited without an (R) or (S) chiral designation for a chiral carbon, it is understood that both the (R) and (S) configurations of each such chiral carbon and hence each enantiomer or diastereomer and mixtures thereof are embraced within the formula or by the name. The production of specific stereoisomers or mixtures thereof may be identified in the Examples where such stereoisomers or mixtures were obtained, but this in no way limits the inclusion of all stereoisomers and mixtures thereof from being within the scope of the disclosure.

[0249] The present disclosure includes all possible enantiomers and diastereomers and mixtures of two or more stereoisomers, for example mixtures of enantiomers and / or diastereomers, in all ratios. Thus, enantiomers are a subject of the present disclosure in enantiomerically pure form, both as levorotatory and as dextrorotatory antipodes, in the form of racemates and in the form of mixtures of the two enantiomers in all ratios.

[0250] Unless otherwise stated, the structures depicted herein are also meant to include the compounds that differ only in the presence of one or more isotopically enriched atoms, in other words, the compounds wherein one or more atoms are replaced by atoms having the same atomic number, but an atomic mass or mass number different from the atomic mass or mass number which predominates in nature. Such compounds are referred to as a “isotopic variant” . The present disclosure is intended to include all pharmaceutically acceptable isotopic variants of the compounds of Formula (I) . Examples of isotopes suitable for inclusion in the compounds of the present disclosure include, but not limited to, isotopes of hydrogen, such as 2H and 3H; carbon, such as 11C, 13C and 14C; chlorine, such as 36Cl; fluorine, such as 18F; iodine, such as 123I and 125I; nitrogen, such as 13N and 15N; oxygen, such as 15O, 17O and 18O; phosphorus, such as 32P; and sulfur, such as 35S. Certain isotopic variants of the compounds of Formula (I) , for example those incorporating a radioactive isotope, may be useful in drug and / or substrate tissue distribution studies. Particularly, compounds having the depicted structures that differ only in the replacement with heavier isotopes, such as the replacement of hydrogen by deuterium (2H) , can afford certain therapeutic advantages, for example, resulting from greater metabolic stability, increased in vivo half-life, or reduced dosage requirements and, hence, may be utilized in some particular circumstances. Isotopic variants of compounds of Formula (I) can generally be prepared by conventional techniques known to one skilled in the art or by processes analogous to those described in the accompanying examples and synthesis using an appropriate isotopically-labeled reagent in place of the non-labeled reagent previously employed. In certain embodiments, isotopic variants of compounds of the present disclosure are deuterated variants.

[0251] As used herein, the terms “peptide” , “polypeptide” , and “protein” are used interchangeably, and refer to a compound comprised of amino acid residues covalently linked by peptide bonds. A protein or peptide contains at least two amino acids, and no limitation is placed on the maximum number of amino acids that may comprise a protein’s or peptide’s sequence. Polypeptides include any peptide or protein comprising two or more amino acids joined to each other by peptide bonds. As used herein, the term refers to both short chains, which also commonly are referred to in the art as peptides, oligopeptides and oligomers, for example, and to longer chains, which generally are referred to in the art as proteins, of which there are many types. “Polypeptides” include, for example, biologically active fragments, substantially homologous polypeptides, oligopeptides, homodimers, heterodimers, variants of polypeptides, modified polypeptides, derivatives, analogs, fusion proteins, among others. The polypeptides include natural peptides, recombinant peptides, synthetic peptides, or a combination thereof.

[0252] SYNTHESIS

[0253] The compounds of the present disclosure may be prepared by the general and specific methods described below, using the common general knowledge of those skilled in the art of synthetic organic chemistry. Such common general knowledge can be found in standard reference books, e.g., Barton and Ollis (Ed. ) , Comprehensive Organic Chemistry, Elsevier; Richard Larock, Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Preparations, John Wiley and Sons; and Compendium of Organic Synthetic Methods, Vol. I-XII, Wiley-Interscience. The starting materials used herein are commercially available or may be prepared by routine methods known in the art.

[0254] The Schemes described hereinafter are intended to provide a general description of the methodology employed in the preparation of the compounds of the present disclosure. Some of the compounds of the present disclosure may contain single or multiple chiral centers with the stereochemical designation (R) or (S) . It will be apparent to those skilled in the art that all of the synthetic transformations can be conducted in a similar manner no whether the materials are enantioenriched or racemic. Moreover, the resolution to the desired optically active material may take place at any desired point in the procedure using well known methods such as those described herein and in the chemistry literature.

[0255] In order that the disclosure may be more fully understood, the following examples are set forth. The examples described herein are offered to illustrate the compounds, methods and compositions provided herein and are not to be construed in any way as limiting the scope of the disclosure.

[0256] During synthetic procedures, it may be necessary and / or desirable to protect sensitive or reactive groups on any of the molecules concerned. This may be achieved by means of conventional protecting groups, such as those described in T. W. Greene and P. G. M. Wutts, Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Edition, John Wiley and Sons. The protective groups are optionally removed at a convenient subsequent stage using methods well known in the art.

[0257] The compounds of the present disclosure can be readily prepared according to the following reaction schemes and examples, or modifications thereof, using readily available starting materials, reagents, and conventional synthesis procedures. In these reactions, it is also possible to make use of variants which are themselves known to those skilled in the art, but are not mentioned in greater detail. Furthermore, other methods for preparing the compounds of the disclosure will be readily apparent to those skilled in the art in light of the reaction schemes and examples as described herein. Unless otherwise indicated, all variables are as defined above.

[0258] EXAMPLE

[0259] In general chemical procedures, all reagents and materials may be purchased from commercial vendors or may be readily prepared by those skilled in the art. A list of abbreviations for reagents used and organic moieties may be found in Table 2, below.

[0260] Table 2. Abbreviations of reagents or organic moieties

[0261] Structures of the compounds were determined by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and / or Mass Spectrometry (MS) . NMR measurements were made with a Bruker ADVANCE III 500MHz spectrometer, using deuterated chloroform (CDCl3) or deuterated dimethyl sulfoxide (DMSO-d6) as the solvent, and tetramethylsilane (TMS) as the internal standard. The 1H NMR data are listed in the following format: chemical shift (multiplicity (s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quadruplet; m, multiplet) , number of protons) .

[0262] MS measurements were performed with a Thermo Q Exactive Plus instrument. Thin-layer chromatography (TLC) used silica gel plates from Yantai Huanghai HSGF254 or Qingdao GF254, with a thickness of 0.20 mm to 0.25 mm. Column chromatography generally used silica gel (200 to 300 mesh) from Yantai Yuhuang as the carrier. The known starting materials of the present disclosure can be synthesized according to methods known in the art, or purchased from companies such as Energy Chemical, Macklin, Bide Pharm, Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Bailingwei Technology Co., Ltd., Sigma-Aldrich, etc.

[0263] Synthetic Example 1. Synthesis of alkyne probes BA, DBA-1, DBA-2, DBA-3, DBA-4, DBA-5, DBA-7, TBA

[0264] Scheme 1. Synthetic route of alkyne probes

[0265] General Procedure 1:

[0266] Acid (1.0 eq. ) was dissolved in 2 mL of DMF, followed by HOBT (62 mg, 0.446 mmol, 1.5 eq. ) , EDCI (85 mg, 0.446 mmol, 1.5 eq. ) , and DIEA (115 mg, 0.892 mmol, 3.0 eq. ) . The mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. Then hept-6-yn-1-amine (50 mg, 0.446 mmol, 1.5 eq) was added and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The completion of reaction was monitored by LC-MS. The reaction was quenched with water, extracted with EA, the organic phase was washed with saturated brine, dried with anhydrous sodium sulfate, rotary evaporated and purified using a preparative HPLC (prep-HPLC) system.

[0267] N- (hept-6-yn-1-yl) -4-hydroxybenzamide (BA)

[0268] Synthesized according to general procedure 1. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 20%-65%ACN in a 20 min gradient) to afford BA as a colorless oil, 35.4 mg, yield 21.14%.

[0269] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.01 (s, 1H) , 8.24 (t, J = 5.7 Hz, 1H) , 7.72 –7.79 (m, 2H) , 6.80 –6.87 (m, 2H) , 3.27 (q, J = 6.6 Hz, 2H) , 2.78 (t, J = 2.6 Hz, 1H) , 2.20 (td, J = 7.0, 2.7 Hz, 2H) , 1.47 –1.60 (m, 4H) , 1.37 –1.47 (m, 2H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C14H18NO2+: 232.1332; found: 232.1330.

[0270] N- (hept-6-yn-1-yl) -3, 4-dihydroxybenzamide (DBA-1)

[0271] Synthesized according to general procedure 1. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 1%FA, 40-60%ACN in a 10 min gradient) to afford DBA-1 as a white solid (15.5 mg, 21.09%) .

[0272] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.18 (s, 2H) , 8.10 (t, J = 5.8 Hz, 1H) , 7.26 (s, 1H) , 7.16 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 6.74 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 3.18 (q, J = 6.7 Hz, 2H) , 2.73 (t, J = 2.6 Hz, 1H) , 2.16-2.13 (m, 2H) , 1.54-1.41 (m, 4H) , 1.39-1.32 (m, 2H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C14H18NO3+: 248.1281; found: 248.1278.

[0273] N- (hept-6-yn-1-yl) -2, 4-dihydroxybenzami-de (DBA-2)

[0274] Synthesized according to general procedure 1. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 40-95%ACN in a 10 min gradient) to afford DBA-2 as a white solid (39.0 mg, 24.32%) .

[0275] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 13.02 (s, 1H) , 10.04 (s, 1H) , 8.51 (t, J = 5.7 Hz, 1H) , 7.66 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 6.27 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H) , 6.21 (d, J = 2.4 Hz, 1H) , 2.73 (t, J =2.6 Hz, 1H) , 2.17 –2.14 (m, 2H) , 1.56 –1.43 (m, 4H) , 1.41 –1.33 (m, 2H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C14H18NO3+: 248.1281; found: 248.1278.

[0276] N- (hept-6-yn-1-yl) -2, 3-dihydroxybenzamide (DBA-3)

[0277] Synthesized according to general procedure 1. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 40-70%ACN in a 10 min gradient) to afford DBA-3 as a white semisolid (53.0 mg, 22.03%) .

[0278] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.84 (s, 1H) , 8.78 (t, J = 5.8 Hz, 1H) , 7.27 (d, J = 8.1 Hz, 1H) , 6.90 (d, J = 7.8 Hz, 1H) , 6.68 (t, J = 7.9 Hz, 1H) , 3.28 (d, J = 6.6 Hz, 2H) , 2.73 (d, J = 2.4 Hz, 1H) , 2.16 (t, J = 6.9 Hz, 2H) , 1.57 -1.51 (m, 2H) , 1.49 -1.45 (m, 2H) , 1.42 -1.36 (m, 2H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C14H18NO3+: 248.1281; found: 248.1278.

[0279] N- (hept-6-yn-1-yl) -2, 5-dihydroxybenzamide (DBA-4)

[0280] Synthesized according to general procedure 1. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 30-95%ACN in a 30 min gradient) to afford DBA-4 as a white solid (27.0 mg, 33.67%) .

[0281] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.78 (d, J = 8.9 Hz, 1H) , 8.96 (d, J = 9.3 Hz, 1H) , 8.71 -8.61 (m, 1H) , 7.25 -7.17 (m, 1H) , 6.89 -6.80 (m, 1H) , 6.70 (t, J = 9.2 Hz, 1H) , 3.28 –3.20 (m, 2H) , 2.76 -2.70 (m, 1H) , 2.19 -2.10 (m, 2H) , 1.58 –1.42 (m, 4H) , 1.42 -1.33 (m, 2H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C14H18NO3+: 248.1281; found: 248.1278.

[0282] 2- (3, 4-dihydroxyphenyl) -N- (hept-6-yn-1-yl) acetamide (DBA-5)

[0283] Synthesized according to general procedure 1. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 10-50%ACN in a 40 min gradient) to afford DBA-5 as a red oily liquid (238.80 mg, 75%) .

[0284] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.93 (d, J = 40.9 Hz, 2H) , 8.03 (d, J = 7.0 Hz, 1H) , 6.77 (d, J = 13.0Hz, 2H) , 6.61 (d, J = 7.9 Hz, 1H) , 3.32 (d, J = 4.3 Hz, 2H) , 3.16 (s, 2H) , 2.90 (t, 1H) , 2.27 (d, 2H) , 1.56 –1.48 (m, 6H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C15H20NO3+: 262.3284; found: 262.3237.

[0285] 3- (3, 4-dihydroxyphenyl) -N- (hept-6-yn-1-yl) propanamide (DBA-7)

[0286] Synthesized according to general procedure 1. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 10-40%ACN in a 40 min gradient) to afford DBA-7 as a oily liquid (87.44 mg, 58%) . 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.63 (s, 1H) , 8.54 (s, 1H) , 7.68 (t, J = 5.7 Hz, 1H) , 6.55 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 6.50 (d, J = 2.1 Hz, 1H) , 6.36 (dd, J = 8.0, 2.1 Hz, 1H) , 2.95 (q, J = 6.5 Hz, 2H) , 2.66 (t, J = 2.7 Hz, 1H) , 2.56 (dd, J = 8.8, 6.8 Hz, 2H) , 2.20 (dd, J = 8.8, 6.8 Hz, 2H) , 2.11 –2.04 (m, 2H) , 1.46 –1.13 (m, 6H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C16H22NO3+: 276.3554; found: 276.3593.

[0287] O- (hept-6-yn-1-yl) -3, 4, 5-trihydroxybenzami-de (TBA)

[0288] Synthesized according to general procedure 1. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 10-50%ACN in a 40 min gradient) to afford TBA as a grey solid (35.62 mg, 25%) . 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 –9.16 (m, 3H) , 8.03 (t, J = 5.7 Hz, 1H) , 6.80 (s, 2H) , 3.16 (q, J = 6.6 Hz, 2H) , 2.73 (t, J = 2.6 Hz, 1H) , 2.15 (td, J = 7.0, 2.7 Hz, 2H) , 1.40–1.52 (m, 4H) , 1.30 –1.42 (m, 2H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C14H18NO4+: 264.3004; found: 264.3038.

[0289] Synthetic Example 2. Synthesis of the alkyne probe DBA-6

[0290] Scheme 2. Synthetic route of the alkyne probe

[0291] N- (3, 4-dihydroxyphenethyl) oct-7-ynamide (DBA-6)

[0292] Dopamine hydrochloride (100 mg, 0.529 mmol, 1 eq) was dissolved in 1 mL DMF, then oct-7-ynoic acid (74.16 mg, 0.529 mmol, 1 eq) was added, followed by the addition of EDCI (202.82 mg, 1.058 mmol, 2 eq) , HOBT (142.94 mg, 1.058 mmol, 2 eq) , and DIEA (205.04 mg, 1.587 mmol, 3 eq) . The mixture was stirred overnight at room temperature and the reaction was monitored by TLC and LCMS. The reaction was quenched with water, and then extracted with ethyl acetate (EA) three times. The organic phases were combined, washed with saturated brine, dried, filtered, and spun dry. The crude product was purified using preparative TLC, and then further purified by flash chromatography to obtain a colorless oil. Purified by prep-HPLC (MeCN / H2O with 0.05%FA, 20-65%MeCN in a 20 min gradient) to afford DBA-6 as a colorless oil solid (20.2 mg, 13.87%) .

[0293] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.74 (s, 1H) , 8.65 (s, 1H) , 7.80 (t, J = 5.7 Hz, 1H) , 6.62 (d, J = 7.9 Hz, 1H) , 6.56 (d, J = 2.1 Hz, 1H) , 6.42 (dd, J = 8.0, 2.1 Hz, 1H) , 3.12 –3.20 (m, 2H) , 2.73 (t, J = 2.7 Hz, 1H) , 2.49 (d, J = 7.5 Hz, 2H) , 2.06 –2.17 (m, 2H) , 2.03 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 1.26 –1.57 (m, 6H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C16H22NO3+: 276.3554; found: 276.3593.

[0294] Synthetic Example 3. Synthesis of the alkyne probe DBA-8

[0295] Scheme 3. Synthetic route of the alkyne probe

[0296] (R) -N- (2- (3, 4-dihydroxyphenyl) -2-hydro-xyethyl) -N-methyloct-7-ynamide (DBA-8)

[0297] Dissolve oct-7-ynoic acid (64.3 mg, 0.459 mmol, 1.2 eq) in 1.0 mL DMF, add BOP (253.6 mg, 0.574 mmol, 1.5 eq) and DIEA (148.0 mg, 1.148 mmol, 3.0 eq) , stir at room temperature for 30 min, then add (R) -4- (1-hydroxy-2- (methylamino) ethyl) benzene-1, 2-diol (70.0 mg, 0.383 mmol, 1.0 eq) , stir at room temperature for 1 hour, monitor the reaction end with LCMS, extract with ethyl acetate (EA) three times, combine the organic phases, wash with saturated brine, dry, filter, spin dry, to obtain 120 mg of crude product, take 30 mg to prepare and get an oil (12.5 mg, 10.71%yield) . Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 10-30-95%ACN in a 20 min gradient) to afford DBA-8 as an oily liquid (12.5 mg, 10.71%yield) .

[0298] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 6.75 –6.74 (m, 1H) , 6.68 –6.66 (m, 1H) , 6.58 –6.56 (m, 1H) , 4.56 (t, J = 6.4 Hz, 1H) , 2.89 –2.75 (m, 3H) , 2.61 –2.57 (m, 1H) , 2.56 –2.51 (m, 3H) , 2.26 –2.21 (m, 1H) , 2.17 –2.11 (m, 2H) , 2.08 –2.04 (m, 0.5H) , 1.71 –1.69 (m, 0.5H) , 1.52 –1.33 (m, 5H) , 1.32 –1.25 (m, 1H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C17H24NO4+: 306.3814; found: 306.1699.

[0299] Synthetic Example 4. Synthesis of DBA-Cy3, TBA-Cy3

[0300] Scheme 4. Synthetic route of DBA-Cy3 and TBA-Cy3

[0301] General Procedure 2:

[0302] Dissolve DBA-1 (16.00 mg, 0.01 mmol, 1.00 eq., 99.1%) or TBA (16.00mg, 0.01mmol, 1.00eq., 99.61%) and a fluorescent dye (4.00 mg, 0.01 mmol, 1.00 eq. ) in 0.50 ml of tert-butanol and 0.5 ml of water, respectively. Separately dissolve sodium ascorbate (8.00 mg, 0.01 mmol, 1.00 eq. ) and copper (II) sulfate pentahydrate (8.00 mg, 0.01 mmol, 1.00 eq. ) in 0.5 ml each. Sequentially add them to the tert-butanol water solution and stir in the dark at 50℃ overnight. The next day, liquid chromatography-mass spectrometry confirms the formation of the target compound (signal as positive -CL ion, appearing 2 / n) , and ensures that all the dye has reacted completely. Stop stirring, filter the reaction solution, and wash the filter head with ACN. After freeze-drying the wash liquid from the filter head through high-pressure reverse-phase preparation (20-50%, ACN / water, 30 min) , a purple solid, DBA-Cy3 and TBA-Cy3 are obtained.

[0303] 2- ( (E) -3- ( (Z) -1- (6- ( (3- (4- (5- (3, 4-dihydroxybenzamido) pentyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) propyl) amino) -6oxohexyl) -3, 3-dimethylindolin-2-ylidene) prop-1-en-1-yl) -1, 3, 3-trimethyl-3H-indol-1-ium chloride (DBA-Cy3)

[0304] Synthesized according to general procedure 2. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.05%FA, 20-50%ACN in a 30 min gradient) to afford DBA-Cy3 as a purple solid (3.20 mg, 56%) .

[0305] 1H NMR. (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.48 (s, 1H) , 8.32 (t, J = 13.4 Hz, 1H) , 8.09 (s, 1H) , 7.93 (s, 1H) , 7.61 (t, J = 6.6 Hz, 2H) , 7.46 -7.37 (m, 4H) , 7.28 (m, 3H) , 7.13 (d, J = 8.4Hz, 1H) , 6.71 (d, J = 8.2 Hz, 1H) ; 6.46 (dd, J = 13.5, 4.6 Hz, 2H) , 4.24 (t, J=7.0 Hz, 2H) , 4.09 (t, J =7.6 Hz, 2H) , 3.63 (s, 3H) , 3.34 -3.10 (m, 2H) , 3.16 (d, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.98 (t, J = 6.9 Hz, 2H) , 2.57 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 2.07 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.85 (p, J = 6.9Hz, 2H) , 1.67 (s, 12H) , 1.59 -1.45 (m, 7H) , 1.33 (m, 5H) ESI-HRMS: m / z [M] + calcd. For C47H60N7O4+: 786.4701; found: 786.4693.

[0306] 3-2- ( (E) -3- ( (Z) -3, 3-dimethyl-1- (6-oxo-6- ( (3- (4- (5- (3, 4, 5-trihydroxybenzamido) pentyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) propyl) amino) hexyl) indolin-2-ylidene) prop-1-en-1-yl) -1, 3, 3-trimethyl-3H-indol-1-ium chloride (TBA-Cy3)

[0307] Synthesized according to general procedure 2. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.05%FA, 20-50%ACN in a 30 min gradient) to afford TBA-Cy3 as a purple solid (2.85 mg, 49%) .

[0308] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.41 (s, 1H) , 8.32 (t, J = 13.4 Hz, 1H) , 8.04 (s, 1H) , 7.92 (s, 1H) , 7.79 (d, J = 6.1 Hz, 1H) , 7.60 (t, J = 6.7 Hz, 2H) , 7.51 –7.35 (m, 4H) , 7.32 –7.23 (m, 2H) , 6.78 (s, 1H) , 6.43 (dd, J = 13.6, 4.1 Hz, 2H) , 4.23 (t, J = 7.1 Hz, 2H) , 4.09 (t, J = 7.4, 7.0 Hz, 2H) , 3.76 –3.86 (m, 3H) , 3.15 (d, J = 2.8 Hz, 2H) , 2.98 (d, J = 6.0 Hz, 2H) , 2.57 (d, J =7.4 Hz, 2H) , 2.06 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 1.84 (q, J = 7.0 Hz, 2H) , 1.68 –1.22 (m, 24H) . ESI-HRMS: m / z [M] + calcd. For C47H60N7O5+: 802.4650; found: 802.4704.

[0309] Synthetic Example 5. Synthesis of DBA-DTB

[0310] Scheme 5. Synthetic route of DBA-DTB

[0311] General Procedure 3:

[0312] 3, 4-dihydroxy-N- (2- (6- (5-methyl-2-oxoimidazolidin-4-yl) hexanamido) ethyl) benzamide (DBA-DTB)

[0313] Dissolve the starting material 3, 4-Dihydroxybenzoic acid or 3, 4, 5-Trihydroxybezoic acid (1.00eq. ) in N, N-Dimethylformamide (DMF) , n-tert-butyloxycarbonyl -1, 2-ethylenediamine is then add, followed by EDCI (52.20mg, 0.27mmol, 1.50eq. ) , HOBt (36.50mg, 0.27mmol, 1.50eq. ) , DIEA (93.30mg, 0.71mmol, 4.00eq., 99.5%) . The mixture is stirred at room temperature for 1h to obtain the crude product, which is the reaction product DBA-DTB-M1. Then DBA-DTB-M1 was added to a THF and DCM solution and spun dry to obtain DBA-DTB-M2. Dissolve DBA-DBIA-M2 (35.00 mg, 0.18 mmol, 1.00 eq. ) in 1.00 ml of N, N-Dimethylformamide (DMF) . Dethiobiotin (46.10mg, 0.21mmol, 1.20eq. ) is then add, followed by EDCI (52.20mg, 0.27mmol, 1.50eq. ) , HOBt (36.50mg, 0.27mmol, 1.50eq. ) , DIEA (93.30mg, 0.71mmol, 4.00eq., 99.5%) . The mixture is stirred at room temperature for 1h and monitored by LCMS. The product is extracted three times with EA, then the organic phases are washed with two times with saturated brine, dried, filtered, and rotary evaporated. After freeze-drying the wash liquid from the filter head through prep-HPLC, a white solid, DBA-DTB is obtained. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 5-25-95%ACN in a 20 min gradient) to afford DBA-DTB as a white solid (12.66 mg, 18%)

[0314] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.43 (s, 1H) , 9.08 (s, 1H) , 8.12 (t, J = 5.7, Hz, 1H) , 7.87 (t, J = 5.8 Hz, 1H) , 7.28 -7.24 (m, 1H) , 7.18 -7.13 (m, 1H) , 6.74 (d, J = 8.2 Hz, 1H) 6, 28 (s, 1H) , 6.11 (s, 1H) , 3.64 -3, 55 (m, 1H) , 3.49 -3.43 (m, 1H) , 3.26 -3.21 (m, 2H) , 3.20 -3.13 (m, 2H) , 2.05 (t, J= 7.4 Hz, 2H) , 1.52 -1.43 (m, 2H) , 1.35 -1.14 (m, 6H) , 0.98 -0.90 (m, 3H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C19H29N4O5+: 393.2132; found: 393.2130.

[0315] Synthetic Example 6. Synthesis of fragments bearing acrylamide

[0316] Scheme 6. Synthetic route of fragments bearing acrylamide.

[0317] General Procedure 4:

[0318] Amine (1.0 eq. ) was dissolved in 1 mL of DCM, followed by TEA (63.10mg, 0.62mmol, 2.00eq., 99.5%) , Acrylyl chloride (33.70mg, 0.37mmol, 1.20eq., 98%) . The mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The completion of reaction was monitored by LC-MS. The reaction was quenched with water, extracted with DCM, the organic phase was washed with saturated brine, dried with anhydrous sodium sulfate, rotary evaporated and purified using a preparative HPLC (prep-HPLC) system.

[0319] N- (2- (1H-indol-3-yl) ethyl) acrylamide (FA-1)

[0320] Synthesized according to general procedure 4. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 20-30-95%ACN in a 17 min gradient) to afford FA-1 as a white solid (18.96 mg, 28%)

[0321] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.82 (s, 1H) , 8.22 (t, J = 5.8 Hz, 1H) , 7.53 (d, J = 7.8 Hz, 1H) , 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 7.15 (d, J = 2.4 Hz, 1H) , 7.06 (t, J = 7.5 Hz, 1H) , 6.97 (t, J =7.4 Hz, 1H) , 6.26 -6.17 (m, 1H) , 6.12 -6.05 (m, 1H) , 5.60 -5.54 (m, 1H) , 3.44 -3.40 (m 2H) , 2.85 (t, J = 7.5 Hz, 2H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C13H15N2O+: 215.1178; found: 215.1176.

[0322] N- (2- (1, 6, 7, 8-tetrahydro-2H-indeno [5, 4-b] furan-8-yl) ethyl) acrylamide (FA-2)

[0323] Synthesized according to general procedure 4. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 20-60-95%ACN in a 13 min gradient) to afford FA-2 as a white solid (14.69 mg, 46%) .

[0324] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.15 (t, J = 5.7 Hz, 1H) , 6.90 (d, J=7.9 Hz, 1H) , 6.52 (d, J =7.9 Hz, 1H) , 6.20 (dd, J =10.2 Hz, 1H) , 6.07 (dd, J = 17.1, 2.3 Hz, 1H) , 5.57 (dd, J =10.1, 2.3 Hz, 1H) , 4.56 -4.47 (m, 1H) , 4.47 -4.38 (m, 1H) , 3.23 -3.01 (m, 5H) , 2.85 -2.76 (m, 1H) , 2.72 -2.62 (m, 1H) , 2.24 -2.14 (m, 1H) , 2.01 -1.90 (m, 1H) , 1.79-1.69 (m, 1H) , 1.55 -1.44 (m, 1H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C16H20NO2+: 258.1488; found: 258.1486.

[0325] N- (4- (benzo [d] oxazol-2-yl) phenyl) acrylamide (FA-3)

[0326] Synthesized according to general procedure 4. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 30-70-95%ACN in a 14 min gradient) to afford FA-3 as a white solid (16.03 mg, 43%) .

[0327] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.54 (s, 1H) , 8.18 (d, J = 8.7 Hz, 2H) , 7.92 (d, J = 8.7 Hz, 2H) , 7.81 –7.73 (m, 2H) , 7.45 –7.36 (m, 2H) , 6.53 –6.44 (m, 1H) , 6.36 –6.28 (m, 1H) , 5.86 –5.80 (m, 1H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C16H13N2O2+: 265.0971; found: 265.0971.

[0328] N- ( (1R, 2S) -2-phenylcyclopropyl) acrylamide (FA-4)

[0329] Synthesized according to general procedure 4. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 20-45-95%ACN in a 14 min gradient) to afford FA-4 as a white solid (21.02 mg, 50%) .

[0330] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.44 -8.39 (m, 1H) , 7.29 -7.23 (m, 2H) , 7.19 -7.14 (m, 1H) , 7.12 (d, J = 7.6 Hz, 2H) . 6.22 -6.12 (m 1H) , 6.12 -6.04 (m, 1H) . 5.62 -5.55 (m, 1H) , 2.94 -2.86 (m, 1H) , 2.00 -1.93 (m, 1H) , 1.22 -1.16 (m, 2H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C12H14NO+: 188.1069; found: 188.1068.

[0331] N- (3, 4, 5-trimethoxyphenyl) acrylamide (FA-5)

[0332] Synthesized according to general procedure 4. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 20-25-95%ACN in a 17 min gradient) to afford FA-5 as a white solid (21.28 mg, 33%)

[0333] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.11 (s, 1H) , 7.06 (s, 2H) , 6.45 -6.36 (m, 1H) , 6.27 -6.20 (m, 1H) , 5.77 -5.71 (m, 1H) , 3.74 (s, 6H) , 3.62 (s, 3H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C12H16NO4+: 238.1073; found: 238.1072.

[0334] N- (adamantan-1-yl) acrylamide (FA-6)

[0335] Synthesized according to general procedure 4. Purified by prep-HPLC (ACN / H2O with 0.1%FA, 30-80-95%ACN in a 15 min gradient) to afford FA-6 as a white solid (15.54 mg, 23%)

[0336] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.54 (s, 1H) , 6.24 (dd, J = 17.0, 10.1 Hz, 1H) , 5.99 (dd, J = 17.0, 2.4 Hz, 1H) , 5.48 (dd, J = 10.1, 2.4Hz, 1H) , 2.03 -1.98 (m, 3H) , 1.97 -1.93 (m, 6H) , 1.64 -1.60 (m, 6H) . ESI-HRMS: m / z [M+H] + calcd. for C13H20NO+: 206.1539; found: 206.1539.

[0337] Application Studies

[0338] Application Example 1. In-Gel Fluorescence analysis demonstrating the necessity of copper ions as a catalyst for protein labeling by dihydroxybenzene-based scaffold probes

[0339] · General procedure 1a (click reaction for gel imaging) : Add freshly prepared pre-mixed click chemistry reaction mixture to the sample, and the click chemistry reaction mixture includes: TAMRA-N3 dissolved in DMSO to a final concentration of 10μM, TBTA dissolved in DMSO to a final concentration of 51μM, CuSO4 dissolved in H2O to a final concentration of 1 mM, TCEP dissolved in H2O to a final concentration of 1mM. This reaction was further incubated at room temperature for 2 hours.

[0340] · General procedure 2a (gel imaging) : The mixture (termed “gel sample” ) dissolved in 1× SDS sample loading buffer and heated at 95℃ for 5 minutes. Subsequently, 20μg of protein from each sample was loaded onto an SDS-PAGE (10%gel) and subjected to electrophoresis for 2 hours. The gel was first visualized using Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging for in-gel fluorescence, followed by Coomassie brilliant blue staining, destaining, and imaging.

[0341] · The preparation procedure for gel samples of investigation of protein labeling reason based on alkyne probe and fluorescent probe: Commercially available BSA standard protein was diluted in PBS to a concentration of 0.25 mg / mL. To this 100μL BSA protein solution, 10μM of DBA-1 (as described in synthetic example 1 for structure and synthesis details) or DBA-Cy3 (as described in synthetic example 4 for structure and synthesis details) incubated with different components of click cocktail (TBTA dissolved in DMSO to a final concentration of 100μM, CuSO4 dissolved in H2O to a final concentration of 1 mM, TCEP dissolved in H2O to a final concentration of 1mM) for a particular span of time at 25℃, and the mixture of DBA-1 needs addition of competitor and a normal click reaction for 2 hours (see general procedure 1a) , followed by general procedure 2a to visualize.

[0342] · The preparation procedure for gel samples of exploration of the catalytic effect of different metal ions on probe-labeled proteins: Commercially available BSA standard protein was diluted in PBS to a concentration of 0.25 mg / mL. To this 100μL BSA protein solution, 10μM of a fluorescent probe (as described in synthetic example 4 for structure and synthesis details) and 100μM of various solutions were added. These solutions included pure water, magnesium chloride, calcium chloride, chromium chloride, manganese chloride, ferrous chloride, iron chloride, cobalt acetate, nickel iodide, cuprous iodide, zinc chloride, hydrogen peroxide, copper sulfate, and cuprous iodide combined with TCEP. The mixture was incubated for 30 minutes at 25℃, followed by general procedure 2a to visualize.

[0343] The results, as shown in FIG. 1A and 1B, indicated that the dihydroxybenzene-type covalent warhead required divalent copper ions for activation to label proteins. Furthermore, it was observed from FIG. 2A and 2B that the capacity of divalent copper ions to induce DBA-1 labeling of proteins was significantly stronger than that of other metal ions, but TBA not.

[0344] Application Example 2. Probe Labeling Experiment within live cells

[0345] · Hela cells were grown in 10cm culture dishes until they reached 80-90%confluence. The culture medium was then removed, and the cells were washed twice with PBS. The cells were washed twice with ice-cold PBS to remove excess competitive molecules.

[0346] · After washing, the cells were treated with cell lysis buffer (1×PBS, 0.1%Triton X-100 (v / v) ) and lysed using an ultrasonic probe in an ice-water bath. Post-centrifugation, the supernatants were collected to obtain the protein solution. The protein concentration was then measured using the BCA protein assay kit according to the manufacturer's protocol, and the protein solution was diluted to 2 mg / mL with PBS.

[0347] · Next, 100μL protein samples were incubated with 15μM BA, DBA-1, DBA-2, DBA-3, DBA-4, DBA-5, DBA-6, DBA-7, DBA-8 or TBA (as described in synthetic example 1～3 for structure and synthesis details) and 1000μM of copper sulfate for 30 minutes at 25℃. Afterward, add urea to a final concentration of 8M, then add methanol for precipitation. The protein pellet is resuspended with 0.1%SDS in 1×PBS, followed by general procedure 1a.

[0348] · After the click reaction, gel samples were visualized by general procedure 2a.

[0349] From FIG. 3, it can be seen that some probes which contain dihydroxybenzene groups exhibit varying degrees of protein labeling activity.

[0350] Application Example 3. Competitive Labeling Experiment within live cells

[0351] · Hela cells were grown in 10cm culture dishes until they reached 80-90%confluence. The culture medium was then removed, and the cells were washed twice with PBS. The cells were subsequently incubated with or without each competitive compound individually for 1 hour. These compounds included either no compound or namely compounds NP-1, NP-2, NP-3, NP-4, FA-1, FA-2, FA-3, FA-4, FA-5, FA-6 (as described in synthetic example 6 for structure and synthesis details) , all at a concentration of 100μM. Following this, the culture medium was removed, and the cells were washed twice with ice-cold PBS to remove excess competitive molecules.

[0352] · After washing, the cells were treated with cell lysis buffer (1×PBS, 0.1%Triton X-100 (v / v) ) and lysed using an ultrasonic probe in an ice-water bath. Post-centrifugation, the supernatants were collected to obtain the protein solution. The protein concentration was then measured using the BCA protein assay kit according to the manufacturer's protocol, and the protein solution was diluted to 2 mg / mL with PBS.

[0353] · Next, samples were incubated with 10μM DBA-1 and 100μM of copper sulfate for 30 minutes, followed by general procedure 1a.

[0354] · After the click reaction, gel samples were visualized by general procedure 2a.

[0355] From FIG. 4, it can be seen that all competing compounds exhibit varying degrees of competitive effect, with the molecules NP-1 and NP-2, which contain dihydroxybenzene groups, showing better competitive effects. In addition, the fragments FA-1 and FA-3 also showed good competitive activity. The findings indicate that dihydroxybenzene-type covalent warheads have the potential to map binding sites of ligands in live cells through the ABPP strategy.

[0356] Application Example 4. Chemoproteomics experiment of probe labeling site (Cys) recognition through isotopic labeling

[0357] · Hela cells were grown in 10 cm dishes until they reached approximately 90% confluence. The culture medium was then removed, and the cells were washed twice with cold PBS. The cells were collected into a 5 mL centrifuge tube, and the dishes were washed twice with 1 mL of cold PBS to collect any leftover cells, combining this wash solution with the cell suspension. All cell pellets were collected with centrifugation.

[0358] · 500μL of cold lysis buffer (1× PBS, 0.1%TritonX-100 (v / v) ) was added to the pellet, and the cells were dispersed thoroughly by pipetting. The cells were then sonicated in an ice bath. After centrifugation, the supernatant was collected, and the protein concentration was measured using the BCA method. The protein concentration was adjusted to 2 mg / mL.

[0359] · The samples were divided into two portions and placed in separate 1.5 mL EP tubes. To each portion, 200μM probe DBA-1 was added, along with 1mM copper sulfate. The samples were incubated for 1 hours with mixing.

[0360] · A freshly prepared mixture of click reagents, containing isoDTB-L or isoDTB-H, was added to the samples. The reaction was carried out with shaking (25℃, 1400 rpm) for 2 hours. The components of the click reagent mixture were TBTA dissolved in DMSO at a final concentration of 51μM, CuSO4 dissolved in H2O at a final concentration of 1mM, isoDTB-L or isoDTB-H dissolved in DMSO at a final concentration of 250μM, and TCEP dissolved in H2O at a final concentration of 1mM.

[0361] · After the click reaction, the samples were transferred to a 15 mL centrifuge tube, and 5 mL of cold methanol was added. The mixture was vortexed and left at -20℃ overnight to precipitate the proteins. The protein pellets were then washed with methanol, and 300μL of 8M urea in 100mM TEAB was added for resuspension, followed by an additional 900μL of 100mM TEAB to achieve a final urea concentration of 2M.

[0362] · 200μL of streptavidin beads were prepared by washing once with 1ml of double distilled water (ddH2O) , twice with 1mL of 0.1M TEAB, and then dispersed in 1.2mL of a solution containing 0.2%NP40 in 0.1M TEAB. These washed beads were added to the samples and incubated at room temperature for 2 hours. After incubation, the beads were centrifuged, the supernatant was discarded, and the beads were washed twice with 600μL of 0.1%NP40 in PBS, three times with PBS, and three times with ddH2O.

[0363] · 300μL of 10mM TCEP was added to the beads, and they were incubated at 37℃ with agitation at 800 rpm for 45 minutes. After incubation, the beads were centrifuged, and 300μL of 10mM iodine acetamide was added. The beads were then incubated at 25℃with agitation at 800 rpm for another 30 minutes. Following this, the beads were centrifuged and washed twice with 200μL of 50mM TEAB.

[0364] · 2ug (4μL) of trypsin in 220μL of 50mM TEAB was added to the beads, which were then placed in a temperature-controlled shaker at 1400 rpm and 37℃ for overnight incubation (16 hours) . After incubation, the beads were centrifuged at 1000g for 1 minute, the supernatant was discarded, and the beads were washed with 600μL of 2M urea in PBS three times, followed by three PBS washes and three water (MS-grade) washes. Then, 100μL of elution buffer (0.1%TFA in 50%acetonitrile-water solution) was added to the beads, and they were incubated at 800 rpm for 10 minutes. This process was repeated twice, and the liquid was combined and collected as the "Site Components. "

[0365] · The site components sample was dried using SpeedVac, then identified using a 2-hour gradient on Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometry after desalting. Briefly, MS1 spectra were acquired at 60-K resolving power with a maximum of 50-ms ion injection time in the Orbitrap. MS2 spectra were acquired by selecting the top ten most abundant features via high-energy collisional induced dissociation (HCD) in the Orbitrap at 15-K resolution using an automatic gain control (AGC) setting of 50 K, a collision energy of 35%, a quadrupole isolation window of 1.2 m / z, and a maximum ion injection time of 22ms.

[0366] · To survey the landscape of all mass shifts observed on peptides in the data sets, an OpenSearch was performed with MSFragger. For this purpose, the following settings were used: Precursor mass tolerance -150 to 1000 Da, (initial) fragment mass tolerance 20 ppm, Calibration and Optimization “Mass calibration, parameter optimization” enabled, Isotope Error “0” , enzyme name “trypsin” , cut after “KR” , but not before “P” , cleavage “enzymatic” , missed cleavages “2” , Clip N-term N enabled, peptide length 7 to 50, peptide mass range 500 to 5000 Da, no variable modifications, no fixed modifications, all other options were left at the standard settings. For downstream data analysis, the “global. modsummary. tsv” file was loaded and the values for the number of PSMs ( “default-ptmshepherd-dataset (PSMs) ” ) were plotted against the “Theoretical Mass Shift” in the mass range between 400 and 1000 Da.

[0367] · To analyze the amino acid selectivity, an Offset Search was performed in MSFragger. For this purpose, the following settings were used in MSFragger: Precursor mass tolerance -20 to 20 ppm, fragment mass tolerance 20 ppm, Calibration and Optimization “None” , Isotope Error “0 / 1 / 2” , enzyme name “trypsin” , cut after “KR” , but not before “P” , cleavage “enzymatic” , missed cleavages “2” , Clip N-term N enabled, peptide length 7 to 50, peptide mass range 500 to 5000 Da, variable modification of 57.02146 Da on C with max. 3 occurrences, no fixed modifications, mass offsets set according to the result of open search. For downstream data analysis, the two “*. tsv” files for the two experiments were individually processed. Only entries were retained that were localized to a unique residue as seen by containing one lower-case letter (If there is no lower-case letter, the score for the unmodified peptide was higher than that for the best modified peptide and therefore no localization was performed) . The fraction of all sites that was modified at each amino acid and the termini was reported.

[0368] The mass spectrometry results (see FIG. 5A-5C) revealed that the probe selectively labeled cystine residues. A total of 6189 amino acid residues were labeled by the H tag, while 4175 amino acid residues were labeled by the L tag (see FIG. 5A and 5B) . According to the amino acid selectivity analysis, the probe DBA-1 primarily labels cysteine sites (see FIG. 5C) .

[0369] Application Example 5. Chemo-proteomics experiment of probe binding site (Cys) recognition through label-free quantification

[0370] · Hela cells were grown in 10 cm dishes until they reached approximately 90% confluence. The culture medium was then removed, and the cells were washed twice with cold PBS. The cells were collected into a 5 mL centrifuge tube, and the dishes were washed twice with 1 mL of cold PBS to collect any leftover cells, combining this wash solution with the cell suspension. All cell pellets were collected with centrifugation.

[0371] · 500μL of cold lysis buffer (1× PBS, 0.1%TritonX-100 (v / v) ) was added to the pellet, and the cells were dispersed thoroughly by pipetting. The cells were then sonicated in an ice bath. After centrifugation, the supernatant was collected, and the protein concentration was measured using the BCA method. The protein concentration was adjusted to 2 mg / mL.

[0372] · For the blank control group, directly add 200 μM DBA-1 along with 1mM copper sulfate and incubate at room temperature for 1 hour; for the competition group, add 200 μM IAA and incubate for 1 hour, then add the 200 μM DBA-1 along with 1mM copper sulfate and incubate for another 1 hour, with two biological replicates per group.

[0373] · After the incubation, the samples were transferred to a 15 mL centrifuge tube, and 5 mL of cold methanol was added. The mixture was vortexed and left at -20℃ overnight to precipitate the proteins. The protein pellets were then washed with methanol, and 300μL of 8M urea in 100mM TEAB was added for resuspension, followed by an additional 900μL of 100mM TEAB to achieve a final urea concentration of 2M.

[0374] · 200μL of streptavidin beads were prepared by washing once with 1ml of double distilled water (ddH2O) , twice with 1mL of 0.1M TEAB, and then dispersed in 1.2mL of a solution containing 0.2%NP40 in 0.1M TEAB. These washed beads were added to the samples and incubated at room temperature for 2 hours. After incubation, the beads were centrifuged, the supernatant was discarded, and the beads were washed twice with 600μL of 0.1%NP40 in PBS, three times with PBS, and three times with ddH2O.

[0375] · 300μL of 10mM TCEP was added to the beads, and they were incubated at 37℃ with agitation at 800 rpm for 45 minutes. After incubation, the beads were centrifuged, and 300μL of 10mM iodine acetamide was added. The beads were then incubated at 25℃with agitation at 800 rpm for another 30 minutes. Following this, the beads were centrifuged and washed twice with 200μL of 50mM TEAB.

[0376] · 2ug (4μL) of trypsin in 220μL of 50mM TEAB was added to the beads, which were then placed in a temperature-controlled shaker at 1400 rpm and 37℃ for overnight incubation (16 hours) . After incubation, the beads were centrifuged at 1000g for 1 minute, the supernatant was discarded, and the beads were washed with 600μL of 2M urea in PBS three times, followed by three PBS washes and three water (MS-grade) washes. Then, 100μL of elution buffer (0.1%TFA in 50%acetonitrile-water solution) was added to the beads, and they were incubated at 800 rpm for 10 minutes. This process was repeated twice, and the liquid was combined and collected as the "Site Components. "

[0377] · The site components sample was dried using SpeedVac, then identified using a 2-hour gradient on Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometry after desalting. Briefly, MS1 spectra were acquired at 60-K resolving power with a maximum of 50-ms ion injection time in the Orbitrap. MS2 spectra were acquired by selecting the top ten most abundant features via high-energy collisional induced dissociation (HCD) in the Orbitrap at 15-K resolution using an automatic gain control (AGC) setting of 50 K, a collision energy of 35%, a quadrupole isolation window of 1.2 m / z, and a maximum ion injection time of 22ms.

[0378] · All acquired data were searched against a FASTA-formatted database downloaded from Uniport (Homo sapiens, sp_canonical TaxID=9606, v2023-06-28) using a Sequest HT search engine with parameters including a 10ppm Precursor Mass Tolerance, a 0.02Da Fragment Mass Tolerance, and fully tryptic peptides. Carbamidomethylation of cysteine residues (+57.0214 Da) , oxidation of methionine residues (+15.9949 Da) , and DBA-isoDTB probes on cysteine residues (+728.3970) were set as variable modifications.

[0379] A total of 5717 cysteine residues were labeled by the DBA-isoDTB tag, and 2415 proteins were identified (see FIG. 5D) . Comparing to IAA, approximately half of the sites are DBA-1-sensitive sites (see FIG. 5E) .

[0380] Application Example 6. Chemoproteomics-based competitive ABPP for DBA-DTB.

[0381] · Hela cells were grown in 10 cm dishes until they reached approximately 90% confluence. The culture medium was then removed, and the cells were washed twice with cold PBS. Then, 4 mL of DMEM containing the selected compounds NP-1, NP-2, NP-3, NP-4, FA-1, FA-3 solution in DMSO (generally final probe concentration of 100 μM, but for NP-1 and NP-2 is 50μM) was added, while only DMSO is added to the control group, with two biological replicates per group. The cells were incubated at 37℃ in a CO2 incubator for 60 minutes. After washing the culture dish twice with 2 mL of cold PBS, the cells were collected in a 5 mL centrifuge tube. The dish was again washed twice with 1 mL of cold PBS, and the wash solution was combined with the cell suspension.

[0382] · N ext, 500μL of cold lysis buffer (1× PBS, 0.1%TritonX-100 (v / v) ) was added to the pellet, and the cells were dispersed thoroughly by pipetting. The cells were then sonicated in an ice bath. After centrifugation, the supernatant was collected, and the protein concentration was measured using the BCA method. The protein concentration was adjusted to 2 mg / mL.

[0383] · For all groups, directly add 200 μM DBA-DTB along with 1mM copper sulfate and incubate at room temperature for 1 hour.

[0384] · After the incubation, the samples were transferred to a 15 mL centrifuge tube, and 5 mL of cold methanol was added. The mixture was vortexed and left at -20℃ overnight to precipitate the proteins. The protein pellets were then washed with methanol, and 300μL of 8M urea in 100mM TEAB was added for resuspension, followed by an additional 900μL of 100mM TEAB to achieve a final urea concentration of 2M.

[0385] · The following steps are the same as application example 4.

[0386] All acquired data were searched against a FASTA-formatted database downloaded from Uniport (Homo sapiens, sp_canonical TaxID=9606, v2023-06-28) using a Sequest HT search engine with parameters including a 10ppm Precursor Mass Tolerance, a 0.02Da Fragment Mass Tolerance, and fully tryptic peptides. Carbamidomethylation of cysteine residues (+57.0214 Da) , oxidation of methionine residues (+15.9949 Da) , and DBA-DTB probes on cysteine residues (+393.2132) were set as variable modifications.

[0387] The mass spectrometry results revealed that the probe selectively labeled cysteine residues. A total of 6202 cysteine residues were labeled by the DBA-DTB tag (+393.2132) , and 2973 proteins were identified (see FIG. 6A) . FIG. 6B and 6C are overview of targets and Cys sites of the selected compounds NP-1, NP-2, NP-3, NP-4, FA-1, FA-3.

Claims

1.A compound of Formula (I) : or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof, whereinR1 has a structure of - (CH2) n-X- (CH2) m-Y, where- (CH2) n-is optionally substituted with one or more substituent (s) selected from the group consisting of halo, and -OH;X is selected from the group consisting of -CH2-, -NH-, -O-, -S-, -NHC (O) -, -N (RN) CO-, -C (O) NH-and -CON (RN) -, where RN is selected from the group consisting of C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl;Y is selected from the group consisting of(1) azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl,(2) biotin, desthiobiotin, and a fluorescent group, and(3) a group generated through click reaction of biotin, desthiobiotin, or a fluorescent group with azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, or -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl;n is an integral of 0 to 5; andm is an integral of 1 to 5;R2 is selected from the group consisting of hydrogen, halo, -NO2, -PO (OH) 2, and a structure of -L-R2’, whereL is a bivalent group selected from the group consisting of -CH2-, -NH-, -O-, -C (O) NH-, -NHC (O) -, -SO-and -SO2-, andR2’ is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl.2.The compound according to claim 1, having a Formular of (I’) : or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof.3.A compound of Formula (I’) : or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof, whereinR1 has a structure of - (CH2) n-X- (CH2) m-Y, whereX is selected from the group consisting of -CH2-, -NH-, -O-, -S-, -NHC (O) -, and -C (O) NH-;Y is selected from the group consisting of(1) azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl,(2) biotin, desthiobiotin, and a fluorescent group, and(3) a group generated through click reaction of biotin, desthiobiotin, or a fluorescent group with azide, tetrazine, optionally substituted strained alkenyl, optionally substituted strained alkynyl, or -C≡C-Ra, where Ra is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl;n is an integral of 0 to 5; andm is an integral of 1 to 5;R2 is selected from the group consisting of hydrogen, halo, -NO2, -PO (OH) 2, and a structure of -L-R2’, whereL is a bivalent group selected from the group consisting of -CH2, -NH-, -O-, -C (O) NH-, -NHC (O) -, -SO-and -SO2-, andR2’ is selected from the group consisting of hydrogen, C1-5 alkyl, and C1-5 haloalkyl.4.The compound according to any one of claim 1-3, having a Formular of (Ia) , (Ib) or (Ic) : or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof.5.The compound according to any one of claim 1-4, having a Formular of (Ia1) , (Ia2) or (Ia3) : or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof.6.The compound according to any one of claim 1-5, having a Formular of (Ib1) , (Ib2) or (Ib3) : or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof.7.The compound according to any one of claim 1-6, having a Formular of (Ic1) , (Ic2) or (Ic3) : or a pharmaceutically acceptable salt, or stereoisomer thereof.8.The compound according to any one of claim 1-7, wherein - (CH2) n-is optionally substituted with one or more -OH, preferably is -CH2-, - (CH2) 2-, - (CH2) 3-, or -CH (OH) -CH2-.9.The compound according to any one of claim 1-8, wherein X is selected from the group consisting of -NHC (O) -, -N (CH3) C (O) -, -C (O) NH-and -C (O) N (CH3) -.10.The compound according to any one of claim 1-9, wherein Y is selected from the group consisting of(1) -C≡CH,(2) 11.The compound according to any one of claims 1-10, whereinn is 0, 1, or 2, and / orm is 2, 3, 4, or 5.12.The compound according to any one of claims 1-11, wherein R2 is selected from the group consisting of hydrogen, -OH, and -O-C1-5 alkyl.13.The compound according to any one of claims 1-12, wherein the compound is selected from the following: 14.Use of a compound according to any one of claims 1-13 in labeling protein.15.Use of a compound according to any one of claims 1-13 in preparation of an agent for labeling protein.16.A composition comprising a compound according to any one of claims 1-13, and copper ion.17.The composition according to claim 16, wherein the copper ion is Cu (II) ion.18.The composition according to claim 16 or 17, wherein the copper comes from one or more water-soluble copper salts selected from the group consisting of copper sulfate, copper nitrate, copper chloride, copper phosphate, and copper acetate.19.Use of a composition according to any one of claims 16-18 in labeling protein.20.Use of a composition according to any one of claims 16-18 in preparation of an agent for labeling protein.21.A method for labeling protein, comprising a step of contacting a compound according to any one of claims 1-13 or a composition according to any one of claims 16-18 with the protein.22.The method according to claim 21, wherein the compound selectively modify Cys in presence of copper ion, preferably, Cu (II) ion.23.The method according to claim 21 or 22, wherein the method further comprises a step of enriching, isolating, purifying and / or identifying the labeled protein.24.The method according to claim 21 or 22, wherein the method further comprises a step of detecting a detectable signal emitted by the labeled protein, especially, the detectable signal is a fluorescent signal.

Images