Methods and compositions for ameliorating impairment of regenerative and cognitive function

Abstract

Provided are methods and compositions for ameliorating age-related impairment of regenerative and cognitive function and uses thereof.

Description

METHODS AND COMPOSITIONS FOR AMELIORATING IMPAIRMENT OF REGENERATIVE AND COGNITIVE FUNCTIONFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present disclosure generally relates to methods and compositions for ameliorating impairment of regenerative and cognitive function in the brain.BACKGROUND

[0002] As a healthier survivor against aging, centenarian maintains a better brain and cognitive function than general old subjects. Centenarians can delay or even escape major aging-related diseases and have been taken as research model for healthy aging. For example, centenarians can delay or avoid neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases, cancers, and maintain a better cognitive function. However, the mechanisms of protected neuron system and successful aging remain largely unknown.

[0003] In recent years, blood-borne rejuvenating factors has been suggested to be an efficient anti-aging strategy. For example, administration of a single blood-borne protein is enough to reverse age-related cardiac hypertrophy (Loffredo, F. S. et al., Cell 153, 828-839, ) and skeletal muscle dysfunction (Sinha, M. et al., Science 344, 649-652) , revitalize hippocampal function (Castellano, J. M. et al., Nature 544, 488-492) , and ameliorate cognition ability (Horowitz, A. M. et al., Blood factors transfer beneficial effects of exercise on neurogenesis and cognition to the aged brain. Science 369, 167-173) . Thus, blood has been emphasized to be a source of endogenous anti-aging factors. Nevertheless, whether these circulating protective factors lie in centenarian has never been proved.

[0004] Therefore, needs remain for developing methods of promoting longevity / health span or treating aging-related cognitive declines.SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] In one aspect, the present disclosure provides a method of a) promoting longevity or b) extending health span or c) improving age-related deceleration and rejuvenation in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby promoting longevity or extending health span or improving age-related deceleration and rejuvenation in the subject.

[0006] In one aspect, the present disclosure provides a method of treating an aging-related cognitive disorder or recession in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby treating the aging-related cognitive disorder or recession in the subject.

[0007] In one aspect, the present disclosure provides a method of promoting neurogenesis or improving neuron function in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby promoting neurogenesis or improving neuron function in the subject.

[0008] In one aspect, the present disclosure provides a method of improving learning and / or memory in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby improving learning and / or memory in the subject.

[0009] In one aspect, the present disclosure provides a method of treating anxiety in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby treating anxiety in the subject. In certain embodiments, the anxiety is age-related.

[0010] In one aspect, the present disclosure provides a method of treating depression in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby treating depression in the subject.

[0011] In one aspect, the present disclosure provides a method of treating neuroinflammation or reducing brain’s immune response in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby treating neuroinflammation or reducing brain’s immune response in the subject.

[0012] In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the active agent as defined by the present disclosure.

[0013] In another aspect, the present disclosure provides a method of screening for a compound that increases expression level of Cystatin-M, comprising measuring the expression level of Cystatin-M in cells or tissues treated with the compound and comparing the expression level to a control.

[0014] In another aspect, the present disclosure provides a method of screening for a compound that increases activity of Cystatin-M, comprising measuring the activity of Cystatin-M treated with the compound and comparing the activity to a control.

[0015] In another aspect, the present disclosure provides a method of screening for a compound that increases expression level of ORM, comprising measuring the expression level of ORM in cells or tissues treated with the compound and comparing the expression level to a control.

[0016] In another aspect, the present disclosure provides a method of screening for a compound that increases activity of ORM, comprising measuring the activity of ORM in cells or tissues treated with the compound and comparing the expression level to a control. BRIEF DESCFRIPTION OF THE DRAWINGS

[0017] Figure 1 shows that expression of centenarian-abundant protein CST6. (a) MS-based relative abundance of CST6 protein in serum of LLIs and aged controls (n=119 of LLIs; n=151 of controls) . (b) ELISA quantification of CST6 in blood of centenarians and aged controls (n=19 of centenarians; n=27 of controls) . LLIs, long-lived individuals, was defined as the population whose age is equal or over 90 years old. Student’s t-tests for (a-b) was used; ****P < 0.0001; mean ± s.e.m.

[0018] Figure 2 shows the study design for injection of CST6, and CST6 ameliorated anxiety, improved spatial learning and memory and neurogenesis in aged mice. (a) Study design for injection of CST6 and subsequent behavioral and molecular analysis. Velocity (b) , time (c) and distance (d) of aged mice in center of open field. Percent of time (e) and distance (f) in open arm of elevate plus maze. (g) Spatial learning and memory were assessed by latency to escape hole in Barnes maze within all 4 days. 4 trials were included in every testing day. (h-j) Water maze test was used to assess spatial learning and memory. Escape latency recording time (seconds) spent to reach platform under water during training days (h) . On the testing day, time to reach platform area (i) and times passing platform area (j) after removing platform were recorded. For each experiment, sample number is 16-21 mice per group. Student’s t-tests for (b) , (f) ; Mann Whitney tests for (c-e) , (i-j) ; two-way repeated-measures ANOVA with Bonferroni’s post hoc test for (g) ; two-way ANOVA with Tukey post hoc test for (h) ; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; mean ± s.e.m. Rectangle represents mice injected with rhCST6 and circle represents mice injected with PBS.

[0019] Figure 3 shows CST6 promoted neurogenesis in DG region of aged hippocampus. Representative microscopic fields for different neurogenesis markers are displayed. Quantification of Brdu-positive (a) , Ki67-positive (b) , Dcx-positive (c) and Sox2-positive (d) cells in DG of aged mice (n=15-17 mice / group) . Mann Whitney tests for (a-b) was used; Student’s t-tests for (c-d) was used; *P < 0.05; mean ± s.e.m.

[0020] Figure 4 shows that Orm1 was induced by CST6 in liver and reached hippocampus of brain. (a) Protein tracing analysis of exogenously injected CST6 by immunoblotting against CST6. (b) Differentially abounded proteins after injection of CST6 in the serum (n=3 per group) . (c) Expression pattern of ORM1 gene across different organs (Data and figure were obtained from The Human Protein Atlas) . (d) MS-based relative abundance of Orm1 protein in serum of LLIs and aged controls (n=119 of LLIs; n=151 of controls) . (e) Expression of Orm1 gene in liver after injection of CST6 by qPCR (n=8-10 per group) . Protein abundance of Orm1 in serum (f; n=14 per group) and hippocampus (g; n=6 per group) after injection of rhCST6. (h) Tracing analysis of exogenous injected protein Orm1 by immunoblotting against histidine-labeled Orm1 protein (His tag / Orm1) 3 min after intravenously (i. v. ) injection. Arrow indicates the location of purified Orm1 protein. Student’s t-tests for (b) , (d-e) , (g-h) was used; Mann Whitney tests for (f) was used; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; mean ± s.e.m.

[0021] Figure 5 shows that Orm1 ameliorated anxiety, improved spatial learning and memory and neurogenesis in aged mice. Time (a) and distance (b) that mice spent in center of open field (29-31 mice / group) . Percent of time (c) that mice spent in open arm of elevate plus maze (29-31 mice / group) . (d-f) Spatial learning and memory were assessed by Water maze test (16-20 mice / group) . (d) Escape latency to platform across 6 training days were first recorded. On the testing day, escape latency for reaching (e) and times for passing platform area (f) after removing platform were tested. (g) Orm1 promoted neurogenesis in DG region of aged hippocampus. Representative microscopic fields for different neurogenesis markers are displayed. Quantification of Brdu-positive, Ki67-positive, Dcx-positive and Sox2-positive cells in DG of aged mice (n=8-10 mice / group) . Student’s t-tests for (g) ; Mann Whitney tests for (a-c) , (e-g) was used; two-way ANOVA with Tukey post hoc test for (d) ; *P<0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; mean ± s.e.m. Triangle represents mice injected with Orm1 and circle represents mice injected with PBS.

[0022] Figure 6 shows that knockdown of Orm1 in liver eliminated neuroprotective function of CST6. (a) qPCR analysis of Orm1 in liver tissues 14 days after tail vein injection of shOrm1 or shControl (n=3 mice / group) . (b) ELISA for the concentration of secreted Orm1 in the serum 14 days after liver-specific knockdown of Orm1 (n=3 mice / group) . Open field test data for percentage of time (c) , and percentage of distance (d) of aged mice (n=24-25 mice / group) in the center area. (e–g) The water maze test to assess spatial learning and memory (n=24-25 mice / group) . Escape latency recording time (seconds) spent to reach the platform under water during training days (e) . On the testing day, the time to reach the platform area (f) and times passing the platform area (g) after platform removal were recorded. h, Representative microscopic fields for different neurogenesis markers are displayed. Quantification of Brdu-positive, Ki67-positive, Dcx-positive, and SOX2-positive cells in DG of aged mice (n=10 mice / group) . Student’s t-tests were used for (a) , (d) , (h) ; Mann Whitney tests were used for (b-c) , (f-h) ; two-way ANOVA with Tukey post hoc test was used for (e) ; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; mean ± s.e.m. Rectangles represent mice injected with shControl+CST6; diamonds represent mice injected with shOrm1+CST6 and circles represent mice injected with vehicle in E.

[0023] Figure 7 shows injection of CST6 improved depression of mice (n=7-10 mice / group) . Student’s t-tests were used for statistical test; *P < 0.05, **P < 0.01; mean ± s.e.m.

[0024] Figure 8 shows injection of CST6 does not alter grip strength of aged mice (n=11-15 mice / group) . Student’s t-tests were used for statistical test; ns means not significant; mean ± s.e.m.

[0025] Figure 9 shows that overexpression of CST6 via AAV alleviated anxiety and improved spatial learning and memory in aged mice. All behavioral analyses were conducted in a blinded manner. (a) Open field test results showing the percentage of time and distance spent in the center area by aged mice. (b) Elevated plus maze results showing the percentage of time and distance spent in the open arms. (c) Morris water maze test results assessing spatial learning and memory. Escape latency (time in seconds to reach the platform) was recorded during training days. On the probe day, the escape latency to reach the platform area and the number of platform crossings (after platform removal) were measured. Sample size: n = 12 (AAV-Control) and n =12 (AAV-CST6) mice. Statistical analyses were performed using Student’s t-tests and Mann-Whitney tests for (a) and (b) , and two-way ANOVA with Tukey's post hoc test for (c) . Significance levels: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Data are presented as mean ± s.e.m.

[0026] Figure 10 shows that CST6 and Orm1 alleviated anxiety and enhanced spatial learning and memory in aged mice. All behavioral analyses were conducted in a blinded manner. (a) Open field test results showing the percentage of time spent in the center, percentage of distance traveled in the center, total active time, total travel distance, average speed, rearing duration, and rearing frequency in male aged mice. (b) Elevated plus maze results, including the percentage of time, percentage of distance, and frequency in the open arms. (c) Morris water maze test results assessing spatial learning and memory. Escape latency (time in seconds to reach the platform) was recorded during training days. On the probe day, escape latency to reach the platform area and the number of platform crossings (after platform removal) were measured. Sample sizes: n = 20 (CST6) , 20 (ORM1) , 19 (vehicle) , and 20 (young, 6-month-old) mice. Statistical analyses were performed using Student’s t-tests and Mann-Whitney tests for (a) and (b) , and two-way ANOVA with Tukey's post hoc test for (c) . Significance levels: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Data are presented as mean ± s.e.m.

[0027] Figure 11 shows that knockdown of Orm1 in liver eliminated neuroprotective function of CST6. All behavioral analyses were conducted in a blinded manner. (a) Open field test results showing the percentage of time spent in the center, percentage of distance traveled in the center, total active time, total travel distance, average speed, rearing duration, and rearing frequency in male aged mice. (b) Elevated plus maze results, including the percentage of time, percentage of distance, and frequency in the open arms. (c) Morris water maze test results assessing spatial learning and memory. Escape latency (time in seconds to reach the platform) was recorded during training days. On the probe day, escape latency to reach the platform area and the number of platform crossings (after platform removal) were measured. Sample sizes: n = 20 (shOrm1+CST6) , 20 (shControl+CST6) , 20 (shOrm1+PBS) , and 20 (shControl+PBS) mice. Statistical analyses were performed using Student’s t-tests and Mann-Whitney tests for (a) and (b) , and two-way ANOVA with Tukey's post hoc test for (c) . Significance levels: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001, ****P < 0.0001. Data are presented as mean ± s.e.m.

[0028] Figure 12 shows that CST6 and Orm1 reduced neuroinflammation in aged mice. Quantification of Iba1-positive cells in the dentate gyrus (DG) of aged mice treated with CST6 (a) or Orm1 (b) . n=10 mice / group. Statistical analysis was performed using Student’s t-tests for (a-b) ; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; mean ± s.e.m.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0029] The following description of the disclosure is merely intended to illustrate various embodiments of the disclosure. As such, the specific modifications discussed are not to be construed as limitations on the scope of the disclosure. It will be apparent to a person skilled in the art that various equivalents, changes, and modifications may be made without departing from the scope of the disclosure, and it is understood that such equivalent embodiments are to be included herein. All references cited herein, including publications, patents and patent applications are incorporated herein by reference in their entirety. I. Definitions

[0030] Throughout the present disclosure, the articles “a, ” “an, ” and “the” are used herein to refer to one or to more than one (i.e., to at least one) of the grammatical object of the article. By way of example, “a protein” means one protein or more than one protein.

[0031] In all occurrences in this application where there are a series of recited numerical values, it is to be understood that any of the recited numerical values may be the upper limit or lower limit of a numerical range. It is to be further understood that the invention encompasses all such numerical ranges, i.e., a range having a combination of an upper numerical limit and a lower numerical limit, wherein the numerical value for each of the upper limit and the lower limit can be any numerical value recited herein. Ranges provided herein are understood to include all values within the range. For example, 1-10 is understood to include all of the values 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10, and fractional values as appropriate. Similarly, ranges delimited by “at least” are understood to include the lower value provided and all higher numbers.

[0032] As used herein, “about” is understood to include within three standard deviations of the mean or within standard ranges of tolerance in the specific art. In certain embodiments, about is understood a variation of no more than 0.5.

[0033] The term “including” is used herein to mean, and is used interchangeably with, the phrase “including but not limited to” . Similarly, “such as” is used herein to mean, and is used interchangeably, with the phrase “such as but not limited to” .

[0034] The term such as “comprising” are to be construed as open-ended terms (i.e., meaning “including, but not limited to, ” ) unless otherwise noted.

[0035] The term “or” is used inclusively herein to mean, and is used interchangeably with, the term “and / or, ” unless context clearly indicates otherwise.

[0036] The term “amino acid” as used herein refers to an organic compound containing amine (-NH2) and carboxyl (-COOH) functional groups, along with a side chain specific to each amino acid. The names of amino acids are also represented as standard single letter or three-letter codes in the present disclosure, which are summarized as follows.

[0037] The terms “polypeptide” and “protein” are used interchangeably, and refer to a chain of amino acid residues covalently linked by peptide bonds. Proteins or polypeptide may include moieties other than amino acids (e.g., may be glycoproteins) and / or may be otherwise processed or modified. Those of ordinary skill will further appreciate that a protein can sometimes include more than one polypeptide chain, for example linked by one or more disulfide bonds or associated by other means.

[0038] A “conservative substitution” with reference to amino acid sequence refers to replacing an amino acid residue with a different amino acid residue having a side chain with similar physiochemical properties. For example, conservative substitutions can be made among amino acid residues with hydrophobic side chains (e.g., Met, Ala, Val, Leu, and Ile) , among amino acid residues with neutral hydrophilic side chains (e.g., Cys, Ser, Thr, Asn and Gln) , among amino acid residues with acidic side chains (e.g., Asp, Glu) , among amino acid residues with basic side chains (e.g., His, Lys, and Arg) , or among amino acid residues with aromatic side chains (e.g., Trp, Tyr, and Phe) . As known in the art, conservative substitution usually does not cause significant change in the protein conformational structure, and therefore could retain the biological activity of a protein.

[0039] The term “homologous” as used herein refers to nucleic acid sequences (or its complementary strand) or amino acid sequences that have sequence identity of at least 60% (e.g., at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%) to another sequence when optimally aligned.

[0040] “Percent (%) sequence identity” with respect to amino acid sequence (or nucleic acid sequence) is defined as the percentage of amino acid (or nucleic acid) residues in a candidate sequence that are identical to the amino acid (or nucleic acid) residues in a reference sequence, after aligning the sequences and, if necessary, introducing gaps, to achieve the maximum number of identical amino acids (or nucleic acids) . In other words, percent (%) sequence identity of an amino acid sequence (or nucleic acid sequence) can be calculated by dividing the number of amino acid residues (or bases) that are identical relative to the reference sequence to which it is being compared by the total number of the amino acid residues (or bases) in the candidate sequence or in the reference sequence, whichever is shorter. Conservative substitution of the amino acid residues may or may not be considered as identical residues. Alignment for purposes of determining percent amino acid (or nucleic acid) sequence identity can be achieved, for example, using publicly available tools such as BLASTN, BLASTp (available on the website of U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI) , see also, Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol., 215: 403–410 (1990) ; Stephen F. et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389–3402 (1997) ) , ClustalW2 (available on the website of European Bioinformatics Institute, see also, Higgins D.G. et al., Methods in Enzymology, 266: 383-402 (1996) ; Larkin M.A. et al., Bioinformatics (Oxford, England) , 23 (21) : 2947-8 (2007) ) , and ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. A person skilled in the art may use the default parameters provided by the tool or may customize the parameters as appropriate for the alignment, such as for example, by selecting a suitable algorithm.

[0041] The term “derivative” with respect to a polypeptide or a polynucleotide refers to a chemically modified polypeptide or polynucleotide, in which one or more well-defined number of substituent groups have been covalently attached (e.g., by attachment of a heterologous polypeptide, fatty acid or a compound, or by glycosylation, acetylation, phosphorylation) to one or more specific amino acid residues of the polypeptide or one or more specific nucleotides of the polynucleotide.

[0042] The term “fragment” as used herein refers to partial sequence of the reference polypeptide or polynucleotide of any length. A fragment can still retain at least partial biological activities of the reference polypeptide. The term “functional fragment” as used herein retains at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%or at least 98%biological activities of the reference polypeptide.

[0043] An “isolated” substance has been altered by the hand of man from the natural state. If an “isolated” composition or substance occurs in nature, it has been changed or removed from its original environment, or both. For example, a polynucleotide or a polypeptide naturally present in a living animal is not “isolated, ” but the same polynucleotide or polypeptide is “isolated” if it has been sufficiently separated from the coexisting materials of its natural state so as to exist in a substantially pure state.

[0044] The terms “polynucleotide” or “nucleic acid” or “oligonucleotide” are used interchangeably, and refer to a chain of covalently linked nucleotides. The nucleotides may be deoxyribonucleotides or ribonucleotides, and modified or unmodified independent from one another.

[0045] The term “vector” as used herein refers to a vehicle into which a genetic element may be operably inserted so as to bring about the expression of that genetic element, such as to produce the protein, RNA or DNA encoded by the genetic element, or to replicate the genetic element. A vector may be used to transform, transduce, or transfect a host cell so as to bring about expression of the genetic element it carries within the host cell. Examples of vectors include plasmids, phagemids, cosmids, artificial chromosomes such as yeast artificial chromosome (YAC) , bacterial artificial chromosome (BAC) , or P1-derived artificial chromosome (PAC) , bacteriophages such as lambda phage or M13 phage, and animal viruses. A vector may contain a variety of elements for controlling expression, including promoter sequences, transcription initiation sequences, enhancer sequences, selectable elements, and reporter genes. In addition, the vector may contain an origin of replication. A vector may also include materials to aid in its entry into the cell, including but not limited to a viral particle, a liposome, or a protein coating. A vector can be an expression vector or a cloning vector. The present disclosure provides vectors (e.g., expression vectors) containing the nucleic acid sequence provided herein encoding the interested proteins, at least one promoter (e.g., SV40, CMV, EF-1α) operably linked to the nucleic acid sequence, and at least one selection marker.

[0046] The phrase “host cell” as used herein refers to a cell into which an exogenous polynucleotide and / or a vector can be or has been introduced.

[0047] “Treating” or “treatment” of a disease, disorder or condition as used herein includes preventing or alleviating a disease, disorder or condition, slowing the onset or rate of development of a disease, disorder or condition, reducing the risk of developing a disease, disorder or condition, preventing or delaying the development of symptoms associated with a disease, disorder or condition, reducing or ending symptoms associated with a disease, disorder or condition, generating a complete or partial regression of a disease, disorder or condition, curing a disease, disorder or condition, or some combination thereof. It is understood that treatment does not necessarily refer to a cure or complete ablation of the disease, condition, or symptoms of the disease or condition.

[0048] As used herein, the terms “prevent” , “preventing” , “prevention” , “prophylactic treatment” , and the like, refer to reducing the probability of developing a disease or condition in a subject, who does not have, but is at risk of or susceptible to developing a disease or condition.

[0049] The terms “detecting” refers to the act of either quantitatively or semi-quantitatively determining, testing or measuring, which act may be performed by any conventional means. II. Cystatin M -ORM Axis

[0050] The present disclosure for the first time identified a centenarian-abundant circulating factor Cystatin-M which displays a novel neuroprotective effect. Specifically, the inventors of the present disclosure found that the level of Cystatin-M is significantly higher in long-lived individuals than that in controls. In addition, it is demonstrated by the inventors that administration of recombinant Cystatin-M protein to subjects in need (e.g., aged subjects) can improve neurogenesis, learning, memory functions, and so on.

[0051] Further, it was also surprisingly discovered by the inventors that, although protein tracing analysis shows that Cystatin-M does not directly enter brain, it is enriched in, for example, the liver, and induces expression of a secreted protein Alpha-1-acid glycoprotein (AGP, or Orosomucoid, ORM) . ORM is further found by the inventors to be able to cross blood-brain barrier and enter hippocampus, and to exhibit similar functions as observed after administration of Cystatin-M, including improvement on neurogenesis, learning, memory functions, and so on. In addition, the present inventors found that ORM is necessary for Cystatin-M function, because Cystatin-M can no longer improve anxiety, neurogenesis or learning and / or memory functions in aged subject, when ORM is knocked down.

[0052] Taken together, the present disclosure provides two novel longevity-associated blood-circulating factors (i.e., Cystatin-M and ORM proteins) , and their activity in promoting health span and anti-aging, potentially through Cystatin-M-liver-ORM-blood-brain axis. III. Methods targeting the Cystatin-M -ORM Axis

[0053] In one aspect, the present disclosure provides methods and compositions for promoting longevity / health span or anti-aging, treating an aging-related cognitive disorder or recession, promoting neurogenesis or improving neuron function, improving learning and / or memory, treating anxiety, treating depression, treating neuroinflammation, or reducing brain’s immune response in a subject. In certain embodiments, the methods provided herein comprise administering to the subject an effective amount of active agent that can increase level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject. (i) . Promoting Longevity / health span or Anti-aging

[0054] As used herein, the term “longevity” refers to enhancement or extension of lifespan. Longevity encompasses extension of overall period of life characterized by good health and functional capacity. Longevity also encompasses delay or prevention of age-related decline, diseases, and degenerative conditions, ultimately promoting a longer and healthier life. People with longevity, or long-lived members of a population, have a lifetime longer than the average of the population.

[0055] Delaying aging means endowing an individual with a younger biological age than the chronological age, thus enabling an individual to live longer and promoting longevity / health-span. Anti-aging can also be useful for a subject showing signs of accelerated aging. Accelerated aging occurs when biological age exceeds chronological age and is associated with a high risk of morbidity and mortality, and a reduced life expectancy. In certain embodiments, individuals at risk for or with accelerated aging can be identified whose biological age exceeds their chronological age. Several surrogate measures of biological age have been developed, including telomere length and epigenetic age (see Junning Fan et al., The Lancet, 2020) .

[0056] A telomere is a region of repetitive nucleotide sequences associated with specialized proteins at the ends of linear chromosomes. Telomeres are a widespread genetic feature most commonly found in eukaryotes. Eukaryotic telomeres normally terminate with 3’ single-stranded-DNA overhang ranging from 75 to 300 bases, which is essential for telomere maintenance and capping. Telomere shortening is associated with aging, mortality, and aging-related diseases. Based upon comparison between individuals of different ages, telomere length is negatively associated with the number of cell divisions in germ and tumor cells. This leads to the link between age and telomere length, as one might expect, the older an individual is the more times their cells have replicated their genome and divided. Methods for measuring the telomere length can be found in e.g., U.S. Patent No. US11639521B2.

[0057] DNA methylation (hereinafter, DNAm) exhibits predictable and consistent changes at specific CpG sites (known as differential methylation sites, DMPs) throughout the entire lifecycle. During aging process of a subject, the average methylation level of DMP changes, mainly manifested as an increase (high methylation) or decrease (low methylation) in DNAm at the CpG site. By calculating and extracting the common DMP of individuals throughout their entire life cycle, these algorithms can accurately select several CpG sites that predict actual age, known as “DNAm age” or “epigenetic age” . Detailed descriptions can be found in references such as Steve Horvath et al., Nature Reviews, 2018. Methods for measuring the level DNAm can be found in e.g., US2022 / 0228217A.

[0058] Other quantization methods or biomarkers known in the art can be used for measuring an individual’s biological age.

[0059] In some embodiments, the method of promoting longevity / health span or age-related deceleration and rejuvenation provided herein effectively reduces the subject’s biological age compared with controls with the same chronological age.

[0060] As used herein, the term “health span” is defined as the period in an individual's life during which they are generally healthy, free from serious or chronic illness (such as neurological diseases) , and able to function independently and effectively in daily activities. Health span specifically refers to the duration of time that an individual maintains a high quality of life and physical, mental, and social well-being, not merely the absence of disease. This term encompasses the maintenance of optimal physiological function, cognitive ability, and mobility, as well as resilience to stressors and environmental challenges. Improvement in health span is considered to delay the onset of age-related decline in health and functional capacity, thereby prolonging the period of life spent in a state of good health.

[0061] As used herein, the term “age-related deceleration” refers to intentional slowing of the biological processes and mechanisms underlying aging, which contribute to the progressive decline in physiological function and increased susceptibility to age-associated diseases. Age-related deceleration may include alleviation or mitigation of age-related diseases or symptoms.

[0062] As used herein, the term “rejuvenation” refers to restoration or enhancement of physiological function at the cellular, tissue, or organ levels to a state that is characteristic of a younger biological age. (ii) . Treating An Aging-Related Cognitive Disorder or Recession

[0063] In one aspect, the present disclosure provides methods and compositions for treating an aging-related cognitive disorder or recession in a subject in need thereof. The methods comprise administering to the subject an effective amount of an active agent that can increase level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject.

[0064] Aging is recognized as a significant contributing factor to the onset and progression of cognitive disorders or recession. As individuals age, they often experience a decline in cognitive function, leading to impairments in memory, attention, reasoning, and other cognitive abilities. Aging-related cognitive disorders are disorders that affect the functioning of the brain, and are often associated with memory loss, confusion, anxiety, and general mental deterioration. Cognitive disorders usually result from the loss of brain cells, which leads to the malfunctioning and death of these cells, and as a result, the brain stops functioning properly. The affected person may experience memory loss, loss of control over certain body parts, and general mental deterioration. The incidence of age-related cognitive disorders increases substantially with advancing age.

[0065] The discovery of two novel longevity-associated blood-circulating factors (i.e., Cystatin-M and ORM) in centenarians suggests their potential involvement in the mechanisms that promote healthy aging and protect against cognitive decline. Their presence in individuals who have achieved exceptional longevity suggests that they may possess inherent properties that contribute to the preservation and maintenance of cognitive function. By harnessing the unique properties of the longevity-associated proteins, novel therapeutic approaches may be devised to slow down, prevent, or even reverse cognitive decline associated with aging, and ultimately improve the quality of life for individuals affected by age-related cognitive decline.

[0066] In some embodiments, the aging-related cognitive disorder or recession includes neurodegenerative diseases.

[0067] In some embodiments, the method for treating an aging-related cognitive disorder or recession includes treating a neurodegenerative disease in a subject, including Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, frontotemporal dementia, Huntington’s disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, vascular dementia, and the like.

[0068] The term “Alzheimer’s disease” as used herein is intended to encompass to all forms of and stages of Alzheimer’s disease. Alzheimer's disease is a progressive, degenerative brain disorder that gradually impairs memory, cognitive function, and behavior. There are five stages of Alzheimer's disease, which include preclinical Alzheimer's disease, mild cognitive impairment caused by Alzheimer’s disease, mild dementia resulting from Alzheimer's disease, moderate dementia linked to Alzheimer's disease, and severe dementia associated with Alzheimer’s disease. The term “dementia” is used to refer to a collection of symptoms that significantly impact intellectual and social capabilities, ultimately interfering with daily functioning. In some embodiments, the subject has or suffer from Alzheimer's disease may have the symptoms selected from the group of cognitive deficits including memory impairment, language dysfunction, and visuospatial skills; functional impairment that may span occupational and social issues (e.g., activities of daily living) ; and behavioral symptoms including depression, anxiety, aggression and psychosis may also appear as the disease progresses in severity. (iii) . Promoting Neurogenesis or Improving Neuron Function

[0069] In one aspect, the present disclosure provides methods and compositions for promoting neurogenesis or improving neuron function in a subject in need thereof. The methods comprise administering to the subject an effective amount of an active agent that can increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject.

[0070] As used herein, the term “neurogenesis” refers to the process by which new neurons are generated. The newly generated neurons make connections with existing neurons. Neurogenesis typically involves production of new neurons by neural stem cells (NSCs) . Types of NSCs include neuroepithelial cells (NECs) , radial glial cells (RGCs) , basal progenitors (BPs) , intermediate neuronal precursors (INPs) , subventricular zone astrocytes, and subgranular zone radial astrocytes, among others. Neurogenesis is most active during embryonic development and is responsible for producing all the various types of neurons of the organism, but it continues throughout adult life in a variety of organisms. Once born, neurons do not divide (see mitosis) , and many will live the lifespan of the animal, except under extraordinary and usually pathogenic circumstances. As individuals age, the number of neurons in the brain gradually decreases. At birth, the number of neurons in the brain reaches around 100 billion, but it decreases year by year since the age of 20. Starting at the age of 40, it decreases at a rate of 10000 per day, which in turn affects memory, attention, and sensory abilities. Neurogenesis plays a crucial role in maintaining and improving brain health.

[0071] However, the rate of neurogenesis decreases with advancing age, leading to reduced neuron regeneration and impaired cognitive function. For example, decreased generation of new neurons in the dentate gyrus, a part of the brain involved in neurogenesis, is linked to memory impairments. Furthermore, brain atrophy can be the result of a combination of dendritic degeneration and neuronal death. Although there are individual differences in the rate of brain atrophy during aging, it is believed that brain imaging data can be used to determine the “biological age” of a person’s brain. Therefore, methods for promoting neurogenesis or improving neuron function is significant for promoting healthspan and anti-aging.

[0072] The two novel longevity-associated blood-circulating factors (i.e., Cystatin-M and ORM) discovered to be abundant in centenarians are found to be involved in mechanisms that foster neurogenesis and support optimal neuron function, especially in subjects with an advanced age. In certain embodiments, the two longevity-associated proteins (i.e., Cystatin-M and ORM) may stimulate the generation of new neurons and enhance the functional capabilities of existing neurons, and thus have the potential to improve cognitive abilities, memory retention, learning capacity, and overall brain health.

[0073] Increased neurogenesis can be identified in many ways. For example, increased neurogenesis can be indicated by increase in number of neuron cells expressing neuron cell proliferative markers, neuron stem cell markers, and / or immature / newborn neuron markers, or increased expression level of such markers. In certain embodiments, the neuron cell proliferative markers include Ki67 and Brdu, among others. In certain embodiments, neuron stem cell marker is Sox2, or the like. In certain embodiments, the immature / newborn neuron marker is Dcx, or the like. In certain embodiments, the methods provided herein promote neurogenesis in a brain tissue, such as hippocampal tissue, or more specifically, dentate gyrus (DG) region of the hippocampal tissue, of an adult subject or an aged subject.

[0074] In some embodiments, neurogenesis is increased by at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 150%, at least 200%, at least 250%, at least 300%, or more in a brain tissue (e.g., in the hippocampal tissue, or in the DG region) in the subject, relative to neurogenesis determined prior to administration of the active agent provided herein. (iv) . Improving Learning and / or Memory

[0075] In one aspect, the present disclosure provides methods and compositions for improving learning and / or memory in a subject in need thereof. The methods comprise administering to the subject an effective amount of an active agent that can increase level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject.

[0076] As used herein, the term “memory” refers to the faculty of an individual’s mind by which data or information is encoded, stored, and retrieved when needed. It is the retention of information over time for the purpose of influencing future action. If past events could not be remembered, it would be impossible for language, relationships, or personal identity to develop.

[0077] Methods of measuring a subject’s faculty of memory can be any method known in the art. These methods may include direct tests (also called explicit memory tests) and indirect tests (implicit memory tests) . In some embodiments, the explicit includes Wechsler Memory Scale (WMS) test, Recognition Memory Test (RMT) , Continuous Recognition Memory (CRM) test, Rey Complex Figure (RCF) test, Adult Memory and Information-processing Battery (AMIPB) test, etc.

[0078] In certain embodiments, the subject suffers from or is at high risk for memory loss. Memory loss is usually described as forgetfulness or amnesia. As used herein, the term “memory loss” refers to a measurable or perceivable decline or decrease in the subject’s ability to recall past events, including recent (new) events (short-term memory) or events further back in time (long-term memory) . In some embodiments, the method for improving learning and / or memory in a subject comprises the method of treating memory loss in the subject.

[0079] The root cause of the memory loss is not necessarily critical to the methods of the present invention. The measurable or perceivable ability of the subject to recall past events may be assessed clinically by a health care provider, such as a physician, physician’s assistant, nurse, nurse practitioner, psychologist, psychiatrist, hospice provider, or any other provider that can assess a subject’s memory. The measurable or perceivable ability of the subject to recall past events may be assessed in a less formal, non-clinical manner, including but not limited to the subject himself or herself, acquaintances of the subject, employers of the subject and the like.

[0080] In some embodiments, the memory loss can be age-related, disease-related or injury-related. In some embodiments, memory loss can be associated with certain disease and conditions, such as a neurodegenerative disease, which includes without limitation Alzheimer’s disease (AD) , vascular disease dementia, frontotemporal dementia (FTD) , corticobasal degeneration (CBD) , progressive supranuclear palsy (PSP) , Lewy body dementia, tangle-predominant senile dementia, Pick’s disease (PiD) , argyrophilic grain disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , other motor neuron diseases, Guam parkinsonism-dementia complex, Lytico-Bodig disease, multiple sclerosis, traumatic brain injury (TBI) , and Parkinson's disease, to name a few. In some embodiment, the memory loss is related to amnestic mild cognitive impairment (aMCI) . In some embodiments, the method for improving learning and / or memory provided herein can remedy for memory loss. In some embodiments, the method for improving memory provided herein includes treating forgetfulness or amnesia in a subject. In some embodiments, the method for improving learning and / or memory provided herein can reduce the risk of short-term memory loss. In some embodiment, the method for improving learning and / or memory provided herein can reduce the risk in long-term memory loss.

[0081] In some embodiments, the method for improving learning and / or memory provided herein can be used for treating a subject suffering from a disease-related memory loss (e.g., a neurodegenerative disease) or an injury-related memory loss. In some embodiments, the method for improving learning and / or memory provided herein can be used for preventing a subject from a disease-related memory loss (e.g., a neurodegenerative disease) or an injury-related memory loss, wherein the subject may be in high risk of developing such memory loss. (v) . Treating Anxiety

[0082] In one aspect, the present disclosure provides methods and compositions for treating anxiety in a subject in need thereof. The methods comprise administering to the subject an effective amount of an active agent that can increase level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject.

[0083] As used herein, the term “anxiety” refers to an emotion which is characterized by an unpleasant state of inner turmoil and includes feelings of dread over anticipated events. Anxiety can be experienced with long, drawn-out daily symptoms that reduce quality of life, known as chronic (or generalized) anxiety, or it can be experienced in short spurts with sporadic, stressful panic attacks, known as acute anxiety. Symptoms of anxiety can range in number, intensity, and frequency, depending on the person. Anxiety can induce several psychological pains (e.g., depression) or mental disorders, and may lead to self-harm or suicide. The behavioral effects of anxiety may include changes in sleeping patterns, changes in habits, increase or decrease in food intake, and increased motor tension (such as foot tapping) .

[0084] The physiological symptoms of anxiety may be reflected in different aspects of health, including neurological symptoms, as headache, paresthesias, fasciculations, vertigo, or presyncope; digestive symptoms, as abdominal pain, nausea, diarrhea, indigestion, dry mouth, or bolus; respiratory symptoms, as shortness of breath or sighing breathing; cardiac symptoms, as palpitations, tachycardia, or chest pain; muscular symptoms, as fatigue, tremors, or tetany; cutaneous symptoms, as perspiration, or itchy skin; and urogenital symptoms, as frequent urination, urinary urgency, dyspareunia, or impotence, chronic pelvic pain syndrome. (vi) . Treating Depression

[0085] In one aspect, the present disclosure provides methods and compositions for treating depression in a subject in need thereof. The methods comprise administering to the subject an effective amount of an active agent that can increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject.

[0086] As used herein, the term “depression” refers to a clinical disorder that includes a predominantly sad or depressed mood and is accompanied by psychological and / or physical symptoms, optionally presenting as a depressive or anxiety-related disorder.

[0087] The depression may be mild depression, moderate depression, severe depression, clinical depression or postpartum depression. Exemplary depressive and anxiety-related disorders include, but are not limited to, major depressive disorder, dysthymic disorder, seasonal affective disorder, mood disorder, mixed anxiety-depressive disorder, bipolar disorder, generalized anxiety disorder, and post traumatic stress disorder, each of which are contemplated to be treated using the methods and compositions described herein. Symptoms of depression and anxiety-related disorders that may be inhibited or alleviated include irritability, mood swings, depressed mood, disturbed sleep, listlessness, short term memory loss, anxiousness, restlessness, tension, poor self esteem, suicidal thoughts or suicidal tendencies. (vii) . Treating Neuroinflammation or Reducing Brain’s Immune Response

[0088] In one aspect, the present disclosure provides methods and compositions for treating neuroinflammation or reducing brain’s immune response. The methods comprise administering to the subject an effective amount of an active agent that can increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject.

[0089] As used herein, the term “neuroinflammation” refers to an inflammatory response within the central nervous system (CNS) (e.g., brain and / or spinal cord) and can be characterized by a host of cellular and molecular changes within the brain or central nervous system (e.g., production of one or more of cytokines, chemokines, reactive oxygen species, and secondary messengers) . In some embodiments, neuroinflammation can be a chronic inflammation that is caused by toxic metabolites, autoimmunity, aging, microbes, viruses, traumatic brain injury, or spinal cord injury. In some embodiments, neuroinflammation can be an acute inflammation. In some embodiments, the neuroinflammation of the present disclosure is directed to inflammation of the brain.

[0090] Neuroinflammation is a response of the immune system of the CNS that is associated with many disorders, including lysosomal storage diseases, Alzheimer’s disease, Dementia with Lewy bodies, Parkinson’s disease, Huntington’s disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) , stroke, multiple sclerosis, spinal cord injury, traumatic brain injury, CNS vasculitis, infection of the brain or central nervous system, brain tumors, fibromyalgia, acute disseminated encephalomyelitis (ADEM) , acute optic neuritis (AON) , transverse myelitis, or neuromyelitis optica (NMO) .

[0091] Neuroinflammation may be mediated by the production of cytokines, chemokines, reactive oxygen species (ROS) , and / or secondary messengers (e.g., nitric oxide (NO) , prostaglandins) . These mediators are produced by resident CNS glia (microglia and astrocytes) , endothelial cells, and peripherally derived immune cells. Although transient, controlled inflammation may be beneficial to the CNS for injury-induced remodeling and training of innate immune cells for a neuro-protective phenotype, chronic, uncontrolled inflammation of the CNS may be detrimental.

[0092] In some embodiments, neuroinflammation is characterized by increased production of cytokines (e.g., IL-1β, IL-6, tumor necrosis factor alpha) , chemokines (e.g., CCL2, CCL5, CXCL1) , ROS, secondary messengers (e.g., NO, prostaglandins) , inducible nitric oxide synthase, and / or other inflammatory mediators. In some embodiments, neuroinflammation is characterized by an increased level of immune cells in CNS, such as microglia. In some embodiments, microglia marker Iba1 is used to evaluate whether neuroinflammation is treated, reduced or ameliorated in a subject. IV. Active Agents Used in the Methods

[0093] In certain embodiments, the methods provided herein comprise administering to the subject an effective amount of active agent that can increase level or activity of Cystatin-M or ORM. (i) . Cystatin-M protein

[0094] As used herein, the terms “Cystatin-M” , “Cystatin M” , “Cystatin-E” , “Cysteine Proteinase Inhibitor” , “Cystatin-6” , “Cystatin 6” , “CST6” , “ECTD15” , “Cystatin M / E” and “Cystatin E / M” can be used interchangeably, which refer to CST6 gene and CST6 gene products such as mRNA of CST6 gene and protein encoded by CST6 gene.

[0095] The cystatin superfamily encompasses proteins that contain multiple cystatin-like sequences. Some of the members are active cysteine protease inhibitors. There are three inhibitory families in the superfamily, including the type 1 cystatins (stefins) , type 2 cystatins and the kininogens. The type 2 cystatin proteins are a class of cysteine proteinase inhibitors found in a variety of human fluids and secretions, where they appear to provide protective functions. The CST6 gene encodes a cystatin from the type 2 family.

[0096] The encoded protein Cystatin-M provides regulatory and protective functions against uncontrolled proteolysis by cysteine proteases. Although most cystatins are ubiquitously expressed, high levels of cystatin-M expression are mainly restricted to the epithelia of the skin (e.g., epidermis, hair follicles, sebaceous glands, and sweat glands) and to a few extracutaneous tissues. The identification of its physiological targets and the localization of these proteases in skin have suggested a regulatory role for cystatin-M in epidermal differentiation.

[0097] In some embodiments, the Cystatin-M is human Cystatin-M. Exemplary sequence of the human CST6 gene is available as the Gene ID of 1474 in NCBI database. Exemplary sequence of the human Cystatin-M protein is available as NCBI accession code NP_001314.1 in NCBI database (the sequence is incorporated herein as SEQ ID NO: 1, wherein the signal peptide portion is bold and underlined) .

[0098] In some other embodiments, the Cystatin-M is a non-human Cystatin-M or orthologs of human Cystatin-M, such as cystatin E / M in house mouse or Rhesus monkey. In some embodiments, the Cystatin-M is from Mus musculus. In certain embodiments, the CST6 gene has the Gene ID of 73720 in NCBI database. In certain embodiments, the Cystatin-M protein has NCBI accession code NP_082899.1 (the sequence is incorporated herein as SEQ ID NO: 9, wherein the signal peptide portion is bold and underlined) . In some embodiments, the Cystatin-M is from Macaca mulatta. In certain embodiments, the CST6 gene has the Gene ID of 714999 in NCBI database. In certain embodiments, the Cystatin-M protein has NCBI accession code XP_014969146.1 (the sequence is incorporated herein as SEQ ID NO: 10, wherein the signal peptide portion is bold and underlined) . (ii) . ORM proteins

[0099] ORM proteins are a class of secreted proteins that belong to the acute phase reactants. This family has two subtypes in humans, human ORM1 and human ORM2. ORM1 is mainly expressed in liver, and sometimes in adipocytes as an adipocyte factor, it has been proven to protect adipose tissue from excessive inflammation. Studies have shown that mice lacking ORM1 have increased fat mass and weight. The ORM gene family also has three subtypes in mouse, including mouse ORM1, mouse ORM2 and mouse ORM3.

[0100] As used herein, the term “ORM1 protein” refers to a protein short for alpha-1-acid glycoprotein 1 encoded by ORM1 gene. In the present disclosure, the ORM1 protein can be derived from various sources including human or non-human animals. As used herein, “human ORM1 protein” and “human ORM1 gene” refer to ORM1 protein and ORM1 gene derived from human, respectively. As used herein, “mouse ORM1 protein” and “mouse ORM1 gene” refer to ORM1 protein and ORM1 gene derived from mouse, respectively.

[0101] The ORM1 gene encodes a key acute phase plasma protein. Because of its increase due to acute inflammation, the ORM1 protein is classified as an acute-phase reactant. The specific function of this protein has not yet been determined. However, it is believed to be involved in aspects of immunosuppression.

[0102] In the present disclosure, it is provided that ORM1 plays an important role in promoting healthspan or anti-aging in a subject. ORM1 is a liver-specific expressed, and the ORM1 protein will be secreted to blood after translation. It is provided herein that the mRNA expression of ORM1 is found to be increased specifically in liver, while the protein abundance of ORM1 was elevated in blood and surprisingly also in hippocampus after the exogenous injection of Cystatin-M. In addition, direct injection of ORM1 protein to blood also results in promoting health span or anti-aging in a subject.

[0103] In some embodiments, the ORM1 protein is derived from human ORM1. In certain embodiments, the human ORM1 gene has the Gene ID of 5004 in NCBI database. In certain embodiments, the human ORM1 protein has NCBI accession code NP_000598.2 (the sequence is incorporated herein as SEQ ID NO: 2, wherein the signal peptide portion is bold and underlined) .

[0104] In some embodiments, the ORM1 protein is derived from mouse ORM1 protein. In certain embodiments, the mouse ORM1 gene has the Gene ID of 18405 in NCBI database. In certain embodiments, the mouse ORM1 protein has NCBI accession code NP_032794.1 (the sequence is incorporated herein as SEQ ID NO: 4, wherein the signal peptide portion is bold and underlined) .

[0105] In some embodiments, human ORM1 comprises a sequence of SEQ ID NO: 2, or a sequence having at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, mouse ORM1 comprises a sequence of SEQ ID NO: 4, or a sequence having at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 4.

[0106] Other subtypes of ORM family also have similar behavior in the Cystatin-M –ORM1 axis, due to their high homology in sequences.

[0107] In certain embodiments, the human ORM2 gene has the Gene ID of 5005 in NCBI database. In certain embodiments, the human ORM2 protein has NCBI accession code NP_000599.1 (the sequence is incorporated herein as SEQ ID NO: 3, wherein the signal peptide portion is bold and underlined) . In some embodiments, human ORM2 comprises a sequence of SEQ ID NO: 3, or a sequence having at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 3.

[0108] In certain embodiments, the mouse ORM2 gene has the Gene ID of 18406 in NCBI database. In certain embodiments, the mouse ORM2 protein has NCBI accession code NP_035146.1 (the sequence is incorporated herein as SEQ ID NO: 5, wherein the signal peptide portion is bold and underlined) . In some embodiments, mouse ORM2 comprises a sequence of SEQ ID NO: 5, or a sequence having at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 5.

[0109] In certain embodiments, the mouse ORM3 gene has the Gene ID of 18407 in NCBI database. In certain embodiments, the mouse ORM3 protein has UniprotKB ID: Q63805 (the sequence is incorporated herein as SEQ ID NO: 6, wherein the signal peptide portion is bold and underlined) . In some embodiments, mouse ORM3 comprises a sequence of SEQ ID NO: 6, or a sequence having at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 6. (iii) . Active Agents

[0110] The active agent provided herein increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject.

[0111] In some embodiments, the active agent comprises a protein, a derivative of the protein, a polynucleotide encoding the protein, or a vector comprising the polynucleotide.

[0112] In some embodiments, the active agent comprises a protein comprising a) Cystatin-M, b) an analog of Cystatin-M, or c) a functional fragment thereof. In some embodiments, the active agent comprises a derivative of the protein, a polynucleotide encoding the protein, or a vector comprising the polynucleotide.

[0113] In some embodiments, the active agent comprises a protein comprising a) ORM protein, b) an analog of ORM protein, or c) a functional fragment thereof. a derivative of the protein, a polynucleotide encoding the protein, or a vector comprising the polynucleotide.

[0114] In some embodiments, the active agent can comprise a chemical compound, a nutrient composition, an encoding or non-encoding nucleic acid or a protein that can: 1) promotes endogenous expression of Cystatin-M, and / or ORM proteins (e.g., ORM1, ORM2 and / or ORM3) ; 2) reduces degradation or inactivation of Cystatin-M, ORM proteins (e.g., ORM1, ORM2 and / or ORM3) ; 3) increases activity of endogenous Cystatin-M, ORM proteins (e.g., ORM1, ORM2 and / or ORM3) , 4) increases blood level of Cystatin-M or promotes biodistribution of Cystatin-M in liver; 5) promotes expression and / or secretion of Orm1 or Orm2 in liver; and / or 6) promotes biodistribution of Orm1 or Orm2 into brain.

[0115] In some embodiments, the active agent comprises a chemical compound, an encoding or non-encoding nucleic acid or a protein that increases blood level of Cystatin-M or promotes biodistribution of Cystatin-M in an organ of interest, such as liver. Such active agents can be identified by a skilled person in the art, for example, by a suitable screening assay. For example, the candidate for the active agent can be administered to a test animal (e.g., a mouse) , followed by testing of its ability to increase level of Cystatin M in the blood and / or in the organ of interest, such as liver, of the test animal.

[0116] In some embodiments, the active agent comprises a chemical compound, an encoding or non-encoding nucleic acid or a protein that promotes expression and / or secretion of ORM proteins (e.g., ORM1, ORM2 and / or ORM3) in an argan of interest, such as liver. Such active agents can be identified by a skilled person in the art, for example, by a suitable screening assay. For example, the candidate for the active agent can be administered to a test animal (e.g., a mouse) , followed by testing of its ability to increase level of ORM proteins (e.g., ORM1, ORM2 and / or ORM3) in the blood and / or in the organ of interest, such as liver, of the test animal.

[0117] In some embodiments, the active agent comprises a chemical compound, an encoding or non-encoding nucleic acid or a protein that promotes biodistribution of ORM proteins (e.g., ORM1, ORM2 and / or ORM3) into brain. Such active agents can be identified by a skilled person in the art, for example, by a suitable screening assay. For example, the candidate for the active agent can be administered to a test animal (e.g., a mouse) , followed by testing of its ability to increase level of ORM proteins (e.g., ORM1, ORM2 and / or ORM3) in the blood and / or to promote biodistribution of ORM proteins (e.g., ORM1, ORM2 and / or ORM3) in the brain.(a) Active Agent: Cystatin-M Proteins

[0118] In some embodiments, the active agent comprises a protein comprising a) Cystatin-M, b) an analog of Cystatin-M, or c) a functional fragment thereof, a derivative of the protein, a polynucleotide encoding the protein, or a vector comprising the polynucleotide.

[0119] In some embodiments, the active agent comprises Cystatin-M. In some embodiments, the active agent comprises human Cystatin-M. In some embodiments, the human Cystatin-M has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the active agent comprises a recombinant Cystatin-M protein, optionally a recombinant human Cystatin-M protein. A “rhCystatin-M protein” or a “rhCST6” as used herein refers to recombinant human Cystatin-M protein. In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

[0120] In some embodiments, the active agent comprises an analog of Cystatin-M. In some embodiments, the active agent comprises an analog of human Cystatin-M. In some embodiments, the analog of the Cystatin-M has at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 1, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 1.

[0121] In some embodiments, the active agent comprises a functional fragment of Cystatin-M or of Cystatin-M analog. In some embodiments, the functional fragment of Cystatin-M retains partial or full activity of Cystatin-M. In some embodiments, the functional fragment of Cystatin-M retains at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%or at least 100%activity of Cystatin-M. In some embodiments, the functional fragment of Cystatin-M comprises at least a QLVAG motif. In some embodiments, the functional fragment has a length of at least 30, at least 40, at least 50, at least 60, at least 70, at least 80, at least 90, at least 100, at least 110, at least 120, at least 130 or at least 140 amino acid residues of SEQ ID NO: 1, and comprises a QLVAG (SEQ ID NO: 7) motif.

[0122] In some embodiments, the functional fragment of Cystatin-M is a mature Cystatin-M without the signal peptide. The term “signal peptide” (also known as “signal sequence” , “leader peptide” or “leader sequence” ) refers to a peptide or sequence of amino acid residues located at the N terminus of a polypeptide that facilitates secretion of a polypeptide from a mammalian cell. A leader sequence may be cleaved upon export of the polypeptide from the mammalian cell, forming a mature protein. Leader sequences may be natural or synthetic, and they may be heterologous or homologous to the protein to which they are attached. Without being restricted to any specific theory, it is anticipated that a protein, whether or not it contains a signal peptide, would exhibit the same or similar activity, considering the role of the signal peptide. This expectation is based on the fact that signal peptides are typically cleaved and removed during protein maturation, and do not participate in the final functional conformation of the protein. Therefore, while the signal peptide plays an important role in protein secretion, it is expected that a protein with or without the signal peptide would exhibit no significant difference in functionality.

[0123] Signal peptides direct secretion of a protein, such as from a eukaryotic host into which the expression vector is transformed. Signal peptides are typically characterized by a core of hydrophobic amino acids which are generally cleaved from the mature protein during secretion in one or more cleavage events. Thus, the invention pertains to the described Cystatin-M proteins having a signal sequence, as well as to Cystatin-M proteins from which the signal sequence has been proteolytically cleaved (i.e., the cleavage products) .

[0124] For example, in some embodiments, the active agent comprises human Cystatin-M having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 (i.e., SEQ ID NO: 1 without signal peptide) . In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the active agent comprises or consists of an analog of human Cystatin-M having at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 11, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 11.

[0125] For another example, in some embodiments, the active agent comprises mouse Cystatin-M having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 (i.e., SEQ ID NO: 9 without signal peptide) . In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the active agent comprises or consists of an analog of mouse Cystatin-M having at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 12, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 12.

[0126] For yet another example, in some embodiments, the active agent comprises Macaca mulatta Cystatin-M having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 (i.e., SEQ ID NO: 10 without signal peptide) . In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. In some embodiments, the active agent comprises or consists of an analog of Macaca mulatta Cystatin-M having at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 13, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 13. (b) Active Agent: ORM Proteins

[0127] In some embodiments, the active agent comprises a protein comprising a) ORM protein, b) an analog of ORM protein, or c) a functional fragment thereof, a derivative of the protein, a polynucleotide encoding the protein, or a vector comprising the polynucleotide.

[0128] In some embodiments, the active agent comprises ORM1 protein, an analog of ORM1 protein, or a functional fragment thereof.

[0129] In some embodiments, the ORM1 is human ORM1. In some embodiments, the human ORM1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

[0130] In some embodiments, the active agent comprises an analog of ORM1. In some embodiments, the active agent comprises an analog of human ORM1. In some embodiments, the analog of the ORM1 has at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 2, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2.

[0131] In some embodiments, the active agent comprises a functional fragment of human ORM1 or of human ORM1 analog. In some embodiments, the functional fragment of human ORM1 retains partial or full activity of human ORM1. In some embodiments, the functional fragment of human ORM1 retains at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%or at least 100%activity of human ORM1. In some embodiments, the functional fragment has a length of at least 30, at least 40, at least 50, at least 60, at least 70, at least 80, at least 90, at least 100, at least 110, at least 120, at least 130, at least 140, at least 150, at least 160, at least 170, at least 180 or at least 190 amino acid residues of SEQ ID NO: 2 and comprises a NGT (SEQ ID NO: 8) motif.

[0132] In some embodiments, the functional fragment of ORM1 is a mature ORM1 without the signal peptide. For example, in some embodiments, the active agent comprises human ORM1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (i.e., SEQ ID NO: 2 without signal peptide) . In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the active agent comprises or consists of an analog of human ORM1 having at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 14, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 14.

[0133] In some embodiments, the ORM1 is mouse ORM1. In some embodiments, the mouse ORM1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

[0134] In some embodiments, the active agent comprises an analog of mouse ORM1. In some embodiments, the active agent comprises an analog of mouse ORM1. In some embodiments, the analog of the mouse ORM1 has at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 4, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 4.

[0135] In some embodiments, the functional fragment of mouse ORM1 retains partial or full activity of mouse ORM1. In some embodiments, the functional fragment of mouse ORM1 retains at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%or at least 100%activity of mouse ORM1. In some embodiments, the functional fragment has a length of at least 30, at least 40, at least 50, at least 60, at least 70, at least 80, at least 90, at least 100, at least 110, at least 120, at least 130, at least 140, at least 150, at least 160, at least 170, at least 180, at least 190 or at least 200 amino acid residues of SEQ ID NO: 4 and comprises a NGT (SEQ ID NO: 8) motif.

[0136] In some embodiments, the functional fragment of ORM1 is a mature mouse ORM1 without the signal peptide. For example, in some embodiments, the active agent comprises mouse ORM1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 (i.e., SEQ ID NO: 4 without signal peptide) . In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. In some embodiments, the active agent comprises or consists of an analog of mouse ORM1 having at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 16, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 16.

[0137] In some embodiments, the active agent comprises a) ORM2, b) an analog of ORM2, or a functional fragment thereof.

[0138] In some embodiments, the ORM2 is human ORM2. In some embodiments, the human ORM2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

[0139] In some embodiments, the active agent comprises an analog of ORM2. In some embodiments, the active agent comprises an analog of human ORM2. In some embodiments, the analog of the ORM1 has at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 3, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 3.

[0140] In some embodiments, the active agent comprises a functional fragment of human ORM2 or of human ORM2 analog. In some embodiments, the functional fragment of human ORM2 retains partial or full activity of human ORM2. In some embodiments, the functional fragment of human ORM2 retains at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%or at least 100%activity of human ORM2. In some embodiments, the functional fragment has a length of at least 30, at least 40, at least 50, at least 60, at least 70, at least 80, at least 90, at least 100, at least 110, at least 120, at least 130, at least 140, at least 150, at least 160, at least 170, at least 180 or at least 190 amino acid residues of SEQ ID NO: 3 and comprises a NGT (SEQ ID NO: 8) motif.

[0141] In some embodiments, the functional fragment of human ORM2 is a mature human ORM2 without the signal peptide. For example, in some embodiments, the active agent comprises human ORM2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 (i.e., SEQ ID NO: 3 without signal peptide) . In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. In some embodiments, the active agent comprises or consists of an analog of human ORM2 having at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 15, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 15.

[0142] In some embodiments, the ORM2 is mouse ORM2. In some embodiments, the mouse ORM2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.

[0143] In some embodiments, the active agent comprises an analog of mouse ORM2. In some embodiments, the analog of the mouse ORM2 has at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 5, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 5.

[0144] In some embodiments, the active agent comprises a functional fragment of mouse ORM2 or of mouse ORM2 analog. In some embodiments, the functional fragment of mouse ORM2 retains partial or full activity of mouse ORM2. In some embodiments, the functional fragment of mouse ORM2 retains at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%or at least 100%activity of mouse ORM2. In some embodiments, the functional fragment has a length of at least 30, at least 40, at least 50, at least 60, at least 70, at least 80, at least 90, at least 100, at least 110, at least 120, at least 130, at least 140, at least 150, at least 160, at least 170, at least 180, at least 190 or at least 200 amino acid residues of SEQ ID NO: 5 and comprises a NGT (SEQ ID NO: 8) motif.

[0145] In some embodiments, the functional fragment of mouse ORM2 is a mature mouse ORM2 without the signal peptide. For example, in some embodiments, the active agent comprises mouse ORM2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 (i.e., SEQ ID NO: 5 without signal peptide) . In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the active agent comprises or consists of an analog of mouse ORM2 having at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 17, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 17.

[0146] In some embodiments, the active agent comprises a) ORM3, b) an analog of ORM3, or a functional fragment thereof.

[0147] In some embodiments, the ORM3 is mouse ORM3. In some embodiments, the mouse ORM3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

[0148] In some embodiments, the active agent comprises an analog of mouse ORM3. In some embodiments, the analog of the mouse ORM3 has at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 6, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 6.

[0149] In some embodiments, the active agent comprises a functional fragment of mouse ORM3 or of mouse ORM3 analog. In some embodiments, the functional fragment of mouse ORM3 retains partial or full activity of mouse ORM3. In some embodiments, the functional fragment of mouse ORM3 retains at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%or at least 100%activity of mouse ORM3. In some embodiments, the functional fragment has a length of at least 30, at least 40, at least 50, at least 60, at least 70, at least 80, at least 90, at least 100, at least 110, at least 120, at least 130, at least 140, at least 150, at least 160, at least 170, at least 180, at least 190 or at least 200 amino acid residues of SEQ ID NO: 6 and comprises a NGT (SEQ ID NO: 8) motif.

[0150] In some embodiments, the functional fragment of mouse ORM3 is a mature mouse ORM3 without the signal peptide. For example, in some embodiments, the active agent comprises mouse ORM3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 (i.e., SEQ ID NO: 6 without signal peptide) . In some embodiments, the active agent consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the active agent comprises or consists of an analog of mouse ORM3 having at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 18, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 18. (c) Polynucleotides encoding the proteins

[0151] In some embodiments, the active agent is a polynucleotide encoding the protein comprising a) Cystatin-M, b) an analog of Cystatin-M, or c) a functional fragment thereof, as provided herein.

[0152] In some embodiments, the active agent is a polynucleotide encoding the protein comprising a) ORM protein, b) an analog of ORM protein, or c) a functional fragment thereof, as provided herein.

[0153] In some embodiments, the polynucleotide comprises DNA or RNA (mRNA) . In some embodiments, the active agent is a vector comprising the polynucleotide disclosed herein. In some embodiments, the vector is a viral vector or a non-viral vector. In some embodiments, the vector is an adeno-associated virus (AAV) .

[0154] In some embodiments, the polynucleotide is an isolated polynucleotide that encodes the targeted proteins (e.g., Cystatin-M and / or ORM) provided herein. Unless otherwise indicated, a particular polynucleotide sequence also implicitly encompasses conservatively modified variants thereof (e.g., degenerate codon substitutions) , alleles, orthologs, SNPs, and complementary sequences as well as the sequence explicitly indicated. Specifically, degenerate codon substitutions may be achieved by generating sequences in which the third position of one or more selected (or all) codons is substituted with mixed-base and / or deoxyinosine residues (see Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991) ; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985) ; and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994) ) .

[0155] In some embodiments, the polynucleotides encoding the proteins is readily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., by using oligonucleotide probes that are capable of binding specifically to genes encoding the proteins) . In some other embodiments, the encoding polynucleotides may also be obtained by synthetic methods.

[0156] The isolated polynucleotide that encodes the targeted proteins (e.g., Cystatin-M and / or ORM) can be inserted into a vector for further cloning (amplification of the DNA) or for expression, using recombinant techniques known in the art. Many vectors are available. The vector components generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter (e.g., SV40, CMV, EF-1α) , and a transcription termination sequence.

[0157] Examples of vectors include, but are not limited to, retrovirus (including lentivirus) , adenovirus, adeno-associated virus, herpesvirus (e.g., herpes simplex virus) , poxvirus, baculovirus, papillomavirus, papovavirus (e.g., SV40) , lambda phage, and M13 phage, plasmid pcDNA3.3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT. RTM., pCDM8, pCDNA1.1 / amp, pcDNA3.1, pRc / RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos etc. V. Subjects

[0158] The term “subject” includes human and non-human animals. Non-human animals include all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as non-human primates, mice, rats, cats, rabbits, sheep, dogs, cows, chickens, amphibians, and reptiles. Except when noted, the terms “patient” or “subject” are used herein interchangeably. In certain embodiments, the subject is human. In some embodiments, the subject is a non-human primate.

[0159] In some embodiments, the subject is an adult, adult of middle-age, or elderly. In some embodiments, the subject is at an age of above 40, above 50, or above 60 years old.

[0160] In some embodiments, the subject is experiencing or suffering from, or has been determined to be at a risk for, an aging-related cognitive disorder or recession. In some embodiments, the subject is experiencing a decrease in neuron number or impaired neuron function. In some embodiments, the subject is suffering from severe loss of memory. In some embodiments, the subject is suffering from anxiety. In some embodiments, the subject can be a healthy individual who desires a longer or healthier lifetime.

[0161] In some embodiments, the subject has been determined to be at risk for cognitive disorder or recession. In some embodiments, the subject has an aging-related condition or disorder having characteristics in reduced cognition. In some embodiments, the subject has reduced neuron function. In some embodiments, the subject has severe anxiety. In some embodiments, the subject has poor learning and / or memory abilities.

[0162] In some embodiments, the condition can be inherited or acquired. In some embodiments, the aging-related cognitive disorder or recession involves aging-related cognitive impairment and / or physiological impairment. In some embodiments, the aging-related cognitive disorder or recession is neurodegenerative diseases. In some embodiments, the neurodegenerative diseases are Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, frontotemporal dementia, Huntington’s disease, or vascular dementia.

[0163] In some embodiments, the subject is experiencing or suffering from, or has been determined to be at a risk for depression, which may be mild depression, moderate depression, severe depression, clinical depression or postpartum depression. In such embodiments, the subject is not limited to an adult or elderly but can be a mammal of all ages.

[0164] In some embodiments, the subject is experiencing or suffering from, or has been determined to be at a risk for neuroinflammation, which may be chronic neuroinflammation or acute neuroinflammation. In such embodiments, the subject is not limited to an adult or elderly but can be a mammal of all ages. VI. Recombinant Methods

[0165] The present disclosure also provides a method of expressing the active agents (e.g., Cystatin-M and / or ORM) provided herein, comprising culturing the host cell provided herein under the condition at which the vector of the present disclosure is expressed.

[0166] Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors herein are the prokaryote, yeast, or higher eukaryote cells described above. Suitable prokaryotes for this purpose include eubacteria, such as Gram-negative or Gram-positive organisms, for example, Enterobacteriaceae such as Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans, and Shigella, as well as Bacilli such as B. subtilis and B. licheniformis, Pseudomonas such as P. aeruginosa, and Streptomyces.

[0167] In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for the interested proteins encoding vectors. Saccharomyces cerevisiae, or common baker’s yeast, is the most commonly used among lower eukaryotic host microorganisms. However, a number of other genera, species, and strains are commonly available and useful herein, such as Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces hosts such as, e.g. K. lactis, K. fragilis (ATCC 12, 424) , K. bulgaricus (ATCC 16, 045) , K. wickeramii (ATCC 24, 178) , K. waltii (ATCC 56, 500) , K. drosophilarum (ATCC 36, 906) , K. thermotolerans, and K. marxianus; yarrowia (EP 402, 226) ; Pichia pastoris (EP 183, 070) ; Candida; Trichoderma reesia (EP 244, 234) ; Neurospora crassa; Schwanniomyces such as Schwanniomyces occidentalis; and filamentous fungi such as, e.g. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, and Aspergillus hosts such as A. nidulans and A. niger.

[0168] Suitable host cells for the expression of the interested proteins provided herein are derived from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculoviral strains and variants and corresponding permissive insect host cells from hosts such as Spodoptera frugiperda (caterpillar) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (fruiffly) , and Bombyx mori have been identified. A variety of viral strains for transfection are publicly available, e.g., the L-1 variant of Autographa californica NPV and the Bm-5 strain of Bombyx mori NPV, and such viruses may be used as the virus herein according to the present invention, particularly for transfection of Spodoptera frugiperda cells. Plant cell cultures of cotton, corn, potato, soybean, petunia, tomato, and tobacco can also be utilized as hosts.

[0169] However, interest has been greatest in vertebrate cells, and propagation of vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a routine procedure. Examples of useful mammalian host cell lines are monkey kidney CV1 line transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; human embryonic kidney line (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977) ) ; baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10) ; Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980) ) ; mouse sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980) ) ; monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70) ; African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2) ; canine kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34) ; buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; human lung cells (W138, ATCC CCL 75) ; human liver cells (Hep G2, HB 8065) ; mouse mammary tumor (MMT 060562, ATCC CCL51) ; TRI cells (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982) ) ; MRC 5 cells; FS4 cells; and a human hepatoma line (Hep G2) . In some embodiments, the host cell is a mammalian cultured cell line, such as CHO, BHK, NS0, 293 and their derivatives.

[0170] Host cells are transformed with the above-described expression or cloning vectors for protein production and cultured in conventional nutrient media modified as appropriate for inducing promoters, selecting transformants, or amplifying the genes encoding the desired sequences. In another embodiment, the protein may be produced by homologous recombination known in the art. In certain embodiments, the host cell is capable of producing the proteins provided herein.

[0171] The host cells used to produce the targeted proteins (e.g., Cystatin-M and / or ORM) provided herein may be cultured in a variety of media. Commercially available media such as Ham’s F10 (Sigma) , Minimal Essential Medium (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , and Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) , Sigma) are suitable for culturing the host cells. In addition, any of the media described in Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979) , Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980) , U.S. Pat. No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; or 5,122,469; WO 90 / 03430; WO 87 / 00195; or U.S. Pat. Re. 30, 985 may be used as culture media for the host cells. Any of these media may be supplemented as necessary with hormones and / or other growth factors (such as insulin, transferrin, or epidermal growth factor) , salts (such as sodium chloride, calcium, magnesium, and phosphate) , buffers (such as HEPES) , nucleotides (such as adenosine and thymidine) , antibiotics (such as GENTAMYCINTM drug) , trace elements (defined as inorganic compounds usually present at final concentrations in the micromolar range) , and glucose or an equivalent energy source. Any other necessary supplements may also be included at appropriate concentrations that would be known to a person skilled in the art. The culture conditions, such as temperature, pH, and the like, are those previously used with the host cell selected for expression, and will be apparent to a person skilled in the art.

[0172] When using recombinant techniques, the proteins can be produced intracellularly, in the periplasmic space, or directly secreted into the medium. If the protein is produced intracellularly, as a first step, the particulate debris, either host cells or lysed fragments, is removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration. Carter et al., Bio / Technology 10: 163-167 (1992) describe a procedure for isolating proteins which are secreted to the periplasmic space of E. coli. Briefly, cell paste is thawed in the presence of sodium acetate (pH 3.5) , EDTA, and phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) over about 30 min. Cell debris can be removed by centrifugation. Where the protein is secreted into the medium, supernatants from such expression systems are generally first concentrated using a commercially available protein concentration filter, for example, an Amicon or Millipore Pellicon ultrafiltration unit. A protease inhibitor such as PMSF may be included in any of the foregoing steps to inhibit proteolysis and antibiotics may be included to prevent the growth of adventitious contaminants.

[0173] The interested proteins prepared from the cells can be purified using, for example, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, DEAE-cellulose ion exchange chromatography, ammonium sulfate precipitation, salting out, and affinity chromatography, with affinity chromatography being the preferred purification technique.

[0174] Following any preliminary purification step (s) , the mixture comprising the protein of interest and contaminants may be subjected to low pH hydrophobic interaction chromatography using an elution buffer at a pH between about 2.5-4.5, preferably performed at low salt concentrations (e.g., from about 0-0.25M salt) . VII. Pharmaceutical Composition

[0175] The present disclosure further provides pharmaceutical compositions comprising the active agents provided herein. The term “pharmaceutical composition” as used herein refers to a formulation containing the active agents of the present disclosure in a form suitable for administration to a subject.

[0176] In some embodiments, the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient. The term “pharmaceutically acceptable excipient” means an excipient that is useful in preparing a pharmaceutical composition that is generally safe, non-toxic and neither biologically nor otherwise undesirable to a subject. In some embodiment, the pharmaceutically acceptable excipient comprises a pharmaceutically acceptable carrier and / or a pharmaceutically acceptable diluent. Suitable excipient may include, for example, antioxidants, fillers, binders, disintegrants, buffers, preservatives, lubricants, flavorings, thickeners, coloring agents, emulsifiers, stabilizers and the like.

[0177] Pharmaceutical compositions are typically formulated to be compatible with its intended route of administration. The particular excipient used will depend upon the means and purpose for which the active agent of the present disclosure is being applied. Solvents are generally selected based on solvents recognized by persons skilled in the art as safe to be administered to a mammal including humans. In general, safe solvents are non-toxic aqueous solvents such as water and other non-toxic solvents that are soluble or miscible in water. Suitable aqueous solvents include water, ethanol, propylene glycol, polyethylene glycols (e.g., PEG 400, PEG 300) , etc. and mixtures thereof.

[0178] In some embodiments, suitable excipients may include buffers such as phosphate, citrate and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as octadecyl dimethyl benzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol) ; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose, or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counter-ions such as sodium; metal complexes (e.g., Zn-protein complexes) ; and / or non-ionic surfactants such as TWEENTM, PLURONICSTM or polyethylene glycol (PEG) .

[0179] In some embodiments, suitable excipients may include one or more stabilizing agents, surfactants, wetting agents, lubricating agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, antioxidants, opaquing agents, glidants, processing aids, colorants, sweeteners, perfuming agents, flavoring agents and other known additives to provide an elegant presentation of the drug (i.e., the active agent of the present disclosure or pharmaceutical composition thereof) or aid in the manufacturing of the pharmaceutical product (i.e., medicament) . The active pharmaceutical ingredients may also be entrapped in microcapsules prepared, for example, by coacervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methyl methacrylate) microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (for example, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nano-particles and nanocapsules) or in macroemulsions. Such techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) . A “liposome” is a small vesicle composed of various types of lipids, phospholipids and / or surfactant which is useful for delivery of a drug (such as the active agents disclosed herein and, optionally, a chemotherapeutic agent) to a mammal including humans. The components of the liposome are commonly arranged in a bilayer formation, similar to the lipid arrangement of biological membranes.

[0180] The pharmaceutical compositions provided herein can be in any form that allows for the composition to be administered to a subject, including, but not limited to a human, and formulated to be compatible with an intended route of administration. Examples of routes of administration include parenteral (including subcutaneous, intravenous, intramuscular and intraperitoneal) , oral, rectal, dermal, transdermal, intrathoracic, intrapulmonary and intranasal (respiratory) routes. The pharmaceutical composition can be, for example, a liquid solution, suspension, emulsion, pill, capsule, tablet, sustained release formulation, or powder.

[0181] A variety of routes are contemplated for the pharmaceutical compositions provided herein, and accordingly the pharmaceutical composition provided herein may be supplied in bulk or in unit dosage form depending on the intended administration route. For example, for oral, buccal, and sublingual administration, powders, suspensions, granules, tablets, pills, capsules, gelcaps, and caplets may be acceptable as solid dosage forms, and emulsions, syrups, elixirs, suspensions, and solutions may be acceptable as liquid dosage forms. For injection administration, emulsions and suspensions may be acceptable as liquid dosage forms, and a powder suitable for reconstitution with an appropriate solution as solid dosage forms. For inhalation administration, solutions, sprays, dry powders, and aerosols may be acceptable dosage form. For topical (including buccal and sublingual) or transdermal administration, powders, sprays, ointments, pastes, creams, lotions, gels, solutions, and patches may be acceptable dosage form. For vaginal administration, pessaries, tampons, creams, gels, pastes, foams and spray may be acceptable dosage form. Methods of formulating suitable pharmaceutical compositions are known in the art, see, e.g., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005) .

[0182] In embodiments, the pharmaceutical compositions are formulated into an injectable composition. The injectable pharmaceutical compositions may be prepared in any conventional form, such as for example liquid solution, suspension, emulsion, or solid forms suitable for generating liquid solution, suspension, or emulsion. Preparations for injection may include sterile and / or non-pyretic solutions ready for injection, sterile dry soluble products, such as lyophilized powders, ready to be combined with a solvent just prior to use, including hypodermic tablets, sterile suspensions ready for injection, sterile dry insoluble products ready to be combined with a vehicle just prior to use, and sterile and / or non-pyretic emulsions. The solutions may be either aqueous or nonaqueous.

[0183] In certain embodiments, unit-dose parenteral preparations are packaged in an ampoule, a vial or a syringe with a needle. All preparations for parenteral administration should be sterile and not pyretic, as is known and practiced in the art. In certain embodiments, a sterile, lyophilized powder is prepared by dissolving the polypeptide conjugate as disclosed herein in a suitable solvent. Reconstitution of a lyophilized powder with water for injection provides a formulation for use in parenteral administration. In one embodiment, for reconstitution the sterile and / or non-pyretic water or other liquid suitable carrier is added to lyophilized powder. The precise amount depends upon the selected therapy being given and can be empirically determined.

[0184] In some embodiments, the pharmaceutical compositions of the present disclosure can be formulated as short-acting, fast-releasing, long-acting, and sustained-releasing. Accordingly, the pharmaceutical formulations of the present disclosure may also be formulated for controlled release or for slow release. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprising an active agent that is or comprises a nucleic acid can be administered by any method suitable for administration of nucleic acid agents. These methods include, for example, gene guns, bio injectors, and skin patches.

[0185] The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration.

[0186] In certain embodiments, the active agents provided herein may be administered in combination with any other therapeutic agent for use in ameliorating age-related impairment of regenerative and cognitive function.

[0187] The term “administered in combination” as used herein includes administration simultaneously as part of the same pharmaceutical composition, simultaneously as separate compositions, or at different timings as separate compositions. A pharmaceutical composition administered prior to or after another agent is considered to be administered “in combination” with that agent as the phrase is used herein, even if the composition and the second agent are administered via different routes. The active agents provided herein, and other therapeutic agent can be administered either punctually or at different time points, as long as they exert effects in the subject during an overlapped timeframe. Where possible, additional therapeutic agents administered in combination with the active agents provided herein are administered according to the schedule listed in the product information sheet of the additional therapeutic agent, or according to the Physicians’ Desk Reference (Physicians ’ Desk Reference, 70th Ed (2016) ) or protocols well known in the art.

[0188] The terms “administer” , “administering” or “administration” include any method of delivery of a pharmaceutical composition or agent into a subject’s system or to a particular region in or on a subject. In certain embodiments, the agent is delivered orally, or parenterally. In certain embodiments, the agent is delivered by injection or infusion, or delivered topically including transmucosal. In certain embodiments, the agent is delivered by inhalation. In certain embodiments of the invention, an agent is administered by parenteral delivery, including, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intramedullary injections, as well as intrathecal, direct intraventricular, intraperitoneal, intranasal, or intraocular injections. In one embodiment, the agent may be administered by injecting directly to a tumor. In some embodiments, the agent may be administered by intravenous injection or intravenous infusion. In certain embodiments, the agent can be administered by continuous infusion. In certain embodiments, administration is not oral. In certain embodiments, administration is systemic. In certain embodiments, administration is local. In some embodiments, one or more routes of administration may be combined, such as, intravenous and intratumoral, or intravenous and peroral, or intravenous and oral, or intravenous and topical, or intravenous and transdermal or transmucosal. Administering an agent can be performed by a number of people working in concert. Administering an agent includes, for example, prescribing an agent to be administered to a subject and / or providing instructions, directly or through another, to take a specific agent, either by self-delivery, e.g., as by oral delivery, subcutaneous delivery, intravenous delivery through a central line, etc. ; or for delivery by a trained professional, e.g., intravenous delivery, intramuscular delivery, intratumoral delivery, continuous infusion, etc.

[0189] The term “effective amount” or “therapeutically effective amount” means the amount of active pharmaceutical agent sufficient to effectuate a desired physiological outcome in an individual in need of the agent. The effective amount can vary among individuals depending on the health and physical condition of the individual to be treated, the taxonomic group of the individuals to be treated, the formulation of the composition, assessment of the individual's medical condition, and other relevant factors. VIII. Kits

[0190] In certain embodiments, the present disclosure provides a kit comprising the active agents provided herein. In certain embodiments, the present disclosure provides a kit comprising the active agents provided herein, and a second therapeutic agent.

[0191] The kit further comprises an instruction reciting the indications. In some embodiments, in the instruction it is recited that the kit is useful for promoting longevity / healthspan or anti-aging, treating an aging-related cognitive disorder or recession, promoting neurogenesis or improving neuron function, improving memory, or treating anxiety in a subject, and the like.

[0192] In some embodiments, the indications include neurodegenerative diseases. In some embodiments, the neurodegenerative disease is Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, frontotemporal dementia, Huntington’s disease, or vascular dementia.

[0193] Such kits can further include, if desired, one or more of various conventional pharmaceutical kit components, such as, for example, containers with one or more pharmaceutically acceptable carriers, additional containers etc., as will be readily apparent to a person skilled in the art. Instructions, either as inserts or a labels, indicating quantities of the components to be administered, guidelines for administration, and / or guidelines for mixing the components, can also be included in the kit. IX. Other Methods

[0194] In a further aspect, the present disclosure provides a method of screening for an agent that increases expression level of Cystatin-M, comprising measuring the expression level of Cystatin-M in cells or tissues treated with the agent and comparing the expression level of Cystatin-M to that in a control cell of tissue.

[0195] In a further aspect, the present disclosure provides a method of screening for an agent that increases activity of Cystatin-M, comprising measuring the activity of Cystatin-M treated with the agent and comparing the activity of Cystatin-M to that in a control cell of tissue.

[0196] In a further aspect, the present disclosure provides a method of screening for an agent that increases expression level of ORM proteins (e.g., ORM1, ORM2 and / or ORM3) , comprising measuring the expression level of ORM proteins (e.g., ORM1, ORM2 and / or ORM3) in cells or tissues treated with the agent and comparing the expression level to that in a control cell of tissue.

[0197] In a further aspect, the present disclosure provides a method for inducing expression of ORM proteins (e.g., ORM1, ORM2 and / or ORM3) in a mammal comprising administering an effective amount of an active agent as disclosed herein to the mammal. In some embodiments, the cells are liver cells.

[0198] In a further aspect, the present disclosure provides a method for identifying compounds that has the potential to modulate induction of ORM proteins (e.g., ORM1, ORM2 and / or ORM3) , comprising screening a library of compounds for activity in modulating the function or expression of Cystatin-M. In some embodiments, the cells are liver cells.

[0199] Any suitable screening methods can be used. In certain embodiments, the screening is carried out in a high throughput screening assay (HTS) . An HTS assay can use an automated equipment to rapidly test thousands to millions of samples for biological activity at the cell level. HTS is an experimental process in which 103–106 small molecule compounds (or chemical mixtures, natural product extracts, oligonucleotides, and antibodies) can be screened in parallel within days.

[0200] In certain embodiments, to screen compounds that facilitate expression of target genes (CST6, ORM1 or ORM2) , compound library comprising thousands of or more compounds are first designed according to drug / database. Then HTS platform are used to screen these compounds in parallel. Briefly, thousands of compounds or mixtures of compounds are treated to cell sample separately. Then the expression of target genes or activity of target proteins are detected by corresponding methods. The biology function of these compounds that increase expression of target genes or activity of target proteins will be further test by in vivo mouse model. After aged mice are treated with former candidate compounds, neurological behavior tests and molecular analysis of neurogenesis markers will be conducted to assess their improvement of age-related declines of cognitive function and neuron regeneration.

[0201] The following examples are provided to better illustrate the claimed invention and are not to be interpreted as limiting the scope of the invention. All specific compositions, materials, and methods described below, in whole or in part, fall within the scope of the present invention. These specific compositions, materials, and methods are not intended to limit the invention, but merely to illustrate specific embodiments falling within the scope of the invention. A person skilled in the art may develop equivalent compositions, materials, and methods without the exercise of inventive capacity and without departing from the scope of the invention. It will be understood that many variations can be made in the procedures herein described while still remaining within the bounds of the present invention. It is the intention of the inventors that such variations are included within the scope of the invention. EXAMPLES EXAMPLE 1. Centenarian-Abundant Blood Circulating Protein CST6

[0202] Untargeted mass spectrum-based (MS-based) proteomics were performed on serum samples from 119 long-lived individuals (LLIs, age: 100.5±3.3 years old) and 151 matched controls (age: 60.6±8.6 years old) to screen centenarian-abundant circulating proteins, in order to find potential anti-aging blood circulating factors from long-lived individuals (LLIs) . The inventors quantified 2484 proteins from these 270 samples and identified 203 upregulated proteins (centenarian-abundant proteins) . Among centenarian-abundant proteins, the inventors manually excluded proteins known to be correlated with aging through literature retrieval or aging-related gene database. Finally, the inventors picked out CST6, which potentially related to neuron function, to explore its anti-aging ability.

[0203] The results show that the level of CST6 was significantly higher in LLIs than the controls (Fig 1a) , which was further confirmed by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) (Fig 1b) .

[0204] Plasmid expressing human CST6 is constructed as follows. Briefly, the consensus coding sequence (CCDS) of CST6 was obtained from NCBI website. A 6 x His tag was added before the stop codon. The gene was synthesized and cloned into a suitable plasmid vector (TK-PCDH-copGFP-T2A-Puro) to make a recombinant plasmid for expression of CST6.

[0205] The recombinant plasmid was transfected to human 293T cells to produce recombinant virus. Briefly, plasmids were mixed with Polyethyleneimine (PEI) transfection reagent and added to the cells for transfection and incubation. Virus-containing medium was harvested twice and stored at 4℃.

[0206] Cell Infection: Cells were cultured to 60%confluency. The first harvested virus was added with Polybrene (6 μg / ml) and incubated for 24 hours. The second harvested virus was added with Polybrene (4 μg / ml) and incubated for 24 hours. Cells underwent puromycin selection for one week and were expanded for further experiments.

[0207] Extraction and purification of protein: After cell collection, cells were resuspended in lysis buffer followed by high-speed centrifugation to collect the supernatant. The His-tagged target protein was purified using HisPur Cobalt Resin. The protein purity was assessed by Western blot before proceeding with further experiments. EXAMPLE 2. CST6 Ameliorated Anxiety and Improved Learning and Memory  Ability in Aged Mice

[0208] Considering that single blood-borne protein administration is capable of improving cognitive function and neurogenesis in aged mice, the inventors wondered whether supplement of CST6 could counteract these aging-associated phenotypes in aged mice. Recombinant human CST6 (rhCST6, its amino acid sequence is as set forth in SEQ ID NO: 1) prepared in Example 1 was purified and injected to 18 months-old C57BL / 6 mice and tested their cognitive performance by several behavioral experiments (Fig 2a) .

[0209] Specifically, to investigate and validate the anti-aging effects of CST6 protein, 18-month-old aged mice received eight consecutive tail intravenous injections of CST6 protein within 24 days. Subsequently, the improvement in their cognitive functions was assessed through neurobehavioral experiments. Furthermore, their neural regeneration markers were examined using immunohistochemistry assays. The objective was to observe whether the CST6 enhances the learning and memory abilities of aged mice and promotes neurogenesis in the hippocampal region of their brains, thereby counteracting the decline in neural regeneration and cognitive decline associated with aging.

[0210] CST6 activity was tested in mice by Open Field Test, Elevated Plus Maze, Barnes Maze and Morris Water Maze.

[0211] In this study, an experimental group of up to 31 mice and a control group of up to 31 mice were included in the beginning.

[0212] Experimental group: Mice received tail intravenous injections of the rhCST6 (dissolved in NaCl and phosphate-saline buffer) at a dosage of approximately 100 μg / kg body weight. For example, if a mouse weighed 35 g, it would receive an injection containing 3.5 μg of rhCST6 protein in a 100 μL protein solution. The treatment was administered every three days, which includes 8 injections across 24 days in total.

[0213] Control group / Vehicle group: Mice received tail intravenous injections of an equivalent volume of 100 μL protein solvent (NaCl and phosphate-saline buffer) alone.

[0214] In this study, because the deterioration of age mice, mice with death or disabled ability were excluded in the experiment. This leaded to an experimental group of 20-30 mice and a control group of 20-30 mice were left in each result.

[0215] Open Field Test: Mice were observed in an unfamiliar open environment (i.e., an arena with walls) , and their anxiety levels were assessed based on their exploratory and avoidance behaviors. The time spent, distance traveled, and average speed in the central and peripheral zones were recorded, with increased time and distance in the central zone indicating reduced anxiety levels.

[0216] Elevated Plus Maze: Similar to the Open Field Test, mice were observed in an unfamiliar open environment, which is an elevated, plus-shaped (+) apparatus with two open and two enclosed arms. Anxiety levels were assessed based on their exploratory and avoidance behaviors. Increased time and distance in the open arms indicated reduced anxiety levels.

[0217] Barnes Maze: This test utilized rodents’ natural aversion to light and preference for dark spaces. Mice were placed on a brightly lit open platform and had to escape to a dark escape box beneath it. The maze consisted of a rotating circular platform with 18 equidistant holes, one of which led to the escape box. Mice were tested for four days, with four 90-second trials per day. During the experiment, the time which entered the box on each trail was recorded. Mice that did not enter the hole within 90 seconds were guided into the escape box and removed after 15 seconds. Reduced time to find the escape box means improved learning and memory.

[0218] Morris Water Maze: As a classic test to evaluate mouse learning and memory, the maze utilized mice's innate ability to swim and avoid water. Mice were placed in an opaque, circular water tank with a submerged escape platform. Mice were given four daily trials for six days, with a one-minute exploration time per trial. During the training period, the time which arrived the platform on each trail was recorded. Mice that stayed swimming within 90 seconds were guided into the platform and removed after 15 seconds. Wipe moisture quickly and keep mice warm in cage. On day seven, the platform was removed, and the times of passing platform area, time and distance spent in the platform area were recorded. Shorter times and distances indicated enhanced learning and memory ability.

[0219] Aged mice usually exhibit anxiety-like behaviors. Anxiety-like and general exploratory activity levels of aged mice were firstly assessed using the open field test. After injection of rhCST6, aged mice showed no difference on walking speed between rhCST6 and vehicle (Fig 2b) . However, mice treated with rhCST6 spent more time on the center area (Fig 2c) , and stepped a longer distance (Fig 2d) , indicating that rhCST6 reduced anxiety-related behaviors in aged mice. In the assay of elevated plus maze, rhCST6 treated mice also spent more time (Fig 2e) and stepped a longer distance (Fig 2f) in open arms than the vehicle. These findings suggest that rhCST6 reduced the anxiety level in aged mice.

[0220] As vital indicators for brain function, learning and memory ability declines through aging progress in humans and mice. To determine whether rhCST6 can improve the learning and memory ability of aged mice, Barnes maze and Morris water maze (MWM) were conducted to test their spatial learning and memory ability. As shown in Fig. 2g, aged mice injected with rhCST6 reached the escape hole with shorter latency in Barnes maze on the third and fourth testing day. Further, in Morris water maze, mice injected with CST6 reached escape platform faster than vehicle (Fig. 2h) on the training process. On the testing day, CST6 treated mice reached the area of escape platform faster (Fig. 2i) and passed the area of escape platform more times than the vehicle (Fig. 2j) . Together, these results indicate that CST6 can improve spatial learning and memory ability in aged mice.

[0221] Further, we utilized an adeno-associated virus (AAV) system to overexpress human CST6 protein (its amino acid sequence is as set forth in SEQ ID NO: 1) in aged male mice for one month, and confirmed its ability to reduce anxiety (Fig. 9a and b) and enhance spatial learning and memory (Fig. 9c) . These results, consistent with the effects of rhCST6 intravenous injection, underscore CST6’s potential in mitigating age-related cognitive decline. EXAMPLE 3. CST6 Promoted Neurogenesis in Aged Hippocampus

[0222] To elucidate the underlying molecular mechanism by which rhCST6 enhances spatial learning and memory ability in aged mice, the inventors focused on hippocampus, a brain region that process spatial memory and is sensitive to the detrimental effects of aging. It has been proved that overexpression of a single protein is enough to boost neurogenesis in hippocampus of aged mice. Therefore, after treatment of rhCST6, the number of adult neuronal stem cells and newborn neurons were tested by immunohistochemistry analysis.

[0223] Immunohistochemistry: Mice were anesthetized, and blood was collected via cardiac puncture. Cardiac perfusion was performed to remove excess blood from the brain. Brains were carefully extracted and placed in chilled 4%paraformaldehyde (PFA) overnight at 4℃. A sucrose gradient dehydration process was conducted subsequently. Once the brains sank to the bottom of the sucrose solution, they were rinsed with phosphate-buffered saline (PBS) and quickly frozen embedding by OCT in a cryostat for sectioning. Brain sections were immersed in 3%bovine serum albumin (BSA) for one hour to block nonspecific binding sites. Sections were incubated overnight at 4℃ with primary antibodies (anti-Ki67, anti-Brdu, anti-Dcx and anti-Sox2 antibodies) . Following PBS washes, sections were incubated at room temperature with corresponding fluorescent secondary antibodies for two hours in the dark. After additional PBS washes, sections were mounted, cover-slipped, and examined under a laser confocal microscope. Images of positively stained cells were captured and saved for further analysis.

[0224] Different makers, including neuron cell proliferative marker Ki67 and Brdu, neuron stem cell marker Sox2 and immature / newborn neuron marker Dcx, were used to test neurogenesis in dentate gyrus (DG) region of aged mouse. This is because DG is a sub-region of hippocampus, where new neurons are generated in adult mammal and is important for formation of memory.

[0225] Results show that mice injected with rhCST6 (its amino acid sequence is as set forth in SEQ ID NO: 1) had more newly born neuron cells (Fig. 3a-d) . rhCST6 injection was sufficient to increase the number of newly proliferated cells in DG indicated by the exogenous marker Brdu (Fig. 3a) and endogenous marker Ki67 (Fig. 3b) . Then Dcx was used to detect whether these newborn cells are immature neurons. Results show that mice injected with rhCST6 significantly produced more immature neurons (Fig. 3c) in the DG. Further, rhCST6 injected mice also showed more Sox2 positive neuron stem cells (Fig. 3d) , indicating CST6 functions to boost adult neurogenesis through amplification numbers of adult neuron stem cell in aged mice. Together, these findings suggest that CST6 promoted adult neurogenesis in the DG region of aged hippocampus. EXAMPLE 4. CST6 Induced Liver-Specific Secretion of A Brain Functional  Protein Orm1

[0226] Next, how blood injected CST6 can boost adult neurogenesis in the aged mice was investigated. In brief, the inventors injected rhCST6 (its amino acid sequence is as set forth in SEQ ID NO: 1) to blood and detected whether it crosses blood-brain-barrier (BBB) and reaches brain. If rhCST6 does not get into brain region, the inventors then detected target tissue that rhCST6 reached and found out whether there is a downstream protein that was induced by rhCST6 and crosses BBB, which finally boosts neurogenesis in DG.

[0227] Unexpectedly, exogenously tail vein injected CST6 protein could not cross BBB to reach brain region including hippocampus and olfactory bulb (Fig. 4a) .

[0228] Then the distribution of rhCST6 was detected in other organs including liver, heart, kidney and so on. Enrichment of injected rhCST6 was observed in the liver after injection (Fig. 4a) .

[0229] It was speculated that CST6 may induce the expression of certain secretory proteins in the liver, some of which may cross the BBB and finally function in the brain. To test this hypothesis, serum proteome was quantified by untargeted proteomics in aged mice after injection of CST6. Results did show a bundle of proteins that were highly expressed in the blood of aged mice after injection of CST6 (Fig. 4b) , including Orm1, which is the most significant upregulated protein.

[0230] ORM1 is a liver-enriched gene (data from The Human Protein Atlas, see Fig. 4c) , whose protein will be secreted to blood after translation. In longevity, ORM1 is also highly abundant in the serum of LLIs collected in Example 1 (Fig. 4d) . First it was validated that the mRNA expression of Orm1 was upregulated after injection of CST6 in the liver (Fig. 4e) . Then results show that protein abundance of Orm1 was elevated in blood (Fig. 4f) and hippocampus (Fig. 4g) after injection of CST6 using ELISA and western blot, respectively. To determine whether Orm1 can directly cross BBB and enter the brain, exogenous Orm1 was injected and its existence in hippocampus was detected after injection (Fig. 4h) . In summary, these results show that CST6 induced a liver-specific secretion of Orm1 that can cross BBB and may function in brain despite that CST6 itself cannot cross the BBB. EXAMPLE 5. Orm1 Reduced Anxiety, Improved Learning and Memory and  Boosts Neurogenesis in Aged Mice

[0231] To test whether Orm1 can play a protective role like CST6 that against impaired aging brain, Orm1 was directly injected to blood and neurological behavior was tested in the aged mice.

[0232] Plasmid expressing mouse Orm1 and recombinant mouse Orm1 protein were produced using similar methods as described in Example 1.

[0233] Neurological activity of mouse Orm1 was tested using similar methods as described in Example 2, except that rhCST6 was replaced by mouse Orm1. Specifically, recombinant mouse Orm1 (rmOrm1, its amino acid sequence is as set forth in SEQ ID NO: 4) was purified and injected 8 times (three days per injection) to 18 months-old C57BL / 6 mice, and tested the cognitive performance by several behavioral experiments, including Open Field Test, Elevated Plus Maze and Morris Water Maze.

[0234] After injection of rmOrm1, aged mice spent more time in the center area in the open-field test (Fig. 5a) and walked a longer distance (Fig. 5b) . Consistently, Orm1-injected mice stay more time in open arms in the elevated plus maze (Fig. 5c) . These observations suggest that Orm1 reduced anxiety in aged mice, working in concert with CST6.

[0235] In Morris water maze, mice injected with rmOrm1 reach escape platform in shorter time across training days (Fig. 5d) . On the testing day, rmOrm1 treated mice reached the area of escape platform faster (Fig. 5e) and passed more times than PBS group (Fig. 5f) . Water maze test indicated that Orm1 improved the learning and memory ability of aged mice.

[0236] In independently blinded behavioral experiments, where aged mice exhibited cognitive decline compared to young controls (6 months) , the inventors confirmed that both CST6 and Orm1 treatments significantly reduced anxiety (Fig. 10a and b) and enhanced spatial learning and memory (Fig. 10c) in aged mice compared to aged vehicle. Notably, there were no significant differences in behavioral outcomes between CST6-and Orm1-treated groups, emphasizing that intravenous injection of either protein yields comparable cognitive benefits in aged mice.

[0237] To elucidate underlying molecular mechanism by which Orm1 enhances spatial learning and memory ability in aged mice, the number of adult neuronal stem cells and newborn neurons were tested by immunohistochemistry after administration of Orm1, using similar methods as described in Example 3.

[0238] As expected by the present inventors, supplement of Orm1 increased the number of newborn neurons in DG labelled by Brdu, Ki67, Dcx and Sox2 (Fig. 5g) . Taken together, results show that supplementation of Orm1, a CST6 induced liver-secreted protein, is sufficient to reduce anxiety, improve learning and memory and boost neurogenesis in aged mice.

[0239] Orm1 also has other isotypes in both human and mouse, including human ORM2, mouse ORM1, mouse ORM2 and mouse ORM3. These isotypes have similar functions due to their high homology of sequences. EXAMPLE 6. Knockdown of Orm1 in Liver Neutralized Neuroprotective  Function of CST6 in Aged Mice

[0240] In Example 2, 3 and 5, CST6 and Orm1 both had been proved to reduce anxiety, improve learning and memory and boost neurogenesis. Besides, Orm1 was found to be induced in the liver by administration of CST6. It is unknown whether CST6’s impacts are mediated by the liver-produced protein Orm1. To investigate this question, the present inventors knocked down the expression of Orm1 in the liver using a liver-specific serotype of adeno-associated virus (AAV; here AAV8) of a Orm1 shRNA ( “shOrm1” ) in 18 months-old-aged mice. Two weeks later, 80%reduction of Orm1 gene expression in the liver (Fig. 6a) and more than 50%reduction of Orm1 protein concentration in the serum (Fig. 6b) in shOrm1 treated mice than controls were observed. Then rhCST6 was intravenously injected into Orm1 knockdown mice (i.e., shOrm1 mice) and shControl mice (i.e., mice treated with empty AAV8 vector) (8 injections, three days per injection) , while a third group of mice injected merely with PBS or shControl+PBS were set as vehicle controls. Three experiment groups, including mice received injection of shOrm1+CST6, shControl+CST6 and PBS vehicle / shControl+PBS, were studied using open field test, Morris water maze and similar molecular experiments as Example 5.

[0241] In the open field test, the shControl+CST6 given mice spent significantly more time in the center area in the open-field test (Fig. 6c and Fig. 11a) and walked a significantly longer distance (Fig. 6d and Fig. 11a) than vehicle controls. In contrast, there were no differences between vehicle control mice and the liver-Orm1-KD mice given CST6 (shOrm1+CST6) . These observations indicated that knockdown of Orm1 neutralizes anxiety reducing function of CST6 in aged mice.

[0242] In Morris water maze, the shControl+CST6 given mice reach escape platform in significantly shorter time across six training days (Fig. 6e and Fig. 11c) ; on the seventh testing day, the shControl+CST6 given mice reached the area of escape platform significantly faster (Fig. 6f and Fig. 11c) and passed significantly more times than vehicle controls (Fig. 6g and Fig. 11c) . In contrast, there were no differences between vehicle control / shControl mice and the liver-Orm1-KD mice given CST6 (shOrm1+CST6) in the test of Morris water maze (Fig. 6e-g and Fig. 11c) . These observations indicated that knockdown of Orm1 neutralizes learning and memory improvement function of CST6 in aged mice.

[0243] The number of adult neuronal stem cells and newborn neurons were tested by immunohistochemistry assay, using similar methods as described in Example 3. As a result, knockdown of Orm1 in liver eliminated the increased number of newborn neurons in DG (Fig. 6h) .

[0244] Taken together, these results suggested that a liver-specific induced factor Orm1 is necessary for the neuroprotective activity of CST6. Knockdown of Orm1 in liver eliminated neuroprotective function of CST6. Finally, the inventors found CST6 protects brain aging through a CST6-liver-Orm1-brain axis. EXAMPLE 7. CST6 Ameliorated Depression in Depression Model Mice

[0245] To see whether CST6 can improve depression in mice, the present inventors firstly modelled a depression model of mouse, then used tail suspension test to examine their depression behavior after tail vein injection of rhCST6 (its amino acid sequence is as set forth in SEQ ID NO: 1) .

[0246] Tail vein injection procedure for rhCST6 uses similar method as described in Example 2. There are three experiment group in this experiment, including depression model mice injected with CST6 (n=10) , depression model mice injected with PBS as vehicle control (n=9) and wild-type (WT) mice with no injection (n=7) .

[0247] Modelling depression in mice: The Chronic Unpredictable Animal Stress Model (CUMS) simulates some stressors, external environmental stimuli, such as day and night reversal, electric shock, moisture, etc., and the individual’s internal stimuli, such as water deprivation, fasting, sensory deprivation, etc. After 4 weeks of stress stimulation, the animal will become dysfunctional, leading to the occurrence of mental illness and depression. After chronic unpredictable stress, animals experience reduced physical activity, anhedonia, and elevated plasma corticosteroids, which are similar to the symptoms of human depression. They can more realistically simulate some of the causes and symptoms of depression patients, so they are animal models of depression. Modeling depressed mice by randomly using the following stimuli, day and night reversal, fasting (24h) , water deprivation (24h) , tilting the cage at 45 degrees (24h) , horizontal shaking for 5min, restraint (4h) , tail clamping for 5min, soaked bedding (24h) , electric shock twice with 0.5mA (2min interval, each electric shock last for 2s) . Each mouse was kept in a single cage during whole experiment.

[0248] Tail suspension test: The animal is hung from a tube by its tail for six minutes approximately 50 cm away from the ground. During this time the animal will try to escape. The time it takes until it remains immobile is measured. Each animal is tested only once and out of view from the other animals.

[0249] In tail suspension test, depressed mice injected with CST6 showed significantly less immobility time than vehicle injected mice, similar to wild-type (WT) mice (Fig. 7) . This result showed that CST6 can improve depression. EXAMPLE 8. Human ORM1 and ORM2 Reduces Anxiety, Improves Learning  and Memory and Boosts Neurogenesis in Aged Mice

[0250] In Example 5, mouse Orm1 has been proved to reduce anxiety, improves learning and memory and boosts neurogenesis in aged mice. To validate the same anti-aging function of human ORM1, similar experiment was conduct with human ORM1 protein. In brief, recombinant human ORM1 or ORM2 (rhORM1 / rhORM2) protein is intravenously injected to aged mice. Then neurological behavior test (including open-field test and water maze test) and molecular analysis of neurogenesis markers (Sox2, Brdu, Ki67 and Dcx) are used to assess their improvement of age-related declines of cognitive function and neuron regeneration. It is speculated that treatment of rhORM1 / rhORM2 in aged mice can reduce their anxiety in open-field test, improve learning and memory in water maze test, boost neurogenesis in analysis of neurogenesis markers. EXAMPLE 9. CST6 and Orm1 Reduced Neuroinflammation

[0251] To determine whether CST6 and Orm1 can reduce neuroinflammation in aged mice (18 months old) , the inventors assessed Iba1-positive cells, which label microglia in the brain, following tail vein injection of rhCST6 (its amino acid sequence is as set forth in SEQ ID NO: 1) or rmOrm1 (its amino acid sequence is as set forth in SEQ ID NO: 4) .

[0252] The tail vein injection procedure for rhCST6 or rmOrm1 follows a similar method to that described in Example 2. Three experimental groups were included in this study: aged mice injected with rhCST6 (n=10) , rmOrm1 (n=10) , and Vehicle (n=10) .

[0253] The number of primary immune cells was assessed using an immunohistochemistry assay, employing methods similar to those described in Example 3. The microglia marker Iba1 was used to evaluate neuroinflammation in the dentate gyrus (DG) region of aged mice.

[0254] The results show that mice injected with rhCST6 (Fig. 12a) and rmOrm1 (Fig. 12b) exhibited a lower number of Iba1-positive cells, suggesting a decrease in neuroinflammation or a reduction in the brain’s immune response. These findings indicate that CST6 and Orm1 can reduce neuroinflammation in aged mice. EXAMPLE 10. Discussion

[0255] Centenarians maintain some survival benefits over the general aged population, but whether these benefits can be transferred by blood factors is not known. In this study, the inventors firstly identified a novel circulating neuroprotective factor CST6 from the long-lived centenarians. Supplementation of CST6 reduces anxiety, improves learning and memory ability and boosts neurogenesis in aged mice. Although exogenous injected CST6 cannot enter brain, the neuro-protective functions can be achieved by a CST6-induced and liver-secreted factor ORM1. These results indicate that centenarians maintain its better cognitive function through reducing aging-related neuron loss and memory decline.

[0256] Up to date, why LLIs exhibit these delayed aging phenotypes remains obscure. GWAS research have revealed several genome loci associated with longevity, but only few of them located within FOXO3 or APOE could be replicated by multiple studies. To date, association analysis has been the most popular method for studying human longevity. On a few genes, e.g., FOXO3 and autophagy have been proved to improve healthy aging directly by in vivo experiment. In the past several years, the inventors have found that enhanced autophagy and lipid metabolism, and reduced ribosome activity contribute to successful aging of LLIs. Here, it was found that blood-borne protein CST6 derived from centenarians act as an anti-aging protein, which is similar to youthful factor found in blood from human umbilical cord or young mouse. This result highlighted shift from previous association analysis to in vivo functional experiment in the field of longevity related research, and LLIs represent a successful aging paradigm for digging anti-aging targets.

[0257] CST6, a cysteine proteinase inhibitor, has never been associated with aging, neurogenesis and cognition previously. Although CST6 failed to ameliorate age-related declines like skeletal muscle strength (Fig. 8) , our data show CST6 improves neurogenesis and cognition in aged mice. Tracer experiment suggest CST6 does not directly enter brain niche through blood but is enriched in liver after injection (Fig. 4a) . Liver is the source organ of many circulating factors, e.g., Gpld1 has been identified to mediate the benefits of exercise in old mice through liver-brain axis. In this study, the inventors found that the centenarian derived blood factor CST6 achieves a brain regenerative ability via a blood-liver-brain axis. These findings suggest that the liver plays important roles in brain function and aging process.

[0258] ORM1, also known as one of acute phase proteins (APP) , is a heavily glycosylated serum protein that has the capacity to bind and transport basic and neutral molecules. ORM1, which is primarily synthesized by hepatocytes and then released to blood circulatory system, is usually overexpressed during acute phase response. Although ORM1 has been reported to be involved in inflammatory, angiogenesis, regeneration and molecule transport, the biological function of this protein is not very clear. Here, the inventors found that a clear neuroprotective function of ORM1, which counteract aging-related learning and memory decline in elderly subjects. Considering ORM1 is naturally enriched in the blood of centenarians, it is a promising intervention target for anti-aging therapy.

[0259] Overall, our results highlighted two centenarian-abundant circulating factor CST6 and ORM1 act as neuroprotective factors counteract aging. Besides nervous system, single blood-borne factors derived from mouse are capable of ameliorating age-related functional declines of different organs, including brain, bone, muscle and heart. Therefore, our future work based on the proteome of centenarian may identify more factors that counteract different detrimental aspects of aging. Besides, these human-born proteins from centenarian are promising to have less side-effect and more potential in the area of anti-aging therapy.

Claims

1.A method of a) promoting longevity or b) extending health span or c) improving age-related deceleration and rejuvenation in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby promoting longevity or extending health span or improving age-related deceleration and rejuvenation in the subject.2.A method of treating an aging-related cognitive disorder or recession in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby treating the aging-related cognitive disorder or recession in the subject.3.A method of promoting neurogenesis or improving neuron function in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby promoting neurogenesis or improving neuron function in the subject.4.A method of improving learning and / or memory in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby improving learning and / or memory in the subject.5.A method of treating anxiety in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby treating anxiety in the subject.6.A method of treating depression in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby treating depression in the subject.7.A method of treating neuroinflammation or reducing brain’s immune response in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of an active agent that increases level or activity of Cystatin-M or ORM in the subject, thereby treating neuroinflammation or reducing brain’s immune response in the subject.8.The method of any one of claims 1 to 7, wherein the active agent comprises a protein, a derivative of the protein, a polynucleotide encoding the protein, or a vector comprising the polynucleotide.9.The method of claim 8, wherein the protein comprises a) Cystatin-M, b) an analog of Cystatin-M, or c) a functional fragment of a) or b) .10.The method of claim 9, wherein the Cystatin-M is human Cystatin-M, mouse Cystatin-M or Macaca mulatta Cystatin-M.11.The method of claim 9, wherein:i) the Cystatin-M has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13;ii) the analog of the Cystatin-M has at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO:13, and at least retain partial or full activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13; oriii) the functional fragment of Cystatin-M comprises a QLVAG motif.12.The method of claim 8, wherein the ORM comprises ORM1, ORM2, or ORM3.13.The method of claim 8 or 12, wherein the protein comprises a) Orm1, b) an analog of Orm1, or a functional fragment of a) or b) .14.The method of claim 13, wherein:i) the Orm1 is human Orm1, optionally the human Orm1 is ORM1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 14, orii) the Orm1 is mouse Orm1, optionally the mouse Orm1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 16, oriii) the analog of the Orm1 has at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 16, and at least retain partial or full activity of Orm1 protein.15.The method of claim 8 or 12, wherein the protein comprises a) Orm2, b) an analog of Orm2, or a functional fragment of a) or b) .16.The method of claim 15, wherein:i) the Orm2 is human Orm2, optionally the human Orm2 is ORM2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 15; orii) the Orm2 is mouse Orm2, optionally the mouse Orm2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 17; oriii) the analog of the Orm2 has at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 17, and at least retain partial or full activity of Orm2 protein.17.The method of claim 8 or 12, wherein the protein comprises a) Orm3, b) an analog of Orm3, or a functional fragment of a) or b) .18.The method of claim 17, wherein:i) the Orm3 is mouse Orm3, optionally the mouse Orm3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 18; orii) the analog of the Orm3 has at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90%of sequence identity to SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 18, and at least retain partial or full activity of Orm3 protein.19.The method of any one of claims 8-18, wherein the polynucleotide comprises DNA or RNA (mRNA) .20.The method of any one of claims 8-18, wherein the vector is a viral vector (e.g., an adeno-associated virus (AAV) ) or a non-viral vector.21.The method of any one of claims 8-18, wherein the subject is human or a non-human animal, optionally a non-human mammal, optionally a non-human primate.22.The method of any one of claims 1 to 7 or claim 12, wherein the active agent comprises a chemical compound, a nutrient composition, an encoding or non-encoding nucleic acid or a protein that:i) promotes endogenous expression of Cystatin-M or ORM; orii) reduces degradation or inactivation of Cystatin-M or ORM; oriii) increases activity of Cystatin-M or ORM; oriv) increases blood level of Cystatin-M or promotes biodistribution of Cystatin-M in liver; orv) promotes expression and / or secretion of Orm1 or Orm2 in liver; orvi) promotes biodistribution of Orm1 or Orm2 into brain.23.The method of any one of preceding claims, wherein the subject is an adult, adult of mid-age, or elderly; at an age of above 40, above 50, or above 60.24.The method of any one of preceding claims, wherein the subject:i) has been determined to be at risk for cognitive disorder or recession, orii) has an aging-related condition or disorder having characteristics in reduced cognition, oriii) has reduced neuron function, oriv) severe anxiety, orv) poor learning and memory abilities.25.The method of any one of preceding claims, wherein the condition can be inherited or acquired.26.The method of claim 2 or any one of claims 8-25, wherein the aging-related cognitive disorder or recession involves aging-related cognitive impairment, neuroinflammation and / or physiological impairment, optionally is a neurodegenerative disease, optionally the neurodegenerative diseases is Alzheimer’s disease, frontotemporal dementia, Huntington’s disease, or vascular dementia.27.A pharmaceutical composition comprising the active agent as defined in any one of the preceding claims.28.The pharmaceutical composition of claim 27, wherein the active agent is present in an amount suitable for providing the therapeutically effective amount for treating neurodegenerative disease, optionally the neurodegenerative diseases is Alzheimer’s disease, frontotemporal dementia, Huntington’s disease, or vascular dementia.29.A method of screening for a compound that increases expression level of Cystatin-M, comprising measuring the expression level of Cystatin-M in cells or tissues treated with the compound and comparing the expression level to a control.30.A method of screening for a compound that increases activity of Cystatin-M, comprising measuring the activity of Cystatin-M treated with the compound and comparing the activity to a control.31.A method of screening for a compound that increases expression level of ORM, comprising measuring the expression level of ORM in cells or tissues treated with the compound and comparing the expression level to a control.32.A method of screening for a compound that increases activity of ORM, comprising measuring the activity of ORM in cells or tissues treated with the compound and comparing the expression level to a control.33.The method of claim 31 or 32, wherein the ORM comprises ORM1, ORM2, or ORM3.34.The method of claim 31 or 32, wherein the cells are liver cells.

Images