Compositions and associated methods for chitosan-based NANO-carriers for therapeutic agents and their applications

Abstract

Provided herein are compositions and associated methods for CH-based nano-carriers for therapeutic agents and their applications, a multi-step method for the synthesis of the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carriers, effectively carrying therapeutic or theranostic radioactive metal isotope, anionic immunotherapeutic agent, or other anionic therapeutic agents used as therapeutic drugs, including the one of "combined radio-and adjuvant immuno-therapy" for cancer treatment.

Description

COMPOSITIONS AND ASSOCIATED METHODS FOR CHITOSAN-BASED NANO-CARRIERS FOR THERAPEUTIC AGENTS AND THEIR APPLICATIONSTECHNICAL FIELD

[0001] This disclosure relates to compositions and associated methods for chitosan-based nano-carriers for therapeutic agents and their applications.BACKGROUND

[0002] New therapies that promote antitumor immunity have been recently developed. Most of these immunomodulatory approaches have focused on enhancing T-cell responses, e.g., targeting inhibitory pathways with immune checkpoint inhibitors. Although these therapies have led to unprecedented successes, only a minority of patients with cancer benefit from these treatments, highlighting the need to identify next generation of immunotherapies. Among those, activation of the innate immune responses may initiate a long-lasting and multilayered tumor control immunity (Demaria O., Nature 2019; O’ Hagan D.T., Semi Immunol. 2020) . Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) that present in microbes, have been used as immune stimulating agents for initiating and sustaining innate and adaptive immune responses via the pattern recognition receptors (PRRs) . The PRRs, such as cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) -stimulator of interferon genes (STING) and Toll-like receptor family (TLR) are intensively presented in the antigen-presenting cells (APCs) that include macrophages, dendritic cells (DC) , B cells and NK cells (Amouzegar A., Cancers. 2021; Gajewski T.F., Science 2020; Ishikawa H., Nature 2008; Chakraborty S., Front Immunol. 2023) . The immune stimulators, including STING and TLR (STING / TLR) agonists, have been intensively investigated for tumor immunotherapy, and especially MPLA (Monophosphoryl lipid A) and CpG1018, as TLR4 and TLR9 agonist, respectively, have been approved as adjuvant in vaccines (FENDrix, Cervarix and Dynavax vaccines, which confer protective immunity against hepatitis B virus and human papilloma virus, respectively) used in human (Fu J., Sci. Transl. Med. 2015; Wang Y-Q., Front. Immunol. 2020; Yang J-X., Pharmaceutics. 2022) . However, although there are quite a few of STING / TLR agonists have advanced to clinic for cancer immunotherapy, the clinic data observed so far are weak (Meric-Bernstam F., Clin Cancer Res. 2022; Sivick K.E., Cell Rep. 2018; Flowers C., Blood 2017) . Hence, in order to enhance STING / TLR agonists’ therapeutic efficacy, attempts have been exploited, such as using nanoparticles as carriers, combining with two or more STING / TLR agonists, or being used as combo with other therapeutic entities that include checkpoint inhibitors, chem-and / or radio-therapies (Atukorale P.U., Cancer Res. 2019; Grewal E.P., Immunotherapy. 2020; Re F., J Biol Chem 2001; Senel S., Reactive Functional Polymers. 2020; Tran T.H., Acta Biomater. 2019; Zhu J.L., Biomater 2018) .

[0003] It’s well known that radiotherapy can induce the immunogenic cell death (ICD) for solid tumors via both its direct cytotoxic effect and changes in tumor immunosuppressive microenvironment (Zhu S., Front. Immunol. 2022 / 2023) . Selective internal radiation therapy (SIRT, different terms may also be used in literature, e.g., interstitial radiotherapy, interstitial-brachytherapy, micro-brachytherapy and radioembolization) is an alternative approach of radiotherapy for patients with local or locally-advanced cancer. Different from systemic and external radiation therapies, the advantage of SIRT is its capability of delivering a high radiation dose directly to the lesions to kill tumor cells with minimal damage to the surrounding healthy tissues (Alimi K.A., Anticancer Res 2007; Tong A., Br J Radiol 2016; Yasaman A., J Intervent. Med. 2023; Bakker R., J Radiat Oncol 2017) . SIRT using beta-emitting radionuclides complexed to nanoparticles (NP) , microspheres (MS) or insoluble colloids, shows potential benefits, including minimal invasive delivery, outpatient treatment, and improved survival and quality of life. For instance, radioembolization by administration of Y-90-MS via transhepatic artery infusion, has been established as a safe and efficacious treatment for both primary and metastatic liver cancers. Another example of SIRT is intratumor injection of P-32-silicon MS (P-32 BioSilicon MS in a size of approximately 30 μm) , which has been approved for the treatment of pancreatic cancer. However, the therapeutic efficacy of SIRT via intratumor administration is widely variable. For instance, a survival benefit was reported for patients with head and neck cancer being treated with CCP P-32 (colloidal chromic phosphate) , as well as for patients with pancreas carcinomas being treated with P-32 BioSilicon MS. On the other hand, no benefit was observed in a study of CCP P-32 treatment in 30 pancreas cancer patients (Huang F., J Radiational Nucl Chem 2014; Kim J. K., Clin Cancer Res 2006) . It is well known that the efficacy of SIRT using beta-emitting radionuclides, e.g., Y-90 or P-32 complexed MS or colloidal, can be impacted by multiple factors. Among those, the most critical is the poor distribution of the radioactivity within the lesion owing to the inherit characters of the particle, and any “missed” parts of the tumor can result in residual or locally recurrent disease. It’s reported that the distribution within the lesion after local administration could be impacted by the size and composition of the NP and tis preferred size should be within a range of <100 nm (Sheth R. S., Radiology. 2024) .

[0004] In view of this, there remains the need to identify an effective manner in which, for instance, pharmacologically stable and multifunctional nano-carriers for high potent therapeutic agents, such as but not limited to therapeutic radionuclides and STING / TLR agonists as new approach of “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” for cancer treatment.SUMMARY

[0005] The present disclosure relates to compositions and associated methods for pharmacologically stable and multifunctional biopolymer nano-carriers for, such as but not limited to therapeutical radionuclides and STING / TLR agonists, which can combine SIRT inducing immunogenic tumor cell death with adjuvant immunotherapy in one entity as “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” (or in term as autologous “in situ” therapeutic vaccine) for patents with local or locally advanced cancers, as illustrated in Figure 1.Specifically, this disclosure relates to cationic biopolymers, such as chitosan (CH) , and methods of preparations for the cationic biopolymers-or CH-based pharmacologically stable and multifunctional nano-carriers, which may be used to selectively and efficiently carry different therapeutic agents. More specifically, this disclosure describes the compositions and methods of compounding therapeutic agents with the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carriers, which possess the capabilities of even distribution and long retention within the lesion after the local administration. In some embodiments, this disclosure relates to approaches to effectively kill the tumor cells by the radiation during the physical decay of the carried radionuclide; following, the APCs localized within the tumor drain lymph node could be selectively and effectively activated by the destroyed tumor cell debris along with the adjuvant of the nano-carried STING / TLR agonists.

[0006] In embodiments, the disclosure is related to the compositions and the associated methods to create pharmacologically stable, well-characterized, and high carrying capacity CH-based nano-carriers by metal elements via chelating chemistry. In some embodiments, this disclosure is related a multi-step method for the CH-based nano-carriers, which can be first composed by crosslinking the cationic CH with ionic crosslinkers, where the created intermediate nanoparticles can be stabilized with metal elements via chelating chemistry, and eventually, the high carrying capacity nano-carriers can be obtained with high density of the preserved free amine groups by the removal of the ionic crosslinkers. In embodiments, the disclosure is related to compositions and procedures for the cationic CH-based nano-carriers that may be used for selectively and effectively carrying different therapeutic agents. In embodiments, the disclosure is related to the compositions of the entity of “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” that include, such as but not limited to, a) cationic biopolymer-or CH-based nano-carriers; b) nano-carried therapeutic radionuclides, which is composed via chelating chemistry between cationic CH-based nano-carriers and radioactive metal elements, in which the nano-carriers is served as “cages” or chelators for radioactive metal isotopes with an extremely high stability; and / or 3) nano-carried anionic STING / TLR agonists that is compounded via the binding of cationic CH-based nano-carriers with the anionic agents. In some embodiments, the compositions and methods disclosed herein, such as but not limited to the CH-based nano-carrier carried therapeutic radiometals and the CH-based nano-carrier carried STING / TLR agonists, can be used as mono or combined for cancer treatment. In some embodiments, the CH-based nano-carrier carried STING / TLR agonists can be used as an adjuvant for vaccination; where, a single, two or more than two STING / TLR agonists can be used to activate APCs (antigen presenting cells) resulted in an effective type-1 immune response to promote a better vaccination efficacy. In some embodiments, besides anionic STING / TLR agonists, the cationic CH-based nano-carriers can also effectively carry other anionic agents, such as but not limited to folic acid and its derivatives, or antisense oligonucleotides (ASO) that can be used accordingly for tumor targeting as NRC (Nano-Radionuclide Conjugate) or gene therapies, respectively. In some embodiments, the cationic CH-based nano-carriers can also effectively carry anionic peptides, e.g., Semaglutide, or other anionic agents, e.g., ascorbyl phosphate, and their therapeutic applications. In some embodiments, this disclosure is related to the cationic CH-based nano-carriers, which may also be used as carriers for other cytotoxic agents, such as, but not limited to mitotic inhibitors, e.g., MMAE and MMAF, which may be covalently linked to the amine groups of the CH-based nano-carriers.

[0007] In accordance with one aspect of the present disclosure, the “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach that combined SIRT and adjuvant immunotherapy of STING / TLR agonists in one entity via the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier, for patents with local or locally advanced cancers. In some embodiments, this disclosure could be used as combined, the “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach, or as separated therapies, for instance, as radiotherapy alone, where the CH-based nano-carrier to carry therapeutic radionuclides to efficaciously eradicate the tumors via local administration of intratumor or intracavity, for example, but not limited to, peritoneal, thoracic and postoperative surgical cavities, or as adjuvant therapy alone, where the CH-based nano-carrier to carry STING / TLR agonists as cancer adjuvant immunotherapy or as adjuvant for vaccines to activate APCs to induce IFN production and arouse host immune responses mediated by activation of immune cells such as T cells and NK cells.

[0008] In embodiments, the compositions or compounds described herein may be administered to a subject in need thereof by a variety of parenteral and non-parenteral routes in formulations containing pharmaceutically acceptable excipients or vehicles. Administration routes may be parenteral or non-parenteral, including but not limited to intratumoral, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intradermal and intraperitoneal administrations.

[0009] The solid cancer may be any appropriate cancer, including but not limited to melanoma, cervical cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, testicular cancer, urothelial carcinoma, bladder cancer, lung cancer, sarcoma, colorectal adenocarcinoma, gastrointestinal stromal tumors, gastroesophageal carcinoma, colorectal cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, hepatocellular cancer, malignant mesothelioma, leukemia, lymphoma, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, and transitional cell carcinoma.

[0010] “Effective amount" or “therapeutically effective amount" or “pharmaceutically effective amount" means that amount which, when administered to a subject or patient for treating a disease, is sufficient to affect such treatment for the disease. In some embodiments, the disclosure is related to a method of treating a subject or patient having solid tumors with therapeutically effective amounts of the radioactivity and / or STING / TLR agonists. In some embodiments, the compositions of this disclosure as a new approach of SIRT are administered via local (e.g., intratumor or intracavity) administration. In some embodiments, the intratumor administration comprises imaging-guided percutaneous and / or intraoperative injection. In some embodiments, the compositions are administered into peritoneal cavity, thoracic cavity, a postsurgical cavity, and / or a recession site of a solid tumor, via a catheter impregnation and / or a direct injection. In embodiments, the compositions and CH-based nano-carriers are biodegradable in vivo over time.

[0011] The compositions may be administered one or more times. In some embodiments, the compositions are administered 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 times or more. Methods may be used in combination with additional distinct cancer therapy. In some embodiments, the distinct cancer therapy includes radiotherapy, chemotherapy, toxin therapy, immunotherapy including checkpoint inhibitor, cryotherapy or gene therapy. Combination therapy may be achieved by use of a single pharmaceutical composition that includes both agents, or by administering two distinct compositions at the same time, wherein one composition includes the compositions described in this disclosure and the other includes the second agent (s) .

[0012] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Methods and materials are described herein for use in the present invention; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0013] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0014] Figure 1: Illustrate mechenism of the approach of “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” for cancer treatment.

[0015] Figure 2: Chemical structure of MPLA (A, Monophosphoryl lipid A) and KLA (B, Kdo2-Lipid A) .

[0016] Figure 3: Confocal imaging for assessing the internization of FITC-conjugated CH-based nano-carriers in mouse macrophages Raw264.7 (top) or human hepatoma cells hepG2 (bottom) : cells were seeded in a 12 well plate (4.0 x 10^5 cells / well) , treated with FITC-conjugated CH-based nano-carriers in a concentration of 40 μg / mL for 16 h, and then washed with PBS. The nucleus and cytoplasm were stained with DAPI and dye Mito-Tracker red, respectively.

[0017] Figure 4: In vitro ROS production by RAW246.7 (top) and 4T1 (bottom) cell lines post 16-h treatment with TLR4 agonists with or without being bound to CH-based nano-carrier (n = 3) .

[0018] Figure 5: Effect of STING / TLR4 agonists on activation of macrophages and cytokine production in PBMC in vitro.

[0019] Figure 6: Tissue distribution (%ID / g) of 68Ga-labeled CH-based nano-carrier (68Ga-NP) at 1-h post i. v. administration in healthy C57 mice (n = 3) .

[0020] Figure 7: An example of PET / CT imaging of 90Y-NP in rhesus macaque after upper arm i.m. (red arrow indication) administration over time, and results demonstrated an extremely high local retention (an approximate 90%ID at 7-days post injection) , and a high in vivo stability (almost no bone accumulation over time) .

[0021] Figure 8: Comparison in therapeutical efficacy among STING / TLR agonists and PT-001 (NP bound with 5 μg ADU-S100 and 2 μg LOS) (A) , their difference in concentration of cytokine IL-6 in plasma before and after the treatment (B) in 4T1 mouse model (n = 4) , and comparison in therapeutical efficacy among three different syngeneic mouse tumor models (C) .

[0022] Figure 9: A high lesion retention (A) and a high therapeutical efficacy (B) observed for 90Y-PT-001 in PET / CT imaging over 7 days or tumor size measurement after the treatment over time, respectively. The observed high therapeutical efficacy of 90Y-PT001 could be owing to the synergy between radio-and adjuvant immune-therapy with a high accumulation of immune cells in residual tumor tissues at Day-18 post the treatment (C) (n = 4) .

[0023] Figure 10: Challenge studies demonstrated a high therapeutical efficacy as well as a significant “abscopal effect” in 90Y-PT001 group in syngeneic CT-26 tumor model in female BALB / c mice (n = 8) .

[0024] Figure 11: A high therapeutical efficacy and a synergy between radio-and adjuvant immune-therapy observed for 225Ac-PT001 in syngeneic CT-26 tumor model in female BALB / c mice (n = 5) .DETAILED DESCRIPTION

[0025] The present disclosure describes compositions and processes of preparation for CH-based nano-carriers as pharmacologically stable and multifunctional carriers specifically for therapeutic agents and their application accordingly. In some embodiments, this disclosure is related a multi-step method for the synthesis of the CH-based nano-carriers, which is first composed by crosslinking the cationic chitosan with ionic crosslinkers, where the created intermediate nanoparticles are stabilized with metal elements via chelating chemistry, and eventually, the high carrying capacity nano-carriers are obtained with high density of the preserved free amine groups by the removal of the ionic crosslinkers. Specifically, the present disclosure describes the applications of the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carriers for, such as but not limited to, therapeutic radionuclides and immune stimulating agents for cancer therapy. More specifically, the disclosure describes a “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach functioned as autologous “in situ” therapeutic vaccine for cancer, where the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carriers can efficiently carry both therapeutic radionuclides and STING / TLR agonists, wherein the CH-based nano-carriers remain even distribution and long-retention within the lesion after local administration. In one embodiment, this disclosure relates the “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach, where the “radiation ablation” causing tumor immunogenic cell death, increasing the releasing of the tumor associate antigens, and along with the combined adjuvant immunotherapy by the STING / TLR agonists. In more embodiments, this disclosure relates to the CH-based nano-carriers to other anionic therapeutical agents, such as but not limited to, ASO, anionic peptides, e.g., Semaglutide, or other anionic agents, e.g., ascorbyl phosphate, and their therapeutic applications.

[0026] Cationic Biopolymers

[0027] The present disclosure relates to cationic biopolymers, which are characterized as macromolecules that possess positive charges, either inherent in polymer side chains and / or its backbone. Cationic biopolymers have been employed commonly in drug delivery because of their superior encapsulation efficiency, low toxicity, and improved profile (Calixto G., Pharm Sci Tech 2019; Chen J., Sci Adv. 2021; Schnurch A. B., Eur J Pharm Biopharm 2012; Smith R., Sci. Adv. 2022) . This disclosure relates to natural or synthetic cationic polymers, including, but not limited to cationic peptides and their derivatives (e.g., polylysine and polyornithine) , linear or branched synthetic polymers (e.g., polybrene and polyethyleneimine) , polysaccharides (e.g., cyclodextrin, cellulose and chitosan) , natural polymers (e.g., histone, collagen, and gelatin) , and activated and non-activated dendrimers. More specifically the present disclosure relates to cationic biopolymer of chitosan for creating the pharmacologically stable and multifunctional nano-carriers.

[0028] Chitosan (CH) , an N-deacetylated product of chitin, as an example, has been proved as a biopolymer with properties of low-toxicity, biodegradability, biocompatibility, hemostasis and biomembrane-adhesion (Neimert-Andersson T., Vaccine. 2014) . CH and its derivatives have received significant scientific interests and have become one of the hottest topics in recent decades, especially for medical and pharmaceutical applications, including in drug delivery. Moreover, owing to its cationic property that can easily bind to negatively charged biomembrane surfaces as well as the capability of penetrating the tight junctions between epithelial cells, CH is a good candidate for the drug encapsulation and controlled-release. CH-based hydrogel for potential prevention of postoperative peritoneal adhesion is under investigation by numerous groups.

[0029] Low toxicity of CH: CH is widely regarded as being a non-toxic, biologically compatible biopolymer. It is approved for dietary applications in Japan, Italy, and Finland. CH has also been approved by the FDA for use in wound dressings. The modifications made to CH can make it more or less toxic and any residual reactants should be carefully removed.

[0030] CH is found to display little in vitro cytotoxicity against CCRF-CEM (human lymphoblastic leukemia) and L132 (human embryonic lung cells) (IC50 > 1 mg / ml) . Interestingly, CH seems to be toxic to several bacteria, fungi and parasites. This pathogen-related toxicity is an effect which could aid in infectious disease control.

[0031] In vivo toxicity assessment particularly after long term administration is of high importance for CH designed for the usage in drug delivery. In a relatively long study (65 days) , no detrimental effect on body weight was found when CH oligosaccharides were injected (7.1 -8.6 mg / kg over 5 days) . However, there was a report that a high dose of CH (50 mg / kg) with an intravenous administration caused mice death, probably due to blood aggregation. CH was not pyrogenic and caused no eye or skin irritation in rabbits and guinea pigs respectively. No toxic effect was noted after subcutaneous implantation of 200 μl of 30 mg / ml photo-crosslinked azide-CH-lactose gel. It is reported that CH has an LD50 of greater than 16 g / kg in oral administration to mice, which is comparable to that of sucrose.

[0032] CH degradation &biodistribution: Chemical characterization assays determining the degradation of CH commonly use viscometer and / or gel permeation chromatography to evaluate a decrease in molecular weight. CH is pharmacologically stable in vitro under non-enzymatic conditions, and lysozyme has been found to efficiently degrade CH. This degradation appears to depend on the degree of acetylation with degradation of acetylated CH (more chitin like) showing a faster rate. A range of proteases have been found to degrade CH-formed film in varying degrees, with leucine amino-peptidase being the most effective, which can degrade the film by 38%over 30 days.

[0033] CH degradation after intravenous administration has been rarely reported because of the potential blood agglutination. It is somewhat unclear what the mechanism of degradation is when CH is injected intravenously. It is likely that degradation and elimination of CH are strongly dependent on the molecular weight and the degree of acetylation. Possible sites of degradation, inferred from the localization of CH, may be in liver and kidney. CH has also been administered subcutaneously, in most cases as an implant. A proposed skin substitute of glutaraldehyde cross-linked CH / collagen is relatively pharmacologically stable over time compared to collagen alone when implanted subcutaneously in rabbits.

[0034] The distribution of CH nanoparticle is related to all aspects of its formulation from the molecular weight and degree of deacetylation to the nanoparticle size. In the case of a nanoparticulate formulation, the kinetics and biodistribution are initially controlled by the size and charge of the NPs, but not by CH. However, after particle decomposition to CH, free CH can distribute in the body and eliminate thereafter. Elimination processes can be preceded by biodegradation. Obviously, CH can be modified in such a way that it is possible to create formulations that exhibit quick release characteristics or long-acting dosage forms which therefore affect CH kinetics, metabolism and excretion.

[0035] Therapeutic Radionuclides

[0036] In the early 1900s, Henri Becquerel and Marie Curie discovered radioactivity, therapeutic applications immediately followed this discovery. For many years radionuclide therapy was limited to the use of Iodide-131 (131I) for thyroid cancer and phosphate-32 (32P) for polycythemia vera. The development of new radiopharmaceutical therapy (RPT) has been growing exponentially, especially RPT currently become popular in theranostic, where RPT being used after imaging verifies the presence of a biological target.

[0037] The physical characteristics of a radionuclide should be considered when selecting it for therapy purposes. These include physical decay half-life, radiation energy, type of emissions, daughter product (s) , as well as radionuclide purity. Radionuclides used in RPT are primarily beta-particle or alpha-particle emitters. Table 1 lists the most commonly used heavy metal radionuclides and their characteristics, where a chelate or a “cage” is usually needed for these radionuclides used in RPT. The radiation destroys the cell directly and indirectly. The distance traveled by particles and the energy deposited in cells must be considered to ensure optimal targeted cell destruction and minimize ionization interaction with healthy cells.

[0038] Table 1. Characteristics of the commonly used heavy metal radionuclides in RPT

[0039] The high-energy beta-emitters, e.g., Yttrium-90 (90Y) , are preferable for treating higher volume solid and poorly perfused tumors and is less suited for targeting micro-metastases to avoid crossfire doses to neighbor cells. 90Y is a popular radionuclide for liver cancer as well as liver metastases from other cancers. Low-energy beta-emitters, e.g., lutetium-177 (177Lu) , are more efficient for small tumors. In addition, 177Lu also emits gamma-rays and can be detected externally as a theranostic agent. Alpha particles are high energy and have shorter path lengths, resulting in higher efficacy in some applications. An alpha particle is identical to a helium nucleus consisting of two protons and two neutrons tightly bound together. Alpha radiation is emitted from the nucleus of a radioactive atom undergoing decay with an energy of 4-9 MeV, and the particles travel only1-3 cell diameters (40-100 μm) in tissue. Owing to their extremely high LET (linear energy transfer, 60-230 keV / μm, particle deposit energy per unit path length) , the alpha-particles’ cytotoxicity is approximately 1500 times higher than that of beta particles.

[0040] In the last three decades, there has been a rapid increase in the use of new nanomaterials to carry radionuclides to enhance cancer diagnosis and therapies. Especially, when NP in a size <100 nm, it can increase its tumor localization via the enhanced permeability and retention (EPR) effect to increase the imaging and therapeutic efficacy, while reducing its side toxicity. However, each nanoparticle type can possess certain advantages and disadvantages based on their inherent features of a particular material, such as solubility, thermal conductivity, ability to bind biomolecules, chemical stability, biocompatibility, immunogenicity, and so on.

[0041] Anionic STING / TLR agonists used in adjuvant immunotherapies

[0042] STING agonists. The presence of cytosolic dsDNA is indicative of viral or bacterial infection or severe tissue damage, which can bind to the nucleotide cyclase enzyme cGAS that subsequently synthesizes cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate (cGAMP) dinucleotides. In turn, cGAMP activates STING (STimulator of INterferon Gene) that is deployed on the cytosolic surfaces of Golgi and cytoplasmic vesicles to elicit potent type I IFN transcription through the TBK1-IRF3 signaling pathway. The STING pathway can foster antigen presentation to CD8+ T cells and initiate the antitumor immunity. Moreover, STING signaling also seems to be important for the immunostimulatory effects, e.g., abscopal responses in radiotherapy and / or immune checkpoint inhibition (Corrales L., Clin Cancer Res 2015; Moore E., Cancer Immunol Res 2016) . Quite a few human STING agonists have entered clinical trials, with good safety but minimal antitumor activity observed to date with monotherapy, even upon repeated injections (Kong X., J Adv Res. 2023; Woo S. R., Immunity 2014) . In combination, there are a few studies as local administration of STING agonists in combination with systemic anti-PD-1 mAbs. For example, in a phase I trial, repeated intratumoral injection of the STING agonist MIW815 (ADU-S100) in combination with spartalizumab was safe and induced objective responses in a minority of patients. Similarly, in a phase I trial, another intratumoral STING agonist, MK-1454, in combination with Keytruda had good tolerability but limited clinical activity. Thus, the high expectations surrounding STING agonists have not been satisfied so far (Shae D., Nat Nanotechnol. 2019) .

[0043] TLR agonists: TLRs (Toll-Like Receptor) are expressed in innate immune cells such as dendritic cells (DCs) and macrophages. TLRs are largely classified into two subfamilies based on their localization, cell surface and intracellular TLRs. Cell surface TLRs include TLR1, TLR2, TLR5, TLR6, and TLR10, whereas intracellular TLRs are localized in the endosome and include TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, TLR11, TLR12, and TLR13. Unlike others, TLR4 are localized both on surface and intracellular (Chakraborty S., Front Immunol. 2023) . Cell surface TLRs mainly recognize microbial membrane components such as lipids, lipoproteins, and proteins. Intracellular TLRs recognize nucleic acids derived from bacteria and viruses, and also recognize self-nucleic acids in disease. The following are a few examples of TLR agonists being used as adjuvants in cancer immune-therapy.

[0044] TLR4 agonists. TLR4 is a cell surface receptor that recognizes bacterial lipopolysaccharide (LPS) and was discovered as a result of its roles in septic shock and DC maturation. In addition to LPS, TLR4 responds to endogenous stimuli, such as the nuclear protein HMGB1, that act as damage associated molecular patterns (DAMPs) . Systemic targeting of TLR4 is clearly dangerous given that this receptor is the main mediator of septic shock; therefore, localized targeting is required. Low toxic LPS derivatives, such as LOS (lipooligosaccharide) and MPLA (monophosphoryl lipid A) , especially MPLA, a detoxified form of LPS, has been approved as an adjuvant in vaccines used in human. However, MPLA has not been used clinically for intratumoral immunotherapy despite many reports showing antitumor effects with intratumoral injection in mouse xenograft models. Figure 2 shows the structure of MPLA and KLA (Kdo2-Lipid A an E. coli LOS) . The TLR4 agonist G100 (GLA-SE, glucopyranosyl lipid A formulated in a Stable oil-in-water Emulsion) , a fully synthetic analogue of MPLA, has been tested intratumorally in patients with Merkel cell carcinoma, with objective tumor regressions observed in both the neoadjuvant and metastatic settings. G100 has also been tested in combination with low dose irradiation, with or without pembrolizumab or rituximab, in a phase I / II trial involving patients with follicular lymphoma (NCT02501473) ; the approach was remarkably safe and the ORR with G100 plus irradiation was 26%. In this setting, consideration must be given to the fact that the malignant B cells express functional TLR4 and are therefore likely to be directly responsive to G100 (Bhatia S., Clin Can Res 2019; Coler R. N., Vaccines. 2018; Reed S. G., Semin Immunol. 2018; Sagiv-Barfi I., Blood 2015) .

[0045] Nanoparticle-carry for LPS or LOS, producing stable pathogen-mimicking nanostructures suitable for targeting antigen presenting cells in the lymph nodes, showed efficient tumor immunotherapy in animal tumor models (Shen H., J Immunol 2008; Smith R., Sci. Adv. 2022) .

[0046] TLR3 agonists. TLR3 is an endosomal receptor for double stranded RNAs (dsRNAs) that often constitute viral genomes or intermediates in the viral replication cycle. Polyinosinic : polycytidylic acid (poly I: C) is a self-hybridizing dsRNA analogue that was originally described as a potent inducer of IFNα / β production by a variety of leukocytes. TLR3 is prominently expressed in DCs, and intratumoral injection of poly I: C induces potent immune mediated tumor regression in mouse models.

[0047] TLR9 is present inside endosomes of myeloid cells, B cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC) , and recognizes contiguous CpG dinucleotide sequences in bacterial or viral double stranded DNA (dsDNA) . TLR9 agonists comprising short, contiguous CpG oligonucleotides have a spectrum of proinflammatory activities and can be classified into three categories depending on their structure and the most abundant cytokines they elicit: type A, which predominantly induce the type I interferons IFNα / β; type B that induce TNF, IL-12, IFNγ and IL-6; and type C that induce both sets of cytokines. Type C oligonucleotides are considered most suitable for antitumor immunity. Pioneering studies of TLR9 agonists for cancer immunotherapy utilized a series of CpG oligonucleotides formulated for subcutaneous injection. Following promising results from a randomized phase II trial, PF-3512676 in combination with chemotherapy for first line treatment of advanced stage non-small cell lung carcinoma (NSCLC) , was halted owing to negative results of phase III trials. However, TLR9 agonists eliciting IFNγ and IFNα / β responses have been revisited for intratumoral administration. More recently, 29 patients were treated with SD-101, of whom six (21%) had an objective response; regression of the injected tumor occurred in almost all patients, with regression of uninfected lesions also noted in 24 patients (83%) . Other TLR9 agonists include tilsotolimod, MGN1703 and CMP101, all of which are being tested as intratumoral immunotherapies in clinical trials. Tilsotolimod (previously known as IMO-2125) is the most advanced TLR9 agonist in clinical development and is being tested in combination with ipilimumab in a phase III trial involving patients with anti-PD-1 mAb refractory advanced stage melanoma (NCT03445533) . This trial was initiated based upon promising results with the same combination in the phase I / II trial (NCT02644967) , which revealed an objective response rate (ORR) of 22%, a disease control rate of 71%and a median overall survival (OS) duration of 21 months in this difficult-to-treat patient population.

[0048] Preparation of CH-based nano-carriers

[0049] The present disclosure relates to the compositions and the association methods being used for the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carriers. CH, a deacetylated form of chitin, has functional groups of amines (-NH2) and hydroxyl (-OH) , which donate a pair of electrons in metal chelating chemistry. The present disclosure describes a multiple-step method to create pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carriers by heavy metal elements via chelating chemistry. For example, first, CH-based intermediate NPs is created with small molecular ionic crosslinker, which includes, but not limited to, citrate, EDTA, and tripolyphosphate (TPP) , reacted with amines of CH, wherein, the ionic crosslinker, such as TPP, applied here is double agent for intermediate NPs formation and amine group protector; second, the intermediate NPs will be further stabilized by adding and chelating heavy metal via excess amines and hydroxyl groups; finally, the product of CH-based nano-carrier with high density of free amines could be obtained by removal of TPP under base condition. The amine (-NH2) groups in the CH-based nano-carriers could be protonated into NH3+ with high binding capacity to anionic therapeutic agents under acidic conditions. In order to properly control the carry capacity and its stability, the size, surface charge and strength of the formed nano-carriers have been assessed and optimized.

[0050] The CH-based nano-carriers described in this disclosure are particles with a size range of 10 to 1000 nm in diameter, more specifically, a size range of 50 to 500 nm (e.g., 50-450 nm, 50-400 nm, 50-350 nm, 50-300 nm, 50-250 nm, 50-200 nm, 50-150 nm, 50-100 nm, 100-500 nm, 100-450 nm, 100-400 nm, 100-350 nm, 100-300 nm, 100-250 nm, 100-200 nm, 100-150 nm, 150-500 nm, 150-450 nm, 150-400 nm, 150-350 nm, 150-300 nm, 150-250 nm, 150-200 nm, 200-500 nm, 200-450 nm, 200-400 nm, 200-350 nm, 200-300 nm, 200-250 nm, 250-500 nm 250-450 nm, 250-400 nm, 250-350 nm, 250-300 nm, 300-500 nm, 300-450 nm, 300-400 nm, 300-350 nm, 350-500 nm, 350-450 nm, 350-400 nm, 400-500 nm, 400-450 nm, or 450-500 nm) .

[0051] Step-1 in the multiple-step method, the intermediate NP synthesis is based on electrostatic interaction between amine groups of CH and anionic groups of polyanion which includes, but not limited to, citrate, EDTA, and tripolyphosphate (TPP) . Specifically, the formation of intermediate NPs is critical for the size, surface charge and strength of final nano-carriers, which, as an example, can be impacted by multiple factors, such as but not limited to, CH characteristics such as molecular weight and degree of deacetylation (DD) , CH concentration, reaction pH and mass ratio of CH : polyanion, as well as with or without addition of stabilizers. More specifically, for example, solutions CH and polyanion in proper concentrations are prepared by dissolving in 0.1 M acetic acid and distilled water, respectively. In some embodiments, the reaction mixture is kept stirring at ambient temperature for 1-18 hours, e.g., about 1 hour, about 2 hours, about 3 hours, about 4 hours, about 5 hours, about 6 hours, about 7 hours, about 8 hours, about 9 hours, about 10 hours, about 11 hours, about 12 hours, about 13 hours, about 14 hours, about 15 hours, about 16 hours, about 17 hours, or about 18 hours. In some embodiments, the pH of the reaction is about 3-6, e.g., about 3, about 3.5, about 4, about 4.5, about 5, about 5.5, or about 6. In some embodiments, the starting concentration of CH is about 0.5-5 mg / ml, e.g., about 0.5 mg / ml, about 1 mg / ml, about 1.5 mg / ml, about 2 mg / ml, about 2.5 mg / ml, about 3 mg / ml, about 3.5 mg / ml, about 4 mg / ml, about 4.5 mg / ml, or about 5 mg / ml. In some embodiments, the molecular weight of CH is about 10-300 kDa (e.g., about 10-300 kDa, about about 10-250 kDa, about 10-200 kDa, about 10-150 kDa, about 10-100 kDa, about 10-50 kDa, about 50-300 kDa, about 50-250 kDa, about 50-200 kDa, about 50-150 kDa, about 50-100 kDa, about 100-300 kDa, about 100-250 kDa, about 100-200 kDa, about 100-150 kDa, about 150-300 kDa, 150-250 kDa, about 150-200 kDa, about 200-300 kDa, about 200-250 kDa. In some embodiments, the mass ratio of CH / TPP is 2-10: 1, e.g., about 2: 1, about 2.5: 1, about 3: 1, about 3.5: 1, about 4: 1, about 4.5: 1, about 5: 1, about 5.5: 1, about 6: 1, about 6.5: 1, about 7: 1, about 7.5: 1, about 8: 1, about 8.5: 1, about 9: 1, about 9.5: 1, or about 10: 1.

[0052] Step-2, stabilizing the intermediate NPs by adding and chelating heavy metal via excess amines and hydroxyl groups. Chelation is a type of bonding of polydentate molecule to metal ions, involves the formation of two or more separate coordinate bonds and a single central metal atom. The stability of a chelate complex depends on the size of the chelate rings, and usually a chelate structure with five or six member rings form the most pharmacologically stable circle. CH and its derivatives, such as the intermediated NP described here, contain various electron rich sites, through which they can easily bind with metal cations with coordination bonding for numerous metals and alloys, such as but not limited to Mg (II) , Cu (II) , Ca (II) , Mn (II) , Ni (II) , Zn (II) , Fe (II) , Mn (III) , Fe (III) , Ga (III) .

[0053] In some embodiments, the reaction mixture is kept stirring at ambient temperature for about 1-24 hours, e.g., 1 hour, about 2 hours, about 3 hours, about 4 hours, about 5 hours, about 6 hours, about 7 hours, about 8 hours, about 9 hours, about 10 hours, about 11 hours, about 12 hours, about 13 hours, about 14 hours, about 15 hours, about 16 hours, about 17 hours, about 18 hours, about 19 hours, about 20 hours, about 21 hours, about 22 hours, about 23 hours, or about 24 hours. In some embodiments, the mass ratio of CH / metal cations is about 2-10: 1, e.g., 2: 1, about 2.5: 1, about 3: 1, about 3.5: 1, about 4: 1, about 4.5: 1, about 5: 1, about 5.5: 1, about 6: 1, about 6.5: 1, about 7: 1, about 7.5: 1, about 8: 1, about 8.5: 1, about 9: 1, about 9.5: 1, or about 10: 1.

[0054] Step-3, obtaining the CH-based nano-carrier product by removal polyanions, e.g., TPP by increasing the pH to > 9.0 and purifying. In some embodiments, the NaOH solution about 0.001-0.1 M is added to the reaction suspension dropwise under stirring. In some embodiments, the pH of the suspension is about 9-11, e.g., about 9, about 9.5, about 10, about 10.5, or about 11. In some embodiments, the suspension mixture is kept stirring at ambient temperature for 0.5-3 hours, e.g., about 0.5 hour, about 1 hours, about 1.5 hours, about 2 hours, about 2.5 hours, or about 3 hours. In some embodiments, the nano-carriers can by washed and purified by centrifuging or filtration to remove any remained non-reacted polyanions or metal cations or any other impurities.

[0055] CH-based nano-carriers for carrying radioactive metals and / or STING / TLR agonists

[0056] The CH-based nano-carriers described in the disclosure contain high density of amine and hydroxyl groups, through which they can easily bind with metal cations with coordination bonding for numerous radioactive metals, such as but not limited to 68Ga, 89Zr, 111In, 153Sm, 90Y, 177Lu, 212Bi, 212Pb, 223Ra, or 225Ac. Here the CH-based nano-carrier is used as “cage” or chelator for stably carry the metal radioisotopes. In some embodiments, the pH of the reaction is about 3-6.5, e.g., about 3, about 3.5, about 4, about 4.5, about 5, about 5.5, about 6, or about 6.5. In some embodiments, the reaction temperature is about ambient temperature to 95 ℃, e.g., from ambient to 40℃, from 40-60 ℃, from 60-80 ℃, or from 80-95 ℃. In some embodiments, the reaction mixture is kept mixing for 0.5-6 hours, e.g., about 0.5 hour, about 1 hours, about 2 hours, about 3 hours, about 4 hours, about 5 hours, or about 6 hours. In some embodiments, if necessary, the radioactive nano-carriers can by purified by centrifuging or filtration to remove any remained non-reacted radioactive metal or any other impurities.

[0057] In some embodiments, the CH-based nano-carriers contain high density of free amine groups, through which they can easily bind anionic therapeutic agents including STING / TLR agonists. In some embodiments, STING / TLR agonists for this innovation include, such as but not limited to, STING agonists of 2'-3'-cyclic GAMP, MIW815 (ADU-S100) or MK-1454; TLR-3 agonist of Polyinosinic : polycytidylic acid (poly I: C) ; TLR-4 agonists of LPS and LOS derivatives, such as but not limited to LPS, LOS, KLA, GLA and MPLA; TLR-9 agonist of CpG dinucleotide sequences, such as ODN-1018 and PF-3512676. In some embodiments, the pH of the reaction is about 3-6.5, e.g., about 3, about 3.5, about 4, about 4.5, about 5, about 5.5, about 6, or about 6.5. In some embodiments, the reaction temperature is about ambient temperature to 60 ℃, e.g., from ambient to 30℃, from 30-40 ℃, from 40-50 ℃, or from 50-60 ℃. In some embodiments, the reaction mixture is kept mixing for 1-8 hours, e.g., about 1 hours, about 2 hours, about 3 hours, about 4 hours, about 5 hours, about 6 hours, about 7 hours, or about 8 hours. In some embodiments, STING / TLR agonist bound nano-carriers can by purified by centrifuging or filtration to remove any remained non-bound STING / TLR agonist or any other impurities.

[0058] The method of the present disclosure can also be performed using a formulation kit, capable of being associated with radioactive metals via chelating chemistry and / or binding with anionic STING / TLR agonists on the application site. Such kits can contain CH-based nano-carriers in sterile form and can include sterile container (s) of acceptable reconstitution liquids. Such kits can also include, if desired, other conventional kit components, for example, one or more carriers, and / or one or more additional vials for mixing. Instructions, either as inserts or labels, indicating quantities, guidelines for compounding, and protocols for administration can also be included in the kit. In some embodiments, the radioactive product as described herein further comprises a “radiolysis stabilizer. ” As used herein, a “radiolysis stabilizer” refers to radiolysis protecting agent, e.g., ascorbic acid, sodium ascorbate, methionine, seleno-methionine, gentisic acid.

[0059] Dosimetry calculation: The dosimetry of the radiotherapeutic, e.g., 90Y-labeled CH-based nano-carrier product as described herein can be calculated based on the retention / kinetic of the radioactivity within the lesion and in different tissues / organs over time post the administration. In a similar manner, the dosimetry can approximately be estimated from the one calculated for the 90Y-chelated Spheres of radioembolization agent. Yttrium-90 is a beta-emitting radionuclide with average and maximum beta energies of 0.93 and 2.26 MeV, respectively. The average absorbed dose is approximately 50 Gray (Gy) when 1 giga-becquerel (GBq) of 90Y is uniformly distributed across 1 kg of soft tissue. The mean and maximum tissue penetration of the emitted beta particles are 2.5 and 11 mm, respectively. 90Y has a physical decay half-life of 2.67 days (64.2 hours) and thus, about 95%of the radiation dose is delivered within 11 days post administration. Given its relatively short decay half-life, limited tissue penetration, and high beta energy, 90Y is an ideal radioisotope for SIRT for local or locally advanced cancers. Two 90Y formulations are currently approved for clinical use by the United States Food and Drug Administration: resin-and glass-based microspheres. SIR-Spheres (SIRTeX Inc) chelate 90Y on the surface of resin microspheres whereas TheraSphere (BTG International Ltd. ) incorporate 90Y into glass microspheres.

[0060] Despite its poor spatial resolution, Bremsstrahlung SPECT is considered reasonable to estimate the tissue distribution of 90Y. Quantifying Bremsstrahlung SPECT photons, however, has proved challenging due to several factors including wide energy range (0-2.3 MeV) , absence of distinct photopeak (s) , and faulty image quality caused by penetration of high-energy photons through the collimator septa preventing acquisition of high-resolution images. Notwithstanding, elaborate reconstruction algorithms have been developed recently to quantitate 90Y Bremsstrahlung photons with a 5%error margin. More recently, 3D PET / CT scanners equipped with time-of-flight technology has been used for 90Y PET imaging. Yttrium-90 decays to the 0+ first excited state of zirconium-90, and the subsequent deexcitation results in emission of an electron-positron pair in 32 per every 1 million transformations of 90Y. Also, a recent prospective trial in patients with HCC demonstrated a dose threshold of 200 Gy was 100%specific for objective response and had a 100%positive predictive value whereas all non-responders received a dose <200 Gy (Tafti B. A. Semi Nucl Med 2019) .

[0061] Methods of treatment

[0062] The “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach described in this disclosure, can effectively kill the tumor cells by the radiation during the physical decay of the carried radionuclide; following, the APCs localized within the tumor drain lymph node could be selectively and effectively activated by the destroyed tumor cell debris along with the adjuvant of the nano-carried STING / TLR agonists. In some embodiments, the described approach can also be served as autologous “in situ” therapeutic vaccine for cancer.

[0063] In one aspect, the disclosure provides methods for treating a cancer in a subject, methods of reducing the rate of the increase of volume of a tumor in a subject over time, methods of reducing the risk of developing a metastasis, or methods of reducing the risk of developing an additional metastasis in a subject. In some embodiments, the treatment can halt, slow, retard, or inhibit progression of a cancer. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of in the number, severity, and / or duration of one or more symptoms of the cancer in a subject. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of the likelihood of recurrence of cancer in a subject.

[0064] In one aspect, the disclosure features methods that include administering a therapeutically effective amount of the nano-carried therapeutics disclosed herein to a subject has a solid tumor, e.g., breast cancer, carcinoid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, renal cancer, colorectal cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, or urethral cancer. In some embodiments, an effective amount can be administered in one or more administrations. In some embodiments, effective amounts of radioactivity and / or STING / TLR agonists, as well as their schedules for administering the nano-carried therapeutics disclosed herein may be determined empirically, and making such determinations is within the skill in the art. In some embodiments, a typical one-time usage, biweekly or monthly dosage of an effective amount of the nano-carried radiotherapeutics is in an effective dosage range of 1-50 mCi, e.g., about 1-5 mCi, about 5-10 mCi, about 10-15 mCi, about 15-20 mCi, about 20-25 mCi, about 25-30 mCi, about 35-40 mCi, about 40-45 mCi, or about 45-50 mCi.

[0065] In some embodiments, whole body imaging for the radioactivity can be conducted via SPECT or SPECT / CT (bremsstrahlung measurement) , PET or PET / CT over time within 3 weeks, such as but not limited to, i.e., at 0, 1, 2, 4, 8 &16 days of post injection of the nano-carried radiotherapeutics. The images can be analyzed for the ROIs (region of interest) for different tissues and / or organs including e.g., the loading site, brain, lungs, heart, liver, spleen, stomach, intestine, colon, kidney, bone and muscles. The distribution of the radioactivity as %ID (%injected radioactivity) and / or %ID / g (%injected radioactivity per gram) can be estimated for the ROIs, as well as within the whole body (%ID) over times of post injection.

[0066] In some embodiments, the compositions and methods disclosed herein, such as but not limited to the CH-based nano-carrier carried therapeutic metal radioisotopes and the CH-based nano-carrier carried STING / TLR agonists, can be used as mono or combined for cancer treatment. In some embodiments, the CH-based nano-carrier carried STING / TLR agonists can be used as an adjuvant for vaccination; where, a single, two or more than two STING / TLR agonists can be used to activate APCs resulted in an effective type-1 immune response to promote a better vaccination efficacy.

[0067] In one aspect, the disclosure provides methods for treating other diseases, such as but not limited to CH-based nano-carriers carried ASO that can be used for gene therapies. Local or systemic administration

[0068] The effectiveness and robustness of cancer immunotherapy often lies in its ability to modulate antigen-presenting cells (APCs) and amplify disease-specific humoral and T-cell responses. APCs, such as dendritic cell (DC) can sample and present disease-specific antigens via major histocompatibility complexes (MHCs) , and further prime antigen-specific T and B cells in the lymphoid tissues, notably tumor-draining lymph nodes (TDLNs) . TDLNs plays a critical role in cancer immunotherapy as potential target sites, and there are certain advantages of local, e.g., intratumoral approach (Aznar M. A., J Immunol 2017; Humeau J., Oncoimmunology. 2021; Wang Y., Immuno-Oncol Tech. 2023) . For instance, local administration route can increase dose exposure and drug bioavailability in the tumor microenvironment while decreasing systemic exposure and limiting immune-related adverse events elsewhere in the body. Similarly, drugs can be delivered at much higher local concentrations than would be feasible or safe by systemic delivery. The preferred routes of a local administration can be apparent to those of skill in the art. Exemplary methods of in vivo local administration include, but are not limited to, intraperitoneal administration, intrathoracic administration, intranodal administration, intratumor administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, transdermal administration, intra-or post-surgery cavity direct injection or impregnation via a catheter, or intravenous administration.

[0069] Intratumoral (IT) injection: Patients with unresectable, locally advanced, or metastatic solid tumors have a poor prognosis and few therapeutic options, especially after having failed standard care therapies. One of promising adjuvant therapies is direct intratumor (IT) delivery of the therapeutic agents. The intratumor radiotherapy (ITR) , also referenced as micro-brachytherapy or interstitial radiotherapy, by directly intratumoral injection of beta-emitting radioactive MS or CCP P-32 has been proven as a relatively safe and effective choice. However, a conflicting evidence on the safety and efficacy observed in current ITRs indicates the necessary of a high retention / even distribution within the lesion post administration for its anti-tumor efficacy.

[0070] As any other micro-brachytherapy, the application of present disclosure of the nano-carried therapeutics can be locally administrated via an intratumoral injection of percutaneous or intraoperative (injection into the unresectable lesions intraoperatively) . Percutaneous injection usually needs to be performed under imaging-guidance; challenge in precise injection is expected much less for an intraoperative IT injection. Imaging-guided, such as ultrasound (US) or computerized tomography (CT) or magnetic resonance imaging (MRI) , percutaneous core needle biopsy has been used extensively in daily clinical practice for the pathologic confirmation for neoplasms. Imaging-guidance for percutaneous injection is necessary for ITR because inadequate local delivery and inhomogeneous dose distribution result in reduced treatment efficacy and potential complications. As an imaging-guidance tool, US has a number of clear advantages over CT or MRI in core needle biopsy: fewer false-negative biopsies, lack of ionizing radiation, portability, relatively short procedure time, real-time intra-procedural visualization of the biopsy needle, ability to guide the procedure in almost any anatomic plane, and relatively lower cost.

[0071] Several factors can impact the distribution and retention of the radioactivity within the lesion, and finally impact the therapeutic efficacy of ITR. These factors include particle size of nano-carriers, administration method, volume and speed of injection, total amount of radioactivity administered, as well as a reliable imaging assay during and after administration. For instance, large size MS may require multiple manual injection locations or in a grid-like pattern, with a small volume in each injection to improve the distribution. Small size nano-carrier can be administered through a single infusion technique in the tumor center, assuming that the pressure force could distribute the NPs throughout the tumor. Empirically, a grid-like injection procedure with small volume depots is advised over a single large infusion for a large tumor.

[0072] For the present disclosure, a needle used for the injection of the nano-carried therapeutics could be a needle in size between 18 and 22G (outer diameter 1.2-0.7 mm) . In addition, the volume and speed of injection can also affect the distribution of the nano-carried therapeutics, and too large volume might result in leakage out of the tumor. With a higher amount of volume, high resistance with a sudden release of syringe pressure is often felt for the leakage during infusion. For this disclosure as ITR, an injection volume of less than 20%of the tumor volume is suggested to ensure an even distribution with minimized possibility of leakage.

[0073] Leakage appears to follow the path of least resistance. Potential routes of leakage include external leakage and internal leakage. External leakage from the syringe can occur due to high resistance in the tumor. Internal leakage to surrounding normal tissues can usually be divided in hematogenous or intravenous and intraductal leakage. In the majority of human and animal studies, some degree of intravenous leakage or shunting of particles through the capillary bed has been reported. Some studies reveal a bi-phasic drainage of the injected particles out of the tumor, a fast wash-out phase followed by a slow decline. Lymphatic drainage is an additional potential route. This well-known route of tumor drainage is commonly used in the sentinel node procedure. The MS may presumably be too large for drainage of significant amounts of radioactivity to the draining lymph nodes.

[0074] A suggested amount of radioactivity for this disclosure as ITR is an average absorbed dose of not less than 100 Gy for the tumor as micro-brachytherapy. The absorbed dose can be calculated based on the retention / kinetical of the radioactivity in the tumor over time. As mentioned previously, a direct IT injection with tumoricidal particles does not automatically lead to an effective tumor treatment. Since an insufficiently absorbed dose, apart from total absorbed dose, an evenly intratumor distribution of the radioactivity is critical, as any missed parts of the tumor can result in residual vital tumors. This disclosure of the nano-carried therapeutics can be a potential solution for the challenges of existing ITR, because of its observed characters of even distribution and long retention after local administration, as well as its additional effect on immune stimulation.

[0075] Peritoneal and thoracic intracavity administration

[0076] One of the examples of intracavity injection is peritoneal for ovarian cancer. Ovarian cancer is the most lethal of the gynecologic cancers, with a 5-year survival rate less than 50%. The unique pattern of dissemination as transperitoneal spread is the most common route in ovarian cancer such that, diagnosis, the tumor is confined to the abdominal and pelvic cavity in approximately 85%of patients. Radiation therapy has been historically used in the adjuvant setting for the management of ovarian carcinoma of all tumor subtypes with reasonable results. Because ovarian cancer is rarely confined to the pelvis, whole pelvic radiation is a largely ineffective method of disease control since it does not treat the entire volume at risk of recurrence. However, the low doses required to meet tolerance of the bowel, kidneys, and liver are ineffective in eradicating gross residual disease in the peritoneal cavity resulting in poor therapeutic efficacy. Additionally, the toxicity of radiation therapy is particularly high when using wide-field external irradiation. High rates of both acute and late toxicity, particularly gastrointestinal, resulted in the abandonment of radiation in this disease particularly when cisplatin is confirmed to be a highly active systemic agent. Improved radiation techniques with lower toxicity have led to a renewed interest in the use of radiation therapy for metastatic ovarian cancer as well as peritoneal metastases form cancers with other disease origins / sites.

[0077] Radioactive insoluble colloids, in particular CCP P-32, have a history of being used as adjuvant treatment for ovarian cancer. With a direct injection into the peritoneal cavity, CCP P-32 has become the agent of choice for the treatment of ovarian cancer and the palliation of malignant ascites since 1960s. Improvement in recurrence rates and even survival has been demonstrated for patients with endometrial cancer and positive peritoneal cytology. However, CCP P-32 for early-stage disease is abandoned due to no difference in survival rate compared to the easier administration and lower toxicity of newer chemotherapeutic agents (platinum) . With aggressive therapy at diagnosis, including surgery and platinum-based chemotherapy, more than 80%of women diagnosed with advanced disease can have an initial complete response. Unfortunately, these responses are infrequently durable and the majority of women with ovarian cancer develop recurrent disease, which is typically incurable although subsequent response and months of survival may still be possible. Hence, a new adjuvant treatment with high efficacy and low toxicity is needed to prevent recurrences. This disclosure of the nano-carried therapeutics can efficaciously eradicate the tumors via local administration, increase the releasing of the tumor associate antigens along with its additional effect on immune stimulation.

[0078] Postsurgical cavity administration

[0079] Another example of intracavity administration is to deliver this disclosure of the nano-carried therapeutics within a surgical created cavity (e.g., via a catheter or needle) . Although treatment modalities vary considerably depending on stage and location, surgical excision is an integral part of treatment for most solid tumors. The goal of surgical resection is the removal of cancer both gross and microscopic. However, incomplete excision as well as residual tumor cells left in the surgical cavity is one of the main reasons of recurrence, and additional post-surgery adjuvant treatments are often prescribed. For example, based on a study of 10 million cancer patients with surgical treatment from year 1998 to 2012 in the largest oncology database, the National Cancer Data Base (NCDB) , 6.5 million out of 10 million cancer patients showed surgical margin data for the resected specimen; among them an overall 30%positive surgical margin (PSM) occurs in T4 category of the ten most common solid organ cancers in the USA. The listed ten most common solid cancers are cancers of prostate, breast, lung and bronchus, colon and rectal, urinary bladder, thyroid, kidney and renal pelvis, uterine corpus, oral cavity, ovarian. In one aspect, the disclosure involves treating the subject having these solid cancers with the nano-carried therapeutics as described herein (e.g., after surgical removal or during surgical removal of these solid cancers) . For example, over the last decade, breast-conserving surgery followed by whole breast irradiation became the standard of care for the treatment of early-stage breast carcinoma to prevent the recurrence. However, the necessity of giving whole breast irradiation for patient after breast conserving surgery has been questioned, due to serious side effects caused by the external beam radiation. In recent years, many studies compared whole breast irradiation with partial breast irradiation, whether in the form of intraoperative single dose radiation or brachytherapy (the treatment of cancer at a short distance with a radioactive isotope placed near, on, or in the lesions or tumor) applied to the surgical site following surgery. Both methods were found to have the same effectiveness while brachytherapy had less toxic side effects.

[0080] Another example of importance to prevent the recurrence after the surgical treatment is brain tumor. Current standard of care for brain tumor includes maximal safe surgical resection, followed by a combination of radiation and chemotherapy. Even with advanced treatment, the prognosis of brain tumor is poor, the rate of recurrence is high, with a median survival of 14.6 months. Due to the short mean survival, a 2-year survival of approximately 26%, new therapeutic strategies for brain tumor have been investigated consecutively including local drug delivery approaches. For example, interstitial radiotherapy has been suggested by using I-125 and Ir-192 temporary and permanent implants. Interstitial high-dose-rate therapy needs complicated implantation techniques such as CT-guided surgery, and is frequently associated with relatively high toxicity. Interstitial low-dose-rate therapy, temporary implants are preferred as permanent implants bear an increased risk of prolonged edema. Brachytherapy with temporary implants can lead to prolonged survival in patients with recurrent glioma, but it is associated with morbidity and relatively high costs. A third approach is the GliaSite, a technological alternative to seed-implantation, in which radiation is applied via a surgically inserted balloon catheter which is filled with a liquid I-125 containing solution to deliver a high-dose-rate therapy. This device is showing promising results in the recurrent disease setting; however, this approach has some shortcomings in terms of uncertainties of dose distribution, side effects and invasiveness in a highly palliative treatment setting.

[0081] Despite the ability to deliver a high radiation dose, current brachytherapy and / or SIRT cannot evenly fill the surgical cavity which raised questions about the homogeneity of the irradiation on the surgical margins. Therefore, a new approach with an even distribution, less invasive and low toxicity is warranted for almost all locally advanced solid tumors due to frequent recurrences after surgical treatment. For instance, the present disclosure of the “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach including both locally radiotherapy and locally and systemically immune therapy can prevent the recurrence.

[0082] A brief outline of the present disclosure of the “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach or as an autologous “in situ” therapeutic vaccine, where the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carriers for carrying both therapeutic radionuclides and STING / TLR immune stimulating agents for cancer treatment has advantages as: 1) the even distribution and long retention of the nano-carried therapeutics after local administration, such as but not limited to intratumor administration, intra-or post-surgery cavity direct injection; 2) the efficacious eradication of the tumor cells by the nano-carried radiotherapeutics; 3) the increased release of the tumor associated antigens to the APCs located in tumor-drain lymph node; and 4) the additional immunotherapy occurred along with the sustained release of the STING / TLR immune stimulating agents.

[0083] In some embodiments, besides anionic STING / TLR agonists, the cationic CH-based nano-carriers can also effectively carry other anionic agents, such as but not limited to folic acid and its derivatives, ASO, anionic peptides, e.g., Semaglutide, or other anionic agents, e.g., ascorbyl phosphate, and their therapeutic applications, respectively.

[0084] EXAMPLES

[0085] The following examples are intended for the purpose of illustration of the present invention. However, the scope of the present invention should be defined as the claims appended hereto, and the following examples should not be constructed as in any way limiting the scope of the present invention.

[0086] Materials

[0087] The molecular weight of chitosan (CH) used in the present disclosure is in a range of 10-300 KDa with a degree of deacetylation (DD) of greater than 70%. The CH or CH solution can be sterilized by autoclaving (121℃, 20 minutes) . A GMP grade of CH, can be used for clinical supply. Other chemicals and materials, with high purity and quality, were purchased from vendors and used without any further purification in the following examples.

[0088] Example 1: Synthesis of CH-based nanoparticles (NPs) as nano-carriers

[0089] In this example, the experiments have been conducted to evaluate the impact of different parameters, such as molecular weight, DD and concentration of CH, different crosslinker and mass ratio of CH : crosslinker, reaction pH, as well as with or without addition of stabilizer, on size and strength of the formed NPs. Three different molecular weight, e.g., 50, 85 and 135 kDa with a DD of >90%of CH have been tested in this example for comparison. At a pH < 6.0, the CH-based nano-carriers being turned to cationic can act as nano-carriers for anionic therapeutics, which is essentially the basis for ion-exchange chromatography. The CH-based NPs can vary in effectivity and affinity for complexation of anionic therapeutics based on the content of amino functional groups. Hence, besides its size and stability, the density of amine or zeta potential of the CH-based NPs have also been evaluated.

[0090] Synthesis of CH-based intermediate NPs with small molecular anionic crosslinkers

[0091] This example described the process of creating CH-based intermediate NPs with small molecular anionic crosslinkers, e.g., citrate or TPP. Briefly, a stock solution of CH (2%w / w) was prepared by dissolving the CH in 0.1M acetic acid, and then kept in a 4℃refrigerator overnight to ensure a complete dissolution. A stock solution (2.5%or 5%w / w) of citrate or TPP was prepared in distilled water. CH solutions in different concentrations of, e.g., 0.5, 1, 2, 3 or 5 mg / ml, were prepared by diluting the CH stock solution (2%w / w) with acetic acid solutions, ensuing approximately 5%molar excess of acetic acid as compared to glucosamine in CH. A proper concentration of crosslinker, e.g., citrate or TPP, was prepared in order to keep a constant volume ratio of CH to crosslinker of 2 : 1 for the reaction. A range of reaction pH tested in this example was between 3-6, which was adjusted by 0.1 M acetic acid. The synthesis of CH-based NP was conducted in a 20-ml glass vial, with a start CH concentration of 0.5, 1, 2, 3, or 5 mg / ml. To 10 ml CH solution under magnetic stirring, 5 ml of crosslinker solution in a 5-ml syringe equipped with a 12G needle was added dropwise. The reaction mixture was kept stirring at ambient temperature for another hour or overnight (e.g., more than 8 hours) . The formed CH-based intermediate NPs were separated and washed in distilled water by either centrifuging or dialyzing. For example, the intermediate NPs were pelleted and water washed by centrifugation at 2500 rpm for 25 minutes in a Beckman Allegra X-12 centrifuge. The results demonstrated that the size and zeta potential of CH-based intermediate NPs were impacted by different parameters, e.g., the reaction pH, the MW and starting concentration of CH, mass molar ratio of CH / crosslinker.

[0092] Synthesis of pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carriers Because the density of amine on the CH-based nano-carriers is critical for effectively compounding anionic therapeutics, two different methods have been evaluated and compared for the synthesis of the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carriers. The first one is using covalent crosslinkers, e.g., Epichlorohydrin (ECH) via primary hydroxyl group with primary amine groups being protected by TPP. Briefly, a 3-step synthetic assay is described here for the CH-based nano-carriers: step-1, the formation of intermediate CH / TPP NPs; step-2, ECH crosslinking through the primary hydroxyl groups; and step-3, the removal of TPP. The second method of heavy metal chelating via excess amines and hydroxyl groups is used in the place of ECH in the step-2. CH and its derivatives, such as the intermediated NP described here, contain various electron rich sites, through which metal cations can be easily bound via coordination bonding. The metal cations in this disclosure contain numerous metals and alloys, such as but not limited to Mg (II) , Cu (II) , Ca (II) , Mn (II) , Ni (II) , Zn (II) , Fe (II) , Mn (III) , Fe (III) , Ga(III) . For example, Mn (III) and Fe (III) were used in the experiments to evaluate the impact of molar ratio of CH : metal on the size, stability as well as the carrying capacity of the CH-based nano-carriers. The impact of different parameters on the size, zeta potential and stability of the CH-based nano-carriers have been characterized by FTIC and ICP-OES. The carry capacity of the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carriers synthesized by these two methods have also been evaluated and compared (Detail data has not shown here) .

[0093] Example 2: CH-based nano-carrier for anionic therapeutic agents

[0094] In these experiments, the carry capacity of the CH-based nano-carriers and its stability have been tested for anionic agents, such as but not limited to cyclic dinucleotide (CDN) STING agonists, TLR4 and TLR9 agonists, Trecovirsen ASO, anionic peptides, as well as ascorbyl phosphate under different pH. The followings are experiments as examples and results demonstrated that the CH-based nano-carrier can effectively bind these tested anionic agents with an expectation of sustained release after local administration (detail data has not shown here) :

[0095] Test-1: The carry capacity of CH-based nano-carriers for CDN STING agonists.

[0096] In this experiment, the CH-based nano-carriers synthesized with 2 different methods as described in Example 1 have been evaluated and compared for the binding of anionic CDN STING agonists including ADU-S100, MK-1454, E-7766, and 2'-3'-cGAMP. Briefly, 1 mg NP suspension (0.5 ml in 2 mg / mL) was mixed with different amount of CDN agents under different pH, e.g., 4.0, 5.8 or 7.4. After 60 minutes incubation at RT, the NP mixture was precipitated via centrifuging (16,000 RPM for 20 min Eppendorf) ; the remaining CDN agents in the supernatant was measured by spectrophotometric analysis. For binding stability, 5 mg NP suspension (2.5 ml in 2 mg / mL) was mixed with predetermined amount of CDN agents under pH 5.8 or 7.4. After 60 minutes incubation at RT, the NP-bound CDN agents was separated from free ones by centrifuging; the precipitant was resuspended and incubated over time. At the predetermined time points, an aliquot of the suspension was token and the free form of CDN agents in the supernatant was measured by spectrophotometric analysis.

[0097] Test-2: The carry capacity of CH-based nano-carriers for TLR4 agonists.

[0098] In this experiment, the TLR4 agonists, such as MPLA, LPS, LOS (salmonella Minnesota R595 and E. coli, serotype R515) , Lipid A, GLA (glucopyranosyl lipid A) , as well as KLA (Kdo2-Lipid A) were evaluated. MPLA has been approved as vaccine adjuvant used in human, its chemical structure as well as structure of KLA are listed in Figure-2. Briefly, 1 mg NP suspension (0.5 ml in 2 mg / mL) was mixed with different amounts of TLR4 agents under different pH, e.g., 4.0, 5.8 or 7.4. After 60 minutes incubation at RT, the NP mixture was precipitated via centrifuging (16,000 RPM for 20 min Eppendorf) ; the remaining TLR4 agonists in the supernatant was measured by spectrophotometric analysis via Carbocyanine dye assay (Wang C., J Colloid Interface Sci. 2019; Aurell C.A., Biochem Biophys Res Commu 1998) . Briefly, in a 1.5 ml Eppendorf tube, 0.5 ml TLR4 agent sample solution was mixed with 0.3 ml Carbocyanine dye reagent solution and 0.2 ml 0.1 M ascorbic acid. The mixture was incubated at 4 ℃ in dark for 10 min. The sample was measured at absorbance wavelength 472 nm, and the concentration of the free agents in the supernatant was calculated based on the standard curve. For binding stability, 5 mg NP suspension (2.5 ml in 2 mg / mL) was mixed with predetermined amounts of TLR4 agents under pH 5.8 or 7.4. After 60 minutes incubation at RT, the NP-bound TLR4 agents was separated from free ones by centrifuging; the precipitant was resuspended and incubated over time. At the predetermined time points, an aliquot of the suspension was token and the free form of TLR4 agonist in the supernatant was measured by spectrophotometric analysis.

[0099] Example 3: CH-based nano-carrier as “cage” or chelator for metal radioisotopes

[0100] The pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carriers described in this disclosure contain high density of amine and hydroxyl groups, which can be used as “cage" or chelator that can easily bind metal radioisotopes, such as but not limited to 68Ga, 89Zr, 111In, 153Sm, 90Y, 177Lu, 212Bi, 212Pb, 223Ra, or 225Ac. As a “cage” , the CH-based nano-carrier should especially be benefit in stability for carrying alpha-emitter radioisotopes. In this experiment, labeling procedure of CH-based nano-carriers with different metal radioisotopes, e.g., 68Ga, 89Zr, 90Y, 177Lu, 225Ac have been evaluated and optimized, an RCP of great than 90%with a high stability, both in vitro and in vivo, has been obtained. On the other hand, as a control, none or low labeling (RCP<5%) was observed for chitosan alone under the same radiolabeling conditions. In brief, 0.5 mL CH-based nano-carrier suspension (2mg / ml dissolved in 0.2 M, pH 5.0-6.5 acetic acid buffer) was mixed with 50 μL of radioactivity, e.g., 90YCl3 solution. The reaction was mixed for 30-120 minutes at either RT or 40 -60℃. The labeling yield was assessed by TLC with mobile buffer of 0.1 M pH 5.0 citrate buffer. The stability of the purified radiolabeled-NPs was determined by incubating in pH 5.5 acetate buffer, PBS or mouse serum over 24 hours at either room temperature or 37 ℃.

[0101] Example 4: Internalization of CH-based nano-carrier by APCs

[0102] The activation of STING / TLR agonists on APCs could be boosted by their internalization through the CH-based nano-carrier. For this experiment, the CH-based nano-carrier has been conjugated with fluorescein of FITC (fluorescence isothiocyanate) or ICG (indocyanine green) or directly labeled with radioisotopes, e.g., 177Lu. For instance, the fluorescein-conjugated NP could be obtained by incubating 1 mg NPs with 30 μg ICG-NHS in 10%DMSO / PBS for 60 minutes. The exact mechanism on the internalization of CH-based nano-carriers in different cell lines needs to be further assessed.

[0103] To estimate the cellular uptake and internalization, RAW264.7 and hepG2 cells were cultured in growth media (DMEM supplemented with 10%Fetal Bovine Serum (FBS) , 100 units / mL Penicillin, and 100 μg / mL Streptomycin) in a humidified incubator at 37 ℃ under 5%CO2. Cells were seeded in 12 well plates (4.0 x 10^5 cells / well) with 1 mL growth media per well. For fluorescent microscopic imaging, after allowing to adhere for 24 h, the cells were incubated with a concentration of 0.02-0.08 mg / ml FITC-conjugated NPs for approximately 1-, 4-and 16-h, and then the cells were be quickly washed with PBS twice and fixed in 2%paraformaldehyde (in PBS) . The fixed cells were analyzed with confocal imaging for the fluorencence uptake. Figure 3 demonstrates the internalization of the FITC-conjugated CH-based nano-carrier by RAW264.7 (top) and hepG2 (bottom) cells after 16-h incubation.

[0104] Example 5. In vitro assessment for CH-based nano-carrier / STING and / or TLR4 agonists as adjuvants

[0105] Test-1: ROS assessment: Recent studies have gradually revealed the critical role of APC cells in the initiation of T cell response and the following immune cascades, which is indispensable for immunotherapy. Besides the natural inflammatory response, activation and metabolic reprogramming of immune cells have been linked to endogenous ROS (reactive oxygen species) production. As a result, it is suggested that the ROS production is capable of mimicking the inflammatory response of the body to employ the immune-related cells, including DC. In this experiment, the production of ROS by different TLR4 agonists in a concentration of 40 ng / ml with or without being bound to CH-based nano-carrier were evaluated. Intracellular ROS levels could be quantified using a ROS-sensitive fluorescence indicator, DCFH-DA. In viable cells, 2, 7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) is cleaved to DCFH by esterase, followed by ROS oxidation to form a highly fluorescent molecule, DCF. Briefly, cells were seeded in a 24-well plate with a density of 5×10^5 cells / mL / well, and pretreated with TLR4 agonist overnight, then, they were washed twice with washing buffer and loaded with 10 μM DCFH-DA detection reagent. After incubation in darkness for another 30 min at 37 ℃, cells were washed twice with washing buffer. Fluorescence representing intracellular ROS levels was measured at 485 / 20 nm excitation and 528 / 20 nm emission in a fluorescence plate reader or FLOW. In addition, different cell lines, including RAW246.7 to mimic the murine macrophage, and other tumor cell lines (4T1, CT26, MC38 and F10-B16) , have been tested and compared in this experiment. Figure 4 demonstrates a high level of ROS production in RAW246.7 for all tested TLR4 agonists with or without being bound to CH-based nano-carrier, but other tested tumor cell lines. In addition, the ROS production was low for the tested tumor cell lines, however, compared to the control (PBS) , a significant difference was observed in F10-B16, but 4T1, CT26 or MC38 (data not shown here) . This observation may be valuable for TLR4 as a biomarker to distinguish “hot” or “cold” tumor (more investigation is necessary) .

[0106] Test-2: Cytokine production: In this experiment, the production of cytokines has been evaluated and compared with different STING / TLR4 agonists with or without being bound to CH-based nano-carrier in RAW246.7 cell line. Two different cytokines, e.g., IL6 and IFNβ have been measured and the data has been listed in Table 2.

[0107] Table 2: Evaluation and comparison of STING / TLR4 agonists in stimulating RAW264.7 for cytokine production

[0108] *Concentration tested as 5 μg / ml ADU-S100, and / or 0.1 μg / ml TLR4 agonist bound to NP as (40 μg / ml) .

[0109] Example 6. Assessment of immune stimulation of STING / TLR4 agonists for PBMC in vitro

[0110] The activation of immune cells was assessed in flow cytometry as well as ELISA analysis for cytokine production. In this experiment, human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) has been used for the comparison of different forms of STING / TLR agonists with or without being bound to CH-based nano-carrier. Using a kit, CD14+ monocytes were isolated and purified from PBMCs of three donors, and their purity was verified by flow cytometry. The cells were cultured with 50 ng / mL rhM-CSF for 3 days to induce differentiation into M0-type macrophages. Half of the culture medium was replaced, and new cytokines (50 ng / mL rhM-CSF) were added to continue the culture for another two days. The M0-type macrophages were then reseeded into a 96-well flat-bottom plate at a density of 1×10^5 cells per well, and the test substances were added to the corresponding wells. Induction media for M1-type macrophages containing 20 ng / mL rhGM-CSF, 100 ng / mL LPS, and 40 ng / mL IFN-γ, as well as M2-type macrophage induction media containing 100 ng / mL rhM-CSF, 40 ng / mL rhIL-4, and 40 ng / mL rhIL-13, were prepared as positive controls. The 96-well flat-bottom plate was placed in a 37 ℃, 5%CO2 incubator for 24 hours, after which cells were collected for flow cytometry to detect the expression of surface markers CD80 and CD86 on M1-type macrophages. Meanwhile, supernatants were collected for ELISA detection of IL-6 and TNF-α. Figure 5 shows that ADU-S100 significantly increase in the expression of CD80 and CD86; while, TLR4 agonists (both GLA and KLA) induce an increase in the expression of the M1 marker CD80, a decrease in CD86 expression compared to the control group. In addition, all tested STING / TLR4 agonists increased the production of IL-6 and TNF-α compared to the control group.

[0111] Example 7. Tissue distribution of 68Ga-NP post i. v. administration in health mice

[0112] The 68Ga-labeling for the CH-based nano-carrier (68Ga-NP) was conducted per Example-3, and the final product (0.1 ml, 0.2 mCi / ml) was administrated intravenously in healthy C57 mice (n = 3) . Whole body imaging for the radioactivity was conducted via PET / CT at 60 min post injection, and the image was analyzed for the ROIs (region of interest) including liver, spleen, lungs, kidney. The distribution of the radioactivity as %ID (%injected radioactivity) and %ID / g (%injected radioactivity per gram) was estimated for the ROIs. In addition, after the imaging, the animal was terminated, tissues of interest, e.g., brain, lungs, heart, liver, spleen, stomach, small and large intestines, kidneys, skin, muscle, bone and blood was collected and weighted, and their radioactivity was measured. Figure 6 lists the tissue distribution (%ID / g) of 68Ga-labeled CH-based nano-carrier at 1-h post i. v. administration. The data demonstrated that besides the observed high uptake in liver and spleen, approximately 20%of the injected radioactivity (% / ID) was remained in the circulation at 1-h post i. v. injection.

[0113] Example 8. PET / CT imaging of 90Y-NP after i. m. administration in rhesus macaque

[0114] The 90Y-labeling for the CH-based nano-carrier (90Y-NP) was conducted per Example-3, and the final product (0.4 ml, 4 mCi / ml) was locally administrated on upper arm (i.m. ) in healthy rhesus macaque (n = 2, one female and one male, with a BW 7.3 kg and 11.4 kg, respectively) . The PET / CT (GE Discovery 710) imaging was conducted over time, e.g., immediately (0.5-) , 4-, 24-, 48-, 72-and 168-hr post injection. The image was analyzed for the ROIs (region of interest) including the loading site, liver, lungs, kidneys, muscle (deltoid on the other side of the injection site) and bone (humerus) . The %ID (%injected radioactivity for injection site, lungs, liver and kidney) , or %ID / g (%injected radioactivity per gram for muscle and bone) was estimated over time. Figure 7 lists the example of imagings, and the results demonstrated that an extremely high local retention (an approximate 90%ID at 7-days post injection) , and a high in vivo stability (almost no bone accumulation over time) for 90Y-NP have been observed.

[0115] Example 9. Assessment and comparison of STING / TLR agonists as adjuvant immunotherapy in tumor mouse model

[0116] In this experiment, a syngeneic mouse tumor model of 4T1 mammary carcinoma in female BALB / c mice was used. The tumor model was created in mice with an age of 8-9 weeks by subcutaneously injection of 0.1 ml of 4T1 tumor cell suspension, including 1.5E+06 4T1 cell in 50uL 1640 serum-free culture medium and 50uL Corning matrix gel, into the right hind limb. The treatment was started when a tumor volume reached to ～ 80 mm3, with a 3-times injection / treatment (50 μl i. t. ) at Day-0, Day-3 and Day-10. The size of the tumor was measured every other day post the treatment. The blood samples were collected 2 days before and 6-hr after the 1st treatment for cytokine analysis.

[0117] Different STING / TLR agonists, e.g., 3 STING agonists of ADU-S100, MK-1454, and 2'-3'-cGAMP (10 μg per mouse) ; 4 TLR4 agonists GLA, KLA, LPS and LOS (5 μg per mouse) ; and 1 TLR9 agonist ODN-1018 (30 μg per mouse) , with or without bound to CH-based nano-carrier (0.2-0.4 mg per mouse) , had been used in this experiment for therapeutical efficacy assessment and comparison (n = 4 per group) . The results demonstrated that the PT-001 (CH-based nano-carrier carried combo of 5 μg ADU-S100 and 2 μg LOS) was more effective in tumor treatment than all the tested STING / TLR4 agonists, and Figure 8 shows a few examples (Figure 8A) as well as the difference in concentration of cytokine IL-6 in plasma before and after the treatment (Figure 8B) . In addition, besides syngeneic 4T1 mouse tumor model, the high therapeutical efficacy was also observed in another two tumor models (Figure 8C) .

[0118] Example 10. Synergy as “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” in tumor mouse model

[0119] The sample for “combined radio-and adjuvant immune-therapy” (90Y-PT001) was prepared by 90Y-labeling as well as binding ADU-S100 and LOS into the nano-carriers. Briefly, 90Y-labeling for the CH-based nano-carrier was conducted per Example-3, and binding of ADU-S100 / LOS was performed with additional 60-minute incubation at RT with the 90Y-labeled NP. In this experiment, the syngeneic mouse tumor model of CT-26 colon carcinoma in female BALB / c mice was used. The tumor model was created in mice with an age of 8-9 weeks by subcutaneously injection of 0.1 ml of CT-26 tumor cell suspension, including 1.5E+06 4T1 cell in 50uL 1640 serum-free culture medium and 50uL Corning matrix gel, into the right hind limb. The treatment was started when a tumor volume reached to ～ 200 mm3, as “large tumor model” , on Day-0, with a single locally intratumor (i.t. ) injecting 0.05 ml 90Y-PT001 (containing ～ 0.1 mCi 90Y, 5 μg ADU-S100 and 2 μg LOS) . Whole body imaging for the radioactivity was conducted via PET / CT over time, e.g., 0- (within 1-h) , 3-, 6-, 24-, 72-and 168-hr post injection. The image was analyzed for the ROIs (region of interest) including the loading site, liver, spleen, lungs, kidney. The distribution of the radioactivity as %ID (%injected radioactivity) or %ID / g (%injected radioactivity per gram) was estimated for the ROIs, over time. The size of the tumor was measured every other day post the treatment. At the end of the study on Day-18, tissues of tumor and spleen were be collected and stored in -80 ℃ freezer for the radioactivity decay for follow-up analysis, e.g., IHC.

[0120] The data had been summarized in Figure 9. An observation of high radioactivity retention in the lesion, an approximately 85%ID after one week post I. T. injection, was obtained in the PET / CT imaging (Figure 9A) . The tumor growing was completely stopped with a single treatment even in this “large tumor model” (Figure 9B) . In addition, the mechanism for the high therapeutical efficacy of 90Y-PT001 could be the synergy between radio-and adjuvant immune-therapy with a high accumulation of immune cells in residual tumor tissues at Day-18 post the treatment (Figure 9C) .

[0121] Example 11. Challenge study for the “combined radio-and adjuvant immuno-therapy”

[0122] The sample preparation of 90Y-PT001 and animal model were in a similar manner as per Example-10; however, in this experiment, the CT-26 colon carcinoma cells was inoculated on both side of the hind limbs, with the right-side tumor as treated tumor being inoculated 7 days prior to the left-side tumor as untreated tumor. A single treatment with intratumor (i. t. ) injection was start when the size of the right-side tumor reaching approximately ～80 mm3 (n = 8) . The size of the tumors on both sides was measured every other day post the treatment, and the study was terminated on Day-18. The study was repeated once with slightly difference in the component of TLR4 agonist in 90Y-PT001. The results illustrated a synergy between radio-and adjuvant immune-therapy, as well as a significant “abscopal effect” observed in 90Y-PT001 groups comparing to groups with radio-therapy (90Y-NP) or adjuvant-therapy alone (Figure 10A / B) .

[0123] Example 12. The potential therapeutical application of 225Ac-CH-based nano-carrier

[0124] The 225Ac-labeling for the CH-based nano-carrier (225Ac-NP) was conducted per Example-3; the preparation of 225Ac-PT001 sample and the animal model used in this experiment were in a similar manner as per Example-10. The treatment was started when a tumor volume reached to ～ 80 mm3, on Day-0, with a single intratumor (i. t. ) injecting 0.05 ml 225Ac-PT001 (containing ～ 1 μCi 225Ac, 5 μg ADU-S100 and 2 μg LOS) ; the size of the tumor was measured every other day post the treatment. Again, a high therapeutical efficacy and a synergy between radio-and adjuvant immune-therapy was observed for 225Ac-PT001 (Figure 11) .

[0125] Example 13. Drug combinations used for “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” :

[0126] a) pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier;

[0127] b) therapeutic or theranostic radioactive metal isotope; and / or

[0128] c) anionic immune-stimulator adjuvant; and / or

[0129] d) other anionic therapeutic agents, such as ASO (antisense oligonucleotide) anionic peptides, e.g., Semaglutide, or other anionic agents, e.g., ascorbyl phosphate;

[0130] wherein the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier effectively and specifically carry therapeutic or theranostic radioactive metal isotopes, anionic immunotherapeutic agents, and / or other therapeutic agents.

[0131] OTHER EMBODIMENTS

[0132] It is to be understood that while the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

[0133] REFERENCES

[0134] Alimi K. A., Firusin N. &Dempke W. Effects of intralesional 32P chromic phosphate in refractory patients with head and neck tumors. Anticancer Res 2007; 27 (4) : 2997.

[0135] Amouzegar A., Chelvanambi M., Filderman J.N., et al. STING agonists as cancer therapeutics. Cancers. 2021; 13: 2695.

[0136] Atukorale P.U., Raghunathan S.P., Raguveer V. et al. Nanoparticle encapsulation of synergistic immune agonists enables systemic codelivery to tumor sites and IFNβ-driven antitumor immunity. Cancer Res. 2019; 79: 5394-5406.

[0137] Aurell C.A., Wistrom A.O. Critical aggregation concentrations of gram-negative bacterial lipopolysaccharides (LPS) . Biochem Biophys Res Commu 1998; 253: 119.

[0138] Aznar M.A., Tinari N., Rullan A.J. et al. Intratumoral delivery of immunotherapy-act locally, think globally. J Immunol 2017; 198: 31.

[0139] Bakker R. et al., Intratumoral treatment with radioactive beta-emitting microparticles: a systemic review. J Radiat Oncol 2017; 6: 323

[0140] Bhatia S., Miller N.J., Lu H., et al. Intratumoral G100, a TLR4 agonist, induces antitumor immune responses and tumor regression in patients with Merkel Cell Carcinoma. Clin Can Res 2019; 25: 1185.

[0141] Calixto G., Annunzin S.R., Victorelli F.D. et al. CH-based drug delivery systems for optimization of photodynamic therapy: a review. AAPS Pharm Sci Tech 2019; 20: 253

[0142] Chakraborty S., Ye J., Wang H., et al. Application of toll-like receptors (TLRs) and their agonists in cancer vaccines and immunotherapy. Front Immunol. 2023; 14: 1227833.

[0143] Chen J., Qiu M., Ye Z. et al. In situ cancer vaccination using lipidoid nanoparticles. Sci Adv. 2021; 7: 1244.

[0144] Coler R.N., Day T.A., Ellis R. et al. The TLR4 agonist adjuvant, GLA-SE, improves magnitude and quality of immune responses elicited by the ID93 tuberculosis vaccine: first-in-human trial. Vaccines. 2018; 3: 34.

[0145] Corrales L. &Gajewski T.F. Molecular pathways: targeting the stimulator of interferon genes (STING) in the immunotherapy of cancer. Clin Cancer Res 2015; 21: 4774.

[0146] Demaria O., Cornen S., Daeron M. et al. Harnessing innate immunity in cancer therapy. Nature. 2019; 574: 45.

[0147] Flowers C., Panizo C., Isufi I. et al. Intratumoral G100 induces systemic immunity and abscopal tumor regression in patients with follicular lymphoma: results of a phase 1 / 2 study examining G100 alone and in combination with pembrolizumab. Blood 2017; 130: 2771.

[0148] Fu J., Kanne D.B., Leong M. et al. Sting agonist formulated cancer vaccines can cure established tumors resistant to pd-1 blockade. Sci. Transl. Med. 2015; 7: 283.

[0149] Gajewski T.F. &Higgs E.F. Immunotherapy with a sting. Science 2020; 369: 921.

[0150] Grewal E.P., Erskine C.L., Nevala W.K. et al. Peptide vaccine with glucopyranosyl lipid A-stable oil-in-water emulsion for patients with resected melanoma. Immunotherapy. 2020; 13: 983.

[0151] Huang F., Gan G.Y., Lin W.Y. et al. Investigation of the local delivery of an intelligent CH-based 188Re thermosensitive in situ-forming hydrogel in an orthotopic hepatoma-bearing rat model. J Radiational Nucl Chem 2014; 299: 31-40

[0152] Humeau J., Naour J.L., Galluzzi L., et al. Trial watch: intratumor immunotherapy. Oncoimmunology. 2021; 10: e1984677.

[0153] Ishikawa H. &Barber G.N. STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signaling. Nature 2008; 455: 674.

[0154] Kim J.K., Han K-H., Lee J.T. et al: Long-term clinical outcome of phase IIb clinical trial of percutaneous injection with Holmium-166 / CH complex (Milican) for the treatment of small hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res 2006: 12 (2) : 503-8

[0155] Kong X., Zuo H., Huang H.D., et al. STING as an emerging therapeutic target for drug discovery: perspectives from the global patent landscape. J Adv Res. 2023; 44: 119

[0156] Meric-Bernstam F., Sweis R.F., Hodi F.S. et al. Phase I dose-escalation trial of MIW815 (ADU-S100) , an intratumor STING agonist, in patients with advanced / metastatic solid tumors or lymphomas. Clin Cancer Res. 2022; 28: 677.

[0157] Meric-Bernstam F., Sweis R.F., Kasper S. et al. Combination of the STING agonist MIW815 (ADU-S100) and PD-1 inhibitor Spartalizumab in advanced / metastatic solid tumors or lymphomas: An open-label, multicenter, Phase Ib study. Clin Cancer Res. 2023; 29: 110.

[0158] Moore E., Clavijo P.E., Davis R. et al. Established T cell-inflamed tumors rejected after adaptive resistance was reversed by combination STING activation and PD-1 pathway blockade. Cancer Immunol Res 2016; 4: 1061.

[0159] Neimert-Andersson T., Binnmyr J., Enoksson M. et al. Evaluation of safety and efficacy as an adjuvant for the chitosan-based vaccine delivery vehicle ViscoGel in a single-blind randomized Phase I / IIa clinical trial. Vaccine. 2014; 32: 5967.

[0160] O’Hagan D.T., Lodaya R.N. &Lofano G. The continued advance of vaccine adjuvants - “we can work it out” . Semi Immunol. 2020; 50: 101426.

[0161] Re F. &Strominger J.L. Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 differentially activate human dendritic cells. J Biol Chem 2001; 276: 37692.

[0162] Reed S.G., Carter D., Casper C., et al. Correlates of GLA family adjuvants’ activities. Semin Immunol. 2018; 39: 22.

[0163] Sagiv-Barfi I., Lu H., Hewitt J. et al. Intratumoral injection of TLR4 agonist (G100) leads to tumor regression of A20 lymphoma and induces abscopal responses. Blood 2015; 126: 820.

[0164] Schnurch A.B &Dunnhaupt S. CH-based drug delivery system. Eur J Pharm Biopharm 2012; 81: 463.

[0165] Senel S. Current status and future of chitosan in drug and vaccine delivery. Reactive Functional Polymers. 2020; 147: 104452.

[0166] Shae D., Becker K.W., Christov P. et al. Endosomolytic polymersomes increase the activity of cyclic dinucleotide STING agonists to enhance cancer immunotherapy. Nat Nanotechnol. 2019; 14 (3) : 269.

[0167] Shen H., Tesar B.M., Walker W.E. &Goldstein D. R. Dual signaling of MyD88 and TRIF is critical for maximal TLR4-induced dendritic cell maturation. J Immunol 2008; 181: 1849.

[0168] Sheth R.S., Wehrenberg-Klee E., Patel S.P. et al. Intratumoral injection of immnotherapeutics: State of the art and future directions. Radiology. 2024; 312 (1) : e232654.

[0169] Sivick K.E., Desbien A.L., Glickman L.H., et al. Magnitude of therapeutic STING activation determines CD8+ T cell-mediated anti-tumor immunity. Cell Rep. 2018; 25: 3074.

[0170] Smith R., Wafa E.I., Geary S.M., et al. Cationic nanoparticles enhance T cell tumor infiltration and antitumor immune responses to a melanoma vaccine. Sci. Adv. 2022; 8: 1.

[0171] Tafti B.A. &Padia S.A. Dosimetry of Y-90 microspheres utilizing Tc-99m SPECT and Y-90 PET. Semi Nucl Med 2019; 01: 211.

[0172] Tong A., Kao Y.H., Too C.W. et al. Yittrium-90 hepatic radioembolization: clinical review and current techniques in interventional radiology and personalized dosimetry. Br J Radiol 2016; 89: 20150943.

[0173] Tran T.H., Phuong-Tran T.H., Truong D.H. et al. Toll-like receptor-targeted particles: A paradigm to manipulate the tumor microenvironment for cancer immunotherapy. Acta Biomaterialia. 2019; 94: 5.

[0174] Wang C., Nelson T., Chen D. et al. Understanding lipopolysaccharide aggregation and its influence on activation of Factor C. J Colloid Interface Sci. 2019; 552: 540.

[0175] Wang Y. &Wang H. Lymph node targeting for immunotherapy. Immuno-Oncol Tech. 2023; 20: 100395.

[0176] Wang Y-Q., Bazin-Lee H., Evans J. et al. MPL adjuvant contains competitive antagonists of human TLR4. Front. Immunol. 2020; 11: 577823.

[0177] Woo S.R., Fuertes M.B., Corrales L. et al. STING-dependent cytosolic DNA sensing mediates innate immune recognition of immunogenic tumors. Immunity 2014; 41: 830.

[0178] Yang J-X., Tseng J-C., Yu G-Y., et al. Recent advantage in the development of Toll-Like Receptor agonist-best vaccine adjuvants for infectious diseases. Pharmaceutics. 2022; 14: 1.

[0179] Yasaman A., Veerman F.E., Keane G. et al. Current status of yttrium-90 microspheres radioembolization in primary and metastatic liver cancer. J Intervent. Med. 2023; 6: 153.

[0180] Zhu J.L., Yu S.W.K., Chow P.K.H. et al. Controlling injectability and in vivo stability of thermogelling copolymers for delivery of yttrium-90 through intra-tumoral injection for potential brachytherapy. Biomaterials 2018; 180: 163-72.

[0181] Zhu S., Wang Y., Tang J. &Cao M. Radiotherapy induced immunogenic cell death by remodeling tumor immune microenvironment. Front Immunol 2022; 13: 1074477.

Claims

1.Therapeutic approaches, including one as “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” for cancer, which comprising:a) pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier;b) therapeutic or theranostic radioactive metal isotope; and / orc) anionic immune-stimulator adjuvant; and / ord) other anionic therapeutic agents, such as ASO (antisense oligonucleotide) anionic peptides, e.g., Semaglutide, or other anionic agents, e.g., ascorbyl phosphate;wherein the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier effectively and specifically carry therapeutic or theranostic radioactive metal isotopes, anionic immunotherapeutic agents, and / or other therapeutic agents.2.The “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach of claim 1, wherein the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier is injectable nanoparticles (NPs) , wherein an even distribution and long retention obtains in the lesion after local administration as sustain-release for the carried drugs.3.The “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach of claim 1or 2, wherein the therapeutic or theranostic radioactive metal isotope being associated by the CH-based nano-carriers, as “cage” or chelator, via chelating chemistry; wherein the therapeutic or theranostic radioactive metal isotope is selected from, e.g., 166Ho, 68Ga, 89Zr, 111In, 153Sm, 90Y, 177Lu, 212Bi, 212Pb, 223Ra, or 225Ac.4.The “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach of claims 1-3, wherein the anionic immune-stimulator adjuvant being associated by the CH-based nano-carriers via ionic binding which is essentially the basis for ion-exchange chromatography; the anionic immune-stimulator adjuvant is selected from:a) cyclic dinucleotide (CDN) STING agonists, such as 2'-3'-cGAMP, ADU-S100, MK-1454, and E-7766; and / orb) TLR4 agonists, such as MPLA, GLA, Lipid A, LOS, KLA, or LPS; and / orc) TLR3 agonists, such as polyinosinic : polycytidylic acid (poly I: C) ; and / ord) TLR9 agonists, such as ODN-1018.5.The “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach of claims 1-4, wherein further comprises a pH-sensitive polymer, an ionic crosslinker, a covalent crosslinker, a radiolysis stabilizer, or a combination thereof for injection.6.A method of making the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier, used in therapeutic approaches, including one of the “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach, comprising:a multiple-step method for the synthesis of the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier:a) Small molecular ionic cross-linker, e.g., TPP is reacted with amines of CH, where the cross-linker applied here is the double agent for intermediate NPs formation and amine group protector;b) the intermediate NPs are stabilized by heavy metals chelating via excess amines and hydroxyl groups, where the heavy metal could be selected from: e.g., Mg (II) , Cu (II) , Ca (II) , Mn (II) , Ni (II) , Zn (II) , Fe (II) , Mn (III) , Fe (III) , Ga (III) ;c) the CH-based nano-carrier product with high density of free amine groups is obtained by removal of cross-linkers under base condition.7.A method of making the therapeutic approaches, including the “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach, comprising:a) the association of the CH-based nano-carrier of claim 6 with the therapeutic or theranostic radioactive metal isotope, which is selected from: e.g., 68Ga, 89Zr, 111In, 153Sm, 90Y, 177Lu, 212Bi, 212Pb, 223Ra, or 225Ac; and / orb) the association of the CH-based nano-carrier of claim 6 with the anionic immune-stimulator adjuvant, which is selected from: cyclic dinucleotide (CDN) STING agonists, TLR4 agonists, TLR3 agonists, TLR9 agonists; orc) the association of the CH-based nano-carrier of claim 6 with other anionic therapeutic agents, which is selected from: ASO, anionic peptides, e.g., Semaglutide, or other anionic agents, e.g., ascorbyl phosphate.8.The method of claims 6-7, wherein the method further comprises formulating the therapeutic approaches, including one of the “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach for injection and / or implantation as cancer therapeutic drug.9.The “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach of claims 6-8 for use in treating a subject having cancer; the method comprising administering a therapeutically effective amount of the “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” to the subject, optionally wherein the subject has a solid tumor.10.The “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach of claims 6-9, wherein also as an autologous “in situ” therapeutic vaccine, is administered via local e.g., intratumor administration, optionally wherein the intratumor administration comprises imaging-guided percutaneous and / or intraoperative injection, or optionally wherein it is administered into peritoneal cavity, thoracic cavity, a postsurgical cavity, and / or a rescission site of a solid tumor, via a catheter impregnation and / or a direct injection.11.The “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach of claims 6-10 for treating a subject having cancer, comprising:a) the “ionizing irradiation ablation” causing tumor immunogenic cell death, increasing the releasing of the tumor associate antigens; andb) the combined adjuvant immunotherapy increasing the “abscopal effect” , enhancing host’s local and systemic immune response to the tumor.12.The “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach of claims 6-11 for treating a subject having cancer, can be used alone, or combined with any other cancer therapeutic assays, e.g., chemotherapy, radiotherapy, and immunotherapies.13.The therapeutic approaches, including the one of “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” approach can be formulated and used separately as a monotherapy:a) as a new form of SIRT (selective internal radiation therapy) , wherein the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier associated with therapeutic or theranostic radioactive metal isotopes; orb) as a new “adjuvant” for vaccine, wherein the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier associated with anionic immune stimulator adjuvants, such as STING / TLR agonists; orc) as other therapeutic application accordingly, wherein the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier associated with anionic therapeutic agents, which is selected from: ASO, anionic peptides, e.g., Semaglutide, or other anionic agents, e.g., ascorbyl phosphate.14.The therapeutic approaches of claims 1, 6, 7, 13, other than “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” for cancer, where it could be applied for different therapeutic purpose accordingly:a) as a new drug used for gene therapy; where, the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier associated with ASOs; orb) as an alternative GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) oral therapeutic agent; where, the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier associated with anionic peptides, e.g., Semaglutide; orc) as an alternative anti-inflammatory oral therapeutic agent for GI inflammatory disease; where, the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier associated with ascorbyl phosphate.15.Drug combination for “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” of claims 1-12, which comprising:a) pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier;b) therapeutic or theranostic radioactive metal isotope; and / orc) anionic immune-stimulator adjuvant;wherein the pharmacologically stable and multifunctional CH-based nano-carrier effectively and specifically carry therapeutic or theranostic radioactive metal isotopes and anionic immunotherapeutic agents.16.Application of the drug combination of claim 15 in “combined radio-and adjuvant immuno-therapy” for cancer.

Images