Oncolytic viral therapy for treating and preventing human papillomavirus (HPV) -associated malignancies

Abstract

Methods are provided for treating or preventing HPV-related disease by administering to a subject a priming vaccine, and a boosting vaccine, wherein the priming and boosting vaccine each elicit an immune response against HPV. Within various embodiments either the priming vaccine or the boosting vaccine can be a recombinant oncolytic virus which expresses an immunogenic protein derived from an HPV strain which has been mutated so as to no longer cause cancer. Within other embodiments the either the priming vaccine or the boosting vaccine can be an immunogenic protein, or a molecule which expresses an immunogenic protein, wherein said immunogenic protein is derived from an HPV strain which has been mutated so as to no longer cause cancer.

Description

ONCOLYTIC VIRAL THERAPY FOR TREATING AND PREVENTING HUMAN PAPILLOMAVIRUS (HPV) -ASSOCIATED MALIGNANCIESFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present invention relates generally to human papillomavirus infections, pre-cancer and cancer therapeutic strategies utilizing oncolytic virus therapy.

[0002] REFERENCE TO SEQUENCE LISTING, TABLE OR COMPUTER PROGRAM

[0003] The contents of the electronic sequence listing (VIRO428PC_Sequence_Listing. xml; Size: 39.5 KB; and Date of Creation: April 19, 2024) is herein incorporated by reference in its entirety.BACKGROUND

[0004] Human papillomavirus (HPV) is a sexually transmitted double-stranded DNA virus. Persistent HPV infection with high-risk HPV stains is associated with the development of several types of cancer, such as cervical, head and neck, vaginal, vulvar, penile and anal cancers.

[0005] A number of vaccines are currently available to prevent infection by some strains of HPV, including GARDASIL, GARDASIL 9, and CERVARIX. GARDASIL is a quadrivalent vaccine against HPV types 6, 11, 16 and 18. GARDASIL 9 protects against HPV types 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52, and 58 (the latter covering an additional 20%of cervical cancers not covered by the quadrivalent vaccine) .

[0006] Although the current available HPV vaccines generate protective antibodies that effectively prevent HPV infections, they don’t produce effective T cell responses to clear HPV infected cells or HPV-related cancer cells, and hence, are not useful for patients that already have an HPV-related disease.

[0007] Current treatments for HPV-related diseases include topical drug therapy, physical therapy, surgery, radiation and chemotherapy. However, HPV-related malignancies often employ immune escape and immune resistance mechanisms, making such diseases difficult to treat.

[0008] The present invention capitalizes on the advantages of HSV to address the limitations of current tumor therapies, and further provides an optimal prime-boost therapeutic method utilizing mRNA vaccine and oncolytic virus to effectively treat advanced cancer with high intratumoral immune suppression.SUMMARY

[0009] Briefly stated, the present invention provides compositions and methods for treating and  / or preventing HPV-related disease, comprising administering to a subject a priming vaccine, and a boosting vaccine, wherein the priming and boosting vaccine each elicit an immune response against HPV. Within various embodiments the priming or boosting vaccine can be: (a) a recombinant virus which expresses an immunogenic protein derived from an HPV strain which has been mutated so as to no longer cause cancer, or (b) an immunogenic protein, or a molecule which expresses an immunogenic protein, wherein said immunogenic protein is derived from an HPV strain which has been mutated so as to no longer cause cancer. In preferred embodiments, if the priming vaccine is a recombinant virus as described herein, then the boosting vaccine is an immunogenic protein or, a molecule which expresses an immunogenic protein (such as mRNA) , as described herein. Alternatively, if the priming vaccine is an immunogenic protein, or a molecule which express an immunogenic protein, then the boosting vaccine will be a recombinant virus which expresses an immunogenic protein derived from an HPV strain. Within certain preferred aspects of the invention the recombinant virus can be a recombinant oncolytic virus. Within other aspects the recombinant virus can be a recombinant HSV (e.g., HSV-1) , or a recombinant oncolytic HSV ( “oHSV” ) .

[0010] Within various embodiments of the invention, the priming vaccine may be administered multiple (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, or more) times. Within other embodiments, the boosting vaccine may be administered multiple (e.g., 1, 2, 3, 4, 5 or more time) .

[0011] The compositions and methods provided herein provide a number of advantages and benefits, including but not limited to: 1) Recombinant oncolytic viruses as described herein which express HPV immunogens induce both an intratumoral and peripheral immunogen-specific T cell responses that lead to growth suppression of both primary and abscopal tumors; 2) Recombinant HSV-1 OV expressing cytokines (IL12-IL15-IL15RA) enhance the anti-tumor immunity induced by OV therapy; 3) Both a single dose and multiple doses of OV therapy restrict tumor growth, with the latter demonstrating superior efficacy; 4) Single dose and multiple doses of mRNA therapy both restrict tumor growth, with the latter demonstrating superior efficacy; 5) The nrmRNA and saRNA therapy both restrict tumor growth, with the latter demonstrating superior efficacy; in addition, both therapies are suitable for multiple administration routes, including but not limited to intramuscular, subcutaneous, and intradermal; and 7) Within certain embodiments mRNA therapy induces high-level of systemic T cell immune response but has  limited access to the intratumoral immune-suppressive environment, whereas the OV’s strength lays in optimizing the intratumoral immune condition which leads effective tumor infiltration of active immune cells. The two method complements.

[0012] The compositions and methods provided herein also particularly beneficial for treating advanced tumors, while at the same time limiting neural toxicity.

[0013] The detail of one or more embodiments are set forth in the description below. The features illustrated or described in connection with one exemplary embodiment may be combined with the features of other embodiments. Thus, any of the various embodiments described herein can be combined to provide further embodiments. Aspects of the embodiments can be modified, if necessary to employ concepts of the various patents, applications and publications as identified herein to provide yet further embodiments. Other features, objects and advantages will be apparent from the description, the drawings, and the claims.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0014] Features of the present disclosure, its nature and various advantages over the current state of the art will be apparent from the accompanying drawings and the following detailed description of various embodiments.

[0015] FIGs. 1A, 1B and 1C are diagrammatic illustrations of the genomic compositions of oncolytic viruses. FIG 1A depicts the major components of wild-type HSV-1 genome. FIG 1B depicts the modifications and insertions introduced in the genome of T23H05 OV. FIG 1C depicts the modifications and insertions introduced in the genome of T23H12 OV. “mirT” represents five copies of binding domains for miR-124 and miR-143.

[0016] FIGs. 2A, 2B and 2C are diagrammatic illustration of genomic modifications introduced in each cluster of OV. FIG. 2A depicts the gene locus for HPV immunogens insertions. FIG. 2B depicts the gene locus for cytokine insertions. FIG. 2C depicts the tumor-specific replication enhancing elements introduced to the ICP34.5 genes.

[0017] FIGs. 3A and 3B are diagrammatic illustrations of HPV immunogen expression and secretion by oncolytic virus-infected cells.

[0018] FIGs. 4A, 4B, 4C and 4D are diagrammatic illustrations of testing the therapeutic efficacy of OV with and without HPV immunogens, T22H07 and T22F05, respectively, using TC1-tumor-bearing mouse models. FIG. 4A depicts the experimental design. FIG. 4B depicts the tumor  growth curve. FIG. 4C depicts the survival proportions of mice. FIG. 4D depicts the body weight changing rates of the mice.

[0019] FIGs. 5A, 5B and 5C are diagrammatic illustrations of the anti-tumor immune response induced by T22H07 treatment comparing to T22F05 and PBS. FIG. 5A depicts the E7-specific CD8+T cell response in tumor. FIG. 5B depicts the E7-specific CD8+T cell response in the periphery. FIG. 5C depicts the abscopal tumor suppressive efficacy induced by T cell response post OV treatment.

[0020] FIG. 6 is a diagrammatic illustration of HPV immunogen payloads, including HPV16 immunogen, multi-valent immunogen-1, and multi-valent immunogen 2, that were inserted into OVs.

[0021] FIGs. 7A, 7B, 7C, 7E and 7F are diagrammatic illustrations of therapeutic efficacy and immunogenicity of OV with and without cytokine expression, T23H04 and T22H07, respectively. FIG 7A depicts the experimental design. FIG 7B depicts the tumor growth curve. FIG 7C depicts the body weigh changes of mice. FIG 7D depicts the survival proportions of mice. FIG 7E and F depict the E7-specific T cell immune response detected using ELISPOT and flowcytometry, respectively.

[0022] FIGs. 8A, 8B, 8C, 8D, 8E and 8F, depicts the results of dosing and efficacy study of OVs. FIG 8A and 8B depict the experimental design and the major differences between two tested viruses. FIG 8C and 8D depict the tumor growth curve and survival propositions of T23H04-treated mice with different dosage, respectively. FIG 8E and 8F depict the tumor growth curve and survival propositions of T22H07-treated mice with different dosage, respectively.

[0023] FIGs. 9A and 9B depicts the results of the therapeutic efficacy and T cell response levels induced by single and multiple doses of mRNA-LNP vaccine (M22H04) . FIG 9A depicts the tumor growth curve. FIG 9B depicts the E7-specific CD8+T levels in spleen.

[0024] FIGs. 10A and 10B depicts the results of the therapeutic efficacy and T cell response levels induced by nrmRNA vaccine (M22H04) and a saRNA-LNP vaccine expressing HPV immunogen. FIG 10A depicts the tumor growth curve. FIG 10B depicts the E7-specific CD8+T levels in PBMC.

[0025] FIGs. 11A and 11B depicts the results of immune responses generated by s.c., i.m., and i.d. administration of vaccines.

[0026] FIGs. 12A, 12B, 12C, 12D and 12E depicts the complementary mechanism of using mRNA-prime followed by OV-boost to treat advanced tumor. FIG 12A depicts the E7-specific T  cell response levels in the periphery. FIG 12B depicts the intratumoral immune cell population. FIG 12C depicts the E7-specific CD8+T cell percentage in tumor. FIG 12D and 12E depicts the gene expression condition of neutrophils in tumor.

[0027] FIGs. 13A, 13B and13C depicts the therapeutic efficacy of mRNA-OV prime-boost therapy comparing with single treatment of each type. FIG. 13A depicts the procedure and time frame for challenging, priming and boosting mice; FIG. 13B depicts the tumor growth curve and FIG. 13C depicts the survival proportions of mice.

[0028] FIGs. 14A, 14B, 14C, 14D and 14E depicts the efficacy of the attenuation of neuronal virulence of oncolytic viruses. FIG 14A depicts the experimental outline. FIG 14B depicts the survival curve of mice. FIG 14C depicts the images of mice’s cornea post infection. FIG 14D depicts the HSV genomic DNA copies detected in TG at 5 weeks post inoculation. FIG 14E depicts the re-activation rates of HSV infection in TG at 5 weeks post inoculation.

[0029] FIGs. 15A, 15B, 15C and 15D depicts the results of testing an optimal administration sequence of mRNA and OV. FIG 15A depicts the experimental design and time line. FIG 15B depicts the tumor growth curve of mice. FIG 15C depicts the mice survival curve. FIG 15D depicts the changing trends of E7-specific CD8+T cell population in PBMC during the time course of the experiment.

[0030] FIG. 16 depicts the images of cell monolayers’ condition post OV with and without truncated gB.

[0031] Corresponding reference numerals indicate corresponding parts throughout the drawings.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0032] As noted above, the present invention provides compositions and methods of treating and / or preventing HPV infections (and associated diseases, that, within preferred embodiments, produce both an intratumo4ral and a peripheral immunogen-specific T cell response that leads to growth suppression of primary and abscopal tumors.

[0033] Definitions:

[0034] The term “oncolytic virus” refers generally to any virus capable of replicating in and killing tumor cells. Representative examples of oncolytic virus include without limitation, adenovirus, herpes simplex virus (HSV) , Newcastle disease virus, poxvirus, myxoma virus, rhabdovirus, picornavirus, influenza virus, coxsackievirus and parvovirus. In preferred  embodiments, the oncolytic virus is a vaccinia virus (e.g. Copenhagen, Western Reserve, Wyeth strain) , reovirus, rhabdovirus (e.g., vesicular stomatitis virus (VSV) ) . The term “recombinant oncolytic virus” refers to an oncolytic virus that has been recombinantly or genetically engineered, e.g., to produce or express one or more proteins, or, immunological protein as described herein.

[0035] As used herein, an “Isolated” nucleic acid molecule means a DNA or RNA of genomic, mRNA, cDNA, or synthetic origin or some combination thereof which is not associated with all or a portion of a polynucleotide in which the isolated polynucleotide is found in nature, or is linked to a polynucleotide to which it is not linked in nature. For purposes of this disclosure, it should be understood that "a nucleic acid molecule comprising" a particular nucleotide sequence does not encompass intact chromosomes. Isolated nucleic acid molecules "comprising" specified nucleic acid sequences may include, in addition to the specified sequences, coding sequences for up to ten or even up to twenty or more other proteins or portions or fragments thereof or may include operably linked regulatory sequences that control expression of the coding region of the recited nucleic acid sequences, and / or may include vector sequences.

[0036] As used herein “expression cassette” refers to one or more gene (s) and the sequence (s) which control their expression. Typically, an expression cassette comprises a regulatory sequence and a nucleotide sequence to be expressed by the expression cassette. Within certain embodiments the expression cassette comprises a promoter sequence, a nucleic acid sequence, and in eukaryotes, a polyadenylation site.

[0037] As used herein, "recombinant" means that a particular nucleic acid (DNA or RNA) is the product of various combinations of cloning, restriction, Polymerase Chain Reaction (PCR) , and / or ligation steps that result in a construct with structurally encoded or non-encoded sequences that are distinguishable from endogenous nucleic acids found in a native system. The DNA sequence encoding the polypeptide may be assembled from a cDNA fragment or from a series of synthetic oligonucleotides to provide a synthetic nucleic acid capable of being expressed from a recombinant transcription unit contained in a cell or in a cell-free transcription and translation system. Genomic DNA comprising related sequences may also be used in the formation of recombinant genes or transcription units. Sequences of untranslated DNA can be present at the 5 'or 3' end of an open reading frame, where such sequences do not interfere with the manipulation or expression of the coding region, and can actually function to regulate the production of the desired product by a variety of mechanisms (see "DNA regulatory sequences" below) . Alternatively, untranslated DNA sequences encoding RNA (e.g., DNA-targeting RNA) can  also be considered recombinant. Thus, for example, the term "recombinant" nucleic acid refers to a nucleic acid that is not naturally occurring, such as is made by human intervention by artificially combining two additional separate segments of sequence. This artificial combination is often accomplished by chemical synthesis means or by artificial manipulation of separate segments of nucleic acid, for example by genetic engineering techniques. This is usually done by replacing a codon with a codon encoding the same amino acid, a conserved amino acid or a non-conserved amino acid. Alternatively, nucleic acid segments having the desired functions are ligated together to produce the desired combination of functions. This artificial combination is often accomplished by chemical synthesis means or by artificial manipulation of separate segments of nucleic acid, for example, by genetic engineering techniques. When a recombinant polynucleotide encodes a polypeptide, the sequence encoding the polypeptide may be naturally occurring ( "wild-type" ) or may be a variant (e.g., a mutant) of the naturally occurring sequence. Thus, the term "recombinant" polypeptide does not necessarily refer to a polypeptide whose sequence is not naturally occurring. In contrast, a "recombinant" polypeptide is encoded by a recombinant DNA sequence, but the sequence of the polypeptide may be naturally occurring ( "wild-type" ) or non-naturally occurring (e.g., variants, mutants, etc. ) . Thus, a "recombinant" polypeptide is the result of human intervention, but may be a naturally occurring amino acid sequence.

[0038] A "vector" or "expression vector" is a replicon, such as a plasmid, phage, virus, or cosmid, to which another DNA segment (i.e., an "insert" ) may be attached in order to cause replication of the attached segment in a cell.

[0039] List of Abbreviations

[0040] OV=oncolytic virus; HSV-1 = herpes simplex virus-1; gB = glycoprotein B; tgB =truncated glycoprotein B; US12=unique short protein 12; ICP0 = infected cell polypeptide 0; ICP27 = infected cell polypeptide 27; ICP47 = infected cell polypeptide 47; ICP34.5 = infected cell polypeptide 34.5; IL = interleukin; miR = microRNA; RA = receptor alpha; TRL = terminal repeat long; TRS = terminal repeat short; IRL = internal repeat long; IRS = internal repeat short; UL = unique long; US = unique short; MOI=multiplicity of cellular infection; HPV-human papillomavirus; E6=early protein 6 of HPV; E7=early protein of HPV; APC=professional antigen presenting cells; PBMC=peripheral blood mononuclear cell; DC=dendritic cell; i.t. =intratumoral administration; i.d. =intradermal administration; s.c. =subcutaneous administration; nrmRNA=non-replicating messenger ribonucleic acid; saRNA=self-amplifying ribonucleic acid; CEA = carcinoembryonic  antigen; CXCR4 = C-X-C Motif Chemokine Receptor 4; gB = glycoprotein B; HSV-1 = herpes simplex virus-1; HPV = Human Papilloma Virus; ICP0 = infected cell polypeptide 0; ICP27 = infected cell polypeptide 27; ICP47 = infected cell polypeptide 47; ICP34.5 = infected cell polypeptide 34.5; IL = interleukin; miR = microRNA; RA = receptor alpha; TRL = terminal repeat long; TRS = terminal repeat short; IRL = internal repeat long; IRS = internal repeat short; UL = unique long; US = unique short; CEACAM6 = carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6; EF1α = elongation factor 1-alpha.

[0041] In order to further an understanding of the various embodiments herein, the following sections are provided to more specifically describe various embodiments of the invention: A. Oncolytic viruses; B. Oncolytic Herpes Virus Constructs; C. Alternative Compositions and Methods related to mRNA and Immunological Proteins; D. Therapeutic Compositions; and E. Administration.

[0042] A. Oncolytic viruses

[0043] As noted above, the present invention provides oncolytic viruses which, optionally, may be engineered to express and / or secrete one or more immunological proteins, such as antigens derived from HPV. Briefly, an “oncolytic virus” is a virus that is capable of replicating in and killing tumor cells. Within certain embodiments the virus can be engineered in order to more selectively target tumor cells. Representative examples of oncolytic viruses include without limitation, adenovirus, coxsackievirus, H-1 parvovirus, herpes simplex virus (HSV) , influenza virus, measles virus, Myxoma virus, Newcastle disease virus, parvovirus picornavirus, reovirus, rhabdovirus (e.g. vesicular stomatitis virus (VSV) ) , paramyxovirus such as Newcastle disease virus, picornavirus such as poliovirus or Seneca valley virus, pox viruses such as vaccinia virus (e.g. Copenhagen, Indiana Western Reserve, and Wyeth strains) , reovirus, or retrovirus such as murine leukemia virus. Further representative examples are described in: US 8,147,822 and 9,045,729 (oncolytic rhabdovirus  / VSV) ; US 9,272,008 (oncolytic Measles virus) ; US Patent Nos. 7,223,593, 7,537,924, 7,063,835, 7,063,851, 7,118,755, 8,216,564, 8,277,818, and 8,680,068 (oncolytic herpes virus vectors) ; and US 8,980,246 (oncolytic vaccinia virus) , all of which are incorporated by reference in their entirety.

[0044] Within certain embodiments of the invention, the oncolytic virus is Herpes Simplex virus (e.g., HSV-1 or HSV-2) . Briefly, Herpes Simplex Virus (HSV) 1 and 2 are members of the Herpesviridae family, which infects humans. The HSV genome contains two unique regions,  which are designated unique long (UL) and unique short (US) region. Each of these regions is flanked by a pair of inverted terminal repeat sequences. There are about 75 known open reading frames. The viral genome can be engineered to develop recombinant oncolytic viruses for use in e.g., cancer therapy. Tumor-selective replication of HSV may be conferred by mutation of the HSV ICP34.5 (also called γ34.5) gene. HSV contains two copies of ICP34.5. Mutants incorporating inactivation or tumor-specific regulation of one or both copies of the ICP34.5 gene are known to lack neurovirulence, i.e. be avirulent / non-neurovirulent and be oncolytic. Tumor selective replication of HSV may also be conferred by controlling expression of key viral genes such as ICP27 and / or ICP4.

[0045] Within other embodiments of the invention oHSV are provided which have one or more mutations or deletions in one or more genes that are involved in immune downregulation in infected cells, e.g., by controlling or otherwise modulating the antiviral interferon response. Hence, within preferred embodiments either ICP34.5 and / or ICP0 can be modified (e.g., by mutation or deletion) to decrease Type I interferon signaling.

[0046] Suitable oncolytic HSV may be derived from either HSV-1 or HSV-2, including any laboratory strain or clinical isolate. In some embodiments, the oHSV may be or may be derived from one of laboratory strains HSV-1 strain 17, HSV-1 strain F, or HSV-2 strain HG52. In other embodiments, it may be of or derived from non-laboratory strain JS-1. Other suitable HSV-1 viruses include HrrR3 (Goldstein and Weller, J. Virol. 62, 196-205, 1988) , G2O7 (Mineta et al. Nature Medicine. 1 (9) : 938-943, 1995; Kooby et al. The FASEB Journal, 13 (11) : 1325-1334, 1999) ; G47Delta (Todo et al. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001; 98 (11) : 6396-6401) ; HSV 1716 (Mace et al. Head &Neck, 2008; 30 (8) : 1045-1051; Harrow et al. Gene Therapy. 2004; 11 (22) : 1648-1658) ; HF10 (Nakao et al. Cancer Gene Therapy. 2011; 18 (3) : 167-175) ; NV1020 (Fong et al. Molecular Therapy, 2009; 17 (2) : 389-394) ; T-VEC (Andtbacka et al. Journal of Clinical Oncology, 2015: 33 (25) : 2780-8) ; J100 (Gaston et al. PloS one, 2013; 8 (11) : e81768) ; M002 (Parker et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000; 97 (5) : 2208-2213) ; NV1042 (Passer et al. Cancer Gene Therapy. 2013; 20 (1) : 17-24) ; G2O7-IL2 (Carew et al. Molecular Therapy, 2001; 4 (3) : 250-256) ; rQNestin34.5 (Kambara et al. Cancer Research, 2005; 65 (7) : 2832-2839) ; G47Δ-mIL-18 (Fukuhara et al. Cancer Research, 2005; 65 (23) : 10663-10668) ; and those vectors which are disclosed in PCT applications PCT / US2017 / 030308 entitled “HSV Vectors with Enhanced Replication in Cancer Cells” , and PCT / US2017 / 018539 entitled “Compositions and Methods of Using Stat1 / 3 Inhibitors with Oncolytic Herpes Virus” , all of the above of which are incorporated  by reference in their entirety.

[0047] As disclosed herein, the oHSV vector may be a recombinant oHSV which includes one or more immunological protein expression cassettes that include genes or nucleotide sequences that encode an immunological protein (e.g., a tumor antigen or non-tumor antigen) under the control of a heterologous promoter. In one embodiment, the immunological protein expression cassette carried by the oncolytic HSV is controlled by a strong constitutive promoter such as the CMV promoter or the EF1α promoter or, alternatively, by a tumor-specific promoter. In other embodiments, the immunological protein may be fused directly to a structural protein within the oHSV vector, such as a capsid protein, a tegument protein, or an envelope protein.

[0048] The oHSV vector may have at least one γ34.5 gene that is modified with miRNA target sequences in its 3’ UTR as disclosed herein; there are no unmodified γ34.5 genes in the vector. In some embodiments, the oHSV has two γ34.5 genes modified with miRNA target sequences; in other embodiments, the oHSV has only one γ34.5 gene, and it is modified with miRNA target sequences. In some embodiments, the modified γ34.5 gene (s) are constructed in vitro and inserted into the oHSV vector as replacements for one or more native viral gene (s) . When the modified γ34.5 gene is a replacement of only one of the two native γ34.5 gene copies, the other native γ34.5 gene copy is deleted. As used herein, the term “deleted” means inactivated by full or partial deletion, unless otherwise indicated. Either of the two native γ34.5 gene copies can be deleted. Alternatively, both copies of the native γ34.5 gene can be deleted. In one embodiment, the terminal repeat, which comprises one copy of the γ34.5 gene, ICP0 gene, and ICP4 gene, is deleted and the remaining copy of the native γ34.5 gene is also deleted. In another embodiment, the internal repeat, which is identical to the terminal repeat and comprises one copy of the γ34.5 gene, ICP0 gene, and ICP4 gene, is deleted instead of the terminal repeat and the remaining copy of the native γ34.5 gene is also deleted. In another embodiment, the internal repeat long (IRL) or terminal repeat long (TRL) region comprising one copy of the γ34.5 gene and ICP0 gene is deleted and the remaining copy of the native γ34.5 gene is also deleted. In another embodiment, the internal repeat short (IRS) or terminal repeat short (TRS) region comprising one copy of ICP4 is deleted and both copies of the native γ34.5 gene are also deleted. Alternatively, if the terminal repeat, internal repeat, terminal repeat long, internal repeat long, terminal repeat short, or internal repeat short region is deleted, any remaining functional copies of the γ34.5 gene are modified with miRNA target sequences. As discussed herein, the γ34.5 gene  may comprise additional changes, such as having an exogenous promoter or modifications to the 5’-untranslated region (5’ -UTR) or to the 3’ -untranslated region (3’ -UTR) .

[0049] The oHSV may have additional mutations, which may include disabling mutations (e.g., deletions, substitutions, insertions) , which may affect the virulence of the virus or its ability to replicate. For example, mutations may be made in any one or more of ICP6, ICPO, ICP4, ICP27, ICP47, ICP24, ICP34.5, and LAT. Preferably, a mutation in one of these genes (optionally in both copies of the gene where appropriate) leads to an inability (or reduction of the ability) of the HSV to express the corresponding functional polypeptide. In some embodiments, the promoter of a viral gene may be substituted with a promoter that is selectively active in target cells or inducible upon delivery of an inducer or inducible upon a cellular event or particular environment. In other embodiments, the promoter of a viral gene may be substituted with a promoter of a different viral gene that reduces the risk of recombination event in the repetitive and non-unique region of the native, or natural, promoter.

[0050] In certain embodiments, the expression of ICP4 or ICP27 is controlled by an exogenous (i.e., heterologous) promoter, e.g., a tumor-specific promoter. Exemplary tumor-specific promoters include survivin, CEA, CXCR4, PSA, ARR2PB, or telomerase; other suitable tumor-specific promoters may be specific to a single tumor type and are known in the art. Other elements may also be present. In some cases, an enhancer such as NFkB / oct4 / sox2 enhancer is present. As well, the 5’ UTR may be exogenous, such as a 5’ UTR from growth factor genes such as FGF.

[0051] The oHSV may also have genes and nucleotide sequences that are non-HSV in origin. For example, a sequence that encodes a prodrug, a sequence that encodes a cytokine or other immune stimulating factor, a tumor-specific promoter, an inducible promoter, an enhancer, a sequence homologous to a host cell, among others may be in the oHSV genome. Exemplary sequences encode IL12, IL15, IL15 receptor alpha subunit, IL18, OX40L, PD-L1 blocker or a PD-1 blocker. For sequences that encode a product, they are operatively linked to a promoter sequence and other regulatory sequences (e.g., enhancer, polyadenylation signal sequence) necessary or desirable for expression.

[0052] The regulatory region of viral genes may be modified to comprise response elements that affect expression. Exemplary response elements include response elements for NF-κB, Oct-3 / 4-SOX2, enhancers, silencers, cAMP response elements, CAAT enhancer binding sequences, and insulators. Other response elements may also be included. A viral promoter may  be replaced with a different promoter. The choice of the promoter will depend upon a number of factors, such as the proposed use of the HSV vector, treatment of the patient, disease state or condition, and ease of applying an inducer (for an inducible promoter) . For treatment of cancer, generally when a promoter is replaced it will be with a cell-specific or tissue-specific or tumor-specific promoter. Tumor-specific, cell-specific and tissue-specific promoters are known in the art. Other gene elements may be modified as well. For example, the 5’ UTR of the viral gene may be replaced with an exogenous UTR.

[0053] Within certain embodiments of the invention the oncolytic Herpes Virus is as described in PCT / US2017 / 044993; PCT / US2018 / 061687; PCT / US2019 / 063838; PCT / US2022 / 021798, PCT / US2023 / 107199 and US20170319639A1, all of which are incorporated by reference in their entirety.

[0054] B. Oncolytic Herpes Virus Vectors

[0055] Within preferred embodiments of the invention, the oncolytic virus is a genetically engineered herpes virus construct such as T23H05, T22H07, T23H03, T23H04, T23H12 and T23H13.

[0056] More specifically, as is shown in Figure 1, T23H05 contains tgB, tUS12, cytokine cassette (IL-12, IL-15, IL-15Rα) , HPV16 immunogen, and regulatory elements for ICP34.5 gene.

[0057] T23H12 contained tgB, tUS12, cytokine cassette, HPV multivalent immunogen, and regulatory elements for ICP34.5 gene.

[0058] As is shown in Figure 2, HPV immunogen insertion was tested in the ICP34.5 locus (T22H07, T23H04, T23H03) , and in UL7 / 8 &UL10 / 11 locus (T23H12, T23H13) ; T22F05 is a control OV that expressed no HPV immunogen. Cytokines were inserted in the UL3 / 4 locus; T23H03, T23H05, T23H12 contains human cytokine sequences (IL-12, IL-15 and IL-15Rα) ; T23H04, T23H12 contains mouse cytokine sequences; T22F05 and T22H07 are control OVs that express no cytokines. Tumor-specific replication enhancing elements are incorporated in T23H05, T23H12 and T23H13; T22F05 is a control OV with ICP34.5 deleted instead of containing regulatory elements.

[0059] Post-transcriptional regulation: Within certain embodiments of the invention, oHSV are provided wherein ICP34.5 expression is post-transcriptionally regulated. Briefly, in wild-type HSV-1, there are 2 copies of the ICP34.5 gene. Within certain embodiments of the invention, one copy of ICP34.5 has been deleted. Within other embodiments of the invention, neither copy of ICP34.5 has been deleted. Within yet other embodiments of the invention, both copies of  ICP34.5 have been deleted. For the remaining copies of the ICP34.5 gene, within certain embodiments of the invention, oHSV may be constructed wherein an ODD domain is fused to ICP34.5 and multiple copies of binding domains for miR-124 and miR-143 are inserted into the 3’-UTR region to regulate the expression of ICP34.5 post-transcriptionally. Within other embodiments of the invention, only one or both copies of the ICP34.5 gene may be modified as described herein.

[0060] mRNA regulation: ICP34.5 is encoded by the HSV late gene g-34.5. It is well known for its function of suppressing anti-viral immunity in host cells, particularly neuronal cells, to cause neurotoxicity. To abolish the functions of ICP34.5 in neurons and other normal cells while retaining their activity in tumor cells for robust replication, instead of deleting the gene or using a specific promoter to control the expression of ICP34.5 to target specific tumors, oHSVs can be constructed which use microRNAs as a post-transcriptional control to achieve differential expression of ICP34.5 in tumor cells. Briefly, miRNAs are ～22 nucleotides, noncoding small RNAs coded by miRNA genes, which are transcribed by RNA polymerase II to produce primary miRNA (pri-miRNA) . Mature single-stranded (ss) miRNA forms the miRNA-associated RNA-induced silencing complex (miRISC) . miRNA in miRISC may influence gene expression by binding to the 3′-untranslated region (3′-UTR) in the target mRNA. This region consists of sequences recognized by miRNA. If the complementarity of the miRNA: mRNA complex is perfect, the mRNA is degraded by Ago2, a protein belonging to the Argonaute family. However, if the complementarity is not perfect, the translation of the target mRNA while not fully degraded, is still suppressed.

[0061] miRNAs are expressed differentially in a tissue specific fashion. One example is miR-124. While the precursors of miR-124 from different species are different, the sequences of mature miR-124 in humans, mice, and rats are completely identical. MiR-124 is the most abundantly expressed miRNA in neuronal cells and is highly expressed in the immune cells and organs (Qin et al., 2016, miRNA-124 in immune system and immune disorders. Frontiers in Immunology, 7 (OCT) , 1–8) . Another example of differential expression of miRNA is miR-143 (Lagos-Quintana et al., 2002, Identification of tissue-specific MicroRNAs from mouse. Current Biology, 12 (9) , 735–739) . MiR-143 is constitutively expressed in normal tissues but significantly downregulated in cancer cells (Michael et al., 2003, Reduced Accumulation of Specific MicroRNAs in Colorectal Neoplasia. Molecular Cancer Research, 1 (12) , 882–891) .

[0062] The 3’ UTR region of the ICP34.5 gene can be constructed to contain multiple copies of binding domains (also referred to as “miRNA target sequences” , “miRNA binding  sequences” or “miRNA binding sites” ) that are completely complementary to the miRNAs of interest. Binding of miR-124 and miR-143 to the 3’ -UTR of ICP34.5 mRNA causes degradation of the mRNA; therefore, the gene is post-transcriptionally downregulated in normal cells but not in tumor cells. This design allows differential expression of ICP34.5 in tumor cells. Within various embodiments, identical or varying lengths of linker DNA can be inserted between different miRNA binding sites. Within other embodiments the linkers range from 1 to 50 base pairs. Within other embodiments the linkers separating different miRNA binding sites are less than 10 base pairs.

[0063] Further miRNAs in tumors that may be targeted are provided in US Publication No. 2022 / 0267799 entitled “Genetically Modified Enterovirus Vectors” (see e.g., FIGS. 10A-10Z, 10AA-10ZZ, and 10AAA-10SSS) , which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0064] Oxygen dependent domains: Another method of post-transcriptional regulation exploits the ODD domain of HIF-1α to control the degradation of selected HSV-1 genes by stabilizing said genes in cancer tissues while promoting the degradation of said genes in healthy tissues.

[0065] Briefly, the interaction between hypoxia-inducible factor (HIF) and cancer entails a multifaceted regulatory mechanism that plays a pivotal role in tumor progression. In normoxic environments, HIF is intricately regulated through a series of hydroxylation events, orchestrated by prolyl hydroxylase enzymes (PHDs) . These hydroxylations serve as molecular tags that mark HIF for degradation via the ubiquitin-proteasome pathway. Consequently, the level of HIF within the cell remains tightly controlled, ensuring minimal accumulation. However, the dynamic balance shifts dramatically in the context of solid tumors, where hypoxic conditions prevail due to the rapid and disorganized growth of cancerous tissue. Hypoxia suppresses PHD activity, thereby curtailing HIF hydroxylation. As a result, HIF evades degradation and becomes stabilized. Thus, the dysregulation of HIF degradation under hypoxic conditions confers a selective advantage to cancer cells, allowing them to not only survive but also thrive within the oxygen-deprived tumor microenvironment.

[0066] Tumor hypoxia presents a formidable barrier to many common antitumor therapeutics such as chemotherapy, radiotherapy, and immunotherapy (see Muz B, de la Puente P, Azab F, Azab AK. The role of hypoxia in cancer progression, angiogenesis, metastasis, and resistance to therapy. Hypoxia (Auckl) . 2015 Dec 11; 3: 83-92 and Rakotomalala A, Escande A, Furlan A, Meignan S, Lartigau E. Hypoxia in Solid Tumors: How Low Oxygenation Impacts the “Six  Rs” of Radiotherapy. Front Endocrinol (Lausanne) . 2021 Sep 2; 12: 742215) . Low oxygen pressure has been observed in several different types of solid tumors (pancreatic, head and neck, breast, cervical, and melanoma) , with hypoxic conditions being more prevalent in larger tumors (see Chen Z, Han F, Du Y, Shi H, Zhou W. Hypoxic microenvironment in cancer: molecular mechanisms and therapeutic interventions. Signal Transduct Target Ther. 2023 Feb 17; 8 (1) : 70) . Hypoxic conditions within the tumor mass are difficult to detect and quantify due to tumor heterogeneity and the challenges of directly accessing tumors in certain anatomical locations. However, it is probable that all solid tumors have the potential to exhibit low oxygen pressure as they develop, thereby allowing treatment with the ODD-regulated HSV-1 constructs described herein.

[0067] As described in more detail herein, by fusing an ODD domain to a protein of interest, the fusion protein will be degraded in normoxic tissue, and will conversely be stabilized in hypoxic cancer tissue. Hence, within one embodiment of the present invention an ODD domain is fused to one or more functional viral genes that affect viral infection and / or replication in vivo, resulting in a virus with selective tumor tropism.

[0068] As noted above within certain embodiments of the invention recombinant herpes simplex virus constructs are provided comprising a modified oncolytic herpes virus genome, wherein the modified oncolytic herpes virus genome comprises an O2-dependent degradation domain (ODD) operably linked to an HSV gene selected from the group consisting of ICP0, ICP4, ICP27, and ICP34.5.

[0069] Within preferred embodiments of the invention, ODD-regulated HSV-1 vectors are constructed as described herein wherein one or both copies of ICP34.5 are regulated by fusion with an ODD domain as described herein.

[0070] As noted above, the ODD domain is highly conserved among land vertebrates, with amino acid sequence identity ranging between 78%and 98%when comparing the human ODD domain (SEQ ID NO: 15) from human HIF-1α (SEQ ID NO: 14) to homologous regions in the genomes of rodents (SEQ ID NOs: 17 and 18) , bovines (SEQ ID NO: 19) , birds (SEQ ID NO: 20) , and non-human primates (SEQ ID NO: 21) . Within one embodiment of the present invention, ODD comprises the minimal human ODD domain (SEQ ID NO: 15) , either with or without flanking sequences. Within other embodiments, ODD comprises the homologous minimal ODD sequence from any land vertebrate, either with or without flanking sequences.

[0071] Within a one preferred embodiment, the ODD SEQ ID NO: 16, either with or without flanking sequences. Briefly, SEQ ID NO: 16 is the minimal consensus amino acid sequence  for Hypoxia-inducible factor 1 alpha subunit (HIF-1α) O2-dependent degradation domain (ODD domain) :

[0072] A, P, A, A, G, D, T, I, I, S, L, D, F, X1, S, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, Q, Q, X9, X10, X11, V, P, L, Y, N, D, V, M, X12, P, S, X13, X14, E, K, L, X15, N, I, N, X16, A, M, S, P, L, P, X17, X18, E, T, X19, K, P, L, R, S, X20, A, D, P, A, L, N, X21, E, V, X22, X23, K, L, E, X24, X25, X26, E, X27, L, X28, L, S, F, T, M, P, Q, X29, Q, X30, Q, X31, X32, S, P, S, D, X33, S, T, X34, Q, S, S, P, E, X35, X36, X37, X38, X39, X40, X41, X42, X43, X44, X45, X46, X47, X48, P, X49, S, P, X50, X51, Y, C,F, X52, V, D, X53, D, M, X54, N, X55, F, K, L, E, L, V, E, K, L, F, A, X56, D, T, E, A, K, N, P, F, S, X57, Q, X58, T, D, L, D, L, E, M, L, A, P, Y, I, P, M, D, D, D, F, Q, L, R, S, F, D, Q, L, S, P, L, E, X59, X60, S, X61, X62, X63, X64, X65, X66, X67, X68, X69, X70, X71, X72, T, X73, X74, Q

[0073] Legend:

[0074] X1 is G or S

[0075] X2 is N, D, or no amino acid

[0076] X3 is D, E, N, or no amino acid

[0077] X4 is T, E, N, S, or no amino acid

[0078] X5 is E, S, D, or no amino acid

[0079] X6 is T, S, D, E, or no amino acid

[0080] X7 is D, E, or no amino acid

[0081] X8 is D, E, or no amino acid

[0082] X9 is L or C

[0083] X10 is E or D

[0084] X11 is E or D

[0085] X12 is L or F

[0086] X13 is P or S

[0087] X14 is N or S

[0088] X15 is Q or no amino acid

[0089] X16 is L or I

[0090] X17 is T, A, or S

[0091] X18 is A or S

[0092] X19 is P or T

[0093] X20 is S or N

[0094] X21 is Q or R

[0095] X22 is A or V

[0096] X23 is L or S

[0097] X24 is P or S

[0098] X25 is N or S

[0099] X26 is P or T

[0100] X27 is S or T

[0101] X28 is E or G

[0102] X29 is I or V

[0103] X30 is D or E

[0104] X31 is T or P

[0105] X32 is P, A, or T

[0106] X33 is G or A

[0107] X34 is R or S

[0108] X35 is R or no amino acid

[0109] X36 is L or no amino acid

[0110] X37 is L or no amino acid

[0111] X38 is Q or no amino acid

[0112] X39 is E or no amino acid

[0113] X40 is N or no amino acid

[0114] X41 is V or no amino acid

[0115] X42 is N or no amino acid

[0116] X43 is T or no amino acid

[0117] X44 is P or no amino acid

[0118] X45 is N or no amino acid

[0119] X46 is F or no amino acid

[0120] X47 is S or no amino acid

[0121] X48 is Q or no amino acid

[0122] X49 is N or S

[0123] X50 is S or N

[0124] X51 is E or D

[0125] X52 is Y or D

[0126] X53 is S, G, or N

[0127] X54 is V or A

[0128] X55 is E or V

[0129] X56 is E or I

[0130] X57 is T or A

[0131] X58 is D or E

[0132] X59 is S or N

[0133] X60 is S or N

[0134] X61 is A, T, P, S, or no amino acid

[0135] X62 is S, G, or no amino acid

[0136] X63 is P, S, G, or no amino acid

[0137] X64 is E, Q, P, S, G, or no amino acid

[0138] X65 is S, N, or no amino acid

[0139] X66 is A, M, V, Q, or no amino acid

[0140] X67 is S, A, N, or no amino acid

[0141] X68 is P, T, A, or no amino acid

[0142] X69 is Q, T, A, or no amino acid

[0143] X70 is S, T, A, or no amino acid

[0144] X71 is T or no amino acid

[0145] X72 is V, N, I, or no amino acid

[0146] X73 is V, G, or I

[0147] X74 is F or L

[0148] A wide variety of ODD domains can be utilized within the present invention, including for example, ODD proteins or derivatives thereof which have sequence identity of greater than 75%, 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or, 100% to any of SEQ ID Nos. 15, 16, 17, 18,  19, 20 or 21. ODD activity can be readily assessed utilizing standard assays in vitro by fusing different ODD domain variants of interest to a protein of interest such as ICP34.5 or to a reporter gene expressing an easily quantifiable protein such as GFP or luciferase, and then evaluating production of said fusion protein (s) under a range of normoxic and hypoxic conditions.

[0149] Transcriptional Control HSV-1 viral replication depends on a cascade of expression of viral genes, with expression of immediate early genes (particularly ICP4 and ICP27) controlling subsequent expression of viral early genes and late genes that govern the lytic replication cycle of the virus. Deletion of ICP4 or ICP27 results in complete abrogation of viral replication and a significant reduction in viral gene expression, which makes ICP4 and ICP27 excellent targets for tumor specific regulation in oncolytic HSV.

[0150] While ICP4 is a major transcriptional factor for viral gene expression, ICP27 is a multi-functional protein that regulates transcription of many virus genes. ICP27 functions in all stages of mRNA biogenesis from transcription, RNA processing and export through to translation. ICP27 has also been implicated in nuclear protein quality control, cell cycle control, activation of stress signaling pathways and prevention of apoptosis.

[0151] Within certain embodiments the native promoter of ICP27 and / or ICP4 is replaced with a tumor-specific promoter (e.g., CEA promoter or CXCR4 promoter) . Within other embodiments, the oncolytic HSV does not utilize transcriptional regulation of ICP27 or ICP4, and the native promoter of ICP27 and / or ICP4 remains unmodified (i.e. wild-type ICP27 promoter and / or wild-type ICP4 promoter) .

[0152] Cytokine Payload As noted above, oncolytic HSV of the present invention can be modified to express or co-express a number of different cytokines, Including IL-12, IL-15, IL-15Rα, and IL-18. Within certain preferred embodiments, the oncolytic HSV expresses IL-12, IL-15 and IL-15Rα. to further stimulate an immunomodulatory response. Expression of IL12 promotes polarization of antigen exposed T cells towards an inflammatory and anti-tumor TH1 phenotype, while IL-15 activates NK cells to further increase tumor killing and activation of antigen presenting cells. In addition to IL15 expression, the mutant viruses also express IL15Rα to further enhance immune stimulation. Within certain embodiments, expression of the cytokine payload may be regulated using a tumor-specific promoter (e.g., CEA promoter or CXCR4 promoter) . Within other embodiments, the cytokine payload utilizes a constitutive promoter for expression, preferably a strong constitutive promoter such as the CMV promoter, EF1a promoter, CAG promoter, etc.

[0153] Antigen Payload The recombinant oncolytic HSV may be engineered to contain an antigen payload comprising one or more HPV antigens. The antigen payload may comprise an expression cassette for one or more antigens that can be secreted outside the infected cell. Within certain embodiments, expression of the antigen payload may be regulated using a tumor-specific promoter (e.g., CEA promoter or CXCR4 promoter) . Within other embodiments, the antigen payload utilizes a constitutive promoter for expression, preferably a strong constitutive promoter such as the CMV promoter, EF1a promoter, CAG promoter, etc. If the recombinant OV includes both a cytokine payload and an antigen payload, different promoters are used for expression of each payload. In one embodiment, the cytokine payload is controlled by the CXCR4 promoter, and the antigen payload is controlled by the CEA promoter. In a preferred embodiment, both the cytokine payload and the antigen payload are driven by a constitutive promoter (e.g., CMV promoter, EF1a promoter, CAG promoter) , wherein each payload utilizes a different constitutive promoter. For example, if the cytokine payload is driven by the CMV promoter, the antigen payload may be driven by the EF1a promoter. Alternatively, if the cytokine payload is driven by the EF1a promoter, the antigen payload may be driven by the CMV promoter.

[0154] Within particularly preferred embodiments of the invention immunogenic proteins can be encoded by the oHSV provided herein from a strain of HPV which causes or is associated with causing cancer, which are mutated so that they do not cause increased cell proliferation. For example, the wild-type early protein 7 (E7) from HPV strain 16 (HPV16) and early protein 6 (E6) from HPV strain 16 (HPV16) [see e.g., CN 101100672 B] are tumorigenic. They localize into the cell nucleus and interact with tumor suppressors, such as p53 and pRB, to cause aberrant cell proliferation. In preferred embodiments of the invention, amino acid residues on E6 and E7 derived from HPV strain 16 that are essential for interacting with p53 and pRB are mutated. As a result, the mutated E6 and E7 do not cause increased cell proliferation.

[0155] Nuclear localized E7 and E6 are presented by MHC-I at a low level, causing E7 / E6-positive cells to be less visible to the immune system. Antigen presentation involves proteasome-dependent peptide generation in the cytoplasm, TAP-dependent peptide transport into the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) where binding to MHC-I molecules occurs, and transit of stable peptide-loaded MHC-I molecules through the secretory pathway to the plasma membrane for T cell recognition. To prevent mutated E7 (mE7) and mutated E6 (mE6) from entering the nucleus, the essential NLS (nuclear localization signal) [5-7] of mE7 and mE6 are  modified to prevent nuclear localization. The resulting non-nuclear localized smnE7-smnE6 induces stronger CD8+ T cell responses than the nuclear-localized protein.

[0156] In another embodiment, amino acid residues that are responsible for interacting with p53 and  / or pRB (e.g., E6 and E7) from other HPV strains such as HPV strains 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 and 68, can similarly be mutated to prevent cell proliferation, and utilized in the compositions and methods provided herein. Representative examples of HPV antigen payloads are diagrammatically illustrated in FIG. 6. In a preferred embodiment, the HPV16 immunogen (SEQ ID NO: 11) HPV antigen payload is a fusion antigen comprising HPV16-E7 and E6 with a leading sequence at the N-terminus. In other preferred embodiments, the multi-valent immunogen-1 (SEQ ID NO: 12) and multi-valent immunogen-2 (SEQ ID NO: 13) HPV antigen payloads comprise E7 fusion proteins from HPV16-18-31-33, and HPV35-45-52-58, respectively.

[0157] Within related embodiments, the immunogenic protein may have 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%or greater sequence identity with the sequences provided in SEQ IS NO: 11, 12 and / or 13.

[0158] Within other embodiments the one or more antigens in the antigen payload may be fused to a copy of an immunogenic viral protein such as the HSV surface glycoprotein D (gD) to further stimulate the immune response. In other embodiments, the one or more antigens in the antigen payload may be fused to, or co-expressed with, an APC-targeting protein or peptide. Alternatively, the antigen payload may be directly fused to an HSV surface protein such as glycoprotein D, glycoprotein B, glycoprotein G, or glycoprotein C to allow for display of the antigen payload on the viral surface. The antigen payload may also be directly fused to an HSV capsid protein such as VP26 to allow for display of the antigen payload on naked capsids which make up a sizable proportion of purified virus particles. In other embodiments, the antigen payload may be fused to a protein such as the HSV protein VP22 or a fragment thereof which can facilitate trafficking of the antigen payload to nearby uninfected cells. In yet other embodiments, direct fusion of the antigen payload to a viral protein may be used in conjunction with an expression cassette for one or more antigens that can be secreted outside the infected cell.

[0159] Truncated Glycoprotein B (gB) HSV-1 fusion is a crucial step of infection. It is dependent on four essential viral glycoproteins (gB, gD, gH, and gL) , which mediate entry into host cells by merging the viral envelope with a host cell membrane. The core fusion protein is glycoprotein B (gB) , a 904-residue glycosylated transmembrane protein encoded by the UL27  gene of HSV-1. Multiple types of mutations within the cytoplasmic domain of gB have yielded a hyperfusogenic phenotype, increasing cell-cell fusion (Chowdary &Heldwein, 2010, Syncytial Phenotype of C-Terminally Truncated Herpes Simplex Virus Type 1 gB Is Associated with Diminished Membrane Interactions. Journal of Virology, 84 (10) , 4923–4935) . In one embodiment, gB may be modified by truncating C-terminal amino acids 877 to 904 from the full-length protein.

[0160] Modified ICP47 In the HSV genome, ICP47 is encoded by the US12 gene. ICP47 contributes to immune escape by blocking the transporter associated with antigen presentation (TAP) , preventing antigenic peptides from being transported to the endoplasmic reticulum, which is the site of assembly of MHC class I molecules. In a preferred embodiment, the recombinant OVs described herein may incorporate a partial deletion of the US12 gene, comprising deletion of amino acids 2-36 of US12, in order to abrogate ICP47 function.

[0161] C. Alternative Compositions and Methods related to mRNA and Immunological Proteins

[0162] The present invention also provides immunogenic proteins and additional methods of delivering such proteins (e.g., by way of an encapsulated mRNA) to a subject.

[0163] Within particularly preferred embodiments of the invention immunogenic proteins are provided from a strain of HPV which causes or is associated with causing cancer, which are mutated so that they do not cause increased cell proliferation. For example, as noted above the wild-type early protein 7 (E7) from HPV strain 16 (HPV16) [1, 2] and early protein 6 (E6) from HPV strain 16 (HPV16) [3, 4] [CN 101100672 B] are tumorigenic. They localize into the cell nucleus and interact with tumor suppressors, such as p53 and pRB, to cause aberrant cell proliferation. In preferred embodiments of the invention, amino acid residues on E6 and E7 derived from HPV strain 16 that are essential for interacting with p53 and pRB are mutated. As a result, the mutated E6 and E7 do not cause increased cell proliferation.

[0164] Nuclear localized E7 and E6 are presented by MHC-I at a low level, causing E7 / E6-positive cells to be less visible to the immune system. Antigen presentation involves proteasome-dependent peptide generation in the cytoplasm, TAP-dependent peptide transport into the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) where binding to MHC-I molecules occurs, and transit of stable peptide-loaded MHC-I molecules through the secretory pathway to the plasma membrane for T cell recognition. To prevent mutated E7 (mE7) and mutated E6 (mE6) from entering the nucleus, the essential NLS (nuclear localization signal) [5-7] of mE7 and mE6 are  modified to prevent nuclear localization. The resulting non-nuclear localized smnE7-smnE6 induces stronger CD8+ T cell responses than the nuclear-localized protein.

[0165] In another embodiment, amino acid residues that are responsible for interacting with p53 and  / or pRB (e.g., E6 and E7) from other HPV strains such as HPV strains 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 and 68, can similarly be mutated to prevent cell proliferation, and utilized in the compositions and methods provided herein. Within related embodiments of the invention the immunogenic protein further comprises a cell-targeting moiety such as the HA protein. Within various embodiments of the invention, the mutation is one or more amino acid mutations or changes (e.g., a substitution, insertion, and / or deletion (e.g., a truncation) ) which substantially maintains immunogenicity similar to that of the native protein, but which no longer causes cell proliferation.

[0166] The mutated immunogenic HPV proteins provided herein (such as E7-E6) can be further modified by fusing it with a cell targeting moiety such as hemagglutinin A protein from influenza virus A (also referred to as “HA protein” ) . Briefly, HA protein interacts with DC-specific ICAM-grabbing non-integrin (DC-SIGN / CD209 protein [8] ) , which is widely expressed on the surface of iDC (immature dendritic cells) and macrophages [1] . HA protein guides the mutated E7-E6 antigen towards DC and macrophages by binding to DC-SIGN / CD209. Upon entering the iDCs, HA protein promotes the activation and maturation of iDCs, leading to more efficient antigen presentation through APCs (antigen presenting cells) . As used within the context of the present invention, “HA protein” refers to both the entire protein sequence, as well as peptide components thereof that are responsible for binding of the influenza virus to the cell that is being infected. In other embodiments, the mutated immunogenic HPV proteins provided herein (such as E7-E6) can be fused with a different cell targeting moiety to guide the mutated HPV antigen (s) towards dendritic cells and macrophages.

[0167] Representative and non-exhaustive examples of additional suitable cell targeting moieties include: (a) Ebola virus glycoprotein (see, e.g., Alvarez, C.P. et al., C -type lectins DC-SIGN and L-SIGN mediate cellular entry by Ebola virus in cis and in trans. J. Virol., 2002. 76 (13) : p. 6841-4) ; (b) envelope glycoprotein gp120 of HIV (see e.g., Becer, C.R., et al., High-affinity glycopolymer binding to human DC-SIGN and disruption of DC-SIGN interactions with HIV envelope glycoprotein. Journal of the American Chemical Society, 2010. 132 (43) : p. 15130-15132) ; (c) Marburg virus glycoprotein (see e.g., Marzi, A., et al., DC-SIGN and DC-SIGNR interact with the glycoprotein of Marburg virus and the S protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus.  J Virol, 2004. 78 (21) : p. 12090-5) ; and (d) E2 glycoprotein from hepatitis C virus (see e.g.,  S., et al., Hepatitis C virus glycoproteins interact with DC-SIGN and DC-SIGNR. Journal of virology, 2003. 77 (7) : p. 4070-4080) ; all of which are incorporated by reference in their entirety.

[0168] The immunogenic proteins (and / or cell targeting moiety) , can readily be made by commercially available synthetic means (see, e.g., commercial manufacturers such as Profacgen, Shirley, NY and GenScript, Piscataway NJ) , or by cloning, expression and purification of a recombinant sequence which encodes the protein (see generally, Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant Proteins 1st ed. 2022 Edition by Kakoli Bose (Editor) ; ISBN-10 9811649863; ISBN-13 978-9811649868) .

[0169] Immunogenicity of the proteins can also be assessed by readily available assays (see, e.g., Stanley, “Immunobiology of HPV and HPV vaccines, Gynecologic Oncology, Vol. 109, Issue 2, Supplement, May 2008, Pages S15-S21; Michel et al., “Enhanced Immunogenicity of HPV 16 E7 Fusion Protein in DNA Vaccination, Virology, Vol. 294, Issue 1, 1 March 2002, Pages 47-59; Turner and Hug, “HPV vaccines: Translating immunogenicity into efficacy” , Human Vaccines &Immunotherapeutics, Vol. 12, 2016, Pages 1403-1405, https:  / / doi. org / 10.1080 / 21645515.2015.1103936; and Kim et al., “Purification and immunogenicity study of human papillomavirus type 16L1 protein in Saccharomyces cerevisiae” , Journal of Virological Methods, Vol. 139, Issue 1, Jan. 2007, Pages 24-30; “T-cell dependent immunogenicity of protein therapeutics: Preclinical assessment and mitigation” , Clinical Immunology, Vol. 149, Issue 3, Part B, December 2013, Pages 534-555, http:  / / dx. doi. org / 10.1016 / j. clim. 2013.09.006, all of which are incorporated by reference in their entirety.

[0170] Within particularly preferred embodiments of the invention, the immunogenic proteins are produced by an mRNA-based vaccine. Briefly, mRNA vaccines use a copy of messenger RNA to introduce RNA into a cell, and thereby to elicit an immune response. Within preferred embodiments the mRNA may be delivered by lipid nanoparticles.

[0171] Representative examples of methods for making RNA-based vaccines are described in “RNA Vaccines: Methods and Protocols” (Methods in Molecular Biology, 1499) 1st ed.2017 Edition by Thomas Kramps (Editor) , Knut Elbers (Editor) , ISBN-10 1493964798; ISBN-13 978-1493964796; “Vaccine Adjuvants: Methods and Protocols” (Methods in Molecular Biology, 1494) 1st ed. 2017 Edition by Christopher B. Fox (Editor) ; ISBN-10 1493964437; ISBN-13 978-1493964437; Kowalski PS, Rudra A, Miao L, Anderson DG (April 2019) . "Delivering the Messenger:  Advances in Technologies for Therapeutic mRNA Delivery" . Mol Ther. 27 (4) : 710–28. doi: 10.1016 / j. ymthe. 2019.02.012. PMC 6453548. PMID 30846391; Verbeke R, Lentacker I, De Smedt SC, Dewitte H (October 2019) . "Three decades of messenger RNA vaccine development" . Nano Today. 28: 100766. doi: 10.1016 / j. nantod. 2019.100766. hdl: 1854 / LU-8628303. S2CID 202221207; Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D (April 2018) . "mRNA vaccines -a new era in vaccinology" . Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4) : 261–279. doi: 10.1038 / nrd. 2017.243. ISSN 1474-1784. PMC 5906799. PMID 29326426; and the following patents and patent applications: US10207009B2 entitled “Method for cellular RNA expression” ; PCT / EP2010 / 004760 Entitled “Vaccine composition comprising 5'-cap modified RNA” ; US10485884B2 entitled “RNA formulation for Immunotherapy” ; US11020477B2 entitled “RNA vaccines” ; and US10106800B2 entitled “Modification of RNA, producing an increased transcript stability and translation efficiency” , US 10106490 entitled “Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids” ” ; US 2019 / 0274968 entitled “Nucleoside modified RNA for inducing an adaptive immune response” ; US 2016 / 0317676 entitled “Methods and compositions for delivery of nucleic acids” ; AU 2018 / 256877 entitled “Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids” ; US 11, 357, 856 entitled “Lipids for delivery of active agents” ; all of which are incorporated by reference in their entirety.

[0172] Hence, in some embodiments the immunological protein may be encoded within an mRNA molecule or self-amplifying mRNA (saRNA) molecule that is encapsulated within lipid nanoparticles (LNP) , lipoplexes ( “LPX” –e.g., colloidal suspensions or complexes of nucleic acids condensed with lipids such as cationic lipids) , or polyplexes ( “PPX” –e.g., colloidal suspensions or complexes of nucleic acids condensed with polymer (s) ) , and injected into the tumor for internalization and translation. Tumor-specific expression of the immunological protein from said mRNA or saRNA may be achieved by adding miRNA target sequences to the 3’ -end and / or the 5’ -end of said mRNA or saRNA, wherein said miRNA target sequences are recognized by miRNAs that are less abundant in the targeted tumor cells compared to normal cells.

[0173] D. Therapeutic Compositions

[0174] Within various embodiments of the invention, therapeutic compositions comprising the above-noted immunogenic proteins (and / or nucleic acid sequences such as mRNA encoding such proteins) , oncolytic viruses (such as the oHSV described herein) , as well as pharmaceutical compositions.

[0175] In certain embodiments, the compositions will further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. The phrase “pharmaceutically acceptable carrier” is meant to encompass any carrier, diluent or excipient that does not interfere with the effectiveness of the immunogenic protein (and / or nucleic acid sequences such as mRNA encoding such proteins) and that is not toxic to the subject to whom it is administered (see generally Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams &Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005 and in The United States Pharmacopoeia: The National Formulary (USP 40 –NF 35 and Supplements) .

[0176] In the case of immunogenic proteins and oncolytic viruses (such as the oHSV described herein) , non-limiting examples of suitable pharmaceutical carriers include phosphate buffered saline solutions, water, emulsions (such as oil  / water emulsions) , various types of wetting agents, sterile solutions, and others. Additional pharmaceutically acceptable carriers include gels, bioabsorbable matrix materials, implantation elements containing the recombinant oncolytic virus, or any other suitable vehicle, delivery or dispensing means or material (s) . Such carriers can be formulated by conventional methods and can be administered to the subject at an effective dose. Additional pharmaceutically acceptable excipients include, but are not limited to, water, saline, polyethylene glycol, hyaluronic acid and ethanol. Pharmaceutically acceptable salts can also be included therein, e.g., mineral acid salts (such as hydrochlorides, hydrobromides, phosphates, sulfates, and the like) and the salts of organic acids (such as acetates, propionates, malonates, benzoates, and the like) . Such pharmaceutically acceptable (pharmaceutical-grade) carriers, diluents and excipients that may be used to deliver the vaccine and will preferably not induce an immune response in the individual (subject) receiving the composition (and will preferably be administered without undue toxicity) .

[0177] The compositions provided herein can be provided at a variety of concentrations. For example, the compositions may be administered as a single dose or as multiple doses spread out over time. Doses may be administered daily, weekly, biweekly, monthly, or bimonthly, and dosage frequency may be cyclical, with each cycle comprising a repeating dosage pattern (e.g. once a week or biweekly dose administration for about 4 weeks comprising one cycle, repeating for up to about 24 cycles) .

[0178] The compositions provided herein can be provided at a variety of concentrations. For example, dosages of recombinant oncolytic virus can be provided which range from about 104 pfu to about 1010 pfu. Within further embodiments, the dosage can range from about 106 pfu to about 107 pfu, or from about 107 pfu to about 108 pfu, or from about 108 pfu to 109 pfu, and  may be administered as a single dose or as multiple doses spread out over time. Doses may be administered daily, weekly, biweekly, monthly, or bimonthly, and dosage frequency may be cyclical, with each cycle comprising a repeating dosage pattern (e.g. once a week or biweekly dose administration for about 4 weeks comprising one cycle, repeating for up to about 24 cycles) . Within other embodiments of the invention, the virus can be provided in ranges from about 5x104 pfu / kg to about 2x109 pfu / kg for intravenous delivery in humans. For intratumoral injection, the preferred dosage can range from about 106 pfu to about 109 pfu per dose (with an injectable volume which ranges from about 0.1 mL to about 5 mL) .

[0179] Within certain embodiments of the invention, lower or higher dosages than standard may be utilized. Hence, within certain embodiments less than about 106 pfu or more than about 109 pfu can be administered to a patient.

[0180] Within certain embodiments of the invention, lower dosages than standard may be utilized. Hence, within certain embodiments less than about 106 pfu / ml (with up to 4 ml being injected into a patient every 2 –3 weeks) can be administered to a patient.

[0181] The compositions may be stored at a temperature conducive to stable shelf-life and includes room temperature (about 20℃) , 4℃, -20℃, -80℃, and in liquid N2. Because compositions intended for use in vivo generally do not have preservatives, storage will generally be at colder temperatures. Compositions may be stored dry (e.g., lyophilized) or in liquid form.

[0182] E. ADMINISTRATION

[0183] In addition to the compositions described herein, various methods of using such compositions to prevent, treat and / or ameliorate HPV-related disease, comprising the step of administering to a subject an effective dose or amount of one or more “priming” compositions (also referred to as a “prime vaccine” ) , and a “boosting” composition” (also referred to as a “boost vaccine” ) . Within various embodiments the “priming” composition can be an immunogenic proteins (and / or nucleic acid sequences such as mRNA encoding such proteins) , or, an oncolytic viruses (such as the oHSV) as described herein. In related embodiments the “boosting” composition can be an immunogenic protein (and / or nucleic acid sequences such as mRNA encoding such proteins) , or, an oncolytic viruses (such as the oHSV) as described herein. Preferably, the priming composition should be different from the boosting composition (e.g., the priming compositions could be an mRNA-based composition, and the boosting composition could be an oHSV-based composition) .

[0184] The terms “effective dose” and “effective amount” refers to amounts of the immunogenic protein that is sufficient to effect treatment of a subject.

[0185] The terms “treat” or “treating” or “treatment, ” as used herein, means an approach for obtaining beneficial or desired results, including clinical results. Beneficial or desired clinical results can include, but are not limited to, alleviation or amelioration of one or more symptoms or conditions, diminishment of extent of disease, stabilized (i.e. not worsening) state of disease, preventing spread of disease, delay or slowing of disease progression, amelioration or palliation of the disease state, diminishment of the reoccurrence of disease, and remission (whether partial or total) , whether detectable or undetectable. The terms “treating” and “treatment” can also mean prolonging survival as compared to expected survival if not receiving treatment.

[0186] The term “prevent” or “preventing” means to lessen the incidence, occurrence, or, likelihood of occurrence of a HPV-related disease.

[0187] The term “HPV-related disease” incudes both skin or mucous membrane growths (e.g., warts) , as well as different types of cancers or precancerous conditions, which have been caused by an HPV infection. Within certain embodiments of the invention, the HPV-related disease is HPV-positive cancer. Within other embodiments of the invention, the HPV-related disease is HPV-associated cancer. "HPV-positive cancer" as used herein refers to a cancer that is positive for HPV. In certain embodiments, an HPV positive cancer tumor expresses one or more proteins derived from an HPV or has a nucleotide sequence encoding the one or more proteins derived from an HPV. “HPV-associated cancer” as used herein refers to a cancer that can arise as a result of prior exposure to HPV. HPV-associated cancers may be positive for HPV or may have a nucleotide sequence encoding one or more proteins derived from an HPV. Alternatively, HPV-associated cancers may arise due to mutations or cellular alterations caused by HPV infection that persist even after the virus is cleared by the host immune response. Examples of cancer include, but are not limited to adrenocortical carcinoma, anal cancer, bladder cancer, brain tumor, brain stem glioma, cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma, ependymoma, medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal, pineal tumors, hypothalamic glioma, breast cancer, carcinoid tumor, carcinoma, cervical cancer, colon cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, extrahepatic bile duct cancer, Ewing’s family of tumors (Pnet) , extracranial germ cell tumor, eye cancer, intraocular melanoma, gallbladder cancer, gastric cancer, extragonadal germ cell tumor, gestational trophoblastic tumor, head and neck cancer,  hypopharyngeal cancer, islet cell carcinoma, laryngeal cancer, leukemia, acute lymphoblastic, leukemia, oral cavity cancer, liver cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, AIDS-related lymphoma, central nervous system (primary) lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's disease, malignant mesothelioma, melanoma, Merkel cell carcinoma, metastatic squamous carcinoma, multiple myeloma, plasma cell neoplasms, mycosis fungoides, myelodysplastic syndrome, myeloproliferative disorders, nasopharyngeal cancer, neuroblastoma, oropharyngeal cancer, osteosarcoma, ovarian epithelial cancer, ovarian germ cell tumor, ovarian low malignant potential tumor, pancreatic cancer, exocrine pancreatic cancer, islet cell carcinoma, paranasal sinus and nasal cavity cancer, parathyroid cancer, penile cancer, pheochromocytoma cancer, pituitary cancer, plasma cell neoplasm, prostate cancer, rhabdomyosarcoma, rectal cancer, renal cell cancer, salivary gland cancer, Sezary syndrome, cutaneous T-cell lymphoma, skin cancer, Kaposi's sarcoma, melanoma, small intestine cancer, soft tissue sarcoma, testicular cancer, thymoma, thyroid cancer, urethral cancer, uterine cancer, sarcoma, unusual cancer of childhood, vaginal cancer, vulvar cancer, Wilms'tumor. Particularly preferred types of cancer to be treated include HPV-associated cancer. Examples of HPV-associated cancer include, but are not limited to cervical cancer, head and neck cancer, vaginal cancer, vulvar cancer, penile cancer, anal cancer, oropharyngeal cancer, oral cancer, laryngeal cancer, sinonasal cancer, esophageal cancer, lung cancer, skin cancer, squamous cell carcinomas, Merkel cell carcinoma, conjunctival cancer.

[0188] Precancerous conditions are known in the art as a group of disorders that have a malignant predisposition, which are conditions associated with a risk of turning into a particular type of cancer. A precancerous condition may be, for example, a genetic predisposition for the cancer, cellular or morphological changes in a tissue, also known as a "lesion" , indicative of a precancerous condition, or a gene mutation or mutations associated with increased risk for a particular type of cancer. Representative examples of precancerous conditions that may be treated in accordance with the present invention include cervical dysplasia or squamous intraepithelial lesion (e.g., diagnosed by pap smear) , prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) ; superficial bladder cancer, also known as transitional cell carcinoma in situ, precancerous lesions of the breast, precancerous lesions of the lung, actinic keratosis, Barrett's esophagus; precancerous melanoma moles, precancerous conditions of the uterus / vulva, precancerous conditions of the ovary, atrophic gastritis, precancerous conditions of the oral cavity, general dysplastic conditions, squamous metaplasia, intraepithelial neoplasia, precancerous conditions  in the head or neck, familial adenomatous polyposis (Gardner's syndrome) , sporadic adenomatous polyposis, hereditary non-polyposis colon cancer (Lynch syndrome) , and Crohn’s disease.

[0189] In the context of HPV-related cancer, the term “treat” or “treating” refers to amounts of immunogenic protein (and / or nucleic acid sequence encoding such protein) that induces remission, reduces tumor burden, and / or prevents tumor spread or growth of the cancer. Effective amounts may vary according to factors such as the subject’s disease state, age, gender, and weight, as well as the pharmaceutical formulation, the route of administration, and the like, but can nevertheless be routinely determined by one skilled in the art.

[0190] The optimal or appropriate dosage regimen of the immunogenic protein is readily determinable within the skill of the art, by the attending physician based on patient data, patient observations, and various clinical factors, including for example a subject’s size, body surface area, age, gender, and the particular recombinant oncolytic virus being administered, the time and route of administration, the type of cancer being treated, the general health of the patient, and other drug therapies to which the patient is being subjected.

[0191] In addition to the compositions described herein, various methods of using such compositions to treat or ameliorate cancer are provided, comprising the step of administering to a subject a first vaccine, wherein the first vaccine comprises a macromolecule capable of inducing an immune response in said subject, and a second vaccine, wherein the second vaccine comprises an oncolytic virus which induces an immune response against a Tumor Antigen and / or a Non-Tumor Associated Antigen. Within various embodiments of the invention, the first vaccine, second vaccine, or both may be administered once or, multiple times.

[0192] The therapeutic compositions are administered to a subject diagnosed with cancer or is suspected of having a cancer. Subjects may be human or non-human animals. As noted above, within certain embodiments of the invention a first or prime vaccine is administered to a subject in order to induce a first immune response, followed by a second or boost vaccine to further enhance the immune response. Within various embodiments the first vaccine may comprises purified immunological proteins (e.g., tumor antigens, non-tumor antigens, or APC-fused tumor or non-tumor antigens) , or, sequences which encode such immunological proteins (e.g., mRNA which encodes such proteins and is encapsulated (e.g., in a liposome or suitable lipid nanoparticle ( “LNP” ) ) for administration) . Within certain embodiments the vaccine (e.g., prime vaccine) can be administered along with a pharmaceutically acceptable carrier. In other  embodiments, the vaccine (e.g., prime vaccine) can be administered along with a pharmaceutically acceptable adjuvant such as aluminum, AS01, AS04, CpG 1018, Matrix-M, or MF59.

[0193] The vaccine (e.g., prime vaccine or boost vaccine) may be administered once or multiple times (e.g., twice, three times, four times, five, times, six times, seven times, eight times, nine times or ten times) . Within certain embodiments, either the first or second vaccine is administered in a series of anywhere between 2 to 10 injections, separated by a time period of anywhere between 1 day to 1 year between injections. Within preferred embodiments of the invention the first vaccine is administered systemically, and the second vaccine is administered intratumorally.

[0194] The recombinant oncolytic viruses and immunological proteins described herein may be given by a route that is, for example, oral, topical, parenteral, systemic, intravenous, intramuscular, intraocular, intrathecal, intratumoral, subcutaneous, intradermal, or transdermal. Within certain embodiments the recombinant oncolytic virus may be delivered by a cannula, by a catheter, or by direct injection. The site of administration may be intra-tumor or at a site distant from the tumor. The route of administration will often depend on the type of cancer being targeted.

[0195] The optimal or appropriate dosage regimen of the recombinant oncolytic virus and immunological protein is readily determinable within the skill of the art, by the attending physician based on patient data, patient observations, and various clinical factors, including for example a subject’s size, body surface area, age, gender, and the particular recombinant oncolytic virus being administered, the time and route of administration, the type of cancer being treated, the general health of the patient, and other drug therapies to which the patient is being subjected. According to certain embodiments, treatment of a subject using the recombinant oncolytic virus described herein may be combined with additional types of therapy, such as radiotherapy or chemotherapy using, e.g., a chemotherapeutic agent such as etoposide, ifosfamide, adriamycin, vincristine, doxycycline, and others.

[0196] Within yet other embodiments of the invention the oncolytic virus can be administered by a variety of methods, e.g., intratumorally, intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intradermally, transdermally, or, after surgical resection of a tumor.

[0197] The following are some exemplary numbered embodiments of the present disclosure.

[0198] A recombinant virus which encodes one or more immunogenic proteins that are derived from HPV (Human Papilloma Virus) . Within certain aspects the recombinant virus can be a recombinant oncolytic virus. Within other aspects the recombinant virus can be a recombinant HSV (e.g., HSV-1) .

[0199] The recombinant HSV according to embodiment 1, wherein said one or more immunogenic proteins are derived from and HPV strain that causes or is associated with causing cancer.

[0200] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-2, wherein said one or mor immunogenic proteins are mutated such that they do not cause cellular proliferation.

[0201] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-3, wherein said mutation is one or more amino acid changes selected from the group consisting of substitutions, insertions and deletions.

[0202] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-4, wherein said protein is mutated to eliminate or diminish interactions with p53 / pRB.

[0203] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-5, wherein said protein is mutated to reduce or prevent nuclear localization.

[0204] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-6, wherein said protein is mutated, but wherein said mutation does not substantively decrease the immune response as compared to unmutated HPV E6 or E7.

[0205] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-7, wherein said protein is mutated, and wherein said mutated protein is HPV E6 or E7.

[0206] The recombinant HSV according to any one of embodiments 1 to 8 wherein said immunogenic protein is selected from an HPV strain selected from the group consisting of HPV strain 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 or 68.

[0207] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-9, wherein said immunogenic protein is selected from 2, 3, 4, 5, 5, 7, 8, 9, or 10 HPV strains.

[0208] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-10, wherein said immunogenic protein comprises HPV strains 16, 18, 33, 35, 45, 52 and 58.

[0209] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-11, wherein said immunogenic protein comprises SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 13.

[0210] The recombinant HSV according to any one or more of embodiments 1-12, further comprises at least one miRNA target sequence.

[0211] The recombinant HSV according to embodiment 13, wherein said miRNA target sequence is operably linked to a first, or, to a first and a second copy of an ICP34.5 gene.

[0212] The recombinant HSV according to embodiment 14 wherein said miRNA target sequence comprises at least two copies of at least two different miRNA target sequences.

[0213] The recombinant HSV according to embodiment 14 wherein said miRNA target sequence is selected from the group consisting of miRNA-124 and miRNA-143.

[0214] The recombinant HSV according to embodiment 13 wherein said at least one miRNA target sequence comprises five copies of the binding site for miRNA-124, and five copies of the binding site for miRNA-143.

[0215] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-17, further comprising a nucleic acid sequence encoding an immunomodulatory protein.

[0216] The recombinant HSV according to embodiment 18, wherein said immunomodulatory protein is a prodrug, a cytokine, or a checkpoint inhibitor.

[0217] The recombinant HSV according to embodiment 19 wherein said cytokine is selected from the group consisting or IL-12, IL-15, IL-15Rα and IL-18.

[0218] The recombinant HSV according to embodiment 18 wherein said immunomodulatory protein is encoded within an expression cassette.

[0219] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-21, wherein said virus expresses a mutated or truncated US12 to reduce virus-induced immune suppression.

[0220] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-22, wherein said virus expresses a mutated or truncated US9, and / or glycoprotein E (gE) , and / or glycoprotein I (gI) to reduce neurovirulence.

[0221] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-23, wherein said virus expresses a mutated or truncated gB (tgB) to enhance cell-to-cell spread of the virus within a tumor.

[0222] The recombinant HSV of embodiment 24, wherein the gene encoding glycoprotein B encodes a glycoprotein B variant that terminates after amino acid 876.

[0223] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-25, further comprising an O2-dependent degradation domain (ODD) operably linked to an HSV gene selected from the group consisting of ICP0, ICP4, ICP27, and ICP34.5.

[0224] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-26, wherein said recombinant HSV encodes an ICP34.5-ODD protein comprising an amino acid sequence having greater than 75%sequence identity with any one of SEQ ID NOs: 14, 15, 17, 18, 19, 20 or 21.

[0225] The recombinant HSV of embodiment 27, wherein said ODD comprises an amino acid sequence having greater than 75%sequence identity with SEQ ID NO: 16.

[0226] The recombinant HSV according to any one or more of the preceding embodiments 1-28, wherein the recombinant herpes virus genome further comprises a mutation in a gene encoding UL37 and / or US9 to reduce neurovirulence by impairing axonal trafficking of viral particles.

[0227] Within various aspects of any one of embodiments 1 to 29, the recombinant HSV is an oncolytic HSV. Within particularly preferred aspects, the HSV is HSV-1. Within further aspects he recombinant oncolytic virus has reduced neurotoxicity. Representative examples of recombinant oncolytic herpes virus vectors include T23H05, T22H07, T23H03, T23H04, T23H12 and T23H13.

[0228] A pharmaceutical composition, comprising a recombinant HSV according to any one of embodiments 1 to 29, along with a pharmaceutically acceptable excipient.

[0229] An immunogenic protein, comprising an amino acid sequence derived from one or more proteins which are responsible for cell proliferation, and wherein said one or more proteins are derived from an HPV strain associated with causing cancer.

[0230] The protein according to embodiment 31, wherein said HPV strain associated with causing cancer is selected from the group consisting of HPV strain 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 or 68.

[0231] The protein according to embodiment 31, wherein said immunogenic protein is mutated such that it does not cause cell proliferation.

[0232] The protein according to embodiment 33 wherein said mutation is one or more amino acid changes selected from the group consisting of substitutions, insertions and deletions.

[0233] The protein according to embodiment 33 wherein said mutation eliminates or diminishes interactions with p53 / pRB.

[0234] The protein according to embodiment 33 wherein said mutation reduces or prevents nuclear localization.

[0235] The protein according to embodiment 33 wherein said mutation does not substantively decrease the immune response as compared to unmutated E6 and E7.

[0236] The protein according to embodiment 35 wherein said mutated protein is E6 or E7.

[0237] The protein according to embodiment 31 wherein said protein comprises SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 13. Within other embodiments the protein comprises a sequence which has greater than 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 98% sequence identity to SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 13.

[0238] An isolated nucleic acid sequence which encodes an immunogenic protein according to any one of embodiments 31 to 39.

[0239] The isolated nucleic acid sequence according to embodiment 40 wherein said nucleic acid sequence is an mRNA sequence.

[0240] The isolated nucleic acid sequence according to embodiment 40 wherein said mRNA is a self-amplifying mRNA.

[0241] An expression cassette which directs the expression of an immunogenic protein according to any one of embodiments 31 to 39.

[0242] A composition comprising an mRNA sequence encoding an immunogenic protein according to any of embodiments 31 to 39.

[0243] The composition according to embodiment 44, wherein said composition is encapsulated within a lipid nanoparticle, lipoplex or, a polyplex.

[0244] A pharmaceutical composition, comprising an immunogenic protein according to any one of embodiments 31 to 39, an isolated nucleic acid sequence according to embodiments 40, 41, or 42, or, an expression cassette according to embodiment 43.

[0245] A method for treating or preventing HPV-related disease, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition according to embodiment 30 or 46.

[0246] A method for treating or preventing HPV-related disease, comprising administering to a subject a priming vaccine and a boosting vaccine, wherein the priming and boosting vaccine each elicit an immune response against HPV.

[0247] The method of embodiment 48 wherein said priming vaccine comprises a recombinant virus which expresses an immunogenic protein derived from an HPV strain which has been mutated so as to no longer cause cancer.

[0248] The method of embodiment 48 wherein said priming vaccine comprises an immunogenic protein, or a molecule which expresses an immunogenic protein, wherein said immunogenic protein is derived from an HPV strain which has been mutated so as to no longer cause cancer.

[0249] The method of embodiment 48 wherein said boosting vaccine comprises a recombinant virus which expresses an immunogenic protein derived from an HPV strain which has been mutated so as to no longer cause cancer.

[0250] The method of embodiment 48 wherein said boosting vaccine comprises an immunogenic protein, or a molecule which expresses an immunogenic protein, wherein said immunogenic protein is derived from an HPV strain which has been mutated so as to no longer cause cancer.

[0251] The method according to embodiments 49 or 51 wherein said recombinant virus is a recombinant herpes virus.

[0252] The method of embodiment 53 wherein said recombinant herpes virus expresses one or more cytokines.

[0253] The method according to embodiment 54 wherein said cytokines comprise one or more of IL-12, IL-15, IL-15Rα and IL-18.

[0254] The method according to embodiment 53 wherein said recombinant herpes virus further comprises a truncated glycoprotein.

[0255] The method according to embodiment 53 wherein said recombinant herpes virus encodes an ICP34.5-ODD protein comprising an amino acid sequence having greater than 75%sequence identity with any one of SEQ ID NOs: 14, 15, 17, 18, 19, 20 or 21.

[0256] The method according to embodiment 53 wherein said recombinant herpes virus is a recombinant herpes virus according to any one of embodiments 1 to 29.

[0257] The method according to embodiments 49 or 51 wherein said immunogenic protein is an immunogenic protein according to embodiments 31 to 39.

[0258] The method according to embodiments 50 or 52, wherein said immunogenic protein is encoded by mRNA.

[0259] The method according to embodiment 60 wherein said mRNA is a self-amplifying mRNA.

[0260] The method according to embodiment 60 wherein said mRNA is encapsulated within lipid nanoparticles, lipoplexes, or polyplexes.

[0261] The method according to embodiment 48 wherein 1, 2, 3, 4, or 5 doses of the priming vaccine are administered.

[0262] The method according to embodiment 48 wherein 1, 2, 3, 4 or 5 doses of the boosting vaccine are administered.

[0263] The method according to embodiment 48 wherein said HPV-related disease is cancer.

[0264] The method according to embodiment 65 wherein said cancer is selected from the group consisting of adrenocortical carcinoma, anal cancer, bladder cancer, brain tumor, brain stem glioma, cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma, ependymoma, medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal, pineal tumors, hypothalamic glioma, breast cancer, carcinoid tumor, carcinoma, cervical cancer, colon cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, extrahepatic bile duct cancer, Ewing’s family of tumors (Pnet) , extracranial germ cell tumor, eye cancer, intraocular melanoma, gallbladder cancer, gastric cancer, extragonadal germ cell tumor, gestational trophoblastic tumor, head and neck cancer, hypopharyngeal cancer, islet cell carcinoma, laryngeal cancer, leukemia, acute lymphoblastic leukemia, oral cavity cancer, liver cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, AIDS-related lymphoma, central nervous system (primary) lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's disease, malignant mesothelioma, melanoma, Merkel cell carcinoma, metastatic squamous carcinoma, multiple myeloma, plasma cell neoplasms, mycosis fungoides, myelodysplastic syndrome, myeloproliferative disorders, nasopharyngeal cancer, neuroblastoma, oropharyngeal cancer, osteosarcoma, ovarian epithelial cancer, ovarian germ cell tumor, ovarian low malignant potential tumor, pancreatic cancer, exocrine pancreatic cancer, islet cell carcinoma, paranasal sinus and nasal cavity cancer, parathyroid cancer, penile cancer, pheochromocytoma cancer, pituitary cancer, plasma cell neoplasm, prostate cancer,  rhabdomyosarcoma, rectal cancer, renal cell cancer, salivary gland cancer, Sezary syndrome, skin cancer, cutaneous T-cell lymphoma, Kaposi's sarcoma, melanoma, small intestine cancer, soft tissue sarcoma, testicular cancer, thymoma, thyroid cancer, urethral cancer, uterine cancer, sarcoma, unusual cancer of childhood, vaginal cancer, vulvar cancer, Wilms' tumor. Within particularly preferred embodiments of the invention the cancer is an HPV-associated cancer. Examples of HPV-associated cancer include, but are not limited to cervical cancer, head and neck cancer, vaginal cancer, vulvar cancer, penile cancer, anal cancer, oropharyngeal cancer, oral cancer, laryngeal cancer, sinonasal cancer, esophageal cancer, lung cancer, skin cancer, squamous cell carcinomas, Merkel cell carcinoma, conjunctival cancer.

[0265] The method according to embodiment 48 wherein said HPV-related disease is a pre-cancerous condition.

[0266] The method according to embodiment 67 wherein said precancerous condition is selected from the group consisting of cervical dysplasia or squamous intraepithelial lesion, prostatic intraepithelial neoplasia, superficial bladder cancer, precancerous lesions of the breast, precancerous lesions of the lung, actinic keratosis, Barrett's esophagus, precancerous melanoma moles, precancerous conditions of the uterus / vulva, precancerous conditions of the ovary, atrophic gastritis, precancerous conditions of the oral cavity, general dysplastic conditions, squamous metaplasia, intraepithelial neoplasia, precancerous conditions in the head or neck, familial adenomatous polyposis (Gardner's syndrome) , sporadic adenomatous polyposis, hereditary non-polyposis colon cancer (Lynch syndrome) , and Crohn’s disease.

[0267] The method according to embodiment 48 wherein said priming and / or boosting vaccine induces an intratumoral immune response.

[0268] The method according to embodiment 48 wherein said priming and / or boosting vaccine induces a peripheral immunogen specific T cell response.

[0269] The invention has been described broadly and generically herein. Each of the narrower species and subgeneric groupings falling within the generic disclosure also form part of the invention. This includes the generic description of the invention with a proviso or negative limitation removing any subject matter from the genus, regardless of whether or not the excised material is specifically recited herein.

[0270] It is also to be understood that as used herein and in the appended claims, the singular forms “a, ” “an, ” and “the” include plural reference unless the context clearly dictates otherwise, the term “X and / or Y” means “X” or “Y” or both “X” and “Y, ” and the letter “s”  following a noun designates both the plural and singular forms of that noun. In addition, where features or aspects of the invention are described in terms of Markush groups, it is intended, and those skilled in the art will recognize, that the invention embraces and is also thereby described in terms of any individual member and any subgroup of members of the Markush group, and Applicants reserve the right to revise the application or claims to refer specifically to any individual member or any subgroup of members of the Markush group.

[0271] It is to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing specific embodiments only and is not intended to be limiting. It is further to be understood that unless specifically defined herein, the terminology used herein is to be given its traditional meaning as known in the relevant art.

[0272] Reference throughout this specification to “one embodiment” or “an embodiment” and variations thereof means that a particular feature, structure, or characteristic described in connection with the embodiment is included in at least one embodiment. Thus, the appearances of the phrases “in one embodiment” or “in an embodiment” in various places throughout this specification are not necessarily all referring to the same embodiment. Furthermore, the particular features, structures, or characteristics may be combined in any suitable manner in one or more embodiments.

[0273] As used in this specification and the appended claims, the singular forms “a, ” “an, ” and “the” include plural referents, i.e., one or more, unless the content and context clearly dictates otherwise. It should also be noted that the conjunctive terms, “and” and “or” are generally employed in the broadest sense to include “and / or” unless the content and context clearly dictates inclusivity or exclusivity as the case may be. Thus, the use of the alternative (e.g., "or" ) should be understood to mean either one, both, or any combination thereof of the alternatives. In addition, the composition of “and” and “or” when recited herein as “and / or” is intended to encompass an embodiment that includes all of the associated items or ideas and one or more other alternative embodiments that include fewer than all of the associated items or ideas.

[0274] Unless the context requires otherwise, throughout the specification and claims that follow, the word “comprise” and synonyms and variants thereof such as “have” and “include, ” as well as variations thereof such as “comprises” and “comprising” are to be construed in an open, inclusive sense, e.g., “including, but not limited to. ” The term "consisting essentially of" limits  the scope of a claim to the specified materials or steps, or to those that do not materially affect the basic and novel characteristics of the claimed invention.

[0275] Any headings used within this document are only being utilized to expedite its review by the reader and should not be construed as limiting the invention or claims in any manner. Thus, the headings and Abstract of the Disclosure provided herein are for convenience only and do not interpret the scope or meaning of the embodiments.

[0276] Where a range of values is provided herein, it is understood that each intervening value, to the tenth of the unit of the lower limit unless the context clearly dictates otherwise, between the upper and lower limit of that range and any other stated or intervening value in that stated range is encompassed within the invention. The upper and lower limits of these smaller ranges may independently be included in the smaller ranges is also encompassed within the invention, subject to any specifically excluded limit in the stated range. Where the stated range includes one or both of the limits, ranges excluding either or both of those included limits are also included in the invention.

[0277] For example, any concentration range, percentage range, ratio range, or integer range provided herein is to be understood to include the value of any integer within the recited range and, when appropriate, fractions thereof (such as one tenth and one hundredth of an integer) , unless otherwise indicated. Also, any number range recited herein relating to any physical feature, such as polymer subunits, size or thickness, are to be understood to include any integer within the recited range, unless otherwise indicated. As used herein, the term "about" means ± 20%of the indicated range, value, or structure, unless otherwise indicated.

[0278] All of the U.S. patents, U.S. patent application publications, U.S. patent applications, foreign patents, foreign patent applications and non-patent publications referred to in this specification and / or listed in the Application Data Sheet, are incorporated herein by reference, in their entirety. Such documents may be incorporated by reference for the purpose of describing and disclosing, for example, materials and methodologies described in the publications, which might be used in connection with the presently described invention. Applicants reserve the right to physically incorporate into this specification any and all materials and information from any such patents, publications, scientific articles, web sites, electronically available information, and other referenced materials or documents.

[0279] The publications discussed above and throughout the text are provided solely for their disclosure prior to the filing date of the present application. Nothing herein is to be  construed as an admission that the inventors are not entitled to antedate any referenced publication by virtue of prior invention.

[0280] In general, in the following claims, the terms used should not be construed to limit the claims to the specific embodiments disclosed in the specification and the claims, but should be construed to include all possible embodiments along with the full scope of equivalents to which such claims are entitled. Accordingly, the claims are not limited by the disclosure.

[0281] Furthermore, the written description portion of this patent includes all claims. Furthermore, all claims, including all original claims as well as all claims from any and all priority documents, are hereby incorporated by reference in their entirety into the written description portion of the specification, and Applicants reserve the right to physically incorporate into the written description or any other portion of the application, any and all such claims. Thus, for example, under no circumstances may the patent be interpreted as allegedly not providing a written description for a claim on the assertion that the precise wording of the claim is not set forth in haec verba in written description portion of the patent.

[0282] The claims will be interpreted according to law. However, and notwithstanding the alleged or perceived ease or difficulty of interpreting any claim or portion thereof, under no circumstances may any adjustment or amendment of a claim or any portion thereof during prosecution of the application or applications leading to this patent be interpreted as having forfeited any right to any and all equivalents thereof that do not form a part of the prior art.

[0283] Other nonlimiting embodiments are within the following claims. The patent may not be interpreted to be limited to the specific examples or nonlimiting embodiments or methods specifically and / or expressly disclosed herein. Under no circumstances may the patent be interpreted to be limited by any statement made by any Examiner or any other official or employee of the Patent and Trademark Office unless such statement is specifically and without qualification or reservation expressly adopted in a responsive writing by Applicants.

[0284] The Examples and preparations provided below further illustrate and exemplify the compounds of the present invention and methods of preparing such compounds. It is to be understood that the scope of the present invention is not limited in any way by the scope of the following Examples and preparations. In the following Examples, molecules with a single chiral center, unless otherwise noted, exist as a racemic mixture. Those molecules with two or more chiral centers, unless otherwise noted, exist as a racemic mixture of diastereomers. Single enantiomers / diastereomers may be obtained by methods known to those skilled in the art. The  starting materials and various reactants utilized or referenced in the examples may be obtained from commercial sources, or are readily prepared from commercially available organic compounds, using methods well-known to one skilled in the art.

[0285] EXAMPLES

[0286] Overview:

[0287] The following examples demonstrates the following:

[0288] 1. Recombinant HSV-1 OV expressing HPV immunogen induces intratumoral and peripheral immunogen-specific T cell responses, that lead to growth suppression of both OV-injected and abscopal tumors.

[0289] 2. Recombinant HSV-1 OV expressing cytokines (IL12-IL15-IL15RA) enhances the anti-tumor immunity induced by OV therapy.

[0290] 3. Both a single dose and multiple doses of OV therapy restrict tumor growth, with the latter demonstrating superior efficacy.

[0291] 4. Single dose and multiple doses of mRNA therapy both restrict tumor growth, with the latter demonstrating superior efficacy.

[0292] 5. The nrmRNA and saRNA therapy both restrict tumor growth, with the latter demonstrating superior efficacy.

[0293] 6. The nrmRNA and saRNA therapy is suitable for multiple administration routes, including but not limited to i. m, s.c., and i.d.

[0294] 7. The mRNA therapy induces high-level of systemic T cell immune response but has limited access to the intratumoral immune-suppressive environment, whereas the OV’s strength lays in optimizing the intratumoral immune environment to promote tumor infiltration of active immune cells. mRNA therapy and OV therapy complement each other to achieve a superior antitumor response.

[0295] 8. The mRNA&OV prime boost has an optimal therapeutic efficacy in treating advanced tumors, and the sequence of administration matters.

[0296] 9. The OV backbones described herein have attenuated neurovirulence.

[0297] 10. The OV backbones described herein induce cell-to-cell fusion, which is important for OV spreading within the solid tumors.

[0298] Summary of Sequences:

[0299] The following summarizes the sequence of certain constructs that are used herein:

[0300] mRNA sequence of the immunogen in M22H04 (SEQ ID NO. 1) :

[0301] Amino acid sequence of HPV immunogen in M22H04 (SEQ ID NO. 2) :

[0302] Amino acid sequence of HPV immunogen in T22H07 (SEQ ID NO. 3) :

[0303] Amino acid sequence of GS linker (SEQ ID NO. 4) :

[0304] DNA sequence of mouse IL12-IL15-IL15RA expression cassette (SEQ ID NO. 5) :

[0305] Amino acid sequence of human IL12-IL15-IL15RA (SEQ ID NO. 6) :

[0306] DNA sequence of mirT following the 3’ of ICP34.5-ODD (SEQ ID NO. 7) :

[0307] Amino acidic sequence of ICP34.5-ODD (SEQ ID NO. 8) :

[0308] DNA sequence of tgB (SEQ ID NO. 9) :

[0309] DNA sequence of tUS12 (SEQ ID NO. 10) :

[0310] Amino acid sequence of HPV16 immunogen (SEQ ID NO: 11)

[0311] Amino acid sequence of multi-valent immunogen-1 (SEQ ID NO: 12)

[0312] Amino acid sequence of multi-valent immunogen-2 (SEQ ID NO: 13)

[0313] Amino acid sequence of human HIF-1α (SEQ ID NO: 14)

[0314] Amino acid sequence of human ODD domain (SEQ ID NO: 15) from human HIF-1α

[0315] SEQ ID NO: 16 is the minimal consensus amino acid sequence for Hypoxia-inducible factor 1 alpha subunit (HIF-1α) O2-dependent degradation domain (ODD domain)

[0316] Amino acid sequence of HIF-1α derived from rodent species 1 (SEQ ID NO: 17)

[0317] Amino acid sequence of HIF-1α derived from rodent species 2 (SEQ ID NO: 18)

[0318] Amino acid sequence of bovine HIF-1α (SEQ ID NO: 19)

[0319] Amino acid sequence of avian HIF-1α (SEQ ID NO: 20)

[0320] Amino acid sequence of non-human primate HIF-1α (SEQ ID NO: 21)

[0321] Example 1

[0322] Engineering recombinant HSV-1 for treating HPV-related pre-cancer and cancers

[0323] Objective: To construct a series of recombinant HSV-1 with the following features: (1) HPV-immunogen (s) inserted in oHSV-1 genome; (2) Syngeneic cytokine gene (s) inserted into oHSV-1 genome; and (3) Modified ICP34.5 genes.

[0324] Procedure: A series of modifications were created using wild-type HSV-1 genome through lambda Red-mediated recombineering techniques in Escherichia coli. The viral genome was cloned into a bacterial artificial chromosome (BAC) (see generally: Tischer BK, Smith GA, Osterrieder N. Methods Mol Biol. 2010; 634: 421-30. doi: 10.1007 / 978-1-60761-652-8_30. PMID:  20677001; Tischer BK, von Einem J, Kaufer B, and Osterrieder N., BioTechniques 40: 191-197, Feb. 2006 (including the Supplementary Material, doi: 10.2144 / 000112096; and Tischer BK, Smith, GA and Osterrieder N. Chapter 30, Jeff Braman (ed. ) , In Vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 634, doi: 10.1007 / 978-1-60761-652-8_30, Springer Science+Business Media, LLC 2010) .

[0325] Results: As shown in Figure 1, T23H05 contained truncated gB, truncated US12, cytokine cassette, HPV16 immunogen, and regulatory elements for ICP34.5 gene.

[0326] T23H12 contained truncated gB, truncated US12, cytokine cassette, HPV multivalent immunogen, and regulatory elements for ICP34.5 gene.

[0327] As is shown in Figure 2, HPV immunogen insertion was tested in ICP34.5 locus (T22H07, T23H04, T23H03) , and in UL7 / 8 &UL10 / 11 locus (T23H12, T23H13) ; T22F05 was a control OV that expressed no HPV immunogen. Cytokines were inserted in the UL3 / 4 locus; T23H03, T23H05, T23H12 contained human cytokine sequences; T23H04, T23H12 contained mouse cytokine sequences; T22F05 and T22H07 were control OVs that express no cytokines. Tumor-specific replication enhancing elements were incorporated in T23H05, T23H12 and T23H13; T22F05 was a control OV with ICP34.5 deleted instead of containing regulatory elements. As depicted in Figure 6, the HPV16 immunogen (SEQ ID NO: 11) HPV antigen payload is a fusion antigen comprising HPV16-E7 and E6 with a leading sequence at the N-terminus. The multi-valent immunogen-1 (SEQ ID NO: 12) and multi-valent immunogen-2 (SEQ ID NO: 13) HPV antigen payloads comprise E7 fusion proteins from HPV16-18-31-33, and HPV35-45-52-58, respectively.

[0328] Example 2

[0329] Expression and secretion of HPV immunogens in OV infected cells

[0330] Objective: To test the expression of HPV immunogen in OV-infected cells and to test the secretion of HPV immunogen post OV infection.

[0331] Procedure: Mammalian cell lines were prepared in 6-well plates followed by infection with oncolytic viruses at MOI of 0.001-1. Cell lysates were collected and analyzed in a Western Blot assay to determine the expression of HPV immunogen using anti-E6 and anti-E7 antibodies.

[0332] Cell culture supernatants were collected and concentrated. The contents of immunogen in the cell culture supernatants were determined using Western Blot assay with anti- E6 and anti-E7 antibodies.

[0333] Results: In OV-infected cells, viral protein VP5 was detected indicating the active replication of OV. The HPV-immunogens were detected in the cell lysates by anti-E6 and anti-E7 antibodies (Figure 3A) . The immunogen was effectively secreted to the extracellular environment, as shown in Figure 3B.

[0334] Example 3

[0335] OV expressing HPV immunogen induces mouse tumor regression and prolongs survival

[0336] Objective: To compare the therapeutic efficacy of OV with and without HPV immunogens.

[0337] Procedure: Immunocompetent mice were challenged with TC1 tumor cells (s.c. with Matrigel) . When the tumor volumes reached over 60 mm^3, they were treated with OV (T22H07 or T22F05) or PBS for 3 doses (i.t. ) (Figure 4A) . Tumor volume and mouse body weight were monitored every other day (each group had 10 mice) . Mouse survival was analyzed using the Kaplan-Meier method.

[0338] Results: Tumors treated with the HPV immunogen-expressing OV T22H07 displayed dramatic shrinkage after 3-dose treatment, whereas the PBS and T22F05-treated tumors grew uncontrollably (Figure 4B) . About 40%of mice receiving T22H07 treatment survived until day 50, while the PBS or T22F05 treated mice did not survive until day 30 (Figure 4C) . There was no obvious body weight variation detected during or after the OV treatment (Figure 4D) , indicating that OV therapy was well tolerated.

[0339] Example 4

[0340] OV expressing HPV immunogen induces mouse tumor regression and generates anti-tumor immunity

[0341] Objective: To confirm the HPV-immunogen-expression OV induces intratumoral and systemic anti-tumor immunity.

[0342] Procedure: Tumor bearing mice were treated with OV (T22H07 or T22F05) or PBS for 1 dose (i.t. ) . At 5 days post treatment, the OV-treated tumor and mouse spleen were collected for immunogenicity analysis. Fresh splenocytes were labelled with E7 peptide-MHCI-tetramer and anti-CD8 antibody for flow cytometry. Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) were isolated and  co-incubated with E7-peptides. Subsequently the cells were analyzed with flow cytometry to quantify the IFNγ-secreting CD8+T cells.

[0343] In another set of experiments, mice were challenged with TC1 tumor cells (s.c. with Matrigel) on both the left and right flank. When the tumor volumes reached over 60 mm^3, the tumors on the right side were treated with 3 consecutive intratumoral doses of either PBS control, T22H07, or T22F05. Tumor volume was monitored every other day (each group had 8 mice) .

[0344] Results: T22H07 treatment induced E7-specific T cell immune response in tumor and in the periphery (Figures 5A&5B, respectively) . The systemic anti-tumor T cells induced by T22H07 treatment facilitated robust abscopal tumor suppression (Figure 5C) .

[0345] Example 5

[0346] Cytokine expression through oncolytic virus infection

[0347] Objective: To test the cytokine (IL12 and IL15) expression level in oncolytic virus-infected tissue culture.

[0348] Procedure: Mammalian cell lines prepared in 6-well plates were infected with OV at MOI of 0.001 to 1. The cell culture supernatants were collected without disturbing the cell monolayer. The protein concentration of human IL12p70, mouse IL12 p70, and IL15 were detected with ELISA kits following the manufacturer’s instructions.

[0349] Results: The following oncolytic viruses expressed human IL12 and IL15: T23H03, T23H05 and T23H12. The oncolytic viruses T23H04 and T23H13 expressed mouse IL12 and IL15 (Figures 6A, 6B, and 6C) .

[0350] Example 6

[0351] Mouse IL12-IL15-IL15Ra enhances anti-tumor efficacy of HPV-immunogen-expressing oncolytic virus

[0352] Objectives: To compare the therapeutic efficacy of HPV-OV with and without cytokine expression and to compare the anti-tumor immunity generated by HPV-OV with and without cytokine expression.

[0353] Procedure: Immunocompetent mice were challenged with TC1 tumor cells. Tumors were treated with OV (T22H07 or T23H04) or PBS for 3 doses (i.t. ) as depicted in Figure 7A. T22H07 contained HPV immunogen. T23H04 contained HPV immunogen and cytokines IL12 and IL15. Tumor volumes and mouse body weight were monitored every other day (each group  had n=10 mice) . In another set of experiments, tumor-bearing mice were treated with OV and PBS as described above. One week after the last dose of therapy, mouse spleens were collected for immune analysis. After co-incubation with E7 peptides the splenocytes were subjected to ELISPOT assay and flow cytometry to determine the IFNγ-secreting T cell response and IFNγ-secreting CD8+T cell percentage, respectively.

[0354] Results: The mouse IL12-IL15-IL15Ra-expressing OV (T23H04) showed superior tumor regression when compared to OV without cytokine expression (T22H07) , as shown in Figure 7B. Because of the effective and long-lasting tumor suppression induced by T23H04, overall mouse body weight remained closer to baseline than in mice treated with T22H07 or PBS, which experienced significant tumor growth (Figure 7C) . All of the mice treated by T23H04 survived (100%) , whereas 40%of T22H07-treated mice survived until day 50 (Figure 7D) . In addition, treatment with T23H04 induced higher T cell immune response than T22H07, as determined by flow cytometry (Figure 7E) and ELISPOT (Figure 7F) , indicating that cytokine expression synergistically enhanced the immunogenicity of immunogen-expressing OV.

[0355] Example 7

[0356] Multi-dose of oncolytic virus shows increased therapeutic efficacy compared to single dose

[0357] Objective: To study the dose and efficacy relationship of OV therapy.

[0358] Procedure: Tumor-bearing mice were treated with low and high PFU of PBS, T22H07 or T23H04, for single dose or three doses (i.t. ) (Figure 8A-8B) . The tumor growth curve and mice body weight were monitored every other day. Mouse survival was analyzed using the Kaplan-Meier method.

[0359] Results: Three doses of OV treatment had enhanced efficacy in suppressing tumor growth and enhancing mice survival rates (Figures 8C-8F) . Mice receiving low and high-doses of OV treatment had comparable survival rates (Figures 8D-8F) . These results suggested that multi-dose OV therapy had better efficacy than a single dose of OV therapy.

[0360] Example 8

[0361] Repeated dosing of mRNA results in superior efficacy compared to single dosing

[0362] Objective: To study the dose and efficacy relationship of mRNA therapy.

[0363] Procedure: Tumor-bearing mice were treated with single or 3 doses (45 pmol / dose, i.m. ) of mRNA therapy (M22H04-LNP) or blank-LNP. Tumor growth curves were  monitored every other day (each group had n=10 mice) . Spleens were collected on day 20 for immune response analysis. Fresh splenocytes labelled with E7 peptide-MHCI-tetramer and anti-CD8 antibody were quantified using a flow cytometer.

[0364] Results: Three consecutive administrations of M22H04-LNP had superior efficacy in tumor suppression and establishing a systemic anti-tumor T cell immune response than a single dose (Figure 9) .

[0365] Example 9

[0366] Therapeutic efficacy and immunogenicity of saRNA vector is superior to nrmRNA

[0367] Objective: To compare the therapeutic efficacy and immunogenicity between saRNA and nrmRNA.

[0368] Procedure: In tumor-bearing mice, HPV immunogen was delivered through saRNA-LNP or nrmRNA-LNP. In one group, mice were vaccinated with 3 doses of nrmRNA-LNP (40 ug or 45 pmol / dose, i.d. ) . in another group, mice received single dose of saRNA-LNP (40 ug / dose, i.d. ) . Blank-LNP treatment served as placebo. Tumor growth curves were monitored every other day. PBMC from peripheral blood were isolated on day 20. The E7-specific CD8+T cells in PBMCs labelled with E7 peptide-MHCI-tetramer and anti-CD8 antibody were quantified using a flow cytometer.

[0369] Results: Single dose of saRNA-LNP showed effective and long-lasting tumor suppressing efficiency whereas the tumor suppressing efficacy of 3-dose nrmRNA-LNP was not persistent. (Figure 10A) . E7-specific CD8+T cell levels in the periphery in each group were correlated with their tumor suppressing efficiency (Figure 10B) .

[0370] Example 10

[0371] Administration routes for mRNA vaccines

[0372] Objective: To test the immune response induced by saRNA-LNP and nrmRNA-LNP through multiple administration routes.

[0373] Procedure: In one set of experiments,  mice were vaccinated with HPV-nrmRNA for 3 doses with 3-7days interval through s. c or i.m. administration. Splenocytes were harvested one week after the final vaccination. Splenocytes were activated with E7 peptides. The IFNγ-secreting CD8+T cell population was quantified using a flow cytometer (Figure 11A) . In another set of experiments,  mice were vaccinated with a single dose of HPV-saRNA through i.m., s.c., or i.d. routes. Splenocytes were collected one week post vaccination and subjected to  IFNγ-ELISPOT assay following activation with E7 peptide. Spot numbers were quantified with an ELISPOT plate reader (Figure 11B) .

[0374] Results: The saRNA-and nrmRNA-vaccinated mice generated significantly higher levels of T cell immune response through all tested routes (i.m., s.c., and i.d. ) when compared to mice vaccinated with Blank-LNP control (Figure 11) .

[0375] Example 11

[0376] Characterizing the complementary roles of mRNA and OV in establishing peripheral anti-tumor immune response and ameliorating intratumoral immune suppression, respectively

[0377] Objectives: To compare the systemic immune response levels induced by mRNA and OV therapy and to compare the intratumoral immune response levels induced by mRNA and OV therapy.

[0378] Procedure: Tumor-bearing mice received three doses of PBS (i.t. and i.m. ) , T22H07 (i.t. ) or M22H04 (i.m. ) . At two days post the last treatment, the levels of peripheral T cell immune response between the three groups of mice were compared by quantifying the E7-TCR+ CD8+T cell population in the spleens using flow cytometry. Simultaneously, the tumors were digested to single cell suspension, in which the immune cells were characterized through single-cell RNA sequencing analysis. To specifically quantify the E7-specific CD8+T cells in the tumor, tumor cells were analyzed with flow cytometry.

[0379] Results: Treatment with M22H04 induced higher levels of systemic E7-specific T cell immune responses than treatment with T22H07 (Figure 12A) . T22H07 was superior to M22H04 in activating the intratumoral immune response (Figure 12B-12E) , as evidenced by OV-treated tumors exhibiting higher levels of immune cell infiltration and higher amounts of E7-specifc CD8+T cell population than the M22H04 treated tumors. Both treatments increased the number of neutrophils in tumor. However, the neutrophils in M22H04-treated tumors expressed higher levels of inflammatory genes and lower levels of precursor genes than the M22H04-treated group.

[0380] Example 12

[0381] The efficacy of the mRNA&OV combo-therapy is superior to that of each treatment alone

[0382] Objective: To compare the therapeutic efficacy of mRNA&OV prime-boost strategy with mRNA or OV treatment alone.

[0383] Procedure: Tumor-bearing mice received a M22H04 vaccine or PBS (i.m. ) on day 4, followed by 3 doses of T22H07 or PBS (i.t. ) from day 9 to 13. Tumor volume and mouse survival were monitored every other day (Figure 13 A) .

[0384] Results: The mice receiving one dose of M22H04 prime and 3 doses of T22H07 boost vaccines showed the best therapeutic outcome in all tested groups and 100%of them survived until the end of the experiment (Figure 13B-13C) . The tumors only receiving T22H07 treatment continued growing until day 15 followed by a rapid shrinkage period which lasted for about 10 days. The M22H04 vaccine induced tumor suppression for about 15 days post treatment followed by a rapid tumor growth, which led to mice death.

[0385] Example 13

[0386] OV backbones are attenuated for neurovirulence

[0387] Objective: To test the viral infection level (using ICP27 gene copy number as proxy) in mouse trigeminal ganglia (TG) and re-activation rate from the TG.

[0388] Procedure: Balb / c mice were inoculated with different viruses in each group, including wild-type HSV-1 (2E4 PFU / dose) , T22F05 (1E5 PFU / dose) , T22F14 (1E5 PFU / dose) , VG2025 (1E5 PFU / dose) and PBS, through corneal infection (Figure 14 A) . The local symptoms in the cornea were recorded during the lytic infection period. At about 2 weeks post infection, the surviving mice recovered from lytic infection. The mice were sacrificed at 5 weeks post viral inoculation for TG collection. Half of the TG tissues were digested for DNA extraction and quantification of ICP27 gene using qPCR assay. The rest of the TG tissues were co-cultured with Vero cells. The cell cultural medium was refreshed every 2-3 days.

[0389] Results: Wild-type HSV-1 infected mice showed severe eye symptoms including increased light sensitivity, lacrimation and abscess. Eighty percent of the mice died from infection by day 11. By comparison, all the mice receiving T22F05, T22F14 or VG2025 survived and did not show local symptoms (Figure 14B-14C) . When comparing with the wild-type HSV-1-infection group, the T22F05-, T22F14-and VG2025-infected mice had lower amounts of HSV-1 genome copies in the TG (Figure 14 D) and lower levels of viral reactivation rate (Figure 14E) .

[0390] Example 14

[0391] Administration sequence for prime-boost strategy

[0392] Objective: To test the optimal administration sequence of prime-boost agents.

[0393] Procedure: Tumor-bearing mice received two doses of therapy following the sequence below: mRNA (i.m. ) prime followed by OV (i.t. ) boost; OV (i.t. ) prime followed by mRNA (i.m. ) boost; mRNA (i.m. ) plus OV (i.t. ) prime followed by mRNA (i.m. ) plus OV (i.t. ) boost; PBS (i.m. plus i.t. ) prime followed by PBS (i.m. plus i.t. ) boost. Peripheral blood was collected before each treatment, and 5 and 10 days after the 2nd treatment. Tumor volumes and mouse survival were monitored every other day (Figure 15A) . The mRNA vaccine was M22H04, and the OV was VG2025.

[0394] PBMCs isolated from the peripheral blood were labelled with E7 peptide-MHCI-tetramer and anti-CD8 antibody to quantify the E7-specific CD8+T cells using flow cytometry.

[0395] Results: The mice receiving mRNA followed by OV showed slower tumor growth rate and longer survival rate than the mice receiving treatment with the opposite sequence (Figure 15B-15C) . The therapeutic efficacy of mRNA prime-OV boost was comparable to that of mRNA plus OV prime-mRNA plus OV boost (Figure 15 B&C) . These results indicated that it was essential to use mRNA to establish a systemic T cell immune response before using OV to optimize the intratumoral immune environment. By monitoring the T cell immune response in the periphery (PBMC) , the results showed that mRNA prime-OV boost induced relatively lower levels of antigen-specific T cell population in the periphery than two doses of mRNA plus OV (Figure 15D) . These data further confirmed that it was essential to use OV to induce tumor infiltration of immune cells for optimal therapeutic efficacy in treating advanced tumors.

[0396] Example 15

[0397] Oncolytic virus with truncated gB enhances cell-to-cell fusion

[0398] Objective: To test the cell-to-cell fusion induced by truncating gB protein in HSV-1.

[0399] Procedure: Vero cells were prepared in a 6-well plate. When the cell monolayers were about 95%confluent, they were infected with OV encoding either wild-type gB or truncated gB at MOI of 0.001 to 1 until all cells showed cytopathic effects.

[0400] Results: The cell monolayers were fused without clear cell membrane structures in the sample infected with OV expressing truncated gB. In comparison, cells infected with the OV encoding wild type gB exhibited individual cell shrinkage with clearly defined cell membranes (Figure 16) .

[0401] All of the U.S. patents, U.S. patent application publications, U.S. patent applications,  foreign patents, foreign patent applications and non-patent publications referred to in this specification and / or listed in the Application Data Sheet are incorporated herein by reference, in their entirety. Such documents may be incorporated by reference for the purpose of describing and disclosing, for example, materials and methodologies described in the publications, which might be used in connection with the presently described invention. The publications discussed above and throughout the text are provided solely for their disclosure prior to the filing date of the present application. Nothing herein is to be construed as an admission that the inventors are not entitled to antedate any referenced publication by virtue of prior invention.

[0402] In general, in the following claims, the terms used should not be construed to limit the claims to the specific embodiments disclosed in the specification and the claims, but should be construed to include all possible embodiments along with the full scope of equivalents to which such claims are entitled. Accordingly, the claims are not limited by the disclosure.

Claims

1.A recombinant HSV which encodes one or more immunogenic proteins that are derived from HPV (Human Papilloma Virus) .2.The recombinant HSV according to claim 1, wherein said one or more immunogenic proteins are derived from and HPV strain that causes or is associated with causing cancer.3.The recombinant HSV according to claim 1 wherein said one or more immunogenic proteins are mutated such that they do not cause cellular proliferation.4.The recombinant HSV according to claim 3 wherein said mutation is one or more amino acid changes selected from the group consisting of substitutions, insertions and deletions.5.The recombinant HSV according to claim 1 wherein said protein is mutated to eliminate or diminish interactions with p53 / pRB.6.The recombinant HSV according to claim 1 wherein said protein is mutated to reduce or prevent nuclear localization.7.The recombinant HSV according to claim 1 wherein said protein is mutated, but wherein said mutation does not substantively decrease the immune response as compared to unmutated HPV E6 or E7.8.The recombinant HSV according to claim 1 wherein said protein is mutated, and wherein said mutated protein is HPV E6 or E7.9.The recombinant HSV according to any one of claims 1 to 8 wherein said immunogenic protein is selected from an HPV strain selected from the group consisting of HPV strain 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 or 68.10.The recombinant HSV according to claim 1 wherein said immunogenic protein is selected from 2, 3, 4, 5, 5, 7, 8, 9, or 10 HPV strains.11.The recombinant HSV according to claim 1 wherein said immunogenic protein comprises HPV strains 16, 18, 33, 35, 45, 52 and 58.12.The recombinant HSV according to claim 1 wherein said immunogenic protein comprises SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 13.13.The recombinant HSV according to any one of claims 1-12, further comprises at least one miRNA target sequence.14.The recombinant HSV according to claim 13, wherein said miRNA target sequence is operably linked to a first, or, to a first and a second copy of an ICP34.5 gene.15.The recombinant HSV according to claim 14 wherein said miRNA target sequence comprises at least two copies of at least two different miRNA target sequences.16.The recombinant HSV according to claim 14 wherein said miRNA target sequence is selected from the group consisting of miRNA-124 and miRNA-143.17.The recombinant HSV according to claim 13 wherein said at least one miRNA target sequence comprises five copies of the binding site for miRNA-124, and five copies of the binding site for miRNA-143.18.The recombinant HSV according to claim 1 further comprising a nucleic acid sequence encoding an immunomodulatory protein.19.The recombinant HSV according to claim 18, wherein said immunomodulatory protein is a prodrug, a cytokine, or a checkpoint inhibitor.20.The recombinant HSV according to claim 19 wherein said cytokine is selected from the group consisting or IL-12, IL-15, IL-15Rα and IL-18.21.The recombinant HSV according to claim 18 wherein said immunomodulatory protein is encoded within an expression cassette.22.The recombinant HSV according to claim 1, wherein said virus expresses a mutated or truncated US12 to reduce virus-induced immune suppression.23.The recombinant HSV according to claim 1 wherein said virus expresses a mutated or truncated US9, and / or glycoprotein E (gE) , and / or glycoprotein I (gI) to reduce neurovirulence.24.The recombinant HSV according to claim 1 wherein said virus expresses a mutated or truncated gB (tgB) to enhance cell-to-cell spread of the virus within a tumor.25.The recombinant HSV of claim 24, wherein the gene encoding glycoprotein B encodes a glycoprotein B variant that terminates after amino acid 876.26.The recombinant HSV according to claim 1 further comprising an O2-dependent degradation domain (ODD) operably linked to an HSV gene selected from the group consisting of ICP0, ICP4, ICP27, and ICP34.5.27.The recombinant HSV of claim 1 wherein said recombinant HSV encodes an ICP34.5-ODD protein comprising an amino acid sequence having greater than 75%sequence identity with any one of SEQ ID NOs: 14, 15, 17, 18, 19, 20 or 21.28.The recombinant HSV of claim 27, wherein said ODD comprises an amino acid sequence having greater than 75%sequence identity with SEQ ID NO: 16.29.The recombinant HSV of claim 1, wherein the recombinant herpes virus genome further comprises a mutation in a gene encoding UL37 and / or US9 to reduce neurovirulence by impairing axonal trafficking of viral particles.30.A pharmaceutical composition, comprising a recombinant HSV according to any one of claims 1 to 28, along with a pharmaceutically acceptable excipient.31.An immunogenic protein, comprising an amino acid sequence derived from one or more proteins which are responsible for cell proliferation, and wherein said one or more proteins are derived from an HPV strain associated with causing cancer.32.The protein according to claim 31, wherein said HPV strain associated with causing cancer is selected from the group consisting of HPV strain 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 or 68.33.The protein according to claim 31, wherein said immunogenic protein is mutated such that it does not cause cell proliferation.34.The protein according to claim 33 wherein said mutation is one or more amino acid changes selected from the group consisting of substitutions, insertions and deletions.35.The protein according to claim 33 wherein said mutation eliminates or diminishes interactions with p53 / pRB.36.The protein according to claim 33 wherein said mutation reduces or prevents nuclear localization.37.The protein according to claim 33 wherein said mutation does not substantively decrease the immune response as compared to unmutated E6 and E7.38.The protein according to claim 35 wherein said mutated protein is E6 or E7.39.The protein according to claim 31 wherein said protein comprises SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: 13.40.An isolated nucleic acid sequence which encodes an immunogenic protein according to any one of claims 31 to 39.41.The isolated nucleic acid sequence according to claim 40 wherein said nucleic acid sequence is an mRNA sequence.42.The isolated nucleic acid sequence according to claim 40 wherein said mRNA is a self-amplifying mRNA.43.An expression cassette which directs the expression of an immunogenic protein according to any one of claims 31 to 39.44.A composition comprising an mRNA sequence encoding an immunogenic protein according to any one of claims 31 to 39.45.The composition according to claim 44, wherein said composition is encapsulated within a lipid nanoparticle, lipoplex or, a polyplex.46.A pharmaceutical composition, comprising an immunogenic protein according to any one of claims 31 to 39, an isolated nucleic acid sequence according to claims 40, 41, or 42, or, an expression cassette according to claim 43.47.A method for treating or preventing HPV-related disease, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition according to claim 30 or 46.48.A method for treating or preventing HPV-related disease, comprising administering to a subject a priming vaccine and a boosting vaccine, wherein the priming and boosting vaccine each elicit an immune response against HPV.49.The method of claim 48 wherein said priming vaccine comprises a recombinant virus which expresses an immunogenic protein derived from an HPV strain which has been mutated so as to no longer cause cancer.50.The method of claim 48 wherein said priming vaccine comprises an immunogenic protein, or a molecule which expresses an immunogenic protein, wherein said immunogenic protein is derived from an HPV strain which has been mutated so as to no longer cause cancer.51.The method of claim 48 wherein said boosting vaccine comprises a recombinant virus which expresses an immunogenic protein derived from an HPV strain which has been mutated so as to no longer cause cancer.52.The method of claim 48 wherein said boosting vaccine comprises an immunogenic protein, or a molecule which expresses an immunogenic protein, wherein said immunogenic protein is derived from an HPV strain which has been mutated so as to no longer cause cancer.53.The method according to claims 49 or 51 wherein said recombinant virus is a recombinant herpes virus.54.The method of claim 53 wherein said recombinant herpes virus expresses one or more cytokines.55.The method according to claim 54 wherein said cytokines comprise one or more of IL-12, IL-15, IL-15Rα and IL-18.56.The method according to claim 53 wherein said recombinant herpes virus further comprises a truncated glycoprotein.57.The method according to claim 53 wherein said recombinant herpes virus encodes an ICP34.5-ODD protein comprising an amino acid sequence having greater than 75%sequence identity with any one of SEQ ID NOs: 14, 15, 17, 18, 19, 20 or 21.58.The method according to claim 53 wherein said recombinant herpes virus is a recombinant herpes virus according to any one of claims 1 to 29.59.The method according to claim 49 or 51 wherein said immunogenic protein is an immunogenic protein according to claims 31 to 39.60.The method according to claims 50 or 52, wherein said immunogenic protein is encoded by mRNA.61.The method according to claim 60 wherein said mRNA is a self-amplifying mRNA.62.The method according to claim 60 wherein said mRNA is encapsulated within lipid nanoparticles, lipoplexes, or polyplexes.63.The method according to claim 48 wherein 1, 2, 3, 4, or 5 doses of the priming vaccine are administered.64.The method according to claim 48 wherein 1, 2, 3, 4 or 5 doses of the boosting vaccine are administered.65.The method according to claim 48 wherein said HPV-related disease is cancer.66.The method according to claim 65 wherein said cancer is selected from the group consisting of adrenocortical carcinoma, anal cancer, bladder cancer, brain tumor, brain stem glioma, cerebellar astrocytoma, cerebral astrocytoma, ependymoma, medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal, pineal tumors, hypothalamic glioma, breast cancer, carcinoid tumor, carcinoma, cervical cancer, colon cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, extrahepatic bile duct cancer, Ewing’s family of tumors (Pnet) , extracranial germ cell tumor, eye cancer, intraocular melanoma, gallbladder cancer, gastric cancer, extragonadal germ cell tumor, gestational trophoblastic tumor, head and neck cancer, hypopharyngeal cancer, islet cell carcinoma, laryngeal cancer, leukemia, acute lymphoblastic leukemia, oral cavity cancer, liver cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, AIDS-related lymphoma, central nervous system (primary) lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's disease, malignant mesothelioma, melanoma, Merkel cell carcinoma, metastatic squamous carcinoma, multiple myeloma, plasma cell neoplasms, mycosis fungoides,  myelodysplastic syndrome, myeloproliferative disorders, nasopharyngeal cancer, neuroblastoma, oropharyngeal cancer, osteosarcoma, ovarian epithelial cancer, ovarian germ cell tumor, ovarian low malignant potential tumor, pancreatic cancer, exocrine pancreatic cancer, islet cell carcinoma, paranasal sinus and nasal cavity cancer, parathyroid cancer, penile cancer, pheochromocytoma cancer, pituitary cancer, plasma cell neoplasm, prostate cancer, rhabdomyosarcoma, rectal cancer, renal cell cancer, salivary gland cancer, Sezary syndrome, skin cancer, cutaneous T-cell lymphoma, Kaposi's sarcoma, melanoma, small intestine cancer, soft tissue sarcoma, testicular cancer, thymoma, thyroid cancer, urethral cancer, uterine cancer, sarcoma, unusual cancer of childhood, vaginal cancer, vulvar cancer, Wilms' tumor.67.The method according to claim 48 wherein said HPV-related disease is a pre-cancerous condition.68.The method according to claim 67 wherein said precancerous condition is selected from the group consisting of cervical dysplasia or squamous intraepithelial lesion, prostatic intraepithelial neoplasia, superficial bladder cancer, precancerous lesions of the breast, precancerous lesions of the lung, actinic keratosis, Barrett's esophagus, precancerous melanoma moles, precancerous conditions of the uterus / vulva, precancerous conditions of the ovary, atrophic gastritis, precancerous conditions of the oral cavity, general dysplastic conditions, squamous metaplasia, intraepithelial neoplasia, precancerous conditions in the head or neck, familial adenomatous polyposis (Gardner's syndrome) , sporadic adenomatous polyposis, hereditary non-polyposis colon cancer (Lynch syndrome) , and Crohn’s disease.69.The method according to claim 48 wherein said priming and / or boosting vaccine induces an intratumoral immune response.70.The method according to claim 48 wherein said priming and / or boosting vaccine induces a peripheral immunogen specific T cell response.

Images