Engineered ch1 and CL domain variants, and antigen binding protein comprising the same

Abstract

The engineered CH1 domain variants, CL domain variants, and variant CH1-CL domain sets, which contain at least one amino acid substitution that promotes preferential CH1-CL pairing are provided.The antigen binding protein, and bispecific / multispecific antibodies comprising such variants; and compositions comprising any of the foregoing are provided.

Description

ENGINEERED CH1 AND CL DOMAIN VARIANTS, AND ANTIGEN BINDING PROTEIN COMPRISING THE SAME

[0001] The present invention claims the priority of the US provisional application 63 / 639,250, filed on April 26, 2024, the contents of which are incorporated herein by its entirety.

[0002] TECHNICAL FILED

[0003] This invention relates to engineered bispecific or multispecific antibodies comprising at least one amino acid substitution in the interface between the heavy chain and the light chain. The invention relates to the CH1-CL pairs, the bispecific or multispecific antibodies which contain the CH1-CL pairs, and compositions comprising the bispecific or multispecific antibodies. These bispecific or multispecific antibodies can have stability and production advantages and can be used for therapeutic purposes.BACKGROUND

[0004] The development of bispecific antibodies as therapeutic agents for human diseases has great clinical potential. Bispecific antibodies can simultaneously recognize two different antigens. However, production of bispecific antibodies is very challenging.

[0005] The IgG-like bispecific antibody is a common format, structurally it is made from half of two mAbs, the product would contain two different arms from the two mAbs, respectively, with each arm having a unique heavy chain and a unique light chain. The expression of the bispecific antibody in production cells during the manufacturing process requires the expression of 4 different proteins: the two different heavy chains and the two different light chains. While the goal is to have each HC pair with its corresponding LC on each arm of the bispecific antibody during production, mispairings (the LC of one arm pairs with the HC of the other arm) usually occur and generate unwanted products, making it challenging to produce and isolate the intended bispecific antibody product.

[0006] By introducing mutations in the Fc region, such as “knobs-into-holes” , the preferred heterodimeric assembly of two different heavy chains has been accomplished. However, the selective pairing of HC-LC of each individual antibody remains challenging. The interface between light-heavy chains includes the variable domain (VH-VL) and the constant domain (CH1-CL) . Several strategies had been applied in designing orthogonal interfaces to facilitate cognate pairing. Roche swapped the domains of CH1 and CL and created the CrossMab platform, Amgen made further electrostatics in the CH1-CL region.

[0007] There is still a need for better methods that can efficiently produce functional and stable bispecific antibodies with desirable expression level and affinity to antigens.SUMMARY OF THE INVENTION

[0008] The object of the present invention is to provide engineered CH1 domain variant polypeptides, or heavy chains comprising such a CH1 domain variant polypeptide. In addition, the present invention is to provide engineered CL domain variant polypeptides, or light chains comprising such CL domain variant polypeptide. The CH1 domain variant polypeptide, or with a heavy chain comprising such a CH1 domain variant polypeptide may preferentially pair with the given CL domain variant polypeptide, or with a light chain comprising such a CL domain variant polypeptide. The CH1 and CL domain variant polypeptide according to the present invention may be incorporated into an antibody or antigen-binding protein such as a bispecific or multispecific antibody or antigen-binding fragment.

[0009] The object is solved by the subject of the present invention.

[0010] According to the invention, there is provided a CH1 variant, comprising an amino acid substitution at one or more of the following positions: 124, 190, 139, 192, 174, 122, 145, 221, 123 and 134 according to Kabat numbering; optionally the CH1 variant is a variant of a CH1 domain of a human IgG, further optionally a human IgGl, human IgG2, or human IgG4.

[0011] According to a specific embodiment, the CH1 variant comprises one or more of the following amino acid substitutions: a) position 124 is substituted with A, G, V, S, R, K, E, D, H, N, Q, T, C, P, Y, W or F; preferably, position 124 is substituted with A, G, V or S; more preferably, position 124 is substituted with A, S or G; b) position 190 is substituted with W, F, M, Y, H, A, L, V, M, P, I, D, E, R or K; preferably, position 190 is substituted with W, F, M, Y, H or A; more preferably, position 190 is substituted with W, F, M, Y or A; c) position 139 is substituted with F, W, Y, L or G; d) position 192 is substituted with A; e) position 174 is substituted with A or C; f) position 122 is substituted with C; g) position 145 is substituted with D; h) position 221 is substituted with E; i) position 123 is substituted with A; j) position 134 is substituted with G.

[0012] According to a specific embodiment, the one or more amino acid substitution (s) of the CH1 variant comprise or consist of an amino acid substitution (s) at: a) position (s) 124 and 190; or b) position (s) 139 and 192; or c) position 174; or d) position (s) 122 and 174; or e) position (s) 145 and 221; or f) position (s) 174 and 190; or g) position (s) 122, 123 and 174; h) position (s) 124, 139 and 190; or i) position (s) 139, 192 and 134; (j) a) position (s) 124, 190, 139 and 192; k) position (s) 124, 190 and 122; l) position (s) 139, 192 and 174; m) position (s) 139, 192, 122 and 174; n) position (s) 124, 190, 139, 192 and 122; o) position (s) 124, 190, 145, 221; p) position (s) 174, 145, 221; q) position (s) 122, 174, 145, 221; r) position (s) 139, 192, 145 and 221; s) position (s) 124, 190, 139, 192, 145, 221; t) position (s) 124, 190, 145, 221, 122; u) position (s) 139, 192, 145, 221, 174; or v) position (s) 139, 192, 145, 221, 122, 174.

[0013] According to a specific embodiment, the CH1 variant comprise or consist of: a) 124A / S / G, and 190W / F / M / Y / H / A; or b) 139F / W / Y / L, and 192A; or c) 174A; or d) 122C, and 174C / A; or e) 145D, and 221E; or f) 174A, and 190A; or g) 122C, 123A, and 174C; or h) 124A / G, 139G, and 190W; or i) 139W, 192A and 134G.

[0014] According to a specific embodiment, the CH1 variant comprise or consist of: a) 124A, and 190W; (b) 139F, and 192A; (c) 174A; (d) 122C, and 174C; (e) 145D, and 221E; (f) 174A, and 190A; (g) 122C, 123A, and 174C; (h) 124G, and 190W; (i) 124G, and 190F; (j) 124G, 139G, and 190W; (k) 139W, and 192A; (l) 139W, 192A and 134G; (m) 139Y, and 192A; (n) 139L, and 192A; (o) 124A, and 190F; (p) 124A, and 190M; (q) 124A, and 190Y; (r) 124A, and 190H; (s) 124S, and 190W; (t) 124A, 190W, 139F, and 192A; u) 124A, 190W, and 122C; v) 139F, 192A, and 174A; w) 139F, 192A, 122C, and 174C; x) 122C, and 174A; y) 124A, 190W, 139F, 192A, and 122C; or z) 139F, 192A, 122C, and 174A.

[0015] According to a specific embodiment, the CH1 variant comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 20-50, 71, 72-74, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87.

[0016] According to a specific embodiment, the CH1 variant comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of 21, 22, 23, 24, 26, 29, 31, 32, 33, 35-47, 50, 71, 72-74, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87.

[0017] According to a specific embodiment, the CH1 variant comprises the amino acid sequence selected from 21, 22, 23, 24 or 76.

[0018] According to the invention, there is provided a CL variant, comprising: an amino acid substitution at one or more of the following positions: 118, 116, 176, 124, 123, 131, 121 and 135 according to Kabat numbering; optionally the CL variant is a variant of a CL domain of human kappa light chain or lambda light chain.

[0019] According to a specific embodiment, the CL variant comprises one or more of the following amino acid substitutions: a) position 118 is substituted with V, L, A, G, H, T, I, P, R, K, D, E, S, C, N, Y or W; preferably, position 118 is substituted with V, L, A, G, H, T, I or P; more preferably, position 118 is substituted with V or A; b) position 116 is substituted with V or A; c) position 176 is substituted with F or C; d) position 124 is substituted with C; e) position 123 is substituted with K; f) position 131 is substituted with K; g) position 121 is substituted with C; or h) position 135 is substituted with V or A.

[0020] According to a specific embodiment, the CL variant comprises comprise or consist of an amino acid substitution (s) at: a) position 118; b) position 116; c) position 176; d) position (s) 124 and 176; e) position (s) 123 and 131; f) position (s) 121 and 176; or g) position (s) 118 and 135; ha) position (s) 116 and 118; i) position (s) 118 and 124; j) position (s) 116 and 176; k) position (s) 116, 124 and 176; l) position (s) 116, 118 and 124; m) position (s) 118, 131, 123; n) position (s) 176, 131, 123; o) position (s) 124, 176, 131, 123; p) position (s) 116, 131, 123; q) position (s) 118, 116, 131, 123; r) position (s) 118, 131, 123, 124; s) position (s) 116, 131, 123, 176; or t) position (s) 116, 131, 123, 124, 176.

[0021] According to a specific embodiment, the amino acid substitution (s) of the CL variant comprise or consist of: a) 118V / L / A / G / H / T / I / P; b) 116V / A; c) 176F; d) 124C, and 176C; e) 123K, and 131K; f) 121C, and 176C; g) 118V, and 135V; h) 118A, and 135A; i) 116V, and 118V; j) 118V, and 124C; k) 116V, and 176F; l) 116V, 124C, and 176C; m) 124C, and 176F; n) 116V, 118V, and 124C; or o) 116V, 124C, and 176F.

[0022] According to a specific embodiment, the CL variant comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 51-70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88.

[0023] According to a specific embodiment, the CL variant comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59-70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88.

[0024] According to a specific embodiment, the CL variant comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of 52, 53, 54, 55 or 76.

[0025] According to the invention, there is provided an antigen binding protein, comprising: (i) a first CH1 domain (CH1) and a first CL domain (CL) ; (ii) a second CH1 domain (CH1) and a second CL domain (CL) ; wherein the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at one or more of the following positions: 124, 190, 139, 192, 174, 122, 145, 221, 123 and 134 according to Kabat numbering; the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at one or more of the following positions: 118, 116, 176, 124, 123, 131, 121 and 135 according to Kabat numbering; wherein the amino acid sequences of the first CH1 and the second CH1 are different, and the amino acid sequences in the first CL and the second CL are different; optionally wherein the first CH1 or the second CH1 is a variant of a CH1 domain of a human IgG, further optionally a human IgGl, human IgG2, or human IgG4; optionally wherein the first CL or the second CL is a variant of a CL domain of human kappa light chain or lambda light chain.

[0026] According to a specific aspect, the first CH1 domain or the second CH1 domain comprises one or more of the following amino acid substitutions: a) position 124 is substituted with A, G, V, S, R, K, E, D, H, N, Q, T, C, P, Y, W or F; preferably, position 124 is substituted with A, G, V or S; more preferably, position 124 is substituted with A, S or G; b) position 190 is substituted with W, F, M, Y, H, A, L, V, M, P, I, D, E, R or K; preferably, position 190 is substituted with W, F, M, Y, H or A; more preferably, position 190 is substituted with W, F, M, Y or A; c) position 139 is substituted with F, W, Y, L or G; d) position 192 is substituted with A; e) position 174 is substituted with A or C; f) position 122 is substituted with C; g) position 145 is substituted with D; h) position 221 is substituted with E; i) position 123 is substituted with A; j) position 134 is substituted with G; and the first CL or the second CL domain comprises one or more of the following amino acid substitutions: a) position 118 is substituted with V, L, A, G, H, T, I, P, R, K, D, E, S, C, N, Y or W; preferably, position 118 is substituted with V, L, A, G, H, T, I or P; more preferably, position 118 is substituted with V or A; b) position 116 is substituted with V or A; c) position 176 is substituted with F or C; d) position 124 is substituted with C; e) position 123 is substituted with K; f) position 131 is substituted with K; g) position 121 is substituted with C; h) position 135 is substituted with V or A.

[0027] According to a specific aspect, the one or more amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 comprise or consist of an amino acid substitution (s) at: a) position (s) 124 and 190; or b) position (s) 139 and 192; or c) position 174; or d) position (s) 122 and 174; or e) position (s) 145 and 221; or f) position (s) 174 and 190; or g) position (s) 122, 123 and 174; h) position (s) 124, 139 and 190; or i) position (s) 139, 192 and 134; the one or more amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL comprise or consist of an amino acid substitution (s) at: a) position 118; or b) position 116; or c) position 176; or d) position (s) 124 and 176; or e) position (s) 123 and 131; or f) position (s) 121 and 176; or g) position (s) 118 and 135.

[0028] According to a specific aspect, (a) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at any one of the positions 124, 139 and 190 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at any one of the positions 118 and 135 according to Kabat numbering; (b) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at any one of the positions 139, 192 and 134 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the position 116 according to Kabat numbering; (c) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the position 174 or 190 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the position 176 according to Kabat numbering; (d) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at any one of the positions 122, 123 and 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at any one of the positions 121, 124 and 176 according to Kabat numbering or (e) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at any one of the positions 145 and 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at any one of the positions 123 and 131 according to Kabat numbering.

[0029] According to a specific aspect, (a) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124 and 190 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the position 118 according to Kabat numbering; (b) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 139 and 192 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the position 116 according to Kabat numbering; (c) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the position 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the position 176 according to Kabat numbering; (d) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 122 and 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 124 and 176 according to Kabat numbering or (e) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 145 and 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 123 and 131 according to Kabat numbering.

[0030] According to a specific aspect, the one or more amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 comprise or consist of an amino acid substitution (s) at: a) position (s) 124, 190, 139 and 192; or b) position (s) 124, 190 and 122; or c) position (s) 139, 192 and 174; or d) position (s) 139, 192, 122 and 174; or e) position (s) 124, 190, 139, 192 and 122; or f) position (s) 124, 190, 145, 221; or g) position (s) 174, 145, 221; or h) position (s) 122, 174, 145, 221; or i) position (s) 139, 192, 145 and 221; or j) position (s) 124, 190, 139, 192, 145, 221; or k) position (s) 124, 190, 145, 221, 122; or l) position (s) 139, 192, 145, 221, 174; or m) position (s) 139, 192, 145, 221, 122, 174; the one or more amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL comprise or consist of an amino acid substitution (s) at: a) position (s) 116 and 118; or b) position (s) 118 and 124; or c) position (s) 116 and 176; or d) position (s) 116, 124 and 176; or e) position (s) 116, 118 and 124; or f) position (s) 118, 131, 123; or g) position (s) 176, 131, 123; or h) position (s) 124, 176, 131, 123; or i) position (s) 116, 131, 123; or j) position (s) 118, 116, 131, 123; or k) position (s) 118, 131, 123, 124; or l) position (s) 116, 131, 123, 176; or m) position (s) 116, 131, 123, 124, 176.

[0031] According to a specific aspect, (a) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124, 190, 139 and 192 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116 and 118 according to Kabat numbering; (b) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124, 190 and 122 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 118 and 124 according to Kabat numbering; (c) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 139, 192 and 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116 and 176 according to Kabat numbering; (d) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 139, 192, 122 and 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116, 124 and 176 according to Kabat numbering; (e) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124, 190, 139, 192 and 122 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116, 118 and 124 according to Kabat numbering; or (f) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124, 190, 145, 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 118, 131, 123 according to Kabat numbering; (g) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 174, 145, 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 176, 131, 123 according to Kabat numbering; (h) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 122, 174, 145, 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 124, 176, 131, 123 according to Kabat numbering; (i) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 139, 192, 145 and 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116, 131, 123 according to Kabat numbering or (j) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124, 190, 139, 192, 145, 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 118, 116, 131, 123 according to Kabat numbering; (k) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124, 190, 145, 221, 122 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 118, 131, 123, 124 according to Kabat numbering; (l) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 139, 192, 145, 221, 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116, 131, 123, 176 according to Kabat numbering; (m) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 139, 192, 145, 221, 122, 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116, 131, 123, 124, 176 according to Kabat numbering.

[0032] According to a specific aspect, the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: a) 124A / S / G, and 190W / F / M / Y / H / A; or b) 139F / W / Y / L, and 192A; or c) 174A; or d) 122C, and 174C / A; or e) 145D, and 221E; or f) 174A, and 190A; or g) 122C, 123A, and 174C; or h) 124A / G, 139G, and 190W; or i) 139W, 192A and 134G; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: a) 118V / L / A / G / H / T / I / P; or b) 116V / A; or c) 176F; or d) 124C, and 176C; or e) 123K, and 131K; or f) 121C, and 176C; or g) 118V, and 135V; or h) 118A, and 135A.

[0033] According to a specific aspect, (a) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 124A / S / G, and 190W / F / M / Y / H / A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 118V / L / A / G / H / T / I / P; b) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 139F / W / Y / L, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 116V / A; c) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 122C, and 174C / A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 124C, and 176C; d) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 124 A / G, 139G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 118V / A and 135V / A.

[0034] According to a specific aspect, a) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V; b) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116V; c) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 176F; d) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C; e) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 123K, and 131K; f) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 174A, and 190A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 176F; g) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, 123A, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C; h) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, 123A, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 121C, and 176C; i) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 135V; j) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 135V; k) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124G, and 190F; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 135V; l) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124G, 139G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 135V; m) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118A, and 135A; n) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124G, 139G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118A, and 135A; o) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 139G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V; p) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139W, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116V; q) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139W, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL or the second CL domain comprise or consist of: 116A; r) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139W, 192A and 134G; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116V; s) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139W, 192A and 134G; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116A; t) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139Y, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116V; u) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139L, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116V; v) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116A; w) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190F; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V; x) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190M; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V; y) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190Y; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V; z) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190H; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V; aa) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V; bb) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124S, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V; cc) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118L; dd) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118A; ee) t he amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118G; ff) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118H; gg) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118T; hh) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118I; ii) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118P.

[0035] According to a specific aspect, the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: a) 124A, 190W, 139F, and 192A; or b) 124A, 190W, and 122C; or c) 139F, 192A, and 174A; or d) 139F, 192A, 122C, and 174C; or e) 122C, and 174A; or f) 124A, 190W, 139F, 192A, and 122C; or g) 139F, 192A, 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: a) 116V, and 118V; or b) 118V, and 124C; or c) 116V, and 176F; or d) 116V, 124C, and 176C; or e) 124C, and 176F; or f) 116V, 118V, and 124C; or g) 116V, 124C, and 176F.

[0036] According to a specific embodiment, a) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, and 118V; b) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; c) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F; d) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176C; e) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F; f) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, and 122C; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, and 124C; g) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176F.

[0037] According to a specific embodiment, he first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 20-50, 71, 72-74, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 51-70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88.

[0038] According to a specific embodiment, the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 26, 29, 31, 32, 33, 35-47, 50, 71, 72-74, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59-70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88.

[0039] According to a specific embodiment, a) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; b) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; c) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54; d) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 24; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55; e) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 26; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; f) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO:29; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54; g) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 31; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55; h) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 32; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55; i) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 33; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 57; j) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 35; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; k) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 36; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; l) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 37; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54; m) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 38; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55; n) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 39; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 60; o) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 40; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 60; p) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 41; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 60; q) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 42; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 60; r) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 39; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 61; s) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 42; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 61; t) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 62; u) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 24; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 63; v) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 26; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 59; w) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 43; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 59; x) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 35; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 59; y) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 44; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 59; z) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 29; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 62; aa) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 37; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 62; bb) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 31; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 63; cc) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 38; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 63; dd) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 45; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; ff) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 46; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; gg) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 47; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; hh) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 50; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; ii) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 64, 65, 66, 67, 68, 69 or 70; jj) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 71; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; kk) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 71; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 56; ll) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 72; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; mm) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 72; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 56; nn) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 73; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; oo) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 74; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; pp) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; qq) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 77; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 78; rr) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 79; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 80; ss) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 81; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 82; tt) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 83; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 84; uu) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 85; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 86; vv) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 87; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 88.

[0040] According to a specific embodiment, the first CH1 is a variant of a CH1 domain of a human IgG, optionally a human IgGl, human IgG2, or human IgG4; and the first CL is a variant of a CL domain of human kappa light chain or lambda light chain; and the second CH1 domain is the wild-type CH1 fragment, and the second CL domain is the wild-type CL fragment;

[0041] or,

[0042] the second CH1 is a variant of a CH1 domain of a human IgG, optionally a human IgGl , human IgG2, or human IgG4; and the second CL is a variant of a CL domain of human kappa light chain or lambda light chain; and the first CH1 domain is the wild-type CH1 fragment, and the first CL domain is the wild-type CL fragment;

[0043] optionally, wherein the wild-type CH1 fragment is the CH1 domain of a human IgGl, human IgG2, or human IgG4; and the wild-type CL fragment is a CL domain of human kappa light chain or lambda light chain;

[0044] further optionally, wherein the wild-type CH1 fragment comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 15, 17 and 18; and the wild-type CL fragment comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 16, 19. According to a specific embodiment, a) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;

[0045] b) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V; and the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;

[0046] c) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 176F; and the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C; d) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;

[0047] e) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K; f) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;

[0048] g) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V; and the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;

[0049] h) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K; i) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;

[0050] j) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;

[0051] k) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F; l) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;

[0052] m) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;

[0053] n) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;

[0054] o) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F; p) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;

[0055] q) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;

[0056] r) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;

[0057] s) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;

[0058] t) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;

[0059] u) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;

[0060] v) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;

[0061] w) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;

[0062] x) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;

[0063] y) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;

[0064] z) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;

[0065] a1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;

[0066] b1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;

[0067] c1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V; d1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V; e1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;

[0068] f1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;

[0069] g1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;

[0070] h1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;

[0071] i1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, 174C, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of:124C, 176C, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;

[0072] j1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, 174C, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 124C, 176C, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;

[0073] k1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, 174C, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of:124C, 176C, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;

[0074] l1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F;

[0075] m1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K;

[0076] n1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, 174C, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, 176C, 131K, and 123K;

[0077] o1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F;

[0078] p1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, and 123K;

[0079] q1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K;

[0080] r1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F;

[0081] s1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176C;

[0082] t1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F;

[0083] u1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, 174C, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, 176C, 131K, and 123K;

[0084] v1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of:116V, 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K;

[0085] w1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of:116V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F;

[0086] x1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, and 122C; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;

[0087] y1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, and 122C; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;

[0088] z1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;

[0089] a2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;

[0090] a2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;

[0091] b2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;

[0092] c2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, 221E, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, 123K, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;

[0093] d2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, 221E, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, 123K, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;

[0094] e2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, 221E, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, 123K, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;

[0095] f2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, 221E, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, 123K, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;

[0096] g2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, 221E, 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, 123K, 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;

[0097] h2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, 221E, 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, 123K, 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;

[0098] i2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, and 122C; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K;

[0099] j2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F;

[0100] k2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K;

[0101] l2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, 221E, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, 123K, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F;

[0102] m2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, 221E, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, 123K, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C;

[0103] optionally, the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain exchange with the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain exchange with the amino acid substitution (s) of the first CL domain.

[0104] According to a specific embodiment, a) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21, 26, 35, 45-47, 50; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52, 59, 64-70; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23, 29, 37; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54, 62;

[0105] b) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21, 26, 35, 45-47, 50; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52, 59, 64-70; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 24, 31, 38; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55, 63;

[0106] c) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23, 29, 37; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54, 62; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 24, 31, 38; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55, 63;

[0107] d) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22, 28, 36, 71, 72, 73, 74; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53, 56; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23, 29, 37; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54, 62;

[0108] e) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22, 28, 36, 71, 72, 73, 74; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53, 56; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 20, 25, 34; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 51;

[0109] f) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21, 26, 35, 45-47, 50; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52, 59, 64-70; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 20, 25, 34; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 51;

[0110] g) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23, 29, 37; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54, 62;

[0111] h) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 20, 25, 34; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 51;

[0112] optionally, the second CH1 domain exchange with the first CH1 domain, and the second CL domain exchange with the first CL domain.

[0113] According to a specific embodiment, a) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54;

[0114] b) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 24; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55;

[0115] c) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 24; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55;

[0116] d) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54;

[0117] e) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 20; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 51;

[0118] f) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 20; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 51;

[0119] g) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54;

[0120] f) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 20; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 51;

[0121] optionally, the second CH1 domain exchange with the first CH1 domain, and the second CL domain exchange with the first CL domain.

[0122] According to a specific embodiment, the antigen binding protein comprises a first variable region of heavy chain (VH1) , a first variable region or light chain (VL1) , and a second variable region of heavy chain (VH2) , a second variable region of light chain (VL2) , wherein VH1 comprises amino acid substitution in position 39 with E, D, K, R or H; and VL1 comprises amino acid substitution in position 38 with E, D, K, R or H; and / or, VH2 comprises amino acid substitution in position 39 with E, D, K, R or H; and VL2 comprises amino acid substitution in position 38 with E, D, K, R or H.

[0123] According to a specific embodiment, wherein VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E.

[0124] According to a specific embodiment, a) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0125] b) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0126] c) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, and 118V; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0127] d) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0128] e) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0129] f) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, and 118V; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E.

[0130] According to a specific embodiment, wherein:

[0131] a) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21, 26, 35, 45-47, 50; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52, 59, 64-70; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0132] b) the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21, 26, 35, 45-47, 50; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52, 59, 64-70; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0133] c) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22, 28, 36, 71, 73, 74, 75; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53, 72; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0134] d) the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22, 28, 36, 71, 73, 74, 75; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53, 72; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0135] e) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 77; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0136] f) the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 77; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E.

[0137] According to a specific embodiment, wherein:

[0138] a) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0139] b) the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0140] c) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0141] d) the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0142] e) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;

[0143] f) the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E.

[0144] Specifically, the antigen binding protein is a heterodimeric antibody comprising a first and a second Fab arm recognizing different antigens or epitopes; optionally wherein the heterodimeric antibody is the bispecific or multispecific antibody.

[0145] According to a specific embodiment, the antigen binding protein further comprises two HCs each comprising a CH2 and a CH3 domain which HCs dimerize into an Fc region, wherein the CH3 domains are engineered to introduce one or more of the following: a) one or more knob or hole mutations, preferably any of: T366Y / Y407'T, F405A / T394'W, T366Y: F405A / T394'W: Y407'T, T366W / Y407'A and S354C: T366W / Y349'C: T366'S: L368'A: Y407'V; b) a cysteine residue in the first CH3 domain that is covalently linked to a cysteine residue in the second CH3 domain, thereby introducing an interdomain disulfide bridge; c) one or more mutations where repulsive charge suppresses heterodimer formation, preferably any of: K409D / D399'K, K409D / D399'R, K409E / D399'K , K409E / D399'R, K409D: K392D / D399'K: E356'K or K409D: K392D: K370D / D399'K: E356'K: E357'K; wherein the numbering above is according to the EU index.

[0146] According to a specific embodiment, wherein the antigens or epitopes recognized by the first or second Fab arm are selected from the EGFR, HER3, PSMA, B7H3, CDH17, CLDN6, CD3, HER2, CD20, CD22, CD47, CD30, CD33, CD44, CD70, VEGFR, IL4Rα, GPRC5D, SCF, PAPP-A, PD-1, PD-L1, BCMA, DLL3, CSF1R, B7H6, B7H4, Cmet, trop2, CLDN18.2, ROR1, GPC3, CDH6, PTK7, mesothelin, IL23p19, C5, C3.

[0147] According to a specific embodiment, wherein the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of EGFR, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of HER3; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of CDH17, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of CD3; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of PSMA, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of B7H3; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of ROR1, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of CD3; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of HER3, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of EGFR; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of CD3, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of CDH17; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of B7H3, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of PSMA; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of CD3, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of ROR1.

[0148] The invention further provides for an isolated polynucleotide or set of isolated polynucleotides comprising at least one sequence that encodes the antigen binding protein mentioned-above.

[0149] The invention further provides for a vector or set of vectors comprising one or more of the polynucleotides or sets of polynucleotides mentioned-above.

[0150] The invention further provides for an isolated cell comprising a polynucleotide or set of polynucleotides, or a vector or set of vectors mentioned-above.

[0151] According to a specific embodiment, the cell is a yeast cell, a bacterial cell, a hybridoma, a Chinese Hamster Ovary (CHO) cell, or a HEK293 cell.

[0152] The invention further provides for an immunoconjugate comprising the antigen binding protein mentioned-above.

[0153] The invention further provides for a chimeric antigen receptor comprising the antigen binding protein mentioned-above.

[0154] The invention further provides for a pharmaceutical composition comprising the antigen binding protein or the immunoconjugate or the chimeric antigen receptor mentioned-above and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0155] The invention further provides for the use of the antigen binding protein or the immunoconjugate or the chimeric antigen receptor or the pharmaceutical composition mentioned-above for the treatment of a disease or disorder in a subject or in the manufacture of a medicine.

[0156] The invention further provides for a method of treatment of a subject having a disease or disorder comprising administering to the subject the antigen binding protein or the immunoconjugate or the chimeric antigen receptor or a pharmaceutical composition mentioned-above.

[0157] The invention further provides for a method of making the antigen binding protein mentioned-above, comprising: (i) cotransfecting a cell with one or more vectors to express the first CH1 domain, the first CL domain; and the second CH1 domain , and the second CL domain; (ii) culturing the cell line under conditions to express the one or more vectors and that allow the first CHCL and second CHCL to assemble; and (iii) purifying the heterodimeric protein from the cell culture.

[0158] The present invention improves pairing of an antibody heavy and light chain, which supports the correct pairing of HC and LC. Specifically, this invention could avoid the intrinsic problem of CrossMab, which caused heavy chain dimer and light chain dimer derived from its design. Such improved pairing would facilitate the production of bispecific antibodies or multispecific antibodies without implementing additional purification process. The foregoing and other features and advantages of the invention will become more apparent from the following detailed description of several embodiments which proceeds with reference to the accompanying figures.BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0159] Figures 1A-1B. The schematic structure of bispecific antibody. Figure 1A presents the bispecific antibody with novel CH1-CL pairs; Figure 1B presents the bispecific antibody with CrossmabCH1CL.

[0160] Figure 2. CH1-CL domain structure of antibody 37F9. Presents interface strands and other contacting residues between CH1 and CL domains.

[0161] Figure 3. CH1-CL domain structure Set_17 Salt-bridge design, Set_18 KIH design, Set_19 KIH design, Set_21 KIH design and Set_22 Disulfide design.

[0162] Figure 4. The MS profiles of the bispecific antibodies with novel CH1-CL pairs.

[0163] Figure 5. The SDS PAGE profiles of the bispecific antibodies with novel CH1-CL pairs.

[0164] Figure 6. The binding data demonstrating that the CH1-CL variants did not alter target binding of the bispecific antibodies.

[0165] Figure 7. The binding data of the Set18 variants compared to original design of Set18.

[0166] Figure 8. The binding data of the Set19 variants compared to original design of Set19.

[0167] Figure 9. The binding data demonstrating that the CH1-CL mutation in combination did not alter target binding of the bispecific antibodies.

[0168] Figure 10. The binding data of the CH1-CL mutation sets that applied to the Fab arms concurrently.

[0169] Figure 11. The binding data showed that VH-VL mutations could be in combination with the CH1-CL mutation sets (Set18, Set19, Set1819) .

[0170] Figure 12. The schematic structure of CDH17xCD3 bispecific antibody.

[0171] Figure 13. The schematic structure of VH-VL mutations plus CH1-CL mutations.

[0172] Figure 14. The schematic structure of ROR1xCD3 bispecific antibody.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0173] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs.

[0174] It is understood that aspects and embodiments of the disclosure described herein include “comprising, ” “consisting, ” and “consisting essentially of’a spects and embodiments.

[0175] The term “antibody” as used herein encompasses any immunoglobulin, monoclonal antibody, polyclonal antibody, multispecific antibody, or bispecific antibody that binds to a specific antigen. A native intact antibody comprises two heavy chains and two light chains. Each heavy chain consists of a variable region ( “HCVR” ) and a first, second, and third constant region (CH1, CH2 and CH3) , while each light chain consists of a variable region ( “LCVR” ) and a constant region (CL) . Mammalian heavy chains are classified as α, δ, ε, γ, and μ, and mammalian light chains are classified as λ or κ. The antibody has a “Y” shape, with the stem of the Y consisting of the second and third constant regions of two heavy chains bound together via disulphide bonding. Each arm of the Y includes the variable region and first constant region of a single heavy chain bound to the variable and constant regions of a single light chain. The variable regions of the light and heavy chains are responsible for antigen binding. The variable regions in both chains generally contain three highly variable loops called the complementarity determining regions (CDRs) (light (L) chain CDRs including LCDR1, LCDR2, and LCDR3, heavy (H) chain CDRs including HCDR1, HCDR2, HCDR3) . CDR boundaries for antibodies may be defined or identified by the conventions of Kabat, Chothia, or Al-Lazikani. The three CDRs are interposed between flanking stretches known as framework regions (FRs) , which are more highly conserved than the CDRs and form a scaffold to support the hypervariable loops. Each HCVR and LCVR comprises four FRs, and the CDRs and FRs are arranged from amino terminus to carboxy terminus in the order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The constant regions of the heavy and light chains are not involved in antigen binding, but exhibit various effector functions. Antibodies are assigned to classes based on the amino acid sequence of the constant region of their heavy chain. The five major classes or isotypes of antibodies are IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, which are characterized by the presence of α, δ, ε, γ, and μ heavy chains, respectively. Several of the major antibody classes are divided into subclasses such as IgG1 (γ1 heavy chain) , IgG2 (γ2 heavy chain) , IgG3 (γ3 heavy chain) , IgG4 (γ4 heavy chain) , IgA1 (α1 heavy chain) , or IgA2 (α2 heavy chain) .

[0176] The term “variable domain” with respect to an antibody as used herein refers to an antibody variable region or a fragment thereof comprising one or more CDRs. Although a variable domain may comprise an intact variable region (such as HCVR or LCVR) , it is also possible to comprise less than an intact variable region yet still retain the capability of binding to an antigen or forming an antigen-binding site.

[0177] Methods and techniques for identifying CDRs within HCVR and LCVR amino acid sequences are well known in the art and can be used to identify CDRs within the specified HCVR and / or LCVR amino acid sequences disclosed herein. Exemplary conventions that can be used to identify the boundaries of CDRs including, e.g., Chothia based on the three-dimensional structure of antibodies and the topology of the CDR loops (Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883) , Kabat based on antibody sequence variability (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition, US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) ) , AbM (University of Bath) , Contact (University College London) , International ImMunoGeneTics database (IMGT) (imgt. cines. fr / on the World Wide Web) , and North CDR definition based on the affinity propagation clustering using a large number of crystal structures. Those skilled in the art can easily identify the CDRs defined by each numbering system.

[0178] A useful comparison of CDR numbering is as below:

[0179] Note 1: some of these definitions (particularly for Chothia loops) vary depending on the individual publication examined; Note2: any of the numbering schemes can be used for these CDR defintions, except the contact definition uses the Chothia or Martin (enhanced Chothia) definition; Note 3: the end of the Chothia HCDR1 loop when numbered using the Kabat numbering convention varies between H32 and H34 depending on the length of the loop. This is because the Kabat numbering scheme places the insertions at H35A and H35B.

[0180] The term “antigen-binding moiety” as used herein refers to an antibody fragment formed from a portion of an antibody comprising one or more CDRs, or any other antibody fragment that binds to an antigen but does not comprise an intact native antibody structure. Examples of antigen-binding moiety include, without limitation, a variable domain, a variable region, a diabody, a Fab, a Fab′, a F (ab′) 2, an Fv fragment, a disulphide stabilized Fv fragment (dsFv) , a (dsFv) 2, a bispecific dsFv (dsFv-dsFv′) , a disulphide stabilized diabody (ds diabody) , a multispecific antibody, a camelized single domain antibody, a nanobody, a domain antibody, and a bivalent domain antibody. An antigen-binding moiety is capable of binding to the same antigen to which the parent antibody binds. In certain embodiments, an antigen-binding moiety may comprise one or more CDRs from a particular human antibody grafted to a framework region from one or more different human antibodies.

[0181] “Fab” with regard to an antibody refers to that portion of the antibody consisting of a single light chain (both variable and constant regions) associating to the variable region and first constant region of a single heavy chain by a disulphide bond. In certain embodiments, the constant regions of both the light chain and heavy chain are replaced with TCR constant regions.

[0182] “Fab′” refers to a Fab fragment that includes a portion of the hinge region.

[0183] “F (ab′) 2” refers to a dimer of Fab′.

[0184] “Bibody” refers to a fusion protein formed by fusing a scFv to the C-terminus of either the light chain (Fab-L-scFv) or heavy chain (Fab-H-scFv) .

[0185] “Tribody” refers to a fusion protein formed by fusing a scFv to both light chain and heavy chain (Fab- (scFv) 2) .

[0186] “Fc” with regard to an antibody refers to that portion of the antibody consisting of the second (CH2) and third (CH3) constant regions of a first heavy chain bound to the second and third constant regions of a second heavy chain via disulphide bonding. The Fc portion of the antibody is responsible for various effector functions such as ADCC, and CDC, but does not function in antigen binding.

[0187] A “monoclonal antibody” or “mAb” refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical and / or bind the same epitope, except for possible variant antibodies (e.g., containing a naturally occurring mutation (s) and / or substitution (s) or arising during production of a monoclonal antibody preparation) , such variants generally being present in minor amounts. In contrast to polyclonal antibody preparations, which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes) , each monoclonal antibody of a monoclonal antibody preparation is directed against a single determinant on an antigen.

[0188] A “multispecific antibody” , which may also be referred to as “multispecific compound” herein, refers to an antibody comprising at least two different antigen binding domains that recognize and specifically bind to at least two different antigens or at least two different epitopes. In some embodiments, a multispecific antibody contains (1) a first heavy chain and a first light chain, which form a cognate pair and bind to a first antigen, and (2) a second heavy chain and a second light chain, which form a cognate pair and bind to a second antigen.

[0189] A “bispecific antibody” , which may also be referred to as “bispecific compound” herein, is a type of multispecific antibody and refers to an antibody comprising two different antigen binding domains which recognize and specifically bind to at least two different antigens or at least two epitopes. The at least two epitopes may or may not be within the same antigen.

[0190] A “different antigen” may refer to different and / or distinct proteins, polypeptides, or molecules; as well as different and / or distinct epitopes, which epitopes may be contained within one protein, polypeptide, or other molecule. Consequently, a bispecific antibody may bind to two epitopes on the same polypeptide.

[0191] The term “epitope” refers to an antigenic determinant that interacts with a specific antigen binding site in the variable region of an antibody molecule known as a paratope. A single antigen may have more than one epitope. Thus, different antibodies may bind to different areas on an antigen and may have different biological effects.

[0192] The term “preferential pairing” refers to the pairing of a heavy chain (or CH1 domain) with a light chain (or CL domain) in a polypeptide, e.g., antibody, e.g., bispecific antibody. When a heavy chain (H1) is co-expressed with two different light chains (L1 and L2) , H1 will pair with each of L1 and L2 resulting in a mixture of H1: L1 and H1: L2. In some instances, H1 may pair equally well with both L1 and L2 resulting in a mixture of approximately 50: 50 H1: L1 to H1: L2. By way of example, “preferential pairing” would occur between H1 and L1 if the amount of H1:L1 heterodimer formed was greater than the amount of H1: L2 heterodimer formed when H1 is co-expressed with L1 and L2.

[0193] In this example, H1 preferentially pairs with L1 relative to L2. Should H1 have an inherent bias to pair with L1 over L2 (such that the ratio of H1: L1 to H1: L2 is not 50: 50 but, e.g., 60: 40 or 70: 30, in which case formation of H1: L2 is still undesirable) , then preferential pairing between the desired pair, i.e., H1: L1, would occur when there is an improvement (increase) in the amount of pairing between H1: L1 as compared to H1: L2.

[0194] Certain positions within the CH1 domain, identified as part of the CH1-CL interface (for both Cκ and Cλ) , were found to influence binding of the heavy chain to the light chain. Additionally, positions within the CH1 domain at the CH1: VH interface were also shown to influence binding of the heavy chain to the light chain. A heavy chain pairs with a light chain via two sets of domain interfaces: one between the VH and VL domains, and the other between the CH1 and CL domains, and where the chains pair or meet or make contact is referred to as an “interface. ”

[0195] In some embodiments, an interface comprises the CH1 domain of the heavy chain and the CL domain of the light chain. The “interface” is preferably derived from an IgG antibody or a Fab thereof.

[0196] The term “CH1 domain” refers to the first constant domain of the heavy chain of an antibody, C-terminal of the variable domain of the heavy chain and N-terminal of the hinge region. According to IMGT, the CH1 domain is the amino acid sequence from positions 118-215 (EU numbering) and the hinge region is the amino acid sequence from positions 216-230 (EU numbering) . In some embodiments, the “CH1 domain variants” comprising at least CH1 residues 118-215 (according to EU numbering) wherein such fragments include one or more of the modifications disclosed herein, as well as a portion of the hinge region.

[0197] “Knobs-into-holes” as used herein, refers to an interaction between two polypeptides, where one polypeptide has a protuberance (i.e. “knob” ) due to presence of an amino acid residue having a bulky side chain (e.g. tyrosine or tryptophan) , and the other polypeptide has a cavity (i.e. “hole” ) where a small side chain amino acid residue resides (e.g. alanine or threonine) , and the protuberance is positionable in the cavity so as to promote interaction of the two polypeptides to form a heterodimer or a complex. Methods of generating polypeptides with knobs-into-holes are known in the art, e.g., as described in U.S. Pat. No. 5731168.

[0198] In particular embodiments, a heavy chain heterodimerizing technology may be further used (e.g., “knob-in-knob” modifications and / or “S=S” modifications in the CH3 domain) to ensure correct heavy-heavy heterodimerization.

[0199] “CrossmabCH1-CL” refers to a technology to enable correct light-chain association in bispecific antibodies by the CH1_CL domain crossover. Specifically, by incorporating the original light chain VL-CH1 domains in the Fab of the second specificity of the bispecific antibody as the novelālight chain” and the original heavy chain VH-CL domains for the novel “heavy chain” by fusing them to the hinge region of the Fc fragment, correct light-chain association can be enforced in the CrossMabCH1-CL format (refer to WO2009080253A1) . The CrossmabCH1-CL format is shown in figure 1B.

[0200] “Conservative amino acid substitutions” are known in the art, and include amino acid substitutions in which one amino acid having certain physical and / or chemical properties is exchanged for another amino acid that has the same or similar chemical or physical properties. For instance, the conservative amino acid substitution can be an acidic / negatively charged polar amino acid substituted for another acidic / negatively charged polar amino acid (e.g., Asp or Glu) , an amino acid with a nonpolar side chain substituted for another amino acid with a nonpolar side chain (e.g., Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val, etc. ) , a basic / positively charged polar amino acid substituted for another basic / positively charged polar amino acid (e.g. Lys, His, Arg, etc. ) , an uncharged amino acid with a polar side chain substituted for another uncharged amino acid with a polar side chain (e.g., Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc. ) , an amino acid with a β-branched side-chain substituted for another amino acid with a β-branched side-chain (e.g., Ile, Thr, and Val) , an amino acid with an aromatic side-chain substituted for another amino acid with an aromatic side chain (e.g., His, Phe, Trp, and Tyr) , etc.

[0201] “Percent (%) sequence identity” with respect to amino acid sequence (or nucleic acid sequence) is defined as the percentage of amino acid (or nucleic acid) residues in a candidate sequence that are identical to the amino acid (or nucleic acid) residues in a reference sequence, after aligning the sequences and, if necessary, introducing gaps, to achieve the maximum number of identical amino acids (or nucleic acids) . Conservative substitution of the amino acid residues may or may not be considered as identical residues. Alignment for purposes of determining percent amino acid (or nucleic acid) sequence identity can be achieved, for example, using publicly available tools such as BLASTN, BLASTp (available on the website of U.S. National Center for Biotechnology Information (NCBI)

[0202] The term “mutation” or “mutated” with regard to amino acid residue as used herein refers to substitution, insertion, or addition of an amino acid residue.

[0203] As used herein, a “homologue sequence” and “homologous sequence” are used interchangeably and refer to polynucleotide sequences (or its complementary strand) or amino acid sequences that have sequences identity of at least 80% (e.g. at least 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) to another sequences when optionally aligned.

[0204] The term “specific binding” or “specifically binds” as used herein refers to a non-random binding reaction between two molecules, such as for example between an antibody and an antigen. In certain embodiments, the polypeptide complex and the bispecific polypeptide complex provided herein specifically bind an antigen with a binding affinity (KD) of ≤10-6 M (e.g., ≤5×10-7 M, ≤2×10-7 M, ≤10-7 M, ≤5×10-8 M, ≤2×10-8 M, ≤10-8 M, ≤5×10-9 M, ≤2×10-9 M, ≤10-9 M, or ≤10-10 M) . KD as used herein refers to the ratio of the dissociation rate to the association rate (koff / kon) , may be determined using surface plasmon resonance methods for example using instrument such as Biacore.

[0205] Polypeptides, molecule, and / or multi-specific antibodies comprising CH1 and / or CL domains variant described herein may be encoded by a polynucleotide or polynucleotides. Such polynucleotide or polynucleotides may be a DNA or RNA or a combination thereof.

[0206] Any of the polypeptide (s) described herein may be present in a vector.

[0207] Any of the CH1 domain (s) variant, CL domain (s) variant, CH1-CL set (s) , polypeptide (s) , molecule (s) , multi-specific antibody (ies) , polynucleotide (s) , and / or vector (s) may be present in a cell, e.g., a eukaryotic cell. In some embodiments, such polypeptides may be expressed in mammalian cells, such as HEK923 cells or Chinese hamster ovary (CHO) cells.

[0208] Any of the CH1 domain (s) variant, CL domain (s) variant, CH1-CL set (s) , polypeptide (s) , molecule (s) , multi-specific antibody (ies) , polynucleotide (s) , vector (s) , and / or cells may be present in a composition. If the composition is a therapeutic composition, the composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.

[0209] The polypeptide (s) , molecule (s) , and the bispecific antibody (ies) provided herein prepared from the cells can be purified using, for example, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, DEAE-cellulose ion exchange chromatography, ammonium sulfate precipitation, salting out, and affinity chromatography, with affinity chromatography being the preferred purification technique.

[0210] In certain embodiments, the polypeptide (s) , molecule (s) , and the bispecific antibody (ies) provided herein can be readily purified with high yields using conventional methods. One of the advantages of the bispecific polypeptide complex is the significantly reduced mispairing between heavy chain and light chain variable domain sequences. This reduces production of unwanted byproducts and make it possible to obtain high purity product in high yields using relatively simple purification processes.

[0211] In certain embodiments, the polypeptide (s) , molecule (s) , and the bispecific antibody (ies) can be used as the base of conjugation with desired conjugates.

[0212] It is contemplated that a variety of conjugates may be linked to the polypeptide (s) , molecule (s) , and the bispecific antibody (ies) provided herein, for example, “Antibody-Drug Conjuate (ADC) ” . The drugs may be linked to the polypeptide (s) , molecule (s) , and the bispecific antibody (ies) by covalent binding, affinity binding, intercalation, coordinate binding, complexation, association, blending, or addition, among other methods.

[0213] The term “Pharmaceutical composition” , as used herein, is intended to refer to a mixture containing one or more of the compounds or a physiological / pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof described herein with other chemical components, such as physiological  / pharmaceutically acceptable carriers and excipients. The purpose of the pharmaceutical composition is to promote the administration to the organism, which is beneficial to the absorption of the active ingredient and exerts the biological activity.

[0214] “Administration” and “treatment” , when applied to an animal, human, experimental subject, cell, tissue, organ, or biological fluid, refer to contact with an exogenous pharmaceutical, therapeutic, diagnostic reagent, or composition with the animal, human, subject, cell, tissue, organ, or biological fluid. “Administration” and “treatment” can refer, e.g., to therapeutic, pharmacokinetic, diagnostic, research, and experimental methods. Treatment of a cell encompasses contacting the cell with a reagent, as well as contacting a fluid with a reagent, wherein the fluid is in contact with the cell. "Administration" and "treatment" also mean in vitro and ex vivo treatments, e.g., of a cell, by a reagent, diagnostic, binding composition or by another cell. "Treatment, " when applied to a human, veterinary, or research subject, refers to therapeutic treatment, prophylactic or preventative measures, research and diagnostic applications.

[0215] “Therapeutically effective amount” refers to an amount effective, at doses and for periods of time necessary, to achieve a desired therapeutic result. A therapeutically effective amount may vary depending on factors such as the disease state, age, sex, and weight of the individual, and the ability of a therapeutic or a combination of therapeutics to elicit a desired response in the individual. Exemplary indicators of an effective therapeutic or combination of therapeutics that include, for example, improved well-being of the patient.

[0216] The antibody or antigen binding fragment using the CH1-CL sets described in the present invention, which can be any pre-existing format, all fall within the scope of the present invention. The following examples are provided to better illustrate the claimed invention and are not to be interpreted as limiting the scope of the invention. All specific compositions, materials, and methods described below, in whole or in part, fall within the scope of the present invention. These specific compositions, materials, and methods are not intended to limit the invention, but merely to illustrate specific embodiments falling within the scope of the invention.

[0217] One skilled in the art may develop equivalent compositions, materials, and methods without the exercise of inventive capacity and without departing from the scope of the invention. It will be understood that many variations can be made in the procedures herein described while still remaining within the bounds of the present invention. It is the intention of the inventors that such variations are included within the scope of the invention.

[0218] EXAMPLE

[0219] The invention is further illustrated by the following specific examples. It is to be understood that these examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention. The experimental methods without detailed conditions in the following examples are generally in accordance with the conditions described in the conventional conditions such as Sambrook. J et al. "Guide to Molecular Cloning Laboratory" (translated by Huang Peitang et al., Beijing: Science Press, 2002) , or in accordance with the conditions recommended by the manufacturer (for example, product manuals) . Percentages and parts are by weight unless otherwise stated. The experimental materials and reagents used in the following examples are commercially available unless otherwise specified.

[0220] The room temperature described in the examples is a conventional room temperature in the art, and is generally 10-30℃.

[0221] EXAMPLE 1 Identifying Residues and Testing Mutations for Bispecific Antibody Platform Engineering

[0222] The binding affinity between a protein and another molecule can often be changed by modifying the atoms in closest spatial proximity in the bound state. In native antibodies, a CH1 and CL domains pair with each other and the degree of pairing can be significantly influenced by atoms / residues at their interface. Changes to the atoms involved in these binding pairs may lead to either increased or decreased binding. The specific atoms involved can be determined by methods such as X-ray crystallography and Cryo-EM.

[0223] Here we design some novel CH1-CL sets. A structure-guided antibody engineering approach was utilized to generate these novel sets. A multispecific antibody can use one or more combinations of such novel CH1-CL set to ensure correct pairing between each heavy chain and each light chain. High resolution crystal structures of antibodies 37F9, a Hansohbio kappa mAb, and anti-ZIKV-DENV neutralizing antibody MZ1 (PDB code: 6MTX) , a Lambda mAb, were used to engineer CH1 and CL substitutions for preferred pairing. The interface between CH1 and CL domains was analyzed using PISA program in CCP4 suite (J. Agirre et al. Acta. Cryst. D79, 449-461 (2023) ) , COOT (Emsley P, Cowtan K (2004) . Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D60, 2126-2132. ) , and PYMOL software ( L. &DeLano, W., 2020. PyMOL, Available at: http:  / / www. pymol. org / pymol) .

[0224] The CH1 / CL interface in kappa mAb involves about 34 residues in each chain, burying a total surface area of 1065 About 20 residues on each domain are located on four anti-parallel beta strands at the interface of the two domains, and 1-3 contacting residues are contributed by the last strand which leads to the Fc region. Mutations were largely targeted to residues located on these central eight strands, except for charge-pair mutations that also included residues from other regions on CH1 and CL. New structure models with engineered residues were either generated using AlphaFold or COOT. Three different strategies Knob-in-Hole (KIH) , Disulfide covalent bond (DS-designs) , and charge pair were adopted to facilitate the preferred CH1 / CL pairing.

[0225] All the engineered constructs were further downsized based upon the total interaction energy changes. The lowest value of the interaction energy between a pair of residues (minimum) indicates the strongest pairwise interaction and vice versa. Several of our mutated residues exhibited much lower (high negative) interaction energies compared to the wild type sequences, indicating stable and preferred pairing between CH1 and CL chains.

[0226] Five designs thus selected were subjected to experimental characterization, the engineered construct is shown in figure 1A. See Figure 3, according to Kabat numbering, Set_18 has L124A and V190W in CH1, and F118V in CL. Set_19 has A139F and T192A in CH1, and F116V in CL. Set_21 has F174A in CH1, and S176F in CL. Set_22 has F122C and F174C in CH1, and Q124C and S176C in CL. Set_17 has K145D and K221E in CH1, and E123K and S131K in CL. The amino acid sequences are shown in Table 1.

[0227] Table 1. The sequence of novel CH1 and CL sets for experimental production

[0228] Effects on the regulation of the CH1-CL sets of the found amino acids were confirmed using the method described below. Screening was carried out using an anti-EGFRxHER3 BsAb with the “Fab-Fc” format (See FIG. 1) . The full-length sequences are shown in Table 3. The novel CH1 and CL sequences are underlined.

[0229] The VH and VL sequences related to the anti-HER3 antibody 18E11 and P2H4 are described in PCT / CN2023 / 127107 and PCT / CN2023 / 087967 respectively, which are incorporated herein by reference in its entirety. The sequence of 2F8 are derived from WO2002 / 100348. One Fc region comprises a S354C mutation and a T366W mutation in Eu numbering, another Fc region comprises a Y349C mutation, a T366S mutation, a L368A mutation and a Y407V mutation in Eu numbering.

[0230] The novel CH1-CL sets were initially constructed in the anti-EGFR arm with the wild-type of CH1-CL set were contructed in anti-HER3 arm. Later we also tested the novel CH1-CL sets in anti-HER3 arm with the wild-type of CH1-CL set in the anti-EGFR arm. Also, the CH1-CL CrossMab in either EGFR or HER3 arm is the positive control.

[0231] Table 2. Sequences of heavy chain and light chain variable domains of tested BsAb

[0232] Table 3. Full-length sequences of tested BsAb

[0233] Production of the recombinant antibodies

[0234] First, the heavy chain expression plasmid and light chain plasmids were co-transfected into Expi293F cells (ThermoFisher, #A14527) using ExpiFectamine 293 Transfection Kit (ThermoFisher, A14524) , or into ExpiCHO-Scells (ThermoFisher #A29127) using ExpiFectamine CHO Transfection Kit (ThermoFisher, A29129) . Based on the manufacturer’s instructions, plasmid DNA concentration reached 1.0 ug per ml of suspended cells, with LC1: HC1: LC2: HC2 vector ratio 1.5: 1: 1.5: 1. The transfected cells were cultured 5 to 7 or 14 days on an orbital shaker at 37 C, 8%CO2. Conditioned medium was collected, and antibodies were purified using HiTrap MabSelect SuRe column (Cytiva, #17549112) on AKTA Pure 25 machine (Cytiva) . After loading, continue to flush the column with equilibrium buffer until the UV value of the effluent no longer decreases. Samples were eluted using elution buffer (20mM glycine-HCl, pH 2.7) and the flow-through was collected. Eluted antibodies were neutralized with Tris Buffer (pH 9.0) and subjected to PBS buffer exchange. Product concentration was measured by UV absorption, and quality was determined by SDS-PAGE and HPLC.

[0235] Reducing and Non-reducing Coomassie Gel

[0236] Antibodies were analyzed by SDS-PAGE in the presence and absence of a reducing agent (5 mM 1, 4-dithiotreitol) . The  Pre-Cast gel system (Invitrogen / ThermoFisher SCIENTIFIC, USA) was used according to the manufacturer’s instruction (4-12%Tris-Glycine gels) , and subsequently stained with Coomassie protein stain followed by destaining until the background was clear. The protein bands were visualized by Bio-Rad Imaging System.

[0237] Native Mass Spectrometry

[0238] Bispecific antibodies (BsAbs) were deglycosylated using Rapid PNGase F enzyme (NEW ENGLAND BioLabs) by incubating at 50℃ for 10 min prior to intact mass analysis. Intact mass spectral data of deglycosylated BsAbs were acquired using a time-of-flight Mass Spectrometer coupled to an HPLC system (Agilent LC / MS 6230) . Buffer A is 0.1%formic acid in water and buffer B is acetonitrile. Approximately 2 μg of BsAbs were loaded to a PLRP-SC-18 Column (Agilent) with temperature maintained at 75℃ and flow rate at 0.5 mL / min. LC separation was carried out using gradient varying from 20%buffer B to 90%buffer B. The MS ion source uses dual AJS EsI system with gas temp at 350℃, sheath gas temp at 400℃, and nozzle voltage at 2kV. TOF parameters were set with fragmentor at 380V, Skimmer at 140V and RF Vpp at 750V. The data acquisition parameters were set as follows: scan range m / z 100-3200, positive mode, acquisition time 1000 ms / spectrum. Agilent Mass Hunter BioConfirm Software 10.0 (Agilent) was used to deconvolute intact mass spectrum and calculate the mass peaks.

[0239] Cell-based Binding Assay

[0240] Binding of the bispecific antibodies to the cell surface targets (EGFR and HER3) was determined by flow cytometry analysis using various cell lines. Briefly, 50 μL of cells in cell staining buffer (2×106 cells / mL) was mixed with 50 μL of antibodies (with different concentration using serial dilution) . The mixture was incubated on ice for 40 min and then washed with ice cold staining buffer twice. The cells were subsequently stained with 50 μL of PE labelled secondary antibody (1: 400 dilution, BioLegend, Cat#405307) or Alexa Fluor 488 (1: 500 dilution, Jackson Lab, Cat#AB2337831) for 20 min. After washing by staining buffer and fixing by 4%PFA, cells were analyzed by flow cytometry. A purified anti-human HER3 antibody, anti-human EGFR, and anti-EGFRxHER3 bispecific were used as positive controls. A purified human IgG1 antibody (b12 or MOTA) was used as isotype control.

[0241] Protein thermal stability test by Differential Scanning Fluorimetry (DSF) method

[0242] The antibody Tm data were acquired by Protein Thermal ShiftTM Dye Kit (ThermoFisher, Cat#4461146) . Briefly, samples were added into 384-well plate, with 4μg each well in Protein Thermal Shift Buffer and subsequently added Protein Thermal Shift Dye into protein mixture, pipet up and down 10 times to mix well. Each sample has triplication to get consistent Tm readout. And centrifuge at 1000rpm for 1 min before using qPCR instrument to read fluorescence signals. The samples were heated from 25-99 degree C and then calculated Tm value of each sample.

[0243] Based on biophysical analysis from SDS-PAGE and LC-MS results, All the BsAbs with novel CH1-CL sets_18, 19, 21 and 22 are regulated more effective than the crossmab format as found in Table 4 and Figures 4-5, which were thought to have considerable effects in regulating the CH1 / CL interface. Also the novel CH1-CL constructed BsAbs demonstrated functional binding on different cell lines in flow cytometry analysis, see Figure 6.

[0244] Table 4. Process yields and purity of bsAb production products

[0245] We further screened the types of amino acid mutations in Set_18, the types of amino acid mutations are shown in Table 5. We provide an illustrative list of the full-length sequences of a tested antibody with CH1-CL underlined in Table 6, and other novel CH1-CL set_18 variants constructed using it as a reference.

[0246] The binding results are shown in Figure 7, and the expression results shown in Table 7. The design was applied to HER3 arm to demonstrate the novel CH1-CL sets could be widely applied. Overall, all the novel CH1-CL set_18 variants are better than CrossMab in terms of purity and cell-binding, except V06. Additionally, V05 show similar quality to CrossMAb based on expression purity, Tm, and binding.

[0247] Table 5. The sequence of Set_18 variants

[0248] Table 6. An example of a full-length sequence of tested BsAb with Set_18 variants

[0249] Table 7. Process yields and purity of bsAb production products

[0250] We further screened the types of amino acid mutations in Set_19, the types of amino acid mutations are shown in Table 8. We provide an illustrative list of the full-length sequences of a tested antibody with CH1-CL underlined in Table 9, and other novel CH1-CL set_19 variants constructed using it as a reference.

[0251] The binding results are shown below in Figure 8, and the expression results shown in Table 10. The design was applied to EGFR arm. Overall, all the novel CH1-CL set_19 variants improve the mispairing.

[0252] Table 8. The sequence of Set_19 variants

[0253] Table 9. An example of a full-length sequence of tested BsAb with Set_19 variants

[0254] Table 10. Process yields and purity of bsAb production products

[0255] Several combinations of CH1-CL sets as described in Table 1 were also tested to find more effective ways to efficiently produce functional and stable bispecific antibodies. The combinations of modifications in the prepared antibodies, and the expressed antibodies are summarized in Table 11 which are tested in HER3 arm, the sequences of CH1-CL sets are summarized in Table 12. The combination designs also improve the purity and expression levels. Other combinations of CH1-CL sets tested in both EGFR arm and HER3 arm are summarized in Table 13.

[0256] The binding results are shown below in Figure 9, 10, and the expression results shown in Table 14, 15.

[0257] Table 11. Specificity and CH1-CL sets combinations in BsAb

[0258] Table 12. The sequence of CH1-CL sets combinations

[0259] Table 13. CH1-CL sets combinations in BsAb

[0260] Note: the CH1-CL sets in Fab1 and the CH1-CL sets in Fab2 can be exchanged. Take EGFR×HER3 BsAb for example, when Fab1 is EGFR arm, the Fab2 is HER3 arm; when Fab1 is HER3 arm, the Fab2 is EGFR arm.

[0261] Table 14. Process yields and purity of bsAb production products

[0262] Table 15. Process yields and purity of bsAb production products

[0263] Note: Set_18, Set_19, Set_1819 applied to EGFR arm; Set 17, Set 21 applied to HER3 In summary, these novel CH1-CL set mutations in Table 1, 5, 8 and 11 could result better yield and purity, and potentially lower the risk in applying to wider antibody sequences because the minimal changes compared to CrossMab.

[0264] These novel CH1-CL set mutations also can be combined with other pre-existing VH-VL sets. Exemplary pre-existing VH-VL pairing technologies are listed in Table 16. Combinations of CH1-CL sets with EKKE mutation tested in both EGFR arm and HER3 arm are summarized in Table 17.

[0265] The binding results are shown below in Figure 11, and the expression results shown in Table 18.

[0266] Table 16: Exemplary pre-existing VH-VL pairing technologies

[0267] Table 17: Combinations of CH1-CL sets with EKKE mutation in BsAb

[0268] Table 18. Process yields, purity and correct pairing of bsAb production products

[0269] Comparison with O-Fab designs

[0270] In WO2016172485 disclosed by ROCHE, Orthogonal Fab (O-Fab) designs have similar mutations disclosed but limited to the following (referring to EU numbering) :

[0271] ·CH1: L128F

[0272] ·CH1: V185A (or L)

[0273] ·CL: F118V (or K / R)

[0274] ·CL: L135V (or F, Y)

[0275] The above mutations can be numbered by Kabat numbering as follows:

[0276] ·CH1: L124F

[0277] ·CH1: V190A (or L)

[0278] ·CL: F118V (or K / R)

[0279] ·CL: L135V (or F, Y)

[0280] We consider the charged mutations will disrupte the stabilized force of the structures and F similar to Y, therefore we tested CH1: L128F and CH1: V185A (or L) with CL: F118V and CL: L135V (F or Y) as the comparison to the novel CH1-CL set mutations of Set_18.

[0281] Table 19. An example of a full-length sequence of tested samples

[0282] Table 20. Process yields, purity and LC mispairing of bsAb production products

[0283] The results shown in Table 20, O-Fab designs showed less yield than the novel CH1-CL set mutations of Set_18, O-Fab show similar purity to Set_18 in the present invention, but showed different mispairing pattern to Set_18, O-Fab designs showed more wild type LC mispairing, which indicates O-Fab designs did not form the preferred pairing as the Set_18 does.EXAMPLE 2 Effects of Modifying Regulation of the CH1 / CL Interface in IgG2 IgG4 subtype and in Lambda Chain CL

[0284] For CrossMabCH1_CL version the elbow region differs from the natural amino acid sequence (Schaefer et al., 2011; Klein et al., 2012) . Consequently, it is required to design the new elbow region as its length differs on the light and heavy side of the originating Fab, and alterations in these elbow region sequences may sometimes impact stability and the light chain pairing selectivity (Joerg Thomas Regula et al., Protein Eng Des Sel. 2018 Aug 28; 31 (7-8) : 289–299) . Because these novel designs in the present invention only apply the minimal changes to the bispecific antibodies, it is more feasible to be widely applied to other IgG subtype antibodies which CrossMab could not be applied to. We demonstrated our designs could be applied to IgG2 and IgG4 subtype as well. Additionally, we adjust the design to fit in the pairing with lambda chain too. Preparation of expression vectors of the H chain or L chain introduced with mutations, and antibody expression were carried out in accordance with reference Example 1.

[0285] The CH1 / CL sequence in IgG2, IgG4 subtype and in kappa chain CL are shown in Tables 21. The CH1 / CL sequence in IgG2, IgG4 subtype and in lambda chain CL are shown in Table 24. We provide an illustrative list of the full-length sequences of the tested antibody with CH1-CL underlined in Table 22 and Table 25, and other novel CH1-CL set in IgG1, IgG2, IgG4 subtype and in lambda chain CL constructed using it as a reference.

[0286] Table 21. Specificity and CH1-CL sets in IgG2 and IgG4 subtype

[0287] Table 22. An example of a full-length sequence of tested samples

[0288] Table 23. Process yields and purity of bsAb production products

[0289] Table 24. Specificity and CH1-CL sets in IgG1 IgG2 and IgG4 with Lambda

[0290] Table 25. An example of a full-length sequence of tested samples

[0291] Table 26. Process yields and purity of bsAb production products

[0292] Table 27. Process yields and purity of bsAb production products

[0293] The results are shown in table 23, 26-27, in summary, these novel CH1-CL set mutations in IgG1, IgG2, IgG4 subtype and in lambda chain CL or kappa chain CL could result better yield and purity. In addition, these novel CH1-CL set mutations are more feasible to be widely applied to other IgG subtype (IgG2 or IgG4) antibodies which CrossMab could not be applied to.

[0294] EXAMPLE 3 Effects of Modifying Regulation of the CH1 / CL Interface Using Different Antibodies

[0295] We applied our designs into other bispecific antibody for the potential wider application of our invention, other than using EGFRxHER3 as proof of concept experiments. Preparation of expression vectors of the H chain or L chain introduced with mutations, and antibody expression were carried out in accordance with Reference Example 1.

[0296] CDH17×CD3 BsAb in IgG1 kappa designs

[0297] A schematic representation of the constructs is given in FIG. 12. As show in Figure. 12, the "Fab-Fc" BsAb has an anti-CDH17 Fab, anti-CD3 Fab and two Fc domain in which the novel engineered CH1-CL pair could be applied to CDH17 arm. CrossMab format developed by Roche was also applied to the anti-CDH17 / CD3 bispecific antibodies of the present disclosure for comparison, the domains of CH1 and CL regions in CDH17 arm were substantially swapped.

[0298] We constructed antibodies BsAb201, 202, and 203 using Set_18, Set_21 and Set_22. The Set_18, Set_21 and Set_22 sequences are shown in Table 1. We provide an illustrative list of the full-length sequences of BsAb201with CH1-CL underlined in Table 28, the other tested antibody BsAb202 and BsAb 203 are constructed using it as a reference.

[0299] Table 28. VH / VL sequences of anti-CDH17 arm and anti-CD3 arm, and an example of the full-length sequence of tested samples

[0300] Table 29. Process yields and purity of bsAb production products

[0301] The result are shown in Table 29. Our designs show better yield and similar SEC purity with marginal improvement. The purity of BsAb202 with Set_21 is the best, at 97.56%. The yield of BsAb 201 is the best, at 5.38mg (30mL) , which is three times higher than the crossmab control. Currently, there is no significant difference in terms of function.

[0302] B7H3 x PSMA BsAb in IgG1 kappa design

[0303] We also examined our designs in other targets to form bispecific antibodies, and we utilized publicly available sequences for PSMA (ARX517, US20240350835A1) , STEAP1 (Vandortuzumab, WO2008052187) and B7H3 (DS7300 or Ifinatamab, WO2012147713A1) . In addition, previous studies showed that mutations at the VH / VL interface can facilitate and improve the efficiency of BsIgG assembly, which is independent of the constant domain interface (MAbs. 2017 Feb / Mar; 9 (2) : 213-230, Protein Eng Des Sel. 2010 Aug; 23 (8) : 667-77) . Therefore, we included the charge-pair EK / KE designs in VH-VL interface (VH: Q39, VL: Q38) to further increase the correct assembly of our bispecific antibodies.

[0304] A schematic representation of the constructs is given in FIG. 13. As shown in Figure. 13, the "Fab-Fc" BsAb has an anti-B7H3 Fab, anti-PSMA Fab and two Fc domain in which the novel engineered CH1-CL pair could be applied to PSMA arm and / or B7H3 arm.

[0305] These novel CH1-CL set mutations also can be combined with VH-VL sets shown in Table 16.Combinations of CH1-CL sets with EK / KE mutation in BsAb are shown in Table 30

[0306] Table 30: Combinations of CH1-CL sets with EKKE mutation in BsAb

[0307] We constructed antibodies BsAb 204, BsAb 205, BsAb 206 using Set_18, Set_19, Set_1819, BsAb 207, BsAb 208, BsAb 209 using Set_18, Set_19, Set_1819 combined with VH-VL sets EKKE. We provide the examplary full-length sequences of BsAb206, BsAb 209 with CH1-CL underlined in Table 31. The other tested antibody BsAb204 and BsAb 205 are constructed using BsAb 206 as a reference, BsAb 207 and BsAb 208 are constructed using BsAb 209 as a reference.

[0308] Table 31. the VH / VL and full-length sequence of tested samples

[0309] The result are shown in Table 32 and 33. Our designs show good yield and improvement of correct pairing level. The correct pairing level of BsAb209 with Set_1819 is at 98.27%. The purity of BsAb209 is 94%and 93%respectively. The yield of BsAb 209 is at 5.6mg (30mL) .

[0310] Table 32. Correct pairing result of bsAb production products

[0311] Table 33. Process yields and purity of bsAb production products

[0312] ROR1×CD3 BsAb in IgG1 kappa designs

[0313] A schematic representation of the constructs is given in FIG. 14. As shown in Figure. 14, the "Fab-Fc" BsAb has an anti-ROR1 Fab, anti-CD3 Fab and two Fc domain in which the novel engineered CH1-CL pair could be applied to ROR1 arm.

[0314] We constructed antibodies BsAb210, 211, and 212 using Set_18, Set_19 and Set_1819. We provide an illustrative list of the full-length sequences of BsAb210 with CH1-CL underlined in Table 34, the other tested antibody BsAb211 and BsAb 212 are constructed using it as a reference. Our designs show good yield and improvement of correct pairing level.

[0315] Table 34. the VH / VL and full-length sequence of tested samples

Claims

1.An antigen binding protein, comprising: (i) a first CH1 domain (CH1) and a first CL domain (CL) ; (ii) a second CH1 domain (CH1) and a second CL domain (CL) ;wherein the first CH1 preferentially pairs with the first CL as compared to the second CL,wherein the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at one or more of the following positions: 124, 190, 139, 192, 174, 122, 145, 221, 123 and 134 according to Kabat numbering; the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at one or more of the following positions: 118, 116, 176, 124, 123, 131, 121 and 135 according to Kabat numbering;wherein the amino acid sequences of the first CH1 and the second CH1 are different, and the amino acid sequences in the first CL and the second CL are different;optionally wherein the first CH1 or the second CH1 is a variant of a CH1 domain of a human IgG, further optionally a human IgGl, human IgG2, or human IgG4;optionally wherein the first CL or the second CL is a variant of a CL domain of human kappa light chain or lambda light chain;Preferably,the first CH1 domain or the second CH1 domain comprises one or more of the following amino acid substitutions:a) position 124 is substituted with A, G, V, S, R, K, E, D, H, N, Q, T, C, P, Y, W or F; preferably, position 124 is substituted with A, G, V or S; more preferably, position 124 is substituted with A, S or G;b) position 190 is substituted with W, F, M, Y, H, A, L, V, M, P, I, D, E, R or K; preferably, position 190 is substituted with W, F, M, Y, H or A; more preferably, position 190 is substituted with W, F, M, Y or A;c) position 139 is substituted with F, W, Y, L or G;d) position 192 is substituted with A;e) position 174 is substituted with A or C;f) position 122 is substituted with C;g) position 145 is substituted with D;h) position 221 is substituted with E;i) position 123 is substituted with A;j) position 134 is substituted with G;and the first CL or the second CL domain comprises one or more of the following amino acid substitutions:a) position 118 is substituted with V, L, A, G, H, T, I, P, R, K, D, E, S, C, N, Y or W; preferably, position 118 is substituted with V, L, A, G, H, T, I or P; more preferably, position 118 is substituted with V or A;b) position 116 is substituted with V or A;c) position 176 is substituted with F or C;d) position 124 is substituted with C;e) position 123 is substituted with K;f) position 131 is substituted with K;g) position 121 is substituted with C;h) position 135 is substituted with V or A.2.The antigen binding protein of claim 1, wherein:the one or more amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 comprise or consist of an amino acid substitution (s) at:a) position (s) 124 and 190; orb) position (s) 139 and 192; orc) position 174; ord) position (s) 122 and 174; ore) position (s) 145 and 221; orf) position (s) 174 and 190; org) position (s) 122, 123 and 174;h) position (s) 124, 139 and 190; ori) position (s) 139, 192 and 134;the one or more amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL comprise or consist of an amino acid substitution (s) at:a) position 118; orb) position 116; orc) position 176; ord) position (s) 124 and 176; ore) position (s) 123 and 131; orf) position (s) 121 and 176; org) position (s) 118 and 135;preferably,(a) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at any one of the positions 124, 139 and 190 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at any one of the positions 118 and 135 according to Kabat numbering;(b) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at any one of the positions 139, 192 and 134 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the position 116 according to Kabat numbering;(c) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the position 174 or 190 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the position 176 according to Kabat numbering;(d) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at any one of the positions 122, 123 and 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at any one of the positions 121, 124 and 176 according to Kabat numbering or(e) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at any one of the positions 145 and 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at any one of the positions 123 and 131 according to Kabat numbering;more preferably,(a) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124 and 190 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the position 118 according to Kabat numbering;(b) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 139 and 192 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the position 116 according to Kabat numbering;(c) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the position 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the position 176 according to Kabat numbering;(d) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 122 and 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 124 and 176 according to Kabat numbering or(e) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 145 and 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 123 and 131 according to Kabat numbering.3.The antigen binding protein of any one of claims 1-2, wherein:the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of:a) 124A / S / G, and 190W / F / M / Y / H / A; orb) 139F / W / Y / L, and 192A; orc) 174A; ord) 122C, and 174C / A; ore) 145D, and 221E; orf) 174A, and 190A; org) 122C, 123A, and 174C; orh) 124A / G, 139G, and 190W; ori) 139W, 192A and 134G;and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of:a) 118V / L / A / G / H / T / I / P; orb) 116V / A; orc) 176F; ord) 124C, and 176C; ore) 123K, and 131K; orf) 121C, and 176C; org) 118V, and 135V; orh) 118A, and 135A;preferably,(a) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 124A / S / G, and 190W / F / M / Y / H / A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 118V / L / A / G / H / T / I / P;b) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 139F / W / Y / L, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 116V / A;c) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 122C, and 174C / A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 124C, and 176C;d) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 124 A / G, 139G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 118V / Aand 135V / A;more preferably,a) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V;b) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116V;c) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 176F;d) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;e) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 123K, and 131K;f) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 174A, and 190A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 176F;g) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, 123A, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;h) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, 123A, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 121C, and 176C;i) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 135V;j) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 135V;k) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124G, and 190F; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 135V;l) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124G, 139G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 135V;m) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118A, and 135A;n) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124G, 139G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118A, and 135A;o) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 139G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V;p) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139W, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116V;q) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139W, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL or the second CL domain comprise or consist of: 116A;r) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139W, 192A and 134G; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116V;s) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139W, 192A and 134G; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116A;t) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139Y, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116V;u) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139L, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116V;v) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 116A;w) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190F; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V;x) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190M; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V;y) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190Y; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V;z) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190H; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V;aa) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124G, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V;bb) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124S, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118V;cc) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118L;dd) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118A;ee) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118G;ff) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118H;gg) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118T;hh) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118I;ii) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of: 118P.4.The antigen binding protein of claim 1 or 2, wherein:the one or more amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 comprise or consist of an amino acid substitution (s) at:a) position (s) 124, 190, 139 and 192; orb) position (s) 124, 190 and 122; orc) position (s) 139, 192 and 174; ord) position (s) 139, 192, 122 and 174; ore) position (s) 124, 190, 139, 192 and 122; orf) position (s) 124, 190, 145, 221; org) position (s) 174, 145, 221; orh) position (s) 122, 174, 145, 221; ori) position (s) 139, 192, 145 and 221; orj) position (s) 124, 190, 139, 192, 145, 221; ork) position (s) 124, 190, 145, 221, 122; orl) position (s) 139, 192, 145, 221, 174; orm) position (s) 139, 192, 145, 221, 122, 174; the one or more amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL comprise or consist of an amino acid substitution (s) at:a) position (s) 116 and 118; orb) position (s) 118 and 124; orc) position (s) 116 and 176; ord) position (s) 116, 124 and 176; ore) position (s) 116, 118 and 124; orf) position (s) 118, 131, 123; org) position (s) 176, 131, 123; orh) position (s) 124, 176, 131, 123; ori) position (s) 116, 131, 123; orj) position (s) 118, 116, 131, 123; ork) position (s) 118, 131, 123, 124; orl) position (s) 116, 131, 123, 176; orm) position (s) 116, 131, 123, 124, 176;preferably,(a) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124, 190, 139 and 192 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116 and 118 according to Kabat numbering;(b) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124, 190 and 122 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 118 and 124 according to Kabat numbering;(c) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 139, 192 and 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116 and 176 according to Kabat numbering;(d) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 139, 192, 122 and 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116, 124 and 176 according to Kabat numbering;(e) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124, 190, 139, 192 and 122 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116, 118 and 124 according to Kabat numbering; or(f) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124, 190, 145, 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 118, 131, 123 according to Kabat numbering;(g) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 174, 145, 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 176, 131, 123 according to Kabat numbering;(h) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 122, 174, 145, 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 124, 176, 131, 123 according to Kabat numbering;(i) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 139, 192, 145 and 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116, 131, 123 according to Kabat numbering or(j) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124, 190, 139, 192, 145, 221 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 118, 116, 131, 123 according to Kabat numbering;(k) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 124, 190, 145, 221, 122 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 118, 131, 123, 124 according to Kabat numbering;(l) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 139, 192, 145, 221, 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116, 131, 123, 176 according to Kabat numbering;(m) the first CH1 or the second CH1 comprises an amino acid substitution at the positions 139, 192, 145, 221, 122, 174 according to Kabat numbering; and the first CL or the second CL comprises an amino acid substitution at the positions 116, 131, 123, 124, 176 according to Kabat numbering;more preferably,the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of:a) 124A, 190W, 139F, and 192A; orb) 124A, 190W, and 122C; orc) 139F, 192A, and 174A; ord) 139F, 192A, 122C, and 174C; ore) 122C, and 174A; orf) 124A, 190W, 139F, 192A, and 122C; org) 139F, 192A, 122C, and 174A;and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of:a) 116V, and 118V; orb) 118V, and 124C; orc) 116V, and 176F; ord) 116V, 124C, and 176C; ore) 124C, and 176F; orf) 116V, 118V, and 124C; org) 116V, 124C, and 176F;more preferably,(a) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 124A, 190W, 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 116V, and 118V;b) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 124A, 190W, and 122C; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 118V and 124C;c) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 139F, 192A, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 116V, and 176F;d) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 139F, 192A, 122C, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 116V, 124C, and 176C;e) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 124C, and 176F;f) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 124A, 190W, 139F, 192A, and 122C; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 116V, 118V, and 124C;g) the amino acid substitution (s) of the first CH1 or the second CH1 domain comprise or consist of 139F, 192A, 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL or the second CL domain comprise or consist of 116V, 124C, and 176F.5.The antigen binding protein of any one of claims 1-4, wherein:the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 20-50, 71, 72-74, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 51-70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88;preferably,the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 26, 29, 31, 32, 33, 35-47, 50, 71, 72-74, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59-70, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88;more preferably,a) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52;b) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53;c) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54;d) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 24; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55;e) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 26; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52;f) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 29; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54;g) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 31; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55;h) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 32; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55;i) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 33; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 57;j) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 35; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52;k) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 36; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53;l) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 37; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54;m) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 38; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55;n) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 39; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 60;o) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 40; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 60;p) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 41; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 60;q) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 42; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 60;r) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 39; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 61;s) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 42; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 61;t) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 62;u) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 24; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 63;v) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 26; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 59;w) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 43; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 59;x) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 35; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 59;y) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 44; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 59;z) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 29; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 62;aa) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 37; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 62;bb) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 31; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 63;cc) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 38; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 63;dd) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 45; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52;ff) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 46; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52;gg) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 47; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52;hh) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 50; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52;ii) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 64, 65, 66, 67, 68, 69 or 70;jj) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 71; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53;kk) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 71; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 56;ll) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 72; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53;mm) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 72; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 56;nn) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 73; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53;oo) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 74; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53;pp) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76;qq) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 77; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 78;rr) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 79; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 80;ss) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 81; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 82;tt) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 83; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 84;uu) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 85; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 86;vv) the first CH1 or the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 87; the first CL or the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 88.6.The antigen binding protein of any one of claims 1-5, wherein:the first CH1 is a variant of a CH1 domain of a human IgG, optionally a human IgGl , human IgG2, or human IgG4; and the first CL is a variant of a CL domain of human kappa light chain or lambda light chain; and the second CH1 domain is the wild-type CH1 fragment, and the second CL domain is the wild-type CL fragment;or,the second CH1 is a variant of a CH1 domain of a human IgG, optionally a human IgGl , human IgG2, or human IgG4; and the second CL is a variant of a CL domain of human kappa light chain or lambda light chain; and the first CH1 domain is the wild-type CH1 fragment, and the first CL domain is the wild-type CL fragment;optionally, wherein the wild-type CH1 fragment is the CH1 domain of a human IgGl, human IgG2, or human IgG4; and the wild-type CL fragment is a CL domain of human kappa light chain or lambda light chain;further optionally, wherein the wild-type CH1 fragment comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 15, 17 and 18; and the wild-type CL fragment comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 16, 19.7.The antigen binding protein of claim 1-6, wherein:a) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;b) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V; and the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;c) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 176F; and the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;d) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;e) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;f) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;g) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V; and the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;h) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;i) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;j) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;k) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;l) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;m) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;n) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;o) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;p) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;q) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;r) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;s) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;t) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;u) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;v) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;w) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;x) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;y) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;z) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;a1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;b1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;c1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;d1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;e1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;f1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;g1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;h1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;i1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, 174C, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 124C, 176C, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;j1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, 174C, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 124C, 176C, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;k1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 122C, 174C, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 124C, 176C, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;l1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F;m1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K;n1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 116V; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, 174C, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, 176C, 131K, and 123K;o1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F;p1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, and 123K;q1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K;r1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F;s1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176C;t1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F;u1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, 174C, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, 176C, 131K, and 123K;v1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K;w1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F;x1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, and 122C; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;y1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, and 122C; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;z1) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;a2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;a2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;b2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 131K, and 123K;c2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, 221E, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, 123K, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V;d2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, 221E, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, 123K, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;e2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, 221E, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, 123K, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;f2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, 221E, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, 123K, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174C; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176C;g2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, 221E, 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, 123K, 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F;h2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, 221E, 122C, and 174C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, 123K, 124C, and 176C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V;i2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, and 122C; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 174A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 176F, 131K, and 123K;j2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, 192A, 145D, and 221E; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 118V, 131K, and 123K; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 124C, and 176F;k2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 122C, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 124C, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, and 221E, and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, and 123K;l2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 145D, 221E, and 122C, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V, 131K, 123K, and 124C; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, and 174A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, and 176F;m2) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, 192A, 145D, 221E, and 174A, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, 131K, 123K, and 176F; the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, and 122C; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V, and 124C;optionally, the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain exchange with the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain, and the amino acid substitution (s) of the second CL domain exchange with the amino acid substitution (s) of the first CL domain;more preferably,a) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21, 26, 35, 45-47, 50; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52, 59, 64-70; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23, 29, 37; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54, 62;b) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21, 26, 35, 45-47, 50; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52, 59, 64-70; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 24, 31, 38; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55, 63;c) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23, 29, 37; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54, 62; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 24, 31, 38; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55, 63;d) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22, 28, 36, 71, 72, 73, 74; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53, 56; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23, 29, 37; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54, 62;e) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22, 28, 36, 71, 72, 73, 74; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53, 56; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 20, 25, 34; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 51;f) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21, 26, 35, 45-47, 50; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52, 59, 64-70; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 20, 25, 34; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 51;g) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23, 29, 37; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54, 62;f) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 20, 25, 34; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 51;further preferably,a) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54;b) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 24; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55;c) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 24; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 55;d) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54;e) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 20; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 51;f) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 20; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 51;g) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 23; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 54;f) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 20; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 51;optionally, the second CH1 domain exchange with the first CH1 domain, and the second CL domain exchange with the first CL domain.8.The antigen binding protein of any one of claims 1-7, which comprises a first variable region of heavy chain (VH1) , a first variable region or light chain (VL1) , and a second variable region of heavy chain (VH2) , a second variable region of light chain (VL2) , wherein VH1 comprises amino acid substitution in position 39 with E, D, K, R or H; and VL1 comprises amino acid substitution in position 38 with E, D, K, R or H; and / or, VH2 comprises amino acid substitution in position 39 with E, D, K, R or H; and VL2 comprises amino acid substitution in position 38 with E, D, K, R or H;preferably, wherein VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E.9.The antigen binding protein of any one of claims 1-8, wherein:a) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 118V; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;b) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;c) the amino acid substitution (s) of the first CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the first CL domain comprise or consist of: 116V, and 118V; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;d) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, and 190W; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 118V; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;e) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;f) the amino acid substitution (s) of the second CH1 domain comprise or consist of: 124A, 190W, 139F, and 192A; and the amino acid substitution (s) of the second CL domain comprise or consist of: 116V, and 118V; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;preferably,a) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;b) the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 21; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 52; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;c) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;d) the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 22; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 53; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;e) the second CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; and the second CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E;f) the first CH1 domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 75; and the first CL domain comprises the amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 76; and VH1 comprises an amino acid substitution: 39E; and VL1 comprises an amino acid substitution: 38K; and VH2 comprises an amino acid substitution: 39K; and VL2 comprises an amino acid substitution: 38E.10.The antigen binding protein of any one of claims 1-9, which is a heterodimeric antibody comprising a first and a second Fab arm recognizing different antigens or epitopes; optionally wherein the heterodimeric antibody is the bispecific or multispecific antibody;preferably, which further comprises two HCs each comprising a CH2 and a CH3 domain which HCs dimerize into an Fc region, wherein the CH3 domains are engineered to introduce one or more of the following:a) one or more knob or hole mutations,preferably any of: T366Y / Y407'T, F405A / T394'W, T366Y: F405A / T394'W: Y407'T, T366W / Y407'A and S354C: T366W / Y349'C: T366'S: L368'A: Y407'V;b) a cysteine residue in the first CH3 domain that is covalently linked to a cysteine residue in the second CH3 domain, thereby introducing an interdomain disulfide bridge;c) one or more mutations where repulsive charge suppresses heterodimer formation, preferably any of: K409D / D399'K, K409D / D399'R, K409E / D399'K, K409E / D399'R, K409D: K392D / D399'K: E356'K or K409D: K392D: K370D / D399'K: E356'K: E357'K;wherein the numbering above is according to the EU index.11.The antigen binding protein of any one of the claims 1-10, wherein the antigens or epitopes recognized by the first or second Fab arm are selected from the EGFR, HER3, PSMA, B7H3, CDH17, CLDN6, CD3, HER2, CD20, CD22, CD47, CD30, CD33, CD44, CD70, VEGFR, IL4R ɑ, GPRC5D, SCF, PAPP-A, PD-1, PD-L1, BCMA, DLL3, CSF1R, B7H6, B7H4, Cmet, trop2, CLDN18.2, ROR1, GPC3, CDH6, PTK7, mesothelin, IL23p19, C5, C3;preferably,the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of EGFR, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of HER3; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of CDH17, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of CD3; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of PSMA, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of B7H3; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of ROR1, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of CD3; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of HER3, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of EGFR; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of CD3, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of CDH17; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of B7H3, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of PSMA; or the first Fab arm recognizes the antigen or epitope of CD3, the second Fab arm recognizes the antigen or epitope of ROR1.12.An isolated polynucleotide or set of isolated polynucleotides comprising at least one sequence that encodes the antigen binding protein according to any one of claims 1-11.13.A vector or set of vectors comprising one or more of the polynucleotides or sets of polynucleotides according to claim 12.14.An isolated cell comprising a polynucleotide or set of polynucleotides according to claim 12, or a vector or set of vectors according to claim 13;Preferably,the cell is a yeast cell, a bacterial cell, a hybridoma, a Chinese Hamster Ovary (CHO) cell, or a HEK293 cell.15.An immunoconjugate comprising the antigen binding protein according to any one of claims 1-11.16.A chimeric antigen receptor comprising the antigen binding protein according to any one of claims 1-11.17.A pharmaceutical composition comprising the antigen binding protein according to any one of the claims 1-11 or the immunoconjugate according to claim 15 or the chimeric antigen receptor according to claim 16, and a pharmaceutically acceptable carrier.18.Use of the antigen binding protein according to any one of claims 1-11 or the immunoconjugate according to claim 15 or the chimeric antigen receptor according to claim 16, or the pharmaceutical composition according to claims 17 for the treatment of a disease or disorder in a subject or in the manufacture of a medicine.19.A method of treatment of a subject having a disease or disorder comprising administering to the subject the antigen binding protein according to any one of claims 1-11 or the immunoconjugate according to claim 15 or the chimeric antigen receptor according to claim 16, or a pharmaceutical composition according to claims 17.20.A method of making the antigen binding protein according to any one of claims 1 -11, comprising:(i) cotransfecting a cell with one or more vectors to express the first CH1 domain, the first CL domain; and the second CH1 domain, and the second CL domain;(ii) culturing the cell line under conditions to express the one or more vectors and that allow the first CHCL and second CHCL to assemble; and(iii) purifying the heterodimeric protein from the cell culture.

Images