Methods of inducing tumor specific t cells with a circular RNA cancer vaccine

Abstract

Provided is a method of using circular RNA as vaccine to treat cancer and design strategy to elicit specific and robust T cell response by promoting antigen presentation.

Description

Methods of inducing tumor specific T cells with a circular RNA cancer vaccineTECHNICAL FIELD

[0001] The present invention relates to the technical field of biological medicine, and particularly relates to a circular RNA vaccine for protecting a subject from a disease-associated protein, and application thereof.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Research on tumor immunotherapy have made tremendous progress in the past decades. Cancer vaccines, which are designed to induce anti-tumor responses by expression tumor antigens in vivo, are also an attractive immunotherapeutic option. A factor which is essential for the efficacy of cancer vaccine is optimal induction of specific T cell responses. Due to the central T-cell tolerance, clinical trials have been largely unsuccessful. Most showed only low rate of clinical responses which was correlated to the moderate T cell immunity. Therefore, the medical need is still high to develop vaccines with robust and specific T cell responses. Here we present a method for inducing both CD4+ and CD8+ T cells immune response through elaborate circular RNA vaccines.

[0003] In the present invention, we have designed several vaccines with different elements to facilitate MHC I and MHC II presentation. Lysosome-associated membrane protein (LAMP1) is a lysosome membrane glycoprotein which facilitates lysosomal acidification for optimal hydrolase activity. This protein shuttles between lysosomes, endosomes, and the plasma membrane. We fused several functional domains of murine or human LAMP1 / Dendritic-cell LAMP to reside antigens in MHC class II processing compartment. MHC class II associated invariant chain (Ii) , a type II membrane protein, serves as both a targeting subunit and guardian of the peptide-binding site, targeting signals in the cytoplasmic domain of the Ii chain can drive Ii-bound complex into the endosomal-lysosomal pathway. Whereas LAMP proteins are predominantly located in acidified late endosomes and lysosomes, antigens fused with Ii chain are targeted to early endosomes. The helper epitopes may also be combined with the antigen coding sequence to break immunological tolerance. The helper epitopes P2P16 are derived from tetaus toxoid, which is known to provide CD4+ mediated T cell response. We show that linking these functional domains to antigens allows robust T cells response, resulting in distinct CD4 / 8+ T cell specificities.SUMMARY OF THE INVENTION

[0004] In one aspect, the present disclosure provides a circular RNA for protecting a subject from a disease-associated protein. The circular RNA comprises a translational initiation element, a first immune enhancer element, an expression element, a second immune enhancer element, and optionally a helper element.

[0005] In one aspect, the present disclosure provides a linear RNA for protecting a subject from a disease-associated protein. The linear RNA comprises a first immune enhancer element, an expression element, a second immune enhancer element, and optionally a helper element.

[0006] In another aspect, the present disclosure provides a DNA for protecting a subject from a disease-associated protein. The DNA could be used to prepare the circular RNA or the linear RNA, or could be transcribed to the linear RNA.

[0007] In another aspect, the present disclosure provides a vector comprising the circular RNA, the linear RNA or the DNA.

[0008] In another aspect, the present disclosure provides a composition comprising the circular RNA, the linear RNA, the DNA, or the vector, and pharmaceutically acceptable excipients.

[0009] In another aspect, the present disclosure provides a use of the circular RNA, the linear RNA, the DNA, the vector, or the composition in the manufacture of a medicament for treating a disease in a subject.

[0010] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating a disease in a subject, comprising administering a therapeutically effective amount of the circular RNA, the linear RNA, or the DNA, the vector, or the composition.

[0011] In another aspect, the present disclosure provides a therapeutically effective amount of the circular RNA, the linear RNA, or the DNA, the vector, or the composition for use in treating a disease in a subject.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0012] Fig. 1 illustrates different design strategies by targeting antigens to MHC pathways for T cell priming. Schematic illustration of the general structure of circular RNAs with translational initiation element, modified antigen sequence including sequence of leading signal peptide, original antigen open reading frame, epitope to break immune tolerance and sorting signal to MHC pathway.

[0013] Fig. 2 shows immune response induced by different circRNA vaccines encoding modified NY-ESO-1 antigens. Mice were immunized at Day0, Day3, Day8 and sacrificed at Day14. Splenocytes were isolated and stimulated with specific antigen peptide pool. IFN-γ secretion of antigen-specific immune response was evaluated with ELISPOT.

[0014] Fig. 3 shows flow cytometry quantification of NY-ESO-1 antigen specific CD8+, CD4+ T cells producing IFN-γ. Mice were immunized with different vaccines at Day0, Day3, Day8 and sacrificed at Day14. Splenocytes were isolated and stimulated with antigens. IFN-γ secretion was evaluated by intracellular cytokine staining.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0015] Unless otherwise defined below, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as commonly understood by an ordinary skilled person in the art. References to techniques used herein are intended to refer to techniques that are generally understood in the art, including those obvious changes or equivalent replacements of the techniques for those skilled in the art. While it is believed that the following terms are well understood by those skilled in the art, the following definitions are set forth to better explain the invention.

[0016] In one aspect, the present disclosure provides a circular RNA for protecting a subject from a disease-associated protein.

[0017] In some embodiments, the circular RNA comprises:

[0018] a translational initiation element,

[0019] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0020] an expression element,

[0021] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0022] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0023] wherein each element is optionally connected by a linker.

[0024] In some embodiments, the circular RNA comprises:

[0025] a translational initiation element,

[0026] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0027] an expression element,

[0028] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0029] a helper element which breaks immunological tolerance,

[0030] wherein each element is optionally connected by a linker.

[0031] In some embodiments, the arrangement of each element in circular RNA is arbitrary. In some embodiments, the circular RNA comprises elements in order, wherein the arrangement of each element in circular RNA includes but not limits the following embodiments.

[0032] For example, in some embodiments, the circular RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’:

[0033] a translational initiation element,

[0034] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0035] an expression element,

[0036] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0037] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0038] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0039] the circular RNA is formed by connecting 5’ and 3’.

[0040] For example, in some embodiments, the circular RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0041] a translational initiation element,

[0042] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0043] an expression element,

[0044] optionally a helper element which breaks immunological tolerance, and

[0045] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0046] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0047] the circular RNA is formed by connecting 5’ and 3’.

[0048] For example, in some embodiments, the circular RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0049] a translational initiation element,

[0050] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0051] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0052] an expression element, and

[0053] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0054] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0055] the circular RNA is formed by connecting 5’ and 3’.

[0056] For example, in some embodiments, the circular RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0057] a translational initiation element,

[0058] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0059] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0060] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0061] an expression element,

[0062] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0063] the circular RNA is formed by connecting 5’ and 3’.

[0064] For example, in some embodiments, the circular RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0065] a translational initiation element,

[0066] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0067] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0068] an expression element, and

[0069] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0070] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0071] the circular RNA is formed by connecting 5’ and 3’.

[0072] For example, in some embodiments, the circular RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0073] a translational initiation element,

[0074] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0075] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0076] optionally a helper element which breaks immunological tolerance, and

[0077] an expression element,

[0078] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0079] the circular RNA is formed by connecting 5’ and 3’.

[0080] In some embodiments, the circular RNA is formed by the in vitro RNA circularization strategies, including but not limiting chemical method, enzymatic ligation method and ribozyme method.

[0081] In some embodiments, the translational initiation element is internal ribosomal entry site (IRES) or a fragment thereof,

[0082] preferably, the IRES is selected from the group consisting of Coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, Enterovirus 71 (EV71) IRES, encephalomyocarditis virus (EMCV) IRES, picornavirus (PV) IRES, hepatitis C virus (HCV) IRES, adenovirus (AdV) IRES, human papillomavirus type 31 (HPV31) IRES, human herpesvirus (HHV) IRES, Rous sarcoma virus (RSV) IRES, classical swine fever virus (CSFV) IRES, FGF9 IRES, SLC7A1 IRES, and RUNX1 IRES,

[0083] more preferably the IRES is CVB3 IRES, the most preferably the IRES is SEQ ID NO: 17.

[0084] In some embodiments, the signal peptide targets endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi. In some embodiments, the first immune enhancer element encodes the signal peptide targets endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.

[0085] In some embodiments, the first immune enhancer element encodes the signal peptide of mouse LAMP1, human LAMP1, or human dendritic-cell LAMP (human D.C. LAMP) ,

[0086] preferably, the first immune enhancer element encoding leading signal peptide of mouse LAMP1 is SEQ ID NO: 9, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9,

[0087] preferably, the first immune enhancer element encoding leading signal peptide of human LAMP1 is SEQ ID NO: 11, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11,

[0088] preferably, the first immune enhancer element encoding leading signal peptide of human D.C. LAMP is SEQ ID NO: 13, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13.

[0089] In some embodiments, the peptide coded by the second enhancer expression element retains the fusion protein in endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi. In some embodiments, the second immune enhancer element encodes a peptide retaining the fusion protein in endosomes, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.

[0090] In some embodiments, the second immune enhancer element encodes the peptide selected from the luminal domain and cytoplasmic tail of mouse LAMP1 protein, human LAMP1 protein, human dendritic-cell LAMP (human D. C. LAMP) protein, or 80 amino acids upstream of the class II-associated invariant chain peptides (CLIP) of Ii;

[0091] preferably, the second immune enhancer element encoding the lumen domain and cytoplasmic tail of mouse LAMP1 is SEQ ID NO: 10, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10,

[0092] preferably, the second immune enhancer element encoding the lumen domain and cytoplasmic tail of human LAMP1 is SEQ ID NO: 12, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12,

[0093] preferably, the second immune enhancer element encoding the lumen domain and cytoplasmic tail of human D. C. LAMP is SEQ ID NO: 14, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14,

[0094] preferably, the second immune enhancer element encoding 80 amino acids upstream of the class II-associated invariant chain peptides (CLIP) of Ii is SEQ ID NO: 21, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21.

[0095] In some embodiments, the second immune enhancer element encodes 80 amino acids upstream of the class II-associated invariant chain peptides (CLIP) of Ii, wherein the 80 amino acids upstream of the class II-associated invariant chain peptides (CLIP) of Ii is aa 18-97 of the amino acid sequence of Ii and includes the transmembrane region of Ii.

[0096] In some embodiments, the expression element comprises a nucleotide sequence encoding a wild type or engineered protein, wherein the wild type or engineered protein is a disease-associated protein derived from bacteria, virus, fungi, parasites, or tumor cell.

[0097] In some embodiments, the helper element breaking immunological tolerance is selected or derived from the tetanus toxoid (TT) of Clostridium tetani;

[0098] preferably is helper epitope P2, P16, or P2P16,

[0099] more preferably is SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 or, SEQ ID NO: 15.

[0100] In some embodiments, the linker encoding animo acid is selected or derived from GA, GS, GG, GGA, GGS, GGG, GGGA, GGGS, GGGG, GGGGA, GGGGS, GGGGG, GGGGA, GGGGS, GGGGG, GGAG, GGSG, AGGGG, SGGG, GAGA, GSGS, GAGAGA, GSGSGS, GAGAGAGA, GSGSGSGS, GAGAGAGAGA, GSGSGSGSGS, GAGAGAGAGAGA, GAGSGSGSGSGS, GGAGGA, GGSGGS, GGAGGAGGA, GGSGGSGGS, GGAGGAGGAGGA, GGSGGSGGSGGS, GGAGGGAG, GGSGGGSG, GGAGGGAGGGAG, GGSGGGSGGSG, GGGAGGGAGGGA or GGGSGGGSGGGS.

[0101] In some embodiments, the nucleotide sequence of the circular RNA is selected from SEQ ID NOs: 27, 29, 31 and 33, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 27, 29, 31 or 33.

[0102] In one aspect, the present disclosure provides a linear RNA for protecting a subject from a disease-associated protein.

[0103] In some embodiments, a linear RNA comprises:

[0104] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0105] an expression element,

[0106] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0107] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0108] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0109] each element of the linear RNA has the same definition as any one of preceding embodiments.

[0110] In some embodiments, a linear RNA comprises:

[0111] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0112] an expression element,

[0113] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0114] a helper element which breaks immunological tolerance,

[0115] wherein each element is optionally connected by a linker,

[0116] each element of the linear RNA has the same definition as any one of preceding embodiments.

[0117] In some embodiments, the arrangement of each element in linear RNA is arbitrary. In some embodiments, the linear RNA comprises elements in order, wherein the arrangement of each element in linear RNA includes but not limits the following embodiments.

[0118] For example, in some embodiments, the linear RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’:

[0119] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0120] an expression element,

[0121] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining a fusion protein, and

[0122] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0123] wherein each element is optionally connected by a linker.

[0124] For example, in some embodiments, the linear RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0125] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0126] an expression element,

[0127] optionally a helper element which breaks immunological tolerance, and

[0128] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0129] wherein each element is optionally connected by a linker.

[0130] For example, in some embodiments, the linear RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0131] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0132] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0133] an expression element, and

[0134] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0135] wherein each element is optionally connected by a linker.

[0136] For example, in some embodiments, the linear RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0137] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0138] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0139] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein, and

[0140] an expression element,

[0141] wherein each element is optionally connected by a linker.

[0142] For example, in some embodiments, the linear RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0143] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0144] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0145] an expression element, and

[0146] optionally a helper element which breaks immunological tolerance,

[0147] wherein each element is optionally connected by a linker.

[0148] For example, in some embodiments, the linear RNA comprises elements in the order from 5’ to 3’ :

[0149] a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,

[0150] a second immune enhancer element encoding a peptide retaining the fusion protein,

[0151] optionally a helper element which breaks immunological tolerance, and an expression element,

[0152] wherein each element is optionally connected by a linker.

[0153] In some embodiments, the signal peptide targets endosome, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi. In some embodiments, the first immune enhancer element encodes the signal peptide targets endosome, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.

[0154] In some embodiments, the peptide coded by the second enhancer expression element retains the fusion protein in endosome, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi. In some embodiments, the second immune enhancer element encodes a peptide retaining the fusion protein in endosome, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.

[0155] In some embodiments, each element of the linear RNA has the same definition as any one of preceding embodiments.

[0156] In another aspect, the present disclosure provides a DNA for protecting a subject from a disease-associated protein.

[0157] In some embodiments, the DNA could be used to prepare the circular RNA of any one of the preceding embodiments, or could be transcribed to the linear RNA of any one of preceding embodiments.

[0158] In another aspect, the present disclosure provides a vector comprising the circular RNA, the linear RNA or the DNA of preceding embodiments.

[0159] In another aspect, the present disclosure provides a composition comprising the circular RNA, the linear RNA, the DNA or the vector of any one of preceding embodiments, and pharmaceutically acceptable excipients.

[0160] In some embodiments, the circular RNA, linear RNA or DNA of any one of preceding embodiment are formulated or is to be formulated as lipoplex particles.

[0161] In some embodiments, the lipoplex particles are obtainable by mixing the RNA with liposomes. In some embodiments, the circular RNA, linear RNA or DNA of any one of preceding embodiment are formulated or is to be formulated as lipid nanoparticles (LNP) .

[0162] In some embodiments, the lipid nanoparticles are obtainable by mixing the RNA with of the organic phase containing LNP lipid components. In another aspect, the present disclosure provides a use of the circular RNA, the linear RNA, the DNA, the vector, or the composition of preceding embodiments in the manufacture of a medicament for treating a disease in a subject.

[0163] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating a disease in a subject, comprising administering a therapeutically effective amount of the circular RNA, the linear RNA, or the DNA, the vector, or the composition of preceding embodiments.

[0164] In another aspect, the present disclosure provides a therapeutically effective amount of the circular RNA, the linear RNA, or the DNA, the vector, or the composition of preceding embodiments for use in treating a disease in a subject.

[0165] General Definition

[0166] As used herein, the terms “including” , “having” , “containing” or “comprising” , and other variants thereof, are inclusive or open, and do not exclude other unlisted elements or method steps.

[0167] As used herein, the terms “embodiment” , “disclosed herein” or “disclosure” are not meant to be limiting, but applies generally to any of the embodiments defined in the claims or described herein. These terms are used interchangeably herein.

[0168] As used herein, the terms “treat” , “treating” , “treatment” and the like refer to eliminating, reducing, or ameliorating a disease or condition, and / or symptoms associated therewith. Although not precluded, treating a disease or condition does not require that the disease, condition, or symptoms associated therewith be completely eliminated. The term “treat” and synonyms contemplate administering a therapeutically effective amount of the circular RNA or the composition disclosed herein to a subject in need of such treatment. The treatment can be orientated symptomatically, for example, to suppress symptoms. It can be effected over a short period, be oriented over a medium term, or can be a long-term treatment, for example within the context of a maintenance therapy.

[0169] Throughout this disclosure, the terms “a” or “an” entity refers to one or more of that entity; for example, “apolynucleotide” is understood to represent one or more polynucleotides. As such, the terms “a” , “an” , “one or more” and “at least one” can be used interchangeably herein.

[0170] The term “variant” , as used herein, refers to a peptide that differs from the recited peptide due to amino acid substitutions, deletions, insertions, and / or modifications. Variants can be produced using art-known mutagenesis techniques.

[0171] The terms “composition” or “pharmaceutical composition” refer to compositions comprising the circular RNA provided herein, along with e.g., pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or diluents for administration to a subject in need of treatment.

[0172] The term “pharmaceutically acceptable” refers to compositions that are, within the scope of sound medical judgment, suitable for contact with the tissues of human beings and animals without excessive toxicity or other complications commensurate with a reasonable benefit / risk ratio.

[0173] An “effective amount” is that amount of a circular RNA provided herein, the administration of which to a subject, either in a single dose or as part of a series, is effective for treatment. For example, with respect to obesity, an amount is effective, for example, when its administration results in one or more of weight loss or weight maintenance (e.g., prevention of weight gain) , loss of body fat, prevention or modulation hypoglycemia, prevention or modulation hyperglycemia, promotion of insulin synthesis, or reduction in food intake. This amount can be a fixed dose for all subjects being treated, or can vary depending upon the weight, health, and physical condition of the subject to be treated, the extent of weight loss or weight maintenance desired, the formulation of the circular RNA or the composition disclosed herein, a professional assessment of the medical situation, and other relevant factors.

[0174] The term “subject” means any subject, particularly a mammalian subject, in need of treatment with the circular RNA or the composition provided herein. Mammalian subjects include, but are not limited to, humans, dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, cattle, bears, cows, apes, monkeys, orangutans, and chimpanzees, and so on. In one embodiment, the subject is a human subject.

[0175] The term “about” as used herein, includes the recited number ± 10%. Thus, “about 10” means 9 to 11.

[0176] As used herein, the terms “circRNA” or “circular polyribonucleotide” or “circular RNA” are used interchangeably and can refer to a polyribonucleotide that forms a circular structure through covalent or non-covalent bonds. When it comes to circular RNA, a skilled person would understand that a polynucleotide in a RNA refers to a polyribonucleotide.

[0177] As used herein, the term “helper element” or “helper epitopes” is a nucleotide or amino acid sequence that has a function of breaking immunological tolerance. In one embodiment, the helper epitopes may be tetanus toxoid-derived, e.g., P2P16 amino acid sequences derived from the tetanus toxoid (TT) of Clostridium tetani. These sequences may support to overcome self-tolerance mechanisms for efficient induction of immune responses to self-antigens by providing tumor-unspecific T-cell help during priming. The tetanus toxoid heavy chain includes epitopes that can bind promiscuously to MHC class II alleles and induce CD4+ memory T cells in almost all tetanus vaccinated individuals. In addition, the combination of TT helper epitopes with tumor-associated antigens is known to improve the immune stimulation compared to the application of tumor-associated antigen alone by providing CD4+ mediated T-cell help during priming. To reduce the risk of stimulating CD8+ T cells, two peptide sequences known to contain promiscuously binding helper epitopes may be used to ensure binding to as many MHC class II alleles as possible, e.g., P2, P16 or P2P16.

[0178] The term “signal peptides” as defined herein preferably allow the transport or targeting of the antigenic peptide or protein as encoded by the RNA into a defined cellular compartment, preferably the cell surface, the endoplasmic reticulum (ER) or the endosomal-lysosomal compartment.

[0179] The term “linker” suitable for use in present disclosure is generally one or more flexible portion (s) that provide flexibility of each element to facilitate their functions independently without interfering. Such flexible portion encodes flexible peptide. Exemplary flexible peptides include, but are not limited to (GS) n, (GSGGS) n, (GGGS) n, GA, GS, GG, GGA, GGS, GGG, GGGA, GGGS, GGGG, GGGGA, GGGGS, GGGGG, GGGGA, GGGGS, GGGGG, GGAG, GGSG, AGGGG, SGGG, GAGA, GSGS, GAGAGA, GSGSGS, GAGAGAGA, GSGSGSGS, GAGAGAGAGA, GSGSGSGSGS, GAGAGAGAGAGA, GAGSGSGSGSGS, GGAGGA, GGSGGS, GGAGGAGGA, GGSGGSGGS, GGAGGAGGAGGA, GGSGGSGGSGGS, GGAGGGAG, GGSGGGSG, GGAGGGAGGGAG, GGSGGGSGGSG, GGGAGGGAGGGA or GGGSGGGSGGGS, wherein wherein n represent 1, 2, 3 or 4.

[0180] The term “MHC class II associated invariant chain (Ii) ” is a type II membrane protein, serves as both a targeting subunit and guardian of the peptide-binding site, targeting signals in the cytoplasmic domain of the Ii chain can drive Ii-bound complex into the endosomal-lysosomal pathway.

[0181] The term “disease-associated antigen” is used in its broadest sense to refer to any antigen associated with a disease. A disease-associated antigen is a molecule which contains epitopes that will stimulate a host’s immune system to make a cellular antigen-specific immune response and / or a humoral antibody response against the disease. The disease-associated antigen or an epitope thereof may therefore be used for therapeutic purposes. Disease-associated antigens may be associated with cancer, typically tumors.

[0182] The term “tumor antigen” refers to a constituent of cancer cells. In particular, it refers to those antigens which are produced intracellularly or as surface antigens on tumor cells.

[0183] The term “disease-associated protein” is used in its broadest sense to refer to any protein associated with a disease, which could be a microorganism, such as bacteria, virus, fungi, parasites, or one or more toxins and / or one or more proteins, for example, surface proteins, (i.e., antigens) of such a microorganism. The disease-associated protein can stimulate the body’s immune system to recognize the protein as a foreign invader, generate antibodies against it, destroy it and develop a memory of it.

[0184] The term “vector” is intended to refer to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked. The commonly used forms of vector in the art include but not limit plasmid, cell, viral vector, bacterial vector, phage and the like. The most commonly used form of vector is plasmid, a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segments may be ligated. In general, expression vectors of utility in recombinant DNA techniques are often in the form of plasmids. In the present application, “plasmid” and “vector” may be used interchangeably.

[0185] Examples

[0186] To make the objects and technical solutions of the present invention clearer, the present invention will be further described below in conjunction with specific examples. It should be understood that the examples are not intended to limit the scope of the invention. Further, specific experimental methods not mentioned in the following examples were carried out in accordance with a conventional experimental method.

[0187] EXAMPLE 1: Synthesis of targeted Circular RNA Vaccine.

[0188] The protein circular RNA encoded consists of several functional domains: a signal peptide leading at the N-terminal, tumor associated antigen to trigger tumor cell specific immune response, helper peptide derived from tetanus toxoid in order to enhance resulting immune response, and amino acids sequence to increase MHC presentation. All these functional domains are joined by protein linkers. Nucleotides encoding this protein are codon optimized with internal algorithms and the translation is initiated through a coxsackievirus B3 (CVB3) internal ribosome entry sites (IRESs) . The nucleotide sequences of IRES and coding region were synthesized by Azenta Life Sciences (Suzhou, China) .

[0189] Table 1. shows different design strategies.

[0190] EXAMPLE 2: Manufacturing of Circular RNA.

[0191] The plasmid was linearized by digestion with BspQ I restriction endonuclease (Vazyme, DD4302-PC-02) , the reaction was incubated at 50 ℃ for 3 hours and the linear DNA template was purified using DNA Clean &Concentrator-25 Kit (ZYMO RESEARCH, D4034) . Following the linearization step, an aliquot of the linearized DNA template was added to an IVT reaction to get the precursor RNA. In a traditional IVT reaction system, reaction components were assembled with 400 ng linearized DNA template, 100 U T7 RNA Polymerase (Vazyme, DD4101-PC-03) , a NTP solution mix including 100 mM GTP (Vazyme, DD4108-PA-02) , 600 mM GMP solution, 100 mM ATP (Vazyme, DD4106-PA-02) , 100 mM CTP (Vazyme, DD4107-PA-02) , 100 mM UTP (Vazyme, DD4105-PA-02) , 10×reaction buffer (Vazyme, DD4101R) , 10 U Rnase Inhibitor (Vazyme, DD4102-PA-01) and 0.008 U Pyrophosphatase (Vazyme, DD4103-PC-01) , the IVT reaction was incubated at 37 ℃ for 2 hours. Then the linear products were exposed to Dnase I (Vazyme, EN401) digestion to remove the template DNA, and the RNA transcripts were column purified by RNA Cleanup Kit (NEB, T2040L) . To get the circular RNA, we then used T4 Rnl2 (Kactus, TRL-BE103-C1) to circularize the RNA transcripts, an enzyme ligation reaction was assembled, 10 U T4 RNA Ligase II, 10×reaction buffer and 10 μg linear RNA were added to a 40 μL reaction mixture and the reaction vessels were incubated at 25 ℃ for 2 hours. At last Rnase R exonuclease (Novoprotein, GMP-E224-M001) was added to degrade the linear RNA and enrich the circular product, 1 μg column purified RNA product, 1 U Rnase R was assembled to the 6 μl reaction system, and the reactions were incubated at 37 ℃ for 30 minutes. The circular RNA products were then purified using  RNA Cleanup Kit (NEB, T2040L) .

[0192] EXAMPLE 3: Induction of Antigen-Specific Immune Responses

[0193] C57BL / 6 mice were repetitively immunized intramuscularly with lipid nanoparticles formulated circular RNA vaccines at Day0, Day3 and Day8.20 μg circRNA-LNP were injected into the tibialis anterior muscle. At Day14, mice were sacrificed and spleen were collected for enyzme-linked immune spot (ELISPOT) and flow cytometry analysis. For single cell suspension preparation, spleens were homogenized by a syringe plunger at a 70 μm cell strainer ( 352350) in RPMI-1640 medium (HyClone, SH30027.01) . Red blood cells were removed by applying ACK lysis buffer (GibcoTM, A1049201) to splenocyte for 4 min at room temperature. Cells were washed with DPBS (GibcoTM, 14040133) twice and resuspended at 1×107 cells / mL. for ELISPOT, 3×105 splenocyte were seeded in 96-plates coated with IFN-γ capture antibody (MABTECH, 3321-4AST) . NY-ESO-1 peptide pool (Miltenyi Biotec, 130-095-381) was added then to a concentration of 0.25 μg / mL and incubated 40 h for in vitro stimulation. IFN-γ secretion was detected by biotinylated anti-IFN-γ antibody. Spots were developed following the manufacturer’s instructions. The final spots were counted using an AID SLISPOT reader. (Figure 2)

[0194] EXAMPLE 4: Induction of Antigen-Specific CD8+ and CD4+ T-Cell Responses

[0195] For antigen specific CD4+ and CD8+ T cells response detection, 3 million splenocytes were stimulated with NY-ESO-1 peptide pool (0.25 μg / mL, Miltenyi Biotec, 130-095-381) and anti-CD28 monoclonal antibody (1 μg / mL, BioLegend, 102116) in a U-bottom 96-well plate. 4 hours later, BD GolgiStop monensin (1: 1000 dilution, BD Bioscience, 554715) was added to block protein transport for 12 hours. Cells were washed with PBS and followed by anti-CD16 / 32 Fc-receptor blockade (BD Pharmingen, 553142) before staining. Cells were stained with PE anti-mouse CD3 Antibody (BioLegend, 100205) , FITC Rat Anti-Mouse CD8a (BD Pharmingen, 553030) , APC Rat Anti-Mouse CD4 (BD Pharmingen, 553051) , and Fixable Viability Stain 510 (BD Pharmingen, 564406) for surface staining at 4 ℃ for 30 minutes. Then cells were washed with stain buffer (BD Pharmingen, 554656) , fixed and permeabilized using the Cytofix / Cytoperm kit (BD Biosciences, 554714) , and stained intracellularly for another 30 minutes in stain buffer with antibodies including PerCP-CyTM5.5 Rat Anti-Mouse IFN-γ (BD Pharmingen, 560660) and PE-CyTM7 Rat Anti-Mouse IL-4(BD Pharmingen, 560699) . (Figure 3) .

Claims

1.A circular RNA, comprising:a translational initiation element,a first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,an expression element,a second immune enhancer element encoding a peptide retaining a fusion protein, andoptionally a helper element which breaks immunological tolerance,wherein each element is optionally connected by a linker.2.The circular RNA of claim 1, wherein the translational initiation element is internal ribosomal entry site (IRES) or a fragment thereof,preferably, the IRES is selected from the group consisting of Coxsackievirus B3 (CVB3) IRES, Enterovirus 71 (EV71) IRES, encephalomyocarditis virus (EMCV) IRES, picornavirus (PV) IRES, hepatitis C virus (HCV) IRES, adenovirus (AdV) IRES, human papillomavirus type 31 (HPV31) IRES, human herpesvirus (HHV) IRES, Rous sarcoma virus (RSV) IRES, classical swine fever virus (CSFV) IRES, FGF9 IRES, SLC7A1 IRES, and RUNX1 IRES,more preferably the IRES is CVB3 IRES,the most preferably the IRES is SEQ ID NO: 17.3.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the signal peptide targets endosome, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.4.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein first immune enhancer element encodes the signal peptide of mouse LAMP1, human LAMP1, or human dendritic-cell LAMP (human D. C. LAMP) ,preferably, the first immune enhancer element encoding leading signal peptide of mouse LAMP1 is SEQ ID NO: 9, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9,preferably, the first immune enhancer element encoding leading signal peptide of human LAMP1 is SEQ ID NO: 11, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11,preferably, the first immune enhancer element encoding leading signal peptide of human D. C. LAMP is SEQ ID NO: 13, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13.5.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the peptide coded by the second enhancer expression element retains the fusion protein in endosome, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.6.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the second immune enhancer element encodes the peptide selected from the luminal domain and cytoplasmic tail of mouse LAMP1 protein, human LAMP1 protein, human dendritic-cell LAMP (human D. C. LAMP) protein, or 80 amino acids upstream of the class II-associated invariant chain peptides (CLIP) of Ii;preferably, the second immune enhancer element encoding the lumen domain and cytoplasmic tail of mouse LAMP1 is SEQ ID NO: 10, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10,preferably, the second immune enhancer element encoding the lumen domain and cytoplasmic tail of human LAMP1 is SEQ ID NO: 12, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12,preferably, the second immune enhancer element encoding the lumen domain and cytoplasmic tail of human D. C. LAMP is SEQ ID NO: 14, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14,preferably, the second immune enhancer element encoding 80 amino acids upstream of the class II-associated invariant chain peptides (CLIP) of Ii is SEQ ID NO: 21, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21.7.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the expression element comprises a nucleotide sequence encoding a wild type or engineered protein, wherein the wild type or engineered protein is a disease-associated protein derived from bacteria, virus, fungi, parasites, or tumor cell.8.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the helper element breaking immunological tolerance is selected or derived from the tetanus toxoid (TT) of Clostridium tetani;preferably is helper epitope P2, P16, or P2P16,more preferably is SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 15.9.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the linker encoding animo acid is selected or derived from GA, GS, GG, GGA, GGS, GGG, GGGA, GGGS, GGGG, GGGGA, GGGGS, GGGGG, GGGGA, GGGGS, GGGGG, GGAG, GGSG, AGGGG, SGGG, GAGA, GSGS, GAGAGA, GSGSGS, GAGAGAGA, GSGSGSGS, GAGAGAGAGA, GSGSGSGSGS, GAGAGAGAGAGA, GAGSGSGSGSGS, GGAGGA, GGSGGS, GGAGGAGGA, GGSGGSGGS, GGAGGAGGAGGA, GGSGGSGGSGGS, GGAGGGAG, GGSGGGSG, GGAGGGAGGGAG, GGSGGGSGGSG, GGGAGGGAGGGA or GGGSGGGSGGGS.10.The circular RNA of any one of the preceding claims, wherein the nucleotide sequence of the circular RNA is selected from SEQ ID NOs: 27, 29, 31 and 33, or has at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, or 80%identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 27, 29, 31 or 33.11.A linear RNA, comprisinga first immune enhancer element encoding a signal peptide relevant to antigen processing and / or presentation of MHC I and / or MHC II,an expression element,a second immune enhancer element encoding a peptide retaining a fusion protein, andoptionally a helper element which breaks immunological tolerance,wherein each element is optionally connected by a linker,each element of the linear RNA has the same definition as any one of preceding claims.12.The linear RNA of the claim 11, wherein the signal peptide targets endosome, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.13.The linear RNA of any one of the preceding claims, wherein the peptide coded by the second enhancer element retains the fusion protein in endosome, proteasomes, lysosomes, ER lumen or Golgi.14.A DNA, wherein the DNA could be used to prepare the circular RNA of any one of claims 1-10, or could be transcribed to the linear RNA of any one of claims 11-13.15.A vector, comprising the circular RNA of any one of claims 1-10, the linear RNA of any one of claims 11-13, or the DNA of claim 14.16.A composition comprising the circular RNA of any one of claims 1-10, the linear RNA of any one of claims 11-13, the DNA of claim 14, or the vector of claim 15, wherein the composition comprises pharmaceutically acceptable excipients.17.Use of the circular RNA of any one of claims 1-10, the linear RNA of any one of claims 11-13, or the DNA of claim 14, the vector of claim 15, or the composition of claim 16 in the manufacture of a medicament for treating a disease in a subject, ora method for treating a disease in a subject, comprising administering a therapeutically effective amount of the circular RNA of any one of claims 1-10, the linear RNA of any one of claims 11-13, or the DNA of claim 14, the vector of claim 15, or the composition of claim 16, ora therapeutically effective amount of the circular RNA of any one of claims 1-10, the linear RNA of any one of claims 11-13, or the DNA of claim 14, the vector of claim 15, or the composition of claim 16 for use in treating a disease in a subject.

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