Targeting prkar2b to enhance beta-islet function and survival for treatments of diabetes

Abstract

A method to enhance beta-islet function and survival for treatments of diabetes by targeting PRKAR2B, and a method of preparing genetically modified human pluripotent stem cell (hPSC) in vitro, comprising providing hPSCs, with said modification comprising reducing or eliminating the expression or function of the gene products of the PRKAR2B gene in said hPSCs to be capable of differentiating in vitro to give rise to beta islets with enhanced function in glucose-stimulated insulin secretion and cell survival,are provided.

Description

TARGETING PRKAR2B TO ENHANCE BETA-ISLET FUNCTION AND SURVIVAL FOR TREATMENTS OF DIABETESFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present application provides materials and methods of gene editing for treating diabetes by targeting PRKAR2B in pancreatic β-islet. More specifically, the application provides methods for producing human pluripotent stem cells (hPSCs) that are genetically modified via genome editing to increase function and survival of their beta-islet progeny, and methods of using such cells for treating type 1 diabetes (T1D) or type 2 diabetes (T2D) . SEQUENCE LISTING

[0002] The present disclosure includes a sequence listing as a part of the disclosure.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0003] Diabetes mellitus is characterized by the inability of pancreatic beta cells to produce or respond adequately to insulin, resulting in chronic hyperglycemia and associated complications. Transplantation of pancreatic islets represents a promising avenue in the quest for a curative treatment for diabetes. Conventional islet transplantation involves the transfer of insulin-producing cells obtained from deceased donor pancreas into recipient's liver via minimally invasive techniques. While the procedure potentially offers a long-term solution for individuals with type 1 diabetes or those with severe type 2 diabetes, challenges such as donor shortage, immune rejection, and the need for lifelong immunosuppression remain significant hurdles to widespread clinical application.

[0004] Stem cell-derived pancreatic islets offer a renewable and potentially limitless source of insulin-producing cells, addressing the critical issue of donor shortage. These islets can be generated from various stem cell sources, including induced pluripotent stem cells (iPSCs) and embryonic stem cells (ESCs) , through complicated differentiation protocols that mimic pancreatic development in vitro. Furthermore, advancements in gene editing techniques, such as CRISPR-Cas, enable precise manipulation of stem cells to enhance their functionality and immune compatibility to tailor treatments to individual patients' needs. Despite these remarkable achievements, further research is warranted to address remaining challenges, including the optimization of differentiation efficiency, scalability, and the long-term function of stem cell-derived islets in vivo, to realize their full therapeutic potential in clinical settings.

[0005] Protein kinase A (PKA) is a key enzyme involved in intracellular signaling pathways that regulate various cellular processes, including glycogen, sugar, and lipid metabolism. The activity of PKA is tightly regulated by a complex mechanism involving cyclic AMP (cAMP) as a second messenger. In response to a variety of signals, the production of cAMP is increased through the activation of adenylate cyclase, which catalyzes the conversion of ATP into cAMP. Elevated levels of cAMP activate PKA by binding to its regulatory subunits, causing their release from the catalytic subunits. Once released, the catalytic subunits of PKA become active and phosphorylate various downstream targets involved in insulin secretion and gene expression regulation within the pancreatic islet cells. PKA exerts its effects on insulin secretion by phosphorylating key proteins involved in the exocytosis machinery, such as synaptotagmin and vesicle-associated membrane protein (VAMP) , and thus facilitates insulin release from the beta cells. In addition, PKA regulates gene expression in pancreatic islet cells by phosphorylating transcription factors such as the cAMP response element-binding protein (CREB) , which binds to cAMP response elements (CREs) in the promoter regions of the target genes.

[0006] Protein kinase A (PKA) is a holoenzyme composed of two regulatory (R) subunits and two catalytic (C) subunits. The regulatory subunits play a crucial role in modulating PKA activity by controlling its subcellular localization and catalytic activity in response to the intracellular cAMP levels. There are two main types of regulatory subunits in PKA, termed type I (RI) and type II (RII) , each encoded by distinct genes (PRKAR1A for RI and PRKAR2A and PRKAR2B for RII) . While both types of the regulatory subunits share structural similarities and can bind cAMP, the differences between RI and RII subunits contribute to the specificity and diversity of PKA signaling in different cellular contexts. RII subunits have a lower affinity for cAMP compared to RI subunits, requiring higher levels of cAMP for dissociation from the catalytic subunits. The disruption of PRKAR2B initiated an isoform switch of the regulatory (R) subunits from RII to RI, leading to increased basal PKA activity in response to lower levels of cAMP. The effects ultimately impact insulin secretion and glucose homeostasis in the pancreatic beta cells.SUMMARY OF THE INVENTION

[0007] The present disclosure provides a method of preparing genetically modified human pluripotent stem cell (hPSC) in vitro, comprising providing hPSCs, with said modification comprising reducing or eliminating the expression or function of the gene products of PRKAR2B gene in said hPSCs.

[0008] In some embodiments, said modification comprises editing within or near said PRKAR2B gene or the regulatory element of said PRKAR2B gene of said hPSCs, thereby reducing or eliminating the expression or function of the gene products of said PRKAR2B gene.

[0009] In some embodiments, said hPSCs are human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) or human embryonic stem cells (hESCs) .

[0010] In some embodiments, said editing is capable of generating one or more single strand breaks (SSBs) or double strand breaks (DSBs) within or near said PRKAR2B gene or said regulatory element of the PRKAR2B gene.

[0011] In some embodiments, said regulatory element is a transcriptional regulatory element or a translational regulatory element.

[0012] In some embodiments, said one or more single strand breaks (SSBs) or double strand breaks (DSBs) result in the cleavage, deletion, modulation or inactivation of the transcriptional control sequence or exonic region of said PRKAR2B gene.

[0013] In some embodiments, said method comprises subjecting said hPSCs to at least one nucleic acid endonuclease.

[0014] In some embodiments, said at least one nucleic acid endonuclease is capable of binding to one or more target sequences within or near said PRKAR2B gene or said regulatory element of the PRKAR2B gene.

[0015] In some embodiments, said at least one nucleic acid endonuclease binds to said target sequence via a single guide RNA molecule.

[0016] In some embodiments, said guide RNA molecule is capable of specifically recognizing said target sequence and hybridizing to it.

[0017] In some embodiments, said method further comprises providing one or more of said single guide RNA molecules.

[0018] In some embodiments, said nucleic acid endonuclease and said single guide RNA molecules are contained in the same or different plasmids.

[0019] In some embodiments, said at least one nucleic acid endonuclease is a CRISPR / Cas protein.

[0020] In some embodiments, said CRISPR / Cas protein is Cas12b.

[0021] In some embodiments, said CRISPR / Cas protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

[0022] In some embodiments, said target sequence is located in one or more exonic regions of said PRKAR2B gene.

[0023] In some embodiments, said target sequence comprises the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NO: 2-12.

[0024] In some embodiments, said method further comprises providing said single guide RNA molecules comprising one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 13-23.

[0025] In some embodiments, the hPSCs prepared by said method are capable of differentiating to form hPSCs-derived functional pancreatic beta-cells. For example, said functional pancreatic beta-cells are capable of producing insulin responding to glucose stimulation.

[0026] The present disclosure provides a method of enhancing the function of human pluripotent stem cell (hPSC) -derived pancreatic beta-cells, comprising: 1) providing the hPSCs prepared by the method described herein, and 2) inducing directed differentiation of said hPSCs of 1) into pancreatic beta-cells. The hPSCs are genetically modified hPSCs.

[0027] The present disclosure provides a human pluripotent stem cell (hPSC) generated by the method described herein. The hPSCs are genetically modified hPSCs.

[0028] The present disclosure provides a cell population comprising the human pluripotent stem cells (hPSCs) generated by the method described herein. The hPSCs are genetically modified hPSCs.

[0029] The present disclosure provides pancreatic beta-cells differentiated from the genetically modified human pluripotent stem cell (hPSC) generated by the method described herein, or obtained by the method described herein, or differentiated from the cell population described herein.

[0030] The present disclosure provides a cell population of pancreatic beta-cells differentiated from the human pluripotent stem cell (hPSC) described herein or the cell population of hPSCs described herein, or generated by the method described herein, or obtained by the method described herein.

[0031] The present disclosure provides a pharmaceutical composition, comprising the pancreatic beta-cells described herein, or the cell population of pancreatic beta-cells described herein, and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0032] The present disclosure provides a kit, comprising the pancreatic beta-cell described herein, the cell population of pancreatic beta-cells described herein, or the pharmaceutical composition described herein.

[0033] The present disclosure provides a method of treating type 1 diabetes and / or type 2 diabetes, wherein said method comprises providing to a patient in need thereof the pancreatic beta-cell described herein, the cell population of pancreatic beta-cells described herein, the pharmaceutical composition described herein, or the kit described herein.

[0034] The present disclosure provides use of the human pluripotent stem cell (hPSC) described herein or the cell population of hPSCs described herein for benefiting cell survival or cell expansion in the process of islet differentiation.

[0035] The present disclosure provides use of the human pluripotent stem cell (hPSC) described herein or the cell population of hPSCs described herein for improving insulin secretion responding to glucose stimulation and / or the levels of insulin-expression of the hPSC-derived islets.

[0036] The present disclosure provides use of the human pluripotent stem cell (hPSC) described herein, the cell population of hPSCs described herein, the pancreatic beta-cell described herein, and / or the cell population of pancreatic beta-cells described herein for alleviating or treating insufficient insulin secretion or diabetes.

[0037] Compared to hPSCs without being edited by the method provided by the present disclosure, the hPSCs or the hPSC-derived pancreatic beta-cells described herein have at least one of the following advantages as described below: 1) during the process of islet differentiation, the cell density is increased at early stages and the average diameter of the cell clusters is increased at the later stages, indicating cell survival and cell fitness; 2) capacity of insulin-secretion responding to glucose stimulation and / or the levels of insulin expression are enhanced in hPSC-derived islets.

[0038] Additional aspects and advantages of the present disclosure will become readily apparent to those skilled in this art from the following detailed description, wherein only illustrative embodiments of the present disclosure are shown and described. As will be realized, the present disclosure is capable of other and different embodiments, and its several details are capable of modifications in various obvious respects, all without departing from the disclosure. Accordingly, the drawings and description are to be regarded as illustrative in nature, and not as restrictive. INCORPORATION BY REFERENCE

[0039] All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication, patent, or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING

[0040] The novel features of the invention are set forth with particularity in the appended claims. A better understanding of the features and advantages of the present invention will be obtained by reference to the following detailed description that sets forth illustrative embodiments, in which the principles of the invention are employed, and the accompanying drawings (also “figure” and “FIG. ” herein) , of which:

[0041] FIG. 1A illustrates the genomic location of CRISPR-Cas12bMax DNA endonucleases target sites for the disruption of PRKAR2B gene at its exon 1 region. Expected cleavage sites are marked with arrows.

[0042] FIG. 1B illustrates the results from the Cas12bMax gRNA screening for efficient editing targeting PRKAR2B exon 1 region in a human pluripotent cell (hPSCs) line.

[0043] FIG. 1C illustrates the detailed information of the most frequent indels obtained from gRNA4 by NGS analysis.

[0044] FIG. 2A illustrates the directed differentiation protocol used to produce SC-islets cells from the mixture of PRKAR2B-edited hPSCs and unedited cells.

[0045] FIG. 2B illustrates the flow cytometry results of the dispersed clusters stained for specific markers from stage 1 to stage 4 of the differentiated hPSCs.

[0046] FIG. 2C illustrates the real-time qPCR results measuring the key beta cell marker gene expression in the mature islets from stage 6, derived from either the PRKAR2B KO (K4) hPSC population or the unedited hPSC.

[0047] FIG. 3A illustrates the cell number comparison of the PRKAR2B edited and unedited cells during the entire beta cell differentiation process.

[0048] FIG. 3B illustrates the average cell cluster diameter comparison of the PRKAR2B edited and unedited cells throughout the beta cell differentiation duration.

[0049] FIG. 4A illustrates the ELISA measurements of the secreted insulin levels from the PRKAR2B edited and unedited cell derived sc-islets incubated cyclically with 2 mM and 20 mM glucose. After two cycles of the low / high-glucose challenges, the islets were depolarized with 30 mM KCl in the presence of 2 mM glucose.

[0050] FIG. 4B illustrates the differentiated beta cell insulin secretion from the PRKAR2B edited and unedited cells. Results are the ELISA measurements of the total proinsulin and insulin detected in the SC-islet lysates harvested after KCL depolarization.

[0051] FIG. 5A illustrates the indels in PRKAR2B locus of PRKAR2B- / -stem cell by next generation sequencing.

[0052] FIG. 5B illustrates PRKAR2B expression in unedited or PRKAR2B- / - (R2B KO) stem cell lysates by representative Western blot.

[0053] FIG. 6 illustrates kinetics of weekly random blood glucose value post SC-islet transplantation in STZ-induced diabetic hIL15-NVG mice. Data are presented as mean ± SEM (n=10 per group) .

[0054] FIG. 7A illustrates fasting oral glucose tolerance test (OGTT) performed 5 weeks after SC-islet transplantation. Blood glucose was measured on 0 min, 15 min, 30 min, 60 min and 120min following oral glucose administration. AUC (area under curve) of OGTT was quantified between unedited and PRKAR2B- / -islet transplanted mice.

[0055] FIG. 7B illustrates the in vivo GSIS performed during OGTT. Insulin concentration was measured in peripheral blood (PB) collected on 0 min, 15 min, 30 min and 60 min. AUC of insulin in PB was quantified between unedited and PRKAR2B- / -islet transplanted mice. Data are presented as mean ± SEM (n=10 per group) .DETAILED DESCRIPTION

[0056] While various embodiments of the invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, changes, and substitutions may occur to those skilled in the art without departing from the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed. I. Definition

[0057] As used herein, the term “in vitro” refers to an artificial environment and to processes or reactions that occur within an artificial environment. In vitro environments exemplified, but are not limited to, test tubes and cell cultures. On the other hand, the term “in vivo” refers to the natural environment (e.g., an animal or a cell) and to processes or reactions that occur within a natural environment, such as embryonic development, cell differentiation, neural tube formation, etc.

[0058] As used herein, the term “pluripotent” refers to a cell type that differentiates into more than one differentiated cell type under various conditions, preferably cell types characteristic of all three germ cell layers (i.e., endoderm (e.g., gut tissue) , mesoderm (e.g., blood, muscle, and vessels) , and ectoderm (e.g., skin and nerve) ) . Although pluripotency is also evidenced by the expression of embryonic stem (ES) cell markers, the preferred test for pluripotency is a description of the ability to differentiate into cells of any of the three germ layers. It should be noted that simply clustering such cells by bioinformatic analyses does not in itself indicate that they are pluripotent. Reprogrammed pluripotent cells (e.g., iPS cells, as that term is defined herein) also have the characteristic of long-term pass-ability without losing their ability to proliferate relative to the primary parental cells. In addition, the parent cells generally have the ability to divide only a limited number of times in culture.

[0059] As used herein, the term “stem cells” refers to cells that retain the ability to renew themselves through mitotic division and can differentiate into a range of specialized cell types. Two broad types of mammalian stem cells are embryonic stem (ES) cells, found in blastocysts, and adult stem cells, found in adult tissues. In the developing embryo, stem cells can differentiate into all specialized embryonic tissues. In adult organisms, stem and progenitor cells serve as the body's repair system, replenishing specialized cells and maintaining the normal turnover of regenerating organs, such as blood, skin or gastrointestinal tissues. Stem cells are also characterized by the ability to differentiate in vitro into functional cells of different cell lines of differentiation from several germ layers (endoderm, mesoderm and ectoderm) , as well as after transplantation, give rise to tissues originating from several germ layers and make a significant contribution to the formation of the majority if not all tissues after injection into blastocysts. According to the development potential, stem cells are classified as follows: 1) totipotent, i.e. capable of giving rise to all embryonic and extraembryonic cell types; 2) pluripotent, i.e. capable of giving rise to all embryonic cell types; 3) multipotent, i.e. capable of giving rise to a group of cell lines of differentiation within a particular tissue, organ or physiological system (e.g., hematopoietic stem cells (HSC) can produce offspring such as HSC (self-renewal) , oligopotent precursors limited to blood cells, comprising all types of cells and cell elements (such as platelets) , which are normal components of the blood) ; 4) oligopotent, i.e. capable of giving rise to a more limited set of cell lines of differentiation than multipotent stem cells; and 5) unipotent, i.e. capable of giving rise to a single cell line of differentiation (e.g., spermatogenic stem cells) .

[0060] As used herein, the term “embryonic stem cell” is used to refer to the pluripotent stem cells in the internal cell population of the blastocyst (U.S. Pat. No. 5,843,780; U.S. Pat. No. 6,200,806) checking. ) . Such cells can similarly be obtained from internal cell populations of blastocysts obtained from somatic cell nuclear transfer (e.g., U.S. Pat. Nos. 5,945,577; 5,994,619; U.S. Pat. 6,235,970) . Characteristics that distinguish embryonic stem cells define their phenotype. Thus, a cell has the phenotype of an embryonic stem cell if it has one or more of the unique characteristics of an embryonic stem cell. This allows the cell to be distinguished from other cells. Typical distinguishable features of embryonic stem cells include, but are not limited to, gene expression profile, proliferation potential, differentiation potential, karyotype, responsiveness to specific culture conditions, and the like.

[0061] As used herein, the term “editing” refers to changing a gene. Genome editing may include correcting or restoring a mutant gene. Genome editing may include knocking out a gene, such as a mutant gene or a normal gene. Genome editing may be used to treat disease by changing the gene of interest.

[0062] As used herein, the term “break” refers to the fracture of the covalent backbone of DNA molecular. The break as described herein can start by several different methods, including but not limited to endonuclease cutting, or enzyme hydrolysis or the chemical hydrolysis of phosphodiester bond. In specific embodiments, the term “single strand breaks (SSBs) ” refers to the phenomenon of a DNA molecule that breaks when one strand is cut. When only one of the two strands of the DNA double helix is defective, the other strand can be used as a template to guide the correction of the damaged strand. On the other hand, the term “double strand break (DSB) ” refers to the phenomenon when two single strands of a double stranded DNA molecule are cut at the same location. While double strand breaks can induce DNA repair, possibly resulting in genetic recombination, cells also have systems that act to cause double strand breaks at other times. Double strand breaks can occur periodically during the normal cellular replication cycle or can be enhanced under certain circumstances, such as ultraviolet light, and inducers of DNA breaks (e.g., various chemical inducers) . Many inducers can cause DSBs to occur indiscriminately in the genome, and DSBs can be regularly induced and repaired in normal cells. During the repair process, the original sequence can be reconstructed with full fidelity, but, in some cases, small insertions or deletions (called “indels” ) are introduced at the DSB site. In some cases, double strand breaks can also be specifically induced at specific sites, which can be used to induce targeted or preferential genetic modifications at selected chromosomal sites. In many cases, the tendency of homologous sequences to recombine easily during DNA repair (and replication) can be exploited, which is the basis for the application of gene editing systems such as CRISPR. This homology-directed repair is used to insert the target sequence in some specific cases, provided through the use of a "donor" polynucleotide, into the desired chromosomal location.

[0063] As used herein, the terms “regulatory elements” , “DNA regulatory sequences” and “control elements” are used interchangeably herein, and refer to transcriptional and translational control sequences, such as promoters, enhancers, polyadenylation signals, terminators, protein degradation signals, and the like, that provide for and / or regulate transcription of a non-coding sequence (e.g., DNA-targeting RNA) or a coding sequence (e.g., site-directed modifying polypeptide, or CRISPR / Cas polypeptide) and / or regulate translation of an encoded polypeptide.

[0064] As described herein, the term “control sequences” refers collectively to regulatory elements such as promoter sequences, polyadenylation signals, transcription termination sequences, upstream regulatory domains, origins of replication, internal ribosome entry sites ( “IRES” ) , enhancers, and the like, which collectively provide for the replication, transcription and translation of a coding sequence in a recipient cell. Not all of these control sequences need to be present. Transcriptional control signals in eukaryotes generally comprise “promoter” and “enhancer” elements. Promoters and enhancers consist of short arrays of DNA sequences that interact specifically with cellular proteins involved in transcription (Maniatis et al., Science 236: 1237 (1987) , incorporated herein by reference in its entirety) . Promoter and enhancer elements have been isolated from a variety of eukaryotic sources including genes in yeast, insect and mammalian cells and viruses (analogous control sequences, i.e., promoters, are also found in prokaryotes) . The selection of a particular promoter and enhancer depends on the recipient cell type. Some eukaryotic promoters and enhancers have a broad host range while others are functional in a limited subset of cell types (See e.g., Voss et al., Trends Biochem. Sci., 11: 287 (1986) ; and Maniatis et al., supra, for reviews, incorporated herein by reference in their entirety) . For example, the SV40 early gene enhancer is very active in a variety of cell types from many mammalian species and has been used to express proteins in a broad range of mammalian cells (Dijkema et al, EMBO J. 4: 761 (1985) , incorporated herein by reference in its entirety) . Promoter and enhancer elements derived from the human elongation factor 1-alpha gene (Uetsuki et al., J. Biol. Chem., 264: 5791 (1989) ; Kim et al., Gene 91: 217 (1990) ; and Mizushima and Nagata, Nucl. Acids. Res., 18: 5322 (1990) ) , the long terminal repeats of the Rous sarcoma virus (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79: 6777 (1982) , incorporated herein by reference in their entirety) , and the human cytomegalovirus (Boshart et al., Cell 41: 521 (1985) , incorporated herein by reference in their entirety) are also of utility for expression of proteins in diverse mammalian cell types. Promoters and enhancers can be found naturally, alone or together. For example, retroviral long terminal repeats comprise both promoter and enhancer elements. Generally, promoters and enhancers act independently of the gene being transcribed or translated. Thus, the enhancer and promoter used can be “endogenous, ” “exogenous, ” or “heterologous” with respect to the gene to which they are operably linked. An “endogenous” enhancer / promoter is one which is naturally linked with a given gene in the genome. An “exogenous” or “heterologous” enhancer or promoter is one which is placed in juxtaposition to a gene by means of genetic manipulation (i.e., molecular biological techniques) such that transcription of that gene is directed by the linked enhancer / promoter.

[0065] As used herein, the terms “nucleic acid endonuclease” and “nuclease” are used interchangeably herein, and refer to an enzyme which possesses catalytic activity for DNA cleavage. By “cleavage” it is meant the breakage of the covalent backbone of a DNA molecule. Both single-stranded cleavage and double-stranded cleavage are possible, and double-stranded cleavage can occur as a result of two distinct single-stranded cleavage events. DNA cleavage can result in the production of either blunt ends or staggered ends. In certain embodiments, a complex comprising a DNA-targeting RNA and a site-directed modifying polypeptide is used for targeted double-stranded DNA cleavage.

[0066] As used herein, the term “binding” refers to a non-covalent interaction between macromolecules (e.g., between a protein and a nucleic acid) . While in a state of non-covalent interaction, the macromolecules are said to be “associated” or “interacting” or “binding” (e.g., when a molecule X is said to interact with a molecule Y, it is meant the molecule X binds to molecule Y in a non-covalent manner) . Not all components of a binding interaction need to be sequence-specific (e.g., contacts with phosphate residues in a DNA backbone) , but some portions of a binding interaction may be sequence-specific. Binding interactions are generally characterized by a dissociation constant (Kd) of less than 10-6M, less than 10-7 M, less than 10-8 M, less than 10-9 M, less than 10-10 M, less than 10-11 M, less than 10-12 M, less than 10-13 M, less than 10-14 M, or less than 10-15M. An increased binding affinity is correlated with a lower Kd value.

[0067] As used herein, the terms “target sequence” , “target site” and “target protospacer DNA” are used interchangeably herein, and refer to a nucleic acid sequence present in a target DNA to which a DNA-targeting segment of a subject DNA-targeting RNA will bind, provided sufficient conditions for binding exist. Suitable DNA / RNA binding conditions include physiological conditions normally present in a cell. Other suitable DNA / RNA binding conditions (e.g., conditions in a cell-free system) are known in the art; see, e.g., Sambrook, supra. The strand of the target DNA that is complementary to and hybridizes with the DNA-targeting RNA is referred to as the “complementary strand” and the strand of the target DNA that is complementary to the “complementary strand” (and is therefore not complementary to the DNA-targeting RNA) is referred to as the “noncomplementary strand” or “non-complementary strand” .

[0068] As used herein, the terms “guide RNA” and “gRNA” are used interchangeably herein and refer to an RNA that is capable of forming a complex with a Cas effector protein and a target nucleic acid (e.g., double-stranded DNA) . The guide RNA may comprise a single RNA molecule or by two or more RNA molecules that bind to each other by hybridizing at complementary regions in the two or more RNA molecules. When used in conjunction with a dual RNA-guided Cas nuclease, such as Cas9, the guide RNA comprises crRNA and tracrRNA. When used in conjunction with a single RNA-guided Cas nuclease such as Cas12i, the guide RNA does not comprise tracrRNA or additional transactivating RNA. Also contemplated herein are precursor guide RNA arrays that can be processed into multiple crRNAs, and for certain CRISPR / Cas systems, the processed crRNAs are further combined with a tracrRNA or another transactivating RNA (e.g., scoutRNA) to guide a Cas effector protein. "crRNA" or "CRISPR RNA" comprises a guide sequence of sufficient complementarity to a target sequence of a target nucleic acid (e.g., double-stranded DNA) that directs sequence-specific binding of a CRISPR complex to the target nucleic acid. The "tracrRNA" or "transactivation CRISPR RNA" is partially complementary to and base-pairs with the crRNA and may play a role in the maturation of the crRNA. A "single guide RNA" or "sgRNA" is an engineered guide RNA having a crRNA and a tracrRNA fused to each other in a single molecule.

[0069] As used herein, the term “hybridizing” refers to the reaction of one or more polynucleotides to form a complex that is stabilized by hydrogen bonding between the bases of the nucleotide residues. Hydrogen bonding may occur by Watson-crick base pairing, hopgstein (Hoogstein) bonding, or in any other sequence specific manner. Sequences that are capable of hybridizing to a given sequence are referred to as “complements” of the given sequence.

[0070] As used herein, the term “differentiation” or “differentiating” refers to the process by which an unspecialized ( “uncommitted” ) or less specialized cell acquires the features of a specialized cell, for example a nerve cell or a muscle cell. A differentiated cell is one that has taken on a more specialized ( “committed” ) position within the lineage of a cell. The term “committed” , when applied to the process of differentiation, refers to a cell that has proceeded in the differentiation pathway to a point where, under normal circumstances, it will continue to differentiate into a specific cell type or subset of cell types, and cannot, under normal circumstances, differentiate into a different cell type or revert to a less differentiated cell type. As used herein, the lineage of a cell defines the heredity of the cell, i.e., which cells it came from and to what cells it can give rise. The lineage of a cell places the cell within a hereditary scheme of development and differentiation. A lineage-specific marker refers to a characteristic specifically associated with the phenotype of cells of a lineage of interest and can be used to assess the differentiation of an uncommitted cell to the lineage of interest.

[0071] As used herein, the term “differentiated” refers to any primary cell that is not pluripotent in its natural form. That is, the term “differentiated cells” when used in reference to cells made by methods of this invention from pluripotent stem cells refer to cells having reduced potential to differentiate when compared to the parent pluripotent stem cells. The differentiated cells of this invention comprise cells that could differentiate further (i.e., they may not be terminally differentiated) . Without wishing to be bound by theory, during the course of normal ontogeny, pluripotent stem cells can differentiate into endodermal cell types capable of forming pancreatic cells. Early endocrine cells are pancreatic islet precursors. The precursors can then be further differentiated into hormon-producing cells (e.g., functional endocrine cells) that secrete insulin, glucagon, somatostatin, or pancreatic polypeptide. Endodermal cells can also differentiate into other cells of endodermal origin, such as lung, liver, intestine, thymus, etc.

[0072] As used herein, the term “derived” or “derived from” “established from” or “differentiated from” when made in reference to any cell disclosed herein refers to a cell that was obtained from (e.g., isolated, purified, etc. ) a parent cell in a cell line, tissue (such as a dissociated embryo, or fluids using any manipulation, such as, without limitation, single cell isolation, cultured in vitro, treatment and / or mutagenesis using for example proteins, chemicals, radiation, infection with virus, transfection with DNA sequences, such as with a morphogen, etc., selection (such as by serial culture) of any cell that is contained in cultured parent cells. A derived cell can be selected from a mixed population by virtue of response to a growth factor, cytokine, selected progression of cytokine treatments, adhesiveness, lack of adhesiveness, sorting procedure, and the like.

[0073] As used herein, the term “beta cell (β cell) ” is a pancreatic endocrine cell capable of expressing insulin but not glucagon, somatostatin, ghrelin, and pancreatic polypeptides. In specific embodiments as described herein, said pancreatic endocrine cells are types of human pluripotent stem cell-derived islets (hPSC-islets) . Pancreatic endocrine cells express markers characteristic of β-cells such as insulin and the following transcription factors: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, ISL1, HNF3β, MAFA, and PAX6. It can be characterized by one. “Pancreatic endocrine cells” as used herein refer to cells capable of secretion at least one of the following hormones: insulin, glucagon, somatostatin, ghrelin, and pancreatic polypeptide. In addition to these hormones, markers characteristic of pancreatic endocrine cells including (but are not limited to) one or more of NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2, and PAX6.

[0074] As used herein, the term “cell population” refers to a group of at least two cells. In non-limiting examples, a cell population can include at least about 10, at least about 100, at least about 200, at least about 300, at least about 400, at least about 500, at least about 600, at least about 700, at least about 800, at least about 900, at least about 1000 cells. The population may be a pure population comprising one cell type. Alternatively, the population may comprise more than one cell type, for example a mixed cell population. For example, the term “population” may refer to a cell culture of more than one cell having the same identification characteristic, or may refer to a culture of more than one cell type having different identification characteristics, for example, a population in one context may be a subpopulation in another context. The term “subpopulation” means a subset of a cell culture or population, when used to describe certain cell types within a cell culture or cell population. By “a cell population of mature pancreatic β cells” as described herein, it means that said cell population mainly comprises the mature pancreatic β cells of the present disclosure, but not excluding the inclusion of other type of cells.

[0075] As used herein, the term “treating” , “treatment” and the like are used herein to generally mean obtaining a desired pharmacologic and / or physiologic effect. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or symptom thereof and / or may be therapeutic in terms of a partial or complete cure for a disease and / or adverse effect attributable to the disease. “Treating” as used herein covers any treatment of a disease or symptom in a mammal, and includes: 1) preventing the disease or symptom from occurring in a subject which may be predisposed to acquiring the disease or symptom but has not yet been diagnosed as having it; 2) inhibiting the disease or symptom, i.e., arresting its development; or 3) relieving the disease, i.e., causing regression of the disease. The therapeutic agent may be administered before, during or after the onset of disease or injury. The treatment of ongoing disease, where the treatment stabilizes or reduces the undesirable clinical symptoms of the patient, is of particular interest. Such treatment is desirably performed prior to complete loss of function in the affected tissues. The subject therapy will desirably be administered during the symptomatic stage of the disease, and in some cases after the symptomatic stage of the disease.

[0076] As use herein, the terms “subject” , “individual” and “patient” are used interchangeably herein for therapeutic purposes and refer to any animal classified as a mammal, including humans, domestic and farm animals, as well as zoos, gyms or pet animals such as dogs, horses, cats, cattle, and the like. In some embodiments, the subject is a human subject.

[0077] As used herein and in the appended claims, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. It should also be noted that the claims may be drafted to exclude any optional element. It is thus intended that such statements be regarded as antecedent basis for use of such exclusive terminology as “solely” , “only” and the like, or as limitations upon the use of “no” in connection with the recitation of claim elements.

[0078] As used herein, the term “and / or” in words such as “a and / or B” is intended to include both a and B; a or B; a (alone) ; and B (alone) . Likewise, as used herein, the term “and / or” in words such as “A, b and / or C” is intended to include each of the following embodiments: A, b and C; A, b or C; A or C; A or b; b or C; A and C; A and b; b and C; A (alone) ; b (alone) ; and C (alone) . II. Genome Editing

[0079] The present disclosure provides a method of preparing genetically modified human pluripotent stem cell (hPSC) in vitro, comprising providing hPSCs, and said modification comprises reducing or eliminating the expression or function of gene products of the PRKAR2B gene in said hPSC. In some embodiments, said modification comprises editing within or near said PRKAR2B gene or the regulatory element of said PRKAR2B gene of said hPSC, thereby reducing or eliminating the expression or function of the gene products of said PRKAR2B gene.

[0080] Gene editing can also be conducted using other nucleases engineered to target specific sequences. To date there are some major types of nucleases: meganucleases and their derivatives, zinc finger nucleases (ZFNs) , transcription activator like effector nucleases (TALENs) , and the other CRISPR / Cas families of nucleases represented by CRISPR-Cas9 nuclease. The different nuclease platforms each has its own distinct mode of action and targeting strategy, particularly as the specificity of ZFNs and TALENs is guided through protein-DNA interactions, while RNA-DNA interactions primarily guide Cas9 function. Cas9 cleavage also requires an adjacent motif, the PAM, which differs between different CRISPR systems. A number of other Cas9 orthologs target protospacer adjacent to alternative PAMs.

[0081] CRISPR endonucleases, such as Cas9, can be used in the methods of the present disclosure. However, the teachings described herein, such as therapeutic target sites, could be applied to other forms of endonucleases, such as ZFNs, TALENs, HEs, or MegaTALs, or using combinations of nucleases. However, in order to apply the teachings of the present disclosure to such endonucleases, one would need to, among other things, engineer proteins directed to the specific target sites. CRISPR Endonuclease System

[0082] Examples of methods of genome editing described herein include methods of using site-directed nucleases to cut deoxyribonucleic acid (DNA) at precise target locations in the genome, thereby creating single-strand or double-strand DNA breaks at particular locations within the genome. Site-directed polypeptides, such as a DNA endonuclease, can introduce double-strand breaks or single-strand breaks in nucleic acids, e.g., genomic DNA. The double-strand break can stimulate a cell's endogenous DNA-repair pathways (e.g., homology-dependent repair or non-homologous end joining or alternative non-homologous end joining (A-NHEJ) or microhomology-mediated end joining) . NHEJ can repair cleaved target nucleic acid without the need for a homologous template. This can sometimes result in small deletions or insertions (indels) in the target nucleic acid at the site of cleavage, and can lead to disruption or alteration of gene expression. HDR can occur when a homologous repair template, or donor, is available. The homologous donor template can comprise sequences that can be homologous to sequences flanking the target nucleic acid cleavage site. The sister chromatid can be used by the cell as the repair template. However, for the purposes of genome editing, the repair template can be supplied as an exogenous nucleic acid, such as a plasmid, duplex oligonucleotide, single-strand oligonucleotide, double-stranded oligonucleotide, or viral nucleic acid. With exogenous donor templates, an additional nucleic acid sequence (such as a transgene) or modification (such as a single or multiple base change or a deletion) can be introduced between the flanking regions of homology so that the additional or altered nucleic acid sequence also becomes incorporated into the target locus. MMEJ can result in a genetic outcome that is similar to NHEJ in that small deletions and insertions can occur at the cleavage site. MMEJ can make use of homologous sequences of a few base pairs flanking the cleavage site to drive a favored end-joining DNA repair outcome. In some instances, it may be possible to predict likely repair outcomes based on analysis of potential microhomologies in the nuclease target regions.

[0083] The modifications of the target DNA due to NHEJ and / or HDR can lead to, for example, mutations, deletions, alterations, integrations, gene correction, gene replacement, gene tagging, transgene insertion, nucleotide deletion, gene disruption, translocations and / or gene mutation. The processes of deleting genomic DNA and integrating non-native nucleic acid into genomic DNA are examples of genome editing.

[0084] In some embodiments, said DNA endonuclease could be a CRISPR / Cas protein. A CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) genomic locus can be found in the genomes of many prokaryotes (e.g., bacteria and archaea) . In prokaryotes, the CRISPR locus encodes products that function as a type of immune system to help defend the prokaryotes against foreign invaders, such as virus and phage. There are three stages of CRISPR locus function: integration of new sequences into the CRISPR locus, expression of CRISPR RNA (crRNA) , and silencing of foreign invader nucleic acid. Five types of CRISPR systems (e.g., Type I, Type II, Type III, Type U, and Type V) have been identified.

[0085] A CRISPR locus includes a number of short repeating sequences referred to as “repeats” . When expressed, the repeats can form secondary structures (e.g., hairpins) and / or comprise unstructured single-stranded sequences. The repeats usually occur in clusters and frequently diverge between species. The repeats are regularly interspaced with unique intervening sequences referred to as “spacers, ” resulting in a repeat-spacer-repeat locus architecture. The spacers are identical to or have high homology with known foreign invader sequences. A spacer-repeat unit encodes a crisprRNA (crRNA) , which is processed into a mature form of the spacer-repeat unit. A crRNA comprises a “seed” or spacer sequence that is involved in targeting a target nucleic acid (in the naturally occurring form in prokaryotes, the spacer sequence targets the foreign invader nucleic acid) . A spacer sequence is located at the 5’ or 3’ end of the crRNA. A CRISPR locus also comprises polynucleotide sequences encoding CRISPR Associated (Cas) genes. Cas genes encode endonucleases involved in the biogenesis and the interference stages of crRNA function in prokaryotes. Some Cas genes comprise homologous secondary and / or tertiary structures.

[0086] In some embodiments, said CRISPR / Cas protein is Cas12b. “Cas12b” , “Cas12b nuclease” , “Cas12b protein” , “C2C1” , “C2C1 nuclease” and “C2C1 protein” are used interchangeably herein to refer to an RNA-guided sequence-specific nuclease from a microbial CRISPR system. Cas12b is capable of targeting and cleaving a DNA target sequence under the direction of a guide RNA to form a DNA Double Strand Break (DSB) , also known as classical dsDNA cleavage activity. More importantly, the complex of Cas12b with the gRNA is able to activate its non-specific single-stranded DNA cleavage activity, also referred to as non-classical bypass ssDNA cleavage activity, upon recognition and binding of the corresponding target DNA sequence. The single-stranded DNA reporter molecule that produces a detectable signal upon cleavage, i.e., can reflect the presence and / or amount of target DNA, is cleaved using non-classical bypass ssDNA cleavage activity. Herein, a DNA molecule that is recognized and bound by a complex of Cas12b and a gRNA, activating the non-specific single-stranded DNA cleavage activity of Cas12b is also referred to as “activator” .

[0087] In some embodiments, the Cas12b protein is an AaCas12b protein from Alicyclobacillus acidophilus, an AkCas12b protein from Alicyclobacillus kakegawensis, an AmCas12b protein from Alicyclobacillus macroreticulatus, a BhCas12b protein from Bacillus hisshi, a BsCas12b protein from Bacillus, a Bs3Cas12b protein from Bacillus, a Disulfovibrio inopinatus Cas12b protein, a lacs Cas12b protein from lacyella sediminis, an SbCas12b protein from sporohae bacteria, a Cas12b protein from leptotus caliidus. In some preferred embodiments, the Cas12b protein is a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidophilus (AaCas12b) . The Cas12b proteins described herein can be used for genome editing in mammals, as well as for the nucleic acid detection methods of the invention.

[0088] In some preferred embodiments, the Cas12b protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the Cas12b protein comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the amino acid sequence of the Cas12b protein has one or more amino acid residue substitutions, deletions, or additions relative to SEQ ID NOs: 1. For example, the Cas12b protein has an amino acid sequence with 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acid residue substitutions, deletions, or additions relative to SEQ ID NOs: 1.Genome-Targeting Nucleic Acid

[0089] The present disclosure provides a genome-targeted nucleic acid that can direct the activity of a polypeptide of interest (e.g., a site-directed polypeptide) to a particular target sequence within a target nucleic acid. The genome-targeting nucleic acid may be RNA. The genomic targeting RNA is referred to herein as a “guide RNA” or “gRNA” . The guide RNA can comprise at least a spacer sequence that hybridizes to the target nucleic acid sequence of interest and the CRISPR repeat. The guide RNA typically consists of a crRNA and a tracrRNA molecule that are partially complementary to form a complex, wherein the crRNA comprises a sequence that is sufficiently identical to a target sequence to hybridize to a complementary sequence of the target sequence and direct the CRISPR complex (CRISPR nuclease + crRNA + tracrRNA) to bind to the target sequence in a sequence-specific manner. However, single guide RNA (sgRNA) may be designed and used, which contain both the characteristics of crRNA and tracrRNA. There are differences in gRNAs corresponding to different CRISPR endonucleases. For example, Cas9 and Cas12b typically require both crRNA and tracrRNA, however, Cas12a (Cpf1) requires only crRNA.

[0090] The gRNA is capable of specifically recognizing the target sequence. For example, in some embodiments (the target nucleic acid molecule is a double-stranded DNA) , the gRNA comprises a spacer sequence (spacer) that is capable of specifically hybridizing to a complementary sequence of the target sequence. In some embodiments (the target nucleic acid molecule is a single-stranded DNA) , the gRNA comprises a spacer sequence capable of specifically hybridizing to a target sequence. The single molecule guide RNA (sgRNA) in a type V system can comprise a minimal CRISPR repeat and spacer sequence in the 5’ to 3’ direction. In some embodiments, the sgRNA consists of a scaffold sequence at the 5’ end and a spacer sequence at the 3’ end. The spacer sequence may specifically hybridize to the target sequence or to the complement of the target sequence. The spacer sequence is typically 18 to 35 nucleotides in length, preferably 20 nucleotides. Exemplary gRNAs include the spacer sequence of SEQ ID NOs: 2-12 in the sequence listing. As understood by one of ordinary skill in the art, each guide RNA can be designed to include a spacer sequence complementary to its genomic target sequence. For example, each of the spacer sequences in SEQ ID NOs: 2-12 of the sequence listing can be placed into a single RNA chimera or crRNA (and corresponding tracrRNA) . See Jinek et al, Science 337, 816-821 (2012) and Deltcheva et al, Nature 471, 602-607 (2011) .

[0091] In some embodiments, the percent complementarity between the spacer sequence and the target nucleic acid is at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 65%, at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%, or 100%. In some embodiments, the percent complementarity between the spacer sequence and the target nucleic acid is at most about 30%, at most about 40%, at most about 50%, at most about 60%, at most about 65%, at most about 70%, at most about 75%, at most about 80%, at most about 85%, at most about 90%, at most about 95%, at most about 97%, at most about 98%, at most about 99%, or 100%. In some embodiments, the percent complementarity between the spacer sequence and the target nucleic acid is 100%relative to the six consecutive 5’ -most nucleotides of the target sequence of the complementary strand of the target nucleic acid. The percent complementarity between the spacer sequence and the target nucleic acid can be at least 60%relative to about 20 consecutive nucleotides. The spacer sequence and the target nucleic acid can differ in length by 1 to 6 nucleotides, which can be considered as one or more bulges (bulges) . The selection of various target regions provided herein for generating DSBs is designed to induce cleavage or deletion that result in modulation or inactivation of transcriptional control protein activity, as well as the selection of specific target sequences within such regions designed to minimize off-target events relative to on-target events.

[0092] In some embodiments, the gRNA is produced by in vitro transcription. In some embodiments, the gRNA is produced by chemical synthesis. In some embodiments, the gRNA is expressed by plasmids transfected into targeted cells. For example, the gRNA provided herein is constructed within pUC19-gRNA plasmids, sequences of which as described in SEQ ID NOs: 13-23.Zinc Finger Nucleases

[0093] Zinc finger nucleases (ZFNs) are modular proteins comprised of an engineered zinc finger DNA binding domain linked to the catalytic domain of the type II endonuclease FokI. Because FokI functions only as a dimer, a pair of ZFNs must be engineered to bind to cognate target “half-site” sequences on opposite DNA strands and with precise spacing between them to enable the catalytically active FokI dimer to form. Upon dimerization of the FokI domain, which itself has no sequence specificity per se, a DNA double-strand break is generated between the ZFN half-sites as the initiating step in genome editing.

[0094] The DNA binding domain of each ZFN is typically comprised of 3-6 zinc fingers of the abundant Cys2-His2 architecture, with each finger primarily recognizing a triplet of nucleotides on one strand of the target DNA sequence, although cross-strand interaction with a fourth nucleotide also can be important. Alteration of the amino acids of a finger in positions that make key contacts with the DNA alters the sequence specificity of a given finger. Thus, a four-finger zinc finger protein will selectively recognize a 12 bp target sequence, where the target sequence is a composite of the triplet preferences contributed by each finger, although triplet preference can be influenced to varying degrees by neighboring fingers. An important aspect of ZFNs is that they can be readily re-targeted to almost any genomic address simply by modifying individual fingers, although considerable expertise is required to do this well. In most applications of ZFNs, proteins of 4-6 fingers are used, recognizing 12-18 bp respectively. Hence, a pair of ZFNs will typically recognize a combined target sequence of 24-36 bp, not including the typical 5-7 bp spacer between half-sites. The binding sites can be separated further with larger spacers, including 15-17 bp. A target sequence of this length is likely to be unique in the human genome, assuming repetitive sequences or gene homologs are excluded during the design process. Nevertheless, the ZFN protein-DNA interactions are not absolute in their specificity so off-target binding and cleavage events do occur, either as a heterodimer between the two ZFNs, or as a homodimer of one or the other of the ZFNs. The latter possibility has been effectively eliminated by engineering the dimerization interface of the FokI domain to create “plus” and “minus” variants, also known as obligate heterodimer variants, which can only dimerize with each other, and not with themselves. Forcing the obligate heterodimer prevents formation of the homodimer. This has greatly enhanced specificity of ZFNs, as well as any other nuclease that adopts these FokI variants.

[0095] A variety of ZFN-based systems have been described in the art, modifications thereof are regularly reported, and numerous references describe rules and parameters that are used to guide the design of ZFNs; see, e.g., Segal et al., Proc Natl Acad Sci USA 96 (6) : 2758-63 (1999) ; Dreier B et al., J Mol Biol. 303 (4) : 489-502 (2000) ; Liu Q et al., J Biol Chem. 277 (6) : 3850-6 (2002) ; Dreier et al., J Biol Chem 280 (42) : 35588-97 (2005) ; and Dreier et al., J Biol Chem. 276 (31) : 29466-78 (2001) .Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs)

[0096] TALENs represent another format of modular nucleases whereby, as with ZFNs, an engineered DNA binding domain is linked to the FokI nuclease domain, and a pair of TALENs operate in tandem to achieve targeted DNA cleavage. The major difference from ZFNs is the nature of the DNA binding domain and the associated target DNA sequence recognition properties. The TALEN DNA binding domain derives from TALE proteins, which were originally described in the plant bacterial pathogen Xanthomonas sp. TALEs are comprised of tandem arrays of 33-35 amino acid repeats, with each repeat recognizing a single base pair in the target DNA sequence that is typically up to 20 bp in length, giving a total target sequence length of up to 40 bp. Nucleotide specificity of each repeat is determined by the repeat variable diresidue (RVD) , which includes just two amino acids at positions 12 and 13. The bases guanine, adenine, cytosine and thymine are predominantly recognized by the four RVDs: Asn-Asn, Asn-Ile, His-Asp and Asn-Gly, respectively. This constitutes a much simpler recognition code than for zinc fingers, and thus represents an advantage over the latter for nuclease design. Nevertheless, as with ZFNs, the protein-DNA interactions of TALENs are not absolute in their specificity, and TALENs have also benefitted from the use of obligate heterodimer variants of the FokI domain to reduce off-target activity.

[0097] Additional variants of the FokI domain have been created that are deactivated in their catalytic function. If one half of either a TALEN or a ZFN pair contains an inactive FokI domain, then only single-strand DNA cleavage (nicking) will occur at the target site, rather than a DSB. The outcome is comparable to the use of CRISPR / Cas9 / Cpf1 “nickase” mutants in which one of the Cas9 cleavage domains has been deactivated. DNA nicks can be used to drive genome editing by HDR, but at lower efficiency than with a DSB. The main benefit is that off-target nicks are quickly and accurately repaired, unlike the DSB, which is prone to NHEJ-mediated mis-repair.

[0098] A variety of TALEN-based systems have been described in the art, and modifications thereof are regularly reported; see, e.g., Boch, Science 326 (5959) : 1509-12 (2009) ; Mak et al., Science 335 (6069) : 716-9 (2012) ; and Moscou et al., Science 326 (5959) : 1501 (2009) . The use of TALENs based on the “Golden Gate” platform, or cloning scheme, has been described by multiple groups; see, e.g., Cermak et al., Nucleic Acids Res. 39 (12) : e82 (2011) ; Li et al., Nucleic Acids Res. 39 (14) : 6315-25 (2011) ; Weber et al., PLoS One. 6 (2) : e16765 (2011) ; Wang et al., J Genet Genomics 41 (6) : 339-47, Epub 2014 May 17 (2014) ; and Cermak T et al., Methods Mol Biol. 1239: 133-59 (2015) .Homing Endonucleases

[0099] Homing endonucleases (HEs) are sequence-specific endonucleases that have long recognition sequences (14-44 base pairs) and cleave DNA with high specificity-often at sites unique in the genome. There are at least six known families of HEs as classified by their structure, including LAGLIDADG, GIY-YIG, His-Cis box, H-N-H, PD- (D / E) xK, and Vsr-like that are derived from a broad range of hosts, including eukarya, protists, bacteria, archaea, cyanobacteria and phage. As with ZFNs and TALENs, HEs can be used to create a DSB at a target locus as the initial step in genome editing. In addition, some natural and engineered HEs cut only a single strand of DNA, thereby functioning as site-specific nickases. The large target sequence of HEs and the specificity that they offer have made them attractive candidates to create site-specific DSBs.

[0100] A variety of HE-based systems have been described in the art, and modifications thereof are regularly reported; see, e.g., the reviews by Steentoft et al., Glycobiology 24 (8) : 663-80 (2014) ; Belfort and Bonocora, Methods Mol Biol. 1123: 1-26 (2014) ; Hafez and Hausner, Genome 55 (8) : 553-69 (2012) ; and references cited therein.MegaTAL / Tev-mTALEN / MegaTev

[0101] As further examples of hybrid nucleases, the MegaTAL platform and Tev-mTALEN platform use a fusion of TALE DNA binding domains and catalytically active HEs, taking advantage of both the tunable DNA binding and specificity of the TALE, as well as the cleavage sequence specificity of the HE; see, e.g., Boissel et al., NAR 42: 2591-2601 (2014) ; Kleinstiver et al., G3 4: 1155-65 (2014) ; and Boissel and Scharenberg, Methods Mol. Biol. 1239: 171-96 (2015) .

[0102] In a further variation, the MegaTev architecture is the fusion of a meganuclease (Mega) with the nuclease domain derived from the GIY-YIG homing endonuclease I-Tevl (Tev) . The two active sites are positioned ～30 bp apart on a DNA substrate and generate two DSBs with non-compatible cohesive ends; see, e.g., Wolfs et al., NAR 42, 8816-29 (2014) . It is anticipated that other combinations of existing nuclease-based approaches will evolve and be useful in achieving the targeted genome modifications described herein.

[0103] As further example, fusion of the TALE DNA binding domain to a catalytically active HE, such as I-Tevl, takes advantage of both the tunable DNA binding and specificity of the TALE, as well as the cleavage sequence specificity of I-Tevl, with the expectation that off-target cleavage can be further reduced.

[0104] The above descriptions of the various gene editing methods are merely intended to elucidate the inventive concept of the present application and exemplary alternative embodiments capable of conducting the inventive concept, and do not constitute a limitation on the scope of the inventions applied to be protected in the present application. III. Delivery

[0105] The guide RNA polynucleotide (RNA or DNA) and / or endonuclease polynucleotide (RNA or DNA) can be delivered by viral vectors or non-viral delivery methods known in the art such as electroporation, mechanical force, cell deformation, and cell penetrating peptides. Alternatively, the endonuclease polypeptide can be delivered by viral or non-viral delivery vehicles known in the art, such as electroporation or lipid nanoparticles. In a further alternative aspect, the DNA endonuclease can be delivered as one or more polypeptides alone or pre-complexed with one or more single guide RNAs, or one or more crRNAs and tracrRNAs.

[0106] Electroporation is a delivery technique in which an electric field is applied to one or more cells to increase the permeability of the cell membrane, which allows for the introduction of substances such as low molecular weight molecules, nucleic acids (genome-targeted nucleic acids) , proteins (site-directed polypeptides) , or RNPs into the cells.

[0107] Polynucleotides can be delivered by non-viral vectors including, but not limited to, nanoparticles, liposomes, ribonucleoproteins, positively charged peptides, small molecule RNA conjugates, aptamer-RNA chimeras, and RNA fusion protein complexes. Some exemplary non-viral delivery vectors are described in Peer and Lieberman, Gene Therapy, 18: 1127-1133 (2011) , specifically for non-viral siRNA delivery, which may also be used to deliver other polynucleotides.

[0108] Polynucleotides such as guide RNAs, sgRNAs, and mRNA encoding endonucleases can be delivered to cells or patients by Lipid Nanoparticles (LNPs) .

[0109] LNP refers to any particle with a diameter of less than 1,000 nm, 500 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm or 25 nm. Alternatively, the nanoparticles may range in size from 1 nm to 1,000 nm, 1 nm to 500 nm, 1 nm to 250 nm, 25 nm to 200 nm, 25 nm to 100 nm, 35 nm to 75 nm, or 25 nm to 60 nm.

[0110] LNPs can be made from cationic, anionic or neutral lipids. Neutral lipids such as the fusogenic phospholipid DOPE or the membrane component cholesterol may be included in the LNP as "helper lipids" to enhance transfection activity and nanoparticle stability. Limitations of cationic lipids include low efficiency due to poor stability and rapid clearance, as well as the generation of inflammatory or anti-inflammatory responses.

[0111] LNPs can also be composed of hydrophobic lipids, hydrophilic lipids, or both hydrophobic and hydrophilic lipids.

[0112] Any lipid or combination of lipids known in the art can be used to produce LNPs. Examples of lipids used to produce LNPs are: DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE, DC-cholesterol, DOTAP-cholesterol, GAP-DMORIE-DPyPE and GL 67A-DOPE-DMPE-polyethylene glycol (PEG) . Examples of cationic lipids are: 98N12-5, C12-200, DLin-KC2-DMA (KC2) , DLin-MC3-DMA (MC3) , XTC, MD1 and 7C 1. Examples of neutral lipids are: DPSC, DPPC, POPC, DOPE, and SM. Examples of PEG-modified lipids are: PEG-DMG, PEG-CerC14 and PEG-CerC 20.

[0113] The lipids can be combined in any number of molar ratios to produce LNP. In addition, one or more polynucleotides can be combined with one or more lipids in a wide range of molar ratios to produce LNPs.

[0114] As previously described, the site-directed polypeptide and the genomic targeting nucleic acid can each be administered separately to a cell or patient. In another aspect, the site-directed polypeptide may be pre-complexed with one or more single guide RNAs, or one or more crRNAs and tracrRNAs. The pre-compounded material may then be applied to a cell or patient. Such pre-composites are called ribonucleoprotein particles (RNPs) .

[0115] RNA is capable of forming specific interactions with RNA or DNA. Although this property is exploited in many biological processes, it also carries the risk of promiscuous interactions in a nucleic acid-rich cellular environment. One solution to this problem is to form RNPs in which RNA is pre-complexed with an endonuclease. Another benefit of RNPs is the protection of RNA from degradation.

[0116] Endonucleases in RNPs can be modified or unmodified. Likewise, the gRNA, crRNA, tracrRNA, or sgRNA may be modified or unmodified. Many modifications are known in the art and may be used.

[0117] Endonucleases and sgRNAs can generally be combined in a molar ratio of 1: 1. Alternatively, the endonuclease, crRNA and tracrRNA may be combined, typically in a molar ratio of 1: 1: 1. However, a wide range of molar ratios can be used to generate RNPs.

[0118] Recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors can be used for delivery. Techniques for producing rAAV particles are standard in the art, wherein an AAV genome to be packaged, comprising the polynucleotide to be delivered, rep and cap genes, and helper viral functions, is provided into a cell. Production of rAAV typically requires the following components to be present within a single cell (denoted herein as a packaging cell) : rAAV genome, AAV rep and cap genes separate from (i.e., not in) the rAAV genome, and helper virus functions. The AAV rep and cap genes can be from any AAV serotype from which recombinant viruses are available, and can be from an AAV serotype other than the rAAV genome ITR, including, but not limited to, AAV serotypes AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, and AAV rh. 74. The production of pseudotyped rAAV is disclosed, for example, in international patent application publication WO 01 / 83692. AAV vector serotypes can be matched to target cell types. In addition to adeno-associated viral vectors, other viral vectors can be used. Such viral vectors include, but are not limited to, lentiviruses, alphaviruses, enteroviruses, pestiviruses, baculoviruses, herpesviruses, epstein-barr virus, papovaviruses, poxviruses, vaccinia viruses, and herpes simplex viruses. IV. Differentiation of the human pluripotent stem cells (hPSC) Sources of pluripotent stem cells and characterization of differentiation process

[0119] Any pluripotent stem cells as described herein may be used in the methods of the invention. Pluripotent stem cells are able to give rise to all cell types of the organism. There are two sources for human pluripotent stem cells, the embryonic stem cells (ESCs) derived from surplus blastocysts created for in vitro fertilization and the induced pluripotent stem cells (iPSCs) generated by reprogramming of the somatic cells.

[0120] Cells taken from a pluripotent stem cell population already cultured in the absence of feeder cells are also suitable sources of cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) , or reprogrammed pluripotent cells, derived from adult somatic cells using forced expression of a number of pluripotent related transcription factors, such as OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, and ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet 2011, 12: 165-185; see also IPS, Cell, 126 (4) : 663-676) may also be used. ESCs can be purchased from commercially available sources. The human embryonic stem cells (hESCs) used in the methods of the invention may also be prepared as described by Thomson et al. (U.S. Pat. No. 5,843,780; Science, 1998, 282: 1145-1147; Curr Top Dev Biol 1998, 38: 133-165; Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1995, 92: 7844-7848) . Mutant human embryonic stem cell lines, such as, BG01v (BresaGen, Athens, Ga. ) , or cells derived from adult human somatic cells, such as, cells disclosed in Takahashi et al., Cell 131: 1-12 (2007) may also be used. In certain embodiments, hESCs are derived from embryos that never undergo in vivo development and are less than 14 days after fertilization. In certain embodiments, pluripotent stem cells suitable for use in the present invention may be derived according to the methods described in: Li et al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009) , Maherali et al. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007) , Stadtfeld et al. (Cell Stem Cell 2: 230-240) , Nakagawa et al. (Nature Biotechnol 26: 101-106, 2008) , Takahashi et al. (Cell 131: 861-872, 2007) , and U.S. Patent App. Pub. No. 2011 / 0104805. In certain embodiments, pluripotent stem cells suitable for use in the present invention may be considered and derived according to the methods described in: Gafni et al. (Nature, 504: 282, 2013) and Ware et al. (PNAS, 111: 4484-4489, 2014) . All of the above references, patents, and patent applications are herein incorporated by reference in their entirety, in particular, as they pertain to the isolation, culture, expansion and differentiation of pluripotent cells.

[0121] Other sources of pluripotent stem cells include induced pluripotent stem cells (IPS, Cell, 126(4) : 663-676) . Yet other sources of suitable cells include human umbilical cord tissue-derived cells, human amniotic fluid-derived cells, human placental-derived cells, and human parthenotes. In an embodiment, the umbilical cord tissue-derived cells may be obtained by the method of the U.S. Pat. No. 7,510,873. In another embodiment, the placental tissue-derived cells may be obtained using the methods of the U.S. Patent App. Pub. No. 2005 / 0058631. In another embodiment, the amniotic fluid-derived cells may be obtained using the methods of the U.S. Patent App. Pub. No. 2007 / 0122903. The disclosure of each of these patent applications is incorporated in its entirety herein as it pertains to the isolation and characterization of the cells. In certain embodiments, the pluripotent stem cells may be of non-embryonic origins.

[0122] In attempts to replicate the differentiation of pluripotent stem cells into functional pancreatic endocrine cells in static in vitro cell cultures, the differentiation process is often viewed as progressing through a number of consecutive stages. In particular, the differentiation process is commonly viewed as progressing through multiple stages. In this step-wise differentiation, Stage 1 refers to the first step in the differentiation process, the differentiation of pluripotent stem cells into cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm (Stage 1 cells) . Stage 2 refers to the second step of the differentiation of cells expressing markers characteristic of the definitive endoderm cells into cells expressing markers characteristic of the gut tube cells (Stage 2 cells) . Stage 3 refers to the third step of the differentiation of cells expressing markers characteristic of gut tube cells into cells expressing markers characteristic of the pancreatic foregut precursor cells (Stage 3 cells) . Stage 4 refers to the fourth step of the differentiation of cells expressing markers characteristic of the pancreatic foregut precursor cells into cells expressing markers characteristic of one or both of the pancreatic endoderm cells and the pancreatic endocrine precursor cells (collectively referred to as Stage 4 cells or, alternatively, the pancreatic endoderm / endocrine precursor cells) . Stage 5 refers to the fifth step of the differentiation of cells expressing markers characteristic of the pancreatic endoderm / endocrine precursor cells into cells expressing markers characteristic of the pancreatic endocrine cells that are immature beta cell (Stage 5 cells) . Stage 5 cells express insulin and are PDX1, NKX6.1 and chromogranin positive. A final step to produce the populations of and cells of the invention is referred to as Stage 6, during which stage the immature beta cells are differentiated to express markers characteristic of the pancreatic endocrine cells that are maturing beta cells with a more matured beta cell phenotype of insulin +, NKX6.1+, and PDX1+.

[0123] It is to be noted that not all cells in a particular population progress through these stages at the same rate. Consequently, it is not uncommon in in vitro cell cultures to detect the presence of cells that have progressed less, or more, down the differentiation pathways than the majority of the cells present in the population, particularly at the later differentiation stages. For example, it is not uncommon to see the appearance of markers characteristic of the pancreatic endocrine cells during the culture of cells at Stage 5. For purposes of illustrating the performance resulting from the present invention, characteristics of the various cell types associated with the above-identified stages are described in the following examples. Examples

[0124] The following examples are set forth so as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present invention, and are not intended to limit the scope of what the inventors regard as their invention nor are they intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (e.g., amounts, temperature, etc. ) but some experimental errors and deviations should be accounted for. Unless indicated otherwise, parts are parts by weight, molecular weight is weight average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or near atmospheric. Standard abbreviations may be used, e.g., bp, base pair (s) ; kb, kilobase (s) ; pl, picoliter (s) ; s or sec, second (s) ; min, minute (s) ; h or hr, hour (s) ; aa, amino acid (s) ; nt, nucleotide (s) ; i.m., intramuscular (ly) ; i.p., intraperitoneal (ly) ; s.c., subcutaneous (ly) ; and the like.Example 1. Genetically modified human pluripotent stem cells (hPSCs) lead to functional improvements of the derived SC-islets

[0125] Co-transfection of a Cas12bMax expression plasmid and a sgRNA expression plasmid into the hPSCs was employed to screen and identify gRNAs efficiently targeting the Exon 1 of PRKAR2B to knockout its expression. The gRNA targeting sequences are identified as SEQ ID NOs: 2-12 and their locations are shown in FIG. 1A. Based on the T7E1 cleavage data shown in FIG. 1B, K4 (i.e., gRNA4) was identified to be one of the most efficient gRNA. NGS-based deep sequencing confirmed that electroporation of Cas12bMax and K4 plasmids (600 ng: 600 ng) to hPSCs produced high rate of indels within exon1 at the PRKAR2B gene locus (FIG. 1C) , which would lead to efficient KO of the PRKAR2B gene expression.

[0126] To evaluate the effects of KO of PRAKR2B gene expression by K4 gRNA, hPSCs were directed toward mature β-cells in vitro based on the protocol shown in FIG 2A, following co-electroporation with Cas12bMax and K4-gRNA plasmids. Our differentiated cells sequentially expressed the endoderm marker, CXCR4 / CD184 on day 3, and the pancreatic β-cell markers, PDX1 and NKX6.1 on day 14, as determined by flow cytometry analysis (FIG. 2B) . Notably, we observed significantly elevated β-islet key markers at the mRNA levels in the K4 edited-hPSC-derived islets, compared to those from the unedited hPSCs (FIG. 2C) . In addition, we observed increased cell density at early stages (from day 0 to day 8) and expanded average cluster diameter at late stages (from day 8 to day 28) , indicating the PRAKR2B gene KO led to an overall better cell fitness in the culture for islet differentiation in vitro (FIG. 3A and FIG. 3B) .

[0127] A static GSIS assay was performed to assess the key features of sc-islet to produce insulin. We tested the K4-edited sc-islets on day 16 and day 30 respectively with a protocol of sequential challenges of low glucose (2 mM) , high glucose (20 mM) and KCL depolarization. The mature sc-islets (collected on day 30) showed a normal insulin-secretion pattern in response to the above-mentioned sequential challenges, while the progenitors collected on day 16 failed to respond to KCL challenge (FIG. 4A) . We also conducted another independent GSIS test to compare the insulin secretion function of the K4-edited sc-islets with the unedited sc-islets. The stimulation index, as calculated by the ratio of insulin secreted in high glucose (20 mM) to low glucose (2 mM) , was used to assess the glucose sensitivity of insulin secretion. The total insulin and proinsulin content in the sc-islet lysate was also analyzed. We observed the edited islets outperformed the unedited islets in both aspects of the β-cell function analysis (FIG. 4B) .

[0128] We separated and generated an PRKAR2B- / -hPSC line from the cell pool electroporated with Cas12bMax and K4 expression plasmids. Deep sequencing data revealed biallelic frameshift mutations occurred in the targeted site of PRKAR2B locus (FIG. 5A) . Representative Western blot confirmed the editing disrupted PRKAR2B expression in the PRKAR2B- / -hPSC line (FIG. 5B) .

[0129] To further determine the effect of disrupting PRKAR2B expression in sc-islets, we assessed the ability of PRKAR2B- / -sc-islet to reverse hyperglycemia in diabetic NSG mice. In the period of the experiment, PRKAR2B- / -sc-islet transplanted mice showed relatively lower blood glucose value than those with unedited grafts (FIG. 6. Once blood glucose levels were normalized in both unedited and PRKAR2B- / -groups, we conducted oral glucose tolerance test (OGTT) combined with in vivo glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) test to evaluate function of engrafted sc-islets (Fig. 7A) . PRKAR2B- / -sc-islets demonstrated improved ability of glucose clearance and increased glucose-responsive insulin releasing compared with the unedited counterparts (Fig. 7A&7B) .Materials and methods Cell culture and directed differentiation

[0130] Undifferentiated hESC lines were cultured in Vitronectin (Gibco) supplemented with Essential 8 (Gibco) media in a 37℃ incubator, with 5%CO2, and 100%humidity. Cells were passaged every 3 to 5 days using ReLeSR (STEMCELL Technologies) .

[0131] Using the previously published protocols to direct SC-islet differentiation (Pagliuca, F. W., et al., Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell, 2014.159 (2) : p. 428-39. ) as shown in FIG. 2A. For initiation of differentiation, the unedited ES and PRKAR2B edited ES (K4 mixture) cells were dispersed to single-cells with Accutase (Sigma) and seeded at 6 x 105 cells / mL in a 30-mL spinner flask. Cells were then cultured in Essential 8 (Gibco) media + 10 μM Y27632 (STEMCELL Technologies) . The media was changed every 24 hrs and the differentiation was initiated 48 hrs after the cells were seeded. Media changes were as follows: Stage 1 DE: Day 1: S1 + 100 ng / ml ActivinA (R&D Systems) + 3 μM Chir99021 (Selleck) ; Day 2: S1 + 100 ng / ml ActivinA. Stage 2 PGT: Days 4 and 6: S2 + 50 ng / ml KGF (Peprotech) . Stage 3 PP1: Days 7 and 8: S3 + 50 ng / ml KGF + 0.25 μM Sant1 (Sigma) + 2 μM RA (Sigma) + 200 nM LDN193189 (only Day 7) (Selleck) + 500 nM PdBU (Sigma) . Stage 4 PP2: Days 9 and 11, 13: S3 + 50 ng / ml KGF +0.25 μM Sant1 + 100 nM RA. Stage 5 EN: Days 14 and 16: S5 + 0.25 μM Sant1 + 100 nM RA +1 μM XXI (Sigma) + 10 μM Alk5i II (Axxora) + 1 μM T3 (Sigma) + 20 ng / ml Betacellulin (R&D Systems) ; Days 18 and 20: S5 + 25 nM RA + 1 μM XXI + 10 μM Alk5i II + 1 μM T3 + 20 ng / ml Betacellulin. Stage 6 Days 21–35 (medium change every other day) : S6 + 10 μM Alk5i II + 1 μM T3. In the final stage, cells were analyzed between days 28 and 35. Cell growth measurement

[0132] 1 mL of the cell cluster samples was collected at several time points during the differentiation process. The outer diameter of the cell clusters was measured using the imaging software PixelBooks (NIKON) . The collected clusters were dissociated with TrypLE Express into single cells and the number of cells were measured. Gene editing in hPSCs with plasmid electroporation

[0133] hPSCs were electroporated using the Lonza 4D-Nucleofector (Lonza) with the P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit (Lonza, V4XP-3032) , following the manufacturer’s instructions. Plasmids were extracted with the Endo-free Plasmid Mini Kit II (Omega, D6950-01) . 600 ng of the pUC19-gRNA plasmid and 600 ng of the pCAG-Cas12bMax plasmid were pre-mixed and electroporated using program CA137. The electroporated hPSCs were cultured in the E8 medium supplemented with Y27632 for 24 hrs and then transferred to the E8 medium without Y27632. T7E1 enzyme cleavage assay

[0134] The electroporated hPSCs were harvested and lysed at room temperature and used the Sample Lysis Kit (Vazyme, P073) for genome extraction. The genomic region surrounding the CRISPR-Cas12b target site was PCR-amplified and 10 μL of the PCR products was subjected to re-annealing process (denatured at 95℃ and slowly cooled to the room temperature) to enable heteroduplex formation. After re-annealing, the products were treated with 1 μL of NEBufferTM 2.1 and 0.5 μL of T7EI (NEB) at 37℃ for 30 min, and analyzed on 2%agarose gels. The cleaved products were separated by gel electrophoresis and analyzed with software ImageJ. Indel frequency measured by the next generation sequencing (NGS)

[0135] The hPSC and sc-islet genomic DNA was extracted using a Mouse Tail DNA Extraction kit (Beyotime, D7283M) . The target region was amplified with the Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme, P525-03) using a two-step protocol. PCR products were subjected to NGS. Sequencing data were imported to the CRISPR RGEN Tools Cas-Analyzer online software for indel frequency measurement and indel pattern identification with 70 bp decomposition window. RT-qPCR Quantification

[0136] Total RNA of the hPSCs was isolated with the FastPure Cell / Tissue Total RNA Isolation Kit V2 (Vazyme, RC112-01) , followed by reverse transcription with the HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme, R212-01) . RT-qPCR was performed with the AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Q511-02) . Measurement of key marker expression with flow cytometry

[0137] The differentiated cell clusters or islets were dispersed into single-cell suspension by incubation in the TrypLE Express at 37℃. For measurement of the surface markers, cells were subjected to FACS analysis, following staining with antibodies of the human CD184 (conjugated with PE, BD Pharmingen) . For intracellular markers, the in vitro differentiated cells were fixed with 4%paraformaldehyde for 10 min and then permeabilized with 0.1%Triton X-100 for 5 min at room temperature. Subsequently, cells were stained with antibodies of the human PDX1 or NKX6.1 (conjugated with PE, BD Pharmingen) for 30 min in the dark. Cells were washed twice to remove the unbound antibody before FACS analysis. In vitro glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) and insulin measurement

[0138] The in vitro differentiated hPSCs (day 16 or day 30 after differentiation) were sampled. Clusters were washed with the Krebs (Krb) buffer and then preincubated in low (2 mM) glucose Krb for 1 hour to remove the residual insulin. The clusters were then washed two more times in the Krb, incubated in the low-glucose Krb for 60 min, and the supernatants collected. Then the clusters were washed two times in the Krb, incubated in high glucose Krb for 60 min, and the supernatants collected. Finally, the clusters were incubated in Krb containing 2 mM glucose and 30 mM KCl (depolarization challenge) for 60 min and then the supernatants collected. The clusters were then dispersed into single cells using the TrypLE Express (Life Technologies) , and the cell number was counted automatically by a Countstar cell analyzer. The supernatant samples containing the secreted insulin were processed using the Human Ultrasensitive Insulin ELISA kit (ALPCO Diagnostics) .

[0139] The total protein of the differentiated hPSCs was extracted with an acid-ethanol lysate solution, and the proinsulin and insulin levels were measured using the human Ultrasensitive Insulin ELISA kit. Western blot analysis

[0140] Sc-islet clusters were digested by TrypLE and resuspended in a RIPA lysis buffer to collect soluble proteins. Protein concentration was determined by a BCA (bicinchoninic acid assay) assay. Protein was heated in SDS buffer to denature, followed by SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) at 120V. Protein Transferring was subjected in a Tris-Glycine buffer at 100V and PVDF membrane was probed with Rabbit Anti-human PRKAR2B (BD Biosciences, 610625) . Transplantation of sc-islets into kidney capsule of immunodeficient mice

[0141] Hyperglycemia was induced in 8-week-old male NVG mice by a 5-day consecutive i. p. injection of 45 mg / kg streptozotocin (STZ) (Millipore-Sigma, S0130) . Mice with random blood glucose (RBG) > 27.7 mmol / L were subjected to sc-islet transplantation into the left kidney capsule. RBG and body weight were monitored weekly after STZ modeling. OGTT and In vivo GSIS

[0142] Hyperglycemia reversal was defined as the average RBG falling below 11.1 mmol / L. Once hyperglycemia reversal occurred in both PRKAR2B- / -and unedited groups, the mice were subjected to an OGTT combined with an in vivo GSIS test. After overnight fasting, mice were orally administrated with a dose (2.5 g / kg) of 50%glucose solution. The blood glucose level was measured at 0, 15, 30, 60, 90 and 120 minutes after the glucose administration. The levels of insulin in the peripheral blood were measured at 0, 15, 30 and 60 minutes with an Ultrasensitive Insulin ELISA Kit (ALPCO Diagnostics, 80-INSHUU-E01.1) .

[0143] While preferred embodiments of the present invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. It is not intended that the invention be limited by the specific examples provided within the specification. While the invention has been described with reference to the aforementioned specification, the descriptions and illustrations of the embodiments herein are not meant to be construed in a limiting sense. Numerous variations, changes, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the invention. Furthermore, it shall be understood that all aspects of the invention are not limited to the specific depictions, configurations or relative proportions set forth herein which depend upon a variety of conditions and variables. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed in practicing the invention. It is therefore contemplated that the invention shall also cover any such alternatives, modifications, variations or equivalents. It is intended that the following claims define the scope of the invention and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.

Claims

1.A method of preparing genetically modified human pluripotent stem cell (hPSC) in vitro, comprising providing hPSCs, with said modification comprising reducing or eliminating the expression or function of the gene products of PRKAR2B gene in said hPSCs.2.The method according to claim 1, wherein said modification comprises editing within or near said PRKAR2B gene or the regulatory element of said PRKAR2B gene of said hPSCs, thereby reducing or eliminating the expression or function of the gene product of said PRKAR2B gene.3.The method according to claim 1 or 2, wherein said hPSCs are human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and / or human embryonic stem cells (hESCs) .4.The method according to claim 2 or 3, wherein said editing is capable of generating one or more single strand breaks (SSBs) or double strand breaks (DSBs) within or near said PRKAR2B gene or said regulatory element of the PRKAR2B gene.5.The method according to claim 4, wherein said one or more single strand breaks (SSBs) or double strand breaks (DSBs) result in the cleavage, deletion, modulation or inactivation of the transcriptional control sequence or exonic region of said PRKAR2B gene.6.The method according to any one of claims 1-5, wherein said method comprises subjecting said hPSCs to at least one nucleic acid endonuclease.7.The method according to claim 6, wherein said at least one nucleic acid endonuclease is capable of binding one or more target sequences within or near said PRKAR2B gene or said regulatory element of the PRKAR2B gene.8.The method according to claim 7, wherein said at least one nucleic acid endonuclease binds said target sequence via a single guide RNA molecule.9.The method according to claim 8, wherein said guide RNA molecule is capable of specifically recognizing said target sequence and hybridizing to it.10.The method according to claim 8 or 9, wherein said method further comprises providing one or more of said single guide RNA molecules.11.The method according to any one of claims 8-10, wherein said nucleic acid endonuclease and said single guide RNA molecule are contained in the same or different plasmids.12.The method according to any one of claims 6-11, wherein said at least one nucleic acid endonuclease is a CRISPR / Cas protein.13.The method according to claim 12, said CRISPR / Cas protein is Cas12b.14.The method according to claim 12 or 13, said CRISPR / Cas protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.15.The method according to any one of claims 7-14, said target sequence is located in one or more exonic regions of said PRKAR2B gene.16.The method according to any one of claims 7-15, wherein said target sequence comprises the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NO: 2-12.17.The method according to any one of claims 8-16, wherein said method further comprises providing said single guide RNA molecule comprising one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 13-23.18.The method according to any one of claims 1-17, the hPSCs prepared by said method are capable of differentiating to form hPSCs-derived functional pancreatic beta-cells.19.A method of enhancing the function of human pluripotent stem cell (hPSC) -derived pancreatic beta-cells, comprising:1) providing the genetically modified hPSCs prepared by the method of any one of claims 1-18, and2) inducing directed differentiation of said hPSCs of 1) into pancreatic beta-cells.20.A genetically modified human pluripotent stem cell (hPSC) generated by the method of any one of claims 1-18.21.A cell population comprising the genetically modified human pluripotent stem cells (hPSCs) generated by the method of any one of claims 1-18.22.A pancreatic beta-cell differentiated from the genetically modified human pluripotent stem cell (hPSC) of claim 20 or the cell population of claim 21, or generated by the method of claim 19.23.A cell population of pancreatic beta-cells differentiated from the genetically modified human pluripotent stem cell (hPSC) of claim 20 or the cell population of claim 21, or generated by the method of claim 19.24.A pharmaceutical composition, comprising the pancreatic beta-cell of claim 22 or the cell population of pancreatic beta-cells of claim 23, and a pharmaceutically acceptable excipient.25.A kit, comprising the pancreatic beta-cell of claim 22, the cell population of pancreatic beta-cells of claim 23, or the pharmaceutical composition of claim 24.26.A method of treating type 1 diabetes and / or type 2 diabetes, wherein said method comprises providing to a patient in need thereof the pancreatic beta-cell of claim 22, the cell population of pancreatic beta-cells of claim 23, the pharmaceutical composition of claim 24, or the kit of claim 25.

Images