Antibodies against integrin and uses thereof

Abstract

Provided herein are anti-integrin ανβ6 antibodies, ADCs comprising the anti-integrin ανβ6 antibody and the preparation method thereof, nucleic acids encoding and methods for preparing the anti-integrin ανβ6 antibodies, and the use of the antibodies and ADCs in a variety of diseases.

Description

ANTIBODIES AGAINST INTEGRIN AND USES THEREOF

[0001] REFERENCE TO A SEQUENCE LISTING

[0002] The present application is being filed along with a Sequence Listing in ST. 26 XML format. The Sequence Listing is provided as a file titled “31298_WO” created 24-April-2025 and is 11 kilobytes in size. The Sequence Listing information in the ST. 26 XML format is incorporated herein by reference in its entirety.FIELD

[0003] This application generally relates to antibodies and antibody-drug conjugates (ADCs) . More specifically, the application relates to monoclonal antibodies against ανβ6, antibody-drug conjugates thereof, a method of preparing the same, and the use of the antibodies and conjugates thereof.BACKGROUND

[0004] The integrins are a large family of membrane-associated proteins with diverse roles in cellular adhesion and motility. Each consists of an α-subunit and a β-subunit, of which there are 18 and 8 variants, respectively, creating the 24 known heterodimers. Integrin β6, a component of the heterodimeric adhesion receptor ανβ6, dimerizes exclusively with isoform αν by non-covalent bonding. While except for β6, integrin αν could dimerize with β1, β3, β5, or β8 [1] . Integrin β6 is poorly expressed or completely absent in the healthy adult tissue epithelia, whereas it is up-regulated specifically during tissue repair, carcinogenesis, and embryogenesis. Integrin ανβ6 plays an important role in tumor pathogenesis and invasiveness, and has been correlated with poor outcomes [2] . Integrin ανβ6 is overexpressed in multiple solid tumors, including pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, bladder cancer, gastric cancer, colorectal cancer and cervical cancer [3] .

[0005] Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most aggressive malignancies with 5-year survival rate less than 5%, which accounts for 80%to 90%of all pancreatic cancer cases [4] . Prognosis and treatment options for PDAC is poor and limited. Currently, chemotherapy and surgery are still the main treatment options for PDAC. However, only 20%of patients were eligible for surgery at the time of diagnosis.

[0006] Lung cancer is the most common cancer and is the leading cause of cancer death [5] . Head and neck cell carcinoma including lip, oral cavity cancer, nasopharynx cancer, oropharynx cancer, hypopharynx cancer and salivary gland cancer, accounting for 3.84%of all new cancer cases in 2022 and also cause 3.86%of all cancer death globally [6] . Therefore, there is a need for improved treatments for these cancers.

[0007] On the other hand, antibody-drug conjugates (ADCs) for treatment of various cancers have been developed, such as Sigvotatug Vedotin (SGN-B6A) , an investigational ADC directed to integrin β6. SGN-B6A showed promising antitumor efficacy in the phase I clinical study in patients with advanced solid tumor (NCT04389632) [7] . Now, it is under Phase III clinical development in previously treated NSCLC patients (NCT06012435) [8] .

[0008] However, there remains a need to develop novel antibodies and ADCs specifically targeting integrin ανβ6, especially antibodies with good internalization ability for the development of a remarkable ADCs.SUMMARY

[0009] The present disclosure provides monoclonal antibodies that specifically bind to ανβ6 and conjugates thereof. Also provided are methods for treatment and diagnosis of conditions associated with ανβ6 expression as well as for detecting ανβ6.

[0010] In one aspect, the disclosure provides an antibody or antigen-binding portion thereof that binds to integrin ανβ6, comprising:

[0011] a heavy chain CDR (HCDR) 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;

[0012] a HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;

[0013] a HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;

[0014] a light chain CDR (LCDR) 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;

[0015] a LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; and

[0016] a LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

[0017] The integrin ανβ6 may be from human, cynomolgus monkey, mouse or rat. The antibody may be in isolated, purified, synthetic or recombinant form. The antibody may be multivalent (e.g., bivalent) or monovalent.

[0018] In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof comprises:

[0019] (A) a heavy chain variable region (VH) : (i) comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 7; or (ii) comprising an amino acid sequence at least 85%, 90%, or 95% (for example, at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%) identical to SEQ ID NO: 7;and / or

[0020] (B) a light chain variable region (VL) : (i) comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 8; or (ii) comprising an amino acid sequence at least 85%, at least 90%, or 95%(for example, at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%) identical to SEQ ID NO:8.

[0021] In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof as disclosed herein comprises one or more substitutions, additions, and / or deletions of amino acids in the framework regions, e.g. FRW1, FRW2, FRW3, and / or FRW4 of a variable region (e.g., VH or VL) . In some embodiments, FRW1 at the N terminal and / or FRW4 at the C terminal of the variable region is truncated, e.g. truncated by no more than 5, 4, 3, 2, or 1 amino acid (s) .

[0022] In some embodiments, the antibody further comprises a human IgG constant region, such as a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 constant region. The human IgG constant region may be a human IgG1 constant region or a variant thereof, such as a human IgG1 Fc region with L234A and L235A substitutions.

[0023] In some embodiments, the antibody is a murine antibody, a chimeric antibody or a humanized antibody.

[0024] In one aspect, the disclosure provides a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding the heavy chain variable region and / or the light chain variable region of the antibody or antigen-binding portion thereof as disclosed herein.

[0025] In one aspect, the disclosure provides a vector comprising the nucleic acid molecule as disclosed herein. In one aspect, the disclosure provides a host cell comprising the vector or the nucleic acid molecule.

[0026] In one aspect, the disclosure provides a method for producing the antibody or antigen-binding portion thereof comprising the steps of:

[0027] -culturing a host cell comprising an expression vector (s) encoding the antibody or antigen-binding portion thereof under suitable conditions; and

[0028] -harvesting the antibody or antigen-binding portion thereof from the cell culture.

[0029] In one aspect, the disclosure provides a fusion molecule comprising the antibody or antigen-binding portion thereof as defined herein and a heterologous moiety. The heterologous moiety may be a detectable moiety, a half-life extending moiety or a polypeptide with a different function.

[0030] In one aspect, the disclosure provides an antibody-drug conjugate (ADC) , comprising the antibody or antigen-binding portion thereof as disclosed herein conjugated to a drug moiety (ies) .

[0031] In some embodiments, the drug moiety comprises one or more types of cytotoxic agents or cytostatic agents. The cytotoxic agent or cytostatic agent may be selected from a toxin, a chemotherapeutic agent, an antibiotic, a radioactive isotope and a nucleolytic enzyme.

[0032] In some embodiments, the cytotoxic agent is selected from maytansinoids, dolastatins, dolostatin peptidic analogs and derivatives thereof, such as auristatins, calicheamicin, trichothecene and Rachelmycin (CC-1065) , optionally the cytotoxic agent is selected from MMAE, DM1, DM3, DM4 and MMAF.

[0033] In some embodiments, the ADC has the formula Ab- (L-D) p, wherein Ab is the antibody or antigen-binding portion thereof, L is a linker, D is the drug moiety, and p is a integer from 1 to 20. For example, the ADC has the formula Ab- (L-MMAE) p, wherein p ranges from 1 to 8.

[0034] In some embodiments, the linker is peptide linker (such as a val-cit linker, a phe-lys linker) , a hydrazone linker, or a disulfide linker.

[0035] In some embodiments, the linker is a cleavable linker. For example, the linker is cleavable by a protease, such as lysosomal protease, membrane associated protease, intracellular protease or endosomal protease.

[0036] In some embodiments, the linker is attached to the antibody through a thiol group on the antibody.

[0037] In some embodiments, the linker is selected from 6-maleimidocaproyl (MC) , maleimidopropanoyl (MP) , valine-citrulline (val-cit) , alanine-phenylalanine (ala-phe) , p-aminobenzyloxycarbonyl (PAB) , N-Succinimidyl 4- (2-pyridylthio) pentanoate (SPP) , N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate (SMCC) , N-Succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate (SIAB) , and 6-maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenyloxycarbonyl (MC-vc-PAB) .

[0038] In some embodiments, the ADC is highly homogeneous with the formula Ab- (L-D) p, wherein p is 4. For example, the homogeneous ADC has the formula Ab- (L-MMAE) p, wherein p is 4. Specifically, the ADCs as disclosed herein may be prepared by a method comprising the following steps:

[0039] (a) incubating a reductant and the anti-ανβ6 antibody in the presence of an effective amount of metal ions such as transition metal ions and divalent metal ions in a buffer system to selectively reduce inter-chain disulfide bonds within the antibody;

[0040] (b) introducing an excess amount of a linker-drug moiety (e.g. MC-MMAF) to react with reduced thiol groups resulted from step (a) ; and

[0041] (c) recovering the resultant antibody-drug conjugate.

[0042] In one aspect, the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding portion thereof or the ADC, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0043] In one aspect, the disclosure provides a method of modulating a ανβ6 related immune response in a subject, comprising administering to the subject the antibody or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition as disclosed herein such that an immune response is modulated in the subject.

[0044] In one aspect, the disclosure provides a method for treating or preventing a disease associated with ανβ6 in a subject, comprising administering an effective amount of the antibody or antigen-binding portion thereof or the pharmaceutical composition as disclosed herein to the subject.

[0045] In some embodiments, the disease is a fibrotic disease or a cancer which is ανβ6 positive or overexpressed.

[0046] In some embodiments, the cancer is selected from lung cancer (e.g. NSCLC) , pancreatic cancer (e.g. PDAC) , head and neck cancer (including cancers of the lip, oral cavity, nasal cavity, paranasal sinuses, pharynx, and larynx) , skin cancer, uterine cancer, breast cancer (including triple negative breast cancer) , bladder cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, stomach cancer, and liver cancer.

[0047] In one aspect, the disclosure provides use of the antibody or antigen-binding portion thereof in the manufacture of a medicament for diagnosing, preventing or treating a disease associated with ανβ6.

[0048] In one aspect, the disclosure provides the antibody or antigen-binding portion thereof for use in treating or preventing a disease associated with ανβ6.

[0049] In one aspect, the disclosure provides a kit, comprising a container comprising the antibody or antigen-binding portion thereof or the ADC.

[0050] The foregoing is a summary and thus contains, by necessity, simplifications, generalizations, and omissions of detail; consequently, those skilled in the art will appreciate that the summary is illustrative only and is not intended to be in any way limiting.

[0051] BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0052] Figure 1 shows binding of antibodies to human, cynomolgus monkey, rat and mouse Integrin ανβ6 measured by ELISA.

[0053] Figure 2 shows binding of antibodies to other heterodimers of Integrin αν, namely ανβ1, ανβ3, ανβ5 and ανβ8. W3XX126-cAb1 (Anti-αν) , W3XX126-cAb3 and W3XX126-cAb4 are positive control antibodies.

[0054] Figures 3 shows binding of antibodies to human and cynomolgus monkey Integrin ανβ6 engineered cells and un-engineered cells, measured by FACS.

[0055] Figure 4 shows binding of antibodies to tumor cells HCC70 and HPAF-II measured by FACS.

[0056] Figure 5 shows antibody internalization result in HPAF-II tumor Cells.

[0057] Figure 6 shows antibody blocking assay for LAP-Integrin ανβ6 binding. The positive control antibody W3XX126-cAb1 inhibits the binding of LAP to Integrin ανβ6.

[0058] Figure 7 shows the competition binding result between the W301126 antibody and W3XX126-BMK2.

[0059] Figures 8 shows in vitro cytotoxicity of ADCs to various tumor cells, including HCC70, HPAF-II, NCI-H322, BxPC-3, HCC827 and A549.

[0060] Figure 9 shows in vivo anti-tumor efficacy of ADCs in cell derived xenograft models of pancreatic cancer (e.g. PDAC) , head and neck cancer (e.g. pharynx cancer) and bladder cancer.

[0061] Figure 10 shows PK study result in mouse indicating the half-life of antibodies in serum measured and calculated by two different methods.DETAILED DESCRIPTION

[0062] While the present disclosure may be embodied in many different forms, disclosed herein are specific illustrative embodiments thereof that exemplify the principles of the disclosure. It should be emphasized that the present disclosure is not limited to the specific embodiments illustrated. Moreover, any section headings used herein are for organizational purposes only and are not to be construed as limiting the subject matter described.

[0063] Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present disclosure shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. Further, unless otherwise required by context, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular. More specifically, as used in this specification and the appended claims, the singular forms “a, ” “an” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “a protein” includes a plurality of proteins; reference to “a cell” includes mixtures of cells, and the like. In this application, the use of “or” means “and / or” unless stated otherwise. Furthermore, the use of the term “comprising, ” as well as other forms, such as “comprises" and “comprised” , is not limiting. In addition, ranges provided in the specification and appended claims include both end points and all points between the end points.

[0064] Generally, nomenclature used in connection with, and techniques of, cell and tissue culture, molecular biology, immunology, microbiology, genetics and protein and nucleic acid chemistry and hybridization described herein are well known and commonly used in the art. The methods and techniques of the present disclosure are generally performed according to conventional methods well known in the art and as described in various general and more specific references that are cited and discussed throughout the present specification unless otherwise indicated. See, e.g., Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th ed., W.B. Saunders Company (2010) ; Sambrook J. &Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2000) ; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John &Sons, Inc. (2002) ; Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998) ; and Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John &Sons, Inc. (2003) . The nomenclature used in connection with, and the laboratory procedures and techniques of, analytical chemistry, synthetic organic chemistry, and medicinal and pharmaceutical chemistry described herein are well known and commonly used in the art.

[0065] Definitions

[0066] In order to better understand the disclosure, the definitions and explanations of the relevant terms are provided as follows.

[0067] The term “antibody” (e.g. anti-ανβ6 antibody) is used herein in the broadest sense and encompass any form of antibody that exhibits the desired biological or binding activity. It covers, but is not limited to, humanized antibodies, fully human antibodies, murine and chimeric antibodies, single-domain antibodies (sdAbs, comprising just one chain, which is typically similar to a heavy chain) , as well as fragments of any of the foregoing as long as they exhibit the desired antigen-binding activity. A conventional antibody comprises a heavy chain (s) and a light chain (s) . Heavy chains may be classified into μ, δ, γ, α and ε, which define isotypes of an antibody as IgM, IgD, IgG, IgA and IgE, respectively. A heavy chain can comprise a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) . A heavy chain can comprise one or more constant regions, for example, 3 constant regions (CH1, CH2 and CH3) . A light chain can comprise a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . A VH and a VL region can further be divided into hypervariable regions (called complementary determining regions (CDRs) ) , which are interspaced by relatively conservative regions (called framework regions (FRW) ) . A VH and a VL can comprise 3 CDRs (Complementarity determining regions) and 4 FRs (Framework regions) in the following order: FRW1, CDR1, FRW2, CDR2, FRW3, CDR3, FRW4 from N-terminal to C-terminal. Antibodies can be of different antibody isotypes, for example, IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 subtype) , IgA1, IgA2, IgD, IgE or IgM antibody.

[0068] As used herein, the term “integrin ανβ6” or “ανβ6” is a transmembrane receptor composed of non-covalently linked integrin αν and β6 subunits, where the β6 subunit partners exclusively with αν. αvβ6 is an epithelial-specific integrin that is a receptor for the extracellular matrix (ECM) proteins fibronectin, vitronectin, tenascin and the latency associated peptide (LAP) of TGF-β. ανβ6 has been reported as a regulator of metastasis and is found to be overexpressed in many cancer phenotypes. ανβ6 is often concentrated in poorly differentiated tumours proximal to invading cancer margins. It has also been identified as an important factor in the “epithelial to mesenchymal transition” (EMT) that is characterized by loss of cell adhesion, repression of E-cadherin and increased cell motility during carcinoma progression. Integrin ανβ6 is thought to operate in a complex manner, initiating cell signaling cascades whilst also interacting with key extracellular matrix (ECM) proteins and activating growth signals such as latent transforming growth factor β1 (TGF-β1) , a recognized inducer of EMT. Integrin αν subunit is also known as ITGAV, CD51, MSK8, VNRA, VTNR, vitronectin receptor, or integrin subunit alpha V. Integrin β6 subunit is also known as ITGB6, Al1H, or integrin subunit beta 6. An exemplary amino acid sequence of human integrin αν protein is provided in Uniprot Accession No. P06756-1. An exemplary amino acid sequence of human integrin β6 protein is provided in  Accession No. NP_000879.2.

[0069] As used herein, the term “Fc region” refers to C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including, for example, native sequence Fc regions, recombinant Fc regions, and variant Fc regions. Although the boundaries of the Fc region of an immunoglobulin heavy chain might vary, the human IgG heavy chain Fc region is often defined to stretch from an amino acid residue at position Cys226 or Pro230 (according to the EU numbering system) , to the carboxyl-terminus thereof. The C-terminal lysine (residue 447 according to the EU numbering system) of the Fc region may be removed, for example, during production or purification of the antibody, or by recombinantly engineering the nucleic acid encoding a heavy chain of the antibody. A functional Fc region possesses an effector function of a native sequence Fc region. Exemplary effector functions include C1q binding; complement dependent cytotoxicity (CDC) ; Fc receptor binding; antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) ; phagocytosis; down regulation of cell surface receptors (e.g., B cell receptor; BCR) , etc. Such effector functions generally require the Fc region to be combined with a binding region or binding domain (e.g., an antibody variable region or domain) and can be assessed using various assays.

[0070] The term “chimeric antibody” , as used herein, refers to an antibody in which the variable region sequences are derived from one species and the constant region sequences are derived from another species, such as an antibody in which the variable region sequences are derived from non-human germline and the constant region sequences are derived from human. The murine antibodies as disclosed herein with non-human IgG constant regions may be IgG converted to obtain chimeric antibodies.

[0071] The term “humanized antibody” , as used herein, refers to antibodies in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species, such as a mouse, llama or alpaca, have been grafted onto human framework sequences. Additional modifications such as back mutations may be made within the human framework sequences, and the CDR sequences may be optimized to remove post-translation modification.

[0072] The term “binding affinity” is herein used as a measure of the strength of a non-covalent interaction between two molecules, e.g., an antibody or antigen-portion thereof, and an antigen. Binding affinity between two molecules may be quantified by determination of the dissociation equilibrium constant (KD) . KD can be determined by measurement of the kinetics of complex formation and dissociation using, as a nonlimiting example, the surface plasmon resonance (SPR) method (BiacoreTM) . The rate constants corresponding to the association and the dissociation of a monovalent complex are referred to as the association rate constants ka (or kon) and dissociation rate constant kd (or koff) , respectively. KD is related to ka and kd through the equation KD = kd / ka or koff / kon. The binding kinetics and binding affinity of the antibody also can be assessed by standard assays known in the art or as described in the Example section below.

[0073] The term “EC50” , as used herein, is also termed as “half maximal effective concentration” and refers to the concentration of a drug, antibody or toxicant which induces a response halfway between the baseline and maximum after a specified exposure time.

[0074] The term “epitope” , as used herein, refers to a portion of an antigen that an immunoglobulin or antibody specifically binds to. “Epitope” is also known as “antigenic determinant” . Epitope or antigenic determinant generally comprises chemically active surface groups of a molecule such as amino acids, carbohydrates or sugar side chains, and generally has a specific three-dimensional structure and a specific charge characteristic. For example, an epitope generally comprises at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 consecutive or non-consecutive amino acids in a unique steric conformation, which may be “linear” or “conformational” . See, for example, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996) . In a linear epitope, all the interaction sites between a protein and an interaction molecule (e.g., an antibody) are present linearly along the primary amino acid sequence of the protein. In a conformational epitope, the interaction sites span over amino acid residues that are separate from each other in a protein. Antibodies may be screened depending on competitiveness of binding to the same epitope by conventional techniques known by a person skilled in the art. For example, studies on competition or cross-competition may be conducted to obtain antibodies that compete or cross-compete with each other for binding to antigens.

[0075] “Antibody-drug conjugate” or ADC as used herein refers to a conjugate formed by covalently coupling a drug to an antibody directly or indirectly via one or more suitable linkers. ADC is generally in a format of antibody-linker-drug conjugate. The Antibody-drug conjugates combine ideal properties of both antibodies and cytotoxic drugs (or those of other properties) by targeting potent cytotoxic (or other) drugs to the antigen-expressing tumor cells (or other cells / organs) , thereby enhancing their anti-tumor (or other medicinal) activity. ADCs are designed with the intention to discriminate between healthy cells and diseased tissue such as tumor cells in a tumor.

[0076] The term “drug” or “payload” as used herein refers to any cytotoxic molecule in the ADC which has for example, an antitumor effect, anti-infection or anti-inflammation effect, and has at least one substituted group or a partial structure allowing connection to a linker structure. The drug may kill cells (e.g. cancer cells) and / or inhibit growth, proliferation, or metastasis of cells (e.g. cancer cells) , thereby reducing, alleviating, or eliminating one or more symptoms of a disease or disorder (e.g. cancer) .

[0077] As used herein, the term “linker” with respect to ADC refers to a reactive molecule which contains at least two reactive groups, one of which can covalently bond a drug molecule and the other of which can covalently couple to an antibody.

[0078] The term “vector” , as used herein, refers to a nucleic acid vehicle which can have a polynucleotide inserted therein. When the vector allows for the expression of the protein encoded by the polynucleotide inserted therein, the vector is called an expression vector. The vector can have carried genetic material elements expressed in a host cell by transformation, transduction, or transfection into the host cell. Vectors are well known by a person skilled in the art, including, but not limited to plasmids, phages, cosmids, artificial chromosome such as yeast artificial chromosome (YAC) , bacterial artificial chromosome (BAC) or P1-derived artificial chromosome (PAC) ; phage such as λ phage or M13 phage and animal virus. The animal viruses that can be used as vectors, include, but are not limited to, retrovirus (including lentivirus) , adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus (such as herpes simplex virus) , pox virus, baculovirus, papillomavirus, papova virus (such as SV40) . A vector may comprise multiple elements for controlling expression, including, but not limited to, a promoter sequence, a transcription initiation sequence, an enhancer sequence, a selection element and a reporter gene. In addition, a vector may comprise an origin of replication.

[0079] The term “host cell” , as used herein, refers to a cell into which a vector can be introduced, including, but not limited to, a prokaryotic cell such as E. coli or Bacillus subtilis, a fungal cell such as yeast cell or Aspergillus, an insect cell such as S2 Drosophila cell or Sf9, and an animal cell such as fibroblast, CHO cell, COS cell, NSO cell, HeLa cell, BHK cell, HEK 293 cell or human cell.

[0080] The term “sequence identity” , as used herein, refers to a relationship between the sequences of two or more polypeptide molecules or two or more nucleic acid molecules, as determined by aligning and comparing the sequences. “Percent identity” means the percent of identical residues between the amino acids or nucleotides in the compared molecules and is calculated based on the size of the smallest of the molecules being compared. For these calculations, gaps in alignments (if any) are preferably addressed by a particular mathematical model or computer program (e.g., an “algorithm” ) .

[0081] The term “subject” as used herein includes any human or nonhuman animal, preferably humans.

[0082] The term “a condition associated with ανβ6” or “a condition related to ανβ6” , as used herein, refers to any condition that is caused by, exacerbated by, or otherwise linked to increased or decreased (generally increased) expression or activities of ανβ6 (e.g. a human ανβ6) .

[0083] The term “cancer” , as used herein, refers to any tumor or any malignant cell growth or proliferation, primary or metastasis-mediated, including solid tumors and non-solid tumors such as leukemia.

[0084] The term “treatment” , “treating” or “treated” , as used herein in the context of treating a condition, pertains generally to treatment or therapy, whether of a human or an animal, in which some desired therapeutic effect is achieved, for example, inhibition of the progress of a condition, and includes a reduction in the rate of progress, a halt in the rate of progress, regression of the condition, amelioration of the condition, and cure of the condition. Treatment as a prophylactic measure (e.g., prophylaxis, prevention) is also included. For cancer, “treating” may refer to a dampening or slowing of a tumor or malignant cell growth, proliferation, or metastasis, or some combination thereof. For tumors, “treatment” includes removal of all or part of a tumor, inhibiting or slowing tumor growth and metastasis, preventing or delaying the development of a tumor, or some combination thereof.

[0085] The term “therapeutically-effective amount, ” as used herein, pertains to that amount of an active compound, or a material, composition or dosage from comprising an active compound, which is effective for producing some desired therapeutic effect, commensurate with a reasonable benefit / risk ratio, when administered in accordance with a desired treatment regimen. For example, a “therapeutically-effective amount” of anti-ανβ6 antibody or ADC refers to an amount or concentration effective to treat a human ανβ6-related disease or condition.

[0086] The term “pharmaceutically acceptable” , as used herein, means that the vehicle, diluent, excipient and / or salts thereof, are chemically and / or physically compatible with other ingredients in the formulation, and physiologically compatible with the recipient.

[0087] As used herein, the term “a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient” refers to a carrier and / or excipient pharmacologically and / or physiologically compatible with a subject and an active agent, which is well known in the art (see, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) , and includes, but is not limited to pH adjuster, surfactant, adjuvant and ionic strength enhancer. For example, the pH adjuster includes, but is not limited to, phosphate buffer; the surfactant includes, but is not limited to, cationic, anionic, or non-ionic surfactant, e.g., Tween-80; the ionic strength enhancer includes, but is not limited to, sodium chloride.

[0088] I. Anti-integrin ανβ6 antibodies

[0089] The αν integrins (ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, and ανβ8) have the capability to bind and activate the pro-fibrotic cytokine transforming growth factor-β (TGFβ) and have been implicated in various fibrotic diseases and cancers. Blocking αν integrins can potentially reduce the downstream effects of TGFβ signaling. While the αν subunit can form a heterodimer with a variety of β subunits (βl, β3, β5, β6 and β8) , the β6 subunit can only be expressed as a heterodimer with the αν subunit. The extracellular and cytoplasmic domains of the β6 subunit mediate different cellular activities: the extracellular and transmembrane domains have been shown to mediate TGF-b activation and adhesion; whereas the cytoplasmic domain of the β6 subunit contains a unique 11-amino acid sequence that is important in mediating ανβ6 regulated cell proliferation, MMP production, migration, and promotes survival.

[0090] In some aspects, the disclosure provides an antibody or antigen-binding portion thereof capable of binding integrin ανβ6 (such as human, mouse, rat or cyno integrin ανβ6) with sufficient affinity. The antibodies include but are not limited to, synthetic antibodies, monoclonal antibodies, recombinantly produced antibodies, monospecific antibodies, multispecific antibodies (including bispecific antibodies) , human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, intrabodies, single-chain Fvs (scFv) , camelized antibodies, Fab fragments, F (ab’ ) fragments, disulfide-linked Fvs (sdFv) , anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, and epitope-binding fragments of any of the above. The antigen-binding portion of the antibody may be and not limited to, a Fab, a Fab’ , a F (ab’ ) 2, a single chain variable fragment (scFv) , or a diabody.

[0091] In some embodiments, the anti-ανβ6 antibody as disclosed herein are murine antibodies produced in mice immunized with a ανβ6 antigen. In some embodiments, the anti-ανβ6 antibody as disclosed herein are chimeric antibodies obtained by combining variable regions from murine anti-ανβ6 antibodies with human IgG (e.g. human IgG1) constant regions. In some embodiments, the anti-ανβ6 antibody as disclosed herein are humanized antibodies obtained by grafting the CDRs of murine anti-ανβ6 antibodies into human germline template of VH and VL domains. Some amino acid residues in the framework regions of the humanized antibodies may also have been back mutated.

[0092] Various methods for humanizing non-human antibodies are known in the art. For example, a humanized antibody can have one or more amino acid residues introduced into it from a source that is non-human. These non-human amino acid residues are often referred to as “import” residues, which are typically taken from an “import” variable domain. Humanized antibodies that bind ανβ6 may be produced using techniques known to those skilled in the art (e.g., Zhang et al., Molecular Immunology, 42 (12) : 1445-1451, 2005; Hwang et al., Methods, 36 (1) : 35-42, 2005; Dall’Acqua et al., Methods, 36 (1) : 43-60, 2005; Clark, Immunology Today, 21 (8) : 397-402, 2000, and U.S. Patent Nos. 6,180,370; 6,054,927; 5,869,619; 5,861,155; 5,712,120; and 4,816,567) .

[0093] Antibodies of the disclosure are characterized by particular functional features or properties of the antibodies. In some embodiments, the antibodies have one or more of the following properties:

[0094] (a) have a high binding affinity to human, cyno, rat and mouse ανβ6, as measured by ELISA, FACS and SPR;

[0095] (b) have a much higher binding to rat and mouse ανβ6 than the benchmark antibody;

[0096] (c) have no specific binding to any of the other heterodimers ανβ1, ανβ3, ανβ5 or ανβ8;

[0097] (d) specifically bind to β6 but not αν subunits;

[0098] (e) no interference with the binding between ανβ6 and its ligand, LAP (latency-associated peptide) ;

[0099] (f) have a more potent binding to ανβ6 expressing tumor cells than the benchmark antibody;

[0100] (g) have a much more potent internalization ability than the benchmark antibody;

[0101] (h) have a good thermal stability, low risk of self-interaction and low hydrophobicity; and

[0102] (i) have normal PK parameters in mouse.

[0103] As shown herein, the inventors have isolated monoclonal antibodies against ανβ6 with high affinity (～nM KD) and specificity, cross-reactivity to non-human orthologs (useful for toxicology studies) . The inventors have humanized some clones by grafting the complementarity determining region (CDR) to a human IgG1 framework and showed these humanized antibodies retain high affinity to ανβ6. The inventors have showed suitability of using these humanized antibodies as antibody-drug conjugates through cancer cell killing by in vitro and in vivo assays. Thus, these antibodies and ADCs can be used as targeted therapy against tumors expressing ανβ6 on the cell surface.

[0104] Binding affinity

[0105] The antibodies as disclosed herein can bind to at least one of human, mouse, rat and cynomolgus monkey ανβ6 with sufficiently high affinity. The binding of an antibody of the disclosure to ανβ6 can be assessed using one or more techniques well established in the art, for instance, ELISA. The binding specificity of an antibody of the disclosure can also be determined by monitoring binding of the antibody to cells expressing an ανβ6 protein, e.g., flow cytometry. For example, an antibody can be tested by a flow cytometry assay in which the antibody is reacted with a cell line that expresses human ανβ6, such as 293F cells that have been transfected to express human ανβ6 or a fragment thereof on their cell surface. Cells or cell lines that naturally express ανβ6 protein, such as HCC70 and HPAF-II tumor cells, can be used. Additionally or alternatively, the binding of the antibody, including the binding kinetics (e.g., KD value) can be tested in BIAcore binding assays or FACS affinity tests.

[0106] In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof can bind to human integrin ανβ6 with an EC50 of no more than 1 nM, no more than 0.5 nM, no more than 0.3 nM, or no more than 0.1 nM, as measured by ELISA. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof can bind to cyno integrin ανβ6 with an EC50 of no more than 1 nM, no more than 0.5 nM, no more than 0.3 nM, or no more than 0.1 nM, as measured by ELISA. In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof can bind to rat or mouse integrin ανβ6 with an EC50 of no more than 1 nM, no more than 0.5 nM, no more than 0.3 nM, no more than 0.1 nM, or no more than 0.05 nM, as measured by ELISA.

[0107] In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof can bind to human integrin ανβ6 expressing cells with an EC50 of no more than 1 nM, no more than 0.8 nM, no more than 0.5 nM, no more than 0.3 nM, or no more than 0.1 nM, as measured by FACS.

[0108] Antibody Stability

[0109] Each antibody will have a characteristic melting temperature indicating its thermal stability, with a higher melting temperature indicating greater overall stability in vivo (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3: 361-71) . Generally, it is preferred that the Tm1 (the temperature of initial unfolding) be greater than 60 ℃, preferably greater than 65 ℃. The melting point of an antibody can be measured using differential scanning calorimetry (Chen et al (2003) Pharm Res 20: 1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68: 47-52) or circular dichroism (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40: 343-9) .

[0110] In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof as disclosed herein has a Tm1 greater than 65 ℃, more preferably greater than 66 ℃, more preferably greater than 67 ℃, and more preferably greater than 68 ℃.

[0111] Preferably, the antibodies as disclosed herein have minimal or low aggregation effects, which can lead to the triggering of an unwanted immune response and / or altered or unfavorable pharmacokinetic properties. Aggregation can be measured by several techniques, including size-exclusion column (SEC) , high performance liquid chromatography (HPLC) , dynamic light scattering and AC-SINS. The stability of the antibodies may also be assessed via thermal stress test and freeze-thaw stress test.

[0112] Non-specific binding

[0113] The non-specific binding of an antibody of the disclosure can be assessed using one or more techniques available in the art, for instance, ELISA, FACS and Baculovirus Particles (BVP) assay which uses the membrane proteins presented on the surface of a baculovirus particle as a reagent to capture mAbs with cross-interaction propensity. Previous work has found strong correlation between a non-specificity ELISA binding score using baculovirus particles (BVP) and clearance rates in human and cynomolgus monkeys. Such assays can be used during lead generation or optimization to identify antibodies with increased risk of having fast clearance in both humans and cynomolgus monkeys, and thus increase the likelihood of obtaining a suitable drug candidate.

[0114] For example, the test antibodies may be incubated with a variety of antigens other than ανβ6 or transfected cells expressing the antigens other than ανβ6 to detect specific or non-specific off-target binding that may influence in vivo behavior. As another example, Baculovirus Particles (BVP) ELISA assay based on ELISA detection of non-specific binding to baculovirus particles are used which can identify antibodies having increased risk for fast clearance, and a higher BVP score in the in vitro assay is associated with faster serum clearance. In some embodiments, the antibodies have a BVP score less than 5 in the Baculovirus Particles (BVP) ELISA assay, indicating they have no non-specific binding.

[0115] CDRs of Anti-ανβ6 antibodies

[0116] In some embodiments, the present disclosure provides an isolated antibody or the antigen-binding portion thereof comprising:

[0117] A) one or more heavy chain CDRs (HCDRs) selected from the group consisting of:

[0118] a HCDR1 comprising SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO: 1 by an amino acid addition, deletion or substitution of not more than 2 amino acids; a HCDR2 comprising SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO: 2 by an amino acid addition, deletion or substitution of not more than 2 amino acids; and a HCDR3 comprising SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO: 3 by an amino acid addition, deletion or substitution of not more than 2 amino acids;

[0119] B) one or more light chain CDRs (LCDRs) selected from the group consisting of:

[0120] a LCDR1 comprising SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO:4 by an amino acid addition, deletion or substitution of not more than 2 amino acids; a LCDR2 comprising SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO: 5 by an amino acid addition, deletion or substitution of not more than 2 amino acids; and a LCDR3 comprising SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO: 6 by an amino acid addition, deletion or substitution of not more than 2 amino acids; or

[0121] C) one or more HCDRs of A) and one or more LCDRs of B) .

[0122] The extent of the framework region and CDRs can be precisely identified using methodology known in the art, for example, by Dr. Martin’s definition, the Kabat definition, the Chothia definition, the AbM definition, the Contact definition, the IMGT definition (all of which are well known in the art) and any combinations thereof. See, e.g., Martin A. “Antibody bioinformatics website of Dr. Andrew Martin's lab at UCL, " last updated on 31 July 2018; Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, Chothia et al., (1989) Nature 342: 877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917, Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273: 927-948; Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May, 63 (1) : 78-85; and Martin and Allen, in “Handbook of Therapeutic Antibodies” , chapter 5, 2007. See also hgmp. mrc. ac. uk and bioinf. org. uk / abs. Correspondence or alignments between numberings according to different definitions can for example be found at www. imgt. org /  (see also Giudicelli V et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. (1997) 25: 206–11; and Lefranc MP et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. (2003) 27: 55–77) .

[0123] As will be appreciated by those in the art, the exact numbering and placement of the CDRs can be different among different numbering systems. However, it should be understood that the disclosure of a variable heavy sequence and / or a variable light sequence includes the disclosure of the associated (inherent) CDRs, regardless of which numbering approach is adopted. Accordingly, the disclosure of each variable region is a disclosure of the CDRs, including HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 and LCDR3. Two antibodies having the same VH and VL means that their CDRs are identical when determined by the same approach (e.g., Dr. Martin’s , the Kabat, AbM, Chothia, Contact, and IMGT numbering approaches as known in the art) . The same antibody as disclosed herein may have a different set of CDRs when determined by a different numbering approach.

[0124] In some embodiments, the CDRs as exemplified herein are identified according to Dr. Martin’s definition.

[0125] Table A Definition of CDR Ranges by Dr. Martin’s definition

[0126] In some embodiments, the antibody or the antigen-binding portion thereof comprises: HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprising or consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3 respectively, and; LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6 respectively.

[0127] In some embodiments, the antibody or the antigen-binding portion thereof comprises: HCDR1, HCDR2 and HCDR3 consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3 respectively, and; LCDR1, LCDR2 and LCDR3 consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6 respectively.

[0128] Variable regions and CDRs in an antibody sequence can also be identified by aligning the sequences against a database of known variable regions. Methods for identifying these regions are described in Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 and Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000. Exemplary databases of antibody sequences are described in, and can be accessed through, the “Abysis" website at www. bioinf. org. uk / abs (maintained by A.C. Martin in the Department of Biochemistry &Molecular Biology University College London, London, England) and the VBASE2 website at www. vbase2. org, as described in Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue) : D671 -D674 (2005) . Sequences may be analyzed using the Abysis database, which integrates sequence data from Kabat, IMGT and the Protein Data Bank (PDB) with structural data from the PDB. See Dr. Andrew C. R. Martin's book chapter Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed. : Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, also available on the website bioinforg. uk / abs) . The Abysis database website further includes general rules that have been developed for identifying CDRs which can be used in accordance with the teachings herein.

[0129] Preferably, the amino acid addition, deletion or substitution of not more than 2 amino acids in any of SEQ ID Nos: 1-6 is a conservative substitution that does not reduce the antigen-binding ability of the antibody or antigen-binding portion thereof. The anti-ανβ6 antibody herein may collectively comprise no more than three substitutions, no more than two substitutions and preferably no more than one substitution in the CDRs compared to the CDRs of W301126-1.32.8-xIgG1KV320.

[0130] In some embodiments, the anti-ανβ6 antibody comprises at least one of the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of the VH region as set forth in SEQ ID NO: 7, and at least one of the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of the VL region as set forth in SEQ ID NO: 8.

[0131] In some embodiments, the anti-ανβ6 antibodies as disclosed herein comprise a VH region and a VL region, wherein the VH region comprises FRW1-HCDR1-FRW2-HCDR2-FRW3-HCDR3-FRW4, and wherein HCDR1 has an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 1, HCDR2 has an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 2, and HCDR3 has an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 3, and / or wherein the VL region comprises FRW1-LCDR1-FRW2-LCDR2-FRW3-LCDR3-FRW4, and wherein LCDR1 has an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 4, LCDR2 has an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 5, and LCDR3 has an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 6.

[0132] In some embodiments, the framework (FR) regions are derived from human germline, e.g. a human immunoglobulin. In some embodiments, the FR regions may include one or more individual FR residue modifications that improve antibody performance, such as stability, binding affinity, isomerization, immunogenicity, etc. For example, the FR regions may comprise a PTM-removal modification to avoid post-translational modification (PTM) . PTMs mainly include isomerization, deamination, glycosylation and oxidation, all of which have a typical amino acid site, e.g. “DG” for isomerization, “NG” for deamination, “N*T / S” (*stand for other amino acid except P or D) for glycosylation and “M” or “C” for oxidation. Once the PTM sites are found in antibody sequence, especially in key regions like CDR3, PTM removal may be needed to avoid the potential risk of PTM modification while minimally affecting the binding compared to the parental antibody.

[0133] In some embodiments, the antibody disclosed herein comprises at least one of the heavy chain FRW1, FRW2, FRW3 and FRW4 of the VH region as set forth in SEQ ID NO: 7, and at least one of the light chain FRW1, FRW2, FRW3 and FRW4 of the VL region as set forth in SEQ ID NO: 8.

[0134] Anti-ανβ6 antibodies comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region

[0135] In some embodiments, the anti-ανβ6 antibody or antigen-binding portion thereof comprises:

[0136] (A) a heavy chain variable region (VH) consisting of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 7; and

[0137] (B) a light chain variable region (VL) consisting of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 8.

[0138] In some embodiments, the anti-ανβ6 antibody or antigen-binding portion thereof comprises:

[0139] (A) a heavy chain variable region (VH) comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 7; and

[0140] (B) a light chain variable region (VL) comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 8.

[0141] In some embodiments, the anti-ανβ6 antibody or antigen-binding portion thereof comprises:

[0142] (A) a heavy chain variable region (VH) :

[0143] (i) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7;

[0144] (ii) comprising an amino acid sequence having at least 85%, 90%, or 95%identity with SEQ ID NO: 7; or

[0145] (iii) comprising an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of one or more (e.g. 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) amino acids in the framework regions compared with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; and / or

[0146] (B) a light chain variable region (VL) :

[0147] (i) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8;

[0148] (ii) comprising an amino acid sequence having at least 85%, 90%, or 95%identity with SEQ ID NO: 8; or

[0149] (iii) comprising an amino acid sequence with addition, deletion and / or substitution of one or more (e.g. 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) amino acids in the framework regions compared with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

[0150] In some embodiments, the amino acid sequences of the heavy chain variable region and / or the light chain variable region can be at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to the respective sequences set forth above. Preferably, the VH and VL as described above have the same set of CDRs as one of SEQ ID NOs: 7-8 and with sequence having at least 85%, 90%, or 95%identity in the framework regions.

[0151] The percent identity between two amino acid sequences can be determined using the algorithm of E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988) ) which has been incorporated into the ALIGN program (version 2.0) , using a PAM120 weight residue table, a gap length penalty of 12 and a gap penalty of 4. In addition, the percentage of identity between two amino acid sequences can be determined by the algorithm of Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970) ) which has been incorporated into the GAP program in the GCG software package (available at http:  / / www. gcg. com) , using either a Blossum 62 matrix or a PAM250 matrix, and a gap weight of 16, 14, 12, 10, 8, 6, or 4 and a length weight of 1, 2, 3, 4, 5, or 6.

[0152] Additionally or alternatively, the protein sequences of the present disclosure can further be used as a “query sequence” to perform a search against public databases to, for example, identify related sequences. Such searches can be performed using the XBLAST program (version 2.0) of Altschul, et al. (1990) J. MoI. Biol. 215: 403-10. BLAST protein searches can be performed with the XBLAST program, score = 50, wordlength = 3 to obtain amino acid sequences homologous to the antibody molecules of the disclosure. To obtain gapped alignments for comparison purposes, Gapped BLAST can be utilized as described in Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402. When utilizing BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of the respective programs (e.g., XBLAST and NBLAST) can be used.

[0153] In some further embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof may contain conservative substitution or modification of amino acids in the variable regions of the heavy chain and / or light chain. It is understood in the art that certain conservative sequence modification can be made which do not remove antigen binding. See, e.g., Brummell et al. (1993) Biochem 32: 1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10: 835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 26864-26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149: 1605-12; Kelley and O’ Connell (1993) Biochem. 32: 6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10: 341-6 and Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6: 2835-43.

[0154] The term “conservative substitution, ” as used herein, refers to amino acid substitutions which would not disadvantageously affect or change the essential properties of a protein / polypeptide comprising the amino acid sequence. For example, a conservative substitution may be introduced by standard techniques known in the art such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Conservative amino acid substitutions include substitutions wherein an amino acid residue is substituted with another amino acid residue having a similar side chain, for example, a residue physically or functionally similar (such as, having similar size, shape, charge, chemical property including the capability of forming covalent bond or hydrogen bond, etc. ) to the corresponding amino acid residue. The families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids having alkaline side chains (for example, lysine, arginine and histidine) , amino acids having acidic side chains (for example, aspartic acid and glutamic acid) , amino acids having uncharged polar side chains (for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, tryptophan) , amino acids having nonpolar side chains (for example, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine) , amino acids having β-branched side chains (such as threonine, valine, isoleucine) and amino acids having aromatic side chains (for example, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . Therefore, a corresponding amino acid residue is preferably substituted with another amino acid residue from the same side-chain family. Methods for identifying amino acid conservative substitutions are well known in the art (see, for example, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993) ; Kobayashi et al., Protein Eng. 12 (10) : 879-884 (1999) ; and Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997) , which are incorporated herein by reference) .

[0155] In a specific embodiment, the antibody or the antigen-binding portion thereof comprises a heavy chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

[0156] Fc region

[0157] The anti-integrin ανβ6 antibodies and antigen-binding portions thereof provided herein may further comprise an immunoglobulin constant region comprising a Fc region, such as a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 Fc region (native or variant thereof) , and optionally a hinge region. In some embodiments, the Fc region is a human IgG1 Fc region, such as a wild-type IgG1 Fc region or an Fc variant. In some embodiments, the Fc region is a human IgG4 Fc region, such as a wild-type IgG4 Fc region or a Fc variant. An Fc variant can possess at least about 80%homology with a native sequence Fc region, or at least about 90%homology therewith, for example, at least about 95%homology therewith. In some embodiments, the Fc variant region has at least one amino acid substitution compared to a native sequence Fc region or to the Fc region of a parent polypeptide, for example, from about one to about ten amino acid substitutions. In some embodiments, the anti-ανβ6 antibody comprises a heavy chain constant region that has at least about 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more homology to SEQ ID NO: 9.

[0158] The Fc variant may comprise one or more amino acid changes (e.g., insertions, deletions or substitutions) that alters the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or other effector functions, or modifying the binding interaction between Fc and FcRn or FcγR, including but not limited to, Leu234Ala / Leu235Ala (LALA) , S298A, E333A, K334A, M252Y / S254T / T256E ( “YTE” ) , M428L / N434S ( “LS” ) , as well as other conventionally adopted substitutions. For example, S298A / E333A / K334A has been shown to result in enhanced ADCC compared to WT IgG when introduced into the humanized IgG1, “YTE” has been shown to increase the binding affinity of the antibody Fc to the MHC Class I neonatal FcR (FcRn) thereby permitting more efficient recycling of administered IgG1 antibody.

[0159] In certain embodiments, the Fc region is an IgG4 Fc region comprising a S228P mutation (according to EU numbering as in Kabat et al. ) that prevents Fab arm exchange and stabilizes IgG4 molecule. The Fc variant region described herein may have a loss of effector function (e.g., silent Fc) . In certain embodiments, the Fc region is a IgG1 Fc region and comprises a LALA mutation, i.e. mutations of L234A and L235A. LALA mutation is perhaps the most commonly used mutation for disrupting antibody effector function, e.g. eliminate Fc binding to specific FcγRs, reduce ADCC activity mediated by PBMCs and monocytes. Modifications in the Fc domain of an antigen-binding molecules may be desirable to reduce Fc receptor binding and therefore reduce the potential for FcγRIIa-mediated activation of platelets. As another example, for human IgG4, engineering mutations S228P / L235E variant (SPLE) has previously demonstrated minimal FcγR binding (Newman et al., 2001, Clin. Immunol. 98, 164–174) . Mutations in IgG1 or IgG4 Fc domains can be combined, for instance combining the LALA mutations in human IgG1 with a mutation at P329G or combining the SPLE mutation in human IgG4 with a mutation at P329G, completely abolished FcγR and C1q interactions (Schlothauer et al., 2016, Protein Eng Des. Sel. 29, 457-466) .

[0160] In some embodiments, an antibody that binds to human integrin ανβ6 comprising a heavy chain (HC) and a light chain (LC) , wherein the HC comprises a heavy chain constant region and the LC comprises a light chain constant region, wherein:

[0161] (A) the heavy chain constant region comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 9; and

[0162] (B) the light chain constant region comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 10.

[0163] In some embodiments, an antibody that binds to human integrin ανβ6 comprising a heavy chain (HC) and a light chain (LC) , wherein the HC comprises a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region, and the LC comprises a light chain variable region (VL) and a light chain constant region, wherein:

[0164] (A) the VH comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 7 and the heavy chain constant region comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 9; and

[0165] (B) the VL comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 8 and the light chain constant region comprises the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 10.

[0166] In some embodiments, an antibody that binds to human integrin ανβ6 comprising a heavy chain (HC) and a light chain (LC) , wherein the HC comprises a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region, and the LC comprises a light chain variable region (VL) and a light chain constant region, wherein:

[0167] (A) the VH consists of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 7 and the heavy chain constant region consists of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 9; and

[0168] (B) the VL consists of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 8 and the light chain constant region consists of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 10.

[0169] In some embodiments, the anti-ανβ6 antibody or antigen-binding portion thereof, wherein the antibody further comprises a human IgG constant region, such as a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 constant region.

[0170] In some embodiments, the anti-ανβ6 antibody or antigen-binding portion thereof, wherein the human IgG constant region is a human IgG1 constant region or a variant thereof, such as a human IgG1 Fc region with L234A and L235A substitutions.

[0171] The “EU numbering system” or “EU index” is generally used when referring to a residue in an immunoglobulin heavy chain constant region (e.g., the EU index reported in Kabat et al., supra) . The “EU numbering as in Kabat” or “EU index as in Kabat” refers to the residue numbering of the human IgG1 EU antibody. Unless stated otherwise herein, references to residue numbers in the constant domain of antibodies means residue numbering by the EU numbering system.

[0172] Antibody Preparation

[0173] Monoclonal antibodies can be prepared using a wide variety of techniques known in the art including hybridoma techniques, recombinant techniques, phage display technologies, transgenic animals (e.g., a  ) or some combination thereof. For example, monoclonal antibodies can be produced using hybridoma and art-recognized biochemical and genetic engineering techniques such as described in more detail in An, Zhigiang (ed. ) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1st ed. 2009; Shire et. al. (eds. ) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science + Business Media LLC, 1st ed. 2010; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988; Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) each of which is incorporated herein in its entirety by reference.

[0174] It should be understood that a selected binding sequence can be further altered, for example, to improve affinity for the target, to humanize the target binding sequence, to improve its production in cell culture, to reduce its immunogenicity in vivo, to create a multispecific antibody, etc., and that an antibody comprising the altered target binding sequence is also an antibody of this invention. In some embodiments, the anti-human ανβ6 monoclonal antibody is prepared by using hybridoma techniques. Generation of hybridomas is well-known in the art. See, e.g., Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York.

[0175] II. Antibody-drug Conjugates

[0176] In some aspects, the disclosure provides an antibody-drug conjugate (ADC) comprising the anti-integrin ανβ6 antibody or antigen-binding portion thereof as disclosed herein conjugated to a drug moiety, such as a cytotoxic or cytostatic agent. The term “conjugate” is used herein with its broadest definition to mean joined or linked (such as convalently linked) together. Molecules are “conjugated” when they act or operate as if joined. The ADC herein may comprise more than one drug moieties per molecule, wherein the drug moieties may be the same or different.

[0177] The drug moiety may include but not limited to, a chemotherapeutic agent, a growth inhibitory agent, a toxin (e.g., an enzymatically active toxin of bacterial, fungal, plant, or animal origin, or fragments thereof) , or a radioactive isotope (i.e., a radioconjugate) .

[0178] In some embodiments, the drug moiety is selected from an anti-cancer moiety (e.g., cytostatic / toxic, and / or anti-proliferative drugs) , an immunotherapeutic moiety and an anti-inflammatory moiety. In some embodiments, the anti-cancer moiety includes chemotherapeutic agents, representative examples of which include antitubulin agents, auristatins, DNA minor groove binders, DNA replication inhibitors, alkylating agents (e.g., platinum complexes such as cis-platin, mono (platinum) , bis (platinum) and tri-nuclear platinum complexes and carboplatin) , anthracyclines, antibiotics, antifolates, antimetabolites, calmodulin inhibitors, chemotherapy sensitizers, duocarmycins, etoposides, fluorinated pyrimidines, ionophores, lexitropsins, maytansinoids, nitrosoureas, platinols, pore-forming compounds, purine antimetabolites, puromycins, radiation sensitizers, rapamycins, steroids, taxanes, topoisomerase inhibitors, vinca alkaloids, or the like.

[0179] The use of antibody-drug conjugates for local delivery of cytotoxic or cytostatic agents, i.e. drugs to kill or inhibit tumor cells in the treatment of cancer allows targeted delivery of the drug moiety to tumors, and intracellular accumulation therein, where systemic administration of unconjugated drug agents may result in unacceptable levels of toxicity to normal cells as well as the tumor cells sought to be eliminated (Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, " in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed. s) , pp. 475-506) . Both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies have been reported as useful in these strategies (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87) . Drugs that can be used in the ADCs disclosed herein include chemotherapeutic agents such as daunomycin, doxorubicin, methotrexate, and vindesine; toxins, for example bacterial toxins such as diphtheria toxin, plant toxins such as ricin, small molecule toxins such as geldanamycin, maytansinoids, and calicheamicin; auristatin peptides, auristatin E (AE) and monomethylauristatin (MMAE) , which are synthetic analogs of dolastatin. MMAE is a synthetic derivative of dolastatin 10, a natural cytostatic pseudo peptide. The toxins may effect their cytotoxic and cytostatic effects by mechanisms including tubulin binding, DNA binding, or topoisomerase inhibition. Some cytotoxic drugs tend to be inactive or less active when conjugated to large antibodies or protein receptor ligands.

[0180] Chemotherapeutic agents useful in the generation of immunoconjugates are further described herein below.

[0181] Enzymatically active toxins and fragments thereof that can be used include diphtheria A chain, non-binding active fragments of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa) , ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii proteins, dianthin proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S) , momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin, and the tricothecenes. See, e.g., WO 93 / 21232 published October 28, 1993. A variety of radionuclides are available for the production of radioconjugated antibodies. Examples include 212Bi, 131I, 131In, 90Y, and 186Re.

[0182] Conjugates of the anti-integrin ανβ6 antibody and one or more small molecule toxins, such as a calicheamicin, maytansinoids, dolastatins, auristatins, a trichothecene, and CC1065, and the derivatives of these toxins that have toxin activity, are also contemplated herein.

[0183] Conjugates of the antibody and cytotoxic agent may be made using a variety of bifunctional protein-coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP) , iminothiolane (IT) , bifunctional derivatives of imidoesters (such as dimethyl adipimidate HCl) , active esters (such as disuccinimidyl suberate) , aldehydes (such as glutaraldehyde) , bis-azido compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine) , bis-diazonium derivatives (such as bis-(p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine) , diisocyanates (such as toluene 2, 6-diisocyanate) , and bis-active fluorine compounds (such as 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenzene) . For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al (1987) Science, 238: 1098. Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an exemplary chelating agent for conjugation of radionucleotide to the antibody (WO94 / 11026) .

[0184] In certain embodiments, the disclosure provides an anti-integrin ανβ6 monoclonal antibody conjugated to a cytotoxic agent, by linking the antibody via a protease-cleavable linker to the cytotoxic agent. In some embodiments, the cytotoxic agent is MMAE. Specifically, the linker system in such ADCs may comprise a thiol reactive maleimidocaproyl spacer, a dipeptide valine–citrulline linker ( “vc” ) , and a self-immolative, p-amino-benzyloxycarbonyl ( “PAB” ) , which is designed to be stable in the bloodstream. Binding to integrin ανβ6 on the cell surface initiates internalization. Upon internalization into integrin ανβ6-expressing tumor cells, MMAE, which exerts its potent cytostatic effect by inhibiting microtubule assembly, tubulin-dependent GTP hydrolysis and polymerization, is released via proteolytic cleavage. Finally, after binding to tubulin, MMAE disrupts the microtubule network within the cell, which, in turn, induces cell cycle arrest and results in apoptotic death of the integrin ανβ6-expressing tumor cells.

[0185] Maytansine and maytansinoids

[0186] In some embodiments, the immunoconjugate comprises the antibody or antigen-binding portion thereof as disclosed herein conjugated to one or more maytansinoid molecules.

[0187] Maytansinoids are mitototic inhibitors which act by inhibiting tubulin polymerization. Maytansine was first isolated from the east African shrub Maytenus serrata and later discovered that certain microbes also produce maytansinoids, such as maytansinol and C-3 maytansinol esters (U.S. Patent No. 4,151,042) . Synthetic maytansinol and derivatives and analogues thereof are disclosed, for example, in U.S. Patent Nos. 4,137,230 and 4,371,533.

[0188] Maytansinoid drug moieties are attractive drug moieties in antibody drug conjugates because they are: (i) relatively accessible to prepare by fermentation or chemical modification, derivatization of fermentation products, (ii) amenable to derivatization with functional groups suitable for conjugation through the non-disulfide linkers to antibodies, (iii) stable in plasma, and (iv) effective against a variety of tumor cell lines.

[0189] Maytansine compounds suitable for use as maytansinoid drug moieties are well known in the art and can be isolated from natural sources according to known methods, produced using genetic engineering techniques (see Yu et al (2002) PNAS 99: 7968-7973) , or maytansinol and maytansinol analogues prepared synthetically according to known methods. Suitable maytansinoids are disclosed, for example, in U.S. Patent No. 5,208,020. Preferred maytansinoids are maytansinol and maytansinol analogues modified in the aromatic ring or at other positions of the maytansinol molecule, such as various maytansinol esters.

[0190] Exemplary maytansinoid drug moieties include those having a modified aromatic ring, such as: C-19-dechloro (US 4256746) (prepared by lithium aluminum hydride reduction of ansamytocin P2); C-20-hydroxy (or C-20-demethyl) + / -C-19-dechloro (US Pat. Nos. 4361650 and 4307016) (prepared by demethylation using Streptomyces or Actinomyces or dechlorination using LAH) ; and C-20-demethoxy, C-20-acyloxy (-OCOR) , + / -dechloro (U.S. Pat. No. 4,294,757) (prepared by acylation using acyl chlorides) and those having modifications at other positions.

[0191] Exemplary maytansinoid drug moieties also include those having modifications such as: C-9-SH (US 4424219) (prepared by the reaction of maytansinol with H2S or P2S5) ; C-14-alkoxymethyl (demethoxy / CH2 OR) (US 4331598) ; C-14-hydroxymethyl or acyloxymethyl (CH2OH or CH2OAc) (US 4450254) (prepared from Nocardia) ; C-15-hydroxy / acyloxy (US 4,364,866) (prepared by the conversion of maytansinol by Streptomyces) ; C-15-methoxy (US Pat. Nos. 4,313,946 and 4,315,929) (isolated from Trewia nudlflora) ; C-18-N-demethyl (US Pat. Nos. 4,362,663 and 4, 322, 348) (prepared by the demethylation of maytansinol by Streptomyces) ; and 4, 5-deoxy (US 4371533) (prepared by the titanium trichloride / LAH reduction of maytansinol) .

[0192] Exemplary embodiments of maytansinoid drug moieties include: DM1, DM3 and DM4. The structure of DM1 is shown below:

[0193] wherein the wavy line indicates the covalent attachment of the sulfur atom of the drug to a linker (L) of an antibody drug conjugate. HERCEPTIN (trastuzumab) linked by SMCC to DM1 has been reported (WO 2005 / 037992, which is expressly incorporated herein by reference in its entirety) .

[0194] An Exemplary maytansinoid antibody drug conjugate “Ab- (SMCC-DM1) p” with the following structure and abbreviation (wherein Ab is antibody and p is 1 to about 8) is shown below (e.g. linked via SMCC) :

[0195] Anti-integrin ανβ6 antibody-maytansinoid conjugates can be prepared by chemically linking the antibody or antigen-binding portion thereof to a maytansinoid molecule without significantly diminishing the biological activity of either the antibody or the maytansinoid molecule. An average of 3-4 maytansinoid molecules conjugated per antibody molecule has shown efficacy in enhancing cytotoxicity of target cells without negatively affecting the function or solubility of the antibody, although even one molecule of toxin / antibody would be expected to enhance cytotoxicity over the use of naked antibody.

[0196] There are many linking groups known in the art for making antibody-maytansinoid conjugates, including, for example, those disclosed in U.S. Patent Nos. 5,208,020, 6,441,163, or EP Patent 0 425 235 B1, Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) , and US 2005 / 0169933 A1, the disclosures of which are hereby expressly incorporated by reference. Antibody-maytansinoid conjugates comprising the linker component SMCC may be prepared as disclosed in U.S. Patent Application No. 11 / 141344. The linking groups include disulfide groups, thioether groups, acid labile groups, photolabile groups, peptidase labile groups, or esterase labile groups, as disclosed in the above-identified patents. Additional linking groups are described and exemplified herein.

[0197] The linker may be attached to the maytansinoid molecule at various positions, depending on the type of the link. For example, an ester linkage may be formed by reaction with a hydroxyl group using conventional coupling techniques. The reaction may occur at the C-3 position having a hydroxyl group, the C-14 position modified with hydroxymethyl, the C-15 position modified with a hydroxyl group, and the C-20 position having a hydroxyl group. In a preferred embodiment, the linkage is formed at the C-3 position of maytansinol or a maytansinol analogue.

[0198] In some embodiments, the antibodies as disclosed herein (full length or fragment) are conjugated to one or more maytansinoid molecules. In some embodiments of the immunoconjugate, the cytotoxic agent is a maytansinoid DM1. In some embodiments of the immunoconjugate, the linker is selected from the group consisting of SPDP, SMCC, IT, SPDP, and SPP. Some exemplary maytansinoid antibody drug conjugates may be Ab- (SPP-DM1) p, Ab- (SMCC-DM1) p, Ab- (BMPEO-DM1) p.

[0199] Immunoconjugates containing maytansinoids, methods of making same, and their therapeutic use are disclosed, for example, in U.S. Patent Nos. 5,208,020; 5,416,064; 6,441,163 and European Patent EP 0 425 235 B1, the disclosures of which are hereby expressly incorporated by reference.

[0200] Auristatins and dolostatins

[0201] In some embodiments, the immunoconjugate comprises the anti-integrin ανβ6 antibody disclosed herein conjugated to dolastatins or dolostatin peptidic analogs and derivatives, the auristatins (US Patent Nos. 5,635,483; 5,780,588) . Dolastatins and auristatins have been shown to interfere with microtubule dynamics, GTP hydrolysis, and nuclear and cellular division and have anticancer and antifungal activity (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965) . The dolastatin or auristatin drug moiety may be attached to the antibody through the N (amino) terminus or the C (carboxyl) terminus of the peptidic drug moiety (WO 02 / 088172) .

[0202] Exemplary auristatin embodiments include the N-terminus linked monomethylauristatin drug moieties DE and DF, disclosed in “Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented March 28, 2004, the disclosure of which is expressly incorporated by reference in its entirety.

[0203] An exemplary auristatin embodiment is MMAE (wherein the wavy line indicates the covalent attachment to a linker (L) of an antibody drug conjugate) :

[0204] Another exemplary auristatin embodiment is MMAF (wherein the wavy line indicates the covalent attachment to a linker (L) of an antibody drug conjugate) :

[0205] Additional exemplary embodiments comprising MMAE or MMAF and various linker components have the following structures and abbreviations (wherein Ab means antibody and p is 1 to about 8) are shown below. For example, VcMMAE (Mc-vc-PAB-MMAE) is obtained by using MMAE linked via p-aminobenzyloxycarbonyl ( “PAB” ) to the lysosomally cleavable dipeptide valine-citrulline (vc) and a thiolreactive maleimidocaproyl spacer (MC) .

[0206] Typically, peptide-based drug moieties can be prepared by forming a peptide bond between two or more amino acids and / or peptide fragments. Such peptide bonds can be prepared, for example, according to the liquid phase synthesis method (see E.  and K. Lübke, “The Peptides” , volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) that is well known in the field of peptide chemistry. The auristatin / dolastatin drug moieties may be prepared according to the methods of Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7) : 778-784.

[0207] Calicheamicin

[0208] In some other embodiments, the immunoconjugate comprises an antibody or antigen-binding portion thereof conjugated to one or more calicheamicin molecules. The calicheamicin family of antibiotics are capable of producing double-stranded DNA breaks at sub-picomolar concentrations. Structural analogues of calicheamicin which may be used include, but are not limited to, γ1I, α2I, α3I, N-acetyl-γ1I, PSAG and θI1. Another anti-tumor drug that the antibody can be conjugated is QFA which is an antifolate. Both calicheamicin and QFA have intracellular sites of action and do not readily cross the plasma membrane. Therefore, cellular uptake of these agents through antibody mediated internalization greatly enhances their cytotoxic effects.

[0209] Other cytotoxic agents

[0210] Other antitumor agents that can be conjugated to the antibodies as disclosed herein include BCNU, streptozoicin, vincristine and 5-fluorouracil, the family of agents known collectively LL-E33288 complex described in U.S. patents 5,053,394, 5,770,710, as well as esperamicins (U.S. patent 5,877,296) .

[0211] As used herein the term “cytotoxic agent” means a substance that is toxic to the cells and decreases or inhibits the function of cells and / or causes destruction of cells. In certain embodiments, the substance is a naturally occurring molecule derived from a living organism. Examples of cytotoxic agents include, but are not limited to, small molecule toxins or enzymatically active toxins of bacteria (e.g., Diptheria toxin, Pseudomonas endotoxin and exotoxin, Staphylococcal enterotoxin A) , fungal (e.g., α-sarcin, restrictocin) , plants (e.g., abrin, ricin, modeccin, viscumin, pokeweed anti-viral protein, saporin, gelonin, momoridin, trichosanthin, barley toxin, Aleurites fordii proteins, dianthin proteins, Phytolacca mericana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S) , Momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, saponaria officinalis inhibitor, gelonin, mitegellin, restrictocin, phenomycin, neomycin, and the tricothecenes) or animals, (e.g., cytotoxic RNases, such as extracellular pancreatic RNases; DNase I, including fragments and / or variants thereof) .

[0212] For the purposes of the present disclosure a “chemotherapeutic agent” comprises a chemical compound that non-specifically decreases or inhibits the growth, proliferation, and / or survival of cancer cells (e.g., cytotoxic or cytostatic agents) . Such chemical agents are often directed to intracellular processes necessary for cell growth or division, and are thus particularly effective against cancerous cells, which generally grow and divide rapidly. For example, vincristine depolymerizes microtubules, and thus inhibits cells from entering mitosis. In general, chemotherapeutic agents can include any chemical agent that inhibits, or is designed to inhibit, a cancerous cell or a cell likely to become cancerous or generate tumorigenic progeny (e.g., TIC) . Such agents are often administered, and are often most effective, in combination, e.g., in regimens such as CHOP or FOLFIRI.

[0213] Examples of chemotherapeutic agents that may be conjugated with or used in combination with the antibodies of the present disclosure include, but are not limited to, alkylating agents, alkyl sulfonates, aziridines, ethylenimines and methylamelamines, acetogenins, a camptothecin, bryostatin, callystatin, CC-1065, cryptophycins, dolastatin, duocarmycin, eleutherobin, pancratistatin, a sarcodictyin, spongistatin, nitrogen mustards, antibiotics, enediyne antibiotics, dynemicin, bisphosphonates, esperamicin, chromoprotein enediyne antiobiotic chromophores, aclacinomysins, actinomycin, authramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, carabicin, carminomycin, carzinophilin, chromomycinis, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine,  doxorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycins, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; anti-metabolites, erlotinib, vemurafenib, crizotinib, sorafenib, ibrutinib, enzalutamide, folic acid analogues, purine analogs, androgens, anti-adrenals, folic acid replenisher such as frolinic acid, aceglatone, aldophosphamide glycoside, aminolevulinic acid, eniluracil, amsacrine, bestrabucil, bisantrene, edatraxate, defofamine, demecolcine, diaziquone, elfornithine, elliptinium acetate, an epothilone, etoglucid, gallium nitrate, hydroxyurea, lentinan, lonidainine, maytansinoids, mitoguazone, mitoxantrone, mopidanmol, nitraerine, pentostatin, phenamet, pirarubicin, losoxantrone, podophyllinic acid, 2-ethylhydrazide, procarbazine,  polysaccharide complex (JHS Natural Products, Eugene, OR) , razoxane; rhizoxin; sizofiran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquone; 2, 2', 2"-trichlorotriethylamine; trichothecenes (especially T-2 toxin, verracurin A, roridin A and anguidine) ; urethan; vindesine; dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosine; arabinoside ( “Ara-C” ) ; cyclophosphamide; thiotepa; taxoids, chloranbucil;  gemcitabine; 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; platinum analogs, vinblastine; platinum; etoposide (VP-16) ; ifosfamide; mitoxantrone; vincristine;  vinorelbine; novantrone; teniposide; edatrexate; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronate; irinotecan (Camptosar, CPT-11) , topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluorometlhylornithine; retinoids; capecitabine; combretastatin; leucovorin; oxaliplatin; inhibitors of PKC-alpha, Raf, H-Ras, EGFR and VEGF-A that reduce cell proliferation and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above. Also included in this definition are anti-hormonal agents that act to regulate or inhibit hormone action on tumors such as anti-estrogens and selective estrogen receptor modulators, aromatase inhibitors that inhibit the enzyme aromatase, which regulates estrogen production in the adrenal glands, and anti-androgens; as well as troxacitabine (a 1, 3-dioxolane nucleoside cytosine analog) ; antisense oligonucleotides, ribozymes such as a VEGF expression inhibitor and a HER2 expression inhibitor; vaccines,  rIL-2;  topoisomerase 1 inhibitor;  rmRH; Vinorelbine and Esperamicins and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above.

[0214] Enzymatically active toxins and fragments thereof which can be used include diphtheria A chain, nonbinding active fragments of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa) , ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii proteins, dianthin proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S) , momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin and the tricothecenes. See, for example, WO 93 / 21232 published October 28, 1993.

[0215] The present disclosure further contemplates an immunoconjugate formed between an antibody and a compound with nucleolytic activity (e.g., a ribonuclease or a DNA endonuclease such as a deoxyribonuclease; DNase) .

[0216] For selective destruction of the tumor, the ADC may comprise a highly radioactive atom. A variety of radioactive isotopes are available for the production of radioconjugated antibodies. Examples include At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 and radioactive isotopes of Lu. When the conjugate is used for detection, it may comprise a radioactive atom for scintigraphic studies, for example tc99m or I123, or a spin label for nuclear magnetic resonance (NMR) imaging (also known as magnetic resonance imaging, mri) , such as iodine-123 again, iodine-131, indium-111, fluorine-19, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, gadolinium, manganese or iron.

[0217] The radio-or other labels may be incorporated in the conjugate in known ways. For example, the peptide may be biosynthesized or may be synthesized by chemical amino acid synthesis using suitable amino acid precursors involving, for example, fluorine-19 in place of hydrogen. Labels such as tc99m or I123, Re186, Re188 and In111 can be attached via a cysteine residue in the peptide. Yttrium-90 can be attached via a lysine residue.

[0218] Conjugates of the antibody and cytotoxic agent may be made using a variety of bifunctional protein coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) , succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) , iminothiolane (IT) , bifunctional derivatives of imidoesters (such as dimethyl adipimidate HCl) , active esters (such as disuccinimidyl suberate) , aldehydes (such as glutaraldehyde) , bis-azido compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine) , bis-diazonium derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine) , diisocyanates (such as toluene 2, 6-diisocyanate) , and bis-active fluorine compounds (such as 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenzene) . The linker may be a “cleavable linker” facilitating release of the cytotoxic drug in the cell. For example, an acid-labile linker, peptidase-sensitive linker, photolabile linker, dimethyl linker or disulfide-containing linker may be used.

[0219] In some embodiments, an antibody-drug conjugate (ADC) , comprising the antibody or antigen-binding portion thereof conjugated to a drug moiety (ies) .

[0220] Drug Loading

[0221] The ADCs herein may be represented by a common ADC Formula Ab- (L-D) p, wherein Ab refers to the anti-integrin ανβ6 antibody or antigen-binding portion thereof as disclosed herein, L refers to the linker and D refers to the drug moiety, generally comprising a cytotoxic or cytostatic agent, and p refers to the integer number of drug moieties for Ab molecule. Drug loading is represented by p and DAR, DAR is the average number of drug moieties per antibody in an ADC molecule. Drug loading may range from 1 to 20 drug moieties (D) per antibody. ADCs include collections of antibodies conjugated with a range of drug moieties, from 1 to 20.

[0222] In the ADCs as disclosed herein, the anti-integrin ανβ6 (Ab) or antigen-binding portion thereof is conjugated to one or more drug moieties (D) , e.g. about 1 to about 20 drug moieties per antibody, about 1 to about 10 drug moieties per antibody, about 1 to about 8 drug moieties per antibody, about 1 to about 5 drug moieties per antibody, about 1 to about 4 drug moieties per antibody, about 1 to about 3 drug moieties per antibody, or about 1 to about 2 drug moieties per antibody, through a linker (L) . In some embodiments, the number of drug moieties (D) per antibody is from about 1 to about 5, from about 2 to about 6, from about 2 to about 5, or from about 3 to about 4 drug moieties per antibody. Because the number of drug moieties per antibody is typically an average number over all conjugates in a population of an antibody drug conjugate, the number of drug moieties per antibody may not be a whole number.

[0223] The average number of drug moieties per antibody in preparations of ADC from conjugation reactions may be characterized by conventional means such as mass spectroscopy, ELISA assay, and HPLC. The quantitative distribution of ADC in terms of p may also be determined. In some instances, separation, purification, and characterization of homogeneous ADC may be achieved by means such as reverse phase HPLC, electrophoresis and hydrophobic interaction chromatography (HIC) .

[0224] For some antibody-drug conjugates, p may be limited by the number of attachment sites on the antibody. Amino acids such as cysteine, serine, lysine, tyrosine, threonine have the potential to be nucleophilic depending on the protein microenvironment and amenable to protein labeling. For example, where the attachment is a cysteine thiol, an antibody may have only one or several cysteine thiol groups, or may have only one or several sufficiently reactive thiol groups through which a linker may be attached. In some instances, higher drug loading, e.g. p >5, may cause aggregation, insolubility, toxicity, or loss of cellular permeability of certain antibody-drug conjugates. In certain embodiments, the drug loading for an ADC of the disclosure ranges from 1 to about 8; from about 2 to about 6; from about 3 to about 5; from about 3 to about 4; from about 3.5 to about 4.5, from about 3.6 to about 4.4, from about 3.7 to about 4.3, from about 3.8 to about 4.2, or from about 3.9 to about 4.1. In some embodiments, the ADC ranges from about 3.5 to about 4.5. Indeed, it has been shown that for certain ADCs, the optimal ratio of drug moieties per antibody may be less than 8, and may be about 2 to about 5.

[0225] In some embodiments, the ADCs (e.g. W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320-MMAE) as disclosed herein are prepared by an optimized conjugation process, which renders the prepared ADCs highly homogeneous with a DAR of 4. For example, at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%or more of the produced ADCs are ADCs with a DAR of 4.

[0226] In certain embodiments, fewer than the theoretical maximum of drug moieties are conjugated to an antibody during a conjugation reaction. An antibody may contain, for example, lysine residues that do not react with the drug-linker intermediate or linker reagent. Generally, antibodies do not contain many free and reactive cysteine thiol groups which may be linked to a drug moiety; indeed most cysteine thiol residues in antibodies exist as disulfide bridges. In certain embodiments, an antibody may be reduced with a reducing agent such as dithiothreitol (DTT) or tricarbonylethylphosphine (TCEP) , under partial or total reducing conditions, to generate reactive cysteine thiol groups. In certain embodiments, the antibody as disclosed herein is subjected to denaturing conditions to reveal reactive nucleophilic groups such as lysine or cysteine.

[0227] The loading (drug / antibody ratio) of an ADC may be controlled in different ways, e.g., by: (i) limiting the molar excess of drug-linker intermediate or linker reagent relative to antibody, (ii) limiting the conjugation reaction time or temperature, (iii) partial or limiting reductive conditions for cysteine thiol modification, (iv) engineering by recombinant techniques the amino acid sequence of the antibody such that the number and position of cysteine residues is modified for control of the number and / or position of linker-drug attachments (such as thioMab or thioFab prepared as disclosed herein and in WO2006 / 034488 (herein incorporated by reference in its entirety) ) .

[0228] It is to be understood that where more than one nucleophilic group reacts with a drug-linker intermediate or linker reagent followed by drug moiety reagent, then the resulting product is a mixture of ADC compounds with a distribution of one or more drug moieties attached to an antibody. The average number of drugs per antibody may be calculated from the mixture by a dual ELISA antibody assay, which is specific for antibody and specific for the drug. Individual ADC molecules may be identified in the mixture by mass spectroscopy and separated by HPLC, e.g. hydrophobic interaction chromatography (see, e.g., Hamblett, K.J., et al. “Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate, ” Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. “Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates, ” Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004) . In certain embodiments, a homogeneous ADC with a single loading value may be isolated from the conjugation mixture by electrophoresis or chromatography.

[0229] Preparation of antibody drug conjugates

[0230] The ADCs may be prepared by several routes, employing organic chemistry reactions, conditions, and reagents known to those skilled in the art, including: (1) reaction of a nucleophilic group of an antibody with a bivalent linker reagent, to form Ab-L, via a covalent bond, followed by reaction with a drug moiety D; and (2) reaction of a nucleophilic group of a drug moiety with a bivalent linker reagent, to form D-L, via a covalent bond, followed by reaction with the nucleophilic group of an antibody. Several MMAE drug moieties, e.g. MMAE linked with MC-VC-PAB (i.e. MC-VC-PAB-MMAE) , are commercially available and can be directly used for conjugation with the antibody.

[0231] As described above, the linker may be composed of one or more linker components. Exemplary linker components include 6-maleimidocaproyl ( “MC” ) , maleimidopropanoyl ( “MP” ) , valine-citrulline ( “val-cit” or “vc” ) , alanine-phenylalanine ( “ala-phe” ) , p-aminobenzyloxycarbonyl ( “PAB” ) , N-Succinimidyl 4- (2-pyridylthio) pentanoate ( “SPP” ) , N-Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate ( “SMCC’ ) , and N-Succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate ( “SIAB” ) . In some embodiments, the linker is MC-vc-PAB. Additional linker components are known in the art and some are described herein.

[0232] In some embodiments, the linker may comprise amino acid residues. Exemplary amino acid linker components include a dipeptide, a tripeptide, a tetrapeptide or a pentapeptide. Exemplary dipeptides include: valine-citrulline (vc or val-cit) , alanine-phenylalanine (af or ala-phe) . Exemplary tripeptides include: glycine-valine-citrulline (gly-val-cit) and glycine-glycine-glycine (gly-gly-gly) . Amino acid residues which comprise an amino acid linker component include those occurring naturally, as well as minor amino acids and non-naturally occurring amino acid analogs, such as citrulline. Amino acid linker components can be designed and optimized in their selectivity for enzymatic cleavage by a particular enzyme, for example, a tumor-associated protease, cathepsin B, C and D, or a plasmin protease.

[0233] Nucleophilic groups on antibodies include but are not limited to: (i) N-terminal amine groups, (ii) side chain amine groups, e.g. lysine, (iii) side chain thiol groups, e.g. cysteine, and (iv) sugar hydroxyl or amino groups where the antibody is glycosylated. Amine, thiol, and hydroxyl groups are nucleophilic and capable of reacting to form covalent bonds with electrophilic groups on linker moieties and linker reagents including: (i) active esters such as NHS esters, HOBt esters, haloformates, and acid halides; (ii) alkyl and benzyl halides such as haloacetamides; (iii) aldehydes, ketones, carboxyl, and maleimide groups. Certain antibodies have reducible interchain disulfides, i.e. cysteine bridges. Antibodies may be made reactive for conjugation with linker reagents by treatment with a reducing agent such as TCEP. Each cysteine bridge will thus form, theoretically, two reactive thiol nucleophiles.

[0234] Antibody drug conjugates of the disclosure may also be produced by modification of the antibody to introduce electrophilic moieties, which can react with nucleophilic substituents on the linker reagent or drug.

[0235] In some embodiments, the anti-ανβ6 ADC as disclosed herein may be prepared by reducing with TCEP and then conjugating with a commercially purchased MC-vc-PAB-MMAE, i.e. linker already linked to the drug moiety.

[0236] In some embodiments, the linker is peptide linker (such as a val-cit linker, a phe-lys linker) , a hydrazone linker, or a disulfide linker.

[0237] In some embodiments, the linker is cleavable by a protease, such as lysosomal protease, membrane associated protease, intracellular protease or endosomal protease.

[0238] Optimized conjugation processes for preparing highly homogeneous ADCs

[0239] One of the problems facing the conventional conjugation of ADC is the heterogeneity of the ADC molecules where the drug moieties are attached at several sites on the antibody, for example, ranging from 0 to 8 per antibody (DAR) by cysteine chemistry. ADC molecules of such a mixture not only bring difficulties in analysis and characterization, but also potentially have different pharmacokinetic, distribution, toxicity and efficacy profiles. Besides, non-specific conjugation also frequently results in impaired antibody function.

[0240] Preferably, the ADCs as disclosed herein are prepared by a process that utilizes metal ions such as transition metal ions and divalent metal ions to generate highly homogeneous ADCs. In the presence of metal ions such as Zn2+, Cd2+, Hg2+, Ca2+, Mg2+, the two interchain S-Sbonds in Fab regions are selectively reduced whereas the two interchain S-Sbonds in the hinge region are protected from being reduced during the incubation of the reductant and the antibody. Thus, four payload bearing reactive groups (i.e., four drug-linker complexes) are attached to one antibody to form D4 ADC. A high content of D4 in the resultant ADCs certainly improve the homogeneity of the ADCs. Details of the conjugation process for producing highly homogeneous D4 ADCs of antibodies can be found in WO2020164561A1, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

[0241] In some embodiments, the ADCs as disclosed herein are prepared by a method comprising the following steps:

[0242] (a) incubating a reductant and the anti-ανβ6 antibody in the presence of an effective amount of metal ions such as transition metal ions and divalent metal ions in a buffer system to selectively reduce inter-chain disulfide bonds within the antibody;

[0243] (b) introducing an excess amount of a linker-drug moiety (e.g. MC-MMAF) to react with reduced thiol groups resulted from step (a) ; and

[0244] (c) recovering the resultant antibody-drug conjugate.

[0245] Optionally, the process further comprises adding an effective amount of oxidant to re-oxidize the unreacted thiol groups after step (b) .

[0246] In some embodiments, the reductant may be TCEP. The concentration of the reductant in the reaction solution may be 0.04 mM to 0.4 mM. The oxidant to be added after step (b) may be DHAA. The concentration of the oxidant in the reaction solution may be 0.08 mM to 0.8 mM.

[0247] In some embodiments, the metal ion which is suitable to be used in the bio-conjugation process of the present disclosure is selected from transition metal ions and divalent ions, including but not limited to, Zn2+, Cd2+, Ca2+, Mg2+ and Hg2+, and the like. Among others, Zn2+ is used due to its easy availability and low cost. For example, suitable transition metal salts may be added in step (a) as long as they are soluble in the reaction solution so that free transition metal ions can be released in the reaction solution. In this regard, ZnCl2, Zn (NO3) 2, ZnSO4, Zn (CH3COO) 2, ZnI2, ZnBr2, Zinc Formate, and zinc tetrafluoroborate may be mentioned as suitable zinc salts. Likewise, other transition metal salts which are soluble and can release free Cd2+ or Hg2+ ions in the reaction solution can be mentioned, which include, but not limited to, CdCl2, Cd (NO3) 2, CdSO4, Cd (CH3COO) 2, CdI2, CdBr2, cadmium formate, and cadmium tetrafluoroborate; HgCl2, Hg (NO3) 2, HgSO4, Hg (CH3COO) 2, HgBr2, Mercury (II) formate, and Mercury (II) tetrafluoroborate; and the like. Those skilled in the art can make a selection from the above transition metal salts and divalent metal salts as the source of metal ions.

[0248] In an embodiment, Zn2+ is used in step (a) . Zinc salts which are water soluble are available. For example, ZnCl2 may be added in step (a) as the Zn2+ source. The concentration of the metal ions in the reaction solution in step (a) may be in a range of 0.01 mM to 0.2 mM.

[0249] The metal ions may be removed in purification step by using EDTA as chelating reagent, which will be filtered out in subsequent dialysis, ultrafiltration or gel filtration.

[0250] Depending on the metal ions, those skilled in the art can select suitable buffer system for the reaction in step (a) , including, but not limited to, Hepes, Histidine buffer, PBS, MES, and the like. In a specific embodiment, the buffer system used in step (a) is PBS.

[0251] The optimum pH for the reaction will typically between about 5.5 and about 8, for instance, about 5.5 to 7.5. The optimal reaction conditions will of course depend upon the specific reactants employed. In an embodiment, the buffer is PBS, pH 7.

[0252] The optimum temperature for the reduction reaction and conjugation reaction will typically be between about -10℃ and 37℃, e.g. about 4℃-22℃. For instance, the reduction reaction occurs at a temperature of about 4℃ overnight, and the conjugation reaction occurs at a temperature of about 4℃ for 2-8 h. The temperature and time may vary depending on the amounts of antibody, reductant and drugs used.

[0253] For instance, the antibody to be conjugated, the metal ions and the reductant may be present in the reaction mixture in a ratio of 1: 2: 4 in molar concentration. In one embodiment, 0.02 mM antibody is incubated with 0.08 mM TCEP and 0.04 mM ZnCl2 at 4℃ overnight.

[0254] In the resultant ADCs, the content of D4 ADCs can reach at least 80 wt%, for example, at least 85 wt%, at least 90 wt%, at least 91 wt%, at least 92 wt%, at least 93 wt%, at least 94 wt%, or at least 95 wt%on the basis of total weight of ADCs.

[0255] There are no specific limitations to the drug and linker which can be used in the conjugation process of the present disclosure, as long as the drug molecule has an antitumor, antiviral or antimicrobial effect and contains at least one substituted group or a partial structure allowing connection to a linker structure, and the linker contains at least two reactive groups, one of which can covalently bond a drug molecule and the other of which can covalently couple to an antibody. Preferably, the linker is susceptible to –SH attack from the antibody and capable of forming a linkage with the antibody.

[0256] Depending on the desired drug and selected linker, those skilled in the art can select suitable method for coupling them together. For example, some conventional coupling methods, such as amine coupling methods, may be used to form the desired drug-linker complex which still contains reactive groups for conjugating to the antibodies through covalent linkage. A drug-maleimide complex (i.e., maleimide linking drug) is taken as an example of the payload bearing reactive group in the present disclosure.

[0257] In an embodiment, the drug may include, but not limited to, cytotoxic reagents, such as chemo-therapeutic agents, immunotherapeutic agents and the like, antiviral agents or antimicrobial agents. In an embodiment, the drug to be conjugated with an antibody may be selected from, but not limited to, MMAE (monomethyl auristatin E) , MMAD (monomethyl auristatin D) , MMAF (monomethyl auristatin F) , and the like.

[0258] Most common reactive group capable of bonding to thiol group in ADC preparation is maleimide. Additionally, organic bromides, iodides also are frequently used.

[0259] Additional exemplary embodiments comprising MMAE or MMAF and various linker components. For example, VcMMAE (Mc-vc-PAB-MMAE) is obtained by using MMAE linked via p-aminobenzyloxycarbonyl ( “PAB” ) to the lysosomally cleavable dipeptide valine-citrulline (vc) and a thiolreactive maleimidocaproyl spacer (MC) .

[0260] Anti-integrin ανβ6 ADCs with certain properties

[0261] The ADCs of the present disclosure are characterized by particular functional features or properties. The in vitro and in vivo functional characteristics and pharmacological activity of the antibodies and ADCs have been fully assessed at the molecular and cellular levels according to the mechanism of action for the target. The ADCs as disclosed herein may have one or more of the following properties:

[0262] (a) have an equivalent or similar binding to integrin ανβ6 as the anti-integrin ανβ6 antibody;

[0263] (b) show strong killing of integrin ανβ6 expressing tumor cells, and no killing of integrin ανβ6 negative cells or normal cells in vitro;

[0264] (c) show significantly better tumor inhibition in in vivo tumor model compared with benchmark ADCs and a good dose-dependent antitumor effect.

[0265] III. Nucleic acid molecules encoding the antibodies

[0266] In some aspects, the disclosure provides an isolated nucleic acid molecule, comprising a nucleic acid sequence encoding the heavy chain variable region and / or the light chain variable region of the isolated antibody as disclosed herein.

[0267] Nucleic acids of the disclosure can be obtained using standard molecular biology techniques. For antibodies expressed by hybridomas, cDNAs encoding the light and heavy chains of the antibody made by the hybridoma can be obtained by standard PCR amplification or cDNA cloning techniques. For antibodies obtained from an immunoglobulin gene library (e.g., using phage display techniques) , a nucleic acid encoding such antibodies can be recovered from the gene library.

[0268] The isolated nucleic acid encoding the VH region can be converted to a full-length heavy chain gene by operatively linking the VH-encoding nucleic acid to another DNA molecule encoding heavy chain constant regions (CH1, CH2 and CH3) . The sequences of human heavy chain constant region genes are known in the art (see e.g., Kabat et al. (1991) , supra) and DNA fragments encompassing these regions can be obtained by standard PCR amplification. The heavy chain constant region can be an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD constant region, but more preferably is an IgG1 or IgG4 constant region.

[0269] The isolated nucleic acid encoding the VL region can be converted to a full-length light chain gene (as well as a Fab light chain gene) by operatively linking the VL-encoding DNA to another DNA molecule encoding the light chain constant region, CL. The sequences of human light chain constant region genes are known in the art (see e.g., Kabat et al., supra) and DNA fragments encompassing these regions can be obtained by standard PCR amplification. The light chain constant region may be a kappa or lambda constant region.

[0270] Once DNA fragments encoding VH and VL segments are obtained, these DNA fragments can be further manipulated by standard recombinant DNA techniques, for example to convert the variable region genes to full-length antibody chain genes, to Fab fragment genes or to a scFv gene. In these manipulations, a VL-or VH-encoding DNA fragment is operatively linked to another DNA fragment encoding another protein, such as an antibody constant region or a flexible linker. The term “operatively linked” , as used in this context, is intended to mean that the two DNA fragments are joined such that the amino acid sequences encoded by the two DNA fragments remain in-frame.

[0271] In some embodiments, the disclosure is directed to an isolated nucleic acid molecule, comprising a nucleic acid sequence encoding the heavy chain variable region of the isolated antibody as disclosed herein.

[0272] In some specific embodiments, the isolated nucleic acid molecule encodes the heavy chain variable region of the isolated antibody and comprises a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:

[0273] (A) a nucleic acid sequence that encodes a heavy chain variable region as set forth in SEQ ID NO: 7; (B) a nucleic acid sequence having at least 85%, 90%, or 95%identity to the nucleic acid sequence of (A) ; or (C) a nucleic acid sequence that hybridizes under high stringency conditions to the complementary strand of the nucleic acid sequence of (A) .

[0274] In some embodiments, the disclosure is directed to an isolated nucleic acid molecule, comprising a nucleic acid sequence encoding the light chain variable region of the isolated antibody as disclosed herein.

[0275] In some specific embodiments, the isolated nucleic acid molecule encodes the light chain variable region of the isolated antibody comprises a nucleic acid sequence selected from the group consisting of:

[0276] (A) a nucleic acid sequence that encodes a light chain variable region as set forth in SEQ ID NO: 8; (B) a nucleic acid sequence having at least 85%, 90%, or 95%identity to the nucleic acid sequence of (A) ; or (C) a nucleic acid sequence that hybridizes under high stringency conditions to the complementary strand of the nucleic acid sequence of (A) .

[0277] In some specific embodiments, the percentage of identity is derived from the degeneracy of the genetic code, and the encoded protein sequences remain unchanged.

[0278] Exemplary high stringency conditions include hybridization at 45℃ in 5X SSPE and 45%formamide, and a final wash at 65℃ in 0.1 X SSC. It is understood in the art that conditions of equivalent stringency can be achieved through variation of temperature and buffer, or salt concentration as described Ausubel, et al. (Eds. ) , Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons (1994) , pp. 6.0.3 to 6.4.10. Modifications in hybridization conditions can be empirically determined or precisely calculated based on the length and the percentage of guanosine / cytosine (GC) base pairing of the probe. The hybridization conditions can be calculated as described in Sambrook, et al, (Eds. ) , Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989) , pp. 9.47 to 9.51.

[0279] IV. Host Cells

[0280] Host cells as disclosed in the present disclosure may be any cell which is suitable for expressing the antibodies of the present disclosure, for example, yeast, bacterial, plant and mammalian cells. Mammalian host cells for expressing the antibodies of the present disclosure include Chinese Hamster Ovary (CHO cells) (including dhfr CHO cells, described in Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77: 4216-4220, used with a DHFR selectable marker, e.g., as described in R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. MoI. Biol. 159: 601-621) , 293F cells, NSO myeloma cells, COS cells and SP2 cells. In particular, for use with NSO myeloma cells, another expression system is the GS gene expression system disclosed in WO 87 / 04462, WO 89 / 01036 and EP 338, 841. Also included are monkey kidney CV1 line transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; human embryonic kidney line (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977) ) ; baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10) ; Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216) ; mouse sertoli cells (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23: 243-251) ; monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70) ; African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2) ; canine kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34) ; buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; human lung cells (W138, ATCC CCL 75) ; human liver cells (Hep G2, HB 8065) ; mouse mammary tumor (MMT 060562, ATCC CCL51) ; TRI cells (Mather et al., 1982, Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68) ; MRC 5 cells; FS4 cells; mouse myeloma cells, such as NSO (e.g. RCB0213, 1992, Bio / Technology 10: 169) and SP2 / 0 cells (e.g. SP2 / 0-Ag14 cells, ATCC CRL 1581) ; rat myeloma cells, such as YB2 / 0 cells (e.g. YB2 / 3HL. P2. G11.16Ag. 20 cells, ATCC CRL 1662) ; PER. C6 cells; and a human hepatoma line (Hep G2) . CHO cells are one of the cell lines that can be used herein, with CHO-K1, DUK-B11, CHO-DP12, CHO-DG44 (Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555 (1986) ) , and Lec13 being exemplary host cell lines. In the case of CHO-K1, DUK-B11, DG44 or CHO-DP12 host cells, these may be altered such that they are deficient in their ability to fucosylate proteins expressed therein. In some embodiments, the host cells herein are selected from CHO, CHO-S, HEK, HEK293, HEK-293F, Expi293F, PER. C6 or NSO cells or lymphocytic cells.

[0281] Suitable prokaryotes for this purpose include eubacteria, such as Gram-negative or Gram-positive organisms, for example, Enterobacteriaceae such as Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans, and Shigella, as well as Bacilli such as B. subtilis and B. licheniformis, Pseudomonas such as P. aeruginosa, and Streptomyces.

[0282] In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are also suitable cloning or expression hosts for antibody-encoding vectors. Saccharomyces cerevisiae, or common baker’s yeast, is the most commonly used among lower eukaryotic host microorganisms. However, a number of other genera, species, and strains are commonly available and useful herein, such as Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces hosts such as, e.g., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424) , K. bulgaricus (ATCC 16,045) , K. wickeramii (ATCC 24,178) , K. waltii (ATCC 56,500) , K. drosophilarum (ATCC 36,906) , K. thermotolerans, and K. marxianus; yarrowia (EP 402,226) ; Pichia pastoris (EP 183,070) ; Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234) ; Neurosporacrassa; Schwanniomyces such as Schwanniomycesoccidentalis; and filamentous fungi such as, e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, and Aspergillus hosts such as A. nidulans and A. niger.

[0283] When recombinant expression vectors encoding an antibody are introduced into mammalian host cells, the antibody is produced by culturing the host cells for a period of time sufficient to allow for expression of the antibody in the host cells or, secretion of the antibody into the culture medium in which the host cells are grown. Antibodies can be recovered from the culture medium using standard protein purification methods.

[0284] V. Pharmaceutical Compositions

[0285] In some aspects, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the ανβ6-binding antibody or antibody-drug conjugates thereof as disclosed herein, and a pharmaceutically acceptable carrier. In some aspects, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid encoding the ανβ6-binding antibody as disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier. In some aspects, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising a cell expressing the ανβ6-binding antibody as disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0286] Components of the compositions

[0287] The pharmaceutical composition may optionally contain one or more additional components, including one or more pharmaceutically active ingredients, such as another antibody or a drug. The pharmaceutical compositions of the disclosure also can be administered in a combination therapy with, for example, another immune-stimulatory agent, anti-cancer agent, an antiviral agent, or a vaccine. A pharmaceutically acceptable carrier can include, for example, a pharmaceutically acceptable liquid, gel or solid carriers, an aqueous medium, a non-aqueous medium, an anti-microbial agent, isotonic agents, buffers, antioxidants, anesthetics, suspending / dispersing agent, a chelating agent, a diluent, adjuvant, excipient or a nontoxic auxiliary substance, or other various combinations of components known in the art.

[0288] Suitable components of the pharmaceutical composition may include, for example, antioxidants, fillers, binders, disintegrating agents, buffers, preservatives, lubricants, flavorings, thickening agents, coloring agents, emulsifiers or stabilizers such as sugars and cyclodextrin. Suitable anti-oxidants may include, for example, methionine, ascorbic acid, EDTA, sodium thiosulfate, platinum, catalase, citric acid, cysteine, mercapto glycerol, thioglycolic acid, Mercapto sorbitol, butyl methyl anisole, butylated hydroxy toluene and / or propyl gallate. In some embodiments, the composition may comprise the antibody or antigen-binding fragment or ADCs thereof as disclosed herein and also comprise one or more anti-oxidants such as methionine, to prevent or reduce a decrease in binding affinity, thereby enhancing antibody stability and extended shelf life. The present disclosure further provides a variety of methods, wherein the antibody or antigen binding fragment thereof or ADCs is mixed with one or more anti-oxidants, such as methionine, so that the antibody or antigen binding fragment thereof can be prevented from oxidation, to extend their shelf life and / or increased activity.

[0289] To further illustrate, pharmaceutical acceptable carriers may include, for example, aqueous vehicles such as sodium chloride injection, Ringer's injection, isotonic dextrose injection, sterile water injection, or dextrose and lactated Ringer's injection, nonaqueous vehicles such as fixed oils of vegetable origin, cottonseed oil, corn oil, sesame oil, or peanut oil, antimicrobial agents at bacteriostatic or fungistatic concentrations, isotonic agents such as sodium chloride or dextrose, buffers such as phosphate or citrate buffers, antioxidants such as sodium bisulfate, local anesthetics such as procaine hydrochloride, suspending and dispersing agents such as sodium carboxymethylcelluose, hydroxypropyl methylcellulose, or polyvinylpyrrolidone, emulsifying agents such as Polysorbate 80 (TWEEN-80) , sequestering or chelating agents such as EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) or EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid) , ethyl alcohol, polyethylene glycol, propylene glycol, sodium hydroxide, hydrochloric acid, citric acid, or lactic acid. Antimicrobial agents utilized as carriers may be added to pharmaceutical compositions in multiple-dose containers that include phenols or cresols, mercurials, benzyl alcohol, chlorobutanol, methyl and propyl p-hydroxybenzoic acid esters, thimerosal, benzalkonium chloride and benzethonium chloride. Suitable excipients may include, for example, water, saline, dextrose, glycerol, or ethanol. Suitable non-toxic auxiliary substances may include, for example, wetting or emulsifying agents, pH buffering agents, stabilizers, solubility enhancers, or agents such as sodium acetate, sorbitan monolaurate, triethanolamine oleate, or cyclodextrin.

[0290] Administration, Formulation and Dosage

[0291] A pharmaceutical composition of the disclosure may be administered to a subject in need thereof, by various routes, including, but not limited to, oral, intravenous, intra-arterial, subcutaneous, parenteral, intranasal, intramuscular, intracranial, intracardiac, intraventricular, intratracheal, buccal, rectal, intraperitoneal, intradermal, topical, transdermal, and intrathecal, or otherwise by implantation or inhalation. The subject compositions may be formulated into preparations in solid, semi-solid, liquid, or gaseous forms; including, but not limited to, tablets, capsules, powders, granules, ointments, solutions, suppositories, enemas, injections, inhalants, and aerosols. The appropriate formulation and route of administration may be selected according to the intended application and therapeutic regimen.

[0292] Suitable formulations for enteral administration include hard or soft gelatin capsules, pills, tablets, including coated tablets, elixirs, suspensions, syrups or inhalations and controlled release forms thereof.

[0293] Formulations suitable for parenteral administration (e.g., by injection) , include aqueous or non-aqueous, isotonic, pyrogen-free, sterile liquids (e.g., solutions, suspensions) , in which the active ingredient is dissolved, suspended, or otherwise provided (e.g., in a liposome or other microparticulate) . Such liquids may additional contain other pharmaceutically acceptable ingredients, such as anti-oxidants, buffers, preservatives, stabilizers, bacteriostats, suspending agents, thickening agents, and solutes which render the formulation isotonic with the blood (or other relevant bodily fluid) of the intended recipient. Examples of excipients include, for example, water, alcohols, polyols, glycerol, vegetable oils, and the like. Examples of suitable isotonic carriers for use in such formulations include Sodium Chloride Injection, Ringer's Solution, or Lactated Ringer's Injection. Similarly, the particular dosage regimen, including dose, timing and repetition, will depend on the particular individual and that individual's medical history, as well as empirical considerations such as pharmacokinetics (e.g., half-life, clearance rate, etc. ) .

[0294] Frequency of administration may be determined and adjusted over the course of therapy and is based on reducing the number of proliferative or tumorigenic cells, maintaining the reduction of such neoplastic cells, reducing the proliferation of neoplastic cells, or delaying the development of metastasis. In some embodiments, the dosage administered may be adjusted or attenuated to manage potential side effects and / or toxicity. Alternatively, sustained continuous release formulations of a subject therapeutic composition may be appropriate.

[0295] It will be appreciated by one of skill in the art that appropriate dosages can vary from patient to patient. Determining the optimal dosage will generally involve the balancing of the level of therapeutic benefit against any risk or deleterious side effects. The selected dosage level will depend on a variety of factors including, but not limited to, the activity of the particular compound, the route of administration, the time of administration, the rate of excretion of the compound, the duration of the treatment, other drugs, compounds, and / or materials used in combination, the severity of the condition, and the species, sex, age, weight, condition, general health, and prior medical history of the patient. The amount of compound and route of administration will ultimately be at the discretion of the physician, veterinarian, or clinician, although generally the dosage will be selected to achieve local concentrations at the site of action that achieve the desired effect without causing substantial harmful or deleterious side-effects.

[0296] In any event, the antibody or antigen binding portion thereof or ADCs of the disclosure is / are preferably administered as needed to subjects in need thereof. Determination of the frequency of administration may be made by persons skilled in the art, such as an attending physician based on considerations of the condition being treated, age of the subject being treated, severity of the condition being treated, general state of health of the subject being treated and the like.

[0297] In some embodiments, the course of treatment involving an anti-ανβ6 antibody of the present disclosure will comprise multiple doses of the selected drug product over a period of weeks or months. For example, an anti-ανβ6 antibody of the present disclosure may be administered once every day, every two days, every four days, every week, every ten days, every two weeks, every three weeks, every month, every six weeks, every two months, every ten weeks or every three months. In this regard, it will be appreciated that the dosages may be altered or the interval may be adjusted based on patient response and clinical practices. Generally, the ADCs would be administrated at a lower frequency than the antibody.

[0298] Dosages and regimens may also be determined empirically for the disclosed therapeutic compositions in individuals who have been given one or more administration (s) . For example, individuals may be given incremental dosages of a therapeutic composition produced as described herein. In some embodiments, the dosage may be gradually increased or reduced or attenuated based respectively on empirically determined or observed side effects or toxicity. To assess efficacy of the selected composition, a marker of the specific disease, disorder or condition can be followed as described previously. For cancer, these include direct measurements of tumor size via palpation or visual observation, indirect measurement of tumor size by x-ray or other imaging techniques; an improvement as assessed by direct tumor biopsy and microscopic examination of the tumor sample; the measurement of an indirect tumor marker or a tumorigenic antigen, a decrease in pain or paralysis; improved speech, vision, breathing or other disability associated with the tumor; increased appetite; or an increase in quality of life as measured by accepted tests or prolongation of survival.

[0299] In some instances, compatible formulations for parenteral administration (e.g., intravenous injection) may comprise an anti-ανβ6 antibody as disclosed herein in concentrations of from about 10 μg / ml to about 100 mg / ml.

[0300] VI. Applications of the Disclosure

[0301] The antibodies, ADCs, compositions and methods of the present disclosure have numerous in vitro and in vivo utilities and uses including, for example, detection of ανβ6 or regulation of ανβ6 related immune response. For example, these molecules can be administered to cells in culture, in vitro or ex vivo, or to human subjects, e.g., in vivo, to enhance immunity in a variety of situations.

[0302] The antibodies of the invention, alone or as anti-ανβ6 antibody drug conjugates, are particularly suitable for treating human patients having a condition or disorder associated with ανβ6, such as fibrotic diseases or cancers that show detectable levels of ανβ6 measured at either the protein (e.g., by immunoassay using one of the exemplified antibodies) or mRNA level. Some such cancers show elevated levels of ανβ6 relative to noncancerous tissue of the same type, preferably from the same patient. Optionally, the level of ανβ6 in a cancer is measured before performing treatment. To achieve antigen-specific enhancement of immunity, anti-ανβ6 antibodies can be administered together with another agent, the two can be administered in either order or simultaneously.

[0303] Examples of cancers associated with ανβ6 expression and amenable to treatment include, for example, bladder cancer, head and neck cancer (including, for example, cancers of the lip, oral cavity, nasal cavity, paranasal sinuses, pharynx, and larynx) , skin cancer, lung cancer (e.g. NSCLC) , pancreatic cancer (e.g. PDAC) , uterine cancer, breast cancer (including triple negative breast cancer) , colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, stomach cancer, and liver cancer. In some embodiments, squamous cell carcinomas and adenocarcinomas are examples of cancers associated with ανβ6 expression and amenable to treatment. The treatment can be applied to patients having primary or metastatic tumors of these kinds. The treatment can also be applied to patients who are treatment naive, who are refractory to conventional treatments (e.g., hormones, tamoxifen, herceptin) , or who have relapsed following a response to such treatments.

[0304] The present disclosure further provides methods for detecting the presence of human ανβ6 antigen in a sample, or measuring the amount of human ανβ6 antigen, comprising contacting the sample or a control sample with the antibody or antigen binding portion thereof, which specifically binds to human ανβ6, under conditions that allow for formation of a complex between the antibody or portion thereof and human ανβ6. The formation of a complex is then detected, wherein a difference complex formation between the sample compared to the control sample is indicative of the presence of human ανβ6 antigen in the sample. Moreover, anti-ανβ6 antibodies of the disclosure can be used to purify human ανβ6 via immunoaffinity purification.

[0305] Treatment of disorders including cancers

[0306] In some aspects, the present disclosure provides a method of treating a disorder or disease associated with ανβ6 in a mammal, which comprises administering to the subject (for example, a human) in need of treatment a therapeutically effective amount of an anti-ανβ6 antibody or antigen-binding portion thereof or ADCs as disclosed herein. In some aspects, the present disclosure provides an anti-ανβ6 antibody or antigen-binding portion thereof or ADCs as disclosed herein for use in treating a disease or disorder associated with ανβ6. In some aspects, provided herein is a use of an anti-ανβ6 antibody or antigen-binding portion thereof or ADCs as disclosed herein for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or disorder associated with ανβ6. In some embodiments, the disorder or disease to be treated is a fibrotic disease, such as fibrosis, including liver fibrosis, lung fibrosis, kidney fibrosis, cardiac fibrosis, arthrofibrosis, mediastinal fibrosis, myelofibrosis, nephrogenic systemic fibrosis, Peyronie’s disease, progressive massive fibrosis, small airway fibrosis, fibrosis associated with chronic obstructive pulmonary disease, and retroperitoneal fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, scleroderma / systemic sclerosis. In some other embodiments, the disorder or disease to be treated is a cancer, such as a cancer of epithelial origin, including a squamous cell carcinoma, an adenocarcinoma, a transitional cell carcinoma, or a basal cell carcinoma.

[0307] A variety of cancers where ανβ6 is implicated, whether malignant or benign and whether primary or secondary, may be treated or prevented with a method provided by the disclosure. The cancers may include, but not limited to, ovary cancer, lung cancer, pancreas cancer, breast cancer, uterine cancer, fallopian tube cancer, primary peritoneum cancer, adrenal cancer, liver cancer, kidney cancer, bladder cancer, gastric cancer, cervical cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, prostate cancer, thyroid cancer, sarcomas, glioblastomas and head and neck cancer or cancer of any other tissue that expresses ανβ6. In some specific embodiments, the cancer to be treated is breast cancer, pancreatic cancer or lung cancer (such as NSCLC) .

[0308] Combined Therapy

[0309] The anti-ανβ6 antibody or ADCs may be used alone as a monotherapy, or may be used in combination with chemical therapies, radiotherapies, targeted therapies or cell immunotherapies etc.

[0310] For combinational usage with a chemotherapy, the anti-ανβ6 antibody may be used in combination with chemotherapies such as an anti-cancer agent, a cytotoxic agent or chemotherapeutic agent, including but not limited to, cytotoxic agents, cytostatic agents, anti-angiogenic agents, debulking agents, chemotherapeutic agents, radiotherapy and radiotherapeutic agents, targeted anti-cancer agents, BRMs, therapeutic antibodies, cancer vaccines, cytokines, hormone therapies, radiation therapy and anti-metastatic agents and immunotherapeutic agents. It will be appreciated that, in some embodiments as discussed above, such anti-cancer agents may be conjugated to the disclosed anti-ανβ6 antibodies prior to administration. For example, the selected anti-cancer agents may be linked to the unpaired cysteines of the antibodies to provide ADCs as set forth herein. In some embodiments, the disclosed anti-cancer agents will be given in combination with anti-ανβ6 ADCs comprising a different therapeutic agent as set forth above.

[0311] As used herein the term “cytotoxic agent” means a substance that is toxic to the cells and decreases or inhibits the function of cells and / or causes destruction of cells. In some embodiments, the substance is a naturally occurring molecule derived from a living organism. Examples of cytotoxic agents include, but are not limited to, small molecule toxins or enzymatically active toxins of bacteria (e.g., Diptheria toxin, Pseudomonas endotoxin and exotoxin, Staphylococcal enterotoxin A) , fungal (e.g., α-sarcin, restrictocin) , plants (e.g., abrin, ricin, modeccin, viscumin, pokeweed anti-viral protein, saporin, gelonin, momoridin, trichosanthin, barley toxin, Aleurites fordii proteins, dianthin proteins, Phytolacca mericana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S) , Momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, saponaria officinalis inhibitor, gelonin, mitegellin, restrictocin, phenomycin, neomycin, and the tricothecenes) or animals, (e.g., cytotoxic RNases, such as extracellular pancreatic RNases; DNase I, including fragments and / or variants thereof) .

[0312] For the purposes of the present disclosure a “chemotherapeutic agent” comprises a chemical compound that non-specifically decreases or inhibits the growth, proliferation, and / or survival of cancer cells (e.g., cytotoxic or cytostatic agents) . Such chemical agents are often directed to intracellular processes necessary for cell growth or division, and are thus particularly effective against cancerous cells, which generally grow and divide rapidly. For example, vincristine depolymerizes microtubules, and thus inhibits cells from entering mitosis. In general, chemotherapeutic agents can include any chemical agent that inhibits, or is designed to inhibit, a cancerous cell or a cell likely to become cancerous or generate tumorigenic progeny (e.g., TIC) . Such agents are often administered, and are often most effective, in combination, e.g., in regimens such as CHOP or FOLFIRI.

[0313] Examples of anti-cancer agents that may be used in combination with anti-ανβ6 antibodies of the present disclosure (either as a component of a site specific conjugate or in an unconjugated state) include, but are not limited to, alkylating agents, alkyl sulfonates, aziridines, ethylenimines and methylamelamines, acetogenins, a camptothecin, bryostatin, callystatin, CC-1065, cryptophycins, dolastatin, duocarmycin, eleutherobin, pancratistatin, a sarcodictyin, spongistatin, nitrogen mustards, antibiotics, enediyne antibiotics, dynemicin, bisphosphonates, esperamicin, chromoprotein enediyne antiobiotic chromophores, aclacinomysins, actinomycin, authramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, carabicin, carminomycin, carzinophilin, chromomycinis, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine,  doxorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycins, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; anti-metabolites, erlotinib, vemurafenib, crizotinib, sorafenib, ibrutinib, enzalutamide, folic acid analogues, purine analogs, androgens, anti-adrenals, folic acid replenisher such as frolinic acid, aceglatone, aldophosphamide glycoside, aminolevulinic acid, eniluracil, amsacrine, bestrabucil, bisantrene, edatraxate, defofamine, demecolcine, diaziquone, elfornithine, elliptinium acetate, an epothilone, etoglucid, gallium nitrate, hydroxyurea, lentinan, lonidainine, maytansinoids, mitoguazone, mitoxantrone, mopidanmol, nitraerine, pentostatin, phenamet, pirarubicin, losoxantrone, podophyllinic acid, 2-ethylhydrazide, procarbazine,  polysaccharide complex (JHS Natural Products, Eugene, OR) , razoxane; rhizoxin; sizofiran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquone; 2, 2', 2"-trichlorotriethylamine; trichothecenes (especially T-2 toxin, verracurin A, roridin A and anguidine) ; urethan; vindesine; dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosine; arabinoside ( “Ara-C” ) ; cyclophosphamide; thiotepa; taxoids, chloranbucil;  gemcitabine; 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; platinum analogs, vinblastine; platinum; etoposide (VP-16) ; ifosfamide; mitoxantrone; vincristine;  vinorelbine; novantrone; teniposide; edatrexate; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronate; irinotecan (Camptosar, CPT-11) , topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluorometlhylornithine; retinoids; capecitabine; combretastatin; leucovorin; oxaliplatin; inhibitors of PKC-alpha, Raf, H-Ras, EGFR and VEGF-Athat reduce cell proliferation and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above. Also included in this definition are anti-hormonal agents that act to regulate or inhibit hormone action on tumors such as anti-estrogens and selective estrogen receptor modulators, aromatase inhibitors that inhibit the enzyme aromatase, which regulates estrogen production in the adrenal glands, and anti-androgens; as well as troxacitabine (a1, 3-dioxolane nucleoside cytosine analog) ; antisense oligonucleotides, ribozymes such as a VEGF expression inhibitor and a HER2 expression inhibitor; vaccines,  rIL-2;  topoisomerase 1 inhibitor;  rmRH; Vinorelbine and Esperamicins and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above.

[0314] Diagnosis

[0315] The disclosure provides in vitro and in vivo methods for detecting, diagnosing or monitoring proliferative disorders and methods of screening cells from a patient to identify tumor cells including tumorigenic cells. Such methods include identifying an individual having cancer for treatment or monitoring progression of a cancer, comprising contacting the patient or a sample obtained from a patient (either in vivo or in vitro) with an anti-ανβ6 antibody as described herein and detecting presence or absence, or level of association, of the antibody to bound or free target molecules in the sample. In some embodiments, the anti-ανβ6 antibody will comprise a detectable label or reporter molecule as described herein.

[0316] In some embodiments, the association of an anti-ανβ6 antibody with particular cells in the sample can denote that the sample may contain tumorigenic cells, thereby indicating that the individual having cancer may be effectively treated with an anti-ανβ6 antibody as described herein.

[0317] Samples can be analyzed by numerous assays, for example, radioimmunoassays, enzyme immunoassays (e.g. ELISA) , competitive-binding assays, fluorescent immunoassays, immunoblot assays, Western Blot analysis and flow cytometry assays. Compatible in vivo theragnostic or diagnostic assays can comprise art recognized imaging or monitoring techniques, for example, magnetic resonance imaging, computerized tomography (e.g. CAT scan) , positron tomography (e.g., PET scan) , radiography, ultrasound, etc., as would be known by those skilled in the art.

[0318] VII. Pharmaceutical packs and kits

[0319] Pharmaceutical packs and kits comprising one or more containers filled with the anti-ανβ6 antibody, ADC or nucleic acid molecules as disclosed herein are also provided. In some embodiments, a unit dosage is provided wherein the unit dosage contains a predetermined amount of a composition comprising the anti-ανβ6 antibody, with or without one or more additional agents. In some embodiments, such a unit dosage is supplied in single-use prefilled syringe for injection. In some embodiments, the composition contained in the unit dosage may comprise saline, sucrose, or the like; a buffer, such as phosphate, or the like; and / or be formulated within a stable and effective pH range. Alternatively, in some embodiments, a composition may be provided as a lyophilized powder that may be reconstituted upon addition of an appropriate liquid, for example, sterile water or saline solution. In some embodiments, the composition comprises one or more substances that inhibit protein aggregation, including, but not limited to, sucrose and arginine. Any label on, or associated with, the container (s) indicates that the enclosed composition is used for treating the neoplastic disease condition of choice.

[0320] The containers may be formed from a variety of materials such as glass or plastic and contain a pharmaceutically effective amount of the disclosed ανβ6-binding antibody in a conjugated or unconjugated form. In some embodiments, the container (s) comprise a sterile access port (for example the container may be an intravenous solution bag or a vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle) . The kits may also contain other pharmaceutically acceptable formulations, either for diagnosis or combined therapy.

[0321] Sequence Listing Summary

[0322] Appended to the instant application is a sequence listing comprising a number of amino acid sequences. The following Table B provides a summary of the sequences, including the sequences of the exemplary antibody W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320. “uIgG1KV320” denotes the IgG1 Fc region comprising L234A / L235A mutations.

[0323] Table B. Amino acid sequences of W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320

[0324] EXAMPLES

[0325] The present disclosure, thus generally described, will be understood more readily by reference to the following Examples, which are provided by way of illustration and are not intended to be limiting of the present disclosure. The Examples are not intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed.

[0326] Example 1: Preparation of Benchmark Antibodies and Cell Lines

[0327] 1.1 Materials and information

[0328] 1.2 Preparation of benchmark antibodies (BMKs)

[0329] The amino acid sequences encoding the variable domains of the W3XX126-BMK2 (h2A2, Seagen, patent US 2021 / 0198367A1) were first codon optimized for mammalian expression and then synthesized by GENEWIZ (SuZhou, CHINA) . The DNA segments were then sub-cloned into pcDNA3.4 expression vectors with constant region of human IgG1. The plasmids containing VH and VL gene were co-transfected into Expi293 cells. Cells were cultured for 5 days and supernatant was collected for protein purification using Protein A column (GE Healthcare, #175438) . The obtained antibodies were analyzed by SDS-PAGE and SEC-HPLC, and then stored at -80 ℃.

[0330] 1.3 Cell Pool / Line Generation

[0331] FreeStyleTM 293F cells express endogenous integrin αv and they were stably transfected with a full length cDNA encoding human integrin β6 (Uniprot #P18564, p1W3XX126-hPro1. FL) or cyno integrin β6 (Uniprot #A0A1D5QZT0, p1W3XX126-cPro1. FL) to generate human or cyno integrin ανβ6 expressing cell line, W3XX126-293F / huβ6 and W3XX126-293F / cynoβ6, respectively. Briefly, 293F cells were transfected with pcDNA3.3 expression vector containing full-length of human or cyno integrin β6 using Lipofectamine 2000 transfection kit (Invitrogen #11668019) according to the manufacturer’s protocol. 48 hours post transfection, the transfected cells were cultured in medium containing 6 μg / mL blasticidin for selection and for human or cyno integrin αvβ6 expression detection. The cell clones were sorted by BD FACSMelodyTM cell sorter. A final clone with stable human or cyno integrin αvβ6 expression was developed.

[0332] Example 2: Generation of Hybridoma, Chimeric and Humanized Antibodies

[0333] 2.1 Generation of Hybridoma

[0334] BALB / c mice from Zhejiang Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd at age of 6-8 weeks were immunized with human integrin ανβ6 (Acro, #IT6-H52E1) . After immunization, hybridoma generation, screening by FACS, ELISA and internalization assay, subcloning and hybridoma sequencing, hybridoma antibody W301126-1.32.8 was obtained.

[0335] 2.2 Chimeric Antibody Generation

[0336] The cognate hybridoma antibody W301126-1.32.8 was altered by replacing the hinge and constant region of the heavy and light chains with the human IgG1 with L234A / L235A mutations. Briefly, the VH and VL DNA sequence were synthesized and then cloned into a modified human hIgG1 expression pcDNA3.4 vector to create the chimeric antibody. Expi293 cells were transiently transfected with the vector for antibody expression. The plasmids containing VH or VL gene were co-transfected into Expi293 cells. Cells were cultured for 5 days and supernatant was collected for protein purification using Protein A chromatography. The generated antibody was named as “W301126-1.32.8-xIgG1KV320” . The obtained antibody was analyzed by SDS-PAGE and SEC-HPLC, and then stored at -80 ℃.

[0337] 2.3 Antibody Numbering and CDR Identification

[0338] A local copy of the open sourced software ANARCI [9] is run to assign the Kabat numberings on W301126-1.32.8. The CDRs are identified according to the definitions at Dr. Martin’s website which are shown in Tables A and B.

[0339] 2.4 Design of Humanization and PTM Removal Variants

[0340] The VH and VL domain sequences of the murine antibody W301126-1.32.8 were aligned to the human germline sequence repertoires of the VH and VL domains at IMGT

[0010] respectively. The human germline sequence of the VH domain IGHV1-69*05 and IGHJ6*01 with the least number of amino acid differences in framework with respect to the VH domain sequence of W301126-1.32.8 was selected as the humanization template of the VH domain. The human germline sequence of the VL domain IGKV1-27*01 and IGKJ4 with the least number of amino acid differences in framework with respect to the VL domain sequence of W301126-1.32.8 was selected as the humanization template of the VL domain. The CDRs of W301126-1.32.8 VH and VL domains were grafted into the framework of the humanization template of the VH and VL domain to constitute the germlined VH and VL domain sequence.

[0341] To restore the antigen binding capacity which is usually lost upon CDR grafting, several “back mutation” positions in the framework are empirically selected to convert the amino acids in the germlined sequence to their counterpart amino acids in the original murine sequence. A set of humanization variants are empirically designed to explore different combinations of these selected back mutation sites.

[0342] 2.5 Humanized Variants Production

[0343] DNA sequence of humanized variants were synthesized in GEMEWIZ (Suzhou, CHINA) , and then subcloned into modified pcDNA3.4 expression vectors with constant region of human IgG1 with L234A / L235A mutation. The plasmids containing VH and VL gene were co-transfected into Expi293 cells. Cells were cultured for 5 days and supernatant was collected for SPR ranking assay or protein purification. The purified antibodies were analyzed by SDS-PAGE and SEC-HPLC, and then stored at -80 ℃. A lead antibody, named as W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 (abbreviated as W301126 antibody) , was selected for further characterization.

[0344] Example 3: Developability Test of W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320

[0345] 3.1 Thermal Stability by DSF

[0346] Tm (melting temperature) of each antibody was investigated using 7 Flex Real-Time PCR system. 19 μL of antibody solution was mixed with 1 μL of 80 X SYPRO Orange solution (Invitrogen) in the 96 well plate. Each sample is tested in duplicate wells. The plate was sealed with the Optical Adhesive Film and centrifuged at 3, 000 rpm for 5 minutes to remove any air bubbles. The plate was heated from 26 ℃ to 95 ℃ at a rate of 0.9 ℃ / min, and the resulting fluorescence data was collected. The negative derivatives of the fluorescence changes with respect to different temperatures were calculated, and the maximal value was defined as melting temperature Tm. If a protein has multiple unfolding transitions, the first two Tm were reported, named as Tm1 and Tm2. Data collection and Tm calculation were conducted automatically by the  Real Time PCR software software (v1.3) .

[0347] 3.2 Self-Interaction by AC-SINS

[0348] Self-Interaction of antibodies was investigated using AC-SINS method. Goat anti-human IgG Fc antibodies (capture) and ChromPure Goat IgG antibodies (non-capture) were buffer exchanged into 20 mM NaAc (pH 4.3) , and then the concentration was normalized to 0.4 mg / mL, respectively. Capture and non-capture IgG solution were mixed with a volume ratio of 4: 1. Then the IgG mixture was mixed with gold nanoparticle (AuNP) solution at a volume ratio of 1: 9, and incubated at room temperature overnight. To block the empty sites on the AuNP, thiolated PEG was added into the mixture to a final concentration 0.1 μM and incubated at room temperature for 1 h. The mixture was filtered through a 0.22 μm PVDF membrane, and 1 / 10 of the starting volume of 50 mM PB, pH 7.0 buffer was used to elute the coated AuNP particles from the membrane to obtain 10X AuNP solution. All antibodies were diluted to 0.1 mg / mL before testing. 90 μL of test antibody solution (0.1 mg / mL) was mixed with 20 μL 10X AuNP and incubated at room temperature for 2 h in a 96-well polypropylene plate. After incubation, 100 μL of the antibody-AuNP mixture was transferred into a 384-well polystyrene UV transparent plate. Absorbance data were collected from 510 to 570 nm at an increment of 1 nm. Δλmax value was calculated by subtraction the max absorbance value of samples with that of PBS.

[0349] 3.3 Hydrophobicity Interaction by HIC-HPLC

[0350] Hydrophobicity property of antibody was detected by HPLC 1260 Infinity II system (Agilent TechnologicsTM) with TSKgel butyl-NPR column (Tosoh#0042168) . Each sample was diluted to 1.0 mg / ml with PBS buffer and 10 μL diluted sample was injected into the column, and separated with a flow rate of 0.5 ml / min for 61 min. The running buffer is 25 mM sodium phosphate, pH 7.0 (Buffer A) and 25 mM sodium phosphate, 1.5 M (NH4) 2SO4, pH 7.0 (Buffer D) . The running gradient was 100%to 0%Buffer D and 0%to 100%Buffer A from 3 to 53 min. The peak retention was detected with UV light of the wavelength at 280 nm and 230 nm. The retention time was analyzed with HIC-HPLC analysis method to integrate all peak areas from 20 min to 40 min. The operation and analysis software was the OpenLab CDS Workstation (V 2.3.0.468) .

[0351] 3.4 Non-specific Binding by BVP ELISA

[0352] Baculovirus particle (BVP) were coated on ELISA plates by adding 100 μl per well of 1%BVP stock (in 50 mM sodium carbonate, pH 9.6) and incubated at 4℃ for 24 hours. Blocking buffer (PBS with 0.5%BSA) was added to the plate with 300 μL / well and incubated for 1 hour prior to three times’ wash with 300 μL PBS. Next, 100 μL of 1 μM primary antibodies in blocking buffer was added to the wells and incubated for 1 hour followed by five washes. 100 μL anti-Human-IgG-HRP was added to the wells and incubated for 1 hour followed by five washes as before. Finally, TMB substrate was added to each well and incubated for 8 to 10 minutes. The reaction was stopped by adding 100 μL of 2 M HCl to each well. The absorbance was read at 450 nm using M5e microplate reader and BVP score were determined by normalizing absorbance by control wells with no test antibody.

[0353] 3.5 DLS-kD

[0354] kD measurement was investigated using DynaPro Plate Reader III (Wyatt Technology) . Samples were firstly filtered with 0.1 μm filter and concentrated to 8～10 mg / mL to observe the appearance by visual inspection. Samples were then concentrated to over 20 mg / mL and diluted with corresponding buffer to a final concentration at 2.5, 5, 10, 15, and 20 mg / mL. 7.5 μL sample solution was then added to 1536 well microplate. The plate was sealed with the ClearSeal Film (Hampton Research#HR4-521) , and centrifuged at 3, 000 rpm for 5 min to let the sample down to the bottom of the well. Each sample is tested in duplicate wells. Put the plate into the corresponding position and data collection was performed by the DYNAMICS operation software (v7.8.1.3) . 5 acquisitions were collected for each protein sample while each acquisition time was 5s. For each measurement, the diffusion coefficient was determined and plotted against protein concentration. kD values were calculated automatically by the software. The purity of a dose point (15 mg / mL) will be tested after concentration.

[0355] 3.6 Thermal Stress Test

[0356] The antibody at 1 mg / mL was incubated at 40℃ for 14 days (T0 as the baseline control) . The antibodies before and after the stress treatment will be tested by Appearance, A280 and SEC-HPLC.

[0357] 3.7 Freeze-Thaw Stress Test

[0358] The antibodies at 1 mg / mL were frozen at -80℃ and thawed at room temperature (T0 as the baseline control) . After 5 repeated freeze / thaw cycling, the antibodies before and after the stress treatment were tested by Appearance, A280 and SEC-HPLC.

[0359] The results of 3.1-3.7 were shown below. W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 has good thermal stability, low risk of self-interaction and low hydrophobicity. The Tm1 value is 68.8 ℃ by DSF and the tagg onset value is 72.2 ℃ by DLS-Tagg. The retention time is 21.66 minutes by HIC-HPLC. It has good solubility and probably has low aggregation property indicated by DLS-kD. There is no significant change of SEC-HPLC purity of W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 after 5 cycles of freeze-thaw or stored at 40 ℃ for 14 days. The data is summarized in Table 1.

[0360] Table 1 Developability Summary Table

[0361] Example 4: In vitro Characterization of Antibodies

[0362] 4.1 ELISA Binding to Human, Cyno, Rat and Mouse Integrin ανβ6

[0363] The binding of W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 to human, cyno, rat and mouse integrin ανβ6 heterodimers was evaluated by protein ELISA. Briefly, 96-well plates (Nunc, #44-2404-21) were coated overnight at 4 ℃ with 1 μg / mL of recombinant protein diluted in coating buffer (Thermo, #28382) . Plates were washed once with wash buffer (PBS with 0.1%Tween) and then blocked for 1 hour at room temperature in blocking buffer (PBS with 2%BSA, 1 mM Ca2+ and 1mM Mg2+) . Plates were washed 3 times and then incubated for 2 hours at room temperature with antibodies diluted in PBS with 2%BSA, 1 mM Ca2+ and 1 mM Mg2+. After 3 times’ washing, plates were incubated for 1 hour with anti-Human-IgG-HRP. Plates were added 100 μL TMB per well after 6 times’ washing. The reaction was stopped with 2 M HCl. Absorbance at OD450 nm and OD540 nm wavelength were read using M5e microplate reader within 15 minutes. The data was analyzed using GraphPad Prism 7.

[0364] W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 has good binding to human integrin ανβ6, and cross-reacts to cynomolgus monkey, rat and mouse integrin ανβ6 (Fig. 1, Table 2) . In comparison, W3XX126-BMK2 has much weaker binding to rat and mouse integrin ανβ6.

[0365] Table 2 Integrin ανβ6 ELISA Binding Summary Table

[0366] 4.2 ELISA Binding to Homology Heterodimers

[0367] The binding of W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 to other homology heterodimers with integrin αν was confirmed by protein ELISA with human ανβ1 (Acro, #IT1-H52E1) , αvβ3 (Acro, #IT3-H52E3) , αvβ5 (Acro, #IT5-H52W5) or αvβ8 (Acro, #IT8-H52W4) proteins. The methods are same as described in section 4.1.

[0368] W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 does not bind to other heterodimers of integrin αν (Fig. 2) .

[0369] 4.3 FACS Binding to Cell Surface Integrin ανβ6

[0370] The binding of W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 to membrane integrin ανβ6 was detected by flow cytometry (FACS) . Human integrin ανβ6 expressing tumor cells HCC70 and HPAF-II, engineering cells W3XX126-293F / huβ6 and W3XX126-293F / cynoβ6 and parental 293F cells with endogenous integrin αν were used. Cells (1E5 / well) were aliquoted to 96-well U-bottom plates. Antibodies were diluted in PBS with 1%BSA, 1 mM Ca2+ and 1 mM Mg2+ and then added to cells for 1 hour incubation at 4℃. The cells were washed once using washing buffer (PBS with 1%BSA, 1 mM Ca2+ and 1 mM Mg2+) before incubation with secondary detection antibody in dark at 4℃ for 0.5 hour. The mean fluorescence intensity (MFI) of the cells was measured by a flow cytometer after 2 times’ washing after 0.5 hour incubation with fluorescence secondary detection antibody. Data was analyzed by FlowJo7.6 and the EC50 values were calculated by four-parameter non-linear regression analysis using GraphPad Prism7.

[0371] W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 has good binding to human β6 engineering 293F cells and cross-reacts to cynomolgus monkey β6 engineering 293F cells, while it has no binding to parental 293F cells with endogenous integrin αν expression (Fig. 3) . W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 binds to natively integrin ανβ6 expressing tumor cell lines HCC70 and HPAF-II, which is more potent than W3XX126-BMK2 (Fig. 4, Table 3) .

[0372] Table 3 FACS Binding to Tumor Cells

[0373] 4.4 Internalization Assay (pHrodo)

[0374] HPAF-II cells (1E4 / well) were aliquoted into a 96-well flat clear bottom black microplates (Greiner, #655090) . Primary antibodies and pHrodo labeled second antibody mixture (1: 1.2 molecule) were incubated at 37℃ for 30 min and then diluted in 5 fold in complete culture medium. 100 μL / well prepared mixture and diluted concentration (Primary antibodies 0.05 pM～100 nM) was added to the plate and the cells were incubated at 37℃ for 6 hours. After washing, 100 μL / well Hoechst33342 (Invitrogen, #H3570, 1 μg / ml) and Calcein AM (Invitrogen, #C3099 0.5 μg / ml) were added into the well and the plates were incubated at 37℃ for 15 minutes. After washing, 100 μL / well complete culture medium were added to the plate and the fluorescence intensity or fluorescence spots was measured by Operetta CLS High-Content Analysis System. The data was analyzed by four-parameter non-linear regression analysis using GraphPad Prism7.

[0375] W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 mediates internalization in pancreatic tumor cells HPAF-II after 6 hours incubation at 37 ℃, which is much more potent and greater than W3XX126-BMK2 (Fig. 5) .

[0376] 4.5 Competition Binding Assay

[0377] Integrin ανβ6 has been shown to be a receptor for RGD sites in latency-associated peptide (LAP) . Binding of integrin ανβ6 to LAP can induce the spatially restricted activation of transforming growth factor beta1 (TGFβ)

[0011] . LAP blockade assay was performed on engineering W3XX126-293F / huβ6 cells, which were used to evaluate the effect of W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 to LAP-integrin ανβ6 binding. Cells (1E5 / well) were aliquoted in a 96-well U-bottom plate and were incubated at 4℃ for 1 hour with the mixture of 20 nM recombinant human LAP-His (Uniprot, #P01137) and diluted concentration of antibodies (0.6 pM ～ 60 nM) in PBS with 1%BSA, 1 mM Ca2+ and 1 mM Mg2+. Cells were then washed and incubated at 4 ℃ for 0.5 hour with APC anti-His Tag antibody (Biolegend, #362605, 1: 100 dilution) . Cells were washed twice and resuspended by PBS with 1%BSA, 1 mM Ca2+ and 1 mM Mg2+. The mean fluorescence intensity (MFI) was measured by a flow cytometry and analyzed by Flowjo. The data was analyzed by four-parameter non-linear regression analysis using GraphPad Prism7.

[0378] The result showed that both W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 and W3XX126-BMK2 didn’ t interfere LAP binding (Fig. 6) .

[0379] The binding epitope (s) of W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 were preliminary determined using ELISA based competition binding assay with biotin labeled W3XX126-BMK2. The competition binding ELISA assay showed that W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 has different binding epitope (s) from W3XX126-BMK2 (Fig. 7) .

[0380] 4.6 Binding Affinity Test by SPR

[0381] The binding affinity of W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 to human, cyno, rat and mouse integrin ανβ6 was evaluated by Surface Plasmon Resonance (SPR) . Briefly, W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 in running buffer (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.05%surfactant P20, 1 mM Ca2+, 1 mM Mg2+, pH 7.4) was captured on an anti-human Fc IgG immobilized CM5 sensor chip (Cytiva) . Human integrin ανβ6 (Acro, #IT6-H52E1) , cyno integrin ανβ6 (Acro, #IT6-C52W9) , mouse integrin ανβ6 (Acro, #IT6-M52W9) and rat integrin ανβ6 (Acro, #IT6-R52E6) at different concentrations (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 and 400 nM for human, cyno and mouse integrin ανβ6; 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 and 400 nM for rat integrin ανβ6) were injected over the sensor chip in a multi-cycle approach at a flow rate of 30 μL / min for an association phase of 180 s, followed by 3600 s dissociation. The chip was regenerated by 10 mM glycine (pH 1.5) after each cycle. The sensorgrams for reference channel and buffer channel were subtracted from the test sensorgrams. The data were fitted by 1: 1 binding model and / or heterogeneous ligand model. Molecular weight of 193 kDa, 192 kDa, 192 kDa and 193 kDa was used to calculate the molar concentration of analyte human integrin ανβ6, cyno integrin ανβ6, rat integrin ανβ6 and mouse integrin ανβ6, respectively.

[0382] The results showed that W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 has comparable binding affinity to human, cyno, rat and mouse integrin ανβ6 with 10-9 M KD level (Table 4) . W3XX126-BMK2 has much weaker binding affinity to rat and mouse integrin ανβ6 than binding to human and cyno integrin ανβ6, which is consistent with that observed in ELISA binding assay (Table 2) .

[0383] Table 4 SPR Binding Affinity to Integrin ανβ6

[0384] Example 5: In vitro and In vivo Characterization of MMAE Conjugated ADC

[0385] 5.1 In vitro Efficacy Study

[0386] Anti-tumor activity of MMAE conjugated W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 to tumor cells was evaluated in vitro. W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 and W3XX126-BMK2 were conjugated with MMAE with WuXi Bio DAR4 technology platform as disclosed in WO2020164561A1. The Linker-Payload used was mc-vc-PAB-MMAE. Tumor cells were incubated with ADC of different concentrations for 5 days at 37 ℃. A non-binding ADC was used as a negative control. Cell viability was determined using the Cell Titer-Glo luminescent assay (Promega #G7573) and detected by Envision. The data was analyzed by four-parameter non-linear regression analysis using GraphPad Prism7.

[0387] W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320-MMAE mediated dose-dependent and strong killing of integrin ανβ6 expressing tumor cells, including HCC70, HPAF-II, NCI-H322, BxPC-3 and HCC827. It showed no killing effect to integrin ανβ6 negative tumor cell A549. W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320-MMAE showed much more potent killing activity than W3XX126-BMK2-MMAE in all tested tumor cells originating from different indications (Fig. 8) .

[0388] 5.2 In vivo Efficacy Study in HPAF-II, Detroit 562, BxPC-3 and HT1376 tumor cells xenograft models

[0389] The in vivo activity of W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320-MMAE was determined in subcutaneous xenograft models using pancreatic cancer cells (HPAF-II, BxPC-3) , head and neck cancer cells (Detroit 562) and bladder cancer cells (HT1376) models. Tumor cells (5E6) HPAF-II, Detroit 562 or BxPC-3 in 50%matrigel were subcutaneously inoculated to CB17 SCID mice (Shanghai Lingchang Biotech Co., Ltd) or 5E6 HT1376 in 50%matrigel were subcutaneously inoculated to BALB / C-nude mice (Shanghai Lingchang Biotech Co., Ltd) . Mice were randomly divided and dosed with test articles via intravenous injections when the tumors reached approximately 150～200 mm3. Dosing and administration were illustrated in the figures. Tumor volumes were monitored using calipers and animals were euthanized when tumor volume reached ～2000 mm3. Results were represented by mean and the standard error (Mean ± SEM) . Statistical analysis: Data were analyzed by One-way ANOVA and Two-way ANOVA using GraphPad Prism 7 and p < 0.05 means statistically significant.

[0390] W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320-MMAE demonstrated dose-dependent antitumor activity in all cell line models, although there was variability in the depth and durability of response (Fig. 9) . In the HPAF-II model, 3 mg / kg W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320-MMAE induced durable tumor regression out to 34 days, which showed much longer durable anti-tumor efficacy than W3XX126-BMK2-MMAE. BxPC-3 is the least responsive model for W3XX126-BMK2-MMAE, 3 mg / kg just showed slightly greater tumor growth inhibition than 1 mg / kg, and tumor re-growth was observed 22 days after treatment. In comparison, 3 mg / kg W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320-MMAE induced much greater and much longer anti-tumor efficacy than W3XX126-BMK2-MMAE, which induced durable tumor regression until the end of the study (38 days) . In the Detroit562 model, both W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320-MMAE and W3XX126-BMK2-MMAE with 4.5 mg / kg induced durable tumor regression out to day 41. At the low dose group (1.5 mg / kg) , W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320-MMAE induced greater tumor growth inhibition than W3XX126-BMK2-MMAE. Moreover, W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320-MMAE showed good anti-tumor efficacy in HT1376 model.

[0391] Example 6: Mouse Pharmacokinetics Study

[0392] Pharmacokinetics study of W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 was conducted in CB17 SCID mice (Shanghai Lingchang Biotech Co., Ltd) . 3 mg / kg or 30 mg / kg antibody was intravenously administered once and the plasma was collected at various time points. Antibody concentration was determined by ELISA. A sandwich ELISA configuration was used in microtiter plates coated with anti-human Fc antibody or antigen (human integrin ανβ6) . Bounded mAb was detected with an anti-human Fc antibody labeled with biotin. The concentration of antibody in plasma was calculated compared to the standard curve.

[0393] Plasma exposure of W301126-1.32.8-z13-uIgG1KV320 in mice was approximately linear with dose. At the intravenous injection of 30 mg / kg, the half-life (t1 / 2) is about 130 hours measured and calculated by two different methods (Fig. 10) .

[0394] Those skilled in the art will further appreciate that the present disclosure may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or central attributes thereof. In that the foregoing description of the present disclosure discloses only exemplary embodiments thereof, it is to be understood that other variations are contemplated as being within the scope of the present disclosure. Accordingly, the present invention is not limited to the particular embodiments that have been described in detail herein. Rather, reference should be made to the appended claims as indicative of the scope and content of the invention.

[0395] References

[0396] [1] LI, Z.H., ZHOU, Y., DING, Y.X., GUO, Q.L., &ZHAO, L. (2019) . Roles of integrin in tumor development and the target inhibitors. Chinese Journal of Natural Medicines, 17 (4) . https:  / / doi. org / 10.1016 / S1875-5364 (19) 30028-7

[0397] [2] Koivisto, L., Bi, J.,  L., &Larjava, H. (2018) . Integrin αvβ6: Structure, function and role in health and disease. In International Journal of Biochemistry and Cell Biology (Vol. 99) . https:  / / doi. org / 10.1016 / j. biocel. 2018.04.013

[0398] [3] Bandyopadhyay, A., &Raghavan, S. (2009) . Defining the Role of Integrin αvβ6 in Cancer. Curr Drugs Targets, 10 (7) . http:  / / doi. org / 10.2174 / 138945009788680374

[0399] [4] Reader, C.S., Vallath, S., Steele, C.W., Haider, S., Brentnall, A., Desai, A., Moore, K.M., Jamieson, N.B., Chang, D., Bailey, P., Scarpa, A., Lawlor, R., Chelala, C., Keyse, S.M., Biankin, A., Morton, J.P., Evans, T.J., Barry, S.T., Sansom, O.J., …Marshall, J.F. (2019) . The integrin αvβ6 drives pancreatic cancer through diverse mechanisms and represents an effective target for therapy. Journal of Pathology, 249 (3) . https:  / / doi. org / 10.1002 / path. 5320

[0400] [5] Aksorn, N., &Chanvorachote, P. (2019) . Integrin as a molecular target for anti-cancer approaches in lung cancer. In Anticancer Research (Vol. 39, Issue 2) . https:  / / doi. org / 10.21873 / anticanres. 13146

[0401] [6] Freddie, B., Mathieu, L., Hyuna, S., Jacques, F., Rebecca, L S., Isabelle, S., Ahmedin, J. (2024) . Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. Nov; 68 (6) . DOI: 10.3322 / caac. 21834

[0402] [7] Hollebecque, A., Lopez, J., Piha-Paul, S., Dowlati, A., Patnaik, A., Galvao, V., Buckorny, B., Sehgal, K., Kingsley, E., Sanborn, R., Peters, S., Sun, Y., Patilea-Vrana, G., Nazarenko, N., &Calvo, E. (2022) . 731 A first-in-human trial of an integrin beta-6 targeted antibody-drug conjugate (ADC) , SGN-B6A, in patients with advanced solid tumors: interim results of a phase 1 study (SGNB6A-001) . https:  / / doi. org / 10.1136 / jitc-2022-sitc2022.0731

[0403] [8] Lyon, R.P., Jonas, M., Frantz, C., Trueblood, E.S., Yumul, R., Westendorf, L., Hale, C.J., Stilwell, J.L., Yeddula, N., Snead, K.M., Kumar, V., Patilea-Vrana, G.I., Klussman, K., &Ryan, M.C. (2023) . SGN-B6A: A New Vedotin Antibody-Drug Conjugate Directed to Integrin Beta-6 for Multiple Carcinoma Indications. Molecular Cancer Therapeutics, 22 (12) . https:  / / doi. org / 10.1158 / 1535-7163. MCT-22-0817

[0404] [9] Dunbar, J., &Deane, C.M. (2016) . ANARCI: Antigen receptor numbering and receptor classification. Bioinformatics, 32 (2) . https:  / / doi. org / 10.1093 / bioinformatics / btv552

[0405]

[0010] Lefranc, M.P. (2003) .  databases, web resources and tools for immunoglobulin and T cell receptor sequence analysis, http:  / / imgt. cines. fr. Leukemia, 17 (1) . https:  / / doi. org / 10.1038 / sj. leu. 2402637

[0406]

[0011] Munger, J.S., Huang, X., Kawakatsu, H., Griffiths, M.J.D., Dalton, S.L., Wu, J., Pittet, J.F., Kaminski, N., Garat, C., Matthay, M.A., Rifkin, D.B., &Sheppard, D. (1999) . The integrin αvβ6 binds and activates latent TGFβ1: A mechanism for regulating pulmonary inflammation and fibrosis. Cell, 96(3) .https: / / doi.org / 10.1016 / S0092-8674(00)80545-0

Claims

1.An antibody or antigen-binding portion thereof that binds to integrin ανβ6, comprising:a heavy chain CDR (HCDR) 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;a HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;a HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;a light chain CDR (LCDR) 1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;a LCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; anda LCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.2.The antibody or antigen-binding portion thereof of claim 1, comprising:(A) a heavy chain variable region (VH) :(i) comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 7; or(ii) comprising an amino acid sequence at least 85%, 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 7; and(B) a light chain variable region (VL) :(i) comprising the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 8; or(ii) comprising an amino acid sequence at least 85%, at least 90%, or 95%identical to SEQ ID NO: 8.3.The antibody of claim 1 or 2, wherein the antibody further comprises a human IgG constant region, wherein the human IgG constant region is selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.4.The antibody of claim 3, wherein the human IgG constant region is a human IgG1 constant region or a variant thereof, wherein the variant thereof has a human IgG1 Fc region with L234A and L235A substitutions.5.The antibody or antigen-binding portion thereof of any of the preceding claims, wherein the antibody is a murine antibody, a chimeric antibody or a humanized antibody.6.A nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding the heavy chain variable region and / or the light chain variable region of the antibody or antigen-binding portion thereof of any of claims 1-5.7.A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 6.8.A host cell comprising the vector of claim 7 or the nucleic acid molecule of claim 6.9.A method for producing the antibody or antigen-binding portion thereof of any of claims 1-5, comprising the steps of:- culturing a host cell comprising an expression vector or vectors encoding the antibody or antigen-binding portion thereof under suitable conditions; and- harvesting the antibody or antigen-binding portion thereof from the cell culture.10.An antibody-drug conjugate (ADC) , comprising the antibody or antigen-binding portion thereof of any of claims 1-5 conjugated to a drug moiety.11.The ADC of claim 10, wherein the drug moiety comprises a cytotoxic agent or a cytostatic agent.12.The ADC of claim 11, wherein the cytotoxic agent or cytostatic agent is selected from a toxin, a chemotherapeutic agent, an antibiotic, a radioactive isotope and a nucleolytic enzyme.13.The ADC of claim 12, wherein the cytotoxic agent is selected from maytansinoids, dolastatins, dolostatin peptidic analogs and derivatives thereof, such as auristatins, calicheamicin, trichothecene and CC1065.14.The ADC of any of claims 10-13, wherein the ADC has the formula Ab- (L-D) p, wherein Ab is the antibody or antigen-binding portion thereof, L is a linker, D is the drug moiety, and p is a integer from 1 to 20.15.The ADC of claim 14, wherein the linker comprises a peptide linker, a hydrazone linker, or a disulfide linker.16.The ADC of claim 14 or 15, wherein the linker is cleavable by a protease.17.The ADC of any of claims 14-16, wherein the linker is attached to the antibody through a thiol group on the antibody.18.The ADC of any of claims 14-17, wherein the linker comprises 6-maleimidocaproyl (MC) , maleimidopropanoyl (MP) , valine-citrulline (val-cit) , alanine-phenylalanine (ala-phe) , p-aminobenzyloxycarbonyl (PAB) , N-Succinimidyl 4- (2-pyridylthio) pentanoate (SPP) , N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate (SMCC) , N-Succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate (SIAB) , or 6-maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenyloxycarbonyl (MC-vc-PAB) .19.The ADC of any of claims 14-18, which is highly homogeneous with the formula Ab- (L-D) p, wherein p is 4.20.A pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding portion thereof of any of claims 1-5 or the ADC of any of claims 10-19, and a pharmaceutically acceptable carrier.21.A method of modulating a ανβ6 related immune response in a subject, comprising administering to the subject the antibody or antigen-binding portion thereof of any of claims 1-5 or the pharmaceutical composition of claim 20 such that an immune response is modulated in the subject.22.A method for treating or preventing a disease or disorder associated with ανβ6 in a subject, comprising administering an effective amount of the antibody or antigen-binding portion thereof of any of claims 1-5 or the pharmaceutical composition of claim 20 to the subject.23.The method of claim 22, wherein the disease is a fibrotic disease or a cancer which is ανβ6 positive or overexpressed.24.The method of claim 23, wherein the cancer is selected from lung cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer, skin cancer, uterine cancer, breast cancer, bladder cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, stomach cancer, and liver cancer.25.Use of the antibody or antigen-binding portion thereof of any of claims 1-5 in the manufacture of a medicament for diagnosing, preventing or treating a disease or disorder associated with ανβ6.26.The antibody or antigen-binding portion thereof of any of claims 1-5 for use in treating or preventing a disease or disorder associated with ανβ6.27.A kit, comprising a container comprising the antibody or antigen-binding portion thereof of any of claims 1-5 or the ADC of any of claims 10-19.

Images